DE69826705T2

DE69826705T2 - Verfahren zur dermalen verabreichung von polypeptiden

Info

Publication number: DE69826705T2
Application number: DE69826705T
Authority: DE
Inventors: Ka Iris LEUNG
Original assignee: Alza Corp
Current assignee: Alza Corp
Priority date: 1997-11-12
Filing date: 1998-11-03
Publication date: 2006-02-23
Anticipated expiration: 2018-11-04
Also published as: EP1030688B1; DE69816325T2; WO1999024015A1; AU1302499A; EP1028706A1; JP2001522815A; CA2309818A1; JP2001522793A; EP1030688A1; ES2202910T3; EP1028706B1; CA2309818C; CA2309955A1; DE69826705D1; AU1375199A; US20020058608A1; WO1999024071A1; US20070078096A1; DE69816325D1; ES2230727T3

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die transdermale Verabreichung von Wirkstoffen. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Verminderung der Selbstassoziation von Polypeptiden zur Unterstützung deren transdermaler Verabreichung.
Hintergrund der Erfindung
Die transdermale (d.h. durch die Haut erfolgende) Verabreichung therapeutischer Mittel bietet ein bequemes, zweckmäßiges und nicht-invasives Verfahren zur Verabreichung von Wirkstoffen. Das Verfahren weist mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Arten der Wirkstoffverabreichung auf. Zum Beispiel werden die bei oraler Behandlung auftretenden unterschiedlichen Geschwindigkeiten von Absorption und (z.B. hepatischem) Metabolismus vermieden und andere inhärente Nachteile – z. B. gastrointestinale Irritationen. und dergleichen – werden unterdrückt. Die transdermale Verabreichung ermöglicht auch einen hohen Grad an Kontrolle der Blutkonzentrationen eines bestimmten Wirkstoffes und ist ein besonders attraktiver Verabreichungsweg für Wirkstoffe mit einem engen therapeutischen Index, kurzer Halbwertszeit und starker Wirksamkeit.
Die transdermale Verabreichung kann entweder passiv oder aktiv sein. Viele Wirkstoffe sind jedoch aufgrund ihrer Größe, ionischen Ladungscharakteristika und Hydrophobie nicht für die passive transdermale Wirkstoffverabreichung geeignet. Ein Verfahren zur Überwindung dieser Beschränkung besteht in der Anwendung geringer elektrischer Stromstärke, um Wirkstoffe aktiv durch die intakte Haut in den Körper zu transportieren. Dieses Verfahren ist bekannt als Wirkstoffverabreichung mittels „Elektrotransport" bzw. „Iontophorese". Die Methode ermöglicht ein besser kontrollierbares Verfahren als bei passiver transdermaler Wirkstoffverabreichung, da die Amplitude, der Zeitrahmen und die Polarität des angewendeten elektrischen Stroms unter Verwendung elektrischer Standardkomponenten leicht zu regulieren ist. Diesbezüglich kann der iontophoretische Wirkstofffluss von 50% bis zu mehreren Größenordnungen größer sein als der passive transdermale Fluss desselben Wirkstoffes.
Iontophoretische Vorrichtungen verwenden im Allgemeinen wenigstens zwei Elektroden. Diese Elektroden sind beide so angeordnet, dass sie in engem elektrischen Kontakt mit einem Teil der Haut des Körpers stehen. Eine Elektrode, genannt die aktive oder Donor-Elektrode, ist die Elektrode, von der das therapeutische Mittel in den Körper verabreicht wird. Die andere Elektrode, genannt die Gegen- oder Rückelektrode, dient zum Schließen des elektrischen Stromkreises durch den Körper. In Verbindung mit der Haut des Patienten wird der Stromkreis durch Verbindung der Elektroden mit einer elektrischen Spannungsquelle, z. B. einer Batterie, und im Allgemeinen mit einer Steuerungsvorrichtung, die eine Kontrolle des durch die Vorrichtung fließenden Stroms ermöglicht, vervollständigt.
In Abhängigkeit von der elektrischen Ladung des transdermal zu verabreichenden Mittels kann entweder die Anode oder die Kathode die aktive oder Donorelektrode sein. Wenn die in den Körper abzugebende ionische Substanz positiv geladen ist, stellt die positive Elektrode (die Anode) somit die aktive Elektrode dar und die negative Elektrode (die Kathode) dient als den Stromkreis vervollständigende Gegenelektrode. Wenn die zu verabreichende ionische Substanz hingegen negativ geladen ist, stellt die kathodische Elektrode die aktive Elektrode dar und die anodische Elektrode die Gegenelektrode. Alternativ können sowohl die Anode als auch die Kathode verwendet werden, um Wirkstoffe entsprechender Ladung in den Körper zu verabreichen. In diesem Fall werden beide Elektroden als aktive oder Donorelektroden angesehen. Mit anderen Worten, die anodische Elektrode kann positiv geladene Mittel in den Körper verabreichen, während die kathodische Elektrode negativ geladene Mittel in den Körper verabreichen kann.
Vorhandene iontophoretische Vorrichtungen erfordern zusätzlich ein Reservoir oder eine Quelle des therapeutisch wirksamen Mittels, das in den Körper verabreicht werden soll. Solche Wirkstoffreservoire sind an die Anode oder die Kathode der iontophoretischen Vorrichtung angeschlossen, wodurch eine festgelegte oder erneuerbare Quelle eines oder mehrerer gewünschter Mittel oder Wirkstoffe zur Verfügung steht. Beispiele von Reservoiren und Quellen sind Beutel, wie in US-Patent Nr. 4,250,878 von Jacobsen beschrieben; vorgeformte Gelkörper, wie in US-Patent Nr. 4,382,529 von Webster beschrieben; und Glas- oder Plastikbehälter, enthaltend eine flüssige Lösung des Wirkstoffes, wie in den Abbildungen des US-Patents Nr. 4,722,726 von Sanderson et al. beschrieben.
Von besonderem Interesse ist hier die transdermale Verabreichung von Peptiden, Polypeptiden und Proteinen wegen der Probleme, die bei üblicheren Verabreichungswegen von Wirkstoffen, wie etwa oraler Verabreichung, auftreten. Polypeptid- und Proteinmoleküle sind hochgradig anfällig für den Abbau durch proteolytische Enzyme im Gastrointestinaltrakt und unterliegen bei oraler Aufnahme einem erheblichen hepatischen Metabolismus. Gewöhnlich machen diese Substanzen daher eine parenterale Verabreichung erforderlich, um therapeutische Spiegel im Blut des Patienten zu erreichen. Die gebräuchlichsten parenteralen Verbreichungsverfahren sind subkutane Injektionen und intravenöse Verabreichung. Polypeptide und Proteine weisen jedoch inhärent eine kurze biologische Aktivität auf, sodass häufige Injektionen, oft mehrmals pro Tag, erforderlich sind, um die notwendigen therapeutisch wirksamen Spiegel aufrecht zu erhalten. Für Patienten ist diese Behandlungsweise häufig unzweckmäßig und schmerzhaft. Eine solche Therapie beinhaltet auch das Risiko z.B. von Infektionen.
Es wurden viele Anstrengungen unternommen, um andere Wege (andere als parenterale Injektionen) zur effektiven Verabreichung pharmazeutischer Polypeptide und Proteine aufzufinden. Verabreichungswege mit weniger Nebenwirkungen sowie besserer Akzeptanz beim Patienten sind dabei von besonderem Interesse. Solche alternativen Wege umfassten allgemein „abgeschirmte" orale Verbreichung, bei der das Polypeptid/Protein aus einer Kapsel oder einem anderen Behältnis freigesetzt wird, nachdem es die Umgebung mit niedrigem pH des Magens passiert hat; Verabreichung durch die Schleimhäute, z.B. durch die Lungenschleimhäute mit Inhalatoren oder die Nasenschleimhäute mit Nasensprays; und implantierbare Pumpen. Leider zeigten diese alternativen Wege der Polypeptid-/Proteinverabreichung nur begrenzten Erfolg.
Eine Reihe von Forschern haben die iontophoretische Verabreichung von Polypeptiden und Proteinen beschrieben. Eine frühe Studie von R. Burnette et al., J. Pharm. Sci. (1986) 75:738, betrifft die in vitro-Durchdringung von Haut durch das Thyreotropin-Releasing-Hormon, ein kleines Tripeptidmolekül. Es wurde gefunden, dass der iontophoretische Fluss größer war als der passive Fluss durch Diffusion. Chien et al., J. Pharm. Sci. (1988) 78:376 zeigten sowohl in in vitro- als auch in in vivo-Studien, dass die transdermale Verabreichung von Vasopressin und Insulin durch Iontophorese möglich ist. Siehe dazu auch Maulding et al., statuarische US- Erfindungsregistrierung („Statutory Invention Registration") Nr. H1160, die die iontophoretische Verabreichung von Calcitonin in Minischweinen beschreibt.
Die iontophoretische Verabreichung von Polypeptiden und Proteinen traf jedoch auch auf technische Schwierigkeiten. Beispielweise können aufgrund der Hydrolyse von Wasser an der Grenzfläche zwischen der Elektrode und der Wirkstofflösung oder der Elektrolytsalzlösung Hautreizungen auftreten. Die Produkte dieser Hydrolyse, Wasserstoffionen an der Anode und Hydroxidionen an der Kathode, konkurrieren mit Wirkstoffionen gleicher Ladung um die Verabreichung in die Haut, wodurch der pH der Haut verändert und eine Reizung verursacht wird. Das US-Patent Nr. 5,533,971 von Phipps et al. beschreibt dieses Problem genauer und berichtet über die Verwendung von Aminosäurepuffern, einschließlich Histidinpuffern, zur Verminderung von Hautreizungen.
Zusätzlich können bestimmte Polypeptide, insbesondere diejenigen, die dem behandelten Lebewesen nicht arteigen sind, Hautreaktionen verursachen, z.B. Sensibilisierung oder Reizung. Viele Polypeptide sind außerdem unbeständig und zersetzen sich rasch. Diesbezüglich beschreibt die WO 97/39768 eine gegen Deaminierung und Aggregation stabilisierte Formulierung, die Wachstumshormon, eine Aminosäure und ein nichtionisches Detergens enthält. Die EP-A-0909564 beschreibt in gleicher Weise eine eine Aminosäure-enthaltende Erythropoietinlösung, die eine lange Lagerfähigkeit aufweist. Ein alternatives Verfahren zur Lagerung ist in der US 5,880,856 beschrieben, worin getrocknete Proteine durch eine Reihe von Stabilisatoren stabilisiert werden. Auch die internationale Veröffentlichung WO 93/12812, veröffentlicht am 8. Juli 1993, beschreibt die Verwendung von Histidinpuffern zur chemischen Stabilisierung von Wachstumshormonformulierungen. Darüber hinaus aggregieren bestimmte Polypeptidwirkstoffe in wässriger Lösung schnell, was sowohl hinsichtlich der Verabreichung als auch der Löslichkeit Probleme verursachen kann.
Zum Beispiel hat Insulin in wässriger Lösung, in für pharmazeutische Zubereitungen relevanten Konzentrationen, eine Neigung zur Ausbildung von Dimeren, die wiederum zu Tetrameren, Hexameren, geschichteten Hexameren und anderen polymeren Sorten selbstassoziieren, bei einer gleichzeitigen Verringerung der Löslichkeit. Diese Aggregate können mechanische Teile von Vorrichtungen zur kontinuierlichen Verabreichung blockieren und sind schwierig, wenn überhaupt, transdermal zu verabreichen. Diese Neigung wird durch die Gegenwart von Metallionen wie Zink, das üblicherweise in Insulinzubereitungen zur Stabilisierung und Verlängerung der Aktivität des Insulins verwendet wird, verstärkt.
Es wurden Versuche unternommen, um die Selbstassoziation von Proteinen wie Insulin zu vermindern. Die US 4,371,523 beschreibt z.B. ein Verfahren zur Verminderung der Aggregation von Insulin in wässrigen Lösungen, die eine organische Verbindung mit wenigstens zwei Carbonsäureeinheiten und wenigstens einer Aminoeinheit oder einer davon abgeleiteten Einheit enthält. Zusätzlich berichten Ogiso et al. in Biol. Pharm. Bull. (1996) 19:1049-1054 über die Verwendung eines Gly-HCl-Puffers zur Förderung der Dissoziation von Insulinoligomeren aus Schweinen, bevor diese transdermal absorbiert werden. Bringer et al. berichten in Diabetes (1981) 30:83-85, dass die zwei Dicarbonsäuregruppen aufweisenden Aminosäuren Asp und Glu bei ihrem isoelektrischen pH die Aggregation von Insulin in Lösung vermindern. Die Experimentatoren erklären, dass ein saurer pH (3,5) notwendig scheint, um die Aggregation unter Verwendung dieser Aminosäuren zu verzögern. Insulin ist in Säure jedoch chemisch instabil. Das US-Patent Nr. 4,940,456 von Sibalis et al. beschreibt Insulinzusammensetzungen zum elektrolytischen transdermalen Transport, die Harnstoff, Propylharnstoff, Kaliumiodid, Natriumperchlorat oder Guanidinhydrochlorid als dissoziierende Mittel enthalten.
Es wurden auch Insulinanaloga entwickelt, die verminderte Neigungen zur Selbstassoziation aufweisen sollen. Zum Beispiel beschreibt US-Patent Nr. 5,164,366 von Balschmidt et al. Insulinanaloga mit Deletionen bestimmter Aminosäuren, wie etwa Phe^B24 oder Phe^B25. Die internationale Veröffentlichung WO 92/12999, veröffentlicht am 6. August 1992, beschreibt Humaninsulin-Analoga, bei denen ausgewählte Aminosäurereste durch Asp- und Glu-Reste substituiert wurden. EP 214,826 B1 , veröffentlicht am 18. März 1987, beschreibt Insulinanaloga mit Aminosäuresubstitutionen, insbesondere in der B9-B12-Region und den B26-B28-Positionen, wobei der für die natürliche Aminosäure substituierte Rest hydrophiler ist. Bevorzugte Aminosäuresubstitutionen umfassen Asp, Glu, Ser, Thr, His und Ile. Allerdings zeigen viele dieser Analoga verminderte biologische Aktivitäten.
Daher sind im Zusammenhang mit transdermaler Verabreichung alternative Verfahren zur Verminderung der Selbstassoziation von Polypeptidwirkstoffen wie Insulin wünschenswert.
Beschreibung der Erfindung
Folglich basiert die vorliegende Erfindung auf einem Verfahren zur Verhinderung der Selbstassoziation von Insulin und anderen bioaktiven Polypeptiden, das gleichzeitig die Solubilisierung solcher Moleküle unterstützt. Das Verfahren verwendet Histidinverbindungen und ermöglicht, auf Grund der Verminderung der Selbstassoziation, eine effizientere transdermale Verabreichung von Proteinen in therapeutisch wirksamen Mengen, wie etwa durch Iontophorese und passive transdermale Verabreichung.
Dementsprechend betrifft die Erfindung in einer Ausführungsform die Verwendung eines Polypeptids und einer Histidinverbindung in einer Menge, die zur Verminderung der Neigung des Polypeptids zur Selbstassoziation ausreicht, zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Verabreichung des Polypeptids durch die Haut mittels Iontophorese oder passiver transdermaler Verabreichung.
Bevorzugt handelt es sich bei der Histidinverbindung um L-Histidin oder L-Glycyl-histidin, und bei dem Polypeptid um eine Insulinverbindung mit oder ohne Zink, wie etwa eine zinkfreie Humaninsulinverbindung oder ein Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin-Analogon.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist auf eine wie zuvor definierte Verwendung gerichtet, bei der die Bildung von Hexameren und größeren Sorten von Humaninsulinverbindungen vermindert wird. Diese umfasst die Kombination der Insulinverbindung mit einer Histidinverbindung bei einem pH-Wert von etwa 7 bis etwa 8. Die Konzentration an Histidin beträgt wenigstens etwa 10 mM.
Noch eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, die zur Verabreichung durch eine Körperoberfläche mittels Iontophorese oder passiver transdermaler Verabreichung geeignet ist, enthaltend eine Insulinverbindung und eine Histidinverbindung in einer Menge, die ausreicht, um die Neigung der Insulinverbindung zur Selbstassoziation zu vermindern.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist auf eine Verwendung, wie zuvor definiert, zur Verabreichung einer Humaninsulinverbindung durch eine Körperoberfläche mittels Iontophorese gerichtet. Dies umfasst:

