NO323365B1

NO323365B1 - Stabile, konsentrerte insulinpreparater for pulmonal avlevering

Info

Publication number: NO323365B1
Application number: NO20011842A
Authority: NO
Inventors: Svend Havelund
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 1998-10-16
Filing date: 2001-04-10
Publication date: 2007-04-10
Also published as: PL197504B1; UA65636C2; WO2000023098A1; EP1121144B1; PL347210A1; ES2177323T3; DK1121144T3; CA2346969A1; KR100617286B1; BR9914585A; CN1210058C; HUP0104111A2; DE69920767D1; JP4212240B2; HUP0104111A3; PT1172114E; DE69901726D1; AU758146B2; AU6188999A; EP1172114A3

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse vedrører konsentrerte vandige insulinpreparater med høy fysisk og kjemisk stabilitet, og som er egnet for pulmonal avlevering.

Oppfinnelsens bakgrunn

Sukkersyke er et generelt uttrykk for forstyrrelser hos mennesker som har for stor urinutskillelse, som ved diabetes mellitus og diabetes insipidus. Diabetes mellitus er en metabolsk forstyrrelse hvor evnen til å utnytte glukose er mer eller mindre, fullstendig tapt. Ca 2 % av alle folk lider av sukkersyke.

Etter introduksjonen i insulin i 1920-årene er det gjort stadige anstrengelser på å forbedre behandlingen av diabetes mellitus. For å hjelpe til å unngå ekstreme glykeminivåer, praktiserer sukkersykepasienter ofte multippelinjeksjonsterapi, hvorved insulin administreres sammen med hvert måltid.

I oppløsning er insulinets selvassosieringsmønster en kompleks funksjon av proteinkonsentrasjon, metall-ioner, pH, ionestyrke og oppløsningsmiddelsammensetning. For de for tiden anvendte oppløselige preparater som inneholder U100-insulin, sinkioner, isotont middel og fenolholdig konserveringsmiddel, må følgende likevekter vurderes:

De kjente nedbrytningsmønstrene for insulin omfatter

a) fibrildannelse, b) deamideringer i A18, A21 og B3, c) dimeriseringer via transamidering eller Schiffbase-dannelse, d)

disulfidutbyttingsreaksj oner.

Ifølge Brange (Stability of Insulin, Kluwer Academic Press, 1994), forløper hver av disse nedbrytningsreaksjonene mye hurtigere i den monomere tilstand enn i den heksamere tilstand. Det mest virkningsfulle middel for å stabilisere

insulinpreparater er derfor å forskyve den ovenfor nevnte

likevekt så langt mot høyre som mulig. I tillegg til denne generelle effekten av massevirkning modifiseres reaktiviteten til utvalgte rester ytterligere, avhengig av deres direkte involvering i T R konformasjonsendringen. Reaktiviteten til B3Asn er således mye lavere i R-tilstanden (når resten befinner seg i en a-helix) enn i T-tilstanden. Den gjensidige omdannelse mellom Te-, T3R3- og Re-konf orma-sjoner til de to sinkinsulin-heksamerer moderes ved hjelp av ligandbinding til T3R3- og Re-formene. Slike anioner som klorid har affinitet for den fjerde koordinasjonsstilling i metallionene i T3R3 og Re, mens konser-veringsmidler, slik som fenol, bindes til hydrofobe lommer som befinner seg nær overflatene til T3R3- og R6-formene. (Derewenda, Nature 338, 594, 1989, og Brzovic, Biochemistry 33, 130557, 1994) . Ved anvendelse av Co<2+->insulin er det blitt påvist at den •kombinerte effekt av anion og fenolbinding er særlig virkningsfull til å stabilisere Rg-tilstanden (Brader, Trends Biochem. Sei. 30, 6636, 1991, og Bloom, J. Mol. Biol. 245, 324, 1995). For både Zn<2+-> og Co<2+->insulin er det dessuten blitt påvist at fenol er mye mer virkningsfull enn m-cresol når det gjelder å indusere R-tilstanden hos insulinheksameren {Wollmer, Biol. Chem. Hoppe-Seyler 368, 903, 1987, og Choi, Biochemistry 32, 11638, 1993). Høyaffinitets fenolderivater som induserer R-tilstanden, er 7-hydroksyindol ((Dodson, Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 345, 153, 1993), resorcinol og 2,6- og 2,7-dihydroksy-naftalen {(Bloom, J. Mol. Biol. 245, 324, 1995). Den fysiske denaturering av insulin er kjent som fibrillering. I den fibrillære tilstand ligger forlengede peptidkjeder parallelt eller antiparallelt og hydrogenbundet til hverandre, såkalte p-struktur- og p-foldede ark. Fibriller utgjør vanligvis den lav-este energitilstand hos proteinet, og bare strenge betingelser, slik som sterk base, kan muliggjøre en regenerering fra denne tilstanden til den naturlig forekommende tilstand med korrekt foldet protein. Faktorer som fremmer dannelseshastigheten for fibriller, er økning av températuren, økning av overflatearealet mellom væske- og luftfasen, og for sinkfri insulin, økning av konsentrasjonen. For heksamert sinkinsulin avtar hastigheten for fibrildannelse med økende konsentrasjon. Dannelsen av fibriller antas å forløpe via monomerisering av insulin. Fibriller av insulin har utseendet av geler eller utfellinger.

