WO2023048505A1 - Apn 그룹을 포함하는 링커 및 이를 이용하여 제조된 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트 - Google Patents

Apn 그룹을 포함하는 링커 및 이를 이용하여 제조된 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트 Download PDF

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WO2023048505A1
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group
substituted
unsubstituted
albumin
unit
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PCT/KR2022/014276
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권인찬
양병섭
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주식회사 프로앱텍
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    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
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    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C255/00—Carboxylic acid nitriles
    • C07C255/49—Carboxylic acid nitriles having cyano groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of a carbon skeleton
    • C07C255/50—Carboxylic acid nitriles having cyano groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of a carbon skeleton to carbon atoms of non-condensed six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)

Definitions

  • One embodiment of the present application relates to a linker comprising an APN group used in the preparation of a conjugate.
  • One embodiment of the present application relates to a functional polypeptide variant-albumin conjugate prepared using a linker comprising an APN group.
  • therapeutic proteins have achieved clinical success in the treatment of a variety of diseases, which continues to serve as an important growth driver for the pharmaceutical sector.
  • therapeutic proteins are easily destroyed by proteolytic enzymes in the body or have an extremely short half-life in blood, so they require repeated administration rather than a single administration, resulting in side effects such as immunogenicity. Therefore, one of the important considerations in the development of therapeutic proteins is to prolong the duration of drug efficacy in order to avoid repeated administration.
  • One of the efficient methods is to use human serum albumin to increase the durability of the therapeutic protein. That is, by producing a therapeutic protein-albumin complex, the in vivo half-life of the therapeutic protein can be increased, and thus, the duration of drug efficacy of the therapeutic protein is increased.
  • thiol groups are mainly used for chemical modification of biomolecules and the like. Since cysteine residues containing thiol groups are relatively less present in proteins or peptides than other reactive amino acids (e.g., lysine), site-specific modification or site-specific conjugation of proteins or peptides It is mainly used for site-specific conjugation.
  • a thiol-maleimide reaction is mainly used. The thiol-maleimide reaction forms a thioether bond at pH 6.5 to 7.5, and makes it possible to prepare a desired conjugate in high yield. Because of their advantages, such as selectivity, efficiency, and accessibility, thiol-maleimide linkages have been used over the past few decades in the development of a variety of materials and/or drugs, ranging from chemicals to therapeutics.
  • the thiol-maleimide reaction forms a thioether group.
  • the thiolether groups formed by the thiol-maleimide reaction are unstable in aqueous media and in vivo conditions, and subsequent trapping by retro-conjugate trapping and endogenous thiols such as glutathione. It has been found to suffer from subsequence trapping. (Baldwin, Aaron D., and Kristi L. Kiick. "Tunable degradation of maleimide-thiol adducts in reducing environments.” Bioconjugate chemistry 22.10 (2011): 1946-1953.)
  • the thiol-maleimide reaction is somewhat unstable in aqueous media and in vivo conditions. Therefore, when preparing an albumin conjugate through a thiol-maleimide bond, there is a problem in that the desired half-life cannot be achieved.
  • H 2 is a second click chemical functional group, wherein the second click chemical functional group is a terminal alkyne group, an azide group, a strained alkyne group, or a diene group. , dienophile group, trans-cyclooctene group, alkene group, thiol group, tetrazine group, triazine group, DBCO (dibenzocyclooctyne) group And any one group selected from the bicyclononyne group,
  • J 2 is a second junction unit, wherein the second junction unit has a structure formed by a reaction between an APN group and a thiol group;
  • P 1 is an albumin unit, wherein the albumin unit is derived from albumin.
  • the second click chemical functional group may include any one group selected from a trans cyclooctyne group, a DBCO group, and a bicyclononine group.
  • the second click chemofunctional group may include a trans cyclooctyne group.
  • the second bonding unit may have the following structure:
  • the S atom is derived from the albumin.
  • the second bonding unit may have the following structure.
  • the S atom is derived from the albumin.
  • the S atom may be derived from a cysteine residue of the albumin.
  • the S atom may be derived from a thiol group of cysteine residue 34 of the albumin.
  • the second anchor unit is substituted or unsubstituted C 1-50 alkylene, substituted or unsubstituted C 1-50 heteroalkylene, -substituted or unsubstituted C 1-20 alkylene-[EG] n -, -Substituted or unsubstituted C 1-20 Heteroalkylene-[EG] n -, -Substituted or unsubstituted C 1-20 Alkylene-[EG] n -Substituted or unsubstituted C 1-20 Alkylene- , -substituted or unsubstituted C 1-20 alkylene-[EG] n -substituted or unsubstituted C 1-20 heteroalkylene-, and -substituted or unsubstituted C 1-20 heteroalkylene-[EG] ] any one selected from n -substituted or unsubstituted C 1-20 heteroalkylene-;
  • EG is an ethylene glycol unit
  • the ethylene glycol unit has a structure of -OCH 2 CH 2 - or -CH 2 OCH 2 -, where n is an integer of 1 or more and 12 or less,
  • the heteroalkylene includes one or more heteroatoms, wherein the heteroatoms are each independently selected from N, O, and S,
  • said second anchor unit is -A 21 -A 22 -A 23 -, wherein:
  • a 22 is a bond, substituted or unsubstituted C 1-12 alkylene, substituted or unsubstituted C 1-12 heteroalkylene, -substituted or unsubstituted C 1-12 alkylene-[EG] n -, -Substituted or unsubstituted C 1-12- Heteroalkylene-[EG] n -, -Substituted or unsubstituted C 1-12 Alkylene-[EG] n -Substituted or unsubstituted C 1-12 Alkylene-, -substituted or unsubstituted C 1-12 heteroalkylene-[EG] n -substituted or unsubstituted C 1-12 alkylene-, and -substituted or unsubstituted C 1-12 heteroalkylene -[EG] any one selected from n -substituted or unsubstituted C 1-12 heteroalkylene-
  • EG is an ethylene glycol unit
  • the ethylene glycol unit has a structure of -OCH 2 CH 2 - or -CH 2 OCH 2 -, where n is an integer of 2 or more and 6 or less,
  • heteroalkylene is each independently selected from N, O, and S,
  • a 21 A case in which both A 22 and A 23 are simultaneously bonded may not exist.
  • the second anchor unit may have any one of the following structures:
  • 3' is an attachment site to the second click chemical functional group
  • 4' is an attachment site to the second bonding unit
  • the albumin may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 01.
  • compounds having the structure of Formula 4-1 may be provided:
  • S is derived from the thiol group of cysteine residue 34 of the albumin
  • n is an integer of 2 or more and 6 or less.
  • compounds having the structure of Formula 4-4 may be provided:
  • S is derived from the thiol group of cysteine residue 34 of the albumin.
  • FPV is a functional polypeptide variant unit, said functional polypeptide variant unit being derived from a functional polypeptide variant, said functional polypeptide variant comprising one or more non-natural amino acids;
  • the non-natural amino acid includes a first click chemical functional group, wherein the first click chemical functional group can undergo a click chemical reaction with a second click chemical functional group, wherein the first click chemical functional group is a terminal alkyne ) group, azide group, strained alkyne group, diene group, dienophile group, trans-cyclooctene group, alkene group, Including any one group selected from a thiol group, a tetrazine group, a triazine group, a dibenzocyclooctyne (DBCO) and a bicyclononyne group,
  • DBCO dibenzocyclooctyne
  • J 1 is a first bonding unit, and the first bonding unit has a structure formed by a click chemical reaction between the first click chemical functional group and the second click chemical functional group;
  • a 2 is a second anchor moiety, said second anchor unit being a substituted hydrocarbon chain containing one or more heteroatoms;
  • J 2 is a second junction unit, wherein the second junction unit has a structure formed by a reaction between an APN group and a thiol group;
  • P 1 is an albumin unit, said albumin unit being derived from albumin;
  • a is an integer greater than or equal to 1 and less than or equal to 8;
  • the functional polypeptide variant may be any one selected from a urate oxidase variant, a urate oxidase subunit variant, a GLP1 variant, an hGH variant, and a GFP variant.
  • the functional polypeptide variant can be any one selected from:
  • the functional polypeptide variant may be a uric acid oxidase subunit variant derived from Arthrobacter globiformis having any one sequence selected from SEQ ID NOs: 100 to 113.
  • the first click chemofunctional group may include a tetrazine group or an azide group.
  • the non-natural amino acid may be frTet.
  • the second click chemical functional group may include any one group selected from a trans cyclooctyne (TCO) group, a DBCO group, and a bicyclononine group.
  • TCO trans cyclooctyne
  • DBCO DBCO
  • bicyclononine group any one group selected from a trans cyclooctyne (TCO) group, a DBCO group, and a bicyclononine group.
  • the second click chemofunctional group may include a trans cyclooctyne (TCO) group.
  • the second bonding unit may have the following structure:
  • the S atom is derived from the albumin.
  • the second bonding unit may have the following structure:
  • the S atom is derived from the albumin.
  • the S atom may be derived from a cysteine residue of the albumin.
  • the S atom may be derived from a thiol group of cysteine residue 34 of the albumin.
  • said second anchor unit is a substituted or unsubstituted C 1-50 alkylene, a substituted or unsubstituted C 1-50 heteroalkylene, -substituted or unsubstituted C 1-20 alkylene-[ EG] n -, -substituted or unsubstituted C 1-20 heteroalkylene-[EG] n -, -substituted or unsubstituted C 1-20 alkylene-[EG] n -substituted or unsubstituted C 1 -20 Alkylene-, -Substituted or unsubstituted C 1-20 Alkylene-[EG] n -Substituted or unsubstituted C 1-20 Heteroalkylene-, and -Substituted or unsubstituted C 1-20 Hetero alkylene-[EG] n -any one selected from substituted or unsubstituted C 1-20
  • EG is an ethylene glycol unit
  • the ethylene glycol unit has a structure of -OCH 2 CH 2 - or -CH 2 OCH 2 -, where n is an integer of 1 or more and 12 or less,
  • the heteroalkylene includes one or more heteroatoms, wherein the heteroatoms are each independently selected from N, O, and S,
  • said second anchor unit is -A 21 -A 22 -A 23 -;
  • a 22 is a bond, substituted or unsubstituted C 1-12 alkylene, substituted or unsubstituted C 1-12 heteroalkylene, -substituted or unsubstituted C 1-12 alkylene-[EG] n -, -Substituted or unsubstituted C 1-12- Heteroalkylene-[EG] n -, -Substituted or unsubstituted C 1-12 Alkylene-[EG] n -Substituted or unsubstituted C 1-12 Alkylene-, -substituted or unsubstituted C 1-12 heteroalkylene-[EG] n -substituted or unsubstituted C 1-12 alkylene-, and -substituted or unsubstituted C 1-12 heteroalkylene -[EG] any one selected from n -substituted or unsubstituted C 1-12 heteroalkylene-
  • EG is an ethylene glycol unit
  • the ethylene glycol unit has a structure of -OCH 2 CH 2 - or -CH 2 OCH 2 -, where n is an integer of 2 or more and 6 or less,
  • heteroalkylene is each independently selected from N, O, and S,
  • a 21 A case in which both A 22 and A 23 are simultaneously bonded may not exist.
  • the second anchor unit may have any one of the following structures:
  • 3' is an attachment site with the first bonding unit
  • 4' is an attachment site with the second bonding unit
  • the albumin may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 01.
  • a can be an integer greater than or equal to 1 and less than or equal to 4.
  • the method for producing a functional polypeptide variant-albumin conjugate according to one embodiment of the present application can improve the half-life of the functional polypeptide variant.
  • the functional polypeptide variant-albumin conjugate according to one embodiment of the present application can improve the half-life of the functional polypeptide variant.
  • linker or albumin-linker conjugate containing an APN group By using the linker or albumin-linker conjugate containing an APN group according to one embodiment of the present application, a functional polypeptide variant-albumin conjugate with improved half-life can be prepared.
  • Figure 1 shows a schematic diagram of uric acid oxidase variants and albumin-linker conjugates.
  • MAL-HSA represents an albumin-linker conjugate formed by the reaction of a maleimide group and a thiol group
  • APN-HSA represents an albumin-linker conjugate formed by the reaction of an APN group and a thiol group.
  • Figure 2 shows the results of SDS-PAGE analysis of Uox (AgUox-WT, WT) and Uox variants (AgUox-frTet, frTet).
  • Figure 2 (a) shows the Coomassie Brilliant Blue-stained protein (CBB-stained protein) of AgUox and its variants.
  • Figure 2 (b) shows CBB stained protein gels of AgUox and variants thereof.
  • Figure 2(c) shows the fluorescence die labeling results for AgUox-WT and AgUox-frTet.
  • Figure 3 shows the MS analysis results for AgUox-WT and AgUox-frTet.
  • FIG. 4 shows the results of preparing the AgUox-HSA conjugate. Specifically, FIG. 4 discloses a protein gel for the reaction of AgUox-frTet with MAL-HSA or APN-HSA (albumin-linker conjugate).
  • FIG. 5 shows the results of preparing the AgUox-HSA conjugate. Specifically, FIG. 5 discloses size exclusion chromatography and protein gel results for AgUox-frTet and MAL-HSA or APN-HSA conjugation mixtures.
  • FIG. 7 shows the in vitro stability test results of the AgUox-HSA conjugate. Specifically, FIG. 7 shows the protein gel results for the AgUox-HSA conjugate cultured for a certain period of time in a blood-simulating environment.
  • FIGS. 8 and 9 show the in vitro stability test results of the AgUox-HSA conjugate. Specifically, FIGS. 8 and 9 show mass spectra results for the AgUox-HSA conjugate cultured for a certain period of time in a blood-simulating environment.
  • the term "about” means approximately as close to a quantity as, relative to a reference amount, level, value, number, frequency, percentage, dimension, size, amount, weight, or length, such as 30, 25, 20, means an amount, level, value, number, frequency, percentage, dimension, size, amount, weight or length that varies by 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 or 1%.
  • polypeptide is used to mean a compound formed by consecutively linking a plurality of amino acids.
  • polypeptide is used to include both peptides and proteins.
  • a polypeptide can include, for example, but is not limited to, three or more amino acid residues.
  • a polypeptide can include, but is not limited to, 15 or more amino acid residues. In other instances, it may include, but is not limited to, 50 or more amino acid residues. In other instances, a polypeptide may include, but is not limited to, 200 or more amino acid residues.
  • Halogen or "halo” refers to a group containing fluorine, chlorine, bromine and iodine included in the halogen group of elements in the periodic table.
  • hetero refers to a compound or group containing at least one heteroatom.
  • heteroatom is an atom other than carbon or hydrogen, including, for example, B, Si, N, P, O, S, F, Cl, Br, I and Se.
  • polyvalent elements such as N, O, and S or monovalent elements such as F, Cl, Br, and I are included, but are not limited thereto.
  • substituted means that one or more hydrogen atoms on an atom are replaced with a substituent, wherein the valence of the atom is normal and the substituted compound is stable.
  • the substituents are each independently selected.
  • Substituents may include deuterium and hydrogen variants.
  • one substituent is a halogen (eg, Cl, F, Br, and I, etc.)
  • halogen eg, Cl, F, Br, and I, etc.
  • substituents can be arbitrary, as long as they are chemically achievable.
  • substituted C 10-20 alkylene may mean that one or more hydrogen atoms linked to the main chain are substituted with substituents, and each substituent may be independently selected.
  • alkyl or “alkane” is used to mean a fully saturated chain or branched hydrocarbon group.
  • Chain and branched alkyl groups include, for example, methyl, ethyl, n-propyl, iso-propyl, n-butyl, sec-butyl, tert-butyl, iso-butyl, pentyl, hexyl, heptyl (heptyl), octyl, nonyl, and decyl.
  • Alkyl groups may include cyclic structures.
  • C xy for example when used with the term alkyl, is intended to include moieties containing from x to y carbons in the chain or ring.
  • C xy alkyl includes substituted or unsubstituted, chain-like alkyl groups, branched alkyl groups, or alkyl groups containing a cyclic structure containing x to y carbons in the chain; , and further haloalkyl groups such as difluoromethyl and 2,2,2-trifluoroethyl, and the like.
  • C 0 Alkyl means hydrogen.
  • C 1-4 alkyl examples include methyl, ethyl, n-propyl, iso-propyl, n-butyl, sec-butyl, tert-butyl, iso-butyl, difluoromethyl, and 2,2,2-trifluoro roethyl and the like, but are not limited thereto.
  • heteroalkyl refers to an alkyl containing one or more heteroatoms.
  • alkenyl or “alkene” is used to mean a chain or branched non-aromatic hydrocarbon group containing one or more double bonds.
  • a chain-like or branched alkenyl group can have 2 to about 50, 2 to 20, or 2 to 10 carbon atoms.
  • Alkenyl groups can include cyclic structures.
  • heteroalkene refers to an alkene containing one or more heteroatoms.
  • alkynyl or “alkyne” is used to mean a chain or branched non-aromatic hydrocarbon group containing one or more triple bonds.
  • a chain or branched alkynyl group can have 2 to about 50, 2 to 20, or 2 to 10 carbon atoms.
  • An alkynyl group may contain one or more double bonds in addition to one or more triple bonds.
  • Alkynyl groups can include cyclic structures.
  • heteroalkyn refers to an alkyne containing one or more heteroatoms.
  • alkylene when used as a molecule on its own or as part of a molecule refers to a divalent radical derived from an alkyl.
  • alkylene may be used with the terms “substituted” or “unsubstituted”, as appropriate.
  • alkylene is intended to include both substituted and unsubstituted alkylenes.
  • Alkylene may be exemplified by -CH 2 -, -CH 2 CH 2 -, -CH 2 CH 2 CH 2 -, and -CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -, but is not limited thereto.
  • alkylene may be used as C 2 alkylene, which refers to an alkylene group containing two carbon atoms in the main chain.
  • C xy alkylene is used to mean an alkylene including both substituted and unsubstituted alkylenes having X to Y number of carbon atoms in the main chain.
  • heteroalkylene when used as a molecule on its own or as part of a molecule refers to a divalent radical derived from a heteroalkyl.
  • heteroalkylene may be used with the terms “substituted” or “unsubstituted” as appropriate.
  • heteroalkylene when the term “heteroalkylene” is not used in conjunction with the terms “substituted” or “unsubstituted”, the term “heteroalkylene” includes both substituted and unsubstituted heteroalkylenes.
  • heteroalkylene groups include, but are not limited to —CH 2 —CH 2 —O—CH 2 —CH 2 —, and —CH 2 —O—CH 2 —CH 2 —NH—CH 2 —.
  • Heteroalkylene groups can contain one or more heteroatoms, and each heteroatom can be the same or different.
  • a heteroalkylene group may contain one or more heteroatoms at non-terminal positions of a chain or branch, and each heteroatom may be the same or different.
  • a heteroalkylene group can contain one or more heteroatoms at each or all ends of a chain or branch, and each heteroatom can be the same or different.
  • C xy heteroalkylene is used to include all substituted or unsubstituted heteroalkylenes having x to y carbon atoms in the main chain.
  • alkenylene when used as a molecule by itself or as part of a molecule refers to a divalent radical derived from an alkene.
  • alkenylene may be used with the terms “substituted” or “unsubstituted” as appropriate.
  • the term “alkenylene” is intended to include both substituted and unsubstituted alkenylene.
  • C xy alkenylene is used to include all substituted or unsubstituted alkenylene having X to Y number of carbon atoms in the main chain.
  • heteroalkenylene when used as a molecule on its own or as part of a molecule refers to a divalent radical derived from a heteroalkene.
  • heteroalkenylene may be used with the terms “substituted” or “unsubstituted” as appropriate.
  • heteroalkenylene when the term “heteroalkenylene” is not used with the terms “substituted” or “unsubstituted”, the term “heteroalkenylene” includes both substituted and unsubstituted heteroalkenylenes. it is intended to A heteroalkenylene group can contain one or more heteroatoms, and each heteroatom can be the same or different.
  • a heteroalkenylene group may contain one or more heteroatoms at non-terminal positions of a chain or branch, and each heteroatom may be the same or different.
  • a heteroalkenylene group may contain one or more heteroatoms at each or all ends of the chain or branch, and each heteroatom may be the same or different.
  • alkynylene when used as a molecule by itself or as part of a molecule refers to a divalent radical derived from an alkyne.
  • alkynylene may be used with the terms “substituted” or “unsubstituted” as appropriate.
  • the term “alkynylene” is intended to include both substituted and unsubstituted alkynylenes.
  • an alkynylene group includes, but is not limited to, -C ⁇ C-, -CH 2 C ⁇ CCH 2 -, and -C ⁇ CC ⁇ C-.
  • C xy alkynylene is used to include all substituted or unsubstituted alkynylene having X to Y number of carbon atoms in the main chain.
  • heteroalkynylene when used as a molecule on its own or as part of a molecule refers to a divalent radical derived from a heteroalkyne.
  • heteroalkynylene may be used with the terms “substituted” or “unsubstituted” as appropriate.
  • heteroalkynylene when the term “heteroalkynylene” is not used with the terms “substituted” or “unsubstituted”, the term “heteroalkynylene” includes both substituted and unsubstituted heteroalkynylene. It is intended to A heteroalkynylene group can contain one or more heteroatoms, and each heteroatom can be the same or different.
  • a heteroalkynylene group may contain one or more heteroatoms at non-terminal positions of a chain or branch, and each heteroatom may be the same or different.
  • a heteroalkynylene group can contain one or more heteroatoms at each or all ends of a chain or branch, and each heteroatom can be the same or different.
  • Compounds herein may have certain geometric or stereoisomeric forms. Where a compound is disclosed in this application unless otherwise specified, cis and trans isomers, (-)- and (+)-enantiomers, (R)- and (S)-enantiomers, portions of said compound Isomers such as stereoisomers, (D)-isomers, (L)-isomers, and racemates are included within the scope of this application. That is, an indication related to an isomer in a formula or structure disclosed in this application (eg, *, , , and etc.), the formula or structure disclosed is meant to include all possible isomers.
  • click-chemistry as used herein is defined by K. Barry Sharpless of the Scripps Research Institute to describe complementary chemical groups and chemical reactions designed to quickly and stably form a covalent bond between two molecules. It is a chemical concept introduced for Click chemistry in the present specification does not mean a specific reaction, but means a concept of a fast and stable reaction. In one embodiment, in order to form bonds between molecules by click chemistry, several conditions must be satisfied. The conditions are high yield, excellent selectivity for the reaction site, organic molecular bonding by operating in a modular manner, and rapid and accurate product production by proceeding in a thermodynamically stabilized direction.
  • the click chemistry of the present specification is a click chemical functional group (eg, terminal alkyne, azide, strained alkyne, diene, dienophile, trans cyclo Octyne (trans-cyclooctene), alkene (alkene), thiol (thiol), tetrazine (tetrazine), triazine (triazine), dibenzocyclooctyne (DBCO) and bicyclononyne (bicyclo[6.1.0]non-4- Including yne), a pair having reactivity with each other reacts.
  • DBCO dibenzocyclooctyne
  • bicyclononyne bicyclo[6.1.0]non-4- Including yne
  • click chemistry reactions include Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition (see Tornoe et al., Journal of Organic Chemistry (2002) 67: 3075-3064, etc.); Diels-Alder reaction; inverse-demand Diels-Alder reaction; Nucleophilic addition to small strained rings such as epoxides and aziridines; a nucleophilic addition reaction to an activated carbonyl group; and addition reactions to carbon-carbon double bonds or triple bonds.
  • the term "natural amino acid” or "standard amino acid” refers to 20 types of amino acids synthesized through gene transcription and translation in the body of an organism. do. Specifically, the standard amino acids are Alanine (Ala, A), Arginine (Arg, R), Asparagine (Asn, N), Aspartic acid (Asp, D), Cysteine (Cys) , C), glutamic acid (Glu, E), glutamine (Gln, Q), glycine (Gly, G), histidine (His, H), isoleucine (Ile, I), Leucine (Leu, L), Lysine (Lys K), Methionine (Met, M), Phenylalanine (Phe, F), Proline (Pro, P), Serine (Ser, S), threonine (Thr, T), tryptophan (Trp, W), tyrosine (Tyr, Y), and valine (Val, V).
  • the standard amino acids are Alanine (Ala,
  • Each of the above standard amino acids has a corresponding DNA codon, and can be represented by a general amino acid one-letter or three-letter notation.
  • the subject referred to by the term standard amino acid should be appropriately interpreted according to the context, and includes all other meanings that can be recognized by those skilled in the art.
  • nonnatural amino acid refers to an amino acid that is not synthesized in the body but artificially synthesized.
  • the non-natural amino acids include, for example, p-Azido-L-phenylalanine (AzF), p-ethynyl-phenylalanine (pEthF), LHomopropargylglycine (HPG), O-propargyl-L-tyrosine (oPa), ppropargyloxyphenylalanine (pPa), 2 -amino-3-(4-azidophenyl)propanoic acid, 2-amino-4-(4-azidophenyl)butanoic acid, and 4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl) phenylalanine (frTet), etc.
  • non-natural amino acid does not have a corresponding DNA codon and cannot be expressed in a general amino acid one-letter or three-letter notation, it is indicated using other characters and additionally supplemented.
  • the subject referred to by the term non-natural amino acid should be appropriately interpreted according to the context, and includes all other meanings that can be recognized by those skilled in the art.
  • amino acid can be used to refer to both amino acids not bound to other amino acids and amino acid residues included in proteins or peptides bound to other amino acids, and the contents of the paragraph in which the amino acid term is used Or it may be appropriately interpreted according to the context.
  • amino acid may be used to include both natural amino acids and non-natural amino acids.
  • alanine may be used to refer to alanine and/or an alanine residue.
  • arginine can be used to refer to arginine and/or arginine residues.
  • amino acid may be used to include both L-type amino acids and D-type amino acids. In some embodiments, where there is no reference to the L or D form, it can be interpreted as an L-form amino acid.
  • amino acid residue refers to an amino acid contained in a compound, peptide, and/or protein that is covalently linked to another portion of the compound, peptide, and/or protein. structure derived from it. For example, when alanine, arginine, and glutamic acid are linked through an amide bond to form a peptide having an ARE sequence, the peptide includes three amino acid residues, wherein A is an alanine residue, R is an arginine residue, and E is may be referred to as glutamic acid residues.
  • the peptide may include three amino acids, and A is alanine, R is arginine, and E is glutamic acid.
  • A is alanine
  • R is arginine
  • E is glutamic acid.
  • the peptide when aspartic acid, phenylalanine, and lysine are linked through an amide bond to form a peptide having a DFK sequence, the peptide includes three amino acid residues, wherein D is an aspartic acid residue, F is a phenylalanine residue, and K may be referred to as a lysine residue.
  • the peptide may include three amino acids, and D may be referred to as aspartic acid, F may be phenylalanine, and K may be referred to as lysine.
  • amino acid sequences are described in the N-terminal to C-terminal direction using one-letter notation or three-letter notation when describing amino acid sequences in the present specification.
  • RNVP when expressed as RNVP, it means a peptide in which arginine, asparagine, valine, and proline are sequentially connected from the N-terminal to the C-terminal.
  • Thr-Leu-Lys when expressed as Thr-Leu-Lys, it means a peptide in which threonine, leucine, and lysine are sequentially connected from the N-terminal to the C-terminal.
  • amino acids that cannot be expressed by the one-letter notation or the three-letter notation other characters are used and additionally supplemented descriptions are provided.
  • treatment refers to an approach for obtaining a beneficial or desirable clinical result.
  • a beneficial or desirable clinical result is limited to alleviation of symptoms, reduction of disease extent, stabilization of the disease state. (i.e., not worsening), delay or slowing of disease progression, prevention of disease, amelioration or palliation of disease state, and alleviation (partial or total), detectable or undetectable.
  • Treatment refers to both therapeutic treatment and prophylactic or prophylactic measures.
  • the term "subject" refers to an animal in need of treatment that can be achieved by a molecule of the invention.
  • Animals that can be treated according to the present invention include vertebrates, with mammals such as murine, bovine, canine, equine, feline, ovine, porcine and primates (including humans and non-human primates) being particularly preferred examples. .
  • therapeutic proteins or therapeutic polypeptides are easily destroyed by proteolytic enzymes in the body, have an extremely short half-life in blood, have low efficacy, require repeated administration rather than single administration, and have side effects such as immunogenicity. There are problems that tend to arise. Therefore, one of the important considerations in the development of therapeutic polypeptides or proteins is to increase the half-life in blood related to the duration of drug efficacy, the number of administrations, and immunogenicity. In order to solve the problem of the therapeutic protein or polypeptide, a method of increasing the blood half-life by covalently or non-covalently attaching albumin to the therapeutic protein or polypeptide has been used.
  • the thiol-maleimide reaction is a technique mainly used in the field of bioconjugation.
  • Thiol-maleimide reactions have been used to covalently attach albumin to therapeutic proteins or polypeptides. Specifically, the thiol group of albumin reacted with the maleimide group of elements other than albumin to form a thiosuccinimide group, through which albumin and elements other than albumin were connected.
  • the thiol-maleimide reaction is formed under the condition of pH 6.5 to 7.5, and under the condition of pH 7.5 or higher, the maleimide group reacts with not only the thiol group but also the primary amine group, and unwanted impurities may be generated. there is. That is, the thiol-maleimide reaction has a problem in that the usable pH range is limited.
  • albumin When albumin is released from the conjugate administered into the body, a therapeutic polypeptide that is not bound to albumin is formed.
  • Therapeutic polypeptides that are not bound to albumin again have the above-mentioned problems such as short duration of drug effect and immunogenicity. Furthermore, this release of albumin causes a decrease in plasma half-life.
  • Koniev, Oleksandr, et al. developed 3-Arylpropiolonitriles (APN) groups having reactivity with thiol groups used for thiol group modification or thiol conjugation.
  • Koniev, Oleksandr, et al. describe that the thiol-APN reaction is highly chemoselective in aqueous buffer conditions and is more stable in vivo than the thiol-maleimide reaction (Koniev, Oleksandr, et al. "Selective Irreversible chemical tagging of cysteine with 3-arylpropiolonitriles.” Bioconjugate chemistry 25.2 (2014): 202-206.).
  • the inventors of the present application attach albumin to a therapeutic polypeptide or the like using the thiol-APN reaction to form a conjugate.
  • a gate was prepared, and it was confirmed that the conjugate prepared through the thiol-APN reaction was more stable in vivo and had a longer plasma half-life than the conjugate prepared through the thiol-maleimide reaction.
  • the present application provides functional polypeptide variant-albumin conjugates.
  • the functional polypeptide variant-albumin conjugate of the present application has a form in which the functional polypeptide variant is covalently linked to albumin through a linker.
  • Functional polypeptide variants, albumin, and linkers are used to prepare functional polypeptide variant-albumin conjugates.
  • the functional polypeptide variant-albumin conjugate is prepared by site-specifically linking (i) functional polypeptide variant and (ii) albumin through (iii) a linker.
  • functional polypeptide variants include non-natural amino acid residues.
  • the linker includes an APN group and a click chemical functional group.
  • the linker includes an APN group at one end and a click chemical functional group at the other end.
  • the APN group of the linker reacts with the thiol group of albumin
  • the click chemistry functional group of the linker reacts with another click chemistry functional group included in the non-natural amino acid residue of the functional polypeptide variant.
  • Functional polypeptide variants, albumins, and linkers are each described in detail in the relevant sections.
  • a functional polypeptide variant-albumin conjugate having the structure of Formula 1 is provided:
  • FPV is a functional polypeptide variant unit.
  • a functional polypeptide variant unit may be a conjugated functional polypeptide variant. That is, a functional polypeptide variant unit is derived from a functional polypeptide variant.
  • J 1 is a first junction unit.
  • the first conjugation unit has a structure formed by a click chemical reaction between a first click chemical functional group included in the functional polypeptide variant and a second click chemical functional group capable of performing a click chemical reaction with the first click chemical functional group.
  • a 2 is a second anchor unit.
  • the second anchor unit refers to a construct linking the functional polypeptide variant unit and the albumin unit.
  • the second anchor unit serves to adjust the distance between the functional polypeptide variant unit and the albumin unit. If it is a structure commonly used for distance control in the art, it is not significantly limited.
  • the second anchor unit is derived from a linker.
  • J 2 is a second junction unit.
  • the second conjugation unit has a structure formed by the reaction of an APN group with a thiol group of albumin.
  • P 1 is an albumin unit.
  • the albumin unit may be conjugated albumin. That is, the albumin unit is derived from albumin.
  • a is an integer of 1 or more and 8 or less. In certain embodiments, a can be an integer greater than or equal to 1 and less than or equal to 4.
  • functional polypeptide variant-albumin conjugates are prepared using a functional polypeptide, a linker, and albumin. Furthermore, in the conjugate, the functional polypeptide variant unit is derived from the functional polypeptide variant, the albumin unit is derived from albumin, and the second anchor unit is derived from the linker.
  • the elements used in the preparation of functional polypeptide variant-albumin conjugates are described in detail.
  • the linker of the present application includes an APN group.
  • Functional polypeptide variants are linked to albumin via a linker.
  • an albumin-linker conjugate may be prepared by reacting albumin with a linker
  • a functional polypeptide variant-albumin conjugate may be prepared by reacting the albumin-linker conjugate with a functional polypeptide variant.
  • a functional polypeptide variant-linker conjugate is prepared by reacting the functional polypeptide variant with a linker
  • a functional polypeptide variant-albumin conjugate is prepared by reacting the functional polypeptide variant-linker conjugate with albumin.
  • the linker includes an APN group and a click chemofunctional group.
  • the APN group reacts with the thiol group of albumin (thiol-APN reaction) to form a structure included in the second conjugation unit.
  • the click chemical functional group reacts with other click chemical functional groups included in the non-natural amino acid of the functional polypeptide variant to form a structure included in the first conjugation unit.
  • the linker may include an APN group and a second click chemofunctional group.
  • the APN group reacts with a thiol group, and the second click chemical functional group may undergo a click chemical reaction with the first click chemical functional group.
  • the linker of the present application includes an APN group.
  • APN groups are reactive with thiol groups.
  • the linker of the present application may be referred to as a linker comprising an APN group.
  • the APN group included in the linker of the present application may have the following structure:
  • an APN group can have the following structure:
  • One embodiment of the present application provides a linker having the structure of Formula 2:
  • H 2 is a second click chemical functional group.
  • the second click chemistry functional group may have a click chemistry functional group.
  • the second click chemistry functional group may undergo a click chemistry reaction with the first click chemistry functional group.
  • a 2 is a second anchor unit.
  • the second anchor unit serves to adjust the distance between the second click chemofunctional group and the APN group.
  • the second anchor unit serves to control the distance between the functional polypeptide variant unit and the albumin unit.
  • B is an APN group.
  • the second click chemistry functional group has a click chemistry functional group.
  • the second click chemistry functional group is a terminal alkyne, azide, strained alkyne, diene, dienophile, trans cyclooctyne (trans) -cyclooctene, alkene, thiol, tetrazine, triazine, methylcyclopropene, norbornene, cyclopentene, styrene ), (including dibenzocyclooctyne (DBCO) and bicyclononyne (bicyclo[6.1.0]non-4-yne)).
  • trans trans cyclooctyne
  • alkene alkene
  • thiol thiol
  • tetrazine triazine
  • methylcyclopropene norbornene
  • cyclopentene styrene
  • DBCO dibenzocyclooctyne
  • bicyclononyne bicyclo[6.1.0]non-4-
  • the second click chemistry functional group is a trans-bicyclo[6.1.0]nonene group, a trans-cyclooctene (TCO) group, a methylcyclopropene group (methylcyclopropene) group, bicyclo[6.1.0]nonyne group, cyclooctyne group, norbornene group, cyclopentene group, styrene group, and a dibenzocyclooctyne group, but is not limited thereto.
  • TCO trans-cyclooctene
  • TCO trans-cyclooctene
  • methylcyclopropene group methylcyclopropene
  • bicyclo[6.1.0]nonyne group cyclooctyne group
  • norbornene group norbornene group
  • cyclopentene group styrene group
  • dibenzocyclooctyne group but is not limited thereto.
  • the second click chemofunctional group can have any one of the following structures:
  • the wavy line represents an attachment site to another part of the linker.
  • a wavy line may indicate an attachment site with the second anchor unit.
  • the second click chemofunctional group can have the following structure:
  • the wavy line represents an attachment site to another part of the linker.
  • a wavy line may indicate an attachment site with the second anchor moiety.
  • a 2 is a second anchor unit.
  • the second anchor unit is a substituted hydrocarbon chain comprising one or more heteroatoms.
  • the hetero atom may be each independently selected from N, O, and S.
  • the second anchor unit may include a polyethylene glycol unit composed of a plurality of ethylene glycol units.