a) Bereitstellen einer Zusammensetzung, umfassend die Insulinverbindung und eine Histidinverbindung bei einem pH von etwa 7 bis etwa 8, worin die Konzentration der Histidinverbindung etwa 10 mmolar bis etwa 250 mmolar ist;
b) Verabreichen der Zusammensetzung durch die Körperoberfläche mittels Iontophorese.

Noch eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist auf eine Verwendung, wie zuvor definiert, zur Verabreichung einer Humaninsulinverbindung durch eine Körperoberfläche mittels passiver transdermaler Verabreichung gerichtet. Dies umfasst:

a) Bereitstellung einer Zusammensetzung, umfassend die Insulinverbindung und eine Histidinverbindung, worin die Histidinverbindung in der Zusammensetzung in einer Menge vorliegt, die ausreicht, um die Neigung des Insulins zur Selbstassoziation zu verringern; und
b) Verabreichen der Zusammensetzung durch die Körperoberfläche mittels passiver transdermaler Verabreichung.

Diese und weitere Ausführungen der vorliegenden Erfindung erschließen sich dem Fachmann im Lichte der vorliegenden Offenbarung ohne Weiteres.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Auswirkung der Erhöhung der Histidinkonzentration auf die Löslichkeit von Wildtyp-Humaninsulin mit zwei gebundenen Zink pro Hexamer bei pH 7,5.
2 ist eine schematische Ansicht einer repräsentativen Vorrichtung zur iontophoretischen Verabreichung von Wirkstoffen, die für die vorliegende Erfindung verwendet werden kann.
3 zeigt eine Querschnittsansicht einer repräsentativen Vorrichtung zur passiven transdermalen Wirkstoffverabreichung, die für die vorliegende Erfindung verwendet werden kann.
4 zeigt eine Querschnittsansicht einer alternativen Vorrichtung zur passiven transdermalen Wirkstoffverabreichung, die für die vorliegende Erfindung verwendet werden kann.
5 zeigt einen Graph, der die mittleren Molekulargewichte von zinkfreiem Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin als Funktion der Insulinkonzentration für die 240 mM Histidindaten aus Tabelle III in den Beispielen darstellt.
6 zeigt einen Graph, der die mittleren Molekulargewichte von zinkfreiem Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin als Funktion der Insulinkonzentration für die 0 mM Histidindaten aus Tabelle III in den Beispielen darstellt.
7 zeigt einen Graph, der die mittleren Molekulargewichte von zinkfreiem Wildtyp-Humaninsulin als Funktion der Insulinkonzentration für die 240 mM Histidindaten aus Tabelle IV in den Beispielen darstellt.
8 ist ein Graph, der die mittleren Molekulargewichte von zinkfreiem Wildtyp-Humaninsulin als Funktion der Insulinkonzentration für die 0 mM Histidindaten aus Tabelle IV in den Beispielen darstellt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Zur Durchführung der vorliegenden Erfindung werden, sofern nicht anders angegeben, herkömmliche Verfahren der Proteinchemie, Elektrochemie und Biochemie, die dem Fachwissen zugehören, verwendet. Solche Verfahren werden in der Literatur eingehend erläutert. Siehe z.B. T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc.; 1975); J.S. Newman, Electrochemical Systems (Prentice Hall, 1973); und A.J. Bard und L.R. Faulkner, Electrochemical Methods, Fundamentals and Applications (John Wiley & Sons, 1980).
Es wird darauf hingewiesen, dass entsprechend der Verwendung in dieser Beschreibung und den angehängten Ansprüchen die Singularformen "ein", "eine" und "der/die/das" die jeweilige Mehrzahl mit umfassen, sofern inhaltlich nicht ausdrücklich etwas anderes ausgesagt wird. Somit umfasst die Bezugnahme auf „ein Polypeptid" zum Beispiel eine Mischung von zwei oder mehreren Polypeptiden und dergleichen.

Die folgenden Aminosäureabkürzungen werden in diesem Text verwendet:

Alanin: Ala (A)	Arginin: Arg (R)
Aspargin: Asn (N)	Asparaginsäure: Asp (D)
Cystein: Cys (C)	Glutamin: Gln (Q)
Glutaminsäure: Glu (E)	Glycin: Gly (G)
Histidin: His (H)	Isoleucin: Ile (I)
Leucin: Leu (L)	Lysin: Lys (K)
Methionin: Met (M)	Phenylalanin: Phe (F)
Prolin: Pro (P)	Serin: Ser (S)
Threonin: Thr (T)	Tryptophan: Trp (W)

Tyrosin: Tyr (Y)

Valin: Val (V)

