ES2228728T3

ES2228728T3 - Preparaciones concentradas estables de insulina para administracion pulmonar.

Info

Publication number: ES2228728T3
Application number: ES01126054T
Authority: ES
Inventors: Svend Havelund
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1998-10-16
Filing date: 1999-10-15
Publication date: 2005-04-16
Anticipated expiration: 2019-10-15
Also published as: UA65636C2; KR100617286B1; EP1121144A1; ZA200102105B; PL197504B1; JP4212240B2; PT1121144E; EP1172114A2; CZ20011134A3; PL347210A1; TWI223597B; EP1121144B1; DE69901726D1; EP1172114B1; JP2002527487A; ATE218364T1; NO20011842L; ATE277630T1; DK1172114T3; NO323365B1

Abstract

Una formulación acuosa de insulina que comprende: 3 a 20 mM de insulina humana o un análogo o un derivado de ésta, menos de 50 mM de cloruro, menos de 10 mM de cualquiera anión diferente de cloruro y acetato, 2 a 5 iones Zn2+ por seis moléculas de insulina, al menos 3 moléculas fenólicas por seis moléculas de insulina, y 5 a 150 mM de una amina zwitteriónica, preferentemente glicilglicina o glicina.

Description

Preparaciones concentradas estables de insulina para administración pulmonar.

Campo de la invención

La invención actual se relaciona con formulaciones acuosas concentradas de insulina con elevada estabilidad física y química y apropiadas para administración pulmonar.

Antecedentes de la invención

Diabetes es un término general para los trastornos del ser humano que implican una excesiva excreción de orina como en la diabetes mellitus y la diabetes insípida. La diabetes mellitus es un trastorno metabólico en el cual la capacidad de utilizar la glucosa se perdió prácticamente por completo. Aproximadamente el 2% de todas las personas sufren de diabetes.

Desde la introducción de la insulina en la década de 1920, se han hecho continuos avances para mejorar el tratamiento de la diabetes mellitus. Para ayudar a evitar niveles de glucemia extremos, los pacientes diabéticos a menudo se practican un tratamiento de inyecciones múltiples, mediante el cual la insulina se administra con cada comida.

En solución, el patrón de autoasociación de la insulina es una función compleja de la concentración proteica, los iones metálicos, el pH, la fuerza iónica y la composición del disolvente. En las preparaciones solubles que se usan corrientemente que contienen U100 de insulina, iones cinc, agente isotónico y conservante fenólico, se deben considerar los equilibrios siguientes:

6 In \leftrightarrow 3 In_{2}

3 In_{2} + 2Zn^{2+} \leftrightarrow In_{6} (T_{6})

T_{6} \leftrightarrow T_{3}R_{3} \leftrightarrow R_{6}

Los patrones de degradación de la insulina conocidos incluyen a) formación de fibrillas; b) desamidaciones en A18, A21 y B3; c) dimerizaciones a través de la transamidación o la formación de la base de Schiff; d) reacciones de intercambio de disulfuro.

