CN116135973A - 低糖基化修饰的激肽原酶及其聚乙二醇修饰物和应用 - Google Patents

低糖基化修饰的激肽原酶及其聚乙二醇修饰物和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116135973A
CN116135973A CN202111353294.2A CN202111353294A CN116135973A CN 116135973 A CN116135973 A CN 116135973A CN 202111353294 A CN202111353294 A CN 202111353294A CN 116135973 A CN116135973 A CN 116135973A
Authority
CN
China
Prior art keywords
kininogenase
amino acid
mutant
recombinant
glycosylation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202111353294.2A
Other languages
English (en)
Inventor
马永
王和
王俊
葛晨楠
江辰阳
姚翔
孙芳
张韬
庄宇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ZONHON BIOPHARMA INSTITUTE Inc
Original Assignee
ZONHON BIOPHARMA INSTITUTE Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ZONHON BIOPHARMA INSTITUTE Inc filed Critical ZONHON BIOPHARMA INSTITUTE Inc
Priority to CN202111353294.2A priority Critical patent/CN116135973A/zh
Priority to PCT/CN2022/132102 priority patent/WO2023088272A1/zh
Publication of CN116135973A publication Critical patent/CN116135973A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6445—Kallikreins (3.4.21.34; 3.4.21.35)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21035—Tissue kallikrein (3.4.21.35)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)

Abstract

本发明涉及低糖基化修饰的激肽原酶及其聚乙二醇修饰物和应用。本发明一方面提供在NFS序列处无糖基化修饰或仅有少量糖基化修饰的低糖基化激肽原酶，相比在NFS处有高糖基化修饰的激肽原酶，其具有更高活性。本发明进一步提供重组激肽原酶突变体，其在NFS序列处无N糖基化修饰，仅含有NMS和NHT处的两个N糖基化修饰位点。该重组KLK1突变体糖基化修饰相对更一致，产物分子量相对更均一、产量更高、纯化工艺更简单，并且令人意外地发现，低糖基化突变体相较未突变的低糖基化组分具有更高的生物学活性和质量更可控的优势。本发明的另一个方面是提供一种长效化、质量可控、低免疫原性，并且具有高生物学活性的聚乙二醇化重组人KLK1，相比原蛋白可以降低给药频率，提高患者依从性，实现该药物对急性缺血性脑卒中、周围神经病、视网膜病、眼底病、高血压、糖尿病肾病、IgA肾炎、慢性肾病等疾病的治疗、预防及愈后恢复、防止复发等阶段的全过程用药覆盖。

Description

低糖基化修饰的激肽原酶及其聚乙二醇修饰物和应用
技术领域
本发明涉及低糖基化修饰的激肽原酶及其聚乙二醇修饰物和应用。特别是在NFS序列处无糖基化修饰或仅有少量糖基化修饰的重组激肽原酶，尤其是针对重组激肽原酶NFS序列的突变体，还涉及它们的聚乙二醇修饰物和应用。
背景技术
激肽原酶，又称激肽释放酶或血管舒缓素，是一种丝氨酸蛋白酶，分为两大类：血浆激肽原酶(PK)和组织激肽原酶(TK)，均发挥十分重要的生理作用。目前认为人组织激肽原酶至少由15个成员(KLK1-KLK15)组成，其中对组织激肽原酶1(KLK1)的研究较多，KLK1通过将激肽原转化为激肽，作用于相应受体，发挥一系列生物作用。已有大量研究表明，KLK1在神经系统、循环系统、呼吸系统、糖尿病、癌症、肾脏疾病等均发挥作用。
目前国内外已上市的KLK1类产品有两大类：第一类由猪胰脏提取的胰激肽原酶，如常州千红制药的怡开，原料受动物来源限制。第二类由人尿提取的激肽原酶，如广东天普的注射用尤瑞克林，但人尿收集困难、产量低，存在病毒污染风险；并且尿源激肽原酶162位点氨基酸存在Glu/Lys多态性，药物质量控制存在较大挑战。除上述天然提取KLK1外，已有较多重组人激肽原酶的研究报道，进展最快的是DiaMedica公司的DM199，目前在开展治疗脑卒中的II/III期临床研究。
KLK1是具有丰富糖基化修饰的酶，糖基化修饰程度对酶活具有重要影响。N-糖基化修饰是糖蛋白药物中最受关注的糖基化修饰，糖链通过与新生肽链中特定天冬酰胺(NXS或NXT,X≠P，其中N表示天冬酰胺，S表示丝氨酸，T表示苏氨酸，P表示脯氨酸)的自由-NH2基连接，N-糖基化修饰位点的三联子序列基序存在38种可能。不同的N-糖基化基序在糖蛋白三维空间结构的不同位置，糖蛋白的结构决定了其糖基化修饰位点可以和哪一种糖基转移酶结合，并产生不同的糖基化修饰。现有技术中关于KLK1不同糖基化程度对药效及安全性的影响并无定论。CN107058269A纯化分离了猪胰激肽原酶的高、中、低三种糖基化程度的蛋白产物，其中低糖基化猪胰激肽原酶的酶活稳定性较差，通过纯化工艺去除后可提高产品的生物活性，减小副作用。广东天普专利CN101134952A分离尿源激肽原酶中间体得到高分子量与低分子量两种组分，选择高分子量组分作为药物成分，发现相比含有高低分子量混合物的人尿激肽原酶，单一高分子量的人尿激肽原酶副作用明显降低。广东天普也在尝试CHO表达重组人激肽原酶，其专利CN101134953A公开了含有3个糖基化修饰位点的高分子量KLK1。DiaMedica公司专利US20130323222A公开了CHO表达重组人激肽原酶，分别纯化获得高糖基化KLK1和低糖基化KLK1，两者体内活性差别不大，但按高低糖基化KLK11:1比例混合的混合物活性比单纯高糖基化KLK1或低糖基化KLK1都更高。
此外，即便确定了成药性最佳的糖基化修饰的KLK1，如何控制糖蛋白的糖基化水平仍是现代医药工业生产的重要技术难题，通常需要对重组表达及纯化条件做大量优化，才能最大限度地获得目的糖基化的产物。如CN101134953A采用CHO表达重组KLK1，【0010】段指出“通过优化培养条件提高了表达产物的糖基化程度”。CN101092598A使用毕赤酵母表达重组KLK1，产物中高糖基化分子量32871.16D，比例低，低糖基化分子量28975.79D，比例较高，两者分子量接近，通过三步纯化将两者分离。
除了解决KLK1糖基化问题，当前KLK1产品还存在生物稳定性差、半衰期短、需要重复给药、重组蛋白具有一定免疫原性等问题。比如DM199治疗方式为在脑卒中发病24小时内静脉滴注KLK1，之后22天内每3天皮下推注一次。临床试验结果表明KLK1可以降低高危人群的脑卒中发病率，预防卒中复发。而KLK1作为一种改善脑侧枝循环代偿程度的药物，要达到治疗效果，需要开展长期、多次的给药。可以预见KLK1的长期用药将成为其重要的应用方向，而频繁用药会降低患者依从性。
聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)化技术是一项利用聚乙二醇修饰剂对蛋白质、多肽等进行化学修饰的技术。目前已有十余种聚乙二醇修饰的蛋白药物上市。PEG修饰蛋白质可以增加蛋白质的溶解性，提高蛋白稳定性，延长体内半衰期、降低免疫原性。聚乙二醇化重组人KLK1国内外尚无相关的报道研究。
发明内容
本申请解决的第一个技术问题是KLK1糖基化修饰的选择。
正如背景技术提及，一方面现有技术中关于KLK1不同糖基化程度对药效及安全性的影响并无定论；另一方面即便确定了成药性最佳的糖基化修饰的KLK1，控制糖蛋白的糖基化水平通常需要对重组表达及纯化条件做大量优化，才能最大限度地获得目的糖基化的产物。
申请人通过表征分析发现重组人激肽原酶(rhKLK1)有三个糖基化修饰位点，分别为N78(NMS序列中N)，N84(NMS序列中N)与N141(NFS序列中的N)，其中高糖基化组分三个糖基化修饰位点均有糖修饰；低糖基化组分中N78、N84均有糖基化修饰，N141基本未发生糖基化修饰，仅有少量发生糖基化修饰；进一步比较高低糖基化组分的生物学活性，令人意外地 发现低糖基化组分的活性远高于高糖基化组分。进一步地为获得低糖基化组分，申请人并未如常规方法那样致力于优化重组表达及纯化条件，而是在对高低糖基化激肽原酶糖基化组分研究的基础上，选择突变其中一个糖基化修饰位点，即突变N141获得了产物更均一、低糖基化人激肽原酶组分产量更高的突变体，更令人吃惊的是申请人发现低糖基化KLK1突变 体相较未突变的低糖基化KLK1组分在酶学性质、活性等方面具有更进一步的优势。
人KLK1存在多种天然变体(同源物)，如Genbank登录号:AAA59455.1、NP002248.1、AAA36136.1、AAP35917、AAU12569等。组成方面，KLK1天然变体的氨基酸数目相同，仅有极个别氨基酸不同(如下表所示)，同源性很高。发明人还发现它们糖基化修饰位点相同，均位于N78，N84与N141，且糖基化修饰位点的三联子序列基序相同，均分别为NMS、NHT、NFS。
表1 KLK1天然变体个别氨基酸差异
Figure BDA0003356582340000031
本申请实施例在AAA59455.1基础上突变N141位点获得了仅含有两个糖基化修饰位点的KLK1(低糖基化KLK1)。如上所述，KLKL1天然变体的氨基酸组成及糖基化修饰位点高度一致，可以预见不同变体的糖基化修饰也相似。本领域技术人员可以合理预期在其他人KLK1天然变体的相应位置(如NFS处糖基化修饰位点或N141或其他相应位置)进行突变也能实现同样的技术效果，即获得产物更均一、低糖基化人KLK1组分产量更高、活性更好的目的产物。
此外，发明人还发现其他灵长类动物的激肽原酶均包含这三种N糖基化修饰位点的三联子序列基序相同，均分别为NMS、NHT、NFS，如NCBI Reference Sequence:XP_004061305.1(大猩猩)、XP_003916022.1(东非狒狒)、XP_003813685.1(倭黑猩猩)、XP_002829668.3(苏门答腊猩猩)、XP_032024960.1(白眉长臂猿)等。本领域技术人员可以合理预期在其他灵长类动物激肽原酶天然氨基酸的相应位置(如NFS处糖基化修饰位点或或其他相应位置)进行突变也能实现同样的技术效果，即获得产物更均一、低糖基化激肽原酶组分产量更高、活性更好的目的产物。
基于上述研究发现，本申请提供一种低糖基化修饰的激肽原酶或其衍生物，该激肽原酶是灵长类动物激肽原酶，含有天然激肽原酶的三个N糖基化修饰位点NMS、NHT、NFS，其中NFS处无糖基化修饰或仅有少量糖基化修饰。所述少量糖基化修饰是指该位点经糖基化修饰的比例≤10％、≤9％、≤8％、≤7％、≤6％、≤5％、≤4％、≤3％、≤2％、≤1％、≤0.5％或≤0.1％。在特定的实施例中，该低糖基化激肽原酶NFS(N141)处96.39％未发生糖基化修饰，仅有不到4％组分有糖基化修饰相比在NFS处有高糖基化修饰的激肽原酶，其具有更高活性。
