HUT56857A

HUT56857A - Human insulin analogues

Info

Publication number: HUT56857A
Application number: HU90984A
Authority: HU
Inventors: Per Balschmidt; Jens Jorgen Veilgaard Brange
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 1988-12-23
Filing date: 1989-12-15
Publication date: 1991-10-28
Also published as: YU243689A; EP0375437A2; DE68928810D1; NO912438D0; CN1043719A; EP0861851A1; EP0861851B1; NZ231936A; NO301483B1; WO1990007522A1; CA2006578A1; ES2134669T3; EP0837072A3; FI913037A0; KR910700262A; DE68928917D1; ATE175974T1; EP0375437B1; IL92853A0; US5164366A

Description

A találmány tárgya

A találmány új emberi inzulin analógokat mutat be, ame* lyek oldatban csak kis mértékben képesek asszociátumok képzésére, bemutat továbbá ezen inzulin analógok előállítására szolgáló eljárást, a találmány tárgyát képező humán inzulin analógokat tartalmazó inzulin készítményeket és a cukorbetegség (Diabetes mellitus) kezelését ezen inzulin analógokkal.

Irodalmi háttér

Amióta 1922-ben fölfedezték az inzulint, számos különböző típusú inzulin készítményt használtak a cukorbetegség kezelésére. A kezdetben kizárólag gyorsan kezdődő és viszonylag gyorsan megszűnő inzulin aktivitással rendelkező inzulin oldatokat használtak, de később áttértek hosszabb aktivitási tartománnyal bíró késszítmények gyártására, amit az inzulin oldhatóságának csökkentésével pl. zink sók és/vagy protaminok hozzáadásával értek el. Az ilyen célokra használt inzulint normál körülmények között a háziállatok hasnyálmirigyéből nyerték ki, a leggyakrabban ökrök, sertések és juhok Pancreas ának felhasználásával, de az utóbbi időben biotechnológiai eredetú emberi inzulint tartalmazó készítmények is feltűntek a piacon.

Az emberi inzulin szerkezetét a következő képlet mutatja

A-lánc

	S-----------------		- S
	1 7		1
H-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-	Cys-Cys-Thr-Ser-	I-le-	Cys-	-Ser-
1 2 3 4 5	6 \| 8 9	10	11	12
	S I
B-lánc	1 S I
H-Phe-Val-Asn-Gln-His-	1 Leu-Cys-Gly-Ser-	His-	Leu-	-Val
1 2 3 4 5	6 7 8 9	10	11	12

A-lánc (folyt.) ²⁰

Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn-OH

14 15 16 17 18 19 |21

IS

I -9

B-lánc (folyt.)S

I

Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 2324

B-lánc (folyt.)

Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-OH

26 27 28 2930

Bizonyos háziállatokból származó inzulinok nagyon hasonlóak az emberi inzulinhoz. így pl. a kutya és a sertés inzulin mindössze abban különbözik az emberi inzulintól, hogy a B-lánc

30. aminosava Alá, a nyúlnál pedig Ser található ugyanebben a pozícióban. Amint azt Morihara és munkátársai a Natúré, 280. (1979), 412-413. számában és Marcussen (USA szabadalmi szám: 4, 343, 898) leírták, ezek az állati inzulinok a B30-aminosav származék Thr-ra történő kicserélésével átalakíthatok emberi inzulinná.

Amikor egy ilyen inzulint fiziológiás pH értéken föloldanak egy koncentráció függő asszociációs egyensúly keletkezik a monomer, dimer, hexamer sőt nagyobb tagszámú polimerek között. Az egyensúly meghatározható egyebek között ultracentrifugálással, ozmolaritás mérésével vagy a gélszűrés módszerével, amint azt R. Valdes Jr. és G. A. Ackers, a Methods in enzimology, 61. (Enzyme structure, part H, eds.: Hirs and Timasheff), Academic Press (1979) 125-142 közleményükben leírták. Az inzulin készítmények normál képleteinél az egyensúly úgy alakul ki, hogy a hexamer forma kerül túlsúlyba.

Az inzulin molekulába különböző szubsztituensek építhetők be azzal a céllal, hogy javuljon az inzulin aktivitásának tartománya a Diabetes kezelése során. A WO 86/05497 számú nemzet • · · ·· ·*· ··· • · · · · közi szabadalomban leírták, hogy az inzulin molekulában levő Glu egy vagy több neutrális aminosavval történő helyettesítése oly módon változtatja meg az inzulin kicsapódását, hogy az injekció beadása után lassú felszívódás figyelhető meg.

Továbbá, az EP 214 826 lajstromszámú európai szabadalomban közzétettek inzulin analógokat, amelyek külünüsen gyorsan abszorbeálódnak az injekció után. Ez a hatás azon a tényen alapul, hogy bizonyos szubsztituációk, melyek az inzulin molekula B9-B12 és a B26-B28 régióiban történnek, szupresszálják az asszociáció irányát, így az inzulin szükségszerűen monomer vagy dimer formában van jelen. Számos ilyen inzulin analóg azonban csökkent biológiai aktivitást mutat.

Az évek során nagy számban írtak le mesterségesen előállított humán inzulin analógokat, rendszerint azzal a céllal, hogy tisztázzák a struktúra aktivitásra gyakorolt hatását. Ilyen közlemény például Marke és munkatársai és Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 360. (1979), 1619-1632 által írt cikkek. Az inzulin (B22-B26) szekvenciájában bekövetkező szubsztitúcióknak a receptor kötődésre gyakorolt hatásának vizsgálata különösen érdekes volt, mivel a nevezett szekvenciáról feltételezték, hogy esszenciális az inzulin receptor kötődése szempont jából és mivel a természetben több mutációt találtak ebben a • · · • · régióban. Lásd S. Shoelson és munkatársai. PNAS 80. (1983),

7390-7394 és M. Kobayashi és munkatársai, Biomed. Rés. fj.. (1984), 267-272 közleményeket. Nagyon alacsony biológiai aktivitásokat kaptak azokkal az analógokkal, amelyekben a B24-es Phe vagy a B25-ös Phe aminosavakat helyettesítették, és ezek *

alapján azt arra következtettek, hogy ennek a két aminosavnak a jelenléte döntő fontosságú a receptor kötődése szempontjából.

Jelen találmány azon a meglepő felismerésen alapul, hogy bizonyos emberi inzulin analógok, amelyekben a Phe⁸²⁴ vagy a Phe⁸²⁵ aminosav származék nincs jelen, gyengén asszociálnak és ugyanakkor a biológiai aktivitásuk nem változott, sót magasabb, mint az emberi inzulin esetében. Akár a Phe⁸²⁴ akár a Phe⁸²⁵ deléciójának a hatására a Lys⁸²⁹ a B28-as helyzetbe kerül. Ez a pozitív változás az emberi inzulinnak ebben a pozíciójában jelentős a találmány szempontjából.

A találmány öszzefoglalása

A találmány legszélesebb értelemben vonatkozik az emberi inzulin analógokra, amelyekben pozitív töltésű aminosav, mint pl. lizin (Lys) vagy arginin (Arg) található a B28-as pozícióban, vagyis a B-láncban, a (ΰ1γ⁸²⁰)-ίό1 számítva a nyolcadik ··· ♦ · ·· · ··· • · · · · helyen.

Ezeknek az inzulin analógoknak meglepően alacsony az asszociációra való hajlamuk, ugyanakkor a fizikai stabilitásuk megnövekedett más, alacsony asszociációs hajlamú inzulin analógokhoz képest. Pozitív töltés bevitele a B28-as helyzetbe két úton történhet. Vagy ki kell ejteni az emberi inzulin B24, B25, B26, B27 vagy a B28 helyeien található aminosav származékokat, ami egy olyan emberi inzulin analóghoz vezet, amelyben a B28 pozícióban lizin van, vagy a humán inzulin B28 helyén lévő prolint kell helyettesíteni lizinnel vagy argininnel. Ha a B28-as helyen arginin beépítése a cél akkor a B24, B25, B26, B27 és a B28 helyeken lévő aminosavak kiejtését lehet kombinálni az eredeti (Lys^B29) aminosav argininnal történő helyettesítésével.

A jelen emberi inzulin analógok tartalmazhatnak továbbá egy vagy több módosítást is a B-lánc C-terminális végén. így a B25 és B27 pozíciókban lévő, valamint a Lys⁸²⁸ vagy Arg⁸²⁸ aminosavakat követően lehetnek tetszőlegesen választott, a természetben előforduló aminosavak, vagy akár a B29 vagy B30, esetleg mindkettő hiányozhat is.

A jelen találmány egyik pontja szerint a Tyr^B26 helyettesíthető egy másik, töltéssel nem rendelkező aminosav szárma• ··

··· zékkal is, amelynek oldalláncában a második szénatom (Cy) sp⁸' ti hibridállapotban van (a kötések síkban helyezkednek el).

Szintén azzal a céllal, hogy stabilizálják a molekulát a kémiai degradációval szemben, helyettesíthetik az A21 és/vagy B3 pozícióban lévő Asn-t egy másik aminosav származékkal.

%

A jelen emberi inzulin analógok a következő képlettel jellemezhetóek (I-es képlet):

A-lánc

S --------------------_s ¹ I

H-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-SerI

S

I

B-lánc S

I H-Phe-Val-Y₂-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-rVal ,· -·\·

A-lánc (folyt.)

Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-y^-OH

I

I-----s i

B-lánc (folyt.) g

I

Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-PheB-lánc (folyt.) • · · * · · ··· ·· ··· • · · · ahol az X_v X₂, X₃, X₅, Y₁ és Y₂ lehet bármely, a természetben előforduló aminosav származék, az X₄ Lys vagy Arg, X₆ bármely természetben előforduló aminosav származék, amely C-terminális hidroxi csoportot vagy -OH-t tartalmaz vagy az X₅ és az X₆együtt képezik a C-terminális hidroxi csoportot.

A találmány megvalósításakor az X₅ lehet bármilyen a természetben előforduló aminosav származék, kivéve a prolint.

A fenti képletben szereplő Y₁ és/vagy Y₂ egy megvalósításkor lehet bármilyen természetben előforduló aminosavszármazék, kivéve az aszparagint.