Según Brange (Stability of Insulin, Kluwer Academic Press, 1994), cada una de estas reacciones de degradación procede mucho más rápido en el estado monomérico que en el estado hexamérico. Por consiguiente, el medio más eficaz de estabilizar las preparaciones de insulina es desplazando el equilibrio anterior hacia la derecha tanto como sea posible. Además de este efecto general de la acción de masas, la reactividad de los residuos seleccionados se modifica aún más dependiendo de su participación directa en el cambio conformacional T \rightarrow R. Por lo tanto, la reactividad de B3Asn es mucho menor en el estado R (cuando el residuo reside en una \alpha-hélice) que en el estado T. La interconversión entre las conformaciones T_{6}, T_{3}R_{3} y R_{6} del hexámero de insulina con dos cinc se modula mediante la unión del ligando a las formas T_{3}R_{3} y R_{6}. Aniones como el cloruro tienen afinidad por la cuarta posición de coordinación de los iones metálicos de T_{3}R_{3}y R_{6}, mientras que los conservantes como el fenol se unen a las cavidades hidrófobas ubicadas cerca de las superficies de las formas T_{3}R_{3} y R_{6} (Derewenda, Nature 338, 594, 1989 y, Brzovic, Biochemistry 33, 130557, 1994). Mediante el uso de insulina-Co^{2+} se ha demostrado que el efecto combinado de la unión de aniones y fenoles es particularmente eficaz en la estabilización del estado R_{6}. (Brader, Tendencias Biochem. Sci. 30, 6 636, 1991 y; Bloom, J. Mol. Biol. 245, 324, 1995). Además, se ha demostrado tanto para la insulina-Zn^{2+} como para la insulina-Co^{2+} que el fenol es mucho más eficaz que el m-cresol para inducir el estado R en el hexámero de insulina (Wollmer, Biol. Chem. Hoppe-Seyler 368, 903, 1987 y, Choi. Biochemistry 32, 11.638, 1993). Los derivados fenólicos de afinidad elevada que inducen el estado R son 7-hidroxiindol (Dodson, Phil. Trans, R. Soc. Lond. A 345, 153, 1993) resorcinol y 2,6- y 2,7-dihidroxinaftaleno (Bloom, J. Mol. Biol. 245, 324, 1995).

La desnaturalización física de la insulina se conoce como fibrilación. En el estado fibrilar las cadenas peptídicas extendidas están situadas paralelas o antiparalelas y enlazadas entre sí por hidrógeno, formando las denominadas estructuras \beta o en hojas \beta.

Las fibrillas representan generalmente el estado de energía más bajo de la proteína y sólo condiciones rigurosas como una base fuerte pueden permitir una regeneración desde este estado al estado nativo de la proteína correctamente plegada. Los factores que promueven la tasa de formación de las fibrillas son el aumento de temperatura, el aumento de la superficie entre la fase líquida y la fase aérea y, para la insulina exenta de cinc, el aumento de la concentración. Para la insulina-cinc hexamérica la tasa de formación de fibrillas disminuye con el aumento de la concentración. Se cree que la formación de fibrillas tiene lugar a través de la monomerización de la insulina. Las fibrillas de insulina tienen la apariencia de geles o precipitados. Los derivados de la insulina tienen truncamientos en el C-terminal de la cadena B, por ejemplo, des-pentapéptido(B26-B30)insulina y des-octapéptido(B23-B30)insulina son más propensos a la formación de fibrillas que la insulina humana. Los análogos de la insulina que se disocian fácilmente de la unidad hexamérica en la forma monomérica, p. ej., la AspB28 insulina humana y la LisB28-ProB29 insulina humana, son asimismo más propensos a la formación de fibrillas que la insulina humana. El estado nativo de la insulina se estabiliza provocando las condiciones que estabilizan la unidad hexamérica, es decir la presencia de iones cinc (2-4 átomos de cinc/hexámero), fenol (0,1-0,5% p/v) y cloruro de sodio (5 - 150 mM).

La adición de agentes que reducen la tensión superficial en la interfase aire-líquido reduce aún más la propensión a la formación de fibrillas. De esta manera, el polietilenglicol, el polipropilenglicol y los copolímeros de éstos con pesos moleculares promedio de aproximadamente 1.800 han encontrado uso como estabilizadores de las soluciones concentradas de insulina para las bombas de infusión (Grau, 1982. In: Neue insuline (Eds. Petersen, Schlüter y Kerp), Freiburger Graphische Betriebe, pág. 411-419 y Thurow, 1981: patente DE2952119A1). Por un examen exhaustivo de la estabilidad física de la insulina consulte Brange 1994, Stability of Insulin, Kluwer Academic Publisher, pág. 18-23. La mayor parte de la degradación química de la insulina en las preparaciones se debe a reacciones que involucran a la función carboxamida de los residuos de asparagina, en particular los residuos B3 y A21. La hidrólisis de los grupos amida produce los derivados desamido, y la transamidación que involucra a un grupo amino de otra molécula da lugar a dímeros covalentemente unidos y, después de reacciones consecutivas similares, a trímeros y polímeros de mayor tamaño.

