KR20180002828A - 개선된 요산분해효소 서열 및 치료방법 - Google Patents

개선된 요산분해효소 서열 및 치료방법 Download PDF

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Abstract

유익한 효과를 갖는 개선된 요산분해효소 서열 및 고요산혈증을 앓는 환자의 치료방법이 기술된다.

Description

개선된 요산분해효소 서열 및 치료방법
<관련 출원에 대한 상호 참조>
본 특허 출원은 본 설명에 참조로 포함된, 2015년 5월 15일 제출된 미국 가 특허출원 번호 62/162,280의 이익을 주장한다.
<전자적으로 제출한 자료의 참조로서의 포함>
본 출원과 동시에 제출되고 다음과 같이 확인되는 컴퓨터 판독 가능한 뉴클레오티드/아미노산 서열 목록은 전체가 참조로써 본 설명에 포함된다: 2016년 5월 12일 생성된 "UCASE-100WO1SequenceListing.TXT"라는 명칭의 103,701 바이트의 아스키(ASCII) (텍스트) 파일.
기능성 요산분해효소는 고세균, 세균 및 진핵생물과 같은 광범위한 유기체에서 발견될 수 있다. 그러나 인간 및 일부 영장류에서는 요산분해효소가 발현되지 않는다. 인간에서의 요산분해효소 발현 결핍은 더 높은 전신성 요산 수준을 초래하였고, 경우에 따라서는 통풍 및 종양 용해 증후군과 같은 고요산혈증 상태를 발생시켰다.
통풍은 800만 명이 넘는 미국인에 영향을 미치고 있는데, 체액에서 요산 용해도를 초과하는 혈청 요산 수준으로 정의되는, 고통스러우면서도 심신을 쇠약하게 만드는 염증성 관절염이다. 통풍에 의한 피해는 만성 통증, 직장과 가정에서의 기능 장애 및 건강과 관련된 위태로운 삶의 질을 초래할 수 있다(예컨대, Wertheimer, et al., Curr Ther Res Clin Exp., 75: 1~4 (2013) 참조).
종양 용해 증후군(TLS)은 대개 비대하고 빠르게 증식하며 치료에 반응하는 종양을 앓는 환자에서 발생한다. TLS는 많은 수의 암세포가 빠르게 파괴되어 전신성 요산의 급격한 증가를 초래하는 분해 생성물을 방출할 때 발생하는 잠재적으로 치명적인 항암치료 합병증이다.
잔틴 산화효소(잔틴을 요산으로 전환하는 효소)의 억제제, 요산뇨약(URAT1을 억제하는 분자) 및 요산분해효소 치료와 같은 다양한 작용 기전이 고요산혈증을 조절하기 위해 존재한다.
임상적으로 승인된 두 가지의 요산분해효소인 크리스텍사(Krystexxa®)와 엘리텍(Elitek®)이 있다. 크리스텍사(페글로티카제)는 통상적인 치료법에 불응하는 성인 환자의 만성 통풍 치료를 위해 승인된 페길화된 요산분해효소이다. 크리스텍사는 과페길화(사분자체당 약 440 kDa PEG)된, 돼지와 개코원숭이 요산분해효소 서열의 키메라 단백질이다. 크리스텍사는 2시간에 걸쳐 정맥 내(IV) 주입으로 투여된다. 3상 임상 시험 동안, 환자의 26%는 주입 반응을 경험하였고, 환자의 6.5%는 아나필락시스를 특징으로 하는 반응을 나타냈다(Baraf et al., Arthritis Res Ther ., 15(5):R137 (2013) 및 Strand et al., J Rheumatol ., 39(7): 1450~1457 (2012)). 크리스텍사는 아나필락시스 및 주입 반응에 대해 경고하는 복약 주의사항을 함유한다(크리스텍사 처방 정보 참조). 그 결과, 환자들은 전형적으로 이러한 IV 주입 전에 항히스타민 또는 코르티코스테로이드로 사전 치료한 다음, 주입 후 모니터링 된다. 사전 치료, IV 주입 및 주입 후 모니터링은 IV 클리닉에서 약 6 내지 8시간이 걸린다.
엘리텍(라스부리카제)는 항암치료를 받고 있으며 종양 용해 및 후속적인 혈장 요산의 상승이 발생할 것으로 예상되는, 백혈병, 림프종 및 고형 종양 악성 종양을 앓는 소아 및 성인 환자에서 혈장 요산 수준의 초기 관리를 위해 권고되는, 변형된 재조합 아스퍼질러스 플라버스(Aspergillus flavus) 요산분해효소이다. 엘리텍은 인간에서 16 내지 21시간의 반감기를 나타내며, IV 주입을 통해 매일 투여되어야 한다. 크리스텍사와 마찬가지로, 엘리텍도 (특히 G6PD 결핍증 환자에서) 아나필락시스와 용혈반응에 대해 경고하는 복약 주의사항이 있다. 투약 빈도(매일), 투여 경로(IV), 면역원성 및 비용 때문에 엘리텍이 만성 통풍 치료를 위해 선택될 가능성은 낮다.
전술한 관점에서, 당해 분야에는 고요산혈증을 치료하기 위한 더 안전하고 편리하며 면역원성이 더 적은 선택지를 개발할 필요성이 있다. 본 설명에 기술된 발명은 이러한 필요성을 충족한다.
선행기술 치료의 중요하고도 공지된 부작용을 극복하기 위해, 다수의 요산분해효소 서열의 잠재력이 평가된 바 있으며, 그러한 서열들의 특정한, 의미 있는 개선이 이루어져, 기존의 치료법보다 더 안전하고 면역원성이 적으며 더욱 편리한 개선된 요산분해효소에 이르렀다.
일부 양태에서, 다수의 상이한 요산분해효소 서열들이 본 설명에 포함된다. 요산분해효소는 서열 번호 1 내지 34 중 어느 하나와 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열로서, 이때, 이러한 서열은 서열 번호 27 내지 33 중 어느 하나가 아닌 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 이러한 요산분해효소는 서열 번호 1과 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나, 서열 번호 2와 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다.
일부 구현예에서, 이러한 요산분해효소는 서열 번호 1 내지 34 중 어느 하나와 약 1개 내지 약 35개 아미노산(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 또는 35개 아미노산)이 상이한 서열이다. 예를 들어, 이러한 요산분해효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2와 약 1개 내지 약 35개 아미노산이 상이할 수 있다.
일부 양태에서, 이러한 요산분해효소는 서열 번호 1 내지 34 중 어느 하나와 약 1개 내지 약 14개 아미노산(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14개 아미노산)이 상이한 서열이다. 예를 들어, 이러한 요산분해효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2와 약 1개 내지 약 14개 아미노산이 상이할 수 있다. 일부 양태에서, 이러한 요산분해효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2이다. 일부 구현예에서, 이러한 요산분해효소는 서열 번호 3 내지 26 또는 34 중 어느 하나이다.
본 설명에 따라, 고요산혈증, (다양한 형태의 통풍을 포함한) 통풍 및 종양 용해 증후군의 치료방법도 제공된다.
추가적인 목적 및 장점이 부분적으로는 다음의 설명에 기재될 것이고, 부분적으로는 설명으로부터 명백하거나, 실시에 의해 습득될 수 있다. 이러한 목적 및 장점은 첨부된 청구범위에서 특별히 지시한 요소 및 조합에 의해 실현되고 달성될 것이다.
전술한 일반적인 설명과 다음의 상세한 설명은 오로지 예시적이고 설명적이며, 청구범위를 제한하지 않음을 이해해야 한다.
본 명세서에 포함되어 일부분을 구성하는 첨부된 도면은 하나의 (복수의) 구현예(들)를 나타내며, 설명과 함께, 본 설명에 기술된 원리를 설명하는 역할을 한다.
도 1은 다양한 요산분해효소를 발현하는 대장균 세포의 세포 용해물에 존재하는 가용성(S) 및 불용성(P) 단백질의 SDS-PAGE 분석을 나타낸 것이다.
도 2a 내지 도 2b는 데이노코커스 제오써르말리스(Deinococcus geothermalis) 요산분해효소(도 2a) 및 데이노코커스 라디오두란스(Deinococcus radiodurans) 요산분해효소(도 2b)의 시차 주사 열량계 안정성을 나타낸 것이다.
도 3은 다양한 기질(UA) 농도에서의 요산분해효소 활성 분석 결과를 나타내는 선 그래프이다. 실선은 미카엘리스 멘텐 반응속도론 적합도를 나타낸다.
도 4는 고정된 피브로넥틴, Fab9mCys, 또는 요산분해효소 변이체에 대한 M21 세포의 부착을 나타내는 선 그래프이다.
도 5는 다양한 기질(UA) 농도에서의 요산분해효소 활성 분석 결과를 나타내는 선 그래프이다. 실선 및 점선은 미카엘리스 멘텐 반응속도론 적합도를 나타낸다.
도 6은 백인 모집단에서 발견된 것과 비교한, 연구 (공여자) 모집단에서의 HLA-DRB1 빈도를 나타내는 막대 그래프이다.
도 7a 내지 도 7c는 생체 외 면역원성 평가를 위한 개별적인 공여자 데이터를 제공한다. 도 7a는 KLH(양성 대조군)와 비교한, 완충액(음성 대조군)의 자극 지수를 나타내는 산점도이다. 도 7b는 시험한 요산분해효소와 비교한, 완충액(음성 대조군)의 자극 지수를 나타내는 산점도이다. 도 7c는 완충액, KLH 및 요산분해효소에 대한 평균 자극 지수(SI)를 나타내는 막대 그래프이다.
도 8a 내지 도 8b는 다양한 N 말단 요산분해효소 절단을 분석한 것을 나타낸다. 도 8a는 SGD 요산분해효소와 비교한, 3개의 N 말단이 절단된 요산분해효소 변이체(V1, V2 및 V3)의 SDS-PAGE 분석이다. 도 8b는 다양한 기질(UA) 농도에서의 요산분해효소 활성 분석 결과를 나타내는 선 그래프이다. 실선은 미카엘리스 멘텐 반응속도론 적합도를 나타낸다.
도 9a 내지 도 9b는 다양한 기질(UA) 농도에서의 요산분해효소 활성 분석 결과를 나타내는 선 그래프이다. 실선은 미카엘리스 멘텐 반응속도론 적합도를 나타낸다. 도 9a는 디-시스(di-Cys)와 트리-시스(tri-Cys) 요산분해효소(PEG 없음)에 대한, DTT 존재 하에 수행된 요산분해효소 활성 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 9b는 디-페길화(di-PEGylated) 요산분해효소 및 트리-페길화(tri-PEGylated) 요산분해효소에 대한 요산분해효소 활성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 10a 내지 도 10d는 디-페길화 요산분해효소를 분석한 것을 나타낸다. 도 10a는 아트로박터 글로비포미스(Arthrobacter globiformis) 요산분해효소(PDB 수탁 코드: 2YZB)의 사분자체 결정 구조 내의 3차원적인 용매 접근 가능한 부위를 보여준다. 도 10b는 페길화되지 않은 요산분해효소와 디-페길화 요산분해효소의 SDS-PAGE 분석이다. 도 10c는 정제된 디-페길화 요산분해효소의 역상 크로마토그래피 분석이다. 도 10d는 다양한 기질(UA) 농도에서의 요산분해효소 활성 분석 결과를 나타내는 선 그래프이다. 실선 및 점선은 미카엘리스 멘텐 반응속도론 적합도를 나타낸 것이다.
도 11a 내지 도 11b는 페길화 요산분해효소에 대한 약동학 데이터를 나타내는 그래프이다. 도 11a는 디-페길화 요산분해효소 및 트리-페길화 요산분해효소에 대한 랫트 약동학 데이터를 나타낸 것이다. 도 11b는 디-페길화 요산분해효소에 대한 개의 약동학 데이터를 나타낸 것이다.
도 12a 내지 도 12c는 디-페길화 요산분해효소 활성 및 안정성에 대한 생체 외 인간 혈청 기반 분석을 나타낸 것이다. 도 12a는 37℃의 50% 인간 혈청 내에서의 디-페길화 요산분해효소 활성과 크리스텍사를 비교한 것을 보여준다. 도 12b는 다양한 시간 동안 37℃에서 인간 혈청에 배양했던 디-페길화 요산분해효소의 활성을 나타낸 것이다. 도 12c는 반복된 용량의 UA에 대한 디-페길화 요산분해효소의 활성을 나타낸 것이다.
도 13은 다양한 배양 시간에서의 페길화 효율에 대한 RP-HPLC 분석을 나타낸 것이다. PEG 접합을 측정하기 위해 RP-HPLC를 이용하였는데, 이것은 상이한 접합 정도를 나타내는 종들에 상응하는, 잘 분리된 피크를 생성한다.
도 14a 내지 도 14b는 10분에서부터 2시간까지의 시점에 대한 전체 페길화 효율에 미치는 시약 농도의 효과를 보여주는 반응 표면도를 나타낸 것이다. 도 14a는 RP-HPLC 분석 결과로부터 직접 획득한 "완전히 페길화된 서브유닛"(즉, 단량체당 세 개의 기능화된 접합 부위 중 세 개)의 분석을 기초로 한 데이터를 나타낸 것이다. 도 14b는 식 (1)을 기초로 하여 전체 유도체화가 계산될 때의 데이터 분석을 나타낸 것이다.
서열에 대한 설명
표 1은 본 설명에 언급된 일부 서열의 목록을 제공한다.
[표 1] 서열에 대한 설명
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요산염 산화효소(요산분해효소 EC 1.7.3.3, uox)는 4개의 동일한 34 KDa 서브유닛으로 구성된 호모테트라머(homotetrameric) 효소이다. 이러한 효소는 요산을 더욱 가용성 있고 쉽게 배설되는 생성물인 알란토인으로 전환하는 일련의 반응들을 시작하는 초기 단계를 담당한다. 요약하자면, 요산분해효소는 5-하이드록시-아이소우레이트(HIU)의 형성을 위한 요산(UA)의 O2와 H2O와의 반응 및 H2O2의 방출을 촉진한다. HIU는 2-옥소-4-하이드록시-4-카르복시-5-우레이도이미다졸린(OHCU)으로의 비 효소적 가수분해를 거친 다음, 자발적으로 탈카르복실화되어 라세믹 알란토인을 형성하는 불안정한 생성물이다. 기능성 요산분해효소를 함유하는 종들에서, 이러한 반응을 더욱 신속하게 촉진하여 (s)-알란토인을 생성하는 두 가지의 추가적인 효소가 발현된다(HIU 가수분해효소 및 OHCU 탈카르복실화효소). 기능성 요산분해효소는 고세균, 세균 및 진핵생물의 광범위한 유기체에서 찾아볼 수 있다. 그러나 인간과 일부 영장류에서는 요산분해효소가 발현되지 않는다. 요산분해효소 발현의 결여는 세 가지 유전자 돌연변이: (오랑우탄, 고릴라, 침팬지 및 인간에 영향을 미치는) 코돈 33에서의 넌센스 돌연변이, (침팬지와 인간에 영향을 미치는) 코돈 187에서의 또 다른 넌센스 돌연변이 및 (침팬지와 인간에 영향을 미치는) 인트론 2의 스플라이스 수용체 부위에서의 돌연변이에 기인한다. 요산분해효소 활성의 진화적 제거와 UA 수준의 상응하는 증가를 설명하기 위해 많은 가설들이 제안된 바 있다. 여기에는 UA 수준의 증가(강력한 항산화제이자 산소 라디칼의 제거제)가 산소 자유 라디칼 관련 질병(암)의 감소 및 수명 증가로 이어졌다는 생각이 포함된다. 또한, UA가 카페인과 테오브로민 같은 신경자극제와 구조적으로 비슷하다는 사실은 증가된 UA 수준이 지적/인지적 점프를 초래했을 수 있다는 추측으로 이어졌다. 마지막으로, 요산의 증가는 매우 낮은 염의 채식 식단(1 내지 2백만 년 전)을 소비하는 동안 인류가 요구했던 혈압 수준을 초래하였고, 그것을 유지하는 데 도움이 되었다고 제안된 바 있다. 결과적으로 발생했을 수 있는 진화적인 이점과 관계 없이, 인간에서의 요산분해효소 발현의 결여는 더 높은 전신성 UA 수준을 초래하였고, 경우에 따라서는 통풍과 종양 용해 증후군과 같은 고요산혈증 상태를 발생시켰다.
통풍은 800만 명이 넘는 미국인에 영향을 미치고 있는데, 체액에서 요산 용해도를 초과하는 혈청 요산 수준으로 정의되는, 고통스러우면서도 심신을 쇠약하게 만드는 염증성 관절염이다. 6.8 mg/dL 보다 높은 혈청 UA 수준은 조직에 UA 결정 형성을 초래하여, 급성 염증 반응을 일으킬 수 있다. 급성 통풍성 관절염 발병(플레어)과 섬유질 조직에 UA 결정이 침착되는 만성 염증은 고통스러우면서도 심신을 쇠약하게 한다. 통풍에 의한 피해는 만성 통증, 직장과 가정에서의 기능 장애 및 건강과 관련된 위태로운 삶의 질을 초래할 수 있다(Wertheimer 외, 위 참조).
종양 용해 증후군(TLS)은 대개 비대하고 빠르게 증식하며 치료에 반응하는 종양을 앓는 환자에서 발생한다. TLS는 많은 수의 암세포가 빠르게 파괴되어 분해 생성물을 방출할 때 발생하는 잠재적으로 치명적인 항암치료 합병증이다. 핵산 퓨린은 UA로 대사되어, 전신성 UA의 급격한 증가를 초래한다. 심한 경우, UA 결정은 세뇨관에서 형성되어, UA 신증(급성 신부전)을 유발한다. TLS는 광범위한 종양 유형에 걸쳐 보고된 바 있다(Ikeda, et al., Drugs, Diseases & Procedures, Medscape (Dec. 3, 2014)).
다양한 작용 기전이 고요산혈증을 조절하기 위해 존재한다. 잔틴 산화효소(잔틴을 요산으로 전환하는 효소)의 억제제는 1960년대 이후 임상적으로 처방되었다. 이들 중에서도 가장 흔한 알로푸리놀(Allopurinol)은 미국에서 200만 명이 넘는 통풍 환자가 이용한다. 그러나 많은 환자들이 계속해서 허용 가능한 UA 수준보다 더 높은 수준을 나타내어, 고요산혈증이 단지 UA 생성 문제가 아님을 시사한다. 더 최근의 연구는 환자의 UA 수준이 UA 재순환을 담당하는 효소인 URAT1을 억제하여서도 조절될 수 있다는 점을 보여주었다. 요산뇨약(URAT1을 억제하는 분자)은 신장의 근위 세뇨관에 작용하며, 이곳에서 UA가 신장으로부터 혈액으로 흡수되는 것을 방해한다. 벤즈브로마론(Benzbromarone)과 레시뉴라드(Lesinurad) 같은 요산뇨약은 UA의 배설을 촉진한다. 마지막으로, 요산분해효소 처리는 UA를 더욱 가용성을 나타내는 생성물인 알란토인으로 산화시켜 말초 혈류에서의 UA 수준을 신속하게 감소시키는 것으로 나타났다. 임상적으로 승인된 요산분해효소에는 크리스텍사(Krystexxa®)와 엘리텍(Elitek®)이 있다.
크리스텍사(페글로티카제)는 통상적인 치료법에 불응하는 성인 환자의 만성 통풍 치료를 위해 승인된 페길화된 요산분해효소이다. 크리스텍사는 과페길화(사분자체당 약 440 kDa PEG)된, 돼지와 개코원숭이 요산분해효소 서열의 키메라 단백질이다. 크리스텍사는 2시간에 걸쳐 정맥 내(IV) 주입으로 투여된다. 3상 임상 시험 동안, 환자의 26%는 주입 반응을 경험하였고, 환자의 6.5%는 아나필락시스를 특징으로 하는 반응을 나타냈다(Baraf et al., Arthritis Res Ther ., 15(5):R137 (2013) 및 Strand et al., J Rheumatol ., 39(7): 1450~1457 (2012)). 크리스텍사는 아나필락시스 및 주입 반응에 대해 경고하는 복약 주의사항을 함유한다(크리스텍사 처방 정보 참조). 그 결과, 환자들은 전형적으로 이러한 IV 주입 전에 항히스타민 또는 코르티코스테로이드로 사전 치료한 다음, 주입 후 모니터링 된다. 사전 치료, IV 주입 및 주입 후 모니터링은 IV 클리닉에서 약 6 내지 8시간이 걸린다. 치료 빈도는 2주에 1회이다. 3상 임상 시험에서, 높은 비율의 환자들이 항약물 항체(약 92%)를 발달시켰으며, 대략 40%의 환자들이 양성 1차 종점(6개월 동안 6 mg/dl 미만의 UA 수준의 감소)을 경험하였다. 주입 반응, 항약물 반응 및 불편한 투약 일정에도, 통풍 결절(요산 결정 침전물)의 감소 또는 분해를 증명하는 극적인 결과가 임상 시험 및 사례 연구에서 관찰되었다. 여러 차례의 크리스텍사 치료 전과 후의 결절 통풍 환자들의 디지털 사진(손 또는 발)은 통풍 결절 및 UA 부하를 해결하는 데 있어서 요산분해효소의 가능성을 증명한 바 있다.