  • EG means an ethylene glycol unit and has a structure of -OCH 2 CH 2 - or -CH 2 OCH 2 -.
  • n may be an integer of 1 or more and 12 or less.
  • the second anchor unit can be a substituted -C 5-15 heteroalkylene-[EG] n -substituted C 1-5 heteroalkylene.
  • EG means an ethylene glycol unit and has a structure of -OCH 2 CH 2 - or -CH 2 OCH 2 -.
  • n may be an integer of 1 or more and 6 or less.
  • the second anchor unit can be a substituted C 5-15 heteroalkylene.
  • the linker may have the structure of Formula 2-1:
  • H 2 is a second click chemical functional group, which is described in detail in the section 'Second click chemical functional group (H 2 )'.
  • -A 21 -A 22 -A 23 - is a second anchor unit.
  • EG means an ethylene glycol unit and has a structure of -OCH 2 CH 2 - or -CH 2 OCH 2 -.
  • n may be an integer of 2 or more and 6 or less.
  • B is a group containing an APN group.
  • the linker can have a structure of any one of the following formulas:
  • n may be an integer of 2 or more and 8 or less.
  • albumin is used in the preparation of functional polypeptide variant-albumin conjugates.
  • Albumin is a simple protein that is widely distributed in body fluids, and serves as a transport protein that binds and transports various molecules.
  • a representative example of albumin is serum albumin.
  • P 1 is an albumin unit.
  • the albumin unit may be conjugated albumin.
  • the albumin unit may be derived from albumin.
  • albumin may be used to include both albumin unconjugated with other compounds and albumin conjugated with other compounds.
  • albumin may be a protein having the sequence of SEQ ID NO: 01.
  • albumin unit P 1 in Formula 1 may be referred to as albumin.
  • albumin Specific examples include albumin
  • the albumin can be mammalian albumin, eg serum albumin.
  • the albumin may be any one selected from human serum albumin (HSA), bovine serum albumin (BSA), ovalbumin, other vertebrate albumin, and variants thereof. . They may be wild-type or recombinant forms (recombinant albumins).
  • the albumin can be wild type or recombinant human serum albumin.
  • the human serum albumin has a long half-life of 2 weeks or more. This is because 1) it is not easily filtered in the glomerulus due to the electrostatic repulsion of the albumin molecule, and 2) it is degraded in the body due to the recycling action mediated by the neonatal Fc receptor (FcRn) of the endothelium. because it is long
  • the albumin can be human serum albumin, wherein the human serum albumin can comprise the amino acid sequence below.
  • the albumin can be human serum albumin or a variant thereof, and the human serum albumin or variant thereof can comprise a sequence selected from any one of the following sequences:
  • a thiol residue of a cysteine included in human serum albumin or a variant thereof may react with an APN group at one end of the linker. More specifically, a thiol residue of cysteine included in human serum albumin or a variant thereof may react with an APN group at one end of the linker. At this time, the cysteine reacting with one end of the linker may be cysteine 34 (Cys 34).
  • the term functional polypeptide is used herein to include all peptides, polypeptides, and proteins having more than one function.
  • the function may be related to treatment and/or prevention of a certain disease.
  • the function may be related to diagnosis.
  • the function may be to act with other polypeptides to form complexes.
  • the function may be to act with a cognate polypeptide to form a complex.
  • the complex can be used to treat any disease.
  • a function may be related to manipulation of a gene.
  • the function may be related to binding to other molecules (eg, antigens and targets, etc.).
  • Functional polypeptides can include, for example, antibodies, fragments of antibodies, antigens, therapeutic proteins that are not antibodies, fragments of therapeutic proteins that are not antibodies, and subunits of therapeutic proteins that are not antibodies.
  • the functional polypeptide comprises Urate oxidase (Uox), a uric acid oxidase subunit, Glucagon-like peptide-1 (GLP1) or an analogue thereof, human growth hormone; hGH), and green fluorescent protein (GFP) or analogues thereof (eg, superfolder GFP), but is not limited thereto.
  • Functional polypeptide variants are functional polypeptides that have been modified to include non-natural amino acids.
  • functional polypeptide variants may be those in which one or more amino acid residues included in the functional polypeptide are substituted with non-natural amino acid residues. That is, functional polypeptide variants contain one or more non-natural amino acid residues.
  • the non-natural amino acid residue may include a click chemofunctional group.
  • Functional polypeptide variants may be described by reference sequences (sequences of functional polypeptides) or reference polypeptides (functional polypeptides).
  • functional polypeptide variants can be specified by describing substitution positions and/or amino acids to be substituted in the reference sequence.
  • the functional polypeptide variant can be any one selected from a urate oxidase variant, a urate oxidase subunit variant, a GLP1 variant, an hGH variant, and a GFP variant.
  • FPV is a functional polypeptide variant unit.
  • a functional polypeptide variant unit may be a conjugated functional polypeptide variant.
  • a functional polypeptide variant unit may be derived from a functional polypeptide variant.
  • a functional polypeptide variant may be used to include both functional polypeptide variants not conjugated with other compounds and functional polypeptide variants conjugated with other compounds.
  • a functional polypeptide variant can be a protein having the sequence of SEQ ID NO: 111.
  • functional polypeptide variant unit FFV in Formula 1 may be referred to as a functional polypeptide variant.
  • non-natural amino acid may be used to refer to both amino acids not bound to other amino acids and non-natural amino acid residues included in proteins and/or peptides bound to other amino acids. may be appropriately interpreted according to the content or context of the paragraph in which is used.
  • a functional polypeptide variant contains non-natural amino acid residues.
  • a functional polypeptide variant is one in which one or more natural amino acid residues contained in the functional polypeptide are substituted with non-natural amino acid residues.
  • Non-natural amino acids containing a first click chemical functional group are non-natural amino acids containing a first click chemical functional group
  • a non-natural amino acid according to one embodiment of the present application includes a click chemofunctional group.
  • the non-natural amino acid may include a first click chemofunctional group.
  • the first click chemistry functional group has a click chemistry functional group capable of performing a click chemistry reaction with the aforementioned second click chemistry functional group.
  • the first click chemistry functional group is a terminal alkyne, azide, strained alkyne, diene, dienophile, trans cyclooctyne (trans) -cyclooctene, alkene, thiol, tetrazine, triazine, methylcyclopropene, norbornene, cyclopentene, styrene ), (including dibenzocyclooctyne (DBCO) and bicyclononyne (bicyclo[6.1.0]non-4-yne)).
  • the first click chemistry functional group may be any one selected from a tetrazine group or an analog thereof, a triazine group or an analog thereof, and an azide group.
  • the non-natural amino acid may include a tetrazine group. In one embodiment, the non-natural amino acid may include a triazine group. In one embodiment, the non-natural amino acid may include an azide group.
  • the non-natural amino acid can have the structure of Formula 3:
  • a 1 is the first anchor moiety.
  • H 1 is a first click chemical functional group.
  • the first click chemistry functional group has a click chemistry functional group, and the click chemistry functional group is a terminal alkyne, an azide, a strained alkyne, a diene, a diene Dienophile, trans-cyclooctene, alkene, thiol, tetrazine, triazine, dibenzocyclooctyne (DBCO) and bicyclononyne, bicyclo[6.1 .0] non-4-yne)).
  • DBCO dibenzocyclooctyne
  • bicyclononyne bicyclo[6.1 .0] non-4-yne
  • the first click chemofunctional group can be represented by any one of the following structures:
  • the first anchor moiety can be a bond or -A 11 -A 12 -.
  • a 11 may be a bond or C 1-5 alkylene.
  • a 12 is a bond or [arylene]p, -[arylene]pC 1-5 alkylene-, -[arylene]pC 1-5 heteroalkylene-, -arylene-C 1- 5 Alkylene-arylene-, -arylene-C 1-5 Heteroalkylene-arylene-, -arylene-heteroarylene-, [heteroarylene]p, -[heteroarylene]pC 1-5 Alkylene-, -[heteroarylene]pC 1-5 Heteroalkylene-, -heteroarylene-C 1-5 Alkylene-arylene-, -heteroarylene-C 1-5 Alkylene-heteroarylene -, -heteroarylene-C 1-5 heteroalkylene-arylene-, and -heteroarylene-C 1-5 heteroalkylene-heteroarylene-.
  • p may be an integer of 0 or more and 3 or less.
  • the non-natural amino acid may include a tetrazine group. In one embodiment, the non-natural amino acid may include a triazine group. In one embodiment, the non-natural amino acid may include an azide group.
  • the non-natural amino acids are p-Azido-L-phenylalanine (AzF), p-ethynyl-phenylalanine (pEthF), LHomopropargylglycine (HPG), O-propargyl-L-tyrosine (oPa), ppropargyloxyphenylalanine (pPa), 2-amino-3-(4-azidophenyl)propanoic acid, 2-amino-4-(4-azidophenyl)butanoic acid, 4-(1,2,3,4-tetrazin-3-yl) phenylalanine (frTet), 4-(6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)phenylalanine (Tet_v2.0), 4-(6-methyl -s- tetrazin-3-yl)phenylalanine, 3-(4- (1,2,4-triazin-6-yl)phenyl)
  • the non-natural amino acid may have a structure of any one of the following formulas:
  • the functional polypeptide variant may be a urate oxidase variant. In one embodiment, the functional polypeptide variant may be a urate oxidase subunit variant.
  • variants of uric acid oxidase and variants of uric acid oxidase subunits will be described in detail.
  • Uric acid oxidase is an enzyme that has the function of decomposing uric acid. Since the human body does not produce uric acid oxidase, if the decomposition of uric acid is not smooth, uric acid is deposited in the body and can cause various diseases. Thus, the uric acid oxidase can be used to treat diseases caused by high levels of uric acid, including, for example, gout.
  • the uric acid oxidase may exist in the form of a tetramer or an octamer in which four monomers having the same structure are combined.
  • the uric acid oxidase is a tetramer or octamer formed by oligomerization of four uric acid oxidase subunits.
  • the wild-type uric acid oxidase is a tetrameric protein in which four identical wild-type uric acid oxidase subunits are oligomerized.
  • the uric acid oxidase variant used in the preparation of the uric acid oxidase variant-albumin conjugate which is an example of the functional polypeptide variant-albumin conjugate disclosed herein, is characterized in that a part of the sequence of wild-type urate oxidase derived from a microorganism is modified do.
  • the uric acid oxidase variant contains one or more non-natural amino acids and can be site-specifically conjugated to albumin via each non-natural amino acid residue.
  • the uric acid oxidase variant may contain one, two, three, or four, or more unnatural amino acids.
  • the uric acid oxidase variant is a tetramer formed by oligomerization of four uric acid oxidase subunit variants, and each uric acid oxidase subunit variant has at least one amino acid in its sequence compared to a wild-type urate oxidase subunit. It is characterized in that it is substituted with a natural amino acid.
  • Wild-type uric acid oxidase which is the prototype of the uric acid oxidase variant provided herein, is derived from a microorganism.
  • the wild-type uric acid oxidase may be a uric acid oxidase derived from a microorganism selected from Aspergillus Flavus , Arthrobacter globiformis , and Candida Utilis .
  • the amino acid sequence of the subunit is from the N-terminus to the C-terminus
  • the amino acid sequence of the subunit is from the N-terminus to the C-terminus
  • the amino acid sequence of the subunit is from the N-terminus to the C-terminus
  • the uric acid oxidase used herein includes microbial uric acid oxidase and mammalian uric acid oxidase.
  • the uric acid oxidase mutant is also a tetrameric protein comprising four subunits.
  • the uric acid oxidase variants include 1 to 4 uric acid oxidase subunit variants, and the uric acid oxidase subunit variants have at least one amino acid substituted with a non-natural amino acid in the nocturnal urate oxidase subunit that is its prototype.
  • the uric acid oxidase variant may comprise one uric acid oxidase subunit variant, and three wild-type uric acid oxidase subunits.
  • the uric acid oxidase variant may comprise two uric acid oxidase subunit variants, and one wild-type urate oxidase subunit. In another embodiment, the uric acid oxidase variant may comprise three uric acid oxidase subunit variants, and one wild-type uric acid oxidase subunit. In another embodiment, said uric acid oxidase variants may comprise four uric acid oxidase subunit variants.
  • Uric acid oxidase subunit variant subunits include one or more non-natural amino acids.
  • the non-natural amino acid includes a first click chemical functional group capable of performing a click chemical reaction with a second click chemical functional group.
  • the non-natural amino acids contained in the uric acid oxidase variant subunits are described in detail in the section 'Non-natural amino acids'.
  • the uric acid oxidase subunit variant may be one in which one or more amino acids of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 are substituted with a non-natural amino acid.
  • the uric acid oxidase variant subunit is 8th tyrosine, 16th tyrosine, 30th tyrosine, 46th tyrosine, 65th tyrosine, 79th phenylalanine of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, 87th phenylalanine, 91st tyrosine, 106th tryptophan, 120th phenylalanine, 159th phenylalanine, 160th tryptophan, 162nd phenylalanine, 167th tyrosine, 174th tryptophan, 186th tryptophan, 188th tryptophan, 191st phenylalanine, 204th At least one residue selected from the group consisting of phenyrosine, 16th
  • the uric acid oxidase variant subunit is glycine at position 137, glutamic acid at position 22, asparagine at position 92, lysine at position 23, serine at position 295, glycine at position 113, lysine at position 273, position 171 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13.
  • the uric acid oxidase variant subunit may be one in which one or more amino acids of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 are substituted with a non-natural amino acid.
  • the uric acid oxidase variant subunit is tyrosine 10, tyrosine 163, phenylalanine 17, phenylalanine 45, tyrosine 59, tyrosine 77 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14.
  • the urate oxidase variant subunit is threonine at position 301, asparagine at position 26, leucine at position 303, lysine at position 194, serine at position 95, serine at position 140, glycine at position 116, position 302 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14.
  • the uric acid oxidase variant subunit may be one in which one or more amino acids of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 are substituted with a non-natural amino acid.
  • the uric acid oxidase variant subunit is tyrosine 20, phenylalanine 52, tyrosine 75, phenylalanine 77, phenylalanine 82, phenylalanine 88, phenylalanine 96, phenylalanine 100 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15.
  • the uric acid oxidase variant subunit is aspartic acid at position 80, phenylalanine at position 82, phenylalanine at position 100, aspartic acid at position 101, phenylalanine at position 114, asparagine at position 119, aspartic acid at position 120 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 , Serine at position 142, glutamic acid at position 143, glycine at position 175, valine at position 195, glutamic acid at position 196, histidine at position 218, and at least one amino acid selected from proline at position 238 may be substituted with a non-natural amino acid.
  • the 196th glutamic acid (tyrosine) residue of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 may be substituted with a non-natural amino acid.
  • the uric acid oxidase subunit having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 is a uric acid oxidase subunit derived from Arthrobacter globiformis .
  • the uric acid oxidase variant subunit may have the sequence of any one of the following sequences:
  • X represents a non-natural amino acid residue.
  • X can be frTet or Azf.
  • a functional polypeptide variant is a variant of a polypeptide having more than one function
  • the functional polypeptide variant is, for example, a urate oxidase variant, a urate oxidase subunit variant, a GLP1 variant, an hGH variant, a GFP variant, Alternatively, it may be a sfGFP mutant, but is not limited thereto.
  • various examples of functional polypeptide variants are disclosed.
  • the functional polypeptide can be GLP1 or an analog thereof, and the GLP1 analog can have the sequence of any one of the following sequences:
  • HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG (SEQ ID NO: 16);
  • HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG (SEQ ID NO: 17);
  • HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG (SEQ ID NO: 18).
  • the functional polypeptide variant may be a GLP1 variant, and the GLP1 variant may be in which any one or more amino acids in the amino acid sequence of GLP1 or a GLP1 analog are substituted with a non-natural amino acid.
  • the functional polypeptide variant can be a GLP1 variant, and the GLP1 variant can have the sequence of any one of the following sequences:
  • HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRX (SEQ ID NO: 19);
  • HGEGTFTSDXSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG SEQ ID NO: 20
  • HGEGTFTSDVSSXLEGQAAKEFIAWLVKGRG (SEQ ID NO: 21);
  • HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEXIAWLVKGRG (SEQ ID NO: 22);
  • HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRX (SEQ ID NO: 23);
  • HAEGTFTSDXSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG (SEQ ID NO: 24);
  • HAEGTFTSDVSSXLEGQAAKEFIAWLVRGRG (SEQ ID NO: 25);
  • HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEXIAWLVRGRG (SEQ ID NO: 26);
  • HGEGTFTSDXSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG (SEQ ID NO: 27);
  • HGEGTFTSDVSSXLEGQAAKEFIAWLVRGRG (SEQ ID NO: 28);
  • HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEXIAWLVRGRG (SEQ ID NO: 29);
  • HGEGTFTSDXSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRX (SEQ ID NO: 30);
  • HGEGTFTSDVSSXLEGQAAKEFIAWLVKGRX (SEQ ID NO: 31);
  • HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEXIAWLVKGRX (SEQ ID NO: 32);
  • HAEGTFTSDXSSXLEGQAAKEFIAWLVRGRG (SEQ ID NO: 33);
  • HAEGTFTSDXSSYLEGQAAKEXIAWLVRGRG (SEQ ID NO: 34);
  • HAEGTFTSDVSSXLEGQAAKEXIAWLVRGRG (SEQ ID NO: 35);
  • HGEGTFTSDXSSXLEGQAAKEFIAWLVRGRG (SEQ ID NO: 36);
  • HGEGTFTSDXSSXLEGQAAKEFIAWLVKGRX (SEQ ID NO: 37);
  • HGEGTFTSDXSSYLEGQAAKEXIAWLVKGRX (SEQ ID NO: 38);
  • HGEGTFTSDVSSXLEGQAAKEXIAWLVKGRX (SEQ ID NO: 39);
  • HGEGTFTSDXSSYLEGQAAKEXIAWLVRGRG (SEQ ID NO: 40);
  • HGEGTFTSDVSSXLEGQAAKEXIAWLVRGRG (SEQ ID NO: 41);
  • HGEGTFTSDXSSXLEGQAAKEXIAWLVRGRG (SEQ ID NO: 43).
  • X is an unnatural amino acid.
  • X can be frTet or Azf.
  • the GLP1 variant is about 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% of the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 19-43. , 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% may have an amino acid sequence having a sequence identity. .
  • the functional polypeptide may be hGH.
  • hGH may have an amino acid sequence of the following sequence:
  • the functional polypeptide variant may be an hGH variant, and the hGH variant may be one in which any one or more amino acids in the sequence of hGH are substituted with a non-natural amino acid.
  • the functional polypeptide variant may be an hGH variant, and the hGH variant may have the sequence of any one of the following sequences:
  • X is an unnatural amino acid.
  • X can be frTet or Azf.
  • the hGH variant is about 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% of the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 45-67. , 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% may have an amino acid sequence having a sequence identity. .
  • the functional polypeptide may be sfGFP.
  • sfGFP can have an amino acid sequence of the following sequence:
  • the functional polypeptide variant may be a sfGFP variant, and the sfGFP variant may have any one or more amino acids in the sfGFP sequence substituted with a non-natural amino acid.
  • the functional polypeptide variant can be a sfGFP variant, and the sfGFP variant can have any one of the following sequences:
  • X is an unnatural amino acid.
  • X can be frTet or Azf.
  • the sfGFP variant is about 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% of the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 69-92. %, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% sequence identity.
  • the functional polypeptide variant-albumin conjugate of the present application has the structure of Formula 1:
  • FPV is a functional polypeptide variant unit.
  • Examples of functional polypeptide variant units are detailed in the section relating to functional polypeptide variants.
  • J 1 is a first junction unit.
  • the first conjugation unit has a structure formed by a click chemical reaction between a first click chemical functional group included in the functional polypeptide variant and a second click chemical functional group capable of performing a click chemical reaction with the first click chemical functional group.
  • Each of the first click chemofunctional group and the second click chemofunctional group is described in detail in the relevant section.
  • a 2 is a second anchor unit.
  • the second anchor unit refers to a construct linking the functional polypeptide variant unit and the albumin unit.
  • the second anchor unit serves to adjust the distance between the functional polypeptide variant unit and the albumin unit. If it is a structure commonly used for distance control in the art, it is not significantly limited.
  • the second anchor unit is derived from a linker.
  • the second anchor unit is described in detail in the section 'Linker: contains an APN group' and is also described below.
  • J 2 is a second junction unit.
  • the second conjugation unit has a structure formed by the reaction of an APN group with a thiol group of albumin.
  • a is an integer of 1 or more and 8 or less. In certain embodiments, a is an integer greater than or equal to 1 and less than or equal to 4.
  • a 2 is a second anchor unit. As described above, the second anchor unit is derived from a linker.
  • the second anchor unit is a substituted hydrocarbon chain comprising one or more heteroatoms.
  • hydrocarbon chains may consist of 1 to 500 atoms.
  • the hetero atom may be each independently selected from N, O, and S.
  • the second anchor unit may include a polyethylene glycol unit composed of a plurality of ethylene glycol units.
  • EG means an ethylene glycol unit and has a structure of -OCH 2 CH 2 - or -CH 2 OCH 2 -.
  • n may be an integer of 1 or more and 12 or less.
  • the second anchor unit can be a substituted -C 5-15 heteroalkylene-[EG] n -substituted C 1-5 heteroalkylene.
  • EG means an ethylene glycol unit and has a structure of -OCH 2 CH 2 - or -CH 2 OCH 2 -.
  • n may be an integer of 1 or more and 6 or less.
  • the second anchor unit can be a substituted C 5-15 heteroalkylene.
  • -A 2 - can be -A 21 -A 22 -A 23 -.
  • EG means an ethylene glycol unit and has a structure of -OCH 2 CH 2 - or -CH 2 OCH 2 -.
  • n may be an integer of 2 or more and 6 or less.
  • the second anchor unit can have any one of the following structures:
  • n may be an integer of 2 or more and 8 or less.
  • 3' may be an attachment site with the first bonding unit.
  • 4' may be an attachment site with the second bonding unit.
  • 3' may be an attachment site with the second bonding unit.
  • 4' may be an attachment site with the first bonding unit.
  • J 1 is a first junction unit.
  • the first bonding unit has a structure formed by a click chemical reaction between a first click chemical functional group and a second click chemical functional group.
  • the first conjugation unit may have a structure formed by a click chemical reaction between a first click chemical functional group included in a non-natural amino acid residue of a functional polypeptide variant and a second click chemical functional group at one end of a linker.
  • the first click chemistry functional group is a terminal alkyne, azide, strained alkyne, diene, dienophile, trans-cyclooctyne (trans- cyclooctene, alkene, thiol, tetrazine, triazine, dibenzocyclooctyne (DBCO) and bicyclononyne (bicyclo[6.1.0]non-4-yne). ) may include any one group selected from among the groups.
  • the first click chemofunctional group can include any one of tetrazine, triazine, and azide groups.
  • the second click chemistry functional group is a terminal alkyne, azide, strained alkyne, diene, dienophile, trans-cyclooctyne (trans- cyclooctene, alkene, thiol, tetrazine, triazine, dibenzocyclooctyne (DBCO) and bicyclononyne (bicyclo[6.1.0]non-4-yne). ) may include any one group selected from among the groups.
  • the second click chemofunctional group can include any one of TCO, DBCO, and bicyclononine groups.
  • the first bonding unit can have any one of the following structures:
  • 1' may be an attachment site with a functional polypeptide variant. More specifically, 1' may be an attachment site with the first anchor unit. In this case, 2' may be an attachment site to another structure of the linker. More specifically, 2' may be an attachment site with the second anchor unit.
  • 1' may be an attachment site with another structure of the linker. More specifically, 1' may be an attachment site with the second anchor unit. In this case, 2' may be an attachment site with a functional polypeptide variant. More specifically, 2' may be an attachment site with the first anchor unit.
  • J 2 is a second junction unit.
  • the second conjugation unit has a structure formed by a reaction between an APN group and a thiol group.
  • the second conjugation unit may have a structure formed by reaction of a thiol group of albumin with an APN group at one end of a linker.
  • the thiol group of albumin can be a Cys 34 thiol group.
  • the second bonding unit may have any one of the following structures:
  • the S atom may be derived from albumin. Specifically, the S atom may be derived from a cysteine residue of albumin. More specifically, the S atom may be derived from a thiol group of a cysteine residue of albumin. In certain embodiments, the S atom may be derived from the thiol group of cysteine 34 (Cys 34) of albumin.
  • FPV is a functional polypeptide variant unit.
  • a functional polypeptide unit may be derived from a functional polypeptide variant.
  • a functional polypeptide variant is one in which the functional polypeptide has been modified to include non-natural amino acids.
  • the functional polypeptide may be any one selected from uric acid oxidase, uric acid oxidase subunit, glucagon-like peptide 1 or an analogue thereof, human growth hormone, and green fluorescent protein, but is not limited thereto.
  • the functional polypeptide comprises an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 13-15, SEQ ID NOs: 16, 44, and 68 and about 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 , 99, or 100% sequence identity.
  • the functional polypeptide variant may be any one selected from uric acid oxidase variants, uric acid oxidase subunit variants, glucagon-like peptide 1 variants, human growth hormone variants, green fluorescent protein variants, and sfGFP variants.
  • the functional polypeptide variant unit may be any one selected from a uric acid oxidase variant unit, a uric acid oxidase subunit variant unit, a glucagon-like peptide 1 variant unit, a human growth hormone variant unit, a green fluorescent protein variant unit, and an sfGFP variant unit.
  • a uric acid oxidase variant unit a uric acid oxidase subunit variant unit
  • a glucagon-like peptide 1 variant unit a human growth hormone variant unit
  • a green fluorescent protein variant unit a green fluorescent protein variant unit
  • an sfGFP variant unit an sfGFP variant unit.
  • P 1 is an albumin unit.
  • the albumin unit may be derived from albumin.
  • the albumin may be any one selected from human serum albumin (HSA), bovine serum albumin (BSA), ovalbumin, other vertebrate albumin, and variants thereof. . They may be wild-type or recombinant forms (recombinant albumins).
  • the albumin is about 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, or 100% of the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 01 to 12. It may have an amino acid sequence having sequence identity.
  • the S atom adjacent to the albumin unit is derived from albumin.
  • the S atom adjacent to the albumin unit is derived from a thiol group of albumin.
  • the S atom adjacent to the albumin unit may be derived from a thiol group of a cysteine residue of albumin.
  • the S atom adjacent to the albumin unit may be derived from the thiol group of cysteine 34 of human serum albumin.
  • n may be an integer of 1 or more and 12 or less. In certain embodiments, n may be an integer greater than or equal to 2 and less than or equal to 6.
  • a may be an integer of 1 or more and 8 or less. In certain embodiments, a can be an integer greater than or equal to 1 and less than or equal to 4.
  • a functional polypeptide variant-albumin conjugate can be prepared by reacting a functional polypeptide variant, albumin, and a linker.
  • the functional polypeptide variant-albumin conjugate can be prepared by (1) reacting albumin with a linker to prepare an albumin-linker conjugate, and then reacting the functional polypeptide variant with the prepared albumin-linker conjugate; or (2) a functional polypeptide variant-linker conjugate is prepared by reacting the linker with the functional polypeptide variant, and then reacted with albumin to prepare the functional polypeptide variant-linker conjugate.
  • the functional polypeptide variant-albumin conjugate can be prepared regardless of the reaction order of the three elements (linker, functional polypeptide variant, albumin).
  • a functional polypeptide variant is required to prepare a functional polypeptide variant-albumin conjugate.
  • a method for preparing a functional polypeptide variant will be described through an example of a urate oxidase variant.
  • one or more residues in the amino acid sequence of wild type uric acid oxidase can be changed to an unnatural amino acid.
  • the position can be selected from phenylalanine, tryptophan, tyrosine.
  • the position can be selected from serine, lysine, alanine, proline, tryptophan, aspartic acid, phenylalanine, glutamine, tryptophan, glutamic acid, histidine, and proline.
  • positions with high solvent accessibility may be selected to ensure efficient binding to the linker.
  • positions in the wild-type uric acid oxidase sequence are substituted with non-natural amino acids to create uric acid oxidase variants. can be determined by referring to molecular modeling simulation results. Specifically, the molecular modeling simulation result may be a scoring result of a Rosetta molecular modeling package.
  • the change to the non-natural amino acid may be a substitution of one or more residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13.
  • one or more residues selected from tryptophan at position 160 and tryptophan at position 174 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 may be substituted with a non-natural amino acid.
  • the uric acid oxidase variant subunit is glycine at position 137, glutamic acid at position 22, asparagine at position 92, lysine at position 23, serine at position 295, glycine at position 113, lysine at position 273, position 171 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13.
  • one or more residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 may be substituted with a non-natural amino acid.
  • At least one residue selected from tyrosine at position 163, phenylalanine at position 170, tyrosine at position 200, and tryptophan at position 271 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 is a non-natural amino acid may be substituted with
  • the urate oxidase variant subunit is threonine at position 301, asparagine at position 26, leucine at position 303, lysine at position 194, serine at position 95, serine at position 140, glycine at position 116, position 302 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14.
  • one or more residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 may be substituted with a non-natural amino acid.
  • aspartic acid at position 80, phenylalanine at position 82, phenylalanine at position 100, aspartic acid at position 101, phenylalanine at position 114, asparagine at position 119, aspartic acid at position 120, serine at position 142, and position 143 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 are obtained.
  • At least one amino acid selected from glutamic acid, glycine at position 175, valine at position 195, glutamic acid at position 196, histidine at position 218, and proline at position 238 may be substituted with a non-natural amino acid.
  • the 196th glutamic acid residue may be substituted with a non-natural amino acid.
  • the method for preparing the uric acid oxidase variant involves the following components: a cell line to express the uric acid oxidase variant; foreign suppressor tRNA (foreign suppressor tRNA) recognizing a specific stop codon; foreign tRNA synthetase; and a vector encoding a variant of uric acid oxidase encoding an unnatural amino acid using the stop codon.
  • the exogenous suppressor tRNA and the exogenous tRNA synthetase are not the suppressor tRNA and tRNA synthetase native to the expressing cell line, but are derived from cells different from the expressing cell line.
  • the exogenous suppressor tRNA is characterized in that it does not react with the tRNA synthetase native to the expressing cell line.
  • the exogenous tRNA synthetase reacts i) only with the exogenous suppressor tRNA, and ii) shows activity only with the non-natural amino acid to be included in the urate oxidase variant.
  • the non-natural amino acid can be introduced into the amino acid sequence by specifically linking the exogenous suppressor tRNA with the non-natural amino acid.
  • the method for producing the uric acid oxidase variant is 1) in the cell line, 2) the exogenous suppressor tRNA and the exogenous tRNA synthetase are involved, 3) based on a vector encoding the uric acid oxidase variant, 4) A method for expressing the uric acid oxidase variant.
  • the order of each process is not particularly limited as long as the uric acid oxidase variant can be expressed in the cell line, and additional processes may be included as necessary.
  • the method for producing the variant uric acid oxidase is characterized in that the variant is obtained by expressing the variant uric acid oxidase in a cell line.
  • the mutant uric acid oxidase-expressing cell line is not particularly limited as long as it can produce the mutant uric acid oxidase.
  • the release facotr recognizing the stop codon in the cell line functions properly, the release factor competes with the foreign-derived tRNA, resulting in a low yield. Therefore, it is preferable to use a cell line in which the release factor that recognizes the stop codon is inactivated.
  • the cell line expressing the uric acid oxidase variant may be selected from the following:
  • genus Escherichia Erwinia genus; Serratia genus; Providencia genus; Corynebacterium genus; Pseudomonas ( Pseudomonas ) genus; genus Leptospira ; genus Salmonella ; Brevibacterium genus; Hyphomonas genus; Chromobacterium ( chromobactorium ) genus; genus norcardia ; Fungi ; and Yeast .
  • the cell line may be one in which a release factor that recognizes a stop codon to terminate translation is inactivated.
  • the stop codon is an amber codon (5'-UAG-3'), an ocher codon (5'-UAA-3'), and an opal codon (5'-UGA-3). ') may be selected.
  • the cell line expressing the uric acid oxidase variant may be a cell line used in registration publication KR 1637010 B1.
  • the cell line may be E.Coli C321. ⁇ A.exp (Addgene, ID: 49018).
  • the exogenous suppressor tRNA is a tRNA that functions to recognize a specific stop codon, and does not react with the tRNA synthesizing enzyme native to the expressing cell line.
  • the exogenous suppressor tRNA specifically reacts with the exogenous tRNA synthetase, and the exogenous tRNA synthetase functions to link a non-natural amino acid to the exogenous suppressor tRNA.
  • the exogenous suppressor tRNA can recognize the specific stop codon and introduce the non-natural amino acid at the corresponding position.
  • the suppressor tRNA is an amber codon (5'-UAG-3'), an ocher codon (5'-UAA-3'), and an opal codon (5'-UGA). -3') can be recognized.
  • the suppressor tRNA may recognize an amber codon.
  • the suppressor tRNA may be a suppressor tRNA (MjtRNA Tyr CUA ) derived from Methanococcus jannaschii (Yang et.al, Temporal Control of Efficient In Vivo Bioconjugation Using a Genetically Encoded Tetrazine-Mediated Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reaction, Bioconjugate Chemistry, 2020, 2456-2464).
  • the tRNA synthetase may be the C11 variant of MjTyrRS.
  • an exogenous suppressor tRNA that specifically reacts only with an exogenous tRNA synthetase is collectively referred to as an orthogonal tRNA/synthetase pair.
  • the method for preparing the uric acid oxidase variant disclosed herein it is important to express the orthogonal tRNA/synthetase pair in the expression cell line, and the method is not significantly limited as long as this purpose can be achieved.
  • the method for producing the variant uric acid oxidase comprises transforming the cell line with a vector capable of expressing the orthogonal tRNA/synthetase pair.
  • a vector capable of expressing the orthogonal tRNA/synthetase pair is Yang et.al (Temporal Control of Efficient In Vivo Bioconjugation Using a Genetically Encoded Tetrazine-Mediated Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reaction, Bioconjugate Chemistry, 2020, 2456-2464) may be pDule_C11.
  • vectors encoding functional polypeptide variants will be described.
  • the present application discloses vectors encoding functional polypeptide variants.
  • the vector encoding the variant functional polypeptide is characterized in that a non-natural amino acid in the sequence of the variant functional polypeptide is encoded using a stop codon.
  • the standard amino acid is encoded by a codon corresponding to the standard amino acid found in nature, and the non-natural amino acid is encoded by a stop codon.
  • the stop codon is an amber codon (5'-UAG-3'), an ocher codon (5'-UAA-3'), and an opal codon (5'-UGA-3'). 3') may be selected.
  • the stop codon may be selected from among 5'-TAG-3', 5'-TAA-3', and 5'-TGA-3'.
  • the vector encoding the functional polypeptide variant may be codon-optimized for the expression cell line.
  • a vector encoding the functional polypeptide variant may be E. coli codon optimized.
  • functional polypeptide variant-albumin conjugates can be prepared through the following methods:
  • a functional polypeptide variant-albumin conjugate is prepared by reacting the albumin-linker conjugate with the functional polypeptide variant.
  • the linker may be connected through a specific amino acid residue of albumin.
  • an albumin-linker conjugate may be prepared by reacting a thiol group of cysteine contained in human serum albumin (HSA) with an APN group of a linker.
  • an albumin-linker conjugate may be prepared by reacting a thiol group of cysteine 34 (Cys 34) of human serum albumin (HSA) with an APN group of a linker.
  • a functional polypeptide variant-albumin conjugate in which functional polypeptide variants are linked through a linker, can be prepared.
  • a functional polypeptide variant-albumin conjugate may be prepared by reacting a click chemical functional group at one end of the albumin-linker conjugate with a click chemical functional group included in a non-natural amino acid of the functional polypeptide variant.
  • the functional polypeptide variant-albumin conjugate can be prepared by reacting the second click chemical functional group at one end of the albumin-linker conjugate with the first click chemical functional group of the functional polypeptide variant.
  • functional polypeptide variant-albumin conjugates can be prepared via a method comprising:
  • the albumin-linker conjugate reacts with the functional polypeptide variant to produce a functional polypeptide variant-albumin conjugate.
  • functional polypeptide variant-albumin conjugates can be prepared through the following methods:
  • a functional polypeptide variant-linker conjugate reacts with albumin to prepare a functional polypeptide variant-albumin conjugate.
  • a functional polypeptide variant-linker conjugate can be prepared by a click chemistry reaction between a click chemistry functional group at one end of a linker and a click chemistry functional group of a non-natural amino acid of a functional polypeptide variant.
  • a functional polypeptide variant-linker conjugate may be prepared by reacting a second click chemical functional group at one end of a linker with a first click chemical functional group included in a functional polypeptide variant.
