JP2022545253A - 治療用コンジュゲート - Google Patents

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Abstract

本発明は、大腸菌（E.coli）由来Ｌ－アスパラギナーゼを以前に投与された患者におけるＬ－アスパラギン枯渇により治療可能な疾患の治療における使用のための、Ｌ－アスパラギナーゼおよび水溶性ポリマーを含むコンジュゲートを提供する。本発明はまた、治療方法、前記コンジュゲートを含む組成物、およびコンジュゲートを製造する方法を提供する。

Description

本発明は、大腸菌（E.coli）由来Ｌ－アスパラギナーゼを以前に投与された患者におけるＬ－アスパラギン枯渇により治療可能な疾患の治療における使用のための、Ｌ－アスパラギナーゼおよび水溶性ポリマーを含むコンジュゲートに関する。本発明はまた、前記コンジュゲートを含む組成物、およびコンジュゲートを製造する方法に関する。
長年、Ｌ－アスパラギナーゼは、細胞外Ｌ－アスパラギンに依存性のがんの治療において成功裏に使用されてきた。Ｌ－アスパラギナーゼは、Ｌ－アスパラギンのアスパラギン酸およびアンモニアへの加水分解を触媒し、それらの抗新生物活性は、循環性Ｌ－アスパラギンレベルを枯渇させ、それにより、タンパク質合成のために細胞外Ｌ－アスパラギンに依拠する腫瘍細胞を殺傷することにより達成されると考えられている。
Ｌ－アスパラギナーゼは、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の治療における必須の成分であり、がん、例えば急性骨髄球性白血病、ホジキン病、急性骨髄単球性白血病、慢性リンパ球性白血病、細網肉腫、黒色肉腫およびリンパ肉腫を治療するためにも使用されている。
現在までに、３つの細菌由来Ｌ－アスパラギナーゼ調製物がＡＬＬの治療における使用のために承認されている。これらとしては、ネイティブな大腸菌Ｌ－アスパラギナーゼ、ＰＥＧ化された大腸菌Ｌ－アスパラギナーゼおよびネイティブなエルウィニア・クリサンテミ（Erwinia chrysanthemi）アスパラギナーゼが挙げられる。
ネイティブな大腸菌Ｌ－アスパラギナーゼ（「ＥｃＡＳＮａｓｅ」）は、欧州において「Ｌ－Ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ Ｍｅｄａｃ（登録商標）」および「Ｋｉｄｒｏｌａｓｅ（登録商標）」、米国において「Ｅｌｓｐａｒ（登録商標）」として市販されている。１９７０年代に、ＥｃＡＳＮａｓｅは、ＡＬＬの治療のための有効な薬物として同定され、その投与はＬ－アスパラギンの急速および強い枯渇に繋がる。しかしながら、ＥｃＡＳＮａｓｅで治療された多くの患者は望ましくない「顕性」のアレルギー症状を示し、抗Ｌ－アスパラギナーゼ抗体応答がほとんどの患者において観察された。抗Ｌ－アスパラギナーゼ抗体は、Ｌ－アスパラギンの酵素活性を遮断し、患者からのＬ－アスパラギンクリアランスの速度を増加させ得るので、高度に有害な治療効果を有し得る。ネイティブな大腸菌Ｌ－アスパラギナーゼは、米国において臨床使用のためにもはや承認されていない。
ＥｃＡＳＮａｓｅと関連付けられる免疫学的なおよび薬物動態の問題の低減を助けるために、ＥｃＡＳＮａｓｅはポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）にコンジュゲート化された。ＰＥＧは周知の水溶性ポリマーであり、ＰＥＧへのコンジュゲート化は、タンパク質の薬物動態のおよび免疫学的な特性を向上させるための長く確立された戦略である。ＰＥＧ化の周知の利点としては、残留酵素活性の向上、熱安定性の向上、ｐＨ安定性の向上、タンパク質加水分解に対する耐性の増加、インビボ半減期（ｔ１／２）の増加、および抗原性の低減が挙げられる。ＰＥＧ化の周知の利点と合致して、ＰＥＧ化されたＥｃＡＳＮａｓｅは特に、ネイティブなＥｃＡＳＮａｓｅと比較して、抗原性の低減およびｔ１／２の増加を示した。２００６年以来、ＰＥＧ化されたＥｃＡＳＮａｓｅは、小児および成人におけるＡＬＬのファーストライン治療のために承認されている。ＰＥＧ化されたＥｃＡＳＮａｓｅは文献において頻繁に「ペグアスパルガーゼ」として参照され、「Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）」として市販されている。Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）は、大腸菌から精製された大腸菌Ｌ－アスパラギナーゼであり、複数の部位において５０００Ｄａ ＰＥＧで修飾されている。
ＡＬＬの治療のために、Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）は、典型的には、注射／注入用の７５０ＩＵ（国際単位）／ｍｌの溶液として１４日毎に投与される。２１歳以下の小児患者において、推奨される用量は、典型的には、（ａ）身体表面積（ＢＳＡ）≧０．６ｍ２を有する患者において身体表面積１ｍ２当たり２，５００ＩＵのＯｎｃａｓｐａｒ（登録商標）（３．３ｍｌのＯｎｃａｓｐａｒ（登録商標）と同等）；および（ｂ）＜０．６ｍ２のＢＳＡを有する患者において体重１ｋｇ当たり８２．５ＩＵのＯｎｃａｓｐａｒ（登録商標）（０．１ｍｌのＯｎｃａｓｐａｒと同等）である。２１歳より上の患者において、（他に処方されなければ）Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）は、典型的には、身体表面積１ｍ２当たり２，０００ＩＵ（２．６７ｍｌのＯｎｃａｓｐａｒと同等）の用量で１４日毎に投与される。
ＥｃＡＳＮａｓｅと比べたその向上にもかかわらず、Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）は重要な制限により足かせされている。特に、Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）の投与は、特にはＯｎｃａｓｐａｒ（登録商標）またはＥｃＡＳＮａｓｅを以前に与えられた患者において、顕性のアレルギー症状と頻繁に関連付けられる。「サイレント不活性化（silent inactivation）」の現象もまた大きな臨床的懸念であり、該現象では、患者はＯｎｃａｓｐａｒ（登録商標）（またはＥｃＡＳＮａｓｅ）に対して抗Ｌ－アスパラギナーゼ抗体応答を起こすが、顕性のアレルギー症状を示さない。サイレント不活性化を伴う大きな懸念は、患者は、治療的な利益を受けることなくＯｎｃａｓｐａｒ（登録商標）（またはＥｃＡＳＮａｓｅ）の継続された投与を与えられるリスクがあることである。
ネイティブなＥ．クリサンテミアスパラギナーゼ（ＥｗＡＳＮａｓｅ）は、大腸菌Ｌ－アスパラギナーゼ（典型的にはＯｎｃａｓｐａｒ（登録商標））に対して過敏症を発症した患者におけるＡＬＬのセカンドまたはサードライン治療のために承認されている。Ｅ．クリサンテミ株ＮＣＰＰＢ １０６６から精製されたＥｗＡＳＮａｓｅは、米国において「Ｅｒｗｉｎａｚｅ（登録商標）」および他の場所において「Ｅｒｗｉｎａｓｅ（登録商標）」として市販されている。ＥｗＡＳＮａｓｅはＥｃＡＳＮａｓｅ（ネイティブなまたはＰＥＧ化された形態）と最小の抗原交差反応性を有するため、Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）（またはＥｃＡＳＮａｓｅ）を以前に与えられた患者は、ＥｗＡＳＮａｓｅに応答するように免疫学的にプライムされていない。そのため、ＥｗＡＳＮａｓｅは、Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）（またはＥｃＡＳＮａｓｅ）に対して過敏性反応を起こした患者の他に、Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）（またはＥｃＡＳＮａｓｅ）に対して抗Ｌ－アスパラギナーゼ抗体応答を起こした患者の継続的な治療によく適する。
Ｅｒｗｉｎａｓｅ（登録商標）は、典型的には、注射用の溶液のための１０，０００ＩＵ／バイアルの凍結乾燥物として提供される。全ての患者にとって通常のＥｒｗｉｎａｓｅ（登録商標）の用量は、身体表面積１ｍ２当たり６，０００ＩＵ（体重１ｋｇ当たり２００ＩＵ）である。Ｅｒｗｉｎａｓｅ（登録商標）ベースの療法は、プロトコールにしたがってさらに強められることがある。
その免疫学的な利点にもかかわらず、ＥｗＡＳＮａｓｅはＯｎｃａｓｐａｒ（登録商標）（およびＥｃＡＳＮａｓｅ）よりも短いｔ１／２を示す。Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）（およびＥｃＡＳＮａｓｅ）により経時的に提供されるインビボＬ－アスパラギナーゼ活性をマッチするのを助けるために、患者はより短い投与間隔でＥｗＡＳＮａｓｅを与えられる。ＡＬＬの治療のために、Ｅｒｗｉｎａｓｅ（登録商標）は典型的には週当たり３回で３週間投与される。
ＥｗＡＳＮａｓｅの投与間隔を広げたいという相当な願望が当分野において存在する。この願望は、Rau et al. Pediatr Blood Cancer. 2018; 65:e26873により認識されており、該文献は、「エルウィニアアスパラギナーゼは大腸菌ＰＥＧ－アスパラギナーゼ［Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）］の安全かつ有効な代替となることが証明されている」、および「低減された頻度の投薬レジメンは重要な利益を提供するであろう」と記載している。
Rau et al. (2018)はまた、「それは大きい、細菌由来のタンパク質であるので、アスパラギナーゼへの曝露は免疫応答を誘発する能力を有する」、および「低減された免疫原性潜在能力を有する調製物は重要な治療的な利益を提供するであろう」と記載している。
Rau et al. (2018)は小児腫瘍学グループ試験ＡＡＬＬ１４２１の結果を記載している。これは、ＡＬＬまたはリンパ芽球性リンパ腫およびＯｎｃａｓｐａｒ（登録商標）に対する過敏症を有する小児患者における「ＪＺＰ－４１６」のフェーズ２臨床試験であった。
「ＪＺＰ－４１６」は組換えＥ．クリサンテミＬ－アスパラギナーゼ（大腸菌中で発現される）および５０００Ｄａ ＰＥＧのコンジュゲートである。現在、「ＪＺＰ－４１６」は、当分野において「Ａｓｐａｒｅｃ（登録商標）」、「ＡＺＰ－０２」および「ｍＰＥＧ－ｒ－クリサンタスパーゼ」としても参照され、Ｊａｚｚ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（以前にはＡｌｉｚｅ Ｐｈａｒｍａ ＩＩ ＳＡＳ）により所有される。
残念なことに、小児腫瘍学グループ試験ＡＡＬＬ１４２１は、４人の患者のうちの３人が「臨床的な過敏症反応として現れる［ＪＺＰ－４１６］に対する過敏症または［血清アスパラギナーゼ活性］の急速なクリアランスを経験した」（Rau et al. (2018)）ために不成功であった。
試験ＡＡＬＬ１４２１の失敗は、以下の理由のために予想外であった：
（ａ）Ｅ．クリサンテミ株ＮＣＰＰＢ １０６６（Ｅｒｗｉｎａｓｅ（登録商標））から精製されたＬ－アスパラギナーゼは、Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）に対する過敏症を起こした患者での使用のために承認されている；および
（ｂ）ＰＥＧ自体は非免疫原性であると一般に考えられている。実際に、ＰＥＧ化はタンパク質の免疫原性を低減させるための周知の戦略である（上記を参照）。
試験ＡＡＬＬ１４２１の失敗を説明することを試みて、Rau et al. (2018)は、（Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）中の）大腸菌Ｌ－アスパラギナーゼは、（ＪＺＰ－４１６中の）Ｅ．クリサンテミＬ－アスパラギナーゼのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有することに基づいて、「ペグクリサンタスパーゼ［ＪＺＰ－４１６］およびペグアスパルガーゼ［Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）］のＬ－アスパラギナーゼ部分の間に交差反応性はない」はずであるとコメントしている。
