KR20220050934A - 치료용 접합체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 이. 콜라이(E. coli) 유래 L-아스파라기나제를 이전에 투여받은 적이 있는 환자에서 L-아스파라긴 결핍(L-asparagine depletion)에 의해 치료 가능한 질환을 치료하는 데 사용하기 위한, L-아스파라기나제(L-asparaginase) 및 수용성 중합체를 포함하는 접합체(conjugate)를 제공한다. 본 발명은 또한, 치료 방법, 상기 접합체를 포함하는 조성물, 및 접합체를 생성하는 방법을 제공한다.

Description

치료용 접합체
본 발명은 이. 콜라이(E. coli) 유래 L-아스파라기나제를 이전에 투여받은 적이 있는 환자에서 L-아스파라긴 결핍(L-asparagine depletion)에 의해 치료 가능한 질환을 치료하는 데 사용하기 위한, L-아스파라기나제(L-asparaginase) 및 수용성 중합체를 포함하는 접합체(conjugate)에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 접합체를 포함하는 조성물, 및 접합체를 생성하는 방법에 관한 것이다.
오랫 동안, L-아스파라기나제는 세포외 L-아스파라긴에 따라 암의 치료에 성공적으로 사용되어 왔다. L-아스파라기나제는 L-아스파라긴으로부터 아스파르트산 및 암모니아로의 가수분해를 촉매화하고, 이의 항신생물성 활성은 순환형(circulating) L-아스파라긴 수준을 결핍시켜, 단백질 합성을 위해 세포외 L-아스파라긴에 의존하는 종양 세포를 사멸화시킴으로써 달성되는 것으로 여겨진다.
L-아스파라기나제는 급성 림프모구성 백혈병(ALL; Acute Lymphoblastic Leukaemia)의 치료에서 필수적인 구성요소이고, 또한 암, 예컨대 급성 골수성 백혈병(acute myelocytic leukaemia), 호지킨 질환(Hodgkin's disease), 급성 골수단핵구성 백혈병(acute myelomonocytic leukaemia), 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukaemia), 세망육종(reticulosarcoma), 흑색육종(melanosarcoma) 및 림프육종(lymphosarcoma)을 치료하기 위해 사용되어 왔다.
현재까지, 3개의 박테리아-유래 L-아스파라기나제 조제물이 ALL의 치료에 사용하기 위해 승인되었다. 이는 네이티브(native) 이. 콜라이 L-아스파라기나제, PEG화된(PEGylated) 이. 콜라이 L-아스파라기나제 및 네이티브 에르위니아 크리산테미(Erwinia　chrysanthemi) 아스파라기나제를 포함한다.
네이티브 이. 콜라이 L-아스파라기나제("EcASNase")는 유럽에서 "L-아스파라기나제 Medac®" 및 "Kidrolase®"로서, 그리고 미국에서 "Elspar®"로서 판매되어 왔다. 1970년대 동안, EcASNase는 ALL의 치료를 위한 효과적인 약물로서 식별되었고, 이의 투여는 L-아스파라긴의 신속하고 강한 결핍을 유발한다. 그러나, EcASNase로 치료되는 많은 환자는 바람직하지 못한 "명시적인" 알레르기 증상을 나타내었고, 항-L-아스파라기나제 항체 반응은 대부분의 환자에서 관찰되었다. 항-L-아스파라기나제 항체는, 이것이 L-아스파라긴의 효소적 활성을 차단하고 환자로부터 L-아스파라긴 청소(clearance) 속도(rate)를 증가시킬 수 있기 때문에 고도로 유해한 치료적 효과를 가질 수 있다. 네이티브 이. 콜라이 L-아스파라기나제는 미국에서 임상 사용을 위해 더 이상 승인되지 않는다.
EcASNase와 관련된 면역학적 및 약물동력학적 문제를 감소시키는 것을 돕기 위해, EcASNase는 폴리에틸렌 글리콜("PEG")에 접합되었다. PEG는 잘 알려진 수용성 중합체이고, PEG에의 접합은 단백질의 약물동력학적 및 면역학적 특성을 향상시키기 위한 장기간-확립된 전략이다. PEG화의 잘 알려진 이점은 향상된 잔여 효소적 활성, 향상된 열 안정성, 향상된 pH 안정성, 단백질가수분해에 대한 증가된 내성, 증가된 생체내 반감기(t1/2), 및 감소된 항원성을 포함한다. PEG화의 잘 알려진 이점과 일관되게, PEG화된 EcASNase는 네이티브 EcASNase와 비교하여 특히 감소된 항원성 및 증가된 t1/2을 나타내었다. 2006년부터, PEG화된 EcASNase는 어린이 및 성인에서 ALL의 1-선 치료를 위해 승인되었다. PEG화된 EcASNase는 문헌에서 "페가스파르가제(pegaspargase)"로서 빈번하게 지칭되고, "Oncaspar®"로서 판매된다. Oncaspar®는 이. 콜라이로부터 정제되고 다수의 부위에서 5000 Da PEG로 변형되는 이. 콜라이 L-아스파라기나제이다.
ALL의 치료를 위해, Oncaspar®는 전형적으로 14일마다 주사/주입을 위한 750 IU(국제 단위)/ml 용액으로서 투여된다. ≤21세 연령의 소아 환자에서, 권고되는 용량은 전형적으로: (a) 체표면적(BSA) ≥0.6 m2인 환자에서 2,500 IU Oncaspar®(3.3 ml Oncaspar®와 동등함)/m2 체표면적; 및 (b) <0.6 m2의 BSA를 갖는 환자에서 82.5 IU의 Oncaspar®(0.1 ml Oncaspar와 동등함)/kg 체중이다. >21세(다르게 처방되지 않는 한) 연령의 환자에서, Oncaspar®는 전형적으로 14일마다 2,000 IU(2.67 ml Oncaspar와 동등함)/m2 체표면적의 용량으로 투여된다.
Oncaspar®는 EcASNase를 능가하는 향상에도 불구하고, 유의한 한계에 의해 제한된다. 특히, Oncaspar®의 투여는, 특히 Oncaspar® 또는 EcASNase를 이전에 받은 환자에서 빈번하게는 명시적인 알레르기 증상과 관련이 있다. 또한, 주요 임상적 염려는, 환자가 Oncaspar®(또는 EcASNase)에 대해 항-L-아스파라기나제 항체 반응을 발달시키지만 명시적인 알레르기 증상을 나타내지 않는 "침묵 비활성화(silent inactivation)"의 현상이다. 침묵 비활성화와의 주요 염려는, 환자가 치료적 이점은 받지 않으면서 Oncaspar®(또는 EcASNase)의 계속된 투여를 받을 위험에 있다는 점이다.
네이티브 이. 크리산테미(E.　chrysanthemi) 아스파라기나제(EwASNase)는, 이. 콜라이 L-아스파라기나제(전형적으로 Oncaspar®)에 대해 과민반응을 발증시킨 환자에서 ALL의 2-선 또는 3-선 치료를 위해 승인된다. 이. 크리산테미 균주 NCPPB 1066으로부터 정제된 EwASNase는 미국에서 "Erwinaze®" 및 어디에서나 "Erwinase®"로서 판매된다. EwASNase는 EcASNase(네이티브 형태 또는 PEG화된 형태)와 최소의 항원성 교차-반응성을 갖고, 따라서 Oncaspar®(또는 EcASNase)를 이전에 받은 환자는 EwASNase에 반응하도록 면역학적으로 프라이밍되지 않는다. 그러므로, EwASNase는, Oncaspar®(또는 EcASNase)에 대해 과민반응을 발증시킨 환자, 뿐만 아니라 Oncaspar®(또는 EcASNase)에 대해 항-L-아스파라기나제 항체 반응을 발달시킨 환자의 계속된 치료에 적절하다.
Erwinase®는 전형적으로, 주사용 용액을 위한 10,000 IU/바이얼 동결건조물로서 제공된다. 모든 환자에 대해, 통상의 Erwinase® 용량은 6,000 IU/m2 체표면적(200 IU/kg 체중)이다. Erwinase®-기초 치료법은 프로토콜에 따라 추가로 강화될 수 있다.
EwASNase는 이의 면역학적 이점에도 불구하고, Oncaspar®(및 EcASNase)보다 더 짧은 t1/2을 나타낸다. Oncaspar®(및 EcASNase)에 의해 시간 경과에 따라 제공되는 생체내 L-아스파라기나제 활성을 매칭시키는 것을 돕기 위해, 환자는 EwASNase의 더 짧은 투여 간격을 받는다. ALL의 치료를 위해, Erwinase®는 전형적으로 3주 동안 주당 3회 투여된다.
EwASNase의 투여 간격을 연장시키기 위한 상당한 요망이 당업계에 존재한다. 이러한 요망은 문헌[Rau 등 Pediatr Blood Cancer. 2018; 65:e26873]에 의해 인식되며, 이는 "에르위니아 아스파라기나제는 이. 콜라이 PEG-아스파라기나제[Oncaspar®]에 대한 안전하고 효과적인 대안인 것으로 입증되었다", 그리고 "감소된 빈도-투약 요법은 중요한 이점을 제공할 것이다"라고 주지한다.
Rau 등(2018)은 또한, "이것이 큰 박테리아-유래 단백질이기 때문에, 아스파라기나제에의 노출은 면역 반응을 유도하는 능력을 갖는다", 그리고 "감소된 면역원성 잠재력을 갖는 조제물은 중요한 치료적 이점을 제공할 것이다"라고 주지한다.
Rau 등(2018)은 소아 종양학 그룹 시험 AALL1421의 결과를 기재한다. 이는 ALL 또는 림프모구성 림프종(lymphoblastic lymphoma) 및 Oncaspar®에 대해 과민반응을 갖는 소아 환자에서 "JZP-416"의 2상 임상 시험이었다.
"JZP-416"은 재조합 이. 크리산테미 L-아스파라기나제(이. 콜라이에서 발현됨)와 5000 Da PEG의 접합체이다. 현재, "JZP-416"은 또한, 당업계에서 "Asparec®", "AZP-02" 및 "mPEG-r-크리산타스파제(crisantaspase)"로서 지칭되고, Jazz Pharmaceuticals(이전에 Alize Pharma II SAS)에 의해 소유되고 있다.
안타깝게도, 소아 종양학 그룹 시험 AALL1421은, 4명의 환자 중 3명이 "임상적 과민반응 반응 또는 [혈청 아스파라기나제 활성]의 신속한 청소로서 나타나는, [JZP-416]에 대한 과민반응을 경험하였기" 때문에 성공적이지 못하였다(Rau 등(2018)).
시험 AALL1421은 예상치 못하였는데, 왜냐하면:
(a) 이. 크리산테미 균주 NCPPB 1066으로부터 정제된 L-아스파라기나제(Erwinase®)가, Oncaspar®에 대해 과민반응을 발증시킨 환자에서 사용하기 위해 승인되기 때문에; 그리고
(b) PEG 자체가 일반적으로, 비-면역원성인 것으로 여겨지기 때문이다. 사실상, PEG화는 단백질의 면역원성을 감소시키기 위한 잘 알려진 전략이다(상기 참조).
시험 AALL1421의 실패를 설명하기 위해, Rau 등(2018)은, 이. 콜라이 L-아스파라기나제(Oncaspar®에서)가 이. 크리산테미 L-아스파라기나제(JZP-416에서)의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 갖는다는 것에 기초하여, "페그크리산타스파제(pegcrisantaspase)의 L-아스파라기나제 부분[JZP-416]과 페가스파르가제[Oncaspar®] 사이에 교차-반응성이 없음"이 있어야 한다고 언급한다.
대신에, Rau 등(2018)은, 소아 종양학 그룹 시험 AALL1421의 실패를 "[JZP-416]의 PEG 모이어티에 대한 기존의 면역원성"에 있다고 보고, 이들의 결론은 AALL1421 시험 환자에서 기존의 항-PEG IgG 항체의 식별에 의해 뒷받침되었다.
궁극적으로, Rau 등(2018)은, "PEG화 이외의 전략은 페가스파르가제-과민성 환자를 위해 에르위니아 아스파라기나제 치료 스케쥴을 최적화시킬 필요가 있을 수 있다"고 결론내린다.
그러므로, Erwinase®보다 더 긴 투여 간격을 갖고, Oncaspar®(또는 EcASNase)에 대해 과민 반응을 발증시킨 환자의 치료에 적합한 L-아스파라기나제에 대한 필요성이 당업계에 존재한다.