进一步地，本申请提供一种重组激肽原酶突变体或其衍生物，该激肽原酶是灵长类动物激肽原酶，该重组激肽原酶或其衍生物由含有两个N糖基化修饰位点的KLK1组成，不存在含三个N糖基化修饰位点的KLK1。
优选的，该重组激肽原酶突变体或其衍生物保留了天然激肽原酶中NMS、NHT处的N糖基化修饰位点，不含有存在于天然激肽原酶中的NFS处的N糖基化修饰位点。所述灵长类动物可以是人，也可以是非人灵长类动物，如大猩猩、东非狒狒、倭黑猩猩、苏门答腊猩猩、白眉长臂猿等。
优选的，该激肽原酶是人激肽原酶，所述天然人激肽原酶氨基酸序列如Genbank登录号:AAA59455.1、NP002248.1、AAA36136.1、AAP35917、AAU12569等所示。
优选的，将天然人激肽原酶氨基酸序列NFS处的N(天冬酰胺)突变为其他任意氨基酸，即第141位天冬酰胺突变为其他任意氨基酸。使之不构成N糖基化基序，从而无法在N141处发生糖基化修饰。
在具体实施例中发明人将AAA59455.1第141位天冬酰胺分别突变为中性极性氨基酸谷氨酰胺(Gln)、酸性氨基酸天冬氨酸(Asp)、碱性氨基酸精氨酸(Arg)，脂肪族氨基酸丙氨酸(Ala)四种不同类型的氨基酸，发现不同突变体在获得更均一、低糖基化组分产量更高的基础上，产物活性均优于突变前低糖基化组分。本领域技术人员可以预期第141位点氨基酸突变不会降低激肽原酶活性，可以将该位点的野生氨基酸突变为其他任意氨基酸。
优选的，将天然人激肽原酶氨基酸序列NFS处的F(苯丙氨酸)突变为脯氨酸，即第142位苯丙氨酸突变为脯氨酸。使之不构成N糖基化基序，从而无法在N141处发生糖基化修饰。
优选的，将天然人激肽原酶氨基酸序列NFS处的S(丝氨酸)突变为其他非苏氨酸的任意氨基酸，即第143位丝氨酸突变为其他非苏氨酸的任意氨基酸。使之不构成N糖基化基序，从而无法在N141处发生糖基化修饰。
在具体的实施例中发明人将N141突变为其他氨基酸，使该位点不构成N糖基化基序，从而无法在N141处发生糖基化修饰。本领域技术人员可以预期第142位氨基酸突变为脯氨酸或者第143位突变为其他非苏氨酸的任意氨基酸也能实现该目的。
优选的，天然人激肽原酶氨基酸序列NFS处的天冬酰胺、苯丙氨酸、丝氨酸中有一个氨基酸、两个氨基酸或三个氨基酸突变。
本申请还提供含有上述低糖基化修饰的激肽原酶的组合物。
KLK1通过将激肽原转化为激肽，作用于相应受体，发挥一系列生物作用。已有大量研究表明，KLK1在神经系统、循环系统、呼吸系统、糖尿病、癌症、肾脏疾病等均发挥作用。目前已上市的KLK1获批适应症有微循环障碍性疾病，如糖尿病引起的肾病、周围神经病、视网膜病、眼底病、高血压的辅助治疗等；还可用于轻-中度急性血栓性脑梗死；正在开展临床实验的适应症还有IgA肾炎，慢性肾病等。本申请的KLK1突变体相比天然KLK1仅有个别氨基酸突变，具体实施例证明它们作用于相同底物发挥体外活性，在MACO脑缺血再灌注模型中也均能产生改善脑梗死症状的体内活性。本领域技术人员可以合理预期本申请的重组KLK1突变体及其组合物的适应症与天然KLK1相同，可用于急性缺血性脑卒中、周围神经病、视网膜病、眼底病、高血压、糖尿病肾病、IgA肾炎、慢性肾病的治疗、预防、愈后恢复、防止复发中的应用。
本申请解决的第二个技术问题是当前KLK1产品存在生物稳定性差、半衰期短、需要重复给药、重组蛋白具有一定免疫原性等问题。
本发明提供一种显著提高蛋白稳定性，降低免疫原性，改善蛋白体内药代动力学性质并最大程度保留蛋白活性的聚乙二醇修饰剂修饰的KLK1。
优选的，所述被PEG修饰的KLK1为上述仅由含有两个糖基化修饰位点的重组激肽原酶或其衍生物，不存在含三个糖基化修饰位点的重组激肽原酶或其衍生物。
优选的，所述聚乙二醇修饰剂在KLK1蛋白N末端或赖氨酸的游离氨基上形成共价偶联。
优选的，所述聚乙二醇修饰剂是分子量5kDa-10kDa的直链聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸脂，结构通式如(1)所示，其中n是105至225的整数，
Figure BDA0003356582340000061
优选的，所述聚乙二醇修饰剂是分子量30kDa-40kDa的分支型聚乙二醇丙醛，结构通式如(2)所示，其中m是335至455的整数，
Figure BDA0003356582340000062
本发明提供一种上述聚乙二醇化激肽原酶的制备方法，包括如下步骤：
第一步，缓冲液置换
通过色谱柱脱盐、透析、浓缩稀释、切向流超滤等手段，将待修饰的激肽原酶置换入修饰缓冲液；
第二步，修饰反应及修饰产物纯化
在第一步收集的激肽原酶溶液中加入PEG修饰剂后反应，反应结束后用离子交换色谱层析进行纯化。
本发明还提供上述聚乙二醇化激肽原酶在急性缺血性脑卒中、周围神经病、视网膜病、眼底病、高血压、糖尿病肾病、IgA肾炎，慢性肾病的治疗、预防、愈后恢复、防止复发中的应用。
本申请相比现有技术具有如下优势：
第一个方面，本申请的重组KLK1优势明显。
未突变的重组KLK1在NFS处无糖基化修饰或仅有少量糖基化修饰，相比在NFS处有高糖基化修饰的重组激肽原酶，其具有更高活性。
重组KLK1突变体有更进一步的优势：
在工艺层面，本申请的重组人激肽原酶突变体纯化过程只需要收集主峰，纯化工艺更简单。
在质量层面，由于不存在难以分离的高低糖基化组分，获得的目的产物相对更均一、质量更可控、产量更高。
在活性及药效方面，本申请令人意外地发现未突变的低糖基化组分的活性高于未突变的高糖基化组分，更令人吃惊的是低糖基化KLK1突变体相较未突变的低糖基化KLK1组分在酶学性质、活性等方面也具有更进一步的优势。
第二个方面，本申请通过聚乙二醇化技术，开发出一种长效化、质量可控、低免疫原性的，并且具有高生物学活性的聚乙二醇化重组人KLK1；并通过相关药效及药代研究，充分挖掘聚乙二醇药物安全、长效的优势，降低给药频率，提高患者依从性，实现该药物对急性缺血性脑卒中、周围神经病、视网膜病、眼底病、高血压、糖尿病肾病、IgA肾炎、慢性肾病等疾病的预防、治疗及预后恢复、防止复发等阶段的全过程用药覆盖。
附图说明
图1：重组人激肽原酶与突变体分子设计图
图2：pZHK2.0表达载体示意图
图3：CHO表达的野生型重组人激肽原酶发酵液上清经过疏水层析洗脱峰色谱图。箭头所指为分离的高糖基化产物(左)与低糖基化产物(右)。
图4：CHO表达的野生型重组人激肽原酶经纯化分离的高低糖基化蛋白SDS-PAGE电泳图。泳道M为蛋白marker，泳道1为高糖基化人激肽原酶，泳道2为低糖基化人激肽原酶。
图5：CHO表达的hKLK1X1突变后重组人激肽原酶发酵液上清经过疏水层析洗脱峰色谱图。箭头所指为分离的单一低糖基化产物。
图6：CHO表达的hKLK1X1突变后重组人激肽原酶经纯化分离的低糖基化蛋白SDS-PAGE电泳图。泳道M为蛋白marker，泳道1为低糖基化人激肽原酶突变体。
图7：CHO表达的野生型重组人激肽原酶高低糖基化蛋白未分离时SDS-PAGE电泳图。泳道M为蛋白marker，泳道1为高、低糖基化混合的野生型重组人激肽原酶。
图8：高糖基化hKLK1样品Trypsin酶切Sequence Coverage图
图9：低糖基化hKLK1样品Trypsin酶切Sequence Coverage图
图10：高糖基化hKLK1三批次样品Trypsin酶切TIC图对比
图11：低糖基化hKLK1三批次样品Trypsin酶切TIC图对比
图12：hKLK1X1样品Trypsin酶切Sequence Coverage图
图13：高糖基化hKLK1脱糖分子量检测解卷积图
图14：低糖基化hKLK1脱糖分子量检测解卷积图
图15：hKLK1X1脱糖分子量检测解卷积图
图16：给予PEG-hKLK1低糖基化的动物抗药抗体检测
图17：给予PEG-hKLK1高糖基化的动物抗药抗体检测
图18：实施例10受试物对神经缺陷症状的影响
图19：实施例10受试物对脑梗死面积的影响
图20：实施例10动物试验模型组与假手术组脑部切片图
图21：实施例10动物试验尤瑞克林组与胰激肽原酶注射液组脑部切片图
图22：实施例11受试物对神经缺陷症状的影响
图23：实施例11受试物对脑梗死面积的影响
图24：实施例11动物试验模型组、假手术组脑部切片图
图25：实施例11动物试验给药组脑部切片图
图26：实施例12受试物对神经缺陷症状的影响
图27：实施例12受试物对脑梗死面积的影响
图28：实施例12动物试验模型组、假手术组及阳性药组脑部切片图
图29：实施例12动物试验hKLK1不同PEG修饰产物组脑部切片图
图30：实施例13受试物对神经缺陷症状的影响
图31：实施例13受试物对脑梗死面积的影响
图32：实施例13动物试验模型组、假手术组脑部切片图
图33：实施例13动物试验hKLK1突变体不同PEG修饰产品给药组脑部切片图
具体实施方式
除非特别指明，否则本申请的技术术语或简称具有下列含义：
激肽原酶：特指组织激肽原酶1，KLK1。
hKLK1：与天然人组织激肽原酶序列一致、未突变的人组织激肽原酶；涵盖人KLK1的各种同源物，包括但不限于Genbank登录号为AAA59455.1、NP002248.1、AAA36136.1、AAP35917、AAU12569等所示的KLK1。
hKLK1高糖基化：未突变的人组织激肽原酶的高糖基化组分。
hKLK1低糖基化：未突变的人组织激肽原酶的低糖基化组分。
hKLK1X：人组织激肽原酶突变体。hKLK1X1、hKLK1X2、hKLK1X3、hKLK1X4代表不同突变体。
KLK1突变体的衍生物：包括本申请KLK1突变体的全长蛋白、部分蛋白或者在本申请KLK1突变体的基础上进一步突变获得的蛋白、融合蛋白(包括但不限于白蛋白融合、Fc融合等)、各种形式修饰物(包括但不限于聚乙二醇化修饰物等)。
KLK1三个糖基化修饰位点N78、N84与N141：分别指KLK1氨基酸序列第78位、84位、141位的天冬酰胺。对应的三联子序列基序分别为NMS、NHT、NFS，N代表天冬酰胺，M代表甲硫氨酸，S代表丝氨酸，H代表组氨酸，T代表苏氨酸，F代表苯丙氨酸。
聚乙二醇：PEG，通常经环氧乙烷聚合而成，有分支型，直链型和多臂型。一般情况下，分子量低于20,000的被称为PEG，分子量更大的被称为PEO。普通的聚乙二醇两端各有一个羟基，若一端以甲基封闭则得到甲氧基聚乙二醇(mPEG)。
聚乙二醇修饰剂：PEG修饰剂，指带有官能团的聚乙二醇衍生物，是经过活化的聚乙二醇，可用于蛋白质以及多肽药物修饰。本申请所用聚乙二醇修饰剂购自江苏众红生物工程创药研究院有限公司或北京键凯科技股份有限公司。特定分子量的PEG修饰剂实际分子量可以是标示值的90％～110％，如PEG5K分子量可以是4.5kDa～5.5kDa。
实施例所用的PEG5K具体指M-SPA-5K，是分子量约为5kDa的直链单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酯，结构如式(1)所示，n为105至110的整数，
Figure BDA0003356582340000101
实施例所用的PEG10K具体指M-SPA-10K，是分子量约为10kDa的直链单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酯，结构如式(1)所示，n为220至225的整数。