Insulinderivater som har avkortninger i C-enden i B-kjeden, f eks des-pentapeptid-(B26-B30)-insulin og des-oktapeptid-(B23-B30)-insulin, er-mer tilbøyelige til å danne fibriller enn humaninsulin. Insulinanaloger som dissosierer lett fra heksamerenheten til den monomere form, f eks AspB28-humaninsulinet og LysB28-ProB29-humaninsulinet, er likeledes mer tilbøyelige til danne fibriller enn humaninsulin. Den naturlig forekommende tilstand til insulin stabiliseres ved å tilveiebringe betingelsene som stabiliserer heksamerenheten, dvs. tilstedeværelsen av sinkioner (2-4 sink/heksamer), fenol (0,1-0,5 % vekt/volum) og natriumklprid ("5-150 mM) .

Tilsetning av midler som reduserer overflatespenningen i luft-væske-overflaten, reduserer tilbøyeligheten til fibrill-dannelse ytterligere. Polyetylenglykol, polypropylenglykol og kopolymerer herav med gjennomsnittlige molekylvekter på ca 1800, har således funnet anvendelse som stabiliseringsmidler i konsentrerte insulinoppløsninger for infusjonspumper (Grau, 1982. I: Neue Insuline (red. Petersen, Schltiter & Kerp) , Freiburger Graphische Betriebe, s. 411-419, og Thurow, 1981: patent DE 295 2li9 Al). For en omfattende oversikt av den fysiske stabilitet til insulin, se Brange 1994, Stability of Insulin, Kluwer Academic Publisher, s. 18-23.

Mesteparten av den kjemiske nedbrytningen av insulin i preparater skyldes reaksjoner som involverer karboksamingruppen i asparaginrestene, særlig restene B3 og A21. Hydrolyse av amid-gruppene fører til desaminoderivater og transamidering som omfatter en aminogruppe fra et annet molekyl, fører til kovalent bundne dimerer og, etter lignende på hverandre følgende reaksjoner, til trimerer og høyere polymerer.

I sur oppløsning er AsnA21 den mest reaktive, idet den fører til AspA21-insulin (Sundby, J. Biol. Chem. 237, 3406, 1962). I urenset insulin av bovin og porsin opprinnelse* erholdt ved hjelp av sur etanolekstraksjon, var de rikeligst isolerte dimerer, AspA21-GlyAl- og AspA21 -PheBl-bundet (Helbig 1976, Insulindimere aus der B-Komponente von InsulinprStparationen, Thesis at the Rheinisch-Westfålischen Technischen Hochschule, Aachen).