엘리텍(라스부리카제)는 항암치료를 받고 있으며 종양 용해 및 후속적인 혈장 요산의 상승이 발생할 것으로 예상되는, 백혈병, 림프종 및 고형 종양 악성 종양을 앓는 소아 및 성인 환자에서 혈장 요산 수준의 초기 관리를 위해 권고되는, 변형된 재조합 아스퍼질러스 플라버스(Aspergillus flavus) 요산분해효소이다. 엘리텍은 인간에서 16 내지 21시간의 반감기를 나타내며, IV 주입을 통해 매일 투여되어야 한다. 크리스텍사와 마찬가지로, 엘리텍도 (특히 G6PD 결핍증 환자에서) 아나필락시스와 용혈반응에 대해 경고하는 복약 주의사항이 있다. 투약 빈도(매일), 투여 경로(IV), 면역원성 및 비용 때문에 엘리텍이 만성 통풍 치료를 위해 선택될 가능성은 낮다.
전술한 관점에서, 당해 분야에는 현재 이용할 수 있는 요산분해효소보다 더 안전하고 편리하며 면역원성이 적은 개선된 요산분해효소를 개발할 필요성이 있다. 본 설명에 기술된 발명은 이러한 필요성을 충족한다.
I. 개선된 요산분해효소 서열
일부 양태에서, 다수의 상이한 요산분해효소 서열들이 본 설명에 포함된다. 본 설명에 기술된 요산분해효소는 서열 번호 1 내지 34 중 어느 하나와 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있는데, 이때, 이러한 서열은 서열 번호 27 내지 33 중 어느 하나가 아니다. 일 구현예에서, 이러한 요산분해효소는 서열 번호 1 내지 26 또는 34 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 이러한 요산분해효소는 서열 번호 1 내지 34 중 어느 하나와 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는데, 이때, 이러한 요산분해효소 서열은 자연 발생적 요산분해효소 서열이 아니다.
일부 구현예에서, 이러한 요산분해효소는 서열 번호 1과 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나 서열 번호 2와 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다.
일부 구현예에서, 이러한 요산분해효소는 서열 번호 1 내지 34 중 어느 하나와 약 1개 내지 약 35개 아미노산(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 또는 35개 아미노산)이 상이한 서열이다. 예를 들어, 이러한 요산분해효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2와 약 1개 내지 약 35개 아미노산이 상이할 수 있다.
일부 양태에서, 이러한 요산분해효소는 서열 번호 1 내지 34 중 어느 하나와 약 1개 내지 약 14개 아미노산(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14개 아미노산)이 상이한 서열이다. 예를 들어, 이러한 요산분해효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2와 약 1개 내지 약 14개 아미노산이 상이할 수 있다. 일부 양태에서, 이러한 요산분해효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2이다. 일부 구현예에서, 이러한 요산분해효소는 서열 번호 3 내지 26 또는 34 중 어느 하나이다. 이러한 요산분해효소는 아미노산 서열에 부가, 결실, 또는 치환을 포함하여, 서열 번호 1 내지 34 중 어느 하나와 "상이"할 수 있다. 아미노산 부가, 결실 및 치환 제조법은 당해 분야에 잘 알려져 있다.
일부 구현예에서, 이러한 요산분해효소는 N 말단 및/또는 C 말단에 절단을 포함할 수 있는데, 이때, 이러한 절단된 요산분해효소는 효소 활성을 보유한다. 일 구현예에서, 약 1개 내지 15개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개) 아미노산은 N 말단으로부터 절단된다. 또 다른 구현예에서, 약 1개 내지 20개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개) 아미노산은 C 말단으로부터 절단된다. 또 다른 구현예에서, 약 1개 내지 15개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개) 아미노산은 N 말단으로부터 절단되고, 약 1개 내지 20개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개) 아미노산은 C 말단으로부터 절단된다. 일 구현예에서, 이러한 요산분해효소는 서열 번호 27 내지 34 중 어느 하나의 요산분해효소로서, 이때, 이러한 요산분해효소는 위에 기술된 바와 같이, N 말단 및/또는 C 말단에 절단을 포함하며, 이러한 절단된 요산분해효소는 효소 활성을 보유한다. 추가적인 구현예에서, 전술된 절단된 요산분해효소는 약 1개 내지 약 14개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14개) 추가적인 아미노산 변화(예컨대, 부가, 결실, 또는 치환)을 함유한다. 요산분해효소의 효소 활성을 분석하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며(예컨대, 생성물 형성 및 기질 고갈 분석법), 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 방법은 본 설명에 기술된 요산분해효소들의 효소 활성을 측정하는 데 이용될 수 있다.
일부 구현예에서, 이러한 요산분해효소는 서열 번호 27 내지 33과 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다. 일부 양태에서, 이러한 요산분해효소는 서열 번호 27 내지 33 중 어느 하나와 약 1개 내지 약 35개 아미노산(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 또는 35개 아미노산)이 상이하다.
일 구현예에서, 이러한 요산분해효소는 NCBI 수탁 번호 D0VWQ1, WP_011525965, WP_010887803, WP_013581210.1, WP_011682147, WP_013569963, 또는 ADG06709와 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다. 일부 양태에서, 이러한 요산분해효소는 NCBI 수탁 번호 D0VWQ1, WP_011525965, WP_010887803, WP_013581210.1, WP_011682147, WP_013569963, 또는 ADG06709 중 어느 하나와 약 1개 내지 약 35개 아미노산(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 또는 35개 아미노산)이 상이하다.
일부 구현예에서, 이러한 요산분해효소는 서열 번호 27과 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다. 일부 양태에서, 이러한 요산분해효소는 서열 번호 27과 약 1개 내지 약 35개 아미노산(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 또는 35개 아미노산)이 상이하다.
일부 구현예에서, 이러한 요산분해효소는 서열 번호 28과 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다. 일부 양태에서, 이러한 요산분해효소는 서열 번호 28과 약 1개 내지 약 35개 아미노산(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 또는 35개 아미노산)이 상이하다.
발현된 단백질의 프로세싱이 원핵생물 숙주와 진핵생물 숙주에서 발생할 수 있는 번역 중 변형(co-translational modification)인 N 말단 메티오닌 잔기의 절단을 초래할 수 있다는 점은 잘 이해되고 있다(Sherman, et al., Bioessays, 3: 27~31 (1985)). 메티오닌 아미노펩티다제에 의해 효소적으로 영향 받는 이러한 프로세싱은 아미노 말단에 인접한 아미노산 잔기의 정체에 의존한다. 메티오닌은 두 번째 잔기가 글리신, 또는 알라닌과 같은 작은 곁사슬이 있는 아미노산일 때 단백질로부터 효율적으로 제거된다(Hirel et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A ., 86: 8247~8251 (1989) 및 Huang et al., Biochemistry, 26: 8242~8246 (1987)). 그러나 N 말단의 메티오닌은 큰 곁사슬이 있는 아미노산이 인접한 잔기일 때에는 절단되지 않는다. 두 번째 잔기가 트레오닌 또는 아스파라긴과 같은 중간 크기의 아미노산일 때에는 다양한 정도의 절단이 일어날 수 있다(Hirel 외, 위 참조). 따라서, 일부 구현예에서, 요산분해효소의 1번 위치의 메티오닌은 이러한 요산분해효소의 프로세싱된 형태가 1번 위치에 메티오닌을 함유하지 않도록 절단된다. 또 다른 구현예에서, 이러한 요산분해효소는 1번 위치에 이러한 메티오닌을 보유한다. 1번 위치에 있는 이러한 메티오닌의 절단을 방지하기 위해, 이러한 요산분해효소는 N 말단의 메티오닌 다음에 하나 이상의 아미노산 치환 또는 결실을 포함할 수 있다. 그러한 치환 또는 결실은 큰 아미노산이 서열 내에서 두 번째 위치에 있게 하기 위해 설계될 것이다. 큰 아미노산의 예는 글루타민, 글루탐산, 페닐알라닌, 메티오닌, 리신, 티로신, 트립토판 및 아르기닌이다. 예를 들어, 일부 양태에서, 이러한 요산분해효소는 2번 위치에 트레오닌을 포함하지 않을 수 있고, 2번 위치는 결실되거나 치환되는데, 이때, 이러한 넘버링은 서열 번호 27에 대한 것이다. 일부 구현예에서, 이러한 요산분해효소 서열은 2번 위치(즉, N 말단 메티오닌 옆의 아미노산)에 알라닌 또는 기타 작은 아미노산을 포함하도록 변형된 것이다. 작은 아미노산의 예는 글리신, 알라닌, 세린, 프롤린, 트레오닌, 발린 및 시스테인이나, 부분적인 프로세싱의 가능성을 제한하기 위해 이들 중 가장 작은 아미노산(글리신과 알라닌)에 우선권이 주어진다(Hirel 외, 위 참조).
일부 구현예에서, 이러한 요산분해효소 서열은 단백질의 반감기를 연장하기 위해 및/또는 면역원성을 완화하기 위해 합성 또는 생합성 고분자에 접합되거나 재조합으로 융합된다. 본 발명에 이용될 수 있는 예시적인 고분자는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 포스포릴콜린의 중합체(예컨대, 미국 특허 출원 공개공보 2013/0034517 참조), "PAS" 또는 "X-TEN" 서열과 같은 반복 펩티드의 중합체(예컨대, Schlapschy et al., Protein Eng . Des. Sel . 26: 489~501 (2013), Schellenberger et al., Nat. Biotechnol ., 27: 1186~1190 (2009) 및 Podust et al., Protein Eng . Des. Sel., 26: 743~753 (2013) 참조), 또는 헤파로산과 같은 탄수화물 기반의 중합체(예컨대, 국제 특허 출원 공개공보 WO 2014/060397 참조) 또는 하이드록시에틸 전분(예컨대, EP 2270036 참조)이다. 다른 구현예에서는, 이러한 요산분해효소 서열은 신장 제거율을 감소시킴으로써 순환 반감기를 연장하는 폴리펩티드에 재조합으로 융합될 수 있다. 그러한 융합 파트너는 당해 분야에 잘 이해되어 있으며, pH 의존적인 방식으로 신생아 Fc 수용체(FcRn)와 직접적으로 결합하거나(예컨대, 면역글로불린의 Fc 영역 또는 혈청 알부민), 자연 발생적인 FcRn 결합 모이어티와 대안적으로 결합하는(예컨대, 혈청 알부민과 결합하는 폴리펩티드) 작용제를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 이러한 요산분해효소 서열은 인간 융모성 생식선 자극호르몬의 베타 서브유닛으로부터 유래된 C 말단 펩티드 단편의 하나 이상의 반복부(repeat)에 접합되거나 재조합으로 융합될 수 있다(예컨대, 미국 특허 6,225,449 참조).
일부 구현예에서, 합성 또는 생합성 고분자는 단백질의 반감기를 연장하기 위해 및/또는 면역원성을 완화하기 위해 요산분해효소의 N 말단 및/또는 C 말단에 접합된다.
일부 구현예에서, 이러한 요산분해효소 서열은 접합을 위해 1 내지 6개(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개)의 표면 접근 가능한 부위를 생성하기 위해 개질된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 이러한 요산분해효소 서열은 고분자(예컨대, PEG)가 접합될 수 있는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 표면 접근 가능한 시스테인 잔기를 함유하도록 개질된다. 일부 구현예에서, 어떠한 시스테인도 함유하지 않거나 소수의 시스테인만을 함유하는 자연 발생적 요산분해효소 서열은 유익한 출발 서열을 제공하여, 시스테인들이 적절한, 표면 접근 가능한 위치로 삽입될 수 있다. 다른 구현예에서는, 이러한 요산분해효소 서열은 고분자가 접합될 수 있는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 표면 접근 가능한 비 자연 발생적 아미노산을 함유하도록 개질된다.
일부 구현예에서, 자연 발생적인 요산분해효소 서열은 기존의 시스테인의 일부 또는 전부를 (결실 및/또는 치환을 통해) 돌연변이시키기 위해 대안적인 아미노산으로 개질된다. 일부 구현예에서는, 새로운 시스테인들이 (부가 및/또는 치환을 통해) 원하는 위치에 도입되어, 약동학적 거동을 변형할 수 있는 고분자 또는 폴리펩티드의 부위 특이적인 접합을 가능하게 한다. 일 구현예에서, Cys 치환을 위한 적절한 아미노산의 선택은, 모든 요산분해효소에 걸친 균등한 위치에서의 자연적 아미노산의 다양성을 결정하기 위한, 관심 있는 요산분해효소의 다른 요산분해효소 서열에 대한 정렬에 의해 유도된다. 그런 다음, 다른 요산분해효소들 내의 관심 위치에서의 출현율을 기초로 비-시스테인 아미노산이 선택된다. 또 다른 구현예에서, Cys 치환을 위한 적절한 아미노산의 선택은, 어떤 아미노산 잔기들이 표면 접근 가능한지를 결정하기 위한, 특정 요산분해효소에 대한 결정 구조 분석에 의해 유도된다. 그런 다음, 하나 이상의 표면 접근 가능한 아미노산들이 선택되어 시스테인으로 변경된다. 경우에 따라서는, 최종적인 개질된 요산분해효소 서열 내의 시스테인들은 페길화될 수 있도록 표면 접근 가능한 위치에 놓인다.
일부 구현예에서, 이러한 요산분해효소는 약 1개 내지 약 6개 시스테인, 구체적으로는 약 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 시스테인을 포함한다. 일 구현예에서, 이러한 요산분해효소는 약 2개의 시스테인을 포함한다.
일부 구현예에서, 이러한 요산분해효소는 이러한 시스테인 잔기(들)에 부착된 PEG 모이어티를 포함한다. 시스테인 잔기의 수와 위치 조절은 PEG 부착 부위의 수, 그리고 그에 따른 접합체의 생물물리학적 속성 및 효소 활성을 포함한 최적의 성질에 대한 조절을 가능하게 한다.
폴리에틸렌 글리콜(PEG)는 H-(O-CH2-CH2)n-OH 구조의 폴리에테르 화합물이다. 단백질 접합에 가장 전형적으로 사용되는 PEG 시약은 구조 CH3-O-(CH2-CH2-O)n-X(이때, X는 선형 링커 및 반응성 기능 기를 함유한다 (선형 PEG))를 갖는, 모노메톡시 폴리(에틸렌 글리콜) 유도체이다. 경우에 따라서, X가 분지형 요소를 함유할 수 있어서, PEG 시약이 한 개의 반응성 기능기 및 두 개 이상의 PEG 고분자 사슬(분지형 PEG) 또는 두 개 이상의 반응성 기능기 및 PEG 고분자 사슬(포크형 PEG)을 함유한다. PEG 시약은 총 PEG 고분자를 약 5, 10, 20, 40, 60 및 80 kDa 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 시스테인 상의 티올 기와 반응시키는 데 티올 반응성 PEG가 이용될 수 있다. 예를 들어, PEG-말레이미드 뿐만 아니라, PEG-오르토피리딜-디설피드, PEG-비닐설폰 및 PEG-요오도아세트아미드가 이용될 수 있다. 다른 구현예에서, 티올 반응성 PEG는 하나의 티올 반응성 모이어티가 있는 선형 또는 가지형 구조를 가질 수 있거나, PEG 분자당 두 개 이상의 반응성 기가 있는 포크형 구조를 가질 수 있다.
따라서, 다양한 접근법이 당해 분야에 공지되어 있으며, 당해 분야에 공지된 임의의 적절한 방법을 이용하여 요산분해효소 내의 시스테인(들)을 페길화할 수 있다.
일부 구현예에서, 이러한 요산분해효소는 다음 위치: 11C, 33C, 119C 및142C 중 적어도 하나에 시스테인을 포함할 수 있는데, 이때, 이러한 위치 넘버링은 서열 번호 27에 대한 것이다.
일 구현예에서, 이러한 요산분해효소는 다음 위치: 11C, 33C, 119C, 120C, 142C, 196C, 238C, 286C 및 289C 중 적어도 하나에 시스테인을 포함할 수 있는데, 이때, 이러한 위치 넘버링은 서열 번호 27에 대한 것이다.
주요한 세포 부착 수용체 패밀리로서, 인테그린은 세포-세포 및 세포-세포 외 기질 상호작용에서 핵심 역할을 한다고 알려져 있다. 피브로넥틴 내의 트리펩티드 Arg-Gly-Asp(RGD)는 인테그린 결합을 통해 세포 부착을 매개하는 것으로 밝혀졌다. RGD 모티프를 함유하는 합성 펩티드는 잠재적인 암 치료제로서 인테그린 의존성 엔도시토시스에 의한 내재화를 위해 알파(v)-인테그린을 특이적으로 표적화하기 위해 생성되었다. 추정상, 인테그린 결합 모티프(RGD)는 말초 혈류에서 기능할 것으로 예상되는 치료제에서 문제가 될 수 있다. 따라서, 본 발명의 일부 양태에서, 이러한 요산분해효소는 RGD 서열을 포함하지 않는다.
아미노산을 돌연변이시키는 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있고, 그러한 방법은 RGD 아미노산 중 하나 이상을 임의의 다른 자연 발생적 아미노산으로 돌연변이시키는 데 이용될 수 있다. 일 구현예에서, RGD 모티프의 아르기닌은 세린으로 돌연변이되어, 이러한 요산분해효소는 RGD 대신 SGD를 함유한다. 또 다른 구현예에서, RGD 모티프 내의 아르기닌, 글리신 및/또는 아스파르트산은 임의의 다른 자연 발생적 아미노산으로 돌연변이되어, 이러한 요산분해효소는 RGD 모티프를 함유하지 않는다. 일 구현예에서, 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 다수의 요산분해효소 아미노산 서열들을 정렬하여 RGD 모티프가 존재하는 아미노산 위치에서 가장 높게 보존된 잔기를 결정하며, RGD 모티프에 존재하는 하나 이상의 아미노산은 그러한 특정 아미노산 위치에서 가장 보존되는 아미노산 잔기로 돌연변이된다. 예를 들어, RGD 모티프 중 G와 D가 높게 보존되는 경우, R만 그 특정 위치에서 가장 높게 보존되는 아미노산 잔기(예컨대, 세린)으로 돌연변이될 것이다.
본 설명에 개시된 요산분해효소 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 제조하는 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있어서, 당업자는 본 설명에 개시된 요산분해효소 아미노산 사열을 암호화하는 핵산 서열을 용이하게 제조할 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 본 설명에 개시된 요산분해효소 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 적절한 발현 벡터가 당해 분야에 공지되어 있고 이용 가능하여, 본 발명은 본 설명에 개시된 요산분해효소 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터도 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 이러한 발현 벡터를 포함하는 세포주를 포함한다. 이러한 세포주는 진핵생물 또는 원핵생물 세포주일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 이러한 세포주는 대장균, 코리네박테리움(corynebacterium) 또는 슈도모나스 플루오레센스(pseudomonas fluorescens)와 같은 원핵생물 세포주이다. 또 다른 구현예에서, 이러한 세포주는 사카로미세스 세레비시아에(saccharomyces cerevisiae), 곤충 세포 등과 같은 진핵생물 세포주이다. 중국 햄스터 난소(CHO) 세포와 같은 포유동물 세포주도 이용될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 본 설명에 기술된 요산분해효소를 포함하는 조성물을 포함한다. 일 양태에서, 이러한 조성물 내의 요산분해효소는 사분자체를 형성한다. 일부 양태에서, 이러한 조성물 내에 존재하는 요산분해효소 단량체의 적어도 93%(예컨대, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 심지어 100%)는 모노-페길화된 것이다(예컨대, 하나의 PEG 모이어티가 각 단량체에 존재한다). 일부 양태에서, 이러한 조성물 내에 존재하는 요산분해효소 단량체의 적어도 93%(예컨대, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 심지어 100%)는 디-페길화된 것이다(예컨대, 두 개의 PEG 모이어티가 각 단량체에 존재한다). 일부 양태에서, 이러한 조성물 내에 존재하는 요산분해효소 단량체의 적어도 93%(예컨대, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 심지어 100%)는 트리-페길화된 것이다(예컨대, 세 개의 PEG 잔기가 각 단량체에 존재한다).
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 설명에 기술된 요산분해효소 단백질의 사분자체와 같은 올리고머 단백질의 페길화 효율성을 결정하는 통계적 모형을 포함한다. 또한, 본 발명은 본 설명의 실시예 14에 기술된 바와 같이, 비 공유적으로 회합된 서브유닛들을 해리시키는 용이하게 접근 가능한 분석법으로부터 얻은 데이터로부터 올리고머 단백질의 전체 기능화를 도출하기 위한 통계 척도를 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 단백질의 크기와 성질 또는 접합체의 생물물리학적 성질이 본래의 조건 하에서 분석을 허용하지 않을 때 올리고머 단백질에 대한 전체 단백질 접합 계산을 가능하게 하는 다항 분포를 기초로 한 통계적 접근법을 포함한다.
II. 치료방법
일부 양태에서, 본 발명은 본 설명에 기술된 요산분해효소 중 임의의 것을 투여하여 요산 및/또는 UA 결정 부하 수준을 감소시키는 것을 포함하는, 고요산혈증 환자의 치료방법을 포함한다. 이러한 환자는 고요산혈증을 초래하는 임의의 수의 상태들을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 이러한 환자는, 만성 난치성 통풍, 결절성 통풍 및/또는 높은 UA 부하와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는, 통풍을 앓을 수 있다. 또 다른 예로서, 이러한 환자는 종양 용해 증후군을 앓거나 종양 용해 증후군의 위험이 있을 수 있다.