I. Definitionen
Bei der Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Ausdrücke verwendet, die wie unten stehend angegeben definiert sein sollen.
Die Ausdrücke „Polypeptid", „Polypeptidmittel" und „Polypeptidwirkstoff" werden hierin wechselseitig verwendet, um jedes bioaktive Polymer aus Aminosäureresten zu bezeichnen. Die Ausdrücke umfassen Peptide, Oligopeptide, Dimere, Multimere und dergleichen. Derartige Polypeptide können aus natürlichen Quellen stammen oder können synthetisiert oder rekombinant hergestellt werden. Die Ausdrücke umfassen auch nach der Expression vorgenommene Modifizierungen der Polypeptide, z.B. Glycosylierung, Acetylierung, Phosphorylierung, etc.
Ein Polypeptidwirkstoff oder -mittel, wie hierin definiert, besteht im Allgemeinen aus einer oder mehreren der oben aufgelisteten 20 natürlichen Aminosäuren und kann auch jedes der diversen bekannten Aminosäureanaloga umfassen, sowohl natürlich auftretende als auch synthetische Analoga, wie etwa, ohne darauf beschränkt zu sein, Homoisoleucin, 2-(Methylencyclopropyl)glycin, S-Methylcystein, S-(prop-1-enyl)cystein, Homoserin, Ornithin, Norleucin, Norvalin, Homoarginin, 3-(3-Carboxyphenyl)alanin, Cyclohexylalanin, Mimosin, Pipecolinsäure, 4-Methylglutaminsäure, Canavanin, 2,3-Diaminopropionsäure und dergleichen. Das Polypeptid kann auch in neutraler oder Salzformen vorliegen, z.B. Säureadditionssalzen (gebildet mit den freien Aminogruppen der analogen Polypeptide), die mit anorganischen Säuren, wie z.B. Salzsäure oder Phosphorsäuren, oder mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Weinsäure, Mandelsäure und dergleichen, gebildet werden. Aus freien Carboxylgruppen gebildete Salze können auch von anorganischen Basen, wie z.B. Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium- oder Eisen-III-Hydroxiden, und von organischen Basen, wie Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin und dergleichen, abstammen. Beispiele von Polypeptidmitteln zur Anwendung in der vorliegenden Erfindung sind weiter unten angegeben.
Der Ausdruck „Insulinverbindung" wie hierin verwendet bezieht sich auf eine Verbindung mit einer Molekülstruktur, die nativem Insulin oder Proinsulin ähnlich oder identisch ist, einschließlich eines Moleküls mit einer Tertiärkonformation ähnlich oder identisch der von nativem Insulin oder Proinsulin, die die Insulinaktivität beibehält, d.h. die Fähigkeit Blutglucosewerte zu regulieren. Solche Verbindungen können Aminosäureadditionen, -substitutionen und -deletionen, relativ zum nativen Molekül, umfassen, solange die Modifikationen die Insulinaktivität nicht zerstören. Beispiele von Insulinverbindungen mit Aminosäuresubstitutionen relativ zum nativen Insulin umfassen Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin und Asp^B28-Humaninsulin. Weiterhin kann für die erfindungsgemäßen Zwecke eine Insulinverbindung von jeder Säugetierquelle abstammen, wie von Menschen, Rind, Kaninchen, Pferd, Schaf, Schwein, Wal, etc. Die Insulinverbindung kann direkt aus der Bauchspeicheldrüse des Quellorganismus aufgereinigt werden oder kann rekombinant oder synthetisch hergestellt werden. Siehe z.B. J. Brange, Galenics of Insulin, The Physico-chemical and Pharmaceutical Aspects of Insulin and Insulin Preparations (Springer-Verlag) bezüglich verschiedener Verfahren, um Insulin zu erhalten.
Außerdem bezeichnet der hierin verwendete Ausdruck „Insulinverbindung" eine Insulinverbindung mit oder ohne assoziierte Metalle. In diesem Zusammenhang wurde gefunden, dass Metalle wie etwa Zink und Calcium die Aktivität von Insulin verlängern sowie die physikalische Stabilität des Moleküls erhöhen. Somit umfasst eine Insulinverbindung zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ohne Einschränkung metallfreies Insulin sowie Insulin in Verbindung mit einem geeigneten Metall, einschließlich, jedoch ohne darauf beschränkt zu sein, Insulin mit etwa 2 Zn²⁺-Molekülen pro Hexamer bis etwa 4 Zn²⁺-Molekülen pro Hexamer. Siehe z.B. US 4,476,118 bezüglich einer Beschreibung solcher Verbindungen sowie bezüglich Verfahren zu deren Herstellung. Weitere Beispiele von Insulinverbindungen zur Anwendung in der vorliegenden Erfindung werden unten ausführlicher beschrieben.
Der Ausdruck „Histidinverbindung", wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Aminosäure L-His sowie auf Aminosäureanaloga von L-His, die die Fähigkeit, die Oligomerbildung eines gegebenen Polypeptids, wie unten definiert, zu verringern. Solche Analoga umfassen ohne Einschränkung Dipeptide und Tripeptide, die His enthalten, wie etwa, ohne darauf beschränkt zu sein, His-Gly, Gly-His, Ala-His, 3-Methyl-His, 1-Methyl-His, Carnosin, His-Ser und His-Ala.
Eine Histidinverbindung „verringert die Oligomerbildung" eines gegebenen Polypeptids, wenn die Selbstassoziation des Polypeptids, die zu Oligomeren wie Tetrameren, Hexameren, geschichteten Hexameren und anderen Polymeren führt, aufgrund der Anwesenheit der Histidinverbindung entweder verzögert (z.B. die Oligomerbildung ist wenigstens teilweise verhindert) oder rückgängig gemacht wird (z.B. bereits aggregierte Polypeptide dissoziieren). Die Fähigkeit einer Histidinverbindung, Oligomerbildung zu verringern, kann bestimmt werden, indem man das Vorliegen oligomerer Spezies in Gegenwart und Abwesenheit der fraglichen Histidinverbindung ermittelt. Solche Bildung kann unter Verwendung der analytischen Ultrazentrifuge (siehe z.B. Modern Analytical Ultracentrifugation, Schuster und Laue, Hg. 1994, Birkhäuser; und Analytical Ultracentrifugation in Biochemistry and Polymer Science, Harding, Rowe und Horton, Hg., 1992, The Royal Society of Chemistry), wie Studien zu Sedimentationsgleichgewichten, wie in den Beispielen beschrieben, spektrophotometrische Bestimmungen (siehe z.B. Ogiso et al., Biol. Pharm. Bull. (1996) 19:1049-1054), Osmometrie, Gelfiltration und dergleichen bestimmt werden. Bezüglich einer Beschreibung solcher Verfahren siehe z.B. Valdes und Ackers, Methods in Enzymology, Band 61 (Enzyme Structure, Teil H, Hirs und Timasheff, Hg.) Academic Press, 1979, Seiten 125-142.
Der Ausdruck "passive transdermale Verabreichung" bezieht sich auf die Verabreichung durch eine Körperoberfläche (z.B. Haut) eines oder mehrerer pharmazeutisch aktiver Polypeptidmittel, so dass diese(s) zur Verteilung über die systemische Zirkulation verfügbar ist(sind), ohne Zuhilfenahme einer angewendeten elektromotorischen Kraft. Passive transdermale Verabreichung kann auf eine Reihe von Arten erreicht werden, einschließlich und ohne Einschränkung die direkte Anwendung auf der Haut, transdermale Pflaster, Membran-vermittelte Systeme zur kontrollierten Verabreichung, adhäsive Diffusions-kontrollierte Systeme, matrixdispersionsartige Systeme und Mikroreservoirsysteme. Solche Systeme sind im Fachgebiet bekannt und im Detail in Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 19. Auflage, 1995 diskutiert. Penetrationsverstärker können eingesetzt werden, um die Absorption durch die Haut zu erleichtern. Solche Penetrationsverstärker umfassen Lösungsmittel wie Wasser, Alkohole, einschließlich Methanol, Ethanol, 2-Propanol und dergleichen, Alkylmethylsulfoxide, Pyrrolidone, Laurocapram, Aceton, Dimethylacetamid, Dimethylformamid, Tetrahydrofurfuryl; oberflächenaktive Substanzen; und Chemikalien wie Harnstoff, N,N-Diethyl-m-toluolamid, und dergleichen.
Die hier verwendeten Ausdrücke „Elektrotransport", „Iontophorese" und „iontophoretisch" beziehen sich auf die Verabreichung durch eine Körperoberfläche (z.B. Haut) eines oder mehrerer pharmazeutisch wirksamer Polypeptidmittel durch Anwendung einer elektromotorischen Kraft auf ein Mittel-enthaltendes Reservoir. Das Mittel kann durch Elektromigration, Elektroporation, Elektroosmose oder beliebige Kombinationen davon verabreicht werden. Elektroosmose wurde auch als Elektrohydrokinese, Elektrokonvektion und elektrisch induzierte Osmose bezeichnet. Im Allgemeinen resultiert die Elektroosmose eines Mittels in ein Gewebe aus der auf der Anwendung einer elektromotorischen Kraft auf das Reservoir des therapeutischen Mittels beruhenden Migration des Lösemittels, in dem das Mittel enthalten ist, d. h. auf einem durch Elektromigration anderer ionischer Mittel induzierten Lösemittelfluss. Während des iontophoretischen Verfahrens können bestimmte Modifizierungen oder Änderungen der Haut auftreten, wie die Bildung vorübergehend existenter Poren in der Haut, was auch als „Elektroporation" bezeichnet wird. Der hier verwendete Ausdruck „Elektrotransport" umfasst jeglichen durch Modifizierungen oder Änderungen der Körperoberfläche (z. B. Bildung von Poren in der Haut) verstärkten elektrisch unterstützten Transport eines Mittels. Somit beziehen sich die hier verwendeten Ausdrücke „Elektrotransport", „Iontophorese" und „iontophoretisch" auf (1) die Verabreichung geladener Mittel durch Elektromigration, (2) die Verabreichung ungeladener Mittel durch das Verfahren der Elektroosmose, (3) die Verabreichung geladener oder ungeladener Mittel durch Elektroporation, (4) die Verabreichung geladener Mittel durch die kombinierten Verfahren von Elektromigration und Elektroosmose, und/oder (5) die Verabreichung einer Mischung geladener und ungeladener Mittel durch die kombinierten Verfahren von Elektromigration und Elektroosmose.
Ein Polypeptid zeigt „verstärkte Iontophorese", wenn der Iontophoresefluss des Polypeptids durch die Körperoberfläche (z.B. die Haut oder Schleimhaut) in Gegenwart einer Histidinverbindung im Vergleich zum Fluss in Abwesenheit der Histidinverbindung erhöht ist, bestimmt unter Verwendung von Standardmessverfahren. Der transdermale iontophoretische Fluss kann zum Beispiel durch eine Reihe im Fachgebiet gut bekannter in vivo- oder in vitro-Verfahren bestimmt werden. In vitro-Verfahren umfassen das Klemmen eines Hautstücks eines geeigneten Lebewesens (z.B. Haut eines menschlichen Leichnams) zwischen die Donor- und Rezeptorkammer einer Iontophoreseflusszelle, wobei die Seite des Hautstücks mit dem Stratum Corneum zur Donorkammer zeigt. Ein(e) den zu verbreichenden Wirkstoff enthaltende(s) flüssige Lösung oder Gel wird mit dem Stratum Corneum in Kontakt gebracht, und elektrischer Strom wird an die Elektroden angelegt, eine Elektrode in jeder Kammer. Der transdermale Fluss wird durch Messung der Wirkstoffmenge in jeder Rezeptorkammer berechnet. Zwei brauchbare Modelle, die zur Optimierung der transdermalen iontophoretischen Wirkstoffverabreichung verwendet werden, sind das isolierte-Schweinehautlappen-Modell von Riviere, Heit et al., J. Pharm. Sci. (1993) 82:240-243, und die Verwendung isolierter haarfreier Haut von haarfreien Nagetieren oder Meerschweinchen. Siehe Hadzija et al., J. Pharm. Pharmacol. (1992) 44:387-390. Siehe auch Ogiso et al., Biol. Pharm. Bull. (1996) 19:1049-1054, bezüglich einer Beschreibung eines Verfahrens zur Evaluation der transdermalen Absorption von Insulin.
II. Ausführungsformen der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Histidinverbindungen zur Verminderung der Selbstassoziation eines Polypeptidmoleküls, wodurch die transdermale Verabreichung des Polypeptidmoleküls im Vergleich zur Verabreichung des unbehandelten Polypeptids verbessert wird. Das Verfahren ermöglicht daher eine erhöhte Wirksamkeit der transdermalen Verabreichung einer großen Zahl von Substanzen und erlaubt die transdermale Verabreichung von Molekülen, die anderweitig für eine solche Verabreichung nicht zugänglich wären. Außerdem erhöht das Verfahren die Löslichkeit des so behandelten Polypeptidmittels und verringert das Potenzial für immunologische Reaktionen, die gegen Aggregate von an sich endogenen Substanzen auftreten können.
Die vorliegende Erfindung ist für eine große Breite von Proteinen und Polypeptidmitteln mit einer Neigung zur Aggregation einsetzbar, wie etwa für eine Reihe von Polypeptiden, die aus eukariotischen, prokariotischen und viralen Quellen stammen, sowie für synthetische Peptide. Solche Polypeptide umfassen ohne Einschränkung Peptidwirkstoffe, die Antibiotika und antivirale Mittel, Antineoplastika, Immunmodulatoren, Peptidhormone wie Insulin, Proinsulin, Wachstumshormon, GHRH, LHRH, EGF, Somatostatin, SNX-111, BNP, Insulinotropin, ANP, und Glycoproteinhormone wie FSH, LH, PSH und hCG darstellen.
Die vorliegende Erfindung wurde unter Verwendung von Insulin und Insulinanaloga beispielhaft veranschaulicht, ist jedoch nicht auf Insulinverbindungen beschränkt. Insulin wurde aufgrund seiner Neigung zur Selbstassoziation zu Hexameren und als „geschichtete Hexamere" bezeichneten polymeren Strukturen zur Veranschaulichung der Erfindung ausgewählt. Eine solche Assoziation inhibiert die transdermale Verabreichung des Polypeptids und kann Reizungen am Verabreichungsort verursachen.
Beispiele von Insulinverbindungen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen alle kommerziell erhältlichen Insuline, wie z.B. rekombinantes Humaninsulin von Sigma, St. Louis, MO, das als neutrale Lösungen oder Suspensionen von Zinkinsulin formuliert ist. Derartige Zubereitungen von Insulin enthalten mindestens zwei gebundene Zinkionen pro Hexamer und weisen eine Insulinkonzentration von etwa 0,2 bis etwa 3,0 mM (1 mg/ml bis 18 mg/ml) auf. Allerdings können hier auch Insulinzubereitungen mit höheren Konzentrationen an Insulin bis etwa 17 mM verwendet werden. Insulin, das frei von Metallen wie etwa Zink ist, kann ebenfalls in den vorliegenden Verfahren verwendet werden, die Konzentration kann im Bereich von etwa 0,1 bis 30 mM liegen. Insulinanaloga zur Verwendung als Insulinverbindung umfassen hier kommerziell erhältliche Humaninsulinanaloga wie ein Lys^B28- und Pro^B29-Insulin, das von Lilly (Indianapolis, IN) als Humalog^®-Insulin-lispro-Injektion erhältlich ist und das in den Beispielen weiter beschrieben ist; Insulinverbindungen, enthaltend Protamin wie NPH (Neutral Protamin Hagedorn) und Isophan-Insulin (erhältlich von verschiedenen Herstellern); und Lente und zweiphasige Insuline (erhältlich von verschiedenen Herstellern). Siehe z.B. Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 19. Auflage, 1995, bezüglich einer Beschreibung dieser und anderer Insulinverbindungen.
Weitere Insulinanaloga zur Verwendung hierin umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Analoga wie die von Marki et al., Z. Physiol. Chem. (1979), 360: 1619-1632, beschriebenen, die an den Aminosäurepositionen 2, 5, 6, 7, 8 und 11 der A-Kette und 5, 7, 13 und 16 der B-Kette substituiert sind; sulfatierte Insuline wie die von Albisser et al. in US Pharmacopeial Convention, Rockville, MD (Gueriguian et al., Hg.), Seiten 84-95 beschriebenen; Des-Phe-Insulin (wobei die N-terminate Aminosäure der B-Kette deletiert ist); Insulinanaloga mit zusätzlichen Deletionen bestimmter Aminosäuren, wie Deletion von Phe^B24 oder Phe^B25 (US-Patent 5,164,366 von Balschmidt et al.); Insulinanaloga mit Aminosäuresubstitution, insbesondere in der B9-B12-Region und den B26-B28-Positionen, wobei der für die natürliche Aminosäure substituierte Rest hydrophiler und im Allgemeinen Asp, Glu, Ser, Thr, His und Ile ist ( EP 214,826 B1 , veröffentlicht am 18. März 1987); Humaninsulinanaloga, bei denen ausgewählte Aminosäurereste durch Asp- und Glu-Reste substituiert sind (WO 92/12999, veröffentlicht am 6. August 1992) und dergleichen.
Histidinverbindungen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen L-His und Analoga davon, wie, ohne darauf beschränkt zu sein, His-enthaltende Dipeptide und Tripeptide, wie His-Gly, Gly-His, Ala-His, 3-Methyl-His, 1-Methyl-His, L-Carnosin (auch als β-Ala-His bekannt), His-Ser und His-Ala. Die Auswahl einer geeigneten Histidinverbindung liegt im Bereich des Fachwissens und ist weitgehend von dem jeweils fraglichen Polypeptid abhängig.
Die Histidinverbindung liegt allgemein bei ihrem isoelektrischen Punkt und in einer Konzentration von etwa 1 mM bis 330 mM, bevorzugt etwa 10 mM bis etwa 250 mM und besonders bevorzugt etwa 25 mM bis etwa 250 mM vor. Die optimale Histidinkonzentration hängt von einer Reihe von Faktoren ab, einschließlich Insulinkonzentration, Konzentration anderer Salze (z.B. NaCl), Anwesenheit oder Abwesenheit von Zink, Anwesenheit oder Abwesenheit von Konservierungsmitteln, Neigung des Polypeptids zur Oligomerbildung und dergleichen. Im Allgemeinen beträgt die Konzentration von Histidin wenigstens etwa 10 mM. Der Fachmann auf dem Gebiet der Proteinformulierung kann die optimale Histidinkonzentration für die in einer bestimmten Anwendung oder Zubereitung verwendeten spezifischen Variablen (z.B. Insulinkonzentration, Salzkonzentration, Anwesenheit oder Abwesenheit von Zink, Konservierungsmittel oder keine Konservierungsmittel) leicht bestimmen.
Das Polypeptid liegt in einer therapeutisch wirksamen Menge vor, d.h. in einer Menge, die ausreicht, um das gewünschte therapeutische Ergebnis zu erreichen. Die exakt benötigte Menge unterscheidet sich von Versuchsperson/-objekt zu Versuchsperson/-objekt in Abhängigkeit von Gattung, Alter und allgemeinem Zustand der/des Versuchsperson/-objekts, der Schwere des behandelten Krankheitszustands und des speziell interessierenden Polypeptidwirkstoffs. Therapeutisch wirksame Dosen kann der Fachmann leicht unter Verwendung von z.B. Standard-Dosis-Wirkungskurven und dergleichen bestimmen. Wenn das Polypeptid z.B. Insulin ist, liegt es normalerweise in einer Konzentration von etwa 0,1 bis etwa 30 mM, bevorzugt 0,2 bis etwa 20 mM und besonders bevorzugt etwa 0,3 bis etwa 17 mM vor, wobei die Konzentration von der speziell verwendeten Insulinverbindung abhängt und davon, ob das Molekül gebundenes Zink enthält.