I nøytral oppløsning som er den foretrukne utførelsesform av insulinpreparater for injeksjonsterapi, er AsnB3 den mest følsomme rest. Nedbrytningsprodukter omfatter AspB3-insulin, AspB3-GlnB4-isopeptidinsulin, og dimerer og høyere polymerer hvor AspB3 tilveiebringer karbonylresten i en peptidbinding med en aminogruppe fra et annet molekyl. For en omfattende oversikt vedrørende den kjemiske stabilitet til insulin, se Brange 1994, Stability of Insulin, Kluwer Academic Publisher, s. 23-36. Som for fysisk stabilitet reduserer betingelser som stabiliserer heksamerenheten, dvs. tilstedeværelse av sinkioner (2-4 sink/heksamer), fenol (0,1-0,5 % vekt/volum) og natriumklorid (5-150 mM), dannelseshastigheten for nedbrytningsprodukter under lagring ved nøytralt pH.

En annen type polymeriseringsreaksjon observeres når betingelsene som stabiliserer heksamerenheten, neglisjeres. I fravær av sink, fenol og natriumklorid, og ved anvendelse av en temperatur på 50 °C, er således disulfidbundne dimerer og polymerer med høy molekylvekt de dominerende produkter som dannes. Dannelsesmekanismen er en disulfidutbyttingsreaksjon som skriver seg fra p-eliminering av disulfidene (Brems, Protein Engineering 5, 519, 1992) .

Oppløselighet av insulin er en funksjon av pH, metallion-konsentrasjon, ionestyrke, fenolholdige stoffer, oppløsnings-middelsammensetning (polyoler, etanol og andre oppløsningsmid-ler), renhet og art (bovin, porsin, human, andre analoger). For en oversikt, se Brange: Galenics of Insulin, Springer-Verlag 1987, s. 18 og 46.

Oppløseligheten av insulin er lav. ved pH-verdier nær dets isoelektriske pH, dvs. pH-området 4,0-7,0. Høykonsentrerte opp-løsninger av porsint insulin (5000 U/ml - 30 mM)ble frembrakt ved sur pH (Galloway, Diabetes Care 4, 366, 1981), men insulinet i preparatet er svært ustabilt pga deamidering i AsnA21. Ved nøytral pH kan det lages høykonsentrerte oppløsninger av sinkfritt insulin, men disse er ustabile pga den høye polymeri-seringshastigheten og deamideringen i AsnB3. Porsine sink-insulinoppløsninger med nøytral pH som omfatter fenol, er blitt rapportert fysisk stabile ved konsentrasjoner på 1000 U/ml ved forhøyet temperatur, men blir supermettet når temperaturen senkes til 4 °C. (Brange og Havelund i Artificial Systems for Insulin Delivery, Brunetti et al., red., Raven Press, 1983).

For å redusere ulempen ved insulininjeksjoner, er det rettet mye oppmerksomhet mot alternative administreringsveier {for en oversikt, se Brange og Langkjær i Protein Delivery: Physical Systems, Sanders og Hendren, red., Plenum Press 1997). Pulmonal avlevering synes å være den mest lovende av disse (Service, Science 277, 1199, 1997). Insulin kan gis aerolisert i form av tørt pulver eller som forstøvede små dråper fra en insu-linoppløsning. Virkningsfullheten kan forøkes ved hjelp av hostepusting (Gonda, US patent nr. 5 743 250) og tilsetning av en absorbsjonsfremmer (BåkstrSm, US patent nr. 5 757 445) eller proteaseinhibitorer (Okumura, Int. J. Pharm. 88, 63, 1992).