본 방법의 일부 양태에서, 이러한 요산분해효소는 피하로 투여될 수 있다. 다른 양태에서, 그것은 정맥 내로 또는 근육 내로 투여될 수 있다.
일부 치료방법의 경우, 이러한 환자는 치료 전에 6.8 mg/dL 보다 높은 혈청 UA 수준 및 치료 후에 6.8 mg/dL 보다 낮은 혈청 UA 수준을 나타낼 수 있다.
일부 구현예에서, 이러한 요산분해효소 또는 치료방법은 아나필락시스와 관련이 없다. 일 구현예에서, 이러한 요산분해효소 또는 치료방법은 비 면역원성이다.
실시예
실시예 1. 요산분해효소의 선택
공개적으로 이용 가능한 데이터베이스로부터 포유동물, 식물, 미생물 등의 요산분해효소를 포함한 200개가 넘는 요산분해효소 서열들을 정렬하였다. 유리한 생물학적 성질(예컨대, 대장균에서의 발현, 중성 pH 가용성, 중성 pH 활성), 다른 서열에 대한 낮은 서열 동일성 또는 유사성(다양성), 낮은 내인성 Cys 함량 및 자신의 요산분해효소가 유리한 성질(극한성, 호열성, 호산성 등)을 나타낼 것임을 시사하는 흥미로운 성질을 갖는 유기체를 포함한 (그러나 이에 한정되지 않는) 독자적인 기준을 이용하여 데이터베이스에서 이용할 수 있는 서열이 있는 후보 요산분해효소들을 선택하였다.
이러한 과정 후, 다음의 7개의 후보 서열들을 추가적인 조사를 위해 선택하였다: 아트로박터 글로비포미스 요산분해효소(서열 번호 27), 데이노코커스 제오써르말리스 요산분해효소(서열 번호 28), 데이노코커스 라디오두란스 요산분해효소(서열 번호 29), 그라눌리셀라 툰드리콜라 요산분해효소(서열 번호 30), 솔리박터 우시타투스 요산분해효소(서열 번호 31), 테리글로부스 사아넨시스 요산분해효소(서열 번호 32) 및 키르피디아 투시아에 요산분해효소(서열 번호 33). 또한, 여덟 번째 서열로서, 여러 요산분해효소 서열들의 정렬로부터 공통 요산분해효소 서열도 안출했다. 이러한 공통 서열은 서열 번호 34로 나타냈다. 아래 표 2에서 보는 바와 같이, 선택된 여덟 가지의 서열들 사이에 상당한 양의 다양성이 존재한다.
[표 2] 요산분해효소 서열 동일성 비교
Figure pct00016
실시예 2. 스크리닝 패러다임
추가적인 최적화를 위한 후보를 확인하기 위하여 초기 스크리닝 패러다임을 이용하였다. 실시예 1에 기술된 8가지의 요산분해효소 서열들을 아미노 말단 His 태그로 클로닝하고, 대장균에서 발현시켰다. 각각의 요산분해효소 구성체를 발현 수준에 대해, 특히 가용성 발현에 대해 평가하였다. 요산분해효소를 발현하는 대장균을 용해시키고, 가용성 물질을 불용성 (펠릿) 물질로부터 분리하였다. 용해물을 SDS-PAGE로 분리하였고, 단백질을 쿠마시 블루 염색으로 시각화하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, 대부분의 요산분해효소들은 불용성(P) 물질에 높은 수준으로 존재했다. 돼지-개코원숭이 키메라는 거의 전적으로 펠릿(P) (불용성) 분획에서 발현되는 것으로 보인다(도 1, 9번 레인). 세포액의 가용성(S) 발현은 유리한 성질로 간주되었다. 그런 다음, 이러한 8가지의 요산분해효소들을 Ni 친화성 크로마토그래피로 대장균 세포 용해물로부터 정제하였다. 280 nm에서의 흡광도를 측정하여 단백질 수율을 결정하였다. 질량분광분석법으로 단백질 크기를 확인하였고, 사분자체 형성은 크기 배제 크로마토그래피와 광산란검출로 확인하였다(아래 표 3 참조).
[표 3] 질량분광분석법 및 SEC-LS 분석
Figure pct00017
적합하지 않은 발현, 가용성 또는 정제 수율을 기초로 하여 세 가지 요산분해효소들, 즉, 솔리박터 우시타투스, 키르피디아 투시아에, 및 그라눌리셀라 툰드리콜라를 추가적인 평가로부터 배제하였다.
열 안정성을 평가하기 위해 시차 주사 열량계(DSC) 측정을 수행했다(아래 표 4 참조). 각각의 요산분해효소에 대해 2회의 전이가 관찰되었다. 테리글로부스 사아넨시스 및 데이노코커스 라디오두란스는 원했던 것보다 더 낮은 열 전이(TM1)을 나타냈고, 그 결과, 이들 두 요산분해효소들은 후보 풀에서 배제하였다. 도 2a 및 도 2b는 DSC 결과의 두 가지 예를 보여준 것이다(데이노코커스 제오써르말리스 요산분해효소(도 2a) 및 데이노코커스 라디오두란스 요산분해효소(도 2b)).
[표 4] 시차 주사 열량계 안정성
Figure pct00018
중성 pH 가용성 특징 및 pH 9.0과 7.4에서의 생성물 형성(H2O2) 관점에서의 활성에 대해 다섯 가지의 요산분해효소들(서열 번호 27, 28, 29, 32 및 34)을 평가하였다. 생성물 형성 분석에서, 알란토인 형성은 H2O2 형성에 비례하는데, H2O2 형성은 비색 고추냉이 퍼록시다제가 촉매하는 비색 반응과 연관이 있다. 과산화수소의 출현은 540 nm에서의 흡광도 증가로 측정할 수 있다. 생성물 형성 분석은 요산분해효소 활성의 관점에서 기질 고갈 분석과 비례하였다. 그러나 생성물 형성 분석은 시간에 따른 효소 활성의 지속적인 모니터링을 허용하지 않는다. Vmax와 Km 같은 반응속도 매개변수를 평가하기에는 기질 고갈 분석법이 훨씬 나았다.
기질 고갈(UA)은 요산분해효소 활성을 평가하는 또 다른 일반적인 방법이다. 기질 고갈 분석에서, 요산분해효소, UA 및 인산염 완충액을 명시된 온도(전형적으로 30℃)에서 1시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 요산분해효소를 1 μg/mL까지 희석하였고, 0.1M 인산염 완충액(PB), pH 7.4 내의 UA 곡선(400 μM을 23.8 μM까지 1:1.6으로 희석함)과 혼합하였다. 일부 분석에서, 1 mM DTT를 분석에 첨가하였다. 분자 장치(Molecular Device) 판독기 온도는 30℃로 설정하였다. 292nm에서의 흡광도 측정치를 10분 동안 20초마다 수집하였다. UA 분해 속도를 소프트맥스 프로(SoftMax Pro) 소프트웨어로 계산하였다. 이들 요산분해효소에 대한 Vmax와 Km을 계산하였다(아래 표 5 참조). 데이터를 도 3에 나타냈다. 각각의 곡선은 4320개의 특정 활성 데이터 포인트를 나타낸다.
[표 5] Vmax, Km 및 kcat/Km
Figure pct00019
반응속도 매개변수를 기초로, 두 가지 요산분해효소를 추가적인 연구를 위해 선택하였는데, 데이노코커스 제오써르말리스는 크리스텍사에 비해 2배의 개선된 Vmax를 나타냈고(10.8 대 5.7), 아트로박터 글로비포미스는 크리스텍사에 비해 2배 더 우수한 Km을 나타냈다(55.7 대 116.3). 두 요산분해효소들은 크리스텍사에 비해 약 2배 더 우수한 kcat/Km을 나타냈다. 마지막으로, 공통 요산분해효소는 우수한 반응속도를 나타냈지만, 이러한 공통 서열은 아트로박터 글로비포미스와 61.7% 동일한 반면, 데이노코커스 제오써르말리스와 아트로박터 글로비포미스는 서로에 대해 겨우 41.2% 동일하여, 이들 둘 사이에 더 큰 다양성이 존재함을 시사한다. 높은 정도의 다양성은 유리한 것으로 여겨졌으므로, 데이노코커스 제오써르말리스와 아트로박터 글로비포미스 요산분해효소들을 추가적인 연구를 위해 선택하였다.
실시예 3. 용량 모형화는 kcat이 가장 중요한 반응속도 매개변수임을 시사한다
통풍과 종양 용해 증후군 환자는 전형적으로 UA (>6.8 mg/dl, 408 μM)의 포화 수준을 나타낸다. 따라서 Vmax(kcat)가 치료적 요산분해효소를 위한 가장 중요한 반응속도 매개변수라는 가설을 세웠다. kcat(아트로박터 글로비포미스) 또는 Km (데이노코커스 제오써르말리스)의 개선을 기반으로 한 용량 모형을 생성하였다. 이러한 모형화는 개선된 km(데이노코커스 제오써르말리스)이 투여량 또는 빈도에 어떠한 장점도 제공하지 않을 것이라고 예측하였지만, 이러한 모형화는 개선된 kcat(아트로박터 글로비포미스)이 투여량 및 빈도의 관점에서 장점을 제공할 것이라고 예측하였다. 따라서, 용량 모형화 결과는 kcat이 치료적 요산분해효소를 위한 가장 중요한 반응속도 매개변수임을 시사한다.
실시예 4. 중첩 펩티드 분석을 기초로 한 면역원성
현재 이용 가능한 요산분해효소들의 경우, 면역원성이 임상에서 문제가 될 수 있는 것으로 밝혀진 바 있으므로, 아트로박터 글로비포미스 및 데이노코커스 제오써르말리스 요산분해효소 둘 다를 대상으로 추정되는 T 세포 면역원성에 대해 에피스크린(EpiScreen™) 분석으로 스크리닝 하였다. CD4+ T 세포 에피토프의 존재에 대해 중첩 펩티드를 이용하여 두 요산분해효소들의 서열을 분석하였다(에피스크린 T 세포 에피토프 매핑 분석). HLA-DRB1 일배체형의 단면을 나타내고자 스크리닝된 54명의 건강한 공여자 코호트에 대해 요산분해효소 아트로박터 글로비포미스의 서열을 포괄하는 총 93개의 중첩 15분자체 펩티드와 데이노코커스 제오써르말리스의 경우 94개를 시험하였다. 개별적인 펩티드에 대한 CD4+ T 세포 반응을 3H 티미딘 도입 증식 분석법을 이용하여 측정하였고, 그 결과를 두 개의 요산분해효소 서열들의 T 세포 에피토프 맵을 편성하는 데 이용하였다. 분석에서 3개 이상의 공여자 시료가 2.00 보다 큰 CD4 자극 지수 점수를 유도했을 경우 추정상의 T 세포 에피토프가 고려되었다. 아트로박터 글로비포미스 서열에서 총 다섯 개의 추정상의 T 세포 에피토프가 확인되었다. 이 경우, 어떠한 펩티드도 4개가 넘는 공여자 시료에서 T 세포 반응을 유도하지 못했다(<10%). 또한, 각각의 양성 펩티드에 대한 자극 지수 규모는 상대적으로 낮아, 이들 펩티드가 강력한 T 세포 에피토프가 아닐 수 있음을 시사하였다. 데이노코커스 제오써르말리스의 중첩 펩티드 T 세포 분석은 여섯 개의 추정상의 에피토프의 존재를 시사하였다. 이들 펩티드 중 일부는 10%가 넘는 스크리닝된 공여자에서 양성의 T 세포 반응을 유도하였고, 반응(자극 지수)의 규모는 더 컸다.
이들 결과 및 아트로박터 글로비포미스에 대한 개선된 Vmax를 기초로 하여, 이 서열을 추가적으로 최적화할 것을 결정하였다.
실시예 5. 아트로박터 글로비포미스 요산분해효소에 대한 서열 진화
A. 초기 서열 진화
서열 번호 22를 개질하여 N 말단 His 태그와 짧은 링커를 부가하였고, C 말단 Cys를 제거하기 위해 C 말단의 11개 아미노산을 절단하여, 서열 번호 21을 생성하였다.
B. RGD를 SGD로 변환
주요한 세포 부착 수용체 패밀리로서, 인테그린은 세포-세포 및 세포-세포 외 기질 상호작용에서 핵심 역할을 한다고 알려져 있다. 피브로넥틴 내의 트리펩티드 RGD는 RGD 모티프를 통해 세포 부착을 매개하는 것으로 밝혀졌다. 추정상, 인테그린 결합 모티프(RGD)는 말초 혈류에서 기능할 것으로 예상되는 치료제에서 문제가 될 수 있다. 서열 번호 21과 서열 번호 22 둘 다는 RGD 모티프를 함유한다. 이러한 RGD가 표면 접근 가능한지를 결정하기 위해 M21 종양 세포 부착 분석법을 수행하였다. M21 세포는 αvβ3 및 αvβ5 인테그린을 발현하기 때문에 이를 이용하였다. RGD를 함유하는 피브로넥틴 기질, PBS(음성 대조군), 또는 시험 품목을 PBS 내에 밤새 0~100 ug/ml로 ELISA 플레이트에 코팅하였다. 코팅된 플레이트 위에 형광으로 라벨링한 (칼세인-AM) M21 세포를 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 결합되지 않은 세포들을 씻어내고, 결합된 세포들을 총 형광으로 측정하였다. Fab9mCys는 CDR-H3 루프 내에 RGD를 함유하는 IgG로, 피브로넥틴과 함께 양성 대조군으로 작용한다. 결과를 도 4에 나타냈으며, 아트로박터 글로비포미스 요산분해효소를 함유하는 RGD가 M21 세포와 결합함을 보여준다. 이들 데이터는 아트로박터 글로비포미스 요산분해효소 내의 RGD가 표면 접근 가능함을 시사한다.
200개가 넘는 정렬된 요산분해효소의 데이터베이스를 이용하여, RGD 모티프 내의 글리신(G)과 아스파르트산(D)이 정렬된 요산분해효소들 전반에 걸쳐 고도로 보존되었음이 결정되었다. 그러나 아르기닌(R)은 고도로 보존된 위치가 아니었고, 이 위치의 공통 잔기는 세린(S)이었다. 따라서, 부위 특이적인 돌연변이유발을 이용하여 RGD 모티프 내의 R을 S로 교체하여, RGD를 SGD로 만들었다. 이러한 개질은 잠재적인 인테그린 결합 모티프를 제거하여, 서열 번호 20을 갖는 요산분해효소를 생성하였는데, 이때, 나타낸 바와 같이, 이러한 서열의 N 말단의 His와 링커 태그는 선택적이다.
C. SGD 개질 평가
RGD의 SGD로의 돌연변이를 발현, 가용성, 정제 수율 등에 미치는 영향에 대해 평가하였다. SGD 돌연변이는 가용성 발현을 약간 감소시켰던 것으로 보이나, 배양 조건을 최적화하여 가용성 발현을 개선할 수 있다.
RGD의 SGD로의 돌연변이는 인테그린 결합 분석에서 현저한 감소를 보여주었다(도 4 참조). 두 요산분해효소를 pH 7.4에서의 활성에 대해 평가하였다. SGD 돌연변이는 비슷한 활성을 나타내는 것으로 보인다(도 5 참조).
실시예 6. 개질된 아트로박터 글로비포미스 요산분해효소의 면역원성 평가
A. 론자(LONZA) 면역원성 분석(에피베이스(Epibase®))
아트로박터 글로비포미스 요산분해효소(서열 번호 22)는 에피스크린 분석을 기초로 한 다섯 개의 추정상의 T 세포 에피토프를 가졌지만, 이들 중 어떤 것도 10%를 초과하는 공여자 시료에서 강한 반응을 이끌어내지 못했다. 또한, 중첩 합성 펩티드 T 세포 에피토프 분석법은 MHC-클래스 2 에피토프를 과잉 예측하는 것으로 알려져 있다. 이는 아마도 모든 잠재적인 펩티드 변이체가 이러한 단백질 치료제의 내인성 엔도솜 분해 과정 내에 존재하지는 않을 것이라는 사실 때문이다. 그 결과, 개질된 아트로박터 글로비포미스(서열 번호 18)가 에피베이스 면역원성 분석에서 홀로단백질(holoprotein)으로 스크리닝되었다. 에피베이스 분석법은 "면역원성 위험"을 평가하는 데 사용되는 인간 PBMC T 세포 면역원성 분석법이다. 이 분석법이 반드시 임상적인 면역원성을 예측할 수 있는 것은 아니지만, 반응자 수와 전체적인 반응 규모(자극 지수)를 기초로 "높은 위험"과 "낮은 위험" 단백질을 확인하는 데 이용될 수 있다. 이 분석법에서, 202명의 정상 공여자로부터의 PBMC 시료들을 사용하여 음성 대조군(완충액)과 양성 대조군(KLH)에 대한 요산분해효소 후보의 T 세포 면역원성을 스크리닝하였다. 이제, 202명의 공여자를 선택하여 백인 모집단에서의 HLA-DRB1 빈도를 나타냈다(도 6 참조). 냉동 스톡으로부터의 PBMC를 해동시켜, 96웰 플레이트에 웰당 3x105개 세포의 밀도로 첨가하였다. 시험 품목을 배지에 30ug/ml로 첨가하였다(완충액, KLH, 서열 번호 18). 각각의 시험 조건을 8반복(n=8)으로 수행하였다. PBMC를 7일 동안 배양하였다. 7일째에, PBMC를 표면 CD3+ 마커와 CD4+ 마커에 대해 표시하였다. 증식성 CD4+ T 세포를 유동 세포 계측법으로 확인하였다. 자극 지수(SI) 값은 처리되지 않은 웰에 대하여 처리된 항원에서의 증식성 CD3+CD4+ T 세포의 비율을 나타낸다. >2의 SI 값은 p 값 <0.05에 의해 뒷받침되는 양성으로 간주된다. 전체 모집단에 대한 T 세포 반응의 규모를 계산하여 모집단 면역원성 분석 또한 결정하였다.
결과는 다음과 같았다: 음성 대조군 - 0개/202개 공여자 시료(0%)가 평균 모집단 SI=1.0으로 반응함; 요산분해효소 후보 - 1개/202개 공여자 시료(0.5%)가 평균 모집단 SI=1.03으로 반응함; 양성 대조군 - 181개/202개 공여자 시료(91%)가 평균 SI=4.2로 반응함. 개별적인 공여자 데이터를 도 7a 내지 도 7c에 나타냈다. 도 7a는 완충액(음성 대조군) 자극 지수가 1.0이고, KLH(양성 대조군)는 91% 반응(SI>2)을 나타냈음을 보여준다. KLH 평균 전체 SI=4.2. 도 7b는 완충액 대조군과 비교한 요산분해효소 후보를 보여준다. 이 분석법에서 4% 이하의 반응 비율은 "낮은 위험"으로 간주되며, 다른 잠재적인 임상 화합물의 이력 스크리닝은 20~25% 면역원성 범위의 비율을 생성했다. 도 7c는 완충액 자극 지수가 1.0이고, KLH 자극 지수가 4.2이며, 요산분해효소 후보 자극 지수는 1.03임을 보여준다. 이 분석법이 반드시 임상적인 면역원성을 예측할 수 있는 것은 아니지만, 면역원성의 위험을 평가하는 데 사용될 수 있으며, 이들 데이터는 평가된 요산분해효소가 임상적 면역원성이 "낮은 위험"임을 시사한다. 시험했던 요산분해효소 단백질 서열의 기원이 미생물(아트로박터 글로비포미스)임을 고려할 때, 이것은 꽤 놀라운 발견이다.
실시예 7. His 태그 제거
생성된 요산분해효소 단백질을 정제하는 효율적인 방법(즉, Ni 친화성 정제)을 제공하기 위해 요산분해효소 서열의 N 말단에 N 말단 His 태그를 부가하였다. 이러한 His 태그는 발견 중에는, 특히 정제 분야에서는 장점을 제공하지만, 의약 제품 제조 전에는 His 태그를 제거하는 것이 바람직하다.
실시예 8. N 말단 최적화
단백질이 대장균에서 발현될 때 N 말단의 메티오닌은 이러한 메티오닌 뒤의 두 번째 잔기에 따라 Met 아미노펩티드 분해효소에 의해 제거될 수 있음은 잘 알려져 있다. 작은 잔기가 이러한 두 번째 위치에 있는 경우, 절단은 전형적으로 발생한다. 부피가 큰 잔기가 이러한 두 번째 위치에 있는 경우, 절단은 발생하지 않는다. 반면, 이러한 두 번째 잔기가 부피가 크지도 않고 특별히 작지도 않은 경우, Met 아미노펩티드 분해효소는 일부 Met을 절단하도록 기능할 수 있지만, 전부가 이질적인 약물을 생성하지는 않는다. 3종의 N 말단 변이체를 생성하여, 최적의 N 말단 서열을 결정하기 위해 발현, 가용성, 메티오닌 절단 및 활성에 대해 분석하였다.
이러한 과정에 대한 출발 서열은 서열 번호 12였고, 세 가지 변이체를 생성하였다. 서열 번호 13(변이체 1)은 Thr2의 결실이 있다. 서열 번호 14(변이체 2)는 Thr2-Ala5의 결실이 있으며, N 말단의 Met은 보유될 것이라 예상되었다. 서열 번호 15(변이체 3)는 Thr2-Thr9의 결실이 있으며, N 말단의 Met이 프로세싱될 것으로 예상되었다.