代わりに、Rau et al. (2018)は、小児腫瘍学グループ試験ＡＡＬＬ１４２１の失敗を「［ＪＺＰ－４１６］のＰＥＧ部分に対する既存の免疫原性」に帰しており、彼らの結論は、ＡＡＬＬ１４２１試験の患者における既存の抗ＰＥＧ ＩｇＧ抗体の同定によりサポートされた。
最終的に、Rau et al. (2018)は、「ＰＥＧ化以外の戦略が、ペグアスパルガーゼ過敏性患者のエルウィニアアスパラギナーゼ治療スケジュールを最適化するために必要とされ得る」と結論した。
そのため、Ｅｒｗｉｎａｓｅ（登録商標）よりも長い投与間隔を有し、かつＯｎｃａｓｐａｒ（登録商標）（またはＥｃＡＳＮａｓｅ）に対する過敏性反応を起こした患者の治療のために好適なＬ－アスパラギナーゼに対する必要性が当分野において存在する。
Ｅｒｗｉｎａｓｅ（登録商標）よりも長い投与間隔を有し、かつＯｎｃａｓｐａｒ（登録商標）（またはＥｃＡＳＮａｓｅ）に対して抗Ｌ－アスパラギナーゼ抗体応答を起こしたが顕性のアレルギー症状を示さない患者の治療のために好適なＬ－アスパラギナーゼに対する必要性もまた当分野において存在する。
本発明は、Ｅｒｗｉｎａｓｅ（登録商標）よりも長い投与間隔を有し、かつＯｎｃａｓｐａｒ（登録商標）（またはＥｃＡＳＮａｓｅ）に対する過敏性反応を起こした患者の治療のために好適なＬ－アスパラギナーゼに対する必要性に取り組んだものである。本発明はまた、Ｅｒｗｉｎａｓｅ（登録商標）よりも長い投与間隔を有し、かつＯｎｃａｓｐａｒ（登録商標）（またはＥｃＡＳＮａｓｅ）に対して抗Ｌ－アスパラギナーゼ抗体応答を起こしたが顕性のアレルギー症状を示さない患者の治療のために好適なＬ－アスパラギナーゼに対する必要性に対して取り組んだものである。
本発明は、小児腫瘍学グループ試験ＡＡＬＬ１４２１の失敗は、Rau et al. (2018)により結論されたように「［ＪＺＰ－４１６］のＰＥＧ部分に対する既存の免疫原性」に起因するものではなかったという驚くべき発見に基づく。代わりに、本発明者らは、試験ＡＡＬＬ１４２１の失敗は、Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）中に存在し、ＪＺＰ－４１６中にも存在する大腸菌からの宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）に対する既存の免疫に起因することを予想外なことに発見した。換言すれば、本発明者らは、Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）の先行する投与は、大腸菌由来Ｌ－アスパラギナーゼ調製物、ＪＺＰ－４１６中に存在する大腸菌ＨＣＰに対する過敏性免疫応答を誘発するように患者を免疫学的に「プライム」したと考える。
宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）は、宿主細胞により発現される内因性タンパク質であり、前記宿主細胞により産生される治療用生成物に無関係である。ＨＣＰは、生物学的薬物中のプロセス関連不純物の主成分を構成し、ＨＣＰは多くの場合に、治療用生成物自体と相互作用することにより治療用生成物と共精製されることが報告されている。
そのため、本発明は、患者におけるＬ－アスパラギン枯渇により治療可能な疾患の治療における使用のための、Ｌ－アスパラギナーゼおよび水溶性ポリマーを含むコンジュゲートであって、
（ａ）Ｌ－アスパラギナーゼが大腸菌以外の供給源からのものであり、
（ｂ）Ｌ－アスパラギナーゼが大腸菌以外の宿主細胞中で発現され、
かつ
（ｃ）患者が大腸菌由来Ｌ－アスパラギナーゼを以前に投与されている、
使用のためのコンジュゲートを提供する。
本発明はまた、患者におけるＬ－アスパラギン枯渇により治療可能な疾患の治療における使用のための組換え異種発現Ｌ－アスパラギナーゼであって、
（ａ）Ｌ－アスパラギナーゼが大腸菌以外の供給源からのものであり、
（ｂ）異種宿主細胞が大腸菌以外の宿主細胞であり、
かつ
（ｃ）患者が大腸菌由来Ｌ－アスパラギナーゼを以前に投与されている、
使用のための組換え異種発現Ｌ－アスパラギナーゼを提供する。
本発明によれば、患者に以前に投与された大腸菌由来Ｌ－アスパラギナーゼは典型的にはＯｎｃａｓｐａｒ（登録商標）である。
典型的には、Ｌ－アスパラギナーゼは宿主細胞中で組換え発現される（即ち、Ｌ－アスパラギナーゼは「組換えＬ－アスパラギナーゼ」である）。
１つの実施形態において、宿主細胞は異種宿主細胞である。
１つの実施形態において、Ｌ－アスパラギナーゼは、大腸菌以外の供給源からのものであり、かつ大腸菌以外の宿主細胞から精製されている（例えばＥ．クリサンテミから精製されたネイティブなＥ．クリサンテミＬ－アスパラギナーゼ）。
本発明はまた、本発明による使用のためのコンジュゲートおよび薬学的に許容される賦形剤を含む組成物を提供する。
１つの実施形態において、本発明のコンジュゲートは、組換え異種発現Ｌ－アスパラギナーゼ（例えばシュードモナス（Pseudomonas）属菌中で発現されるＥ．クリサンテミＬ－アスパラギナーゼ）を含む。
本発明はまた、本発明による使用のための組換え異種発現Ｌ－アスパラギナーゼおよび薬学的に許容される賦形剤を含む組成物を提供する。
典型的には、本発明の組成物は大腸菌からの宿主細胞タンパク質を実質的に含まない。好ましくは、本発明の組成物は大腸菌からの宿主細胞タンパク質を含有しない。
本発明はまた、大腸菌由来Ｌ－アスパラギナーゼを以前に投与された患者においてＬ－アスパラギン枯渇により治療可能な疾患を治療する方法であって、前記患者に有効量の本発明のコンジュゲートまたは組成物を投与する工程を含む、方法を提供する。
本発明は、重要なおよび実世界の治療的な利点を提供する：
・本発明は、Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）（またはＥｃＡＳＮａｓｅ）で以前に治療された患者において（さらなる）過敏性反応のリスクを有意に低減させる；
・本発明は、本発明のＬ－アスパラギナーゼコンジュゲートにおける使用のために水溶性ポリマーを選択する場合の選択の自由の増加を当業者に提供する。例えば、当業者は、ＰＥＧ化の他に、他の種類の水溶性ポリマーにより提供される周知の免疫学的および薬物動態的な利点を享受し得る；
・決定的なことに、小児腫瘍学グループ試験ＡＡＬＬ１４２１の失敗の原因となる鍵となる抗原決定基を同定したので、本発明の開示はまた、Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）（またはＥｃＡＳＮａｓｅ）に対して感受性を起こしたがん患者への大腸菌由来Ｌ－アスパラギナーゼの将来的な投与の回避を助ける。そしてこれは、さらなる患者が既に敏感な患者群で苦しむことの回避を助ける。
本発明者らは、大腸菌由来Ｌ－アスパラギナーゼ（例えばＯｎｃａｓｐａｒ（登録商標））を以前に投与された患者は、大腸菌に由来するＬ－アスパラギナーゼに対する過敏性応答を誘発するように免疫学的な素因を有することを初めて決定した。
さらに、大腸菌由来Ｌ－アスパラギナーゼ（例えばＯｎｃａｓｐａｒ（登録商標））を以前に投与された患者は、その後に投与される大腸菌由来Ｌ－アスパラギナーゼが別の部分（例えばＰＥＧ）にコンジュゲート化されているかどうかにかかわらず、大腸菌に由来するＬ－アスパラギナーゼに対する過敏性応答を誘発するように免疫学的な素因を有する。
本明細書において使用される場合、「大腸菌由来Ｌ－アスパラギナーゼ」という用語は、（組換え発現または内因性発現のいずれかにより）大腸菌中で産生されたＬ－アスパラギナーゼを指す。そのため、本発明によれば、「大腸菌由来Ｌ－アスパラギナーゼ」という用語は以下を含む：
（ａ）大腸菌から精製されたネイティブな大腸菌Ｌ－アスパラギナーゼ、
（ｂ）Ｌ－アスパラギナーゼの供給源またはアミノ酸配列にかかわらず（即ち、組換え発現されるＬ－アスパラギナーゼが大腸菌Ｌ－アスパラギナーゼであるのかどうか、または組換え発現されるＬ－アスパラギナーゼが大腸菌以外の供給源、例えばＥ．クリサンテミからのものであるのかどうかにかかわらず）、大腸菌中で発現された組換えＬ－アスパラギナーゼ、ならびに
（ｃ）上記の（ａ）または（ｂ）を含む組成物および／またはコンジュゲート。
ＪＺＰ－４１６のＥ．クリサンテミＬ－アスパラギナーゼ成分は大腸菌中で組換え発現された。そのため、ＪＺＰ－４１６は、本発明によれば「大腸菌由来Ｌ－アスパラギナーゼ」である。
本明細書において使用される場合、「大腸菌以外の供給源からのＬ－アスパラギナーゼ」という用語は、大腸菌Ｌ－アスパラギナーゼのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するＬ－アスパラギナーゼ（コンジュゲート化されたものまたはコンジュゲート化されていないもののいずれか）を指す。「大腸菌アスパラギナーゼ」は、ＥｃＡＳＮａｓｅおよびＯｎｃａｓｐａｒ（登録商標）、ならびに配列番号１のアミノ酸配列を含む。典型的には、大腸菌以外の供給源からのＬ－アスパラギナーゼは、配列番号１のアミノ酸配列に対して９０％より低い配列同一性（例えば配列番号１のアミノ酸配列に対して９０％より低い、８５％より低い、８０％より低い、７５％より低い配列同一性）を有する。
ＭＥＦＦＫＫＴＡＬＡＡＬＶＭＧＦＳＧＡＡＬＡＬＰＮＩＴＩＬＡＴＧＧＴＩＡＧＧＧＤＳＡＴＫＳＮＹＴＶＧＫＶＧＶＥＮＬＶＮＡＶＰＱＬＫＤＩＡＮＶＫＧＥＱＶＶＮＩＧＳＱＤＭＮＤＮＶＷＬＴＬＡＫＫＩＮＴＤＣＤＫＴＤＧＦＶＩＴＨＧＴＤＴＭＥＥＴＡＹＦＬＤＬＴＶＫＣＤＫＰＶＶＭＶＧＡＭＲＰＳＴＳＭＳＡＤＧＰＦＮＬＹＮＡＶＶＴＡＡＤＫＡＳＡＮＲＧＶＬＶＶＭＮＤＴＶＬＤＧＲＤＶＴＫＴＮＴＴＤＶＡＴＦＫＳＶＮＹＧＰＬＧＹＩＨＮＧＫＩＤＹＱＲＴＰＡＲＫＨＴＳＤＴＰＦＤＶＳＫＬＮＥＬＰＫＶＧＩＶＹＮＹＡＮＡＳＤＬＰＡＫＡＬＶＤＡＧＹＤＧＩＶＳＡＧＶＧＮＧＮＬＹＫＳＶＦＤＴＬＡＴＡＡＫＴＧＴＡＶＶＲＳＳＲＶＰＴＧＡＴＴＱＤＡＥＶＤＤＡＫＹＧＦＶＡＳＧＴＬＮＰＱＫＡＲＶＬＬＱＬＡＬＴＱＴＫＤＰＱＱＩＱＱＩＦＮＱＹ（配列番号１）
そのため、本発明によれば、ＥｗＡＳＮａｓｅおよびＪＺＰ－４１６は、大腸菌以外の供給源からのＬ－アスパラギナーゼである。ＥｗＡＳＮａｓｅ（およびＪＺＰ－４１６）のアミノ酸配列は配列番号２により提供される。
ＡＤＫＬＰＮＩＶＩＬＡＴＧＧＴＩＡＧＳＡＡＴＧＴＱＴＴＧＹＫＡＧＡＬＧＶＤＴＬＩＮＡＶＰＥＶＫＫＬＡＮＶＫＧＥＱＦＳＮＭＡＳＥＮＭＴＧＤＶＶＬＫＬＳＱＲＶＮＥＬＬＡＲＤＤＶＤＧＶＶＩＴＨＧＴＤＴＶＥＥＳＡＹＦＬＨＬＴＶＫＳＤＫＰＶＶＦＶＡＡＭＲＰＡＴＡＩＳＡＤＧＰＭＮＬＬＥＡＶＲＶＡＧＤＫＱＳＲＧＲＧＶＭＶＶＬＮＤＲＩＧＳＡＲＹＩＴＫＴＮＡＳＴＬＤＴＦＫＡＮＥＥＧＹＬＧＶＩＩＧＮＲＩＹＹＱＮＲＩＤＫＬＨＴＴＲＳＶＦＤＶＲＧＬＴＳＬＰＫＶＤＩＬＹＧＹＱＤＤＰＥＹＬＹＤＡＡＩＱＨＧＶＫＧＩＶＹＡＧＭＧＡＧＳＶＳＶＲＧＩＡＧＭＲＫＡＭＥＫＧＶＶＶＩＲＳＴＲＴＧＮＧＩＶＰＰＤＥＥＬＰＧＬＶＳＤＳＬＮＰＡＨＡＲＩＬＬＭＬＡＬＴＲＴＳＤＰＫＶＩＱＥＹＦＨＴＹ（配列番号２）
当業者は、「大腸菌以外の宿主細胞中で発現された」という用語は、適切な場合、内因性発現および組換え発現を包含することを理解する。
Ｌ－アスパラギナーゼは、Ｌ－アスパラギンアミノヒドロラーゼ活性を有する酵素である。
１国際単位（「ＩＵ」）のＬ－アスパラギナーゼ活性は、３７℃で１分当たり１μｍｏｌのアンモニアの放出を触媒する酵素の量として定義される。≧０．１ＩＵ／ｍｌの血清Ｌ－アスパラギナーゼ活性（ＳＡＡ）レベルは、アスパラギンの治療的な低減を提供すると一般に考えられる。
多数のＬ－アスパラギナーゼが様々な異なる供給源生物、例えば細菌、植物および真菌において同定されている。上述のように、大腸菌Ｌ－アスパラギナーゼおよびＥ．クリサンテミＬ－アスパラギナーゼは、ＡＬＬの治療のために臨床的に承認されているただ２つのＬ－アスパラギナーゼである。
Ｌ－アスパラギナーゼに関する配列情報は、オンラインデータベース、例えばｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／を介して容易に入手可能である。Ｅ．クリサンテミからのＬ－アスパラギナーゼは、本発明において使用するために理想的に適している。参照Ｅ．クリサンテミＬ－アスパラギナーゼアミノ酸配列は配列番号２により提供される。
１つの実施形態において、Ｌ－アスパラギナーゼは、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性、例えば、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有する。