Den biologiske tilgjengelighet av en forstøvet konsentrert insulinoppløsning (500 U/ml) ble påvist å være 20-25 % sammen-lignet med en subkutan injeksjon (Elliot, Aust. Paediatr. J. 23, 293, 1987). Ved å anvende 30-50 ul insulinoppløsning per utstøt-ing, må insulinoppløsningen være 5-20 ganger mer konsentrert enn den vanlige konsentrasjon på 0,6 mM. Ved å anvende en enkelt- , dosebeholder, f eks en blærepakning (Gonda, US patentskrift nr. 5 743 250), oppheves behovet for et konserveringsmiddel. De fleste insulinpreparater konserveres ved hjelp av den toksiske, mukoseirriterende og ubehagelig luktende fenol og m-cresol. Utelatelse av fenoler vil imidlertid forårsake stabilitets-problemer. I tillegg til den bakteriostatiske virkningsfullhet virker fenolene som fysikalskkjemiske stabiliseringsmidler for insulin i kombinasjon med sinkioner. Det er derfor foretrukket at preparater av insulin for inhalasjon lages med en minimal konsentrasjon av fenol, og at fenol er blitt erstattet med mer akseptable substitutter.

I US patentskrift nr. 5 474 978 beskrives farmasøytiske preparater av insulinanaloger som er stabilisert mot kjemisk nedbrytning. Ifølge dette patentskriftet forbedres kjemisk stabilitet ved å formulere insulinanalogene slik at det dannes sinkholdige heksamerer av insulinanaloger. Patentskriftet vedrører imidlertid ikke forbedring av fysisk stabilitet for høykonsentrerte insulinformuleringer. Dessuten sies det i patentskriftet ikke noe om den øvre grense for klorid og andre anioner enn klorid og acetat. Derimot ble alle insulinoppløs-ningene beskrevet i patentskriftet underkastet et syreutslags-trinn ved å anvende HC1 til å senke pH-verdien.

Beskrivelse av oppfinnelsen

Def inis j oner

Med "analog av humaninsulin" (og lignende uttrykk) er det, slik det her er brukt, ment humaninsulin hvor en eller flere aminosyrer er blitt utelatt og/eller erstattet med andre aminosyrer, inkludert ikke-kodbare aminosyrer, eller humaninsulin som omfatter ytterligere aminosyrer, dvs. mer enn 51 aminosyrer.

Med "derivat av humaninsulin" (og lignende uttrykk) er det, slik det her er brukt, ment humaninsulin eller en analog derav hvor minst én organisk substituent er bundet til én eller flere av aminosyrene.

Med "fenolholdig molekyl" er det, slik det her er brukt, ment fenol eller hvilket som helst derivat derav, slik som m-cresol eller klorcresol.

Kort beskrivelse av oppfinnelsen

Det er ét formål ved foreliggende oppfinnelse å tilveie-" bringe et konsentrert insulinpreparat for pulmonal avlevering. som har en akseptabel fysisk og kjemisk stabilitet.

Dette formålet er uventet blitt oppnådd ved å tilveiebringe et insulinpreparat hvor konsentrasjonen av klorid holdes under 50 mM, og hvor konsentrasjonen av andre anioner, slik som fosfat, er minimalisert.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig et vandig insulinpreparat som omfatter: 6-15 mM av humaninsulin eller av en analog eller et derivat derav, mindre enn 50 mM klorid, mindre enn 10 mM av hvilke som helst andre anioner enn klorid og acetat, 2-5 Zn<2+->ioner per seks insulinmolekyler og minst 3 fenolholdige molekyler per seks insulinmolekyler; og at det har en pH-verdi i området 7-8,5, fortrinnsvis 7,4-7,9.

Foretrukne utførelsesformer

Ved visse fordelaktige utførelsesformer omfatter preparatet ifølge oppfinnelsen ca 6 mM, ca 9 mM, ca 12 mM eller ca 15 mM av humaninsulin eller av en analog eller et derivat derav.

Når insulinpreparatet ifølge oppfinnelsen skal administreres fra flerdosebeholdere, er det ønsket med en konserverende effekt og det kan således fordelaktig inneholde opp til 50 mM fenolholdige molekyler. Overraskende oppnås imidlertid passende stabilitet ved å anvende en forholdsvis lav konsentrasjon av fenolholdige molekyler, slik som 3-12 fenol-holdige molekyler per seks insulinmolekyler, fortrinnsvis 3-9 fenolholdige molekyler per seks insulinmolekyler. Lav konsentrasjon av fenol-holdige molekyler kan anvendes når ingen eller liten konserverende virkning trengs, som i enkeltdosebeholder. En ytterligere fordel ved å anvende en liten mengde fenolholdige molekyler, er en økt bekvemmelighet for pasienten.

