PT2854841T

PT2854841T - Isoformas de glicosilação da calicreína 1 em tecido humano

Info

Publication number: PT2854841T
Application number: PT138011655T
Authority: PT
Inventors: Charles Matthew; Kolodka Tadeusz; Williams Mark
Original assignee: Diamedica Inc
Priority date: 2012-06-04
Filing date: 2013-06-04
Publication date: 2017-05-15
Also published as: US9839678B2; US9364521B2; ES2625548T3; HUE032613T2; PL2854841T3; CA2880085C; SI2854841T1; CA2880085A1; EP2854841B1; CY1119073T1; EP2854841A4; US20150196624A1; US20170119862A1; HRP20170673T1; EP2854841A1; WO2013181755A1; LT2854841T; US20130323222A1; DK2854841T3

Description

DESCRIÇÃO

"ISOFORMAS DE GLICOSILAÇÃO DA CALICREÍNA 1 EM TECIDO HUMANO"

ESTADO DA TÉCNICA

Em indivíduos saudáveis, a libertação de insulina pelo pâncreas é estritamente acoplada à concentração de glucose no sangue. Teores elevados de glucose no sangue tal como os que ocorrem depois das refeições são rapidamente compensados por um aumento correspondente da secreção de insulina. A Diabetes mellitus, ou simplesmente a diabetes é um grupo de doenças metabólicas no qual uma pessoa tem açúcar elevado no sangue, quer por causa de o pâncreas não produzir insulina suficiente, quer porque as células não respondem à insulina que é produzida. Cerca de 366 milhões de pessoas no mundo sofrem de diabetes mellitus. Quando não é tratada, a diabetes pode provocar muitas complicações.

As complicações agudas incluem a cetoacidose diabética e o coma hiperosmolar não cetótico. As complicações sérias a longo termo incluem doença cardiovascular, falha renal crónica, retinopatia diabética, e neuropatia diabética. 0 tratamento adequado da diabetes é, portanto, importante e existe uma necessidade de terapias melhoradas para o tratamento da diabetes.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção presente inclui uma composição, compreendendo uma primeira forma madura e activa de um polipéptido calicreina 1 (KLK1) de tecido humano e uma segunda forma madura e activa de um polipéptido calicreina 1 (KLK1) de tecido humano:

Em que o primeiro polipéptido KLK1 tem três glicanas ligadas por N em três posições diferentes por polipéptido e o segundo polipéptido KLK1 tem duas glicanas ligadas a duas posições diferentes por polipéptido; e

Em que o primeiro polipéptido KLK1 e os segundos polipéptidos KLKl estejam presentes a uma razão de entre 45:55 e 55:45.

As três glicanas do primeiro polipéptido KLKl estão ligadas por N aos resíduos 78, 84, e 141. As duas glicanas do segundo polipéptido KLKl são glicanas ligadas por N nos resíduos 78 e 84, mas não 141. Em alguns aspectos, a razão entre o primeiro polipéptido KLKl e o segundo polipéptido KLKl na composição é de 50:50. A invenção presente inclui uma composição contendo uma isoforma triplamente glicosilada de um polipéptido tecidular calicreina 1 (KLKl) e uma isoforma duplamente glicosilada de um polipéptido tecidular calicreína 1 (KLK1), em que a isoforma triplamente gli cosilada do polipéptido tecidular calicreína 1 KLK1 e a isoforma duplamente glicosilada do polipéptido tecidular calicreína 1 estão presentes na composição a uma razão de entre 45:55 e 55:45. A isoforma triplamente glicosilada inclui glicanas ligadas por N nos resíduos de aminoácido 78, 84, e 141 de KLKl, tal como se define na SEQ ID NO: 1. A isoforma duplamente glicosilada inclui glicanas ligadas por N nos resíduos de aminoácido 78 e 84, mas não no resíduo de aminoácido 141 de KLKl, tal como se define na SEQ ID N0:1. Em alguns aspectos, a isoforma triplamente glicosilada e a isoforma duplamente glicosilada de KLKl estão presentes na composição a uma razão de 50:50. Em alguns aspectos da composição da invenção presente, um ou mais polipéptidos KLKl é um polipéptido de tecido humano com calicreína 1 (hKLKl).

Em alguns aspectos da composição da invenção presente, um ou mais polipéptidos KLKl inclui resíduos dos aminoácidos 78-141 da SEQ ID NO:l ou resíduos dos aminoácidos 78-141 da SEQ ID NO:2.

Em alguns aspectos da composição da invenção presente, um ou mais polipéptidos KLKl inclui resíduos dos aminoácidos 25-262 da SEQ ID N0:1 ou resíduos de aminoácidos 25-262 da SEQ ID NO:2.

Em alguns aspectos da composição da invenção presente, um ou mais polipéptidos KLKl inclui uma sequência de aminoácidos contendo pelo menos 95 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO:l ou a SEQ ID NO:2.

Em alguns aspectos da composição da invenção presente, um ou mais polipéptidos KLK1 inclui uma sequência de aminoácidos contendo pelo menos uma identidade de sequência de 95 % com os resíduos dos aminoácidos 25-262 da SEQ ID NO:1 ou da SEQ ID NO:2.

Em alguns aspectos da composição da invenção presente, um ou mais polipéptidos KLK1 inclui uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95 % de identidade de sequência com os resíduos dos aminoácidos 25-262 da SEQ ID NO:2, e em que o ou os referidos polipéptidos KLK1 compreendam E145 e/ou A188.

Em alguns aspectos da composição da invenção presente, um ou mais polipéptidos KLK1 incluem uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95 % de identidade de sequência com os resíduos de aminoácido 25-262 da SEQ ID NO: 2, e os referidos polipéptidos KLKl compreendam Q145 e/ou VI88.

Em alguns aspectos da composição da invenção presente, o ou os polipéptidos KLKl apresentam uma SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2.

Em alguns aspectos da composição da invenção presente, o ou os polipéptidos KLK1 têm os resíduos 25-262 da SEQ ID NO:1 ou da SEQ ID NO:2.

Em alguns aspectos da composição da invenção presente, a composição também inclui um diluente, adjuvante, ou veículo aceitável do ponto de vista farmacêutico.

Em alguns aspectos da composição da invenção presente, A composição está substancialmente isenta de outras isoformas glicosiladas (glicoformas) de KLK1.

Em alguns aspectos da composição da invenção presente, a composição possui teores de endotoxinas inferiores a 1 EU/mg de proteína, proteína de células hospedeiras inferior a 100 ng/mg de proteína total, ADN de célula hospedeira inferior a 10 pg/mg de proteína total, e/ou é substancialmente isenta de agregados (aparecendo mais do que 95 % como um único pico no SEC HPLC). A invenção presente também inclui um dispositivo contendo uma composição tal como se descreve neste documento, em que o dispositivo seja adequado para entregar a composição por via subcutânea. Em alguns aspectos, o dispositivo é uma seringa. Em alguns aspectos, a seringa inclui adicionalmente uma montagem com uma agulha hipodérmica ligada à seringa. Em alguns aspectos, a seringa inclui adicionalmente uma tampa protectora em torno da montagem da agulha. Em alguns aspectos, a seringa possui uma agulha de entre ^ polegada e 5/8 de uma polegada de comprimento, com um calibre de entre 25 e cerca de 31. São descritos métodos de tratar um sujeito que necessite do tratamento, incluindo administrar-se ao sujeito uma composição tal como descrita neste documento.

Em alguns aspectos dos métodos, a administração é uma administração subcutânea.

Em alguns aspectos dos métodos o sujeito sofre de diabetes de tipo 1 estabelecido (T1D) ou de diabetes do tipo 2 (T2D) . Em alguns aspectos, o sujeito sofre de diabetes de tipo 2 (T2D), resistência à insulina, pré- diabetes, diabetes, tolerância à glucose comprometida, metabolismo da glucose comprometido, hiperglicemia, hiperinsulinémia, ou sindrome X. Em alguns aspectos, o sujeito sofre de diabetes autoimune de adultos (LADA).

Em alguns aspectos dos métodos o sujeito também é tratado com um fármaco contra a diabetes. Em alguns aspectos, o fármaco contra a diabetes é insulina ou um mimético de incretina. A não ser aonde se defina algo em contrário, todos os termos técnicos e científicos utilizados neste documento têm os mesmos significados que são normalmente entendidos pelos indivíduos com conhecimentos médios da técnica na qual a invenção se insere. Embora se possam utilizar quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos neste documento na prática ou nos testes da invenção presente, são descritos os métodos e os materiais preferidos. Para os objectivos da invenção presente, definem-se adiante os seguintes termos.

Os artigos "o/a" e "um/uma" são utilizados neste documento para referir um ou mais do que um/uma (isto é, pelo menos um/uma) dos objectos gramaticais do artigo. A titulo de exemplo, "um elemento" significa um elemento ou mais do que um elemento.

Por "cerca de" significa-se uma quantidade, teor, valor, número, frequência, percentagem, dimensão, tamanho, quantidade, peso ou comprimento que varie até tanto como 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 % em relação a uma quantidade, teor, valor, número, frequência, percentagem, dimensão, tamanho, quantidade, peso ou comprimento de referência.

Ao longo de toda a especificação presente, a não ser aonde o contexto ditar algo em contrário, as palavras "compreende", "inclua", e "compreendendo" devem ser entendidas como implicando a inclusão do passo ou elemento referido ou do conjunto de passos ou de elementos, mas não a exclusão de qualquer outro passo ou elemento ou de um conjunto de passos ou de elementos. Por "constituído por" significa-se incluindo, e limitado ao que quer que se siga na frase que se inicia por "constituído por". Deste modo, a frase "constituído por" indica que os elementos listados são indispensáveis ou obrigatórios, e que não podem estar presentes outros elementos. Por "constituído essencialmente por" significa-se incluindo quaisquer elementos listados em seguida, e limitando-se a outros elementos que não interfiram com nem contribuam para a actividade ou a actuação especificada a descrição para os elementos listados. Deste modo, a frase "constituído essencialmente por" indica que os elementos listados são indispensáveis ou obrigatórios, mas que outros elementos são opcionais e podem ou não estar presentes, dependendo de afectarem ou não materialmente a actividade ou a actuação dos elementos listados.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 é um gel de SDS-PAGE contrastado com corante Azul de Coomassie e diversas quantidades de KLK1 recombinante humano purificado a partir de linhas de células CHO ou 293 após uma transfecção transiente. A faixa 1 é uma escada proteica previamente contrastada, estando as massas moleculares dos padrões escritos do lado (em kDa) . As faixas 2-5 têm KLK1 purificado a partir de células CHO (faixa 2 - 14 pg de proteína; faixa 3 - 7 pg de proteína; faixa 4-3,5 pg de proteína; faixa 5 - 1,35 pg de proteína). A faixa 6 tem 14 pL de proteína KLK1 purificada a partir de uma transfecção transiente de células 293. A Figura 2 é uma transferência Western contrastada com anticorpos policlonais de murganho anti KLK1 humana a diversas quantidades de KLK1 recombinante humana purificada de linhas de células CHO ou 293 após uma transfecção transiente. As faixas 1 e 6 são carregadas com uma escada proteica previamente contrastada, escrevendo-se as massas moleculares dos padrões do lado (em kDa) . As faixas 2-5 têm KLK1 purificada a partir de células CHO (faixa 2 - 5 pL de proteína; faixa 3 - 2,5 pL de proteína; faixa 4 - 1,25 pL de proteína). A faixa 5 tem 2,5 pL de proteína KLK1 purificada de uma transfecção transiente de células 293. A Figura 3 são resultados de um cromatograma. A Figura 3A é um cromatograma representando a absorvância a A280 de diversas fracções de eluição da resina hidrofóbica de octil sefarose utilizada para separar as glicoformas com pequena e grande massa molecular de KLK1 recombinante humana. A Figura 3B é uma ampliação do pico mostrado na Figura 3A. representa concentração proteica (medida a A280); · representa % de tampão de eluição; o representa % de tampão de carga/tampão de lavagem; e □ representa o pH da solução que sai da coluna. A Figura 4 é um SDS-PAGE de amostras das fracções eluídas da resina de interacção hidrofóbica de octil sefarose utilizada para separar os isómeros com massa molecular pequena e grande de KLK1 recombinante humana. A Figura 5 são resultados de um cromatograma. A Figure 5A é um cromatograma da análise por RP-HPLC de KLK1 humana isolada de células CHO apresentando a mistura de glicoformas com massa molecular pequena e elevada (à razão aproximada de 45:55) de hKLKl. A Figura 5B é um cromatograma da análise por RP-HPLC da Fracção BI1 (glicoforma com elevada massa molecular de KLK1 humana) . A Figura 5C é um cromatograma da análise por RP-HPLC da Fracção B5 (glicoforma com pequena massa molecular de KLK1 humana). A Figura 6 é um cromatograma da análise por RP-HPLC de uma KLK1 humana isolada de células CHO representando uma mistura a cerca de 50:50 das glicoformas de pequena e grande massa molecular de KLK1. A Figura 7 é um gráfico da infusão de glucose em ratos Sprague-Dawley durante uma estenose com pinça hiperinsulinémica-euglicémica, após administração de HU KLK1, rhKLKl, glicoformas de massa molecular pequena ou elevada de KLK1. A Figura 8 é um gráfico da área sob a curva (AUC) da taxa de infusão de glucose na Figura 7.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DAS INVENÇÃO A invenção presente proporciona composições de glicoformas de polipéptido calicreína 1 (KLK1) de razões definidas de polipéptidos duplamente e triplamente glicosilados KLK1 tal como definidos nas reivindicações, que são úteis no tratamento de diabetes. De modo surpreendente, estas composições são mais eficazes no tratamento e no controlo da diabetes do que as composições de KLK1 com ocorrência natural.

As calicreinas tecidulares são membros de uma superfamilia de genes das proteases de serina compreendendo pelo menos 15 proteínas em separado e distintas (denominadas calicreína tecidular 1 a 15) (Yousef et al., 2001, Endocrine Rev.; 22: 184-204). A calicreína 1 tecidular é predominantemente produzida no pâncreas, donde a origem do nome a partir do termo grego 'kallikrein.' Ela também é produzida nas glândulas salivares e nos rins e encontra-se no tracto urogenital e no músculo esquelético. A calicreina tecidular 1 também é conhecida como KLK1, calicreina pancreática/renal, calicreina 1 glandular, protease de serina calicreina 1, calicreina 1, calicreina renal, calicreina renal/pancreática/salivar, calicreina glandular renal/pancreática/salivar. Tal como se utiliza neste documento, o termo "calicreina 1 tecidular" e "KLK1" são sinónimos. A calicreina 1 tecidular é uma protease de serina semelhante a tripsina. Nos tecidos de seres humanos e de animais, a calicreina 1 tecidular cliva o quininogénio a lisil-bradiquinina (também denominada calidina), uma quinina decapeptídica com efeitos fisiológicos semelhantes aos da bradiquinina. A bradiquinina é um decapéptido que provoca a dilatação dos vasos sanguíneos e, portanto, leva a tensão sanguínea a diminuir. A calidina é idêntica à bradiquinina contendo um resíduo lisina adicional no terminal N e sinaliza-se através do receptor de bradiquinina. 0 gene de KLK1 codifica para um único pré-proenzima que tem 262 resíduo de aminoácido de comprimento e que inclui a sequência "pré-" (resíduos 1-18) e a sequência "pró-" (resíduos 19-24), que é activada por enzimas do tipo da tripsina. A forma madura e activa de KLK1 humana é uma glicoproteína com 238 resíduos de aminoácido (os resíduos 25-262) com uma massa molecular de 26 kDa e um pi teórico de 4,6. A KLK1 apresenta cinco ligações dissulfureto na sua estrutura terciária, que se crê serem responsáveis pela elevada estabilidade da proteína, tanto contra a digestão por tripsina como na inactivação térmica. A sequência de aminoácidos de calicreína 1 tecidular encontra-se disponível, para uma grande variedade de espécies, incluindo mas não se limitando a seres humanos (SEQ ID N0:1 e SEQ ID N0:2), murganho (veja-se, por exemplo, GenBank: AAA39349.1, 1 de Fevereiro de 1994); gato doméstico (veja-se, por exemplo, a Sequência de Referência NCBI: XP_003997527.1, 6 de Novembro de 2012); gorila (veja-se, por exemplo, a Sequência de Referência NCBI: XP_004061305.1, 3 e3 Dezembro de 2012); gado (veja-se, por exemplo, GenBank: AAI51559.1, 2 de Agosto de 2007); cão (veja-se, por exemplo, a Sequência de Referência CBI: NP_001003262.1, 22 de Fevereiro de 2013); rato (veja-se, por exemplo, GenBank: CAE51906.1, 25 de Abril de 2006); e babuíno verde-azeitona (veja-se, por exemplo, a Sequência de Referência NCBI: XP_003916022.1, 4 de Setembro de 2012) . A KLK1 é funcionalmente conservada através das espécies na sua capacidade de libertar o péptido vasoactivo, Lys-bradiquinina, a partir do quininogénio com pequena massa molecular. Um polipéptido de calicreína 1 tecidular da invenção presente pode conter qualquer uma das sequências de aminoácidos para KLK1, ou um seu fragmento ou variante.