本発明者らは、Ｅ．クリサンテミ以外の供給源からのＬ－アスパラギナーゼ（大腸菌由来Ｌ－アスパラギナーゼを除く）もまた、本発明を特徴付ける有利な技術的効果を提供すると考える。
例えば、１つの実施形態において、Ｌ－アスパラギナーゼはシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）Ｌ－アスパラギナーゼである。参照シュードモナス・プチダＬ－アスパラギナーゼ配列は配列番号３により提供される：
ＭＩＤＨＳＳＬＰＲＬＳＩＡＳＬＧＧＴＶＳＭＱＡＱＡＶＧＣＧＶＴＰＴＬＤＣＥＱＱＬＬＱＶＰＱＬＲＱＭＡＱＬＮＶＡＳＬＣＬＶＰＳＡＳＬＤＦＡＴＬＬＤＶＬＡＷＡＲＣＥＶＥＲＧＡＱＡＬＶＶＳＱＧＴＤＳＬＥＥＳＡＹＦＬＤＬＬＷＰＦＤＡＰＬＶＭＴＧＡＭＲＳＡＳＱＰＧＮＤＧＰＡＮＬＬＡＡＡＱＶＡＬＡＱＧＳＣＧＲＧＶＬＶＶＭＮＤＱＶＨＲＡＡＲＶＲＫＴＡＳＭＡＩＡＡＦＥＳＰＧＣＧＰＬＧＥＶＶＥＧＫＶＶＹＲＨＰＰＡＲＧＥＶＬＰＶＰＨＲＴＤＱＲＶＡＬＬＥＡＣＬＤＡＤＴＡＬＬＱＡＶＡＰＬＧＹＥＧＬＶＩＡＧＦＧＡＧＨＶＡＡＳＷＳＤＶＬＥＱＬＡＰＴＬＰＶＶＶＡＴＲＴＧＮＧＰＴＡＲＡＴＹＧＦＡＧＡＥＩＤＬＱＫＫＧＶＹＭＡＧＨＬＣＰＲＫＣＲＩＬＬＷＬＬＩＧＴＤＲＲＨＥＬＨＤＷＬＨＡ（配列番号３）
１つの実施形態において、Ｌ－アスパラギナーゼは、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性、例えば、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有する。
１つの実施形態において、Ｌ－アスパラギナーゼはシュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）Ｌ－アスパラギナーゼである。参照シュードモナス・フルオレセンスＬ－アスパラギナーゼ配列は配列番号４により提供される：
ＭＱＳＡＮＮＶＭＶＬＹＴＧＧＴＩＧＭＱＡＳＡＮＧＬＡＰＡＳＧＦＥＶＲＭＲＥＱＦＡＤＡＤＬＰＡＷＲＦＲＥＭＳＰＬＩＤＳＡＮＭＮＰＡＹＷＱＲＬＲＳＡＶＶＥＡＶＤＡＧＣＤＡＶＬＩＬＨＧＴＤＴＬＡＹＳＡＡＡＭＳＦＱＬＬＧＬＰＡＰＶＶＦＴＧＳＭＬＰＡＧＶＰＤＳＤＡＷＥＮＶＳＧＡＬＴＡＬＡＥＧＬＥＰＧＶＨＬＹＦＨＧＡＬＭＡＰＴＲＣＡＫＩＲＳＦＧＲＮＰＦＡＡＬＱＲＫＤＤＦＡＲＡＥＴＬＰＡＡＬＤＹＲＱＰＫＡＬＡＮＶＧＶＬＰＬＩＰＧＦＤＡＡＱＬＤＡＩＩＳＳＧＩＱＧＬＶＬＥＣＦＧＳＧＴＧＰＳＤＮＰＱＦＬＡＳＬＱＲＡＱＤＱＧＶＶＶＶＡＩＴＱＣＨＥＧＧＶＥＬＤＶＹＥＡＧＳＲＬＲＧＡＧＶＬＳＧＡＧＭＴＲＥＡＡＦＧＫＬＨＡＬＬＧＡＧＬＡＶＥＥＶＲＲＬＶＥＬＤＬＨＴＮＰＴ（配列番号４）
１つの実施形態において、Ｌ－アスパラギナーゼは、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性、例えば、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有する。
１つの実施形態において、Ｌ－アスパラギナーゼはウォリネラ・サクシノゲネス（Wolinella succinogenes）Ｌ－アスパラギナーゼである。参照ウォリネラ・サクシノゲネスＬ－アスパラギナーゼ配列は配列番号５により提供される：
ＭＡＫＰＱＶＴＩＬＡＴＧＧＴＩＡＧＳＧＥＳＳＶＫＳＳＹＳＡＧＡＶＴＶＤＫＬＬＡＡＶＰＡＩＮＤＬＡＴＩＫＧＥＱＩＳＳＩＧＳＱＥＭＴＧＫＶＷＬＫＬＡＫＲＶＮＥＬＬＡＱＫＥＴＥＡＶＩＩＴＨＧＴＤＴＭＥＥＴＡＦＦＬＮＬＴＶＫＳＱＫＰＶＶＬＶＧＡＭＲＳＧＳＳＭＳＡＤＧＰＭＮＬＹＮＡＶＮＶＡＩＮＫＡＳＴＮＫＧＶＶＩＶＭＮＤＥＩＨＡＡＲＥＡＴＫＬＮＴＴＡＶＮＡＦＡＳＰＮＴＧＫＩＧＴＶＹＹＧＫＶＥＹＦＴＱＳＶＲＰＨＴＬＡＳＥＦＤＩＳＫＩＥＥＬＰＲＶＤＩＬＹＡＨＰＤＤＴＤＶＬＶＮＡＡＬＱＡＧＡＫＧＩＩＨＡＧＭＧＮＧＮＰＦＰＬＴＱＮＡＬＥＫＡＡＫＳＧＶＶＶＡＲＳＳＲＶＧＳＧＳＴＴＱＥＡＥＶＤＤＫＫＬＧＦＶＡＴＥＳＬＮＰＱＫＡＲＶＬＬＭＬＡＬＴＫＴＳＤＲＥＡＩＱＫＩＦＳＴＹ（配列番号５）
１つの実施形態において、Ｌ－アスパラギナーゼは、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性、例えば、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有する。
１つの実施形態において、コンジュゲートは、Ｌ－アスパラギナーゼの断片、例えば配列番号２、３、４または５の断片を含む。１つの実施形態において、組換え異種発現Ｌ－アスパラギナーゼは、Ｌ－アスパラギナーゼの断片、例えば配列番号２、３、４または５の断片を含む。１つの実施形態において、断片は、参照Ｌ－アスパラギナーゼアミノ酸配列の少なくとも３０個の連続するアミノ酸、例えば、参照Ｌ－アスパラギナーゼアミノ酸配列の少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０個またはそれより多くの連続するアミノ酸を含む。１つの実施形態において、参照Ｌ－アスパラギナーゼアミノ酸配列は、オンラインデータベース上で公的に入手可能なネイティブなＬ－アスパラギナーゼアミノ酸配列である。本発明によれば、Ｌ－アスパラギナーゼの断片は、全長Ｌ－アスパラギナーゼのインビトロ活性の少なくとも６０％、例えば、全長Ｌ－アスパラギナーゼのインビトロ活性の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％のインビトロ活性を有する。
本発明のコンジュゲートは水溶性ポリマーを含む。
典型的には、水溶性ポリマーは、コンジュゲート化されていないＬ－アスパラギナーゼと比較して、拡大された流体力学的体積を提供する。ＰＥＧ化およびＰＡＳ化は、拡大された流体力学的体積を提供することが周知である。流体力学的体積は、当分野における任意の好適な方法を使用して、例えば分析的サイズ排除クロマトグラフィーおよび動的光散乱測定により評価されてもよい。理論により縛られることを望まないが、本発明者らは、流体力学的体積の増加および対応した遮水の増加は、コンジュゲート化されたＬ－アスパラギナーゼの免疫原性を低減させながら、インビボｔ１／２の増加を助けると考える。
１つの実施形態において、水溶性ポリマーは、（ａ）ポリアルキレンオキシド、（ｂ）ポリアミノ酸、および（ｃ）多糖からなる群から選択される。
典型的には、水溶性ポリマーは非毒性である。
１つの実施形態において、水溶性ポリマーはＰＥＧを含む。１つの実施形態において、水溶性ポリマーはＰＥＧからなる。ＰＥＧは、当分野において非常に周知であり、様々な異なる構成（典型的には直鎖状または分岐鎖状（マルチアームを含む））および様々な異なる重量で利用可能である。ＰＥＧの重量は典型的には５００Ｄａ～２００００Ｄａの範囲内である。ＰＥＧ混合物は多分散であるが、現行の商用のＰＥＧ混合物は典型的には低い多分散性を示し、１に近い多分散指数（ＰＤＩ）値（例えばＰＤＩ＝１．０５、１．１、１．１５または１．２）を有する。ＰＥＧの重量の文脈において使用される場合、「約」という用語はこの多分散性を反映する。
１つの実施形態において、ＰＥＧは、約１００００Ｄａより低い、例えば、約１００００Ｄａより低い、約９０００Ｄａより低い、約８０００Ｄａより低い、約７０００Ｄａより低い、約６０００Ｄａより低い、約５０００Ｄａより低い、約４０００Ｄａより低い、約３０００Ｄａより低い、約２０００Ｄａより低い、約１０００Ｄａより低い、約８００Ｄａより低い分子量を有する。１つの実施形態において、ＰＥＧは、約５０００Ｄａより低い分子量を有する。
１つの実施形態において、ＰＥＧは約１００００Ｄａの分子量を有する。１つの実施形態において、ＰＥＧは約５０００Ｄａの分子量を有する。１つの実施形態において、ＰＥＧは直鎖状の５０００ＤａのＰＥＧ鎖を含む。１つの実施形態において、ＰＥＧは分岐鎖状の５０００ＤａのＰＥＧ鎖を含む。
ＰＥＧをタンパク質にコンジュゲート化する方法は当分野において周知であり、典型的には化学的コンジュゲート化を伴う。典型的には、ＰＥＧは、タンパク質中のアミノ酸と優先的に反応する活性化／官能化された部分を含有する。機能的部分は、典型的には、タンパク質内の反応性部位（例えばリジン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸およびＮ末端）の利用可能性に基づいて選択される。１つの実施形態において、ＰＥＧは、活性エステル、例えばスクシンイミジルエステルを含有する。１つの実施形態において、ＰＥＧは、カーボネート部分、例えばスクシンイミジルカーボネートを含有する。
多数のホモ二官能化、ヘテロ二官能化、およびモノメトキシ末端キャップ付加一官能化ＰＥＧが商業的に入手可能である。１つの実施形態において、ＰＥＧは、メトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）、例えば官能化されたｍＰＥＧである。１つの実施形態において、ＰＥＧは、ヒドロキシＰＥＧ（ＨＯ－ＰＥＧ）、例えば官能化されたＨＯ－ＰＥＧである。
１つの実施形態において、ＰＥＧは、Ｌ－アスパラギナーゼの１つまたはそれより多くのアミノ酸に共有結合的に連結されている。１つの実施形態において、ＰＥＧは、アミド結合によりＬ－アスパラギナーゼの１つまたはそれより多くのアミノ酸に共有結合的に連結されている。
１つの実施形態において、本発明のコンジュゲートは、式：
ＰＥＧ－Ｏ－ＣＯ－ＮＨ－［Ｌ－アスパラギナーゼ］
を有する。
本発明のコンジュゲートは、以下の式：
（ＰＥＧ－Ｏ－ＣＯ－ＮＨ）ｎ－［Ｌ－アスパラギナーゼ］
（式中、ｎ＝１～３０、典型的には５～１５である）により表されるように、複数のＰＥＧ部分を含んでもよい。
１つの実施形態において、水溶性ポリマーはＰＡＳポリマーを含む。１つの実施形態において、水溶性ポリマーはＰＡＳポリマーからなる。ＰＡＳポリマーは、プロリン（Ｐ）、アラニン（Ａ）およびセリン（Ｓ）を含む立体配置的に無秩序なポリペプチド鎖である。ＰＡＳポリマーは、ＰＥＧに類似した生物物理学的特性を示し、ＰＡＳポリマーへのコンジュゲート化（「ＰＡＳ化」）はまた、インビボｔ１／２を延長し、コンジュゲート化されたタンパク質の免疫原性を低減させる。
ＰＥＧ化を上回るＰＡＳ化の利点は、ＰＡＳポリマーは組換え発現の間にＬ－アスパラギナーゼに融合され得ることである。換言すれば、Ｌ－アスパラギナーゼおよびＰＡＳポリマーは単一のポリペプチドとして発現され得る。有利なことに、ＰＡＳ化は、（ＰＥＧ化により要求されるような）別々のコンジュゲート化工程に対する要求を回避し、それにより、本発明のコンジュゲートの製造を単純化する。そのため、１つの実施形態において、本発明のコンジュゲートは、単一のポリペプチド鎖として発現されるＬ－アスパラギナーゼおよびＰＡＳポリマーを含む。
プロリンは、コドン：「ＣＣＵ」、「ＣＣＣ」、「ＣＣＡ」および「ＣＣＧ」によりコードされ、アラニンは、コドン：「ＧＣＵ」、「ＧＣＣ」、「ＧＣＡ」および「ＧＣＧ」によりコードされ、セリンは、コドン：「ＵＣＵ」、「ＵＣＣ」、「ＵＣＡ」、「ＵＣＧ」、「ＡＧＵ」および「ＡＧＣ」によりコードされることを当業者は認識する。
１つの実施形態において、ＰＡＳポリマー中のアミノ酸残基の少なくとも８０％は、プロリン、アラニンおよびセリンからなり、例えば、ＰＡＳポリマー中のアミノ酸残基の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％または１００％は、プロリン、アラニンおよびセリンからなる群から選択される。
１つの実施形態において、ＰＡＳポリマーは、少なくとも１０個のアミノ酸残基、例えば、少なくとも１５、２０、２５または３０個のアミノ酸残基を含む。
１つの実施形態において、ＰＡＳポリマーは１０～６０個のアミノ酸残基を含む。１つの実施形態において、ＰＡＳポリマーは１５～５０個のアミノ酸残基を含む。１つの実施形態において、ＰＡＳポリマーは２０～４０個のアミノ酸残基を含む。１つの実施形態において、ＰＡＳポリマーは２０～３０個のアミノ酸残基を含む。
１つの実施形態において、ＰＡＳポリマー中のアミノ酸残基の少なくとも８０％は、プロリン、アラニンおよびセリンからなり、かつＰＡＳポリマーは１０～６０個のアミノ酸残基を含む。
１つの実施形態において、ＰＡＳポリマーは精製タグを追加的に含む。１つの実施形態において、精製タグはＨｉｓ６タグである。１つの実施形態において、精製タグはＳｔｒｅｐタグである。