A fenti (I) képlet esetében

az	X¹	specifikusan Tyr,	lehet	Phe,	Alá, His,	Thr,	Ser, Asn	vagy
az	^X2	specifikusan	lehet	Tyr,	Thr, Glu,	Asp,	Alá, His,	Ser
		vagy Phe	/
az	^X3	specifikusan	lehet	Pro,	Glu, Asp,	Ser,	Thr vagy	His.
az	^X5	specifikusan	lehet	Lys,	Thr, Ser,	Alá,	Asp vagy	Glu,
az	^X6	specifikusan	lehet	Thr-	OH, Ser-ÖH,	Alá·	-OH, Asp-OH,

Glu-OH vagy -OH, az Y₁ lehet Asn, Glu, Asp, His, Ser, Thr, Val, Leu, Ile,

Alá, Met, Trp, Tyr, Gin vagy Gly, de ajánlatosabb Glu, Asp, Glu vagy Alá, *Η ·· * · « az Υ₂ lehet Asn, Glu, Asp, His, Ser, Thr, Val, Leu, Ile,

Alá, Met, Trp, Tyr, Gin vagy Gly, de ajánlatosabb Glu vagy Asp.

Az emberi inzulin analógok egy csoportja jellemezhető azzal, hogy a B24 és B25 helyzetekben eltávolított aminosav származékokat követő, B26 aminosav származékot helyettesítik egy másik, semleges töltésű aminosavval, amelyben a γ-helyzetben levő szénatom sp² hibridállapotban van, valamint azzal, hogy az A21, B3 és B30 helyeken lévő egy vagy több aminosav származék különbözik az emberi inzulin megfelelő helyein található aminosavaktól, továbbá azzal, hogy a B30 pozícióban nincs aminosav származék.

Egy egyszerűbb meghatározás alapján, analógok azok a peptidek, amelyekben az emberi inzulin Tyr^B26 pozíciója hiányzik, amelyekben a Phe^B25-ot tetszőleges semleges töltésű aminosav helyettesíti, amelyben a γ-helyzetben lévő szénatom sp² hibridállapotban van, amelyekben a A21, B3 és B30 helyeken levő aminosav származékok közül egy vagy több különbözik az emberi inzulin aminosav származékaitól és amelyekben a B30 pozícióban nincs aminosav származék.

A semleges töltésű aminosav, amelyben a C_y sp² hibridállapotban van lehet Tyr, Phe, His, Trp és Asn.

A fent említett emberi inzulin analógok esetében lehetséges további helyettesítéseket és módosításokat is végrehajtani, amennyiben a tulajdonságok nem változnak meg lényegesen. Ilyen további módosítások lehetnek például a karboxil csoportok észterezése vagy amídálása, az amino vagy hidroxil csoportok alkilezése vagy a karboxamid csoportok deaminálása. További szubsztitúció lehet a Thr^A8 His-re vagy a His^B1° Asp-ra történő kicserélése. Lehetséges még hozzáadni vagy eltávolítani egy vagy néhány aminosav származékot elsősorban a B-lánc Cés/vagy N-terminális végéhez.

A találmány tárgyát képező emberi inzulin analógok egyik csoportjának az alábbi (II) képletben bemutatott szerkezete van, ahol az X jelentése Tyr, His, Phe vagy Asn, az Y pedig Thr, Ser, Alá, Asp vagy Glu vagy egy deléció és ahol tetszőlegesen egyik vagy mindkét aláhúzott Asn-t szubsztitúcióval, deaminálással Asp-ra változtatják, illetve az A-láncban az aláhúzott Asn lehet Gly.

A-lánc S

I I

H-Gly-lle-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-SerI s

I

B-lánc S

I

H-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val

A-lánc (folyt.) (II)

Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn-OH

B-lánc (folyt.)

1------S 1 s %

Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-PheB-lánc (folyt.)

X-Thr-Pro-Lys-Y-OH

A találmány szerint leginkább preferált emberi inzulin analógok a következők:

des \|	[Phe^B2S]	\| -emberi	inzulin
desfTyr⁸²⁶ ]	\| -emberi	inzulin
des \|	[Thr⁸²⁷ ]	\| -emberi	inzulin
des \|	[Pro⁸²⁸ ]	\| -emberi	inzulin
des \|	[Phe^B2S]	\|-sertés	inzulin
des \|	[Pro⁸²⁸ ]	\|-sertés	inzulin
des \|	[Pro⁸²⁸ ]	\|-nyúl inzulin
des \|	[ Phe^B25 ]	\|, des [Thr⁸³⁰]-emberi	inzulin
des [Tyr⁸²⁶ ]	des [ Thr⁸³⁰ ]-emberi	inzulin

[Ser^A21]	-des [Pro⁸²⁸]-emberi inzulin
[Gly^A21 ]	-des [Pro⁸²⁸ ]-emberi inzulin
[Gly^A21 ]	-des [ Phe⁸²⁵ ]-emberi inzulin
[ Asp^A21 ]	-des [Phe⁸²⁵ ]-emberi inzulin
[His⁶²⁵ ]	-des[Tyr⁸²⁶ ], des[Thr⁸³⁰ ]-emberi	inzulin
[ Asn⁸²⁵ ]	-des [Tyr⁸²⁶ ], des [Thr⁸³⁰ ]-emberi	inzulin
[ Asp^A21 ]	-des [Phe⁸²⁵ ], des [Thr⁸³⁰ ] -emberi	inzulin
[ Asp⁸²⁸ ]	-des [Phe⁸²⁵ ]-emberi inzulin
[Asp⁸³]-	-des [Phe⁸²⁵ ]-emberi inzulin
[Lys⁸²⁸ ]	-emberi inzulin
[Lys⁶²⁸,	Thr⁸²⁹ ]-emberi inzulin
[ Arg⁸²⁸]	-des [Lys⁸²⁹ ]-emberi inzulin

A találmány tárgyát képező emberi inzulin analógok előnyösen használhatók a Diabetes kezelésére, mivel csökkent aszszociációs képességük révén gyorsabban szívódnak fel a véráramba, mint a közönséges inzulin, nemcsak az általánosan használt bőr alá adott injekció esetében, hanem non-parenterális használat esetén is, amint azt a Nemzetközi Szabadalmi Közlönyben a WO87/06137 számú szbadalomban is leírják. Megnövekedett fizikai stabilitásuk is előnyösebbé teszi őket a cukorbe tegség kezelésében.

• * · · · ·· · ··· ·· ··· ··· • · · · ·

A találmány tárgyát képező inzulin analógok a proinzulin gén átalakításával állíthatók elő, mégpedig oly módon, hogy az eredeti humán proinzulin génben a megfelelő helyen kicserélik a kodon(oka)t a kívánt aminosav származékot kódoló bázis triplet(ek)re és/vagy kiejtik a kívánt kódoló rész(eke)t. Alternatív megoldásként, a kívánt inzulin analógot kódoló egész DNS szekvenciát lehet szintetizálni. A kívánt inzulin analógot kódoló gént azután egy megfelelő expressziós vektorba klónozzák, amelyet egy alkalmas gazdába, baktériumba, pl. E. coli-ba. Bacillus-ba vagy élesztőbe transzformálják, ami termeli a várt terméket. A megtermelt peptidet ezután a sejtekből vagy a fermentációs táptalajból nyerik ki, attól függően, hogy az expresszált géntermék kijut-e a sejtekből vagy sem.

Inzulin analógok kémiai szintézissel is előállíthatok a Márki és munkatársai (Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem..360 (1979), 1619-1632) által leírt módszerrel analóg eljárásokkal. A megfelelő aminosav szubsztitúciókat és deléciókat tartalmazó A- és B-láncok külön is szintetizálhatók, ami után a módosított A- és B-láncok diszulfid hidak létrejöttével kapcsolhatók össze az ismert módszer alapján, melyet Chance és munkatársai tettek közzé (Rick DH, Gross E (eds) Peptides: Synthesis Structure - Function. Proceedings of seventh American peptide • 4 ·· «V ··

4 · 4 · · ·

4·· ·· ··· ·<· • * 4 4 4 symposium, Illionis, pp. 721-728) .

Az inzulin analógok előállíthatok továbbá a 01635229A lajstromszámú Európai Szabadalmi leírásban közzétett módszer szerint. Ilyen módszerrel a B28 vagy B29 helyzetben bázikus aminosavat (amennyiben a végtermékben is bázikus aminosav van ezen a helyen) tartalmazó humán inzulin analóg prekurzora a Gly^Al-hez kapcsolt és az élesztő expresszálja és választja ki. Ezt peptid kötést vagy a különböző hosszúságú peptidláncot a megfelelő helyzetű diszulfid hidakkal, azután Morihara módszerrel vagy az úgynevezett transzpeptidálási reakcióval (lásd a 4, 343, 898. lajstromszámú Amerikai szabadalmat) átalakítják a kívánt emberi inzulin analóggá.

A találmány tárgyát képező inzulin analógok előállíthatok oly módon, hogy a kérdéses inzulin analóg prekurzort kódoló DNS szekvenciát klónozzák egy megfelelő élesztő expressziós vektorba, amely miután betranszformálták az élesztőbe, megfelelő táptalajban tenyésztve a transzformánsokat, képes expresszálni és kiválasztani az inzulin analóg prekurzorát, amelyben [Lys^B28J, [Arg^B28], [Lys⁶²⁹ ] vagy [Arg⁸²⁹ ] van a Gly^A1-hez kapcsolva egy peptid kötéssel vagy a III-as képlettel jellemzett peptidlánccal,

-R -R¹n (III) ahol az R egy n számú aminosav származékot tartalmazó peptidlánc, amikor az n egy 0-tól 33-ig terjedő egész szám, az R¹ pedig Lys vagy Arg. A prekurzot ezután kinyerik a fermentációs táptalajból és a IV-es képlettel jellemzett

Q -OR (IV) *

amino vegyülettel reagáltatjak, ahol a Q egy aminosav származék, leginkább Thr, vagy egy dipeptid, az R pedig védő, karboxi csoport (általában metil vagy tercier-butil származék). A reakciót a 4, 343, 898 lajstromszámú Amerikai szabadalomban leírt módszerrel analóg módon végzik szerves oldószer és víz keverékében tripszint vagy tripszin szerű enzimet használva katalizátorként, miáltal a védő kardoxi csoportot eltávolítják és az inzulin analógot a reakció elegyből izolálják.