实施例所用的PEG30K具体指Y-PALD-30K，是分子量约为30kD的分支型聚乙二醇丙醛，结构如式(2)所示，m为335至340的整数，
Figure BDA0003356582340000102
实施例所用的PEG40K具体指Y-PALD-40K，是分子量约为40kD的分支型聚乙二醇丙醛，结构如式(2)所示，m为450至455的整数。
术语“偶联物”，是指聚乙二醇修饰激肽原酶后得到的修饰产物。
实施例1重组人激肽原酶(hKLK1)基因设计、表达载体构建、表达、纯化
(一)基因设计与表达载体构建
结合GenBank中已公开的人激肽原酶序列(GenBank:AAA59455.1)信息，进行密码子优化后确定成熟产物氨基酸序列(SEQ ID No：1)与包含信号肽与前肽的人激肽原酶cDNA序列(SEQ ID No：2)。在重组人激肽原酶基因(SEQ ID No：2)前添加AvrII，在序列后添加BstZ17I酶切位点序列后进行合成。将合成基因构建到pUC57质粒中，得到一种长期保存质粒，记为pUC57-hKLK1质粒。使用引物从pUC57-hKLK1质粒中扩增hKLK1基因。1％琼脂糖电泳回收PCR产物，对所得最终目的基因产物使用AvrII和BstZ17I双酶切PCR回收产物(图1)和pZHK 2.0载体(图2)，使用T4连接酶将酶切后目的基因连入pZHK2.0载体中。并转化到Top10感受态细胞中，涂于含有卡那霉素抗性的LB平板中37℃过夜培养。第二天筛选阳性克隆菌，并测序比对，与预期序列完全一致。形成pZHK2.0-hKLK1表达载体。
(二)稳定表达
将上述构建的质粒通过NruI(R0192S，购于NEB公司)过夜酶切进行线性化，电转染到CHO-S细胞中后，进行加压筛选获得稳定细胞株。将含有高表达重组人激肽原酶稳定表达CHO细胞株接种于Dynamis培养基中(A2617501，购自Thermo Fisher公司)，37℃，8％CO2，130rpm，进行分批补料流加培养，培养2周后收获培养液。
(三)纯化
1、培养液预处理
收集上述含有重组人激肽原酶的培养液，6000rpm，15min离心去除细胞，超滤浓缩，并过滤0.22μm的膜，去除细胞碎片。加入1.5M(NH4)2SO4，室温下搅拌活化3天。将活化后培养液经过0.45μm微滤膜包澄清过滤。
2、疏水层析
首先用20mM Tris-HCl，1.5M硫酸铵，pH＝8.0的缓冲液平衡柱子直至基线平衡，然后将预处理后的上清经过POROS Benzyl介质(A32563，购自赛默飞)从培养基中捕获重组人激肽原酶，接着用20mM Tris-HCl，pH＝8.0梯度洗脱，可见疏水分离明显2个峰，收集各个洗脱峰，分离糖基化修饰程度不一致的重组hKLK1蛋白，洗脱峰色谱图见图3。
3、阴离子交换
用20mM Tris-HCl，pH＝8.0的磷酸缓冲液将步骤2中收集到的含有重组hKLK1蛋白洗脱峰用10kDa的超滤膜包超滤至电导＝10-15ms/cm；用20mM Tris-HCl，100mM NaCl pH＝8.0缓冲液平衡柱子直至基线平衡；接着将超滤预处理后的上清经过Q FF介质(17515601，购自GE公司)；最后用20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH＝8.0洗脱缓冲液等度洗脱柱子，收集主洗脱峰。
4、阳离子交换
对步骤3样品超滤换液为10mM NaAc-HAc，50mM NaCl，pH＝3.5-3.7。用SP FF介质(17072904，购自GE公司)对上一步收集到的分子量不同的重组hKLK1进行精纯。平衡缓冲液为10mM NaAc-HAc，50mM NaCl，pH＝3.7，洗脱缓冲液为50mM Tris-HCl，1M NaCl，pH＝8.0。
通过SDS-PAGE凝胶电泳分析纯化样品的纯度，SDS-PAGE胶图显示高糖基化hKLK1蛋白分子量略高于低糖基化hKLK1蛋白，见图4。
实施例2：重组人激肽原酶(hKLK1)连续三批生产及质量表征分析
对野生型重组人激肽原酶进行连续3批7L搅拌式反应器高密度培养，初始培养条件为：转速100rpm，溶氧40％，温度37℃，pH值7.0，取种子悬液接种生物反应器，密度5×10e5 cells/mL。第3天调节温度为33℃，分别补充补料培养基与葡萄糖，维持培养液的糖含量不低于2g/L。当细胞活率低于90％时，收集培养液使用实施例1所述纯化工艺完成纯化，分别获得3批次含高、低糖基化的重组人激肽原酶。
对这些样品进行蛋白质量表征分析，包括产量、SEC-HPLC纯度、使用LC/MS(ThermoQ Exactive)进行N/C端氨基酸序列、肽图分析及糖基化修饰位点与糖修饰等分析，结果汇总如下。
表2
Figure BDA0003356582340000121
Figure BDA0003356582340000131
上表分析结果表明：分离的高低糖基化重组人激肽原酶，纯度均达97％以上。高低糖基化蛋白分子量有差异。基于Trypsin酶切完成高低糖基化hKLK1氨基酸覆盖率检测，均达到100％覆盖(图8、9)。hKLK1低糖基化N/C端序列与理论一致(表6～8)，三批次肽图表征一致(图11)。但高糖基化蛋白在连续三批生产工艺中的批次二出现了部分蛋白组分N端与理论不一致，缺失序列情况(表3～5)，批次二与批次一、批次三的肽图不一致(图10)，说明高糖基化重组人激肽原酶可能存在分子稳定性缺陷，这在药物生产过程中会引入巨大的风险。同时，高低糖基化的分离纯化工艺也比较复杂，工艺的不稳定性也易导致不同批次间纯化产物的糖基化水平难以控制。
表3高糖基化hKLK1第一批20200701样品N/C端分析结果
Figure BDA0003356582340000132
表4高糖基化hKLK1第二批20200703样品N/C端分析结果(N端丢失IVG序列)
Figure BDA0003356582340000133
表5高糖基化hKLK1第三批20200705样品N/C端分析结果
Figure BDA0003356582340000134
表6低糖基化hKLK1第一批20200702样品N/C端分析结果
Figure BDA0003356582340000141
表7低糖基化hKLK1第二批20200704样品N/C端分析结果
Figure BDA0003356582340000142
表8低糖基化kKLK1第三批20200706样品N/C端分析结果
Figure BDA0003356582340000143
表9低糖基化hKLK1(20200702)样品中N78/N84//N141位点糖肽表征分析检测结果
Modification Glycan Category Sequence Confidence Abundance
～N78+A3Ga2G0F A3Ga2G0F N-Glycan HNLFDDENTAQFVHVSESFPHPGFNMSLLENHTRQADEDYSHDLMLLR 100 43.57％
～N78+A4G3F A4G3F N-Glycan HNLFDDENTAQFVHVSESFPHPGFNMSLLENHTRQADEDYSHDLMLLR 100 56.43％
～N84+A4Ga1G2F A4Ga1G2F N-Glycan HNLFDDENTAQFVHVSESFPHPGFNMSLLENHTRQADEDYSHDLMLLR 100 100％
N141+A1G0F A1G0F N-Glycan VVELPTQEPEVGSTCLASGWGSIEPENFSFPDDLQCVDLK 100 1.51％
N141+A1G0M4F A1G0M4F N-Glycaa VVELPTQEPEVGSTCLASGWGSIEPENFSFPDDLQCVDLK 100 0.29％
N141+A2G0F A2G0F N-Glycan VVELPTQEPEVGSTCLASGWGSIEPENFSFPDDLQCVDLK 100 0.12％
N141+A2S2 A2S2 N-Glycan VVELPTQEPEVGSTCLASGWGSIEPENFSFPDDLQCVDLK 100 0.39％
N141+A3S2G0 A3S2G0 N-Glycan VVELPTQEPEVGSTCLASGWGSIEPENFSFPDDLQCVDLK 100 0.46％
N141+GnF GnF N-Glycan VVELPTQEPEVGSTCLASGWGSIEPENFSFPDDLQCVDLK 100 0.59％
N141+M3 M3 N-Glycan VVELPTQEPEVGSTCLASGWGSIEPENFSFPDDLQCVDLK 100 0.29％
N141+Unglycosylated Unglycosylated N-Glycan VVELPTQEPEVGSTCLASGWGSIEPENFSFPDDLQCVDLK 100 96.39％
此外，重组人激肽原酶的糖基化修饰位点分析结果表明：重组人激肽原酶低糖基化组分中N78、N84均有糖基化修饰，N141基本未发生糖基化修饰(96.39％)，仅有少量组分(不到4％)有糖基化修饰(表9)；hKLK1高糖基化组分含有3个N糖基化修饰位点，分别为N78，N84与N141，且含有多种类型糖基化修饰，糖型修饰种类复杂。
合并实施例1高低糖基化蛋白的疏水层析洗脱峰，并进行相同的后续阴离子、阳离子纯化，获得高低糖基化混合的重组hKLK1蛋白，通过SDS-PAGE凝胶电泳分析纯化样品的纯度，见图7，可见高、低糖基化蛋白形成弥散分布的条带，在高糖基化蛋白上方存在分子量更大的修饰存在。如图3所示未突变的重组人激肽原酶疏水纯化分离高低糖基化组分时分离度较差，难以做到高低糖基化组分完全分离。综上可知，未突变的hKLK1原蛋白并不是以简单的高低糖基化2种产物混合存在的，N141含有不均一、复杂的糖基化程度，为重组hKLK1的质量控制带来较大挑战。
进一步比较高低糖基化组分的生物学活性(实施例5)，令人意外地发现低糖基化组分的活性远高于高糖基化组分。
实施例3：重组人激肽原酶突变体(hKLK1X)设计、表达载体构建、表达、纯化
进一步地为获得低糖基化组分，申请人并未如常规方法那样致力于优化重组人激肽原酶表达及纯化条件，而是在上述高低糖基化激肽原酶糖基化组分研究的基础上，选择突变其中一个糖基化修饰位点，即突变N141获得了产物更均一、低糖基化人激肽原酶组分产量更高的突变体，更令人吃惊的是在随后的实验中发现低糖基化KLK1突变体相较未突变的低糖基化KLK1组分在酶学性质、活性等方面具有更进一步的优势。
对糖基化修饰位点N141进行点突变，将天冬酰胺分别突变成中性极性氨基酸谷氨酰胺(Gln)，酸性氨基酸天冬氨酸(Asp)，碱性氨基酸精氨酸(Arg)，脂肪族氨基酸丙氨酸(Ala)四种不同类型的氨基酸，将对应的人激肽原酶突变体分别命名为hKLK1X1(SEQ IDNo：3)，hKLK1X2(SEQ ID No：4)，hKLK1X3(SEQ ID No：5)，hKLK1X4(SEQ ID No：6)。按照实施例1的方法制备各突变体。
对于重组人激肽原酶hKLK1X1，使用实施例1的三步纯化工艺进行纯化。在突变体的疏水纯化图谱中，疏水洗脱仅出现1个主洗脱峰(图5)，说明突变后产物更均一。未突变的重组人激肽原酶，纯化工艺分离高低糖基化组分分离度较差(图3)，难以做到高低糖基化组分完全分离。突变后的重组人激肽原酶疏水层析只需要收集一个主峰，纯化工艺更简单。
通过SDS-PAGE凝胶电泳分析纯化样品的纯度，发现纯化样品分子量与低糖基化hKLK1十分接近，蛋白突变后含有较多N141糖修饰的高糖基化组分完全消失(图6)，低糖基化hKLK1比例更高、产量更高，产物更均一。