１つの実施形態において、ＰＡＳポリマーはＬ－アスパラギナーゼのＮ末端に配置されている。１つの実施形態において、ＰＡＳポリマーはＬ－アスパラギナーゼのＣ末端に配置されている。１つの実施形態において、ＰＡＳポリマーはＬ－アスパラギナーゼのＮおよびＣ末端に配置されている。
１つの実施形態において、ＰＡＳポリマーおよびＬ－アスパラギナーゼはリンカーを介して連結されている。１つの実施形態において、スペーサーはアミノ酸リンカーである。典型的には、リンカーは約２０～２５個までのアミノ酸残基を含む。そのため、１つの実施形態において、本発明のコンジュゲートは、単一のポリペプチド鎖として発現されるＬ－アスパラギナーゼ、ＰＡＳポリマーおよび１つまたはそれより多くのリンカーを含む。
本発明のＬ－アスパラギナーゼは大腸菌以外の宿主細胞中で発現される。
細菌属の好適な宿主細胞としては、エルウィニア、シュードモナス、バシラス（Bacillus）、ラクトバシラス（Lactobacillus）、およびストレプトミセス（Streptomyces）の細胞が挙げられるがこれらに限定されない。細菌種の好適な細胞としては、エルウィニア・クリサンテミ、シュードモナス・フルオレセンス、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、バシラス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バシラス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、ラクトバシラス・ブレビス（Lactobacillus brevis）およびストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）の細胞が挙げられるがこれらに限定されない。１つの実施形態において、宿主細胞は、シュードモナス・エルギノーサ、シュードモナス・フルオレセンスおよびシュードモナス・プチダからなるリストから選択される。１つの実施形態において、宿主細胞はエルウィニア・クリサンテミである。
糸状真菌の好適な宿主細胞としては、真菌類亜門の全ての糸状形態が挙げられる。糸状真菌属の好適な細胞としては、アクレモニウム（Acremonium）、アスペルギルス（Aspergillus）、オーレオバシジウム（Aureobasidium）、ビルカンデラ（Bjerkandera）、セリポリオプシス（Ceriporiopsis）、クリソスポリウム（Chrysoporium）、コプリナス（Coprinus）、コリオラス（Coriolus）、コリナスカス（Corynascus）、ケトミウム（Chaetomium）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、フィロバシディウム（Filobasidium）、フサリウム（Fusarium）、ジベレラ（Gibberella）、フミコラ（Humicola）、ヒポクレア（Hypocrea）、マグナポルテ（Magnaporthe）、ムコール（Mucor）、ミセリオプトラ（Myceliophthora）、ネオカリマスティクス（Neocallimastix）、ニューロスポラ（Neurospora）、ペシロミセス（Paecilomyces）、ペニシリウム（Penicillium）、ファネロケーテ（Phanerochaete）、フレビア（Phlebia）、ピロミセス（Piromyces）、プレウロタス（Pleurotus）、シタリジウム（Scytaldium）、シゾフィラム（Schizophyllum）、スポロトリカム（Sporotrichum）、タラロミセス（Talaromyces）、サーモアスカス（Thermoascus）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）、トラメテス（Trametes）、およびトリコデルマ（Trichoderma）の細胞が挙げられるがこれらに限定されない。ある特定の態様において、組換え細胞は、トリコデルマ属菌（例えば、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei））、ペニシリウム属菌、フミコラ属菌（例えば、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens））；アスペルギルス属菌（例えば、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger））、クリソスポリウム（Chrysosporium）属菌、フサリウム属菌、またはヒポクレア属菌である。好適な細胞はまた、これらの糸状真菌属の様々なアナモルフおよびテレオモルフ形態の細胞を含むことができる。
糸状真菌種の好適な細胞としては、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・フェティダス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・ジャポニカス（Aspergillus japonicus）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulanｓ）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、クリソスポリウム・ルクノウェンセ（Chrysosporium lucknowense）、フサリウム・バクテロイデス（Fusarium bactridioides）、フサリウム・セレアリス（Fusarium cerealis）、フサリウム・クルックウェレンセ（Fusarium crookwellense）、フサリウム・カルモラム（Fusarium culmorum）、フサリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）、フサリウム・グラミナム（Fusarium graminum）、フサリウム・ヘテロスポラム（Fusarium heterosporum）、フサリウム・ネグンジ（Fusarium negundi）、フサリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、フサリウム・レティクラツム（Fusarium reticulatum)、フサリウム・ロセウム（Fusarium roseum）、フサリウム・サムブシナム（Fusarium sambucinum）、フサリウム・サルコクロウム（Fusarium sarcochroum）、フサリウム・スポロトリキオイデス（Fusarium sporotrichioides）、フサリウム・スルフレウム（Fusarium sulphureum）、フサリウム・トルロサム（Fusarium torulosum）、フサリウム・トリコテシオイデス（Fusarium trichothecioides）、フサリウム・ベネナタム（Fusarium venenatum）、ビルカンデラ・アドゥスタ（Bjerkandera adusta）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ceriporiopsis aneirina）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ceriporiopsis aneirina）、セリポリオプシス・カルネギエア（Ceriporiopsis caregiea）、セリポリオプシス・ギルベセンス（Ceriporiopsis gilvescens）、セリポリオプシス・パンノシンタ（Ceriporiopsis pannocinta）、セリポリオプシス・リブロサ（Ceriporiopsis rivulosa）、セリポリオプシス・スブルファ（Ceriporiopsis subrufa）、セリポリオプシス・スブベルミスポラ（Ceriporiopsis subvermispora）、コプリナス・シネレウス（Coprinus cinereus）、コリオラス・ヒルスタス（Coriolus hirsutus）、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、フミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）、ムコール・ミエヘイ（Mucor miehei）、ミセリオプトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、ニューロスポラ・インテルメディア（Neurospora intermedia）、ペニシリウム・プルプロゲナム（Penicillium purpurogenum）、ペニシリウム・カネセンス（Penicillium canescens）、ペニシリウム・ソリタム（Penicillium solitum）、ペニシリウム・フニクロサム（Penicillium funiculosum）、ファネロケーテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）、フレビア・ラジアタ（Phlebia radiate）、プレウロタス・エリンギ（Pleurotus eryngii）、タラロミセス・フラバス（Talaromyces flavus）、チエラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）、トラメテス・ビロサ（Trametes villosa）、トラメテス・ベルシコロル（Trametes versicolor）、トリコデルマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum）、トリコデルマ・コニンギ（Trichoderma koningii）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、およびトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）の細胞が挙げられるがこれらに限定されない。
宿主細胞は典型的には原核性宿主細胞である。
１つの実施形態において、Ｌ－アスパラギナーゼは組換え発現される。Ｌ－アスパラギナーゼをコードする核酸は、典型的には、Ｌ－アスパラギナーゼの転写および／または翻訳を提供または補助することができる１つまたはそれより多くの核酸配列、例えばＬ－アスパラギナーゼが発現されるべき生物において作動可能なプロモーターに作動可能に連結されている。プロモーターは、同種または異種、および構成的または誘導性のものであり得る。プロモーター配列は当分野において周知である。
糸状真菌宿主中の組換え発現が所望される場合、プロモーターは、真菌プロモーター（糸状真菌プロモーターが挙げられるがこれに限定されない）、植物細胞において作動可能なプロモーター、哺乳動物細胞において作動可能なプロモーターであり得る。
１つの実施形態において、Ｌ－アスパラギナーゼは宿主細胞により内因性に発現される。
１つの実施形態において、Ｌ－アスパラギナーゼは、（典型的には宿主細胞の使用を伴わずに）合成的に製造される。Ｌ－アスパラギナーゼの合成的製造は、本発明の組成物中のＨＣＰの存在を実質的に回避する。
Ｌ－アスパラギナーゼは、当分野において公知の任意の方法により、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン（陰イオン／陽イオン）交換、ニッケル親和性およびグルタチオン親和性を含む親和性、ならびにサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、差次的な溶解性により、またはタンパク質の精製のための任意の他の標準的な技術により宿主細胞から回収および／または精製され得る。追加的に、Ｌ－アスパラギナーゼは、精製を促すために異種ポリペプチド配列に融合させることができる。そのような精製タグは当分野において公知であり、任意の従来のタグが使用され得る。
大腸菌由来Ｌ－アスパラギナーゼを以前に投与されている患者は、例えば、患者がＯｎｃａｓｐａｒ（登録商標）を以前に投与されていることを典型的には指し示す患者の医療記録を調べることにより、容易に同定され得る。
１つの実施形態において、患者は、大腸菌由来Ｌ－アスパラギナーゼを用いる治療を受けているが、大腸菌由来Ｌ－アスパラギナーゼに対する過敏症を有するとして同定されない。