이러한 3종의 N 말단 요산분해효소 변이체를 클로닝하고 대장균에서 발현시켜 정제하였다. 각각의 구성체는 His 태그를 붙인 구성체와 비슷한 가용성 분획으로 발현되었다. His 태그가 없기 때문에, 이들 구성체에 대한 정제 과정을 계획하였다. 간단히 설명하면, 이것은 Q 이온 교환 크로마토그래피 단계(완충액 A: PBS, pH 7.8, 5 mM DTT; 완충액 B: 10x PBS, pH7.2)에 이어 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 포함했다. SEC로부터의 분획들을 SDS-PAGE 상에서 구동하였고, 단백질들을 쿠마시 블루 염색으로 시각화하였다. 높은 수준의 요산분해효소를 함유하는 분획들을 추가적인 분석을 위해 합했다. 도 8a는 His 태그를 붙인 구성체(표지된 SGD)에 대한, 정제된 조제물로부터의 쿠마시 블루 염색된 SDS-PAGE를 나타낸 것이다. 변이체 1과 변이체 3은 N 말단 메티오닌이 프로세싱(제거)된 것으로 나타났으나, 변이체 2는 N 말단 메티오닌을 보유한 것으로 밝혀졌다. 모든 프로세싱은 균일한 것으로 나타났다.
도 8b는 V1, V2 및 V3의 활성을 나타낸 것이다. 변이체 1과 변이체 2는 변이체 3보다 상당히 우수한 활성을 나타냈다. 추가적인 개발을 위해 변이체 1을 선택했다.
실시예 9. 특이적 페길화(PEGylation)
치료적 단백질의 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로의 개질은, 선택된 단백질 잔기(예컨대, 리신 곁사슬)에 대한 무작위 부착으로 수행될 수 있거나, 고유의 사전 결정된 자리에 대해 부위 특이적일 수 있다. 후자의 접근법은 접합 화학이 더 우수하게 조절될 수 있고, 일관되게 제조될 수 있어서, 정의된 생물활성을 나타내는 고도로 균일한 페길화 생성물을 생성한다는 장점이 있다. 부위 특이적인 부착 방법 중에서도, 가장 널리 사용되는 접근법은 쌍을 이루지 않은 시스테인 잔기에 대한 짝지음으로, 이것은 단백질 서열 내로 하나 이상의 자유 시스테인 잔기를 도입하는 것을 수반한다. PEG로의 개질 후에 접합 생성물의 생물활성 또는 생물물리학적 성질에 어떠한 부정적인 영향도 미치지 않도록 Cys 도입을 위한 부위는 조심스럽게 선택될 수 있다.
서열 번호 27에 기술된 아트로박터 글로비포미스 요산분해효소 서열은 오로지 하나의 천연 C 말단 Cys 잔기를 함유하고 있어서 시스테인을 기반으로 한 부위 특이적 개질에 특히 적절하다. 단백질이 Cys을 함유하지 않도록 C 말단 영역을 절단하였다(서열 번호 18과 서열 번호 20). 따라서, 이러한 단백질의 Cys 반응성 시약에 의한 개질은 Cys 잔기들이 도입된 부위들로 용이하게 제한된다. 아트로박터 글로비포미스 요산분해효소 서열에서 Cys 잔기 도입을 위한 잠재적인 부위를 선택하기 위해, 다음의 기준을 고려하였다:
i. 티오 반응성 PEG 시약과의 효율적인 반응을 보장하기 위해 단백질의 용매 노출된 표면 상에 부위가 존재해야 하고;
ii. 활성에 영향을 미칠 위험을 피하기 위해 부위는 효소 활성 자리와 가깝지 않아야 하고;
iii. 한 부위의 페길화가 다른 부위들의 페길화를 입체적으로 저해하지 않도록 부위들은 서로 인접하지 않아야 한다.
또한, 요산분해효소의 사분자체 속성을 고려하여, ii와 iii의 경우에 서브유닛 내 거리와 서브유닛 간 거리 이상적으로는 고려되어야 한다.
이러한 고려사항들과 관련된 매개변수를 계산하기 위해, 아트로박터 글로비포미스 요산분해효소의 3차원 구조를 사용하였다. 제한된 수의 상이한 요산분해효소 구조들이 보고된 바 있는데, 이들 가운데 하나는 요산 기질에 결합된 아트로박터 글로비포미스 요산분해효소의 결정 구조이다(PDB 수탁 코드: 2YZB)(도 10a 참조). 이러한 구조의 원자 좌표를 사용하여 다음 매개변수 세트를 계산하였다:
i. 이 요산분해효소 내의 각각의 아미노산 잔기를 위한 용매 접근 가능한 영역의 표면적 및
ii. 요산 기질의 각각의 곁사슬 Cα 원자와 C5 원자 사이의 원자 거리(Cα-C5 거리).
시스테인으로의 치환을 위한 아트로박터 글로비포미스 요산분해효소 내의 바람직한 위치를 확인하기 위해, 다음의 기준을 초기에 설정하였다. 먼저, > 100 Å 2의 전체 용매 접근 가능한 표면적 및 > 25 Å 의 Cα-C5 거리(즉, 요산분해효소 사분자체에 결합된 4개의 요산 분자들에서 각각의 C5에 대한)를 나타내는 잔기들을 확인하였다. 둘째, 추가적인 제한으로써, 임의의 주어진 요산분해효소 잔기의 경우, 이들 기준은 모든 네 개의 서브유닛에서 충족되어야 했다. 각각의 요산분해효소 서브유닛 내의 287개 아미노산 잔기들 중에서, 오로지 9개만이 이들 기준을 충족했다. 이들은 Thr11; Asn33; Asn119; Asp120; Ser142; Glu196; Pro238; Glu286 및 Arg289였다. 그런 다음, 사분자체 구조 전체에 걸친 이러한 잔기들 세트 내에서의 Cα 원자쌍들 사이의 원자 거리의 매트릭스를 계산하여 세 번째 기준을 고려하였다(표 6 참조). 이러한 분석으로부터, 시스테인으로의 치환을 위한 바람직한 잔기들로 Thr11, Asn33, Glu196 및 Asn119를 선택하였는데, 이는 사분자체 전체에 걸친 그것들의 Cα 원자들이 잘 분리되기 때문이다(모든 쌍의 경우 ≥ 19.5 Å).
아래의 표 6은 요산분해효소 구조 2YZB 내의 선택된 Cα 원자들 사이의 원자 거리(단위: Å)를 나타내는 매트릭스이다. 서브유닛은 글자, 즉, -A, -B, -C, -D로 나타냈다. 이러한 사분자체의 고도로 대칭적인 속성 때문에, 아래의 거리 세트는 사분자체에 걸친 모든 거리 쌍들을 특징 짓는 데 충분하다(예: T11-A에서 T11-B까지의 거리는 T11-C에서 T11-D까지와 동일하다; T11-A에서 T11-C까지는 T11-B에서 T11-D까지와 동일하다; T11-A에서 T11-D까지는 T11-B에서 T11-C까지와 동일하다).
[표 6] 원자 거리(단위: Å)를 나타내는 매트릭스
Figure pct00020
실시예 10. 부위 특이적 페길화를 위한 요산분해효소의 시스테인 함유 변이체
요산분해효소 단량체당 1개, 2개, 3개 및 4개 Cys 잔기의 다수의 상이한 조합을 생성하였다. 이것들을 페길화 전과 후에 발현, 가용성, 순도 및 활성에 대해 분석하였다. 용매에 노출된 Cys의 속성 때문에, 이들 구성체는 환원 조건 하에서 보관되지 않을 경우 응집하는 경향이 있다(이황화 결합). 이것은 정제 및 분석 과정 중에 환원제(DTT 또는 기타)의 존재를 필요케 한다. 일단 이러한 Cys이 페길화되면, 환원제는 더 이상 필요하지 않다. Cys을 함유하는 구성체들의 시험했던 모든 순열들을 페길화 전과 후에 발현시키고, 정제하여, 우수한 활성을 증명할 수 있었다.
도 10a는 아트로박터 글로비포미스 요산분해효소(PDB 수탁 코드: 2YZB)(1)의 사분자체 결정 구조 내의 3차원적인 용매 접근 가능한 부위를 나타낸 것이다. 이러한 사분자체 효소의 각각의 요산분해효소 단량체 서브유닛을 나타냈고, 시스테인으로의 치환을 위해 선택된 잔기들(T11, N33, S142)을 확인했다. 이러한 곁사슬들은 고도로 표면에 노출된 것으로, 서로 거리를 두고 있으며, 사분자체 내에서 각각의 활성 자리로부터 떨어져 있다. 두 가지의 Cys을 함유하는 변이체(T11C, N33C(서열 번호 17) 및 T11C, N33C, S142C(서열 번호 16))을 페길화 전과 후에 발현, 가용성, 순도 및 활성에 대해 분석하였다. 도 9a는 논(non)-Cys(서열 번호 20), 디-Cys(T11C, N33C)(서열 번호 17) 및 트리-Cys(T11C, N33C 및 S142C)(서열 번호 16) 요산분해효소 활성을 나타낸 것이다. 모든 분석은 이황화 결합의 가능성을 제거하기 위해 DTT 존재 하에서 수행한 것이다.
실시예 11. 페길화 최적화
요산분해효소에 의한 UA의 장기적인 억제는 반감기 연장을 위해 이러한 분자가 어느 정도 개질될 것을 요구한다. 페길화되지 않고, 어떠한 접합체 반감기 연장 성질도 함유하지 않은, 상업적으로 이용 가능한 라스부리카제는 인간에서 16 내지 21시간의 반감기를 나타내며, 종양 용해 증후군을 위해 매일 IV 투여를 필요로 한다(Ueng et al 2005). 페길화는 임상 전에 다수의 요산분해효소들의 반감기를 연장하기 위해 이용되어 왔다. 크리스텍사는 활성 사분자체의 표면에 접합된 대략 44 X 10 kDa PEG 분자(사분자체당 대략 440 kDa의 총 PEG)를 함유하는 과페길화 요산분해효소이다. 문헌에 따르면, 크리스텍사의 초기 개발 과정에서, PEG는 효과적으로 외래 단백질인 요산분해효소를 차폐하여 면역원성을 낮출 것이라는 가설이 세워졌었다(Hershfield 외, 2010 PNAS). 효소 활성을 보유하면서 이러한 요산분해효소의 표면 상에 PEG의 양을 최대화하기 위해 전임상 연구를 수행하였다. 사분자체당 44 X 10 kDa PEG가 이러한 요산분해효소에 접합되어 효소 활성을 보유할 수 있는 최대 PEG 양인 것으로 밝혀졌다. PEG 접합은 1차 아민을 무작위로 페길화하여 달성되었다. 크리스텍사 시험으로부터의 임상 데이터는 환자의 약 90%가 항-크리스텍사 약물 반응을 발달시킴을 보여준다(Lipsky et al 2014 Arthritis Research & therapy). 이러한 항-약물 반응의 많은 비율은 단백질이 아닌 PEG에 있는 것으로 보인다. 가장 주목할만한 점은 항-약물(PEG) 반응을 발달시킨 환자들로부터의 항체가 비-요산분해효소 페길화 단백질과 결합하여, 이러한 반응이 PEG에 대한 것이지 단백질 또는 단백질-PEG 계면에 대한 것이 아님을 증명한다는 사실이다. 이러한 시험 전에는, 페길화된 치료제의 PEG 모티프는 면역원성을 나타낼 것 같지 않다는 것이 일반 통념이었다. 페길화 치료제의 대다수는 반감기를 연장하기에 충분한 PEG만을 함유하며, 크리스텍사와 같이 "과페길화"되지 않는다. 한 가지 가설은 크리스텍사 상의 PEG 양은 이러한 약물과 관련된 항-PEG 면역원성을 유발했다는 것이다. 크리스텍사 사분자체는 약 136 kDa이고, 표면에 접합된 PEG는 대략 440 kDa이다. 이는 약 576 kDa 분자로 이어지며, 페길화 치료제로서는 전례 없는 크기이다. 그 결과, 실시예 10에 기술된 바와 같이, 부위 특이적 페길화를 위한 제한된 수의 Cys 잔기들을 조작하였다.
처음에는 2개(디-시스) 또는 3개(트리-시스) 시스테인이 있는 요산분해효소들을 정제의 편리함을 위한 His 태그와 함께 생성하였다. 도 9a는 이들 디-시스 요산분해효소와 트리-시스 요산분해효소가 요산분해효소 활성을 보유하고 있음을 나타낸 것이다.
시간, pH, 인산염 농도, NaCl, 단백질, PEG 및 TCEP를 바꾸어 디-페길화 반응 조건을 최적화하였다. 더 높은 PEG 농도는 페길화 효율을 개선하는 것으로 나타났고, 더 높은 TCEP 농도는 페길화 효율을 약간 감소시켰다. 다른 변수들은 페길화 효율에 거의 영향을 미치지 않았다. 아래 표 7은 페길화를 최적화하기 위해 시험했던 변수들과 달성된 최적화 조건을 나타낸 것이다.
[표 7] 페길화의 최적화
Figure pct00021
도 9b는 디-페길화 요산분해효소와 트리-페길화 요산분해효소가 요산분해효소 활성을 보유하고 있음을 나타낸 것이다.
SDS-PAGE에 의한 디-페길화 물질의 분석(도 10b) 결과, 단백질 대부분이 PEG와 균일하게 접합되었음이 확인되었다. 이러한 디-페길화된 물질의 역상 크로마토그래피 분석은 92.6%가 디-페길화되었고, 4.4%가 모노-페길화되었음을 시사하였고, 과페길화된 소량의 물질(약 3%)이 관찰되었다(도 10c). 페길화는 요소 활성에 영향을 미치지 않는 것으로 보였다. 디-페길화된 물질은 비-페길화된 효소와 비교하여 비슷한 UA 산화 비율을 나타냈다(도 10d). 트리-페길화된 물질의 경우에 비슷한 결과가 얻어졌다(데이터 미도시). 이러한 분석 방법은 요산분해효소의 4차 구조를 파괴하지만, 호모테트라머로서 이러한 디-PEG 요산분해효소에 대한 우세한 자연 상태의 생성물은 8 x 10 kDa PEG 사슬을 가질 것으로 예상되는 한편, 트리-PEG 요산분해효소는 12 x 10 kDa PEG 사슬을 가질 것으로 예상된다.
확인된 최적화된 페길화 조건(표 7 참조)을 기초로 하여, his 태그를 붙이지 않은 디-PEG 요산분해효소와 트리PEG 요산분해효소를 생성하고 정제하고 페길화 효율과 효소 활성을 분석하였다. 이들 페길화된 분자들을 생체 내 PK 연구에서 추가적으로 분석하였다.
실시예 12. 디-PEG 요산분해효소와 트리-PEG 요산분해효소에 대한 생체 내 PK
2종의 페길화된 요산분해효소(디-PEG T11C, N33C 및 트리-PEG T11C, N33C, 및 S142C)를 랫트 연구에서 평가하였다. 랫트에서 페길화된 요산분해효소의 PK를 시험한 전례(Zhang et al, 2012 International Journal of Pharmaceutics)가 있었기에 랫트 연구를 선택했다. 본 분석에서는 서열 번호 16과 17을 이용하였다. 디-페길화 요산분해효소와 트리-페길화 요산분해효소 둘 다에 대해 랫트에서 생체 내 약물동력학을 결정하였다. 각 군의 4마리의 랫트에 5 mg/kg으로 IV 투여하였고, (-1일), 주사 후 0.5, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 96시간 및 마지막에 144시간에 10가지의 시료를 수집하였다. 혈청 분리관에 전혈을 수집하고 동결시켰다. 잔여 요산분해효소 활성에 대해 혈청을 분석하였고, 데이터를 적정 곡선에 맞추었다. 랫트에 들어간 요산분해효소(사전 용량)와 혈청으로부터 측정된 요산분해효소(사후 용량)의 효소 특이적 활성은 비슷해서, 생체 내 연구 기간 동안 활성이 보유되었음을 시사하였다. 도 11a는 디페길화 및 트리-페길화 요산분해효소가 페길화되지 않은 요산분해효소보다 실질적으로 더 긴 반감기를 나타냄을 보여준다. 페길화되지 않은 요산분해효소는 본 연구에서 2~3시간의 반감기를 나타낸다(도 11a, 삼각형). 디-페길화 요산분해효소와 트리-페길화 요산분해효소는 단상성 프로파일을 나타낸다. 각 요산분해효소의 반감기, 분포 용적(Vd) 및 제거율을 아래 표 8에 나타냈다. 변동 계수는 괄호 안에 백분율로 표시하였다.
[표 8] 디-페길화 요산분해효소와 트리-페길화 요산분해효소에 대한 랫트 PK
Figure pct00022
표 8에 나타낸 결과는 디-PEG와 트리-PEG가 매우 비슷한 약물동력학 프로파일을 나타냈으며, 트리-PEG가 디-PEG보다 약간의 장점이 있음을 나타낸다. 그러나 제조 및 분석과 관련하여 디-PEG가 약간 더 바람직하다고 여겨졌으며, 따라서 디-PEG T11C, N33C을 추가적인 시험을 위해 선택하였다. 크리스텍사보다는 실질적으로 더 적은 PEG를 가져, 이러한 디-페길화 요산분해효소는 면역원성의 관점에서 유리할 수 있다.
동일한 랫트 PK 연구에서 크리스텍사의 약물동태학적 거동도 평가하였다. 디-페길화 요산분해효소와 트리-페길화 요산분해효소와는 달리, 크리스텍사는 단상성 제거를 나타내지 않고, 처음 2시간 내에 크리스텍사가 신속히 제거된 후에 더욱 점진적인 제거 프로파일을 나타내는 복합 프로파일을 나타냈다(도 11a, 사각형). 이러한 크리스텍사 제거 프로파일은 디-페길화 요산분해효소와 트리-페길화 요산분해효소의 제거 프로파일과는 분명히 다르다.
SC로 투여된 디-페길화 요산분해효소의 PK를 개에서 연구하였다. 개에서 페길화된 요산분해효소의 PK를 시험한 전례(Pegloticase/ Krystexxa® FDA BLA No. 125293, section 2.6.5.4.1)가 있었기에 개 연구를 선택했다. 3 mg/kg 및 10 mg/kg으로 개에 SC 투여하였고, 다양한 시점에서 혈청 또는 혈액 시료를 수집하고, 요산분해효소 활성(PK) 및 요산(PD)을 분석하였다. 개로 들어간 요산분해효소(사전 용량)와 혈청으로부터 측정된 요산분해효소(사후 용량)의 효소 특이적 활성은 비슷해서, 생체 내 연구 기간 동안 활성이 보유되었음을 시사하였다. 도 11b는 SC 투여 경로를 통해 개로 전달된 디-페길화 요산분해효소는 3 mg/kg (n=3)의 경우 1.81 ±0.31일 및 10 mg/kg (n=3)의 경우 1.82 ±0.22일의 반감기를 나타냈음을 보여준다. UA 수준의 실질적인 감소(약 85%)가 관찰되었고, 혈청 요산분해효소 수준에 비례하는 것으로 보인다(도 11b). 요산분해효소 수준이 고갈됨에 따라 혈중 UA 수준은 정상으로 회복되었다.
실시예 13. 생체 외 활성 및 안정성 평가
생체 내 매트릭스 환경 및 온도를 모방하기 위해 37℃의 50% 인간 혈청(전혈은 약 50% 혈청임)에서 디-PEG 요산분해효소(서열 번호 1) 활성을 평가하였다. 다음과 같이 분석을 수행하였다: UA, 인산염 완충액 및 혈청을 37℃까지 가온하였다. 모든 반응 단계는 37℃에서 수행하였다. 요산분해효소를 20~30분 동안 혈청에 8 ug/mL까지 희석시켜 인간 혈청 시료 내의 내인성 요산을 고갈시켰다. 그런 다음, 인산염 완충액 내의 UA의 적정 동량을 첨가하고, 50% 과염소산을 이용하여 0, 1, 2, 4 또는 6분에 반응을 중단시켰다. 과염소산은 단백질은 침전시키나, UA를 침전시키지 않는 것으로 밝혀진 바 있다(Sakuma et al, 1987 Clinical Chemistry and Stove et al, 2007 Clinical Chemistry). 침전물을 펠릿화하고, 상층액 100 uL를 UV 플레이트로 옮겼다. 292 nM에서 흡광도를 측정했다. 소프트맥스 프로 소프트웨어를 이용하여 각각의 UA 농도에서 4시점의 기울기를 그래프로 나타내어 속도를 계산하였다. 도 12a는 37℃의 50% 인간 혈청에서의 디-페길화 요산분해효소 활성과 크리스텍사를 비교한 것을 나타낸 것이다.
인간 혈청을 기초로 한 안정성 분석도 수행하였다. 디-페길화된 요산분해효소를 50% 인간 혈청에 37℃에서 0, 0.5, 1, 2, 4, 또는 24시간 동안 배양한 다음, 활성을 분석했다. 디-PEG 요산분해효소는 각 시점에서 활성을 보유하여, 이러한 단백질이 적어도 24시간 동안에는 50% 인간 혈청에서 안정적이며 UA 산화효소 활성을 보유함을 시사한다. 도 12b는 혈청 안정성 실험으로부터의 결과를 나타낸 것이다.