基于LC-MS完成重组人激肽原酶hKLK1X1的氨基酸覆盖率检测分析，与理论氨基酸序列覆盖率为100％(图12)，说明重组hKLK1X1一级序列的正确性；并完成糖基化修饰位点鉴定(表10)，重组hKLK1X1仅含N78、N84两个糖基化修饰位点，与分子设计目标一致。
表10 hKLK1X1-20210811样品在Chymotrypsin酶切方式下糖基化修饰位点鉴定
Figure BDA0003356582340000161
实施例4突变前后蛋白样品MS脱糖分子量检测
基于LC-MS开展突变前后重组蛋白的脱糖分子量检测，重组蛋白经盐酸胍变性及脱糖酶PNGaseF酶切后进行分子量检测。高糖基化hKLK1的脱糖分子量为26380.338Da，与理论分子量26377.493Da基本一致(图13，表11)；低糖基化hKLK1的脱糖分子量为26379.346Da，与理论分子量26377.493Da基本一致(图14，表11)；hKLK1X1的脱糖分子量为26418.82Da，与理论分子量26418.48Da基本一致(图15，表11)。上述结果进一步表明了重组蛋白一级结构的正确性。
表11脱糖分子量检测结果汇总
Figure BDA0003356582340000162
实施例5 PEG修饰hKLK1/hKLK1X样品的制备、纯化及纯度分析
不同PEG修饰hKLK1/hKLK1X样品可以通过常规方法制备、纯化。
一、PEG偶联物样品制备
(1)预处理：
取重组人组织激肽原酶原蛋白(以下简称hKLK1)，使用3kDa超滤膜包(或其他等效的缓冲液置换方法)处理，置换缓冲液为磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲液pH6.0～8.0，同时浓缩至蛋白浓度10～25mg/mL。
(2)投料修饰
PEG5K-hKLK1随机修饰制备：按hKLK1蛋白与M-SAP-5K PEG质量比1:(25～30)的比例，向预处理后的hKLK1蛋白溶液中加入PEG，缓慢搅拌至混合均匀后，于4℃条件下，反应24h。
PEG10K-hKLK1随机修饰制备：按hKLK1蛋白与M-SAP-10K PEG质量比1:(15～20)的比例，向预处理后的hKLK1蛋白溶液中加入PEG，缓慢搅拌至混合均匀后，于4℃条件下，反应24h。
PEG30K-hKLK1定点修饰制备：按hKLK1蛋白与Y-PALD-PEG 30K摩尔比1:(6～8)的比例向预处理过后的hKLK1蛋白溶液中加入PEG，按PEG与还原剂(氰基硼氢化钠)摩尔比1:(50～100)的比例，向PEG30K与蛋白混合溶液中加入还原剂，缓慢搅拌至混合均匀后，于4℃条件下，反应24h。
PEG40K-hKLK1定点修饰制备：按hKLK1蛋白与Y-PALD-PEG 40K摩尔比1:(6～8)的比例向预处理过后的hKLK1蛋白溶液中加入PEG，按PEG与还原剂(氰基硼氢化钠)摩尔比1:(50～100)的比例，向PEG40K与蛋白混合溶液中加入还原剂，缓慢搅拌至混合均匀后，于4℃条件下，反应24h。
二、反应混合物纯化
色谱法条件如下：
纯化填料选用GE公司Q SepharoseTM High Performance介质，纯化流动相为BufferA：50mM Tris-HCl(pH8.0～9.0)；BufferB：50mM Tris-HCl+1M NaCl(pH8.0～9.0)。
上样：取反应结束后的上述PEG-hKLK1修饰反应混合物，经双蒸水稀释约10倍后，再经Buffer A液稀释约5倍后上样纯化。上样结束后使用BufferA洗涤层析柱不少于5个柱床体积。
洗脱：设置0-50％BufferB梯度洗脱10个柱床体积，根据UV280趋势分步收集洗脱样品。
PEG修饰hKLK1突变体(PEG-hKLK1X)同样按上述方法制备、纯化。
三、PEG偶联物样品纯度分析
(1)HPLC纯度分析
参考《中国药典》2020年版通则0512高效液相色谱法进行检测，检测色谱类型为SEC(分子筛色谱)，流动相为含5％异丙醇的20mM PB 7.0缓冲液，色谱柱BEH450 SEC 3.5μm，采集条件为280nm，采集时间为20～25分钟。
液相检测结果显示，制备的PEG-hKLK1/hKLK1X1系列蛋白纯度均≥95％。
(2)SDS-PAGE纯度分析
按照2020版中国药典0541电泳法第五法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法开展样品纯度测定，配置12.5％的SDS-PAGE开展样品检测。
电泳结果显示，制备的PEG-hKLK1/hKLK1X1系列蛋白分子条带均一，未见杂带，修饰度与纯度均较优。
(3)PEG结合数检测
a)溶液配制：配置1、2、4、6、8mg/ml的PEG标准品溶液；配制1mg/ml重组人激肽原酶(低糖基化/rhKLK1X1)及其对应的PEG修饰物溶液。
b)检测方法：
色谱柱：XBridge BEH SEC 3.5μm 450A；柱温：25℃。
流动相：20mM PB 7.0+10％IPA，流速0.4ml/min。
检测器：PDA检测器，检测波长280nm；RI检测器，检测波长280nm。
c)数据分析：
供试品(PEG修饰)实测浓度＝供试品(PEG修饰)PDA检测器峰面积/未修饰原蛋白PDA检测器峰面积×1.0
样品中PEG峰面积＝(供试品(PEG修饰)RI检测器峰面积/供试品(PEG修饰)实测浓度)-(未修饰原蛋白RI检测器峰面积/未修饰原蛋白浓度)
样品中PEG浓度，将样品中PEG峰面积代入PEG标准曲线中进行计算
样品中PEG结合数＝(样品中PEG含量/PEG分子量)/(样品蛋白浓度/蛋白分子量26kD)
表12
Figure BDA0003356582340000191
实施例6：重组人激肽原酶(hKLK1)及其突变体(hKLK1X)活性检测
激肽原酶在体内催化低分子激肽原LMWK水解释放赖氨酰缓激肽发挥生物学功能，水解反应涉及精氨酸(Arg)羧基端肽键的断裂。因此，重组人激肽原酶及其突变体的体外生物学活性评价是基于水解人工合成发色底物S-2266(H-D-Val-Leu-Arg-PNA)中Arg与对硝基苯胺间酰胺键断裂生成对硝基苯胺(PNA)，在405nm下检测PNA的生成。活性单位IU定义为在37℃、pH8.0条件下，每分钟水解1μmol S-2266为PNA的酶量为1IU。反应体系为200μl20mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液，10μl供试品，20μl 20mM S-2266底物溶液，置于37℃水浴中准确反应10min，加入20μl 50％醋酸溶液终止反应，基于不同浓度的PNA标准品拟合的标准曲线定量反应体系中PNA的生成量。运用上述方法完成高低糖基化hKLK1、hKLK1突变体以及hKLK1-PEG修饰样品的体外生物学活性检测。
结果如下表所示，hKLK1低糖基化(未突变)样品的活性显著高于hKLK1高糖基化(未突变)样品；未突变蛋白的PEG修饰系列产物中，随机修饰相较于定点修饰具有更高的体外活性，其中PEG10K-hKLK1低糖基化较优。位点突变后，突变体(hKLK1X1、hKLK1X2、hKLK1X3、hKLK1X4)样品的活性均高于未突变的hKLK1-低糖基化样品。同时PEG修饰样品的活性稍低于修饰前hKLK1X1蛋白；PEG10K-hKLK1X1的活性高于PEG5K-hKLK1X1，PEG10K修饰后基本保留了原蛋白活性。
表13
Figure BDA0003356582340000192
Figure BDA0003356582340000201
实施例7 PEG修饰的hKLK1/hKLK1X等体外酶促动力学检测
一、检测方法
(1)标准品稀释：使用S2266底物缓冲液将标准品胰激肽原酶稀释至10IU/mL，将稀释好的标准品按照下表分别稀释至1、2、3、4、5、6IU/mL，制成标准曲线：
底物缓冲液 90μL 80μL 70μL 60μL 50μL 40μL
10IU/mL标准品 10μL 20μL 30μL 40μL 50μL 60μL
(2)不同浓度底物配置：使用S2266底物缓冲液将分装好的底物S2266分别稀释为400、200、100、50、25、10μM的底物溶液。
(3)样品稀释：使用S2266底物缓冲液将样品稀释至1-6IU/mL之间。
(4)加样：将上述标准曲线、不同浓度底物溶液、稀释后样品加至酶标板，80μL/孔，其中标准曲线与200μM底物反应。
(5)读数：设置酶标仪37℃、405nm下进行动力学检测，读数间隔为1min，检测时长设置为15min；待仪器样品池温度升至37℃时，将稀释好的底物加加至上述样品中，80μL/孔，注意需快速加样且进行吹打混匀。加样结束后，立即进行读数即可。
(7)结果处理：使用GraphPad prism软件进行结果处理，按照米氏方程进行数据拟合，计算酶促动力学参数。其中Km为米氏常数，其含义为酶促反应最大速度(Vmax)一半时的底物的浓度。一般用1/Km近似的表示酶对底物的亲和力大小，1/Km越大，表示酶对该底物的亲和力越大，酶促反应易于进行。
二、实验结果
各样品酶促动力学结果如下表所示：
表14
样品名称 Km(μmol/L)
hKLK1低糖基化 43.76
PEG10K-hKLK1低糖基化 79.39
hKLK1X1 27.56
PEG5K-hKLK1X1 47.23
PEG10K-hKLK1X1 46.65
由酶促动力学检测结果可知，hKLK1X1相较未突变低糖基化hKLK1的Km值降低，说明突变后与底物的亲和力增加。同时突变体的两种PEG修饰产物，相对于未突变的PEG修饰产物Km值降低，表明突变体的两种修饰产物在酶学性质上具有优于未突变蛋白修饰产物的性能。
实施例8 hKLK1高、低糖基化蛋白PEG修饰产物在大鼠体内药代比较
一、分组
根据实验第一天测定的SD大鼠体重，按体重随机分组分为4组：PEG5K-hKLK1高糖基化静脉注射组、PEG5K-hKLK1高糖基化皮下注射组、PEG10K-hKLK1低糖基化静脉注射组、PEG10K-hKLK1低糖基化皮下注射组，每组6只，雌雄各半，染色编号。
二、给药
给药途径：皮下注射、静脉注射。
给药剂量：浓度均为0.1mg/mL，剂量均为0.5mg/kg。
给药频率：单次给药，于实验的第一天给药一次。
三、血样采集
检测时间：分别于0min(给药前)、30min、1h、2h、4h、8h、24h、2d、3d、5d、7d各采血一次，共采血11次，采血量：50-100μl血清，用于药代动力学参数的测定。
四、药代检测
血清中的药物浓度采用ELISA法进行测定。分析流程如下：
1)包被：使用20mM磷酸盐缓冲液(PB，pH7.4)稀释包被抗体为400ng/孔，吸取上述稀释包被抗体加入酶标板孔内(100uL/孔)，封板，4℃包被过夜；包被板为Thermo酶标板；
2)封闭：弃掉孔内液体，用洗板机洗板1次，300uL/孔，甩干。加入封闭液(含有2％BSA和0.05％Tween20的20mM PBS)200uL/孔，封板，37℃孵育约2h；
3)加样：甩掉孔内液体，待测药代样本(先用10％SD大鼠混合空白血清稀释至定量限浓度(2560ng/ml至80ng/ml)范围内)、标准品(系列2倍浓度，5120ng/ml至40ng/ml)和高(1920ng/ml)、中(480ng/ml)、低浓度(240ng/ml)的质控品溶液等用封闭液10倍稀释后加入酶标板，100uL/孔，封板，37℃孵育1.5h；
4)加检测抗体：弃掉孔内液体，用洗板机洗板3次，300uL/孔，甩干，加入检测抗体工作液(使用封闭液将检测抗体1000倍稀释制备成检测抗体工作液)，100uL/孔，封板，37℃孵育45min；
5)显色：弃掉孔内液体，用洗板机洗板5次，300uL/孔，甩干，加TMB 1号显色液，37℃孵育15min，视显色情况而定；