１つの実施形態において、患者は、大腸菌由来Ｌ－アスパラギナーゼに対する過敏症を有するとして同定される。様々な種類の過敏症が当業者に公知であり、これには、例えば、アレルギー性反応、アナフィラキシーショック、および亜臨床的な過敏症（サイレント不活性化としても公知）が含まれる。
大腸菌由来Ｌ－アスパラギナーゼに対する過敏症を有する患者は、大腸菌由来Ｌ－アスパラギナーゼへの曝露後のアレルギー性反応により同定されてもよい。アレルギー性反応と関連付けられる症状は周知であり、皮膚刺激（例えば一過性の潮紅、発疹、蕁麻疹）、呼吸困難（例えば気管支痙攣、喘鳴音）、嘔吐、下痢、浮腫（例えば血管性浮腫）および低血圧が挙げられるがこれらに限定されない。
患者は、大腸菌由来Ｌ－アスパラギナーゼに応答してアナフィラキシーショックを経験していてもよい。アナフィラキシーショックは、曝露後に急速に起こるアレルギー性反応であり、典型的には、喉および／または舌の腫脹、嘔吐、重篤な皮膚刺激ならびに低血圧が挙げられるがこれらに限定されない１つまたはそれより多くの症状を伴う。
患者は、大腸菌由来Ｌ－アスパラギナーゼに対する亜臨床的な過敏症（サイレント不活性化としても公知）を有してもよい。亜臨床的な過敏症は、過敏症の臨床徴候（例えば、上記のような、アレルギー性反応と関連付けられるもの）の非存在下での抗大腸菌Ｌ－アスパラギナーゼ抗体応答により特徴付けられる。亜臨床的な過敏症を有する患者は、抗大腸菌Ｌ－アスパラギナーゼ抗体を発生した患者として同定されてもよい。抗大腸菌由来Ｌ－アスパラギナーゼ抗体の発生は、当分野において公知の様々な方法、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により同定され得る。
亜臨床的な過敏症はまた、大腸菌由来Ｌ－アスパラギナーゼを用いた治療にもかかわらず患者の臨床症状（例えばＡＬＬの臨床症状）の進行性の悪化があることとして同定されてもよい。亜臨床的な過敏症はまた、血清Ｌ－アスパラギナーゼ活性を経時的に評価することにより同定されてもよい。
患者は典型的には哺乳動物、好ましくはヒトである。
１つの実施形態において、患者は２１歳またはそれ未満である。１つの実施形態において、患者は１８歳またはそれ未満である。１つの実施形態において、患者は１５歳またはそれ未満である。１つの実施形態において、患者は１２歳またはそれ未満である。１つの実施形態において、患者は８歳またはそれ未満である。１つの実施形態において、患者は６歳またはそれ未満である。１つの実施形態において、患者は４歳またはそれ未満である。１つの実施形態において、患者は２歳またはそれ未満である。１つの実施形態において、患者は２２歳またはそれより上の年齢である。
Ｌ－アスパラギンアミノヒドロラーゼ活性を決定する方法は当分野において周知である。
１つの実施形態において、本発明のコンジュゲートは、大腸菌中で発現された同等のコンジュゲートと比較して少なくとも８０％のインビトロ活性、例えば、大腸菌中で発現された同等のコンジュゲートのインビトロ活性の少なくとも８０％、９０％または１００％のインビトロ活性を有する。
１つの実施形態において、Ｌ－アスパラギンアミノヒドロラーゼ活性は、ネスラー法を使用して測定され、これは、Ｌ－アスパラギンに対するＬ－アスパラギナーゼの触媒活性により放出されるアンモニアの量を決定する。例えば、試験試料は、９００μＬのＴｒｉｓ－ＨＣＬ緩衝液およびＬ－アスパラギン（ｐＨ ８．６）として調製され得る。Ｌ－アスパラギナーゼ（１００μＬ）が試験試料に加えられ、３７℃で３０分間インキュベートされ得る。３０分後に、１．５Ｍトリクロロ酢酸溶液を加えることにより反応物はクエンチされ得る。試料は次に、任意の粒子状物質を除去するために遠心分離される。１００μＬの上清が次に、３．８ｍＬの水およびネスラー試薬を含有するチューブに加えられ、１５分間インキュベートされ得る。試料は次に分光光度的（４２５ｎｍ）に分析されて、Ｌ－アスパラギナーゼによるＬ－アスパラギンの触媒作用により放出されたアンモニアの相対量の指標が提供される。ネスラー法はインビトロＬ－アスパラギナーゼ活性の評価に理想的に適する。
Ｌ－アスパラギンアミノヒドロラーゼ活性を決定する別の方法は、Ｌ－アスパラギナーゼをＬ－アスパラギン酸β－ヒドロキサメートとインキュベートすることを伴う。Ｌ－アスパラギン酸β－ヒドロキサメートは触媒されてＬ－アスパラギンおよびヒドロキシルアミンをもたらし、ヒドロキシルアミンは次に８－ヒドロキシキノリンと縮合され、インドオキシンに酸化される。Ｌ－アスパラギンアミノヒドロラーゼ活性は分光光度的（７１０ｎｍ）に決定される（例えば、Lanvers et al. Analytical Biochemistry (2002), 309(1):117-126を参照）。Ｌ－アスパラギン酸β－ヒドロキサメート触媒方法は、体液試料、例えば血清中のＬ－アスパラギナーゼ活性の評価に理想的に適する。Ｌ－アスパラギン酸β－ヒドロキサメート触媒方法は、例えば、Ｌ－アスパラギナーゼの投与（本発明のコンジュゲートの投与を含む）後に間隔をおいて血漿試料中のＬ－アスパラギナーゼ活性を評価することにより、インビボｔ１／２の評価に理想的に適する。
本発明のコンジュゲートは、典型的には、同等のタンパク質用量（即ち、投与されるタンパク質の重量：体重）で投与された場合に、Ｌ－アスパラギナーゼが水溶性ポリマーにコンジュゲート化されていない場合よりも長いインビボｔ１／２を有する。１つの実施形態において、コンジュゲートは、Ｅ．クリサンテミからのＬ－アスパラギナーゼを含み、かつＥｗＡＳＮａｓｅよりも長いｔ１／２を有する。Ｌ－アスパラギナーゼがＥ．クリサンテミからのものであり、かつ水溶性ポリマーがＰＥＧを含む１つの実施形態において、コンジュゲートはＥｗＡＳＮａｓｅよりも長いｔ１／２を有する。Ｌ－アスパラギナーゼがＥ．クリサンテミからのものであり、かつ水溶性ポリマーがＰＡＳポリマーを含む１つの実施形態において、コンジュゲートはＥｗＡＳＮａｓｅよりも長いｔ１／２を有する。
１つの実施形態において、コンジュゲートは、Ｅ．クリサンテミからのＬ－アスパラギナーゼを含み、かつ同等のタンパク質用量（即ち、投与されるタンパク質の重量：体重）で投与された場合に、ＥｃＡＳＮａｓｅよりも長いｔ１／２を有する。Ｌ－アスパラギナーゼがＥ．クリサンテミからのものであり、かつ水溶性ポリマーがＰＥＧを含む１つの実施形態において、コンジュゲートはＥｃＡＳＮａｓｅよりも長いｔ１／２を有する。Ｌ－アスパラギナーゼがＥ．クリサンテミからのものであり、かつ水溶性ポリマーがＰＡＳポリマーを含む１つの実施形態において、コンジュゲートはＥｃＡＳＮａｓｅよりも長いｔ１／２を有する。
１つの実施形態において、コンジュゲートは、Ｅ．クリサンテミからのＬ－アスパラギナーゼを含み、かつ同等のタンパク質用量（即ち、投与されるタンパク質の重量：体重）で投与された場合に、Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）と類似したまたはそれよりも長いｔ１／２を有する。Ｌ－アスパラギナーゼがＥ．クリサンテミからのものであり、かつ水溶性ポリマーがＰＥＧを含む１つの実施形態において、コンジュゲートはＯｎｃａｓｐａｒ（登録商標）と類似したまたはそれよりも長いｔ１／２を有する。Ｌ－アスパラギナーゼがＥ．クリサンテミからのものであり、かつ水溶性ポリマーがＰＡＳポリマーを含む１つの実施形態において、コンジュゲートはＯｎｃａｓｐａｒ（登録商標）と類似したまたはそれよりも長いｔ１／２を有する。「類似した」ｔ１／２は、Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）のｔ１／２の少なくとも７０％、例えば、Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）のｔ１／２の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％または少なくとも１３０％を指す。
「より長い」ｔ１／２は、少なくとも１０％長い、例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５または少なくとも３００％長いｔ１／２を指す。
本発明のコンジュゲートおよび組成物は、投薬製剤と適合性の方式で、および治療的に有効であるような量（即ち、「治療有効量」）で患者に投与される。
本発明のコンジュゲートおよび組成物は、典型的には、大腸菌由来Ｌ－アスパラギナーゼを用いた治療後のセカンドまたはサードライン療法として投与される。
本発明のコンジュゲートおよび組成物は、一般に、従来の経路、例えば、静脈内、皮下、腹腔内、または粘膜経路により投与される。投与は、典型的には、非経口投与、例えば、静脈内または筋肉内注射により為される。
１つの実施形態において、本発明のコンジュゲート（または組換え異種発現Ｌ－アスパラギナーゼ）は、約１００ＩＵ／ｍ２～約３００００ＩＵ／ｍ２（約０．２～６０ｍｇタンパク質／ｍ２）の範囲内の用量で投与される。１つの実施形態において、本発明のコンジュゲートは、約１００ＩＵ／ｍ２～約２５００ＩＵ／ｍ２、例えば約１００ＩＵ／ｍ２～約５００ＩＵ／ｍ２、または約５００ＩＵ／ｍ２～約２５００ＩＵ／ｍ２の用量で投与される。１つの実施形態において、組換え異種発現Ｌ－アスパラギナーゼは、約６０００ＩＵ／ｍ２～約２５０００ＩＵ／ｍ２、例えば約６０００ＩＵ／ｍ２～約１００００ＩＵ／ｍ２、または約１００００ＩＵ／ｍ２～約２５０００ＩＵ／ｍ２の用量で投与される。２１歳以下の小児患者において、本発明のコンジュゲートは、典型的には、２１歳より上の患者におけるよりも低い用量で投与される。
１つの実施形態において、治療は、週当たり３回未満の本発明のコンジュゲートまたは組成物の投与を含む。１つの実施形態において、治療は、週当たり２回未満の本発明のコンジュゲートまたは組成物の投与を含む。１つの実施形態において、治療は、週当たり１回未満の本発明のコンジュゲートまたは組成物の投与を含む。１つの実施形態において、治療は、少なくとも７日の間隔、例えば、少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１日の間隔での本発明のコンジュゲートまたは組成物の投与を含む。
１つの実施形態において、血清Ｌ－アスパラギナーゼ活性が本発明のコンジュゲートまたは組成物の次の投与の前に測定される。１つの実施形態において、投与される用量は、所望のレベルまで血清Ｌ－アスパラギナーゼ活性を上昇させるために増加される。１つの実施形態において、投与間隔は、所望のレベルまで血清Ｌ－アスパラギナーゼ活性を上昇させるために減少される。１つの実施形態において、所望のレベルまで血清Ｌ－アスパラギナーゼ活性を上昇させるために、投与される用量は増加され、かつ投与間隔は減少される。所望の血清Ｌ－アスパラギナーゼ活性レベルは、典型的には、アスパラギンの治療的な低減を提供するレベルである。
１つの実施形態において、本発明のコンジュゲートまたは組成物は単剤療法として投与される。１つの実施形態において、本発明のコンジュゲートまたは組成物は、例えば、他の化学療法または放射線療法と組み合わせて、併用療法の部分として投与される。
１つの実施形態において、Ｌ－アスパラギン枯渇により治療可能な疾患はがんである。１つの実施形態において、がんは、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、リンパ肉腫、非ホジキンリンパ腫、ＮＫリンパ腫、および膵臓がんからなる群から選択される。１つの実施形態において、がんはＡＬＬである。
２つのアミノ酸配列をアライメントするために利用可能な多くの確立されたアルゴリズムが存在する。典型的には、１つの配列は、試験配列が比較され得る参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムのパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセンテージを算出する。比較のためのアミノ酸配列のアライメントは、例えば、コンピュータ実装アルゴリズム（例えばＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡもしくはＴＦＡＳＴＡ）、またはＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムにより実行されてもよい。