마지막으로, 37℃에서 반복된 용량(재충전)의 UA로 디-페길화된 요산분해효소의 활성을 조사하였다. 요약하면, UA(100 μM)와 디-PEG 요산분해효소(1 μg/ml)를 37℃에서 100 μL 부피(UV 투과성 96 웰 플레이트)에 합한다. 292 nm에서의 흡광도를 10분 동안 모니터링하였다. 2000 uM UA 2.5 μL를 이러한 100 μL 웰에 첨가하였고("재충전") 292 nm에서의 흡광도를 추가로 10분 동안 모니터링하였다. 이러한 과정을 반복하였고, 활성(UA 고갈 기울기)은 각 "재충전"에 대해 상대적으로 일정하게 유지되었다. 도 12c는 본 연구로부터의 결과를 나타낸 것이다.
실시예 14. PEG 접합 효율 결정
다수의 접합 부위가 생체분자에 존재할 때, 접합 반응은 종종 다양한 정도의 기능화 및/또는 상이한 개질 자리를 특징으로 하는 생성물들의 이질적인 혼합물을 초래한다. 이는 리신 잔기의 ε 아미노 기를 표적으로 하는 단백질 접합과 같이, 일반적으로 1세대, 비 특이적 짝지음(coupling) 화학의 경우 그렇다. 그러나 부위 특이적인 접합 접근법이 선택되는 경우에도, 예를 들어, 조작된 시스테인 잔기들을 표적으로 하는 자주 이용되는 접근법에서, 이러한 반응은 예컨대, 입체적인 제약으로, 완료되지 않을 수 있다. 이는 마찬가지로 다양한 유도체화 정도를 나타내는 접합 단백질의 분포를 초래한다. 생물학적 활성은 개질 정도에 따라 크게 달라질 수 있으므로, 잘 정의되고, 일관되게 제조된 생물 접합체를 보장하기 위해서 이러한 최종 생성물은 개질의 관점에서 철저하게 특징지어질 필요가 있다.
질량 분광분석법 또는 HPLC 기반의 방법들을 포함하는 몇몇 분석 접근법이 생물 접합체의 전체 유도체화를 특징 짓기 위해 이용될 수 있다. 그러나 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 같은 고분자를 단백질에 부착하는 것을 수반하는 중요한 부류의 생물 접합체의 경우, 이러한 기법들 중 대부분은 다수의 부착된 고분자를 함유하는 접합체에 대해 점점 어려워지고 있다. 고분자와 단백질의 크기와 전하 분포뿐만 아니라, PEG의 다분산성 때문에, 전자분무 이온화(ESI)를 기초로 한 질량 분광분석 접근법은 일반적으로 실현 가능하지 않으며, MALDI MS는 종종 넓은 연속 질량 스펙트럼을 생성한다. 더 작은 페길화 단백질 및/또는 적은 수의 접합 자리(N<3)의 경우, (크기 배제 또는 이온 교환을 기초로 한) 자연 조건 하에서의 HPLC 기반의 기법들은 여전히 개별 종을 구별하기에 충분한 해상도를 제공할 수 있다. 그러나 이들 기법은 다수의 접합 부위가 있는 더 큰 단백질의 경우에는 일반적으로 적합하지 않거나 충분히 해결되지 않는다. 과하게 수화된 PEG 고분자는 단백질 접합체에 큰 유체역학적 반경을 부여하는데, 이는 충분한 해상도의 SEC 기반의 분리를 방해하며, 표면 전하의 차폐는 IEX 수지와의 정전기적 상호작용을 약화시킨다. 이 경우, 역상(RP) HPLC가 정확한 반응 모니터링 및 생성물 특성 분석을 위해 종종 선택되는 방법이다. 그러나 올리고머 단백질의 경우, 이 기법은 종종 서브유닛들의 해리를 초래하고, 단량체 단위의 설명만을 제공하여 과정 최적화 노력에 대해 호도할 수 있는 분자 기능화에 대한 부분적인 이해를 제공한다. 과정 최적화 및 생성물 특성 분석을 위한 올리고머 생물치료제의 진정한 접합 상태를 정확하게 정량하기 위해, 단량체 수준에서 개질화 정도와 그에 따른 4차 수준에서의 전체 유도체화 사이의 관계에 대한 이해가 도출되어야 한다.
실험 설계:
NOF로부터 말레이미드 기능화 PEG-10(10 kDa, 썬브라이트(Sunbright) MA-100)을 입수하였다. 모든 완충액 성분들과 시약은 시그마(Sigma, 미국 미주리 주 세인트루이스 소재) 또는 아반토 퍼모먼스 머티리얼즈(Avantor Performance Materials, 미국 펜실베이니아 주 센터 밸리 소재)에서 구입하였다. 트리-시스 요산분해효소의 페길화 반응은 인산염 나트륨 완충액, pH 7.0에서 수행하였다. 선택된 시점 후에 DTT를 10 mM의 최종 농도까지 첨가하여 페길화 반응을 ??치시키고, 애질런트(Agilent) HPLC1200 시스템과 함께 와이엠씨 어메리카(YMC America, 미국 펜실베이니아 주 알렌타운 소재)의 YMC-팩(Pack) 프로틴(Protein)-RP 컬럼(250x2.0 mm, S-5 μm)을 이용하여 분석적 역상 고성능 액체 크로마토그래피 RP HPLC(RP-HPLC)로 분석하였다. 이동상 A는 물 중 0.1% TFA이고, 이동상 B는 아세토니트릴 중 0.1 % TFA로 구성되었다. 0.4 ml/분의 유속으로 이동상 B가 증가하는 선형 기울기로 시료를 용리시켰다. 용리 프로파일을 280 nm에서의 UV 흡광도로 모니터링하였다.
단백질 페길화를 최대화하려는 목표로 2단계의 박스 벤켄(Box-Behnken) 설계를 이용하였다. 사분자체당 각각 8개 또는 12개의 접합 부위를 함유하는 디-시스 요산분해효소와 트리-시스 요산분해효소에 대해 단백질(1~3 mg/ml), PEG-10 (0.5 ~ 1 mM) 및 환원제 TCEP(0 ~ 0.5 mM)의 농도를 다르게 하는 한편, pH, 염 및 인산염 완충액 이온 농도는 고정된 값으로 유지하였다. 10분에서 4시간에 걸친 선택된 시점 후에 데이터를 분석하였다. 모든 2차 효과뿐만 아니라 시간을 카테고리 변수로 처리하여, 1차 라운드에서 각 단백질 변이체에 대해 스크리닝 연구를 위한 64개의 실험 및 최적화 연구의 2차 라운드에서 단백질 변이체당 60개의 추가적인 실험 설계를 얻었다. 소프트웨어 JMP 10으로 데이터 분석을 수행하였다.
통계적 모형:
비 공유적으로 회합된 서브유닛들을 해리시키는, (역상(RP) HPLC처럼) 용이하게 접근할 수 있는 분석법으로부터 수득된 데이터로부터 올리고머 단백질의 전체 유도체화를 도출하기 위한 통계 척도를 생성하였다. 각 서브유닛에 m개의 잠재적인 접합 부위를 갖는 n개의 서브유닛을 함유하는 단백질(또는 생체분자)의 경우. p i (i=0, ..., m)를 i개의 접합된 부위를 갖는 서브유닛들의 실험적으로 관찰된 비율이라 하면,
Figure pct00023
이다. j개의 총 접합된 부위를 갖는 올리고머 단백질을 관찰할 확률 q j 은 다음의 다항 확률 표를 이용하여 요약할 수 있다.
[표 9]
Figure pct00024
여기서, k i (i=0, ..., m)는 정확하게 i개의 접합된 부위를 갖는 서브유닛들의 수이고, 이러한 서브유닛 전체는 총 j개의 접합된 부위를 가지며
Figure pct00025
이다. 그러면, 이러한 분자의 평균 전체 유도체화는
유도체화전체 = 1q1 + 2q2 + ... + jqj + ... + n x m x qn x m (식 1)
로 용이하게 표현된다.
이 값을 이용할 수 있는 접합 자리의 총 수(n x m)에 대해 정규화하면 접합 효율이 산출된다.
생화학적으로, 그리고 약학적으로 중요한 이분자체, 삼분자체 및 사분자체 단백질 부류의 경우, 계산은 아래에 자세히 설명되어 있다.
[표 10] 서브유닛당 m = 2개 또는 3개의 접합 자리를 갖는 이분자체 단백질(n = 2)에 대한 전체 유도체화 계산
1. 다음과 같이 엑셀에 실험적으로 관찰된 서브유닛당 접합을 입력한다:
Figure pct00026
p0, p1, ...p3: 0, 1, ...3개의 접합된 분자들이 있는 서브유닛들의 실험적으로 관찰된 비율. 서브유닛당 m = 2개의 접합 부위의 경우, 필드 A2, B2, C2를 채운다. 서브유닛당 3개의 접합 부위의 경우, 필드 A2, B2, C2, D2를 채운다.
*: E2 = 합계 검사 = SUM(A2:D2). 전체 비율은 총 1의 값, 즉 100%가 되어야 한다.
2. 다항 확률 및 전체 유도체화 계산
다음과 같이 엑셀 표를 마련한다:
Figure pct00027
단백질이 서브유닛당 m = 2개의 접합 부위만 가질 경우, 필드 B15와 B16은 채워지지 않을 것이다.
**: 필드 B17(합계 검사)은 =1이 되어야 한다.
***: (nxm), 접합 부위 총 수는 여기에 숫자 형태로 입력되어야 한다.
[표 11] 서브유닛당 m = 2개 또는 3개의 접합 자리를 갖는 삼분자체 단백질(n = 3)에 대한 전체 유도체화 계산
1. 다음과 같이 엑셀에 실험적으로 관찰된 서브유닛당 접합을 입력한다:
Figure pct00028
p0, p1, ...p3: 0, 1, ...3개의 접합된 분자들이 있는 서브유닛들의 실험적으로 관찰된 비율. 서브유닛당 m = 2개의 접합 부위의 경우, 필드 A2, B2, C2를 채운다. 서브유닛당 3개의 접합 부위의 경우, 필드 A2, B2, C2, D2를 채운다.
*: E2 = 합계 검사 = SUM(A2:D2). 전체 비율은 총 1의 값, 즉 100%가 되어야 한다.
2. 다항 확률 및 전체 유도체화 계산
다음과 같이 엑셀 표를 마련한다:
Figure pct00029
단백질이 서브유닛당 m = 2개의 접합 부위만 가질 경우, 필드 B17 내지 B19는 채워지지 않을 것이다.
**: 필드 B20(합계 검사) 합계는 =1이 되어야 한다.
***: (nxm), 접합 부위 총 수는 여기에 숫자 형태로 입력되어야 한다.
[표 12] 서브유닛당 m = 2개 또는 3개의 접합 자리를 갖는 사분자체 단백질(n = 4)에 대한 전체 유도체화 계산
1. 다음과 같이 엑셀에 실험적으로 관찰된 서브유닛당 접합을 입력한다:
Figure pct00030
p0, p1, ...p3: 0, 1, ...3개의 접합된 분자들이 있는 서브유닛들의 실험적으로 관찰된 비율. 서브유닛당 m = 2개의 접합 부위의 경우, 필드 A2, B2, C2를 채운다. 서브유닛당 3개의 접합 부위의 경우, 필드 A2, B2, C2, D2를 채운다.
*: E2 = 합계 검사 = SUM(A2:D2). 전체 비율은 총 1의 값, 즉 100%가 되어야 한다.
2. 다항 확률 및 전체 유도체화 계산
다음과 같이 엑셀 표를 마련한다:
Figure pct00031
단백질이 서브유닛당 m = 2개의 접합 부위만 가질 경우, 필드 B19 내지 B22는 채워지지 않을 것이다.
**: 필드 B23(합계 검사) 합계는 =1이 되어야 한다.
***: (nxm), 접합 부위 총 수는 여기에 숫자 형태로 입력되어야 한다.
위의 데이터는 비 공유적으로 회합된 서브유닛들을 해리시키는, 용이하게 접근할 수 있는 분석법으로부터 얻어진 데이터로부터의 올리고머 단백질의 전체적인 기능화를 유도하기 위한 통계 척도를 기술한 것이다. 위의 데이터는 모형 시스템으로 호모테트라머 요산분해효소 단백질의 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)과의 접합을 이용하는 이 방법을 설명한다. 치료적 단백질의 PEG로의 공유적 개질은 현재 생체 내에서 반감기를 증가시키고, 면역원성을 감소시키며, 용해도를 개선하고, 단백질 가수분해성 분해에 대한 민감성을 감소시키는 잘 확립된 접근법이다. 그러나 이러한 방법은 고정된 수의 접합 부위에서 부분적인 기능화를 초래하는 올리고머의 다른 생물접합 공정에 동일하게 적용될 수 있다.
여기서 연구된 사분자체 요산분해효소 단백질(n=4)은 >100kDa의 총 질량을 갖는다. 말레이미드 기능화된 PEG와의 페길화를 허용하는 자유 시스테인 잔기들을 조작하여 고정된 수의 접합 부위를 도입하였다. 다음 논의는 서브유닛당 m=3개의 접합 부위가 있어서, 이러한 사분자체의 경우 총 12개의 가능한 접합 자리가 생기는 단백질 변이체를 중심으로 한다. 위에 기술된 바와 같이, 이러한 단백질의 크기 및 접합 부위의 수 때문에, 충분한 해상도를 지닌, 생물접합체의 특성을 분석하는 모든 분석 도구들은 비 공유적으로 결합된 올리고머를 개별적인 서브유닛으로 해리시키는 기법을 기반으로 한다. 도 13은 RP HPLC를 이용하여 시간에 따른 반응 분석을 보여주는 것으로, RP HPLC는 적분에 의해 용이하게 정량될 수 있는, 상이한 접합 정도를 나타내는 종들에 상응하는, 잘 분리된 피크를 생성한다. 따라서 분석 결과는 상이한 기능화 정도: 0, 1, 2, 또는 3개의 부착된 PEG 사슬들을 함유하는 서브유닛들의 비율 p0, p1, p2, p3을 나타내는 단량체의 상대적인 양이다. 이들 값으로부터, 위의 다항 확률표에 따라 0, 1, 2, 3,...12개의 부착된 PEG 사슬을 갖는 사분자체 단백질에 대한 개별적인 확률 q0, q1, q2, q3, ....q12는
Figure pct00032
으로 계산된다.
이 실시예의 경우, 식 1은
유도체화전체 = 1q 1 + 2q 2+ 3q 3 +...+12q 12
가 된다.
표 13은 이러한 분석을 예시하고, RP HPLC 분석으로부터 유도된 상이하게 페길화된 서브유닛들의 상대적인 양을, 식 (1)로부터 계산된 전체 유도체화 및 페길화 효율과 함께 열거한 것이다.
[표 13] 도 13에서 설명한 실험에 대한 데이터 분석
Figure pct00033
*이 단백질은 총 12개의 가능한 접합 자리가 있다.
이러한 데이터는 계산된 전체 유도체화가 전체 단백질 개질을 즉시 측정할 수 있게 하는 공정 개발자를 위한 가치 있는 도구임을 보여준다. 예를 들어, 10분의 시점 후에 선택된 반응 조건은 (3개 중에서) 3개의 기능화된 접합 자리가 있는 서브유닛을 28.9% 생산한다. 그러나 나머지 서브유닛들이 부분적으로 접합된다(1개 PEG 사슬이 있는 서브유닛 15.9%, 2개의 PEG 사슬이 있는 서브유닛 53.9%)는 사실을 고려하고, 이들 데이터를 식 1에 따른 다항 분포에 넣으면, 이러한 단백질의 평균 전체 유도체화는 12개의 총 접합 부위 중에 실제로는 8.4개로, 70.1%에 이른다는 점을 즉시 알아차릴 수 있다.
공정 최적화를 위해 분자의 전체 유도체화를 고려하는 값을 추가적으로 설명하기 위해, 최대 단백질 페길화를 생산한 반응 조건을 최적화하려는 목표로 실험 계획(Design-of-Experiment, DOE) 접근법에 대한 반응 매개변수로 이 값을 이용하였다. 개별적인 서브유닛에 대한 접합의 실험 산출물이 선택되었을 때 이러한 결과들을 데이터 분석과 비교하였다. 실험 섹션에서 기술된 바와 같이, 박스 벤켄 설계를 이용하였다. 도 14a와 도 14b는 연구의 1차 라운드를 위한 반응 표면을 예시하여, 10분에서부터 2시간까지의 시점에 대한 전체 페길화 효율에 미치는 시약 농도의 영향을 보여준다. 도 14a는 RP HPLC 분석 결과로부터 직접 획득한 "완전히 페길화된 서브유닛"(즉, 단량체당 세 개의 기능화된 접합 부위 중 세 개)의 분석을 기초로 한 데이터를 나타낸 것이고, 한편, 도 14b는 식 (1)을 기초로 하여 전체 유도체화가 계산될 때의 데이터 분석을 나타낸 것이다. 양 패널 모두 PEG의 농도가 증가함에 따라 페길화 효율이 증가됨을 보여준다. 그러나 두 가지 분석 방법에 대한 결론은 상이하다. 예를 들어, >90%의 접합 효율이 목표라면, 도 14a에 기초한 분석은 공정 개발자로 하여금 전체 유도체화를 기초로 한 분석(도 14b)과 비교하여 적어도 2배 더 높은 농도의 PEG를 첨가하고 더 오랜 반응 시간 동안 배양하도록 이끌 수 있다. 이런 명백한 차이는 서브유닛당 더 많은 접합 부위가 존재할수록 더욱 두드러진다. 전체 계산된 유도체화 대신에 반응 매개변수로서 서브유닛당 최대 접합만을 선택하는 것은 올리고머 분자에 대한 기능화의 실상을 제공하지 않으며 오해의 소지가 있을 수 있다. PEG 및 기타 접합 시약의 높은 비용을 고려하면, 전체 유도체화를 기초로 한 공정 최적화가 상당한 (시간뿐만 아니라) 원가의 절감을 가져올 수 있다.
이 실시예는 올리고머 단백질의 크기와 속성, 또는 접합체의 생물물리학적 성질이 자연적인 조건 하에서 분석을 허용하지 않을 때, 이러한 단백질에 대한 전체 단백질 접합의 계산을 가능하게 하는 다항 분포를 기초로 한, 적용 가능한 통계적 접근법을 제공한다. 식 (1)에 따라 계산된 전체 분자 유도체화에 대한 정량적인 설명은 공정 최적화 노력뿐만 아니라 규제 기록을 위한 이러한 접합체의 정확한 특성 분석을 뒷받침할 것이고, 성공적으로 신규한 생물접합체들을 임상으로 옮기는 데 도움이 될 것으로 기대된다.
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균등물
전술한 명세서는 당업자가 구현예를 실시할 수 있도록 하기에 충분하다고 여겨진다. 전술한 설명 및 실시예는 특정 구현예를 상세히 설명하며, 발명자들이 고안한 최적의 방식을 기술하고 있다. 그러나 전술한 내용이 본문에 아무리 상세히 설명되었더라도 이러한 구현예는 여러 가지 방식으로 실시될 수 있으며 첨부된 청구범위 및 이의 임의의 균등물에 따라 해석되어야 함은 인정할 것이다.