En solución ácida AsnA21 es la más reactiva, dando lugar a AspA21 insulina. (Sundby, J. Biol. Chem. 237, 3.406, 1962). En la insulina bruta de origen bovino y porcino, obtenida mediante la extracción ácida con etanol, los dímeros aislados más abundantes fueron AspA21-GliA1 y AspA21-FenB1 unidos (Helbig 1976, Insulindimere aus der B-Kornponente von Insulinpräparationen. Thesis at the Rheinisch-Weslfälischen Technischen Hochschule, Aachen). En solución neutra, que es la materialización preferida de las preparaciones de insulina para tratamiento inyectable, AsnB3 es el residuo más sensible. Los productos de degradación incluyen AspB3 insulina, AspB3-GlnB4 isopéptido insulina y dímeros y polímeros de mayor tamaño en los que AspB3 proporciona la porción carbonilo del enlace peptídico con un grupo amino de otra molécula. Por un análisis exhaustivo de la estabilidad química de la insulina consulte Brange 1994, Stability of Insulin, Kluwer Academic Publisher, pág. 23-36. En cuanto a la estabilidad física, las condiciones que estabilizan la unidad hexamérica, es decir la presencia de iones cinc (2-4 iones cinc/hexámero), fenol (0,1-0,5% p/v) y cloruro de sodio (5-150 mM), reducen la tasa de formación de los productos de degradación durante el almacenamiento a pH neutro.

Se observa un tipo de reacción de polimerización diferente cuando se descuidan las condiciones que estabilizan la unidad hexamérica. Por lo tanto, en ausencia de cinc, fenol y cloruro de sodio y usando una temperatura de 50ºC los productos que se forman predominantemente son los dímeros unidos por disulfuro y los polímeros de peso molecular elevado. El mecanismo de formación es una reacción de intercambio de disulfuro, que da como resultado la \beta-eliminación de los disulfuros (Brems, Protein Engineering 5, 519, 1992).

La solubilidad de la insulina depende del pH, la concentración de iones metálicos, la fuerza iónica, las sustancias fenólicas, la composición del disolvente (polioles, etanol y otros disolventes), la pureza y la especie (bovina, porcina, humana, otros análogos). Por un análisis consulte Brange: Galenics of Insulin, Springer-Verlag 1987, pág. 18 y 46.

La solubilidad de la insulina es baja a valores de pH próximos a su pH isoeléctrico, es decir en el intervalo de pH 4,0 - 7,0. Se llevaron a pH ácido soluciones muy concentradas de insulina porcina (5.000 U/ml \sim 30 mM) (Galloway, Diabetes Care 4, 366, 1981), pero la insulina de la formulación es sumamente inestable debido a la desamidación en AsnA21. Se pueden preparar soluciones muy concentradas de insulina exenta de cinc a pH neutro, pero éstas son inestables debido a una alta tasa de polimerización y desamidación en AsnB3. Se ha informado de soluciones de insulina-cinc porcina a pH neutro que comprenden fenol, físicamente estables a concentraciones de 1.000 U/ml a temperatura elevada, pero que se tornaron sobresaturadas cuando la temperatura se redujo a 4ºC. (Brange y Havelund en Artificial Systems for insulin Delivery, Brunetti et al. eds, Raven Press 1983).

Para reducir el inconveniente de las inyecciones de insulina se prestó mucha atención a las vías de administración alternativas (por una visión general consulte Brange y Langkjaer en Protein Delivery: Physical Systems, Sanders y Hendren. eds., Plenum Press 1997). La administración pulmonar parece ser la más promisoria de ellas (Service Science 277, 1.199. 1997). La insulina se puede administrar en aerosol en forma de un polvo seco o como gotas nebulizados de una solución de insulina. La eficacia se podría mejorar mediante el entrenamiento de la respiración (Gonda, US Patent 5,743,250) y el agregado de un potenciador de la absorción (Baekstroem, US Patent 5,747,445) o inhibidores de la proteasa (Okumura, Int. J. Pharm. 88, 63, 1992).