以下に示されるＢＬＯＳＵＭ６２表は、５００より多くの群の関連タンパク質の高度に保存された領域を表す、タンパク質配列セグメントの約２，０００の局所的な複数のアライメントに由来するアミノ酸置換マトリックスである（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919, 1992；参照により本明細書に組み入れられる）。アミノ酸は標準的な１文字表記により指し示される。同一性パーセントは以下の通りに算出される：
同一のマッチの総数
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ ×１００
［より長い配列、および２つの配列をアライメント
するためにより長い配列に導入されたギャップの数を足した長さ］
ＢＬＯＳＵＭ６２表
Figure 2022545253000002
相同性比較において、同一性は、少なくとも１０アミノ酸残基の長さ（例えば少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５またはそれより多くのアミノ酸残基の長さ、例えば、参照配列の全長までの長さ）である配列の領域にかけて存在してもよい。
実質的に相同的なポリペプチドは、１つまたはそれより多くのアミノ酸置換、欠失、または付加を有する。多くの実施形態において、それらの変化は軽微な性質のものであり、例えば、保存的アミノ酸置換のみを伴う。保存的置換は、以下の群内の１つのアミノ酸を別のアミノ酸で置き換えることにより為されるものである：塩基性：アルギニン、リジン、ヒスチジン；酸性：グルタミン酸、アスパラギン酸；極性：グルタミン、アスパラギン；疎水性：ロイシン、イソロイシン、バリン；芳香族：フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン；小さい：グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、メチオニン。実質的に相同的なポリペプチドはまた、ポリペプチドのフォールディングまたは活性に重要に影響しない他の置換；小さい欠失、典型的には１～約３０アミノ酸（例えば１～１０、または１～５アミノ酸）の欠失；および小さいアミノまたはカルボキシル末端伸長、例えばアミノ末端メチオニン残基、約２０～２５残基までの小さいリンカーペプチド、またはアフィニティータグを含むものを包含する。
１つの実施形態において、本発明の組成物は大腸菌からの宿主細胞タンパク質を実質的に含まない。１つの実施形態において、本発明の組成物は大腸菌からの宿主細胞タンパク質を含有しない。
その高い検出感度に起因して、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、ＨＣＰを検出するための現行のゴールドスタンダードの方法である。ＨＣＰ検出プロトコールは当分野において周知であり、ＥＬＩＳＡベースのＨＣＰ検出アッセイは商業的に入手可能である（例えばＣｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳ（Ｍａｒｖａｉ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓの部分）の「Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＣＰ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ」；およびＡｂｃａｍ、ＵＫの「Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＣＰ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）」）。
しかしながら、ＨＣＰのＥＬＩＳＡベースの検出と関連付けられるある特定の制限がある。例えば、抗ＨＣＰ抗体プールはＨＣＰ集団全体をカバーできず、弱い免疫原性のＨＣＰは、それらの検出を促すための何らの／十分な抗体を誘発しないことがある。好適な宿主細胞およびＬ－アスパラギナーゼ供給源の注意深い同定を通じて、本発明は、Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）（もしくはＥｃＡＳＮａｓｅ）に対する過敏性反応を起こした患者および／またはＯｎｃａｓｐａｒ（登録商標）（もしくはＥｃＡＳＮａｓｅ）に対して抗Ｌ－アスパラギナーゼ抗体応答を起こしたが顕性のアレルギー症状を示さない患者の治療のための超純粋なＬ－アスパラギナーゼ調製物に対する要求の回避を助ける。
本発明の組成物は、薬学的に許容され、かつ活性成分と適合性の賦形剤を含んでもよい。好適な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびこれらの組合せである。追加的に、本発明の組成物は、助剤物質、例えば湿潤もしくは乳化剤、および／またはｐＨ緩衝化剤を含有してもよい。
１つの実施形態において、本発明のコンジュゲートまたは組成物は凍結乾燥形態である。１つの実施形態において、本発明の組成物は凍結乾燥形態である。本発明のコンジュゲートまたは組成物は、コンジュゲートまたは組成物の粉末化形態を提供するために凍結乾燥されてもよい。本発明の凍結乾燥されたコンジュゲートまたは組成物はその後、投与の前に再構成されてもよい。注射可能な溶液の調製のための無菌粉末は、本発明のコンジュゲートまたは組成物を含む溶液を凍結乾燥して、任意の任意選択的な共に可溶化された生体適合性成分と共にコンジュゲート（または組換え異種発現Ｌ－アスパラギナーゼ）を含む粉末を得ることにより生成され得る。一般に、分散体または溶液は、本発明のコンジュゲート（または組換え異種発現Ｌ－アスパラギナーゼ）を、基本的な分散培地または溶媒（例えば、希釈剤）および、任意選択的に、他の生体適合性成分を含有する無菌媒体に組み込むことにより調製される。適合性の希釈剤は、薬学的に許容され（ヒトへの投与のために安全かつ非毒性）、かつ液体製剤、例えば凍結乾燥後に再構成される製剤の調製のために有用なものである。希釈剤は、例えば、無菌水、注射用の静菌水、ｐＨ緩衝化溶液（例えばリン酸緩衝化食塩水）、無菌食塩水溶液、リンゲル溶液またはデキストロース溶液を含む。希釈剤は、例えば、塩および／または緩衝剤の水性溶液を含んでもよい。
１つの実施形態において、本発明の組成物は、１つまたはそれより多くの凍結乾燥保護剤を含む。１つの実施形態において、本発明のコンジュゲートまたは組成物は、凍結乾燥保護剤、例えば、アミノ酸、例えばモノナトリウムグルタメートまたはヒスチジン；メチルアミン、例えばベタイン；離液性塩、例えばマグネシウムスルフェート；ポリオール、例えば三水酸基またはより高分子量の糖アルコール、例えば、グリセリン、デキストラン、エリスリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、およびマンニトール；プロピレングリコール；ならびにこれらの組合せと組み合わせて凍結乾燥される。追加の例示的な凍結乾燥保護剤としては、グリセリンおよびゼラチン、ならびに糖メリビオース、メレジトース、ラフィノース、マンノトリオースおよびスタキオースが挙げられる。１つの実施形態において、凍結乾燥保護剤はトレハロースを含む。１つの実施形態において、凍結乾燥保護剤はスクロースを含む。１つの実施形態において、凍結乾燥保護剤はトレハロースおよびスクロースを含む。
凍結乾燥保護剤は、（例えば凍結乾燥前に）「保護的量（protecting amount）」で組成物に加えられ、これは、本発明のコンジュゲート（または組換え異種発現Ｌ－アスパラギナーゼ）は貯蔵の間（例えば、再構成および貯蔵後）にその物理的および化学的安定性および完全性を本質的に保持することを意味する。
本発明のコンジュゲートおよび組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして、注射剤として調製されてもよい。注射前に液体中に溶解、または懸濁するために好適な固体形態が代替的に調製されてもよい。
１つの実施形態において、組成物は投薬形態である。
１つの実施形態において、組成物は無菌である。
本発明の組成物は緩衝化剤を含んでもよい。１つの実施形態において、緩衝化剤はヒスチジンヒドロクロリド（例えば、Ｌ－ヒスチジンＨＣＬ）を含む。
本発明の組成物は、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０またはポリソルベート８０を安定化剤として含んでもよい。
本発明はまた、本発明のコンジュゲートを製造する方法を提供する。
１つの実施形態において、本発明は、本発明のコンジュゲートを製造する方法であって、
（ａ）大腸菌以外の宿主細胞中で、（ｉ）大腸菌以外の供給源からのＬ－アスパラギナーゼおよび（ｉｉ）ＰＡＳポリマーをコードする核酸を発現させる工程、ならびに
（ｂ）コンジュゲートを精製する工程
を含む、方法を提供する。
１つの実施形態において、本発明は、本発明のコンジュゲートを製造する方法であって、
（ａ）大腸菌以外の宿主細胞中で、大腸菌以外の供給源からのＬ－アスパラギナーゼをコードする核酸を発現させる工程、
（ｂ）Ｌ－アスパラギナーゼを精製する工程、および
（ｃ）Ｌ－アスパラギナーゼをＰＥＧにコンジュゲート化する工程
を含む、方法を提供する。
１つの実施形態において、本発明は、本発明のコンジュゲートを製造する方法であって、
（ａ）大腸菌以外の供給源からのネイティブなＬ－アスパラギナーゼを精製する工程、および
（ｂ）Ｌ－アスパラギナーゼをＰＥＧにコンジュゲート化する工程
を含む、方法を提供する。
本発明はまた、本発明の組換え異種発現Ｌ－アスパラギナーゼを製造する方法であって、
（ａ）大腸菌以外の異種宿主細胞中で、大腸菌以外の供給源からのＬ－アスパラギナーゼをコードする核酸を発現させる工程、および
（ｂ）Ｌ－アスパラギナーゼを精製する工程
を含む、方法を提供する。
Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）中の大腸菌ＨＣＰの決定のための標準曲線。ＨＣＰ濃度（ｎｇ／ｍＬ）をＹ軸上の吸光度（Ａ４５０）に対してＸ軸上にプロットしている。Ｒ２＝０．９９９９。
実施例１：Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）中の大腸菌ＨＣＰの検出
Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）の市販のバイアルを酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および質量分析により大腸菌ＨＣＰの存在について分析した。両方の分析はＯｎｃａｓｐａｒ（登録商標）中の大腸菌ＨＣＰの存在を裏付けた。
（ａ）ＥＬＩＳＡによる大腸菌ＨＣＰの検出
Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）の市販のバイアル（３，７５０ＩＵ）を水中に再構成し、抗大腸菌ＨＣＰ ＥＬＩＳＡを使用して分析した。試験キット中、ＥＬＩＳＡプレートを捕捉抗体（抗大腸菌ＨＣＰ抗体）で事前コーティングした。捕捉抗体とのＯｎｃａｓｐａｒ（登録商標）のインキュベーション後に、検出抗体（ビオチンとコンジュゲート化された第２の抗大腸菌ＨＣＰ抗体）をアプライした。検出抗体とのインキュベーション後に、プレートを、ビオチン標識化抗体に結合するストレプトアビジン－ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートと共にインキュベートした。「ＴＭＢ」（３，３’，５，５’’－テトラメチルベンジジン）基質を次に加え、これは捕捉されたＨＲＰにより、プレートに結合したＨＣＰの量に比例して有色生成物に変換される。吸光度を４５０ｎｍで測定した。
大腸菌ＨＣＰの濃度（ｎｇ／ｍＬ）および吸光度（４０５ｎｍ）の間の関係性を決定するために標準曲線を生成した。標準曲線（図１）は０．９９９９のＲ２値を有し、これは非常に良好な「フィット」およびデータの高い信頼度を表す。
ＥＬＩＳＡ分析は、Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）のバイアルは約１．１ｎｇの大腸菌ＨＣＰを含有することを決定した。
Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）の典型的な用量は４５００ＩＵであり、これは１．２バイアルのＯｎｃａｓｐａｒ（登録商標）に対応する。よって、患者は、Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）の用量を与えられる毎回に約１．３ｎｇの大腸菌ＨＣＰを投与される。