본 설명에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 명시적으로 표시된 것인지 상관없이, 예를 들어, 정수, 분수 및 백분율을 포함하는 수치에 관한 것이다. 용어 "약"은 일반적으로 당업자가 (예컨대, 동일한 기능 또는 결과를 나타내는) 열거된 값과 동등하다고 간주하는 수치 값의 범위(예컨대, 열거된 범위의 +/- 5~10%)를 지칭한다. "적어도" 및 "약"과 같은 용어가 수치 값 또는 범위 목록에 선행할 때, 이러한 용어는 목록에 제공된 값 또는 범위 전부를 수식한다. 경우에 따라, 용어 "약"은 가장 가까운 유효 숫자로 반올림된 수치 값들을 포함할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> MedImmune, LLC <120> IMPROVED URICASE SEQUENCES AND METHODS OF TREATMENT <130> UCASE-100WO1 <150> US 62/162,280 <151> 2015-05-15 <160> 34 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 290 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified Arthrobacter globiformis Uricase, modified N-terminus, SGD, 2-Cys, C-terminal truncation (SGD V1 C2) <400> 1 Met Ala Thr Ala Glu Thr Ser Thr Gly Cys Lys Val Val Leu Gly Gln 1 5 10 15 Asn Gln Tyr Gly Lys Ala Glu Val Arg Leu Val Lys Val Thr Arg Cys 20 25 30 Thr Ala Arg His Glu Ile Gln Asp Leu Asn Val Thr Ser Gln Leu Ser 35 40 45 Gly Asp Phe Glu Ala Ala His Thr Ala Gly Asp Asn Ala His Val Val 50 55 60 Ala Thr Asp Thr Gln Lys Asn Thr Val Tyr Ala Phe Ala Arg Asp Gly 65 70 75 80 Phe Ala Thr Thr Glu Glu Phe Leu Leu Arg Leu Gly Lys His Phe Thr 85 90 95 Glu Gly Phe Asp Trp Val Thr Gly Gly Arg Trp Ala Ala Gln Gln Phe 100 105 110 Phe Trp Asp Arg Ile Asn Asp His Asp His Ala Phe Ser Arg Asn Lys 115 120 125 Ser Glu Val Arg Thr Ala Val Leu Glu Ile Ser Gly Ser Glu Gln Ala 130 135 140 Ile Val Ala Gly Ile Glu Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Glu Phe His Gly Phe Pro Arg Asp Lys Tyr Thr Thr Leu Gln Glu Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ala Thr Asp Val Ser Ala Arg Trp Arg Tyr Asn 180 185 190 Thr Val Glu Val Asp Phe Asp Ala Val Tyr Ala Ser Val Arg Gly Leu 195 200 205 Leu Leu Lys Ala Phe Ala Glu Thr His Ser Leu Ala Leu Gln Gln Thr 210 215 220 Met Tyr Glu Met Gly Arg Ala Val Ile Glu Thr His Pro Glu Ile Asp 225 230 235 240 Glu Ile Lys Met Ser Leu Pro Asn Lys His His Phe Leu Val Asp Leu 245 250 255 Gln Pro Phe Gly Gln Asp Asn Pro Asn Glu Val Phe Tyr Ala Ala Asp 260 265 270 Arg Pro Tyr Gly Leu Ile Glu Ala Thr Ile Gln Arg Glu Gly Ser Arg 275 280 285 Ala Asp 290 <210> 2 <211> 290 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified Arthrobacter globiformis Uricase, modified N-terminus, RGD, 2-Cys, C-terminal truncation (RGD V1 C2) <400> 2 Met Ala Thr Ala Glu Thr Ser Thr Gly Cys Lys Val Val Leu Gly Gln 1 5 10 15 Asn Gln Tyr Gly Lys Ala Glu Val Arg Leu Val Lys Val Thr Arg Cys 20 25 30 Thr Ala Arg His Glu Ile Gln Asp Leu Asn Val Thr Ser Gln Leu Arg 35 40 45 Gly Asp Phe Glu Ala Ala His Thr Ala Gly Asp Asn Ala His Val Val 50 55 60 Ala Thr Asp Thr Gln Lys Asn Thr Val Tyr Ala Phe Ala Arg Asp Gly 65 70 75 80 Phe Ala Thr Thr Glu Glu Phe Leu Leu Arg Leu Gly Lys His Phe Thr 85 90 95 Glu Gly Phe Asp Trp Val Thr Gly Gly Arg Trp Ala Ala Gln Gln Phe 100 105 110 Phe Trp Asp Arg Ile Asn Asp His Asp His Ala Phe Ser Arg Asn Lys 115 120 125 Ser Glu Val Arg Thr Ala Val Leu Glu Ile Ser Gly Ser Glu Gln Ala 130 135 140 Ile Val Ala Gly Ile Glu Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Glu Phe His Gly Phe Pro Arg Asp Lys Tyr Thr Thr Leu Gln Glu Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ala Thr Asp Val Ser Ala Arg Trp Arg Tyr Asn 180 185 190 Thr Val Glu Val Asp Phe Asp Ala Val Tyr Ala Ser Val Arg Gly Leu 195 200 205 Leu Leu Lys Ala Phe Ala Glu Thr His Ser Leu Ala Leu Gln Gln Thr 210 215 220 Met Tyr Glu Met Gly Arg Ala Val Ile Glu Thr His Pro Glu Ile Asp 225 230 235 240 Glu Ile Lys Met Ser Leu Pro Asn Lys His His Phe Leu Val Asp Leu 245 250 255 Gln Pro Phe Gly Gln Asp Asn Pro Asn Glu Val Phe Tyr Ala Ala Asp 260 265 270 Arg Pro Tyr Gly Leu Ile Glu Ala Thr Ile Gln Arg Glu Gly Ser Arg 275 280 285 Ala Asp 290 <210> 3 <211> 290 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified Arthrobacter globiformis Uricase, modified N-terminus, RGD variants, 2-Cys, C-terminal truncation (RGD variants of V1 C2) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (48)..(48) <223> X is either R or any natural amino acid except C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(49) <223> X is either G or any natural amino acid except C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50) <223> X is either D or any natural amino acid except C <400> 3 Met Ala Thr Ala Glu Thr Ser Thr Gly Cys Lys Val Val Leu Gly Gln 1 5 10 15 Asn Gln Tyr Gly Lys Ala Glu Val Arg Leu Val Lys Val Thr Arg Cys 20 25 30 Thr Ala Arg His Glu Ile Gln Asp Leu Asn Val Thr Ser Gln Leu Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Phe Glu Ala Ala His Thr Ala Gly Asp Asn Ala His Val Val 50 55 60 Ala Thr Asp Thr Gln Lys Asn Thr Val Tyr Ala Phe Ala Arg Asp Gly 65 70 75 80 Phe Ala Thr Thr Glu Glu Phe Leu Leu Arg Leu Gly Lys His Phe Thr 85 90 95 Glu Gly Phe Asp Trp Val Thr Gly Gly Arg Trp Ala Ala Gln Gln Phe 100 105 110 Phe Trp Asp Arg Ile Asn Asp His Asp His Ala Phe Ser Arg Asn Lys 115 120 125 Ser Glu Val Arg Thr Ala Val Leu Glu Ile Ser Gly Ser Glu Gln Ala 130 135 140 Ile Val Ala Gly Ile Glu Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Glu Phe His Gly Phe Pro Arg Asp Lys Tyr Thr Thr Leu Gln Glu Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ala Thr Asp Val Ser Ala Arg Trp Arg Tyr Asn 180 185 190 Thr Val Glu Val Asp Phe Asp Ala Val Tyr Ala Ser Val Arg Gly Leu 195 200 205 Leu Leu Lys Ala Phe Ala Glu Thr His Ser Leu Ala Leu Gln Gln Thr 210 215 220 Met Tyr Glu Met Gly Arg Ala Val Ile Glu Thr His Pro Glu Ile Asp 225 230 235 240 Glu Ile Lys Met Ser Leu Pro Asn Lys His His Phe Leu Val Asp Leu 245 250 255 Gln Pro Phe Gly Gln Asp Asn Pro Asn Glu Val Phe Tyr Ala Ala Asp 260 265 270 Arg Pro Tyr Gly Leu Ile Glu Ala Thr Ile Gln Arg Glu Gly Ser Arg 275 280 285 Ala Asp 290 <210> 4 <211> 301 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Genus sequence, with optional N-terminal modification, 4 possible cysteines, R/SGD, optionally with or without C-terminal truncation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(301) <223> From at least one, two, three, or four cysteines are included in the sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X is either present or absent, and if present is T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> X is either T or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(33) <223> X is either N or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(49) <223> X is either R or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (119)..(119) <223> X is either N or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (142)..(142) <223> X is either S or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (292)..(301) <223> One or more amino acids in the C-terminus are optional <400> 4 Met Xaa Ala Thr Ala Glu Thr Ser Thr Gly Xaa Lys Val Val Leu Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Tyr Gly Lys Ala Glu Val Arg Leu Val Lys Val Thr Arg 20 25 30 Xaa Thr Ala Arg His Glu Ile Gln Asp Leu Asn Val Thr Ser Gln Leu 35 40 45 Xaa Gly Asp Phe Glu Ala Ala His Thr Ala Gly Asp Asn Ala His Val 50 55 60 Val Ala Thr Asp Thr Gln Lys Asn Thr Val Tyr Ala Phe Ala Arg Asp 65 70 75 80 Gly Phe Ala Thr Thr Glu Glu Phe Leu Leu Arg Leu Gly Lys His Phe 85 90 95 Thr Glu Gly Phe Asp Trp Val Thr Gly Gly Arg Trp Ala Ala Gln Gln 100 105 110 Phe Phe Trp Asp Arg Ile Xaa Asp His Asp His Ala Phe Ser Arg Asn 115 120 125 Lys Ser Glu Val Arg Thr Ala Val Leu Glu Ile Ser Gly Xaa Glu Gln 130 135 140 Ala Ile Val Ala Gly Ile Glu Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly 145 150 155 160 Ser Glu Phe His Gly Phe Pro Arg Asp Lys Tyr Thr Thr Leu Gln Glu 165 170 175 Thr Thr Asp Arg Ile Leu Ala Thr Asp Val Ser Ala Arg Trp Arg Tyr 180 185 190 Asn Thr Val Glu Val Asp Phe Asp Ala Val Tyr Ala Ser Val Arg Gly 195 200 205 Leu Leu Leu Lys Ala Phe Ala Glu Thr His Ser Leu Ala Leu Gln Gln 210 215 220 Thr Met Tyr Glu Met Gly Arg Ala Val Ile Glu Thr His Pro Glu Ile 225 230 235 240 Asp Glu Ile Lys Met Ser Leu Pro Asn Lys His His Phe Leu Val Asp 245 250 255 Leu Gln Pro Phe Gly Gln Asp Asn Pro Asn Glu Val Phe Tyr Ala Ala 260 265 270 Asp Arg Pro Tyr Gly Leu Ile Glu Ala Thr Ile Gln Arg Glu Gly Ser 275 280 285 Arg Ala Asp His Pro Ile Trp Ser Asn Ile Ala Gly Phe 290 295 300 <210> 5 <211> 300 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Genus sequence, with modified N-terminus, with 4 possible cysteines, SGD, optionally with or without C-terminal truncation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(300) <223> From at least one, two, three, or four cysteines are included in the sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> X is either T or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> X is either N or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (118)..(118) <223> X is either N or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (141)..(141) <223> X is either S or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (291)..(300) <223> One or more amino acids in the C-terminus are optional <400> 5 Met Ala Thr Ala Glu Thr Ser Thr Gly Xaa Lys Val Val Leu Gly Gln 1 5 10 15 Asn Gln Tyr Gly Lys Ala Glu Val Arg Leu Val Lys Val Thr Arg Xaa 20 25 30 Thr Ala Arg His Glu Ile Gln Asp Leu Asn Val Thr Ser Gln Leu Ser 35 40 45 Gly Asp Phe Glu Ala Ala His Thr Ala Gly Asp Asn Ala His Val Val 50 55 60 Ala Thr Asp Thr Gln Lys Asn Thr Val Tyr Ala Phe Ala Arg Asp Gly 65 70 75 80 Phe Ala Thr Thr Glu Glu Phe Leu Leu Arg Leu Gly Lys His Phe Thr 85 90 95 Glu Gly Phe Asp Trp Val Thr Gly Gly Arg Trp Ala Ala Gln Gln Phe 100 105 110 Phe Trp Asp Arg Ile Xaa Asp His Asp His Ala Phe Ser Arg Asn Lys 115 120 125 Ser Glu Val Arg Thr Ala Val Leu Glu Ile Ser Gly Xaa Glu Gln Ala 130 135 140 Ile Val Ala Gly Ile Glu Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Glu Phe His Gly Phe Pro Arg Asp Lys Tyr Thr Thr Leu Gln Glu Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ala Thr Asp Val Ser Ala Arg Trp Arg Tyr Asn 180 185 190 Thr Val Glu Val Asp Phe Asp Ala Val Tyr Ala Ser Val Arg Gly Leu 195 200 205 Leu Leu Lys Ala Phe Ala Glu Thr His Ser Leu Ala Leu Gln Gln Thr 210 215 220 Met Tyr Glu Met Gly Arg Ala Val Ile Glu Thr His Pro Glu Ile Asp 225 230 235 240 Glu Ile Lys Met Ser Leu Pro Asn Lys His His Phe Leu Val Asp Leu 245 250 255 Gln Pro Phe Gly Gln Asp Asn Pro Asn Glu Val Phe Tyr Ala Ala Asp 260 265 270 Arg Pro Tyr Gly Leu Ile Glu Ala Thr Ile Gln Arg Glu Gly Ser Arg 275 280 285 Ala Asp His Pro Ile Trp Ser Asn Ile Ala Gly Phe 290 295 300 <210> 6 <211> 292 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Genus sequence, with truncated N-terminus, 4 possible cysteines, SGD, optionally with or without C-terminal truncation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(292) <223> From at least one, two, three, or four cysteines are included in the sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X is either T or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> X is either N or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (110)..(110) <223> X is either N or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (133)..(133) <223> X is either S or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (283)..(292) <223> One or more amino acids in the C-terminus are optional <400> 6 Met Xaa Lys Val Val Leu Gly Gln Asn Gln Tyr Gly Lys Ala Glu Val 1 5 10 15 Arg Leu Val Lys Val Thr Arg Xaa Thr Ala Arg His Glu Ile Gln Asp 20 25 30 Leu Asn Val Thr Ser Gln Leu Ser Gly Asp Phe Glu Ala Ala His Thr 35 40 45 Ala Gly Asp Asn Ala His Val Val Ala Thr Asp Thr Gln Lys Asn Thr 50 55 60 Val Tyr Ala Phe Ala Arg Asp Gly Phe Ala Thr Thr Glu Glu Phe Leu 65 70 75 80 Leu Arg Leu Gly Lys His Phe Thr Glu Gly Phe Asp Trp Val Thr Gly 85 90 95 Gly Arg Trp Ala Ala Gln Gln Phe Phe Trp Asp Arg Ile Xaa Asp His 100 105 110 Asp His Ala Phe Ser Arg Asn Lys Ser Glu Val Arg Thr Ala Val Leu 115 120 125 Glu Ile Ser Gly Xaa Glu Gln Ala Ile Val Ala Gly Ile Glu Gly Leu 130 135 140 Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser Glu Phe His Gly Phe Pro Arg Asp 145 150 155 160 Lys Tyr Thr Thr Leu Gln Glu Thr Thr Asp Arg Ile Leu Ala Thr Asp 165 170 175 Val Ser Ala Arg Trp Arg Tyr Asn Thr Val Glu Val Asp Phe Asp Ala 180 185 190 Val Tyr Ala Ser Val Arg Gly Leu Leu Leu Lys Ala Phe Ala Glu Thr 195 200 205 His Ser Leu Ala Leu Gln Gln Thr Met Tyr Glu Met Gly Arg Ala Val 210 215 220 Ile Glu Thr His Pro Glu Ile Asp Glu Ile Lys Met Ser Leu Pro Asn 225 230 235 240 Lys His His Phe Leu Val Asp Leu Gln Pro Phe Gly Gln Asp Asn Pro 245 250 255 Asn Glu Val Phe Tyr Ala Ala Asp Arg Pro Tyr Gly Leu Ile Glu Ala 260 265 270 Thr Ile Gln Arg Glu Gly Ser Arg Ala Asp His Pro Ile Trp Ser Asn 275 280 285 Ile Ala Gly Phe 290 <210> 7 <211> 301 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Genus sequence, with optional N-terminal modification, 9 possible cysteines, R/SGD, optionally with or without C-terminal truncation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(301) <223> From at least one, two, three, or four cysteines are included in the sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X is either present or absent, and if present is T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> X is either T or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(33) <223> X is either N or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(49) <223> X is either R or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (119)..(119) <223> X is either N or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (120)..(120) <223> X is either D or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (142)..(142) <223> X is either S or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (196)..(196) <223> X is either E or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (238)..(238) <223> X is either P or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (286)..(286) <223> X is either E or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (289)..(289) <223> X is either R or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (292)..(301) <223> One or more amino acids in the C-terminus are optional <400> 7 Met Xaa Ala Thr Ala Glu Thr Ser Thr Gly Xaa Lys Val Val Leu Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Tyr Gly Lys Ala Glu Val Arg Leu Val Lys Val Thr Arg 20 25 30 Xaa Thr Ala Arg His Glu Ile Gln Asp Leu Asn Val Thr Ser Gln Leu 35 40 45 Xaa Gly Asp Phe Glu Ala Ala His Thr Ala Gly Asp Asn Ala His Val 50 55 60 Val Ala Thr Asp Thr Gln Lys Asn Thr Val Tyr Ala Phe Ala Arg Asp 65 70 75 80 Gly Phe Ala Thr Thr Glu Glu Phe Leu Leu Arg Leu Gly Lys His Phe 85 90 95 Thr Glu Gly Phe Asp Trp Val Thr Gly Gly Arg Trp Ala Ala Gln Gln 100 105 110 Phe Phe Trp Asp Arg Ile Xaa Xaa His Asp His Ala Phe Ser Arg Asn 115 120 125 Lys Ser Glu Val Arg Thr Ala Val Leu Glu Ile Ser Gly Xaa Glu Gln 130 135 140 Ala Ile Val Ala Gly Ile Glu Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly 145 150 155 160 Ser Glu Phe His Gly Phe Pro Arg Asp Lys Tyr Thr Thr Leu Gln Glu 165 170 175 Thr Thr Asp Arg Ile Leu Ala Thr Asp Val Ser Ala Arg Trp Arg Tyr 180 185 190 Asn Thr Val Xaa Val Asp Phe Asp Ala Val Tyr Ala Ser Val Arg Gly 195 200 205 Leu Leu Leu Lys Ala Phe Ala Glu Thr His Ser Leu Ala Leu Gln Gln 210 215 220 Thr Met Tyr Glu Met Gly Arg Ala Val Ile Glu Thr His Xaa Glu Ile 225 230 235 240 Asp Glu Ile Lys Met Ser Leu Pro Asn Lys His His Phe Leu Val Asp 245 250 255 Leu Gln Pro Phe Gly Gln Asp Asn Pro Asn Glu Val Phe Tyr Ala Ala 260 265 270 Asp Arg Pro Tyr Gly Leu Ile Glu Ala Thr Ile Gln Arg Xaa Gly Ser 275 280 285 Xaa Ala Asp His Pro Ile Trp Ser Asn Ile Ala Gly Phe 290 295 300 <210> 8 <211> 301 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Genus sequence, with optional N-terminal modification, 9 possible cysteines, XGD, optionally with or without C-terminal truncation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(301) <223> From at least one, two, three, or four cysteines are included in the sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X is either present or absent, and if present is T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> X is either T or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(33) <223> X is either N or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(49) <223> X is any naturally occurring amino acid except C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (119)..(119) <223> X is either N or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (120)..(120) <223> X is either D or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (142)..(142) <223> X is either S or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (196)..(196) <223> X is either E or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (238)..(238) <223> X is either P or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (286)..(286) <223> X is either E or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (289)..(289) <223> X is either R or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (292)..