Em alguns aspectos, um polipéptido calicreína 1 é uma calicreína 1 de tecido humano (hKLKl), incluindo, mas nao se limitando a, um polipéptido hKLKl representado pela SEQ ID NO:1 ou pela SEQ ID NO:2.

Por exemplo, a hKLKl pode ser representada pela sequência de aminoácidos do GenBank Ref a . NP_002248.1, tendo a sequência de aminoácidos completa da pré-pro-proteina KLK1 que se ilustra adiante: MWFLVLCLALSLGGTGAAPPIQSRIVGGWECEQHSQPWQAALYHFSTFQC 50 GGILVHRQWVLTAAHCISDNYQLWLGRHNLFDDENTAQFVHVSESFPHPG 100 FNMSLLENHTRQADEDYSHDLMLLRLTEPADTITDAVKVVELPTEEPEVG 150 STCLASGWGSIEPENFSFPDDLQCVDLKILPNDECKKAHVQKVTDFMLCV 200 GHLEGGKDTCVGDSGGPLMCDGVLQGVTSWGYVPCGTPNKPSVAVRVLSY 250 VKWIEDTIAENS (SEQ ID NO:l)

Os aminoácidos 1 a 18 da SEQ ID NO:l representam o péptido de sinal, os aminoácidos 19 a 24 representam sequências de pró-péptido, e os aminoácidos 25 a 262 representam o péptido maduro. Deste modo, a pré-pró-proteína inclui um péptido de sinal presumido com 17 aminoácidos, um fragmento pró enzimático com 7 aminoácidos e uma proteína KLK1 madura com 238 aminoácidos.

Tal como descrito no Exemplo 1, uma segunda sequência de aminoácidos para KLK1 humano é representada pela SEQ ID NO:2, ilustrada adiante: ríWFLVLCLALSLGGTGAAPPIQSRIVGGWECEQHSQPWQAALYHFSTFQC 50 GGILVHRQWVLTAAHCISDNYQLWLGRHNLFDDENTAQFVHVSESFPHPG 100 FNMSLLENHTRQADEDYSHDLMLLRLTEPADTITDAVKWELPTQEPEVG 150 STCLASGWGSIEPENFSFPDDLQCVDLKILPNDECKKVHVQKVTDFMLCV 200 GHLEGGKDTCVGDSGGPLMCDGVLQGVTSWGYVPCGTPNKPSVAVRVLSY 250 VKWIEDTIAENS (SEQ ID N0:2)

Mais uma vez, os aminoácidos 1 a 18 da SEQ ID NO:1 representam o péptido de sinal, os aminoácidos 19 a 24 representam as sequências de pró péptidos, e os aminoácidos 25 a 262 representam o péptido maduro. Deste modo, a pré-pro-proteína inclui um péptido de sinal presuntivo de 17 aminoácidos, um fragmento de proenzima com 7 aminoácidos e uma proteína KLK1 madura com 238 aminoácidos.

Uma comparação entre a SEQ ID N0:1 e a SEQ ID NO: 2 mostra duas diferenças de aminoácidos entre as duas sequências de aminoácidos de hKLKl. Polimorfismo de um único nucleótido (SNP) entre dois indivíduos de uma espécie explicam uma substituição de E por Q no resíduo de aminoácido 145 dos 262 e uma substituição de A por V na posição 188 de 262. A SEQ ID N0:1 tem um E (ácido glutâmico) na posição 145 e um A (alanina) na posição 188, enquanto a SEQ ID NO:2 tem um Q (glutamina) na posição 145 e um V (valina) na posição 188.

Um polipéptido KLK1 da invenção presente pode ter um E na posição 145; pode ter um Q na posição 145; pode ter um A na posição 188; pode ter um A na posição 188; pode ter

um E na posição 145 e um A na posição 188; pode ter uma Q na posição 145 e um V na posição 188; pode ter um Q na posição 145 e um A na posição 188; ou pode ter um E na posição 145 e um V na posição 188.

Em determinadas concretizações, um polipéptido de calicreina 1 tecidular pode incluir os resíduos 1-262, os resíduos 19-262, ou os resíduos 25-262 de uma sequência de pré-pró-proteína de calicreina, incluindo, mas não se limitando a KLK1 humana com a SEQ ID N0:1 ou a SEQ ID NO:2, e seus fragmentos e variantes. Os fragmentos e as variantes de um polipéptido KLK1 mantêm a capacidade enzimática para libertar o péptido vasoactivo, Lys-bradiquinina, a partir do quininogénio com massa molecular pequena. Em algumas concretizações, uma variante ou fragmento activos mantêm a actividade de protease de serina de um polipéptido KLK1 que liberta calidina a partir de um precursor com maior massa molecular, tal como quininogénio, ou que cliva um substrato semelhante ao quininogénio tal como D-val-leu-arg-7-amido-4-trifluorometilcoumarina para libertar um fragmento colorimétrico ou fluorométrico.

Uma "variante" de um polipéptido de partida ou de referência é um polipéptido que tem uma sequência de aminoácidos diferente da do polipéptido de partida ou de referência. Incluem-se nestas variantes, por exemplo, eliminações de, inserções em, e/ou substituições de resíduos na sequência de aminoácidos do polipéptido de interesse. Um aminoácido variante, neste contexto, refere-se a um aminoácido diferente do aminoácido na posição correspondente numa sequência de polipéptido de partida ou de referência. Qualquer combinação de eliminação, inserção, e substituição pode ser feita para chegar à variante final ou à construção mutante, desde que a construção final possua as características funcionais pretendidas. As alterações de aminoácidos também podem alterar os processos do polipéptido de após a tradução, tais como a alteração do número ou da posição dos locais de glicosilação.

Uma variante de polipéptido pode ter pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 91 %, pelo menos cerca de 92 %, pelo menos cerca de 93 %, pelo menos cerca de 94 %, pelo menos cerca de 95 %, pelo menos cerca de 96 %, pelo menos cerca de 97 %, pelo menos cerca de 98 %, pelo menos cerca de 98,5 %, pelo menos cerca de 99 %, ou pelo menos cerca de 99,5 % de identidade de aminoácidos com a sequência referida, tal como, por exemplo, uma sequência de aminoácidos descrita neste documento.

Em alguns aspectos, um polipéptido KLK1 tem pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 91 %, pelo menos cerca de 92 %, pelo menos cerca de 93 %, pelo menos cerca de 94 %, pelo menos cerca de 95 %, pelo menos cerca de 96 %, pelo menos cerca de 97 %, pelo menos cerca de 98 %, pelo menos cerca de 98,5 %, pelo menos cerca de 99 %, ou pelo menos cerca de 99,5 % de identidade de aminoácidos com a SEQ ID NO: 1, ou com um fragmento da SEQ ID NO:l, tal como por exemplo, os resíduos 25-262 ou os resíduos 78-141 da SEQ ID NO: 1. Um tal polipéptido KLKl pode ter um E ou um Q no resíduo de aminoácido 145, e/ou um A ou um V na posição 188.

Em alguns aspectos, um polipéptido KLKl tem pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 91 %, pelo menos cerca de 92 %, pelo menos cerca de 93 %, pelo menos cerca de 94 %, pelo menos cerca de 95 %, pelo menos cerca de 96 %, pelo menos cerca de 97 %, pelo menos cerca de 98 %, pelo menos cerca de 98,5 %, pelo menos cerca de 99 %, ou pelo menos cerca de 99,5 % de identidade de aminoácidos com a da SEQ ID NO:2, ou a de um fragmento da SEQ ID NO:2, tal como por exemplo, os resíduos 25-262 ou os resíduos 78-141 da SEQ ID NO: 2. Um tal polipéptido KLKl pode ter um E ou um Q no resíduo de aminoácido 145, e/ou um A ou um V na posição 188. A "percentagem (%) de identidade de aminoácidos" em relação a um polipéptido é definida como a percentagem de resíduos de aminoácidos numa sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência de referência, depois de se alinharem as sequências e de se introduzirem espaçamentos, caso seja necessário, para se conseguir o máximo de percentagem de identidade de sequências, e não considerando quaisquer substituições conservadoras como parte da identidade de sequências. O alinhamento com o objectivo de se determinar a percentagem de identidade de sequências de aminoácidos pode ser conseguido de diversas maneiras que se encontram ao alcance dos conhecimentos da técnica, por exemplo, usando programas de computador disponíveis ao público, tais como BLAST, BLAST-2, ALIGN, ou Megalign (DNASTAR). Os especialistas da técnica podem determinar os parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para conseguir o alinhamento máximo ao longo do comprimento total da sequência que se estiver a comparar. 0 programa ALIGN-2 encontra-se disponível ao público através da Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia.

Para os objectivos deste documento, a % de identidade entre a sequência de aminoácidos de uma determinada sequência A e, com, ou em relação a uma determinada sequência de aminoácidos B (que pode em alternativa ser redigido como uma determinada sequência de aminoácidos A que tem ou compreende uma determinada % de identidade de sequência de aminoácidos com, face a, ou contra uma determinada sequência de aminoácidos B) , pode ser calculada como se segue: 100 vezes a fracção X/Y,

Em que X seja o número de resíduos de aminoácidos classificados como identicamente emparelhados pelo programa de alinhamento de sequências quando esse programa está a alinhar A e B, e em que Y é o número total de resíduos de aminoácidos de B. Entender-se-á que quando o comprimento da sequência de aminoácidos de da sequência A não é igual ao comprimento da sequência de aminoácidos B, a % de identidade das sequências de aminoácidos A em relação a B não será igual à % de identidade da sequência de aminoácidos de B em relação a A.

As variantes também podem incluir sequências adicionadas ao polipéptido de referência para facilitar a sua purificação, para melhorar a sua vida média metabólica ou para tornar o polipéptido mais fácil de identificar, por exemplo, uma região Fc, um marcador His, e/ou uma sequência de PEGilação. 0 termo "fragmento" inclui porções mais pequenas de um polipéptido KLK1 que mantêm a actividade de um polipéptido KLK1. Fragmentos inclui, por exemplo, um fragmento de um polipéptido KLK1 que pode ter um tamanho de entre cerca de 20 e cerca de 50, cerca de 20 a cerca de 100, cerca de 20 a cerca de 150, cerca de 20 a cerca de 200, ou cerca de 20 a cerca de 250 aminoácidos de comprimento. Noutras concretizações, um fragmento do polipéptido KLK1 pode variar em tamanho entre cerca de 50 e cerca de 100, cerca de 50 a cerca de 150, cerca de 50 a cerca de 200, ou cerca de 50 a cerca de 250 aminoácidos de comprimento. Noutras concretizações, um fragmento do polipéptido KLK1 pode ter um tamanho de entre cerca de 100 e cerca de 150, cerca de 100 a cerca de 200, cerca de 100 a cerca de 250, cerca de 150 a cerca de 175, cerca de 150 a cerca de 200, ou cerca de 150 a cerca de 250 aminoácidos de tamanho. Noutras concretizações ilustrativas, um fragmento de polipéptido KLK1 pode ter um tamanho de entre cerca de 200 e cerca de 250 aminoácidos de comprimento. Determinadas concretizações incluem um fragmento polipeptídico de uma KLKI de comprimento inteiro com cerca de, ou até cerca de, ou pelo menos cerca de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250 ou mais (por exemplo, contíguos) resíduos de aminoácidos. Em algumas concretizações, um fragmento pode conter os resíduos 25-262 ou os resíduos 78-141 de uma sequência de pré-pró-proteína. Em algumas concretizações, um fragmento pode ter um qualquer dos tamanhos destes fragmentos, como descritos acima, da SEQ D NO:l ou da SEQ ID NO:2.

Uma sequência de "tipo selvagem" ou "de referência" ou a sequência de uma proteína/polipéptido de "tipo selvagem" ou "de referência" pode ser a sequência de referência a partir da qual são derivados polipéptidos variantes por introdução de alterações. Em geral, a sequência de aminoácidos "de tipo selvagem" para uma determinada proteína é a sequência mais habitual na natureza. De um modo semelhante, uma sequência de um gene "de tipo selvagem" é a sequência de polinucleótido para aquele gene que se encontra mais amiúde na natureza. Podem introduzir-se mutações num gene "de tipo selvagem" (e deste modo na proteína que ele codifica) quer através de processos naturais, quer por meios induzidos por seres humanos.

Expressão de uma KLKl Recombinante

Os polipéptidos KLKl e as misturas descritas neste documento podem ser preparados por qualquer processo adequado conhecido dos entendidos na técnica, incluindo por metodologias recombinantes. A titulo de um exemplo geral, pode preparar-se KLKl por um processo incluindo um ou mais dos passos de: se preparar uma construção compreendendo uma sequência de polinucleótido que codifique para rhKLKl e que seja operacionalmente ligada a um elemento regulador; introduzir esta construção numa célula hospedeira; fazer uma cultura da célula hospedeira para expressar rhKLKl; e isolar rhKLKl da célula hospedeira. A construção e o sistema de expressão podem ser tais que a rhKLKl madura ou activa seja expressa a partir da célula hospedeira. Em alternativa, pode expressar-se rhKLKl sob uma forma inactiva, tal como a de um pró-péptido, e activar-se a potease de serina rhKLKl (por exemplo, por remoção da sequência "pró") depois de se isolar rhKLKl da célula hospedeira.