（ｂ）質量分析による大腸菌ＨＣＰの検出
Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）をまた、質量分析（ＭＳ）を使用して分析した。具体的には、タンデム質量分析を伴う液体クロマトグラフィー（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を使用して、Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｄａｔａ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ（「ＩＤＡ」）（Patel, V. J. et al. Journal of Proteome Research, (2009). 8: 3752-3759）によりＯｎｃａｓｐａｒ（登録商標）中の未知のＨＣＰを同定した。トリプシンを使用して試料を消化し、イオン化し、イオンの質量対電荷比（ｍ／ｚ）を決定した。結果をＵｎｉｐｒｏｔ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅで検索して試料中のＨＣＰを同定した。
５つの主なペプチドがＭＳにより同定され、それを表１に要約する：
Figure 2022545253000003
予測されたように、最も豊富に存在するペプチドは、大腸菌からのＬ－アスパラギナーゼとして同定された。２番目に豊富に存在するペプチドは、Ｅ．クリサンテミからのＬ－アスパラギナーゼとして同定された。理論により縛られることを望まないが、本発明者らは、Ｅ．クリサンテミからのＬ－アスパラギナーゼとして同定されたペプチドは、ネイティブなＥ．クリサンテミＬ－アスパラギナーゼに対して非常に高い配列同一性を有する大腸菌Ｌ－アスパラギナーゼの領域に対応すると考える。
ＭＳ分析もまた、Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）中の大腸菌ＨＣＰの存在を裏付けた。これらのＭＳデータは、ＥＬＩＳＡにより生成された結果をさらに正当化する。Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）中の大腸菌ＨＣＰのうち、ＭＳ分析は、（ｉ）推定上のスルファターゼＡｓＩＡ、（ｉｉ）特徴付けされていないタンパク質ＹｇｇＥ＿ＯＳ、および（ｉｉｉ）タンパク質ＵｓｈＡ＿ＯＳを同定した。
実施例２：Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）中の高度に免疫原性の大腸菌ＨＣＰの同定
Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）中に同定された大腸菌ＨＣＰを、主要組織適合複合体クラスＩＩ（ＭＨＣ ＩＩ）に対するそれらの結合親和性、および任意の公知のＭＨＣ ＩＩ受容体により提示される可能性について評価した。これはＴ細胞応答の発生において不可欠であり、免疫原性の強い指標を提供する。
免疫原性分析は、公的に利用可能な「ＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎ」サーバーを使用して行った。このサーバーはＡｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋｓを使用し、３つのＭＨＣ ＩＩアイソタイプＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＰの他に、マウス分子（Ｈ－２）をカバーする、結合親和性の５００，０００を上回る測定値、および溶出されたリガンドの質量分析のデータセットで訓練されている（詳細について、Jensen et al. 2018, Immunology, 154. 394-406を参照）。
免疫原性の結果を表２に示す：
Figure 2022545253000004
強いバインダーは、ヒト集団の＞９９％をカバーする２５のＨＬＡアレルにわたり＜５０ｎＭの親和性を有する。中間プラス強いバインダーは、ヒト集団の＞９９％をカバーする２５のＨＬＡアレルにわたり＜５００ｎＭの親和性を有する（Wang et al., 2010 BMC bioinformatics. 2010;11:568）。
表２に示されるように、ＭＳによりＯｎｃａｓｐａｒ（登録商標）中に同定された大腸菌ＨＣＰは、強いおよび中間プラス強いバインダーの極めて高い数を示した。Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）中に同定された大腸菌ＨＣＰの各々はしたがって高度に免疫原性である。
大腸菌ＨＣＰの投与は、その後に投与される大腸菌に由来するＬ－アスパラギナーゼに対して過敏性応答を誘発するように患者に免疫学的な素因を与える。ＨＣＰが高度に免疫原性である場合、危険かつ望ましくない免疫反応のリスクが増加される。
実施例３：Ｅ．クリサンテミＬ－アスパラギナーゼおよびＰＡＳポリマーを含むコンジュゲートの製造
Ｅ．クリサンテミＬ－アスパラギナーゼおよびＰＡＳポリマーをコードする核酸を、Ｐｃプロモーターの制御下でｐＭＭＰｃベクター（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＣ５４４２６６）にクローニングする。クローニングはポリメラーゼ連鎖反応分析により確認される。シュードモナス・フルオレセンス株ＭＢ２１４を次にエレクトロポレーションによりベクターで形質転換する。
形質転換されたシュードモナス・フルオレセンスをブロスに接種し、４８ｈ増殖させ、続いて遠心分離する。一連のクロマトグラフィーおよび濃縮工程を行う。試料純度をナトリウムドデシルスルフェート－ポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認する。コンジュゲートのアミノ酸配列をＮ－末端タンパク質シークエンシングおよび液体クロマトグラフィー－質量分析により確認する。
Ｌ－アスパラギナーゼ活性を３７℃でネスラー法によりインビトロで確認する。
実施例４：Ｅ．クリサンテミＬ－アスパラギナーゼおよび５０００Ｄａ ＰＥＧを含むコンジュゲートの製造
工程Ａ：実施例３に記載されるようにＥ．クリサンテミＬ－アスパラギナーゼをコードする核酸をｐＭＭＰｃベクターにクローニングする。実施例３の通りにシュードモナス・フルオレセンス株ＢＭ２１４を次にベクターで形質転換し、増殖させる。実施例３に記載されるように、接種および４８ｈの増殖後に、Ｅ．クリサンテミＬ－アスパラギナーゼを次に精製し、濃縮する。
工程Ｂ：精製されたＥ．クリサンテミＬ－アスパラギナーゼ（５ｍｇ／ｍｌ）を次に５０００Ｄａ官能化ｍＰＥＧ（１００ｍｇ／ｍｌ）およびナトリウムホスフェート緩衝液（１００ｍＭ；ｐＨ ８．０）の存在下で２．５時間混合する。ＰＥＧ化されたＥ．クリサンテミＬ－アスパラギナーゼを濃縮および精製し、Ｌ－アスパラギナーゼ活性を３７℃でネスラー法によりインビトロで確認する。
実施例５：Ｅ．クリサンテミＬ－アスパラギナーゼコンジュゲートのインビボ半減期の分析
実施例３および４のコンジュゲートの薬物動態特性を評価するために、コンジュゲートを免疫コンピテントマウス（それぞれ「群１」および「群２」）の静脈内に投与する。対照として、「群３」のマウスには、実施例３の工程Ａにおいて濃縮および精製されたＥ．クリサンテミＬ－アスパラギナーゼ（即ち、ＰＥＧにコンジュゲート化されていない）を投与する。
血液をマウスから後眼窩出血により収集する。出血は、投与の１ｈｒ前、ならびに投与の６ｈ、１２ｈ、１８ｈ、２４ｈ、３６ｈおよび４８ｈ後に行う。残留Ｌ－アスパラギナーゼ活性をＬ－アスパラギン酸β－ヒドロキサメート触媒方法により評価し、インビボｔ１／２値を算出する。
群１および２は、群３よりも有意に長いｔ１／２を示す。
実施例６：Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）に対する過敏症を起こした患者における使用のための好適性
患者＃１：ＡＬＬを患う男性患者は、Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）の３回目の用量に対して過敏性反応を経験する。このアレルギー性反応の１週後に、彼の静脈内に、実施例３にしたがって調製されたコンジュゲートを７５０ＩＵ／ｍ２の用量で投与する。患者は、Ｅ．クリサンテミＬ－アスパラギナーゼおよびＰＡＳポリマーのコンジュゲートを忍容し、彼のＳＡＡレベルは投薬の４８ｈ後に治療的な範囲（≧０．１ＩＵ／ｍｌ）内である。
患者＃２：ＡＬＬを患う女性患者は、Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標）の２回目の用量に対してアレルギー性反応を経験する。このアレルギー性反応の１週後に、彼女の静脈内に、実施例３にしたがって調製されたコンジュゲートを７５０ＩＵ／ｍ２の用量で投与する。患者は、Ｅ．クリサンテミＬ－アスパラギナーゼおよびＰＡＳポリマーのコンジュゲートを忍容し、彼女のＳＡＡレベルは投薬の４８ｈ後に治療的な範囲内である。

Claims (70)

  1. 患者におけるＬ－アスパラギン枯渇により治療可能な疾患の治療における使用のための、Ｌ－アスパラギナーゼおよび水溶性ポリマーを含むコンジュゲートであって、
    （ａ）前記Ｌ－アスパラギナーゼが大腸菌（E.coli）以外の供給源からのものであり、
    （ｂ）前記Ｌ－アスパラギナーゼが大腸菌以外の宿主細胞中で発現され、かつ
    （ｃ）前記患者が大腸菌由来Ｌ－アスパラギナーゼを以前に投与されている、
    使用のためのコンジュゲート。
  2. 前記Ｌ－アスパラギナーゼが組換えＬ－アスパラギナーゼである、請求項１に記載の使用のためのコンジュゲート。
  3. 患者におけるＬ－アスパラギン枯渇により治療可能な疾患の治療における使用のための組換え異種発現Ｌ－アスパラギナーゼであって、
    （ａ）前記Ｌ－アスパラギナーゼが大腸菌以外の供給源からのものであり、
    （ｂ）異種宿主細胞が大腸菌以外の宿主細胞であり、かつ
    （ｃ）前記患者が大腸菌由来Ｌ－アスパラギナーゼを以前に投与されている、
    使用のための組換え異種発現Ｌ－アスパラギナーゼ。
  4. 前記患者が大腸菌由来Ｌ－アスパラギナーゼに対する過敏症を有していた患者である、請求項１もしくは請求項２に記載の使用のためのコンジュゲート、または請求項３に記載の使用のための組換え異種発現Ｌ－アスパラギナーゼ。
  5. 前記過敏症が、アレルギー性反応、アナフィラキシーショック、およびサイレント不活性化からなる群から選択される、請求項４に記載の使用のためのコンジュゲート、または請求項４に記載の使用のための組換え異種発現Ｌ－アスパラギナーゼ。
  6. 前記大腸菌由来Ｌ－アスパラギナーゼがＯｎｃａｓｐａｒ（登録商標）である、請求項１から５のいずれか一項に記載の使用のためのコンジュゲート、または請求項１から５のいずれか一項に記載の使用のための組換え異種発現Ｌ－アスパラギナーゼ。
  7. 前記Ｌ－アスパラギナーゼがエルウィニア（Erwinia）Ｌ－アスパラギナーゼである、請求項１から６のいずれか一項に記載の使用のためのコンジュゲート、または請求項１から６のいずれか一項に記載の使用のための組換え異種発現Ｌ－アスパラギナーゼ。
  8. 前記エルウィニアＬ－アスパラギナーゼがＥ．クリサンテミ（E.chrysanthemi）Ｌ－アスパラギナーゼである、請求項７に記載の使用のためのコンジュゲート、または請求項７に記載の使用のための組換え異種発現Ｌ－アスパラギナーゼ。
  9. 前記Ｅ．クリサンテミＬ アスパラギナーゼが、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する、請求項８に記載の使用のためのコンジュゲート、または請求項８に記載の使用のための組換え異種発現Ｌ－アスパラギナーゼ。
  10. 前記水溶性ポリマーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用のためのコンジュゲート。
  11. 前記ＰＥＧが、約１００００Ｄａより低い分子量を有する、請求項１０に記載の使用のためのコンジュゲート。