Se demostró que la biodisponibilidad de una solución de insulina concentrada (500 U/ml) nebulizada era de 20 a 25% en comparación con una inyección subcutánea (Elliot, Aust.Paediatr. J. 23. 293. 1987). Al utilizar 30 a 50 \mul de solución de insulina por bocanada la solución de insulina necesita ser 5 a 20 veces más concentrada que la concentración habitual de 0,6 mM. Al utilizar un envase de dosis única, por ejemplo, un blíster (Gonda, US Patent 5,743,250), se suprime la necesidad de un conservante. La mayoría de las formulaciones de insulina se conservan con fenol y m-cresol que son tóxicos, irritantes de la mucosa y tienen un olor desagradable. Sin embargo, omitir los fenoles causaría problemas de estabilidad. Además de la eficacia bacteriostática, los fenoles actúan como estabilizadores fisicoquímicos de la insulina en combinación con iones cinc. Entonces, se prefiere que las formulaciones de insulina para inhalación se elaboren con una concentración mínima del fenol o que el fenol sea reemplazado por sustitutos más aceptables.

Descripción de la invención Definiciones

Por "análogo de la insulina humana" (y expresiones similares) según se usa aquí se debe entender insulina humana en la que uno o más aminoácidos han sido eliminados y/o reemplazados por otros aminoácidos, incluidos los aminoácidos no codificables, o insulina humana que contiene aminoácidos adicionales, es decir más de 51 aminoácidos.

Por "derivado de la insulina humana" (y expresiones similares) según se usa aquí, se debe entender insulina humana o un análogo de ésta en la que al menos un sustituyente orgánico está unido a uno o más de los aminoácidos.

Por "molécula fenólica" según se usa aquí se debe entender fenol o cualquier derivado de éste como el m-cresol o el cloro-cresol.

Breve descripción de la invención

Es un objetivo de la presente invención el proporcionar una formulación concentrada de insulina para administración pulmonar que cuente con una estabilidad física y química aceptable.

Este objetivo se alcanzó inesperadamente al proporcionar una formulación de insulina en la que la concentración de cloruro se mantiene por debajo de 50 mM y en la que la concentración de otros aniones como el fosfato se reduce al mínimo.

En consecuencia, la presente invención se relaciona con una formulación acuosa de insulina que comprende: 3 a 20 mM de insulina humana o de un análogo o un derivado de ésta, menos de 50 mM de cloruro, menos de 10 mM de cualquier anión diferente de cloruro y acetato, 2 a 5 iones Zn^{2+} por seis moléculas de insulina, al menos 3 moléculas fenólicas por seis moléculas de insulina, y 5 a 150 mM de una amina zwitteriónica, preferentemente glicilglicina o glicina.

Materializaciones preferidas

La formulación de insulina de acuerdo con la presente invención comprende preferentemente de 3 a 15, más preferentemente de 4 a 15 mM, aún más preferentemente de 5 a 15 mM, incluso más preferentemente de 6 a 15 mM de insulina humana o de un análogo o un derivado de ésta.

En ciertas materializaciones ventajosas, la formulación de la invención comprende aproximadamente 3 mM, aproximadamente 6 mM, aproximadamente 9 mM, aproximadamente 12 mM o aproximadamente 15 mM de insulina humana o de un análogo o un derivado de ésta.

Cuando la formulación de insulina de la invención vaya a ser administrada a partir de envases multidosis es aconsejable un efecto conservante y por lo tanto puede contener ventajosamente hasta 50 mM de moléculas fenólicas. Sorprendentemente, sin embargo, se obtiene una estabilidad adecuada usando una concentración relativamente baja de moléculas fenólicas como 3 a 12 moléculas fenólicas por seis moléculas de insulina, preferentemente 3 a 9 moléculas fenólicas por seis moléculas de insulina. Se puede utilizar una baja concentración de moléculas fenólicas cuando no se necesita una acción conservante o cuando se necesita una pequeña acción conservante como en el caso de los envases monodosis. Otra ventaja de utilizar una baja cantidad de moléculas fenólicas es una mayor comodidad para el paciente.