  • a functional polypeptide variant-albumin conjugate can be prepared by reacting a thiol group of cysteine contained in human serum albumin (HSA) with an APN group of a functional polypeptide variant-linker conjugate.
  • a functional polypeptide variant-albumin conjugate can be prepared by reacting a thiol group of cysteine 34 (Cys 34) of human serum albumin (HSA) with an APN group of a functional polypeptide variant-linker conjugate.
  • functional polypeptide variant-albumin conjugates can be prepared via a method comprising:
  • a functional polypeptide variant-linker conjugate reacts with albumin to produce a functional polypeptide variant-albumin conjugate.
  • an albumin-linker conjugate can be prepared through the reaction of a linker with albumin.
  • One embodiment of the present application provides an albumin-linker conjugate.
  • the albumin-linker conjugate can have the structure of Formula 4:
  • H 2 is a second click chemical functional group.
  • the second click chemistry functional group includes a click chemistry functional group.
  • the second click chemistry functional group may undergo a click chemistry reaction with the first click chemistry functional group capable of performing a click chemistry reaction with the second click chemistry functional group.
  • the first bonding unit is formed by a click chemical reaction between the second click chemical functional group and the first click chemical functional group.
  • the second click chemofunctional group is described in detail in a related section.
  • a 2 is a second anchor unit.
  • the second anchor unit may refer to a component connecting the second click chemical functional group and the second conjugation unit and/or the albumin unit. If it is a structure commonly used for distance control in the art, it is not significantly limited.
  • the second anchor unit is derived from a linker. The second anchor unit is described in detail in the section related to the second anchor unit, including the section 'linker:comprising an APN group'.
  • J 2 is a second junction unit.
  • the second bonding unit has a structure formed by the reaction of an APN group and a thiol group.
  • the second conjugation unit may have a structure formed by reaction of a thiol group of albumin with an APN group at one end of a linker.
  • the thiol group of albumin can be that of cysteine 34 (Cys 34).
  • the second bonding unit is described in detail in the section related to the second bonding unit including the section 'second bonding unit'.
  • P 1 is an albumin unit.
  • Albumin units are derived from albumin.
  • Albumin and albumin units are each described in detail in the sections relating to albumin units, including the section 'Albumin and albumin units'.
  • albumin-linker conjugates Specific examples include albumin-linker conjugates
  • albumin-linker conjugates are disclosed.
  • P 1 is an albumin unit.
  • a functional polypeptide variant-linker conjugate can be prepared by reacting a linker with a functional polypeptide variant.
  • One embodiment of the present application provides functional polypeptide variant-linker conjugates.
  • the functional polypeptide variant-linker conjugate may have the structure of Formula 5:
  • FPV is a Functional Polypeptide Variant Unit.
  • a functional polypeptide variant unit is derived from a functional polypeptide variant.
  • Each of the Functional Polypeptide Variants and Functional Polypeptide Variant Units is described in detail in the relevant section.
  • J 1 is a first junction unit.
  • the first bonding unit is described in detail in the section related to the first bonding unit including the section 'first bonding unit'.
  • a 2 is a second anchor unit.
  • the second anchor unit is described in detail in the section related to the second anchor unit, including the section 'linker:comprising an APN group'.
  • J 2 is a second junction unit.
  • the second bonding unit is described in detail in the section related to the second bonding unit including the section 'second bonding unit'.
  • B is an APN group.
  • APN groups are described in detail in sections related to APN groups, including the section 'Linker:Includes APN Group'.
  • a may be an integer of 1 or more and 8 or less. In certain embodiments, a can be an integer greater than or equal to 1 and less than or equal to 4.
  • FPV is a functional polypeptide variant unit.
  • a may be an integer of 1 or more and 8 or less. In certain embodiments, a can be an integer greater than or equal to 1 and less than or equal to 4.
  • One embodiment of the present application provides a composition for treating a target disease comprising a functional polypeptide variant-albumin conjugate as an active ingredient.
  • One embodiment of the present application provides a pharmaceutical composition for treating a target disease comprising a functional polypeptide variant-albumin conjugate as an active ingredient.
  • the target disease may be a disease associated with a functional polypeptide variant. More specifically, the target disease may be a disease that can be treated using a functional polypeptide variant.
  • composition for diagnosis comprising a functional polypeptide variant-albumin conjugate as an active ingredient may be provided.
  • treatment refers to any activity that improves or beneficially transforms the symptoms of a target disease by the administration of the pharmaceutical composition according to the present application, and includes prevention of the target disease.
  • prevention refers to any action that suppresses a target disease or delays the onset of a target disease by administration of the pharmaceutical composition according to the present application.
  • the pharmaceutical composition of the present application may further include a pharmaceutically acceptable carrier in addition to containing the functional polypeptide variant-albumin conjugate as an active ingredient.
  • the type of carrier that can be used in the present application is not particularly limited, and any carrier commonly used in the art may be used.
  • Non-limiting examples of the carrier include saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection solution, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, maltodextrin, glycerol, ethanol, and the like. can These may be used alone or in combination of two or more.
  • the pharmaceutical composition of the present application may be used by adding other pharmaceutically acceptable additives such as excipients, diluents, antioxidants, buffers or bacteriostats, fillers, extenders, wetting agents, disintegrants, dispersants, surfactants , a binder or a lubricant may be additionally added and used.
  • other pharmaceutically acceptable additives such as excipients, diluents, antioxidants, buffers or bacteriostats, fillers, extenders, wetting agents, disintegrants, dispersants, surfactants , a binder or a lubricant may be additionally added and used.
  • the term "administration” means introducing the pharmaceutical composition of the present application to a patient by any suitable method, and the route of administration of the composition of the present application can be oral or parenteral as long as it can reach the target tissue. It can be administered via any route.
  • composition of the present application may be formulated and used in various dosage forms suitable for oral or parenteral administration.
  • Non-limiting examples of formulations for oral administration using the pharmaceutical composition of the present application include troches, lozenges, tablets, aqueous suspensions, oily suspensions, powdered preparations, granules, emulsions, hard capsules, and soft capsules, syrups or elixirs; and the like.
  • a binder such as lactose, saccharose, sorbitol, mannitol, starch, amylopectin, cellulose or gelatin; excipients such as dicalcium phosphate and the like; disintegrants such as corn starch or sweet potato starch; Lubricants such as magnesium stearate, calcium stearate, sodium stearyl fumarate, or polyethylene glycol wax may be used, and sweeteners, aromatics, syrups, and the like may also be used.
  • a liquid carrier such as fatty oil may be additionally used in addition to the above-mentioned materials.
  • Non-limiting examples of parenteral preparations using the pharmaceutical composition of the present application include injection solutions, suppositories, powders for respiratory inhalation, aerosols for sprays, ointments, powders for application, oils, creams, and the like.
  • aqueous solutions In order to formulate the pharmaceutical composition of the present application for parenteral administration, sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, external preparations, etc. may be used, and the non-aqueous solvents and suspensions include propylene glycol, polyethylene Glycols, vegetable oils such as olive oil, injectable esters such as ethyl oleate, and the like may be used.
  • the pharmaceutical composition of the present application is formulated as an injection solution
  • the pharmaceutical composition of the present application is mixed in water together with a stabilizer or buffer to prepare a solution or suspension, which is used for unit administration in an ampoule or vial can be formulated.
  • a propellant or the like may be blended with additives so that the water-dispersed concentrate or wet powder is dispersed.
  • composition of the present application When the pharmaceutical composition of the present application is formulated into an ointment, cream, powder for application, oil, external skin preparation, etc., animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracanth, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite , silica, talc, zinc oxide, etc. may be formulated using a carrier.
  • the pharmaceutically effective amount and effective dose of the pharmaceutical composition of the present application may vary depending on the formulation method, administration method, administration time and/or route of administration of the pharmaceutical composition, and the type of response to be achieved by administration of the pharmaceutical composition. and degree, type of subject to be administered, age, weight, general health condition, symptom or severity of disease, sex, diet, excretion, drugs used simultaneously or simultaneously with the subject, and other components of the composition, etc. It can be varied according to factors and similar factors well known in the medical field, and those skilled in the art can easily determine and prescribe an effective dosage for the desired treatment.
  • the daily dose of the pharmaceutical composition of the present application is 0.01 to 1000 mg/kg, preferably 0.1 to 100 mg/kg, and may be administered once or several times a day.
  • Administration of the pharmaceutical composition of the present application may be administered once a day, or may be divided and administered several times.
  • the pharmaceutical composition of the present application may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. Considering all of the above factors, it can be administered in an amount that can obtain the maximum effect with the minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
  • the administration route and administration method of the pharmaceutical composition of the present application may be independent, and may follow any route and administration method without particular limitation as long as the pharmaceutical composition can reach the target site.
  • the pharmaceutical composition may be administered orally or parenterally.
  • intravenous administration intraperitoneal administration, intramuscular administration, transdermal administration, subcutaneous administration, etc.
  • a method of applying, spraying, or inhaling the composition to the diseased area It can also be used, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition of the present application may be additionally used in combination with various methods such as hormone therapy and drug therapy to prevent or treat a target disease.
  • a urate oxidase variant-albumin conjugate or a urate oxidase subunit variant-albumin conjugate may be provided.
  • a pharmaceutical composition for treating a target disease comprising a urate oxidase variant-albumin conjugate.
  • the target disease is tumor lysis syndrome (TLS), hyperuricemia, gout, intra-articular urate crystal deposition, acute gouty arthritis due to urate crystal deposition, urolithiasis, nephrolithiasis and gouty It may be any one or more selected from nephropathy.
  • TLS tumor lysis syndrome
  • hyperuricemia gout
  • gout intra-articular urate crystal deposition
  • acute gouty arthritis due to urate crystal deposition urolithiasis
  • nephrolithiasis gouty It may be any one or more selected from nephropathy.
  • Tumor lysis syndrome is caused by the rapid destruction of tumor cells after administration of anticancer drugs, resulting in the release of intracellular uric acid, potassium, and phosphorus into the bloodstream. Significantly increased uric acid excretion results in the precipitation of uric acid crystals in the urinary tubules, which can lead to urinary tubule obstruction and renal failure. As described above, patients with tumor lysis syndrome may rapidly deteriorate due to metabolic abnormalities. At this time, hyperuricemia is known as the most common target abnormality in tumor lysis syndrome.
  • Hyperuricemia is a disease in which the concentration of uric acid in the blood is increased. This occurs when the concentration of monosodium urate in serum exceeds the limited solubility limit. The uric acid saturation of plasma at 37°C is about 7 mg/dl. Therefore, when this concentration is exceeded, it becomes supersaturated physically and chemically. It is known that the serum uric acid concentration is relatively higher when it exceeds +2 standard deviation than the average serum uric acid concentration of normal subjects. In most epidemiologic studies, the upper limit is 7 mg/dl for men and 6 mg/dl for women. For this reason, the practical upper limit for hyperuricemia is defined as 7.0 mg/dl or higher.
  • the hyperuricemia and hyperuricemia-related metabolic disorders are diseases or diseases caused by excess uric acid remaining in the blood and increasing blood uric acid levels when uric acid is higher than normal and the ability of the kidneys to excrete uric acid is lowered say the disease
  • the hyperuricemia-related metabolic disorders include gout, uric acid crystals, intra-articular urate crystal deposition, acute gouty arthritis due to urate crystal deposition, monoarticular arthritis, pain attacks of inflammatory arthritis, urolithiasis, nephrolithiasis and gouty nephropathy. Long-term nephrolithiasis and gouty nephropathy are known to increase the risk of kidney damage and renal failure.
  • Gout is a medical condition usually characterized by recurrent attacks of acute inflammatory arthritis and commonly occurs in the metatarsophalangeal joint at the base of the big toe. Also, gout is caused by blood uric acid crystallized and deposited in joints, tendons and surrounding tissues, and may exist as gouty nodules, kidney stones or urate nephropathy.
  • a GLP1 variant-albumin conjugate can be provided.
  • a pharmaceutical composition for the treatment of a target disease comprising a GLP1 mutant-albumin conjugate.
  • the target disease may be any one selected from diabetes, persistent diabetes, obesity, type 2 diabetes, prediabetes, liver disease, metabolic disease, and cardiovascular disease, but is not limited thereto.
  • an hGH variant-albumin conjugate may be provided.
  • a pharmaceutical composition for the treatment of a target disease comprising the hGH variant-albumin conjugate.
  • the target disease may be, but is not limited to, Growth Hormone Deficiency (GHD).
  • GFD Growth Hormone Deficiency
  • an sfGFP variant-albumin conjugate may be provided.
  • a diagnostic composition comprising the sfGFP variant-albumin conjugate.
  • the composition for diagnosis may be a composition for diagnosis of a target disease. In one embodiment, the composition for diagnosis may be a composition for diagnosis of albumin-requiring cancer cells.
  • TCO-Cy3 was purchased from AAT Bioquest (Sunnyvale, CA, USA).
  • TCO-PEG4-maleidime TCO-PEG4-MAL
  • TCO-amine amine-axially substituted TCO
  • PFP Pentafluorophenyl ester
  • Disposable PD-10 desalting column and Superdex 200 10/300 GL increase column were purchased from Cytiva (Uppsala, Sweden).
  • Vivaspin 6 centrifugal concentrators with a molecular weight cut-off (MWCO) 10 kDa and 100 kDa were purchased from Sartorius (Gottingen, Germany).
  • HSA and all other chemicals were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
  • a linker (1) (TCO-PEG4-APN, compound a) containing an APN group was prepared.
  • TCO-PEG4-APN was prepared by reacting TCO-amine with PFP-PEG4-APN (Pentafluorophenyl ester-PEG 4 -APN) in DMSO at a molar ratio of 1:1 at room temperature for 30 minutes.
  • TCO-APN Linker (2) (TCO-APN, compound b) containing an APN group was prepared.
  • TCO-NHS ester (A) (33.8 mg, 0.127 mmol) (FutureChem, Cat No. FC-6172-A) was prepared as APN-NH 2 .
  • Reaction with HCl (36.7mg, 0.140 mmol) (Conju-Probe, Cat No. CP-8003) and DIPEA (0.07ml, 0.253mmol) in DMF at room temperature for 4 hours gave TCO-APN (compound b) .
  • the gene encoding Arthrobacter globiformis -derived uric acid oxidase (AgUox) and its mutants was synthesized by requesting Macrogen (Seoul, South Korea).
  • AgUox-WT wild-type AgUox
  • AgUox-frTet AgUox variant
  • frTet an unnatural amino acid
  • the synthesized gene was used as a template and the primer pBAD-AgUox_F (5'-GCCGCCATGGTGTCTGCTGTGAAGG- 3', SEQ ID NO: 93) and pBAD-AgUox_R (5'-GCCGAGATCTTTAATGGTGATGGTG-3', SEQ ID NO: 94).
  • the amplified gene was digested with two restriction enzymes (NcoI and BglIII), and the gene was inserted into the NcoI and BgIII sites of the pBAD vector to synthesize pBAD_AgUox.
  • NcoI and BglIII restriction enzymes
  • the gene was inserted into the NcoI and BgIII sites of the pBAD vector to synthesize pBAD_AgUox.
  • UAG amber codon
  • primers AgUox-196Amb_F 5'-GTCGAAGTCCACCTATACGGTGTTGTAACGCCAACGG-3' SEQ ID NO: 95
  • AgUox pBAD-AgUox_196amb was prepared using -196Amb_R (5'-CCGTTGGCGTTACAACACCGTATAGGTGGACTTCGAC-3', SEQ ID NO: 96).
  • AgUox-frTet was expressed using C321 ⁇ A.exp, pDule_C11, and pBAD_AgUox-196amb in the following manner.
  • E. coli cells containing MjtRNA Tyr /MjTyrRS optimized for frTet were prepared.
  • coli cells cultured in Luria Broth (LB) medium containing ampicillin (100 ⁇ g/mL) and tetracycline (10 ⁇ g/mL) were inoculated into 2x YT medium under the same conditions while shaking overnight at 37°C.
  • LB Luria Broth
  • frTet and L-(+)-arabinose were added to the medium to obtain final concentrations of 1 mM and 0.4% (w/ v) was made.
  • the cells were centrifuged at 5000 rpm at 4° C. for 10 minutes, and AgUox-frTet was obtained.
  • the AgUox-frTet was prepared by stationary metal affinity chromatography at 4° C. using a polypropylene column packed with nickel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) agarose resin according to the manufacturer's protocol (Qiagen). It was purified through immobilized-metal affinity chromatography. The purified AgUox-frTet was desalted with PBS (pH 7.4) using a PD-10 column. The expression and purification process of AgUox-WT followed a method similar to that of AgUox-frTet, but tetracycline and frTet were not added to the culture medium during the expression step.
  • SDS-PAGE (run at 120V) using tris-glycine gels (5% acrylamide stacking and 12% acrylamide resolving gels) (running buffer: 25 mM Tris, 192 mM glycine, and 0.1 % SDS at pH8.3) was performed. At this time, a molecular weight standard marker (Bio-Rad Laboratories Inc., Berkeley, CA, USA) was used.
  • Figure 2 (a) shows the Coomassie Brilliant Blue-stained protein (CBB-stained protein) of AgUox and its variants.
  • Mw is molecular weight
  • BI is before induction
  • AI stands for after induction.
  • Figure 2 (b) shows CBB stained protein gels of AgUox and variants thereof.
  • FIG. 3 shows a fragment of trypsin-digested AgUox-WT.
  • X means frTet.
  • the peak of the fragment AVIETPEIDEIKMSLPNK SEQ ID NO: 99 (residues 232-250) was used as a control.
  • TCO-Cy3 represents the analysis results for samples cultured without TCO-Cy3.
  • TCO-Cy3 (+) represents the analysis result for samples incubated with TCO-Cy3.
  • HSA was purified via anion exchange chromatography using a HiTrap Q HP anion exchange column. After desalting the purified HSA with PBS (pH 7.0), it was reacted with TCO-PEG4-MAL at a molar ratio of 1:4 in PBS (pH 7.0) at room temperature. After 2 hours, the reaction mixture was desalted with PBS (pH 7.4) using a PD-10 column, and the unreacted TCO-PEG4-MAL linker was removed to obtain a MAL-HSA conjugate.
  • the molecular weight and purity of the eluted fractions were analyzed using SDS-PAGE, and the fractions corresponding to AgUox-frTet conjugated to four MAL-HSA molecules (AgUox-MAL-HSA) were selected and concentrated for further analysis.
  • TCO-amine was mixed with Pentafluorophenyl ester-PEG 4 -APN (PFP-PEG4-APN). The reaction was carried out at room temperature for 30 minutes in DMSO at a molar ratio of 1:1.
  • Purified HSA was buffer exchanged with 50 mM sodium borate buffer (pH 9.0). In 50 mM sodium borate buffer (pH 9.0), purified HSA was reacted with TCO-PEG4-APN in a molar ratio of 1:4 at room temperature for 2 hours.
  • reaction mixture was desalted with PBS (pH 7.4) using a PD-10 column.
  • Conjugation of AgUox-frTet conjugated to four HSA molecules via APN-containing linkers (AgUox-APN-HSA) and purification were performed in a similar manner to AgUox-MAL-HSA.
  • the MAL lane is the result of the reaction of MAL-HSA and AgUox-frTet.
  • the APN lane is the result of the reaction between APN-HSA and AgUox-frTet.
  • AgUox-MAL-HSA represents an AgUox subunit variant-albumin conjugate prepared via a linker containing MAL.
  • AgUox-APN-HSA represents an AgUox subunit variant-albumin conjugate prepared via a linker containing APN.
  • FIG. 5 shows size exclusion chromatography and protein gel results for AgUox-frTet and MAL-HSA or APN-HSA conjugation mixtures. More specifically, the upper figure of FIG. 5 is a result of size exclusion chromatography and protein gel for a mixture containing AgUox-MAL-HSA and MAL-HSA. The figure below in FIG. 5 shows the results of size exclusion chromatography and protein gel for mixtures containing AgUox-APN-HSA and APN-HSA.
  • the AgUox-HSA conjugate was incubated at 37°C for 4 days in PBS buffer (pH7.4) containing 5 ⁇ M glutathione and 20 ⁇ M HSA, mimicking normal blood conditions for 5 days. Samples were then analyzed by SDS-PAGE.
  • the enzymatic activity of the AgUox-HSA conjugates was similar to that of AgUox-frTet and was about 94% higher than that of AgUox-WT (see FIG. 6). These results indicate that site-specific HSA conjugation via MAL or APN linkers does not adversely affect enzyme activity. Enzyme activity assays were performed in quadruplicate and error bars represent standard deviations.

Abstract

본 출원은 APN 그룹을 포함하는 링커를 이용하여 제조된 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트를 제공한다. 나아가, 본 출원은 APN 그룹을 포함하는 링커를 이용하여 제조된, 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트 제조에 사용되는, 알부민-링커 컨쥬게이트를 제공한다.

Description

APN 그룹을 포함하는 링커 및 이를 이용하여 제조된 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트
본 출원의 일 실시양태는 컨쥬게이트의 제조에 사용되는 APN 그룹을 포함하는 링커에 관한 것이다.
본 출원의 일 실시양태는 APN 그룹을 포함하는 링커를 이용하여 제조된 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트에 관한 것이다.
지난 30년 동안 치료용 단백질은 다양한 질병의 치료에서 임상적인 성공을 거두어 왔으며, 이는 계속해서 제약 분야의 중요한 성장 동기로 작용하고 있다. 하지만, 치료용 단백질은 체내 단백질 분해 효소에 의해 쉽게 파괴되거나 혈중 반감기가 극히 짧아 단 회 투여가 아닌 반복 투여를 하게 되어 면역 원성 등의 부작용이 발생하기 쉽다. 따라서, 치료용 단백질의 개발에서 중요한 고려사항 중 하나는 반복 투여를 피하기 위하여 약효의 지속시간을 연장시키는 것이다. 치료용 단백질의 약효 지속성을 높이기 위해 인간 혈청 알부민 (human serum albumin)을 이용하는 것은 효율적인 방법 중 하나이다. 즉, 치료용 단백질-알부민 복합체를 생산하여 치료용 단백질의 생체 내 반감기를 높일 수 있고, 이에 따라, 치료용 단백질의 약효 지속성이 증가된다.
한편, 티올기는 생체 분자 등의 화학적 변형 등에 주로 사용된다. 티올기를 포함하는 시스테인 잔기는 상대적으로 다른 반응성을 갖는 아미노산 (예를 들어, 라이신)보다 단백질 또는 펩티드에 적게 존재하기 때문에, 단백질 또는 펩티드의 위치 특이적 변형(site-specific modification) 또는 위치 특이적 컨쥬게이션(site-specific conjugation)에 주로 사용된다. 단백질 또는 펩티드에 포함된 티올기를 이용하여 컨쥬게이트를 제조하거나 상기 단백질 또는 펩티드의 화학적 변형을 위해서, 티올-말레이미드 (thiol-maleimide) 반응이 주로 사용된다. 상기 티올-말레이미드 반응은 pH 6.5 내지 7.5에서 티오에터(thioether) 결합을 형성하며, 목적하는 컨쥬게이트를 높은 수율로 제조 가능하게 한다. 선택성, 효율성, 및 접근성 등과 같은 장점으로 인해, 티올-말레이미드 결합은, 지난 몇십년 동안, 화학약품에서부터 치료제에 이르기까지, 다양한 재료 및/또는 약물 개발에 사용되어 왔다.
전술한 바와 같이, 티올-말레이미드 반응은 티오에터 그룹을 형성한다. 그러나, 상기 티올-말레이미드 반응에 의해 형성된 티올에터 그룹은 수성 매질 및 생체내 조건에서 불안정하며, 레트로-컨쥬게이트 첨가(retro-conjugate trapping) 및 글루타티온(glutathione)과 같은 내인성 티올에 의해 후속 트래핑(subsequence trapping)을 겪는 것이 밝혀졌다. (Baldwin, Aaron D., and Kristi L. Kiick. "Tunable degradation of maleimide-thiol adducts in reducing environments." Bioconjugate chemistry 22.10 (2011): 1946-1953.)
전술한 바와 같이, 티올-말레이미드 반응은 수성 매질 및 생체내 조건에서 다소 불안정함을 보인다. 따라서, 티올-말레이미드 결합을 통해 알부민 컨쥬게이트를 제조하는 경우 목적하는 반감기가 달성되지 못하는 문제가 있다.
본 출원의 일 실시양태로, 화학식 4의 구조를 갖는 화합물이 제공된다:
[화학식 4]
H2-A2-J2-P1,
이때, H2는 제2 클릭화학작용기이고, 이때 상기 제2 클릭화학작용기는 말단 알킨 (terminal alkyne) 그룹, 아자이드 (azide) 그룹, 스트레인된 알킨(strained alkyne) 그룹, 다이엔 (diene) 그룹, 친다이엔체 (dienophile) 그룹, 트랜스 시클로옥틴(trans-cyclooctene) 그룹, 알켄 (alkene) 그룹, 티올 (thiol) 그룹, 테트라진 (tetrazine) 그룹, 트리아진(triazine) 그룹, DBCO(dibenzocyclooctyne) 그룹 및 비시클로노닌(bicyclononyne) 그룹 중에서 선택된 어느 하나의 그룹을 포함하고,
A2는 제2 앵커 유닛이고, 이때 상기 제2 앵커 유닛은 하나 이상의 헤테로 원자를 포함하는 치환된 탄화수소 사슬이고, 이때 상기 헤테로 원자는, 각각 독립적으로, N, O, 및 S 중에서 선택되고, 이때 상기 치환은 하나 이상의 비수소 치환기로 치환된 것으로, 상기 비수소 치환기는, 각각 독립적으로, 할로겐, C1-3알킬, -NH2, =O, 및 =S 로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며,
J2는 제2 접합 유닛이고, 이때 상기 제2 접합 유닛은 APN 그룹과 티올기의 반응에 의해 형성된 구조를 갖고,
P1은 알부민 유닛이고, 이때 상기 알부민 유닛은 알부민으로부터 유래됨.
특정한 실시양태에서, 상기 제2 클릭화학작용기는 트랜스 시클로옥틴 그룹, DBCO 그룹, 및 비시클로노닌 그룹 중 선택된 어느 하나의 그룹을 포함할 수 있다.
특정한 실시양태에서, 상기 제2 클릭화학작용기는 트랜스 시클로옥틴 그룹을 포함할 수 있다.
특정한 실시양태에서, 상기 제2 접합 유닛은 하기의 구조를 가질 수 있다:
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000001
,
이때, 상기 구조에서, S 원자는 상기 알부민으로부터 유래됨.
특정한 실시양태에서, 이때, 상기 제2 접합 유닛은 하기의 구조를 가질 수 있다.
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000002
,
이때 상기 구조에서, S 원자는 상기 알부민으로부터 유래됨.
특정한 실시양태에서, 이때, 상기 S 원자는 상기 알부민의 시스테인 잔기로부터 유래된 것일 수 있다.
특정한 실시양태에서, 이때, 상기 S 원자는 상기 알부민의 34번 시스테인 잔기의 티올기로부터 유래된 것일 수 있다.
특정한 실시양태에서,
상기 제2 앵커 유닛은 치환 또는 비치환된 C1-50알킬렌, 치환 또는 비치환된 C1-50헤테로알킬렌, -치환 또는 비치환된 C1-20알킬렌-[EG]n-, -치환 또는 비치환된 C1-20헤테로알킬렌-[EG]n-, -치환 또는 비치환된 C1-20알킬렌-[EG]n-치환 또는 비치환된 C1-20알킬렌-, -치환 또는 비치환된 C1-20알킬렌-[EG]n-치환 또는 비치환된 C1-20헤테로알킬렌-, 및 -치환 또는 비치환된 C1-20헤테로알킬렌-[EG]n-치환 또는 비치환된 C1-20헤테로알킬렌- 중에서 선택되는 어느 하나이고,
이때 EG는 에틸렌글리콜 단위체이고, 상기 에틸렌글리콜 단위체는 -OCH2CH2- 또는 -CH2OCH2-의 구조를 가지며, 이때 n은 1 이상 12 이하의 정수이고,
이때 상기 헤테로알킬렌은 하나 이상의 헤테로원자를 포함하고, 이때 상기 헤테로원자는, 각각 독립적으로, N, O, 및 S 중에 선택되며,
이때 상기 치환은 하나 이상의 비수소 치환기로 치환된 것으로, 이때 상기 비수소 치환기는 각각 독립적으로 할로겐, C1-3알킬, -NH2, =O, 및 =S 로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
특정한 실시양태에서, 상기 제2 앵커 유닛은 -A21-A22-A23- 이고, 이때:
A21은 결합(bond), -CH2CH2OC(=O)NH-, -CH2OC(=O)NH-, -OC(=O)NH-, -C(=O)NH-, -NH- 또는 -C(=O)- 이고,
A22는 결합(bond), 치환 또는 비치환된 C1-12 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C1-12 헤테로알킬렌, -치환 또는 비치환된 C1-12알킬렌-[EG]n-, -치환 또는 비치환된 C1-12-헤테로알킬렌-[EG]n-, -치환 또는 비치환된 C1-12알킬렌-[EG]n-치환 또는 비치환된 C1-12알킬렌-, -치환 또는 비치환된 C1-12헤테로알킬렌-[EG]n-치환 또는 비치환된 C1-12알킬렌-, 및 -치환 또는 비치환된 C1-12헤테로알킬렌-[EG]n-치환 또는 비치환된 C1-12헤테로알킬렌- 중에서 선택되는 어느 하나이고,
이때 EG는 에틸렌글리콜 단위체이고, 상기 에틸렌글리콜 단위체는 -OCH2CH2- 또는 -CH2OCH2-의 구조를 가지며, 이때 n은 2 이상 6 이하의 정수이고,
이때 상기 헤테로알킬렌은 각각 독립적으로 N, O, 및 S 중에서 선택되고,
이때 상기 치환은 하나 이상의 비수소 치환기로 치환된 것으로, 상기 비수소 치환기는 각각 독립적으로 할로겐, C1-3알킬, -NH2, =O, 및 =S 로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고,
A23은 결합(bond), -CH2CH2OC(=O)NH-, -CH2OC(=O)NH-, -OC(=O)NH-, -C(=O)NH-, -NH- 또는 -C(=O)- 이고,
이때, A21, A22, 및 A23 모두가 동시에 결합(bond)인 경우는 존재하지 않을 수 있다.
특정한 실시양태에서, 상기 제2 앵커 유닛은 하기의 구조 중 어느 하나의 구조를 가질 수 있다:
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000003
이때 3'은 상기 제2 클릭화학작용기와의 부착부 (attachment site)이고, 4'는 상기 제2 접합 유닛과의 부착부(attachment site)임.
특정한 실시양태에서, 상기 알부민은 서열번호 01의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
특정한 실시양태에서, 화학식 4-1의 구조를 갖는 화합물이 제공될 수 있다:
[화학식 4-1]
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000004
,
이때, S는 상기 알부민의 34번 시스테인 잔기의 티올기로부터 유래되고,
이때, n은 2 이상 6 이하의 정수임.
특정한 실시양태에서, 화학식 4-4의 구조를 갖는 화합물이 제공될 수 있다:
[화학식 4-4]
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000005
이때, S는 상기 알부민의 34번 시스테인 잔기의 티올기로부터 유래됨.
본 출원의 일 실시양태로, 하기의 화학식 1의 구조를 갖는 화합물이 제공된다:
[화학식 1]
FPV-[J1-A2-J2-P1]a,
이때:
FPV는 기능성 폴리펩티드 변이체 유닛이고, 상기 기능성 폴리펩티드 변이체 유닛은 기능성 폴리펩티드 변이체로부터 유래되고, 상기 기능성 폴리펩티드 변이체는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하며,
이때 상기 비천연아미노산은 제1 클릭화학작용기를 포함하고, 이때 상기 제1 클릭화학작용기는 제2 클릭화학작용기와 클릭화학반응을 할 수 있으며, 이때 상기 제1 클릭화학작용기는 말단 알킨 (terminal alkyne) 그룹, 아자이드 (azide) 그룹, 스트레인된 알킨(strained alkyne) 그룹, 다이엔 (diene) 그룹, 친다이엔체 (dienophile) 그룹, 트랜스 시클로옥틴(trans-cyclooctene) 그룹, 알켄 (alkene) 그룹, 티올 (thiol) 그룹, 테트라진 (tetrazine) 그룹, 트리아진(triazine) 그룹, DBCO(dibenzocyclooctyne) 및 비시클로노닌(bicyclononyne) 그룹 중에서 선택된 어느 하나의 그룹을 포함하고,
J1은 제1 접합 유닛이고, 상기 제1 접합 유닛은 상기 제1 클릭화학작용기와 상기 제2 클릭화학작용기의 클릭화학반응에 의해 형성된 구조를 갖고,
A2는 제2 앵커 모이어티이고, 상기 제2 앵커 유닛은 하나 이상의 헤테로 원자를 포함하는 치환된 탄화수소 사슬이고,
이때 상기 헤테로 원자는, 각각 독립적으로, N, O, 및 S 중에서 선택되고, 이때 상기 치환은 하나 이상의 비수소 치환기로 치환된 것으로, 상기 비수소 치환기는, 각각 독립적으로, 할로겐, C1-3알킬, -NH2, =O, 및 =S 로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며,
J2는 제2 접합 유닛이고, 이때 상기 제2 접합 유닛은 APN 그룹과 티올기의 반응에 의해 형성된 구조를 갖고,
P1은 알부민 유닛이고, 상기 알부민 유닛은 알부민으로부터 유래되며,
a는 1 이상 8 이하의 정수임.
특정한 실시양태에서, 상기 기능성 폴리펩티드 변이체는 요산산화효소 변이체, 요산산화효소 서브유닛 변이체, GLP1 변이체, hGH 변이체, 및 GFP 변이체 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.
특정한 실시양태에서, 상기 기능성 폴리펩티드 변이체는 하기로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다:
서열번호 13의 아미노산 서열의 137번째 글리신, 22번째 글루탐산, 92번째 아스파라긴, 23번째 리신, 295번째 세린, 113번째 글리신, 273번째 리신, 171번째 리신, 240번째 알라닌, 89번째 글루탐산, 266번째 리신, 24번째 트레오닌, 48번째 리신, 192번째 세린, 202번째 프롤린, 110번째 아스파르트산, 243번째 글루타민, 195번째 글루타민, 138번째 리신, 115번째 프롤린, 199번째 세린, 272번째 글리신, 리신4, 112번째 아스파르트산, 267번째 글리신, 114번째 리신, 70번째 글루타민, 174번째 트립토판, 223번째 아스파라긴, 41번째 글루탐산, 261번째 아스파르트산, 25번째 글리신, 52번째 세린, 241번째 아르기닌, 213번째 글루탐산, 274번째 아스파라긴, 221번째 글루탐산, 206번째 알라닌, 236번째 글루탐산, 164번째 아르기닌, 269번째 글루타민, 136번째 글루탐산, 259번째 글루탐산, 246번째 글루탐산, 49번째 알라닌, 148번째 글리신, 19번째 히스티딘, 296번째 세린, 및 47번째 트레오닌 중 선택된 하나 이상의 아미노산이 비천연 아미노산으로 치환된 서열을 갖는 Aspergillus Flavus 유래 요산산화효소 서브유닛 변이체;
서열번호 14의 아미노산 서열의 301번째 트레오닌, 26번째 아스파라긴, 303번째 류신, 194번째 리신, 95번째 세린, 140번째 세린, 116번째 글리신, 302번째 리신, 167번째 리신, 115번째 아스파르트산, 299번째 글루탐산, 24번째 프롤린, 271번째 트립토판, 277번째 아스파르트산, 169번째 아스파르트산, 118번째 프롤린, 177번째 트레오닌, 174번째 글루타민, 208번째 리신, 275번째 글루탐산, 266번째 류신, 273번째 글리신, 200번째 티로신, 92번째 글루탐산, 247번째 글루탐산, 228번째 류신, 300번째 리신, 204번째 리신, 51번째 글루탐산, 207번째 아스파르트산, 117번째 리신, 250번째 시스테인, 175번째 프롤린, 270번째 리신, 268번째 아스파르트산, 44번째 글리신, 193번째 아스파라긴, 164번째 글리신, 73번째 트레오닌, 29번째 리신, 230번째 아스파라긴, 25번째 글루타민, 216번째 아스파라긴, 55번째 세린, 28번째 리신, 6번째 세린, 27번째 프롤린, 298번째 리신, 113번째 알라닌, 213번째 아스파라긴, 220번째 글루탐산, 141번째 글리신, 163번째 티로신, 253번째 티로신, 178번째 아스파르트산, 93번째 리신, 103번째 리신, 144번째 리신, 139번째 아르기닌, 138번째 리신, 세린7, 151번째 아스파르트산, 297번째 아르기닌, 272번째 리신, 278번째 아스파라긴, 및 265번째 페닐알라닌 중 선택된 하나 이상의 아미노산이 비천연 아미노산으로 치환된 서열을 갖는 Candida Utilis 유래 요산산화효소 서브유닛 변이체; 및
서열번호 15의 아미노산 서열의 80번째 아스파르트산, 82번째 페닐알라닌, 100번째 페닐알라닌, 101번째 아스파르트산, 114번째 페닐알라닌, 119번째 아스파라긴, 120번째 아스파르트산, 142번째 세린, 143번째 글루탐산, 175번째 글리신, 195번째 발린, 196번째 글루탐산, 218번째 히스티딘, 238번째 프롤린 중 선택된 하나 이상의 아미노산이 비천연 아미노산으로 치환된 서열을 갖는 Arthrobacter globiformis 유래 요산산화효소 서브유닛 변이체
특정한 실시양태에서, 상기 기능성 폴리펩티드 변이체는 서열번호 100 내지 113의 서열 중 선택된 어느 하나의 서열을 갖는, Arthrobacter globiformis 유래 요산산화효소 서브유닛 변이체일 수 있다.