6)读板：加入终止液(2M H2SO4)50uL/孔，终止反应，立即测定450nm的OD值。以标准曲线样本浓度为X坐标，OD值为Y坐标绘制标准曲线，计算样本浓度。
7)使用Origin 8软件进行标曲绘制和计算测定样本浓度。利用Microsoft EXCEL计算均值、标准差和变异系数等。
五、检测结果
同等给药剂量下，药物在体内的暴露量(AUC)如下：
表15
Figure BDA0003356582340000231
根据上述药代动力学结果可知，PEG10K-hKLK1低糖基化在静脉注射和皮下注射两种给药方式下，其药代曲线均显著优于高糖基化蛋白修饰物PEG5K-hKLK1高糖基化，显示出了更长的药物半衰期。另外，同一种候选分子静脉注射的药物暴露量显著高于皮下注射方式。
实施例9 hKLK1高、低糖基化蛋白PEG修饰产物在大鼠体内免疫原性比较
一、分组
根据实验第一天测定的SD大鼠体重，按体重随机分组分为2组：PEG5K-hKLK1高糖基化组、PEG10K-hKLK1低糖基化组，每组12只，雌雄各半，染色编号。
二、给药
给药途径：静脉注射。
给药频率：每周给药1次，给药8次。
给药剂量：给药浓度均为0.2mg/mL，给药剂量均为0.5mg/kg。
三、血样采集
检测时间：分别于0min(给药前)、给药后第3天、第7天，各采血1次；恢复期每周采血1次，恢复期为2周；每次采约500μL全血，静置2h后，3000rpm，离心10min，分离血清，用于免疫原性的测定。
四、免疫原性检测
1)包被：将包被抗原(PEG修饰的hKLK1)工作液加入微孔板，100uL/孔，2-8℃孵育过夜；
2)封闭：弃孔内液体，洗板3次，甩干，加入封闭液(含有2％BSA和0.05％Tween20的20mM PBS)，200uL/孔，37℃孵育约2h；
3)样本处理：所有样本用封闭液10倍稀释；
4)加样：弃去酶标孔内液体，甩干，每孔加入处理后样本(动物血清)，100uL/孔，37℃ 200rpm震荡孵育约2h；
5)加入检测抗原工作液：弃去酶标孔内液体，洗板3次，甩干，筛选试验的酶标板中每孔加入100uL/孔的检测抗原工作液(使用封闭液将检测抗原1000倍稀释制备成检测抗原工作液)，确证试验的酶标板中每孔加入100uL/孔的确证分析检测抗原工作液(使用封闭液将检测抗原1000倍稀释制备成稀释液，上述稀释液按照200μg/ml的浓度稀释包被抗原作为确证分析检测抗原工作液)，37℃ 200rpm震荡孵育约1h；
6)加入信号放大检测物工作液(使用封闭液将信号放大检测物按照1/20000倍稀释成信号放大检测工作液)：弃去酶标孔内液体，洗板3次，甩干，加入信号放大检测物工作液100uL/孔，37℃ 200rpm震荡孵育约1h；
7)显色：弃孔内液体，洗板3次，甩干，每孔加入显色液100uL，37℃避光放置15min；
8)终止：加入终止液100uL/孔，终止反应，立即在酶标仪上测定450nm处的OD值。
五、检测结果
图16、17的免疫原性评价结果表明，PEG-hKLK1低糖基化组在12只动物的血清中均未检测出抗药抗体(ADA)，而PEG-hKLK1高糖基化组在12只动物中有2只动物检测到了较高的ADA值。说明低糖基化蛋白修饰物的免疫原性更低。
实施例10注射用尤瑞克林与胰激肽原酶注射液的体内药效比较
一、模型制备
SD大鼠，雄性，SPF级，体重270～300g。采用大脑中动脉线栓法制备大脑中动脉阻塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)脑缺血再灌注模型。动物用异氟烷麻醉，仰卧位固定，消毒皮肤，颈部正中切开，分离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，轻轻剥离迷走神经，结扎并剪断颈外动脉。夹闭颈总动脉近心端，从颈外动脉的结扎线的远端作一切口，插入的MCAO线栓(型号2438-A5，购自北京西浓科技有限公司)，经过颈总动脉分叉进入颈内动脉，然后徐徐插入至有轻微阻力为止(自分叉处约20mm)，阻断大脑中动脉的血供，缝合颈部皮肤，消毒，放回笼中。缺血90min后，再次将大鼠诱导麻醉，固定在鼠板上，剪开颈部皮肤，找到线栓将其轻轻拔出，恢复血供进行再灌注，缝合颈部皮肤，消毒，放回笼中饲养。
分组：共设4个组，即假手术组、模型组、胰激肽原酶注射液组(0.080mg/kg，肌肉注射，胰激肽原酶注射液是PEG10K修饰的猪胰脏提取KLK1b，详见CN201611129081.0、CN201710699360.9)、尤瑞克林组(0.020mg/kg，静脉注射)。给药组在再灌注2h后给药。
二、神经缺陷症状评价
用改良Bederson 5分制法进行神经缺陷症状评价。
Figure BDA0003356582340000251
三、脑梗死体积的测定
动物用10％的水合氯醛麻醉，断头取脑，去除嗅球、小脑和低位脑干，用生理盐水冲洗大脑表面血迹，吸去表面残留水迹，于-80℃放置7min，取出后立即于视线交叉平面垂直向下作冠状切面，并向后每隔2mm切一片，将脑片置于用生理盐水新鲜配制的TTC(20g/L)染液中于37℃温育90min，正常脑组织染成深红色，缺血脑组织则呈苍白色，用生理盐水冲洗后，迅速将脑片从前向后按顺序排列，吸干表面残留水迹，拍照。用图像分析软件(ImageTool)对照片进行统计，圈定右侧缺血面积(白色区域)和右侧面积，脑梗死面积％＝缺血总面积÷左侧总面积×100。
四、结果
1、受试物对神经缺陷症状的影响
如图18和下表16所示，尤瑞克林组(F7,87＝20.80，P＝0.018)与模型组相比，对神经缺陷症状有显著的改善作用；胰激肽原酶注射液组(F7，87＝20.80，P＝0.021)与模型组相比，对神经缺陷症状有显著的改善作用。
表16受试物对神经缺陷症状的影响
组别 总动物(只) 死亡(只) 舍弃(只) 样本(只) 神经缺陷症状评分
假手术组 8 0 0 8 0.00±0.00
模型组 21 9 0 12 2.92±0.15
尤瑞克林组 21 8 0 13 1.92±0.21*
胰激肽原酶注射液组 21 8 1 12 1.92±0.15**
均值±标准误。*P<0.05，与模型组比较。
2、受试物对脑梗死面积(％)的影响
如图19、20、21和下表17所示，尤瑞克林组(F7,87＝12.72，P＝0.042)、胰激肽原酶注射液组(F7,87＝12.72，P＝0.019)与模型组相比，对脑梗死面积有显著的改善作用。
表17受试物对脑梗死面积(％)的影响
组别 总动物(只) 死亡(只) 舍弃(只) 样本(只) 脑梗死面积(％)
假手术组 8 0 0 8 0.00±0.00
模型组 21 9 0 12 39.71±2.30
尤瑞克林组 21 8 0 13 22.74±3.71*
胰激肽原酶注射液组 21 8 1 12 21.05±3.01*
均值±标准误。*P<0.05，与模型组比较。
3、受试物对累积死亡率(％)的影响
如下表18所示，除假手术组外，其他各组均有动物死亡，死亡率间无组间差异。尤瑞克林组(F1,28＝0.18，P＝0.6746)、胰激肽原酶注射液组(F1,28＝0.18，P＝0.6753)与模型组相比，无统计学差异。
表18受试物对累积死亡率(％)的影响
组别 D0 D1 D5
假手术组 0.00 0.00 0.00
模型组 0.00 23.81 42.86
尤瑞克林组 0.00 23.81 38.10
胰激肽原酶注射液组 0.00 23.81 38.10
4、结论
缺血再灌注后给予受试物治疗时，与模型组相比，受试物尤瑞克林、注射用胰激肽原酶均有较显著的脑保护作用。
实施例11未突变高糖基化hKLK1的PEG10K修饰产物体内活性评价一、模型制备、神经缺陷症状评价、脑梗死体积的测定方法同实施例10。
分组及给药：共设4个组，即假手术组、模型组、阳性药组(注射用胰激肽原酶，0.080mg/kg，肌肉注射)，PEG10K-hKLK1高糖基化组(0.017mg/kg，静脉注射)，给药组在再灌注2h后给药。
二、结果
1、受试物对神经缺陷症状的影响
如图22和下表19所示，受试物PEG10K-hKLK1高糖基化组(F3,43＝63.32，P＝0.352)与模型组相比，对神经缺陷症状有一定的改善作用，但无统计学差异；阳性药组(F3,44＝56.34，P＝0.006)与模型组相比，对神经缺陷症状有显著的改善作用。
表19受试物对神经缺陷症状的影响
组别 总动物(只) 死亡(只) 舍弃(只) 样本(只) 神经缺陷症状评分
假手术组 8 0 0 8 0.00±0.00
模型组 21 8 0 13 3.15±0.15
阳性药组 21 7 1 13 2.23±0.17*
PEG10K-hKLK1高糖基化组 21 7 1 13 2.77±0.17
均值±标准误。*P<0.05，与模型组比较。
2、受试物对脑梗死面积(％)的影响
如图23、24、25和下表20所示，PEG10K-hKLK1高糖基化组(F3,43＝37.72，P＝0.197)与模型组相比，对脑梗死面积有一定的改善作用，但无显著性差异；阳性药组(F3,44＝34.58，P＝0.007)与模型组相比，对脑梗死面积有显著的改善作用。
表20受试物对脑梗死面积(％)的影响
组别 总动物(只) 死亡(只) 舍弃(只) 样本(只) 脑梗死面积(％)
假手术组 8 0 0 8 0.00±0.00
模型组 21 8 0 13 44.76±2.46
阳性药组 21 7 1 13 29.42±2.91*
PEG10K-hKLK1高糖基化组 21 7 1 13 36.40±3.35
均值±标准误。*P<0.05，与模型组比较。
3、受试物对累积死亡率(％)的影响
如下表21所示，除假手术组外，其他各组均有动物死亡，死亡率间无组间差异。阳性药组(F1,6＝0.00，P＝1.0000)、PEG10K-hKLK1高糖基化组(F1,6＝0.00，P＝1.0000)与模型组相比，无统计学差异。
表21受试物对累积死亡率(％)的影响
组别 D1 D2
假手术组 0.0 0.0
模型组 17.39 34.78
阳性药组 21.74 30.43
PEG10K-hKLK1高糖基化组 21.74 30.43
4、结论
缺血再灌注后给予受试物治疗时，与模型组相比，受试物PEG10K-hKLK1高糖基化均仅有改善症状的趋势，但无统计学差异。
实施例12未突变低糖基化hKLK1不同PEG修饰产物体内活性评价
一、模型制备、神经缺陷症状评价、脑梗死体积的测定方法
同实施例10。
分组及给药：共设7个组，即假手术组、模型组、阳性药组(注射用胰激肽原酶，0.080mg/kg，肌肉注射，注射用胰激肽原酶是PEG10K修饰的猪胰脏提取KLK1b，详见CN201611129081.0、CN201710699360.9)，PEG40K-hKLK1低糖基化组(0.030mg/kg)、PEG30K-hKLK1低糖基化组(0.036mg/kg)、PEG10K-hKLK1低糖基化蛋白组(0.017mg/kg)、PEG5K-hKLK1低糖基化组(0.018mg/kg)，给药组在再灌注2h后静脉注射给药。各给药组给药剂量按照样品比活性折算，每千克给入相同活性单位的PEG-KLK1修饰物。
二、结果
1、受试物对神经缺陷症状的影响
如图26和下表22所示，PEG40K-hKLK1低糖基化组(F3,44＝46.28，P＝0.209)、PEG30K-hKLK1低糖基化组(F3,43＝53.33，P＝0.242)、PEG5K-hKLK1低糖基化组(F3,44＝46.28，P＝0.209)与模型组相比，对神经缺陷症状有一定的改善作用，但无统计学差异；PEG10K-hKLK1低糖基化组(F3,45＝46.43，P＝0.008)、阳性药组(F3,45＝46.43，P＝0.003)与模型组相比，对神经缺陷症状有显著的改善作用。