Para se expressar um polipéptido pretendido, pode inserir-se uma sequência de nucleótidos codificando para o polipéptido, ou uma sua equivalente funcional, no vector de expressão apropriado, isto é, um vector que contenha os elementos necessários para a transcrição e a tradução da sequência de codificação inserida. São bem conhecidos dos especialistas na técnica métodos que se podem utilizar para construir vectores de expressão contendo sequências codificando para o polipéptido de interesse e elementos de controlo transcricional e de tradução apropriados. Estes métodos incluem técnicas in vitro de ADN recombinante, técnicas sintéticas, e recombinação genética in vivo. Estas técnicas são descritas em Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2001), e em Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (2003). São conhecidos diversos sistemas de vectores de expressão e hospedeiros, e podem utilizar-se para conter e expressar sequências de polinucleótidos. Estes incluem, mas não se limitam a, micro-organismos tais como bactérias transformadas com bacteriófagos recombinantes, plasmídeos, ou vectores de expressão de ADN cosmídicos; levedura transformada com vectores de expressão; sistemas de células de insecto infectados com vector de expressão de vírus (por exemplo, baculovírus); sistemas de células de plantas transformados com vectores de expressão de vírus (por exemplo, vírus mosaico de couve-flor, CaMV; vírus mosaico do tabaco, TMV) ou com vectores de expressão bacterianos (por exemplo, plasmídeos Ti ou pBR322); ou sistemas de células animais, incluindo sistemas de células de mamíferos. Caso se utilize um sistema de expressão sem ser de mamíferos (tal como de bactérias) , então seria necessário utilizar um processo para adicionar grupos glicana ao rhKLKl, tal como células geneticamente modificadas que expressam os enzimas necessários para a glicosilação do estilo da dos mamíferos.

Em células hospedeiras de mamíferos, estão em geral disponíveis diversos sistemas de expressão baseados em vírus. Por exemplo, em casos em que se utiliza um adenovirus como vector de expressão, podem ligar-se sequências codificando para um polipéptido de interesse a um complexo de transcrição/tradução de adenovirus constituído pelo promotor tardio e pela sequência líder tripartida. A inserção de uma região não essencial El ou E3 do genoma virai pode ser utilizada para se obter um vírus viável que é capaz de expressar o polipéptido e células hospedeiras infetadas (Logan e Shenk, 1984, PNAS USA; 81: 3655-3659). Além disto, podem utilizar-se potenciadores da transcrição, tais como o vírus de sarcoma Rous (RSV) , para aumentar a expressão em células hospedeiras de mamífero.

Incluem-se nos exemplos de linhas de células hospedeiras de mamíferos úteis a linha de células CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); a linha humana de rim embriónico (células 293 ou células 293 subclonadas para crescimento numa cultura em suspensão, Graham et al., 1977, J. Gen. Virol.; 36: 59); células renais de rim de hamster infantil (BHK, ATCC CCL 10); células sertoli de murganho (TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod.; 23: 243-251); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde Africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2) ; células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34) ; células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); células de tumor mamário de murganho (MMT 060562, ATCC CCL51); células TR1 (Mather et ai., 1982, Annals NY Acad. Sci.; 383: 44-68); células MRC 5; células FS4; e uma linha de hepatoma humano (Hep G2). Outras linhas de hospedeiros humanos úteis incluem células de ovário de hamster Chinês (CHO), incluindo células DHFR-CHO (Urlaub et al., 1980, PNAS USA; 77: 4216)); e linhas de células de mieloma tais como NSO e Sp2/0. O ADN exógeno da invenção presente obtidas por clonagem genómica ou de cADN ou por síntese genética originam poliéptidos recombinantes KLK1 (rKLKl). Os produtos polipeptídicos KLK1 de expressão de culturas de células de vertebrados (por exemplo, de mamíferos e de aves) podem ser adicionalmente caracterizadas por serem isentas de associação a proteínas humanas ou a outros contaminantes, que podem estar associados a KLK1 no seu ambiente celular mamífero natural ou em fluidos extracelulares tais como plasma ou urina. Os polipéptidos da invenção também podem incluir um resíduo inicial do aminoácido metionina (na posição 1). Determinadas concretizações incluem portanto células hospedeiras (por exemplo, células hospedeiras eucarióticas tais como células CHO, células 293) que compreendam um polinucleótido recombinante ou introduzido que codifique para um polipéptido KLK1 descrito neste documento, tal como o polipéptido da SEQ ID NO:l ou da SEQ ID NO:2. Também se incluem células hospedeiras que compreendam um polinuleótido que codifique para o polipéptido KLK1 recombinante (por exemplo, não ocorrendo na natureza) descrito neste documento, tal como o polipéptido da SEQ ID NO:1 ou da SEQ ID NO:2. A cultura de células expressando polipéptidos KLK1 da invenção presente pode ser isolada e purificada utilizando, por exemplo, separações cromatográficas ou separações imunológicas envolvendo preparações de anticorpos monoclonais e/ou policlonais, ou utilizando inibidores ou substratos de proteases de serina para cromatografia por afinidade. Tal como será evidente aos especialistas da técnica, as sequências de aminoácidos da SEQ ID N0:1 e da SEQ ID NO: 2 listam a sequência para pré-pró KLK1. Caso o gene codificando para qualquer uma destas sequências seja expresso em células de mamíferos, o péptido de sinal com 17 aminoácidos (resíduos 1-18) deve resultar no polipéptido KLK1 que será segregado pela célula, e o péptido de sinal será removido pela célula. Caso seja pretendido não ter este polipéptido segregado, ou caso não se utilizem células sem ser de mamíferos para a expressão, pode gerar-se um gene codificando para KLK1 no qual seja omitida a sequência de sinal, ou seja, substituída por outra sequência. A pró-sequência com 7 aminoácidos (resíduos 19-24) inibirá a actividade da protease de serina de KLK1 e podem ser removidos para permitir a actividade do polipéptido KLK1 maduro. A pró-sequência pode ser removida depois de o polipéptido KLK1 ser isolado, por exemplo expondo a pró-KLKl a tripsina em condições que permitam a clivagem da pró-sequência, ou gerando um gene codificando para KLK1 em que a pró-sequência seja omitida ou substituída por outra sequência.

Em determinados aspectos, os polipéptidos KLK1 descritos neste documento podem ser "marcados" por associação covalente com uma substância marcadora detectável (tal como, por exemplo, radiomarcadores tais como 125I ou 32P e marcadores não isotópicos tais como biotina) para proporcionar reagentes úteis na detecção e na quantificação de KLK1 em tecido sólido e amostras de fluido tais coo sangue ou urina.

Para além dos métodos de produção recombinante, podem produzir-se os polipéptidos rhKLKl por síntese peptídica directa utilizando técnicas em fase sólida (veja-se, por exemplo, Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc.; 85: 2149-2154). Pode levar-se a cabo a síntese proteica utilizando técnicas manuais ou por automação. Pode conseguir-se a síntese automatizada, por exemplo, utilizando o Sintetizador de Péptidos da Applied Biosystems 431A (Perkin Elmer). Em alternativa, podem sintetizar-se quimicamente diversos fragmentos em separado, e combinar-se utilizando métodos químicos para se produzir o polipéptido pretendido. Também se inclui a expressão proteica isenta de células. Esta concretização e outras relacionadas utilizam tipicamente ARN polimerase purificada, ribossomas, tARN e ribonucleótidos; estes reagentes podem ser produzidos por extracção de células ou de um sistema de expressão baseado em células.

Para os processos sintéticos que não originem polipéptidos KLK1 glicosilados, também se pode empregar um processo para adicionar grupos glicana do estilo de mamíferos, ligados por N nas posições 78 e 84 para gerar o (duplamente glicosilado) e nas posições 78, 84 e 141 para gerar a forma glicosilada de massa molecular elevada (triplamente glicosilada) do polipéptido rhKLKl.

Glicoformas A invenção presente diz respeito a composições com diversas formas glicosiladas de polipéptidos calicreína 1 tecidular (KLK1), incluindo composições que incluem razões definidas de polipéptidos KLK1 duplamente e triplamente glicosilados tal como se definem nas reivindicações. A sequência de aminoácidos da calicreína 1 tecidular indica que existem três locais potenciais ligados a Asn (ligados por N) para glicosilação no polipéptido, nas posições dos aminoácidos 78, 84, e 141 (em relação à sequência intacta de aminoácidos da pré-pró-proteína mostrada, por exemplo, na SEQ ID N0:1), bem como locais de glicosilação putativos ligados por 0. A KLK1 está presente em circulação apenas em pequenas quantidades, que se encontram no soro a 3,5+/-0,4 ng/mL (Chao e Chao, 1996, Hypertension; 27: 491-494). Uma via principal de eliminação da KLK1 do corpo humano é através dos rins. A calicreina tecidular isolada da urina humana aparece num gel de SDS PAGE como duas bandas, uma glicoforma com massa molecular menor e outra com massa molecular maior. A calicreina urinária humana (HU KLK) contém cerca de 30 % de conteúdo em hidratos de carbono baseados na massa molecular estimada por electroforese sobre gel de poliacrilamida com dodecilsulf ato de sódio (SDS) . A calicreina humana tem três locais potenciais de glicosilação em Asn (ligados por N) nas posições 78, 84, e 141. Numa análise mais detalhada, foi determinado que a calicreina KLK1 urinária humana está completamente glicosilada nas posições 78 e 84, mas apenas parcialmente glicosilada na posição 141, com apenas 60 % de glicosilação na posição 141 (veja-se WO/1989/000 192). Não se detecta glicosilação ligada por O em KLK1 com ocorrência natural.

Uma análise de KLK1 recombinante humana (rhKLKl) expressa a partir de células CHO, detecta um perfil de glicosilação semelhante ao detectado para a KLK1 humana proveniente da urina, isto é, 40 % dos polipéptidos demonstram glicosilação ligada por N em apenas duas posições, as posições 78 e 84, e 60 % dos polipéptidos demonstram glicosilação ligada por N em todas as três posições, 78, 84, e 141 (Lu et al., 1996, Protein

Expression and Purification; 8:227-237).

Antes da invenção presente, a única razão conhecida entre a glicoforma com pequena massa molecular de KLK1 e a gicoforma com elevada massa molecular em rhKLKl é de 40:60 (baixa:alta). Tal como se utiliza neste documento, o termo "glicoforma" refere-se a diversas isoformas de KLK1 que diferem relativamente ao número ou tipo de grupos glicana a elas ligadas (isto é, hidratos de carbono, polissacáridos, oligossacáridos, ou grupos de glicosilação).

Detectam-se por uma análise em SDS-PAGE, polipéptidos KLK1 glicosilados em apenas duas das três posições disponíveis (posições 78 e 84) como uma banda de baixa massa molecular, e são referidas neste documento como a glicoforma duplamente glicosilada com pequena massa molecular de KLK1 (ou como a KLK1 "inferior" ou "dupla") . Numa análise por SDS-PAGE, detectam-se polipéptidos KLK1 glicosilados em todas as três posições (posições 78, 84, e 141) como banda de massa molecular elevada, e são referidas neste documento como a glicoforma com elevada massa molecular, triplamente glicosilada de KLK1 (ou KLK1 "maior" ou "tripla"). A invenção presente inclui composições com um primeiro polipéptido calicreina 1 tecidular e um segundo polipéptido calicreina 1 tecidular, em que o primeiro polipéptido calicreina 1 tecidular tem três glicanas ligadas a três posições diferentes disponíveis para gli cosilação no polipéptido e o segundo polipéptido calicreína 1 tecidular tem duas glicanas ligadas a apenas duas das três posições diferentes disponíveis para glicosilação no polipéptido, tal como se definem nas reivindicações e em que o primeiro e o segundo polipéptidos rhKLKl estão presentes a uma razão de entre 45:55 e 55:45 (alta:baixa). Em algumas concretizações, uma razão entre as glicoformas de alta massa molecular e baixa massa molecular é de 50:50. Em algumas concretizações, a razão não é 60:40 (alta:baixa). Em algumas concretizações, a razão não é 40:60 (alta:baixa).

Isolamento de KLKl com Baixa Massa Molecular e com Alta Massa Molecular

As razões entre as isoformas duplamente e triplamente glicosiladas de KLKl podem ser detectadas e quantificadas por diversos métodos, incluindo cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) , que pode incluir fase reversa (RP-HPLC), cromatografia de afinidade de lectina e electroforese de afinidade de lectina.

Em determinadas concretizações da invenção presente, a razão entre glicoformas de baixa (duplamente glicosilada) e alta (triplamente glicosilada) massa molecular de KLKl é de 50:50 (baixa:alta). Noutras concretizações, a razão é de entre 45:55 e 55:45 incluindo, por exemplo, cerca de 46:54, cerca de 47:53, cerca de 48:52, cerca de 49:51, cerca de 51:49, cerca de 52:48, cerca de 53:47, e cerca de 54:46, incluindo todos os valores inteiros e os valores decimais entre estes.

Incluem-se nas concretizações da invenção presente composições que compreendem um polipéptido recombinante KLK1 (rKLKl), e aquelas que incluam um ácido nucleico codificando para um polipéptido rKLKl, e misturas destas glicoformas desses polipéptidos rKLKl. Em concretizações especiais, o polipéptido KLK1 é um polipéptido recombinante humano. 0 KLK1 recombinante humano (rhKLKl) pode proporcionar determinadas vantagens em relação a outras fontes de KLK1, tais como KLK1 urinário (por exemplo, KLK1 humano isolado da urina humana), incluindo uma preparação homogénea de rhKLKl, um caminho mais simples para seu licenciamento, e opções para alterar a sequência de aminoácidos ou o perfil de glicosilação com base nas condições de cultura de células.

Tal como descrito acima, a KPK1 pode ser expressa como uma pró-KLKl em que KLK1 esteja ligado ao pró-péptido. Pode remover-se o pró-péptido antes da separação das glicoformas com alta e baixa massa molecular, ou podem separar-se as glicoformas de KLK1 com alta e com baixa massa molecular, e em seguida digerir-se para se recuperar o pró-péptido e deste modo gerar a KLK1 activa. Pode activar-se a pró-KLKl por digestão com tripsina, ou outros enzimas. Em alternativa, pode expressar-se uma variante de KLK1 que não codifique para a pró-sequência, ou codifica para a pró-sequência que é clivada por enzimas na célula, gerando assim uma KLK1 activa.

Pode empregar-se uma variedade de outros métodos para gerar misturas de glicoformas de KLK1 com alta e com baixa massa molecular. Numa concretização, pode introduzir-se um vector codificando para KLK1 numa linha de células, e podem despistar-se diversos clones expressando KLK1 recombinante para se determinar a razão entre as glicoformas de KLK1 com baixa e com alta massa molecular. Uma linha de células que expressa a razão pretendida entre as glicoformas de KLK1 com baixa e com alta massa molecular pode então ser seleccionada.

Noutra concretização, uma linha de células pode não expressar a razão pretendida entre as glicoformas com baixa e alta massa molecular de KLK1, mas podem manipular-se as condições da cultura de células até a linha de células expressar as glicoformas com baixa e alta massa molecular de KLK1 à razão pretendida. São conhecidas diversas metodologias na técnica para manipular as condições da cultura de células de modo a que a glicosilação das proteínas seja alterada, tal como a adição de determinados açúcares ou outros nutrientes, os teores em oxigénio dissolvido, etc. Descreve-se num artigo exemplificativo para manipular as condições da cultura de células para afectar as alterações de glicosilação, Devasahayam, 2007, Indian J. Med. Res.; 126: 22-27.