특정한 실시양태에서, 상기 제1 클릭화학작용기는 테트라진 그룹 또는 아자이드 그룹을 포함할 수 있다.
특정한 실시양태에서, 상기 비천연 아미노산은 frTet일 수 있다.
특정한 실시양태에서, 상기 제2 클릭화학작용기는 트랜스 시클로옥틴(TCO) 그룹, DBCO 그룹, 및 비시클로노닌 그룹 중 선택된 어느 하나의 그룹을 포함할 수 있다.
특정한 실시양태에서, 상기 제2 클릭화학작용기는 트랜스 시클로옥틴(TCO) 그룹을 포함할 수 있다.
특정한 실시양태에서, 상기 제2 접합 유닛은 하기의 구조를 가질 수 있다:
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000006
,
이때, 상기 구조에서, S 원자는 상기 알부민으로부터 유래됨.
특정한 실시양태에서, 이때, 상기 제2 접합 유닛은 하기의 구조를 가질 수 있다:
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000007
,
이때 상기 구조에서, S 원자는 상기 알부민으로부터 유래됨.
특정한 실시양태에서, 이때, 상기 S 원자는 상기 알부민의 시스테인 잔기로부터 유래된 것일 수 있다.
특정한 실시양태에서, 이때, 상기 S 원자는 상기 알부민의 34번 시스테인 잔기의 티올기로부터 유래된 것일 수 있다.
특정한 실시양태에서, 상기 제2 앵커 유닛은 치환 또는 비치환된 C1-50알킬렌, 치환 또는 비치환된 C1-50헤테로알킬렌, -치환 또는 비치환된 C1-20알킬렌-[EG]n-, -치환 또는 비치환된 C1-20헤테로알킬렌-[EG]n-, -치환 또는 비치환된 C1-20알킬렌-[EG]n-치환 또는 비치환된 C1-20알킬렌-, -치환 또는 비치환된 C1-20알킬렌-[EG]n-치환 또는 비치환된 C1-20헤테로알킬렌-, 및 -치환 또는 비치환된 C1-20헤테로알킬렌-[EG]n-치환 또는 비치환된 C1-20헤테로알킬렌- 중에서 선택되는 어느 하나이고,
이때 EG는 에틸렌글리콜 단위체이고, 상기 에틸렌글리콜 단위체는 -OCH2CH2- 또는 -CH2OCH2-의 구조를 가지며, 이때 n은 1 이상 12 이하의 정수이고,
이때 상기 헤테로알킬렌은 하나 이상의 헤테로원자를 포함하고, 이때 상기 헤테로원자는, 각각 독립적으로, N, O, 및 S 중에 선택되며,
이때 상기 치환은 하나 이상의 비수소 치환기로 치환된 것으로, 이때 상기 비수소 치환기는 각각 독립적으로 할로겐, C1-3알킬, -NH2, =O, 및 =S 로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
특정한 실시양태에서, 상기 제2 앵커 유닛은 -A21-A22-A23- 이고,
이때:
A21은 결합(bond), -CH2CH2OC(=O)NH-, -CH2OC(=O)NH-, -OC(=O)NH-, -C(=O)NH-, -NH- 또는 -C(=O)- 이고,
A22는 결합(bond), 치환 또는 비치환된 C1-12 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C1-12 헤테로알킬렌, -치환 또는 비치환된 C1-12알킬렌-[EG]n-, -치환 또는 비치환된 C1-12-헤테로알킬렌-[EG]n-, -치환 또는 비치환된 C1-12알킬렌-[EG]n-치환 또는 비치환된 C1-12알킬렌-, -치환 또는 비치환된 C1-12헤테로알킬렌-[EG]n-치환 또는 비치환된 C1-12알킬렌-, 및 -치환 또는 비치환된 C1-12헤테로알킬렌-[EG]n-치환 또는 비치환된 C1-12헤테로알킬렌- 중에서 선택되는 어느 하나이고,
이때 EG는 에틸렌글리콜 단위체이고, 상기 에틸렌글리콜 단위체는 -OCH2CH2- 또는 -CH2OCH2-의 구조를 가지며, 이때 n은 2 이상 6 이하의 정수이고,
이때 상기 헤테로알킬렌은 각각 독립적으로 N, O, 및 S 중에서 선택되고,
이때 상기 치환은 하나 이상의 비수소 치환기로 치환된 것으로, 상기 비수소 치환기는 각각 독립적으로 할로겐, C1-3알킬, -NH2, =O, 및 =S 로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고,
A23은 결합(bond), -CH2CH2OC(=O)NH-, -CH2OC(=O)NH-, -OC(=O)NH-, -C(=O)NH-, -NH- 또는 -C(=O)- 이고,
이때, A21, A22, 및 A23 모두가 동시에 결합(bond)인 경우는 존재하지 않을 수 있다.
특정한 실시양태에서, 상기 제2 앵커 유닛은 하기의 구조 중 어느 하나의 구조를 가질 수 있다:
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000008
,
이때 3'은 상기 제1 접합 유닛과의 부착부 (attachment site)이고, 4'는 상기 제2 접합 유닛과의 부착부(attachment site)임.
특정한 실시양태에서, 상기 알부민은 서열번호 01의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
특정한 실시양태에서, a는 1 이상 4 이하의 정수일 수 있다.
본 출원의 일 실시양태에 따른 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트의 생산 방법은 기능성 폴리펩티드 변이체의 반감기를 향상시킬 수 있다.
본 출원의 일 실시양태에 따른 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트는 기능성 폴리펩티드 변이체의 반감기를 향상시킬 수 있다.
본 출원의 일 실시양태에 따른 APN 그룹을 포함하는 링커 또는 알부민-링커 컨쥬게이트를 이용하면 반감기가 개선된 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트를 제조할 수 있다.
도 1은 요산산화효소 변이체와 알부민-링커 컨쥬게이트의 모식도를 나타낸다. MAL-HSA는 말레이미드 그룹과 티올기의 반응에 의해 형성된 알부민-링커 컨쥬게이트를 나타내고, APN-HSA는 APN 그룹과 티올기의 반응에 의해 형성된 알부민-링커 컨쥬게이트를 나타낸다.
도 2는 Uox (AgUox-WT, WT) 및 Uox 변이체 (AgUox-frTet, frTet)의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다. 도 2 (a)는 AgUox 및 이의 변이체의 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 단백질(CBB-stained protein)을 나타낸다. 도 2 (b)는 AgUox 및 이의 변이체의 CBB 염색된 단백질 겔을 나타낸다. 도 2 (c)는 AgUox-WT 및 AgUox-frTet에 대한 형광 다이 라벨링 결과를 나타낸다.
도 3은 AgUox-WT 및 AgUox-frTet 에 대한 MS 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 AgUox-HSA 컨쥬게이트를 제조한 결과를 나타낸다. 구체적으로 도 4는 AgUox-frTet과 MAL-HSA 또는 APN-HSA (알부민-링커 컨쥬게이트)의 반응물에 대한 단백질 겔을 개시한다.
도 5는 AgUox-HSA 컨쥬게이트를 제조한 결과를 나타낸다. 구체적으로 도 5는 AgUox-frTet 및 MAL-HSA 또는 APN-HSA 컨쥬게이션 혼합물에 대한 크기 배제 크로마토그래피 및 단백질 겔 결과를 개시한다.
도 6은 AgUox-HSA 컨쥬게이트의 in vitro 효소 활성 측정 결과를 나타낸다.
도 7은 AgUox-HSA 컨쥬게이트의 in vitro 안정성 테스트 결과를 나타낸다. 구체적으로 도 7은 혈액 모사환경에서 일정 기간 배양된 AgUox-HSA 컨쥬게이트에 대한 단백질 겔 결과를 나타낸다.
도 8 및 도 9는 AgUox-HSA 컨쥬게이트의 in vitro 안정성 테스트 결과를 나타낸다. 구체적으로 도 8 및 도 9는 혈액 모사환경에서 일정 기간 배양된 AgUox-HSA 컨쥬게이트에 대한 mass spectra 결과를 나타낸다.
도 10은 AgUox-HSA 컨쥬게이트의 in vivo 반감기 확인 결과를 나타낸다.
용어의 정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 및 기타 다른 참고문헌은 전체가 참고로 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약"은 어떤 수량에 거의 가까운 정도를 의미하며, 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리펩티드"는 복수의 아미노산이 연속적으로 연결되어 형성된 화합물을 의미하는 것으로 사용된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리펩티드"는 펩티드 및 단백질을 모두 포함하는 의미로 사용된다. 폴리펩티드는, 예를 들어, 3개 이상의 아미노산 잔기를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 다른 예로, 폴리펩티드는 15개 이상의 아미노산 잔기를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 다른 예로, 50개 이상의 아미노산 잔기를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 다른 예로, 폴리펩티드는 200개 이상의 아미노산 잔기를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
"할로겐" 또는 "할로"는 주기율표에서 할로겐 족 원소에 포함된 플루오르, 염소, 브롬 및 요오드를 포함하는 군을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "헤테로"는 적어도 하나의 헤테로원자를 포함하는 화합물 또는 그룹을 지칭한다. 용어 "헤테로원자"는 탄소나 수소가 아닌 원자로서, 예를 들어 B, Si, N, P, O, S, F, Cl, Br, I 및 Se 등을 포함한다. 바람직하게는, N, O, 및 S와 같은 다가 원소나 F, Cl, Br, 및 I와 같은 일가 원소 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치환된"은 원자의 원자가(valence)가 정상이고 치환된 화합물이 안정적인, 원자상의 하나 이상의 수소 원자가 치환기로 치환됨을 의미한다. 이때 치환기는 각각 독립적으로 선택된다. 치환기는 중수소 및 수소 변이체(variants)를 포함할 수 있다. 치환기가 산소(즉, =O)인 경우, 이는 두개의 수소 원자가 치환되었음을 의미한다. 하나의 치환기가 할로겐(예를 들어, Cl, F, Br, 및 I 등)인 경우, 이는 하나의 수소원자가 할로겐으로 치환되었음을 의미한다. 치환기가 하나의 그룹에 두개 이상 존재할 경우, 상기 그룹에 존재하는 치환기는 같거나 다를 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 치환기의 유형 및 수는 화학적으로 달성 가능한 한, 임의적일 수 있다. 예시적으로, 치환기는 할로겐, C1-6알킬, C1-6헤테로알킬, -NH2, =O, =S, -OH, 및 -SH 중에서 선택될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 치환된 C10-20 알킬렌은 주사슬에 연결된 하나 이상의 수소원자가 치환기로 치환된 것을 의미할 수 있으며, 이때 각각의 치환기는 독립적으로 선택될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "알킬" 또는 "알칸"은 사슬 모양, 또는 가지 모양의 탄화수소로서 완전히 포화된 그룹을 의미하는 것으로 사용된다. 사슬 모양 및 가지 모양 알킬기는 예를 들어, 메틸, 에틸, n-프로필, iso-프로필, n-부틸, sec-부틸, tert-부틸, iso-부틸, 펜틸(pentyl), 헥실(hexyl), 헵틸(heptyl), 옥틸(octyl), 노닐(nonyl), 및 데실(decyl) 등일 수 있다. 알킬기는 고리형 구조를 포함할 수 있다. "Cx-y"라는 용어는, 예를 들어, 용어 알킬과 함께 사용되는 경우 사슬 또는 고리에 x 내지 y 개의 탄소를 포함하는 잔기를 포함하도록 의도된다. 예를 들어, "Cx-y알킬"이라는 용어는 치환된 또는 비치환된, 사슬 모양 알킬기, 가지 모양 알킬 기, 또는 고리형 구조를 포함하는 알킬기로써 사슬에 x 내지 y 개의 탄소를 포함하는 것을 포함하고, 나아가 디플루오로메틸 및 2,2,2-트리플루오로에틸, 등과 같은 할로알킬 기를 포함하는 것을 의미할 수 있다. C0 알킬은 수소를 의미한다. C1-4 알킬의 예에는 메틸, 에틸, n-프로필, iso-프로필, n-부틸, sec-부틸, tert-부틸, iso-부틸, 디플루오로메틸, 및 2,2,2-트리플루오로에틸 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "헤테로알킬"은 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 알킬을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "알케닐" 또는 "알켄"은 사슬 모양 또는 가지 모양의 비방향족 탄화수소로서 하나 이상의 이중 결합을 포함하는 그룹을 의미하는 것으로 사용된다. 예를 들어, 사슬 모양 또는 가지 모양 알케닐 기는, 2 내지 약 50 개, 2 내지 20개, 또는 2 내지 10개의 탄소 원자를 가질 수 있다. 알케닐 기는 고리형 구조를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "헤테로알켄"은 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 알켄을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "알키닐" 또는 "알킨"은 사슬 모양 또는 가지 모양의 비방향족 탄화수소로서, 하나 이상의 삼중 결합을 포함하는 그룹을 의미하는 것으로 사용된다. 예를 들어, 사슬 모양 또는 가지 모양 알키닐 기는, 2 내지 약 50 개, 2 내지 20개, 또는 2 내지 10개의 탄소 원자를 가질 수 있다. 알키닐 기는 하나 이상의 삼중 결합 외에도 하나 이상의 이중 결합을 포함할 수 있다. 알키닐 기는 고리형 구조를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "헤테로알킨"은 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 알킨을 의미한다.
그 자체인 분자로 쓰이거나 또는 분자의 일부로 사용되는 용어 "알킬렌"은 알킬로부터 유도된 2가 라디칼(divalent radical)을 의미한다. 용어 "알킬렌"은, 필요에 따라, "치환된" 또는 "비치환된"의 용어와 함께 사용될 수 있다. 용어 "알킬렌"이 "치환된" 또는 "비치환된"의 용어와 함께 사용되지 않는 경우에는, 용어 "알킬렌"은 치환된 알킬렌 및 비치환된 알킬렌을 모두 포함하는 것으로 의도된다. 알킬렌은 -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH2CH2-, 및 -CH2CH2CH2CH2- 으로 예시될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 알킬렌은 C2 알킬렌과 같이 사용될 수 있으며, 이는 주사슬에 두개의 탄소 원자를 포함하는 알킬렌 그룹을 의미한다. 예시적으로, 본 명세서에서 "Cx-y 알킬렌" 은 주사슬에 X 내지 Y 수의 탄소 원자를 갖는, 치환된 또는 비치환된 알킬렌을 모두 포함하는 알킬렌을 의미하는 것으로 사용된다.
그 자체인 분자로 쓰이거나 또는 분자의 일부로 사용되는 용어 "헤테로알킬렌"은 헤테로알킬로부터 유도된 2가 라디칼을 의미한다. 용어 “헤테로알킬렌”은 필요에 따라, “치환된” 또는 "비치환된"의 용어와 함께 사용될 수 있다. 용어 "헤테로알킬렌"이 "치환된" 또는 "비치환된"의 용어와 함께 사용되지 않는 경우에는, 용어 "헤테로알킬렌"은 치환된 헤테로알킬렌 또는 비치환된 헤테로알킬렌을 모두 포함하는 것으로 의도된다. 예시적으로 헤테로알킬렌 그룹은 ―CH2―CH2―O―CH2―CH2―, 및 ―CH2―O―CH2―CH2―NH―CH2― 를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 헤테로알킬렌 그룹은 하나 이상의 헤테로원자를 포함할 수 있고, 각각의 헤테로원자는 같거나 다를 수 있다. 예를 들어, 헤테로알킬렌 그룹은 사슬 또는 가지의 말단이 아닌 위치에 하나 이상의 헤테로원자를 포함할 수 있고, 각각의 헤테로원자는 같거나 다를 수 있다. 예를 들어, 헤테로알킬렌 그룹은 사슬 또는 가지의 말단 각각, 또는 모든 말단에 하나 이상의 헤테로원자를 포함할 수 있고, 각각의 헤테로원자는 같거나 다를 수 있다. 예시적으로, 본 명세서에서 "Cx-y 헤테로알킬렌" 은 주사슬에 x 내지 y 수의 탄소 원자를 갖는, 치환 또는 비치환된 헤테로알킬렌을 모두 포함하는 것으로 사용된다.
그 자체인 분자로 쓰이거나 또는 분자의 일부로 사용되는 용어 "알케닐렌"은 알켄으로부터 유도된 2가 라디칼을 의미한다. 용어 “알케닐렌”은 필요에 따라, “치환된” 또는 "비치환된"의 용어와 함께 사용될 수 있다. 용어 "알케닐렌"이 "치환된" 또는 "비치환된"의 용어와 함께 사용되지 않는 경우에는, 용어 "알케닐렌"은 치환된 알케닐렌 또는 비치환된 알케닐렌을 모두 포함하는 것으로 의도된다. 예시적으로 알케닐렌 그룹은 -CH=CH-, -CH2CH=CHCH2-, 및 -CH=CH-CH=CH- 을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예시적으로, 본 명세서에서 "Cx-y 알케닐렌" 은 주사슬에 X 내지 Y 수의 탄소 원자를 갖는, 치환 또는 비치환된 알케닐렌을 모두 포함하는 것으로 사용된다.
그 자체인 분자로 쓰이거나 또는 분자의 일부로 사용되는 용어 "헤테로알케닐렌"은 헤테로알켄으로부터 유도된 2가 라디칼을 의미한다. 용어 “헤테로알케닐렌”은 필요에 따라, “치환된” 또는 "비치환된"의 용어와 함께 사용될 수 있다. 용어 "헤테로알케닐렌"이 "치환된" 또는 "비치환된"의 용어와 함께 사용되지 않는 경우에는, 용어 "헤테로알케닐렌"은 치환된 헤테로알케닐렌 또는 비치환된 헤테로알케닐렌을 모두 포함하는 것으로 의도된다. 헤테로알케닐렌 그룹은 하나 이상의 헤테로원자를 포함할 수 있고, 각각의 헤테로원자는 같거나 다를 수 있다. 예를 들어, 헤테로알케닐렌 그룹은 사슬 또는 가지의 말단이 아닌 위치에 하나 이상의 헤테로원자를 포함할 수 있고, 각각의 헤테로원자는 같거나 다를 수 있다. 예를 들어, 헤테로알케닐렌 그룹은 사슬 또는 가지의 말단 각각, 또는 모든 말단에 하나 이상의 헤테로원자를 포함할 수 있고, 각각의 헤테로원자는 같거나 다를 수 있다.
그 자체인 분자로 쓰이거나 또는 분자의 일부로 사용되는 용어 "알키닐렌"은 알킨으로부터 유도된 2가 라디칼을 의미한다. 용어 “알키닐렌”은 필요에 따라, “치환된” 또는 "비치환된"의 용어와 함께 사용될 수 있다. 용어 "알키닐렌"이 "치환된" 또는 "비치환된"의 용어와 함께 사용되지 않는 경우에는, 용어 "알키닐렌"은 치환된 알키닐렌 또는 비치환된 알키닐렌을 모두 포함하는 것으로 의도된다. 예컨데, 알키닐렌 그룹은 -C≡C-, -CH2C≡CCH2-, 및 -C≡C-C≡C-를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 예시적으로, 본 명세서에서 "Cx-y 알키닐렌" 은 주사슬에 X 내지 Y 수의 탄소 원자를 갖는, 치환 또는 비치환된 알키닐렌을 모두 포함하는 것으로 사용된다.
그 자체인 분자로 쓰이거나 또는 분자의 일부로 사용되는 용어 "헤테로알키닐렌"은 헤테로알킨으로부터 유도된 2가 라디칼을 의미한다. 용어 “헤테로알키닐렌”은 필요에 따라, “치환된” 또는 "비치환된"의 용어와 함께 사용될 수 있다. 용어 "헤테로알키닐렌"이 "치환된" 또는 "비치환된"의 용어와 함께 사용되지 않는 경우에는, 용어 "헤테로알키닐렌"은 치환된 헤테로알키닐렌 또는 비치환된 헤테로알키닐렌을 모두 포함하는 것으로 의도된다. 헤테로알키닐렌 그룹은 하나 이상의 헤테로원자를 포함할 수 있고, 각각의 헤테로원자는 같거나 다를 수 있다. 예를 들어, 헤테로알키닐렌 그룹은 사슬 또는 가지의 말단이 아닌 위치에 하나 이상의 헤테로원자를 포함할 수 있고, 각각의 헤테로원자는 같거나 다를 수 있다. 예를 들어, 헤테로알키닐렌 그룹은 사슬 또는 가지의 말단 각각, 또는 모든 말단에 하나 이상의 헤테로원자를 포함할 수 있고, 각각의 헤테로원자는 같거나 다를 수 있다.
본 명세서의 화합물은 특정 기하(geometric) 또는 입체 이성질체 형태를 가질 수 있다. 달리 명시되지 않고 본 출원에 화합물이 개시되는 경우, 상기 화합물의, 시스 및 트랜스 이성질체, (-)- 및 (+)- 거울상 이성질체(enantiomers), (R)- 및 (S)- 거울상 이성질체, 부분입체이성질체, (D)- 이성질체, (L)-이성질체, 및 라세미체 등의 이성질체는 본 출원의 범위에 포함된다. 즉, 본 출원에 개시된 화학식 또는 구조에 이성질체와 관련된 표시(예를 들어, *,
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000009
,
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000010
, 및
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000011
등)가 없는 경우, 개시된 화학식 또는 구조는 가능한 모든 이성질체를 포함함을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “클릭화학(click-chemistry)”은 Scripps Research Institute의 K. Barry Sharpless에 의하여, 두 개의 분자가 빠르고 안정적으로 공유 결합을 형성하도록 설계된 상보적인 화학작용기 및 화학 반응을 설명하기 위해 도입된 화학적 개념이다. 본 명세서의 클릭화학은 특정한 반응을 의미하는 것이 아닌, 빠르고 안정적인 반응의 개념을 의미한다. 일 실시양태로, 클릭화학으로 분자들 사이의 결합을 형성하기 위해서는 몇 가지 조건을 만족해야 한다. 상기 조건은 높은 수득률, 반응 자리에 대한 뛰어난 선택성, 모듈식으로 작동하여 유기적으로 분자가 결합되는 것 및 열역학적으로 안정화된 방향으로 진행되어 빠르고 정확한 생성물을 만드는 것이다. 본 명세서의 클릭화학은 클릭화학작용기(예를 들어, 말단 알킨 (terminal alkyne), 아자이드 (azide), 스트레인된 알킨(strained alkyne), 다이엔 (diene), 친다이엔체 (dienophile), 트랜스 시클로옥틴(trans-cyclooctene), 알켄 (alkene), 티올 (thiol), 테트라진 (tetrazine), 트리아진(triazine), DBCO(dibenzocyclooctyne) 및 비시클로노닌(bicyclononyne, bicyclo[6.1.0]non-4-yne)을 포함)중에서 서로 반응성을 갖는 쌍이 반응하는 것을 포함한다. 클릭화학반응의 예시로는, 휴이스겐 1,3-이극성 고리화첨가 (Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition; Tornoe et al.　Journal of Organic Chemistry (2002) 67: 3075-3064 등 참조); 디엘스-알더 반응 (Diels-Alder reaction); inverse-demand 디엘스-알더(Diels-Alder) 반응; 에폭사이드 (epoxide) 및 아지리딘 (aziridine)과 같은 작은 스트레인된 고리 (strained ring)에 대한 친핵성 첨가 반응 (Nucleophilic addition); 활성화된 카르보닐기 (activated carbonyl group)에 대한 친핵성 첨가 반응; 및 탄소-탄소 이중결합 또는 삼중결합에 대한 첨가 반응이 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "천연 아미노산(natural amino acid)" 또는 "표준 아미노산(standard amino acid)"은 유기체(organism)의 체내에서 유전자의 전사 및 번역 과정을 통해 합성되는 20종의 아미노산을 통틀어 의미한다. 구체적으로, 상기 표준 아미노산은 알라닌(Alanine; Ala, A), 아르기닌(Arginine; Arg, R), 아스파라긴(Asparagine; Asn, N), 아스파르트산(Aspartic acid; Asp, D), 시스테인(Cysteine; Cys, C), 글루탐산(Glutamic acid; Glu, E), 글루타민(Glutamine; Gln, Q), 글리신(Glycine; Gly, G), 히스티딘(Histidine; His, H), 이소류신(Isoleucine; Ile, I), 류신(Leucine; Leu, L), 리신(Lysine; Lys K), 메티오닌(Methionine; Met, M), 페닐알라닌(Phenylalanine; Phe, F), 프롤린(Proline; Pro, P), 세린(Serine; Ser, S), 트레오닌(Threonine; Thr, T), 트립토판(Tryptophan; Trp, W), 티로신(Tyrosine; Tyr, Y), 및 발린(Valine; Val, V)을 포함한다. 상기 표준 아미노산 각각은 모두 대응하는 DNA 코돈이 존재하며, 일반적인 아미노산 일문자 또는 세문자 표기법으로 나타낼 수 있다. 상기 표준 아미노산이라는 용어가 지칭하는 대상은 문맥에 따라 적절하게 해석되어야 하며, 그 외 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 “비천연 아미노산(nonnatural amino acid)”이라는 용어는, 체내에서 합성되지 않고 인공적으로 합성한 아미노산을 지칭한다. 상기 비천연 아미노산은 예들 들어, p-Azido-L-phenylalanine (AzF), p-ethynyl-phenylalanine (pEthF), LHomopropargylglycine(HPG), O-propargyl-L-tyrosine (oPa), ppropargyloxyphenylalanine(pPa), 2-amino-3-(4-azidophenyl)propanoic acid, 2-amino-4-(4-azidophenyl)butanoic acid, 및 4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl) phenylalanine (frTet) 등이 있다. 상기 비천연 아미노산은 이에 대응하는 DNA 코돈이 존재하지 않으며, 일반적인 아미노산 일문자 또는 세문자 표기법으로 나타낼 수 없으므로, 다른 문자를 사용하여 표기하며, 추가적으로 보충하여 설명한다. 상기 비천연 아미노산이라는 용어가 지칭하는 대상은 문맥에 따라 적절하게 해석되어야 하며, 그 외 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "아미노산"은 다른 아미노산과 결합되지 않은 아미노산 및 다른 아미노산과 결합된, 단백질 또는 펩타이드에 포함된 아미노산 잔기를 모두 지칭하는 것으로 사용될 수 있으며, 상기 아미노산 용어가 사용된 단락의 내용 또는 문맥에 따라 적절히 해석될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "아미노산"은 천연 아미노산 및 비천연 아미노산을 모두 포함하는 의미로 사용될 수 있다. 예를 들어, 알라닌은 알라닌 및/또는 알라닌 잔기를 지칭하는 것으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 아르기닌은 아르기닌 및/또는 아르기닌 잔기를 지칭하는 것으로 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "아미노산"은 L형 아미노산 및 D형 아미노산 모두를 포함하는 것으로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, L형 또는 D형에 대한 언급이 없는 경우, L형 아미노산으로 해석될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "아미노산 잔기(amino acid residue)"는 화합물, 펩타이드, 및/또는 단백질에 포함된, 상기 화합물, 펩타이드, 및/또는 단백질의 다른 부분과 공유결합으로 연결되어 있는, 아미노산으로부터 유래된 구조를 의미한다. 예를 들어, 알라닌, 아르기닌 및 글루탐산이 아마이드 결합을 통해 연결되어 ARE 서열을 갖는 펩타이드가 형성된 경우, 상기 펩타이드는 3개의 아미노산 잔기를 포함하며, 이때, A는 알라닌 잔기, R은 아르기닌 잔기, E는 글루탐산 잔기로 지칭될 수 있다. 나아가, 전술한 바와 같이, ARE 서열을 갖는 펩타이드에서, 상기 펩타이드는 3개의 아미노산을 포함할 수 있고, A는 알라닌, R은 아르기닌, E는 글루탐산으로도 지칭될 수 있다. 다른 예로, 아스파르트산, 페닐알라닌, 라이신이 아마이드 결합을 통해 연결되어 DFK 서열을 갖는 펩타이드가 형성된 경우, 상기 펩타이드는 3개의 아미노산 잔기를 포함하며, 이때, D는 아스파르트산 잔기, F는 페닐알라닌 잔기, K는 라이신 잔기로 지칭될 수 있다. 나아가, 전술한 바와 같이, DFK 서열을 갖는 펩타이드에서, 상기 펩타이드는 3개의 아미노산을 포함할 수 있고, D는 아스파르트산, F는 페닐알라닌, K는 라이신으로도 지칭될 수 있다.
달리 서술하지 않는 한, 본 명세서에서는 아미노산 서열을 기재할 때는 아미노산 일문자 표기법, 또는 세문자 표기법을 사용하여, N-터미널에서 C-터미널 방향으로 기재한다. 예를 들어, RNVP로 표기하는 경우, N-터미널에서 C-터미널 방향으로 아르기닌(arginine), 아스파라긴(asparagine), 발린(valine), 및 프롤린(proline)이 차례로 연결된 펩타이드를 의미한다. 또 다른 예를 들어, Thr-Leu-Lys로 표기하는 경우, N-터미널에서 C-터미널 방향으로 트레오닌(Threonine), 류신(Leucine), 및 리신(Lysine)이 차례로 연결된 펩타이드를 의미한다. 상기 일문자 표기법, 또는 세문자 표기법으로 나타낼 수 없는 아미노산의 경우, 다른 문자를 사용하여 표기하며, 추가적으로 보충하여 설명한다.
용어 "치료”는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병의 예방, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감 (부분적이거나 전체적으로), 검출 가능하거나 또는 검출되지 않거나의 여부를 포함한다. 상기 치료는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 가리킨다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "대상"은 본 발명의 분자에 의해 달성될 수 있는 처치를 필요로 하는 동물을 지칭한다. 본 발명에 따라 처치될 수 있는 동물에는 척추동물이 포함되고, 포유동물 예컨대 쥐과, 소과, 개과, 말과, 고양이과, 양과, 돼지과 및 영장류 (인간 및 비-인간 영장류 포함) 동물이 특히 바람직한 예이다.
이하, 발명의 구체적인 내용을 개시한다.
치료용 폴리펩티드의 약효지속성 증가의 필요성
전술한 바와 같이, 치료용 단백질 또는 치료용 폴리펩티드는 체내 단백질 분해 효소에 의해 쉽게 파괴되거나, 혈중 반감기가 극히 짧아 약효 지속성이 낮으며, 단회 투여가 아닌 반복 투여가 요구되며, 면역 원성 등의 부작용이 발생하기 쉬운 문제가 있다. 따라서, 치료용 폴리펩티드 또는 단백질의 개발에서 중요한 고려사항 중 하나는 약효 지속성, 투여 횟수, 및 면역원성 등과 관련된 혈중 반감기를 높이는 것이다. 치료용 단백질 또는 폴리펩티드의 문제점을 해결하기 위하여, 치료용 단백질 또는 폴리펩티드에 알부민을 공유적으로 또는 비공유적으로 부착하여 혈중 반감기를 높이는 방법이 사용되었다.
종래의 알부민 접합 기술: 티올-말레이미드 반응
전술한 바와 같이, 티올-말레이미드 반응은 바이오 컨쥬게이션 분야에서 주로 사용되는 기술이다. 치료용 단백질 또는 폴리펩티드에 알부민을 공유적으로 부착하기 위해 티올-말레이미드 반응이 사용되었다. 구체적으로는 알부민의 티올기와 알부민이 아닌 다른 요소의 말레이미드 그룹을 반응시켜, 티오숙신이미드 그룹을 형성하고, 이를 통해 알부민과 알부민이 아닌 다른 요소를 연결하였다.
티올-말레이미드 반응에 의해 형성된 티오숙신이미드 그룹의 분해 및 알부민의 이탈
그러나, 티올-말레이미드 반응에 의해 형성된 티오숙신이미드 그룹은 체내에서 레트로 마이클(retro-michael) 반응에 의해 분해되는 것이 알려졌으며 (Baldwin, Aaron D., and Kristi L. Kiick. "Tunable degradation of maleimide-thiol adducts in reducing environments." Bioconjugate chemistry 22.10 (2011): 1946-1953.), 이러한 레트로 마이클(retro-michael) 반응은 컨쥬게이트로부터 알부민의 이탈을 야기한다.
나아가, 티올-말레이미드 반응은 pH 6.5 ~ 7.5의 조건에서 반응이 형성되며, pH 7.5 이상의 조건에서 말레이미드 그룹은 티올 그룹 뿐만 아니라 1차 아민 그룹과도 반응을 형성하여 원하지 않는 불순물이 생성될 수 있다. 즉, 티올-말레이미드 반응은 사용 가능한 pH범위가 제한적인 문제가 있다.
알부민의 이탈이 야기하는 문제
체내로 투여된 컨쥬게이트로부터 알부민이 이탈되면, 알부민과 결합되지 않은 치료용 폴리펩티드가 형성된다. 알부민과 결합되지 않은 치료용 폴리펩티드는 전술한 짧은 약효 지속성 및 면역 원성 등의 문제를 다시 갖게 된다. 나아가, 이러한 알부민의 이탈은 혈장 반감기의 감소를 야기한다.
티올-APN 반응을 이용한 치료용 폴리펩티드-알부민 컨쥬게이트의 반감기 개선
Koniev, Oleksandr, et al.은 티올 기의 모디피케이션 또는 티올기를 이용한 컨쥬게이션에 사용되는 티올기와 반응성을 갖는 3-아릴프로피올로니트릴(3-Arylpropiolonitriles; APN) 그룹을 개발하였다. Koniev, Oleksandr, et al.은 티올-APN 반응은 수성 버퍼 컨디션에서 화학 선택성이 높으며, 티올-말레이미드 반응 보다 생체 내(in vivo)에서 더 안정하다고 설명한다 (Koniev, Oleksandr, et al. "Selective irreversible chemical tagging of cysteine with 3-arylpropiolonitriles." Bioconjugate chemistry 25.2 (2014): 202-206.). 본 출원의 발명자는 이러한 티올-APN 반응을 통해 형성된 그룹이 티올-말레이미드 반응을 통해 형성된 그룹보다 체내에서 보다 안정한 점을 바탕으로, 티올-APN 반응을 이용하여 알부민을 치료용 폴리펩티드 등에 부착시켜 컨쥬게이트를 제조하였으며, 상기 티올-APN 반응을 통해 제조된 컨쥬게이트가 티올-말레이미드 반응에 의해 제조된 컨쥬게이트보다 생체 내에서 안정하며 혈장 반감기가 긴 것을 확인하였다. 본 출원의 출원일 이전에 티올-APN 반응을 이용하여 제조된 알부민 컨쥬게이트와 티올-말레이미드 반응에 의해 제조된 알부민 컨쥬게이트의 생체 내 안정성(in vivo stability) 및/또는 혈장 반감기(serum half-life)를 비교한 내용을 개시하는 문헌은 없다.
기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트 개괄
기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트의 제조에 사용되는 요소
본 출원은 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트를 제공한다. 본 출원의 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트는 기능성 폴리펩티드 변이체가, 링커를 통해, 알부민과 공유적으로 연결된 형태를 가진다. 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트의 제조에는 기능성 폴리펩티드 변이체, 알부민, 및 링커가 사용된다. 구체적으로, 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트는 (i) 기능성 폴리펩티드 변이체(functional polypeptide variant)와 (ii) 알부민이 (iii) 링커를 통해 위치-특이적으로 연결되어 제조된다. 여기서, 기능성 폴리펩티드 변이체는 비천연 아미노산 잔기를 포함한다. 여기서, 링커는 APN 그룹 및 클릭화학작용기를 포함한다. 구체적으로, 링커는 일 말단에 APN 그룹 및 다른 말단에 클릭화학작용기를 포함한다. 링커의 APN 그룹은 알부민의 티올기와 반응하며, 링커의 클릭화학작용기는 기능성 폴리펩티드 변이체의 비천연 아미노산 잔기에 포함된 다른 클릭화학작용기와 클릭화학반응을 한다. 기능성 폴리펩티드 변이체, 알부민, 및 링커 각각은 관련 단락에서 상세히 기술된다.