Insulinpreparatet ifølge oppfinnelsen inneholder fortrinnsvis mindre enn 40 mM, mer foretrukket mindre enn 30 mM klorid, enda mer foretrukket 5-20 mM klorid, for å sikre optimal stabilitet.

Ved en spesiell utførelsesform kan insulinet omfatte en liten mengde fosfatbuffer, fortrinnsvis opp til 5 mM fosfat.

Insulinpreparater ifølge oppfinnelsen som omfatter 2-4 Zn<2+->ioner, fortrinnsvis 2,2-3,2 Zn<2+->ioner per seks insulinmolekyler, er svært stabile.

Insulinpreparater ifølge oppfinnelsen som omfatter 3-5 Zn<2+->ioner, fortrinnsvis 3,5-5 Zn<2+->ioner per seks insulinmolekyler, er også egnet.

Overraskende er det mulig å tilsette forholdsvis høye konsentrasjoner av zwitterioner, slike som glysylglysin og glysin, til insulinpreparater ifølge oppfinnelsen uten å redusere oppløseligheten av insulin. Glysylglysin virker som en buffer ved nøytral pH og øker dessuten oppløsningshastigheten for sinkinsulin ved nøytral til basisk pH pga en middels sink-gelaterende effekt. Glysylglysin vil også kunne virke som et utrenskningsmiddel for aminreaksjoner under lagringstiden. Ved en foretrukket utførelsesform omfatter således insulinpreparater ifølge oppfinnelsen videre 5-150 mM av et zwitterionamin, fortrinnsvis glysylglysin eller glysin.

Ved en foretrukket utførelsesform omfatter insulinpreparatet ifølge oppfinnelsen videre 5-50 mM trishydroksymetylaminometan som virker som en buffer ved nøytral pH, og som et utrenskningsmiddel for reaktive aminforbindelser.

Ved en annen foretrukket utførelsesform omfatter insulinpreparatet ifølge oppfinnelsen natriumioner som kationer. Natri-umionet har en lav utsaltingseffekt. Ved en annen foretrukket utførelsesform omfatter Insulinpreparatet ifølge oppfinnelsen kalium- eller en blanding av kalium- og natriumioner som kationer. Kaliumioner ved en konsentrasjon som er høyere enn plasmakonsentrasjonen på 4-5 mM, øker transporten av insulin gjennom lungene.

Ved en annen foretrukket utførelsesform anvendes kaliumion ved en konsentrasjon som er høyere enn 4-5 mM, i kombinasjon med en mild bronkodilator, slik som mentol.

Ved en annen foretrukket utførelsesform omfatter insulinpreparatet ifølge oppfinnelsen mellom 0,001 vekt% og 1 vekt% av et ikke-ionisk overflateaktivt middel, fortrinnsvis tween 20 eller Polox 188. En ikke-ionisk detergent kan tilsettes for å stabilisere insulinet mot fibrillering under lagring og forstøv-ning.

Ved en annen foretrukket utførelsesform omfatter insulinpreparatet ifølge oppfinnelsen 1 mM. til 10 mM av et anionisk overflateaktivt middel, fortrinnsvis natriumtaurocholat, for ytterligere å øke insulinets biologiske tilgjengelighet.

Ved en foretrukket utførelsesform er det anvendte insulin humaninsulin.

Ved en annen foretrukket utførelsesform er det anvendte insulin en analog av humaninsulin hvor B28-stillingen er Asp, Lys, Leu, Val eller Ala, og B29-stillingen er Lys eller Pro, eller des(B28-B30)-, des(B27}- eller des(B30)-humaninsulin.