Em determinados aspectos podem separar-se preparações de calicreína ou de pró-calicreína purificadas em duas glicoformas diferentes por cromatografia de benzamidina - sefarose. A coluna de afinidade acoplada a benzamidina exibe uma afinidade diferencial de ligação em relação às duas glicoformas. A calicreína com elevada massa molecular liga-se folgadamente à coluna de afinidade e pode ser eluída utilizando uma eluição isocrática com NaCl 50 mM no tampão de eluição, enquanto a calicreína com massa molecular baixa se liga mais firmemente à coluna de benzamidina e pode ser eluída com GdnHCl 2 M em tampão de Tris-HCl 10 mM a pH 7,6. Noutra concretização, a separação por benzamidina - sefarose das calicreínas com alta e baixa massa molecular pode ser levada a cabo utilizando uma preparação de calicreína parcialmente purificada. Os passos descritos acima para a purificação de calicreína recombinante podem ser seguidos para isolar uma razão específica das glicoformas de KLK1. Por exemplo, caso se pretenda uma mistura a 50:50 (ou outra) das glicoformas com alta e baixa massa molecular de KLK1, mas uma linha de células estiver a produzir uma mistura a 60:40 (alta:baixa), as condições de lavagem da coluna podem ser alteradas de modo a que parte da KLK1 com alta massa molecular seja eluída e não retida, antes da eluição da KLK1 restante, resultando uma mistura a 50:50 das glicoformas após a purificação na coluna. Em alternativa, podem manipular-se as condições de eluição de modo a que uma fracção da KLK1 com alta massa molecular seja retida na coluna, resultando uma mistura das glicoformas a 50:50 após purificação em coluna.

Pode também utilizar-se cromatografia de interacção hidrofóbica utilizando uma coluna de octil sefarose para isolar as pró-calicreinas com alta e baixa massas moleculares. A uma concentração de 1,0 M em sulfato de amónio, a octil sefarose pode ligar-se selectivamente a pró-calicreína obtida de uma preparação parcialmente purificada de pró-calicreína. Nestas condições, a calicreína residual não ligada da preparação elui da coluna na fracção que passa directamente. A pró-calicreína com massa molecular alta da preparação apresenta uma ligação menos forte à coluna de interacção hidrofóbica e é eluída numa eluição isocrática utilizando sulfato de amónio 1 M. A pró-calicreína com massa molecular baixa que exibe uma ligação mais forte à coluna pode ser eluída subsequentemente com um gradiente reverso linear de 1,0 até 0 M de sulfato de amónio. Tal como descrito acima, caso se pretenda uma mistura a 50:50 ou uma mistura semelhante das glicoformas com massa molecular baixa e alta de KLK1, mas uma linha de células está a produzir uma mistura 60:40 (alta:baixa), as condições de lavagem da coluna podem ser alteradas de modo a que parte da KLK1 de massa molecular alta seja eluída e não seja retida antes da eluição da KLKl restante, resultando numa mistura a entre 45:55 e 55:45 de glicoformas após a purificação na coluna. Em alternativa, as condições de eluição podem ser manipuladas de modo a que a fracção da KLKl de massa molecular elevada seja mantida na coluna, resultando uma mistura a entre 45:55 e 55:45 das glicoformas após a purificação em coluna.

Em determinadas concretizações, as glicoformas podem ser isoladas por HPLC em fase reversa. Noutra concretização, as glicoformas podem ser isoladas empregando cromatografia de exclusão de dimensões, e pode utilizar-se preferivelmente esta separação em soluções em que a KLK1 esteja quer parcialmente, quer substancialmente purificada a partir do meio celular. Adicionalmente, as glicoformas são separadas em condições não redutoras ou não desnaturantes para permitir que a KLK1 mantenha as ligações dissulfureto internas. Outra técnica que se poderia utilizar é a separação baseada na carga ou na hidrofobicidade. 0 terceiro grupo glicosilado que distingue as formas de massa molecular baixa e alta de KLK1 resultaria em a forma com massa molecular mais alta ser mais hidrofilica. Além disto, as duas glicoformas difeririam no ponto isoeléctrico devido ao ácido siálico adicional na espécie hidrato de carbono. Uma vez separadas, as glicoformas podem ser recombinadas gerando a razão pretendida. Em alternativa, quer a glicoforma com massa molecular alta quer a com massa molecular baixa de KLK1 podem ser adicionadas a uma mistura previamente existente de glicoformas de KLK1 até se atingir a razão pretendida.

Por exemplo, para gerar uma razão 55:45 a partir de uma mistura inicial 70:30 (glicoformas com massa molecular alta em relação a baixa, pode adicionar-se uma quantidade de glicoforma com massa molecular baixa de KLK1 até a mistura atingir os 55:45. De modo semelhante, para gerar uma razão de 45:55 a partir de uma mistura inicial 25:75 (glicoformas com massa molecular alta em relação a baixa), pode adicionar-se KLK1 com massa molecular alta até se atingir uma razão de 45:55.

Pureza. As determinações da pureza de uma composição da invenção presente podem incluir, mas não se limitam a, determinação de endotoxina, proteína de célula hospedeira, ADN de célula hospedeira, e/ou percentagem de pureza de pico único por SEC HPLC.

Determinação de proteína da célula hospedeira. Pode caracterizar-se a pureza em relação aos teores de proteínas de célula hospedeira. As células hospedeiras utilizadas para expressão recombinante podem ser de linhas celulares de bactérias e de leveduras ou de espécies de mamíferos ou de insectos. As células contêm centenas a milhares de proteínas de célula hospedeira (HCP) e outras biomoléculas que poderiam contaminar o produto final. 0 HCP pode ser segregado em conjunto com a proteína de interesse, ou libertados por lise acidental das células, e podem contaminar a proteína com interesse. Podem aplicar-se dois tipos de métodos imunológicos à análise de HCP: transferência Western (WB) e imunoensaio (IA), que inclui técnicas tais como ELISA e imunoensaio em sanduíche ou métodos semelhantes utilizando marcadores radioactivos, luminescentes, ou fluorescentes de reportagem. As composições da invenção presente podem incluir proteína da célula hospedeira inferiores a cerca de 500, inferiores a cerca de 400, inferiores a cerca de 300, inferiores a cerca de 200, inferiores a cerca de 100 ou menos do que cerca de 50 ng/mg de proteína total.

Determinação de ADN da célula hospedeira. Pode caracterizar-se a pureza em relação aos teores do ADN da célula hospedeira. A detecção de ADN residual da célula hospedeira pode ser levada a cabo por Reacção de Polimerase em Cadeia (PCR) com uma série de iniciadores para sequências do genoma da célula hospedeira. Reporta-se em geral o ADN residual da célula hospedeira como sendo inferior a um determinado valor limiar, mas também se pode quantificar por um método de rPCR. As composições da invenção presente podem incluir ácido desoxirribonucleico celular (ADN) inferior a cerca de 100, inferior a cerca de 90, inferior a cerca de 80, inferior a cerca de 70, inferior a cerca de 60, inferior a cerca de 50, inferior a cerca de 40, inferior a cerca de 30, inferior a cerca de 20, ou inferior a cerca de 10 pg/mg de proteína total.

Teste de endotoxina. A endotoxina é extremamente potente, é estável ao calor, passa por filtros de membrana esterilizante e está presente em todos os locais nos quais as bactérias tenham estado ou estejam presentes. Uma Unidade de Endotoxina (EU) é uma unidade de actividade biológica do Padrão de Referência de Endotoxinas da USP. 0 teste de endotoxinas bacterianas (BET) é um teste para detectar ou quantificar endotoxinas de bactérias Gram-negativas utilizando lisado de amebócitos (células brancas de sangue) do caranguejo-ferradura (Limulus polyphemus ou Tachypleus tridentatus) . Utiliza-se reagente de lisado de amebócitos Limulus (LAL), aprovados pela FDA, é utilizado para todos os testes de endotoxinas USP. Existem três métodos para este teste: o Método A, a técnica de coagulação de gel, que se baseia na formação de gel; o Método B, a técnica turbidimétrica, baseada no desenvolvimento de turbidez após a clivagem de um substrato endógeno; e o Método C, técnica cromogénica, baseado no desenvolvimento de cor depois da clivagem de um complexo sintético de péptido-cromogénico.

Estão descritos dois tipos de testes de endotoxinas na USP <85> BET. Os testes fotométricos necessitam de um espectrofotómetro, um programa especifico para endotoxinas e uma capacidade de impressão. 0 sistema fotométrico é uma unidade manual empregando um cartucho LAL de utilização única que contém reagentes secos, previamente calibrados; não há necessidade de reagentes líquidos nem de padrões. A unidade aprovada pela FDA é comercializada sob a designação Endosafe®-PTS™. 0 dispositivo necessita de cerca de 15 minutos para analisar pequenas quantidades de amostra, uma alíquota de 25 pL de CSP diluída num tubo estéril, e a impressão dos resultados. Em contraste, os métodos de coagulação de gel necessitam de um bloco aquecido a seco, pipetas calibradas e um termómetro, um misturador vórtex, reagentes LAL liofilizados, Água Reagente para LAL (LRW) para hidratar os reagentes e vidraria isenta de pirogénicos. Neste teste de coagulação, a amostra diluída e os reagentes líquidos necessitam de cerca de uma hora para a preparação da amostra e do controlo positivo e de uma hora de incubação num bloco térmico; os resultados são manualmente registados. Deste modo, a simplicidade e a velocidade do sistema automatizado tornam-no idealmente adequado para instalações farmacêuticas.

Pureza por SEC HPLC. 0 grau de agregação da rhKLKl (glicoforma isolada ou mistura de glicoformas) pode ser determinado por cromatografia de exclusão de dimensões (SEC) , que separa partículas com base no seu tamanho. É u método geralmente aceite para determinar a estrutura terciária e a estrutura quaternária de proteínas purificadas. Utiliza-se a SEC sobretudo para a análise de moléculas grandes tais como proteínas ou polímeros. A SEC funciona armadilhando estas moléculas mais pequenas nos poros de uma partícula. As moléculas maiores passam simplesmente pelos poros uma vez que são grandes demais para entrar nos poros. As moléculas maiores fluem, portanto, através da coluna mais depressa do que as moléculas mais pequenas, isto é, quanto mais pequena a molécula, mais longo o período de tempo de retenção. Em determinadas concretizações, a "pureza" de um polipéptido KLK1 numa composição pode ser especificamente definida. Por exemplo, determinadas composições podem incluir um polipéptido hKLKl que seja pelo menos cerca de 80, pelo menos cerca de 85, pelo menos cerca de 90, pelo menos cerca de 91, pelo menos cerca de 92, pelo menos cerca de 93, pelo menos cerca de 94, pelo menos cerca de 95, pelo menos cerca de 96, pelo menos cerca de 97, pelo menos cerca de 98, pelo menos cerca de 99, ou 100 % puro, incluindo todos os valores decimais entre estes, tal como medidos, por exemplo e de modo algum como limitação, por cromatografia liquida de alta eficiência (HPLC) , uma forma bem conhecida de cromatografia em coluna frequentemente utilizada em bioquímica e em química analítica para separar, identificar, e quantificar compostos. Determinadas composições são também substancialmente isentas de agregados (aparecendo em mais do que 95 % como um único pico na SEC HPLC). Determinadas concretizações são isentas de agregados aparecendo mais do que cerca de 96 %, cerca de 97 %, cerca de 98 %, ou cerca de 99 % como um único pico no SEC HPLC.

Em determinadas concretizações, a glicoforma de alta ou de baixa massa molecular de rhKLKl, ou uma mistura de glicoformas, pode apresentar uma ou mais das seguintes determinações de pureza: menos do que cerca de 1 EU de endotoxina/mg de proteína, menos do que cerca de 100 ng de proteína de célula hospedeira/mg de proteína, menos do que cerca de 10 pg de ADN de célula hospedeira/mg de proteína, e/ou mais do que cerca de 95 % de pureza do pico único no SEC HPLC.

Actividade de Glicoformas de rhKLKl. A KLK1 é uma protease de serina que cliva quininogénio com massa molecular baixa originando a libertação de calidina (lys-bradiquinina). Esta actividade de protease das glicoformas isoladas de KLK1 pode ser quantificada num ensaio de actividade enzimática quantificando quer a clivagem de quininogénio com pequena massa molecular, ou a geração de lys-bradiquinina. Num formato de ensaio, faz-se reagir um substrato marcado com a glicoforma KLK1, e detecta-se a libertação de um fragmento marcado. Um exemplo de um tal substrato fluorogénico adequado para a determinação da actividade de KLK1 é a D-val-leu-arg-7-amido-4- trifluorometilcoumarina (D-VLR-AFC, FW 597.6) (Sigma, N2 de Catálogo nV2888 ou Ana Spec. Inc. N2 de Catálogo 24137). Quando a D-VLR-AFC é hidrolisada, a AFC livre resultante da reacção pode ser quantificada por detecção fluorométrica (excitação a 400 nm, emissão a 505 nm) ou por detecção espectrofotométrica a 380 nm (coeficiente de extinção = 12.600 a pH 7,2). Outros métodos e substratos também podem ser utilizados para quantificar a actividade proteolitica de glicoformas de KLK1. A actividade de KLK1, medida em Unidades ou em Unidades/mL, pode ser determinada comparando a actividade relativa de uma amostra de KLK1 com a do padrão de quininogenase porcina adquirido junto do National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC, Produto N2 78/543) . Para este padrão, a potência atribuída é de 22,5 unidades internacionais (IU) por ampola de 20 pg de quininogenase pancreática porcina. Tipicamente, são feitas diluições em série do padrão, e compara-se a actividade de uma amostra desconhecida de KLK1 com a do padrão. Para as experiências descritas neste documento, as glicoformas de rhKLKl ou suas misturas tinham actividades especificas de cerca de 200 a 450 IU/mg, embora as actividades especificas de determinados lotes possam estar fora desta gama. No entanto, a actividade especifica de rhKLKl pode variar de lote para lote, e necessitaria, portanto, de ser monitorizada para se determinar a dosagem em mg/kg ou total por mg de rhKLKl para ser administrada a um animal ou a um doente.

Os ensaios baseados em animais podem também ser utilizados para se determinar a actividade de glicoformas de hKLKl, incluindo estimular-se a absorção de glucose da circulação, num animal. Por exemplo, a glicoforma de KLKl pode ser administrada a um animal que reaja a KLKl, tal como um rato Sprague-Dawley, e a absorção de glucose pelos tecidos determinada com uma estenose hiperinsulinémica-euglicémica. Os resultados destes ensaios baseados em animais podem ser difíceis de quantificar. Deste modo, podem utilizar-se os resultados de testes em animais de um modo qualitativo tal como comparando glicoformas para se determinar se determinadas glicoformas ou suas misturas têm mais ou menos actividade quando comparada com outras glicoformas ou misturas. A invenção presente também inclui composições farmacêuticas incluindo uma quantidade eficaz do ponto de vista terapêutico de uma mistura de isoformas de KLK1 glicosiladas descritas neste documento, e um diluente, veiculo ou adjuvante aceitável do ponto de vista farmacêutico. Estas composições farmacêuticas podem ser formuladas com veículos ou excipientes aceitáveis do ponto de vista farmacêutico, por exemplo, para optimizar a estabilidade e conseguir a isotonicidade. Em determinados aspectos, o pH da formulação pode ser próximo do pH fisiológico ou cerca de pH 7,4, incluindo cerca de pH 6,5, cerca de 7,0, cerca de 7.1, cerca de 7,2, cerca de 7,3, cerca de 7,4, cerca de 7,5, cerca de 7,6, cerca de 7,7, cerca de 7,8, cerca de 7,9, cerca de 8,0, cerca de 8,5, u qualquer gama destas. Em algumas concretizações, a composição (por exemplo a composição farmacêutica) compreende um polipéptido KLK1 em combinação com um veículo fisiologicamente aceitável. Incluem-se nestes veículos os veículos, excipientes ou estabilizadores aceitáveis do ponto de vista farmacêutico que sejam não tóxicos para a célula ou para o mamífero que a eles seja exposto às dosagens e concentrações empregues. São bem conhecidos na técnica métodos de formulação que estão descritos, por exemplo, no Remington: The Science and Practice of

Pharmacy, Mack Publishing Company, Easton, Pa., Edição 21 (2005) . A frase "fisiologicamente aceitável" ou "aceitável do ponto de vista farmacêutico" refere-se a entidades moleculares e a composições que não originam nenhuma reacção significativa, alérgica ou semelhante e inconveniente, quando administrados a um ser humano. Tipicamente, estas composições são preparadas como injectáveis, quer como soluções liquidas, quer como suspensões; também se podem preparar formas sólidas adequadas para solução em, ou suspensão em liquido, antes de uma injecção. As preparações também podem ser emulsionadas.