또한, Erwinase®보다 더 긴 투여 간격을 갖고, Oncaspar®(또는 EcASNase)에 대해 항-L-아스파라기나제 항체 반응을 발달시켰으나 명시적인 알레르기 증상을 나타내지 않는 환자의 치료에 적합한 L-아스파라기나제에 대한 필요성이 당업계에 존재한다.
본 발명은, Erwinase®보다 더 긴 투여 간격을 갖고, Oncaspar®(또는 EcASNase)에 대해 과민 반응을 발증시킨 환자의 치료에 적합한 L-아스파라기나제에 대한 필요성을 해결한다. 본 발명은 또한, Erwinase®보다 더 긴 투여 간격을 갖고, Oncaspar®(또는 EcASNase)에 대해 항-L-아스파라기나제 항체 반응을 발달시켰으나 명시적인 알레르기 증상을 나타내지 않는 환자의 치료에 적합한 L-아스파라기나제에 대한 필요성을 해결한다.
본 발명은, 소아 종양학 그룹 시험 AALL1421의 실패가 Rau 등 (2018)에 의해 결론내려졌던 바와 같이 "[JZP-416]의 PEG 모이어티에 대한 기존의 면역원성"으로 인한 것이 아니었다는 놀라운 발견에 기초한다. 대신에, 본 발명자들은 예상치 못하게도, 시험 AALL1421의 실패가, Oncaspar®에 존재하고 또한 JZP-416에 존재한 이. 콜라이로부터의 숙주 세포 단백질(HCP)에 대한 기존의 면역력으로 인한 것이었음을 발견하였다. 다르게 말하자면, 본 발명자들은, Oncaspar®의 이전의 투여가, 이. 콜라이-유래 L-아스파라기나제 조제물, JZP-416에 존재한 이. 콜라이 HCP에 대한 과민성 면역 반응을 유도하기 위해 환자를 면역학적으로 "프라이밍(primed)"하였다고 여긴다.
숙주 세포 단백질(HCP)은 숙주 세포에 의해 발현되는 내인성 단백질이고, 상기 숙주 세포에 의해 생성되는 치료 생성물과 관련이 없다. HCP는 생물학적 약물에서 과정-관련 불순물의 주요 구성요소를 이루고, HPC는 종종 치료 생성물 자체와 상호작용함으로써 치료 생성물과 함께 공동-정제되는 것으로 보고되었다.
그러므로, 본 발명은 환자에서 L-아스파라긴 결핍에 의해 치료 가능한 질환을 치료하는 데 사용하기 위한, L-아스파라기나제 및 수용성 중합체를 포함하는 접합체를 제공하며,
(a) L-아스파라기나제는 이. 콜라이 이외의 공급원으로부터의 것이며;
(b) L-아스파라기나제는 이. 콜라이 이외의 숙주 세포에서 발현되고;
(c) 환자는 이. 콜라이-유래 L-아스파라기나제를 이전에 투여받은 적이 있다.
본 발명은 또한, 환자에서 L-아스파라긴 결핍에 의해 치료 가능한 질환을 치료하는 데 사용하기 위한, 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제를 제공하며,
(a) L-아스파라기나제는 이. 콜라이 이외의 공급원으로부터의 것이며;
(b) 이종성 숙주 세포는 이. 콜라이 이외의 숙주 세포이고;
(c) 환자는 이. 콜라이-유래 L-아스파라기나제를 이전에 투여받은 적이 있다.
본 발명에 따르면, 환자에게 이전에 투여된 이. 콜라이-유래 L-아스파라기나제는 전형적으로 Oncaspar®이다.
전형적으로, L-아스파라기나제는 숙주 세포에서 재조합적으로 발현된다(즉, L-아스파라기나제는 "재조합 L-아스파라기나제"임).
일 구현예에서, 숙주 세포는 이종성 숙주 세포이다.
일 구현예에서, L-아스파라기나제는 이. 콜라이 이외의 공급원으로부터의 것이고 이. 콜라이 이외의 숙주 세포로부터 정제된다(예를 들어 이. 크리산테미로부터 정제된 네이티브 이. 크리산테미 L-아스파라기나제).
본 발명은 또한, 본 발명에 따라 사용하기 위한 접합체 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명의 접합체는 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제(예를 들어 슈도모나스 종(Pseudomonas spp.)에서 발현되는 이. 크리산테미 L-아스파라기나제)를 포함한다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따라 사용하기 위한 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다.
전형적으로, 본 발명의 조성물은 이. 콜라이로부터의 숙주 세포 단백질이 실질적으로 없다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 이. 콜라이로부터의 숙주 세포 단백질을 함유하지 않는다.
본 발명은 또한, 이. 콜라이-유래 L-아스파라기나제를 이전에 투여받은 적이 있는 환자에서 L-아스파라긴 결핍에 의해 치료 가능한 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 방법은 유효량의 본 발명의 접합체 또는 조성물을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 유의하고 실제적인 치료 이점을 제공한다:
· 본 발명은 Oncaspar®(또는 EcASNase)로 이전에 치료되었던 환자에서 (추가) 과민 반응의 위험을 유의하게 감소시킨다;
· 본 발명은 본 발명의 L-아스파라기나제 접합체에 사용하기 위한 수용성 중합체(들)를 선택할 때 증가된 선택 자유도(freedom of choice)를 당업자에게 제공한다. 예를 들어, 당업자는 PEG화, 뿐만 아니라 다른 유형의 수용성 중합체에 의해 제공되는 잘 알려진 면역학적 및 약물동력학적 이점을 유용할 수 있다;
· 결정적으로, 소아 종양학 그룹 시험 AALL1421의 실패에 책임이 있는 주된 항원 결정기를 식별하여, 본 발명의 개시내용은 또한 Oncaspar®(또는 EcASNase)에 대해 민감성을 발증시킨 암 환자에게 이. 콜라이-유래 L-아스파라기나제의 향후 투여를 피하는 것을 도울 것이다. 이는 다시 말해, 이미 취약한 환자 그룹에서 앓고 있는 추가 환자를 피하는 것을 도울 것이다.
본 발명자들은 처음으로, 이. 콜라이-유래 L-아스파라기나제(예컨대 Oncaspar®)를 이전에 투여받은 적이 있는 환자는 이. 콜라이로부터 유래되는 L-아스파라기나제에 대해 과민 반응을 유도하기에 면역학적으로 소인이 있음을 결정하였다.
더욱이, 이. 콜라이-유래 L-아스파라기나제(예컨대 Oncaspar®)를 이전에 투여받은 적이 있는 환자는, 후속적으로-투여되는 이. 콜라이-유래 L-아스파라기나제가 또 다른 모이어티(예컨대 PEG)에 접합되는지의 여부와 상관 없이, 이. 콜라이로부터 유래되는 L-아스파라기나제에 대한 과민 반응을 유도하기에 면역학적으로 소인이 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "이. 콜라이-유래 L-아스파라기나제"는 이. 콜라이(재조합 또는 내인성 발현에 의해)에서 생성되었던 L-아스파라기나제를 지칭한다. 그러므로, 본 발명에 따르면, 용어 "이. 콜라이-유래 L-아스파라기나제"는
(a) 이. 콜라이로부터 정제되는 네이티브 이. 콜라이 L-아스파라기나제;
(b) L-아스파라기나제의 공급원 또는 아미노산 서열과 상관 없이, 이. 콜라이에서 발현되는 재조합 L-아스파라기나제(즉, 재조합적으로 발현되는 L-아스파라기나제가 이. 콜라이 L-아스파라기나제인지의 여부와 상관 없이, 또는 재조합적으로 발현되는 L-아스파라기나제가 이. 콜라이 이외의 공급원으로부터, 예컨대 이. 크리산테미로부터의 것인지의 여부와 상관 없이); 및
(c) 상기 (a) 또는 (b)를 포함하는 조성물 및/또는 접합체
를 포함한다.
JZP-416의 이. 크리산테미 L-아스파라기나제 구성요소는 이. 콜라이에서 재조합적으로 발현되었다. 그러므로, JZP-416은 본 발명에 따른 "이. 콜라이-유래 L-아스파라기나제"이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "이. 콜라이 이외의 공급원으로부터의 L-아스파라기나제"는 이. 콜라이 L-아스파라기나제의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 갖는 L-아스파라기나제 (접합되거나 비접합됨)를 지칭한다. "이. 콜라이 아스파라기나제"는 EcASNase 및 Oncaspar®, 및 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함한다. 전형적으로, 이. 콜라이 이외의 공급원으로부터의 L-아스파라기나제는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열과 90% 미만의 서열 동일성(예를 들어 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열과 90% 미만, 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만의 서열 동일성)을 갖는다.
Figure pct00001
그러므로, 본 발명에 따르면, EwASNase 및 JZP-416은 이. 콜라이 이외의 공급원으로부터의 L-아스파라기나제이다. EwASNase(및 JZP-416)의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2에 의해 제공된다.
Figure pct00002
당업자는, 용어 "이. 콜라이 이외의 숙주 세포에서 발현되는"은 적절하다면 내인성 발현 및 재조합 발현을 포괄함을 이해할 것이다.
L-아스파라기나제는 L-아스파라긴 아미노하이드롤라제(aminohydrolase) 활성을 갖는 효소이다.
L-아스파라기나제 활성의 하나의 국제 단위("IU")는, 37℃에서 분당 1 μmol의 암모니아의 방출을 촉매화하는 효소의 양으로서 정의된다. ≥0.1 IU/ml의 혈청 L-아스파라기나제 활성(SAA) 수준은 일반적으로, 아스파라긴의 치료적 감소를 제공하는 것으로 여겨진다.
많은 L-아스파라기나제가 여러 가지 상이한 공급원 유기체, 예컨대 박테리아, 식물 및 진균류에서 식별되었다. 상기 주지된 바와 같이, 이. 콜라이 L-아스파라기나제 및 이. 크리산테미 L-아스파라기나제는 ALL의 치료를 위해 임상적으로 승인된 유일한 L-아스파라기나제이다.
L-아스파라기나제에 대한 서열 정보는 온라인 데이터베이스, 예컨대 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/를 통해 쉽게 입수 가능하다. 이. 크리산테미로부터의 L-아스파라기나제는 본 발명에 사용하기에 이상적으로 적합하다. 기준 이. 크리산테미 L-아스파라기나제 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2에 의해 제공된다.
일 구현예에서, L-아스파라기나제는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성, 예를 들어 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열과 적어도 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 동일성을 갖는다.
본 발명자들은, 이. 크리산테미 이외의 공급원으로부터의 L-아스파라기나제(이. 콜라이-유래 L-아스파라기나제를 제외함)는 또한 본 발명을 특징화하는 유리한 기술적 효과를 제공할 것으로 여긴다.
예를 들어, 일 구현예에서, L-아스파라기나제는 슈도모나스 푸티다 L-아스파라기나제이다. 기준 슈도모나스 푸티다 L-아스파라기나제 서열은 SEQ ID NO: 3에 의해 제공된다:
Figure pct00003
일 구현예에서, L-아스파라기나제는 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성, 예를 들어 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열과 적어도 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 동일성을 갖는다.
일 구현예에서, L-아스파라기나제는 슈도모나스 플루오레센스 L-아스파라기나제이다. 기준 슈도모나스 플루오레센스 L-아스파라기나제 서열은 SEQ ID NO: 4에 의해 제공된다:
Figure pct00004
일 구현예에서, L-아스파라기나제는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성, 예를 들어 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열과 적어도 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 동일성을 갖는다.
일 구현예에서, L-아스파라기나제는 올리넬라 석시노게네스(Wolinella succinogenes) L-아스파라기나제이다. 기준 올리넬라 석시노게네스 L-아스파라기나제 서열은 SEQ ID NO: 5에 의해 제공된다:
Figure pct00005
일 구현예에서, L-아스파라기나제는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성, 예를 들어 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열과 적어도 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 동일성을 갖는다.
일 구현예에서, 접합체는 L-아스파라기나제의 단편, 예컨대 SEQ ID NO: 2, 3, 4 또는 5의 단편을 포함한다. 일 구현예에서, 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제는 L-아스파라기나제의 단편, 예컨대 SEQ ID NO: 2, 3, 4 또는 5의 단편을 포함한다. 일 구현예에서, 단편은 기준 L-아스파라기나제 아미노산 서열의 적어도 30개 연속(consecutive) 아미노산, 예를 들어 기준 L-아스파라기나제 아미노산 서열의 적어도 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310개 이상의 연속 아미노산을 포함한다. 일 구현예에서, 기준 L-아스파라기나제 아미노산 서열은 온라인 데이터베이스 상에서 공개적으로 입수 가능한 네이티브 L-아스파라기나제 아미노산 서열이다. 본 발명에 따르면, L-아스파라기나제의 단편은 전장 L-아스파라기나제의 시험관내 활성의 적어도 60%, 예를 들어 전장 L-아스파라기나제의 시험관내 활성의 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100%의 시험관내 활성을 갖는다.