(301) <223> One or more amino acids in the C-terminus are optional <400> 8 Met Xaa Ala Thr Ala Glu Thr Ser Thr Gly Xaa Lys Val Val Leu Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Tyr Gly Lys Ala Glu Val Arg Leu Val Lys Val Thr Arg 20 25 30 Xaa Thr Ala Arg His Glu Ile Gln Asp Leu Asn Val Thr Ser Gln Leu 35 40 45 Xaa Gly Asp Phe Glu Ala Ala His Thr Ala Gly Asp Asn Ala His Val 50 55 60 Val Ala Thr Asp Thr Gln Lys Asn Thr Val Tyr Ala Phe Ala Arg Asp 65 70 75 80 Gly Phe Ala Thr Thr Glu Glu Phe Leu Leu Arg Leu Gly Lys His Phe 85 90 95 Thr Glu Gly Phe Asp Trp Val Thr Gly Gly Arg Trp Ala Ala Gln Gln 100 105 110 Phe Phe Trp Asp Arg Ile Xaa Xaa His Asp His Ala Phe Ser Arg Asn 115 120 125 Lys Ser Glu Val Arg Thr Ala Val Leu Glu Ile Ser Gly Xaa Glu Gln 130 135 140 Ala Ile Val Ala Gly Ile Glu Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly 145 150 155 160 Ser Glu Phe His Gly Phe Pro Arg Asp Lys Tyr Thr Thr Leu Gln Glu 165 170 175 Thr Thr Asp Arg Ile Leu Ala Thr Asp Val Ser Ala Arg Trp Arg Tyr 180 185 190 Asn Thr Val Xaa Val Asp Phe Asp Ala Val Tyr Ala Ser Val Arg Gly 195 200 205 Leu Leu Leu Lys Ala Phe Ala Glu Thr His Ser Leu Ala Leu Gln Gln 210 215 220 Thr Met Tyr Glu Met Gly Arg Ala Val Ile Glu Thr His Xaa Glu Ile 225 230 235 240 Asp Glu Ile Lys Met Ser Leu Pro Asn Lys His His Phe Leu Val Asp 245 250 255 Leu Gln Pro Phe Gly Gln Asp Asn Pro Asn Glu Val Phe Tyr Ala Ala 260 265 270 Asp Arg Pro Tyr Gly Leu Ile Glu Ala Thr Ile Gln Arg Xaa Gly Ser 275 280 285 Xaa Ala Asp His Pro Ile Trp Ser Asn Ile Ala Gly Phe 290 295 300 <210> 9 <211> 292 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Genus sequence, with N-terminal truncation, 9 possible cysteines, XGD, optionally with or without C-terminal truncation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(292) <223> From at least one, two, three, or four cysteines are included in the sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X is either T or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> X is either N or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (40)..(40) <223> X is any naturally occurring amino acid except C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (110)..(110) <223> X is either N or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (111)..(111) <223> X is either D or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (133)..(133) <223> X is either S or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (187)..(187) <223> X is either E or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (229)..(229) <223> X is either P or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (277)..(277) <223> X is either E or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (280)..(280) <223> X is either R or C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (283)..(292) <223> One or more amino acids in the C-terminus are optional <400> 9 Met Xaa Lys Val Val Leu Gly Gln Asn Gln Tyr Gly Lys Ala Glu Val 1 5 10 15 Arg Leu Val Lys Val Thr Arg Xaa Thr Ala Arg His Glu Ile Gln Asp 20 25 30 Leu Asn Val Thr Ser Gln Leu Xaa Gly Asp Phe Glu Ala Ala His Thr 35 40 45 Ala Gly Asp Asn Ala His Val Val Ala Thr Asp Thr Gln Lys Asn Thr 50 55 60 Val Tyr Ala Phe Ala Arg Asp Gly Phe Ala Thr Thr Glu Glu Phe Leu 65 70 75 80 Leu Arg Leu Gly Lys His Phe Thr Glu Gly Phe Asp Trp Val Thr Gly 85 90 95 Gly Arg Trp Ala Ala Gln Gln Phe Phe Trp Asp Arg Ile Xaa Xaa His 100 105 110 Asp His Ala Phe Ser Arg Asn Lys Ser Glu Val Arg Thr Ala Val Leu 115 120 125 Glu Ile Ser Gly Xaa Glu Gln Ala Ile Val Ala Gly Ile Glu Gly Leu 130 135 140 Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser Glu Phe His Gly Phe Pro Arg Asp 145 150 155 160 Lys Tyr Thr Thr Leu Gln Glu Thr Thr Asp Arg Ile Leu Ala Thr Asp 165 170 175 Val Ser Ala Arg Trp Arg Tyr Asn Thr Val Xaa Val Asp Phe Asp Ala 180 185 190 Val Tyr Ala Ser Val Arg Gly Leu Leu Leu Lys Ala Phe Ala Glu Thr 195 200 205 His Ser Leu Ala Leu Gln Gln Thr Met Tyr Glu Met Gly Arg Ala Val 210 215 220 Ile Glu Thr His Xaa Glu Ile Asp Glu Ile Lys Met Ser Leu Pro Asn 225 230 235 240 Lys His His Phe Leu Val Asp Leu Gln Pro Phe Gly Gln Asp Asn Pro 245 250 255 Asn Glu Val Phe Tyr Ala Ala Asp Arg Pro Tyr Gly Leu Ile Glu Ala 260 265 270 Thr Ile Gln Arg Xaa Gly Ser Xaa Ala Asp His Pro Ile Trp Ser Asn 275 280 285 Ile Ala Gly Phe 290 <210> 10 <211> 301 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Genus sequence, with optional N-terminal modification, 9 possible conjugation sites, XGD, optionally with or without C-terminal truncation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(301) <223> From at least one, two, three, or four cysteines are included in the sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X is either present or absent, and if present is T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> X is either T or any natural or unnatural amino acid used for site-specific conjugation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33)..(33) <223> X is either N or any natural or unnatural amino acid used for site-specific conjugation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(49) <223> X is any naturally occurring amino acid except C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (119)..(119) <223> X is either N or any natural or unnatural amino acid used for site-specific conjugation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (120)..(120) <223> X is either D or any natural or unnatural amino acid used for site-specific conjugation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (142)..(142) <223> X is either S or any natural or unnatural amino acid used for site-specific conjugation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (196)..(196) <223> X is either E or any natural or unnatural amino acid used for site-specific conjugation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (238)..(238) <223> X is either P or any natural or unnatural amino acid used for site-specific conjugation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (286)..(286) <223> X is either E or any natural or unnatural amino acid used for site-specific conjugation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (289)..(289) <223> X is either R or any natural or unnatural amino acid used for site-specific conjugation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (292)..(301) <223> One or more amino acids in the C-terminus are optional <400> 10 Met Xaa Ala Thr Ala Glu Thr Ser Thr Gly Xaa Lys Val Val Leu Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Tyr Gly Lys Ala Glu Val Arg Leu Val Lys Val Thr Arg 20 25 30 Xaa Thr Ala Arg His Glu Ile Gln Asp Leu Asn Val Thr Ser Gln Leu 35 40 45 Xaa Gly Asp Phe Glu Ala Ala His Thr Ala Gly Asp Asn Ala His Val 50 55 60 Val Ala Thr Asp Thr Gln Lys Asn Thr Val Tyr Ala Phe Ala Arg Asp 65 70 75 80 Gly Phe Ala Thr Thr Glu Glu Phe Leu Leu Arg Leu Gly Lys His Phe 85 90 95 Thr Glu Gly Phe Asp Trp Val Thr Gly Gly Arg Trp Ala Ala Gln Gln 100 105 110 Phe Phe Trp Asp Arg Ile Xaa Xaa His Asp His Ala Phe Ser Arg Asn 115 120 125 Lys Ser Glu Val Arg Thr Ala Val Leu Glu Ile Ser Gly Xaa Glu Gln 130 135 140 Ala Ile Val Ala Gly Ile Glu Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly 145 150 155 160 Ser Glu Phe His Gly Phe Pro Arg Asp Lys Tyr Thr Thr Leu Gln Glu 165 170 175 Thr Thr Asp Arg Ile Leu Ala Thr Asp Val Ser Ala Arg Trp Arg Tyr 180 185 190 Asn Thr Val Xaa Val Asp Phe Asp Ala Val Tyr Ala Ser Val Arg Gly 195 200 205 Leu Leu Leu Lys Ala Phe Ala Glu Thr His Ser Leu Ala Leu Gln Gln 210 215 220 Thr Met Tyr Glu Met Gly Arg Ala Val Ile Glu Thr His Xaa Glu Ile 225 230 235 240 Asp Glu Ile Lys Met Ser Leu Pro Asn Lys His His Phe Leu Val Asp 245 250 255 Leu Gln Pro Phe Gly Gln Asp Asn Pro Asn Glu Val Phe Tyr Ala Ala 260 265 270 Asp Arg Pro Tyr Gly Leu Ile Glu Ala Thr Ile Gln Arg Xaa Gly Ser 275 280 285 Xaa Ala Asp His Pro Ile Trp Ser Asn Ile Ala Gly Phe 290 295 300 <210> 11 <211> 292 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Genus sequence, with N-terminal truncation, 9 possible conjugation sites, XGD, optionally with or without C-terminal truncation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(292) <223> From at least one, two, three, or four cysteines are included in the sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X is either T or any natural or unnatural amino acid used for site-specific conjugation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> X is either N or any natural or unnatural amino acid used for site-specific conjugation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (40)..(40) <223> X is any naturally occurring amino acid except C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (110)..(110) <223> X is either N or any natural or unnatural amino acid used for site-specific conjugation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (111)..(111) <223> X is either D or any natural or unnatural amino acid used for site-specific conjugation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (133)..(133) <223> X is either S or any natural or unnatural amino acid used for site-specific conjugation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (187)..(187) <223> X is either E or any natural or unnatural amino acid used for site-specific conjugation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (229)..(229) <223> X is either P or any natural or unnatural amino acid used for site-specific conjugation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (277)..(277) <223> X is either E or any natural or unnatural amino acid used for site-specific conjugation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (280)..(280) <223> X is either R or any natural or unnatural amino acid used for site-specific conjugation <220> <221> MISC_FEATURE <222> (283)..(292) <223> One or more amino acids in the C-terminus are optional <400> 11 Met Xaa Lys Val Val Leu Gly Gln Asn Gln Tyr Gly Lys Ala Glu Val 1 5 10 15 Arg Leu Val Lys Val Thr Arg Xaa Thr Ala Arg His Glu Ile Gln Asp 20 25 30 Leu Asn Val Thr Ser Gln Leu Xaa Gly Asp Phe Glu Ala Ala His Thr 35 40 45 Ala Gly Asp Asn Ala His Val Val Ala Thr Asp Thr Gln Lys Asn Thr 50 55 60 Val Tyr Ala Phe Ala Arg Asp Gly Phe Ala Thr Thr Glu Glu Phe Leu 65 70 75 80 Leu Arg Leu Gly Lys His Phe Thr Glu Gly Phe Asp Trp Val Thr Gly 85 90 95 Gly Arg Trp Ala Ala Gln Gln Phe Phe Trp Asp Arg Ile Xaa Xaa His 100 105 110 Asp His Ala Phe Ser Arg Asn Lys Ser Glu Val Arg Thr Ala Val Leu 115 120 125 Glu Ile Ser Gly Xaa Glu Gln Ala Ile Val Ala Gly Ile Glu Gly Leu 130 135 140 Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser Glu Phe His Gly Phe Pro Arg Asp 145 150 155 160 Lys Tyr Thr Thr Leu Gln Glu Thr Thr Asp Arg Ile Leu Ala Thr Asp 165 170 175 Val Ser Ala Arg Trp Arg Tyr Asn Thr Val Xaa Val Asp Phe Asp Ala 180 185 190 Val Tyr Ala Ser Val Arg Gly Leu Leu Leu Lys Ala Phe Ala Glu Thr 195 200 205 His Ser Leu Ala Leu Gln Gln Thr Met Tyr Glu Met Gly Arg Ala Val 210 215 220 Ile Glu Thr His Xaa Glu Ile Asp Glu Ile Lys Met Ser Leu Pro Asn 225 230 235 240 Lys His His Phe Leu Val Asp Leu Gln Pro Phe Gly Gln Asp Asn Pro 245 250 255 Asn Glu Val Phe Tyr Ala Ala Asp Arg Pro Tyr Gly Leu Ile Glu Ala 260 265 270 Thr Ile Gln Arg Xaa Gly Ser Xaa Ala Asp His Pro Ile Trp Ser Asn 275 280 285 Ile Ala Gly Phe 290 <210> 12 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified Arthrobacter globiformis Uricase C1 construct (T11C mutation, SGD, optional N-terminal His tag and optional short linker (first Uricase residue corresponds to Thr2)) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(13) <223> Optional N-terminal His tag and optional linker <400> 12 Met Gly Ser His His His His His His Gly Ala Arg Gln Thr Ala Thr 1 5 10 15 Ala Glu Thr Ser Thr Gly Cys Lys Val Val Leu Gly Gln Asn Gln Tyr 20 25 30 Gly Lys Ala Glu Val Arg Leu Val Lys Val Thr Arg Asn Thr Ala Arg 35 40 45 His Glu Ile Gln Asp Leu Asn Val Thr Ser Gln Leu Ser Gly Asp Phe 50 55 60 Glu Ala Ala His Thr Ala Gly Asp Asn Ala His Val Val Ala Thr Asp 65 70 75 80 Thr Gln Lys Asn Thr Val Tyr Ala Phe Ala Arg Asp Gly Phe Ala Thr 85 90 95 Thr Glu Glu Phe Leu Leu Arg Leu Gly Lys His Phe Thr Glu Gly Phe 100 105 110 Asp Trp Val Thr Gly Gly Arg Trp Ala Ala Gln Gln Phe Phe Trp Asp 115 120 125 Arg Ile Asn Asp His Asp His Ala Phe Ser Arg Asn Lys Ser Glu Val 130 135 140 Arg Thr Ala Val Leu Glu Ile Ser Gly Ser Glu Gln Ala Ile Val Ala 145 150 155 160 Gly Ile Glu Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser Glu Phe His 165 170 175 Gly Phe Pro Arg Asp Lys Tyr Thr Thr Leu Gln Glu Thr Thr Asp Arg 180 185 190 Ile Leu Ala Thr Asp Val Ser Ala Arg Trp Arg Tyr Asn Thr Val Glu 195 200 205 Val Asp Phe Asp Ala Val Tyr Ala Ser Val Arg Gly Leu Leu Leu Lys 210 215 220 Ala Phe Ala Glu Thr His Ser Leu Ala Leu Gln Gln Thr Met Tyr Glu 225 230 235 240 Met Gly Arg Ala Val Ile Glu Thr His Pro Glu Ile Asp Glu Ile Lys 245 250 255 Met Ser Leu Pro Asn Lys His His Phe Leu Val Asp Leu Gln Pro Phe 260 265 270 Gly Gln Asp Asn Pro Asn Glu Val Phe Tyr Ala Ala Asp Arg Pro Tyr 275 280 285 Gly Leu Ile Glu Ala Thr Ile Gln Arg Glu Gly Ser Arg Ala Asp 290 295 300 <210> 13 <211> 290 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified Arthrobacter globiformis Uricase C1 construct (variant 1), with tag eliminated, deletion of Thr2 (to avoid partial N-term Met cleavage) and Cys at position 11 <400> 13 Met Ala Thr Ala Glu Thr Ser Thr Gly Cys Lys Val Val Leu Gly Gln 1 5 10 15 Asn Gln Tyr Gly Lys Ala Glu Val Arg Leu Val Lys Val Thr Arg Asn 20 25 30 Thr Ala Arg His Glu Ile Gln Asp Leu Asn Val Thr Ser Gln Leu Ser 35 40 45 Gly Asp Phe Glu Ala Ala His Thr Ala Gly Asp Asn Ala His Val Val 50 55 60 Ala Thr Asp Thr Gln Lys Asn Thr Val Tyr Ala Phe Ala Arg Asp Gly 65 70 75 80 Phe Ala Thr Thr Glu Glu Phe Leu Leu Arg Leu Gly Lys His Phe Thr 85 90 95 Glu Gly Phe Asp Trp Val Thr Gly Gly Arg Trp Ala Ala Gln Gln Phe 100 105 110 Phe Trp Asp Arg Ile Asn Asp His Asp His Ala Phe Ser Arg Asn Lys 115 120 125 Ser Glu Val Arg Thr Ala Val Leu Glu Ile Ser Gly Ser Glu Gln Ala 130 135 140 Ile Val Ala Gly Ile Glu Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Glu Phe His Gly Phe Pro Arg Asp Lys Tyr Thr Thr Leu Gln Glu Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ala Thr Asp Val Ser Ala Arg Trp Arg Tyr Asn 180 185 190 Thr Val Glu Val Asp Phe Asp Ala Val Tyr Ala Ser Val Arg Gly Leu 195 200 205 Leu Leu Lys Ala Phe Ala Glu Thr His Ser Leu Ala Leu Gln Gln Thr 210 215 220 Met Tyr Glu Met Gly Arg Ala Val Ile Glu Thr His Pro Glu Ile Asp 225 230 235 240 Glu Ile Lys Met Ser Leu Pro Asn Lys His His Phe Leu Val Asp Leu 245 250 255 Gln Pro Phe Gly Gln Asp Asn Pro Asn Glu Val Phe Tyr Ala Ala Asp 260 265 270 Arg Pro Tyr Gly Leu Ile Glu Ala Thr Ile Gln Arg Glu Gly Ser Arg 275 280 285 Ala Asp 290 <210> 14 <211> 287 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified Arthrobacter globiformis Uricase C1 construct (variant 2 - N-term truncation) with tag eliminated, deletion of Thr2-Ala5 and Cys at position 11, expect complete retention of N-term Met <400> 14 Met Glu Thr Ser Thr Gly Cys Lys Val Val Leu Gly Gln Asn Gln Tyr 1 5 10 15 Gly Lys Ala Glu Val Arg Leu Val Lys Val Thr Arg Asn Thr Ala Arg 20 25 30 His Glu Ile Gln Asp Leu Asn Val Thr Ser Gln Leu Ser Gly Asp Phe 35 40 45 Glu Ala Ala His Thr Ala Gly Asp Asn Ala His Val Val Ala Thr Asp 50 55 60 Thr Gln Lys Asn Thr Val Tyr Ala Phe Ala Arg Asp Gly Phe Ala Thr 65 70 75 80 Thr Glu Glu Phe Leu Leu Arg Leu Gly Lys His Phe Thr Glu Gly Phe 85 90 95 Asp Trp Val Thr Gly Gly Arg Trp Ala Ala Gln Gln Phe Phe Trp Asp 100 105 110 Arg Ile Asn Asp His Asp His Ala Phe Ser Arg Asn Lys Ser Glu Val 115 120 125 Arg Thr Ala Val Leu Glu Ile Ser Gly Ser Glu Gln Ala Ile Val Ala 130 135 140 Gly Ile Glu Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser Glu Phe His 145 150 155 160 Gly Phe Pro Arg Asp Lys Tyr Thr Thr Leu Gln Glu Thr Thr Asp Arg 165 170 175 Ile Leu Ala Thr Asp Val Ser Ala Arg Trp Arg Tyr Asn Thr Val Glu 180 185 190 Val Asp Phe Asp Ala Val Tyr Ala Ser Val Arg Gly Leu Leu Leu Lys 195 200 205 Ala Phe Ala Glu Thr His Ser Leu Ala Leu Gln Gln Thr Met Tyr Glu 210 215 220 Met Gly Arg Ala Val Ile Glu Thr His Pro Glu Ile Asp Glu Ile Lys 225 230 235 240 Met Ser Leu Pro Asn Lys His His Phe Leu Val Asp Leu Gln Pro Phe 245 250 255 Gly Gln Asp Asn Pro Asn Glu Val Phe Tyr Ala Ala Asp Arg Pro Tyr 260 265 270 Gly Leu Ile Glu Ala Thr Ile Gln Arg Glu Gly Ser Arg Ala Asp 275 280 285 <210> 15 <211> 283 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified Arthrobacter globiformis Uricase C1 construct (variant 3 - N-term truncation) with tag eliminated, deletion of Thr2-Thr9, Cys at position 11, expect processing of N-term met <400> 15 Met Gly Cys Lys Val Val Leu Gly Gln Asn Gln Tyr Gly Lys Ala Glu 1 5 10 15 Val Arg Leu Val Lys Val Thr Arg Asn Thr Ala Arg His Glu Ile Gln 20 25 30 Asp Leu Asn Val Thr Ser Gln Leu Ser Gly Asp Phe Glu Ala Ala His 35 40 45 Thr Ala Gly Asp Asn Ala His Val Val Ala Thr Asp Thr Gln Lys Asn 50 55 60 Thr Val Tyr Ala Phe Ala Arg Asp Gly Phe Ala Thr Thr Glu Glu Phe 65 70 75 80 Leu Leu Arg Leu Gly Lys His Phe Thr Glu Gly Phe Asp Trp Val Thr 85 90 95 Gly Gly Arg Trp Ala Ala Gln Gln Phe Phe Trp Asp Arg Ile Asn Asp 100 105 110 His Asp His Ala Phe Ser Arg Asn Lys Ser Glu Val Arg Thr Ala Val 115 120 125 Leu Glu Ile Ser Gly Ser Glu Gln Ala Ile Val Ala Gly Ile Glu Gly 130 135 140 Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser Glu Phe His Gly Phe Pro Arg 145 150 155 160 Asp Lys Tyr Thr Thr Leu Gln Glu Thr Thr Asp Arg Ile Leu Ala Thr 165 170 175 Asp Val Ser Ala Arg Trp Arg Tyr Asn Thr Val Glu Val Asp Phe Asp 180 185 190 Ala Val Tyr Ala Ser Val Arg Gly Leu Leu Leu Lys Ala Phe Ala Glu 195 200 205 Thr His Ser Leu Ala Leu Gln Gln Thr Met Tyr Glu Met Gly Arg Ala 210 215 220 Val Ile Glu Thr His Pro Glu Ile Asp Glu Ile Lys Met Ser Leu Pro 225 230 235 240 Asn Lys His His Phe Leu Val Asp Leu Gln Pro Phe Gly Gln Asp Asn 245 250 255 Pro Asn Glu Val