Tal como se utiliza neste documento, "veiculo" inclui todos e quaisquer solventes, meios dispersivos, veículos, revestimentos, diluentes, agentes isotónicos e de atraso da absorção, tampões, soluções de transporte, suspensões, colóides, e outros semelhantes. Excepto em quanto diz respeito a quaisquer meios ou agentes convencionais que sejam incompatíveis com o ingrediente activo, a sua utilização nas composições terapêuticas está contemplada.

As composições de KLKl descritas neste documento podem ser formuladas para serem administradas por diversas técnicas, incluindo, por exemplo, a via subcutânea, endovenosa, oral, rectal, transmucosal, transdérmica, intestinal, parenteral, intramuscular, intramedular, intratecal, intraventricular directa, intraperitoneal, intranasal, e intraocular, entre outras.

Algumas concretizações incluem a administração por injecção subcutânea. Uma injecção subcutânea (abreviada como SC, SQ, sub-cu, sub-Q ou subcut sendo SQ a abreviatura preferida) pode ser administrada sob a forma de um bolus na subcutis, camada de pele directamente abaixo da derme e da epiderme, colectivamente referidas como a cutis. São exemplos de locais do corpo ande as pessoas podem injectar SC com maior facilidade, sem limitação, a área exterior da parte superior do braço, imediatamente acima e abaixo da cintura, excepto em determinados aspectos a área em torno do umbigo (um circulo com cerca de 5 cm de diâmetro) , a área superior da nádega, logo atrás dos ossos da anca, e a parte frontal da coxa, a meio do caminho para o outro lado, entre cerca de 10 cm abaixo da parte superior da coxa e cerca de 10 cm acima do joelho. Estas áreas podem variar consoante o tamanho da pessoa. Além disto, alterando o local da injecção pode evitar a formação de inchaços ou pequenas cavidades denominadas lipodistrofias na pele.

As injecções subcutâneas atingem normalmente o tecido adiposo por baixo da pele e em alguns casos pode utilizar-se uma agulha mais pequena, mais curta. Em casos específicos, pode utilizar-se uma agulha com um comprimento de entre cerca de ^ polegada e cerca de 5/8 de uma polegada, com um calibre de cerca de 25 a cerca de 31, que é suficiente para administrar a medicamentação por via subcutânea. Tal como o entenderá um indivíduo com conhecimentos da técnica, estas recomendações são de natureza geral e as injecções SC podem ser administradas utilizando agulhas com outros tamanhos. Em algumas concretizações a administração SC é levada a cabo beliscando-se o tecido de modo a levantá-lo para evitar uma injecção no músculo, e/ou insere-se a agulha a um ângulo de cerca de 45° em relação à pele. A injecção intramuscular é uma injecção dentro da massa de um músculo, em geral o músculo da parte superior do braço, da coxa ou da nádega. As injecções intramusculares são administradas quando a substância se destina a ser rapidamente absorvida. Elas devem ser administradas com o maior cuidado, em particular na nádega, porque se pode lesionar o nervo ciático ou se pode atingir um vaso sanguíneo de grande calibre caso a injecção não seja feita de modo correcto no quadrante superior e exterior da nádega. Também se utiliza o músculo deltoide no ombro, mas menos habitualmente que o músculo glúteo da nádega; deve tomar-se o cuidado de inserir a agulha no centro, 2 cm abaixo do acrómio. As injecções na região anterolateral da coxa são consideradas as mais seguras por existir uma menor probabilidade de lesão de um vaso sanguíneo principal ou de um nervo. A agulha deve ser suficientemente longa para assegurar que se injecta a medicamentação profundamente no tecido do músculo. Regra geral, não se administram mais do que 5 mL numa injecção intramuscular a um adulto. Insere-se a agulha a um ângulo de 902 em relação à pele. Não se administram em geral injecções intraperitoneais a doentes humanos devido ao desconforto, e apenas se administram para se obterem teores sistémicos do agente no sangue mais depressa do que por injecção subcutânea ou intramuscular, utilizando-se quando não existam veias acessíveis. Introduz-se a agulha no flanco superior puxando-se o êmbolo da seringa para se assegurar que não se penetrou no intestino. A solução a injectar deve correr livremente.

As injecções intravitreais (intraoculares) são injecções nos olhos e é essencial um pequeno volume de injecção para estes tipos de injecções para evitar hipertensão ocular. 0 local da injecção é habitualmente inferotemporal para facilidade de acesso. Alguns especialistas da retina farão a injecção no quadrante superotemporal, uma vez que crê que caso se forme uma complicação tal como um deslocamento da retina, pode ser tratada mais facilmente com uma retinopexia pneumática. A injecção intracerebral é uma injecção no cerebelo ou no cérebro. Estas injecções necessitariam de um pequeno volume de injecção para se evitar uma hipertensão localizada que pode resultar em danos do tecido neuronal.

Injecção intraespinal (intratecal) é uma injecção de uma substância através da theca da medula espinal no espaço subaracnóide. 0 doseamento das misturas de glicoformas de rhKLKl dependerá de diversos factores, incluindo a doença que se pretende tratar, outros medicamento que o doente esteja a tomar, etc. 0 doseamento de KLK1 também depende da actividade especifica da proteína KLK1. As dosagens de KLK1 são administradas com base no número de unidades, que são transformadas em mg de proteína. A KLK1 é uma protease de serina que cliva quininogénio com pequena massa molecular resultando na libertação de calidina (lys-bradiquinina). Esta actividade da KLK1 pode ser quantificada num ensaio de actividade enzimática descrito acima, ou por outros métodos podem também utilizar-se substratos para medir a actividade proteolítica de KLK1.

Segundo as Recomendações da FDA para a Indústria: Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trial for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers (Julho de 2005), Apêndice D: Converting animal doses to human equivalent doses. Uma dose equivalente para seres humanos é 1/7 da dose para ratos, e uma dose equivalente para humanos é 1/12 da dose para murganhos. A título de um exemplo não limitativo, em alguns aspectos, uma mistura de glicoformas de KLK1 é administrada por via subcutânea a uma dose de pelo menos cerca de 200 pg/kg (0,20 mg/kg), ou a entre cerca de 20 pg/kg e cerca de 5.000 pg/kg (0,02 a 5,0 mg/kg) . A título de um exemplo ilustrativo, caso se administre rhKLKl a uma dose de cerca de 200 pg/kg a um doente com 90 kg, então seriam necessários no total cerca de 18,0 mg de KLK1. Caso a KLK1 seja formulada a 5 mg/mL, então no total injectar-se-iam cerca de 3,6 mL, que é um volume grande e provocaria desconforto caso se injectasse por via subcutânea. No entanto, caso se formulasse a KLK1 a 25 mg/mL, o volume total da injecção seria de 0,72 mL, que se encontra adentro do volume recomendado para injecção subcutânea, que é de 1,0 a 1,5 mL.

Em alternativa, para administrar uma dose de 500 pg/kg a uma pessoa com 90 kg são necessários cerca de 45 mg de KLK1. Caso se formulasse a KLKl a 25 mg/mL, o volume da injecção é de cerca de 1,8 mL, acima do volume de injecção recomendado para via subcutânea. Caso se formulasse a KLKl a 50 mg/mL, o volume de injecção será de cerca de 0,9 mL, adentro do limite tolerável para uma injecção subcutânea num ser humano.

Uma composição da invenção presente pode incluir uma ou mais modalidades terapêuticas. Em alguns aspectos, a administração de uma composição da descrição presente pode permitir a eficácia de uma menor dosagem de outras modalidades terapêuticas quando comparada com a administração apenas das outras modalidades terapêuticas, proporcionando alivio da toxicidade observada para a administração de maiores doses das outras modalidades. Pode administrar-se um ou mais agentes terapêuticos adicionais antes, depois, e/ou simultaneamente com a administração dos agentes da descrição presente. Os agentes da descrição presente e os agentes terapêuticos adicionais podem ser administrados em separado ou como parte de uma mistura. Tal como se utiliza neste documento, um agente terapêutico adicional pode incluir, por exemplo, um agente cuja utilização no tratamento da diabetes seja conhecida por parte do técnico conhecedor.

Também se podem administrar as composições de KLK1 tal como descritas neste documento em combinação com outros fármacos. Uma composição de KLK1 descrita neste documento pode ser utilizada para tratar um doente com diabetes tal como diabetes de tipo 1 ou 2 diabetes de tipo 2, podendo administrar-se ao sujeito uma composição de KLK e um fármaco conhecido para a diabetes, conhecido na técnica como sendo útil no tratamento ou na prevenção da resistência à insulina e da diabetes. Incluem-se nos exemplos de fármacos para a diabetes, por exemplo, um antioxidante (tal como a vitamina E, a vitamina C, uma isoflavona, zinco, selénio, ebselen, ou um carotenóide); uma insulina ou um análogo de insulina (tal como insulina regular, insulina lente, insulina semilente, insulina ultralente, detemir, glargina, degludec, NPH ou Humalog); um antagonista de receptor α-adrenérgico (tal como prazosina, doxazocina, fenoxibenzamina, terazosina, fentolamina, rauvolescina, iohimbina, tolazolina, tamsulosina, ou terazosina); um antagonista de receptor β-adrenérgico (tal como acebutolol, atenolol, betaxolol, bisoprolol, carteolol, esmolol, metoprolol, nadolol, penbutolol, pindolol, propanolol, timolol, cloridrato de dobutamina, alprenolol, bunolol, bupranolol, carazolol, epanolol, moloprolol, oxprenolol, pamatolol, talinolol, tiprenolol, tolamolol, ou toliprolol); um antagonista de receptor adrenérgico não selectivo (tal como carvedilol ou labetolol); uma sulfonilureia da primeira geração (tal como tolazamida, tolubutamida, clorpropamida, acetohexamida); uma sulfonilureia de segunda geração (tal como gliburido, glipizido, e glimepirido) ; um agente biguanido (tal como a metformina); um derivado de ácido benzoico (tal como replaglinido); um inibidor de α-glucosidase (tal como acarbose e miglitol); uma tiazolidinadiona (tal como rosiglitazona, pioglitazona, ou troglitazono) ; um inibidor de pfhosfodiesterase (tal como anagrelido, tadalafil, dipiridamole, difilina, vardenafil, cilostazol, milrinona, teofilina, ou cafeína); um antagonista de colineresterase (tal como donepezilo, tacrine, edrofónio, demecário, piridostigmina, zanapezilo, fosfolina, metrifonato, neostigmina, ou galatamina) ; um composto que aumente a glutationa (tal como N-acetilcisteína, um éster de cisteína, L-2-oxotiazolidina-4-carboxolato (OTC), gama glutamilcisteína e o seu éster etílico, éster etílico de glutationa, éster isopropílico de glutationa, ácido lipóico, cisteína, metionina, ou S-adenosilmetionina) ; ou incretina ou miméticos de incretina (tais como GLP-1, GLP-2, análogos peptídicos tais como glucagona, tais como DAC:GLP-1(CJC-1131), Liraglutido, ZP10, BIM51077, LY315902, LY307161 (SR), e exenatido). Em algumas concretizações, as composições de hKLKl são administradas a um sujeito com insulina ou um mimético de incretina. São descritos métodos para tratar um sujeito que necessite do tratamento, compreendendo administrar-se ao sujeito uma quantidade eficaz de uma composição tal como se descreve neste documento. Em algumas concretizações, o sujeito tem diabetes de tipo 1 estabelecida (T1D) ou diabetes de tipo 2 estabelecida (T2D) . Em algumas concretizações, o sujeito está na fase de lua de mel, tendo sido recente o inicio ou o diagnóstico de diabetes de tipo 1 T1D. A lua de mel, ou fase de remissão, refere-se ao período após o diagnóstico inicial em que as células beta remanescente produtoras de insulina funcionam bem. Durante esta lua de mel, é mais fácil controlar os açúcares no sangue, com menos alterações bruscas, menor risco de hipoglicémia, e menores valores médios de açúcar no sangue. 0 período de luz de mel em doentes com diabetes do tipo 1 é caracterizado pela função mantida das células β. Em algumas concretizações, o sujeito na fase da lua de mel ou após início recente de T1D tem cerca de 10-20 % das suas células beta pancreáticas, em comparação com um controlo saudável, produzindo insulina. Em alguns casos, o sujeito não tem 1 diabetes de tipo 1 (T1D) mas está em risco de desenvolver T1D. Em algumas concretizações, o sujeito tem diabetes autoimune latente dos adultos (LADA). A diabetes de tipo 2 (T2D), tal como se utiliza neste documento, é uma doença caracterizada por teores acima do normal de glucose no sangue. A T2D pode ser provocada por produção insuficiente de insulina no sujeito, ou por o sujeito ser resistente à acção da insulina (resistente à insulina). A administração das composiçoes descritas neste documento a u sujeito com T2D pode ajudar a moderar os teores de glucose no sangue.

Em algumas concretizações, uma quantidade eficaz do ponto de vista terapêutico de uma composição de KLK1 inclui uma quantidade que diminui a glucose em jejum, aumenta a tolerância à glucose, ou outro indicador, num sujeito com diabetes. Em algumas concretizações, uma dose eficaz do ponto de vista terapêutico é a quantidade de composição de glicoformas de KLK1 que trata ou que atrasa o inicio de diabetes do tipo I sem efeitos colaterais adversos sobre a tensão sanguínea nem a pulsação.

Em algumas concretizações, o sujeito está num estado isquémico. Incluem-se nos exemplos não limitativos a isquémia cardíaca (isquémia do miocárdio), a colite isquémica, a isquémia cerebral (apoplexia isquémica), a isquémia de um membro, e a isquémia cutânea. Estes estados de doença e outros relacionados podem ser diagnosticados por técnicas conhecidas que são rotineiras.

As composições da descrição presente podem ser administradas por qualquer meio adequado incluindo, mas não se limitando a, por exemplo, a via oral, rectal, nasal, tópica (incluindo, por exemplo, transdérmica, com aerossol, bucal e sublingual), vaginal, parenteral (incluindo, por exemplo, subcutânea, intramuscular, endovenosa, intradérmica, intravesical, intraperitoneal, intravitreal, intraocular, ou intracerebral, intraespinal). Ocorrerá necessariamente uma variação da dosagem dependendo do estado do sujeito que se estiver a tratar. A pessoa responsável pela administração, terá que, de qualquer modo, determinar a dose apropriada para o sujeito individual. Além disto, para administração a humanos, as preparações devem cumprir os critérios de esterilidade, pirogenicidade, e padrões de segurança e de pureza em geral, consoante é obrigatório por parte da FDA. Esta preparação pode ser isenta de pirogénicos.