기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트의 구조
본 출원의 일 실시양태로, 화학식 1의 구조를 갖는 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트가 제공된다:
[화학식 1]
FPV-[J1-A2-J2-P1]a
화학식 1에서, FPV는 기능성 폴리펩티드 변이체 유닛(functional polypeptide variant unit)이다. 기능성 폴리펩티드 변이체 유닛은 컨쥬게이트된 기능성 폴리펩티드 변이체일 수 있다. 즉, 기능성 폴리펩티드 변이체 유닛(functional polypeptide variant unit)은 기능성 폴리펩티드 변이체로부터 유래된다.
화학식 1에서, J1은 제1 접합 유닛이다. 제1 접합 유닛은 기능성 폴리펩티드 변이체에 포함된 제1 클릭화학작용기와, 제1 클릭화학작용기와 클릭화학반응을 할 수 있는 제2 클릭화학작용기의 클릭화학반응에 의해 형성된 구조를 갖는다.
화학식 1에서, A2는 제2 앵커 유닛이다. 컨쥬게이트에서, 제2 앵커 유닛은 기능성 폴리펩티드 변이체 유닛과 알부민 유닛을 연결하는 구성을 지칭한다. 제2 앵커 유닛은 기능성 폴리펩티드 변이체 유닛과 알부민 유닛 사이의 거리를 조절하는 역할을 한다. 당해 분야에서 거리조절을 위해 통상적으로 사용되는 구조라면, 크게 제한되지 않는다. 제2 앵커 유닛은 링커로부터 유래된다.
화학식 1에서, J2는 제2 접합 유닛이다. 제2 접합 유닛은 APN 그룹과 알부민의 티올기의 반응에 의해 형성된 구조를 갖는다.
화학식 1에서, P1은 알부민 유닛이다. 알부민 유닛은 컨쥬게이트된 알부민일 수 있다. 즉, 알부민 유닛은 알부민으로부터 유래된다.
화학식 1에서, a는 1 이상 8 이하의 정수이다. 특정한 실시양태에서, a는 1 이상 4 이하의 정수일 수 있다.
전술한 바와 같이, 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트는 기능성 폴리펩티드, 링커, 및 알부민을 사용하여 제조된다. 나아가, 컨쥬게이트에서, 기능성 폴리펩티드 변이체 유닛은 기능성 폴리펩티드 변이체로부터 유래되며, 알부민 유닛은 알부민으로부터 유래되며, 제2 앵커 유닛은 링커로부터 유래된다. 이하에서, 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트의 제조에 사용되는 요소에 대하여 상세히 기술한다.
링커: APN 그룹을 포함함
링커 개괄
본 출원은 링커를 제공한다. 본 출원의 링커는 APN 그룹을 포함한다.
기능성 폴리펩티드 변이체는 알부민과 링커를 통해 연결된다. 예를 들어, 알부민과 링커가 반응하여 알부민-링커 컨쥬게이트가 제조되고, 알부민-링커 컨쥬게이트와 기능성 폴리펩티드 변이체가 반응하여 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트가 제조될 수 있다. 다른 예로, 기능성 폴리펩티드 변이체와 링커가 반응하여 기능성 폴리펩티드 변이체-링커 컨쥬게이트가 제조되고, 기능성 폴리펩티드 변이체-링커 컨쥬게이트와 알부민이 반응하여 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트가 제조될 수 있다.
링커는 APN 그룹 및 클릭화학작용기를 포함한다. 상기 APN 그룹은 알부민의 티올기와 반응 (티올-APN 반응)하여 제2 접합 유닛에 포함된 구조를 형성한다. 상기 클릭화학작용기는 기능성 폴리펩티드 변이체의 비천연아미노산에 포함된 다른 클릭화학작용기와 반응하여 제1 접합 유닛에 포함된 구조를 형성한다. 예를 들어, 링커는 APN 그룹 및 제2 클릭화학작용기를 포함할 수 있다. APN 그룹은 티올기와 반응하고, 제2 클릭화학작용기는 제1 클릭화학작용기와 클릭화학반응을 할 수 있다.
APN 그룹
본 출원의 링커는 APN 그룹을 포함한다. APN 그룹은 티올기와 반응성을 갖는다. 본 출원의 링커는 APN 그룹을 포함하는 링커로 지칭될 수 있다. 본 출원의 링커에 포함된 APN 그룹은 하기의 구조를 가질 수 있다:
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000012
.
일 실시양태에서, APN 그룹은 하기의 구조를 가질 수 있다:
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000013
.
APN 그룹을 포함하는 링커의 구조 (화학식 2의 화합물)
본 출원의 일 실시양태는 화학식 2의 구조를 갖는 링커를 제공한다:
[화학식 2]
H2-A2-B.
화학식 2에서, H2는 제2 클릭화학작용기이다. 제2 클릭화학작용기는 클릭화학작용기를 가질 수 있다. 제2 클릭화학작용기는 제1 클릭화학작용기와 클릭화학반응을 할 수 있다.
화학식 2에서, A2는 제2 앵커 유닛이다. 링커에서, 제2 앵커 유닛은 제2 클릭화학작용기와 APN 그룹 사이의 거리를 조절하는 역할을 한다. 컨쥬게이트에서, 제2 앵커 유닛은 기능성 폴리펩티드 변이체 유닛과 알부민 유닛 사이의 거리를 조절하는 역할을 한다.
화학식 2에서, B는 APN 그룹이다.
제2 클릭화학작용기 (H2)
전술한 바와 같이, 제2 클릭화학작용기는 클릭화학작용기를 갖는다.
일 실시양태에서, 제2 클릭화학작용기는 말단 알킨 (terminal alkyne), 아자이드 (azide), 스트레인된 알킨(strained alkyne), 다이엔 (diene), 친다이엔체 (dienophile), 트랜스 시클로옥틴(trans-cyclooctene), 알켄 (alkene), 티올 (thiol), 테트라진 (tetrazine), 트리아진(triazine), 메틸사이클로프로펜(methylcyclopropene), 노르보르넨(norbornene), 사이클로펜텐(cyclopentene), 스티렌(styrene), (DBCO(dibenzocyclooctyne) 및 비시클로노닌(bicyclononyne, bicyclo[6.1.0]non-4-yne)을 포함) 그룹 중에서 선택된 어느 하나의 그룹을 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 제2 클릭화학작용기는 트랜스-바이사이클로[6.1.0]노넨(trans-bicyclo[6.1.0]nonene) 그룹, 트랜스 사이클로옥텐(trans-cyclooctene; TCO) 그룹, 메틸사이클로프로펜(methylcyclopropene) 그룹, 바이사이클로[6.1.0]노닌(bicyclo[6.1.0]nonyne) 그룹, 사이클로옥틴 (cyclooctyne) 그룹, 노르보르넨(norbornene) 그룹, 사이클로펜텐(cyclopentene) 그룹, 스티렌(styrene) 그룹, 및 다이벤조사이클로옥틴(dibenzocyclooctyne) 그룹 중 어느 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 실시양태에서, 제2 클릭화학작용기는 하기의 구조 중 어느 하나의 구조를 가질 수 있다:
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000014
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000015
.
여기서, 물결선은 링커의 다른 부분과의 부착부(attachment site)를 나타낸다. 예를 들어, 물결선은 제2 앵커 유닛과의 부착부(attachment site)를 나타낼 수 있다.
특정한 실시양태에서, 제2 클릭화학작용기는 하기의 구조를 가질 수 있다:
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000016
.
여기서, 물결선은 링커의 다른 부분과의 부착부(attachment site)를 나타낸다. 예를 들어, 물결선은 제2 앵커 모이어티와의 부착부(attachment site)를 나타낼 수 있다.
제2 앵커 유닛 (A2)
화학식 2에서, A2는 제2 앵커 유닛이다.
일 실시양태에서, 제2 앵커 유닛은 하나 이상의 헤테로 원자를 포함하는, 치환된 탄화수소 사슬이다. 이때 상기 헤테로 원자는, 각각 독립적으로, N, O, 및 S 중에서 선택될 수 있다. 이때 상기 치환은 하나 이상의 비수소 치환기로 치환된 것으로, 상기 비수소 치환기는, 각각 독립적으로, 할로겐, C1-3알킬, -NH2, =O, 및 =S 로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다. 일 실시양태에서, 제2 앵커 유닛은 복수의 에틸렌글리콜 단위체로 구성된 폴리에틸렌글리콜 유닛을 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 제2 앵커 유닛은 치환 또는 비치환된 C1-50알킬렌, 치환 또는 비치환된 C1-50헤테로알킬렌, -치환 또는 비치환된 C1-20알킬렌-[EG]n-, -치환 또는 비치환된 C1-20헤테로알킬렌-[EG]n-, -치환 또는 비치환된 C1-20알킬렌-[EG]n-치환 또는 비치환된 C1-20알킬렌-, -치환 또는 비치환된 C1-20알킬렌-[EG]n-치환 또는 비치환된 C1-20헤테로알킬렌-, 및 -치환 또는 비치환된 C1-20헤테로알킬렌-[EG]n-치환 또는 비치환된 C1-20헤테로알킬렌- 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 이때, 상기 헤테로알킬렌은 -NH-, -O-, -S-, -O-N=, -S(=O)-, 및 -S(=O)2-로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 헤테로원자 그룹, 또는 O, N, 및 S로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하고, 헤테로원자 그룹 또는 헤테로원자는 각각 독립적으로 선택될 수 있다. 이때, 상기 치환은 하나 이상의 비수소 치환기로 치환된 것으로, 상기 비수소 치환기는 할로겐, C1-3알킬, -NH2, =O, 및 =S 로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고, 비수소 치환기는 각각 독립적으로 선택될 수 있다. 이때, EG는 에틸렌글리콜 단위체를 의미하며, -OCH2CH2- 또는 -CH2OCH2-의 구조를 갖는다. 이때, n은 1이상 12 이하의 정수일 수 있다.
특정한 실시양태에서, 제2 앵커 유닛은 치환된 -C5-15 헤테로알킬렌-[EG]n-치환된 C1-5 헤테로알킬렌일 수 있다. 이때, 상기 헤테로알킬렌은 -NH-, -O-, -S-, -O-N=, -S(=O)-, 및 -S(=O)2-로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 헤테로원자 그룹, 또는 O, N, 및 S로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하고, 헤테로원자 그룹 또는 헤테로원자는 각각 독립적으로 선택될 수 있다. 이때, 상기 치환은 하나 이상의 비수소 치환기로 치환된 것으로, 상기 비수소 치환기는 할로겐, C1-3알킬, -NH2, =O, 및 =S 로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고, 비수소 치환기는 각각 독립적으로 선택될 수 있다. 이때, EG는 에틸렌글리콜 단위체를 의미하며, -OCH2CH2- 또는 -CH2OCH2-의 구조를 갖는다. 이때, n은 1이상 6 이하의 정수일 수 있다.
특정한 실시양태에서, 제2 앵커 유닛은 치환된 C5-15 헤테로알킬렌일 수 있다. 이때, 상기 헤테로알킬렌은 -NH-, -O-, -S-, -O-N=, -S(=O)-, 및 -S(=O)2-로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 헤테로원자 그룹, 또는 O, N, 및 S로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하고, 헤테로원자 그룹 또는 헤테로원자는 각각 독립적으로 선택될 수 있다. 이때, 상기 치환은 하나 이상의 비수소 치환기로 치환된 것으로, 상기 비수소 치환기는 할로겐, C1-3알킬, -NH2, =O, 및 =S 로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고, 비수소 치환기는 각각 독립적으로 선택될 수 있다.
링커의 구체예
일 실시양태에서, 링커는 하기의 화학식 2-1의 구조를 가질 수 있다:
[화학식 2-1]
H2-A21-A22-A23-B.
화학식 2-1의 구조에서, H2는 제2 클릭화학작용기이고, 섹션 '제2 클릭화학작용기 (H2)'에서 상세히 설명된다.
화학식 2-1의 구조에서, -A21-A22-A23-는 제2 앵커 유닛이다.
이때 A21은 결합(bond), -CH2CH2OC(=O)NH-, -CH2OC(=O)NH-, -OC(=O)NH-, -C(=O)NH-, -NH- 또는 -C(=O)- 일 수 있다.
이때 A22는 결합(bond), 치환 또는 비치환된 C1-12 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C1-12 헤테로알킬렌, -치환 또는 비치환된 C1-12알킬렌-[EG]n-, -치환 또는 비치환된 C1-12-헤테로알킬렌-[EG]n-, -치환 또는 비치환된 C1-12알킬렌-[EG]n-치환 또는 비치환된 C1-12알킬렌-, -치환 또는 비치환된 C1-12헤테로알킬렌-[EG]n-치환 또는 비치환된 C1-12알킬렌-, 및 -치환 또는 비치환된 C1-12헤테로알킬렌-[EG]n-치환 또는 비치환된 C1-12헤테로알킬렌- 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 이때, 상기 헤테로알킬렌은 -NH-, -O-, -S-, -O-N=, -S(=O)-, 및 -S(=O)2-로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 헤테로원자 그룹, 또는 O, N, 및 S로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하고, 헤테로원자 그룹 또는 헤테로원자는 각각 독립적으로 선택될 수 있다. 이때, 상기 치환은 하나 이상의 비수소 치환기로 치환된 것으로, 상기 비수소 치환기는 할로겐, C1-3알킬, -NH2, =O, 및 =S 로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고, 비수소 치환기는 각각 독립적으로 선택될 수 있다. 이때, EG는 에틸렌글리콜 단위체를 의미하며, -OCH2CH2- 또는 -CH2OCH2-의 구조를 갖는다. 이때, n은 2이상 6 이하의 정수일 수 있다.
이때 A23은 결합(bond), -CH2CH2OC(=O)NH-, -CH2OC(=O)NH-, -OC(=O)NH-, -C(=O)NH-, -NH- 또는 -C(=O)- 일 수 있다.
이때 A21, A22, 및 A23 모두가 동시에 결합(bond)인 경우는 존재하지 않는다.
화학식 2-1의 구조에서, B는 APN 그룹을 포함하는 그룹이다.
일 실시양태에서, 링커는 하기의 화학식 중 어느 하나의 화학식의 구조를 가질 수 있다:
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000017
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000018
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000019
이때, n은 2 이상 8 이하의 정수일 수 있다.
알부민 및 알부민 유닛
알부민 및 알부민 유닛 개괄
전술한 바와 같이, 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트의 제조에는 알부민이 사용된다. 알부민은 체액 중 넓게 분포되어 있는 단순 단백질로써, 다양한 분자들과 결합하여 운반시키는 수송 단백질의 역할을 한다. 알부민의 대표적인 예로는 혈청 알부민이 있다.
화학식 1에서, P1은 알부민 유닛이다. 알부민 유닛은 컨쥬게이트된 알부민일 수 있다. 알부민 유닛은 알부민으로부터 유래될 수 있다.
본 명세서에서 용어 알부민은 다른 화합물과 컨쥬게이트되지 않은 알부민 및 다른 화합물과 컨쥬게이트된 알부민을 모두 포함하는 것으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 알부민은 서열번호 01의 서열을 갖는 단백질일 수 있다. 예를 들어, 화학식 1에서 알부민 유닛 P1은 알부민으로 지칭될 수 있다.
알부민의 구체예
일 실시양태에서, 알부민은 포유류의 알부민, 예를 들어 혈청 알부민일 수 있다. 일 실시양태에서, 알부민은 인간 혈청 알부민 (human serum albumin; HSA), 소혈청알부민 (bovine serum albumin; BSA), 오브알부민, 기타 척추동물의 알부민, 및 이들의 변이체 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 이들은 야생형 또는 재조합 형태(재조합 알부민)일 수 있다.
일 실시양태에서, 알부민은 야생형 또는 재조합 인간 혈청 알부민일 수 있다. 상기 인간 혈청 알부민은 2주 이상의 긴 반감기를 가진다. 이는, 1) 알부민 분자의 정전기적 반발력(electrostatic repulsion)으로 인해 사구체에서 쉽게 여과되지 않으며, 2) 내피세포(endothelium)의 neonatal Fc receptor (FcRn)에 의해 매개되는 재순환 작용으로 인해 체내에서 분해되는 주기가 길기 때문이다.
일 실시양태에서, 알부민은 인간 혈청 알부민일 수 있고, 이때, 인간 혈청 알부민은 하기의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
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다른 실시양태에서, 알부민은 인간 혈청 알부민 또는 이의 변이체일 수 있고, 인간 혈청 알부민 또는 이의 변이체는 하기의 서열 중 선택된 어느 하나의 서열을 포함할 수 있다:
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DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFTAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL (서열번호 12).
일 실시양태에서, 인간 혈청 알부민 또는 이의 변이체에 포함된 시스테인의 티올 잔기는 링커의 일 말단의 APN 그룹과 반응할 수 있다. 보다 구체적으로, 인간 혈청 알부민 또는 이의 변이체에 포함된 시스테인의 티올 잔기는 링커의 일 말단의 APN 그룹과 반응할 수 있다. 이때, 링커의 일 말단과 반응하는 시스테인은 34번 시스테인(Cys 34)일 수 있다.
기능성 폴리펩티드 변이체 및 기능성 폴리펩티드 변이체 유닛
기능성 폴리펩티드 (functional polypeptide)
본 명세서에서 용어 기능성 폴리펩티드는 하나 이상의 기능을 가진 펩티드, 폴리펩티드, 및 단백질을 모두 포함하는 것으로 사용된다. 예를 들어, 기능은 어떤(certain) 질병의 치료 및/또는 예방과 관련된 것일 수 있다. 예를 들어, 기능은 진단과 관련된 것일 수 있다. 예를 들어, 기능은 다른 폴리펩티드와 작용하여 복합체를 형성하는 것일 수 있다. 예를 들어, 기능은 동종의 폴리펩티드와 작용하여 복합체를 형성하는 것일 수 있다. 이때 상기 복합체는 어떤 질병을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 기능은 유전자의 조작과 관련된 것일 수 있다. 예를 들어, 기능은 다른 분자(예를 들어, 항원 및 타겟 등)와의 결합과 관련된 것일 수 있다. 기능성 폴리펩티드는 예는 항체, 항체의 단편, 항원, 항체가 아닌 치료용 단백질, 항체가 아닌 치료용 단백질의 단편, 및 항체가 아닌 치료용 단백질 서브유닛 등을 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 기능성 폴리펩티드는 요산산화효소(Urate oxidase; Uox), 요산산화효소 서브유닛, 글루카곤유사펩타이드 1(Glucagon-like peptide-1; GLP1) 또는 이의 유사체, 인간 성장 호르몬 (human growth hormone; hGH), 및 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein; GFP) 또는 이의 유사체 (예를 들어 superfolder GFP 등) 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
기능성 폴리펩티드 변이체 (functional polypeptide variant) 개괄: 비천연 아미노산을 포함함
기능성 폴리펩티드 변이체는 기능성 폴리펩티드가 비천연 아미노산을 포함하도록 변형된 것이다. 예를 들어, 기능성 폴리펩티드에 포함된 하나 이상의 아미노산 잔기가 비천연 아미노산 잔기로 치환된 것이 기능성 폴리펩티드 변이체일 수 있다. 즉, 기능성 폴리펩티드 변이체는 하나 이상의 비천연 아미노산 잔기를 포함한다. 여기서, 비천연 아미노산 잔기는 클릭화학작용기를 포함할 수 있다. 기능성 폴리펩티드 변이체는 레퍼런스 서열(기능성 폴리펩티드의 서열) 또는 레퍼런스 폴리펩티드(기능성 폴리펩티드)를 통해 설명될 수 있다. 예를 들어, 기능성 폴리펩티드 변이체는 레퍼런스 서열에서 치환 위치 및/또는 치환되는 아미노산 등을 설명함을 통해 특정될 수 있다.
일 실시양태에서, 기능성 폴리펩티드 변이체는 요산산화효소 변이체, 요산산화효소 서브유닛 변이체, GLP1 변이체, hGH 변이체, 및 GFP 변이체 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.
기능성 폴리펩티드 변이체 및 기능성 폴리펩티드 변이체 유닛
화학식 1에서, FPV는 기능성 폴리펩티드 변이체 유닛이다. 기능성 폴리펩티드 변이체 유닛은 컨쥬게이트된 기능성 폴리펩티드 변이체일 수 있다. 기능성 폴리펩티드 변이체 유닛은 기능성 폴리펩티드 변이체로부터 유래될 수 있다.
본 명세서에서 용어 기능성 폴리펩티드 변이체는 다른 화합물과 컨쥬게이트되지 않은 기능성 폴리펩티드 변이체 및 다른 화합물과 컨쥬게이트된 기능성 폴리펩티드 변이체를 모두 포함하는 것으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 기능성 폴리펩티드 변이체는 서열번호 111의 서열을 갖는 단백질일 수 있다. 예를 들어, 화학식 1에서 기능성 폴리펩티드 변이체 유닛 FFV는 기능성 폴리펩티드 변이체로 지칭될 수 있다.
비천연 아미노산
비천연 아미노산 개괄
본 명세서에서 사용되는 용어 비천연 아미노산은 다른 아미노산과 결합되지 않은 아미노산 및 다른 아미노산과 결합된, 단백질 및/또는 펩타이드에 포함된 비천연아미노산 잔기를 모두 지칭하는 것으로 사용될 수 있으며, 상기 비천연 아미노산 용어가 사용된 단락의 내용 또는 문맥에 따라 적절히 해석될 수 있다.
전술한 바와 같이, 기능성 폴리펩티드 변이체는 비천연 아미노산 잔기를 포함한다. 기능성 폴리펩티드 변이체는 기능성 폴리펩티드에 포함된 하나 이상의 천연 아미노산 잔기를 비천연 아미노산 잔기로 치환된 것이다.
제1 클릭화학작용기를 포함하는 비천연 아미노산
본 출원의 일 실시양태에 따른 비천연 아미노산은 클릭화학작용기를 포함한다. 일 실시양태에서, 비천연 아미노산은 제1 클릭화학작용기를 포함할 수 있다. 상기 제1 클릭화학작용기는, 전술한, 제2 클릭화학작용기와 클릭화학 반응을 할 수 있는 클릭화학작용기를 갖는다. 일 실시양태에서, 제1 클릭화학작용기는 말단 알킨 (terminal alkyne), 아자이드 (azide), 스트레인된 알킨(strained alkyne), 다이엔 (diene), 친다이엔체 (dienophile), 트랜스 시클로옥틴(trans-cyclooctene), 알켄 (alkene), 티올 (thiol), 테트라진 (tetrazine), 트리아진(triazine), 메틸사이클로프로펜(methylcyclopropene), 노르보르넨(norbornene), 사이클로펜텐(cyclopentene), 스티렌(styrene), (DBCO(dibenzocyclooctyne) 및 비시클로노닌(bicyclononyne, bicyclo[6.1.0]non-4-yne)을 포함) 그룹 중에서 선택된 어느 하나의 그룹을 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제1 클릭화학작용기는 테트라진 그룹 또는 이의 유사체, 트리아진 그룹 또는 이의 유사체, 및 아자이드 그룹 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
일 실시양태에서, 비천연 아미노산은 테트라진 그룹을 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 비천연 아미노산은 트리아진 그룹을 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 비천연 아미노산은 아자이드 그룹을 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 비천연 아미노산은 하기의 화학식 3의 구조를 가질 수 있다:
[화학식 3]
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000020
.
여기서, A1은 제1 앵커 모이어티(first anchor moiety)이다.
여기서, H1은 제1 클릭화학작용기이다. 일 실시양태에서, 제1 클릭화학작용기는 클릭화학작용기를 갖고, 클릭화학작용기는 말단 알킨 (terminal alkyne), 아자이드 (azide), 스트레인된 알킨(strained alkyne), 다이엔 (diene), 친다이엔체 (dienophile), 트랜스 시클로옥틴(trans-cyclooctene), 알켄 (alkene), 티올 (thiol), 테트라진 (tetrazine), 트리아진(triazine), DBCO(dibenzocyclooctyne) 및 비시클로노닌(bicyclononyne, bicyclo[6.1.0]non-4-yne)을 포함) 중에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
일 실시양태에서, 제1 클릭화학작용기는 하기의 구조 중 어느 하나로 표현될 수 있다:
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000021
이때, R1은 H, 할로겐, C1-3알킬, C3-6 시클로알킬, C3-6 헤테로시클로알킬, 아릴, 및 헤테로아릴 중에 선택되는 어느 하나이고, 이때, 상기 헤테로시클로알킬, 또는 헤테로아릴은 -NH-, -O-, -S-, -O-N=, -S(=O)-, 및 -S(=O)2-로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 헤테로원자 그룹, 또는 O, N, 및 S로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 제1 앵커 모이어티는 결합(bond) 또는 -A11-A12- 일 수 있다.
이때, A11은 결합(bond) 또는 C1-5 알킬렌일 수 있다.
이때, A12는 결합(bond) 또는 [아릴렌]p, -[아릴렌]p-C1-5알킬렌-, -[아릴렌]p-C1-5헤테로알킬렌-, -아릴렌-C1-5알킬렌-아릴렌-, -아릴렌-C1-5헤테로알킬렌-아릴렌-, -아릴렌-헤테로아릴렌-, [헤테로아릴렌]p, -[헤테로아릴렌]p-C1-5알킬렌-, -[헤테로아릴렌]p-C1-5헤테로알킬렌-, -헤테로아릴렌-C1-5알킬렌-아릴렌-, -헤테로아릴렌-C1-5알킬렌-헤테로아릴렌-, -헤테로아릴렌-C1-5헤테로알킬렌-아릴렌-, 및 -헤테로아릴렌-C1-5헤테로알킬렌-헤테로아릴렌- 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 이때 p는 0 이상 3 이하의 정수일 수 있다. 이때 상기 헤테로알킬렌 또는 상기 헤테로아릴렌은 -NH-, -O-, -S-, -O-N=, -S(=O)-, 및 -S(=O)2-로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 헤테로원자 그룹, 또는 O, N, 및 S로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함할 수 있다.
비천연 아미노산의 구체예
일 실시양태에서, 비천연 아미노산은 테트라진 그룹을 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 비천연 아미노산은 트리아진 그룹을 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 비천연 아미노산은 아자이드 그룹을 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 비천연 아미노산은 p-Azido-L-phenylalanine (AzF), p-ethynyl-phenylalanine (pEthF), LHomopropargylglycine(HPG), O-propargyl-L-tyrosine (oPa), ppropargyloxyphenylalanine(pPa), 2-amino-3-(4-azidophenyl)propanoic acid, 2-amino-4-(4-azidophenyl)butanoic acid, 4-(1,2,3,4-tetrazin-3-yl) phenylalanine (frTet), 4-(6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)phenylalanine (Tet_v2.0), 4-(6-methyl-s-tetrazin-3-yl)phenylalanine, 3-(4-(1,2,4-triazin-6-yl)phenyl)-2-aminopropanoic acid, 2-amino-3-(4-(2-(6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)ethyl)phenyl)propanoic acid, 2-amino-3-(4-(6-phenyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)phenyl)propanoic acid, 3-(4-((1,2,4,5-tetrazin-3-yl)amino)phenyl)-2-aminopropanoic acid, 3-(4-(2-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)ethyl)phenyl)-2-aminopropanoic acid, 3-(4-((1,2,4,5-tetrazin-3-yl)thio)phenyl)-2-aminopropanoic acid, 2-amino-3-(4-((6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)thio)phenyl)propanoic acid, 3-(4-((1,2,4,5-tetrazin-3-yl)oxy)phenyl)-2-aminopropanoic acid, 2-amino-3-(4-((6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)oxy)phenyl)propanoic acid, 3-(4'-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)-[1,1'-biphenyl]-4-yl)-2-aminopropanoic acid, 2-amino-3-(4'-(6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)-[1,1'-biphenyl]-4-yl)propanoic acid, 2-amino-3-(6-(6-(pyridin-2-yl)-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)pyridin-3-yl)propanoic acid, 3-(4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)phenyl)-2-aminopropanoic acid, 및 2-amino-3-(4-(6-methyl-1,2,4,5-tetrazin-3-yl)phenyl)propanoic acid 중에 어느 하나일 수 있다.
일 실시양태에서, 비천연 아미노산은 하기의 화학식 중 어느 하나의 화학식의 구조를 가질 수 있다:
[화학식 3-1]
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000022
,
[화학식 3-2]
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000023
,
[화학식 3-3]
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000024
,
[화학식 3-4]
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000025
,
[화학식 3-5]
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000026
,
[화학식 3-6]
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000027
,
[화학식 3-7]
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000028
,
[화학식 3-8]
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000029
,
[화학식 3-9]
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000030
,
[화학식 3-10]
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000031
,
[화학식 3-11]
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000032
, 및
[화학식 3-12]
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000033
.
기능성 폴리펩티드 변이체 예시 (1) - 요산산화효소 변이체 또는 요산산화효소 서브유닛 변이체
요산산화효소 변이체 및 요산산화효소 서브유닛 변이체 개괄
일 실시양태에서, 기능성 폴리펩티드 변이체는 요산산화효소 변이체일 수 있다. 일 실시양태에서, 기능성 폴리펩티드 변이체는 요산산화효소 서브유닛 변이체일 수 있다. 이하에서, 요산산화효소 변이체 및 요산산화효소 서브유닛 변이체에 대하여 상세히 설명한다.
요산산화효소는 요산을 분해하는 기능을 갖는 효소이다. 인체는 요산산화효소를 생산하지 않기 때문에 요산의 분해가 원활하지 않은 경우 체내에 요산이 침착되어 다양한 질병을 유발할 수 있다. 따라서, 상기 요산산화효소는 요산의 높은 수치로 인해 발생하는 질병, 예를 들어 통풍을 포함하는 질병을 치료하는데 사용될 수 있다. 상기 요산산화효소는 4개의 동일한 구조의 단량체가 결합한 형태를 갖는 사량체(tetramer) 또는 팔량체(octamer) 형태로 존재할 수 있다. 즉, 상기 요산산화효소는 요산산화효소 서브유닛 4개가 올리고머화(oligomerization)되어 형성된 사합체(tetramer) 또는 팔량체(octamer)이다. 일 실시양태에서, 상기 야생형 요산산화효소는 동일한 4개의 야생형 요산산화효소 서브유닛이 올리고머화된 사량체(tetramer) 단백질이다.
본 명세서에서 개시하는 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트의 일 예시인 요산산화효소 변이체-알부민 컨쥬게이트의 제조에 사용되는 요산산화효소 변이체는 미생물 유래의 야생형 요산산화효소의 서열 일부가 변형된 것을 특징으로 한다. 상기 요산산화효소 변이체는 1개 이상의 비천연아미노산을 포함하며, 각각의 비천연아미노산 잔기를 통해 위치-특이적으로 알부민과 접합될 수 있다. 예를 들어, 상기 요산산화효소 변이체는 1개, 2개, 3개, 또는 4개, 또는 그 이상의 비천연아미노산을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 요산산화효소 변이체는 요산산화효소 서브유닛 변이체 4개가 올리고머화 되어 형성된 사합체이며, 각각의 요산산화효소 서브유닛 변이체는 야생형 요산산화효소 서브유닛과 비교해 그 서열 내 하나 이상의 아미노산이 비천연 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 한다.
본 명세서에서 제공하는 상기 요산산화효소 변이체의 원형이 되는 야생형 요산산화효소는 미생물에서 유래된 것이다. 일 실시양태에서, 상기 야생형 요산산화효소는 Aspergillus Flavus, Arthrobacter globiformis, 및 Candida Utilis에서 선택된 미생물 유래 요산산화효소일 수 있다.
요산산화효소 서브유닛
일 실시양태에서, 상기 야생형 요산산화효소가 Aspergillus Flavus 유래 요산산화효소인 경우, 그 서브유닛의 아미노산 서열은 N말단에서 C말단 방향으로,
SAVKAARYGKDNVRVYKVHKDEKTGVQTVYEMTVCVLLEGEIETSYTKADNSVIVATDSIKNTIYITAKQNPVTPPELFGSILGTHFIEKYNHIHAAHVNIVCHRWTRMDIDGKPHPHSFIRDSEEKRNVQVDVVEGKGIDIKSSLSGLTVLKSTNSQFWGFLRDEYTTLKETWDRILSTDVDATWQWKNFSGLQEVRSHVPKFDATWATAREVTLKTFAEDNSASVQATMYKMAEQILARQQLIETVEYSLPNKHYFEIDLSWHKGLQNTGKNAEVFAPQSDPNGLIKCTVGRSSLKSKL (서열번호 13)일 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 야생형 요산산화효소가 Candida Utilis 유래 요산산화효소인 경우, 그 서브유닛의 아미노산 서열은 N말단에서 C말단 방향으로,
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(서열번호 14) 일 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 야생형 요산산화효소가 Arthrobacter globiformis 유래 요산산화효소인 경우, 그 서브유닛의 아미노산 서열은 N말단에서 C말단 방향으로,
MTATAETSTGTKVVLGQNQYGKAEVRLVKVTRNTARHEIQDLNVTSQLRGDFEAAHTAGDNAHVVATDTQKNTVYAFARDGFATTEEFLLRLGKHFTEGFDWVTGGRWAAQQFFWDRINDHDHAFSRNKSEVRTAVLEISGSEQAIVAGIEGLTVLKSTGSEFHGFPRDKYTTLQETTDRILATDVSARWRYNTVEVDFDAVYASVRGLLLKAFAETHSLALQQTMYEMGRAVIETHPEIDEIKMSLPNKHHFLVDLQPFGQDNPNEVFYAADRPYGLIEATIQREGSRADHPIWSNIAGFC (서열번호 15)일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 요산산화효소는 미생물 유래 요산산화효소 및 포유류 유래 요산산화효소를 포함한다.
상기 야생형 요산산화효소와 마찬가지로, 상기 요산산화효소 변이체도 4개의 서브유닛를 포함하는 사량체 단백질이다. 상기 요산산화효소 변이체는 1개 내지 4개의 요산산화효소 서브유닛 변이체를 포함하며, 상기 요산산화효소 서브유닛 변이체는 그 원형이 되는 야행성 요산산화효소 서브유닛에서 하나 이상의 아미노산이 비천연 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 한다. 일 실시양태에서, 상기 요산산화효소 변이체는 1개의 요산산화효소 서브유닛 변이체, 및 3개의 야생형 요산산화효소 서브유닛을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 요산산화효소 변이체는 2개의 요산산화효소 서브유닛 변이체, 및 1개의 야생형 요산산화효소 서브유닛을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 요산산화효소 변이체는 3개의 요산산화효소 서브유닛 변이체, 및 1개의 야생형 요산산화효소 서브유닛을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 요산산화효소 변이체는 4개의 요산산화효소 서브유닛 변이체를 포함할 수 있다.
요산산화효소 서브유닛 변이체 (Uox subunit variant)
요산산화효소 서브유닛 변이체 서브유닛은 하나 이상의 비천연아미노산을 포함한다. 비천연아미노산은 제2 클릭화학작용기와 클릭화학반응을 할 수 있는 제1 클릭화학작용기를 포함한다. 요산산화효소 변이체 서브유닛에 포함된 비천연 아미노산은 섹션 '비천연 아미노산'에서 상세히 설명된다.
요산산화효소 서브유닛 변이체에서 비천연 아미노산 치환 위치
일 실시양태에서, 요산산화효소 서브유닛 변이체는 서열번호 13의 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산이 비천연 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 일 실시양태에서, 상기 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 13의 아미노산 서열의 8번째 타이로신(tyrosine), 16번째 타이로신, 30번째 타이로신, 46번째 타이로신, 65번째 타이로신, 79번째 페닐알라닌(phenylalanine), 87번째 페닐알라닌, 91번째 타이로신, 106번째 트립토판, 120번째 페닐알라닌, 159번째 페닐알라닌, 160번째 트립토판, 162번째 페닐알라닌, 167번째 타이로신, 174번째 트립토판, 186번째 트립토판, 188번째 트립토판, 191번째 페닐알라닌, 204번째 페닐알라닌, 208번째 트립토판, 219번째 페닐알라닌, 233번째 타이로신, 251번째 타이로신, 258번째 타이로신, 259번째 페닐알라닌, 265번째 트립토판 및 279번째 페닐알라닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기가 비천연 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 보다 더 구체적으로, 서열번호 13의 아미노산 서열의 160번째 트립토판, 또는 174번째 트립토판 중 선택되는 하나 이상의 잔기가 비천연 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 13의 아미노산 서열의 137번째 글리신, 22번째 글루탐산, 92번째 아스파라긴, 23번째 리신, 295번째 세린, 113번째 글리신, 273번째 리신, 171번째 리신, 240번째 알라닌, 89번째 글루탐산, 266번째 리신, 24번째 트레오닌, 48번째 리신, 192번째 세린, 202번째 프롤린, 110번째 아스파르트산, 243번째 글루타민, 195번째 글루타민, 138번째 리신, 115번째 프롤린, 199번째 세린, 272번째 글리신, 리신4, 112번째 아스파르트산, 267번째 글리신, 114번째 리신, 70번째 글루타민, 174번째 트립토판, 223번째 아스파라긴, 41번째 글루탐산, 261번째 아스파르트산, 25번째 글리신, 52번째 세린, 241번째 아르기닌, 213번째 글루탐산, 274번째 아스파라긴, 221번째 글루탐산, 206번째 알라닌, 236번째 글루탐산, 164번째 아르기닌, 269번째 글루타민, 136번째 글루탐산, 259번째 글루탐산, 246번째 글루탐산, 49번째 알라닌, 148번째 글리신, 19번째 히스티딘, 296번째 세린, 및 47번째 트레오닌 중 선택된 하나 이상의 아미노산이 비천연 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 여기서, 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 요산산화효소 서브유닛은 Aspergillus Flavus 유래 요산산화효소 서브유닛이다.