Amennyiben az inzulin analógok Lys-től vagy Arg-től különböző aminosav származékot tartalmaznak a B-lánc C-terminális végén, szintén előállíthatok az EP195 691 lajstromszámon közzétett Európai Szabadalomban leírt módszerrel analóg eljárással. Ennél a módszernél, az A- és B-láncok között egy pár bázikus aminosavból (Lys, Arg) álló hidat tartalmazó inzulin analóg prekurzorokat élesztőben állítják elő és azután enzimes konverzióval alakítják át inzulin analóggá.

Ha a B-láncban a C-terminális aminosv származék Lys vagy

Arg akkor az inzulin analógok előállíthatok a fenti bioszintetikus prekurzorból, tripszinnel végzett enzimatikus hasítással.

A találmány tárgyát képező emberi inzulin analógok, amelyekben a csak a B-lánc C-terminális végéhez legközelebb eső utolsó néhány aminosav származék tartalmaz szubsztitúciókat per se is előállíthatok mégpedig sertés inzulinból, mivel a sertés inzulin, amint azt Inoye, K. és munkatrásai JACS 101. (3), 1978, 751-752 közleményükben leírják, tripszinnel hasítható des-(B23-30)- emberi inzulinra, amely azután szintén enzimatikusan, párosítható a kívánt aminosav szekvenciájú szintetikus pepiiddel.

Az inzulin analógok felhasználhatók új inzulin készítmények előállítására, amelyekben az inzulin aktivitást a szakterületen ismert inzulin készítési módokon emberi vagy sertés inzulinnal helyettesítik. Az ilyen, új inzulin készítmények a találmány tárgyát képező inzulin analógokat vagy a gyógyszergyártásban elfogadott sókat tartalmaznak vizes oldatban vagy szuszpenzióban, leginkább semleges pH értéken. A vizes közeget izotóniásra készítik nátrium klorid, nátrium acetát vagy glicerin hozzáadásával. A vizes közeg tartalmazhat továbbá cink ionokat, puffereket pl. acetát és citrát, valamint tartósító-

szereket mint az m-krezol, metil-paraben vagy fenol. Az inzulin készítmény pH-ját a kívánt értékre állítják és szűréssel sterilezik.

Az inzulin analógokat keverhetik egyéb megvédett inzulin aktivitással rendelkező analógokkal is annak érdekében, hogy *

gyorsan ható és megvédett inzulint tartalmazó készítményeket kapjanak.

A találmány inzulin készítményei a már ismert inzulin készítmények alkalmzásához hasonló módon használhatók fel.

SZAKKIFEJEZÉSEK

Az aminosavak esetében használt rövidítések a J. Bioi.

Chem. 243 (1968), 3558 számában megállapítottak. Az aminosavak L-konfigurációban vannak. Ha külön nem jelezzük, akkor minden esetben az emberi inzulinról van szó.

A RAJZOK RÖVID LEÍRÁSA

A találmány leírásában illusztrációként mellékelünk ábrákat, amelyekben bemutatjuk

1. ábrán a pYGABA 14276 expressziós plazmidot,

2. ábrán a pAB24 élesztő vektort

3. ábrán a pKFN-864 plazmidból származó 0.4kb méretű

EcoRI-Xbal fragmentum DNS szekvenciáját és

4. ábrán a pKFN-866 expressziós plazmid készítését.

RÉSZLETES LEÍRÁS

A módosított inzulin prekurzort kódoló DNS szekvenciát egy expressziós kazettában készítettük, amely az 1. ábrán bemutatott pYGABA expressziós plazmid BamHI helyén található, 1103 bázispár hosszú és tartalmazza a következőket (az 5'-végról kiinduló sorrendben): A GAPDH promoter (Travis és munkatársai, J. Bioi. Chem., 260. (1985), 4384-4389), utána a kódoló régió, amely tartalmazza: a Kurján és Herskovitz által leírt vad típusú élesztő DNS szekvenciája által kódolt MF al-vezér szekvencia N-terminálisának 83 aminosavát, majd a Lys-t és Arg-t kódoló AAA és AGA tripleteket és az egy szálú des[Thr^B3°]-emberi inzulin (SCI) prekurzort kódoló régiót, amely az élesztő által preferált kodonokat fölhasználó szintetikusan előállított gén. Két stop kodon után egy Sáli restrikciós hely található és a maradék szekvencia a terminátor régiót tartalmazó MFal-szekvencia. A szekvenciát az általánosan használt technikák alkalmazásával készítettük.

Az alkalmazott módszer az oligonukleotid helyspecifikus mutagenezis volt, amelyet Zoller és Smith írtak le a DNA, Vol. 3.z No. 6 (1984), 479-488 számában. A következőkben röviden leírjuk a módszert, az 1. Példában azonban hosszab leírása is megtalálható. Az inzulin prekurzor szekvenciát az expreszsziós plazmidból izoláljuk és egy egyszálú genomba építjük be, *

a kör aalkú M13 bakteriofág vektorba. Ezután a kémiailag szintetizált komplementer DNS szálat csatoljuk az egyszálú genomhoz. A DNS szál tartalmazza a kívánt szekvenciát, környezetében pedig az inzulin szekvenciával teljesen homológ részek találhatók a kör alakú DNS-en. Ezt követően in vitro. Klenow polimerázt használva biokémiailag teljesen kiterjesztjük a prímért a kör alakú genom teljes hosszában. Ez a szál egyszálú fágokat eredményez, amelyek E. coli-ban növesztve lehetőséget adnak dupla szálú DNS izolálására. Ebből a dupla szálú DNS-ből azután lehet restrikciós fragmentumot izolálni és egy expresz sziós vektorba újra beépíteni.

A TALÁLMÁNY MEGVALÓSÍTÁSI MÓDJAI

A találámányt az alábbi példákon keresztül mutatjuk be.

I. Példa

A des [Phe^B25]-SCI inzulin analóg expresszálálására használható expressziós plazmid készítése.

A pYGABA (1. ábrán bemutatott) expressziós plazmidban lévő expressziós kazettát egy BamHI restrikciós fragmentumon izoláltuk. Az expressziós vektort BamHI restrikciós endonukleázzal inkubáltuk az alábbi körülmények között: 20 μς plazmid DNS, 50 egység BamHI. 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH=7.5, 10 mM MgCl₂, és 1 mM DTT 100 μΐ össz-térfogatban. A hőmérséklet 37 °C, a reakció idő 2 óra volt. A két fragmentumot 1%-os agaróz gélen választottuk el, majd a kívánt DNS darabot visszaizoláltuk .

Ligálás az M13mpl8 vektorba

Az izolált restrikciós fragmentumot, az előzőleg szintén BamHI restrikciós endonukleázzal emésztett M13mpl8 fágvektorba ligáltuk a következő reakció elegyben: 0.2 μg fragmentum, 0.02 μg vektor, 50 mM Tris-HCl, pH=7.4, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT és 1 mM ATP 20 μΐ össz-térfogatban. Ebből az elegyből 5 μΐ-t ·· transz-formáltunk az E. coli JM101 törzsbe. A fragmentum meglétét és orientációját a vektorban a transzformánsokból izolált dupla szálú M13 DNS restrikciós térképezésével ellenőriztük .

Egvszálú DNS (ss-DNS^ izolálása (templát^ %

A fenti transzformánsokból Messing által a Gene-ben (19. (1982) 269-276) leírt módszer alapján izoláltunk egyszálú DNSt.

A mutagenizációs primer 5' foszforilálása

Az 5'-TTGGAGTGTAGAAACCTCTT-3' szekvenciájú mutagenizációs primer 5' végét 30 μΐ reakció elegyben végeztük, amely a következő komponenseket tartalmazta: 70 mM Tris-HCl, pH=7.0, 10 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 1 mM ATP, 100 pmol oligonukleotid és 3.6 egység T4 polinukleotid kináz. A reakció idő 30 perc, a hőmérséklet 37 °C volt. Ezután inaktiváltuk az enzimet 65 °C-on, 10 percig tartó inkubálással.

A templát és a foszforilált mutagenizációs primer csatolása

A templát és a primer cstolását 10 μΐ térfogatban hajtottuk végre. A reakcióelegy tartalmazott 0.5 pmol templátot, 5 pmol prímért, 20 mM Tris-HCl-t, pH=7.5, 10 mM MgCl₂~ot, 50 mM NaCl-ot és 1 mM DTT-t. 65 °C-on melegítettük 10 percig, majd

lehűtöttük 0 °C-ra.

Extenzió és ligálás

A fenti reakcióelegyhez 10 μΐ-t adtunk a következő keverékből: 0.3 mM dATP, 0.3 mM dCTP, 0.3 mMclGTP, 0.3 mM dTTP, 1 mM ATP, 20 mM Tris-HCl, ,pH=7.5, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 3 egység T4 ligáz és 2.5 egység Klenow polimeráz. A reakciót ezután 16 °C-on végeztük 16 órán keresztül.

A JM101 transzformálása

A fenti reakció elegyet különböző hígításokban transzformáltuk CaCl₂-dal kezelt E. coli JM101 törzsbe az általános módszerrel és 2 X YT lemezek felületére kentük ki 2 X YT topagarban. (2 X YT=16 g/1 tripton, 10 g/1 élesztő kivonat, 5 g/1 NaCl; 2 X YT topagar= 2 X YT kiegészítve 0.4% agarózzal és autoklávozva; 2 X YT agar lemez= 2 X YT kiegészítve 2% agarral és autoklávozva) Ezután a lemezeket 37 °C-on inkubáltuk egy éjszakán át.

A pozitív kiónok azonosítása

A plakk hibridizációt használtuk, amelyet az alábbiakban ismertetünk: Nitrocellulóz filtert helyeztünk a lemezek felületére, úgy, hogy a plakkok jól látszódjanak, tehát a filtert előzőleg megnedvesíttük. Ezután a filtert a következő oldatokba tettük: 1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH 30 másodpercre, 1.5 M NaCl,

0.5 M Tris-HCl, ρΗ=8.0 1 percre, 2Χ SSC (0.3 Μ NaCl, 0.03 Μ nátrium-citrát) a felhasználásig. A filtert 3MM szűrőpapíron szárítottuk és 80 °C-on, 2 óráig sütöttük vákum sütőben.