Dispositivos. A invenção presente também inclui dispositivos que contenham uma composição descrita neste documento, incluindo dispositivos adequados para a entrega subcutânea. Em algumas concretizações, o dispositivo é uma seringa. Em algumas concretizações, a seringa está ligada a uma montagem de uma agulha hipodérmica, opcionalmente compreendendo uma tampa protectora em torno da montagem da agulha. Em algumas concretizações, a agulha pode ter entre cerca de ^ polegada e cerca de 5/8 de polegada de comprimento, e tem um calibre de cerca de 25 a cerca de 31. Determinadas concretizações incluem, portanto, dispositivos com uma montagem de uma agulha a eles ligada ou ligável, e que seja adequada para administração subcutânea, compreendendo uma composição baseada numa mistura de glicoformas de KLK1 descrita neste documento. Por exemplo, determinados dispositivos incluem um frasco ou uma seringa, opcionalmente em que o frasco ou a seringa seja ligável a, ou esteja ligado a, uma montagem com um agulha hipodérmica. Também se incluem frascos com uma rolha de borracha, na qual se pode inserir uma agulha/seringa no frasco através da rolha em borracha, para se retirar a composição baseada em KLK1 para administração subcutânea.

Em aspectos específicos, o dispositivo é uma seringa que se encontra ligada ou é ligável a uma agulha hipodérmica, e que é embalada com uma ou mais coberturas de protecção e/ou permanentes em torno da agulha ou da montagem da agulha. Por exemplo, uma primeira cobertura de protecção (que é retirada durante a administração) pode proteger um utilizador ou outra pessoa em relação à agulha antes da administração, e uma segunda cobertura de protecção pode ser colocada (isto é, encaixada) no seu lugar para se descartar o dispositivo em segurança depois da sua utilização.

Em determinados aspectos, um dispositivo, opcionalmente um dispositivo descartável, compreende uma dose individual de uma KLK1 com pelo menos cerca de 25 mg, ou entre cerca de 2 e cerca de 500 mg. Em algumas concretizações, o dispositivo inclui uma dose de pelo menos cerca de 0,02 a cerca de 5,0 mg/kg, pelo menos cerca de 0,02 a cerca de 10 mg/kg. Em algumas concretizações, o dispositivo compreende uma dose de pelo menos cerca de 0,02, cerca de 0,03, cerca de 0,04, cerca de 0,05, cerca de 0,06, cerca de 0,07, cerca de 0,08, cerca de 0,09, cerca de 0,1, cerca de 0,2, cerca de 0,3, cerca de 0,4, cerca de 0,5, cerca de 0,6, cerca de 0,7, cerca de 0,8, cerca de 0,9, cerca de 1,0, cerca de 1,1, cerca de 1,2, cerca de 1,3, cerca de 1,4, cerca de 1,5, cerca de 1,6, cerca de 1,7, cerca de 1,8, cerca de 1,9, cerca de 2,0, cerca de 2,1,about 2,2, cerca de 2,3, cerca de 2,4, cerca de 2,5, cerca de 2,6, cerca de 2,7, cerca de 2,8, cerca de 2,9, cerca de 3,0, cerca de 3,1, cerca de 3,2, cerca de 3,3, cerca de 3,4, cerca de 3,5, cerca de 3,6, cerca de 3,7, cerca de 3,8, cerca de 3,9, cerca de 4,0, cerca de 4,1, cerca de 4,2, cerca de 4,3, cerca de 4,4, cerca de 4,5, cerca de 4,6, cerca de 4,7, cerca de 4,8, cerca de 4,9, ou cerca de 5,0 mg/kg.

Em determinados aspectos, a composição de KLK1 pode ser embalada de modo a permitir a sua administração por parte do doente ou ao doente, num ambiente da residência e uma base diária, diversas vezes por semana, semanalmente, ou com menor frequência. Uma composição de KLK1 pode ser formulada num frasco multi-dose ou numa seringa multi-dose/multiutilização, semelhante a formulações de insulina ou de hormona de crescimento humana. Num frasco multi-dose vial, um frasco pode conter uma quantidade suficiente para pelo menos 2 administrações (por exemplo, 50 mg, ou na gama de cerca de 5 a 1.000 mg), e utilizam-se uma agulha e uma seringa para retirar a quantidade necessária de KLK1 do frasco e para a injectar no doente. Uma seringa multi-dose ou de multiutilização contém uma quantidade de KLK1 suficiente para pelo menos 2 administrações (por exemplo, 50 mg, o entre cerca de 5 e 1.000 mg), e o volume que se pode injectar pode ser determinado pelo doente. A seringa multi-dose pode também conter um cartucho substituível que se pode carregar na seringa que contém quantidades adicionais de composição de KLK1.

Para se determinar se uma dose de uma mistura de glicoformas de KLK1 com uma razão definida é eficaz para tratar um doente, quer em termos da quantidade (número de unidades administradas a um doente) de glicoformas de KLKl administradas, quer da frequência da administração, podem quantificar-se diversos marcadores. Os marcadores que se seguem são descritos como exemplos no tratamento de doentes com T1D, e não se pretende que constituam uma lista exaustiva. Uma dose eficaz de glicoformas de KLKl pode aumentar os números de células T reguladoras no baço, especificamente as células CD4+/CD25+/FoxP3+ no baço de um sujeito com T1D. Outro ponto terminal cuja dose eficaz há que determinar é uma melhoria aquando do teste de estenose hiperinsulinémica-euglicémica, tal como observado e descrito adiante neste documento. Outro ponto terminal cuja dose eficaz há que determinar é uma diminuição da insulite, que se mede em biópsias pancreáticas, ou recorrendo a outros processos não invasivos em seres humanos. Tal como pode ser evidente, quando se tratam doenças diferentes da T1D, podem quantificar-se outros marcadores para se determinar se uma dose de uma glicoforma de KLKl ou de uma mistura destas é eficaz para tratar a doença.

Para o tratamento de sujeitos com T2D, a composição de mistura de glicoformas de KLKl é administrada ao sujeito e medem-se parâmetros tais como uma diminuição da hemoglobina glicada (HbAlc) nos teores de glucose em jejum. Outros parâmetros também podem ser medidos para averiguar se a dose de misturas de glicoformas de rhKLKl é eficaz para tratar T2D.

Com base nos resultados dos marcadores que se estão a medir, a quantidade da dosagem de glicoforma de KLK1 ou das suas misturas pode ser aumentada ou diminuída, apenas a título de exemplo, de cerca de l,lx, l,2x, l,3x, l,4x, l,5x, l,6x, l,7x, l,8x, 1,9x, 2x, 2,5x, 3x, 3,5x, 4x, 4,5x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, lOx, 15x, 20x ou mais, em relação à dosagem anterior. A frequência de dosagem pode ser aumentada ou diminuída, meramente a título de ilustração, para cerca de 1, 2, 3, 4, 5 ou mais dosagens ao dia, e/ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais dosagens por semana, em relação ao horário de dosagem anterior. Tal como se notou acima, podendo aumentar-se ou diminuir-se a quantidade da dosagem em separado ou em combinação com a frequência de dosagem, e vice-versa, opcionalmente até se atingir uma gama de um ou mais biomarcadores ou outros indicadores do tratamento.

Uma composição da invenção presente pode ser isenta de endotoxinas ou substancialmente isenta de endotoxinas. Tal como se utiliza neste documento, o termo "isento de endotoxinas" ou "substancialmente isento de endotoxinas" diz respeito em geral a composições, solventes, dispositivos, e/ou recipientes que contêm quando muito quantidades vestigiais (por exemplo, quantidades que não denotem efeitos clínicos fisiológicos adversos para um sujeito) de endotoxina, e preferivelmente quantidades indetectáveis de endotoxina. As endotoxinas são toxinas associadas a determinadas bactérias, tipicamente bactérias Gram-negativas, embora se possam encontrar endotoxinas em bactérias Gram-positivas, tais como Listeria monocytogenes. As endotoxinas mais prevalentes são lipopolissacáridos (LPS) ou lipo-oligo-sacáridos (LOS) que se encontram na membrana exterior de diversas bactérias Gram-negativas, e que representam um aspecto patogénico central na capacidade que estas bactérias denotam de provocarem doenças. Pequenas quantidades de endotoxinas em seres humanos podem originar febre, uma diminuição da tensão sanguínea, e uma activação da inflamação e da coagulação, entre outros efeitos fisiológicos adversos.

Portanto, numa produção farmacêutica, é amiúde desejável retirar a maior parte dos vestígios de endotoxina dos produtos farmacológicos e/ou dos contentores de fármacos, porque mesmo pequenas quantidades podem provocar efeitos adversos em seres humanos. Pode utilizar-se para este efeito um forno de despirogenação, uma vez que as temperaturas superiores a 300°C são tipicamente necessárias para quebrar a maior parte das endotoxinas. Por exemplo, com base no material de embalagem principal, tal como seringas ou frascos, a combinação de uma temperatura do vidro de 250°C com um período de tempo de permanência de 30 minutos é amiúde suficiente para se conseguir uma diminuição de 3 ordens de grandeza nos teores em endotoxinas. Outros métodos de remover endotoxinas são levados em conta, incluindo, por exemplo, métodos envolvendo cromatografia ou filtração, tal como descritos neste documento e conhecidos na técnica. Também se incluem métodos de produzir polipéptidos KLK1 em células eucarióticas e se isolarem esses polipéptidos delas, tais como células de mamíferos, para diminuir, ou mesmo eliminar, o risco de estarem presentes endotoxinas numa composição da invenção. São preferidos os métodos de produção de polipéptidos KLKl em células recombinantes cultivadas em meios quimicamente definidos, isentos de soro.

Podem detectar-se endotoxinas utilizando metodologias de rotina conhecidas na técnica. Por exemplo, o ensaio do Lisado de Amebócito Limulus, que recorre a sangue do caranguejo-ferradura, é um ensaio extremamente sensível para detectar a presença de endotoxinas. Neste teste, teores muito pequenos de LPS podem provocar uma coagulação detectável do lisado de limulus devido a uma potente cascata de enzimas que amplifica esta reacção. Também se podem quantificar as endotoxinas por ensaio de imunossorvente ligado a enzima (ELISA). Para ser substancialmente isento de endotoxinas, os teores em endotoxina podem ser inferiores a cerca de 0,001, 0,005, 0, 01, 0,02, 0,03, 0, 04, 0,05, 0, 06, 0, 08, 0, 09, 0, 1, 0,5, 1,0, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 EU/mL, ou EU/mg de proteína. Tipicamente, 1 ng de lipopolissacárido (LPS) corresponde a cerca de 1-10 EU.

Os termos "modulando" e "alterando" incluem "aumentando", "potenciando" ou "estimulando", bem como "diminuindo" ou "reduzindo", tipicamente de uma guantidade estatisticamente significativa ou fisiologicamente significativa, ou num tal grau, em relação a um controlo. Uma quantidade "aumentada", "estimulada" ou "potenciada" é tipicamente uma quantidade "estatisticamente significativa", e pode incluir um aumento que seja para 1, 1, 1,2, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 ou mais vezes (por exemplo 500 ou 1.000 vezes) (e incluindo todos os valores inteiros e decimais compreendidos, que sejam maiores do que 1, por exemplo, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, etc.) do que a quantidade ou o teor produzidos por uma composição de controlo, amostra ou sujeito em teste. Uma quantidade "diminuída" ou "reduzida" é tipicamente uma quantidade "estatisticamente significativa", e pode incluir diminuições de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, ou 100 % da quantidade ou do teor produzidos numa composição de controlo, amostra ou sujeito em teste. A título de um exemplo não limitativo, pode fazer-se a comparação entre a quantidade ou o teor de um parâmetro farmacocinético ou de uma resposta biológica/terapêutica produzida aquando da administração de uma mistura de isoformas triplamente:duplamente glicosiladas (ou glicoformas) de KLK1 (por exemplo, a cerca de 55:45, cerca de 50:50, ou cerca de 45:55), em relação a se administrar uma mistura diferente de tais glicoformas (por exemplo, a cerca de 60:40, cerca de 40:60, ~90:10, ~10:90, ~95:5, ou ~5:95). A titulo de outro exemplo não limitativo, a comparação pode ser feita entre uma quantidade ou um teor de um parâmetro farmacocinético ou de uma resposta biológica/terapêutica produzida aquando da administração de uma composição substancialmente pura de uma isoforma triplamente glicosilada (ou glicoforma) de rhKLKl (por exemplo, a cerca de 90 % ou a cerca de 95 % triplamente glicosilada) em relação à administração de uma glicoforma diferente (por exemplo, a cerca de 90 % ou cerca de 95 % duplamente glicosilada) , ou de uma mistura de glicoformas (por exemplo, a cerca de 60:40 ou a cerca de 40 : 60) . São descritos neste documento outros exemplos de comparações e de quantidades "estatisticamente significativos". Um resultado é tipicamente referido como sendo "estatisticamente significativo" quando é improvável que tenha ocorrido por acaso. O nivel de significância de um teste ou de um resultado relaciona-se tradicionalmente com a quantidade de dados necessária para se aceitar que um acontecimento provavelmente não ocorreu por acaso. Em determinados casos, a significância estatística pode ser definida como a probabilidade de se tomar uma decisão rejeitando a hipótese nula quando esta hipótese nula for de facto a verdade (uma decisão conhecida como um erro de Tipo I, ou uma "determinação positiva falsa"). Esta decisão é frequentemente feita com base no valor de p: caso o valor de p seja inferior ao nível de significância, rejeita-se a hipótese nula. Quanto menor o valor de p, mais significativo o resultado. Também se podem utilizar factores Bayesianos para determinar a significância estatística (veja-se Goodman, Ann. Intern. Med. 130: 1005-13, 1999).

O termo "solubilidade" refere-se à propriedade de um polipéptido rhKLKl proporcionado neste documento se dissolver num solvente líquido para formar uma solução homogénea. A solubilidade é tipicamente expressa como uma concentração, quer em massa de soluto por unidade de volume do solvente (g de soluto por kg de solvente, g por dL (100 mL), mg/mL, etc.), molaridade, molalidade, fracção molar ou outras descrições semelhantes da concentração. 0 valor máximo de soluto que em equilíbrio se consegue dissolver numa quantidade de solvente é a solubilidade desse soluto nesse solvente, nas condições especificadas, incluindo temperatura, pressão, pH, e a natureza do solvente. Em determinadas concretizações, mede-se a solubilidade ao pH fisiológico, ou a outro valor de pH, por exemplo a pH 6,0, pH 7,0, pH 7,4, pH 8,0 ou pH 9,0. In certain embodiments, solubility is measured in water or a physiological buffer such as PBS or NaCl (with or without NaP) . In specific embodiments, solubility is measured at relatively lower pH (por exemplo, pH 6.0) and relatively higher salt (por exemplo, 500mM NaCl and lOmM NaP) . Em determinadas concentrações, mede-se a solubilidade num fluido biológico (solvente) tal como sangue ou soro. Em determinadas concretizações, a temperatura pode ser próxima da temperatura ambiente (por exemplo, cerca de 20, cerca de 21, cerca de 22, cerca de 23, cerca de 24, ou cerca de 25°C) ou próxima da temperatura do corpo (37°C). Em determinadas concretizações, um polipéptido KLK1 tem uma solubilidade de pelo menos cerca de 1, pelo menos cerca de 2, pelo menos cerca de 3, pelo menos cerca de 4, pelo menos cerca de 5, pelo menos cerca de 6, pelo menos cerca de 7, pelo menos cerca de 8, pelo menos cerca de 9, pelo menos cerca de 10, pelo menos cerca de 11, pelo menos cerca de 12, pelo menos cerca de 13, pelo menos cerca de 14, pelo menos cerca de 15, pelo menos cerca de 16, pelo menos cerca de 17, pelo menos cerca de 18, pelo menos cerca de 19, pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca de 25, pelo menos cerca de 30, pelo menos cerca de 35, pelo menos cerca de 40, pelo menos cerca de 45, pelo menos cerca de 50, or pelo menos cerca de 60 mg/mL à temperatura ambiente ou a 37°C. "Substancialmente" ou "essencialmente" significa quase totalmente ou completamente, por exemplo, a 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais, de uma determinada quantidade. "Tratamento" ou "tratando", tal como se utilizam neste documento, incluem qualquer efeito pretendido sobre os sintomas ou a patologia de uma doença ou de um estado, e podem incluir mesmo alterações ou melhorias muito pequenas num ou em diversos marcadores da doença ou do estado que se esteja a tratar. "Tratamento" ou "tratando" não indica necessariamente uma eliminação completa ou uma cura, da doença ou do estado, ou dos sintomas associados a estes. 0 sujeito que recebe este tratamento é qualquer sujeito que dele necessite. Os exemplos de marcadores de melhorias cínicas serão aparentes às pessoas entendidas na técnica.