Wenn L-His zusammen mit kommerziell erhältlichem Humaninsulin, das im Allgemeinen Insulin in Form von Hexameren und geschichteten Hexameren umfasst, verwendet wird, liegt das Insulin gewöhnlich in einer Konzentration von etwa 0,2 mM bis etwa 17 mM (1 mg/ml bis 100 mg/ml) und L-His in einer Konzentration von etwa 25 bis 250 mM vor. Der Fachmann kann ohne Weiteres die geeignete Menge von Insulin und L-His zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren bestimmen.
Polypeptidwirkstoffe zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung können negativ geladen, positiv geladen oder neutral sein, wobei die Auswahl neben anderen Faktoren von der speziell verwendeten Histidinverbindung sowie von dem gewünschten pH abhängt. Die Bestimmung dieser Parameter gehört zum Fachwissen. Wenn z.B. L-His als Histidinverbindung verwendet wird und der ph-Wert der Zusammensetzung 7 bis 8 beträgt, so ist die Insulinverbindung negativ geladen.
Der pH der endgültigen Lösung beträgt im Allgemeinen etwa pH 6 bis pH 8,5, bevorzugt pH 7 bis etwa pH 8. Der pH der Lösung kann jedoch wiederum in Abhängigkeit von dem im Verfahren verwendeten speziellen Polypeptid und der Histidinverbindung variieren.
Die Polypeptid- und Histidinverbindungen liegen im Allgemein in pharmazeutisch verträglichen Exzipienten vor, wie Wasser, Kochsalzlösung, wässrige Dextrose, Glycerol, Ethanol und dergleichen, sodass sich eine Lösung oder Suspension bildet. Die zu verabreichende pharmazeutische Zusammensetzung kann gegebenenfalls auch geringe Mengen nichttoxischer Hilfsstoffe enthalten, wie Feuchthalte- oder Emulgiermittel, Konservierungsstoffe, pH-Puffer und dergleichen, z.B. Natriumacetat, Sorbitanmonolaurat, Triethanolamin-Natriumacetat, Triethanolamin-Oleat, etc. Die Auswahl geeigneter Exzipienten und Additive bestimmt sich maßgeblich nach den verwendeten Polypeptid- und Histidinverbindungen. Bezüglich einer Darstellung von Polypeptidzubereitungen siehe z.B. Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 19. Auflage, 1995.
Für Insulinzubereitungen umfassen solche Substanzen ohne Einschränkung Konservierungsstoffe wie Methylparaben und Phenol (m-Cresol), isotonische Mittel wie Glycerol oder Salze, einschließlich, jedoch ohne darauf beschränkt zu sein, NaCl (im Allgemeinen in einer Konzentration von etwa 1 bis etwa 100 mM NaCl); und andere Additive und Puffer wie Natriumacetat, Na₃PO₄, und dergleichen. Bezüglich einer Darstellung von Insulinzubereitungen siehe z.B. Brange, J., Stability of Insulin (Kluwer Academic Publishers); J. Brange, Galenics of Insulin, The Physico-chemical and Pharmaceutical Aspects of Insulin and Insulin Perparations (Springer-Verlag); und Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 19. Auflage, 1995.
Sobald die gewünschte Polypeptidzubereitung mit Histidin hergestellt ist, kann sie dem Lebewesen unter Verwendung verschiedener Systeme zur transdermalen Wirkstoffverabreichung verabreicht werden, wobei die Verabreichung nicht auf die Verwendung eines bestimmten Systems beschränkt ist. Beispiele von Systemen zur iontophoretischen Wirkstoffverabreichung sind z.B. in den US-Patenten Nr. 5,312,326 von Myers et al.; 5,080,646 von Theeuwes et al.; 5,387,189 von Gyory et al. und 5,169,383 von Gyory et al. beschrieben, auf deren Offenbarung hier in Gänze Bezug genommen wird.
2 veranschaulicht eine repräsentative Vorrichtung zur iontophoretischen Verabreichung, die in Verbindung mit dem vorliegenden Verfahren eingesetzt werden kann. Die Vorrichtung 10 umfasst ein oberes Gehäuse 16, eine Leiterplatte 18, ein unteres Gehäuse 20, Anodenelektrode 22, Kathodenelektrode 24, Anodenreservoir 26, Kathodenreservoir 28 und einen hautverträglichen Klebestreifen 30. Das obere Gehäuse 16 weist laterale Flügel 15 auf, die dazu beitragen, die Vorrichtung 10 auf der Haut eines Patienten zu halten. Das obere Gehäuse 16 besteht bevorzugt aus einem spritzgießbaren Elastomer (zum Beispiel Ethylenvinylacetat). Die bestückte Leiterplatte 18 umfasst einen integrierten Schaltkreis 19, der an die einzelnen Komponenten 40 und Batterie 32 angeschlossen ist. Die Leiterplatte 18 ist mittels durch die Öffnungen 13a und 13b geführter Stege (in 2 nicht gezeigt) mit dem Gehäuse 16 verbunden, wobei die Enden der Stege erhitzt/geschmolzen werden, um die Leiterplatte 18 durch die Hitzeeinwirkung am Gehäuse 16 zu befestigen. Das untere Gehäuse 20 ist mit dem oberen Gehäuse 16 mittels des Klebestreifens 30 verbunden, wobei die obere Oberfläche 34 des Klebestreifens 30 sowohl an dem unteren Gehäuse 20 als auch an dem oberen Gehäuse 16 einschließlich der Unterseiten der Flügel 15 haftet.
Auf der Unterseite der Leiterplatte 18 ist (teilweise) eine Knopfzellbatterie 32 gezeigt. Andere Arten von Batterien können zum Betrieb der Vorrichtung 10 ebenfalls verwendet werden.
Die Vorrichtung 10 umfasst im Allgemeinen eine Batterie 32, elektronische Steuerungsvorrichtungen 19, 40, Elektroden 22, 24 und Wirkstoff-/chemische Reservoire 26, 28, die alle in einer abgeschlossenen Einheit integriert sind. Die Schaltkreisausgänge (nicht gezeigt in 2) der Leiterplatte 18 stehen mittels elektrisch leitender Klebestreifen 42, 42' durch Öffnungen 23, 23' in den im unteren Gehäuse 20 ausgebildeten Vertiefungen 25, 25' in elektrischem Kontakt mit den Elektroden 24 und 22. Die Elektroden 22 und 24 stehen wiederum in direktem mechanischen und elektrischen Kontakt mit den Oberseiten 44', 44 der Wirkstoffreservoire 26 und 28. Die Unterseiten 46', 46 der Wirkstoffreservoire 26, 28 stehen durch die Öffnungen 29', 29 im Klebestreifen 30 mit der Haut des Patienten in Kontakt.
Die Vorrichtung 10 ist gegebenenfalls so ausgelegt, dass der Patient sich eine Dosis des Wirkstoffes mittels Elektrotransport selbst verabreichen kann. Durch Drücken des Druckknopfschalters 12 liefert die elektronische Schaltungstechnik auf der Leiterplatte 18 einen voreingestellten DC-Strom während eines Abgabeintervalls von voreingestellter Länge an die Elektroden/Reservoire 22, 26 und 24, 28. Der Druckknopfschalter 12 ist geeigneterweise auf der Oberseite der Vorrichtung 10 angebracht und lässt sich leicht durch die Kleidung betätigen. Zur Inbetriebnahme der Vorrichtung zur Wirkstoffabgabe wird bevorzugt ein doppeltes Drücken des Druckknopfschalters 12 innerhalb einer kurzen Zeitdauer, z.B. 3 Sekunden, verwendet, wodurch die Wahrscheinlichkeit einer unbeabsichtigten Inbetriebnahme der Vorrichtung 10 minimiert wird. Vorzugsweise übermittelt die Vorrichtung dem Benutzer eine visuelle und/oder akustische Bestätigung für den Beginn des Wirkstoffabgabeintervalls, indem eine LED 14 aufleuchtet und/oder ein akustisches Tonsignal von z.B. einem „Pieper" ertönt. Der Wirkstoff wird über die Haut des Patienten mittels Iontophorese, z.B. auf dem Arm, während des vorbestimmten Abgabeintervalls abgegeben.
Die anodische Elektrode 22 umfasst bevorzugt Silber und die kathodische Gegenelektrode 24 umfasst bevorzugt Silberchlorid. Beide Reservoire 26 und 28 umfassen bevorzugt Polymerhydrogelmaterialien. Die Elektroden 22, 24 und die Reservoire 26, 28 werden in den Vertiefungen 25', 25 im unteren Gehäuse 20 gehalten.
Der Druckknopfschalter 12, die elektronische Schaltungstechnik auf der Leiterplatte 18 und die Batterie 32 sind zwischen dem oberen Gehäuse 16 und dem unteren Gehäuse 20 klebend „versiegelt". Das obere Gehäuse 16 besteht bevorzugt aus Gummi oder einem anderen elastomeren Material. Das untere Gehäuse 20 besteht bevorzugt aus einem Kunststoff oder elastomeren bahnförmigen Material (z.B. Polyethylen), das leicht geformt werden kann, um Vertiefungen 25, 25' auszubilden, und leicht geschnitten werden kann, um Öffnungen 23, 23' auszubilden. Die zusammengesetzte Vorrichtung 10 ist vorzugsweise wasserresistent (d.h. spritzwassergeschützt) und ganz besonders bevorzugt wasserdicht. Das System besitzt einen flachen Querschnitt, der sich leicht an den Körper anpasst, wodurch Bewegungsfreiheit am und um den Trageort gewährleistet wird. Die Reservoire 26 und 28 sind auf der Haut-kontaktierenden Seite der Vorrichtung 10 angebracht und ausreichend voneinander getrennt, um ein versehentliches elektrisches Kurzschließen während der normalen Handhabung und Verwendung zu verhindern.
Die Vorrichtung 10 haftet mittels des peripheren Klebestreifens 30, der eine obere Seite 34 und eine Körper-kontaktierende Seite 36 aufweist, an der Körperoberfläche (z.B. Haut) des Patienten. Die anhaftende Seite 36 besitzt Hafteigenschaften, die gewährleisten, dass die Vorrichtung 10 während der normalen Benutzertätigkeit an Ort und Stelle auf dem Körper bleibt, und die dennoch eine angemessene Entfernung nach der vorbestimmten (z.B. 24 Stunden) Tragedauer gestatten. Die obere klebende Seite 34 haftet am unteren Gehäuse 20 und sorgt für eine Verbindung des unteren Gehäuses 20 mit dem oberen Gehäuse 16.
Die Reservoire 26 und 28 umfassen im Allgemeinen eine Gelmatrix, wobei die Wirkstofflösung gleichförmig in wenigstens einem der Reservoire 26 und 28 dispergiert ist. Es können Wirkstoffkonzentrationen im Bereich von etwa 1 × 10^-4 M bis 1,0 M oder mehr verwendet werden, wobei Wirkstoffkonzentrationen im unteren Teil des Bereiches bevorzugt sind. Geeignete Polymere für die Gelmatrix können im Wesentlichen alle nichtionischen synthetischen und/oder natürlich vorkommenden polymeren Materialien sein. Polare Eigenschaften sind bevorzugt, wenn das aktive Mittel polar und/oder zur Ionisierung befähigt ist, sodass die Löslichkeit des Mittels erhöht wird. Gegebenenfalls ist die Gelmatrix wasserquellbar. Beispiele geeigneter synthetischer Polymere umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Polyacrylamid, Poly(2-hydroxyethylacrylat), Poly(2-hydroxypropylacrylat), Poly(N-vinyl-2-pyrrolidon), Poly(N-methylolacrylamid), Poly(diacetonacrylamid), Poly(2-hydroxyethylmethacrylat), Polyvinylalkohol und Polyallylalkohol. Hydroxyfunktionelle kondensierte Polymere (d.h. Polyester, Polycarbonate, Polyurethane) sind ebenfalls Beispiele geeigneter polarer synthetischer Polymere. Zur Verwendung als Gelmatrix geeignete polare natürlich vorkommende Polymere (oder Derivate davon) sind beispielsweise Celluloseether, Methylcelluloseether, Cellulose und hydroxylierte Cellulose, Methylcellulose und hydroxylierte Methylcellulose, Gummis wie etwa Guarkernmehl, Johannisbrot(kernmehl), Karayagummi, Xanthangummi, Gelatine und Derivate davon. Ionische Polymere können ebenfalls für die Matrix verwendet werden, vorausgesetzt, die verfügbaren Gegenionen sind entweder Wirkstoffionen oder andere Ionen, die relativ zum aktiven Mittel entgegengesetzt geladen sind.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Polypeptid/Histidin-Zubereitungen werden somit in das Wirkstoffreservoir eingebracht, z.B. eine Gelmatrix wie soeben beschrieben, und einem Patienten unter Verwendung eines Systems zur iontophoretischen Wirkstoffverabreichung, gegebenenfalls wie oben beispielhaft dargestellt, verabreicht. Das Einbringen der Wirkstofflösung kann auf eine Reihe von Arten erfolgen, z.B. durch Aufsaugen der Lösung in die Reservoirmatrix, durch Vermischen der Wirkstofflösung mit dem Matrixmaterial vor Bildung des Hydrogels, oder dergleichen.
In anderen erfindungsgemäßen Ausführungsformen kann passive transdermale Verabreichung zur Verabreichung der Polypeptid/Histidin-Zubereitungen verwendet werden. Der Fachmann erkennt, dass die vorliegende Erfindung in Verbindung mit einer großen Breite passiver transdermaler Systeme verwendet werden kann, da die Erfindung in dieser Hinsicht nicht beschränkt ist. Für Beispiele passiver Systeme kann, ohne darauf beschränkt zu sein, Bezug auf die US-Patente Nr. 4,379,454 von Campbell et al.; 4,588,580 von Gale et al.; 4,832,953 von Campbell et al.; 4,698,062 von Gale et al.; 4,867,982 von Campbell et al. und 5,268,209 von Hunt et al. genommen werden, wobei jedes der dort beschriebenen Systeme in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden kann. Zwei Beispiele von Vorrichtungen zur passiven transdermalen Verabreichung sind in den 3 und 4 dargestellt.
In 3 umfasst die Vorrichtung zur passiven transdermalen Verabreichung 88 ein Reservoir 90, das die transdermal zu verabreichende Zubereitung enthält. Das Reservoir 90 liegt bevorzugt in Form einer Matrix vor, die die Zubereitung darin dispergiert enthält. Das Reservoir 90 befindet sich sandwichartig zwischen einer Rückschicht 92, die für das Mittel undurchlässig ist, und einer optionalen Membran zur Geschwindigkeitskontrolle 94. In 3 ist das Reservoir 90 aus einem Material wie etwa einem Polymer gebildet, das ausreichend viskos ist, um seine Form beizubehalten. Wenn ein Material geringerer Viskosität für das Reservoir 90 verwendet wird, wie ein wässriges Gel, dichtet man die Rückschicht 92 und die Membran zur Geschwindigkeitskontrolle 94 in ihren Randbereichen zur Vermeidung von Leckage zusammen ab. Unter der Membran 94 befindet sich die Einheit 2 zur Durchbohrung der Haut, die auf einer zur Haut zeigenden Oberfläche davon ein verbindendes Mittel 65 aufweist, das sich durch die Öffnungen (nicht gezeigt) in der Einheit 2 erstreckt, um die Membran 94 zu kontaktieren. Die Vorrichtung 88 haftet mittels der Kontaktklebefläche 96 um die Randbereiche der Einheit 2 und gegebenenfalls mittels eines der Verankerungselemente der zuvor beschriebenen Ausführungsformen auf einer Körperoberfläche. Anfangs wird die verbindende Einheit 65 in den meisten Fällen aktives Mittel enthalten. Normalerweise wird eine abziehbare Freisetzungsabdeckung (nicht gezeigt) entlang der freiliegenden Oberfläche der Klebeschicht 96 aufgebracht und vor Anwendung der Vorrichtung 10 auf der Körperoberfläche entfernt.
Wie in der vergrößerten 4 gezeigt, kann die transdermale therapeutische Vorrichtung 98 alternativ mittels einer flexiblen klebenden Auflage 100 mit der Körperoberfläche verbunden werden. Die Vorrichtung 98 besteht aus einem Mittel-enthaltendem Reservoir 90, das vorzugsweise in Form einer Matrix vorliegt, die das darin dispergierte Mittel enthält. Die verbindende Einheit 65 erstreckt sich durch die Öffnungen 8, um das Reservoir 90 zu kontaktieren. Alternativ kann die Matrix im Reservoir 90 sich durch die Öffnungen 8 erstrecken, um anfangs in Kontakt mit dem verbindenden Mittel 65 zu stehen, oder das Reservoir und das verbindende Mittel können gleich sein. Eine undurchlässige Rückschicht 102 schließt an eine Oberfläche des Reservoirs 90 an. Die klebende Auflage 100 hält die Vorrichtung auf der Körperoberfläche. Die klebende Auflage 100 kann zusammen mit den übrigen Elementen der Vorrichtung 98 hergestellt werden oder separat davon bereitgestellt werden. Für bestimmte Zubereitungen kann die klebende Auflage 100 dem in 3 gezeigten Kontaktkleber 96 bevorzugt sein. Dies trifft beispielsweise zu, wenn das Reservoir für das Mittel ein Material enthält (wie z.B. eine ölige oberflächenaktive Substanz), das die klebrigen Eigenschaften der Kontaktklebeschicht 96 negativ beeinflusst. Die undurchlässige Rückschicht 102 ist vorzugsweise etwas größer als das Reservoir 90, sodass sie auf diese Weise die Mittel im Reservoir 90 davon abhält, auf nachteilige Weise mit dem Kleber in der Auflage 100 in Wechselwirkung zu treten. Gegebenenfalls kann eine Membran zur Geschwindigkeitskontrolle (nicht gezeigt in 4), ähnlich der Membran 94 in 3, auf der Seite zur Körperoberfläche des Reservoirs 90 angebracht werden. Normalerweise wird auch eine abziehbare Freisetzungsabdeckung (nicht gezeigt) mit der Vorrichtung 98 zur Verfügung gestellt, die unmittelbar vor Anwendung der Vorrichtung 98 auf der Körperoberfläche entfernt wird.
Die Zubereitung des Reservoirs 90 kann auf wässriger oder nichtwässriger Basis vorliegen. Die Zubereitung ist so hergerichtet, dass das Mittel in den benötigten Flussraten verabreicht wird. Wässrige Zubereitungen enthalten üblicherweise Wasser und etwa 1 bis 60 Gew.-% eines hydrophilen Polymers als Geliermittel, wie Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Hydroxyethylmethacrylat und in weichen Kontaktlinsen verwendete Polymere. Übliche nichtwässrige Zubereitungen enthalten Silikonflüssigkeiten, Silikonkautschuke, Kohlenwasserstoffpolymere, Polyisobutylen, Gummis oder Mineralöl. Gele auf Basis von Mineralöl enthalten üblicherweise auch 1 bis 2 Gew.-% eines Geliermittels, wie kolloidales Siliziumdioxid.
Die Reservoirmatrix mit darin enthaltenem Mittel sollte mit dem verabreichten Mittel, dem die Aufnahme inhibierenden Mittel (sofern vorhanden) und jedem Träger dafür verträglich sein. Wenn ein System auf wässriger Basis verwendet wird, ist die Reservoirmatrix vorzugsweise ein hydrophiles Polymer (z.B. ein Hydrogel). Wenn ein System auf nichtwässriger Basis verwendet wird, besteht die Reservoirmatrix vorzugsweise aus einem hydrophoben Polymer. Geeignete Polymermatrices sind im Fachgebiet der transdermalen Wirkstoffverabreichung hinreichend bekannt.
Wenn eine konstante Verabreichungsgeschwindigkeit des Mittels gewünscht ist, liegt das Mittel in der Matrix oder dem Träger in einer Konzentration oberhalb des Sättigungsgrades vor, wobei der Überschuss eine Funktion der gewünschten Verabreichungszeit des Mittels des Systems darstellt. Das Mittel kann allerdings auch bei einem Wert unterhalb des Sättigungsgrades vorliegen, solange die Polypeptid/Histidin-Zubereitung und das die Aufnahme verhindernde Mittel (sofern vorhanden) kontinuierlich und weitgehend am selben Ort der Körperoberfläche in einer Menge und für einen Zeitraum verabreicht werden, die ausreichen, um eine Reizung der Haut durch das Mittel zu vermindern oder zu verhindern.
Zusätzlich zu dem aktiven Mittel kann das verbindende Mittel auch Farbstoffe, Pigmente, inerte Füller, Durchdringungsverstärker, Exzipienten, Klebrigmacher, neutrale Polymere, oberflächenaktive Substanzen, Reagenzien, Puffer, Weichmacher und andere herkömmliche Bestandteile pharmazeutischer Produkte oder transdermaler Vorrichtungen, die im Fachgebiet bekannt sind, enthalten.