De foretrukne analoger av humaninsulin er de hvor B28-stillingen er Asp eller Lys, og B29-stillingen er Lys eller Pro, fortrinnsvis AspB28-humaninsulin eller Lys<828-> Pro<B>29-humaninsulin.

Ved en annen foretrukket utførelsesform er insulinet valgt fra gruppen av oppløselige langtidsvirkende insulinderivater, slik som derivater av humaninsulin som har én eller flere lipofile substituenter, fortrinnsvis acylerte insuliner.

Insulinderivatet ifølge denne utførelsesformen er fortrinnsvis valgt fra gruppen bestående av B29-Ne<->myristoyl-des(B30)-humaninsulin, B29-Ns<->palmitoyl-des(B30)- humaninsulin, B29-Ne<->myristoyl-humaninsulin, B29-Ns<->palmitoyl-humaninsulin, B28-Ns<->myristo<y>l-Lys<B28>Pro<B29->humaninsulin, B28-Ne<->palmitoyl-Lys<B>28ProB29-humaninsulin, B30-Ns<->myristoyl-ThrB29Lys<B30->humaninsulin, B30-Ne<->palmitoyl-Thr<B29>LysB30-humaninsulin, B29-N<*-> (N-palmitoyl-y-glutamyl) -des (B30) -humaninsulin, B29-N8- (N-litocholyl-y-glutamyl) - des (B30) -humaninsulin, B29-N8- (oa-karboksy-heptadekanoyl) - des {B30)-humaninsulin og B29-N8-(ca-karboksyheptadekanoyl) - humaninsulin.

Det mest - foretrukne insulinderivat er B29-Ne<->myristoyl-des (B30)-humaninsulin eller B29-N8-(N-litocholyl-y-glutamyl) - des(B30)-humaninsulin.

De ovenfor nevnte, oppløselige langtidsvirkende insulinderivater er albuminbindende og er blitt utformet for å tilveiebringe en konstant grunntilførsel av insulin (Markussen, Diabetologia 39,' 281, 1996). Subkutan administrering én eller to ganger daglig sikrer den påkrevde basalavlevering av insulin, mens det for pulmonal administrering er anbefalt flere daglige inhaleringer, fortrinnsvis i forbindelse med måltider.

Insulinderivatene har en forsinket virkningsstart og kan således kompensere for den svært hurtige økning i plasmainsulin som normalt er forbundet med pulmonal administrering. Ved for-siktig utvelgelse av insulintypen muliggjør foreliggende oppfinnelse regulering av timingen, og for å oppnå den ønskede insulinprofil.

Ved en bestemt utførelsesform av foreliggende oppfinnelse omfatter insulinpreparatet en insulinanalog av humaninsulin samt et insulinderivat.

De fenolholdige molekylene i insulinpreparatet er fortrinnsvis valgt fra gruppen bestående av fenol, m-cresol, klorcresol og tymol, eller hvilken som helst blanding derav.

Denne oppfinnelsen er ytterligere illustrert ved hjelp av de følgende eksempler.

Eksempel 1

2,5 ml av en 21 mM insulinstandardoppløsning ble laget ved å oppløse 337 mg sinkfritt humaninsulin i 1237 vann- og tilsette 263 pl 0,1 M ZnCl2 og 637 ul vann før regulering av pH med 38 ul 0,2 M NaOH, og til sist tilsette vann inntil 2,5 ml, idet det spesifikke volum av insulin beregnes som 0,7 ul/mg. Et preparat med 15 mM ble så laget ved å tilsette 350 ul 0,16 M m-cresol, 175 u.1 0,32 M fenol og salt eller detergent til konsentrasjonene vist i tabell 1, og deretter fortynnet ved hjelp av.medium til 12, 9, 6, 3 og 0,6 mM, og lagret ved 5 °C.