본 발명의 접합체는 수용성 중합체를 포함한다.
전형적으로, 수용성 중합체는 비접합된 L-아스파라기나제와 비교하여 확장된(expanded) 유체역학적 부피(hydrodynamic volume)를 제공한다. PEG화 및 PAS화(PASylation)는 확장된 유체역학적 부피를 제공하는 것으로 잘 알려져 있다. 유체역학적 부피는 당업계에서 임의의 적합한 방법을 사용하여, 예를 들어 분석적 크기 배제 크로마토그래피 및 동적 광 산란 측정에 의해 평가될 수 있다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 발명자들은, 증가된 유체역학적 부피 및 상응하는 증가된 수 차폐(water shielding)가 생체내 t1/2을 증가시키는 것으로 돕는 한편, 접합된 L-아스파라기나제의 면역원성을 감소시킨다고 여긴다.
일 구현예에서, 수용성 중합체는 (a) 폴리 알킬렌 옥사이드; (b) 폴리 아미노산; 및 (c) 다당류로 이루어진 군으로부터 선택된다.
전형적으로, 수용성 중합체는 무독성이다.
일 구현예에서, 수용성 중합체는 PEG를 포함한다. 일 구현예에서, 수용성 중합체는 PEG로 구성된다. PEG는 당업계에 매우 잘 알려져 있고, 여러 가지 상이한 배치(전형적으로 선형 또는 분지형(다중-아암(multi-arm) 포함)으로 그리고 여러 가지 상이한 중량으로 이용 가능하다. PEG 중량은 전형적으로 500 Da 내지 20000 Da 범위 내에 있다. PEG 혼합물은 다분산성(polydisperse)이지만, 현재의 상업적인 PEG 혼합물은 전형적으로 낮은 다분산성(polydispersity)을 나타내고, 다분산성 지수(PDI) 값은 1에 근접한다(예를 들어 PDI = 1.05, 1.1, 1.15 또는 1.2). PEG 중량의 맥락에서 사용될 때, 용어 "약"은 이러한 다분산성을 반영한다.
일 구현예에서, PEG는 약 10000 Da 미만, 예를 들어 약 10000 Da 미만, 약 9000 Da 미만, 약 8000 Da 미만, 약 7000 Da 미만, 약 6000 Da 미만, 약 5000 Da 미만, 약 4000 Da 미만, 약 3000 Da 미만, 약 2000 Da 미만, 약 1000 Da 미만, 약 800 Da 미만의 분자량을 갖는다. 일 구현예에서, PEG는 약 5000 Da 미만의 분자량을 갖는다.
일 구현예에서, PEG는 약 10000 Da의 분자량을 갖는다. 일 구현예에서, PEG는 약 5000 Da의 분자량을 갖는다. 일 구현예에서, PEG는 선형 5000 Da PEG 사슬을 포함한다. 일 구현예에서, PEG는 분지형 5000 Da PEG 사슬을 포함한다.
PEG를 단백질에 접합시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 전형적으로 화학적 접합을 수반한다. 전형적으로, PEG는, 단백질 내의 아미노산과 우선적으로 반응하는 활성화된/작용화된 모이어티를 함유한다. 작용적 모이어티는 전형적으로 단백질(예컨대 리신, 시스테인, 아스파르트산, 글루탐산 및 N-말단) 내의 반응성 부위의 이용 가능성에 기초하여 선택된다. 일 구현예에서, PEG는 활성 에스테르, 예컨대 숙신이미딜 에스테르를 함유한다. 일 구현예에서, PEG는 카르보네이트 모이어티, 예컨대 숙신이미딜 카르보네이트를 함유한다.
많은 호모이작용화된(homobifunctionalized), 헤테로이작용화된(heterobifunctionalized), 그리고 모노-메톡시 말단캡핑된 모노작용화된(monofunctionalized) PEG는 상업적으로 입수 가능하다. 일 구현예에서, PEG는 메톡시PEG(mPEG), 예컨대 작용화된 mPEG이다. 일 구현예에서, PEG는 하이드록시PEG(HO-PEG), 예컨대 작용화된 HO-PEG이다.
일 구현예에서, PEG는 L-아스파라기나제의 하나 이상의 아미노산에 공유 연결된다. 일 구현예에서, PEG는 아미드 결합을 통해 L-아스파라기나제의 하나 이상의 아미노산에 공유 연결된다.
일 구현예에서, 본 발명의 접합체는 화학식을 갖는다:
Figure pct00006
본 발명의 접합체는 하기 화학식으로 표시되는 바와 같이 다수의 PEG 모이어티를 포함할 수 있으며:
Figure pct00007
여기서, n = 1 내지 30, 전형적으로 5 내지 15이다.
일 구현예에서, 수용성 중합체는 PAS 중합체를 포함한다. 일 구현예에서, 수용성 중합체는 PAS 중합체로 구성된다. PAS 중합체는 프롤린(P), 알라닌(A) 및 세린(S)을 포함하는 입체배좌적으로(conformationally)-무질서화된(disordered) 폴리펩타이드 사슬이다. PAS 중합체는 PEG와 유사한 생물물리학적 특성을 나타내고, PAS 중합체에의 접합("PAS화")은 또한 생체내 t1/2을 연장시키고, 접합된 단백질의 면역원성을 감소시킨다.
PEG화를 능가하는 PAS화의 이점은, PAS 중합체는 재조합 발현 동안 L-아스파라기나제에 융합될 수 있다는 점이다. 다르게 말하자면, L-아스파라기나제 및 PAS 중합체는 단일 폴리펩타이드로서 발현될 수 있다. 유리하게는, PAs화는 별도의 접합 단계(PEG화에 의해 필요한 바와 같이)에 대한 요건을 피하므로, 본 발명의 접합체의 생성을 단순화시킨다. 그러므로, 일 구현예에서, 본 발명의 접합체는 단일 폴리펩타이드 사슬로서 발현되는 L-아스파라기나제 및 PAS 중합체를 포함한다.
당업자는, 프롤린이 코돈: "CCU", "CCC", "CCA" 및 "CCG"에 의해 인코딩되며; 알라닌이 코돈: "GCU", "GCC", "GCA" 및 "GCG"에 의해 인코딩되고; 세린이 코돈: "UCU", "UCC", "UCA", "UCG", "AGU" 및 "AGC"에 의해 인코딩됨을 알 것이다.
일 구현예에서, PAS 중합체 내 아미노산 잔기 중 적어도 80%는 프롤린, 알라닌 및 세린으로 구성되고, 예를 들어 PAS 중합체 내 아미노산 잔기 중 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100%는 프롤린, 알라닌 및 세린으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, PAS 중합체는 적어도 10개의 아미노산 잔기, 예를 들어 적어도 15, 20, 25 또는 30개의 아미노산 잔기를 포함한다.
일 구현예에서, PAS 중합체는 10 내지 60개의 아미노산 잔기를 포함한다. 일 구현예에서, PAS 중합체는 15 내지 50개의 아미노산 잔기를 포함한다. 일 구현예에서, PAS 중합체는 20 내지 40개의 아미노산 잔기를 포함한다. 일 구현예에서, PAS 중합체는 20 내지 30개의 아미노산 잔기를 포함한다.
일 구현예에서, PAS 중합체 내 아미노산 잔기 중 적어도 80%는 프롤린, 알라닌 및 세린으로 구성되고, PAS 중합체는 10 내지 60개의 아미노산 잔기를 포함한다.
일 구현예에서, PAS 중합체는 정제 태그를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 정제 태그는 His6-태그이다. 일 구현예에서, 정제 태그는 Strep-태그이다.
일 구현예에서, PAS 중합체는 L-아스파라기나제의 N-말단에 위치한다. 일 구현예에서, PAS 중합체는 L-아스파라기나제의 C-말단에 위치한다. 일 구현예에서, PAS 중합체는 L-아스파라기나제의 N-말단 및 C-말단에 위치한다.
일 구현예에서, PAS 중합체 및 L-아스파라기나제는 링커를 통해 연결된다. 일 구현예에서, 스페이서는 아미노산 링커이다. 전형적으로, 링커는 약 20-25개까지의 아미노산 잔기를 포함한다. 그러므로, 일 구현예에서, 본 발명의 접합체는 단일 폴리펩타이드 사슬로서 발현되는 L-아스파라기나제, PAS 중합체 및 하나 이상의 링커를 포함한다.
본 발명의 L-아스파라기나제는 이. 콜라이 이외의 숙주 세포에서 발현된다.
박테리아 속의 적합한 숙주 세포는 에르위니아, 슈도모나스, 바실러스, 락토바실러스, 및 스트렙토마이세스의 세포를 포함하지만 이로 제한되지는 않는다. 박테리아 종의 적합한 세포는 에르위니아 크리산테미, 슈도모나스 플루오레센스, 슈도모나스 푸티다, 슈도모나스 애루기노사, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 리헤니포르미스, 락토바실러스 브레비스 및 스트렙토마이세스 리비단스의 세포를 포함하지만 이로 제한되지는 않는다. 일 구현예에서, 숙주 세포는 슈도모나스 애루기노사, 슈도모나스 플루오레센스 및 슈도모나스 푸티다로 이루어진 목록으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 숙주 세포는 에르위니아 크리산테미이다.
사상성 진균류의 적합한 숙주 세포는 유미코티나(Eumycotina) 아부(subdivision)의 모든 사상성 형태를 포함한다. 사상성 진균류 속의 적합한 세포는 아크레모니움(Acremonium), 아스페르길루스(Aspergillus), 아우레오바시디움(Aureobasidium), 브제르칸데라(Bjerkandera), 세리포리옵시스(Ceriporiopsis), 크리소포리움(Chrysoporium), 코프리누스(Coprinus), 코리올루스(Coriolus), 코리나스쿠스(Corynascus), 채토미움(Chaetomium), 크립토콕커스(Cryptococcus), 필로바시디움(Filobasidium), 푸사리움(Fusarium), 기베렐라(Gibberella), 휴미콜라(Humicola), 히포크레아(Hypocrea), 마그나포르테(Magnaporthe), 무코르(Mucor), 미셀리오프토라(Myceliophthora), 네오칼리마스틱스(Neocallimastix), 뉴로스포라(Neurospora), 패실로마이세스(Paecilomyces), 페니실리움(Penicillium), 파네로캐테(Phanerochaete), 플레비아(Phlebia), 피로마이세스(Piromyces), 플류로투스(Pleurotus), 스키탈디움(Scytaldium), 스키조필룸(Schizophyllum), 스포로트리쿰(Sporotrichum), 탈라로마이세스(Talaromyces), 테르모아스쿠스(Thermoascus), 티엘라비아(Thielavia), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 트라메테스(Trametes), 및 트리코데르마(Trichoderma)의 세포를 포함하지만 이로 제한되지는 않는다. 소정의 양태에서, 재조합 세포는 트리코데르마 종(Trichoderma sp.)(예를 들어, 트리코데르마 레에세이(Trichoderma reesei)), 페니실리움 종(Penicillium sp.), 휴미콜라 종(Humicola sp.)(예를 들어, 휴미콜라 인솔렌스(Humicola insolens); 아스페르길루스 종(Aspergillus sp.)(예를 들어, 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger), 크리소스포리움 종(Chrysosporium sp.), 푸사리움 종(Fusarium sp.), 또는 히포크레아 종(Hypocrea sp)이다. 적합한 세포는 또한, 이러한 사상성 진균류 속의 다양한 불완전세대형(anamorph) 및 완전세대형(teleomorph) 형태의 세포를 포함할 수 있다.