Die Menge an im Reservoir vorliegenden Mittel und die Größe des Reservoirs sind im Allgemeinen nicht beschränkt, wobei es sich um eine Menge handelt, die gleich oder größer derjenigen Menge an Mittel ist, die in dessen freigesetzter Form wirksam ist, um die gewünschten lokalen und/oder systemischen physiologischen und/oder pharmakologischen Wirkungen hervorzurufen.
Die bevorzugte Form, in der ein Mittel verabreicht wird, bestimmt im Allgemeinen die Art des zu verwendenden Verabreichungssystems, und umgekehrt. Das heißt die Auswahl eines passiven Systems, welches das Mittel durch Diffusion verabreicht, oder eines elektrisch betriebenen Systems, welches das Mittel durch Iontophorese verabreicht, hängt in erster Linie von der Art des Mittels ab. Für passive Verabreichungssysteme wurde beispielsweise im Allgemeinen erkannt, dass das Mittel vorzugsweise entweder in seiner freien Base- oder Säureform als in der Form eines wasserlöslichen Salzes verabreicht wird, wenn das Mittel durch das Stratum Corneum diffundiert. Für Vorrichtungen zur iontophoretischen Verabreichung wurde andererseits erkannt, dass die Mittel im Allgemeinen in Wasser löslich sein sollten. Im Allgemeinen nimmt man an, dass die Durchgangswege bei passiver und iontophoretischer transdermaler Verabreichung des Mittels durch intakte Haut unterschiedlich sind, wobei die passive Verabreichung durch Lipidregionen (d.h. hydrophobe Regionen) der Haut auftritt, und die iontophoretische Verabreichung durch hydrophile Durchgangswege oder Poren auftritt, wie etwa jene, die mit Haarfollikeln und Schweißdrüsen zusammenhängen. Im Fall von durchbohrter Haut kann ein erheblicher passiver Fluss durch die gebildeten Durchgangswege, die wässrig sind, erwartet werden. Das Mittel zur passiven Verabreichung im Falle von durchbohrter Haut ist im Allgemeinen hydrophil (z.B. wasserlösliche Salzform), die bevorzugte Form eines Mittels zur iontophoretischen Verabreichung ist ebenfalls hydrophil (z.B. wasserlösliche Salzform). Zur passiven Verabreichung kann eine Kombination aus ionisiertem Mittel (z.B. wasserlöslich) und nichtionisiertem Mittel (z.B. hydrophil) verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform zur passiven transdermalen Verabreichung von Insulin enthält die Zubereitung einen Histidinpuffer und eine Insulinverbindung, die frei von Zink und Konservierungsmitteln wie m-Cresol oder Phenol ist, und entweder Wildtyp-Humaninsulin oder ein Analogon von Insulin mit einer verminderten Neigung zur Selbstassoziation, wie etwa ein Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin-Analogon. In einer solchen Zuberreitung ist der Anteil der vorhandenen Insulinmoleküle als schneller diffundierende Sorte mit geringerem Molekulargewicht maximiert.
Die Polypeptid/Histidin-Zubereitungen können auch unter Verwendung osmotisch und Druck-getriebener Systeme verabreicht werden, bei denen die Mittel durch einen an ein Lösungsmittel gekoppelten Fluss verabreicht werden. Bei solchen Systemen hat das aktive Mittel vorzugsweise eine ausreichende Löslichkeit im Trägerlösungsmittel. Der Fachmann erkennt, dass die vorliegende Erfindung in Verbindung mit einer großen Breite osmotisch und Druck-getriebener Systeme verwendet werden kann, da die Erfindung in dieser Hinsicht nicht auf eine bestimmte Vorrichtung beschränkt ist. Bezüglich Beispielen osmotisch und Druck-getriebener Vorrichtungen sei auf die US-Patente Nr. 4,340,480 von Eckenhoff; 4,655,766 von Theeuwes et al.; 4,753,651 von Eckenhoff; 5,279,544 von Gross et al.; 4,655,766 von Theeuwes; 5,242,406 von Gross et al.; und 4,753,651 von Eckenhoff verwiesen, die alle für die vorliegende Erfindung verwendet werden können.
III. Experimentalteil
Materialien
Humaninsulin (hergestellt durch Expression in E. coli.), β-Lactoglobulin, L-Histidin (Base) und Serinamid wurden von Sigma (St. Louis, MO) erworben. Die Insulinpräparation von Sigma enthält etwa 0,4% Zink, was etwa zwei Zinkatomen pro Insulinhexamer entspricht. Humalog^® (ein Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin-Anlogon) sowie Humulin^® (Humaninsulin-Injektion), die beide einem rekombinanten DNA-Ursprung entstammen und von Lilly (Indianapolis, IN) hergestellt werden, wurden von Handelsapotheken bezogen. L-Histidin (Base) wurde von J.T. Baker (Phillipsburg, NJ) sowie von Sigma (St. Louis, MO) erhalten. Eisessig wurde von J.T. Baker (Phillipsburg, NJ) erhalten. Salzsäure wurde von Mallinckrodt (Paris, KY) erworben. Natriumchlorid (NaCl) wurde von Aldrich (St. Louis, MO) geliefert. Lysozym wurde von der Worthington Biochemical Corp. (Freehold, NJ) erhalten. L-Glycyl-L-histidindipeptid wurde von Bachem Bioscience Inc. (King of Prussia, PA) synthetisiert.
Verfahren
Herstellung zinkfreier Humaninsuline
Alle aus gewerblichen Quellen erhältlichen Humaninsuline enthalten etwa zwei gebundene Zinkmoleküle pro Insulinhexamer. Das an das Wildtyp-Humaninsulin (erhältlich von Sigma oder als Humulin^® R) und das Lys^B28Pro^B29-Analogon (erhältlich als Humalog^®) gebundene Zink kann durch umfassende Dialyse gegen 10 mM Essigsäure bei 4°C entfernt werden. Im Fall von Humulin^® R und Humalog^® wurde der pH des injizierbaren Insulins zunächst unter Verwendung von Eisessig und 1 N Salzsäure vor der Dialyse von neutralem pH auf pH 3,5 eingestellt. Das Insulin wurde nach der Dialyse gefriergetrocknet. Eine Analyse auf Zink des gefriergetrockneten Materials ergab, dass der Restzinkgehalt weniger als 0,03 Zink/Hexamer betrug.
Herstellung der L-Histidin- und L-Glycyl-L-Histidin-Puffer Milli-Q-Wasser (Millipore, Medford, MA) wurde zur Herstellung aller Puffer verwendet. Vor der Verwendung wurden die Puffer durch 0,22 μm Celluloseacetatmembranen gefiltert. Der pH einer 252 mM L-Histidinlösung betrug etwa pH 7,62 ± 0,1 bei 22°C, der pH eines 1 M L-Glycyl-L-histidinpuffers betrug etwa pH 7,68 ± 0,1 bei 22°C.
Herstellung des Serinamidpuffers
Eine 100 mM Serinamidpuffer-Stammlösung wurde hergestellt und der pH auf 7,5 ± 0,1 eingestellt.
Herstellung von Insulin in L-Histidin- und L-Glycyl-L-Histidin-Puffern
Für jedes in der analytischen Ultrazentrifuge durchgeführte Experiment wurde eine Insulinstammlösung hergestellt. Die Konzentration der Stammlösung wurde bestimmt, indem ein Aliquot in 6 M Guanidinhydrochlorid (Pierce, Rockford, IL) verdünnt und dessen Absorption mit einem Spektrophotometer (Aviv, Modell 14DS, Lakewood, NJ) vermessen wurde. Vor der Bestimmung der Konzentration der Probe wurde deren Absorption unter Verwendung eines molaren Extinktionskoeffizienten von 1,109 ml mg^-1 cm^-1 bei 276 nm um die Lichtstreuung korrigiert. Für Histidin-enthaltende Zubereitungen wurde die Insulinstammlösung entweder in 250 oder 330 mM L-Histidin hergestellt. Für L-Glycyl-L-Histidin wurde die Insulinstammlösung in 260 mM und/oder 1 M L-Glycyl-L-Histidin-Puffer hergestellt. Mit Wildtypinsulin, das etwa 2 Zink/Hexamer enthielt, wurde üblicherweise eine Stammlösung von bis zu 10 mM (etwa 60 mg/ml) entweder in L-Histidin oder L-Glycyl-L-Histidin hergestellt. Für Zubereitungen ohne Histidin wurde eine mit NaOH auf pH 7,5 eingestellte Stammlösung in 10 mM NaCl hergestellt, die 7,1 mg/ml an Wildtypinsulin mit 2 Zink/Hexamer enthielt. Im Fall zinkfreier Wildtyp- und/oder Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin-Analoga kann eine Stammlösung von bis zu 17 mM (etwa 100 mg/ml) entweder in 0,1 M NaCl, pH 7,5 und/oder 250 mM Histidin, 0,1 M NaCl, pH 7,5 hergestellt werden. Der pH der Insulinstammlösung betrug etwa 7,68 ± 0,1 in einem 1 M Glycyl-Histidin-Puffer und pH 7,62 ± 0,1 in 250 mM Histidin bei 22°C.
Vor dem Durchlauf der analytischen Ultrazentrifuge wurde die Insulinstammlösung entweder mit Histidin- oder Glycyl-Histidin-Puffer mit oder ohne die geeignete Menge an NaCl verdünnt, sodass die Konzentration des Insulins von geringen 2 mg/ml (0,35 mM) bis zu hohen 40 mg/ml (7 mM) variierte. Die Endkonzentration des L-Histidin-Puffers, in dem das Insulin gelöst wurde, variierte von 10 mM bis 252 mM. Mit L-Glycyl-L-Histidin wurden Wildtypinsulinzubereitungen, die zwei Zink/Hexamer enthielten, in 250 und 750 mM Puffern in der Ultrazentrifuge untersucht. Zusätzlich wurde Natriumchlorid in einer Endkonzentration von 50 und 100 mM zu einigen der Insulinproben in L-Histidin- oder L-Glycyl-L-Histidin-Puffern gegeben.
Herstellung von Lysozym und β-Lactoglobulin
Lysozymlösungen (15 mg/ml) wurden in 0,15 M NaCl mit 0,100 oder 250 mM L-Histidin hergestellt. Der pH der Histidin-enthaltenden Lösungen betrug 7,60 ± 0,1 bei 21 °C; der pH der Lysozymlösung ohne L-Histidin wurde mit verdünnter Base auf denselben Wert eingestellt. In gleicher Weise wurde der pH des β-Lactoglobulins in 0,15 M NaCl mit verdünnter Base auf denselben pH wie demjenigen in 250 mM L-Histidin, pH 7,74 ± 0,1, eingestellt.
Untersuchungen von Sedimentationsgleichgewichten in der analytischen Ultrazentrifuge
Experimente zu Sedimentationsgleichgewichten mit verschiedenen Insulinzubereitungen wurden unter Verwendung einer analytischen Ultrazentrifuge (Modell XL-A oder XL-I; Beckman, Palo Alto, CA) bei 32°C durchgeführt.
Die Daten beim Sedimentationsgleichgewicht wurden für alle Proben unter Verwendung von Rayleigh-Interferenzoptik und/oder Optik zum Abtasten des UV-sichtbaren Bereichs bei verschiedenen Rotorgeschwindigkeiten erhalten. Im letzteren Fall wurde die Absorption der Insulinproben bei mehreren Wellenlängen, z.B. 248, 288, 291 und 295 nm, gemessen. Die Werte des molaren Extinktionskoeffizienten wurden aus Aufnahmen abgeschätzt, die zu Beginn eines Durchgangs mit dem auf die obigen Wellenlängen eingestellten Monochromator erhalten wurden. Diese Werte wurden verwendet, um die molaren Assoziationsgleichgewichtskonstanten von Insulin unter verschiedenen Bedingungen zu berechnen. Jeder Datenpunkt in den Absorptionsaufnahmen wurde als Mittelwert von 10 Aufnahmen mit einer jeweiligen Zunahme des Radialabstands von 0,002 cm aufgenommen. Beim Interferenzoptiksystem wurde Licht von 675 nm verwendet, um Sedimentationsgleichgewichtsdaten sowohl für Insulin- als auch für Lysozymproben zu erhalten. Die Randverschiebung einer 1 mg/ml Polypeptidlösung bei einer Weglänge von 1 cm wurde als 2,77 Randzonen angenommen (McMeekin et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1962) 7:151-156; Doty und Geiduschek, S. 393-460, in The Proteins, 1A, herausgegeben von Neurath und Baily, Academic Press, N.Y. (1943); Perlmann und Longsworth, J. Amer. Chem. Soc. (1948) 70:2719-2724). Dieser Wert wurde verwendet, um die molaren Assoziationskonstanten für Insulin- und Lysozymproben zu berechnen. Als Molekulargewicht von monomerem Humaninsulin wurden 5796 g/mol mit einem spezifischen Partialvolumen von 0,727 ml/g angenommen, berechnet aus der Aminosäurezusammensetzung unter Verwendung von Cohn-und-Edsall-Werten für das übrige spezifische Partialvolumen. Im Fall von Lysozym wurde ein Molekulargewicht des Monomers von 14315 g/mol und ein Wert von 0,703 ml/g des spezifischen Partialvolumens angenommen (Sophianopoulus et al., J. Biol. Chem. (1962) 237:1107). Für β-Lactoglobulin wurden UV-Absorptionsaufnahmen bei 280 nm gemacht, das Molekulargewicht des Monomers wurde als 18400 g/mol angenommen. Das Partialvolumen des Letzteren beträgt 0,747 ml/g (Kelly und Reithel, Biochemistry (1971) 10:2639-2644); der zur Berechnung der molaren Assoziationskonstanten verwendete Extinktionskoeffizient betrug 0,97 ml g^-1 cm^-1 (Wetlaufer und Lovrien, J. Biol. Chem. (1964) 243:596). Das wirksame Auftriebsmolekulargewicht in Gegenwart von L-Histidin wurde unter Verwendung des „Modells des ausgeschlossenen Volumens" („excluded volume model") (Jacobsen et al., Biochemistry (1996) 35:13173-13179) berechnet, bei dem als B_AM-Wert einfach das mit dem spezifischen Partialvolumen multiplizierte Molekulargewicht des Monomers angesetzt wurde. Das spezifische Partialvolumen von L-Histidin und L-Glycyl-Histidin wurde als 0,641 ml/g angesetzt (S. 370-381, Proteins, Amino Acids and Peptides, (1943) herausgegeben von Cohn und Edsall, Hafner Publishing, N.Y).
Nach der Zentrifugation wurden die aus den Interferenz- und Absorptions-Aufnahmen gewonnenen Daten unter Verwendung bekannter Verfahren analysiert, einschließlich eines Algorithmus, der auf Gleichung 9 in Shire et al., Biochemistry (1991) 30:7703-7711 basiert. Der verwendete Algorithmus beinhaltete eine Modifizierung, bei welcher der Anpassungsparameter (BM₁)^1/2 anstelle von (B)^1/2 war. Diese Analyse ergibt eine Abschätzung der Assoziationskonstanten für ein benutzerspezifiziertes Modell. Das Modell kann das eines idealen Monomers sein (das einfachste Modell) oder eines Monomers, das im chemischen Gleichgewicht mit 1, 2, 3 oder mehreren Aggregaten spezifischer Größe vorliegt. Das wahrscheinlichste Modell ist dasjenige, bei welchem die Summe der Quadrate der Abweichung zwischen der experimentellen Absorption und der theoretischen Absorption minimiert ist, d.h. das Modell, das den geringsten Wert der Wurzel des mittleren Fehlerquadrats aufweist.
Beispiel 1
Effekt von L-Histidin auf die Löslichkeitsgrenze von Insulin
Um die Auswirkung von L-Histidin auf die Löslichkeitsgrenze vom Wildtyp-Humaninsulin mit 2 Zink/Hexamer zu bestimmen, wurden verschiedene Konzentrationen von Insulin mit L-Histidin kombiniert. Wie in 1 gezeigt, erhöhte die Verwendung von L-Histidin in der Pufferlösung die maximale Insulinkonzentration einer Insulin-enthaltenden Pufferlösung. Ohne L-Histidin lag die höchste erzielte Konzentration von Insulin mit 2 Zink/Hexamer bei pH 7,5; 10 mM NaCl und Raumtemperatur bei 7,1 mg/ml oder 1,2 mM. In Gegenwart von 250 mM Histidin bei dessen pl wurden Insulinlösungen mit einer Konzentration mit bis zu 16,5 mM erhalten, entsprechend einem 15fachen Anstieg der Konzentration.
Beispiel 2
Effekt von L-Histidin und L-Glycyl-Histidin bei pl auf die Selbstassoziation von Insulin in Abwesenheit von NaCl
Um die Auswirkung von L-Histidin und L-Glycyl-Histidin bei deren pls auf die Selbstassoziation in Abwesenheit von NaCl zu bestimmen, wurden Untersuchungen zu Sedimentationsgleichgewichten wie oben beschrieben durchgeführt. Wie in Tabelle I gezeigt, führte eine erhöhte L-Histidinkonzentration zu einer Abnahme der Hexamerisierungsgleichgewichtskonstante. Bei pH 7,5 und in Abwesenheit von Histidin konnten die Sedimentationsgleichgewichtsdaten (aufgenommen bei 32°C und einer Rotorgeschwindigkeit von 18000 bis 48000) mit einem Dimer-Hexamer-Assoziationsmodell mit einem InK_2-6-Wert von 52,6 angepasst werden. Der Koeffizient B für die Nicht-Idealität berücksichtigt den nicht-idealen Effekt, der aufgrund der sehr geringen Ionenstärke des Puffers auftritt. Unter der Annahme, dass eine einzige Molekulargewichtsgröße vorlag, ergab die Datenanalyse unter Verwendung des einfachsten Modells einen M_avg/M₁-Wert von 5,5, wodurch nahegelegt wird, dass die mittlere Größe der Insulinaggregate in Abwesenheit von Histidin geringfügig geringer als ein Hexamer war. Die Beobachtung, dass drei Insulindimere sich in Gegenwart von Zink bei neutralem pH zur Bildung eines Hexamers zusammenfügen, ist mit veröffentlichten Daten konsistent (Brange, Galenics of Insulin, (1987) Springer Verlag). Die in Gegenwart von 20 bis 252 mM Histidin bei pH 7,6 ± 0,1 bei verschiedenen Rotorgeschwindigkeiten aufgenommenen Sedimentationsgleichgewichtsdaten wurden mit einem Dimer-Hexamer-Assoziationsmodell angepasst. Eine Abnahme der Hexamerisierungsgleichgewichtskonstanten wurde beobachtet, als die Konzentration von Histidin von 20 auf 252 mM erhöht wurde. Der Effekt von Histidin wurde mit Insulin bei Insulinkonzentrationen in der Zentrifugenzelle im Bereich von nur 0,01 mM (0,1 mg/ml) bis zu 13 mM (75 mg/ml) beobachtet. Trotz der Tatsache, dass Histidin die Löslichkeit von Insulin deutlich erhöhte (die Löslichkeitsgrenze betrug 16,5 mM in 250 mM His, pH 7,5 ± 0,1), lag unter diesen Bedingungen nicht das gesamte aggregierte Insulin als Dimere und Hexamere vor. Bei der höchsten Insulinkonzentration (6 mM), die in der Ultrazentrifuge untersucht wurde, wurden auch Aggregate multipler Hexamere gefunden. Nur 80% des ursprünglich in die Zelle eingefüllten Insulins blieb in Lösung, als die Probe bei einer Rotorgeschwindigkeit von 20000 Upm ein Gleichgewicht erreichte. Die übrigen 20% des Insulins bildeten als große unlösliche Aggregate ein Pellet am Zellenboden. Eine ungefähre Berechnung legt nahe, dass die Aggregate ein mittleres Molekulargewicht von mehr als 100000 besaßen, entsprechend etwa 3 Insulinhexameren.
Glycyl-Histidin war eines der Histidinanaloga, die hinsichtlich ihrer Wirkung auf die Selbstassoziation von Insulin untersucht wurden. Bei 250 mM verminderte auch Glycyl-Histidin die Neigung von Insulin zur Ausbildung von Hexameren, jedoch nicht so wirksam wie Histidin. Die Analyse des unter Verwendung von Interferenzoptik bei einer Rotorgeschwindigkeit von 50000 erhaltenen Sedimentationsgleichgewichts, die mit dem Modell einer Größe durchgeführt wurde, zeigte, dass das mittlere Molekulargewicht des Insulins demjenigen eines Tetramers in Glycyl-Histidin entsprach (Tabelle I). Zum Vergleich, bei 252 mM Histidin (die höchste in der Ultrazentrifuge untersuchte Konzentration) entsprach das mittlere Molekulargewicht des Insulins demjenigen eines Dimers. Ersatz des Histidins durch einen weiteren Puffer, Serinamid, ebenfalls auf pH 7,5 ± 0,1 eingestellt, konnte die Fähigkeit von Wildtypinsulin zur Selbstassoziation bei neutralem pH nicht vermindern. Tabelle I Effekt verschiedener Puffer auf die Selbstassoziation von Wildtyphumaninsulin (mit 2 pro Hexamer gebundenen Zink) in Abwesenheit von Natriumchlorid bei pH 7,5 ± 0,1 und 32°C, analysiert unter Verwendung eines Dimer-Hexamer-Assoziationsmodells