Az 5'-TTGGAGTGTAGAAACCTCTT-3' szekvenciájú mutagenizációs prímért radioaktívan jelöltök az 5*-végén 30 μΐ reakcióelegyben, amely tartalmazott70 mM Tris-HCl-t pH=7.5, 10 mM MgCl₂-ot, 5 mM DTT-t, 10 pmol oligonukleotidot, 20 pmol y-³²P-ATP-t és 3.5 egység T4 polinukleotidkinázt. Az elegyet 37 °C-on inkubáltuk 30 percig, majd 100 °C-ra tettük 5 percre.

A száraz filtert 2 órán keresztül 65°C-on előhibridizáltűk 6 X SSC, 0.2% bovin-szérum albumin (BSA), 0.2% Ficoll, 0.2% polivinil-pirrolidin, 0.2% nátrium-lauril-szulfát (SDS) és 50 gg/ml hering sperma DNS tartalmú hibridizációs pufferben. Ezután a jelölt próbát tartalmazó reakcióelegyet hozzáadtuk 15 ml friss hibridizációs pufferhez és ebben inkubáltuk a filtert 28 °C-on egy éjszakán keresztül rázatva. A hibridizáció után a filtert 3 X 15 percig mostuk 2 X SSC-t + 0.1% SDS-t tartalmazó oldatban, majd autoradiografáltűk. A mosás után ugyanabban az oldatban, de most 52 °C-on és másik autoradiográfiával a mutagenizációs printerrel komplementer DNS szekvenciákat tartalmazó plakkokat azonosítottuk.

A pozitív klőnok ismételt vizsgálata

Mivel az azonosított klón heteroduplex eredménye, a plakkot újra kiszélesztettük lemezre, majd megismételtük a hibridizációt és az azonosítást.

Duplaszálú M13-fág DNS tisztítása

Az újra ellenőrzött kiónt használtuk az E. coli JM101 törzs fertőzésére. Egy megközelítőleg 10⁸ fágot és 5 JM101 telepet tartalmazó tenyészet 5 ml-ét növesztettük 5 órán keresztül 37 °C-on 2 x YT táptalajban. Ezután duplaszálú, cirkuláris DNS-t tisztítottunk a csapadékból a Bimbóim és Doly által a Nucleic Acids Rés.-ben (2. (1979), 1513.) leírt módszer szerint.

A módosított inzulin prekurzort tartalmazó restrikciós fragmentum izolálása

A fenti módon izolált izolált (körülbelül 5 μg) DNS készítményt 10 egység BamHI restrikciós endonukleázzal emésztettük 60 μΐ, 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH=7.5, 10 mM MgCl₂ és 1 mM DTT tartalmú oldatban 2 órán keresztül 37 °C-on. A DNS termékeket agaróz gélen különítettük el majd a fragmentumot gélből tisztítottuk.

Ligálás a PAB24 élesztő vektorba (2. ábra)

Az izolált restrikciós fragmentumot az előzőleg BamHI • · .:. .· ·· ·· restrikciós endonukleázzal emésztett pAB24 élesztő vektorba ligáltuk a következő reakcióelegyben: 0.2 μg fragmentum, 0.02 μg vektor, 50 mM Tris-HCl,pH=7.4, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT és 1 mM ATP 20 μΐ össz-térfogatban. Ennek a reakcióelegynek az 5 μΐ-ét használtuk az MC1061 E. coli törzs, transzformálására, amelyben a módosított expressziós plazmidot azonosítottuk és szaporítottuk. A kiejtett kodon kivételével a plazmid megegyezett pYGABA plazmiddal.

Az élesztő transzformálása

Az expressziós plazmid transzformálását a Saccharomvces cerevisiae JC482ApepÁLeu2cir· (a, his4, pep4, ura3, leu2,cir^-) törzsébe az Ito és munkatársai által a J. Bacteriol.-bán (153. No.l (1983), 163-168) leírt módszer szerint végeztük. A transzformált sejteket SC-ura táptalajra (0.7% Yeast Nitrogén Base, 2.0% glükóz, 0.5% casamino sav, 2.0% agar) kentük ki a plazmidot tartalmazó sejtek szelektálására.

II. példa

A des [Tyr^B26]-SCI termelésére használható expressziós plazmid készítése.

Az alkalmazott eljárás megegyezik az I.példában leírtakkal, azzal a különbséggel hogy, a mutagenizációs primer szék

venciája: 5'-ACCCTTTGGAGTGAAGAAACCTCT-3', a hibridizáció hőmérséklete 36 °C és a hibridizáció utáni mosás 60 °C-on történt. A kiejtett kodon kivételével a módosított plazmid szekvenciája azonos a pYGABA plazmádéval.

•III. példa

A [His⁸²⁵ ] ,des [Tyr^B26]-SCI termelésére használható expressziós plazmid készítése.

Az alkalmazott eljárás megegyezik az I. példában leírtakkal azzal a különbséggel hogy, a mutagenizációs primer szekvenciája: 5'-AATACCCTTTGGAGTGTTGAAACCTCTTTCACC-3', a hibridizáció hőmérséklete 42 °C volt és a hibridizáció utáni mosás 65 °C-on történt. A módosított és kiejtett kodonok kivételével a módosított plazmid szekvenciája megegyezik a pYGABA plazmádéval .

IV. példa

A [ Asn⁸²⁵ ], des [ Tyr⁸²⁶ ]-SCI termelésére használható expressziós plazmid készítése.

Az alkalmazott eljárás megegyezik az I. példában leírtakkal azzal a különbséggel hogy, a mutagenizációs plazmid szekvenciája: 5--AATACCCTTTGGAGTGTTGAAACCTCTTTCACC-3', a hibridizáció hőmérséklete 42 °C volt és a hibridizálás után a mosás 65 °C-on történt. A módosított és kiejtett kodonok kivételével a

módosított plazmid szekvenciája megegyezik a pYGABA plazmádéval .

V, példa

A prekurzor expressziója és izolálás a táptalajból.

Az I.-IV. példákban leírt módon transzformált élesztő sejteket Petri-csészében, minimál táptalajon, uracil nélkül növesztettük 48 órán keresztül, 30 °C-on. A Petri-csészéből származó egy teleppel inokuláltunk 100 ml-es palckokat, amelyekben uracil nélküli, 5 g/1 casamidosavat + 10 g/1 szukcinilt + 30 g/1 glükózt tartalmazó, pH=5.0 minimál táptalaj volt. A palackokat 30 °C-on rázattuk 72 órán keresztül.

Centrifugálás után az összegyűjtött 1 liter felülúszót szűréssel sterileztünk és 5 M HC1 és víz hozzáadásával beállítottuk a pH=4 - 4.5, valamint vezetőképesség 10 mS-nél kisebb értékét. Ezt a felülúszót azután egy előzőleg 50 mM ecetsav, 50% (tf) pH=4.0 (NaOH-val beállítva) eleggyel telített, 1.6 x 6 cm S/Sepharose FF töltetű oszlopra vittük 120 ml/óra áramlási sebességgel. Az oszlopot 60 ml pufferrel mostuk, majd a prekurzort eluáltuk 360 ml NaCl puffer 0 - 0.35 M lineáris gradiensével, 10 ml/óra térfogatárammal. Az eluátumot 4 ml-es frakciókra osztottuk és UV abszorbanciát mértünk. A prekurzort tartalmazó frakciókat RP-HPLC analízissel azonosítottuk és • ·· öszszegyűjtöttük. Sephadex G25 oszlopon, 1 M ecetsavval végzett sótalanítás után liofilezéssel izoláltuk a prekurzort.

VI, példa

A des [Phe⁸²⁵ ],des [Thr⁸³⁰ ]-emberi inzulin előállítása

Az I. és V. példákban leírt módokon készített 400 mg des [Phe⁸²⁵ ]-t felodottunk 40 ml 50 mM tris-hidroximetil-aminometán és 20% (tf) etanol, pH=9.0 (HC1) tartalmú oldatban és hozzáadtunk 40 ml, 32 mg immobilizált tripszint tartalmazó Sepharose ugyanabban a pufferben készült keverékét. A szuszpenziót 8 -10 °C-on hagytuk 24 óráig, gyengén rázatva, majd leszűrtük. A gélt 40 ml pufferrrel mostuk és az összegyűjtött szűrleteket előzőleg 50 mM tris-hidroximetil-aminometán, 50% (tf) etanol, pH=8.0 (HC1) tartalmú oldattal telített, 2.6 x

7.5 cm méretű Q-Sepharose FF oszlopra vittük. Ezután eluáltuk az oszlopot NaCl puffer 0 - 0.15 M gradiensével, 6 órán keresztül 225 ml/óra térfogatárammal. A frakciókat UV abszorbanciával vizsgáltuk és a fő proteint tartalmazó csúcsot összegyűjtöttük. Az alkohol vákuumos eltávolítása után a fehérjét pH=5.4-en kicsaptuk. 250 mg des [Phe⁸²⁵ ], des [Thr⁸³⁰ ]-emberi inzulin izoláltunk liofilezéssel.

A termék azonosságát megerősítettük aminosav analízissel, PDtömegspektrometriával és az elválasztott, vinilpiridilált A29 és B-láncok Eciman degradálásával.

VII. példa

A des [Phe^B2S]-emberi inzulin előállítása.