A fin de asegurar una estabilidad óptima, la formulación de insulina de acuerdo con la invención contiene preferentemente menos de 40 mM, más preferentemente menos de 30 mM de cloruro, aún más preferentemente de 5 a 20 mM de cloruro.

En una materialización particular la insulina puede contener una pequeña cantidad de solución amortiguadora de fosfato, preferentemente hasta 5 mM de fosfato.

Las formulaciones de insulina de la invención que comprenden de 2 a 4 iones Zn^{2+}, preferentemente 2,2 a 3,2 iones Zn^{2+} por seis moléculas de insulina, son muy estables.

Las formulaciones de insulina de la invención que comprenden de 3 a 5 iones Zn^{2+}, preferentemente de 3,5 a 5 iones Zn^{2+} por seis moléculas de insulina, también son adecuadas.

Sorprendentemente, es posible agregar concentraciones relativamente altas de zwitteriones como glicilglicina y glicina a la formulación de insulina de la invención sin disminuir la solubilidad de la insulina. La glicilglicina actúa como una solución amortiguadora a pH neutro y además aumenta la tasa de disolución de la insulina-cinc a un pH de neutro a básico debido a un efecto moderadamente quelante del cinc. Asimismo, la glicilglicina puede actuar como un depurador de las reacciones de aminas durante el período de almacenamiento. De este modo, en una materialización preferida la formulación de insulina de la invención comprende además de 5 a 150 mM de una amina zwitteriónica, preferentemente glicilglicina o glicina.

En una materialización preferida la formulación de insulina de la invención comprende además de 5 a 50 mM de trishidroximetilaminometano que actúa como una solución amortiguadora a pH neutro y como un depurador de los compuestos de amina reactivos.

En otra materialización preferida la formulación de insulina de la invención comprende iones de sodio como cationes. El ion sodio tiene un bajo efecto de desalado (salting out).

En otra materialización preferida la formulación de insulina de la invención comprende iones potasio o una mezcla de iones potasio y sodio como cationes. Una concentración de iones potasio mayor que la concentración plasmática de 4 - 5 mM aumenta el transporte de insulina a través de los pulmones.

En otra materialización preferida se usa una concentración de iones potasio mayor que 4-5 mM en combinación con un broncodilatador suave como el mentol.

En otra materialización preferida la formulación de insulina de la invención comprende entre 0,001% en peso y 1% en peso de un agente tensioactivo no iónico, preferentemente Tween 20 o Polox 188. Se puede agregar un detergente no iónico para estabilizar la insulina contra la fibrilación durante el almacenamiento y la nebulización.

En otra materialización preferida la formulación de insulina de la invención comprende de 1 mM a 10 mM de un agente tensioactivo aniónico, preferentemente el taurocolato de sodio, a fin de incrementar aún más la biodisponibilidad de la insulina.

En una materialización preferida la insulina utilizada es insulina humana.

En otra materialización preferida la insulina utilizada es un análogo de la insulina humana donde la posición B28 es Asp, Lis, Leu, Val o Ala y la posición B29 es Lis o Pro; o des(B28-B30), des(B27) o des(B30)insulina humana.

Los análogos preferidos de la insulina humana son aquellos en los que la posición B28 es Asp o Lis, y la posición B29 es Lis o Pro, preferentemente Asp^{B28} insulina humana o Lis^{B28}Pro^{B29} insulina humana.

En otra materialización preferida la insulina se selecciona del grupo de los derivados de la insulina solubles de acción prolongada como los derivados de la insulina humana que tienen uno o más sustituyentes lipófilos, preferentemente las insulinas aciladas.