表22受试物对神经缺陷症状的影响
组别 总动物(只) 死亡(只) 舍弃(只) 样本(只) 神经缺陷症状评分
假手术组 8 0 0 8 0.00±0.00
模型组 21 8 0 13 3.08±0.14
阳性药组 21 7 1 13 2.15±0.22*
PEG40K-hKLK1低糖基化组 21 7 0 14 2.57±0.17
PEG30K-hKLK1低糖基化组 21 8 0 13 2.62±0.14
PEG10K-hKLK1低糖基化组 21 6 0 15 2.27±0.15*
PEG5K-hKLK1低糖基化组 21 7 0 14 2.57±0.17
均值±标准误。*P<0.05，与模型组比较。
2、受试物对脑梗死面积(％)的影响
如图27、28、29和下表23所示，PEG40K-hKLK1低糖基化组(F3,44＝37.73，P＝0.446)、PEG30K-hKLK1低糖基化组(F3,43＝36.56，P＝0.502)、PEG5K-hKLK1低糖基化组(F3,44＝39.05，P＝0.218)与模型组相比，对脑梗死面积有一定的改善作用，但无显著性差异；PEG10K-hKLK1低糖基化组(F3,45＝39.30，P＝0.001)、阳性药组(F3,45＝39.30，P＝0.001)与模型组相比，对脑梗死面积有显著的改善作用。
表23受试物对脑梗死面积(％)的影响
组别 总动物(只) 死亡(只) 舍弃(只) 样本(只) 脑梗死面积(％)
假手术组 8 0 0 8 0.00±0.00
模型组 21 8 0 13 42.41±2.26
阳性药组 21 7 1 13 27.36±3.29*
PEG40K-hKLK1低糖基化组 21 7 0 14 36.48±2.72
PEG30K-hKLK1低糖基化组 21 8 0 13 36.66±2.97
PEG10K-hKLK1低糖基化组 21 6 0 15 27.72±2.09*
PEG5K-hKLK1低糖基化组 21 7 0 14 34.92±2.47
均值±标准误。*P<0.05，与模型组比较。
3、受试物对累积死亡率(％)的影响
如下表24所示，除假手术组外，其他各组均有动物死亡，死亡率间无组间差异。阳性药组(F1,3＝0.15，P＝0.7239)、PEG40K-hKLK1低糖基化组(F1,3＝0.17，P＝0.7100)、PEG30K-hKLK1低糖基化组(F1,3＝0.17，P＝0.7106)、PEG10K-hKLK1低糖基化组(F1,3＝0.15，P＝0.7239)、PEG5K-hKLK1低糖基化组(F1,3＝0.00，P＝0.9994)与模型组相比，无统计学差异。
表24受试物对累积死亡率(％)的影响
Figure BDA0003356582340000301
Figure BDA0003356582340000311
4、结论
结果表明：对于未突变低糖基化hKLK1，PEG10K-hKLK1低糖基化在动物体内模型中显示出显著的脑保护药效，PEG5K-hKLK1低糖基化、PEG40K-hKLK1低糖基化、PEG30K-hKLK1低糖基化均有改善症状的趋势。同时体内药效结果与体外药效也具有一定对应性，PEG10K修饰低糖基化hKLK1体外活性高于PEG-5K修饰低糖基化hKLK1，并高于PEG30K/40K修饰低糖基化hKLK1。
综合实施例11、12结果，给药剂量相同的情况下，PEG10K-hKLK1高糖基化药效作用不及PEG10K-hKLK1低糖基化样品。分析结果可认为，相同PEG修饰条件下，未突变低糖基化样品优于高糖基化样品。
实施例13 hKLK1突变体不同PEG修饰产物体内活性评价
一、模型制备、神经缺陷症状评价、脑梗死体积的测定方法同实施例10。
分组：共设4个组，即假手术组、模型组、PEG5K-hKLK1X1组(0.018mg/kg)、PEG10K-hKLK1X1组(0.014mg/kg)。给药组在再灌注2h后给药。按照比活性折算，每千克给入与实施例9相同活性单位的PEG-KLK1修饰物。
二、结果
1、受试物对神经缺陷症状的影响
如图30和下表25所示，PEG5K-hKLK1X1组(F2,38＝67.13，P＝0.017)与模型组相比，对神经缺陷症状有显著的改善作用；PEG10K-hKLK1X1组(F2,37＝86.65，P＝0.003)与模型组相比，对神经缺陷症状有极显著的改善作用。
表25受试物对神经缺陷症状的影响
Figure BDA0003356582340000312
Figure BDA0003356582340000321
均值±标准误。*P<0.05，**P<0.01，与模型组比较。
2、受试物对脑梗死面积(％)的影响
如图31、32、33和下表26所示，PEG5K-hKLK1X1组(F2,38＝39.50，P＝0.001)、PEG10K-hKLK1X1组(F2,37＝90.50，P＝0.000)与模型组相比，对脑梗死面积有显著的改善作用。
表26受试物对脑梗死面积(％)的影响
组别 总动物(只) 死亡(只) 舍弃(只) 样本(只) 脑梗死面积(％)
假手术组 8 0 0 8 0.00±0.00
模型组 18 2 0 16 38.73±1.99
PEG5K-hKLK1X1组 18 1 0 17 23.60±3.28**
PEG10K-hKLK1X1组 18 2 0 16 22.92±1.71***
均值±标准误。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001与模型组比较。
3、受试物对累积死亡率(％)的影响
如下表27所示，除假手术组外，其他各组均有动物死亡，死亡率间无组间差异。PEG5K-hKLK1X1组(F1,5＝0.71，P＝0.4369)、PEG10K-hKLK1X1组(F1,5＝0.00，P＝1.0000)与模型组相比，无统计学差异。
表27受试物对累积死亡率(％)的影响
组别 D0 D1
假手术组 0.0 0.0
模型组 0.00 11.11
PEG5K-hKLK1X1组 0.00 5.56
PEG10K-hKLK1X1组 0.00 11.11
4、结论
缺血再灌注后给予受试物治疗时，与模型组相比，受试物PEG5K-hKLK1X1、PEG10K-hKLK1X1均有较显著的脑保护作用。
综合实施例12与实施例13，PEG-hKLK1(未突变)/hKLK1X(突变体)体内药效结论表明：
表28
Figure BDA0003356582340000331
可见，hKLK1蛋白经N141位点突变后，采用相同PEG修饰剂制备的药物分子的药效较突变前有明显优势，蛋白突变后性能更优，能获得更好的体内治疗效果。
综合实施例10～13中具备体内药效作用的药物结果：
表29
Figure BDA0003356582340000332
*注射用胰激肽原酶为肌肉注射给药，其余样品均为静脉注射给药
可见，相同修饰剂修饰，未突变的hKLK1低糖基化药效优于未突变的hKLK1高糖基化；hKLK1蛋白经N141位点突变后，采用PEG10K修饰剂制备的药物分子由于其较优的酶活性，在较低给药剂量下即具有明显药效优势。
江苏江苏江苏序列表
<110> 江苏众红生物工程创药研究院有限公司
<120> 低糖基化修饰的激肽原酶及其聚乙二醇修饰物和应用
<130> 2021-11-04
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 1
Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu Gln His Ser Gln Pro Trp Gln Ala
1 5 10 15
Ala Leu Tyr His Phe Ser Thr Phe Gln Cys Gly Gly Ile Leu Val His
20 25 30
Arg Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Ile Ser Asp Asn Tyr Gln
35 40 45
Leu Trp Leu Gly Arg His Asn Leu Phe Asp Asp Glu Asn Thr Ala Gln
50 55 60
Phe Val His Val Ser Glu Ser Phe Pro His Pro Gly Phe Asn Met Ser
65 70 75 80
Leu Leu Glu Asn His Thr Arg Gln Ala Asp Glu Asp Tyr Ser His Asp
85 90 95
Leu Met Leu Leu Arg Leu Thr Glu Pro Ala Asp Thr Ile Thr Asp Ala
100 105 110
Val Lys Val Val Glu Leu Pro Thr Gln Glu Pro Glu Val Gly Ser Thr
115 120 125
Cys Leu Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile Glu Pro Glu Asn Phe Ser Phe
130 135 140
Pro Asp Asp Leu Gln Cys Val Asp Leu Lys Ile Leu Pro Asn Asp Glu
145 150 155 160
Cys Lys Lys Ala His Val Gln Lys Val Thr Asp Phe Met Leu Cys Val
165 170 175
Gly His Leu Glu Gly Gly Lys Asp Thr Cys Val Gly Asp Ser Gly Gly
180 185 190
Pro Leu Met Cys Asp Gly Val Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Tyr
195 200 205
Val Pro Cys Gly Thr Pro Asn Lys Pro Ser Val Ala Val Arg Val Leu
210 215 220
Ser Tyr Val Lys Trp Ile Glu Asp Thr Ile Ala Glu Asn Ser
225 230 235
<210> 2
<211> 789
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
atgtggttcc tggtgctgtg cctggccctg agcctgggcg gcaccggcgc cgccccccct 60
atccagtcca ggatcgtcgg gggttgggag tgtgaacagc atagtcagcc ctggcaggcc 120
gctctgtacc acttctccac ctttcagtgc ggcggaatcc tggtgcacag gcagtgggtc 180
ctgacagcag cccattgtat tagcgataac tatcagctgt ggctgggccg gcataacctg 240
ttcgacgatg agaataccgc ccagtttgtg cacgtctcag aatccttccc ccatcctggc 300
ttcaacatga gtctgctgga gaatcacacc aggcaggctg acgaagatta ctcacatgac 360
ctgatgctgc tgcgactgac agagccagca gacactatca ccgatgctgt gaaggtggtc 420