A VI. példában leírt módszerekkel készített 200 mg des [ Phe^B2S ], des [ Thr^B3° ]-emberi inzulint feloldottunk 400 mg treonin metil észter, 2.0 ml etanol és 0.8 ml víz keverékében. A pH-t ecetsavval beállítottuk 6.3-ra és 4 ml 3.2 mg immobilizált tripszint tartalmazó Sepharose keveréket adtunk hozzá. 2 óra 20 °C-on végzett gyenge rázatás után a gélt szűréssel eltávolítottuk és a fehérjét 10 térfogat 2-propanol hozzáadásával kicsaptuk. A légszáraz csapadékot újraoldottuk 20 mM tris-hidroximetil-aminometán/HCl, 60% (tf) etanol, pH=8.25 oldatban és 2.6 x 20 cm méretű Q-Sepharose FF oszlopra vittük, amelyet előzőleg a fenti pufferrel telítettük, majd NaCl ugyanezen pufferben készült lineáris grádiensével eluáltuk 15 órán keresztül, 125 ml/óra térfogatárammal. A des[ Phe^B2S]-humán inzulin-B30-metil észterét tartalmazó összegyűjtött frakciókról vákumban eltávolítottuk az alkoholt és a fehérjét pH=6.1 mellett kicsaptuk. A szuszpenziót lecentrifugáltuk és a csapadékot liofileztük. A metil észtert ezután 10 mg/ml fehérje koncentrációnál 10 percig hidrolizáltűk 0.1 M hideg NaOH oldatban. A reakciót pH=8.5 beállításával és 2 tér-

fogat 20 mM tris-hidroximetil-aminometán/HCl pH=8.5 hozzáadásával állítottuk le. Az oldatot ezután 2.6 x 20 cm méretű QSepharose FF töltetű oszlopra vittük és a fentebb leírt módon eluáltuk. Az etanol vákumos eltávolítása után a fehérjét pH=5.5 beállításával kicsaptuk.

mg des[Phe^B25J humán inzulint kaptunk liofilezés után.

A termék azonosságát aminosav analízissel, PD-tömegspektrometriával és a szétválasztott, vinilpiridlált A- és B-láncok Edman degradálásával erősítettük meg.

VIII, példa

A des [Tyr^B26], des [Thr^B3°]-humán inzulin előállítása

A II és V. példákban leírt módokon készült 250 mg des[Tyr^B26]-SCI-t felodottunk 25 ml 50 mM tris-hidroximetil-aminometán, 20% (tf) etanol, pH=9.0 /HC1 oldatban és hozzáadtunk 25 ml, 20 mg immobilizált tripszint tartalmazó Sepharose ugyanezen pufferben készült szuszpenzióját. A szuszpenziót 24 órán keresztül gyengén rázattuk 8-10 °C-on és utána leszűrtük. A gélt 25 ml pufferrel mostuk és az összegyűjtött szűrletet 2.6 x 7.5 cm méretű Q-Sepharose töltetű oszlopra vittük, amelyet előzőleg telítettünk, 50 mM tris-hidroximetil-aminometán és 50% (tf) etanol pH=8.0 (HC1) tartalmú oldattal. Ezután eluáltuk az oszlopot NaCl ugyanezen pufferben készült 0 - 0.15 M

lineáris gradiensével 6 órán keresztül 225 ml/óra térfogatárammal. Az eluátumot UV-abszorbanciával vizsgáltuk és a fő protein csúcsot tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük. Az alkohol vákumos eltávolítása után a fehérjét pH=5.4 beállításával kicsaptuk.

130 mg des [Tyr^B26] ,des [Thr^B3°] -humán inzulint izoláltunk liofilezés után.

A termék azonosságát aminosav analízissel és a szétválasztott, vinil-piridilált A- és B-láncok Edman degradálásával erősítettük meg.

IX. példa

A des [His®²⁵] ,des [Tyr⁸²⁶] ,des [Thr^B3°]-humán inzulin előállítása.

A III. és V. példákban leírt módszerekkel készített [His⁸²⁵ ], des [Tyr⁸²⁶]-SCI 450 mg-ját feloldottuk 45 ml 50 mM trishidroximetil-aminometán és 20% (tf) etanol, pH=9 (HC1) oldatában majd hozzáadtunk ugyanezen pufferben készült, 36 mg immobilizált tripszint tartalmazó Sepharose-t. A szuszpenziót lassan rázatva állni hagytuk 24 órán keresztül 8 -10 °C-on, majd leszűrtük. A gélt 40 ml pufferrel mostuk és az összegyűjtött szűrletet 2.6 x 7.5 cm méretű Q-Sepharose FF oszlopra vittük, amelyet előzőleg 50 mM tris-(hidroximetil)-aminometán és 50% etanol tartalmú, pH=8.0 (HC1) pufferrel telítettünk. Ezután eluáltuk az oszlopot NaCl uganezen pufferben készült ineáris gradiens oldatával (0 - 0.15 M) 6 órán keresztül, 225 ml/óra térfogatárammal. Az eluátumot UV-abszorbanciával vizsgáltuk és a fő protein csúcsot tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük. Az alkohol vákuumos eltávolítása után a pH=5.4 beállításával kicsaptuk a fehérjét.

200 mg [His⁸²⁵ ], des [Tyr⁸²⁶ ], des [Thr⁸³⁰ ]-humán inzulint izoláltunk liofilezéssel.

X. példa

Az [ Asn⁸²⁵ ], des [Tyr⁸²⁶ ], des [Thr⁸³⁰ ]-emberi inzulin előállítása

A IV. és V. példákban leírt módszerek szerint készített [ Asn⁸²⁵ ] , des [Tyr⁸²⁶ ]-SCI-ből 150 mg-ot feloldottunk 15 ml 50 mM tris-(hidroximetil)-aminometán, 20% (tf) etanol, pH=9 (HC1) oldatában és hozzáadtunk 12 mg immobilizált tripszint tartalmazó Sepharose, ugyanezen pufferben készült szuszpenziójából 15 ml-t. A szuszpenziót 24 órán át gyengén rázattuk 8-10 °Con, majd leszűrtük. A gélt 40 ml pufferrel mostuk, majd az összegyűjtött szűrleteket 1.6 x 10 cm méretű Q-Sepharose FFből készült oszlopre vittük, amelyet előzőleg 50 mM tris-(hidroximetil)-aminometán, 50% (tf) etanol, pH=8.0 (HC1) oldattal telítettünk. Az oszlopot ezután NaCl ugyanezen pufferben készített lineáris grádiens oldatával (0 - 0.15 M) eluáltuk 6 órán keresztül 90 ml/óra térfogatárammal. Az eluátumot UV-abszorbanciával vizsgáltuk és a fő protein csúcsot tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük. Az alkohol vákuumos eltávolítása után a pH=5.4 beállításával kicsaptuk a fehérjét.

mg [Ans⁶²⁵ ], des [Tyr^B26], des [Thr^B3°]-humán inzulint izoláltunk liofilezés után.

XI. példa

Az [ Asp^A21 ], des [Tyr^B26], des [Thr^B3° ]-humán inzulin előállítása

A VI. példában leírt módszerek szerint készített des[ Phe^B2S ], des [ Thr^B3° ]-humán inzulinból 50 mg-ot feloldottunk 10 ml, 1 M HCl-lel 2-re állított pH-jú vízben. Az oldatot 30 °C-on hagytuk 16 órán keresztül. Lehűlés (20 °C-ra) után 7.5 g karbamidot adtunk hozzá és a pH=8.1 értéket állítottuk be 1 M NaOHdal. Az oldatot ezután egy 1.6 x 20 cm méretű Q-Sepharose FF ··· ·· · ·· • · · ♦ oszlopra vittük, amelyet előzőleg 20 mM tris-(hidroximetil)-aminometán/HCl, 7 M karbamid, pH=8.1 oldattal telítettünk 4 °Con, majd NaCl, ugyanezen pufferben készült lineáris gradiens oldatával (0 - 0.05 M) eluáltuk 24 órán keresztül 40 ml/ óra térfogatárammal. Az utolsó eluálódó csúcsból összegyűjtöttük a proteint tartalmazó frakciókat és Sephadex G25 oszlopon 1 M ecetsavval sótalanítottuk, majd liofileztük.

mg [ Asp*²¹ ],des [Phe^B2S], des [Thr⁸³⁰] -humán inzulinhoz jutottunk.

A termék azonosságát aminosav analízissel, 5 lépéses Edman degradálással és karboxipeptidáz-A-val végzett C-terminális analízissel erősítettük meg.

XII. példa

A [Ser*²¹ ], des [Pro⁸²⁸ ]-humán inzulin előállítása

A [Ser*²¹ ], des [Pro⁸²⁸ ] -humán inzulin előállítására használható expressziós plazmid készítése és a [ Ser^A21 ], des [ Pro⁶²⁸ ]-humán inzulin készítése.

Az analógot kódoló, pUC19 eredetű, pKFN - 864 plazmidot a pKFN -734 plazmidból, a Morinaga és munkatársai által leírt (Biotechniology 2. (1984), 636-639), gapped duplex mutagenezis-nek nevezett módszerrel készítettük két mutagén primer, a

NOR-648 CTAGAGCCTGCGGGCTGCGTCTAGCTGCAGTAG és a NOR-745 ATTGTT

CGACAATACCCTTAGCAGCCTTGGTGTAGAAGAAACCTCTTTCACC felhasználásával. A pKFN-734 plazmidot úgy készítettük, hogy a pUC-19 2.7 kb méretű EcoRI-Xbal fragmentumába ligáltunk egy 0.4 kb nagyságú EcoRI-Xbal fragmentumot, amely a pLaC212spx3 plazmidból származó szintetikus inzulin prekurzor [B(1-29)-AlaAlaLys-A(1*

21)] génhez frame-ben kapcsolt élesztő vezető szignált kódolt.

A pLaC212spx3 plazmid megtalálható a III. példa leírásában és a 6. ábrán, valamint a nemzetközi szabadalmi leírásban a WO 89/02463 lajstromszám alatt.

A szignál-vezér-inzulin B(1-29),des28Pro)-ALaALaLys-A(121,21Ser), pKFN-864 plazmidból származó 0.4 kb méretű EcoRIXbal fragmentum DNS szekvenciáját a 3. ábrán adjuk meg.