Phe Tyr Ala Ala Asp Arg Pro Tyr Gly Leu Ile Glu 260 265 270 Ala Thr Ile Gln Arg Glu Gly Ser Arg Ala Asp 275 280 <210> 16 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified Arthrobacter globiformis Uricase with SGD, and PEGylation available sites at T11C, N33C, S142C, optional N-terminal His tag and optional short linker <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(13) <223> Optional N-terminal His tag and optional linker <400> 16 Met Gly Ser His His His His His His Gly Ala Arg Gln Thr Ala Thr 1 5 10 15 Ala Glu Thr Ser Thr Gly Cys Lys Val Val Leu Gly Gln Asn Gln Tyr 20 25 30 Gly Lys Ala Glu Val Arg Leu Val Lys Val Thr Arg Cys Thr Ala Arg 35 40 45 His Glu Ile Gln Asp Leu Asn Val Thr Ser Gln Leu Ser Gly Asp Phe 50 55 60 Glu Ala Ala His Thr Ala Gly Asp Asn Ala His Val Val Ala Thr Asp 65 70 75 80 Thr Gln Lys Asn Thr Val Tyr Ala Phe Ala Arg Asp Gly Phe Ala Thr 85 90 95 Thr Glu Glu Phe Leu Leu Arg Leu Gly Lys His Phe Thr Glu Gly Phe 100 105 110 Asp Trp Val Thr Gly Gly Arg Trp Ala Ala Gln Gln Phe Phe Trp Asp 115 120 125 Arg Ile Asn Asp His Asp His Ala Phe Ser Arg Asn Lys Ser Glu Val 130 135 140 Arg Thr Ala Val Leu Glu Ile Ser Gly Cys Glu Gln Ala Ile Val Ala 145 150 155 160 Gly Ile Glu Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser Glu Phe His 165 170 175 Gly Phe Pro Arg Asp Lys Tyr Thr Thr Leu Gln Glu Thr Thr Asp Arg 180 185 190 Ile Leu Ala Thr Asp Val Ser Ala Arg Trp Arg Tyr Asn Thr Val Glu 195 200 205 Val Asp Phe Asp Ala Val Tyr Ala Ser Val Arg Gly Leu Leu Leu Lys 210 215 220 Ala Phe Ala Glu Thr His Ser Leu Ala Leu Gln Gln Thr Met Tyr Glu 225 230 235 240 Met Gly Arg Ala Val Ile Glu Thr His Pro Glu Ile Asp Glu Ile Lys 245 250 255 Met Ser Leu Pro Asn Lys His His Phe Leu Val Asp Leu Gln Pro Phe 260 265 270 Gly Gln Asp Asn Pro Asn Glu Val Phe Tyr Ala Ala Asp Arg Pro Tyr 275 280 285 Gly Leu Ile Glu Ala Thr Ile Gln Arg Glu Gly Ser Arg Ala Asp 290 295 300 <210> 17 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified Arthrobacter globiformis Uricase, NH2-terminal truncated, SGD, PEGylation available sites at T11C and N33C 2-Cys (SGD His C2) with optional N-terminal His tag and optional short linker <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(13) <223> Optional N-terminal His tag and optional linker <400> 17 Met Gly Ser His His His His His His Gly Ala Arg Gln Thr Ala Thr 1 5 10 15 Ala Glu Thr Ser Thr Gly Cys Lys Val Val Leu Gly Gln Asn Gln Tyr 20 25 30 Gly Lys Ala Glu Val Arg Leu Val Lys Val Thr Arg Cys Thr Ala Arg 35 40 45 His Glu Ile Gln Asp Leu Asn Val Thr Ser Gln Leu Ser Gly Asp Phe 50 55 60 Glu Ala Ala His Thr Ala Gly Asp Asn Ala His Val Val Ala Thr Asp 65 70 75 80 Thr Gln Lys Asn Thr Val Tyr Ala Phe Ala Arg Asp Gly Phe Ala Thr 85 90 95 Thr Glu Glu Phe Leu Leu Arg Leu Gly Lys His Phe Thr Glu Gly Phe 100 105 110 Asp Trp Val Thr Gly Gly Arg Trp Ala Ala Gln Gln Phe Phe Trp Asp 115 120 125 Arg Ile Asn Asp His Asp His Ala Phe Ser Arg Asn Lys Ser Glu Val 130 135 140 Arg Thr Ala Val Leu Glu Ile Ser Gly Ser Glu Gln Ala Ile Val Ala 145 150 155 160 Gly Ile Glu Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser Glu Phe His 165 170 175 Gly Phe Pro Arg Asp Lys Tyr Thr Thr Leu Gln Glu Thr Thr Asp Arg 180 185 190 Ile Leu Ala Thr Asp Val Ser Ala Arg Trp Arg Tyr Asn Thr Val Glu 195 200 205 Val Asp Phe Asp Ala Val Tyr Ala Ser Val Arg Gly Leu Leu Leu Lys 210 215 220 Ala Phe Ala Glu Thr His Ser Leu Ala Leu Gln Gln Thr Met Tyr Glu 225 230 235 240 Met Gly Arg Ala Val Ile Glu Thr His Pro Glu Ile Asp Glu Ile Lys 245 250 255 Met Ser Leu Pro Asn Lys His His Phe Leu Val Asp Leu Gln Pro Phe 260 265 270 Gly Gln Asp Asn Pro Asn Glu Val Phe Tyr Ala Ala Asp Arg Pro Tyr 275 280 285 Gly Leu Ile Glu Ala Thr Ile Gln Arg Glu Gly Ser Arg Ala Asp 290 295 300 <210> 18 <211> 290 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified Arthrobacter globiformis Uricase (C-term truncation with SGD) <400> 18 Met Ala Thr Ala Glu Thr Ser Thr Gly Thr Lys Val Val Leu Gly Gln 1 5 10 15 Asn Gln Tyr Gly Lys Ala Glu Val Arg Leu Val Lys Val Thr Arg Asn 20 25 30 Thr Ala Arg His Glu Ile Gln Asp Leu Asn Val Thr Ser Gln Leu Ser 35 40 45 Gly Asp Phe Glu Ala Ala His Thr Ala Gly Asp Asn Ala His Val Val 50 55 60 Ala Thr Asp Thr Gln Lys Asn Thr Val Tyr Ala Phe Ala Arg Asp Gly 65 70 75 80 Phe Ala Thr Thr Glu Glu Phe Leu Leu Arg Leu Gly Lys His Phe Thr 85 90 95 Glu Gly Phe Asp Trp Val Thr Gly Gly Arg Trp Ala Ala Gln Gln Phe 100 105 110 Phe Trp Asp Arg Ile Asn Asp His Asp His Ala Phe Ser Arg Asn Lys 115 120 125 Ser Glu Val Arg Thr Ala Val Leu Glu Ile Ser Gly Ser Glu Gln Ala 130 135 140 Ile Val Ala Gly Ile Glu Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser 145 150 155 160 Glu Phe His Gly Phe Pro Arg Asp Lys Tyr Thr Thr Leu Gln Glu Thr 165 170 175 Thr Asp Arg Ile Leu Ala Thr Asp Val Ser Ala Arg Trp Arg Tyr Asn 180 185 190 Thr Val Glu Val Asp Phe Asp Ala Val Tyr Ala Ser Val Arg Gly Leu 195 200 205 Leu Leu Lys Ala Phe Ala Glu Thr His Ser Leu Ala Leu Gln Gln Thr 210 215 220 Met Tyr Glu Met Gly Arg Ala Val Ile Glu Thr His Pro Glu Ile Asp 225 230 235 240 Glu Ile Lys Met Ser Leu Pro Asn Lys His His Phe Leu Val Asp Leu 245 250 255 Gln Pro Phe Gly Gln Asp Asn Pro Asn Glu Val Phe Tyr Ala Ala Asp 260 265 270 Arg Pro Tyr Gly Leu Ile Glu Ala Thr Ile Gln Arg Glu Gly Ser Arg 275 280 285 Ala Asp 290 <210> 19 <211> 289 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified Arthrobacter globiformis Uricase (processed form - Met cleaved at N-term., SGD, and C-term truncation) <400> 19 Ala Thr Ala Glu Thr Ser Thr Gly Thr Lys Val Val Leu Gly Gln Asn 1 5 10 15 Gln Tyr Gly Lys Ala Glu Val Arg Leu Val Lys Val Thr Arg Asn Thr 20 25 30 Ala Arg His Glu Ile Gln Asp Leu Asn Val Thr Ser Gln Leu Ser Gly 35 40 45 Asp Phe Glu Ala Ala His Thr Ala Gly Asp Asn Ala His Val Val Ala 50 55 60 Thr Asp Thr Gln Lys Asn Thr Val Tyr Ala Phe Ala Arg Asp Gly Phe 65 70 75 80 Ala Thr Thr Glu Glu Phe Leu Leu Arg Leu Gly Lys His Phe Thr Glu 85 90 95 Gly Phe Asp Trp Val Thr Gly Gly Arg Trp Ala Ala Gln Gln Phe Phe 100 105 110 Trp Asp Arg Ile Asn Asp His Asp His Ala Phe Ser Arg Asn Lys Ser 115 120 125 Glu Val Arg Thr Ala Val Leu Glu Ile Ser Gly Ser Glu Gln Ala Ile 130 135 140 Val Ala Gly Ile Glu Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser Glu 145 150 155 160 Phe His Gly Phe Pro Arg Asp Lys Tyr Thr Thr Leu Gln Glu Thr Thr 165 170 175 Asp Arg Ile Leu Ala Thr Asp Val Ser Ala Arg Trp Arg Tyr Asn Thr 180 185 190 Val Glu Val Asp Phe Asp Ala Val Tyr Ala Ser Val Arg Gly Leu Leu 195 200 205 Leu Lys Ala Phe Ala Glu Thr His Ser Leu Ala Leu Gln Gln Thr Met 210 215 220 Tyr Glu Met Gly Arg Ala Val Ile Glu Thr His Pro Glu Ile Asp Glu 225 230 235 240 Ile Lys Met Ser Leu Pro Asn Lys His His Phe Leu Val Asp Leu Gln 245 250 255 Pro Phe Gly Gln Asp Asn Pro Asn Glu Val Phe Tyr Ala Ala Asp Arg 260 265 270 Pro Tyr Gly Leu Ile Glu Ala Thr Ile Gln Arg Glu Gly Ser Arg Ala 275 280 285 Asp <210> 20 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified Arthrobacter globiformis Uricase (contains optional N-terminal His tag and optional short linker, contains SGD instead of RGD) (C-term truncation with his tag and SGD) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(13) <223> Optional N-terminal His tag and optional linker <400> 20 Met Gly Ser His His His His His His Gly Ala Arg Gln Thr Ala Thr 1 5 10 15 Ala Glu Thr Ser Thr Gly Thr Lys Val Val Leu Gly Gln Asn Gln Tyr 20 25 30 Gly Lys Ala Glu Val Arg Leu Val Lys Val Thr Arg Asn Thr Ala Arg 35 40 45 His Glu Ile Gln Asp Leu Asn Val Thr Ser Gln Leu Ser Gly Asp Phe 50 55 60 Glu Ala Ala His Thr Ala Gly Asp Asn Ala His Val Val Ala Thr Asp 65 70 75 80 Thr Gln Lys Asn Thr Val Tyr Ala Phe Ala Arg Asp Gly Phe Ala Thr 85 90 95 Thr Glu Glu Phe Leu Leu Arg Leu Gly Lys His Phe Thr Glu Gly Phe 100 105 110 Asp Trp Val Thr Gly Gly Arg Trp Ala Ala Gln Gln Phe Phe Trp Asp 115 120 125 Arg Ile Asn Asp His Asp His Ala Phe Ser Arg Asn Lys Ser Glu Val 130 135 140 Arg Thr Ala Val Leu Glu Ile Ser Gly Ser Glu Gln Ala Ile Val Ala 145 150 155 160 Gly Ile Glu Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser Glu Phe His 165 170 175 Gly Phe Pro Arg Asp Lys Tyr Thr Thr Leu Gln Glu Thr Thr Asp Arg 180 185 190 Ile Leu Ala Thr Asp Val Ser Ala Arg Trp Arg Tyr Asn Thr Val Glu 195 200 205 Val Asp Phe Asp Ala Val Tyr Ala Ser Val Arg Gly Leu Leu Leu Lys 210 215 220 Ala Phe Ala Glu Thr His Ser Leu Ala Leu Gln Gln Thr Met Tyr Glu 225 230 235 240 Met Gly Arg Ala Val Ile Glu Thr His Pro Glu Ile Asp Glu Ile Lys 245 250 255 Met Ser Leu Pro Asn Lys His His Phe Leu Val Asp Leu Gln Pro Phe 260 265 270 Gly Gln Asp Asn Pro Asn Glu Val Phe Tyr Ala Ala Asp Arg Pro Tyr 275 280 285 Gly Leu Ile Glu Ala Thr Ile Gln Arg Glu Gly Ser Arg Ala Asp 290 295 300 <210> 21 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified Arthrobacter globiformis Uricase (contains optional N-terminal His tag and optional short linker) (C-term truncation with his tag) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(13) <223> Optional N-terminal His tag and optional linker <400> 21 Met Gly Ser His His His His His His Gly Ala Arg Gln Thr Ala Thr 1 5 10 15 Ala Glu Thr Ser Thr Gly Thr Lys Val Val Leu Gly Gln Asn Gln Tyr 20 25 30 Gly Lys Ala Glu Val Arg Leu Val Lys Val Thr Arg Asn Thr Ala Arg 35 40 45 His Glu Ile Gln Asp Leu Asn Val Thr Ser Gln Leu Arg Gly Asp Phe 50 55 60 Glu Ala Ala His Thr Ala Gly Asp Asn Ala His Val Val Ala Thr Asp 65 70 75 80 Thr Gln Lys Asn Thr Val Tyr Ala Phe Ala Arg Asp Gly Phe Ala Thr 85 90 95 Thr Glu Glu Phe Leu Leu Arg Leu Gly Lys His Phe Thr Glu Gly Phe 100 105 110 Asp Trp Val Thr Gly Gly Arg Trp Ala Ala Gln Gln Phe Phe Trp Asp 115 120 125 Arg Ile Asn Asp His Asp His Ala Phe Ser Arg Asn Lys Ser Glu Val 130 135 140 Arg Thr Ala Val Leu Glu Ile Ser Gly Ser Glu Gln Ala Ile Val Ala 145 150 155 160 Gly Ile Glu Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser Glu Phe His 165 170 175 Gly Phe Pro Arg Asp Lys Tyr Thr Thr Leu Gln Glu Thr Thr Asp Arg 180 185 190 Ile Leu Ala Thr Asp Val Ser Ala Arg Trp Arg Tyr Asn Thr Val Glu 195 200 205 Val Asp Phe Asp Ala Val Tyr Ala Ser Val Arg Gly Leu Leu Leu Lys 210 215 220 Ala Phe Ala Glu Thr His Ser Leu Ala Leu Gln Gln Thr Met Tyr Glu 225 230 235 240 Met Gly Arg Ala Val Ile Glu Thr His Pro Glu Ile Asp Glu Ile Lys 245 250 255 Met Ser Leu Pro Asn Lys His His Phe Leu Val Asp Leu Gln Pro Phe 260 265 270 Gly Gln Asp Asn Pro Asn Glu Val Phe Tyr Ala Ala Asp Arg Pro Tyr 275 280 285 Gly Leu Ile Glu Ala Thr Ile Gln Arg Glu Gly Ser Arg Ala Asp 290 295 300 <210> 22 <211> 291 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified Arthrobacter globiformis Uricase (0 cysteines) (truncated the C-terminal 11 amino acids to eliminate the Cys) (C-term truncation) <400> 22 Met Thr Ala Thr Ala Glu Thr Ser Thr Gly Thr Lys Val Val Leu Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Tyr Gly Lys Ala Glu Val Arg Leu Val Lys Val Thr Arg 20 25 30 Asn Thr Ala Arg His Glu Ile Gln Asp Leu Asn Val Thr Ser Gln Leu 35 40 45 Arg Gly Asp Phe Glu Ala Ala His Thr Ala Gly Asp Asn Ala His Val 50 55 60 Val Ala Thr Asp Thr Gln Lys Asn Thr Val Tyr Ala Phe Ala Arg Asp 65 70 75 80 Gly Phe Ala Thr Thr Glu Glu Phe Leu Leu Arg Leu Gly Lys His Phe 85 90 95 Thr Glu Gly Phe Asp Trp Val Thr Gly Gly Arg Trp Ala Ala Gln Gln 100 105 110 Phe Phe Trp Asp Arg Ile Asn Asp His Asp His Ala Phe Ser Arg Asn 115 120 125 Lys Ser Glu Val Arg Thr Ala Val Leu Glu Ile Ser Gly Ser Glu Gln 130 135 140 Ala Ile Val Ala Gly Ile Glu Gly Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly 145 150 155 160 Ser Glu Phe His Gly Phe Pro Arg Asp Lys Tyr Thr Thr Leu Gln Glu 165 170 175 Thr Thr Asp Arg Ile Leu Ala Thr Asp Val Ser Ala Arg Trp Arg Tyr 180 185 190 Asn Thr Val Glu Val Asp Phe Asp Ala Val Tyr Ala Ser Val Arg Gly 195 200 205 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Arthrobacter globiformis Uricase (0 cysteines) (RGD variants, truncated the C-terminal aa to eliminate the cysteine) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(49) <223> X is either R or any natural amino acid except C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50) <223> X is either G or any natural amino acid except C <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(51) <223> X is either D or any natural amino acid except C <400> 25 Met Thr Ala Thr Ala Glu Thr Ser Thr Gly Thr Lys Val Val Leu Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Tyr Gly Lys Ala Glu Val Arg Leu Val Lys Val Thr Arg 20 25 30 Asn Thr Ala Arg His Glu Ile Gln Asp Leu Asn Val Thr Ser Gln Leu 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Phe Glu Ala Ala His Thr Ala Gly Asp Asn Ala His Val 50 55 60 Val Ala Thr Asp Thr Gln Lys Asn Thr Val Tyr Ala Phe Ala Arg Asp 65 70 75 80 Gly Phe Ala Thr Thr Glu Glu Phe Leu Leu Arg Leu Gly Lys His Phe 85 90 95 Thr Glu Gly Phe Asp Trp Val Thr Gly Gly Arg Trp Ala Ala Gln Gln 100 105 110 Phe Phe Trp Asp Arg Ile Asn Asp His Asp His Ala Phe Ser Arg Asn 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amino acids) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(49) <223> X is either R or any natural amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50) <223> X is either G or any natural amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(51) <223> X is either D or any natural amino acid <400> 26 Met Thr Ala Thr Ala Glu Thr Ser Thr Gly Thr Lys Val Val Leu Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Tyr Gly Lys Ala Glu Val Arg Leu Val Lys Val Thr Arg 20 25 30 Asn Thr Ala Arg His Glu Ile Gln Asp Leu Asn Val Thr Ser Gln Leu 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Phe Glu Ala Ala His Thr Ala Gly Asp Asn Ala His Val 50 55 60 Val Ala Thr Asp Thr Gln Lys Asn Thr Val Tyr Ala Phe Ala Arg Asp 65 70 75 80 Gly Phe Ala Thr Thr Glu Glu Phe Leu Leu Arg Leu Gly Lys His Phe 85 90 95 Thr Glu Gly Phe Asp Trp Val Thr Gly Gly Arg Trp Ala Ala Gln Gln 100 105 110 Phe Phe Trp Asp Arg Ile Asn Asp His Asp His Ala Phe Ser Arg Asn 115 120 125 Lys Ser Glu Val Arg Thr Ala Val Leu Glu Ile Ser Gly Ser Glu Gln 130 135 140 Ala Ile Val Ala Gly Ile Glu Gly Leu Thr Val 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Trp Arg 180 185 190 Tyr Asn Trp Thr Asp Asp Gln Pro Met Pro Asp Trp Asp Lys Ser Tyr 195 200 205 Glu Gln Val Arg Lys His Leu Leu Glu Ala Phe Ala Glu Thr Tyr Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gln Gln Thr Leu Tyr Gln Met Gly Ser Arg Val Leu Glu 225 230 235 240 Ala Arg Pro Glu Ile Asp Glu Ile Arg Phe Ser Leu Pro Asn Lys His 245 250 255 His Phe Leu Val Asp Leu Glu Pro Phe Gly Leu Asp Asn Asp Asn Glu 260 265 270 Val Tyr Phe Ala Ala Asp Arg Pro Tyr Gly Leu Ile Glu Ala Thr Val 275 280 285 Leu Arg Asp Gly Ala Glu Pro Arg Ile Pro Val Asp Met Thr Asn Leu 290 295 300

Claims (31)

  1. 서열 번호 1 내지 34 중 어느 하나와 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 요산분해효소로서, 이때, 이러한 서열은 서열 번호 27 내지 33 중 어느 하나는 아닌 것인 요산분해효소.
  2. 제1항에 있어서, 서열 번호 1과 적어도 약 90% 동일한 요산분해효소.
  3. 제1항에 있어서, 서열 번호 1과 적어도 약 95% 동일한 요산분해효소.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 이러한 요산분해효소는 2번 위치에 T를 포함하지 않으며, 2번 위치는 결실되거나 치환되는데, 이때, 이러한 넘버링은 서열 번호 27에 대한 것인 요산분해효소.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 27에 대한 2번 위치는 A인 요산분해효소.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 약 1개 내지 약 6개의 시스테인을 포함하는 요산분해효소.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 11C, 33C, 119C 및 142C 중 적어도 한 위치에 시스테인을 포함하되, 이러한 위치 넘버링은 서열 번호 27에 대한 것인 요산분해효소.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 11C, 33C, 119C, 120C, 142C, 196C, 238C, 286C 및 289C 중 적어도 한 위치에 시스테인을 포함하되, 이러한 위치 넘버링은 서열 번호 27에 대한 것인 요산분해효소.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 두 개의 시스테인을 포함하는 요산분해효소.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 시스테인 잔기(들)에서 페길화된 요산분해효소.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, RGD 모티프를 포함하지 않는 요산분해효소.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 이러한 요산분해효소는 RGD 모티프를 포함하되, 이때, R은 S로 돌연변이된 것인 요산분해효소.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1 내지 34 중 어느 하나와 약 1개 내지 약 35개 아미노산이 상이한 서열을 포함하는 요산분해효소.
  14. 제13항에 있어서, 서열 번호 1과 약 1개 내지 약 14개 아미노산이 상이한 요산분해효소.
  15. 제1항에 있어서, 서열 번호 1인 요산분해효소.
  16. 제1항에 있어서, 서열 번호 2인 요산분해효소.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 요산분해효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열.
  18. 제17항의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터.
  19. 제18항의 벡터를 포함하는 세포주.
  20. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 요산분해효소를 포함하는 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 이러한 요산분해효소는 조성물 내에서 사분자체를 형성하는 것인 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 각 사분자체 내에서 요산분해효소 단량체의 적어도 95%는 디페길화된 것인 조성물.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 고요산혈증 환자의 요산 및/또는 요산염 결정 부하 수준을 감소시키는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 이러한 환자는 통풍을 앓는 환자인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 이러한 환자는 만성 난치성 통풍 및/또는 결절성 통풍을 앓는 환자인 방법.
  26. 제23항에 있어서, 이러한 환자는 종양 용해 증후군을 앓는 환자인 방법.
  27. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 이러한 요산분해효소는 피하로 투여되는 것인 방법.
  28. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 이러한 요산분해효소는 정맥 내로 투여되는 것인 방법.
  29. 제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 이러한 환자는 치료 전에 6.8 mg/dL 보다 높은 혈청 요산염 수준 및 치료 후에 6.8 mg/dL 보다 낮은 수준을 나타내는 것인 방법.
  30. 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원성과 관련이 없는 방법.
  31. 제23항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 아나필락시스와 관련이 없는 방법.
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