  12. 前記ＰＥＧが、約５０００Ｄａより低い分子量を有する、請求項１０または請求項１１に記載の使用のためのコンジュゲート。
  13. 前記ＰＥＧが、約４０００Ｄａより低い分子量を有する、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の使用のためのコンジュゲート。
  14. 前記ＰＥＧが、約３０００Ｄａより低い分子量を有する、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の使用のためのコンジュゲート。
  15. 前記ＰＥＧが、約２０００Ｄａより低い分子量を有する、請求項１０から１４のいずれか一項に記載の使用のためのコンジュゲート。
  16. 前記水溶性ポリマーがＰＡＳポリマーである、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用のためのコンジュゲート。
  17. 前記ＰＡＳポリマー中のアミノ酸残基の少なくとも８０％が、プロリン、アラニンおよびセリンからなる、請求項１６に記載の使用のためのコンジュゲート。
  18. 前記ＰＡＳポリマー中のアミノ酸残基の少なくとも９０％が、プロリン、アラニンおよびセリンからなる、請求項１６または請求項１７に記載の使用のためのコンジュゲート。
  19. 前記ＰＡＳポリマー中のアミノ酸残基の少なくとも９５％が、プロリン、アラニンおよびセリンからなる、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の使用のためのコンジュゲート。
  20. 前記ＰＡＳポリマー中のアミノ酸残基の少なくとも９７％が、プロリン、アラニンおよびセリンからなる、請求項１６から１９のいずれか一項に記載の使用のためのコンジュゲート。
  21. 前記ＰＡＳポリマー中のアミノ酸残基の少なくとも９９％が、プロリン、アラニンおよびセリンからなる、請求項１６から２０のいずれか一項に記載の使用のためのコンジュゲート。
  22. 前記ＰＡＳポリマー中のアミノ酸残基の全てが、プロリン、アラニンおよびセリンからなる、請求項１６から２１のいずれか一項に記載の使用のためのコンジュゲート。
  23. 前記ＰＡＳポリマーが少なくとも１０個のアミノ酸残基を含む、請求項１６から２２のいずれか一項に記載の使用のためのコンジュゲート。
  24. 前記ＰＡＳポリマーが少なくとも１５個のアミノ酸残基を含む、請求項１６から２３のいずれか一項に記載の使用のためのコンジュゲート。
  25. 前記ＰＡＳポリマーが少なくとも２０個のアミノ酸残基を含む、請求項１６から２４のいずれか一項に記載の使用のためのコンジュゲート。
  26. 前記ＰＡＳポリマーが少なくとも２５個のアミノ酸残基を含む、請求項１６から２５のいずれか一項に記載の使用のためのコンジュゲート。
  27. 前記ＰＡＳポリマーが少なくとも３０個のアミノ酸残基を含む、請求項１６から２６のいずれか一項に記載の使用のためのコンジュゲート。
  28. 前記ＰＡＳポリマーが１０～６０個のアミノ酸残基を含む、請求項１６から２７のいずれか一項に記載の使用のためのコンジュゲート。
  29. 前記ＰＡＳポリマーが１５～５０個のアミノ酸残基を含む、請求項１６から２８のいずれか一項に記載の使用のためのコンジュゲート。
  30. 前記ＰＡＳポリマーが２０～４０個のアミノ酸残基を含む、請求項１６から２９のいずれか一項に記載の使用のためのコンジュゲート。
  31. 前記ＰＡＳポリマーが２０～３０個のアミノ酸残基を含む、請求項１６から３０のいずれか一項に記載の使用のためのコンジュゲート。
  32. 前記ＰＡＳポリマーが精製タグを追加的に含む、請求項１６から３１のいずれか一項に記載の使用のためのコンジュゲート。
  33. 前記精製タグがＨｉｓ６タグである、請求項３２に記載の使用のためのコンジュゲート。
  34. 前記精製タグがＳｔｒｅｐタグである、請求項３２に記載の使用のためのコンジュゲート。
  35. 前記宿主細胞がシュードモナス（Pseudomonas）属の細胞である、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用のためのコンジュゲート、または先行する請求項のいずれか一項に記載の使用のための組換え異種発現Ｌ－アスパラギナーゼ。
  36. 前記宿主細胞がシュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）である、請求項３５に記載の使用のためのコンジュゲート、または請求項３５に記載の使用のための組換え異種発現Ｌ－アスパラギナーゼ。
  37. 前記宿主細胞がシュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）である、請求項３５に記載の使用のためのコンジュゲート、または請求項３５に記載の使用のための組換え異種発現Ｌ－アスパラギナーゼ。
  38. 前記宿主細胞がシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）である、請求項３５に記載の使用のためのコンジュゲート、または請求項３５に記載の使用のための組換え異種発現Ｌ－アスパラギナーゼ。
  39. 前記患者が２１歳またはそれ未満である、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用のためのコンジュゲート、または先行する請求項のいずれか一項に記載の使用のための組換え異種発現Ｌ－アスパラギナーゼ。
  40. 凍結乾燥形態である、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用のためのコンジュゲート、または先行する請求項のいずれか一項に記載の使用のための組換え異種発現Ｌ－アスパラギナーゼ。
  41. 大腸菌中で発現された同等のコンジュゲートと比較して少なくとも８０％のインビトロ活性を有する、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用のためのコンジュゲート。
  42. 大腸菌中で発現された同等のコンジュゲートと比較して少なくとも９０％のインビトロ活性を有する、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用のためのコンジュゲート。
  43. 大腸菌中で発現された同等のコンジュゲートと少なくとも同等のインビトロ活性を有する、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用のためのコンジュゲート。
  44. 前記治療が前記コンジュゲートの静脈内投与を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用のためのコンジュゲート、または先行する請求項のいずれか一項に記載の使用のための組換え異種発現Ｌ－アスパラギナーゼ。
  45. 前記治療が前記コンジュゲートの筋肉内投与を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用のためのコンジュゲート、または先行する請求項のいずれか一項に記載の使用のための組換え異種発現Ｌ－アスパラギナーゼ。
  46. 前記治療が週当たり３回未満の前記コンジュゲートの投与を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用のためのコンジュゲート。
  47. 前記治療が週当たり２回未満の前記コンジュゲートの投与を含む、請求項１から４６のいずれか一項に記載の使用のためのコンジュゲート。
  48. 前記治療が週当たり１回未満の前記コンジュゲートの投与を含む、請求項１から４７のいずれか一項に記載の使用のためのコンジュゲート。
  49. Ｌ－アスパラギン枯渇により前記治療可能な疾患ががんである、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用のためのコンジュゲート、または先行する請求項のいずれか一項に記載の使用のための組換え異種発現Ｌ－アスパラギナーゼ。
  50. 前記がんが、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫、ＮＫリンパ腫、および膵臓がんからなる群から選択される、請求項４９に記載の使用のためのコンジュゲート、または請求項４９に記載の使用のための組換え異種発現Ｌ－アスパラギナーゼ。
  51. 前記がんがＡＬＬである、請求項４９もしくは請求項５０に記載の使用のためのコンジュゲート、または請求項４９もしくは請求項５０に記載の組換え異種発現Ｌ－アスパラギナーゼ。
  52. （ａ）先行する請求項のいずれか一項に記載の使用のためのコンジュゲート、および／または（ｂ）先行する請求項のいずれか一項に記載の使用のための組換え異種発現Ｌ－アスパラギナーゼ、ならびに薬学的に許容される賦形剤を含む、組成物。
  53. １つまたはそれより多くの凍結乾燥保護剤を含む、請求項５２に記載の使用のための組成物。
  54. 前記凍結乾燥保護剤が、トレハロースおよびスクロースからなるリストから選択される、請求項５３に記載の使用のための組成物。
  55. 凍結乾燥形態である、請求項５２から５４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
  56. 可溶化された形態である、請求項５２から５４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
  57. 大腸菌由来Ｌ－アスパラギナーゼを以前に投与された患者においてＬ－アスパラギン枯渇により治療可能な疾患を治療する方法であって、前記患者に有効量の先行する請求項のいずれか一項で定義されるコンジュゲートまたは組成物を投与する工程を含む、方法。
  58. 大腸菌由来Ｌ－アスパラギナーゼを以前に投与された患者においてＬ－アスパラギン枯渇により治療可能な疾患を治療する方法であって、前記患者に有効量の先行する請求項のいずれか一項で定義される組換え異種発現Ｌ－アスパラギナーゼまたは組成物を投与する工程を含む、方法。
  59. 前記患者が大腸菌由来Ｌ－アスパラギナーゼに対する過敏症を有していた患者である、請求項５７または請求項５８に記載の方法。
  60. 前記過敏症が、アレルギー性反応、アナフィラキシーショック、およびサイレント不活性化からなる群から選択される、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記患者がＯｎｃａｓｐａｒ（登録商標）を以前に投与されている、請求項５７から６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記患者が２１歳またはそれ未満である、請求項５７から６０のいずれか一項に記載の方法。
  63. Ｌ－アスパラギン枯渇により治療可能な前記疾患ががんである、請求項５７から６２のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記がんが、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、リンパ肉腫、非ホジキンリンパ腫、ＮＫリンパ腫、および膵臓がんからなる群から選択される、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記がんがＡＬＬである、請求項６３または請求項６４に記載の方法。
  66. 前記コンジュゲートまたは組成物が静脈内に投与される、請求項５７から６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. 前記コンジュゲートまたは組成物が筋肉内に投与される、請求項５７から６６のいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記コンジュゲートまたは組成物が週当たり３回未満で投与される、請求項５７から６７のいずれか一項に記載の方法。
  69. 前記コンジュゲートまたは組成物が週当たり２回未満で投与される、請求項５７から６８のいずれか一項に記載の方法。
  70. 前記コンジュゲートまたは組成物が週当たり１回未満で投与される、請求項５７から６９のいずれか一項に記載の方法。
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