El derivado de la insulina de acuerdo con esta materialización se selecciona preferentemente del grupo que consiste en B29-N^{6}-miristoil-des(B30)insulina humana, B29-N^{6}-palmitoil-des(B30)insulina humana, B29-N^{6}-miristoil insulina humana, B29-N^{6}-palmitoil insulina humana, B28-N^{6}-miristoil-Lis^{B28}Pro^{B29} insulina humana, B28-N^{6}-palmitoil Lis^{B28}Pro^{B29} insulina humana, B30-N^{6}-miristoil-Treo^{B28}Lis^{B30} insulina humana, B30-N^{6}-palmitoil-Treo^{B29}Lis^{B30} insulina humana, B29-N^{6}-(N-palmitoil-\gamma-glutamil)-des(B30)insulina humana, B29-N^{6}-(N-litocolil-\gamma-glutamil)-des(B30)insulina humana, B29-N^{6}-(\omega-carboxiheptadecanoil)-des(B30)insulina humana y B29-N^{6}-(\omega-carboxiheptadecanoil) insulina humana.

El derivado de la insulina que más se prefiere es B29-N^{6}-miristoil-des(B30)insulina humana o B29-N^{6}-(N-litocolil-\gamma-glutamil)-des(B30)insulina humana.

Los derivados de insulina solubles de acción prolongada se unen a la albúmina y fueron diseñados para proporcionar un suministro basal constante de insulina (Markussen, Diabetologia 39, 281, 1996). La administración subcutánea una vez o dos veces al día asegura el suministro basal necesario de insulina, mientras que para la administración pulmonar se recomienda varias inhalaciones diarias, preferentemente relacionadas con las comidas.

Los derivados de la insulina tienen un inicio prolongado de la acción y pueden compensar de este modo el muy rápido aumento de la insulina plasmática normalmente asociado a la administración pulmonar. Mediante la selección cuidadosa del tipo de insulina, la presente invención permite el ajuste de la sincronización para obtener el perfil deseado de insulina.

En una materialización particular de la presente invención, la formulación de insulina comprende un análogo de la insulina o insulina humana así como un derivado de la insulina.

Las moléculas fenólicas de la formulación de insulina se eligen preferentemente del grupo que consiste en fenol, m-cresol, cloro-cresol, timol o cualquier mezcla de éstos.

La preparación de insulina de la presente invención tiene preferentemente un valor de pH en el intervalo de 7 a 8,5, más preferentemente de 7,4 a 7,9.

Esta invención se ilustra aún más con los ejemplos siguientes, los que, no obstante no se prepararon con carácter limitante.

Ejemplo 1

(con fines ilustrativos, no como parte de invención)

Se prepararon 2,5 ml de una solución de reserva de insulina de 21 mM disolviendo 337 mg de insulina humana exenta de cinc en 1.237 \mul de agua y agregando 263 \mul de ZnCl_{2} 0,1 M y 637 \mul de agua antes de ajustar el pH con 38 \mul de NaOH 0,2 M y finalmente agregando agua para completar 2,5 ml, calculando el volumen específico de insulina como 0,7 \mul/mg. A continuación se elaboró una preparación de 15 mM agregando 350 \mul de m-cresol 0,16 M, 175 \mul de fenol 0,32 M y sal o detergente para obtener las concentraciones que se muestran en la Tabla 1 que posteriormente fueron diluidas a la mitad hasta 12, 9, 6, 3 y 0,6 mM y almacenadas a 5ºC.

Ejemplo 2

Se dispersó insulina-cinc en agua (1:10) en un baño de hielo, se le agregó glicilglicina (7/15) equivalentes e hidróxido de sodio (3,1 equivalentes) y se agitó lentamente durante toda la noche a 5ºC. Después se le agregó 0,1 equivalente de cloruro de cinc y detergente, se ajustó el pH a 7,5 mediante 0,8 equivalentes de ácido clorhídrico y se ajustó el volumen antes de agregar fenol y agua y finalmente diluir la preparación de 15 mM con un medio que contiene cloruro de sodio, glicilglicina y detergente para obtener 12, 9, 6 y 3 mM de insulina humana. (Tablas 2 y
3).