I.S.: ist die Ionenstärke des Puffers in mM
B (g^-2/l mol): ist der Koeffizient für die Nicht-Idealität, berechnet auf der Basis eines Insulindimers
W. m. Fq.: bezeichnet die Wurzel des mittleren Fehlerquadrats bezüglich der Abweichung zwischen experimentellen und theoretischen Daten
M_avg/M₁: ist das mittlere Molekulargewicht der sedimentierenden Spezies, dividiert durch das Molekulargewicht des Insulinmonomers, bezüglich eines nicht-idealen Modells einer Spezies
InK_2-6: ist der natürliche Logarithmus der Assoziationskonstante für die Bildung eines Hexamers aus drei Dimeren

Beispiel 3
Effekt von L-Histidin und L-Glycyl-Histidin bei pl auf die Selbstassoziation von Wildtyp-Humaninsulin mit zwei pro Hexamer gebundenen Zink in Gegenwart von NaCl
Um die Wirkung von L-Histidin und L-Glycyl-Histidin bei deren pls auf die Selbstassoziation von Histidin in Gegenwart von NaCl zu bestimmen, wurden Experimente wie oben beschrieben durchgeführt. Wenn die Ionenstärke der Proben bei pH 7,5 mit Natriumchlorid auf etwa 100 mM angehoben wurde, lag das Wildtyp-Humaninsulin in Abwesenheit von Histidinpuffer vorwiegend als Hexamere vor. Wie in Tabelle II gezeigt, trat eine leichte Abnahme der Hexamerisierungsgleichgewichtskonstante auf, als die Konzentration des Histidins in den Insulinproben von 50 auf 226 mM erhöht wurde. Der Effekt war nicht so stark wie derjenige, der bei Abwesenheit von Salz beobachtet wurde (siehe Tabelle I). Bei 226 mM, der höchsten bei einer Ionenstärke von 100 mM untersuchten Nistidinkonzentration, betrug der M_avg/M₁-Wert, der unter Annahme einer einzigen Insulinspezies berechnet wurde, etwa 6. Im Gegensatz dazu wurde Insulin bei Abwesenheit von NaCl in 252 mM Histidin, pH 7,6 ± 0,1, hauptsächlich als Dimere gefunden. Zusätzlich betrug die Endkonzentration von Insulin, das mit einer mittleren Größe gleich oder geringer derjenigen eines Dodecamers sedimentierte, in Gegenwart von 226 mM Histidin und 100 mM NaCl und unabhängig von der ursprünglichen Beladungskonzentration des Insulins etwa 2 mM. Der Rest der Insulinprobe lagerte sich bei einer Rotorgeschwindigkeit von 20000 am Zellenboden als Pellet ab. Somit war der Prozentsatz von Insulin, das sehr große Aggregate bildet, in einem 100 mM NaCl enthaltenden Histidinpuffer beträchtlich höher als ohne NaCl. Im letzteren Fall lag der Insulinkonzentrationsbereich, der zu einer Pelletbildung großer Aggregate führte, bei etwa 4,8 mM.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Wirkung von Histidin auf die Selbstassoziation von Insulin vom Ionenmilieu des Mediums abhängt. Vorläufige Daten legen nahe, dass die freie Gibbs-Energie der Bildung eines Insulindodecamers aus zwei Hexameren als Funktion der Quadratwurzel der Ionenstärke des Puffers ansteigt.
Im Fall von L-Histidin und L-Glycyl-Histidin führte die Zugabe von 50 mM NaCl zu der Wildtyp-Humaninsulinprobe (wobei die Gesamtionenstärke auf 77,5 mM erhöht wurde) zu einer Hexamerisierungsgleichgewichtskonstante nahe derjenigen, die für Insulin in 226 mM Histidin und 100 mM NaCl beobachtet wurde (Tabelle II). Histidin ist bei seinem pl ein Zwitterion und sein Effekt auf Insulin scheint spezifisch zu sein. Wie in Tabelle II gezeigt, konnte beispielsweise die Verwendung von Taurin, einem weiteren Zwitterion bei pH 7,5 ± 0,1, bei einer Ionenstärke von etwa 100 mM die Hexamerisierungsgleichgewichtskonstante von Insulin nicht vermindern. Tabelle II Effekt von L-Histidin und L-Glycyl-Histidin auf die Selbstassoziation von Wildtyp-Humaninsulin mit zwei Zink/Hexamer in Gegenwart von 50 und 100 mM Natriumchlorid bei pH 7,5 ± 0,1 und 32°C, analysiert unter Verwendung eines Dimer-Hexamer-Assoziationsmodells 50 mM NaCl
100 mM NaCl