Az EcoRl és Xbal enzimekkel hasított pKFN-864 plazmid 0.5 kb nagyságú fragmentumát összeligáltuk a pMT636 plazmidból származó 9.5kb Ncol-Xbal és 1.4kb NcoI-EcoRI fragmentumokkal, miáltal a pKFN-866 plazmidhoz jutottunk (lásd 4. ábra). A pMT636 plazmidot a pMT608-ból (a LEU-2 gén eltávolítása után) és a pMT479-ből készítettük (lásd 4. ábra). A pMT608 az EP 195 691, a pMT479 az EP163 529 lajstromszámú szabadalmi leírásban található. A pMT479 tartalmazza a Schizosaccaharomvces pombe TPI (PÓT) génjét, a S. cerevisiae triózfoszfát izomeráz promo-

terét és terminátorát, (TPI_p és TPI_T) (Alber, T. és Kawasaki,

G. J. Mól. Appl. Gén. 1 (1982), 419-434) A pKFN-866 plazmid a következő szekvenciát tartalmazza: TPI_p-vezér-szignál-inzulin B(l-29, des28 Pro)-AlaAlaLys-A(1-21, 21 Ser)-TPI_T

Az MT663 (E2-7B XE11-36 a/α, AtpiAtpi, pep4-3/pep4-3) S. cerevisiae törzset YPGaL táptalajban (1% Bacto élesztő kivonat, 2% Bacto pepton, 2% galaktóz, 1% laktát) növesztettük OD₆₀₀ = 0.6 értékig.

A kapott tenyészet 100 ml-ét lecentrifugáltuk, 10 ml vízzel mostuk és újra szuszpendáltuk 10 ml 1.2 M szorbitolt, 25 mM Na₂EDTA-t, pH=8.0 és 6.7 mg/ml ditiotreitolt tartalmazó oldatban. A szuszpenziót 15 percig inkubáltuk 30 °C-on, lecentrifugáltuk és a sejteket újra szuszpendáltuk 10 ml 1.2 M szorbitolt, 10 mM Na₂EDTA-t, 0.1 M nátrium-citrátot, pH=5.8 és 2 mg Novozym 234-et tartalmazó oldatban. A szuszpenziót 30 percig inkubáltuk, 30 °C-on, a sejteket centrifugálással összegyűjtöttük, mostuk 10 ml 1.2 M-os szorbitollal és 10 ml CAS-sal (1.2 M szorbitol, 10 mM CaCl₂, 10 mM Tris/HCl (Tris= Tris (hidroximetil)aminometán) pH=7.5) és újra szuszpendáltuk 2 ml CASban. Transzformációhoz 0.1 ml CAS-ban szuszpendált sejtet kevertünk össze, kb. 1 μς pKFN-866 plazmid DNS-sel és szobahő• · · • · mérsékleten hagytuk 15 percig. 1 ml, 20% polietilénglikol

4000, 10 mM CaCl₂, 10 mM Tris/HCl, pH=7.5 tartalmú oldatot adtunk hozzá, majd a keveréket további 30 percig hagytuk szobahőmérsékleten. Ezután lecentrifugáltuk, majd a csapadékot újra szuszpendáltuk 0.1 ml SOS pufferben (1.2 M szorbitol, 33% (tf) YPD, 6.7 mMCaCl₂, 14 jug/ml leucin) , és 30 °C-on inkubáltuk 2 óráig. A szuszpenziót lecentrifugáltuk és a csapadékot ismét fölszuszpendáltuk 0.5 ml 1.2 M szorbitol oldatban. Ezután hozzáadtunk 6 ml, 52 °C-os top-agart, (1.2 M szorbitolt plusz 2.5% agart tartalmazó SC-táptalaj, Sherman és munkatársai, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981) és a szuszpenziót szilárd, szorbitol tartalmú agar lemezre öntöttük. 3 nap, 30 °C-os inkubálás után a transzformáns telepeket fölszedtük és folyékony tenyészet indítására használtuk őket. Egy ilyen transzformánst, a KFN-883-at választottuk ki további jellemzésre.

A KFN-883 élesztő törzset YPD táptalajban (1% élesztő kivonat, 2% pepton (a Difco Laboratories-től) és 2% glükóz) növesztettük fel. 10 ml tenyészetet 30 °-on rázattunk OD₆₀₀=20 denzitás eléréséig. Centrifugálás után a felülúszót HPLC-vel analizáltuk, amint azt Snel, L. és munkatársai leírták a Chromatgraphia 24.· (1987), 329-332 számában. A hozam körülbelül 14 • ·· • · · • · mg/liter inzulin B(l-29, des 28 pro)-AlaAlaLys-A(1-21, 21 Ser) volt.

Az egyszálú inzulin prekurzort a fermentáció felülúszójából izoláltuk egy ioncserélő oszlopon, alacsony pH értéken végzett adszorpcióval. A leválasztást magas pH értéken, az összegyűjtött frakciók kicsapását cink ionokkal végeztük. A prekurzor transzpeptidálása [Ser^A21 ], des [Pro⁸²⁸], [Thr^B30-OMe] emberi inzulinná a következőképpen történt:

mmol (2.35 g) treonin metilésztert és jégecetet oldottunk 5 ml DMF-ben, hozzáadtunk 2.5 ml 76.5% (tf) vizes DMF oldatot és a keverékben föloldottunk 0.5 g prekurzort, majd 12 °C-on tartottuk; ezután 50 mg tripszint adunk hozzá 1.25 ml 0.05 M kalcium acetát oldatban és 24 óra, 12 °C-on történt inkubálás után a reakcióelegyet 100 ml acetonba öntöttük a peptidek kicsapása végett, lecentrifugáltuk és vákumban megszárítottuk.

Az izolált inzulin analóg észtert preparatív HPLC oszlopon tisztítottuk szilika-C18 fázison, savas pH mellett. A tisztított észtert vizes közegben hidrolizáltuk, pH=10 mellett, 25 °C-on 24 órán keresztül. A képződött [ Ser^A21 ] , des[Pro⁸²⁸ ]-humán inzulin-t cink ionokkal csaptuk ki semleges pH értéken. A csapadékot anion cserélő kromatográfiával tisztítottuk és azt követően gélszűréssel sótalanítottuk. 102 mg volt a liofilizált [Ser*²¹ ], des [Pro⁸²⁸]-humán inzulin kitermelés.

XIII. példa

A des [Thr⁸²⁷]-humán inzulin készítése g cinkmentes sertés inzulint föloldottunk 40 ml vízben a pH=9 érték beállítása mellett és hozzáadtunk 50 mg sertés *

tripszint, föloldva 10 ml 0.25 M ammónium-hidrogén karbonát, pH=9 (ammóniával állítva) oldatban. Az oldatot 4 °C-on hagytuk 48 órán keresztül ami a HPLC anlízis alapján 65% terméket eredményezett. A reakcióelegyet ezután Sephadex G50 szuperfinom gélből készült oszlopon szűrtük 0.05 M ammónium-hidrogén karbonát oldattal 90 ml/ óra térfogatárammal. A fő protein csúcsot tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük és liofileztük. A hozam 520 mg des(B23-B30) humán inzulin volt.

A Gly-Phe-Phe-Tyr-Pro-Lys-Thr szekvenciájú peptidet PAMgyantán szintetizáltuk az Applie Biosystems peptidszintetizáló készülékével, védett aminosav anhidridekből. A végén a peptidet vízmentes hidrogén-fluoriddal vágtuk le a gyantáról 0 °Con, miáltal a maradék védőcsoportokat eltávolítottuk.

200 mg des(B23-B30)-humán inzulint és 400 mg peptidet föloldottunk 2.40 ml dimetil-formamid és 1.20 ml víz keverékében, az elegy pH értékét trietil-aminnal állítottuk be

6.5-re. Ezután hozzáadtunk 10 mg sertés tripszin 0.20 ml vizes oldatát, majd a reakcióelegyet 4 °C-on hagytuk 4 órán keresztül. A reakciót 25 ml 2-propanol hozzáadásával állítottuk le és a kicsapott fehérjéket centrifugálással izoláltuk. A felülúszó leszívatása után a csapadékot újra oldottuk 10 ml 1 M-os ecetsavban és fölvittük egy 2.6 x 20 cm méretű, Lichroprep RP-18, előzőleg 0.5 mM sósav, 0.1 M nátrium-klorid 30% (tf) etanolos oldattal telített, töltetből készült oszlopra. Az oszlopot azután 20 °C-on eluáltuk ugyanazzal a pufferrel, de az alkohol koncentrációt lineárisan emeltük 50%-ra, 20 ml/óra térfogatárammal, 24 órán keresztül. Az eluátumot UV-abszorpcióval vizsgáltuk és a fő protein csúcsot tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük. A fehérjét ugyanakkora térfogatú víz hozzáadásával és a pH=5.5 nátrium-hidroxiddal történő beállításával csaptuk ki. Állni hegytuk 4 °C-on, 1 órán át, majd a csapadékot centrifugálással és liofilezéssel izoláltuk.

A des [Thr^B27]-humán inzulin kitermelése 80 mg volt, az azonosítást a vinil-piridilált A- és B-láncok ismételt degradálásával végeztük.

XIV. példa

Az injektálható oldat készítése

A találmány szerinti emberi inzulin analógból 60 gmol-t fölodottunk 4 ml 0.1 M HCl-ben és hozzáadtunk 20 ml 1.5%-os m krezol oldatot. Most az oldatot összekevertük 40 ml 4%-os glicerollal és 20 ml 65 mM-os dinátrium-foszfáttal és a pH értéket 7.3-ra állítottuk be. Végül az oldatot vízzel 100 ml-re töltöttük fel és szűréssel sterileztük.

XV. példa

Az asszociáció fok becslése

Egy 2.6 x 88 cm méretű Sephadex G-75 oszlopot 13 mM-os nátrium-foszfát oldattal, pH=7.3, 22 ml/óra térfogatárammal telítettünk. Des-(oktapeptid-B²³'³⁰)-humán inzulint, citokróm Ct, ribonukleázt és a mioglobin monomerjét és dimerjét alkalmazva molekulasúly markerként elúciós térfogattal kifejezett molekulasúly görbét vettünk fel.

ml 0.6 mM cinkmentes emberi inzulint vagy 0.6 mM inzulin analógot alkamazva és a XII.példában leírt módon végrehejtva az eluálást azt találtuk, hogy a cinkmentes emberi inzulin elhúzódó csúccal jön le az oszlopról kb. a 14 kD méretű molekulasúly tartományban, a VI.-X.példákban leírt módokon készített analógok pedig szimmetrikus csúcsként eluálódnak az 5 kD körüli molekulasúly tartományban.

Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a találmány tárgyát képező emberi inzulin analógok pH=7.3-as oldatban elsődlegesen monomereknek, míg a normál emberi inzulin ugyanezen körűimé··· · 4 es · * · • se· ·· ······ • 4 4 4 ·· ·Λ· ·· ·< ···· nyék között dimerek és nagyobb tagszámú oligomerek keverékének tűnik.