사상성 진균류 종의 적합한 세포는 아스페르길루스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스페르길루스 포에티두스(Aspergillus foetidus), 아스페르길루스 야포니쿠스(Aspergillus japonicus), 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger), 아스페르길루스 오리재(Aspergillus oryzae), 크리소스포리움 루크노웬세(Chrysosporium lucknowense), 푸사리움 박트리디오이데스(Fusarium bactridioides), 푸사리움 세레알리스(Fusarium cerealis), 푸사리움 크로오크웰렌세(Fusarium crookwellense), 푸사리움 쿨모룸(Fusarium culmorum), 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum), 푸사리움 그라미눔(Fusarium graminum), 푸사리움 헤테로스포룸(Fusarium heterosporum), 푸사리움 네군디(Fusarium negundi), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 푸사리움 레티쿨라툼(Fusarium reticulatum), 푸사리움 로세움(Fusarium roseum), 푸사리움 삼부시눔(Fusarium sambucinum), 푸사리움 사르코크로움(Fusarium sarcochroum), 푸사리움 스포로트리키오이데스(Fusarium sporotrichioides), 푸사리움 설푸레움(Fusarium sulphureum), 푸사리움 토룰로숨(Fusarium torulosum), 푸사리움 트리코테키오이데스(Fusarium trichothecioides), 푸사리움 베네나툼(Fusarium venenatum), 브제르칸데라 아두스타(Bjerkandera adusta), 세리포리옵시스 아네이리나(Ceriporiopsis aneirina), 세리포리옵시스 아네이리나(Ceriporiopsis aneirina), 세리포리옵시스 카레기에아(Ceriporiopsis caregiea), 세리포리옵시스 길베센스(Ceriporiopsis gilvescens), 세리포리옵시스 판노신타(Ceriporiopsis pannocinta), 세리포리옵시스 리불로사(Ceriporiopsis rivulosa), 세리포리옵시스 서브루파(Ceriporiopsis subrufa), 세리포리옵시스 서브베르미스포라(Ceriporiopsis subvermispora), 코프리누스 시네레우스(Coprinus cinereus), 코리올루스 히르수투스(Coriolus hirsutus), 휴미콜라 인솔렌스(Humicola insolens), 휴미콜라 라누기노사(Humicola lanuginosa), 무코르 미에헤이(Mucor miehei), 미셀리오프토라 테르모필라(Myceliophthora thermophila), 뉴로스포라 크라싸(Neurospora crassa), 뉴로스포라 인테르메디아(Neurospora intermedia), 페니실리움 푸르푸로게눔(Penicillium purpurogenum), 페니실리움 카네센스(Penicillium canescens), 페니실리움 솔리툼(Penicillium solitum), 페니실리움 푸니쿨로숨(Penicillium funiculosum), 파네로캐테 크리소스포리움(Phanerochaete chrysosporium), 플레비아 라디아테(Phlebia radiate), 플류로투스 에린기이(Pleurotus eryngii), 탈라로마이세스 플라부스(Talaromyces flavus), 티엘라비아 테레스트리스(Thielavia terrestris), 트라메테스 빌로사(Trametes villosa), 트라메테스 베르시콜로르(Trametes versicolor), 트리코데르마 하르지아눔(Trichoderma harzianum), 트리코데르마 코닌기이(Trichoderma koningii), 트리코데르마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum), 트리코데르마 레에세이(Trichoderma reesei), 및 트리코데르마 비리데(Trichoderma viride)의 세포를 포함하지만 이로 제한되지는 않는다.
숙주 세포는 전형적으로 원핵생물 숙주 세포이다.
일 구현예에서, L-아스파라기나제는 재조합적으로 발현된다. L-아스파라기나제를 인코딩하는 핵산은 전형적으로, L-아스파라기나제의 전사 및/또는 번역을 제공하거나 일조할 수 있는 하나 이상의 핵산 서열, 예를 들어 L-아스파라기나제가 발현되는 유기체에서 작동 가능한 프로모터에 작동적으로 연결된다. 프로모터는 상동성 또는 이종성, 그리고 구성적(constitutive) 또는 유도적(inducible)일 수 있다. 프로모터 서열은 당업계에 잘 알려져 있다.
사상성 진균류 숙주에서의 재조합 발현이 요망되는 경우, 프로모터는 진균류 프로모터(사상성 진균류 프로모터를 포함하지만 이로 제한되지 않음), 식물 세포에서 작동 가능한 프로모터, 포유류 세포에서 작동 가능한 프로모터일 수 있다.
일 구현예에서, L-아스파라기나제는 숙주 세포에 의해 내인성적으로 발현된다.
일 구현예에서, L-아스파라기나제는 합성적으로 생성된다(전형적으로 숙주 세포의 사용을 수반하지 않으면서). L-아스파라기나제의 합성적 생성은 본 발명의 조성물에서 HCP의 존재를 실질적으로 피한다.
L-아스파라기나제는 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들어, 크로마토그래피(예를 들어, 이온(음이온/양이온) 교환, 친화도 - 니켈 친화도 및 글루타티온 친화도 포함, 및 크기 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차별적 용해도(differential solubility)에 의해, 또는 단백질의 정제를 위한 임의의 다른 표준 기법에 의해 숙주 세포로부터 회수되고/거나 정제될 수 있다. 이에 더하여, L-아스파라기나제는 정제를 용이하게 하기 위해 이종성 폴리펩타이드 서열에 융합될 수 있다. 이러한 정제 태그는 당업계에 알려져 있고, 임의의 종래의 태그가 사용될 수 있다.
이. 콜라이-유래 L-아스파라기나제를 이전에 투여받은 적이 있는 환자는 예를 들어 환자의 의료 기록을 검토함으로써 쉽게 식별될 수 있으며, 이는 전형적으로 환자가 Oncaspar®를 이전에 투여받은 적이 있음을 나타낼 것이다.
일 구현예에서, 환자는 이. 콜라이-유래 L-아스파라기나제를 이용한 치료를 받지만 이. 콜라이-유래 L-아스파라기나제에 대해 과민반응을 갖는 것으로 식별되지 않는다.
일 구현예에서, 환자는 이. 콜라이-유래 L-아스파라기나제에 대해 과민반응을 갖는 것으로 식별된다. 다양한 유형의 과민반응은 당업자에게 알려져 있고, 예를 들어 알레르기 반응, 아나필락시스 쇼크, 및 준임상(sub-clinical) 과민반응(침묵 비활성화로도 알려져 있음)을 포함한다.
이. 콜라이-유래 L-아스파라기나제에 대해 과민반응을 갖는 환자는 이. 콜라이-유래 L-아스파라기나제에 노출 후 알레르기 반응에 의해 식별될 수 있다. 알레르기 반응과 관련된 증상은 잘 알려져 있고, 피부 자극(예를 들어 일시적 홍조(transient flushing), 발진(rash), 두드러기(urticaria)), 호흡 곤란(예를 들어 기관지경련(bronchospasm), 천명(wheezing)), 구토, 설사, 부종(예를 들어 혈관부종(angioedema)) 및 저혈압을 포함하지만 이로 제한되지는 않는다.
환자는 이. 콜라이-유래 L-아스파라기나제에 반응하여 아나필락시스 쇼크를 경험했을 수 있다. 아나필락시스 쇼크는 노출 후 신속하게 발생하고 전형적으로 인후(throat) 및/또는 혀 팽창, 구토, 중증 피부 자극 및 저혈압을 포함하지만 이로 제한되지 않는 하나 이상의 증상을 수반하는 알레르기 반응이다.
환자는 이. 콜라이-유래 L-아스파라기나제에 대한 준임상 과민반응(침묵 비활성화로도 알려져 있음)을 가질 수 있다. 준임상 과민반응은 과민반응(예컨대 상기 기재된 바와 같이 알레르기 반응과 관련된 것)의 임상적 징후의 부재 하에 항-이. 콜라이 L-아스파라기나제 항체 반응을 특징으로 한다. 준임상 과민반응을 갖는 환자는, 항-이. 콜라이 L-아스파라기나제 항체를 발달시켰던 환자로서 식별될 수 있다. 항-이. 콜라이-유래 L-아스파라기나제 항체의 발달은 당업계에 알려진 다양한 방법, 예를 들어 효소-연결 면역흡착 검정(ELISA)에 의해 식별될 수 있다.
준임상 과민반응은 또한, 이. 콜라이-유래 L-아스파라기나제를 이용한 치료에도 불구하고 환자의 임상적 증상(예를 들어 ALL)의 점진적인 악화로서 식별될 수 있다. 준임상 과민반응은 또한, 시간 경과에 따른 혈청 L-아스파라기나제 활성을 평가함으로써 식별될 수 있다.
환자는 전형적으로 포유류, 바람직하게는 인간이다.
일 구현예에서, 환자는 21세 이하이다. 일 구현예에서, 환자는 18세 이하이다. 일 구현예에서, 환자는 15세 이하이다. 일 구현예에서, 환자는 12세 이하이다. 일 구현예에서, 환자는 8세 이하이다. 일 구현예에서, 환자는 6세 이하이다. 일 구현예에서, 환자는 4세 이하이다. 일 구현예에서, 환자는 2세 이하이다. 일 구현예에서, 환자는 22세 이상이다.
L-아스파라긴 아미노하이드롤라제 활성을 결정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 접합체는 이. 콜라이에서 발현되었던 동등한 접합체와 비교하여 적어도 80%의 시험관내 활성, 예를 들어 이. 콜라이에서 발현되었던 동등한 접합체의 적어도 80%, 90% 또는 100%의 시험관내 활성을 갖는다.
일 구현예에서, L-아스파라긴 아미노하이드롤라제 활성은 네슬러 시약처리(Nesslerisation) 방법을 사용하여 측정되며, 이 방법은 L-아스파라긴에 대한 L-아스파라기나제의 촉매적 활성에 의해 유리되는 암모니아의 양을 결정한다. 예를 들어, 시험 시료는 900 μL의 Tris-HCL 완충제로서 제조될 수 있고, pH 8.6. L-아스파라기나제(100 μL)에서 L-아스파라긴은 시험 시료에 첨가되고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션될 수 있다. 30분 후, 반응은 1.5 M 트리클로로아세트산 용액을 첨가함으로써 켄칭(quench)될 수 있다. 그 후에, 시료는 원심분리되어, 임의의 미립자를 제거한다. 그 후에, 100 μL의 상층액은, 3.8 mL의 물 및 네슬러 시약을 함유하는 튜브에 첨가되고, 15분 동안 인큐베이션될 수 있다. 그 후에, 시료는 분광광도적으로(425 nm에서) 분석되어, L-아스파라기나제에 의한 L-아스파라긴의 촉매작용에 의해 유리되는 암모니아의 상대량의 지표(indication)를 제공한다. 네슬러 시약처리 방법은 시험관내 L-아스파라기나제 활성의 평가에 이상적으로-적합화된다.
L-아스파라긴 아미노하이드롤라제 활성을 결정하는 또 다른 방법은 L-아스파라기나제를 L-아스파르틱 β-하이드록사메이트와 함께 인큐베이션하는 단계를 수반한다. L-아스파르틱 β-하이드록사메이트는 촉매작용되어 L-아스파라긴 및 하이드록실아민을 산출하며, 이는 그 후에 8-하이드록시퀴놀린과 축합되고 인도옥신으로 산화된다. L-아스파라긴 아미노하이드롤라제 활성은 분광광도법적으로(710 nm에서) 결정된다(예를 들어 문헌[Lanvers 등 Analytical Biochemistry (2002), 309(1):117-126] 참조). L-아스파르틱 β-하이드록사메이트 촉매작용 방법은 체액 시료, 예컨대 혈청에서 L-아스파라기나제 활성의 평가를 위해 이상적으로 적합화된다. L-아스파르틱 β-하이드록사메이트 촉매작용 방법은 - 예를 들어 L-아스파라기나제의 투여(본 발명의 접합체의 투여를 포함) 후 간격을 두고 얻은 혈장 시료에서 L-아스파라기나제 활성을 평가함으로써 생체내 t1/2의 평가를 위해 이상적으로 적합화된다.
본 발명의 접합체는 전형적으로, 동등한 단백질 용량(즉, 투여되는 단백질의 중량: 체중)으로 투여될 때, L-아스파라기나제가 수용성 중합체에 접합되지 않을 때보다 더 긴 생체내 t1/2을 갖는다. 일 구현예에서, 접합체는 이. 크리산테미로부터의 L-아스파라기나제를 포함하고, EwASNase보다 더 긴 t1/2을 갖는다. L-아스파라기나제가 이. 크리산테미로부터의 것이고 수용성 중합체가 PEG를 포함하는 일 구현예에서, 접합체는 EwASNase보다 더 긴 t1/2을 갖는다. L-아스파라기나제가 이. 크리산테미로부터의 것이고 수용성 중합체가 PAS 중합체를 포함하는 일 구현예에서, 접합체는 EwASNase보다 더 긴 t1/2을 갖는다.
일 구현예에서, 접합체는 동등한 단백질 용량(즉, 투여되는 단백질의 중량: 체중)으로 투여될 때, 이. 크리산테미로부터의 L-아스파라기나제를 포함하고 EcASNase보다 더 긴 t1/2을 갖는다. L-아스파라기나제가 이. 크리산테미로부터의 것이고 수용성 중합체가 PEG를 포함하는 일 구현예에서, 접합체는 EcASNase보다 더 긴 t1/2을 갖는다. L-아스파라기나제가 이. 크리산테미로부터의 것이고 수용성 중합체가 PAS 중합체를 포함하는 일 구현예에서, 접합체는 EcASNase보다 더 긴 t1/2을 갖는다.