Um "sujeito", tal como se utiliza neste documento, inclui qualquer animal que exiba um sintoma, ou que esteja em risco de exibir um sintoma, que se possa tratar com um polipéptido KLK1 ou com uma composição da invenção presente. Os sujeitos adequados (doentes) incluem animais de laboratório (tais como murqanho, rato, coelho ou cobaia), animais em produção, e animais domésticos ou de companhia (tal como qato ou cão). Estão incluídos os primatas não humanos e, preferivelmente, doentes humanos. 0 termo "isolado" designa material que seja substancialmente ou essencialmente isento de componentes que normalmente o acompanham no seu estado nativo. Por exemplo, um "péptido isolado" ou um "polipéptido isolado" e outros semelhantes, tal como se utiliza neste documento, inclui o isolamento e/ou a purificação in vitro de uma molécula de péptido ou de polipéptido a partir do seu ambiente celular natural, e da sua associação com outras componentes da célula; isto é, não se encontra significativamente associado às substâncias que o acompanham in vivo tais como proteínas da célula hospedeira ou ácidos nucleicos. A invenção é ilustrada pelos exemplos seguintes. Deve entender-se que os exemplos, os materiais, as quantidades, e os processos específicos devem ser interpretados de um modo abrangente consoante o âmbito da invenção, tal como este se define neste documento.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Um cADN codificando para KLK1 pré-pró-humana, com a sequência de 262 resíduos de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 2 adquirida à OriGene™ (Rockville, MD, EUA) . 0 cADN da KLK1 (N2 de Catálogo SC122623) é um cADN humano clonado com quadro de leitura aberto, clonado no local de multiclonagem do vector pCMV6-XL5 da OriGene, entre um promotor de citomegalovírus (CMV) para controlar a transcrição do cADN codificando para a KLK1 pré-pró-humana e um sinal de poliadenilação. Este clone de KLK1 foi sequenciado e, utilizando um programa de tradução, traduzido para revelar a SEQ ID NO:2. Esta sequência diferia em 2 resíduos de aminoácidos da sequência de KLK1 humana no GenBank sob a Refa. N2 NP_002248.1 (SEQ ID N0:1). Tal como se representa na SEQ ID N0:2, polimorfismos de um único nucleótido (SNP) resultaram na modificação de E para Q no resíduo de aminoácido 145 de 262, e na modificação de A para V na posição de aminoácido 188 de 262. Todas as experiências subsequentes foram levadas a cabo sobre KLK1 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2.

Transfectou-se o cADN de KLK1 humana no pCMV6-XL5 para uma linha de células CHO utilizando o Sistema de Expressão em CHO Freestyle™ MAX (Invitrogen, Carlsbad, CA N2 de Catálogo K9000-20). 0 estojo permitia uma transfecção transiente de vectores em células de Ovário de Hamster Chinês (CHO), o crescimento das células CHO transfectadas em culturas de 10 litros, e a expressão proteica em meio definido, isento de soro. Cultivam-se as células CHO em suspensão e levou-se a cabo a transfecção transiente com o vector KLK1 utilizando o reagente de lipossoma fornecido no estojo, tal como as instruções. A expressão e a purificação da KLK1 recombinante humana foram levadas a cabo essencialmente tal como descrito por Hsieng S. Lu, et al., ('Purification and Characterization of Human Tissue Prokallikrein and Kallikrein Isoforms Expressed in Chinese Hamster Ovary Cells', Protein Expression and Purification (1996), 8, 227-237). Em suma, após a transfecção e concedendo tempo suficiente para a expressão de KLK1 recombinante humana, recolheu-se o sobrenadante da cultura de células CHO com 10 litros por centrifugação e em seguida por filtração através de membranas com 0,2 micron. Concentrou-se então osobrenadante clarificado, fez-se reagir com tripsina para activar a KLK1 recombinante humana. Uma vez que a transfecção transiente tinha sido levada a cabo com o cADN codificando para KLK1 pré-pró-humana, a KLK1 recombinante humana segregada das células CHO estava sob a forma inactiva de pró-proteína. Portanto, o ensaio de actividade de KLK1 no sobrenadante da cultura de células envolve um passo de activação com uma digestão por tripsina. A activação é levada a cabo com tripsina a 10 nM de concentração final durante 2 horas à temperatura ambiente, e a tripsina é inactivada com Inibidor de Tripsina de Soja.

Depois da activação da KLK1 recombinante humana, adicionou-se sulfato de amónio ao sobrenadante, e carregou-se numa coluna de octil sefarose®. Purificou-se o conjunto de KLK1 activa proveniente da eluição da coluna de octil sefarose numa coluna de afinidade de benzamidina. Em seguida, o conjunto das fracções activas provenientes da coluna de benzamidina foram permutadas com tampão até uma equilibração com DEAE e polidas numa coluna de DEAE. Juntaram-se as fracções de KLK1 activas da DEAE e permutaram-se com tampão a tampão 1 X PBS. A substância farmacológica final de KLK1 a granel foi dividida em alíquotas que se armazenaram a -20°C.

Exemplo 2 A KLK1 purificada recombinante humana tinha um conteúdo de cerca de 30 % de hidratos de carbono com base na massa molecular estimada por electroforese sobre gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio (SDS) (veja-se a

Figura 1). A KLK1 de células CHO aparece como uma banda com uma massa molecular aparente de ~40 a 49 kDa; uma tal banda larga pode provir de diferentes isoformas glicosiladas de KLK1 segregadas das células CHO. Para a KLK1 expressa em células 293, duas bandas apareceram no gel de SDS-PAGE a cerca de 40 kDa e de 45 kDa. A identidade das bandas como KLK1 humana foi confirmada por análise de transferência Western utilizando anticorpo policlonal de murganho criado contra uma proteína KLK1 humana de comprimento inteiro (N2 de Catálogo: H00003816-B01P, anticorpo policlonal purificado MaxPab de murganho contra KLK1 (B01P), Abnova Corporation, Walnut, CA, EUA) (veja-se a Figura 2) . A análise por transferência Western confirma os resultados do gel de SDS-PAGE, de que a KLK1 recombinante humana de células CHO aparece como uma banda com uma massa molecular aparente de ~40 a 49 kDa, e a KLK1 expressa em células 293 resolve-se como duas bandas a cerca de 40 kDa e 45 kDa. A pureza da KLK1 de CHO foi estimada visualmente a partir do gel de SDS-PAGE como sendo >90 % com uma concentração final de 1,19 mg de proteína KLKl/mL. A partir do gel de SDS-PAGE, aparece que a KLK1 produzida de CHO também contém impurezas como massa molecular mais elevada (~70-95 kDa) que não são visíveis na preparação a partir de 293.

Utilizou-se um ensaio de actividade enzimática para testar a actividade da KLK1 recombinante humana em sobrenadantes de cultura de células, em fracções cromatográficas durante a purificação e no produto final purificado. Um substrato fluorogénico adeguado para a medição de actividade de calicreina tecidular é a D-val-leu-arg-7-amido-4-trifluorometilcoumarina (D-VLR-AFC, FW 597.6) (Sigma, N2 de Catálogo V2888 ou Ana Spec. Inc. N2 de Catálogo 24137) . Quando se hidrolisa D-VLR-AFC, a AFC livre produzida na reacção pode ser guantificada por detecção fluorométrica (excitação a 400 nm, emissão a 505 nm) ou por detecção espectrofotométrica a 380 nm (coeficiente de extinção = 12.600 a pH 7,2). A medição da actividade de KLK1 recombinante humana (Unidades/mL) produzida nas células CHO foi determinada comparando a actividade relativa da KLK1 recombinante com a de padrão de quininogenase porcina adquirida do National Institute for Biological Standards and Control (Produto NIBSC N2 78/543). Para este padrão, a potência atribuída é de 22,5 unidades internacionais (IU) por ampola de 20 pg de quininogenase pancreática porcina.

Exemplo 3

Levaram-se a cabo experiências para determinar se a coluna de octil sefarose era capaz de resolver as formas com massa molecular alta e baixa da KLK1 recombinante humana, e para quantificar a actividade relativa das duas formas isoladas.

Cerca de 45 mg (20 mL) de KLK1 recombinante humana foi submetida à coluna de octil sefarose tal como se pormenoriza adiante (veja-se a Tabela 1):

Tabela 1. Protocolo para a Coluna de Octil Sefarose

0 cromatograma da Figura 3A (ampliado na Figura 3B) e a análise por SDS-PAGE da Figura 4 ilustram gue a glicoforma com baixa massa molecular de KLK1 foi isolada da glicoforma com alta massa molecular utilizando a coluna de Octil Sefarose. Todas as fracções foram filtradas para esterilizar e armazenadas a 2-8°C até à análise.

Identificaram-se duas fracções para análise adicional, a fracção Bll de glicoforma com massa molecular alta (triplamente glicosilada) de rhKLKl (Figura 4, pista 6) e a fracção B5 de glicoforma com baixa massa molecular (duplamente glicosilada) de rhKLKl (Figura 4, pista 8) . Analisaram-se estas duas fracções por absorvância, actividade e cromatografia liquida de elevado desempenho em fase reversa (RP-HPLC). Dividiram-se estas fracções em aliquotas de 1 mL, rotularam-se e congelaram-se. Mostram-se adiante os resultados dos testes. A quantificação por RP-HPLC correlaciona-se muito bem com a absorvância a A280 (utilizando um coeficiente de extinção de 1,76) e mostra as duas glicoformas de rhKLKl (veja-se a Figura 5) , tal como observadas através dos resultados de cromatografia sobre Octil Sefarose. Em particular, a análise por RP-HPLC da KLK1 recombinante humana antes da separação das glicoformas aparece como dois picos (Figura 5A) . Após a separação das glicoformas, a análise por RP-HPLC da fracção Bll (glicoforma de KLK1 com massa molecular elevada) aparece como uma única banda (Figura 5B) , e a fracção B5 (glicoforma de KLK1 com massa molecular baixa) aparece como uma banda principal (Figura 5C) , embora seja evidente alguma contaminação da banda de KLK1 com massa molecular baixa.

Geraram-se cinco linhas de células produzindo diferentes razões entre as glicoformas com alta e baixa massa molecular de rhKLKl. A Figura 5A representa uma mistura da rhKLKl purificada com as glicoformas com massa molecular baixa e alta de KLK1 a uma razão aproximada de 55:45, respectivamente, e em particular com 52 % e 47,5 % respectivamente para as glicoformas de KLK1 com massa molecular alta e baixa, e apresentando 0,5 % sob a forma de agregados. Purificou-se também a rhKLKl a partir de outra linha de células recombinantes CHO que expressava as glicoformas de rhKLKl aproximadamente a uma razão de 50:50 (veja-se a Figura 6).

Actividade especifica de KLK1. A actividade específica (Unidades/mg) das glicoformas com massa molecular baixa, com massa molecular alta de rhKLKl, bem como a mistura a 50:50 de rhKLKl e KLK1 humana urinária, foram testadas por ensaios de actividade enzimática. Um substrato fluorogénico adequado para a medição da actividade da calicreina 1 tecidular é a D-val-leu-arg-7-amido-4-trifluorometilcoumarina (D-VLR-AFC, FW 597,6) (Sigma, N2 de Catálogo V2888 ou Ana Spec. Inc. N2 de Catálogo 24137) . Quando a D-VLR-AFC é hidrolisada, a AFC livre produzida na reacção pode ser quantificada por detecção fluorométrica (excitação a 400 nm, emissão a 505 nm de acordo com o catálogo, mas são possíveis excitações e emissões alternativas, incluindo excitação a 360 nm, emissão a 460 nm) ou por detecção espectrofotométrica a 380 nm (coeficiente de extinção = 12.600 a pH 7,2). A medição da actividade específica (Unidades/mg) para as glicoformas de KLK1 e para misturas foi determinada comparando a actividade relativa de KLK1 em relação ao padrão de quininogenase porcina adquirido do National Institute for Biological Standards and Control (Produto NIBSC N2 78/543). Para este padrão, a potência atribuída é de 22,5 unidades internacionais (IU) por ampola de 20 pg de quininogenase pancreática porcina. Todos os doseamentos em ratos foram baseados em unidades de KLK1. A KLK1 urinária humana (HU) foi adquirida à Lee BioSciences (N2 de Catálogo: 314-15: CAS: 9001-01-8 : Lote n2: L23165). Sabe-se que a HU KLK1 compreende uma razão de glicoformas 60:40 (massa molecular alta em relação a baixa). Consoante a especificação do produto por parte do fabricante, a HU KLK1 é >99 % pura e tem uma actividade específica de 9,9 U/mg. No entanto, esta determinação da actividade específica com um ensaio diferente e em condições diferentes em relação às do ensaio D-VLR-AFC descrito acima. Portanto, testou-se a HU KLK1 pelo ensaio D-VLR-AFC em conjunto com as glicoformas com baixa e alta massa molecular de rhKLKl e com a mistura a 50:50 de rhKLKl. Os resultados dos cálculos de actividade específica e as concentrações proteicas tal como determinadas por RP-HPLC ou A280 nm estão resumidos na Tabela 2 adiante.

Tabela 2. Actividade específica

A pureza de rhKLKl (mistura a 50:50, fracção B5 e Bll) apresentava relativamente pouca endotoxina em relação a proteína total (< 1 EU/mg de proteína) , pequena proteína da célula hospedeira em relação a proteína total (<100 ng/mg de proteína), pouco ADN da célula hospedeira em relação à proteína total (<10 pg/mg de proteína), e aparecia sobretudo como um monómero (>95 % de pico único por SEC HPLC) . Para a HU KLK1 não se quantificaram nem a endotoxina nem o grau de agregação. No entanto, um teste qualitativo sugeria que a HU KLK1 continha teores de endotoxina > 1 EU/mg de proteína, mais elevados que para a mistura de rkKLKl a 50:50, fracção B5 e Bll, e um maior grau de agregação (>5 %) do que a rhKLKl (mistura a 50:50, fracção B5 e Bll), apresentando esta última teores de agregação <5 %.

Estenose hiperinsulinémica-euglicémica. A actividade in vivo, e especificamente a capacidade de estimular a absorção de glucose pelos tecidos, das duas glicoformas isoladas de rhKLKl, da mistura a 50:50 de glicoformas e da HU KLK1, foram determinadas por um estudo de estenose com pinça hiperinsulinémica-euglicémica. A piça hiperinsulinémica-euglicémica é o padrão de ouro para se investigar a utilização de glucose, incluindo a quantificação da resistência à insulina porque mede a quantidade de glucose necessária para compensar um teor aumentado de insulina sem provocar hipoglicémia. Detectando-se com a pinça um aumento da velocidade de infusão de glucose também pode indicar uma maior sensibilidade à insulina, ou um aumento da absorção de glucose pelos músculos, adipócitos, ou outros tecidos do corpo.