다른 실시양태에서, 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 14의 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산이 비천연 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 일 실시양태에서, 상기 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 14의 아미노산 서열의 10번째 타이로신(tyrosine), 163번째 타이로신(tyrosine), 17번째 페닐알라닌(phenylalanine), 45번째 페닐알라닌, 59번째 타이로신, 77번째 트립토판(tryptophan), 82번째 페닐알라닌 (phenylalanine), 90번째 페닐알라닌(phenylalanine), 94번째 타이로신, 109번째 트립토판(tryptophan), 112번째 타이로신, 123번째 페닐알라닌, 136번째 타이로신, 137번째 타이로신, 143번째 타이로신, 162번째 페닐알라닌, 163번째 타이로신, 165번째 타이로신, 170번째 페닐알라닌, 189번째 트립토판, 191번째 트립토판, 200번째 타이로신, 211번째 페닐알라닌,215번째 타이로신, 226번째 페닐알라닌, 239번째 페닐알라닌, 253번째 타이로신, 257번째 타이로신, 264번째 타이로신, 265번째 페닐알라닌, 271번째 트립토판, 281번째 페닐알라닌, 및 282번째 타이로신 중 선택되는 하나 이상의 잔기가 비천연아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 보다 더 구체적으로, 서열번호 14의 아미노산 서열의 163번째 타이로신(tyrosine), 170번째 페닐알라닌 (phenylalanine), 200번째 타이로신, 및 271번째 트립토판(tryptophan) 중 선택되는 하나 이상의 잔기가 비천연 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 14의 아미노산 서열의 301번째 트레오닌, 26번째 아스파라긴, 303번째 류신, 194번째 리신, 95번째 세린, 140번째 세린, 116번째 글리신, 302번째 리신, 167번째 리신, 115번째 아스파르트산, 299번째 글루탐산, 24번째 프롤린, 271번째 트립토판, 277번째 아스파르트산, 169번째 아스파르트산, 118번째 프롤린, 177번째 트레오닌, 174번째 글루타민, 208번째 리신, 275번째 글루탐산, 266번째 류신, 273번째 글리신, 200번째 티로신, 92번째 글루탐산, 247번째 글루탐산, 228번째 류신, 300번째 리신, 204번째 리신, 51번째 글루탐산, 207번째 아스파르트산, 117번째 리신, 250번째 시스테인, 175번째 프롤린, 270번째 리신, 268번째 아스파르트산, 44번째 글리신, 193번째 아스파라긴, 164번째 글리신, 73번째 트레오닌, 29번째 리신, 230번째 아스파라긴, 25번째 글루타민, 216번째 아스파라긴, 55번째 세린, 28번째 리신, 6번째 세린, 27번째 프롤린, 298번째 리신, 113번째 알라닌, 213번째 아스파라긴, 220번째 글루탐산, 141번째 글리신, 163번째 티로신, 253번째 티로신, 178번째 아스파르트산, 93번째 리신, 103번째 리신, 144번째 리신, 139번째 아르기닌, 138번째 리신, 세린7, 151번째 아스파르트산, 297번째 아르기닌, 272번째 리신, 278번째 아스파라긴, 및 265번째 페닐알라닌 중 선택된 하나 이상의 아미노산이 비천연 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 여기서, 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 요산산화효소 서브유닛은 Candida Utilis 유래 요산산화효소 서브유닛이다.
다른 실시양태에서, 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 15의 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산이 비천연 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 일 실시양태에서, 상기 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 15의 아미노산 서열의 20번째 타이로신, 52번째 페닐알라닌, 75번째 타이로신, 77번째 페닐알라닌, 82번째 페닐알라닌, 88번째 페닐알라닌, 96번째 페닐알라닌, 100번째 페닐알라닌, 102번째 트립토판, 108번째 트립토판, 113번째 페닐알라닌, 114번째 페닐알라닌, 115번째 트립토판, 125번째 페닐알라닌, 163번째 페닐알라닌, 166번째 페닐알라닌, 171번째 타이로신, 190번째 트립토판, 192번째 타이로신, 199번째 페닐알라닌, 203번째 타이로신, 214번째 페닐알라닌, 227번째 타이로신, 253번째 페닐알라닌, 260번째 페닐알라닌, 269번째 페닐알라닌, 270번째 타이로신, 276번째 타이로신, 295번째 트립토판, 및 301번째 페닐알라닌 중 선택된 하나 이상의 아미노산이 비천연 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 15의 아미노산 서열의 80번째 아스파르트산, 82번째 페닐알라닌, 100번째 페닐알라닌, 101번째 아스파르트산, 114번째 페닐알라닌, 119번째 아스파라긴, 120번째 아스파르트산, 142번째 세린, 143번째 글루탐산, 175번째 글리신, 195번째 발린, 196번째 글루탐산, 218번째 히스티딘, 238번째 프롤린 중 선택된 하나 이상의 아미노산이 비천연 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 서열번호 15의 아미노산 서열의 196번째 글루탐산 (tyrosine) 잔기가 비천연 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 여기서, 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 요산산화효소 서브유닛은 Arthrobacter globiformis 유래 요산산화효소 서브유닛이다.
일 실시양태에서, 요산산화효소 변이체 서브유닛은 하기의 서열 중 어느 하나의 서열을 가질 수 있다:
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MTATAETSTGTKVVLGQNQYGKAEVRLVKVTRNTARHEIQDLNVTSQLRGDFEAAHTAGDNAHVVATDTQKNTVYAFARDGFATTEEFLLRLGKHFTEGFDWVTGGRWAAQQFFWDRINDHDHAFSRNKSEVRTAVLEISGSEQAIVAGIEGLTVLKSTGSEFHGFPRDKYTTLQETTDRILATDVSARWRYNTXEVDFDAVYASVRGLLLKAFAETHSLALQQTMYEMGRAVIETHPEIDEIKMSLPNKHHFLVDLQPFGQDNPNEVFYAADRPYGLIEATIQREGSRADHPIWSNIAGFC (서열번호 110);
MTATAETSTGTKVVLGQNQYGKAEVRLVKVTRNTARHEIQDLNVTSQLRGDFEAAHTAGDNAHVVATDTQKNTVYAFARDGFATTEEFLLRLGKHFTEGFDWVTGGRWAAQQFFWDRINDHDHAFSRNKSEVRTAVLEISGSEQAIVAGIEGLTVLKSTGSEFHGFPRDKYTTLQETTDRILATDVSARWRYNTVXVDFDAVYASVRGLLLKAFAETHSLALQQTMYEMGRAVIETHPEIDEIKMSLPNKHHFLVDLQPFGQDNPNEVFYAADRPYGLIEATIQREGSRADHPIWSNIAGFC(서열번호 111);
MTATAETSTGTKVVLGQNQYGKAEVRLVKVTRNTARHEIQDLNVTSQLRGDFEAAHTAGDNAHVVATDTQKNTVYAFARDGFATTEEFLLRLGKHFTEGFDWVTGGRWAAQQFFWDRINDHDHAFSRNKSEVRTAVLEISGSEQAIVAGIEGLTVLKSTGSEFHGFPRDKYTTLQETTDRILATDVSARWRYNTVEVDFDAVYASVRGLLLKAFAETXSLALQQTMYEMGRAVIETHPEIDEIKMSLPNKHHFLVDLQPFGQDNPNEVFYAADRPYGLIEATIQREGSRADHPIWSNIAGFC(서열번호 112); 및
MTATAETSTGTKVVLGQNQYGKAEVRLVKVTRNTARHEIQDLNVTSQLRGDFEAAHTAGDNAHVVATDTQKNTVYAFARDGFATTEEFLLRLGKHFTEGFDWVTGGRWAAQQFFWDRINDHDHAFSRNKSEVRTAVLEISGSEQAIVAGIEGLTVLKSTGSEFHGFPRDKYTTLQETTDRILATDVSARWRYNTVEVDFDAVYASVRGLLLKAFAETHSLALQQTMYEMGRAVIETHXEIDEIKMSLPNKHHFLVDLQPFGQDNPNEVFYAADRPYGLIEATIQREGSRADHPIWSNIAGFC(서열번호 113).
이때 X는 비천연아미노산 잔기를 나타낸다. 특정한 실시양태에서, X는 frTet 또는 Azf일 수 있다.
기능성 폴리펩티드 변이체 예시 (2)
전술한 바와 같이, 기능성 폴리펩티드 변이체는 하나 이상의 기능을 가지는 폴레펩티드의 변이체이며, 기능성 폴리펩티드 변이체는, 예를 들어, 요산산화효소 변이체, 요산산화효소 서브유닛 변이체, GLP1 변이체, hGH 변이체, GFP 변이체, 또는 sfGFP 변이체일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 이하에서, 기능성 폴리펩티드 변이체의 다양한 예시를 개시한다.
일 실시양태에서, 기능성 폴리펩티드는 GLP1 또는 이의 유사체일 수 있고, GLP1 유사체는 하기의 서열 중 어느 하나의 서열을 가질 수 있다:
HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG (서열번호 16);
HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG (서열번호 17); 및
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG (서열번호 18).
일 실시양태에서, 기능성 폴리펩티드 변이체는 GLP1 변이체일 수 있고, GLP1 변이체는 GLP1 또는 GLP1 유사체의 아미노산 서열의 어느 하나 이상의 아미노산이 비천연아미노산으로 치환된 것일 수 있다.
일 실시양태에서, 기능성 폴리펩티드 변이체는 GLP1 변이체일 수 있고, GLP1 변이체는 하기의 서열 중 어느 하나의 서열을 가질 수 있다:
HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRX (서열번호 19);
HGEGTFTSDXSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG (서열번호 20);
HGEGTFTSDVSSXLEGQAAKEFIAWLVKGRG (서열번호 21);
HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEXIAWLVKGRG (서열번호 22);
HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRX (서열번호 23);
HAEGTFTSDXSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG (서열번호 24);
HAEGTFTSDVSSXLEGQAAKEFIAWLVRGRG (서열번호 25);
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEXIAWLVRGRG (서열번호 26);
HGEGTFTSDXSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG (서열번호 27);
HGEGTFTSDVSSXLEGQAAKEFIAWLVRGRG (서열번호 28);
HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEXIAWLVRGRG (서열번호 29);
HGEGTFTSDXSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRX (서열번호 30);
HGEGTFTSDVSSXLEGQAAKEFIAWLVKGRX (서열번호 31);
HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEXIAWLVKGRX (서열번호 32);
HAEGTFTSDXSSXLEGQAAKEFIAWLVRGRG (서열번호 33);
HAEGTFTSDXSSYLEGQAAKEXIAWLVRGRG (서열번호 34);
HAEGTFTSDVSSXLEGQAAKEXIAWLVRGRG (서열번호 35);
HGEGTFTSDXSSXLEGQAAKEFIAWLVRGRG (서열번호 36);
HGEGTFTSDXSSXLEGQAAKEFIAWLVKGRX (서열번호 37);
HGEGTFTSDXSSYLEGQAAKEXIAWLVKGRX (서열번호 38);
HGEGTFTSDVSSXLEGQAAKEXIAWLVKGRX (서열번호 39);
HGEGTFTSDXSSYLEGQAAKEXIAWLVRGRG (서열번호 40);
HGEGTFTSDVSSXLEGQAAKEXIAWLVRGRG (서열번호 41);
HAEGTFTSDXSSXLEGQAAKEXIAWLVRGRG (서열번호 42); 및
HGEGTFTSDXSSXLEGQAAKEXIAWLVRGRG (서열번호 43).
이때, 아미노산 서열은 N 말단에서 C 말단 방향으로 개시된다. 이때 X는 비천연아미노산이다. 특정한 실시양태에서, X는 frTet 또는 Azf일 수 있다.
일 실시양태에서, GLP1 변이체는 서열번호 19 내지 서열번호 43 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 의 서열 동일성(identity)을 가지는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
일 실시양태에서, 기능성 폴리펩티드는 hGH일 수 있다. hGH는 하기의 서열의 아미노산 서열을 가질 수 있다:
FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF (서열번호 44).
일 실시양태에서, 기능성 폴리펩티드 변이체는 hGH 변이체일 수 있고, hGH 변이체는 hGH의 서열의 어느 하나 이상의 아미노산이 비천연아미노산으로 치환된 것일 수 있다.
일 실시양태에서, 기능성 폴리펩티드 변이체는 hGH 변이체일 수 있고, hGH 변이체는 하기의 서열 중 어느 하나의 서열을 가질 수 있다:
FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYXEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF (서열번호 45);
FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAXIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF (서열번호 46);
FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSXCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF (서열번호 47);
FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSXSIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF (서열번호 48);
FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREXTQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF (서열번호 49);
FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQXKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF (서열번호 50);
FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLXLLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF (서열번호 51);
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FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVXGSCGF (서열번호 67).
이때, 아미노산 서열은 N 말단에서 C 말단 방향으로 개시된다. 이때 X는 비천연아미노산이다. 특정한 실시양태에서, X는 frTet 또는 Azf일 수 있다.
일 실시양태에서, hGH 변이체는 서열번호 45 내지 서열번호 67 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 의 서열 동일성(identity)을 가지는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
일 실시양태에서, 기능성 폴리펩티드는 sfGFP일 수 있다. sfGFP는 하기의 서열의 아미노산 서열을 가질 수 있다:
GSMSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDEL (서열번호 68).
일 실시양태에서, 기능성 폴리펩티드 변이체는 sfGFP 변이체일 수 있고, sfGFP 변이체는 sfGFP의 서열의 어느 하나 이상의 아미노산이 비천연아미노산으로 치환된 것일 수 있다.
일 실시양태에서, 기능성 폴리펩티드 변이체는 sfGFP 변이체일 수 있고, sfGFP 변이체는 하기의 서열 중 어느 하나의 서열을 가질 수 있다:
GSMSKGEXLFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDEL (서열번호 69);
GSMSKGEELFXGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDEL (서열번호 70);
GSMSKGEELFTGXVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDEL (서열번호 71);
GSMSKGEELFTGVVPILVELDGDVNXHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDEL (서열번호 72);
GSMSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHXFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDEL (서열번호 73);
GSMSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDAXNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDEL (서열번호 74);
GSMSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATXGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDEL (서열번호 75);
GSMSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICXTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDEL (서열번호 76);
GSMSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPXHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDEL (서열번호 77);
GSMSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFXDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDEL (서열번호 78);
GSMSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYXTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDEL (서열번호 79);
GSMSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEXDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDEL (서열번호 80);
GSMSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELXGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDEL (서열번호 81);
GSMSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIXFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDEL (서열번호 82);
GSMSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEXGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDEL (서열번호 83);
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GSMSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEXGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDEL (서열번호 87);
GSMSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGXGPVLLPDNHYLSTQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDEL (서열번호 88);
GSMSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPXLLPDNHYLSTQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDEL (서열번호 89);
GSMSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDXHYLSTQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDEL (서열번호 90);
GSMSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSVLSKDXNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDEL (서열번호 91); 및
GSMSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAXITHGMDEL (서열번호 92).
이때, 아미노산 서열은 N 말단에서 C 말단 방향으로 개시된다. 이때 X는 비천연아미노산이다. 특정한 실시양태에서, X는 frTet 또는 Azf일 수 있다.
일 실시양태로, sfGFP 변이체는 서열번호 69 내지 92 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 의 서열 동일성(identity)을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트의 구조
기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트의 구조 개괄
전술한 바와 같이, 본 출원의 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트는 화학식 1의 구조를 갖는다:
[화학식 1]
FPV-[J1-A2-J2-P1]a
화학식 1에서, FPV는 기능성 폴리펩티드 변이체 유닛이다. 기능성 폴리펩티드 변이체 유닛의 예시는 기능성 폴리펩티드 변이체와 관련된 섹션에서 상세히 설명된다.
화학식 1에서, J1은 제1 접합 유닛이다. 제1 접합 유닛은 기능성 폴리펩티드 변이체에 포함된 제1 클릭화학작용기와, 제1 클릭화학작용기와 클릭화학반응을 할 수 있는 제2 클릭화학작용기의 클릭화학반응에 의해 형성된 구조를 갖는다. 제1 클릭화학작용기 및 제2 클릭화학작용기 각각은 관련된 섹션에서 상세히 설명된다.
화학식 1에서, A2는 제2 앵커 유닛이다. 컨쥬게이트에서, 제2 앵커 유닛은 기능성 폴리펩티드 변이체 유닛과 알부민 유닛을 연결하는 구성을 지칭한다. 제2 앵커 유닛은 기능성 폴리펩티드 변이체 유닛과 알부민 유닛 사이의 거리를 조절하는 역할을 한다. 당해 분야에서 거리조절을 위해 통상적으로 사용되는 구조라면, 크게 제한되지 않는다. 제2 앵커 유닛은 링커로부터 유래된다. 제2 앵커 유닛은 섹션 '링커: APN 그룹을 포함함'에서 상세히 설명되며 하기에서 또한 설명된다.
화학식 1에서, J2는 제2 접합 유닛이다. 제2 접합 유닛은 APN 그룹과 알부민의 티올기의 반응에 의해 형성된 구조를 갖는다.
화학식 1에서, a는 1 이상 8이하의 정수이다. 특정한 실시양태에서, a는 1 이상 4이하의 정수이다.
이하에서, 제2 앵커 유닛, 제1 접합 유닛 및 제2 접합 유닛 각각에 대하여 상세히 설명한다.
제2 앵커 유닛
화학식 1에서, A2는 제2 앵커 유닛이다. 전술한 바와 같이 제2 앵커 유닛은 링커로부터 유래된다.
일 실시양태에서, 제2 앵커 유닛은 하나 이상의 헤테로 원자를 포함하는, 치환된 탄화수소 사슬이다. 특정한 실시양태에서, 탄화수소 사슬은 1 내지 500개의 원자로 구성될 수 있다. 이때 상기 헤테로 원자는, 각각 독립적으로, N, O, 및 S 중에서 선택될 수 있다. 이때 상기 치환은 하나 이상의 비수소 치환기로 치환된 것으로, 상기 비수소 치환기는, 각각 독립적으로, 할로겐, C1-3알킬, -NH2, =O, 및 =S 로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다. 일 실시양태에서, 제2 앵커 유닛은 복수의 에틸렌글리콜 단위체로 구성된 폴리에틸렌글리콜 유닛을 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 제2 앵커 유닛은 치환 또는 비치환된 C1-50알킬렌, 치환 또는 비치환된 C1-50헤테로알킬렌, -치환 또는 비치환된 C1-20알킬렌-[EG]n-, -치환 또는 비치환된 C1-20헤테로알킬렌-[EG]n-, -치환 또는 비치환된 C1-20알킬렌-[EG]n-치환 또는 비치환된 C1-20알킬렌-, -치환 또는 비치환된 C1-20알킬렌-[EG]n-치환 또는 비치환된 C1-20헤테로알킬렌-, 및 -치환 또는 비치환된 C1-20헤테로알킬렌-[EG]n-치환 또는 비치환된 C1-20헤테로알킬렌- 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 이때, 상기 헤테로알킬렌은 -NH-, -O-, -S-, -O-N=, -S(=O)-, 및 -S(=O)2-로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 헤테로원자 그룹, 또는 O, N, 및 S로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하고, 헤테로원자 그룹 또는 헤테로원자는 각각 독립적으로 선택될 수 있다. 이때, 상기 치환은 하나 이상의 비수소 치환기로 치환된 것으로, 상기 비수소 치환기는 할로겐, C1-3알킬, -NH2, =O, 및 =S 로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고, 비수소 치환기는 각각 독립적으로 선택될 수 있다. 이때, EG는 에틸렌글리콜 단위체를 의미하며, -OCH2CH2- 또는 -CH2OCH2-의 구조를 갖는다. 이때, n은 1이상 12 이하의 정수일 수 있다.
특정한 실시양태에서, 제2 앵커 유닛은 치환된 -C5-15 헤테로알킬렌-[EG]n-치환된 C1-5 헤테로알킬렌일 수 있다. 이때, 상기 헤테로알킬렌은 -NH-, -O-, -S-, -O-N=, -S(=O)-, 및 -S(=O)2-로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 헤테로원자 그룹, 또는 O, N, 및 S로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하고, 헤테로원자 그룹 또는 헤테로원자는 각각 독립적으로 선택될 수 있다. 이때, 상기 치환은 하나 이상의 비수소 치환기로 치환된 것으로, 상기 비수소 치환기는 할로겐, C1-3알킬, -NH2, =O, 및 =S 로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고, 비수소 치환기는 각각 독립적으로 선택될 수 있다. 이때, EG는 에틸렌글리콜 단위체를 의미하며, -OCH2CH2- 또는 -CH2OCH2-의 구조를 갖는다. 이때, n은 1이상 6 이하의 정수일 수 있다.
특정한 실시양태에서, 제2 앵커 유닛은 치환된 C5-15 헤테로알킬렌일 수 있다. 이때, 상기 헤테로알킬렌은 -NH-, -O-, -S-, -O-N=, -S(=O)-, 및 -S(=O)2-로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 헤테로원자 그룹, 또는 O, N, 및 S로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하고, 헤테로원자 그룹 또는 헤테로원자는 각각 독립적으로 선택될 수 있다. 이때, 상기 치환은 하나 이상의 비수소 치환기로 치환된 것으로, 상기 비수소 치환기는 할로겐, C1-3알킬, -NH2, =O, 및 =S 로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고, 비수소 치환기는 각각 독립적으로 선택될 수 있다.
일 실시양태에서, -A2-는 -A21-A22-A23-일 수 있다.
이때 A21은 결합(bond), -CH2CH2OC(=O)NH-, -CH2OC(=O)NH-, -OC(=O)NH-, -C(=O)NH-, -NH- 또는 -C(=O)- 일 수 있다.
이때 A22는 결합(bond), 치환 또는 비치환된 C1-12 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C1-12 헤테로알킬렌, -치환 또는 비치환된 C1-12알킬렌-[EG]n-, -치환 또는 비치환된 C1-12-헤테로알킬렌-[EG]n-, -치환 또는 비치환된 C1-12알킬렌-[EG]n-치환 또는 비치환된 C1-12알킬렌-, -치환 또는 비치환된 C1-12헤테로알킬렌-[EG]n-치환 또는 비치환된 C1-12알킬렌-, 및 -치환 또는 비치환된 C1-12헤테로알킬렌-[EG]n-치환 또는 비치환된 C1-12헤테로알킬렌- 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 이때, 상기 헤테로알킬렌은 -NH-, -O-, -S-, -O-N=, -S(=O)-, 및 -S(=O)2-로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 헤테로원자 그룹, 또는 O, N, 및 S로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하고, 헤테로원자 그룹 또는 헤테로원자는 각각 독립적으로 선택될 수 있다. 이때, 상기 치환은 하나 이상의 비수소 치환기로 치환된 것으로, 상기 비수소 치환기는 할로겐, C1-3알킬, -NH2, =O, 및 =S 로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고, 비수소 치환기는 각각 독립적으로 선택될 수 있다. 이때, EG는 에틸렌글리콜 단위체를 의미하며, -OCH2CH2- 또는 -CH2OCH2-의 구조를 갖는다. 이때, n은 2이상 6 이하의 정수일 수 있다.
이때 A23은 결합(bond), -CH2CH2OC(=O)NH-, -CH2OC(=O)NH-, -OC(=O)NH-, -C(=O)NH-, -NH- 또는 -C(=O)- 일 수 있다.
이때 A21, A22, 및 A23 모두가 동시에 결합(bond)인 경우는 존재하지 않는다.
일 실시양태에서, 제2 앵커 유닛은 하기의 구조 중 어느 하나의 구조를 가질 수 있다:
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000034
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000035
.
이때, n은 2 이상 8 이하의 정수일 수 있다.
이때, 이때, 일 실시양태에서, 3'은 제1 접합 유닛과의 부착부(attachment site)일 수 있다. 이때, 4'은 제2 접합 유닛과의 부착부(attachment site)일 수 있다.
이때, 이때, 다른 실시양태에서, 3'은 제2 접합 유닛과의 부착부(attachment site)일 수 있다. 이때, 4'은 제1 접합 유닛과의 부착부(attachment site)일 수 있다.
제1 접합 유닛
화학식 1에서, J1은 제1 접합 유닛이다.
제1 접합 유닛은 제1 클릭화학작용기와 제2 클릭화학작용기의 클릭화학반응에 의해 형성된 구조를 갖는다. 예를 들어, 제1 접합 유닛은 기능성 폴리펩티드 변이체의 비천연 아미노산 잔기에 포함된 제1 클릭화학작용기와 링커의 일 말단의 제2 클릭화학작용기의 클릭화학반응에 의해 형성된 구조를 가질 수 있다.
일 실시양태에서 제1 클릭화학작용기는 말단 알킨 (terminal alkyne), 아자이드 (azide), 스트레인된 알킨(strained alkyne), 다이엔 (diene), 친다이엔체 (dienophile), 트랜스 시클로옥틴(trans-cyclooctene), 알켄 (alkene), 티올 (thiol), 테트라진 (tetrazine), 트리아진(triazine), DBCO(dibenzocyclooctyne) 및 비시클로노닌(bicyclononyne, bicyclo[6.1.0]non-4-yne)을 포함) 그룹 중에서 선택된 어느 하나의 그룹을 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제1 클릭화학작용기는 테트라진, 트리아진, 및 아자이드 그룹 중 어느 하나의 그룹을 포함할 수 있다. 일 실시양태에서 제2 클릭화학작용기는 말단 알킨 (terminal alkyne), 아자이드 (azide), 스트레인된 알킨(strained alkyne), 다이엔 (diene), 친다이엔체 (dienophile), 트랜스 시클로옥틴(trans-cyclooctene), 알켄 (alkene), 티올 (thiol), 테트라진 (tetrazine), 트리아진(triazine), DBCO(dibenzocyclooctyne) 및 비시클로노닌(bicyclononyne, bicyclo[6.1.0]non-4-yne)을 포함) 그룹 중에서 선택된 어느 하나의 그룹을 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제2 클릭화학작용기는 TCO, DBCO, 및 비시클로노닌 그룹 중 어느 하나의 그룹을 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 제1 접합 유닛은 하기의 구조 중 어느 하나의 구조를 가질 수 있다:
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000036
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000037
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000038
이때, R1은 H, 할로겐, C1-3알킬, C3-6 시클로알킬, C3-6 헤테로시클로알킬, 아릴, 및 헤테로아릴 중에 선택되는 어느 하나이고, 이때, 상기 헤테로시클로알킬, 또는 헤테로아릴은 -NH-, -O-, -S-, -O-N=, -S(=O)-, 및 -S(=O)2-로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 헤테로원자 그룹, 또는 O, N, 및 S로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함할 수 있다.
이때, 일 실시양태에서, 1'은 기능성 폴리펩티드 변이체와의 부착부(attachment site)일 수 있다. 보다 구체적으로, 1'은 제1 앵커 유닛과의 부착부(attachment site)일 수 있다. 이때, 2'은 링커의 다른 구조와의 부착부(attachment site)일 수 있다. 보다 구체적으로, 2'은 제2 앵커 유닛과의 부착부(attachment site)일 수 있다.
이때, 다른 실시양태에서, 1'은 링커의 다른 구조와의 부착부(attachment site)일 수 있다. 보다 구체적으로 1'은 제2 앵커 유닛과의 부착부(attachment site)일 수 있다. 이때, 2'은 기능성 폴리펩티드 변이체와의 부착부(attachment site)일 수 있다. 보다 구체적으로, 2'은 제1 앵커 유닛과의 부착부(attachment site)일 수 있다.
제2 접합 유닛
화학식 1에서, J2는 제2 접합 유닛이다.
제2 접합 유닛은 APN 그룹과 티올기의 반응에 의해 형성된 구조를 갖는다. 예를 들어, 제2 접합 유닛은 알부민의 티올기와 링커의 일 말단의 APN 그룹의 반응에 의해 형성된 구조를 가질 수 있다. 일 실시양태에서, 알부민의 티올기는 Cys 34의 티올기일 수 있다.
일 실시양태에서, 제2 접합 유닛은 하기의 구조 중 어느 하나의 구조를 가질 수 있다:
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000039
, 및
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000040
.
이때 S 원자는 알부민으로부터 유래된 것일 수 있다. 구체적으로, S 원자는 알부민의 시스테인 잔기로부터 유래될 수 있다. 보다 구체적으로, S 원자는 알부민의 시스테인 잔기의 티올기로부터 유래된 것일 수 있다. 특정한 실시양태에서, S 원자는 알부민의 34번 시스테인 (Cys 34)의 티올기로부터 유래된 것일 수 있다.
기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트의 구체예
이하에서는, 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트의 구체예를 개시한다.
본 출원의 일 실시양태에 따른 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트는 하기의 화학식 중 어느 하나의 화학식의 구조를 가질 수 있다:
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000041
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000042
이때, FPV는 기능성 폴리펩티드 변이체 유닛이다. 기능성 폴리펩티드 유닛은 기능성 폴리펩티드 변이체로부터 유래된 것일 수 있다. 전술한 바와 같이, 기능성 폴리펩티드 변이체는 기능성 폴리펩티드가 비천연 아미노산을 포함하도록 변형된 것이다. 일 실시양태에서, 기능성 폴리펩티드는 요산산화효소, 요산산화효소 서브유닛, 글루카곤유사펩타이드 1 또는 이의 유사체, 인간성장호르몬, 및 녹색형광단백질 중 선택되는 어느 하나일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일 실시양태에서, 기능성 폴리펩티드는 서열번호 13 내지 서열번호 15, 서열번호 16, 44, 및 68 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열과 약 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%의 서열 동일성(identity)을 가지는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일 실시양태에서, 기능성 폴리펩티드 변이체는 요산산화효소 변이체, 요산산화효소 서브유닛 변이체, 글루카곤유사펩타이드 1 변이체, 인간성장호르몬 변이체, 녹색형광단백질 변이체, sfGFP 변이체 중 선택되는 어느 하나일 수 있다. 즉, 기능성 폴리펩티드 변이체 유닛은 요산산화효소 변이체 유닛, 요산산화효소 서브유닛 변이체 유닛, 글루카곤유사펩타이드 1 변이체 유닛, 인간성장호르몬 변이체 유닛, 녹색형광단백질 변이체 유닛, sfGFP 변이체 유닛 중 선택되는 어느 하나일 수 있다. 기능성 폴리펩티드 및 기능성 폴리펩티드 변이체는 관련 단락에서 상세히 설명된다.
이때, P1은 알부민 유닛이다. 알부민 유닛은 알부민으로부터 유래된 것일 수 있다. 일 실시양태에서, 알부민은 인간 혈청 알부민 (human serum albumin; HSA), 소혈청알부민 (bovine serum albumin; BSA), 오브알부민, 기타 척추동물의 알부민, 및 이들의 변이체 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 이들은 야생형 또는 재조합 형태(재조합 알부민)일 수 있다. 일 실시양태에서, 알부민은 서열번호 01 내지 서열번호 12 중 어느 하나의 서열로 표시되는 아미노산 서열과 약 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100%의 서열 동일성(identity)을 가지는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
이때, 알부민 유닛에 인접한 S 원자는 알부민으로부터 유래된다. 일 실시양태에서 알부민 유닛에 인접한 S 원자는 알부민의 티올기로부터 유래된다. 일 실시양태에서, 알부민 유닛에 인접한 S 원자는 알부민의 시스테인 잔기의 티올기로부터 유래될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 알부민 유닛에 인접한 S 원자는 인간 혈청 알부민의 34번 시스테인의 티올기로부터 유래된 것일 수 있다.
이때, n은 1 이상 12 이하의 정수일 수 있다. 특정한 실시양태에서, n은 2 이상 6 이하의 정수일 수 있다.
이때, a는 1 이상 8 이하의 정수일 수 있다. 특정한 실시양태에서, a는 1 이상 4 이하의 정수일 수 있다.
기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트의 제조
기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트의 제조 개괄
본 출원의 일 실시양태로, 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트의 제조방법이 제공된다. 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트는 기능성 폴리펩티드 변이체, 알부민, 및 링커가 반응하여 제조될 수 있다. 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트는 (1) 알부민과 링커가 반응하여 알부민-링커 컨쥬게이트가 제조되고, 이후 기능성 폴리펩티드 변이체와 제조된 알부민-링커 컨쥬게이트가 반응하여 제조될 수 있거나; 또는 (2) 링커와 기능성 폴리펩티드 변이체가 반응하여 기능성 폴리펩티드 변이체-링커 컨쥬게이트가 제조되고, 이후 알부민과 제조된 기능성 폴리펩티드 변이체-링커 컨쥬게이트가 반응하여 제조될 수 있다. 또는, 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트는 3 요소(링커, 기능성 폴리펩티드 변이체, 알부민)의 반응 순서와 무관하게 제조될 수 있다.
기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트를 제조하기 위해서는 기능성 폴리펩티드 변이체가 필요하다. 이하에서, 기능성 폴리펩티드 변이체의 제조 방법을 요산산화효소 변이체의 예시를 통해 설명한다.
기능성 폴리펩티드 변이체의 제조 예시 - 요산산화효소 변이체 제조 예시
비천연 아미노산을 포함하는 요산산화효소 변이체를 생산하기 위해, 야생형 요산산화효소의 아미노산 서열에서 하나 이상의 잔기를 비천연아미노산으로 변경할 수 있다. 이를 위해, 본래 요산산화효소의 구조와 기능에 가능한 영향을 미치지 않는 최적의 위치를 결정하는 것이 필요하다. 일 실시양태에서, 상기 위치는 페닐알라닌, 트립토판, 타이로신 중에서 선택될 수 있다. 일 실시양태에서, 상기 위치는 세린, 리신, 알라닌, 프롤린, 트립토판, 아스파르트산, 페닐알라닌, 글루타민, 트립토판, 글루탐산, 히스티딘, 및 프롤린 중에서 선택될 수 있다. 또한, 링커와의 효율적인 결합이 이루어지게 하기 위해 높은 용매 접근성을 가지는 위치 중에서 선택될 수 있다.일 실시양태에서, 요산산화효소 변이체를 만들기 위해 상기 야생형 요산산화효소 서열 중 비천연 아미노산으로 치환하는 위치는 분자 모델링 시뮬레이션 결과를 참조하여 결정할 수 있다. 구체적으로, 상기 분자 모델링 시뮬레이션 결과는 Rosetta 분자 모델링 패키지의 스코어링 결과일 수 있다.