일 구현예에서, 동등한 단백질 용량(즉, 투여되는 단백질의 중량: 체중)으로 투여될 때, 접합체는 이. 크리산테미로부터의 L-아스파라기나제이고 Oncaspar®와 유사한 또는 더 긴 t1/2을 갖는다. L-아스파라기나제가 이. 크리산테미로부터의 것이고 수용성 중합체가 PEG를 포함하는 일 구현예에서, 접합체는 Oncaspar®와 유사한 또는 더 긴 t1/2을 갖는다. L-아스파라기나제가 이. 크리산테미로부터의 것이고 수용성 중합체가 PAS 중합체를 포함하는 일 구현예에서, 접합체는 Oncaspar®와 유사한 또는 더 긴 t1/2을 갖는다. "유사한" t1/2은 Oncaspar®의 t1/2의 적어도 70%, 예를 들어 Oncaspar®의 t1/2의 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 105%, 110%, 115%, 120%, 125% 또는 적어도 130%를 지칭한다.
"더 긴" t1/2은 적어도 10% 더 긴, 예를 들어 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275 또는 적어도 300% 더 긴 t1/2을 지칭한다.
본 발명의 접합체 및 조성물은 투약 제형(dosage formaultiaon)과 상용성인(상용성) 방식으로 그리고 이러한 치료적으로 효과적일 양(즉, "치료적 유효량")으로 환자에게 투여된다.
본 발명의 접합체 및 조성물은 전형적으로 이. 콜라이-유래 L-아스파라기나제의 처리 후 2-선 또는 3-선 치료법으로서 투여된다.
본 발명의 접합체 및 조성물은 일반적으로, 종래의 경로, 예를 들어 정맥내, 피하, 복강내, 또는 점막 경로에 의해 투여된다. 투여는 전형적으로 비경구 투여, 예를 들어 정맥내 또는 근육내 주사에 의한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 접합체(또는 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제)는 약 100 IU/m2 내지 약 30000 IU/m2(약 0.2 내지 60 mg 단백질/m2) 범위의 용량으로 투여된다. 일 구현예에서, 본 발명의 접합체는 약 100 IU/m2 내지 약 2500 IU/m2, 예컨대 약 100 IU/m2 내지 약 500 IU/m2, 또는 약 500 IU/m2 내지 약 2500 IU/m2의 용량으로 투여된다. 일 구현예에서, 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제는 약 6000 IU/m2 내지 약 25000 IU/m2, 예컨대 약 6000 IU/m2 내지 약 10000 IU/m2, 또는 약 10000 IU/m2 내지 약 25000 IU/m2의 용량으로 투여된다. ≤21세 연령의 소아 환자에서, 본 발명의 접합체는 전형적으로, >21세 연령의 환자에서보다 더 낮은 용량으로 투여된다.
일 구현예에서, 치료는 주당 3회 미만의 본 발명의 접합체 또는 조성물의 투여를 포함한다. 일 구현예에서, 투여는 주당 2회 미만의 본 발명의 접합체 또는 조성물의 투여를 포함한다. 일 구현예에서, 치료는 주당 1회 미만의 본 발명의 접합체 또는 조성물의 투여를 포함한다. 일 구현예에서, 투여는 적어도 7-일 간격, 예를 들어 적어도 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21-일 간격의 본 발명의 접합체 또는 조성물의 투여를 포함한다.
일 구현예에서, 혈청 L-아스파라기나제 활성은 본 발명의 접합체 또는 조성물의 다음 투여 전에 측정된다. 일 구현예에서, 혈청 L-아스파라기나제 활성을 요망되는 수준까지 상승시키기 위해 투여되는 용량은 증가된다. 일 구현예에서, 혈청 L-아스파라기나제 활성을 요망되는 수준까지 상승시키기 위해 투여 간격은 저하된다. 일 구현예에서, 혈청 L-아스파라기나제 활성을 요망되는 수준까지 상승시키기 위해 투여되는 용량은 증가되고 투여 간격은 저하된다. 요망되는 혈청 L-아스파라기나제 활성 수준은 전형적으로, 아스파라긴의 치료 감소를 제공하는 수준이다.
일 구현예에서, 본 발명의 접합체 또는 조성물은 단독 치료법으로서 투여된다. 일 구현예에서, 본 발명의 접합체 또는 조성물은 병용 치료법의 파트로서, 예를 들어 다른 화학 치료법 또는 방사선 치료법과 병용되어 투여된다.
일 구현예에서, L-아스파라긴 결핍에 의해 치료 가능한 질환은 암이다. 일 구현예에서, 암은 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 림프육종(lymphosarcoma), 비-호지킨 림프종, NK 림프종(NK lymphoma), 및 췌장암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 암은 ALL이다.
2개의 아미노산 서열을 정렬시키는 데 이용 가능한 많은 확립된 알고리즘이 존재한다. 전형적으로, 하나의 서열은 기준 서열로서 작용하여, 이 기준 서열에 대해 시험 서열이 비교될 수 있다. 서열 비교 알고리즘은 표기된 프로그램 매개변수에 기초하여, 기준 서열에 비해 시험 서열(들)에 대한 서열 동일성 백분율을 계산한다. 비교를 위한 아미노산 서열의 정렬은 예를 들어, 컴퓨터 실행 알고리즘(예를 들어 GAP, BESTFIT, FASTA 또는 TFASTA), 또는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘에 의해 수행될 수 있다.
아래 제시된 BLOSUM62 표는 단백질 서열 분절의 약 2,000개의 국소 다중 정렬(local multiple alignment)로부터 유래되는 아미노산 치환 매트릭스이며, 관련 단백질의 500개 초과의 그룹의 고도로 보존된 영역을 나타낸다(문헌[Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919, 1992]; 참조에 의해 본원에 포함됨). 아미노산은 표준 1-글자 코드로 표시된다. 동일성 백분율은 하기와 같이 계산된다:
Figure pct00008
BLOSUM62 표
Figure pct00009
상동성 비교에서, 동일성은 적어도 10개 아미노산 잔기 길이(예를 들어 적어도 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325개 이상의 아미노산 잔기 길이) - 예를 들어 기준 서열의 전체 길이까지의 서열의 영역에 걸쳐 존재할 수 있다.
실질적으로 상동성인 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 또는 첨가를 갖는다. 많은 구현예에서, 이러한 변화는 미미한 성질을 가지며, 예를 들어, 단지 보존적 아미노산 치환을 수반한다. 보존적 치환은, 하기 그룹 내의 하나의 아미노산을 또 다른 아미노산으로 대체함으로써 이루어지는 것이다: 염기성: 아르기닌, 리신, 히스티딘; 산성: 글루탐산, 아스파르트산; 극성: 글루타민, 아스파라긴; 소수성: 류신, 이소류신, 발린; 방향족: 페닐알라닌, 트립토판; 작은 것(Small): 글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 메티오닌. 실질적으로 상동성인 폴리펩타이드는 또한, 폴리펩타이드의 폴딩(folding) 또는 활성에 유의하게 영향을 미치지 않는 다른 치환을 포함하는 것을 포괄한다; 작은 결실, 전형적으로 1 내지 약 30개의 아미노산(예컨대 1 내지 10, 또는 1 내지 5개의 아미노산); 및 작은 아미노-말단 또는 카르복실-말단 연장, 예컨대 아미노-말단 메티오닌 잔기, 약 20 내지 25개까지의 잔기의 작은 링커 펩타이드, 또는 친화도 태그.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 이. 콜라이로부터의 숙주 세포 단백질이 실질적으로 없다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 이. 콜라이로부터의 숙주 세포 단백질을 함유하지 않는다.
효소 연결된 면역흡착 검정(ELISA)은 이의 높은 검출 민감성으로 인해, HCP를 검출하기 위한 현재의 금 표준(gold standard) 방법이다. HCP 검출 프로토콜은 당업계에 잘 알려져 있고, ELISA-기초 HCP 검출 검정은 상업적으로 입수 가능하다(예를 들어 미국 소재의 Cygnus Technologies(Marvai LifeSciences의 파트)로부터의 "이. 콜라이 HCP ELISA 키트"; 영국 소재의 Abcam으로부터의 "이. 콜라이　HCP ELISA 키트(숙주 세포 단백질)").
그러나, HCP의 ELISA-기초 검출과 관련된 소정의 한계가 존재한다. 예를 들어, 항-HCP 항체 풀(pool)은 전체 HCP 집단을 망라하지 않을 수 있고, 약하게 면역원성인 HCP는 이의 검출을 용이하게 할 정도의 임의의/충분한 항체를 유도할 수 없다. 적합한 숙주 세포 및 L-아스파라기나제 공급원의 주의 깊은 식별을 통해, 본 발명은, Oncaspar®(또는 EcASNase)에 대해 과민성 반응을 발증시킨 환자 및/또는 Oncaspar®(또는 EcASNase)에 대해 항-L-아스파라기나제 항체 반응을 발달시켰으나 명시적인 알레르기 증상을 나타내지 않는 환자의 치료를 위한 초순수한 L-아스파라기나제 조제물에 대한 요건을 피하는 것을 돕는다.
본 발명의 조성물은, 약학적으로 허용 가능하고 활성 성분과 상용성인 부형제를 포함할 수 있다. 적합한 부형제는 예를 들어, 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 및 이의 조합이다. 이에 더하여, 본 발명의 조성물은 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, 및/또는 pH 완충제를 함유할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 접합체 또는 조성물은 동결건조된 형태이다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 동결건조된 형태이다. 본 발명의 접합체 또는 조성물은 동결건조되어, 분말화된 형태의 접합체 또는 조성물을 제공할 수 있다. 그 후에, 본 발명의 동결건조된 접합체 또는 조성물은 투여 전에 재구성될 수 있다. 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말은 본 발명의 접합체 또는 조성물을 포함하는 용액을 동결건조시켜, 임의의 선택적인 공동-가용화된 생체적합성 성분과 함께 접합체(또는 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제)를 포함하는 분말을 산출할 수 있다. 일반적으로, 분산액 또는 용액은 기본(basic) 분산액 매질 또는 용매(예를 들어, 희석제) 및 선택적으로, 다른 생체적합성 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 본 발명의 접합체(또는 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제)를 혼입함으로써 제조된다. 용성 희석제는, 약학적으로 허용 가능하고(인간에게 투여하기에 안전하고 무독성임), 액체 제형, 예컨대 동결건조 후 재구성되는 제형의 제조에 유용한 것이다. 희석제는 예를 들어 멸균수, 정균적 주사용수, pH 완충액(예를 들어 포스페이트-완충 식염수), 멸균 생리 식염수, 링거액 또는 덱스트로스 용액을 포함한다. 희석제는 예를 들어 염 및/또는 완충제의 수용액을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 동결건조보호제(들)를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 접합체 또는 조성물은 동결건조보호제, 예를 들어 아미노산, 예컨대 모노소듐 글루타메이트 또는 히스티딘; 메틸아민, 예컨대 베타인; 이액성(lyotropic) 염, 예컨대 마그네슘 설페이트; 폴리올, 예컨대 3가(trihydric) 또는 더 높은 분자량의 당 알코올, 예를 들어 글리세린, 덱스트란, 에리트리톨, 글리세롤, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨, 및 만니톨; 프로필렌 글리콜; 및 이의 조합과 조합되어 동결건조된다. 추가의 예시적인 동결건조보호제는 글리세린 및 젤라틴, 및 당(sugar) 멜리비오스(mellibiose), 멜레지토스(melezitose), 라피노스(raffinose), 만노트리오스(mannotriose) 및 스타키오스(stachyose)를 포함한다. 일 구현예에서, 동결건조보호제는 트레할로스를 포함한다. 일 구현예에서, 동결건조보호제는 수크로스를 포함한다. 일 구현예에서, 동결건조보호제는 트레할로스 및 수크로스를 포함한다.
동결건조보호제는, 본 발명의 접합체(또는 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제)가 저장 동안(예를 들어, 재구성 및 보관 후에) 이의 물리적 및 화학적 안정성 및 온전성(integrity)을 본질적으로 보유함을 의미하는 "보호량(protecting amount)"(예를 들어 동결건조전)으로 조성물에 첨가된다.
본 발명의 접합체 및 조성물은 주사액으로서, 액체 용액 또는 현탁액으로서 제조될 수 있다. 주사 전에 액체 중 용액 또는 액체 중 현탁액에 적합한 고체 형태가 대안적으로 제조될 수 있다.