InK_6iso: ist der natürliche Logarithmus der Assoziationskonstante für die Bildung von isodesmischen Hexameren

Beispiel 4
Effekt von L-Histidin bei pl auf die Selbstassoziation von zinkfreiem Wildtyp-Humaninsulin und eines zinkfreien Lys-Pro-Insulinanalogons
Untersuchungen zu Sedimentationsgleichgewichten wurden in einer XL-I analytischen Ultrazentrifuge mit nativem Wildtyp-Humaninsulin (zinkfrei, von Sigma und Humulin^® R) sowie mit einem zinkfreien Lys^B28Pro^B29-Insulinanalogon (aufgereinigt aus Humalog^®, Lilly) als Funktion ansteigender Histidinkonzentration bei pH 7,5 und 32°C wie oben beschrieben durchgeführt. Interferenzdaten wurden bei mehreren Rotorgeschwindigkeiten aufgenommen, gesammelt und gemeinsam unter Verwendung von an verschiedene Modelle angepasster nicht-linearer Regression gemeinsam analysiert. Die Daten von Wildtyp- und Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin, beide zinkfrei und in Gegenwart von 100 mM NaCl bei pH 7,5, können mit einem Modell, das Monomer, Dimer und Hexamer und isodesmische Hexamere enthält, angepasst werden.
Wie in Tabelle III gezeigt, änderte sich der Wert von InK₁₂ für das zinkfreie LysPro-Analogon nicht signifikant mit der Konzentration von Nistidin, InK_6iso zeigte jedoch eine signifikante Abnahme mit ansteigender Histidinkonzentration. Die Ergebnisse legen nahe, dass Histidin eine Auswirkung auf die Selbstassoziationseigenschaften des LysPro-Insulinanalogons hatte. Ein prägnantes Verfahren, den Grad der Aggregation eines Proteins auszudrücken, ist die Berechnung eines mittleren Molekulargewichts aus den Assoziationsgleichgewichtskonstanten. Mehrere solcher Mittelwerte sind in der Literatur gut beschrieben (siehe z.B. „Analytical Ultracentrifugation in Biochemistry and Polymer Science", Hg. S.E. Hardin, A.J. Rowe und J.C. Horton, Royal Society of Chemistry, Cambridge, 1992). Einer, Mn bzw. das gewichtsmittlere Molekulargewicht, ist definiert als c_gesamt/Σ(c_i/M_i), worin c_i die gewichtsbezogene Konzentration der i-ten Spezies mit dem Molekulargewicht M_i ist. Eine zweite Art von Mittelwert, M_w, genannt das gewichtsmittlere Molekulargewicht, ist definiert als Σc_i/M_ic_gesamt. Noch höhere Molekulargewichtsmittelwerte wie M_z können definiert werden, wobei M_z= Σc_iM_i ²/Σc_iM_i ist. 5 zeigt die Konzentrationsabhängigkeit dieser drei Mittelwerte für das LysPro-Insulinanalogon in Gegenwart von 240 mM Histidin (berechnet aus den InK₁₂-, InK₂₆- und InK_6iso-Werten für 240 mM Histidin in Tabelle III), während 6 eine ähnliche Darstellung für den Fall der Abwesenheit von Histidin zeigt (berechnet aus den InK-Werten für 0 mM in Tabelle III). 7 zeigt die gleiche Darstellung für zinkfreies Wildtypinsulin in Gegenwart von 240 mM Histidin (berechnet aus den InK₁₂-, InK₂₆- und InK_6iso-Werten für 240 mM Histidin in Tabelle IV), während 8 eine vergleichbare Darstellung in Abwesenheit von Histidin zeigt (berechnet aus den InK-Werten für 0 mM Histidin in Tabelle IV).
Aus diesen Darstellungen ist ersichtlich, dass die Gegenwart von Histidin das mittlere Molekulargewicht von Insulin wesentlich verringert und dass dieser Effekt für das LysPro-Analogon ausgeprägter ist.
Tabelle III
Lys^B28Pro^B29-Humaninsulin-Analogon (zinkfrei) in 100 mM NaCl, pH 7,5; 32°C
Unter den jeweiligen Bedingungen wurden bei 5 Rotorgeschwindigkeiten (12000, 18000, 24000, 34000, 50000) Interferenzdaten gesammelt und gemeinsam analysiert.