일 실시양태로, 상기 비천연 아미노산으로의 변경은 서열번호 13의 아미노산 서열의 하나 이상의 잔기가 치환되는 것일 수 있다. 구체적인 일 실시양태로, 서열번호 13의 아미노산 서열의 8번째 타이로신(tyrosine), 16번째 타이로신, 30번째 타이로신, 46번째 타이로신, 65번째 타이로신, 79번째 페닐알라닌(phenylalanine), 87번째 페닐알라닌, 91번째 타이로신, 106번째 트립토판, 120번째 페닐알라닌, 159번째 페닐알라닌, 160번째 트립토판, 162번째 페닐알라닌, 167번째 타이로신, 174번째 트립토판, 186번째 트립토판, 188번째 트립토판, 191번째 페닐알라닌, 204번째 페닐알라닌, 208번째 트립토판, 219번째 페닐알라닌, 233번째 타이로신, 251번째 타이로신, 258번째 타이로신, 259번째 페닐알라닌, 265번째 트립토판 및 279번째 페닐알라닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기가 비천연 아미노산으로 치환되는 것일 수 있다. 보다 더 구체적인 일 실시양태로, 서열번호 13의 아미노산 서열의 160번째 트립토판, 또는 174번째 트립토판 중 선택되는 하나 이상의 잔기가 비천연 아미노산으로 치환되는 것일 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 13의 아미노산 서열의 137번째 글리신, 22번째 글루탐산, 92번째 아스파라긴, 23번째 리신, 295번째 세린, 113번째 글리신, 273번째 리신, 171번째 리신, 240번째 알라닌, 89번째 글루탐산, 266번째 리신, 24번째 트레오닌, 48번째 리신, 192번째 세린, 202번째 프롤린, 110번째 아스파르트산, 243번째 글루타민, 195번째 글루타민, 138번째 리신, 115번째 프롤린, 199번째 세린, 272번째 글리신, 리신4, 112번째 아스파르트산, 267번째 글리신, 114번째 리신, 70번째 글루타민, 174번째 트립토판, 223번째 아스파라긴, 41번째 글루탐산, 261번째 아스파르트산, 25번째 글리신, 52번째 세린, 241번째 아르기닌, 213번째 글루탐산, 274번째 아스파라긴, 221번째 글루탐산, 206번째 알라닌, 236번째 글루탐산, 164번째 아르기닌, 269번째 글루타민, 136번째 글루탐산, 259번째 글루탐산, 246번째 글루탐산, 49번째 알라닌, 148번째 글리신, 19번째 히스티딘, 296번째 세린, 및 47번째 트레오닌 중 선택된 하나 이상의 아미노산이 비천연 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.
또 다른 일 실시양태로, 서열번호 14의 아미노산 서열의 하나 이상의 잔기가 비천연 아미노산으로 치환되는 것일 수 있다. 구체적인 일 실시양태로, 서열번호 14의 아미노산 서열의 10번째 타이로신(tyrosine), 163번째 타이로신(tyrosine), 17번째 페닐알라닌(phenylalanine), 45번째 페닐알라닌, 59번째 타이로신, 77번째 트립토판(tryptophan), 82번째 페닐알라닌 (phenylalanine), 90번째 페닐알라닌(phenylalanine), 94번째 타이로신, 109번째 트립토판(tryptophan), 112번째 타이로신, 123번째 페닐알라닌, 136번째 타이로신, 137번째 타이로신, 143번째 타이로신, 162번째 페닐알라닌, 163번째 타이로신, 165번째 타이로신, 170번째 페닐알라닌, 189번째 트립토판, 191번째 트립토판, 200번째 타이로신, 211번째 페닐알라닌,215번째 타이로신, 226번째 페닐알라닌, 239번째 페닐알라닌, 253번째 타이로신, 257번째 타이로신, 264번째 타이로신, 265번째 페닐알라닌, 271번째 트립토판, 281번째 페닐알라닌, 및 282번째 타이로신 중 선택되는 하나 이상의 잔기가 비천연아미노산으로 치환되는 것일 수 있다. 보다 더 구체적인 일 실시양태로, 서열번호 14의 아미노산 서열의 163번째 타이로신(tyrosine), 170번째 페닐알라닌 (phenylalanine), 200번째 타이로신, 및 271번째 트립토판(tryptophan) 중 선택되는 하나 이상의 잔기가 비천연 아미노산으로 치환되는 것일 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 요산산화효소 변이체 서브유닛은 서열번호 14의 아미노산 서열의 301번째 트레오닌, 26번째 아스파라긴, 303번째 류신, 194번째 리신, 95번째 세린, 140번째 세린, 116번째 글리신, 302번째 리신, 167번째 리신, 115번째 아스파르트산, 299번째 글루탐산, 24번째 프롤린, 271번째 트립토판, 277번째 아스파르트산, 169번째 아스파르트산, 118번째 프롤린, 177번째 트레오닌, 174번째 글루타민, 208번째 리신, 275번째 글루탐산, 266번째 류신, 273번째 글리신, 200번째 티로신, 92번째 글루탐산, 247번째 글루탐산, 228번째 류신, 300번째 리신, 204번째 리신, 51번째 글루탐산, 207번째 아스파르트산, 117번째 리신, 250번째 시스테인, 175번째 프롤린, 270번째 리신, 268번째 아스파르트산, 44번째 글리신, 193번째 아스파라긴, 164번째 글리신, 73번째 트레오닌, 29번째 리신, 230번째 아스파라긴, 25번째 글루타민, 216번째 아스파라긴, 55번째 세린, 28번째 리신, 6번째 세린, 27번째 프롤린, 298번째 리신, 113번째 알라닌, 213번째 아스파라긴, 220번째 글루탐산, 141번째 글리신, 163번째 티로신, 253번째 티로신, 178번째 아스파르트산, 93번째 리신, 103번째 리신, 144번째 리신, 139번째 아르기닌, 138번째 리신, 세린7, 151번째 아스파르트산, 297번째 아르기닌, 272번째 리신, 278번째 아스파라긴, 및 265번째 페닐알라닌 중 선택된 하나 이상의 아미노산이 비천연 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.
또 다른 일 실시양태로, 서열번호 15의 아미노산 서열의 하나 이상의 잔기가 비천연 아미노산으로 치환되는 것일 수 있다. 구체적인 일 실시양태로, 서열번호 15의 아미노산 서열의 80번째 아스파르트산, 82번째 페닐알라닌, 100번째 페닐알라닌, 101번째 아스파르트산, 114번째 페닐알라닌, 119번째 아스파라긴, 120번째 아스파르트산, 142번째 세린, 143번째 글루탐산, 175번째 글리신, 195번째 발린, 196번째 글루탐산, 218번째 히스티딘, 238번째 프롤린 중 선택된 하나 이상의 아미노산이 비천연 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 보다 더 구체적인 일 실시양태로, 196번째 글루탐산 잔기가 비천연 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 또 다른 일 실시양태로, 서열번호 15의 아미노산 서열의 20번째 타이로신, 52번째 페닐알라닌, 75번째 타이로신, 77번째 페닐알라닌, 82번째 페닐알라닌, 88번째 페닐알라닌, 96번째 페닐알라닌, 100번째 페닐알라닌, 102번째 트립토판, 108번째 트립토판, 113번째 페닐알라닌, 114번째 페닐알라닌, 115번째 트립토판, 125번째 페닐알라닌, 163번째 페닐알라닌, 166번째 페닐알라닌, 171번째 타이로신, 190번째 트립토판, 192번째 타이로신, 199번째 페닐알라닌, 203번째 타이로신, 214번째 페닐알라닌, 227번째 타이로신, 253번째 페닐알라닌, 260번째 페닐알라닌, 269번째 페닐알라닌, 270번째 타이로신, 276번째 타이로신, 295번째 트립토판, 및 301번째 페닐알라닌 중 선택된 하나 이상의 아미노산이 비천연 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.
이하에서는 기능성 폴리펩티드 변이체의 예시로 요산산화효소 변이체의 제조 방법의 예시를 개시한다.
상기 요산산화효소 변이체의 제조방법에는 다음 구성 요소가 관여된다: 요산산화효소 변이체를 발현시킬 세포주; 특정 종결 코돈을 인식하는 외래 유래 suppressor tRNA(foreign suppressor tRNA); 외래 유래 tRNA 합성효소(foreign tRNA synthetase); 및 상기 종결코돈을 이용하여 비천연 아미노산을 암호화한, 요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터. 여기서, 상기 외래 유래 suppressor tRNA 및 상기 외래 유래 tRNA 합성효소는, 상기 발현 세포주 고유의 suppressor tRNA 및 tRNA 합성효소가 아니라, 발현 세포주와 다른 세포에서 유래된 것이다. 따라서, 상기 외래 유래 suppressor tRNA는 상기 발현 세포주 고유의 tRNA 합성효소와 반응하지 않는 것을 특징으로 한다. 상기 외래 유래 tRNA 합성효소는, i) 상기 외래 유래 suppressor tRNA와만 반응하며, ii) 상기 요산산화효소 변이체에 포함시킬 비천연 아미노산에만 활성을 보인다. 결과적으로, 상기 외래 유래 tRNA 합성효소를 사용하는 경우, 상기 외래 유래 suppressor tRNA에 상기 비천연 아미노산을 특이적으로 연결시켜 아미노산 서열 내 상기 비천연 아미노산을 도입할 수 있다.
상기 요산산화효소 변이체의 제조방법은 1) 상기 세포주 내에서, 2) 상기 외래 유래 suppressor tRNA 및 외래 유래 tRNA 합성효소가 관여되어, 3) 상기 요산산화효소 변이체를 암호화하는 벡터에 기반해, 4) 상기 요산산화효소 변이체가 발현되도록 하는 방법이다. 상기 요산산화효소 변이체 제조방법에서, 상기 세포주 내 상기 요산산화효소 변이체가 발현될 수 있다면 각 과정의 순서는 특별히 제한되지 않으며, 필요에 따라 추가적인 과정을 포함할 수 있다.
요산산화효소 변이체 제조 예시 - 요산산화효소 변이체 발현 세포주
상기 요산산화효소 변이체의 제조방법은 상기 요산산화효소 변이체를 세포주 내에서 발현시켜 수득하는 것을 특징으로 한다. 상기 요산산화효소 변이체 발현 세포주는 상기 요산산화효소 변이체를 생산할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 다만, 상기 세포주 내 종결 코돈을 인식하는 release facotr가 제 기능을 하는 경우, 상기 release factor가 상기 외래 유래 tRNA와 경쟁적으로 작용하게 되어 수율이 떨어지는 문제가 있다. 따라서, 종결 코돈을 인식하는 release factor가 비활성화 된 세포주를 사용하는 것이 바람직하다.
일 구현예로, 상기 요산산화효소 변이체를 발현시키는 세포주는 다음에서 선택된 것일 수 있다:
에스케리키아 (Escherichia) 속; 어위니아 (Erwinia) 속; 세라티아 (Serratia) 속; 프로비덴시아 (Providencia) 속; 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속; 슈도모나스 (Pseudomonas) 속; 렙토스피라 (Leptospira) 속; 살모넬라 (Salmonellar) 속; 브레비박테리움 (Brevibacterium) 속; 하이포모나스 (Hyphomonas) 속; 크로모박테리움 (chromobactorium) 속; 노카디아 (norcardia) 속; 펀자이류 (Fungi); 및 효모류 (Yeast).
일 구현예로, 상기 세포주는 종결 코돈을 인식하여 번역을 종결시키는 release factor가 비활성화 된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 종결 코돈은 엠버 코돈(ambber codon; 5'-UAG-3'), 오커 코돈(ocher codon; 5'-UAA-3'), 및 오팔 코돈(opal codon; 5'-UGA-3') 중 선택된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 요산산화효소 변이체를 발현시키는 세포주는 등록공보 KR 1637010 B1에서 사용된 세포주일 수 있다. 구체적으로, 상기 세포주는 E.Coli C321.ΔA.exp(Addgene, ID:49018) 일 수 있다.
요산산화효소 변이체 제조 예시 - 외래 유래 suppressor tRNA
상기 외래 유래 suppressor tRNA는 특정 종결코돈을 인식하는 기능을 하는 tRNA이며, 발현 세포주 고유의 tRNA 합성 효소와는 반응하지 않는다. 상기 외래 유래 suppressor tRNA는 상기 외래 유래 tRNA 합성효소와 특이적으로 반응하며, 상기 외래 유래 tRNA 합성효소는 상기 외래 유래 suppressor tRNA에 비천연 아미노산을 연결시키는 기능을 한다. 결과적으로, 상기 외래 유래 suppressor tRNA는 상기 특정 종결코돈을 인식해서, 해당 위치에 상기 비천연 아미노산을 도입할 수 있다.
일 구현예로, 상기 suppressor tRNA는 엠버 코돈(ambber codon; 5'-UAG-3'), 오커 코돈(ocher codon; 5'-UAA-3'), 및 오팔 코돈(opal codon; 5'-UGA-3') 중 선택된 것을 인식할 수 있다. 바람직하게, 상기 suppressor tRNA는 엠버 코돈을 인식하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 suppressor tRNA는 Methanococcus jannaschii 유래의 suppressor tRNA (MjtRNATyr CUA)일 수 있다 (Yang et.al, Temporal Control of Efficient In Vivo Bioconjugation Using a Genetically Encoded Tetrazine-Mediated Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reaction, Bioconjugate Chemistry, 2020, 2456-2464). 바람직하게, 상기 tRNA 합성효소는 상기 MjTyrRS의 C11 변형체일 수 있다.
요산산화효소 변이체 제조 예시 - 직교적 tRNA/합성효소 페어 (Orthogonal tRNA/syntetase pair)
본 명세서에서는, 1) 외래 유래 tRNA 합성효소와만 특이적으로 반응하는 외래 유래 suppressor tRNA, 및 2) 상기 외래 유래 tRNA 합성효소를 통틀어 직교적 tRNA/합성효소 페어이라 일컫는다. 본 명세서에서 개시하는 요산산화효소 변이체의 제조방법에 있어, 상기 발현 세포주 내에서 상기 직교적 tRNA/합성효소 페어를 발현시키는 것이 중요하며, 이러한 목적을 달성할 수 있다면 그 방법은 크게 제한되지 않는다. 일 구현예로, 상기 요산산화효소 변이체의 제조방법은 상기 직교적 tRNA/합성효소 페어를 발현할 수 있는 벡터를 상기 세포주에 형질전환하는 것을 포함한다. 구체적으로, 상기 직교적 tRNA/합성효소 페어를 발현할 수 있는 벡터는 Yang et.al (Temporal Control of Efficient In Vivo Bioconjugation Using a Genetically Encoded Tetrazine-Mediated Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reaction, Bioconjugate Chemistry, 2020, 2456-2464)에 개시된 pDule_C11일 수 있다. 이하에서, 기능성 폴리펩티드 변이체를 암호화하는 벡터에 대하여 설명한다.
요산산화효소 변이체 제조 예시 - 기능성 폴리펩티드 변이체를 암호화하는 벡터
본 출원에서는 기능성 폴리펩티드 변이체를 암호화하는 벡터를 개시한다. 상기 기능성 폴리펩티드 변이체를 암호화하는 벡터는 상기 기능성 폴리펩티드 변이체 서열 중 비천연아미노산을 종결 코돈을 사용하여 암호화한 것을 특징으로 한다. 일 구현예로, 상기 기능성 폴리펩티드 변이체를 암호화하는 벡터는 상기 기능성 폴리펩티드 변이체 서열 중, 표준 아미노산은 자연계에서 발견되는 상기 표준 아미노산과 대응되는 코돈으로 암호화하고, 비천연아미노산은 종결 코돈으로 암호화한 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 종결 코돈은 엠버 코돈(ambber codon; 5'-UAG-3'), 오커 코돈(ocher codon; 5'-UAA-3'), 및 오팔 코돈(opal codon; 5'-UGA-3') 중 선택된 것일 수 있다. 또 다른 예를 들어, 상기 종결 코돈은 5'-TAG-3', 5'-TAA-3', 및 5'-TGA-3' 중 선택된 것일 수 있다. 일 실시양태로, 상기 기능성 폴리펩티드 변이체를 암호화하는 벡터는 상기 발현 세포주 코돈 최적화된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 기능성 폴리펩티드 변이체를 암호화하는 벡터는 대장균 코돈 최적화된 것일 수 있다.
비천연 아미노산을 포함하는 요산산화효소 변이체의 생산을 위한 발현 벡터 제작 및 생산 균주에 관한 내용의 다른 예시는 대한민국등록특허공보 10-1637010에 기재되어 있으며, 해당 내용은 본 명세서에 참조로 통합된다.
기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트의 제조 예시 (1)
전술한 바와 같이, 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트는 하기의 방법을 통해 제조될 수 있다:
1) 링커 및 알부민이 반응하여 알부민-링커 컨쥬게이트가 제조됨; 및
2) 알부민-링커 컨쥬게이트와 기능성 폴리펩티드 변이체가 반응하여 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트가 제조됨.
이하에서, 1) 링커 및 알부민의 반응을 설명한다.
상기 링커는 알부민의 특정 아미노산 잔기를 통해 연결될 수 있다.
일 실시양태로, 시스테인 잔기를 통해 알부민과 연결될 수 있으며, 상기 연결은 링커의 APN 그룹과 알부민의 시스테인 잔기와의 반응에 의해 형성될 수 있다. 특정한 실시예에서, 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)에 포함된 시스테인의 티올기와 링커의 APN 그룹이 반응하여 알부민-링커 컨쥬게이트가 제조될 수 있다. 특정한 실시예에서, 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)의 34번 시스테인 (Cys 34)의 티올기와 링커의 APN 그룹이 반응하여 알부민-링커 컨쥬게이트가 제조될 수 있다.
이하에서, 2) 알부민-링커 컨쥬게이트와 기능성 폴리펩티드 변이체의 반응을 설명한다.
상기 반응으로부터 기능성 폴리펩티드 변이체가 링커를 통해 연결된, 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트가 제조될 수 있다. 알부민-링커 컨쥬게이트 일 말단의 클릭화학작용기와 기능성 폴리펩티드 변이체의 비천연아미노산에 포함된 클릭화학작용기가 반응하여 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트가 제조될 수 있다. 일 실시양태에서, 알부민-링커 컨쥬게이트의 일 말단의 제2 클릭화학작용기와 기능성 폴리펩티드 변이체의 제1 클릭화학작용기가 반응하여 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트가 제조될 수 있다.
일 실시양태에서, 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트는 다음을 포함하는 방법을 통해 제조될 수 있다:
알부민-링커 컨쥬게이트와 기능성 폴리펩티드 변이체가 반응하여 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트가 제조됨.
기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트의 제조 예시 (2)
전술한 바와 같이, 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트는 하기의 방법을 통해 제조될 수 있다:
1) 링커 및 기능성 폴리펩티드 변이체가 반응하여 기능성 폴리펩티드 변이체-링커 컨쥬게이트가 제조됨; 및
2) 기능성 폴리펩티드 변이체-링커 컨쥬게이트와 알부민이 반응하여 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트가 제조됨.
이하에서, 1) 링커 및 기능성 폴리펩티드의 반응을 설명한다.
일 실시양태로, 링커의 일 말단의 클릭화학작용기와 기능성 폴리펩티드 변이체의 비천연아미노산의 클릭화학작용기의 클릭화학반응에 의해 기능성 폴리펩티드 변이체-링커 컨쥬게이트가 제조될 수 있다. 일 실시양태에서, 링커의 일 말단의 제2 클릭화학작용기와 기능성 폴리펩티드 변이체에 포함된 제1 클릭화학작용기가 반응하여 기능성 폴리펩티드 변이체-링커 컨쥬게이트가 제조될 수 있다.
이하에서, 2) 기능성 폴리펩티드 변이체-링커 컨쥬게이트와 알부민의 반응을 설명한다.
일 실시양태로, 시스테인 잔기를 통해 알부민과 연결될 수 있으며, 상기 연결은 기능성 폴리펩티드 변이체-링커 컨쥬게이트의 APN 그룹과 알부민의 시스테인 잔기와의 반응에 의해 형성될 수 있다. 특정한 실시예에서, 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)에 포함된 시스테인의 티올기와 기능성 폴리펩티드 변이체-링커 컨쥬게이트의 APN 그룹이 반응하여 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트가 제조될 수 있다. 특정한 실시예에서, 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA)의 34번 시스테인 (Cys 34)의 티올기와 기능성 폴리펩티드 변이체-링커 컨쥬게이트의 APN 그룹이 반응하여 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트가 제조될 수 있다.
일 실시양태에서, 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트는 다음을 포함하는 방법을 통해 제조될 수 있다:
기능성 폴리펩티드 변이체-링커 컨쥬게이트와 알부민이 반응하여 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트가 제조됨.
알부민-링커 컨쥬게이트
알부민-링커 컨쥬게이트 개괄
전술한 바와 같이, 링커와 알부민의 반응을 통해 알부민-링커 컨쥬게이트가 제조될 수 있다. 본 출원의 일 실시양태는 알부민-링커 컨쥬게이트를 제공한다.
일 실시양태에서, 알부민-링커 컨쥬게이트는 화학식 4의 구조를 가질 수 있다:
[화학식 4]
H2-A2-J2-P1
화학식 4에서, H2는 제2 클릭화학작용기이다. 제2 클릭화학작용기는 클릭화학작용기를 포함한다. 제2 클릭화학작용기는 제2 클릭화학작용기와 클릭화학반응을 할 수 있는 제1 클릭화학작용기와 클릭화학 반응을 할 수 있다. 제2 클릭화학작용기와 제1 클릭화학작용기의 클릭화학반응에 의해 제1 접합 유닛이 형성된다. 제2 클릭화학작용기는 관련된 섹션에서 상세히 설명된다.
화학식 4에서, A2는 제2 앵커 유닛이다. 알부민-링커 컨쥬게이트에서 제2 앵커 유닛은 제2 클릭화학작용기와 제2 접합 유닛 및/또는 알부민 유닛을 연결하는 구성을 지칭할 수 있다. 당해 분야에서 거리조절을 위해 통상적으로 사용되는 구조라면, 크게 제한되지 않는다. 제2 앵커 유닛은 링커로부터 유래된다. 제2 앵커 유닛은 섹션 '링커:APN 그룹을 포함함'을 포함하는 제2 앵커 유닛과 관련된 섹션에서 상세히 설명된다.
화학식 4에서, J2는 제2 접합 유닛이다. 전술한 바와 같이, 제2 접합 유닛은 APN 그룹과 티올기의 반응에 의해 형성된 구조를 갖는다. 예를 들어, 제2 접합 유닛은 알부민의 티올기와 링커의 일 말단의 APN 그룹의 반응에 의해 형성된 구조를 가질 수 있다. 일 실시양태에서, 알부민의 티올기는 34번 시스테인(Cys 34)의 티올기일 수 있다. 제2 접합 유닛은 섹션 '제2 접합 유닛'을 포함하는 제2 접합 유닛과 관련된 섹션에서 상세히 설명된다.
화학식 4에서, P1은 알부민 유닛이다. 알부민 유닛은 알부민으로부터 유래된다. 알부민 및 알부민 유닛 각각은 섹션 '알부민 및 알부민 유닛'을 포함하는 알부민 유닛과 관련된 섹션에서 상세히 설명된다.
알부민-링커 컨쥬게이트의 구체예
이하에서, 알부민-링커 컨쥬게이트의 구체예를 개시한다.
본 출원의 일 실시양태에 따른 알부민-링커 컨쥬게이트는 하기의 화학식 중 어느 하나의 화학식의 구조를 가질 수 있다:
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000043
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000044
이때, P1은 알부민 유닛이다.
기능성 폴리펩티드 변이체-링커 컨쥬게이트
기능성 폴리펩티드 변이체-링커 컨쥬게이트 개괄
전술한 바와 같이, 링커와 기능성 폴리펩티드 변이체의 반응을 통해 기능성 폴리펩티드 변이체-링커 컨쥬게이트가 제조될 수 있다. 본 출원의 일 실시양태는 기능성 폴리펩티드 변이체-링커 컨쥬게이트를 제공한다.
일 실시양태에서, 기능성 폴리펩티드 변이체-링커 컨쥬게이트는 화학식 5의 구조를 가질 수 있다:
[화학식 5]
FPV-[J1-A2-J2-B]a
화학식 5에서, FPV는 기능성 폴리펩티드 변이체 유닛이다. 기능성 폴리펩티드 변이체 유닛은 기능성 폴리펩티드 변이체로부터 유래된다. 기능성 폴리펩티드 변이체 및 기능성 폴리펩티드 변이체 유닛 각각은 관련된 섹션에서 상세히 설명된다.
화학식 5에서, J1은 제1 접합 유닛이다. 제1 접합 유닛은 섹션 '제1 접합 유닛'을 포함하는 제1 접합 유닛과 관련된 섹션에서 상세히 설명된다.
화학식 5에서, A2는 제2 앵커 유닛이다. 제2 앵커 유닛은 섹션 '링커:APN 그룹을 포함함'을 포함하는 제2 앵커 유닛과 관련된 섹션에서 상세히 설명된다.
화학식 5에서, J2는 제2 접합 유닛이다. 제2 접합 유닛은 섹션 '제2 접합 유닛'을 포함하는 제2 접합 유닛과 관련된 섹션에서 상세히 설명된다.
화학식 5에서, B는 APN 그룹이다. APN 그룹은 섹션 '링커:APN 그룹을 포함함'을 포함하는 APN 그룹과 관련된 섹션에서 상세히 설명된다.
화학식 5에서, a는 1 이상 8 이하의 정수일 수 있다. 특정한 실시양태에서, a는 1 이상 4 이하의 정수일 수 있다.
기능성 폴리펩티드 변이체-링커 컨쥬게이트 구체예
이하에서, 기능성 폴리펩티드 변이체-링커 컨쥬게이트의 구체예를 개시한다.
본 출원의 일 실시양태에 따른 기능성 폴리펩티드 변이체-링커 컨쥬게이트는 하기의 화학식 중 어느 하나의 화학식의 구조를 가질 수 있다:
[화학식 5-1]
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000045
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000046
이때, FPV는 기능성 폴리펩티드 변이체 유닛이다.
이때, a는 1 이상 8 이하의 정수일 수 있다. 특정한 실시양태에서, a는 1 이상 4 이하의 정수일 수 있다.
기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트의 용도
기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트의 용도 개괄
본 출원의 일 실시양태는 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트를 유효성분을 포함하는 표적 질환의 치료하기 위한 조성물을 제공한다. 본 출원의 일 실시양태는 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트를 유효성분을 포함하는 표적 질환의 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다. 여기서, 표적 질환은 기능성 폴리펩티드 변이체와 관련된 질환일 수 있다. 보다 구체적으로, 표적 질환은 기능성 폴리펩티드 변이체를 이용하여 치료할 수 있는 질환일 수 있다.
본 출원의 다른 실시양태로, 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트를 유효성분으로 포함하는 진단용 조성물이 제공될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "치료"란 본 출원에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 표적 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변형되는 모든 행위를 의미하고, 표적 질환의 예방을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "예방"이란 본 출원에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 표적 질환을 억제시키거나 표적 질환의 발명을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 출원의 약학적 조성물은 상기 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트를 유효 성분으로 포함하는 것 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본 출원에서 사용될 수 있는 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 말토덱스트린, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
또한, 본 출원의 약학적 조성물은 필요한 경우, 부형제, 희석제, 항산화제, 완충액 또는 정균제 등 기타 약학적으로 허용 가능한 첨가제들을 첨가하여 사용할 수 있으며, 충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제, 분산제, 계면 활성제, 결합제 또는 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 사용할 수 있다.
본 출원에서 사용된 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 출원의 약학 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 출원의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 출원의 약학적 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여를 위한 적합하고 다양한 제형으로 제제화되어 사용될 수 있다.
본 출원의 약학적 조성물을 이용한 경구 투여용 제제의 비제한적인 예로는, 트로키제 (troches), 로젠지 (lozenge), 정제, 수용성 현탁액, 유성 현탁액, 조제 분말, 과립, 에멀젼, 하드 캡슐, 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제 등을 들 수 있다.
본 출원의 약학적 조성물을 경구 투여용으로 제제화하기 위하여, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴 등과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트 등과 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분 등과 같은 붕해제; 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌 글리콜 왁스 등과 같은 윤활유 등을 사용할 수 있으며, 감미제, 방향제, 시럽제 등도 사용할 수 있다. 나아가 캡슐제의 경우에는 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체 등을 추가로 사용할 수 있다.
본 출원의 약학적 조성물을 이용한 비경구용 제제의 비제한적인 예로는, 주사액, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 연고, 도포용 파우더, 오일, 크림 등을 들 수 있다.
본 출원의 약학적 조성물을 비경구 투여용으로 제제화하기 위하여, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조 제제, 외용제 등을 사용할 수 있으며, 상기 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 출원의 약학적 조성물을 주사액으로 제제화하는 경우, 본 출원의 약학적 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 (ampoule) 또는 바이알 (vial)의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다.
본 출원의 약학적 조성물을 에어로졸제로 제제화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합할 수 있다.
본 출원의 약학적 조성물을 연고, 크림, 도포용 파우더, 오일, 피부 외용제 등으로 제제화하는 경우에는, 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등을 담체로 사용하여 제제화할 수 있다.
본 출원의 약학적 조성물의 약학적 유효량, 유효 투여량은 약학적 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로 등에 의해 다양해질 수 있으며, 약학 조성물의 투여로 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 투여 대상이 되는 개체의 종류, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 질병의 증세나 정도, 성별, 식이, 배설, 해당 개체에 동시 또는 이시에 함께 사용되는 약물 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 약학적 조성물의 일일 투여량은 0.01 내지 1000mg/kg이고, 바람직하게는 0.1 내지 100mg/kg이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.
본 출원의 약학적 조성물의 투여는 하루에 1회 투여될 수 있고, 수회에 나누어 투여될 수도 있다. 본 출원의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양으로 투여할 수 있으며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 출원의 약학적 조성물의 투여 경로 및 투여 방식은 각각 독립적일 수 있으며, 목적하는 해당 부위에 상기 약학적 조성물이 도달할 수 있는 한, 특별한 제한없이 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다. 상기 약학적 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다.
본 출원의 약학적 조성물의 비경구 투여 방법으로는, 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 경피 투여 또는 피하 투여 등을 이용할 수 있으며, 상기 조성물을 질환 부위에 도포하거나 분무, 흡입하는 방법 또한 이용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 약학적 조성물은 표적 질환을 예방 또는 치료하기 위하여 추가적으로 호르몬 치료, 약물 치료 등의 다양한 방법들과 병용하여 사용될 수 있다.
기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트의 용도 예시 (1): 요산산화효소 변이체-알부민 컨쥬게이트의 용도
기능성 폴리펩티드 변이체로 요산산화효소 변이체 또는 요산산화효소 서브유닛 변이체가 사용되는 경우, 요산산화효소 변이체-알부민 컨쥬게이트 또는 요산산화효소 서브유닛 변이체-알부민 컨쥬게이트가 제공될 수 있다. 나아가, 본 출원의 일 실시양태는 요산산화효소 변이체-알부민 컨쥬게이트를 포함하는 표적 질환의 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다. 나아가, 본 출원의 일 실시양태는 요산산화효소 서브유닛 변이체-알부민 컨쥬게이트를 포함하는 표적 질환의 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다.
일 실시양태에서, 표적 질환은 종양용해증후군(tumor lysis syndrome, TLS), 고요산혈증, 통풍, 관절내 요산염 결정의 침착, 요산염 결정의 침착으로 인한 급성 통풍성 관절염, 요로 결석증, 신결석증 및 통풍성 신병증 중에 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
종양용해증후군(tumor lysis syndrome, TLS)은 항암제 투여 후 종양세포의 급격한 파괴로 인해, 세포 내 요산, 칼륨, 인이 혈류로 유리되어 발생한다. 요산 배설이 현저히 증가하면 요세관에 요산 결정이 침전되고, 이로 인해 요세관이 폐쇄되어 신부전이 유발될 수 있다. 이와 같이 종양용해증후군 환자는 대사이상으로 상태가 빠르게 악화될 수 있다. 이때, 종양용해증후군에서 가장 흔한 대상이상으로 알려져 있는 것이 고요산혈증이다.
고요산혈증 (Hyperuricemia)이란 혈액에 요산의 농도가 증가되어 있는 질환이다. 이는 혈청에서 모노소디움 요산염의 농도가 제한된 용해도의 한계를 넘을 때 발생한다. 37℃에서 혈장의 요산 포화도는 약 7 mg/dl이다. 그러므로 이 농도를 넘으면 물리화학적으로 과포화 상태가 된다. 혈청 요산 농도는 정상인의 평균 혈청 요산 농도보다 +2 표준편차를 초과한 경우에 상대적으로 높은 것으로 알려져 있다. 대부분의 역학 조사에서 남자의 상위 한계는 7 mg/dl, 여자는 6 mg/dl이다. 이러한 이유 때문에 고요산혈증의 실질적인 상위 한계 수준은 7.0 mg/dl 이상인 경우로 정의되고 있다.
본 출원에 있어서, 상기 고요산혈증 및 고요산혈증 관련 대사 장애는 요산이 정상 수치보다 많아져서 신장이 요산을 배설시키는 능력이 저하될 경우 혈액 중에 여분의 요산이 남아있게 되고 혈중 요산치가 높아져 발생되는 질환이나 질병을 말한다.
구체적으로, 상기 고요산혈증 관련 대사 장애에는 통풍, 요산 결정, 관절내 요산염 결정의 침착, 요산염 결정의 침착으로 인한 급성 통풍성 관절염, 단일 관절성 관절염, 염증성 관절염의 통증 발작, 요로 결석증, 신결석증 및 통풍성 신병증이 포함된다. 장기적인 신결석증 및 통풍성 신병증은 신장 손상 및 신부전의 위험을 증가시키는 것으로 알려져 있다.
상기 통풍은 통상적으로 급성 염증성 관절염의 재발성 발작을 특징으로 하는 의학적 상태이며, 엄지 발가락 기저부의 중족-지골 관절에서 흔하게 발생한다. 또한, 통풍은 관절, 힘줄 및 주변 조직들 내에서 결정화되고 침착 되는 혈중 요산에 의해 유발되며, 통풍 결절, 신장 결석 또는 요산염 신병증으로서 존재할 수도 있다.
기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트의 용도 예시 (2): GLP1 변이체-알부민 컨쥬게이트의 용도
기능성 폴리펩티드 변이체로 GLP1 변이체가 사용되는 경우, GLP1 변이체-알부민 컨쥬게이트가 제공될 수 있다. 나아가, 본 출원의 일 실시양태는 GLP1 변이체-알부민 컨쥬게이트를 포함하는 표적 질환의 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다.
일 실시양태에서, 표적 질환은 당뇨, 지속형 당뇨, 비만, 제2형 당뇨, 당뇨병 전증(prediabetes), 간질환, 대사질환, 및 심혈관질환 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트의 용도 예시 (3): hGH 변이체-알부민 컨쥬게이트의 용도
기능성 폴리펩티드 변이체로 hGH 변이체가 사용되는 경우, hGH 변이체-알부민 컨쥬게이트가 제공될 수 있다. 나아가, 본 출원의 일 실시양태는 hGH 변이체-알부민 컨쥬게이트를 포함하는 표적 질환의 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다.
일 실시양태에서, 표적 질환은 성장호르몬 결핍증(Growth hormone deficiency; GHD)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트의 용도 예시 (4): sfGFP 변이체-알부민 컨쥬게이트의 용도
기능성 폴리펩티드 변이체로 sfGFP가 사용되는 경우, sfGFP 변이체-알부민 컨쥬게이트가 제공될 수 있다. 나아가, 본 출원의 일 실시양태는 sfGFP 변이체-알부민 컨쥬게이트를 포함하는 진단용 조성물을 제공한다.
일 실시양태에서, 상기 진단용 조성물은 표적 질환의 진단을 위한 조성물일 수 있다. 일 실시양태에서, 상기 진단용 조성물은 알부민 요구 암세포의 진단을 위한 조성물일 수 있다.
이하, 실험예 또는 실시예를 통해 본 출원이 제공하는 발명에 대해 더욱 상세히 설명한다. 이들 실험예는 오로지 본 출원에 의해 개시되는 내용을 예시하기 위한 것으로, 본 명세서에 의해 개시되는 내용의 범위가 이들 실험예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실험예
재료
FrTet (4-(1,2,3,4-tetazin-3-yl)phenylalanine)은 Aldlab Chemicals (Woburn, MA, USA) 에서 구매되었다. TCO-Cy3는 AAT Bioquest (Sunnyvale, CA, USA)에서 구매되었다. TCO-PEG4-maleidime (TCO-PEG4-MAL) 및 아민-축으로 치환된 TCO (amine-axially substituted TCO; TCO-amine)은 FutureChem(Seoul, Korea)에서 구매되었다. Pentafluorophenyl ester (PFP)-PEG4-APN은 CONJU-PROBE(San Diego, CA, USA)에서 얻었다. Disposable PD-10 desalting column 및 Superdex 200 10/300 GL increase column은 Cytiva (Uppsala, Sweden)에서 구매되었다. Vivaspin 6 centrifugal concentrators with a molecular weight cut-off (MWCO) 10kDa 및 100kDa는 Sartorius(Gottingen, Germany)에서 구매되었다. HSA 및 모든 다른 화학 약품들은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구매되었다.
실험예 1. APN 그룹을 포함하는 링커의 제조
APN 그룹을 포함하는 링커 (1)의 제조
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000047
APN 그룹을 포함하는 링커 (1) (TCO-PEG4-APN, 화합물 a)가 제조되었다.
DMSO에서 TCO-amine을 PFP-PEG4-APN(Pentafluorophenyl ester-PEG4-APN)과 1:1의 몰비로 실온에서 30분동안 반응시켜 TCO-PEG4-APN을 제조하였다.