일 구현예에서, 조성물은 투약 형태(dosage form)이다.
일 구현예에서, 조성물은 멸균이다.
본 발명의 조성물은 완충제를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 완충제는 히스티딘 하이드로클로라이드(예를 들어, L-히스티딘 HCL)를 포함한다.
본 발명의 조성물은 비이온성 계면활성제(들), 예컨대 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60 또는 폴리소르베이트 80을 안정화제로서 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 접합체를 생성하는 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 접합체를 생성하는 방법을 제공하며, 방법은
(a) 이. 콜라이 이외의 숙주 세포에서: (i) 이. 콜라이 이외의 공급원으로부터의 L-아스파라기나제 및 (ii) PAS 중합체를 인코딩하는 핵산을 발현시키는 단계; 및
(b) 접합체를 정제하는 단계
를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 접합체를 생성하는 방법을 제공하며, 방법은
(a) 이. 콜라이 이외의 숙주 세포에서 이. 콜라이 이외의 공급원으로부터의 L-아스파라기나제를 인코딩하는 핵산을 발현시키는 단계;
(b) L-아스파라기나제를 정제하는 단계; 및
(c) L-아스파라기나제를 PEG에 접합시키는 단계
를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 접합체를 생성하는 방법을 제공하며, 방법은
(a) 이. 콜라이 이외의 공급원으로부터 네이티브 L-아스파라기나제를 정제하는 단계; 및
(b) L-아스파라기나제를 PEG에 접합시키는 단계
를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제를 생성하는 방법을 제공하며, 방법은
(a) 이. 콜라이 이외의 이종성 숙주 세포에서 이. 콜라이 이외의 공급원으로부터의 L-아스파라기나제를 인코딩하는 핵산을 발현시키는 단계; 및
(b) L-아스파라기나제를 정제하는 단계
를 포함한다.
도 1 Oncaspar®에서 이. 콜라이 HCP의 결정을 위한 표준 곡선이다. HCP 농도(ng/mL)는 Y-축 상의 흡광도(A450)에 대해 X-축 상에 플롯화된다. R2 = 0.9999.
실시예
실시예 1: Oncaspar®에서 이. 콜라이 HCP의 검출
Oncaspar®의 상업적인 바이얼을 효소-연결 면역흡착 검정(ELISA)에 의해 그리고 질량 분광법에 의해 이. 콜라이 HCP의 존재에 대해 분석하였다. 분석 둘 다, Oncaspar®에서 이. 콜라이 HCP의 존재를 확인시켜 주었다.
(a) ELISA에 의한 이. 콜라이 HCP의 검출
Oncaspar®(3,750 IU)의 상업적인 바이얼을 물에서 재구성하고, 항-이. 콜라이 HCP ELISA를 사용하여 분석하였다. 시험 키트에서, ELISA 플레이트를 포착(capture) 항체(항-이. 콜라이 HCP 항체)로 예비-코팅하였다. Oncaspar®를 포착 항체와 함께 인큐베이션한 후, 검출 항체(비오틴과 접합된 제2 항-이. 콜라이 HCP 항체)를 적용하였다. 검출 항체와 함께 인큐베이션한 후, 플레이트를 비오틴-표지된 항체에 결합하는 스트렙타비딘-호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP) 접합체와 함께 인큐베이션하였다. 그 후에, "TMB"(3,3',5,5"-테트라메틸벤지딘) 기질을 첨가하였고, 이는 포착된 HRP에 의해, 플레이트에 결합된 HCP의 양에 비례하여 착색된 생성물로 전환된다. 흡광도를 450 nm에서 측정하였다.
표준 곡선을 생산하여, 이. 콜라이 HCP의 농도(ng/mL)와 흡광도(405 nm) 사이의 관계를 결정하였다. 표준 곡선(도 1)은 0.9999의 R2 값을 가졌고, 이는 데이터에서 매우 양호한 '적합도(fit)' 및 높은 신뢰도의 값을 의미한다.
ELISA 분석은, Oncaspar®의 바이얼이 약 1.1 ng의 이. 콜라이 HCP를 함유한다고 결정하였다.
Oncaspar®의 전형적인 용량은 4500 IU이고, 이는 Oncaspar®의 1.2 바이얼에 상응한다. 이에, 환자에게 매회 약 1.3 ng의 이. 콜라이 HCP를 투여하여, 이러한 환자는 Oncaspar®의 용량을 받는다.
(b) 질량분광법에 의한 이. 콜라이 HCP의 검출
Oncaspar®를 또한, 질량분광법(MS)을 사용하여 분석하였다. 구체적으로, 탠덤 질량분광법과 함께 액체 크로마토그래피(LC-MS/MS)를 사용하여, 독립적 데이터 획득('IDA'; Independent Data Acquisition)에 의해 Oncaspar® 내 미지의 HCP를 식별하였다(문헌[Patel, V.J. 등 Journal of Proteome Research, (2009). 8: 3752-3759]). 시료를 트립신을 사용하여 분해하고, 이온화하고, 이온의 전하에 대한 질량 비(m/z)를 결정하였다. 결과를 Uniprot 완전 단백질 데이터베이스에 대해 검색하여, 시료 내 HCP를 식별하였다.
5개의 주요 펩타이드를 MS에 의해 식별하였고, 이를 표 1에 요약한다:
표 1
Figure pct00010
예상된 바와 같이, 가장 풍부한 펩타이드를 이. 콜라이로부터의 L-아스파라기나제로서 식별하였다. 두번째로 가장 풍부한 펩타이드를 이. 크리산테미로부터의 L-아스파라기나제로서 식별하였다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자들은, 이. 크리산테미로부터의 L-아스파라기나제로서 식별되는 펩타이드는, 네이티브 이. 크리산테미 L-아스파라기나제와 매우 높은 서열 동일성을 갖는 이. 콜라이 L-아스파라기나제의 영역에 상응한다고 여긴다.
MS 분석은 또한, Oncaspar®에서 이. 콜라이 HCP의 존재를 확인시켜 주었다. 이러한 MS 데이터는 ELISA에 의해 생산된 결과를 추가로 확증시킨다. Oncaspar®에서 이. 콜라이 HCP 중에서, MS 분석은 (i) 추정상 설파타제 AsIA; (ii) 특징없는 단백질 YggE_OS; 및 (iii) 단백질 UshA_OS를 식별하였다.
실시예 2: Oncaspar®에서 고도로 면역원성인 이. 콜라이 HCP의 식별
Oncaspar®에서 식별된 이. 콜라이 HCP를 주 조직적합성 복합체 부류 II(MHC II)에 대한 이의 결합 친화도, 및 임의의 기지의 MHC II 수용체에 의해 제시되는 가능성(likelihood)에 대해 평가하였다. 이는 T-세포 반응의 발달에 결정적이고, 면역원성의 강한 지표를 제공한다.
공개적으로-입수 가능한 "NetMHCIIpan" 서버를 사용하여 면역원성 분석을 수행하였다. 이러한 서버는 인공 신경 네트워크를 사용하고, 결합 친화도의 500,000개 초과의 측정의 데이터세트 상에서 트레이닝하고, 3개의 MHC II 이소타입(isotype) HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP, 뿐만 아니라 마우스 분자(H-2)(세부사항에 대해서는 문헌[Jensen 등 2018, Immunology, 154. 394-406] 참조)를 망라하는 리간드 질량분광법을 용리한다.
면역원성 결과를 표 2에 나타낸다:
표 2
Figure pct00011
강한 결합제는 인간 집단 중 >99%를 망라하는 25개 HLA 대립유전자에 걸쳐 <50 nM의 친화도를 갖는다. 중간-플러스-강한 결합제는 인간 집단 중 >99%를 망라하는 25개 HLA 대립유전자에 걸쳐 <500 nM의 친화도를 갖는다(문헌[Wang 등, 2010 BMC bioinformatics. 2010;11:568]).
표 2에 제시된 바와 같이, MS에 의해 Oncaspar®에서 식별된 이. 콜라이 HCP는 매우 높은 수의 강한 결합제 및 중간-플러스-강한 결합제를 나타내었다. 따라서, Oncaspar®에서 식별된 각각의 이. 콜라이 HCP는 고도로 면역원성이다.
이. 콜라이 HCP의 투여는, 이. 콜라이로부터 유래되는 후속적으로 투여되는 L-아스파라기나제에 대한 과민성 반응을 유도하기 위해 환자를 면역학적으로 소인을 갖게 한다. HCP가 고도로 면역원성일 때, 위험하고 바람직하지 못한 면역 반응의 위험성은 증가된다.
실시예 3: 이. 크리산테미 L-아스파라기나제 및 PAS 중합체를 포함하는 접합체의 생성
이. 크리산테미 L-아스파라기나제 및 PAS 중합체를 인코딩하는 핵산을 Pc 프로모터의 제어 하에 pMMPc 벡터(GenBank 기탁 번호　KC544266) 내로 클로닝한다. 클로닝을 중합효소 사슬 반응 분석에 의해 확인한다. 그 후에, 슈도모나스 플루오레센스　균주 MB214를 전기천공에 의해 벡터로 형질전환시킨다.
형질전환된 슈도모나스 플루오레센스를 브로쓰(broth) 내로 접종하고 48시간 동안 성장시키고, 뒤이어 원심분리한다. 일련의 크로마토그래피 및 농축 단계를 수행한다. 시료 순도를 소듐 도데실 설페이트 - 폴리아크릴아미드 젤 전기영동에 의해 확인한다. 접합체의 아미노산 서열을 N-말단 단백질 시퀀싱 및 액체 크로마토그래피-질량 분광법에 의해 확인한다.
L-아스파라기나제 활성을 시험관내에서 37℃에서 네슬러 시약처리 방법에 의해 확인한다.
실시예 4: 이. 크리산테미 L-아스파라기나제 및 5000 Da PEG를 포함하는 접헙체의 생성
단계 A: 이. 크리산테미 L-아스파라기나제를 인코딩하는 핵산을 실시예 3에 기재된 바와 같이 pMMPc 벡터 내로 클로닝한다. 그 후에, 슈도모나스 플루오레센스　균주 BM214를 실시예 3에 따라 벡터로 형질전환시키고 성장시킨다. 접종 및 48시간 동안 성장 후, 그 후에 이. 크리산테미 L-아스파라기나제를 실시예 3에 제시된바와 같이 정제하고 농축시킨다.
단계 B: 그 후에, 정제된 이. 크리산테미 L-아스파라기나제(5 mg/ml)를 5000 Da 작용화된 mPEG(100 mg/ml) 및 소듐 포스페이트 완충제(100 mM; pH 8.0)의 존재 하에 2.5시간 동안 혼합한다. PEG화된 이. 크리산테미 L-아스파라기나제를 농축시키고 정제하고, L-아스파라기나제 활성을 37℃에서 네슬러 시약처리 방법에 의해 시험관내에서 확인한다.
실시예 5: 이. 크리산테미 L-아스파라기나제 접합체의 생체내 반감기 분석
실시예 3 및 4의 접합체의 약물동력학적 특성을 평가하기 위해, 접합체를 면역(immune competent) 마우스(각각 "그룹 1" 및 "그룹 2")에게 정맥내로 투여한다. 대조군으로서, "그룹 3" 마우스에게 실시예 3 단계 A에서 농축되고 정제된(즉, PEG에 접합되지 않음) 이. 크리산테미 L-아스파라기나제를 투여한다.
혈액을 안와(retro-orbital) 채혈에 의해 마우스로부터 수집한다. 채혈을 투여-전 1시간에서, 그리고 투여-후 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 36시간 및 48시간에서 수행한다. 잔여 L-아스파라기나제 활성을 L-아스파르틱 β-하이드록사메이트 촉매작용 방법에 의해 평가하고, 생체내 t1/2 값을 계산한다.
그룹 1 및 2는 그룹 3보다 유의하게 더 긴 t1/2을 나타낸다.
실시예 6: Oncaspar®에 대해 과민반응을 발증시킨 환자에 사용하기 위한 적합성.
환자 #1: ALL을 앓고 있는 남성 환자는 자신의 제3 용량의 Oncaspar®에 대해 알레르기 반응을 경험한다. 이러한 알레르기 반응 후 1주일째에, 환자는 실시예 3에 따라 제조된 접합체를 750 IU/m2의 용량으로 정맥내로 투여받는다. 환자는 이. 크리산테미 L-아스파라기나제 및 PAS 중합체의 접합체를 관용하고, 환자의 SAA 수준은 투약 후 48시간에서 치료 범위(≥0.1 IU/ml) 내에 존재한다.