Levou-se a cabo um ensaio de 120 minutos com a pinça hiperinsulinémica-euglicémica em ratos Sprague Dawley jejuados durante 6 horas, com uma infusão continua de insulina humana (Humulin, Lilly) a uma taxa constante de 4 mU/kg/minuto. Em simultâneo, infundiu-se uma solução a 20 % de glucose a uma taxa variável ajustando-se a velocidade a cada 10 minutos para se manter o teor pretendido em glucose no sangue. Infundiram-se tanto a insulina como a glucose através da veia jugular direita cateterizada e monitorizaram-se os teores em glucose no sangue a partir da artéria carótida esquerda cateterizada.

Utilizaram-se doze conjuntos de três ratos cada um para este procedimento com a pinça. Cada conjunto de quatro ratos sofreu uma injecção subcutânea quer de rhKLKl, Fracção 11 (glicoforma com alta massa molecular de KLK1), Fracção 5 (glicoforma com baixa massa molecular de KLK1), e KLK1 urinária humana a 1,0 U, 0,33 U e 0,1 U/rato (veja-se a Tabela 3 adiante) . Dissolveu-se a KLKl humana em PBS e dosearam-se os ratos por via subcutânea, 30 minutos antes do procedimento com a pinça. A Tabela 3 resume o doseamento dos ratos com as diversas formas de KLK1 humana.

Tabela 3

Os teores em glucose no sangue arterial foram monitorizados antes do doseamento a t=-120, -90, -30, -15 e 0 minutos e depois a cada 10 minutos durante 120 minutos (t=120), utilizando o medidor de Glucose (Accu Check, Roche Diagnostics). Continuaram a utilizar-se as pinças durante 120 minutos (t=120), altura em que a experiência terminava. O efeito da administração de glicoforma KLK1 sobre a taxa de infusão de glucose necessária para manter o teor de glucose no sangue igual foi registado. A Figura 7 é um gráfico da taxa de infusão de glucose (GIR) para ratos tratados com 1 U/rato de rhKLKl (mistura a 50:50), HU KLK1, ou a glicoforma com baixa ou alta massa molecular de rhKLKl. Este gráfico é típico dos gráficos GIR na medida em que o GIR aumenta desde o instante zero tendo o pico a cerca de 40 a 60 minutos, e depois existe uma ligeira diminuição de GIR. Levou-se a cabo uma análise adicional da taxa de infusão de glucose (GIR) para se calcular a área sob a curva (AUC), uma medida do total de glucose infundida (mg/kg/minuto-minuto) durante o estudo com a pinça. A velocidade de infusão de glucose necessária para manter teores de glucose iguais no sangue era significativamente maior para os conjuntos tratados com

rhKLKl (glicoformas misturadas a 50:50) a 1 U/rato, do que nos animais tratados com a Fracção 11, a Fracção 5, ou com HU KLK1. Esta diferença é evidente quando se calculam os dados para o total da AUC da taxa de infusão de glucose (vejam-se a Figura 8 e a Tabela 4). Para ratos tratados com a fracção Bll, a AUC é 3996 +/- 98 mg/kg/minuto-minuto (Média + /- EPM) e para a fracção B5, a AUC é de 3551 +/-113 mg/kg/minuto·minuto. Esperava-se que a mistura a 50:50 de rhKLKl denotasse uma AUC intermédia entre as das glicoformas com baixa e coma alta massa molecular. Surpreendentemente, para a mistura a 50:50, a AUC era de 4547 +/- 69 mg/kg/minuto ·minuto. Esta AUC surpreendentemente elevada indica que a combinação da KLK1 com massa molecular alta e baixa tem um efeito aditivo ou mais, inesperado, de estimulação da absorção de glucose. Para a KLK1 urinária humana, uma vez que uma quantidade igual de rhKLKl e de HU KLK1 foi administrada aos ratos baseada na actividade in vitro (Unidades calculadas no ensaio D-VLR-AFC), era de esperar que o efeito sobre a GIR seria o mesmo. No entanto, a AUC de GIR para a KLK1 urinária humana era de 3444 +/- 227 mg/kg/minuto-minuto, que era significativamente inferior à de 4547 +/- 69 mg/kg/minuto-minuto calculada para rhKLKl.

Tabela 4. Absorção de Glucose

Tal como se mostra na Tabela 5 adiante, a mistura a 50:50 de rhKLKl estimulava consistentemente a absorção aumentada de glucose nos ratos comparada com a HU KLK1 tal como medida por uma AUC GIR aumentada. A uma dose de 0,33 U, a rhKLKl em mistura a 50:50 tinha uma AUC de 4127 + /- 78 mg/kg/minuto·minuto enquanto a HU KLK1 tinha 2969 +/-144 mg/kg/minuto-minuto, e a 0,1 U, a rhKLKl tinha 3612 +/-135 mg/kg/minuto-minuto, enquanto a HU KLK1 tinha 2503 +/- 266 mg/kg/minuto·minuto.

Tabela 5. Absorção de qlucose

Nestas experiências, administraram-se quantidades iguais de KLK1 em ratos, com base na actividade in vitro de KLK1 tal como medida no ensaio com protease. Uma dose única de KLK1 (isoforma duplamente glicosilada, isoforma triplamente glicosilada, mistura a 50:50, ou HU KLK1) foi administrada por via subcutânea 30 minutos antes da pinça. Porque as diversas preparações de KLK1 foram administradas por via subcutânea, a proteína devia ser administrada lentamente pela circulação relativamente à administração IV. Além disto, testaram-se os animais adentro dos 30 minutos após a administração dos polipéptidos KLK1. Deste modo, quaisquer diferenças de pK ou de vida média entre os polipéptidos KLK1 em circulação deveriam ser minimizados e qualquer efeito no GIR deveria resultar da actividade da KLK1 administrada. O tratamento de ratos com a glicoforma com massa molecular elevada de rhKLKl resultou numa utilização de glucose ligeiramente aumentada, tal como detectada por uma maior AUC GIR, comparada com a obtida para a glicoforma com baixa massa molecular de rhKLKl. Isto pode em parte ser atribuído a que a forma com massa molecular elevada apresenta uma vida média mais longa em circulação do que a glicoforma com massa molecular baixa. A glicoforma com massa molecular alta pode não ser eliminada pelos rins tão depressa. Tal como se descreveu acima, atento o intervalo de tempo curto nos testes (30 minutos após a administração) , o efeito pode não ser apenas devido à vida média da proteína KLK1 em circulação.

Em alternativa, a glicosilação adicional pode permitir à glicoforma de KLK1 com massa molecular alta ligar-se a determinados receptores no animal, que poderia originar alterações da utilização de glucose. Por exemplo, a glicoforma com massa molecular mais alta pode ser mais eficiente do que a glicoforma com massa molecular mais baixa na estimulação directa de um receptor, ou ligar-se a outra proteína (por exemplo serpina) mais eficientemente e o complexo afectar a utilização de glucose. A glicoforma com massa molecular mais alta pode também ligar-se a um receptor de um modo mais eficiente do que a glicoforma com a massa molecular mais baixa, e sequestrar a glicoforma de KLK1 para um microambiente em que a sua actividade enzimática actue para influenciar a utilização de glucose. A glicosilação adicional também pode permitir que a glicoforma de KLK1 com massa molecular alta seja mais activa num ambiente fisiológico tal como num animal, o que não se reflecte nos ensaios in vitro.

Surpreendentemente, a mistura a 50:50 das glicoformas de rhKLKl resultou numa maior AUC GIR comparada com a da glicoforma com massa molecular alta. O resultado esperado era de que a mistura das glicoformas a 50:50 tivesse uma actividade (tal como media pela AUC GIR) intermédia entre as das glicoformas de baixa e de alta massa molecular. Este efeito de sinergia na mistura a 50:50 é inesperado. De facto, a AUC GIR era significativamente maior para os ratos tratados com rhKLKl (mistura a 50:50) comparada com a HU KLK1 (mistura a 60:40) a todas as doses testadas (veja-se a Tabela 5).

Uma explicação possível, não limitativa da sinergia da mistura das glicoformas a 50:50 para os ratos é que as glicoformas com massa molecular alta e baixa actuem de modos ligeiramente diferentes (actividades enzimáticas ligeiramente diferentes, ou ligações ligeiramente diferentes a receptores) num meio fisiológico. Estas pequenas diferenças de actividades são complementares e, portanto, sinergísticas quando as glicoformas estão misturadas a 50:50.

Em alternativa, a KLK1 pode actuar por diversos mecanismos diferentes para influenciar a utilização da glucose, tais como a ligação a receptores e a actividade enzimática. As glicoformas com alta e baixa massa molecular podem actuar de um modo complementar em que uma das glicoformas tem uma actividade enzimática maior num meio fisiológico, enquanto a outra glicoforma tem uma afinidade de ligação maior. Em conjunto, estas diferenças resultam num efeito sinergístico num animal. Esta sinergia ou complementaridade não foi detectada à razão de 60:40 de KLK1 de alta e baixa massa molecular.

Conduziu-se um estudo num modelo animal de diabetes do tipo 2, especificamente com murganhos db/db com 11 semanas de idade, a que se administrou a mistura a 52:57,5 de rhKLKl descrita acima. Os murganhos db/db desenvolveram diabetes de tipo 2 como o provam os teores de glucose em jejum maiores do que 250 mg/dL. Separaram-se os murganhos em quatro conjuntos com dez murganhos por conjunto, e após um jejum de um dia para o outro (8 horas), administrou-se aos murganhos quer apenas tampão (controlo negativo), quer 2 Unidades, 0,8 Unidades ou ainda 0,04 Unidades por murganho da mistura de rhKLKl. Passados 90 minutos depois da administração de rhKLKl, testaram-se os teores de glucose no sangue dos murganhos. Nos animais do controlo negativo, os teores em glucose no sangue permaneciam elevados 220 +/- 16 mg/dL. Os animais que receberam 2 Unidades de rhKLKl apresentavam um decréscimo significativo dos teores em glucose no sangue, para 141 +/-9 mg/dL (p< 0,05) comparados com o controlo. Os animais que receberam 0,8 Unidades por murganho apesentavam um decréscimo menos forte, mas ainda significativo do teor em glucose no sangue, para 149 +/- 14 mg/dL (p< 0,05) comparados com o controlo. Não existia nenhuma diferença estatística dos teores em glucose no sangue de murganhos que receberam a menor dose de rhKLKl de 0,04 Unidades por murganho (212 +/- 23 mg/dL) comparados com o controlo. Portanto, o tratamento de murganhos diabéticos db/db com rhKLKl a uma razão de glicoformas de 52:47,5 resulta num decréscimo significativo da hiperglicémia.

Embora a invenção acima tenha sido descrita com algum pormenor por ilustração e exemplos com os objectivos de clareza da sua compreensão, será facilmente aparente a indivíduos com conhecimentos médios da técnica atentos os ensinamentos desta invenção que determinadas alterações e modificações podem ser feitas a ela sem que exista qualquer afastamento em relaçao ao âmbito das reivindicações apensas. A descrição pormenorizada apensa e os exemplos foram dados apenas para clareza da compreensão. Não se entendem quaisquer limitações desnecessárias desta descrição. A invenção não se limita aos pormenores exactos que se mostram e descrevem, porque as variações óbvias para os entendidos na técnica estarão incluídas adentro da invenção definida pelas reivindicações.

Listagem das Sequências Livres SEQ ID NO :1-2 - Sequências de aminoácidos da pré-pró-proteína calicreína tecidular humana

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Uma composição incluindo uma primeira forma madura e activa de um polipéptido calicreina 1 tecidular humana (KLK1) e uma segunda forma madura e activa de um polipéptido calicreina tecidular humana (KLK1), em que o primeiro polipéptido KLK1 apresente três glicanas ligadas por N aos seus resíduos 78, 84, e 141 tal como se define na SEQ ID N0:1 e o segundo polipéptido KLK1 apresente duas glicanas ligadas por N aos seus resíduos 78 e 84 mas não ao 141, tal como se define na SEQ ID N0:2; e em que o primeiro polipéptido KLK1 e o segundo polipéptido KLK1 estejam presentes na composição a uma razão de entre 45:55 e 55:45.
2. A composição da reivindicação 1, em que a razão entre o primeiro polipéptido KLK1 e o segundo polipéptido KLK1 na composição seja de 50:50.
3. A composição da reivindicação 1 ou da 2, em que o ou os referidos polipéptidos KLK1 compreendam os resíduos de aminoácidos 78-141 da SEQ ID NO:l ou os resíduos dos aminoácidos 78-141 da SEQ ID NO:2.
4. A composição de qualquer uma das reivindicações 1-3, em que os referidos polipéptidos KLK1 compreendam resíduos dos aminoácidos 25-262 da SEQ ID N0:1 ou resíduos dos aminoácidos 25-262 da SEQ ID N0:2.
5. A composição das reivindicações 1 ou 2, em que os referidos polipéptidos KLK1 compreendam uma sequência de aminoácidos denotando pelo menos 95 % de identidade de sequência com os resíduos de aminoácidos 25-262 da SEQ ID NO:1 ou a SEQ ID NO:2.
6. A composição da reivindicação 5, em que os referidos polipéptidos KLK1 compreendam uma sequência de aminoácidos denotando pelo menos 95 % de identidade de sequência com os resíduos dos aminoácidos 25-262 da SEQ ID NO: 2, and em que said KLK1 polypeptide (s) comprises E145 e/ou A188.
7. A composição de qualquer uma das reivindicações 1-3, em que os referidos polipéptidos KLK1 compreendam uma sequência de aminoácidos denotando pelo menos 95 % de identidade de sequência com os resíduos dos aminoácidos 25-262 da SEQ ID N0:2, e em que os referidos polipéptidos KLK1 compreendam Q145 e/ou V188.
8. A composição de qualquer uma das reivindicações 1-7, em que os polipéptidos KLK1 consistam nos resíduos dos aminoácidos 25-262 da SEQ ID N0:1 ou nos resíduos de aminoácidos 25-262 da SEQ ID N0:2.
9. A composição de qualquer uma das reivindicações 1-8, compreendendo adicionalmente um diluente, adjuvante ou veiculo aceitável do ponto de vista farmacêutico.
10. A composição de qualquer uma das reivindicações 1-9, em que a composição seja substancialmente isenta de outras isoformas glicosiladas (glicoformas) de KLK1.
11. A composição de qualquer uma das reivindicações 1-10, em que a composição apresente teores em endotoxinas inferiores a 1 EU/mg de proteína, proteína da célula hospedeira inferior a 100 ng/mg de proteína total, ADN da célula hospedeira inferior a 10 pg/mg da proteína total, e/ou seja substancialmente isenta de agregados (aparecendo mais do que 95 % como um único pico na SEC HPLC).
12. Um dispositivo compreendendo uma composição de qualquer uma das reivindicações 1-11, em que o dispositivo seja adequado para entregar a composição por via subcutânea.
13. O dispositivo da reivindicação 12, em que o dispositivo seja uma seringa.
14. A seringa da reivindicação 13, compreendendo adicionalmente uma montagem com uma agulha hipodérmica ligada à seringa.
15. A seringa da reivindicação 14, em que a agulha tenha um comprimento de entre lê de polegada e 5/8 de polegada, e tenha um calibre de cerca de 25 a cerca de 31.