In(K_6iso): = 6,01 – 0,0037 [Histidin], p = 0,004
In(K₁₂): ist der natürliche Logarithmus der Assoziationskonstante für die Bildung eines Dimers aus zwei Insulinmonomeren
In(K₂₆): ist der natürliche Logarithmus der Assoziationskonstante für die Bildung eines Insulinhexamers aus drei Dimeren
In(K_6iso): ist der natürliche Logarithmus der Assoziationskonstante für die Bildung geschichteter Hexamere

Unter den jeweiligen Bedingungen betrug die Beladungskonzentration an Insulin 4 mM. Während der Zentrifugation findet eine Umverteilung des Insulins in der Zentrifugenzelle statt.
Der in der Tabelle angegebene [Insulin]Bereich spiegelt den unter den verschiedenen Rotorgeschwindigkeiten und den jeweiligen Bedingungen beobachteten Bereich von [Insulin].
Tabelle IV
Wildtyp-Humaninsulin (zinkfrei) in 100 mM NaCl, pH 7,5; 32°C
Unter den jeweiligen Bedingungen wurden bei 5 Rotorgeschwindigkeiten (12000, 18000, 24000, 34000, 50000) Interferenzdaten gesammelt und gemeinsam analysiert.

In(K₁₂): = 9,06 (Mittelwert) (Standardfehler des Mittelwerts = 0,273) (keine signifikante Abhängigkeit von [Histidin])
In(K_6iso): = 7,116 – 0,002 [Histidin], p = 0,02

Die Insulinbeladungskonzentration betrug 2 mM unter den jeweiligen Bedingungen mit Ausnahme von 224 mM Histidin. Im letzteren Fall wurden die dargestellten Daten durch Kombination der Daten aus drei Insulinbeladungskonzentrationen von 1, 3 und 6 mM erhalten.
Beispiel 5
Effekt von L-Histidin bei dessen pl auf die Selbstassoziation anderer Proteine
Die Auswirkung von L-Histidin auf die Selbstassoziation von Lysozym und β-Lactoglobulin wurde unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren ebenfalls untersucht. Bei Lysozym und β-Lactoglobulin handelt es sich um gut untersuchte Proteine, die bei alkalischem pH vorwiegend in einem Monomer-Dimer-Gleichgewicht vorliegen (Kim et al., Chemical Reviews (1977) 77:659-690). Die Daten für das Sedimentationsgleichgewicht von Lysozym bei alkalischem pH werden durch ein Monomer-Dimer-Tetramer-System besser modelliert als durch ein einfacheres Monomer-Dimer-System (Holladay, Ph.D. Dissertation (1973) Emory University). Das Selbstassoziationsverhalten von Lysozym ohne L-Histidin bei 4°C wurde durch gemeinsame Analyse der Interferenzranddaten bei 14000, 18000 und 30000 Upm ermittelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle V dargestellt.
Das bei den Randmessungen erwartete Untergrundrauschen des Beckman XL-I-Systems liegt bei etwa 0,02 bis 0,04 Randzonen. Die Daten bei 4°C werden am besten durch ein ideales Monomer-Dimer-Tetramer(1-2-4)-System beschrieben. Es ist zu beachten, dass jedes Modell, das größere Aggregate als Dimere enthält, im Wesentlichen identische Abschätzungen für den In(K₁₂) ergibt. Da diese Ergebnisse (unten dargestellt) für die Auswirkung von L-Histidin auf die Dimerisierung von Lysozym nicht dazu neigen, modellabhängig zu sein, wurde die Modellierung mit einem idealen 1-2-4-System durchgeführt. Das Einbeziehen eines zweiten Virialkoeffizienten konnte den Wert der Wurzel des mittleren Fehlerquadrats nicht signifikant vermindern. Beim isodesmischen Typ I liegen alle Aggregate mit identischen Assoziationskonstanten vor. Beim Typ II liegen nur geradzahlige Aggregate vor. Typ III weist eine von nachfolgenden Assoziationsschritten, von denen man annimmt, dass sie isodesmisch sind, verschiedene Dimerisierungskonstanten auf. Beim Typ IV liegen nur geradzahlige Aggregate vor, von denen man annimmt, dass sie mit einer von nachfolgenden Assoziationsschritten, die als isodesmisch angenommen werden, verschiedenen Dimerisierungskonstanten vorliegen. Die Gleichungen für die isodesmischen Modelle sind im Fachgebiet bekannt und wurden beschrieben (Tang et al., Biophys. Chem. (1977) 7:121-139). Es ist zu beachten, dass der In(K₁₄) für das isodesmische Modell IV 17,9 beträgt, nahe demjenigen, der für das 1-2-4-Modell abgeschätzt wurde. Die vorausgesagten Mengen von Aggregaten größer als Tetramere sind für alle isodesmischen Modelle relativ klein.
Die Auswirkung von L-Histidin auf die Dimerisierung von Lysozym ist in Tabelle VI dargestellt. Die Ergebnisse in Tabelle VI wurden unter Verwendung eines idealen 1-2-4-Modells (Monomer-Dimer-Tetramer) und einer gemeinsamen Analyse von zwei Rotorgeschwindigkeiten, die sich um 4000 Upm unterschieden, erzeugt. Die Auswirkung von L-Histidin auf die Dimerisierung von β-Lactoglobulin bei drei Temperaturen ist in Tabelle VII dargestellt. Bei beiden Proteinen scheint eine leichte Abnahme der Dimerisierungsgleichgewichtskonstante mit zunehmender Temperatur aufzutreten. Für diese Analyse wurde implizit angenommen, dass das wirksame Auftriebsmolekulargewicht eines jeden Aggregats in Gegenwart von L-Histidin eine ganze Zahl multipliziert mit dem wirksamen Auftriebsmolekulargewicht des Monomers ist. Dies impliziert, dass der Wert B_AM eines jeden Aggregats eine ganze Zahl multipliziert mit dem Wert B_AM ist. Da sich die äußere Gesamtform eines Aggregats in Wirklichkeit wahrscheinlich etwas von derjenigen des Monomers unterscheidet, ist es möglich, dass die leichten Abnahmen der Dimerisierungskonstanten für Lysozym und β-Lactoglobulin die Annahme widerlegen könnten, dass das Auftriebsmolekulargewicht des Aggregats eine ganze Zahl multipliziert mit demjenigen des Monomers sei. Es ist jedoch festzuhalten, dass der erhaltene Wert In(K₁₂) nicht dazu neigt, von Änderungen einiger weniger Prozente des Auftriebsgewichts des Monomers beeinflusst zu werden. Tabelle V Effekt der Auswahl des Selbstassoziationsmodells auf den In(K₁₂) von Lysozym in 150 mM NaCl, pH 7,6; 4°C, aus einer gemeinsamen Analyse von Interferenzdaten, die bei Rotorgeschwindigkeiten von 14000, 18000 und 30000 erhalten wurden

1-2: bezeichnet ein Modell, bei dem das Monomer im Gleichgewicht mit Dimeren vorliegt
1-2-4: bezeichnet ein Modell, bei dem das Monomer im Gleichgewicht mit Dimer und Tetramer vorliegt
InK_1-2: ist die Gleichgewichtskonstante für die Bildung eines Dimers aus zwei Monomeren
InK_1-4: ist die Gleichgewichtskonstante für die Bildung eines Tetramers aus vier Monomeren

Tabelle VI Effekt von L-Histidin auf die Selbstassoziation von Lysozym bei pH 7,6; 150 mM NaCl bei mehreren Rotorgeschwindigkeiten unter Verwendung eines 3 mm Mittelstücks
Tabelle VII Effekt von L-Histidin auf die Selbstassoziation von β-Lactoglobolin bei pH 7,6; 150 mM NaCl bei mehreren Rotorgeschwindigkeiten unter Verwendung eines 3 mm Mittelstücks
Auf Basis der obigen Experimente ist es offensichtlich, dass Histidin und Histidinanaloga die Selbstassoziation von Insulin und Insulinanaloga mit und ohne Zink verringern können. Im Falle von Wildtypinsulin, das zwei Zinkmoleküle/Hexamer enthält, können die Sedimentationsgleichgewichtsdaten im untersuchten Konzentrationsbereich bei pH 7,5 mit einem nicht-idealen Dimer-Hexamer-Modell in Abwesenheit von NaCl oder mit einem idealen Dimer-Hexamer-Modell (wenn die Beladungskonzentration an Insulin unterhalb 1 mM beträgt) in Gegenwart von 100 mM NaCl angepasst werden. Darüber hinaus besteht ein auffälliger Effekt der Histidinkonzentration auf den InK₂₆-Wert von nativem Humaninsulin mit zwei Zink/Hexamer, unabhängig vom Vorliegen von NaCl. In Abwesenheit von Zink ist der Effekt von Histidin auf das LysPro-Analogon ausgeprägter als beim Wildtyp-Insulin. Histidin ist auch in der Lage, die Selbstassoziation anderer völlig unabhängiger Proteine wie Lysozym und β-Lactoglobulin zu verringern.
Somit werden Verfahren zur Verminderung der Selbstassoziation und zur Erhöhung der Löslichkeit von Polypeptidmitteln offenbart.

Claims

Verwendung eines Polypeptids und einer Histidinverbindung in einer Menge, die ausreicht, die Neigung des Polypeptids zur Selbstassoziation zu verringern, zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Verabreichung des Polypeptids durch die Haut mittels Elektrotransport oder passive transdermale Verabreichung.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Histidinverbindung um L-Histidin oder L-Glycyl-Histidin handelt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei das Polypeptid eine Insulinverbindung ist.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei es sich bei der Insulinverbindung um eine Humaninsulinverbindung handelt.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei es sich bei der Insulinverbindung um eine zinkfreie Humaninsulinverbindung handelt.
Verwendung nach Anspruch 4 oder 5, wobei die Insulinverbindung ein Human-Lys^B28Pro^B29-Insulinanalogon ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 6, wobei die Insulinhexamerbildung verringert ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Konzentration der Histidinverbindung wenigstens etwa 10 mmolar ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der pH der Zusammensetzung etwa pH 7 bis pH 8 ist.
Verwendung nach Anspruch 1 zur Verabreichung einer Insulinverbindung durch die Haut mittels Elektrotransport, wobei das Molverhältnis der Insulinverbindung zu der Histidinverbindung 1:10 bis 1:1000 beträgt.
Zusammensetzung, die zur Verabreichung durch eine Körperoberfläche mittels Elektrotransport oder passive transdermale Verabreichung geeignet ist, umfassend eine Insulinverbindung und eine Histidinverbindung in einer Menge, die ausreicht, die Neigung der Insulinverbindung zur Selbstassoziation zu verringern.
Vorrichtung zur Verabreichung mittels Elektrotransport oder Vorrichtung zur passiven transdermalen Verabreichung, umfassend eine Zusammensetzung wie in einem der Ansprüche 1 bis 10 definiert.