Los resultados se presentan en las tablas siguientes 1 a 3.

Los datos de la tabla 1 muestran que incluso una pequeña cantidad de fosfato (p. ej. 5 mM) reducen la estabilidad de la insulina, y la sustitución del cloruro de sodio por clorhidrato de trihidroximetilaminometano tiende a disminuir la solubilidad de la insulina. Contrariamente a las sales los zwitteriones glicilglicina y glicina aumentaron la solubilidad de la insulina, y fue posible agregar concentraciones inesperadamente altas de los zwitteriones glicilglicina y glicina sin deteriorar el efecto estabilizante sobre la insulina. La glicilglicina actúa como una solución amortiguadora a pH neutro y además aumenta la velocidad de disolución de la insulina-cinc a un pH de neutro a básico debido a un efecto moderadamente quelante del cinc. La glicilglicina también puede actuar como un depurador para las reacciones de amina durante el almacenamiento. El agregado de los detergentes no iónicos Tween 20 y Poloxamer 188 hasta 1% en peso y 3 mM del detergente aniónico taurocolato de sodio no redujeron la estabilidad durante el almacenamiento a 5ºC.

En la tabla 2 se muestra una evaluación del efecto de una sustancia fenólica agregada equimolar a la insulina. Tres de las moléculas fenólicas aumentan la estabilidad física a baja temperatura de 6 a 15 mM de insulina o más y reducen la formación de polímeros a temperatura elevada en un factor de 2-3 (a baja concentración de cloruro). En otro conjunto de experimentos (tabla 3) la cantidad relativa de fenol o cloro-cresol se varió de 0 a 2 por insulina a estabilidad química en aumento.

Ejemplo 3

Se suspendieron 441 mg de B29-N^{6}-(N-litocolil-\gamma-glutamil)-des(B30)insulina humana (143 nmol/mg) en 5 ml de agua a 0ºC y se le agregaron 220 \mul de NaOH 1 N. Después de la disolución del análogo de la insulina se agregaron 295 \mul de ZnCl_{2} 0,1 M y la solución se agitó hasta que se disolvió un precipitado temporal. A continuación se le agregaron 315 \mul de fenol 0,32 mM y 98 \mul de glicilglicina 0,5 M y 70 \mul de Tween 20 al 1% y se midió el pH hasta 7,60. Finalmente se agregaron 693 \mul de agua y la solución se pasó a través de un filtro estéril de 0,22 \mum Millex®-GV para obtener 7 ml de B29-N^{6}-(N-litocolil-\gamma-glutamil)-des(B30)insulina humana 9 mM. La solución permaneció estable después de 3 meses a 5ºC.

TABLA 1 Estabilidad de las soluciones de insulina humana a las concentraciones convencionales de fenol/cresol (usadas para envases multidosis) como una función de la concentración de sal, de la carga iónica y de la concentración del detergente

1

2

TABLA 2 Estabilidad de la insulina humana a concentraciones equimolares de conservantes fenólicos

3

TABLA 3 Estabilidad de la insulina humana a distintas concentraciones de conservantes fenólicos

4

Claims

1. Una formulación acuosa de insulina que comprende: 3 a 20 mM de insulina humana o un análogo o un derivado de ésta, menos de 50 mM de cloruro, menos de 10 mM de cualquiera anión diferente de cloruro y acetato, 2 a 5 iones Zn^{2+} por seis moléculas de insulina, al menos 3 moléculas fenólicas por seis moléculas de insulina, y 5 a 150 mM de una amina zwitteriónica, preferentemente glicilglicina o glicina.

2. Una formulación de insulina de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende de 3 a 15 mM de insulina humana o un análogo o un derivado de ésta, preferentemente aproximadamente 3 mM, aproximadamente 6 mM, aproximadamente 9 mM, aproximadamente 12 mM, o aproximadamente 15 mM de insulina humana o de un análogo o un derivado de ésta.