XVI,példa

A biológiai aktivitás becslése

Az in vitro biológiai aktivitás meghatározását az izolált patkány adipociták és hepatociták inzulin receptoraihoz való kötődési képesség mérésével végeztük J. Gliemann és S. Gammeltoft: Diabetológia 10 (1974), 105-113. közleményében leírt módon.

Az inzulin analógokat félszintetikus emberi inzulinhoz hasonlítottuk, amelyeknek a kötődési képességét 100%-nak vettük. Az eredményeket az alábbi táblázatban mutatjuk be.

	Adipociták	Hepatociták
des [Phe⁸²⁵ ] ,des [Thr⁸³⁰ ]-
humán inzulin	223%	201%
des [Phe⁸²⁵ ]-humán inzulin	225%	249%
[ Asp^A21 ] -des [ Phe⁸²⁵ ], des [ Thr⁸³⁰ ] -
humán inzulin	250%	242%

• ·· *· ** ·*-

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Emberi inzulin analógok, azzal jellemezve, hogy pozitív töltésű aminosav, úgymint Lys vagy Arg található a B-lánc [Gly^B20]-től számított B28-as és 8-as helyzetében, és ezek további tetszőleges módosítást tartalmaznak a B-lánc C-terminális végén, a [Phe^B24]-től a C-terminális aminosav származékig, azzal a kikötéssel, hogy a B29 helyen nem Pro van és az A21 és/vagy a B3 különbözik az Asn-től.
2. Enberi inzulin analógok, azzal jellemezve, hogy a képletük a következő

A-lánc S s

II

H-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-

12 3 4 56 789 10 1112 i

S

I

B-láncS

I

H-Phe-Val-Y2~Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val

1 2 34 56 78 9 10 1112

A-lánc (folyt.)

13 14 15 16 17 18 19 2021

Leu-Tyr-Gln'-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Y₁-OH

I lS !

B-lánc (folyt.)g

I

Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe13 14 15 16 17 18 19 20 21 2223

B-lánc (folyt.) ^X1^X2“^X3~^X4“^X5“^X6

25 26 27 28 29 30 ahol az X_v X₂, X₃, X₅ Y₁ és Y₂ természetben előforduló aminosav származék; X₄ Lys vagy Arg; és X₆ bármely természetben előforduló aminosav származék, amely C-terminális hidroxi-csoportot vagy -OH-t hordoz vagy az X₅ és X₆ együtt képez egy hidroxi csoportot.
3. A 2. igénypont szerinti emberi inzulin analógok, azzal jellemezve, hogy az X_$, a prolin kivételével lehet bármely, a természetben előforduló aminosav.
4. A 2. vagy 3. igénypont szerinti emberi inzulin analógok azzal jellemezve, hogy az Y, és /vagy Y₂, az Asn kivételével lehetnek bármely, a természetben előforduló aminosavak.

5. A 2. igénypont szerinti emberi inzulin analógok, azzal jellemezve, hogy a

^xt -lehet Phe, Alá, His, Thr, Ser, Asn vagy Tyr ^X2 -lehet Tyr, Thr, Glu, Asp, Alá, His, Ser vagy Phe ^X3 -lehet Pro, Glu, Asp, Ser, Thr vagy His ^X5 -lehet Lys, Thr, Ser, Alá, Asp vagy Glu ^X6 -lehet Thr- OH, Ser-OH, Alá -OH, Asp-< DH, Glu-OH,vagy -OH vagy az X₅ és X₆ együtt képezik a C-terminális hidroxi . csoportot. ^Y1 -lehet Asn, Asp, Gly, Ser, Glu vagy Alá ^Y2 -lehet Asn, Gin, Glu vagy Asp

6. A 2. igénypont szerinti emberi inzulin analógok azzal, jellemezve, hogy

^X1 -lehet Phe, Alá, His, Thr, Ser, Asn vagy Tyr x₂ -lehet Tyr, Thr, Glu, Asp, Alá, His, Ser vagy Phe ^X3 -lehet Pro, Glu,Asp, Ser, Thr vagy His ^X5 -lehet Lys, Thr,Ser, * Alá, Asp vagy Glu ^X6 -OH csoport ^Y1 -lehet Asp, Alá, Gly, Ser, Glu vagy Alá ^Y ₂ -lehet Asn, Gin, Glu vagy Asp. 7. A 2. igénypont szerinti emberi inzulin analógok, azzal jellemezve , hogy ^X1 -lehet Phe, Alá, His, Thr, Ser, Asn vagy Tyr ^x ₂ -lehet Tyr, Thr, Glu, Asp, Alá, His, Ser vagy Phe ^X3 -lehet Pro, Glu, Asp, Ser, Thr vagy His X₅ és X₆ együtt képezik egy C-terminális hidroxi-csoportot ^Y1 -lehet Asn, Asp,Gly, Glu, Ser vagy Alá és Y₂ -lehet Asn, Gin, Glu vagy Asp.

8. A

2. igénypont szerinti emberi inzulin analógok, azzal jellemezve, hogy az X, Phe; az X₂ Tyr; X₃ Thr, X₅ Lys; az X₆

Thr-OH; az Y₅ lehet Asn, Asp, Ser vagy Gly és az Y₂ lehet Asn,

Gin, Asp vagy Glu.

9. A 2. igénypont szerinti emberi inzulin analógok, azzal jellemezve, hogy az X₁ Tyr; az X₂ Thr; X₃ Pro; az X₅ Thr; az X₆-OH csoport; Y₁ lehet Asn, Asp, Ser vagy Gly és az Y₂ lehet Asn, Gin, Asp vagy Glu.
10. A 2. igénypont szerinti emberi inzulin analógok, azzal jellemezve, hogy az X₁ Phe; X₂ Thr; X₃ Pro; az X₅ Thr; az X₆-OH csoport; Y₁ lehet Asn, Asp, Ser vagy Gly és az Y₂ lehet Asn, Gin, Asp vagy Glu.
11. A 2. igénypont szerinti emberi inzulin analógok, azzal jellemezve, hogy az X₁ Phe; X₂ Tyr; X₃ Pro; az X₅ Thr; X₆-OH csoport; Y, lehet Asn, Asp, Ser vagy Gly és Y₂ lehet Asn, Gin, Asp vagy Glu.
12. A 2. igénypont szerinti emberi inzulin analóg azzal jellemezve, hogy az X₁ aminosav töltés nélküli és gamma-helyzetben tartalmaz egy sp²-hibridállapotú szénatomot és X₆ egy -OH csoport.
13. A 12. igénypont szerinti emberi inzulin analógok, azzal jellemezve, hogy az Y₁ és Y₂ az Asn kivételével lehetnek bármilyen természetben előforduló aminosav származékok és X₅ a Thr kivételével lehet bármelyik a természetben előforduló aminosav származék.
14. A 12. igénypont szerinti emberi inzulin analógok, azzal jellemezve, hogy az X₅ és X₆ együtt képezik a -OH csopor- tót.
15. A következő képlettel jellemzett emberi inzulin analógot tartalmazó gyógyszer összetétel:

A-lánc S —S

II

H-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 l

S

I

B-láncS

I

H-Phe-Val-Y2-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112

A-lánc (folyt.)

13 14 15 16 17 18 19 2021

Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Y-^-OH

I

IS

I

B-lánc (folyt.)s

I

Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 2324

B-lánc (folyt.)

X1-X2-X3-X4-X5-X6

25 26 27 28 29 30 ahol az X_v X₂, X₃, X₅ Y₁ és Y₂ természetben előforduló aminosav származék; X₄ Lys vagy Arg; és X₆ bármely természetben előforduló aminosav származék, amely C-terminális hidroxi-csoportot vagy -OH-t hordoz vagy az X_$ és X₆ együtt képezik a hidroxicsoportot vagy a gyógyszeriparilag elfogadható sóik és a gyógyszeriparilag elfogadható hordozók.

• · · * · · · «

• · ··· ·· • ·
16. A 15. igénypont szerinti gyógyszer összetétel, azzal jellemezve, hogy a pH=7.3 értéken alacsony oldhatóságot mutat.
17. A 16. igénypont szerinti gyógyszer összetétel, azzal jellemezve, hogy a nevezett inzulin analóg szükségszerűen monomer.
18. A 15. igénypont szerinti gyógyszer összetétel, azzal jellemezve, hogy vizes oldat formájában készül.
19. A 15. igénypont szerinti gyógyszer összetétel, azzal jellemezve, hogy vizes szuszpenzió formájában készül.
20. A 15. igénypont szerinti gyógyszer összetétel, azzal jellemezve, hogy a gyógyszeriparilag elfogadható hordozó egy izotóniás vizes oldat.
21. A 18., 19. vagy 20. igénypont szerinti gyógyszer öszszetétel, azzal jellemezve, hogy a vizes oldat, a vizes szuszpenzió vagy az izotóniás vizes oldat tartalmaz még cink ionokat és/vagy puffért (acetát vagy citrát) és/vagy tartósítószert, mint m-krezol, metil-paraben vagy fenol.
22. A 15. igénypont szerinti gyógyszer összetétel, azzal jellemezve, hogy a több mint egy inzulin analógot tartalmaz.
23. A 15. igénypont szerinti gyógyszer összetétel, azzal jellemezve, hogy szájon át adható vagy bőr alá történő injek• · · • · cióra alkalmas formában készítik.
24. A 15. igénypont szerinti gyógyszer összetétel, azzal jellemezve, hogy parenterális alkalmazásra megfelelő formában készítik.
25. A 15. igénypont szerinti gyógyszer összetétel, azzal jellemezve, hogy az X₅, a prolin kivételével lehet bármely, a természetben előforduló aminosav.
26. A 15. vagy 25. igénypont szerinti gyógyszer összetétel, azzal jellemezve, hogy az Y₁ és /vagy Y₂, az Asn kivételével lehetnek bármely, a természetben előforduló aminosavak.
27. A 15. igénypont szerinti gyógyszer összetétel, azzal

jellemezve , hogy az ^X1 -lehet Phe, Alá, His, Thr, Ser, Asn vagy Tyr ^X ₂ -lehet Tyr, Thr, Glu, Asp, Alá, His, Ser vagy Phe ^X3 -lehet Pro, Glu, Asp, Ser, Thr vagy His ^X5 -lehet Lys, Thr, Ser, Alá, Asp vagy Glu ^X6 -lehet Thr- OH, Ser-OH, Alá -OH, Asp-OH, Glu-OH,

vagy -OH illetve az X₅ és X₆ együtt képezik a Cterminális hidroxi csoportot.