gagctgccca cacaggaacc tgaagtgggc tctacttgcc tggcaagcgg atggggttct 480
atcgagcctg aaaacttcag ttttccagac gatctgcagt gcgtggacct gaagattctg 540
cctaatgatg agtgtaagaa agctcacgtc cagaaagtga ctgattttat gctgtgcgtg 600
gggcatctgg agggaggcaa ggacacctgc gtcggcgact ccggaggacc tctgatgtgt 660
gacggggtgc tgcagggtgt cactagctgg ggctacgtgc catgtggaac cccaaataag 720
ccctccgtgg ccgtcagagt gctgagctat gtgaaatgga tcgaggacac cattgctgaa 780
aacagttga 789
<210> 3
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 3
Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu Gln His Ser Gln Pro Trp Gln Ala
1 5 10 15
Ala Leu Tyr His Phe Ser Thr Phe Gln Cys Gly Gly Ile Leu Val His
20 25 30
Arg Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Ile Ser Asp Asn Tyr Gln
35 40 45
Leu Trp Leu Gly Arg His Asn Leu Phe Asp Asp Glu Asn Thr Ala Gln
50 55 60
Phe Val His Val Ser Glu Ser Phe Pro His Pro Gly Phe Asn Met Ser
65 70 75 80
Leu Leu Glu Asn His Thr Arg Gln Ala Asp Glu Asp Tyr Ser His Asp
85 90 95
Leu Met Leu Leu Arg Leu Thr Glu Pro Ala Asp Thr Ile Thr Asp Ala
100 105 110
Val Lys Val Val Glu Leu Pro Thr Gln Glu Pro Glu Val Gly Ser Thr
115 120 125
Cys Leu Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile Glu Pro Glu Gln Phe Ser Phe
130 135 140
Pro Asp Asp Leu Gln Cys Val Asp Leu Lys Ile Leu Pro Asn Asp Glu
145 150 155 160
Cys Lys Lys Ala His Val Gln Lys Val Thr Asp Phe Met Leu Cys Val
165 170 175
Gly His Leu Glu Gly Gly Lys Asp Thr Cys Val Gly Asp Ser Gly Gly
180 185 190
Pro Leu Met Cys Asp Gly Val Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Tyr
195 200 205
Val Pro Cys Gly Thr Pro Asn Lys Pro Ser Val Ala Val Arg Val Leu
210 215 220
Ser Tyr Val Lys Trp Ile Glu Asp Thr Ile Ala Glu Asn Ser
225 230 235
<210> 4
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 4
Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu Gln His Ser Gln Pro Trp Gln Ala
1 5 10 15
Ala Leu Tyr His Phe Ser Thr Phe Gln Cys Gly Gly Ile Leu Val His
20 25 30
Arg Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Ile Ser Asp Asn Tyr Gln
35 40 45
Leu Trp Leu Gly Arg His Asn Leu Phe Asp Asp Glu Asn Thr Ala Gln
50 55 60
Phe Val His Val Ser Glu Ser Phe Pro His Pro Gly Phe Asn Met Ser
65 70 75 80
Leu Leu Glu Asn His Thr Arg Gln Ala Asp Glu Asp Tyr Ser His Asp
85 90 95
Leu Met Leu Leu Arg Leu Thr Glu Pro Ala Asp Thr Ile Thr Asp Ala
100 105 110
Val Lys Val Val Glu Leu Pro Thr Gln Glu Pro Glu Val Gly Ser Thr
115 120 125
Cys Leu Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile Glu Pro Glu Asp Phe Ser Phe
130 135 140
Pro Asp Asp Leu Gln Cys Val Asp Leu Lys Ile Leu Pro Asn Asp Glu
145 150 155 160
Cys Lys Lys Ala His Val Gln Lys Val Thr Asp Phe Met Leu Cys Val
165 170 175
Gly His Leu Glu Gly Gly Lys Asp Thr Cys Val Gly Asp Ser Gly Gly
180 185 190
Pro Leu Met Cys Asp Gly Val Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Tyr
195 200 205
Val Pro Cys Gly Thr Pro Asn Lys Pro Ser Val Ala Val Arg Val Leu
210 215 220
Ser Tyr Val Lys Trp Ile Glu Asp Thr Ile Ala Glu Asn Ser
225 230 235
<210> 5
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 5
Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu Gln His Ser Gln Pro Trp Gln Ala
1 5 10 15
Ala Leu Tyr His Phe Ser Thr Phe Gln Cys Gly Gly Ile Leu Val His
20 25 30
Arg Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Ile Ser Asp Asn Tyr Gln
35 40 45
Leu Trp Leu Gly Arg His Asn Leu Phe Asp Asp Glu Asn Thr Ala Gln
50 55 60
Phe Val His Val Ser Glu Ser Phe Pro His Pro Gly Phe Asn Met Ser
65 70 75 80
Leu Leu Glu Asn His Thr Arg Gln Ala Asp Glu Asp Tyr Ser His Asp
85 90 95
Leu Met Leu Leu Arg Leu Thr Glu Pro Ala Asp Thr Ile Thr Asp Ala
100 105 110
Val Lys Val Val Glu Leu Pro Thr Gln Glu Pro Glu Val Gly Ser Thr
115 120 125
Cys Leu Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile Glu Pro Glu Arg Phe Ser Phe
130 135 140
Pro Asp Asp Leu Gln Cys Val Asp Leu Lys Ile Leu Pro Asn Asp Glu
145 150 155 160
Cys Lys Lys Ala His Val Gln Lys Val Thr Asp Phe Met Leu Cys Val
165 170 175
Gly His Leu Glu Gly Gly Lys Asp Thr Cys Val Gly Asp Ser Gly Gly
180 185 190
Pro Leu Met Cys Asp Gly Val Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Tyr
195 200 205
Val Pro Cys Gly Thr Pro Asn Lys Pro Ser Val Ala Val Arg Val Leu
210 215 220
Ser Tyr Val Lys Trp Ile Glu Asp Thr Ile Ala Glu Asn Ser
225 230 235
<210> 6
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 6
Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu Gln His Ser Gln Pro Trp Gln Ala
1 5 10 15
Ala Leu Tyr His Phe Ser Thr Phe Gln Cys Gly Gly Ile Leu Val His
20 25 30
Arg Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Ile Ser Asp Asn Tyr Gln
35 40 45
Leu Trp Leu Gly Arg His Asn Leu Phe Asp Asp Glu Asn Thr Ala Gln
50 55 60
Phe Val His Val Ser Glu Ser Phe Pro His Pro Gly Phe Asn Met Ser
65 70 75 80
Leu Leu Glu Asn His Thr Arg Gln Ala Asp Glu Asp Tyr Ser His Asp
85 90 95
Leu Met Leu Leu Arg Leu Thr Glu Pro Ala Asp Thr Ile Thr Asp Ala
100 105 110
Val Lys Val Val Glu Leu Pro Thr Gln Glu Pro Glu Val Gly Ser Thr
115 120 125