3. Una formulación de insulina de acuerdo con la reivindicación 2 que comprende de 4 a 15 mM, preferentemente de 5 a 15 mM, más preferentemente de 6 a 15 mM de insulina humana o de un análogo o un derivado de ésta.

4. Un formulación de insulina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende hasta 50 mM de moléculas fenólicas, preferentemente de 3 a 12 moléculas fenólicas por seis moléculas de insulina, más preferentemente de 3 a 9 moléculas fenólicas por seis moléculas de insulina.

5. Una formulación de insulina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende menos de 40 mM, preferentemente menos de 30 mM de cloruro, más preferentemente de 5 a 20 mM de cloruro.

6. Una formulación de insulina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende hasta 5 mM de fosfato.

7. Una formulación de insulina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende de 2 a 4 iones Zn^{2+}, preferentemente de 2,2 a 3,2 iones Zn^{2+} por seis moléculas de insulina.

8. Una formulación de insulina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende además 5 a 50 mM de trishidroximetilaminometano.

9. Una formulación de insulina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende iones sodio, iones potasio, o una mezcla de éstos, como cationes.

10. Una formulación de insulina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además entre 0,001% en peso y 1% en peso de un agente tensioactivo no iónico, preferentemente Tween 20 o Polox 188.

11. Una formulación de insulina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además 1 mM a 10 mM de un agente tensioactivo aniónico, preferentemente taurocolato de sodio.

12. Una formulación de insulina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende insulina humana.

13. Una preparación de insulina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende un análogo de insulina humana en el que la posición B28 es Asp, Lis, Leu, Val o Ala y la posición B29 es Lis o Pro; o des(B28-B30), des(B27) o des(B30)insulina humana.

14. Una preparación de insulina de acuerdo con la reivindicación 13, que comprende un análogo de la insulina humana en el que la posición B28 es Asp o Lis, y la posición B29 es Lis o Pro, preferentemente Asp^{B28} insulina humana Lis^{B28}Pro^{B29} insulina humana.

15. Una preparación de insulina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende un derivado de la insulina humana que tiene uno o más sustituyentes lipófilos, preferentemente una insulina acila-
da.

16. Una preparación de insulina de acuerdo con la reivindicación 15, donde el derivado de la insulina se elige del grupo que consiste en B29-N^{6}-miristoil-des(B30) insulina humana, B29-N^{6}-palmitoil-des(B30)insulina humana, B29-N^{6}-miristoil insulina humana, B29-N^{6}-palmitoil insulina humana, B28-N^{6}-miristoil-Lis^{B28}Pro^{B29} insulina humana, B28-N^{6}-palmitoil-Lis^{B28}Pro^{B29} insulina humana, B30-N^{6}-miristoil-Treo^{B29}Lis^{B30} insulina humana, B30-N^{6}-palmitoil-Treo^{B29}Lis^{B30} insulina humana, B29-N^{6}-(N-palmitoil-\gamma-glutamil)-des(B30)insulina humana, B29-N^{6}-(N-litocolil-\gamma-glutamil)-des(B30)insulina humana, B29-N^{6}-(\omega-carboxiheptadecanoil)-des(B30)insulina humana y B29-N^{6}(\omega-carboxiheptadecanoil)insulina humana.

17. Una preparación de insulina de acuerdo con la reivindicación 16, en la que el derivado de la insulina es B29-N^{2}-miristoil-des(B30)insulina humana o B29-N^{2}-(N-litocolil-\gamma-glutamil)-des(B30)insulina humana.

18. Una preparación de insulina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende un análogo de la insulina o insulina humana así como un derivado de insulina.

19. Una preparación de insulina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que las moléculas fenólicas se seleccionan del grupo que consiste en fenol, m-cresol, cloro-cresol, timol o cualquier mezcla de éstos.

20. Una preparación de insulina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes que tiene un valor de pH en el intervalo de 7 a 8,5, preferentemente de 7,4 a 7,9.