APN 그룹을 포함하는 링커 (2)의 제조
Figure PCTKR2022014276-appb-img-000048
APN 그룹을 포함하는 링커 (2) (TCO-APN, 화합물 b)가 제조되었다. TCO-NHS ester (A) (33.8mg, 0.127 mmol) (FutureChem, Cat No. FC-6172-A)를 APN-NH2. HCl (36.7mg, 0.140 mmol) (Conju-Probe, Cat No. CP-8003) 및 DIPEA과 (0.07ml, 0.253mmol) DMF 내에서 실온에서 4시간 동안 반응시켜 TCO-APN (화합물 b)를 수득하였다.
- 1H NMR: (400 MHz, CDCl3) δ 9.15 (br s, 1H), 7.72 (d, J = 8 Hz, 2H), 7.62 (d, J = 8 Hz, 2H), 5.73-5.61 (m, 2H), 4.84 (br s, 1H), 4.75-4.73 (m, 1H), 3.30-3.29 (m, 2H), 2.42-2.39 (m, 2H), 2.35-2.30 (m, 1 H), 2.19-2.17 (m, 2H), 2.12-2.10 (m, 1H), 1.89-1.83 (m, 4H), 1.81-1.74 (m, 1H), 1.62-1.58 (m, 3 H))
실험예 2. 비천연아미노산을 포함하는 기능성 폴리펩티드 변이체 (요산산화효소 변이체) 제조
Arthrobacter globiformis 유래 요산산화효소 변이체(AgUox-frTet) 수득을 위한 벡터 제조
Arthrobacter globiformis 유래 요산산화효소(AgUox) 및 그 변이체를 암호화하는 유전자는 Macrogen (Seoul, South Korea)에 의뢰해 합성했다. 야생형 AgUox(AgUox-WT), 또는 비천연 아미노산인 frTet이 서열 내에 도입된 AgUox 변이체 (AgUox-frTet)를 발현시키기 위해, 합성된 상기 유전자를 주형으로 삼고, 프라이머 pBAD-AgUox_F (5'-GCCGCCATGGTGTCTGCTGTGAAGG-3', 서열번호 93) 및 pBAD-AgUox_R (5'-GCCGAGATCTTTAATGGTGATGGTG-3', 서열번호 94)를 사용한 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 통해 증폭했다. 증폭된 유전자를 2개의 제한효소 (NcoI 및 BglIII)로 절단하고, pBAD 벡터의 NcoI 및 BgIII 부위에 상기 유전자를 삽입하여 pBAD_AgUox를 합성하였다. AgUox-WT 서열 내 196번 위치의 글루탐산 코돈을 엠버 코돈 (UAG)로 대체하기 위해, 상기 pBAD-AgUox를 주형으로 사용하고, 프라이머 AgUox-196Amb_F (5'-GTCGAAGTCCACCTATACGGTGTTGTAACGCCAACGG-3' 서열번호 95) 및 AgUox-196Amb_R (5'-CCGTTGGCGTTACAACACCGTATAGGTGGACTTCGAC-3', 서열번호 96)를 사용하여 pBAD-AgUox_196amb를 제조했다.
AgUox-frTet 발현 및 정제
AgUox-frTet을 발현시키기 위해, Yang et.al, Temporal Control of Efficient In Vivo Bioconjugation Using a Genetically Encoded Tetrazine-Mediated Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reaction, Bioconjugate Chemistry, 2020, 2456-2464에 개시된 방법을 참조하여, C321ΔA.exp, pDule_C11, 및 pBAD_AgUox-196amb를 사용하여 아래와 같은 방법으로 AgUox-frTet를 발현시켰다. frTet에 대해 최적화된 MjtRNATyr/MjTyrRS를 포함하는 E.coli 세포를 준비했다. ampicillin (100 μg/mL) 및 tetracycline (10 μg/mL)이 포함된 Luria Broth (LB) 배지에서 배양된 E.coli 세포를 37℃에서 밤새 진탕하면서, 동일 조건 하 2x YT 배지에 접종했다. 진탕 배양 2.5시간 후, 상기 세포를 포함하는 배지가 600 nm에서 광학 밀도 0.5에 도달했을 때, frTet 및 L-(+)-아라비노스를 배지에 첨가하여 최종 농도가 각각 1mM 및 0.4%(w/v)가 되도록 하였다. 이를 5 시간동안 배양한 후, 세포를 5000rpm에서 4℃에서 10분 동안 원심분리하고, AgUox-frTet을 수득했다. 상기 AgUox-frTet을 제조업제의 프로토콜(Qiagen)에 따라 니켈-니트릴로트리아세트산(nickel-nitrilotriacetic acid, Ni-NTA) 아가로스 레진과 함께 패킹된 폴리프로필렌 컬럼을 사용하여 4℃에서 고정 금속 친화성 크로마토그래피(immobilized-metal affinity chromatography)를 통해 정제했다. 상기 정제된 AgUox-frTet은 PD-10 컬럼을 사용하여 PBS(pH 7.4)로 탈염했다. AgUox-WT의 발현 및 정제 과정은 AgUox-frTet과 유사한 방법을 따르되, 발현 단계 동안 배양 배지에 테트라사이클린 및 frTet을 첨가하지 않았다. 배양된 세포 및 정제된 AgUox 변이체에 대하여, tris-glycine gels(5% acrylamide stacking and 12% acrylamide resolving gels)를 사용하여 SDS-PAGE (run at 120V) (running buffer: 25mM Tris, 192mM glycine, 및 0.1% SDS at pH8.3)를 수행하였다. 이때 분자량 표준 마커 (Bio-Rad Laboratories Inc., Berkeley, CA, USA)가 사용되었다.
Uox (AgUox-WT, WT) 및 Uox 변이체 (AgUox-frTet, frTet)의 SDS-PAGE 분석 결과는 도 2 (a) 및 (b)에 개시된다.
도 2 (a)는 AgUox 및 이의 변이체의 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 단백질(CBB-stained protein)을 나타낸다. 도 2 (a)에서 Mw는 분자량; BI는 before induction; AI는 after induction을 의미한다.
도 2 (b)는 AgUox 및 이의 변이체의 CBB 염색된 단백질 겔을 나타낸다.
MALDO-TOF Mass Spectrometry (MS) 분석
상기 제조된 AgUox-frTet 및 AgUox-WT를 확인하기 위해, 이들을 제조업체의 프로토콜에 따라 트립신으로 분해시켰다. 총 0.4mg/mL의 Uox 변이체(AgUox-WT 및 AgUox-frTet)를 37℃에서 밤새 분해한 후 ZipTip C18을 사용하여 탈염했다. 트립신으로 분해된 혼합물을 2,5-디히드록시벤조산(DHB) 매트릭스 용액(30:70(v/v) 아세토니트릴: 물 내 트리플루오로아세트산 0.1% 내 DHB 20mg/mL)과 혼합한 후, Microflex MALDI-TOF/MS 장치(Bruker Corporation, Billerica, MA, USA)를 사용해 분석했다.
MS 분석 결과는 도 3에 개시된다. 도 3 (a)는 트립신 분해된 AgUox-WT의 절편을 나타낸다. AgUox-WT 절편인 YNTVEVDFDAVYASVR (서열번호 97) (residues 192-207)는 AgUox-frTet 절편인 YNTVXVDFDAVYASVR (서열번호 98)과 비교되었다. 이때 X는 frTet을 의미한다. 절편 AVIETPEIDEIKMSLPNK (서열번호 99) (잔기 232-250)의 피크는 컨트롤로 사용되었다.
실험예 3. 요산산화효소 변이체에의 위치 특이적 형광 다이 라벨링
정제된 AgUox-WT 및 AgUox-frTet을 PBS(pH 7.4)에서 실온에서 1:2 몰비로 TCO-Cy3 형광 염료와 반응시켰다. 2시간 후, 반응 혼합물을 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)에 적용하였다. 단백질 겔의 형광 이미지는 ChemiDoc XRS+ 시스템(302 nm에서 일루미네이션, 510-610 nm 필터, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)을 사용하여 수득하였다. 형광분석 후 단백질 겔을 Coomassie Brilliant Blue R-250 염료로 염색하였다. 백색광 조명을 사용하는 ChemiDoc XRS+ 시스템을 사용하여 단백질 겔 이미지를 수득하였다.
제조된 AgUox-WT 및 AgUox-frTet에 대한 형광 다이 라벨링 결과를 도 2 (c)에 나타내었다. 도 2 (c)에서, TCO-Cy3 (-)는 TCO-Cy3 없이 배양한 샘플에 대한 분석 결과를 나타낸다. TCO-Cy3 (+)는 TCO-Cy3와 함께 배양한 샘플에 대한 분석 결과를 나타낸다.
실험예 4. 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트 (요산산화효소 변이체-알부민 컨쥬게이트) 제조
AgUox에서 부위 특이적 알부미네이션을 수행하기 위해, HiTrap Q HP 음이온 교환 컬럼을 사용하여 음이온 교환 크로마토그래피를 통해 HSA를 정제하였다. 정제된 HSA를 PBS(pH 7.0)로 탈염한 후, TCO-PEG4-MAL과 반응시키되, 실온 하 PBS(pH 7.0)에서 1:4의 몰비로 반응시켰다. 2시간 후, 반응 혼합물을 PD-10 컬럼을 사용하여 PBS(pH 7.4)로 탈염하고, 미반응 TCO-PEG4-MAL 링커를 제거하여 MAL-HSA 접합체를 얻었다. 정제된 Uox-frTet을 PBS(pH 7.4)에서 1:4의 몰비로 MAL-HSA와 실온에서 5시간 동안 반응시켰다. 컨쥬게이션(접합) 후, 상기 반응 혼합물을 NGC Quest 10 Plus 크로마토그래피 시스템(Bio-Rad Laboratories Inc., Berkeley, CA, USA)을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography, SEC) (Superdex 200 increase 10/300 column, 0.25 mL/min ow rate, 및 absorbance measurement at 280 nm) 에 적용했다. 용출된 분획의 분자량 및 순도는 SDS-PAGE를 사용하여 분석하였고, 4개의 MAL-HSA 분자에 접합된 AgUox-frTet에 상응하는 분획 (AgUox-MAL-HSA)을 선별하고 추가 분석을 위해 농축했다.
TCO 및 APN을 함유하는 이종-이작용성 크로스링커(hetero-bifunctional cross-linker)를 통해 AgUox-HSA 접합체를 생성하기 위해, TCO-아민을 PFP-PEG4-APN(Pentafluorophenyl ester-PEG4-APN)과 반응시키되, 실온에서 30분 동안 DMSO에서 1:1의 몰비로 반응시켰다. 정제된 HSA를 50mM 붕산나트륨 완충액(pH 9.0)으로 완충액 교환하였다. 50mM 붕산나트륨 완충액(pH 9.0)에서, 정제된 HSA를 TCO-PEG4-APN 과 1:4의 몰비로 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 미반응 TCO-PEG4-APN 링커를 제거하기 위해, 반응 혼합물을 PD-10 컬럼을 사용하여 PBS(pH 7.4)로 탈염하였다. APN을 함유하는 링커를 통해 4개의 HSA 분자에 접합된 AgUox-frTet의 접합(AgUox-APN-HSA) 및 정제는 AgUox-MAL-HSA와 유사한 방식으로 수행되었다.
AgUox-HSA 접합체를 제조한 결과를 도 4 내지 도 5에 나타냈다.
도 4는 AgUox-frTet과 MAL-HSA 또는 APN-HSA (알부민-링커 컨쥬게이트)의 반응물에 대한 단백질 겔을 개시한다. MAL lane은 MAL-HSA와 AgUox-frTet의 반응물에 대한 결과이다. APN lane은 APN-HSA와 AgUox-frTet의 반응물에 대한 결과이다. AgUox-MAL-HSA는 MAL을 포함하는 링커를 통해 제조된 AgUox 서브유닛 변이체-알부민 컨쥬게이트를 나타낸다. AgUox-APN-HSA는 APN을 포함하는 링커를 통해 제조된 AgUox 서브유닛 변이체-알부민 컨쥬게이트를 나타낸다.
도 5는 AgUox-frTet 및 MAL-HSA 또는 APN-HSA 컨쥬게이션 혼합물에 대한 크기 배제 크로마토그래피 및 단백질 겔 결과이다. 보다 구체적으로, 도 5의 위 그림은 AgUox-MAL-HSA 및 MAL-HSA를 포함하는 혼합물에 대한 크기 배제 크로마토그래피 및 단백질 겔 결과이다. 도 5의 아래 그림은 AgUox-APN-HSA 및 APN-HSA를 포함하는 혼합물에 대한 크기 배제 크로마토그래피 및 단백질 겔 결과이다.
실험예 5. 요산산화효소 변이체-알부민 컨쥬게이트(AgUox-HSA)의 효소 활성 및 in vitro 안정성 확인
AgUox-WT, AgUox-frTet 및 AgUox-HSA 컨쥬게이트 (AgUox-MAL-HSA 및 AgUox-APN-HSA)의 효소 활성이 확인되었다. 단백질의 농도는 BCA(Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA) 방법으로 결정되었다. AgUox 의 요산-분해 효소적 활성은 문헌 ' Lim, Sung In, Young S. Hahn, and Inchan Kwon. "Site-specific albumination of a therapeutic protein with multi-subunit to prolong activity in vivo." Journal of Controlled Release 207 (2015): 93-100.'에 개시된 바와 같이 분광광도계로 측정되었다. 효소 활성 분석 버퍼 (50 mM sodium borate 및 0.2 M NaCl, pH 9.5)내 100μL 200μM의 요산에 100μL 120nM의 정제된 AgUox-WT 또는 AgUox-HSA 컨쥬게이트를 첨가하였다. 요산-분해 효소적 활성은 293nm에서 흡광 변화로 측정되었다. AgUox 변이체의 세럼 활성(serum activity)은 100μM 요산을 함유하는 100μL 효소 활성 분석 버퍼를 5μL 세럼을 함유하는 100μL 효소 활성 버퍼에 첨가하고 전술한 바와 같이 측정되었다.
AgUox-HSA 컨쥬게이트는 5일 동안 정상 혈액 상태를 모방하여 5 μM 글루타티온 및 20 μM HSA를 함유하는 PBS 버퍼 (pH7.4)에서 37°C, 4일동안 인큐베이션되었다. 그 다음 샘플을 SDS-PAGE로 분석하였다.
AgUox-HSA 컨쥬게이트(AgUox-MAL-HSA 및 AgUox-APN-HSA)의 효소 활성은 AgUox-frTet 과 유사하였으며 AgUox-WT 대비 약 94%로 관찰되었다 (도 6 참조). 이러한 결과는 MAL 또는 APN 링커를 통한 위치 특이적 HSA 접합이 효소 활성에 부정적인 영향을 미치지 않는 것을 나타낸다. 효소 활성 분석은 quadruplicate로 수행되었으며 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 7 및 도 8 내지 도 9는 5μM 글루타티온 및 20μM HSA를 함유하는 PBS 버퍼 (pH 7.4) 내의 AgUox-HSA 컨쥬게이트(AgUox-MAL-HSA 및 AgUox-APN-HSA)의 37°C에서 시간-경과 활성에 대한 결과를 나타낸다.
각각 다른 타임 포인트(0, 1, 3, 및 5일)에서 수득된 샘플은 단백질 겔에 로드되었고 이후 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색되었다 (도 7 참조).
도 8 내지 도 9는 AgUox 및 글루타티온 처리된 AgUox-MAL-HSA 및 AgUox-APN-HSA 샘플의 MALDI-TOF MS spectra 결과를 나타낸다. 샘플들은 sinapinic　acid　(SA)　matrix　solution　Ⅱ(20　mg/mL　of　SA　in 30:70 (v/v) acetonitrile:　trifluoroacetic　acid　0.1%　in water)와 혼합되었고 SA　matrix solution Ⅰ(20 mg/mL　of　SA　in　ethanol)으로 코팅된　표적 플레이트로 로드되었다. 샘플의 mass spectra는 Microflex MALDI-TOF/MS　(Bruker　Corporation,　Billerica,　MA,　USA)를 사용하여 얻었다.
실험예 6. 요산산화효소 변이체-알부민 컨쥬게이트의 in vivo 안정성 분석
마우스에서 AgUox-HSA 접합체의 안정성 분석은 광주과학기술원 (GIST-2020-037)의 동물 관리 및 사용 위원회의 지침에 따라 수행하였다. AgUox-WT, AgUox-MAL-HSA, 또는 AgUox-APN-HSA 각각을 어린 암컷 BALB/c 마우스 (n=4)의 꼬리 정맥에 주사했다 (pH 7.4에서 200 μL PBS 내 AgUox 단량체 5.0 nmol 기준). AgUox-WT의 경우 15분, 3 시간, 6 시간 및 12시간 후 안와후 출혈(retro-orbital bleeding)을 통해 혈액 샘플을 수득했고, AgUox-HSA 컨쥬게이트의경우 같은 방법으로 15분, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 84 시간, 96 시간, 108 시간 및 120시간에 혈액 샘플을 수집했다. 상기 수집한 혈액에서 혈청을 분리한 후, AgUox-WT 및 AgUox-MAL-HSA, 및 AgUox-APN-HSA의 혈청 활성을 100 μM의 요산을 포함하는 효소 활성 분석 완충액 100 μL를 5 μL의 세럼을 포함하는 100 μL 효소 활성 완충액에 첨가하여 293 nm에서의 흡광도 변화에 의해 측정하였다.
상기 in vivo 반감기 확인 결과를 도 10에 나타냈다. 실험 결과, 알부민을 접합하지 않은 AgUox-WT에 비해 AgUox-APN-HSA 및 AgUox-MAL-HSA에서 현저한 반감기 상승이 나타남을 확인했다.

Claims (30)

  1. 화학식 4의 구조를 갖는 화합물:
    [화학식 4]
    H2-A2-J2-P1,
    이때,
    H2는 제2 클릭화학작용기이고, 이때 상기 제2 클릭화학작용기는 말단 알킨 (terminal alkyne) 그룹, 아자이드 (azide) 그룹, 스트레인된 알킨(strained alkyne) 그룹, 다이엔 (diene) 그룹, 친다이엔체 (dienophile) 그룹, 트랜스 시클로옥틴(trans-cyclooctene) 그룹, 알켄 (alkene) 그룹, 티올 (thiol) 그룹, 테트라진 (tetrazine) 그룹, 트리아진(triazine) 그룹, DBCO(dibenzocyclooctyne) 그룹 및 비시클로노닌(bicyclononyne) 그룹 중에서 선택된 어느 하나의 그룹을 포함하고,
    A2는 제2 앵커 유닛이고, 이때 상기 제2 앵커 유닛은 하나 이상의 헤테로 원자를 포함하는 치환된 탄화수소 사슬이고,
    이때 상기 헤테로 원자는, 각각 독립적으로, N, O, 및 S 중에서 선택되고, 이때 상기 치환은 하나 이상의 비수소 치환기로 치환된 것으로, 상기 비수소 치환기는, 각각 독립적으로, 할로겐, C1-3알킬, -NH2, =O, 및 =S 로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며,
    J2는 제2 접합 유닛이고, 이때 상기 제2 접합 유닛은 APN 그룹과 티올기의 반응에 의해 형성된 구조를 갖고,
    P1은 알부민 유닛이고, 이때 상기 알부민 유닛은 알부민으로부터 유래됨.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제2 클릭화학작용기는 트랜스 시클로옥틴 그룹, DBCO 그룹, 및 비시클로노닌 그룹 중 선택된 어느 하나의 그룹을 포함하는, 화합물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제2 클릭화학작용기는 트랜스 시클로옥틴 그룹을 포함하는, 화합물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 제2 접합 유닛은 하기의 구조를 갖는, 화합물:
    Figure PCTKR2022014276-appb-img-000049
    ,
    이때, 상기 구조에서, S 원자는 상기 알부민으로부터 유래됨.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 제2 접합 유닛은 하기의 구조를 갖는, 화합물:
    Figure PCTKR2022014276-appb-img-000050
    ,
    이때 상기 구조에서, S 원자는 상기 알부민으로부터 유래됨.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 S 원자는 상기 알부민의 시스테인 잔기로부터 유래된, 화합물.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 S 원자는 상기 알부민의 34번 시스테인 잔기의 티올기로부터 유래된, 화합물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 제2 앵커 유닛은 치환 또는 비치환된 C1-50알킬렌, 치환 또는 비치환된 C1-50헤테로알킬렌, -치환 또는 비치환된 C1-20알킬렌-[EG]n-, -치환 또는 비치환된 C1-20헤테로알킬렌-[EG]n-, -치환 또는 비치환된 C1-20알킬렌-[EG]n-치환 또는 비치환된 C1-20알킬렌-, -치환 또는 비치환된 C1-20알킬렌-[EG]n-치환 또는 비치환된 C1-20헤테로알킬렌-, 및 -치환 또는 비치환된 C1-20헤테로알킬렌-[EG]n-치환 또는 비치환된 C1-20헤테로알킬렌- 중에서 선택되는 어느 하나이고,
    이때 EG는 에틸렌글리콜 단위체이고, 상기 에틸렌글리콜 단위체는 -OCH2CH2- 또는 -CH2OCH2-의 구조를 가지며, 이때 n은 1 이상 12 이하의 정수이고,
    이때 상기 헤테로알킬렌은 하나 이상의 헤테로원자를 포함하고, 이때 상기 헤테로원자는, 각각 독립적으로, N, O, 및 S 중에 선택되며,
    이때 상기 치환은 하나 이상의 비수소 치환기로 치환된 것으로, 이때 상기 비수소 치환기는 각각 독립적으로 할로겐, C1-3알킬, -NH2, =O, 및 =S 로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인,
    화합물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 제2 앵커 유닛은 -A21-A22-A23- 이고,
    이때:
    A21은 결합(bond), -CH2CH2OC(=O)NH-, -CH2OC(=O)NH-, -OC(=O)NH-, -C(=O)NH-, -NH- 또는 -C(=O)- 이고,
    A22는 결합(bond), 치환 또는 비치환된 C1-12 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C1-12 헤테로알킬렌, -치환 또는 비치환된 C1-12알킬렌-[EG]n-, -치환 또는 비치환된 C1-12-헤테로알킬렌-[EG]n-, -치환 또는 비치환된 C1-12알킬렌-[EG]n-치환 또는 비치환된 C1-12알킬렌-, -치환 또는 비치환된 C1-12헤테로알킬렌-[EG]n-치환 또는 비치환된 C1-12알킬렌-, 및 -치환 또는 비치환된 C1-12헤테로알킬렌-[EG]n-치환 또는 비치환된 C1-12헤테로알킬렌- 중에서 선택되는 어느 하나이고,
    이때 EG는 에틸렌글리콜 단위체이고, 상기 에틸렌글리콜 단위체는 -OCH2CH2- 또는 -CH2OCH2-의 구조를 가지며, 이때 n은 2 이상 6 이하의 정수이고,
    이때 상기 헤테로알킬렌은 각각 독립적으로 N, O, 및 S 중에서 선택되고,
    이때 상기 치환은 하나 이상의 비수소 치환기로 치환된 것으로, 상기 비수소 치환기는 각각 독립적으로 할로겐, C1-3알킬, -NH2, =O, 및 =S 로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고,
    A23은 결합(bond), -CH2CH2OC(=O)NH-, -CH2OC(=O)NH-, -OC(=O)NH-, -C(=O)NH-, -NH- 또는 -C(=O)- 이고,
    이때, A21, A22, 및 A23 모두가 동시에 결합(bond)인 경우는 존재하지 않는,
    화합물.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 제2 앵커 유닛은 하기의 구조 중 어느 하나의 구조를 갖는, 화합물:
    Figure PCTKR2022014276-appb-img-000051
    ; 및
    Figure PCTKR2022014276-appb-img-000052
    ,
    이때 3'은 상기 제2 클릭화학작용기와의 부착부 (attachment site)이고, 4'는 상기 제2 접합 유닛과의 부착부(attachment site)임.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 알부민은 서열번호 01의 아미노산 서열을 갖는, 화합물.
  12. 제1항에 있어서,
    하기의 화학식 4-1의 구조를 갖는 화합물:
    Figure PCTKR2022014276-appb-img-000053
    ,
    이때, S는 상기 알부민의 34번 시스테인 잔기의 티올기로부터 유래되고,
    이때, n은 2 이상 6 이하의 정수임.
  13. 제1항에 있어서,
    하기의 화학식 4-4의 구조를 갖는 화합물:
    Figure PCTKR2022014276-appb-img-000054
    ,
    이때, S는 상기 알부민의 34번 시스테인 잔기의 티올기로부터 유래됨.
  14. 하기의 화학식 1의 구조를 갖는 화합물:
    [화학식 1]
    FPV-[J1-A2-J2-P1]a,
    이때:
    FPV는 기능성 폴리펩티드 변이체 유닛이고, 상기 기능성 폴리펩티드 변이체 유닛은 기능성 폴리펩티드 변이체로부터 유래되고, 상기 기능성 폴리펩티드 변이체는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하며,
    이때 상기 비천연아미노산은 제1 클릭화학작용기를 포함하고, 이때 상기 제1 클릭화학작용기는 제2 클릭화학작용기와 클릭화학반응을 할 수 있으며, 이때 상기 제1 클릭화학작용기는 말단 알킨 (terminal alkyne) 그룹, 아자이드 (azide) 그룹, 스트레인된 알킨(strained alkyne) 그룹, 다이엔 (diene) 그룹, 친다이엔체 (dienophile) 그룹, 트랜스 시클로옥틴(trans-cyclooctene) 그룹, 알켄 (alkene) 그룹, 티올 (thiol) 그룹, 테트라진 (tetrazine) 그룹, 트리아진(triazine) 그룹, DBCO(dibenzocyclooctyne) 및 비시클로노닌(bicyclononyne) 그룹 중에서 선택된 어느 하나의 그룹을 포함하고,
    J1은 제1 접합 유닛이고, 상기 제1 접합 유닛은 상기 제1 클릭화학작용기와 상기 제2 클릭화학작용기의 클릭화학반응에 의해 형성된 구조를 갖고,
    A2는 제2 앵커 모이어티이고, 상기 제2 앵커 유닛은 하나 이상의 헤테로 원자를 포함하는 치환된 탄화수소 사슬이고,
    이때 상기 헤테로 원자는, 각각 독립적으로, N, O, 및 S 중에서 선택되고, 이때 상기 치환은 하나 이상의 비수소 치환기로 치환된 것으로, 상기 비수소 치환기는, 각각 독립적으로, 할로겐, C1-3알킬, -NH2, =O, 및 =S 로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며,
    J2는 제2 접합 유닛이고, 이때 상기 제2 접합 유닛은 APN 그룹과 티올기의 반응에 의해 형성된 구조를 갖고,
    P1은 알부민 유닛이고, 상기 알부민 유닛은 알부민으로부터 유래되며,
    a는 1 이상 8 이하의 정수임.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 기능성 폴리펩티드 변이체는 요산산화효소 변이체, 요산산화효소 서브유닛 변이체, GLP1 변이체, hGH 변이체, 및 GFP 변이체 중 선택되는 어느 하나인, 화합물.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 기능성 폴리펩티드 변이체는 하기로부터 선택되는 어느 하나인, 화합물:
    서열번호 13의 아미노산 서열의 137번째 글리신, 22번째 글루탐산, 92번째 아스파라긴, 23번째 리신, 295번째 세린, 113번째 글리신, 273번째 리신, 171번째 리신, 240번째 알라닌, 89번째 글루탐산, 266번째 리신, 24번째 트레오닌, 48번째 리신, 192번째 세린, 202번째 프롤린, 110번째 아스파르트산, 243번째 글루타민, 195번째 글루타민, 138번째 리신, 115번째 프롤린, 199번째 세린, 272번째 글리신, 리신4, 112번째 아스파르트산, 267번째 글리신, 114번째 리신, 70번째 글루타민, 174번째 트립토판, 223번째 아스파라긴, 41번째 글루탐산, 261번째 아스파르트산, 25번째 글리신, 52번째 세린, 241번째 아르기닌, 213번째 글루탐산, 274번째 아스파라긴, 221번째 글루탐산, 206번째 알라닌, 236번째 글루탐산, 164번째 아르기닌, 269번째 글루타민, 136번째 글루탐산, 259번째 글루탐산, 246번째 글루탐산, 49번째 알라닌, 148번째 글리신, 19번째 히스티딘, 296번째 세린, 및 47번째 트레오닌 중 선택된 하나 이상의 아미노산이 비천연 아미노산으로 치환된 서열을 갖는 Aspergillus Flavus 유래 요산산화효소 서브유닛 변이체;
    서열번호 14의 아미노산 서열의 301번째 트레오닌, 26번째 아스파라긴, 303번째 류신, 194번째 리신, 95번째 세린, 140번째 세린, 116번째 글리신, 302번째 리신, 167번째 리신, 115번째 아스파르트산, 299번째 글루탐산, 24번째 프롤린, 271번째 트립토판, 277번째 아스파르트산, 169번째 아스파르트산, 118번째 프롤린, 177번째 트레오닌, 174번째 글루타민, 208번째 리신, 275번째 글루탐산, 266번째 류신, 273번째 글리신, 200번째 티로신, 92번째 글루탐산, 247번째 글루탐산, 228번째 류신, 300번째 리신, 204번째 리신, 51번째 글루탐산, 207번째 아스파르트산, 117번째 리신, 250번째 시스테인, 175번째 프롤린, 270번째 리신, 268번째 아스파르트산, 44번째 글리신, 193번째 아스파라긴, 164번째 글리신, 73번째 트레오닌, 29번째 리신, 230번째 아스파라긴, 25번째 글루타민, 216번째 아스파라긴, 55번째 세린, 28번째 리신, 6번째 세린, 27번째 프롤린, 298번째 리신, 113번째 알라닌, 213번째 아스파라긴, 220번째 글루탐산, 141번째 글리신, 163번째 티로신, 253번째 티로신, 178번째 아스파르트산, 93번째 리신, 103번째 리신, 144번째 리신, 139번째 아르기닌, 138번째 리신, 세린7, 151번째 아스파르트산, 297번째 아르기닌, 272번째 리신, 278번째 아스파라긴, 및 265번째 페닐알라닌 중 선택된 하나 이상의 아미노산이 비천연 아미노산으로 치환된 서열을 갖는 Candida Utilis 유래 요산산화효소 서브유닛 변이체; 및
    서열번호 15의 아미노산 서열의 80번째 아스파르트산, 82번째 페닐알라닌, 100번째 페닐알라닌, 101번째 아스파르트산, 114번째 페닐알라닌, 119번째 아스파라긴, 120번째 아스파르트산, 142번째 세린, 143번째 글루탐산, 175번째 글리신, 195번째 발린, 196번째 글루탐산, 218번째 히스티딘, 238번째 프롤린 중 선택된 하나 이상의 아미노산이 비천연 아미노산으로 치환된 서열을 갖는 Arthrobacter globiformis 유래 요산산화효소 서브유닛 변이체
  17. 제14항에 있어서,
    상기 기능성 폴리펩티드 변이체는 서열번호 100 내지 113의 서열 중 선택된 어느 하나의 서열을 갖는, Arthrobacter globiformis 유래 요산산화효소 서브유닛 변이체인, 화합물.
  18. 제14항에 있어서,
    상기 제1 클릭화학작용기는 테트라진 그룹 또는 아자이드 그룹을 포함하는, 화합물.
  19. 제14항에 있어서,
    상기 비천연 아미노산은 frTet인, 화합물.
  20. 제14항에 있어서,
    상기 제2 클릭화학작용기는 트랜스 시클로옥틴(TCO) 그룹, DBCO 그룹, 및 비시클로노닌 그룹 중 선택된 어느 하나의 그룹을 포함하는, 화합물.
  21. 제14항에 있어서,
    상기 제2 클릭화학작용기는 트랜스 시클로옥틴(TCO) 그룹을 포함하는, 화합물.
  22. 제14항에 있어서,
    상기 제2 접합 유닛은 하기의 구조를 갖는, 화합물:
    Figure PCTKR2022014276-appb-img-000055
    ,
    이때, 상기 구조에서, S 원자는 상기 알부민으로부터 유래됨.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 제2 접합 유닛은 하기의 구조를 갖는, 화합물:
    Figure PCTKR2022014276-appb-img-000056
    ,
    이때 상기 구조에서, S 원자는 상기 알부민으로부터 유래됨.
  24. 제22항에 있어서,
    상기 S 원자는 상기 알부민의 시스테인 잔기로부터 유래된, 화합물.
  25. 제22항에 있어서,
    상기 S 원자는 상기 알부민의 34번 시스테인 잔기의 티올기로부터 유래된, 화합물.
  26. 제14항에 있어서,
    상기 제2 앵커 유닛은 치환 또는 비치환된 C1-50알킬렌, 치환 또는 비치환된 C1-50헤테로알킬렌, -치환 또는 비치환된 C1-20알킬렌-[EG]n-, -치환 또는 비치환된 C1-20헤테로알킬렌-[EG]n-, -치환 또는 비치환된 C1-20알킬렌-[EG]n-치환 또는 비치환된 C1-20알킬렌-, -치환 또는 비치환된 C1-20알킬렌-[EG]n-치환 또는 비치환된 C1-20헤테로알킬렌-, 및 -치환 또는 비치환된 C1-20헤테로알킬렌-[EG]n-치환 또는 비치환된 C1-20헤테로알킬렌- 중에서 선택되는 어느 하나이고,
    이때 EG는 에틸렌글리콜 단위체이고, 상기 에틸렌글리콜 단위체는 -OCH2CH2- 또는 -CH2OCH2-의 구조를 가지며, 이때 n은 1 이상 12 이하의 정수이고,
    이때 상기 헤테로알킬렌은 하나 이상의 헤테로원자를 포함하고, 이때 상기 헤테로원자는, 각각 독립적으로, N, O, 및 S 중에 선택되며,
    이때 상기 치환은 하나 이상의 비수소 치환기로 치환된 것으로, 이때 상기 비수소 치환기는 각각 독립적으로 할로겐, C1-3알킬, -NH2, =O, 및 =S 로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인,
    화합물.
  27. 제14항에 있어서,
    상기 제2 앵커 유닛은 -A21-A22-A23- 이고,
    이때:
    A21은 결합(bond), -CH2CH2OC(=O)NH-, -CH2OC(=O)NH-, -OC(=O)NH-, -C(=O)NH-, -NH- 또는 -C(=O)- 이고,
    A22는 결합(bond), 치환 또는 비치환된 C1-12 알킬렌, 치환 또는 비치환된 C1-12 헤테로알킬렌, -치환 또는 비치환된 C1-12알킬렌-[EG]n-, -치환 또는 비치환된 C1-12-헤테로알킬렌-[EG]n-, -치환 또는 비치환된 C1-12알킬렌-[EG]n-치환 또는 비치환된 C1-12알킬렌-, -치환 또는 비치환된 C1-12헤테로알킬렌-[EG]n-치환 또는 비치환된 C1-12알킬렌-, 및 -치환 또는 비치환된 C1-12헤테로알킬렌-[EG]n-치환 또는 비치환된 C1-12헤테로알킬렌- 중에서 선택되는 어느 하나이고,
    이때 EG는 에틸렌글리콜 단위체이고, 상기 에틸렌글리콜 단위체는 -OCH2CH2- 또는 -CH2OCH2-의 구조를 가지며, 이때 n은 2 이상 6 이하의 정수이고,
    이때 상기 헤테로알킬렌은 각각 독립적으로 N, O, 및 S 중에서 선택되고,
    이때 상기 치환은 하나 이상의 비수소 치환기로 치환된 것으로, 상기 비수소 치환기는 각각 독립적으로 할로겐, C1-3알킬, -NH2, =O, 및 =S 로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고,
    A23은 결합(bond), -CH2CH2OC(=O)NH-, -CH2OC(=O)NH-, -OC(=O)NH-, -C(=O)NH-, -NH- 또는 -C(=O)- 이고,
    이때, A21, A22, 및 A23 모두가 동시에 결합(bond)인 경우는 존재하지 않는,
    화합물.
  28. 제14항에 있어서,
    상기 제2 앵커 유닛은 하기의 구조 중 어느 하나의 구조를 갖는, 화합물:
    Figure PCTKR2022014276-appb-img-000057
    ; 및
    Figure PCTKR2022014276-appb-img-000058
    ,
    이때 3'은 상기 제1 접합 유닛과의 부착부 (attachment site)이고, 4'는 상기 제2 접합 유닛과의 부착부(attachment site)임.
  29. 제1항에 있어서,
    상기 알부민은 서열번호 01의 아미노산 서열을 갖는, 화합물.
  30. 제1항에 있어서,
    a는 1 이상 4 이하의 정수인, 화합물.
PCT/KR2022/014276 2021-09-23 2022-09-23 Apn 그룹을 포함하는 링커 및 이를 이용하여 제조된 기능성 폴리펩티드 변이체-알부민 컨쥬게이트 WO2023048505A1 (ko)

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