Cys Leu Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile Glu Pro Glu Ala Phe Ser Phe
130 135 140
Pro Asp Asp Leu Gln Cys Val Asp Leu Lys Ile Leu Pro Asn Asp Glu
145 150 155 160
Cys Lys Lys Ala His Val Gln Lys Val Thr Asp Phe Met Leu Cys Val
165 170 175
Gly His Leu Glu Gly Gly Lys Asp Thr Cys Val Gly Asp Ser Gly Gly
180 185 190
Pro Leu Met Cys Asp Gly Val Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Tyr
195 200 205
Val Pro Cys Gly Thr Pro Asn Lys Pro Ser Val Ala Val Arg Val Leu
210 215 220
Ser Tyr Val Lys Trp Ile Glu Asp Thr Ile Ala Glu Asn Ser
225 230 235

Claims (17)

1.低糖基化修饰的激肽原酶或其衍生物，该激肽原酶是灵长类动物激肽原酶，含有天然激肽原酶NMS、NHT和NFS序列处的三个N糖基化修饰位点，其中NFS处无糖基化修饰或仅有少量糖基化修饰，所述少量糖基化修饰是指该位点经糖基化修饰的比例≤10％、≤9％、≤8％、≤7％、≤6％、≤5％、≤4％、≤3％、≤2％、≤1％、≤0.5％或≤0.1％。
2.重组激肽原酶突变体或其衍生物，该激肽原酶是灵长类动物激肽原酶，该重组激肽原酶突变体或其衍生物有且仅有两个N糖基化修饰位点。
3.权利要求2所述的重组激肽原酶突变体或其衍生物，保留了天然激肽原酶氨基酸序列NMS、NHT处的N糖基化修饰位点，不含有存在于天然激肽原酶氨基酸序列NFS处的N糖基化修饰位点。
4.权利要求2所述的重组激肽原酶突变体或其衍生物，所述天然人激肽原酶氨基酸序列NFS处或第141位的天冬酰胺突变为其他任意氨基酸。
5.权利要求2所述的重组激肽原酶突变体或其衍生物，所述天然人激肽原酶氨基酸序列NFS处或第142位的苯丙氨酸突变为脯氨酸。
6.权利要求2所述的重组激肽原酶突变体或其衍生物，所述天然人激肽原酶氨基酸序列NFS处或第143位的丝氨酸突变为其他非苏氨酸的任意氨基酸。
7.权利要求4～6任一项所述的重组激肽原酶突变体或其衍生物，所述天然人激肽原酶氨基酸序列NFS处天冬酰胺、苯丙氨酸、丝氨酸中有一个氨基酸、两个氨基酸或三个氨基酸突变。
8.权利要求4所述的重组激肽原酶突变体或其衍生物，所述突变体是将天然人激肽原酶氨基酸序列NFS处或第141位氨基酸突变为中性极性氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸，脂肪族氨基酸。
9.权利要求8所述的重组激肽原酶突变体或其衍生物，所述突变体是将天然人激肽原酶氨基酸序列NFS处或第141位氨基酸突变为谷氨酰胺(Gln)、天冬氨酸(Asp)、精氨酸(Arg)或丙氨酸(Ala)。
10.权利要求9所述的重组激肽原酶突变体或其衍生物，所述突变体氨基酸序列如SEQID No：3、SEQ ID No：4、SEQ ID No：5或SEQ ID No：6所示。
11.权利要求2～6任一项所述的重组激肽原酶突变体或其衍生物，该激肽原酶是人激肽原酶，天然人激肽原酶氨基酸序列如Genbank登录号AAA59455.1、NP002248.1、AAA36136.1、AAP35917、AAU12569所示。
12.含有权利要求2～6任一项所述重组激肽原酶突变体或其衍生物的组合物。
13.权利要求2～6任一项所述重组激肽原酶突变体或其衍生物在制备急性缺血性脑卒中、周围神经病、视网膜病、眼底病、高血压、糖尿病肾病、IgA肾炎、慢性肾病的治疗、预防、愈后恢复、防止复发的药物中的应用。
14.聚乙二醇修饰剂修饰的激肽原酶，所述被聚乙二醇修饰的激肽原酶为权利要求1所述的激肽原酶或权利要求2～6任一项的重组激肽原酶突变体。
15.权利要求14所述的聚乙二醇修饰剂修饰的激肽原酶，所述聚乙二醇修饰剂是分子量5kDa-10kDa的直链聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸脂，结构通式如(1)所示，
Figure FDA0003356582330000021
其中n是105至225的整数。
16.权利要求14所述的聚乙二醇修饰剂修饰的激肽原酶，所述聚乙二醇修饰剂是分子量30kDa-40kDa的分支型聚乙二醇丙醛，结构通式如(2)所示，
Figure FDA0003356582330000022
其中m是335至455的整数。
17.权利要求14～16任一项所述聚乙二醇修饰剂修饰的激肽原酶在制备治疗急性缺血性脑卒中、周围神经病、视网膜病、眼底病、高血压、糖尿病肾病、IgA肾炎，慢性肾病的治疗、预防、愈后恢复、防止复发的药物中的应用。
CN202111353294.2A 2021-11-16 2021-11-16 低糖基化修饰的激肽原酶及其聚乙二醇修饰物和应用 Pending CN116135973A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111353294.2A CN116135973A (zh) 2021-11-16 2021-11-16 低糖基化修饰的激肽原酶及其聚乙二醇修饰物和应用
PCT/CN2022/132102 WO2023088272A1 (zh) 2021-11-16 2022-11-16 低糖基化修饰的激肽释放酶i及其聚乙二醇修饰物和药物应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111353294.2A CN116135973A (zh) 2021-11-16 2021-11-16 低糖基化修饰的激肽原酶及其聚乙二醇修饰物和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116135973A true CN116135973A (zh) 2023-05-19

Family

ID=86334031

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111353294.2A Pending CN116135973A (zh) 2021-11-16 2021-11-16 低糖基化修饰的激肽原酶及其聚乙二醇修饰物和应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN116135973A (zh)
WO (1) WO2023088272A1 (zh)

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101134952B (zh) * 2007-07-02 2011-02-09 广东天普生化医药股份有限公司 一种人尿激肽原酶及其制备方法
WO2009039704A1 (fr) * 2007-09-27 2009-04-02 Shanghai Wanxing Biopharmaceuticals, Co., Ltd. Procédé de fabrication de kallikréine 1 humaine
CA2880085C (en) * 2012-06-04 2021-09-07 Diamedica Inc. Human tissue kallikrein 1 glycosylation isoforms
CN109498815B (zh) * 2013-12-30 2022-07-22 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 重组人激肽释放酶的化学修饰物及其应用
CN107058269B (zh) * 2015-12-31 2020-03-31 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 药用激肽原酶及其制备方法和应用
CN107760661B (zh) * 2016-08-18 2020-10-27 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 药用激肽原酶的peg修饰物及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2023088272A1 (zh) 2023-05-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109498815B (zh) 重组人激肽释放酶的化学修饰物及其应用
US8883726B2 (en) Fibroblast growth factor 21 variants
KR101910124B1 (ko) 재조합 인간 이듀로네이트-2-설파타아제를 포함하는 조성물, 제제 및 이의 제조방법
CN102573917B (zh) 聚乙二醇化的l-天冬酰胺酶
CN100528235C (zh) 红细胞生成素共轭物
JP2001064300A (ja) エリスロポエチン誘導体
US8530417B2 (en) Y-shaped polyethylene glycol modified G-CSF, the preparation and use thereof
US10406235B2 (en) Use of multi-arm polyethylene glycol modifier and application of multi-arm polyethylene glycol modifier in L-asparaginasum modification
US20160060317A1 (en) Novel neurturin conjugates for pharmaceutical use
WO2016106941A1 (zh) 聚乙二醇定点修饰的门冬酰胺酶及其制备方法与应用
EP3439702B1 (en) Conjugated c1 esterase inhibitor and uses thereof
CN107760661A (zh) 药用激肽原酶的peg修饰物及其制备方法和应用
CN116135973A (zh) 低糖基化修饰的激肽原酶及其聚乙二醇修饰物和应用
CN111690635B (zh) 重组人奥克纤溶酶的制备方法
CN114450029A (zh) 治疗性缀合物
CN106749608A (zh) 干扰素α缀合物
WO2023143246A1 (zh) 激肽或其衍生物的聚乙二醇修饰物及其药物应用
CN111848776B (zh) 聚乙二醇修饰的rhBNP及其制备方法
WO2019006348A1 (en) IX-TRANSFERRIN FACTOR FUSION PROTEINS
KR20240029777A (ko) 재조합 영지버섯 면역 조절 단백질의 새로운 돌연변이체 및 이의 용도
MXPA01003867A (en) Methods and compositions for the prevention and treatment of anemia

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication