CN114450029A - 治疗性缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包含L‑天冬酰胺酶和水溶性聚合物的缀合物，其用于治疗先前已施用大肠杆菌衍生的L‑天冬酰胺酶的患者中通过L‑天冬酰胺耗尽可治疗的疾病。本发明还提供了治疗方法、包含所述缀合物的组合物，以及生产该缀合物的方法。

Description

治疗性缀合物
本发明涉及包含L-天冬酰胺酶和水溶性聚合物的缀合物，其用于治疗先前已施用大肠杆菌衍生的L-天冬酰胺酶的患者中通过L-天冬酰胺耗尽可治疗的疾病。本发明还涉及包含所述缀合物的组合物，以及生产该缀合物的方法。
多年来，L-天冬酰胺酶已成功用于治疗依赖于胞外L-天冬酰胺的癌症。L-天冬酰胺酶催化L-天冬酰胺水解为天冬氨酸和氨，并且认为它们的抗肿瘤活性通过耗尽循环L-天冬酰胺水平来实现，从而杀死依赖于胞外L-天冬酰胺进行蛋白质合成的肿瘤细胞。
L-天冬酰胺酶是治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)的必需组分，并且还用于治疗癌症，如急性髓细胞白血病、霍奇金病、急性骨髓单核细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、网状肉瘤、黑素肉瘤和淋巴肉瘤。
迄今为止，三种细菌来源的L-天冬酰胺酶制剂已被批准用于治疗ALL。这些包括天然大肠杆菌L-天冬酰胺酶、PEG化大肠杆菌L-天冬酰胺酶和天然菊欧文氏菌(Erwiniachrysanthemi)天冬酰胺酶。
天然大肠杆菌L-天冬酰胺酶(“EcASNase”)已经在欧洲以“L-天冬酰胺酶
Figure BDA0003553080600000011
”和
Figure BDA0003553080600000012
销售，并且在美国以
Figure BDA0003553080600000013
销售。在20世纪70年代，EcASNase被鉴定为用于治疗ALL的有效药物，并且其施用导致L-天冬酰胺的快速和强烈消耗。然而，用EcASNase治疗的许多患者显示出不期望的“明显”过敏症状，并且在大多数患者中观察到抗L-天冬酰胺酶抗体应答。抗L-天冬酰胺酶抗体可具有高度有害的治疗效果，因为它们可阻断L-天冬酰胺的酶活性并提高患者的L-天冬酰胺清除率。天然大肠杆菌L-天冬酰胺酶在美国不再被批准用于临床使用。
为了帮助减少与EcASNase相关的免疫学和药代动力学问题，将EcASNase与聚乙二醇(“PEG”)缀合。PEG是众所周知的水溶性聚合物，并且与PEG缀合是确立已久的用于改善蛋白质的药代动力学和免疫学性质的策略。众所周知的PEG化的优点包括改善的残留酶活性、改善的热稳定性、改善的pH稳定性、增加的对蛋白水解的抗性、增加的体内半衰期(t1/2)和降低的抗原性。与众所周知的PEG化的优点一致，与天然EcASNase相比，PEG化的EcASNase尤其显示出降低的抗原性和增加的t1/2。自2006年以来，PEG化的EcASNase已被批准用于儿童和成人ALL的一线治疗。PEG化的EcASNase在文献中经常被称为“培门冬酶”，并且以
Figure BDA0003553080600000021
销售。
Figure BDA0003553080600000022
是从大肠杆菌中纯化的大肠杆菌L-天冬酰胺酶，并在多个位点用5000Da PEG修饰。
对于ALL的治疗，
Figure BDA0003553080600000023
通常每14天以750IU(国际单位)/ml的注射/输注溶液给药。在年龄≤21岁的儿科患者中，推荐的计量通常为：(a)在体表面积(BSA)≥0.6m2的的患者中，2,500IU
Figure BDA0003553080600000024
(相当于3.3ml
Figure BDA0003553080600000025
)/m2体表面积；(b)在BSA<0.6m2的患者中，82.5IU
Figure BDA0003553080600000026
(相当于0.1ml Oncaspar)/kg体重。在年龄>21岁的患者中(除非另有规定)，
Figure BDA0003553080600000027
通常以每14天2,000IU(相当于2.67mL Oncaspar)/m2体表面积的剂量给药。
尽管相对于EcASNase有所改进，但
Figure BDA0003553080600000028
受到显著限制的阻碍。特别地，施用
Figure BDA0003553080600000029
通常与明显的过敏症状相关，特别是在先前已接受了
Figure BDA00035530806000000210
或EcASNase的患者中。主要的临床关注还有“沉默失活”现象，由此患者对
Figure BDA00035530806000000211
(或EcASNase)产生抗L-天冬酰胺酶抗体应答，但不显示明显的过敏症状。沉默失活的主要问题是患者面临持续给药
Figure BDA00035530806000000212
(或EcASNase)而没有获得治疗益处的风险。
天然菊欧文氏菌天冬酰胺酶(EwASNase)被批准用于已经对大肠杆菌L-天冬酰胺酶(通常为
Figure BDA00035530806000000213
)产生超敏反应的患者的ALL的二线或三线治疗。已经从菊欧文氏菌菌株NCPPB 1066纯化的EwASNase在美国以
Figure BDA00035530806000000214
销售，而在其他地方以
Figure BDA00035530806000000215
销售。EwASNase与EcASNase(天然或PEG化形式)具有最小的抗原交叉反应性，因此先前接受
Figure BDA00035530806000000216
(或EcASNase)的患者未被免疫引发以响应EwASNase。因此，EwASNase非常适合于持续治疗已对
Figure BDA00035530806000000217
(或EcASNase)产生超敏反应的患者，以及对
Figure BDA00035530806000000218
(或EcASNase)已产生抗-L-天冬酰胺酶抗体应答的患者。
Figure BDA00035530806000000219
通常以10,000IU/小瓶冻干物提供给用于注射的溶液。对于所有患者，通常的
Figure BDA00035530806000000220
剂量为6,000IU/m2体表面积(200IU/kg体重)。基于
Figure BDA00035530806000000221
的疗法可以根据方案进一步加强。
尽管具有免疫学优势，但EwASNase显示出比
Figure BDA00035530806000000222
(和EcASNase)更短的t1/2。为了帮助匹配
Figure BDA0003553080600000031
(和EcASNase)随时间提供的体内L-天冬酰胺酶活性，患者接受更短的EcASNase给药间隔。对于ALL的治疗，
Figure BDA0003553080600000032
通常每周施用三次，持续三周。
本领域中存在相当大的延长EwASNase的给药间隔的期望。Rau等，Pediatr BloodCancer.2013；2018；65:e26873认识到了这个期望，其指出：“欧文氏菌天冬酰胺酶已被证明是大肠杆菌PEG-天冬酰胺酶
Figure BDA0003553080600000033
的安全且有效的替代物”，以及“降低频率-给药方案将提供重要的益处”。
Rau等(2018)还指出：“因为它是一种大的细菌来源的蛋白质，暴露于天冬酰胺酶具有引发免疫应答的能力”，并且“具有降低的免疫原性潜力的制剂将提供重要的治疗益处”。
Rau等(2018)描述了儿童肿瘤组试验AALL1421的结果。这是“JZP-416”在患有ALL或淋巴母细胞淋巴瘤和对
Figure BDA0003553080600000034
超敏反应的儿科患者中的2期临床试验。
“JZP-416”是重组菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶(在大肠杆菌中表达)和5000Da PEG的缀合物。目前，“JZP-416”在本领域中也被称为
Figure BDA0003553080600000035
“AZP-02”和“mPEG-r-crisantaspase”，并且由Jazz Pharmaceuticals(先前的Alize Pharma II SAS)拥有。
不幸的是，儿童肿瘤组试验AALL1421是不成功的，因为四名患者中的三名“经历对[JZP-416]的超敏反应，表现为临床超敏反应或[血清天冬酰胺酶活性]的快速清除”(Rau等(2018))。
试验AALL1421的失败是出乎意料的，因为：
(a)从菊欧文氏菌菌株NCPPB 1066纯化的L-天冬酰胺酶
Figure BDA0003553080600000036
被批准用于对
Figure BDA0003553080600000037
产生超敏反应的患者；和
(b)PEG本身通常被认为是非免疫原性的。实际上，PEG化是众所周知的降低蛋白质免疫原性的策略(参见上文)。
为了解释试验AALL1421的失败，Rau等(2018)基于大肠杆菌L-天冬酰胺酶(在
Figure BDA0003553080600000038
中)的氨基酸序列不同于菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶(在JZP-416中)的氨基酸序列，评论了“在pegcrisantaspase[JZP-416]的L-天冬酰胺酶部分和培门冬酶
Figure BDA0003553080600000039
之间没有交叉反应性”。
相反，Rau等(2018)将儿童肿瘤组试验AALL 1421的失败归因于“预先存在的针对[JZP-416]的PEG部分的免疫原性”，并且他们的结论得到AALL 1421试验患者中预先存在的抗PEG IgG抗体的鉴定的支持。
最终，Rau等(2018)得出结论，“可能需要除PEG化之外的策略来优化培门冬酶超敏患者的欧文氏菌天冬酰胺酶治疗方案”。
因此，本领域需要一种L-天冬酰胺酶，其具有比
Figure BDA0003553080600000041
更长的给药间隔，并且适用于治疗已经对
Figure BDA0003553080600000042
(或EcASNase)产生超敏反应的患者。
本领域还需要一种L-天冬酰胺酶，其具有比
Figure BDA0003553080600000043
更长的给药间隔，并且适用于治疗已经对
Figure BDA0003553080600000044
(或EcASNase)产生抗L-天冬酰胺酶抗体应答但未显示明显过敏症状的患者。
本发明解决了对L-天冬酰胺酶的需求，所述L-天冬酰胺酶具有比
Figure BDA0003553080600000045
更长的给药间隔，并且适用于治疗已经对
Figure BDA0003553080600000046
(或EcASNase)超敏反应的患者。本发明还解决了对L-天冬酰胺酶的需求，所述L-天冬酰胺酶具有比
Figure BDA0003553080600000047
更长的给药间隔，并且适用于治疗已经对
Figure BDA0003553080600000048
(或EcASNase)产生抗L-天冬酰胺酶抗体应答但未显示明显过敏症状的患者。
本发明基于以下令人惊讶的发现：儿童肿瘤组试验AALL1421的失败不是由于Rau等(2018)得出结论的“预先存在的针对[JZP-416]的PEG部分的免疫原性”。相反，本发明人意外地发现，试验AALL1421的失败是由于预先存在的对来自大肠杆菌的宿主细胞蛋白(HCP)的免疫力，所述宿主细胞蛋白存在于
Figure BDA0003553080600000049
中并且也存在于JZP-416中。换句话说，本发明人认为先前的
Figure BDA00035530806000000410
给药具有在免疫学上“引发了”患者引发针对存在于大肠杆菌衍生的L-天冬酰胺酶制剂JZP-416中的大肠杆菌HCP的超敏免疫应答。
宿主细胞蛋白(HCP)是由宿主细胞表达的内源性蛋白，并且与由所述宿主细胞产生的治疗性产物无关。HCP构成生物药物中工艺相关杂质的主要组分，并且据报道HCP通常通过与治疗性产物本身相互作用而与治疗性产物共同纯化。
因此，本发明提供了包含L-天冬酰胺酶和水溶性聚合物的缀合物，其用于治疗患者中通过L-天冬酰胺耗尽可治疗的疾病，其中：
(a)L-天冬酰胺酶来自大肠杆菌以外的来源；
(b)L-天冬酰胺酶在大肠杆菌以外的宿主细胞中表达；和
(c)患者先前已经被给药大肠杆菌衍生的L-天冬酰胺酶。
本发明还提供了用于治疗患者中通过L-天冬酰胺耗尽可治疗的疾病的重组异源表达的L-天冬酰胺酶，其中：
(a)L-天冬酰胺酶来自大肠杆菌以外的来源；
(b)异源宿主细胞是大肠杆菌以外的宿主细胞；和
(c)患者先前已经被给药大肠杆菌衍生的L-天冬酰胺酶。
根据本发明，先前施用于患者的大肠杆菌来源的L-天冬酰胺酶通常是
Figure BDA0003553080600000051
通常，L-天冬酰胺酶在宿主细胞中重组表达(即，L-天冬酰胺酶是“重组L-天冬酰胺酶”)。
在一个实施方案中，宿主细胞是异源宿主细胞。
在一个实施方案中，L-天冬酰胺酶来自大肠杆菌以外的来源，并且从大肠杆菌以外的宿主细胞纯化(例如，从菊欧文氏菌纯化的天然菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶)。
本发明还提供了一种组合物，其包含根据本发明使用的缀合物和药学上可接受的赋形剂。
在一个实施方案中，本发明的缀合物包含重组异源表达的L-天冬酰胺酶(例如在假单胞菌属物种中表达的菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶)。
本发明还提供了一种组合物，其包含根据本发明使用的重组异源表达的L-天冬酰胺酶和药学上可接受的赋形剂。
通常，本发明的组合物基本上不含来自大肠杆菌的宿主细胞蛋白。优选，本发明的组合物不含来自大肠杆菌的宿主细胞蛋白。
本发明还提供了一种治疗在先前已经施用大肠杆菌衍生的L-天冬酰胺酶的患者中通过L-天冬酰胺耗尽可治疗的疾病的方法，所述方法包括给所述患者施用有效量的本发明的缀合物或组合物。
本发明提供了显著的和现实世界的治疗优势：
·本发明显著降低了先前用
Figure BDA0003553080600000052
(或EcASNase)治疗的患者的(进一步的)超敏反应的风险；
·选择用于本发明的L-天冬酰胺酶缀合物中的水溶性聚合物时，本发明为技术人员提供了增加的选择自由度。例如，技术人员可以享有由PEG化以及其他类型的水溶性聚合物提供的众所周知的免疫学和药代动力学优点；
·关键地，在鉴定了导致儿童肿瘤组试验AALL1421失败的关键抗原决定簇后，本发明的公开内容还将有助于避免将来给已经对
Figure BDA0003553080600000061
(或EcASNase)产生敏感性的癌症患者施用大肠杆菌来源的L-天冬酰胺酶。这又将有助于在已经脆弱的患者组中避免患者进一步遭受痛苦。
发明人首次确定了先前已经施用大肠杆菌衍生的L-天冬酰胺酶(例如
Figure BDA0003553080600000062
)的患者在免疫学上倾向于引发对源自大肠杆菌的L-天冬酰胺酶的超敏反应。
此外，先前已经施用大肠杆菌衍生的L-天冬酰胺酶(如
Figure BDA0003553080600000063
)的患者在免疫学上倾向于引发对源自大肠杆菌的L-天冬酰胺酶的超敏反应，无论随后施用的大肠杆菌衍生的L-天冬酰胺酶是否与另一部分(例如PEG)缀合。
如本文所用，术语“大肠杆菌衍生的L-天冬酰胺酶”是指在大肠杆菌中产生的L-天冬酰胺酶(通过重组或内源表达)。因此，根据本发明，术语“大肠杆菌衍生的L-天冬酰胺酶”包括：
(a)从大肠杆菌纯化的天然大肠杆菌L-天冬酰胺酶；
(b)在大肠杆菌中表达的重组L-天冬酰胺酶，无论L-天冬酰胺酶的来源或氨基酸序列如何(即，无论重组表达的L-天冬酰胺酶是否是大肠杆菌L-天冬酰胺酶，或重组表达的L-天冬酰胺酶是否来自大肠杆菌以外的来源，如来自菊欧文氏菌)；和
(c)包含上述(a)或(b)的组合物和/或缀合物。
在大肠杆菌中重组表达了JZP-416的菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶组分。因此，根据本发明，JZP-416是“大肠杆菌衍生的L-天冬酰胺酶”。
如本文所用，术语“来自大肠杆菌以外的来源的L-天冬酰胺酶”是指具有与大肠杆菌L-天冬酰胺酶的氨基酸序列不同的氨基酸序列的L-天冬酰胺酶(缀合的或未缀合的)。“大肠杆菌天冬酰胺酶”包括EcASNase和
Figure BDA0003553080600000064
以及SEQ ID NO:1的氨基酸序列。通常，来自大肠杆菌以外的来源的L-天冬酰胺酶与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有小于90％的序列同一性(例如与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有小于90％、小于85％、小于80％、小于75％的序列同一性)。
MEFFKKTALAALVMGFSGAALALPNITILATGGTIAGGGDSATKSNYTVGKVGVENLVNAVPQLKDIANVKGEQVVNIGSQDMNDNVWLTLAKKINTDCDKTDGFVITHGTDTMEETAYFLDLTVKCDKPVVMVGAMRPSTSMSADGPFNLYNAVVTAADKASANRGVLVVMNDTVLDGRDVTKTNTTDVATFKSVNYGPLGYIHNGKIDYQRTPARKHTSDTPFDVSKLNELPKVGIVYNYANASDLPAKALVDAGYDGIVSAGVGNGNLYKSVFDTLATAAKTGTAVVRSSRVPTGATTQDAEVDDAKYGFVASGTLNPQKARVLLQLALTQTKDPQQIQQIFNQY(SEQ ID NO:1)
因此，根据本发明，EwASNase和JZP-416是来自大肠杆菌以外的来源的L-天冬酰胺酶。EwASNase(和JZP-416)的氨基酸序列由SEQ ID NO:2提供。
ADKLPNIVILATGGTIAGSAATGTQTTGYKAGALGVDTLINAVPEVKKLANVKGEQFSNMASENMTGDVVLKLSQRVNELLARDDVDGVVITHGTDTVEESAYFLHLTVKSDKPVVFVAAMRPATAISADGPMNLLEAVRVAGDKQSRGRGVMVVLNDRIGSARYITKTNASTLDTFKANEEGYLGVIIGNRIYYQNRIDKLHTTRSVFDVRGLTSLPKVDILYGYQDDPEYLYDAAIQHGVKGIVYAGMGAGSVSVRGIAGMRKAMEKGVVVIRSTRTGNGIVPPDEELPGLVSDSLNPAHARILLMLALTRTSDPKVIQEYFHTY(SEQ ID NO:2)
本领域技术人员将理解术语“在大肠杆菌以外的宿主细胞中表达”包括内源表达和重组表达，视情况而定。
L-天冬酰胺酶是具有L-天冬酰胺氨基水解酶活性的酶。
L-天冬酰胺酶活性的一个国际单位(“IU”)定义为在37℃下每分钟催化释放1μmol氨的酶量。通常认为≥0.1IU/ml的血清L-天冬酰胺酶活性(SAA)水平将提供天冬酰胺的治疗性减少。
已经在多种不同来源的生物体(如细菌、植物和真菌)中鉴定了许多L-天冬酰胺酶。如上所述，大肠杆菌L-天冬酰胺酶和菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶是临床上批准用于治疗ALL的唯一L-天冬酰胺酶。
关于L-天冬酰胺酶的序列信息可通过在线数据库容易地获得，如https://www.ncbi.nlm.nih.gov/。来自菊欧文氏菌的L-天冬酰胺酶理想地适用于本发明。参考菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶氨基酸序列由SEQ ID NO:2提供。
在一个实施方案中，L-天冬酰胺酶与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80％同一性，例如与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性。
发明人认为来自菊欧文氏菌以外的来源的L-天冬酰胺酶(除了大肠杆菌衍生的L-天冬酰胺酶)也将提供表征本发明的有利技术效果。
例如，在一个实施方案中，L-天冬酰胺酶是恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)L-天冬酰胺酶。参考恶臭假单胞菌L-天冬酰胺酶序列由SEQ ID NO:3提供：
MIDHSSLPRLSIASLGGTVSMQAQAVGCGVTPTLDCEQQLLQVPQLRQMAQLNVASLCLVPSASLDFATLLDVLAWARCEVERGAQALVVSQGTDSLEESAYFLDLLWPFDAPLVMTGAMRSASQPGNDGPANLLAAAQVALAQGSCGRGVLVVMNDQVHRAARVRKTASMAIAAFESPGCGPLGEVVEGKVVYRHPPARGEVLPVPHRTDQRVALLEACLDADTALLQAVAPLGYEGLVIAGFGAGHVAASWSDVLEQLAPTLPVVVATRTGNGPTARATYGFAGAEIDLQKKGVYMAGHLCPRKCRILLWLLIGTDRRHELHDWLHA(SEQ ID NO:3)
在一个实施方案中，L-天冬酰胺酶与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少80％同一性，例如与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性。
在一个实施方案中，L-天冬酰胺酶是荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)L-天冬酰胺酶。参考荧光假单胞菌L-天冬酰胺酶序列由SEQ ID NO:4提供：
MQSANNVMVLYTGGTIGMQASANGLAPASGFEVRMREQFADADLPAWRFREMSPLIDSANMNPAYWQRLRSAVVEAVDAGCDAVLILHGTDTLAYSAAAMSFQLLGLPAPVVFTGSMLPAGVPDSDAWENVSGALTALAEGLEPGVHLYFHGALMAPTRCAKIRSFGRNPFAALQRKDDFARAETLPAALDYRQPKALANVGVLPLIPGFDAAQLDAIISSGIQGLVLECFGSGTGPSDNPQFLASLQRAQDQGVVVVAITQCHEGGVELDVYEAGSRLRGAGVLSGAGMTREAAFGKLHALLGAGLAVEEVRRLVELDLHTNPT(SEQ ID NO:4)
在一个实施方案中，L-天冬酰胺酶与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少80％同一性，例如与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性。
在一个实施方案中，L-天冬酰胺酶是产琥珀酸沃廉菌(Wolinella succinogenes)L-天冬酰胺酶。参考产琥珀酸沃廉菌L-天冬酰胺酶序列由SEQ ID NO:5提供：
MAKPQVTILATGGTIAGSGESSVKSSYSAGAVTVDKLLAAVPAINDLATIKGEQISSIGSQEMTGKVWLKLAKRVNELLAQKETEAVIITHGTDTMEETAFFLNLTVKSQKPVVLVGAMRSGSSMSADGPMNLYNAVNVAINKASTNKGVVIVMNDEIHAAREATKLNTTAVNAFASPNTGKIGTVYYGKVEYFTQSVRPHTLASEFDISKIEELPRVDILYAHPDDTDVLVNAALQAGAKGIIHAGMGNGNPFPLTQNALEKAAKSGVVVARSSRVGSGSTTQEAEVDDKKLGFVATESLNPQKARVLLMLALTKTSDREAIQKIFSTY(SEQ ID NO:5)
在一个实施方案中，L-天冬酰胺酶与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少80％同一性，例如与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性。
在一个实施方案中，缀合物包含L-天冬酰胺酶的片段，如SEQ ID NO:2、3、4或5的片段。在一个实施方案中，重组异源表达的L-天冬酰胺酶包含L-天冬酰胺酶的片段，如SEQID NO:2、3、4或5的片段。在一个实施方案中，片段包含参考L-天冬酰胺酶氨基酸序列的至少30个连续氨基酸，例如参考L-天冬酰胺酶氨基酸序列的至少30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310或更多个连续氨基酸。在一个实施方案中，参考L-天冬酰胺酶氨基酸序列是可在在线数据库上公开获得的天然L-天冬酰胺酶氨基酸序列。根据本发明，L-天冬酰胺酶的片段具有全长L-天冬酰胺酶的至少60％的体外活性，例如全长L-天冬酰胺酶的至少60％、70％、80％、90％、95％或100％的体外活性。
本发明的缀合物包含水溶性聚合物。
通常，与未缀合的L-天冬酰胺酶相比，水溶性聚合物提供扩大的流体动力学体积。众所周知，PEG化和PAS化提供扩大的流体动力学体积。流体动力学体积可以使用本领域任何合适的方法LAI评估，例如通过分析性尺寸排阻色谱法和动态光散射测量。不希望受理论束缚，发明人认为增加的流体动力学体积和相应增加的水屏蔽有助于增加体内t1/2，同时降低缀合的L-天冬酰胺酶的免疫原性。
在一个实施方案中，水溶性聚合物选自：(a)聚环氧烷；(b)聚氨基酸；和(c)多糖。
通常，水溶性聚合物是无毒的。
在一个实施方案中，水溶性聚合物包含PEG。在一个实施方案中，水溶性聚合物由PEG组成。PEG在本领域中是非常公知的，并且可以以各种不同的构型(通常是直链或支链(包括多臂))和各种不同的重量来利用。PEG重量通常在500Da至20000Da的范围内。PEG混合物是多分散的，但目前商业PEG混合物通常显示低的多分散性，多分散性指数(PDI)值接近1(例如PDI＝1.05、1.1、1.15或1.2)。在PEG重量的内容中使用时，术语“约”反映了这种多分散性。
在一个实施方案中，PEG的分子量小于约10000Da，例如小于约10000Da、小于约9000Da、小于约8000Da、小于约7000Da、小于约6000Da、小于约5000Da、小于约4000Da、小于约3000Da、小于约2000Da、小于约1000Da、小于约800Da。在一个实施方案中，PEG具有小于约5000Da的分子量。
在一个实施方案中，PEG具有约10000Da的分子量。在一个实施方案中，PEG具有约5000Da的分子量。在一个实施方案中，PEG包含线性5000Da PEG链。在一个实施方案中，PEG包含支链5000Da PEG链。
将PEG与蛋白质缀合的方法是本领域熟知的，并且通常涉及化学缀合。通常，PEG含有优先与蛋白质中的氨基酸反应的活化/官能化部分。通常基于蛋白质内的反应位点(例如赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和N-末端)的可用性来选择功能部分。在一个实施方案中，PEG含有活性酯，如琥珀酰亚胺酯。在一个实施方案中，PEG含有碳酸酯部分，如琥珀酰亚胺基碳酸酯。
许多同双官能化、异双官能化和单甲氧基封端的单官能化PEG是可商购的。在一个实施方案中，PEG是甲氧基PEG(mPEG)，如官能化mPEG。在一个实施方案中，PEG是羟基PEG(HO-PEG)，例如官能化HO-PEG。
在一个实施方案中，PEG与L-天冬酰胺酶的一个或多个氨基酸共价连接。在一个实施方案中，PEG通过酰胺键与L-天冬酰胺酶的一个或多个氨基酸共价连接。
在一个实施方案中，本发明的缀合物具有下式：
PEG-O-CO-NH-[L-天冬酰胺酶]
本发明的缀合物可包含多个PEG部分，如下式所示：
(PEG-O-CO-NH)n-[L-天冬酰胺酶]
其中n＝1-30，通常为5-15。
在一个实施方案中，水溶性聚合物包含PAS聚合物。在一个实施方案中，水溶性聚合物由PAS聚合物组成。PAS聚合物是包含脯氨酸(P)、丙氨酸(A)和丝氨酸(S)的构象无序多肽链。PAS聚合物显示出与PEG类似的生物物理性质，并且与PAS聚合物的缀合(“PAS化”)也在体内延长了t1/2并降低了缀合蛋白的免疫原性。
PAS化相对于PEG化的优点是PAS聚合物可以在重组表达期间与L-天冬酰胺酶融合。换句话说，L-天冬酰胺酶和PAS聚合物可表达为单个多肽。有利地，PAS化避免了需要单独的缀合步骤(如PEG化所需的)，从而简化了本发明缀合物的生产。因此，在一个实施方案中，本发明的缀合物包含L-天冬酰胺酶和表达为单个多肽链的PAS聚合物。
技术人员将意识到脯氨酸由密码子“CCU”、“CCC”、“CCA”和“CCG”编码；丙氨酸由密码子“GCU”、“GCC”、“GCA”和“GCG”编码；并且丝氨酸由密码子“UCU”、“UCC”、“UCA”、“UCG”、“AGU”和“AGC”编码。
在一个实施方案中，PAS聚合物中至少80％的氨基酸残基由脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸组成，例如PAS聚合物中至少80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的氨基酸残基选自脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸。
在一个实施方案中，PAS聚合物包含至少10个氨基酸残基，例如至少15、20、25或30个氨基酸残基。
在一个实施方案中，PAS聚合物包含10-60个氨基酸残基。在一个实施方案中，PAS聚合物包含15-50个氨基酸残基。在一个实施方案中，PAS聚合物包含20-40个氨基酸残基。在一个实施方案中，PAS聚合物包含20-30个氨基酸残基。
在一个实施方案中，PAS聚合物中至少80％的氨基酸残基由脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸组成，并且PAS聚合物包含10-60个氨基酸残基。
在一个实施方案中，PAS聚合物另外包含纯化标签。在一个实施方案中，纯化标签是His6-标签。在一个实施方案中，纯化标签是Strep-标签。
在一个实施方案中，PAS聚合物位于L-天冬酰胺酶的N-末端。在一个实施方案中，PAS聚合物位于L-天冬酰胺酶的C-末端。在一个实施方案中，PAS聚合物位于L-天冬酰胺酶的N-和C-末端。
在一个实施方案中，PAS聚合物和L-天冬酰胺酶通过接头连接。在一个实施方案中，间隔物是氨基酸接头。通常，接头包含多达约20-25个氨基酸残基。因此，在一个实施方案中，本发明的缀合物包含表达为单个多肽链的L-天冬酰胺酶、PAS聚合物和一个或多个接头。
本发明的L-天冬酰胺酶在大肠杆菌以外的宿主细胞中表达。
细菌属的合适宿主细胞包括但不限于欧文氏菌属(Erwinia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)和链霉菌属(Streptomyces)的细胞。细菌物种的合适细胞包括但不限于菊欧文氏菌(Erwiniachrysanthemi)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)和浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)的细胞。在一个实施方案中，宿主细胞选自铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌。在一个实施方案中，宿主细胞是菊欧文氏菌。
丝状真菌的合适宿主细胞包括真菌亚门的所有丝状形式。丝状真菌属的合适细胞包括但不限于支顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管菌属(Bjerkandera)、蜡孢霉属(Ceriporiopsis)、金孢霉属(Chrysoporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、棒孢菌属(Corynascus)、毛壳菌属(Chaetomium)、隐球菌属(Cryptococcus)、丝状担子属(Filobasidium)、镰刀菌属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、腐质霉属(Humicola)、肉座菌属(Hypocrea)、稻瘟菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美丽丝菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、Scytaldium、裂褶菌属(Schizophyllum)、侧孢霉属(Sporotrichum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)和木霉属(Trichoderma)。在某些方面中，重组细胞是木霉属种(例如，里氏木霉(Trichoderma reesei))、青霉属种、腐质霉属种(例如，孤独腐质霉(Humicola insolens))、曲霉属种(例如，黑曲霉(Aspergillus niger))、金孢子菌属种、镰刀菌属种或肉座菌属种。合适的细胞还可以包括这些丝状真菌属的各种无性型和有性型形式的细胞。
丝状真菌物种的合适细胞包括但不限于泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、Chrysosporium lucknowense、杆状镰刀菌(Fusariumbactridioides)、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、大刀镰刀菌(Fusariumculmorum)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、Fusarium graminum、异孢镰刀菌(Fusarium heterosporum)、合欢木镰刀菌(Fusarium negund)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、网状镰刀菌(Fusarium reticulatum)、粉红镰刀菌(Fusarium roseum)、接骨木镰刀菌(Fusarium sambucinum)、肤色镰刀菌(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰刀菌(Fusarium sporotrichioides)、硫磺镰刀菌(Fusarium sulphureum)、圆孢镰刀菌(Fusarium torulosum)、拟单端孢镰刀菌(Fusarium trichothecioides)、Fusariumvenenatum、黑刺烟管菌(Bjerkandera adumoria)、Ceriporiopsis aneirina、Ceriporiopsis aneirina、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、Ceriporiopsis subvermispora、灰盖鬼伞(Coprinuscinereus)、Coriolus hirsutus、孤独腐质霉(Humicola insolens)、Humicolalanuginosa、米赫毛霉(Mucor miehei)、粗孢脉孢菌(Neurospora crassa)、间型脉孢菌(Neurospora intermedia)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、变灰青霉(Penicillium canescens)、离生青霉(Penicillium solitum)、绳状青霉(Penicilliumfuniculosum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、Phlebia radiate、Talaromyces flavus、Thielavia terrestris、Trametes villosa、Trametes versicolor、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康氏木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)和绿色木霉(Trichoderma viride)。
宿主细胞通常是原核宿主细胞。
在一个实施方案中，L-天冬酰胺酶是重组表达的。编码L-天冬酰胺酶的核酸通常可操作地连接能够提供或辅助L-天冬酰胺酶的转录和/或翻译的一个或多个核酸序列，例如在待表达L-天冬酰胺酶的生物体中可操作的启动子。启动子可以是同源的或异源的，以及组成型或诱导型的。启动子序列是本领域公知的。
需要在丝状真菌宿主中重组表达时，启动子可以是真菌启动子(包括但不限于丝状真菌启动子)、在植物细胞中可操作的启动子、在哺乳动物细胞中可操作的启动子。
在一个实施方案中，L-天冬酰胺酶由宿主细胞内源性表达。
在一个实施方案中，L-天冬酰胺酶是合成产生的(通常不涉及使用宿主细胞)。L-天冬酰胺酶的合成生产基本上避免了本发明组合物中HCP的存在。
L-天冬酰胺酶可以通过本领域已知的任何方法从宿主细胞中回收和/或纯化，例如通过色谱法(例如，离子(阴离子/阳离子)交换、亲和-包括镍亲和和谷胱甘肽亲和，以及尺寸柱色谱法)、离心、差异溶解度，或通过用于纯化蛋白质的任何其他标准技术。此外，L-天冬酰胺酶可以与异源多肽序列融合以促进纯化。此类纯化标签是本领域已知的，并且可以使用任何常规标签。
先前已经施用大肠杆菌来源的L-天冬酰胺酶的患者可以容易地鉴定，例如通过检查患者的病历，这通常表明患者先前已经施用了
Figure BDA0003553080600000151
在一个实施方案中，患者正在用大肠杆菌衍生的L-天冬酰胺酶进行治疗，但未被鉴定为对大肠杆菌衍生的L-天冬酰胺酶具有超敏性。
在一个实施方案中，患者被鉴定为对大肠杆菌衍生的L-天冬酰胺酶具有超敏性。各种类型的超敏反应是本领域技术人员已知的，并且包括例如过敏反应、过敏性休克和亚临床超敏反应(也称为沉默失活)。
对大肠杆菌衍生的L-天冬酰胺酶具有超敏反应的患者可以通过暴露于大肠杆菌衍生的L-天冬酰胺酶后的过敏反应来鉴定。与过敏反应相关的症状是众所周知的，并且包括但不限于皮肤刺激(例如短暂潮红、皮疹、荨麻疹)、呼吸困难(例如支气管痉挛、喘息)、呕吐、腹泻、水肿(例如血管性水肿)和低血压。
患者可能已经经历了响应大肠杆菌衍生的L-天冬酰胺酶的过敏性休克。过敏性休克是在暴露后快速发生的过敏反应，并且通常涉及一种或多种症状，包括但不限于咽喉和/或舌头肿胀、呕吐、严重皮肤刺激和低血压。
患者可能对大肠杆菌衍生的L-天冬酰胺酶具有亚临床超敏反应(也称为沉默失活)。亚临床超敏反应的特征在于抗大肠杆菌L-天冬酰胺酶抗体应答，而不存在超敏反应的临床体征(如与过敏反应相关的那些，如上所述)。具有亚临床超敏反应的患者可以被鉴定为产生了抗大肠杆菌L-天冬酰胺酶抗体的患者。可以通过本领域已知的各种方法，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)，来鉴定抗大肠杆菌衍生的L-天冬酰胺酶抗体。
亚临床超敏反应也可以被鉴定为患者临床症状(例如ALL的症状)的进行性恶化，尽管用大肠杆菌衍生的L-天冬酰胺酶治疗。还可以通过评估血清L-天冬酰胺酶活性随时间的变化来鉴定亚临床超敏反应。
患者通常是哺乳动物，优选人。
在一个实施方案中，患者为21岁或更小。在一个实施方案中，患者为18岁或更小。在一个实施方案中，患者为15岁或更小。在一个实施方案中，患者为12岁或更小。在一个实施方案中，患者为8岁或更小。在一个实施方案中，患者为6岁或更小。在一个实施方案中，患者为4岁或更小。在一个实施方案中，患者为2岁或更小。在一个实施方案中，患者为22岁或更大。
测定L-天冬酰胺氨基水解酶活性的方法是本领域熟知的。
在一个实施方案中，与在大肠杆菌中表达的等效缀合物相比，本发明的缀合物具有至少80％的体外活性，例如在大肠杆菌中表达的等效缀合物的体外活性的至少80％、90％或100％。
在一个实施方案中，使用Nesslerisation方法测量L-天冬酰胺氨基水解酶活性，该方法测定通过L-天冬酰胺酶对L-天冬酰胺的催化活性所释放的氨的量。例如，可以将测试样品制成900μL Tris-HCL缓冲液和pH 8.6的L-天冬酰胺。可以将L-天冬酰胺酶(100μL)加入测试样品中并在37℃下孵育30分钟。30分钟后，可以通过加入1.5M三氯乙酸溶液淬灭反应。然后将样品离心以除去任何颗粒。然后可以将100μL上清液加入含有3.8mL水和Nessler试剂试管管中，并孵育15分钟。然后用分光光度法(在425nm处)分析样品，以提供由L-天冬酰胺酶催化L-天冬酰胺所释放的氨的相对量的指示。Nesslerisation方法理想地适于体外L-天冬酰胺酶活性的评估。
测定L-天冬酰胺氨基水解酶活性的另一种方法涉及将L-天冬酰胺酶与L-天冬氨酸β-异羟肟酸孵育。催化L-天冬氨酸β-异羟肟酸以产生L-天冬酰胺和羟胺，然后将其与8-羟基喹啉缩合并氧化成吲哚氧辛。通过分光光度法(在710nm处)测定L-天冬酰胺氨基水解酶活性(参见例如Lanvers等，Analytical Biochemistry(2002)，309(1)：117-126)。L-天冬氨酸β-异羟肟酸催化方法理想地适于评估体液样品(如血清)中的L-天冬酰胺酶活性。L-天冬氨酸β-异羟肟酸催化方法理想地适于评估体内t1/2，例如通过评估在施用L-天冬酰胺酶(包括施用本发明的缀合物)后间隔采集的血浆样品中的L-天冬酰胺酶活性。
以相等的蛋白质剂量(即施用的蛋白质重量：体重)施用时，本发明的缀合物通常具有比L-天冬酰胺酶不与水溶性聚合物缀合时更长的体内t1/2。在一个实施方案中，缀合物包含来自菊欧文氏菌的L-天冬酰胺酶，并且具有比EwASNase更长的t1/2。在一个实施方案中，其中L-天冬酰胺酶来自菊欧文氏菌并且水溶性聚合物包含PEG，缀合物具有比EwASNase更长的t1/2。在一个实施方案中，其中L-天冬酰胺酶来自菊欧文氏菌并且水溶性聚合物包含PAS聚合物，缀合物具有比EwASNase更长的t1/2。
在一个实施方案中，缀合物包含来自菊欧文氏菌的L-天冬酰胺酶，并且以相等的蛋白质剂量(即所施用的蛋白质重量：体重)施用时，所述缀合物具有比EcASNase更长的t1/2。在一个实施方案中，其中L-天冬酰胺酶来自菊欧文氏菌并且水溶性聚合物包含PEG，所述缀合物具有比EcASNase更长的t1/2。在一个实施方案中，其中L-天冬酰胺酶来自菊欧文氏菌并且水溶性聚合物包含PAS聚合物，所述缀合物具有比EcASNase更长t1/2。
在一个实施方案中，缀合物包含来自菊欧文氏菌的L-天冬酰胺酶，并且以相等的蛋白质剂量(即所施用的蛋白质的重量：体重)施用时，具有与
Figure BDA0003553080600000171
相似或更长的t1/2。在一个实施方案中，其中L-天冬酰胺酶来自菊欧文氏菌并且水溶性聚合物包含PEG，缀合物具有与
Figure BDA0003553080600000172
相似或更长的t1/2。在一个实施方案中，其中L-天冬酰胺酶来自菊欧文氏菌并且水溶性聚合物包含PAS聚合物，缀合物具有与
Figure BDA0003553080600000173
相似或更长的t1/2。“相似”t1/2是指
Figure BDA0003553080600000174
的t1/2的至少70％，例如
Figure BDA0003553080600000175
的t1/2的至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、110％、115％、120％、125％或至少130％。
“更长”t1/2是指长至少10％，例如长至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、225、250、275或至少300％的t1/2。
本发明的缀合物和组合物以与剂量制剂相容的方式并且以治疗有效的量(即“治疗有效量”)施用于患者。
本发明的缀合物和组合物通常在用大肠杆菌衍生的L-天冬酰胺酶治疗后作为二线或三线疗法施用。
本发明的缀合物和组合物通常通过常规途径施用，例如静脉内、皮下、腹膜内或粘膜途径。施用通常通过肠胃外施用，例如静脉内或肌内注射。
在一个实施方案中，本发明的缀合物(或重组异源表达的L-天冬酰胺酶)以约100IU/m2至约30000IU/m2(约0.2-60mg蛋白质/m2)的剂量施用。在一个实施方案中，本发明的缀合物以约100IU/m2至约2500IU/m2，如约100IU/m2至约500IU/m2，或约500IU/m2至约2500IU/m2的剂量施用。在一个实施方案中，重组异源表达的L-天冬酰胺酶以约6000IU/m2至约25000IU/m2，如约6000IU/m2至约10000IU/m2，或约10000IU/m2至约25000IU/m2的剂量施用。在年龄≤21岁的儿科患者中，本发明的缀合物通常以低于年龄>21岁的患者的剂量来施用。
在一个实施方案中，治疗包括每周施用本发明的缀合物或组合物少于三次。在一个实施方案中，治疗包括每周施用本发明的缀合物或组合物少于两次。在一个实施方案中，治疗包括每周施用本发明的缀合物或组合物少于一次。在一个实施方案中，治疗包括以至少7天的间隔施用本发明的缀合物或组合物，例如至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天的间隔。
在一个实施方案中，在下一次施用本发明的缀合物或组合物前测量血清L-天冬酰胺酶活性。在一个实施方案中，增加施用剂量以将血清L-天冬酰胺酶活性提高至所需水平。在一个实施方案中，缩短施用间隔以将血清L-天冬酰胺酶活性提高至所需水平。在一个实施方案中，增加施用剂量并缩短施用间隔以将血清L-天冬酰胺酶活性提高至所需水平。期望的血清L-天冬酰胺酶活性水平通常是提供天冬酰胺的治疗性减少的水平。
在一个实施方案中，本发明的缀合物或组合物作为单一疗法施用。在一个实施方案中，本发明的缀合物或组合物作为组合疗法的一部分施用，例如与其他化疗或放疗结合。
在一个实施方案中，通过L-天冬酰胺耗尽可治疗的疾病是癌症。在一个实施方案中，癌症选自急性淋巴细胞白血病(ALL)、淋巴肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、NK淋巴瘤和胰腺癌。在一个实施方案中，癌症是ALL。
有许多已建立的算法可用于比对两个氨基酸序列。通常，一个序列充当参考序列，测试序列可以针对该参考序列进行比较。序列比较算法基于指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。用于比较的氨基酸序列的比对可以例如通过计算机实施的算法(例如GAP、BESTFIT、FASTA或TFASTA)或BLAST和BLAST 2.0算法来进行。
以下所示的BLOSUM62表是源自蛋白质序列区段的约2,000个局部多重比对的氨基酸取代矩阵，所述蛋白质序列区段代表超过500组相关蛋白质的高度保守区域(Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919，1992；通过引用并入本文)。氨基酸由标准的单字母代码表示。同一性百分比计算如下：
相同匹配的总数/[较长序列的长度加上为了比对两个序列引入较长序列中的缺口数]×100
BLOSUM62表
Figure BDA0003553080600000181
Figure BDA0003553080600000191
在同源性比较中，同一性可以存在于长度为至少10个氨基酸残基(例如长度为至少15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325或更多个氨基酸残基-例如多达参考序列的整个长度)的序列区域上。
基本上同源的多肽具有一个或多个氨基酸取代、缺失或添加。在许多实施方案中，这些变化具有较小的性质，例如，仅涉及保守性氨基酸取代。保守性取代是通过用以下组内的另一种氨基酸替换一种氨基酸而进行的那些：碱性的：精氨酸、赖氨酸、组氨酸；酸性：谷氨酸、天冬氨酸；极性：谷氨酰胺、天冬酰胺；疏水性：亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸；芳香族：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸；小的：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸。基本上同源的多肽还涵盖包含不显著影响多肽的折叠或活性的其他取代的那些多肽；小的缺失，通常为1至约30个氨基酸(例如1-10个或1-5个氨基酸)；和小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸残基、多达约20-25个残基的小接头肽，或亲和标签。
在一个实施方案中，本发明的组合物基本上不含来自大肠杆菌的宿主细胞蛋白。在一个实施方案中，本发明的组合物不含来自大肠杆菌的宿主细胞蛋白。
由于其高检测灵敏度，酶联免疫吸附测定(ELISA)是目前用于检测HCP的金标准方法。HCP检测方案是本领域熟知的，并且基于ELISA的HCP检测测定是商业上可获得的(例如来自Cygnus Technologies，US(Marvai LifeSciences的一部分)的“E.coli HCP ELISA试剂盒”和来自Abeam，UK的“E.coli HCP ELISA试剂盒(宿主细胞蛋白)”)。
然而，存在与基于ELISA的HCP检测相关的某些限制。例如，抗HCP抗体库不能覆盖整个HCP群体，并且弱免疫原性HCP可能不会引发任何/足够的抗体以促进其检测。通过仔细鉴定合适的宿主细胞和L-天冬酰胺酶来源，本发明有助于避免需要超纯L-天冬酰胺酶制剂来治疗对
Figure BDA0003553080600000201
(或EcASNase)已经产生超敏反应的患者和/或对
Figure BDA0003553080600000202
(或EcASNase)产生抗L-天冬酰胺酶抗体反应但没有显示明显过敏症状的患者。
本发明的组合物可以包含药学上可接受的并且与活性成分相容的赋形剂。合适的赋形剂是例如水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等及其组合。此外，本发明的组合物可以含有辅助物质，如润湿剂或乳化剂，和/或pH缓冲剂。
在一个实施方案中，本发明的缀合物或组合物为冻干形式。在一个实施方案中，本发明的组合物为冻干形式。可以将本发明的缀合物或组合物冻干以提供缀合物或组合物的粉末形式。然后可以在施用前重构本发明的冻干缀合物或组合物。用于制备可注射溶液的无菌粉末可以通过将包含本发明的缀合物或组合物的溶液冻干以产生包含缀合物(或重组异源表达的L-天冬酰胺酶)以及任何任选的共溶解的生物相容性成分的粉末来产生。通常，通过将本发明的缀合物(或重组异源表达的L-天冬酰胺酶)掺入含有基础分散介质或溶剂(例如稀释剂)和任选的其他生物相容性成分的无菌介质中来制备分散体或溶液。相容的稀释剂是药学上可接受的稀释剂(对于施用于人是安全且无毒的)，并且可用于制备液体制剂，如冻干后重构的制剂。稀释剂包括例如无菌水、抑菌注射用水、pH缓冲液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液或右旋糖溶液。稀释剂可包括例如盐和/或缓冲剂的水溶液。
在一个实施方案中，本发明的组合物包含一种或多种冻干保护剂。在一个实施方案中，本发明的缀合物或组合物与冻干保护剂组合冻干，所述冻干保护剂例如为氨基酸，如谷氨酸单钠或组氨酸；甲胺，如甜菜碱；易溶盐，如硫酸镁；多元醇，如三元或更高分子量的糖醇，例如甘油、葡聚糖、赤藓糖醇、甘油、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇；丙二醇；及其组合。另外的示例性冻干保护剂包括甘油和明胶，以及糖蜜二糖、松三糖、棉子糖、甘露三糖和水苏糖。在一个实施方案中，冻干保护剂包含海藻糖。在一个实施方案中，冻干保护剂包含蔗糖。在一个实施方案中，冻干保护剂包含海藻糖和蔗糖。
将冻干保护剂以“保护量”(例如冻干前)加入组合物中，这意味着本发明的缀合物(或重组异源表达的L-天冬酰胺酶)在储存期间(例如重构和储存后)基本上保持其物理和化学稳定性和完整性。
本发明的缀合物和组合物可以制成注射剂，作为液体溶液或悬浮液。或者，可以制成适于在注射前溶解或悬浮于液体中的固体形式。
在一个实施方案中，组合物在剂型中。
在一个实施方案中，组合物是无菌的。
本发明的组合物可包含缓冲剂。在一个实施方案中，缓冲剂包含组氨酸盐酸盐(例如L-组氨酸HCL)。
本发明的组合物可包含非离子型表面活性剂，如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60或聚山梨醇酯80作为稳定剂。
本发明还提供了生产本发明缀合物的方法。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于生产本发明的缀合物的方法，该方法包括：
(a)在大肠杆菌以外的宿主细胞中表达编码以下的核酸：(i)来自大肠杆菌以外的来源的L-天冬酰胺酶和(ii)PAS聚合物；和
(b)纯化缀合物。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于生产本发明的缀合物的方法，该方法包括：
(a)在大肠杆菌以外的宿主细胞中表达来自大肠杆菌以外的来源的编码L-天冬酰胺酶的核酸；
(b)纯化L-天冬酰胺酶；和
(c)将L-天冬酰胺酶与PEG缀合。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于生产本发明的缀合物的方法，该方法包括：
(a)从大肠杆菌以外的来源纯化天然L-天冬酰胺酶；和
(b)将L-天冬酰胺酶与PEG缀合。
本发明还提供了一种用于生产本发明的重组异源表达的L-天冬酰胺酶的方法，该方法包括：
(a)在大肠杆菌以外的异源宿主细胞中表达来自大肠杆菌以外的来源的编码L-天冬酰胺酶的核酸；和
(b)纯化L-天冬酰胺酶。
附图简述
图1用于测定
Figure BDA0003553080600000221
中大肠杆菌HCP的标准曲线。
将HCP浓度(ng/mL)绘制在X-轴上，将吸光度(A450)绘制在Y-轴上。R2＝0.9999。
实施例
实施例1：
Figure BDA0003553080600000222
中大肠杆菌HCP的检测
通过酶联免疫吸附测定(ELISA)和质谱法分析商业小瓶的
Figure BDA0003553080600000223
中大肠杆菌HCP的存在。两种分析均证实了在
Figure BDA0003553080600000224
中存在大肠杆菌HCP。
(a)通过ELISA检测大肠杆菌HCP
将商业小瓶的
Figure BDA0003553080600000225
(3,750IU)在水中重构，并使用抗大肠杆菌HCP ELISA进行分析。在测试试剂盒中，用捕获抗体(抗大肠杆菌HCP抗体)预包被ELISA板。将
Figure BDA0003553080600000226
与捕获抗体一起孵育后，应用检测抗体(与生物素缀合的第二抗大肠杆菌HCP抗体)。与检测抗体一起孵育后，将板与结合生物素标记的抗体的链霉亲和素-辣根过氧化物酶(HRP)缀合物一起孵育。然后加入“TMB”(3,3',5,5”-四甲基联苯胺)底物，其通过捕获的HRP转化为与板结合的HCP的量成比例的有色产物。在450nm处测量吸光度。
生成标准曲线以确定大肠杆菌HCP的浓度(ng/mL)与吸光度(405nm)之间的关系。标准曲线(图1)具有0.9999的R2值，这表示数据中非常好的“拟合”和高置信度。
ELISA分析确定
Figure BDA0003553080600000231
的小瓶含有约1.1ng大肠杆菌HCP。
Figure BDA0003553080600000232
的典型剂量为4500IU，相当于1.2小瓶的
Figure BDA0003553080600000233
因此，每次接受一剂
Figure BDA0003553080600000234
时，向患者施用了～1.3ng的大肠杆菌HCP。
(b)通过质谱法检测大肠杆菌HCP
还使用质谱法(MS)分析了
Figure BDA0003553080600000235
具体地，使用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)通过独立数据采集(“IDA”)鉴定
Figure BDA0003553080600000236
中未知的HCP(Patel，V.J等，Journal ofProteome Research，(2009).8:3752-3759)。使用胰蛋白酶消化样品，电离并测定离子的质荷比(m/z)。对Uniprot完全蛋白质数据库搜索结果以鉴定样品中的HCP。
通过MS鉴定了五种主要肽，其总结在表1中：
蛋白质名称 物种 肽(95％)
L-天冬酰胺酶 大肠杆菌(株K12) 690
L-天冬酰胺酶 菊欧文氏菌(株3937) 43
推定的硫酸酯酶AsIA 大肠杆菌(株K12) 1
未表征的蛋白质YggE_OS 大肠杆菌(株K12) 1
蛋白质UshA_OS 大肠杆菌(株K12) 1
如预期的，最丰富的肽鉴定为来自大肠杆菌的L-天冬酰胺酶。第二丰富的肽鉴定为来自菊欧文氏菌的L-天冬酰胺酶。不希望受理论束缚，发明人认为鉴定为来自菊欧文氏菌的L-天冬酰胺酶的肽对应于与天然菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶具有非常高序列同一性的大肠杆菌L-天冬酰胺酶的区域。
MS分析还证实了在
Figure BDA0003553080600000241
中存在大肠杆菌HCP。这些MS数据进一步验证了ELISA产生的结果。在
Figure BDA0003553080600000242
中的大肠杆菌HCP中，MS分析鉴定了(i)推定的硫酸酯酶AslA；(ii)未表征的蛋白质YggE_OS；和(iii)蛋白质UshA_OS。
实施例2：
Figure BDA0003553080600000243
中高免疫原性大肠杆菌HCP的鉴定
评估了在
Figure BDA0003553080600000244
中鉴定的大肠杆菌HCP对主要组织相容性复合物II类(MHCII)的结合亲和力，以及由任何已知的MHC II受体呈递的可能性。这在T细胞应答的发展中是关键的，并且提供了免疫原性的强烈指示。
使用公众可获得的“NetMHCIIpan”服务器进行免疫原性分析。该服务器使用人工神经网络，并在超过500,000次结合亲和力测量和洗脱配体质谱的数据集上进行训练，包括三种MHC II同种型HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP以及小鼠分子(H-2)(详情参见Jensen等，2018，Immunology，154.394-406)。
免疫原性结果示于表2中：
Figure BDA0003553080600000245
强结合物在覆盖>99％的人群的25个HLA等位基因中具有<50nM的亲和力。中+强结合物结合物在覆盖>99％的人群的25个HLA等位基因中具有<500nM的亲和力(Wang等，2010BMC bioinformatics.2010；11:56 8)。
如表2中所示，通过MS在
Figure BDA0003553080600000246
中鉴定的大肠杆菌HCP显示出极高数量的强以及中加强结合物。因此，在
Figure BDA0003553080600000247
中鉴定的每种大肠杆菌HCP具有高度免疫原性。
大肠杆菌HCP的施用在免疫学上预先使患者引发对随后施用的源自大肠杆菌的L-天冬酰胺酶的超敏反应。HCP具有高免疫原性时，危险和不期望的免疫反应的风险增加。
实施例3：包含菊欧文氏菌L-天冬氨酸酶和PAS聚合物的缀合物的产生
将编码菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶和PAS聚合物的核酸克隆到Pc启动子控制下的pMMPc载体(GenBank登录号KC544266)中。通过聚合酶链反应分析证实了克隆。然后通过电穿孔用载体转化荧光假单胞菌菌株MB214。
将转化的荧光假单胞菌接种到培养基并生长48h，然后离心。进行一系列色谱和浓缩步骤。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳确认样品纯度。通过N-末端蛋白质测序和液相色谱-质谱法确认缀合物的氨基酸序列。
在37℃下通过Nesslerisation方法在体外确认L-天冬酰胺酶活性。
实施例4：包含菊欧文氏菌L-天冬氨酸酶和5000Da PEG的缀合物的生产
步骤A：将编码菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶的核酸克隆到如实施例3中所述的pMMPc载体中。然后用载体转化荧光假单胞菌菌株BM214并按照实施例3生长。在接种和生长48h后，然后如实施例3中所述纯化和浓缩菊花欧文氏菌L-天冬酰胺酶。
步骤B：然后将纯化的菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶(5mg/ml)在5000Da官能化mPEG(100mg/ml)和磷酸钠缓冲液(100mM，pH 8.0)存在下混合2.5小时。将PEG化的菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶浓缩并纯化，并通过在37℃下的Nesslerisation方法在体外确认L-天冬酰胺酶活性。
实施例5：菊欧文氏菌L-天冬氨酸酶缀合物的体内半衰期分析
为了评估实施例3和4的缀合物的药代动力学性质，将缀合物静脉内施用于免疫活性小鼠(分别为“第1组”和“第2组”)。作为对照，“第3组”小鼠施用在实施例3步骤A中浓缩和纯化的菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶(即未与PEG缀合)。
通过眼眶后采血从小鼠收集血液。在给药前1hr和给药后6h、12h、18h、24h、36h和48h进行采血。通过L-天冬氨酸β-异羟肟酸催化方法评估残留的L-天冬酰胺酶活性，并计算体内t1/2值。
第1组和第2组显示出比第3组显著更长的t1/2。
实施例6：用于对
Figure BDA0003553080600000261
已经产生了超敏反应的患者中的适用性。
患者#1：患有ALL的男性患者对其第三剂
Figure BDA0003553080600000262
经历了超敏反应。在这种过敏反应后一周，以750IU/m2的剂量静脉内施用根据实施例3制备的缀合物。患者耐受菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶和PAS聚合物的缀合物，并且在给药后48h，他的SAA水平在治疗范围内(≥0.1IU/ml)。
患者#2：患有ALL的女性患者对其第二剂
Figure BDA0003553080600000263
经历了过敏反应。在这种过敏反应后一周，以750IU/m2的剂量静脉内施用根据实施例3制备的缀合物。患者耐受菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶和PAS聚合物的缀合物，并且在给药后48h，她的SAA水平在治疗范围内。
序列表
<110> 波顿生物制药有限公司 (PORTON BIOPHARMA LIMITED)
<120> 治疗性缀合物
<130> P62403WO
<150> GB1912020.3
<151> 2019-08-21
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 348
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 1
Met Glu Phe Phe Lys Lys Thr Ala Leu Ala Ala Leu Val Met Gly Phe
1 5 10 15
Ser Gly Ala Ala Leu Ala Leu Pro Asn Ile Thr Ile Leu Ala Thr Gly
20 25 30
Gly Thr Ile Ala Gly Gly Gly Asp Ser Ala Thr Lys Ser Asn Tyr Thr
35 40 45
Val Gly Lys Val Gly Val Glu Asn Leu Val Asn Ala Val Pro Gln Leu
50 55 60
Lys Asp Ile Ala Asn Val Lys Gly Glu Gln Val Val Asn Ile Gly Ser
65 70 75 80
Gln Asp Met Asn Asp Asn Val Trp Leu Thr Leu Ala Lys Lys Ile Asn
85 90 95
Thr Asp Cys Asp Lys Thr Asp Gly Phe Val Ile Thr His Gly Thr Asp
100 105 110
Thr Met Glu Glu Thr Ala Tyr Phe Leu Asp Leu Thr Val Lys Cys Asp
115 120 125
Lys Pro Val Val Met Val Gly Ala Met Arg Pro Ser Thr Ser Met Ser
130 135 140
Ala Asp Gly Pro Phe Asn Leu Tyr Asn Ala Val Val Thr Ala Ala Asp
145 150 155 160
Lys Ala Ser Ala Asn Arg Gly Val Leu Val Val Met Asn Asp Thr Val
165 170 175
Leu Asp Gly Arg Asp Val Thr Lys Thr Asn Thr Thr Asp Val Ala Thr
180 185 190
Phe Lys Ser Val Asn Tyr Gly Pro Leu Gly Tyr Ile His Asn Gly Lys
195 200 205
Ile Asp Tyr Gln Arg Thr Pro Ala Arg Lys His Thr Ser Asp Thr Pro
210 215 220
Phe Asp Val Ser Lys Leu Asn Glu Leu Pro Lys Val Gly Ile Val Tyr
225 230 235 240
Asn Tyr Ala Asn Ala Ser Asp Leu Pro Ala Lys Ala Leu Val Asp Ala
245 250 255
Gly Tyr Asp Gly Ile Val Ser Ala Gly Val Gly Asn Gly Asn Leu Tyr
260 265 270
Lys Ser Val Phe Asp Thr Leu Ala Thr Ala Ala Lys Thr Gly Thr Ala
275 280 285
Val Val Arg Ser Ser Arg Val Pro Thr Gly Ala Thr Thr Gln Asp Ala
290 295 300
Glu Val Asp Asp Ala Lys Tyr Gly Phe Val Ala Ser Gly Thr Leu Asn
305 310 315 320
Pro Gln Lys Ala Arg Val Leu Leu Gln Leu Ala Leu Thr Gln Thr Lys
325 330 335
Asp Pro Gln Gln Ile Gln Gln Ile Phe Asn Gln Tyr
340 345
<210> 2
<211> 327
<212> PRT
<213> 菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)
<400> 2
Ala Asp Lys Leu Pro Asn Ile Val Ile Leu Ala Thr Gly Gly Thr Ile
1 5 10 15
Ala Gly Ser Ala Ala Thr Gly Thr Gln Thr Thr Gly Tyr Lys Ala Gly
20 25 30
Ala Leu Gly Val Asp Thr Leu Ile Asn Ala Val Pro Glu Val Lys Lys
35 40 45
Leu Ala Asn Val Lys Gly Glu Gln Phe Ser Asn Met Ala Ser Glu Asn
50 55 60
Met Thr Gly Asp Val Val Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Asn Glu Leu
65 70 75 80
Leu Ala Arg Asp Asp Val Asp Gly Val Val Ile Thr His Gly Thr Asp
85 90 95
Thr Val Glu Glu Ser Ala Tyr Phe Leu His Leu Thr Val Lys Ser Asp
100 105 110
Lys Pro Val Val Phe Val Ala Ala Met Arg Pro Ala Thr Ala Ile Ser
115 120 125
Ala Asp Gly Pro Met Asn Leu Leu Glu Ala Val Arg Val Ala Gly Asp
130 135 140
Lys Gln Ser Arg Gly Arg Gly Val Met Val Val Leu Asn Asp Arg Ile
145 150 155 160
Gly Ser Ala Arg Tyr Ile Thr Lys Thr Asn Ala Ser Thr Leu Asp Thr
165 170 175
Phe Lys Ala Asn Glu Glu Gly Tyr Leu Gly Val Ile Ile Gly Asn Arg
180 185 190
Ile Tyr Tyr Gln Asn Arg Ile Asp Lys Leu His Thr Thr Arg Ser Val
195 200 205
Phe Asp Val Arg Gly Leu Thr Ser Leu Pro Lys Val Asp Ile Leu Tyr
210 215 220
Gly Tyr Gln Asp Asp Pro Glu Tyr Leu Tyr Asp Ala Ala Ile Gln His
225 230 235 240
Gly Val Lys Gly Ile Val Tyr Ala Gly Met Gly Ala Gly Ser Val Ser
245 250 255
Val Arg Gly Ile Ala Gly Met Arg Lys Ala Met Glu Lys Gly Val Val
260 265 270
Val Ile Arg Ser Thr Arg Thr Gly Asn Gly Ile Val Pro Pro Asp Glu
275 280 285
Glu Leu Pro Gly Leu Val Ser Asp Ser Leu Asn Pro Ala His Ala Arg
290 295 300
Ile Leu Leu Met Leu Ala Leu Thr Arg Thr Ser Asp Pro Lys Val Ile
305 310 315 320
Gln Glu Tyr Phe His Thr Tyr
325
<210> 3
<211> 329
<212> PRT
<213> 恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)
<400> 3
Met Ile Asp His Ser Ser Leu Pro Arg Leu Ser Ile Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Ser Met Gln Ala Gln Ala Val Gly Cys Gly Val Thr Pro
20 25 30
Thr Leu Asp Cys Glu Gln Gln Leu Leu Gln Val Pro Gln Leu Arg Gln
35 40 45
Met Ala Gln Leu Asn Val Ala Ser Leu Cys Leu Val Pro Ser Ala Ser
50 55 60
Leu Asp Phe Ala Thr Leu Leu Asp Val Leu Ala Trp Ala Arg Cys Glu
65 70 75 80
Val Glu Arg Gly Ala Gln Ala Leu Val Val Ser Gln Gly Thr Asp Ser
85 90 95
Leu Glu Glu Ser Ala Tyr Phe Leu Asp Leu Leu Trp Pro Phe Asp Ala
100 105 110
Pro Leu Val Met Thr Gly Ala Met Arg Ser Ala Ser Gln Pro Gly Asn
115 120 125
Asp Gly Pro Ala Asn Leu Leu Ala Ala Ala Gln Val Ala Leu Ala Gln
130 135 140
Gly Ser Cys Gly Arg Gly Val Leu Val Val Met Asn Asp Gln Val His
145 150 155 160
Arg Ala Ala Arg Val Arg Lys Thr Ala Ser Met Ala Ile Ala Ala Phe
165 170 175
Glu Ser Pro Gly Cys Gly Pro Leu Gly Glu Val Val Glu Gly Lys Val
180 185 190
Val Tyr Arg His Pro Pro Ala Arg Gly Glu Val Leu Pro Val Pro His
195 200 205
Arg Thr Asp Gln Arg Val Ala Leu Leu Glu Ala Cys Leu Asp Ala Asp
210 215 220
Thr Ala Leu Leu Gln Ala Val Ala Pro Leu Gly Tyr Glu Gly Leu Val
225 230 235 240
Ile Ala Gly Phe Gly Ala Gly His Val Ala Ala Ser Trp Ser Asp Val
245 250 255
Leu Glu Gln Leu Ala Pro Thr Leu Pro Val Val Val Ala Thr Arg Thr
260 265 270
Gly Asn Gly Pro Thr Ala Arg Ala Thr Tyr Gly Phe Ala Gly Ala Glu
275 280 285
Ile Asp Leu Gln Lys Lys Gly Val Tyr Met Ala Gly His Leu Cys Pro
290 295 300
Arg Lys Cys Arg Ile Leu Leu Trp Leu Leu Ile Gly Thr Asp Arg Arg
305 310 315 320
His Glu Leu His Asp Trp Leu His Ala
325
<210> 4
<211> 325
<212> PRT
<213> 荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)
<400> 4
Met Gln Ser Ala Asn Asn Val Met Val Leu Tyr Thr Gly Gly Thr Ile
1 5 10 15
Gly Met Gln Ala Ser Ala Asn Gly Leu Ala Pro Ala Ser Gly Phe Glu
20 25 30
Val Arg Met Arg Glu Gln Phe Ala Asp Ala Asp Leu Pro Ala Trp Arg
35 40 45
Phe Arg Glu Met Ser Pro Leu Ile Asp Ser Ala Asn Met Asn Pro Ala
50 55 60
Tyr Trp Gln Arg Leu Arg Ser Ala Val Val Glu Ala Val Asp Ala Gly
65 70 75 80
Cys Asp Ala Val Leu Ile Leu His Gly Thr Asp Thr Leu Ala Tyr Ser
85 90 95
Ala Ala Ala Met Ser Phe Gln Leu Leu Gly Leu Pro Ala Pro Val Val
100 105 110
Phe Thr Gly Ser Met Leu Pro Ala Gly Val Pro Asp Ser Asp Ala Trp
115 120 125
Glu Asn Val Ser Gly Ala Leu Thr Ala Leu Ala Glu Gly Leu Glu Pro
130 135 140
Gly Val His Leu Tyr Phe His Gly Ala Leu Met Ala Pro Thr Arg Cys
145 150 155 160
Ala Lys Ile Arg Ser Phe Gly Arg Asn Pro Phe Ala Ala Leu Gln Arg
165 170 175
Lys Asp Asp Phe Ala Arg Ala Glu Thr Leu Pro Ala Ala Leu Asp Tyr
180 185 190
Arg Gln Pro Lys Ala Leu Ala Asn Val Gly Val Leu Pro Leu Ile Pro
195 200 205
Gly Phe Asp Ala Ala Gln Leu Asp Ala Ile Ile Ser Ser Gly Ile Gln
210 215 220
Gly Leu Val Leu Glu Cys Phe Gly Ser Gly Thr Gly Pro Ser Asp Asn
225 230 235 240
Pro Gln Phe Leu Ala Ser Leu Gln Arg Ala Gln Asp Gln Gly Val Val
245 250 255
Val Val Ala Ile Thr Gln Cys His Glu Gly Gly Val Glu Leu Asp Val
260 265 270
Tyr Glu Ala Gly Ser Arg Leu Arg Gly Ala Gly Val Leu Ser Gly Ala
275 280 285
Gly Met Thr Arg Glu Ala Ala Phe Gly Lys Leu His Ala Leu Leu Gly
290 295 300
Ala Gly Leu Ala Val Glu Glu Val Arg Arg Leu Val Glu Leu Asp Leu
305 310 315 320
His Thr Asn Pro Thr
325
<210> 5
<211> 330
<212> PRT
<213> 产琥珀酸沃廉菌(Wolinella succinogenes)
<400> 5
Met Ala Lys Pro Gln Val Thr Ile Leu Ala Thr Gly Gly Thr Ile Ala
1 5 10 15
Gly Ser Gly Glu Ser Ser Val Lys Ser Ser Tyr Ser Ala Gly Ala Val
20 25 30
Thr Val Asp Lys Leu Leu Ala Ala Val Pro Ala Ile Asn Asp Leu Ala
35 40 45
Thr Ile Lys Gly Glu Gln Ile Ser Ser Ile Gly Ser Gln Glu Met Thr
50 55 60
Gly Lys Val Trp Leu Lys Leu Ala Lys Arg Val Asn Glu Leu Leu Ala
65 70 75 80
Gln Lys Glu Thr Glu Ala Val Ile Ile Thr His Gly Thr Asp Thr Met
85 90 95
Glu Glu Thr Ala Phe Phe Leu Asn Leu Thr Val Lys Ser Gln Lys Pro
100 105 110
Val Val Leu Val Gly Ala Met Arg Ser Gly Ser Ser Met Ser Ala Asp
115 120 125
Gly Pro Met Asn Leu Tyr Asn Ala Val Asn Val Ala Ile Asn Lys Ala
130 135 140
Ser Thr Asn Lys Gly Val Val Ile Val Met Asn Asp Glu Ile His Ala
145 150 155 160
Ala Arg Glu Ala Thr Lys Leu Asn Thr Thr Ala Val Asn Ala Phe Ala
165 170 175
Ser Pro Asn Thr Gly Lys Ile Gly Thr Val Tyr Tyr Gly Lys Val Glu
180 185 190
Tyr Phe Thr Gln Ser Val Arg Pro His Thr Leu Ala Ser Glu Phe Asp
195 200 205
Ile Ser Lys Ile Glu Glu Leu Pro Arg Val Asp Ile Leu Tyr Ala His
210 215 220
Pro Asp Asp Thr Asp Val Leu Val Asn Ala Ala Leu Gln Ala Gly Ala
225 230 235 240
Lys Gly Ile Ile His Ala Gly Met Gly Asn Gly Asn Pro Phe Pro Leu
245 250 255
Thr Gln Asn Ala Leu Glu Lys Ala Ala Lys Ser Gly Val Val Val Ala
260 265 270
Arg Ser Ser Arg Val Gly Ser Gly Ser Thr Thr Gln Glu Ala Glu Val
275 280 285
Asp Asp Lys Lys Leu Gly Phe Val Ala Thr Glu Ser Leu Asn Pro Gln
290 295 300
Lys Ala Arg Val Leu Leu Met Leu Ala Leu Thr Lys Thr Ser Asp Arg
305 310 315 320
Glu Ala Ile Gln Lys Ile Phe Ser Thr Tyr
325 330

Claims (70)

1.一种包含L-天冬酰胺酶和水溶性聚合物的缀合物，其用于治疗患者中通过L-天冬酰胺耗尽可治疗的疾病，其中：
(a)L-天冬酰胺酶来自大肠杆菌以外的来源；
(b)L-天冬酰胺酶在大肠杆菌以外的宿主细胞中表达；和
(c)患者先前已经施用了大肠杆菌衍生的L-天冬酰胺酶。
2.据权利要求1使用的缀合物，其中L-天冬酰胺酶是重组L-天冬酰胺酶。
3.一种重组异源表达的L-天冬酰胺酶，其用于治疗患者中通过L-天冬酰胺耗尽可治疗的疾病，其中：
(a)L-天冬酰胺酶来自大肠杆菌以外的来源；
(b)异源宿主细胞是大肠杆菌以外的宿主细胞；和
(c)患者先前已经施用了大肠杆菌衍生的L-天冬酰胺酶。
4.根据权利要求1或权利要求2使用的缀合物或根据权利要求3使用的重组异源表达的L-天冬酰胺酶，其中患者对大肠杆菌来源的L-天冬酰胺酶已经具有超敏性。
5.根据权利要求4使用的缀合物或根据权利要求4使用的重组异源表达的L-天冬酰胺酶，其中超敏性选自过敏反应、过敏性休克和沉默失活。
6.根据权利要求1至5任一项使用的缀合物或根据权利要求1至5中任一项使用的重组异源表达的L-天冬酰胺酶，其中大肠杆菌衍生的L-天冬酰胺酶是
Figure FDA0003553080590000011
7.根据权利要求1至6任一项使用的缀合物或根据权利要求1至6中任一项使用的重组异源表达的L-天冬酰胺酶，其中所述L-天冬酰胺酶是欧文氏菌(Erwinia)L-天冬酰胺酶。
8.根据权利要求7使用的缀合物或根据权利要求7使用的重组异源表达的L-天冬酰胺酶，其中欧文氏菌L-天冬酰胺酶是菊欧文氏菌(E.chrysanthemi)L-天冬酰胺酶。
9.根据权利要求8使用的缀合物或根据权利要求8使用的重组异源表达的L-天冬酰胺酶，其中菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80％同一性。
10.根据前述任一项权利要求使用的缀合物，其中水溶性聚合物包含聚乙二醇(PEG)。
11.根据权利要求10使用的缀合物，其中PEG具有小于约10000Da的分子量。
12.根据权利要求10或权利要求11使用的缀合物，其中PEG具有小于约5000Da的分子量。
13.根据权利要求10至12任一项使用的缀合物，其中PEG具有小于约4000Da的分子量。
14.根据权利要求10至13任一项使用的缀合物，其中PEG具有小于约3000Da的分子量。
15.根据权利要求10至14任一项使用的缀合物，其中PEG具有小于约2000Da的分子量。
16.根据前述任一项权利要求使用的缀合物，其中水溶性聚合物是PAS聚合物。
17.根据权利要求16使用的缀合物，其中PAS聚合物中至少80％的氨基酸残基由脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸组成。
18.根据权利要求16或权利要求17使用的缀合物，其中PAS聚合物中至少90％的氨基酸残基由脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸组成。
19.根据权利要求16至18任一项使用的缀合物，其中PAS聚合物中至少95％的氨基酸残基由脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸组成。
20.根据权利要求16至19任一项使用的缀合物，其中PAS聚合物中至少97％的氨基酸残基由脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸组成。
21.根据权利要求16至20任一项使用的缀合物，其中PAS聚合物中至少99％的氨基酸残基由脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸组成。
22.根据权利要求16至21任一项使用的缀合物，其中PAS聚合物中的所有氨基酸残基由脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸组成。
23.根据权利要求16至22任一项使用的缀合物，其中PAS聚合物包含至少10个氨基酸残基。
24.根据权利要求16至23任一项使用的缀合物，其中PAS聚合物包含至少15个氨基酸残基。
25.根据权利要求16至24任一项使用的缀合物，其中PAS聚合物包含至少20个氨基酸残基。
26.根据权利要求16至25任一项使用的缀合物，其中PAS聚合物包含至少25个氨基酸残基。
27.根据权利要求16至26任一项使用的缀合物，其中PAS聚合物包含至少30个氨基酸残基。
28.根据权利要求16至27任一项使用的缀合物，其中PAS聚合物包含10-60个氨基酸残基。
29.根据权利要求16至28任一项使用的缀合物，其中PAS聚合物包含15-50个氨基酸残基。
30.根据权利要求16至29任一项使用的缀合物，其中PAS聚合物包含20-40个氨基酸残基。
31.根据权利要求16至30任一项使用的缀合物，其中PAS聚合物包含20-30个氨基酸残基。
32.根据权利要求16至31任一项使用的缀合物，其中PAS聚合物另外包含纯化标签。
33.根据权利要求32使用的缀合物，其中纯化标签是HiS6-标签。
34.根据权利要求32使用的缀合物，其中纯化标签是Strep-标签。
35.根据前述任一项权利要求使用的缀合物或根据前述任一项权利要求使用的重组异源表达的L-天冬酰胺酶，其中宿主细胞是假单胞菌属(Pseudomonas)的。
36.根据权利要求35使用的缀合物或根据权利要求35使用的重组异源表达的L-天冬酰胺酶，其中宿主细胞是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。
37.根据权利要求35使用的缀合物或根据权利要求35使用的重组异源表达的L-天冬酰胺酶，其中宿主细胞是荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。
38.根据权利要求35使用的缀合物或根据权利要求35使用的重组异源表达的L-天冬酰胺酶，其中宿主细胞是恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。
39.根据前述任一项权利要求使用的缀合物或根据前述任一项权利要求使用的重组异源表达的L-天冬酰胺酶，其中患者为21岁或更小。
40.根据前述任一项权利要求使用的缀合物或根据前述任一项权利要求使用的重组异源表达的L-天冬酰胺酶，其中缀合物或重组异源表达的L-天冬酰胺酶为冻干形式。
41.根据前述任一项权利要求使用的缀合物，其中与在大肠杆菌中表达的等效缀合物相比，所述缀合物具有至少80％的体外活性。
42.根据前述任一项权利要求使用的缀合物，其中与在大肠杆菌中表达的等效缀合物相比，所述缀合物具有至少90％的体外活性。
43.根据前述任一项权利要求使用的缀合物，其中所述缀合物具有至少与在大肠杆菌中表达的等效缀合物一样高的体外活性。
44.根据前述任一项权利要求使用的缀合物或根据前述任一项权利要求使用的重组异源表达的L-天冬酰胺酶，其中治疗包括静脉内施用缀合物。
45.根据前述任一项权利要求使用的缀合物或根据前述任一项权利要求使用的重组异源表达的L-天冬酰胺酶，其中治疗包括肌内施用缀合物。
46.根据前述任一项权利要求使用的缀合物，其中治疗包括每周施用缀合物少于三次。
47.根据权利要求1至46任一项使用的缀合物，其中治疗包括每周施用缀合物少于两次。
48.根据权利要求1至47任一项使用的缀合物，其中治疗包括每周施用缀合物少于一次。
49.根据前述任一项权利要求使用的缀合物或根据前述任一项权利要求使用的重组异源表达的L-天冬酰胺酶，其中通过L-天冬酰胺耗尽可治疗的疾病是癌症。
50.根据权利要求49使用的缀合物或根据权利要求49使用的重组异源表达的L-天冬酰胺酶，其中癌症选自急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤、NK淋巴瘤和胰腺癌。
51.根据权利要求49或权利要求50使用的缀合物或根据权利要求49或权利要求50的重组异源表达的L-天冬酰胺酶，其中所述癌症是ALL。
52.一种组合物，其包含：(a)根据前述任一项权利要求使用的缀合物，和/或(b)根据前述任一项权利要求使用的重组异源表达的L-天冬酰胺酶，和药学上可接受的赋形剂。
53.根据权利要求52使用的组合物，其中组合物包含一种或多种冻干保护剂。
54.根据权利要求53使用的组合物，其中冻干保护剂选自海藻糖和蔗糖。
55.根据权利要求52至54任一项使用的组合物，其中组合物为冻干形式。
56.根据权利要求52至54任一项使用的组合物，其中组合物为溶解形式。
57.一种治疗先前已施用大肠杆菌衍生的L-天冬酰胺酶的患者中通过L-天冬酰胺耗尽可治疗的疾病的方法，所述方法包括给所述患者施用有效量的如前述任一项权利要求中所定义的缀合物或组合物。
58.一种治疗先前已施用大肠杆菌来源的L-天冬酰胺酶的患者中通过L-天冬酰胺耗尽可治疗的疾病的方法，所述方法包括给所述患者施用有效量的如前述权利要求中任一项所定义的重组异源表达的L-天冬酰胺酶或组合物。
59.根据权利要求57或权利要求58的方法，其中患者对大肠杆菌衍生的L-天冬酰胺酶已具有超敏反应。
60.根据权利要求59的方法，其中超敏反应选自过敏反应、过敏性休克和沉默失活。
61.根据权利要求57至60任一项的方法，其中患者先前已施用了
Figure FDA0003553080590000051
62.根据权利要求57至60任一项的方法，其中患者为21岁或更小。
63.根据权利要求57至62任一项的方法，其中所述通过L-天冬酰胺耗尽可治疗的疾病是癌症。
64.根据权利要求63的方法，其中所述癌症选自急性淋巴细胞白血病(ALL)、淋巴肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、NK淋巴瘤和胰腺癌。
65.根据权利要求63或权利要求64的方法，其中所述癌症是ALL。
66.根据权利要求57至65任一项的方法，其中所述缀合物或组合物静脉内施用。
67.根据权利要求57至66任一项的方法，其中所述缀合物或组合物肌内施用。
68.根据权利要求57至67任一项的方法，其中所述缀合物或组合物每周施用少于三次。
69.根据权利要求57至68任一项的方法，其中所述缀合物或组合物每周施用少于两次。
70.根据权利要求57至69任一项的方法，其中所述缀合物或组合物每周施用少于一次。
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