환자 #2: ALL을 앓고 있는 여성 환자는 자신의 제2 용량의 Oncaspar®에 대해 알레르기 반응을 경험한다. 이러한 알레르기 반응 후 1주일째에, 환자는 실시예 3에 따라 제조된 접합체를 750 IU/m2의 용량으로 정맥내로 투여받는다. 환자는 이. 크리산테미 L-아스파라기나제 및 PAS 중합체의 접합체를 관용하고, 환자의 SAA 수준은 투약 후 48시간에서 치료 범위 내에 존재한다.
SEQUENCE LISTING <110> Porton Biopharma Limited <120> THERAPEUTIC CONJUGATE <130> P62403WO <150> GB1912020.3 <151> 2019-08-21 <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 348 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Met Glu Phe Phe Lys Lys Thr Ala Leu Ala Ala Leu Val Met Gly Phe 1 5 10 15 Ser Gly Ala Ala Leu Ala Leu Pro Asn Ile Thr Ile Leu Ala Thr Gly 20 25 30 Gly Thr Ile Ala Gly Gly Gly Asp Ser Ala Thr Lys Ser Asn Tyr Thr 35 40 45 Val Gly Lys Val Gly Val Glu Asn Leu Val Asn Ala Val Pro Gln Leu 50 55 60 Lys Asp Ile Ala Asn Val Lys Gly Glu Gln Val Val Asn Ile Gly Ser 65 70 75 80 Gln Asp Met Asn Asp Asn Val Trp Leu Thr Leu Ala Lys Lys Ile Asn 85 90 95 Thr Asp Cys Asp Lys Thr Asp Gly Phe Val Ile Thr His Gly Thr Asp 100 105 110 Thr Met Glu Glu Thr Ala Tyr Phe Leu Asp Leu Thr Val Lys Cys Asp 115 120 125 Lys Pro Val Val Met Val Gly Ala Met Arg Pro Ser Thr Ser Met Ser 130 135 140 Ala Asp Gly Pro Phe Asn Leu Tyr Asn Ala Val Val Thr Ala Ala Asp 145 150 155 160 Lys Ala Ser Ala Asn Arg Gly Val Leu Val Val Met Asn Asp Thr Val 165 170 175 Leu Asp Gly Arg Asp Val Thr Lys Thr Asn Thr Thr Asp Val Ala Thr 180 185 190 Phe Lys Ser Val Asn Tyr Gly Pro Leu Gly Tyr Ile His Asn Gly Lys 195 200 205 Ile Asp Tyr Gln Arg Thr Pro Ala Arg Lys His Thr Ser Asp Thr Pro 210 215 220 Phe Asp Val Ser Lys Leu Asn Glu Leu Pro Lys Val Gly Ile Val Tyr 225 230 235 240 Asn Tyr Ala Asn Ala Ser Asp Leu Pro Ala Lys Ala Leu Val Asp Ala 245 250 255 Gly Tyr Asp Gly Ile Val Ser Ala Gly Val Gly Asn Gly Asn Leu Tyr 260 265 270 Lys Ser Val Phe Asp Thr Leu Ala Thr Ala Ala Lys Thr Gly Thr Ala 275 280 285 Val Val Arg Ser Ser Arg Val Pro Thr Gly Ala Thr Thr Gln Asp Ala 290 295 300 Glu Val Asp Asp Ala Lys Tyr Gly Phe Val Ala Ser Gly Thr Leu Asn 305 310 315 320 Pro Gln Lys Ala Arg Val Leu Leu Gln Leu Ala Leu Thr Gln Thr Lys 325 330 335 Asp Pro Gln Gln Ile Gln Gln Ile Phe Asn Gln Tyr 340 345 <210> 2 <211> 327 <212> PRT <213> Erwinia chrysanthemi <400> 2 Ala Asp Lys Leu Pro Asn Ile Val Ile Leu Ala Thr Gly Gly Thr Ile 1 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Asp Asp Pro Glu Tyr Leu Tyr Asp Ala Ala Ile Gln His 225 230 235 240 Gly Val Lys Gly Ile Val Tyr Ala Gly Met Gly Ala Gly Ser Val Ser 245 250 255 Val Arg Gly Ile Ala Gly Met Arg Lys Ala Met Glu Lys Gly Val Val 260 265 270 Val Ile Arg Ser Thr Arg Thr Gly Asn Gly Ile Val Pro Pro Asp Glu 275 280 285 Glu Leu Pro Gly Leu Val Ser Asp Ser Leu Asn Pro Ala His Ala Arg 290 295 300 Ile Leu Leu Met Leu Ala Leu Thr Arg Thr Ser Asp Pro Lys Val Ile 305 310 315 320 Gln Glu Tyr Phe His Thr Tyr 325 <210> 3 <211> 329 <212> PRT <213> Pseudomonas putida <400> 3 Met Ile Asp His Ser Ser Leu Pro Arg Leu Ser Ile Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Ser Met Gln Ala Gln Ala Val Gly Cys Gly Val Thr Pro 20 25 30 Thr Leu Asp Cys Glu Gln Gln Leu Leu Gln Val Pro Gln Leu Arg Gln 35 40 45 Met Ala Gln Leu Asn Val Ala Ser Leu Cys Leu Val Pro Ser Ala Ser 50 55 60 Leu Asp Phe Ala Thr Leu Leu Asp Val Leu Ala Trp Ala Arg Cys Glu 65 70 75 80 Val Glu Arg Gly Ala Gln Ala Leu Val Val Ser Gln Gly Thr Asp Ser 85 90 95 Leu Glu Glu Ser Ala Tyr Phe Leu Asp Leu Leu Trp Pro Phe Asp Ala 100 105 110 Pro Leu Val Met Thr Gly Ala Met Arg Ser Ala Ser Gln Pro Gly Asn 115 120 125 Asp Gly Pro Ala Asn Leu Leu Ala Ala Ala Gln Val Ala Leu Ala Gln 130 135 140 Gly Ser Cys Gly Arg Gly Val Leu Val Val Met Asn Asp Gln Val His 145 150 155 160 Arg Ala Ala Arg Val Arg Lys Thr Ala Ser Met Ala Ile Ala Ala Phe 165 170 175 Glu Ser Pro Gly Cys Gly Pro Leu Gly Glu Val Val Glu Gly Lys Val 180 185 190 Val Tyr Arg His Pro Pro Ala Arg Gly Glu Val Leu Pro Val Pro His 195 200 205 Arg Thr Asp Gln Arg Val Ala Leu Leu Glu Ala Cys Leu Asp Ala Asp 210 215 220 Thr Ala Leu Leu Gln Ala Val Ala Pro Leu Gly Tyr Glu Gly Leu Val 225 230 235 240 Ile Ala Gly Phe Gly Ala Gly His Val Ala Ala Ser Trp Ser Asp Val 245 250 255 Leu Glu Gln Leu Ala Pro Thr Leu Pro Val Val Val Ala Thr Arg Thr 260 265 270 Gly Asn Gly Pro Thr Ala Arg Ala Thr Tyr Gly Phe Ala Gly Ala Glu 275 280 285 Ile Asp Leu Gln Lys Lys Gly Val Tyr Met Ala Gly His Leu Cys Pro 290 295 300 Arg Lys Cys Arg Ile Leu Leu Trp Leu Leu Ile Gly Thr Asp Arg Arg 305 310 315 320 His Glu Leu His Asp Trp Leu His Ala 325 <210> 4 <211> 325 <212> PRT <213> Pseudomonas fluorescens <400> 4 Met Gln Ser Ala Asn Asn Val Met Val Leu Tyr Thr Gly Gly Thr Ile 1 5 10 15 Gly Met Gln Ala Ser Ala Asn Gly Leu Ala Pro Ala Ser Gly Phe Glu 20 25 30 Val Arg Met Arg Glu Gln Phe Ala Asp Ala Asp Leu Pro Ala Trp Arg 35 40 45 Phe Arg Glu Met Ser Pro Leu Ile Asp Ser Ala Asn Met Asn Pro Ala 50 55 60 Tyr Trp Gln Arg Leu Arg Ser Ala Val Val Glu Ala Val Asp Ala Gly 65 70 75 80 Cys Asp Ala Val Leu Ile Leu His Gly Thr Asp Thr Leu Ala Tyr Ser 85 90 95 Ala Ala Ala Met Ser Phe Gln Leu Leu Gly Leu Pro Ala Pro Val Val 100 105 110 Phe Thr Gly Ser Met Leu Pro Ala Gly Val Pro Asp Ser Asp Ala Trp 115 120 125 Glu Asn Val Ser Gly Ala Leu Thr Ala Leu Ala Glu Gly Leu Glu Pro 130 135 140 Gly Val His Leu Tyr Phe His Gly Ala Leu Met Ala Pro Thr Arg Cys 145 150 155 160 Ala Lys Ile Arg Ser Phe Gly Arg Asn Pro Phe Ala Ala Leu Gln Arg 165 170 175 Lys Asp Asp Phe Ala Arg Ala Glu Thr Leu Pro Ala Ala Leu Asp Tyr 180 185 190 Arg Gln Pro Lys Ala Leu Ala Asn Val Gly Val Leu Pro Leu Ile Pro 195 200 205 Gly Phe Asp Ala Ala Gln Leu Asp Ala Ile Ile Ser Ser Gly Ile Gln 210 215 220 Gly Leu Val Leu Glu Cys Phe Gly Ser Gly Thr Gly Pro Ser Asp Asn 225 230 235 240 Pro Gln Phe Leu Ala Ser Leu Gln Arg Ala Gln Asp Gln Gly Val Val 245 250 255 Val Val Ala Ile Thr Gln Cys His Glu Gly Gly Val Glu Leu Asp Val 260 265 270 Tyr Glu Ala Gly Ser Arg Leu Arg Gly Ala Gly Val Leu Ser Gly Ala 275 280 285 Gly Met Thr Arg Glu Ala Ala Phe Gly Lys Leu His Ala Leu Leu Gly 290 295 300 Ala Gly Leu Ala Val Glu Glu Val Arg Arg Leu Val Glu Leu Asp Leu 305 310 315 320 His Thr Asn Pro Thr 325 <210> 5 <211> 330 <212> PRT <213> Wolinella succinogenes <400> 5 Met Ala Lys Pro Gln Val Thr Ile Leu Ala Thr Gly Gly Thr Ile Ala 1 5 10 15 Gly Ser Gly Glu Ser Ser Val Lys Ser Ser Tyr Ser Ala Gly Ala Val 20 25 30 Thr Val Asp Lys Leu Leu Ala Ala Val Pro Ala Ile Asn Asp Leu Ala 35 40 45 Thr Ile Lys Gly Glu Gln Ile Ser Ser Ile Gly Ser Gln Glu Met Thr 50 55 60 Gly Lys Val Trp Leu Lys Leu Ala Lys Arg Val Asn Glu Leu Leu Ala 65 70 75 80 Gln Lys Glu Thr Glu Ala Val Ile Ile Thr His Gly Thr Asp Thr Met 85 90 95 Glu Glu Thr Ala Phe Phe Leu Asn Leu Thr Val Lys Ser Gln Lys Pro 100 105 110 Val Val Leu Val Gly Ala Met Arg Ser Gly Ser Ser Met Ser Ala Asp 115 120 125 Gly Pro Met Asn Leu Tyr Asn Ala Val Asn Val Ala Ile Asn Lys Ala 130 135 140 Ser Thr Asn Lys Gly Val Val Ile Val Met Asn Asp Glu Ile His Ala 145 150 155 160 Ala Arg Glu Ala Thr Lys Leu Asn Thr Thr Ala Val Asn Ala Phe Ala 165 170 175 Ser Pro Asn Thr Gly Lys Ile Gly Thr Val Tyr Tyr Gly Lys Val Glu 180 185 190 Tyr Phe Thr Gln Ser Val Arg Pro His Thr Leu Ala Ser Glu Phe Asp 195 200 205 Ile Ser Lys Ile Glu Glu Leu Pro Arg Val Asp Ile Leu Tyr Ala His 210 215 220 Pro Asp Asp Thr Asp Val Leu Val Asn Ala Ala Leu Gln Ala Gly Ala 225 230 235 240 Lys Gly Ile Ile His Ala Gly Met Gly Asn Gly Asn Pro Phe Pro Leu 245 250 255 Thr Gln Asn Ala Leu Glu Lys Ala Ala Lys Ser Gly Val Val Val Ala 260 265 270 Arg Ser Ser Arg Val Gly Ser Gly Ser Thr Thr Gln Glu Ala Glu Val 275 280 285 Asp Asp Lys Lys Leu Gly Phe Val Ala Thr Glu Ser Leu Asn Pro Gln 290 295 300 Lys Ala Arg Val Leu Leu Met Leu Ala Leu Thr Lys Thr Ser Asp Arg 305 310 315 320 Glu Ala Ile Gln Lys Ile Phe Ser Thr Tyr 325 330

Claims (70)

  1. 환자에서 L-아스파라긴 결핍(L-asparagine depletion)에 의해 치료 가능한 질환을 치료하는 데 사용하기 위한, L-아스파라기나제(L-asparaginase) 및 수용성 중합체를 포함하는 접합체(conjugate)로서,
    (a) L-아스파라기나제는 이. 콜라이 이외의 공급원으로부터의 것이며;
    (b) L-아스파라기나제는 이. 콜라이 이외의 숙주 세포에서 발현되고;
    (c) 환자는 이. 콜라이-유래 L-아스파라기나제를 이전에 투여받은 적이 있는, 사용하기 위한 접합체.