Y₁ -lehet Asn, Asp, Gly, Ser, Glu vagy Alá

Y₂ -lehet Asn, Gin, Glu vagy Asp
28. A 15. igénypont szerinti gyógyszer összetétel, azzal

jellemezve, hogy ^X! -lehet Phe, Alá, His, Thr, Ser, Asn vagy Tyr ^X ₂ -lehet Tyr, Thr, Glu,Asp, Alá, His, Ser ’ vagy Phe ^X3 -lehet Pro, Glu,Asp, Ser, Thr vagy His ^X5 -lehet Lys, Thr,Ser, Alá, Asp vagy Glu ^X6 -OH csoport ^Y1 -lehet Asn, Asp, Alá, Gly, Ser, Glu vagy Alá ^Y2 -lehet Asn, Gin, Glu vagy Asp.
29. A 15. igénypont szerinti gyógyszer összetétel, azzal jellemezve, hogy

X, -lehet Phe, Alá, His, Thr, Ser, Asn vagy Tyr

X₂ -lehet Tyr, Thr, Glu, Asp, Alá, His, Ser vagy Phe

X₃ -lehet Pro, Glu, Asp, Ser, Thr vagy His

X₅ és X₆ együtt képezik a C-terminális hidroxi-csoportot

Y, -lehet Asn, Asp,Gly, Glu, Ser vagy Alá és

Y₂ -lehet Asn, Gin, Glu vagy Asp.
30. A 15. igénypont szerinti gyógyszer összetétel, azzal jellemezve, hogy az X₁ Phe; az X₂ Tyr; X₃ Thr, X₅ Lys; az X₆

Thr-OH; az Y₁ lehet Asn, Asp, Ser vagy Gly és az Y₂ lehet Asn,

Gin, Asp vagy Glu.
31. A 15. igénypont szerinti gyógyszer összetétel, azzal jellemezve, hogy az X₄ Tyr; az X₂ Thr; X₃ Pro; az X_$ Thr; az X₆ • · ·

-OH csoport; Y₁ lehet Asn, Asp, Ser vagy Gly és az Y₂ lehet Asn, Gin, Asp vagy Glu.
32. A 15. igénypont szerinti gyógyszer összetétel, azzal jellemezve, hogy az X₁ az Phe; X₂ az Thr; X₃ az Pro; az X₅ az Thr; az X₆ az -OH csoport; Y₁ lehet Asn, Asp, Ser vagy Gly és az Y₂ lehet Asn, Gin, Asp vagy Glu.
33. A 15. igénypont szerinti gyógyszer összetétel, azzál jellemezve, hogy az X₁ az Phe; X₂ az Tyr; X₃ az Pro; az X₅ az Thr; X₆ az -OH csoport; Y₁ lehet Asn, Asp, Ser vagy Gly és Y₂lehet Asn, Gin, Asp vagyGlu.
34. A 15. igénypont szerinti gyógyszer összetétel, azzal jellemezve, hogy az X, aminosav töltés nélküli és gamma-helyzetben tartalmaz egy sp²-hibridállapotú szén atomot és az X₆egy -OH csoport.
35. A 34. igénypont szerinti gyógyszer összetétel, azzal jellemezve, hogy az Y₁ és Y₂ az Asn kivételével lehetnek bármilyen természetben előforduló aminosav származékok és X₅ a Thr kivételével lehet bármelyik a természetben előforduló aminosav származék.
36. A 34. igénypont szerinti gyógyszer összetétel, azzal jellemezve, hogy az X₅ és X₆ együtt képezik az -OH csoportot.
37. Eljárás a cukorbetegség (Diabetes mellitus) kezelésé• · re az alábbi képlettel jellemzett emberi inzulin analógot tartalmazó gyógyszer összetétel alkalmazásával:

A-Iáne $

II

H-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-

1 2 3 4 5 6 7 1 S I 8 9 10 11 12 B-lánc 1 S 1 H-Phe-Val-Y₂~Gln· -His· -Leu· -Cys-Gly- -Ser-His -Leü- -Val 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 li 12 A-lánc (folyt.) 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Yj-OH

I

IS

I

B-lánc (folyt.)s

I

Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 2324

B-lánc (folyt.)

X1-X₂-X3“X4-X5-X6

25 26 27 28 29 30 ahol az X_v X₂, X_JZ X₅ Y₁ és Y₂ természetben előforduló aminosav származék; X_A Lys vagy Arg; és X₆ bármely természetben előforduló aminosav származék, amely C-terminális hidroxi-csoportot vagy -OH-t hordoz vagy az X₅ és X₆ együtt képezik a hidroxicsoportot vagy a gyógyszeriparilag elfogadható sóik és a gyógyszeriparilag elfogadható hordozók.

···
38. A 37. igénypont szerinti ejárás, azzal jellemezve, hogy a nevezett inzulin analóg a pH=7.3 értéken alacsony oldhatóságot mutat.
39. A 38. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nevezett inzulin analóg szükségszerűen monomer.

40 . A 37. igénypont szerinti * eljárás, azzal j ellemezve, hogy a nevezett . gyógyszer összetétel vizes oldat formájában készül. 41 . A 37. igénypont szerinti eljárás, azzal j ellemezve,

hogy a gyógyszer összetétel vizes szuszpenzió formájában készül .
42. A 37. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gyógyszeriparilag elfogadható hordozó egy izotóniás vizes oldat.
43. A 40., 41. vagy 42. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vizes oldat, vizes szuszpenzió vagy az izotóniás vizes oldat tartalmaz még cink ionokat és/vagy puffért (acetát vagy citrát) és/vagy tartósítószert, mint m-krezol, metil-paraben vagy fenol.
44. A 37. igénypont szerinti gyógyszer összetétel, azzal jellemezve, hogy több mint egy inzulin analógot tartalmaz.
45. A 37. igénypont szerinti gyógyszer összetétel, azzal • · · jellemezve, hogy szájon át adható vagy bór alá történő injekcióra alkalmas formáhan készítik.
46. A 37. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy parenterális alkalmazásra megfelelő formában készítik.
47. A következő képlettel jellemzett emberi inzulin analóg készítésének folyamata:

A-lánc ^s 'S,;

II.

H-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112

I

S l

B-láncS

I

H-Phe-Val-Y₂-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112

A-lánc (folyt.)

13 14 15 16 17 18 19 2021

Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Y-^-OH

I iS

I

B-lánc (folyt.)s

I

Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 2324

B-lánc (folyt.)

X1-X2-X3-X4-X5-X6

25 26 27 28 29 30 ahol az X_1Z X₂, X_JZ X₅ Y₁ és Y₂ természetben előforduló aminosav származék; X₄ Lys vagy Arg; és X₆ bármely természetben előforduló aminosav származék, amely C-terminális hidroxi-csoportot vagy -OH-t hordoz vagy az X₅ és X₆ együtt képezik a hidroxi

4 » · · · · · * ··· .··. ··; ·*:

csoportot, azzal jellemezve, hogy a kérdéses inzulin analóg prekurzort kódoló DNS szekvenciát egy megfelelő élesztő expressziős vektorba klónozzák, amely miután betranszformálták az élesztőbe, képes expresszálni és kiválasztani az inzulin analóg prekurzorát, amelyben [Lys⁶²⁸], [Arg⁶²⁸], [Lys⁸²⁹ ] vagy [Arg⁶²⁹ ] van a Gly^A1-hez kapcsolva egy peptid kötéssel vagy a III-as képlettel jellemzett peptidlánccal,

-R(n) —R (1) — (III) ahol az R egy n tagszámú aminosav származékot tartalmazó peptidlánc, amikor az n egy 0-tól 33-ig terjedő egész szám, az R(l) pedig Lys vagy Arg, a transzformált élesztő törzset megfelelő táptaljban fermentálva, a prekurzor a fermentációs táptalajból kinyerve, a IV-es képlettel jellemzett

Q -0R (IV) amino vegyülettel reagál, ahol a Q egy aminosav származék, az R pedig védő, karboxi-csoport úgymint metil vagy tercierbutil származék, tripszin vagy tripszin szerű enzimet használva katalizátorként víz és szerves oldószer keverékében, miáltal a védő kardoxi-csoport eltávozik és az inzulin analógot a reakció elegyből izolálják vagy egy inzulin analóg, amelyben a C-terminális aminosav Lys-tól vagy Arg-től különbözik és a prekurzor tartalmaz egy pár bázikus aminosavból (Lys, Arg) álló hidat a C-terminális vég és a Gly*¹ között, izolálható és tripszin és karboxipeptidáz B fölhasználásával enzimes kezeléssel alakítják át inzulin analóggá.
48. Az alábbi képlettel rendelkező emberi inzulin analóg készítésének folyamata:

A-lánc S —--------—s lI

H-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 l

S

I

B-láncS

I

H-Phe-Val-Y₂-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112

A-lánc (folyt.)

13 14 15 16 17 18 19 2021

Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Yj-OH

I

IS

I B-lánc (folyt.)g

I

Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 2324

B-lánc (folyt.) ^X1^-X2~^X3“^X4^-X5^-X6

25 26 27 28 29 30 ahol az X_1# X₂, X₃, X₅ Y₁ és Y₂ természetben előforduló aminosav származék; Χ_ς Lys vagy Arg; és X₆ bármely természetben előforduló aminosav származék, amely C-terminális hidroxi-csoportot vagy -OH-t hordoz vagy az X₅ és X₆ együtt képezik a hidroxi csoportot, ahol a des(B23-B30)-emberi inzulin analógot úgy >·· állítják elő, hogy a (B23-B30) aminosavak lehasításához egy inzulint tripszinnel kezelnek, a kívánt öt-hét aminosavból álló peptidet szintetizálják, és a kapott pepetidet párosítják a des(B23-B30)-humán inzulinnal majd a kapott inzulin analógot visszaizolálják a reakció elegyból.