Eksempel 2

Sinkinsulin ble dispergert i vann {1:10) på isbad, tilsatt glysylglysin (7/15) ekvivalent og natriumhydroksid (3,1 ekvival-enter), og det ble omrørt sakte over natten ved 5 °C. 0,1 ekvivalent sinkklorid og detergent ble så til*satt, pH regulert til 7,5 ved hjelp av 0,8 ekvivalent saltsyre og volum regulert før tilsetning av fenol og vann, og til sist fortynning av 15 mM-preparatet med medium inneholdende natriumklorid, glysylglysin og detergent, hvorved det ble oppnådd 12, 9, 6 og 3 mM humaninsulin. (Tabell 2 og 3).

Resultatene er vist i de etterfølgende tabellene 1-3.

Dataene i tabell 1 viser at selv en liten mengde fosfat (f eks 5 mM) reduserer insulinets stabilitet, og utbytting av natriumklorid med trihydroksymetylaminometanhydroklorid er også tilbøyelig til å redusere oppløseligheten av insulin. I mot-setning til salter økte zwitterionene glysylglysin og glysin oppløseligheten av insulin, og det var mulig å tilsette uventet høye konsentrasjoner av zwitterionene glysylglysin og glysin uten å.ødelegge den stabiliserende effékfc-på-insulin. Glysylglysin virker som en buffer ved nøytral pH og øker dessuten-oppløsningshastigheten for sinkinsulin ved nøytral til basisk pH på grunn av en middels sinkchelaterende effekt. Glysylglysin kan også virke som et utrenskningsmiddel for aminreaksjoner under lagring. Tilsetning av de ikke-ioniske detergentene tween 20 og poloksamer 188 opptil 1 vekt% og 3 mM av den anioniske detergent natriumtaurocholat reduserte ikke stabiliteten ved 5 °C lagring.

En evaluering av effekten av et fenolholdige stoff tilsatt ekvimolart til insulin er vist i tabell 2. Tre av de fenol-holdige molekylene øker den fysiske stabilitet fra 6 til 15 mM insulin eller mer ved lav temperatur og reduserer dannelsen av polymerer ved forhøyet temperatur ved en faktor på 2-3 (ved lav kloridkonsentrasjon). Ved et annet sett av forsøk (tabell 3) varieres den relative mengde av fenol eller klorcresol fra 0 til 2 per insulin ved økende kjemisk stabilitet.

Eksempel 3

441 mg B29-N6- (N-litocholyl-y-glutamyl) -des (B30) - humaninsulin {143 nmol/mg) ble oppslemmet i 5 ml vann ved 0 °C og

220 al 1 N NaOH ble tilsatt. Etter oppløsning av insulinanalogen ble 295 ul 0,1 M ZnCl2 tilsatt og oppløsningen ble omrørt til en midlertidig utfelling ble oppløst. 315 ul 0,32 mM fenol og 98 ul 0,5 M glysylglysin og 70 ul 1 % tween 20 ble deretter tilsatt og pH målt til 7,60. Til sist ble 693 ul vann tilsatt og opp-løsningen ble sendt gjennom en steril 0,22 um Millex-GV-filter-enhet, hvorved man fikk 7 ml 9 mM B29-N<8->(N-litocholyl-y-glutamyl)-des (B30)-humaninsulin. Oppløsningen var fortsatt stabil etter 3 måneder ved 5 °C.

Claims

1. Vandig insulinpreparat, karakterisert ved at det omfatter: 6-15 mM av humaninsulin eller av en analog eller et derivat derav, mindre enn 50 mM klorid, mindre enn 10 mM av hvilke som helst andre anioner enn klorid og acetat, 2-5 Zn<2+->ioner per seks insulinmolekyler og minst 3 fenolholdige molekyler per seks insulinmolekyler; og at det har en pH-verdi i området 7-8,5, fortrinnsvis 7,4-7,9.

2. Insulinpreparat ifølge krav 1, karakterisert ved at det omfatter ca 6 mM, ca 9 mM, ca 12 mM eller ca 15 mM av humaninsulin eller av en analog eller et derivat derav.

3. Insulinpreparat ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det omfatter opp til 50' mM fenolholdige molekyler, fortrinnsvis 3-12 fenolholdige molekyler per seks insulinmolekyler, mer foretrukket 3-9 fenol-holdige molekyler per seks insulinmolekyler.

4. Insulinpreparat ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, karakterisert ved at det omfatter mindre enn 40 mM, fortrinnsvis mindre enn 30 mM klorid, mer foretrukket 5-20 mM klorid.

5. Insulinpreparat ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, karakterisert ved at det omfatter opp til 5 mM fosfat.

6. Insulinpreparat ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, karakterisert ved at det omfatter 2-4 Zn<2+->ioner, fortrinnsvis 2,2-3,2 Zn<2+->ioner per seks insulinmolekyler.

7. Insulinpreparat ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, karakterisert ved at det videre omfatter 5-150 mM av et zwitterionisk amin, fortrinnsvis glysylglysin eller glysin.

8. * Insulinpreparat ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, karakterisert ved at det videre omfatter 5-50 mM trishydroksymetylaminometan.

9. Insulinpreparat ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, karakterisert ved at det omfatter natriumioner, kaliumioner eller en blanding derav, som kationer.

10. Insulinpreparat ifølge hvilket som helst.av de forutgående krav, karakterisert ved at det videre omfatter mellom 0,001 vekt% og 1 vekt% av et ikke-ionisk overflateaktivt middel, fortrinnsvis tween 20 aller Polox 188.

11. Insulinpreparat ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, karakterisert ved at det videre omfatter 1 mM til 10 mM av et anionisk overflateaktivt middel, fortrinnsvis natriumtaurocholat.

12. Insulinpreparat ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, karakterisert ved at det omfatter humaninsulin.

13. Insulinpreparat ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, karakterisert ved at det omfatter en analog av humaninsulin hvor B28-stillingen er Asp, Lys, Leu, Val eller Ala og B29-stillingen er Lys eller Pro, eller des(B28-B30) des(B27)- eller des(B30)-humaninsulin.

14. Insulinpreparat ifølge krav 13, karakterisert ved at det omfatter en analog av humaninsulin hvor B(28)-stillingen er Asp eller Lys, og B29-stillingen er Lys eller Pro, fortrinnsvis AspB2<8->humaninsulin eller LysB28Pro<B29->humaninsulin.

15. Insulinpreparat ifølge hvilket som helst av kravene 1-11, karakterisert ved at det omfatter et derivat av humaninsulin som har én eller flere lipofile substituenter, fortrinnsvis et acylert insulin.

16. Insulinpreparat ifølge krav 15, karakterisert ved at insulinderivatet er valgt fra gruppen bestående av B29-N8-myristoyl-des (B30)-humaninsulin, B29-Ne-palmitoyl-des (B30) -humaninsulin, B29-Ne-myristoyl-humaninsulin, B29-Ne<->palmitoyl-humaninsulin, B28-Ne<->myristoyl-LysB2<8>Pro<B29->humaninsulin, B28-N<8->palmitoyl-Lys<B28>Pro<B>29-humaninsulin, B30-N<8->myristoyl-ThrB29Lys<B30->humaninsulin, B30-N<8->pal-mitoyl-ThrB29LysB30-humaninsulin, B29-N<8-> (N-palmitoyl-Y-glutamyl)-des (B30) -humaninsulin, B29-N8- (N-litocholyl^y-glutamyl) -des (B30)-humaninsulin, B29-N<8->(©-karboksyheptadekanoyl)-des(B30)-humaninsulin og B29-N<8->{©-karboksyheptadekanoyl)-humaninsulin.

17. Insulinpreparat ifølge krav 16, karakterisert ved at insulinderivatet er B29-Ns<->myristoyl-des(B30)-humaninsulin eller B29-N<8>(N-litocholyl-y-glutamyl)-des{B30)-humaninsulin.

18. Insulinpreparat ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, karakterisert ved at det omfatter en insulinanalog av humaninsulin samt et insulinderivat.

19. Insulinpreparat ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, karakterisert ved at de fenolholdige molekyler er valgt fra gruppen bestående av fenol, m-cresol, klorcresol og tymol, eller en hvilken som helst blanding derav.