  2. 제1항에 있어서, L-아스파라기나제는 재조합 L-아스파라기나제인, 사용하기 위한 접합체.
  3. 환자에서 L-아스파라긴 결핍에 의해 치료 가능한 질환을 치료하는 데 사용하기 위한, 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제로서,
    (a) L-아스파라기나제는 이. 콜라이 이외의 공급원으로부터의 것이며;
    (b) 이종성 숙주 세포는 이. 콜라이 이외의 숙주 세포이고;
    (c) 환자는 이. 콜라이-유래 L-아스파라기나제를 이전에 투여받은 적이 있는, 사용하기 위한 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제.
  4. 제1항 또는 제2항에 따른 사용하기 위한 접합체, 또는 제3항에 따른 사용하기 위한 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제에 있어서, 환자는 이. 콜라이-유래 L-아스파라기나제에 대한 과민반응(hypersensitivity)을 갖고 있었던, 사용하기 위한 접합체, 또는 사용하기 위한 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제.
  5. 제4항에 따른 사용하기 위한 접합체, 또는 제4항에 따른 사용하기 위한 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제에 있어서, 과민반응은 알레르기 반응, 아나필락시스 쇼크(anaphylactic shock), 및 침묵 비활성화(silent inactivation)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 사용하기 위한 접합체, 또는 사용하기 위한 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 사용하기 위한 접합체, 또는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 사용하기 위한 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제에 있어서, 이. 콜라이-유래 L-아스파라기나제는 Oncaspar®인, 사용하기 위한 접합체, 또는 사용하기 위한 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 사용하기 위한 접합체, 또는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 사용하기 위한 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제에 있어서, L-아스파라기나제는 에르위니아(Erwinia) L-아스파라기나제인, 사용하기 위한 접합체, 또는 사용하기 위한 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제.
  8. 제7항에 따른 사용하기 위한 접합체, 또는 제7항에 따른 사용하기 위한 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제에 있어서, 에르위니아 L-아스파라기나제는 이. 크리산테미(E.　chrysanthemi) L-아스파라기나제인, 사용하기 위한 접합체, 또는 사용하기 위한 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제.
  9. 제8항에 따른 사용하기 위한 접합체, 또는 제8항에 따른 사용하기 위한 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제에 있어서, 이. 크리산테미 L　아스파라기나제는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖는, 사용하기 위한 접합체, 또는 사용하기 위한 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제.
  10. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하는, 사용하기 위한 접합체.
  11. 제10항에 있어서, PEG는 약 10000 Da 미만의 분자량을 갖는, 사용하기 위한 접합체.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, PEG는 약 5000 Da 미만의 분자량을 갖는, 사용하기 위한 접합체.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, PEG는 약 4000 Da 미만의 분자량을 갖는, 사용하기 위한 접합체.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, PEG는 약 3000 Da 미만의 분자량을 갖는, 사용하기 위한 접합체.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, PEG는 약 2000 Da 미만의 분자량을 갖는, 사용하기 위한 접합체.
  16. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 수용성 중합체는 PAS 중합체인, 사용하기 위한 접합체.
  17. 제16항에 있어서, PAS 중합체 내 아미노산 잔기 중 적어도 80%는 프롤린, 알라닌 및 세린으로 구성되는, 사용하기 위한 접합체.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, PAS 중합체 내 아미노산 잔기 중 적어도 90%는 프롤린, 알라닌 및 세린으로 구성되는, 사용하기 위한 접합체.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, PAS 중합체 내 아미노산 잔기 중 적어도 95%는 프롤린, 알라닌 및 세린으로 구성되는, 사용하기 위한 접합체.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, PAS 중합체 내 아미노산 잔기 중 적어도 97%는 프롤린, 알라닌 및 세린으로 구성되는, 사용하기 위한 접합체.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, PAS 중합체 내 아미노산 잔기 중 적어도 99%는 프롤린, 알라닌 및 세린으로 구성되는, 사용하기 위한 접합체.
  22. 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, PAS 중합체 내 모든 아미노산 잔기는 프롤린, 알라닌 및 세린으로 구성되는, 사용하기 위한 접합체.
  23. 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, PAS 중합체는 적어도 10개의 아미노산 잔기를 포함하는, 사용하기 위한 접합체.
  24. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, PAS 중합체는 적어도 15개의 아미노산 잔기를 포함하는, 사용하기 위한 접합체.
  25. 제16항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, PAS 중합체는 적어도 20개의 아미노산 잔기를 포함하는, 사용하기 위한 접합체.
  26. 제16항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, PAS 중합체는 적어도 25개의 아미노산 잔기를 포함하는, 사용하기 위한 접합체.
  27. 제16항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, PAS 중합체는 적어도 30개의 아미노산 잔기를 포함하는, 사용하기 위한 접합체.
  28. 제16항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, PAS 중합체는 10 내지 60개의 아미노산 잔기를 포함하는, 사용하기 위한 접합체.
  29. 제16항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, PAS 중합체는 15 내지 50개의 아미노산 잔기를 포함하는, 사용하기 위한 접합체.
  30. 제16항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, PAS 중합체는 20 내지 40개의 아미노산 잔기를 포함하는, 사용하기 위한 접합체.
  31. 제16항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, PAS 중합체는 20 내지 30개의 아미노산 잔기를 포함하는, 사용하기 위한 접합체.
  32. 제16항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, PAS 중합체는 정제 태그를 추가로 포함하는, 사용하기 위한 접합체.
  33. 제32항에 있어서, 정제 태그는 His6-태그인, 사용하기 위한 접합체.
  34. 제32항에 있어서, 정제 태그는 Strep-태그인, 사용하기 위한 접합체.
  35. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 따른 사용하기 위한 접합체, 또는 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 따른 사용하기 위한 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제에 있어서, 숙주 세포는 슈도모나스(Pseudomonas) 속(genus)의 것인, 사용하기 위한 접합체, 또는 사용하기 위한 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제.
  36. 제35항에 따른 사용하기 위한 접합체, 또는 제35항에 따른 사용하기 위한 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제에 있어서, 숙주 세포는 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa)인, 사용하기 위한 접합체, 또는 사용하기 위한 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제.
  37. 제35항에 따른 사용하기 위한 접합체, 또는 제35항에 따른 사용하기 위한 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제에 있어서, 숙주 세포는 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)인, 사용하기 위한 접합체, 또는 사용하기 위한 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제.
  38. 제35항에 따른 사용하기 위한 접합체, 또는 제35항에 따른 사용하기 위한 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제에 있어서, 숙주 세포는 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)인, 사용하기 위한 접합체, 또는 사용하기 위한 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제.
  39. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 따른 사용하기 위한 접합체, 또는 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 따른 사용하기 위한 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제에 있어서, 환자는 21세 이하인, 사용하기 위한 접합체, 또는 사용하기 위한 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제.
  40. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 따른 사용하기 위한 접합체, 또는 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 따른 사용하기 위한 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제에 있어서, 접합체, 또는 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제는 동결건조된 형태(lyophilised form)인, 사용하기 위한 접합체, 또는 사용하기 위한 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제.
  41. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 접합체는 이. 콜라이에서 발현되었던 동등한 접합체와 비교하여 적어도 80%의 시험관내 활성을 갖는, 사용하기 위한 접합체.
  42. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 접합체는 이. 콜라이에서 발현되었던 동등한 접합체와 비교하여 적어도 90%의 시험관내 활성을 갖는, 사용하기 위한 접합체.
  43. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 접합체는 이. 콜라이에서 발현되었던 동등한 접합체만큼 적어도 높은 시험관내 활성을 갖는, 사용하기 위한 접합체.
  44. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 따른 사용하기 위한 접합체, 또는 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 따른 사용하기 위한 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제에 있어서, 상기 치료는 접합체의 정맥내 투여를 포함하는, 사용하기 위한 접합체, 또는 사용하기 위한 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제.
  45. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 따른 사용하기 위한 접합체, 또는 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 따른 사용하기 위한 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제에 있어서, 상기 치료는 접합체의 근육내 투여를 포함하는, 사용하기 위한 접합체, 또는 사용하기 위한 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제.
  46. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료는 주당 3회 미만의 접합체의 투여를 포함하는, 사용하기 위한 접합체.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료는 주당 2회 미만의 접합체의 투여를 포함하는, 사용하기 위한 접합체.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료는 주당 1회 미만의 접합체의 투여를 포함하는, 사용하기 위한 접합체.
  49. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 따른 사용하기 위한 접합체, 또는 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 따른 사용하기 위한 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제에 있어서, L-아스파라긴 결핍에 의해 치료 가능한 상기 질환은 암인, 사용하기 위한 접합체, 또는 사용하기 위한 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제.
  50. 제49항에 따른 사용하기 위한 접합체, 또는 제49항에 따른 사용하기 위한 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제에 있어서, 상기 암은 급성 림프모구성 백혈병(ALL; Acute Lymphoblastic Leukemia), 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), NK 림프종(NK lymphoma), 및 췌장암(pancreatic cancer)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 사용하기 위한 접합체, 또는 사용하기 위한 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제.
  51. 제49항 또는 제50항에 따른 사용하기 위한 접합체, 또는 제49항 또는 제50항에 따른 사용하기 위한 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제에 있어서, 상기 암은 ALL인, 사용하기 위한 접합체, 또는 사용하기 위한 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제.
  52. 조성물로서, (a) 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 따른 사용하기 위한 접합체, 및/또는 (b) 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 따른 사용하기 위한 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는, 조성물.
  53. 제52항에 있어서, 조성물은 하나 이상의 동결건조보호제(lyoprotectant)(들)를 포함하는, 사용하기 위한 조성물.
  54. 제53항에 있어서, 동결건조보호제(들)는 트레할로스 및 수크로스로 이루어진 목록으로부터 선택되는, 사용하기 위한 조성물.
  55. 제52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 동결건조된 형태(lyophilised form)인, 사용하기 위한 조성물.
  56. 제52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 용해된 형태(solubilised form)인, 사용하기 위한 조성물.
  57. 이. 콜라이-유래 L-아스파라기나제를 이전에 투여받은 적이 있는 환자에서 L-아스파라긴 결핍에 의해 치료 가능한 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 유효량의 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 접합체 또는 조성물을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  58. 이. 콜라이-유래 L-아스파라기나제를 이전에 투여받은 적이 있는 환자에서 L-아스파라긴 결핍에 의해 치료 가능한 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 유효량의 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 재조합의 이종적으로-발현된 L-아스파라기나제 또는 조성물을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서, 환자는 이. 콜라이-유래 L-아스파라기나제에 대해 과민반응을 갖고 있었던, 방법.
  60. 제59항에 있어서, 과민반응은 알레르기 반응, 아나필락시스 쇼크, 및 침묵 비활성화로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  61. 제57항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 Oncaspar®를 이전에 투여받은 적이 있는, 방법.
  62. 제57항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 21세 이하인, 방법.
  63. 제57항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 L-아스파라긴 결핍에 의해 치료 가능한 질환은 암인, 방법.
  64. 제63항에 있어서, 상기 암은 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 림프육종, 비-호지킨 림프종, NK 림프종, 및 췌장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  65. 제63항 또는 제64항에 있어서, 상기 암은 ALL인, 방법.
  66. 제57항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접합체 또는 조성물은 정맥내로 투여되는, 방법.
  67. 제57항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접합체 또는 조성물은 근육내로 투여되는, 방법.
  68. 제57항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접합체 또는 조성물은 주당 3회 미만으로 투여되는, 방법.
  69. 제57항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접합체 또는 조성물은 주당 2회 미만으로 투여되는, 방법.
  70. 제57항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접합체 또는 조성물은 주당 1회 미만으로 투여되는, 방법.
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