TR201806885T4 - Çölyak sprue hastalığının tedavisi için bileşimler ve yöntemler. - Google Patents

Abstract

Buluş çölyak sprue hastalığının tedavisi için bileşimleri ve yöntemleri sağlar

Description

TARIFNAME ÇÖLYAK SPRUE HASTALIGININ TEDAVISI IÇIN BILESIMLER VE YÖNTEMLER Çapraz Referans Bu basvuru 8/10/2011 tarihinde dosyalanmasi yapilmis U.S. Provisional Application Serial No. 61/521,899 dökümanina göre öncelik istemlendirir.

Hükümet Desteginin Beyani Bu bulus Savunma Ileri Arastirma Projeleri Ajansi (DARPA) hibe numarasi belirli haklara sahiptir. Önceki Teknik Çölyak sprue bugday, arpa ve çavdarda bulunan “glutenler” olarak bilinen diyet proteinlerinin genetik olarak yatkin bireylerin ince bagirsaklarinda bir immün tepki uyandiran bir yüksek derecede yaygin hastaliktir. Sonuçtaki enflamasyon ince bagirsagin besinlerin absorpsiyonunu engelleyen bagirsak içi kilimsi çikintilarinin bozunmasina götürebilir. Semptomlar erken çocuklukta veya yasamda daha sonra ortaya çikabilir ve siddetlikte, ishal, yorgunluk ve agirlik kaybindan abdominal siskinlik, anemi ve nörolojik semptomlara kadar genis aralik içinde yer alabilir. Diyette glutenlerin toplam olarak ortadan kaldirilmasi hariç, halen bu yasam boyu hastalik için hiçbir etkili terapi yoktur. Her ne kadar çölyak sprue büyük ölçüde teshislendirilmemis olarak kalirsa da, ABD ve Avrupada onun yayinligi popülasyonun % 0.5-1”i olarak tahmin edilir. Çölyak hastaligi için oral terapötikler olarak uygun dogal olarak meydana gelen enzimlerin kimliklendirilmesi, insan sindirim yolunun zorlu ve yüksek decedede 27969.03 asidik ortaminda spesifik olarak ve etkili olarak gluten-türevli peptidleri bozundurmak üzere kesin fiziksel ve kimyasal gerekliliklerden dolayi, zordur.

Bulusun Kisa Açiklamasi Bir birinci husus içinde, mevcut bulus SEQ ID NO:35 uyarinca bir amino asit dizinine en az % 75 benzesik olan bir amino asit dizini içeren polipeptidleri saglar ve burada, (21) polipeptid pH 4ide bir PQPQLP (SEQ ID NO:34) peptidi bozundurur; (b) kalinti 278 Seridir, kalinti 78 Gluidur ve kalinti 82 Asp”dir; ve meydana gelen gruptan seçilmis bir veya daha fazla kalintida SEQ ID NO: 67°den bir amino asit degisimini içerir ve burada, SEQ ID 67°den sözü edilen bir veya daha fazla amino asit degisimi en azindan G13OS, D169G ve D179H”yi veya SEQ ID NO:67'den sözü edilen bir veya daha fazla amino asit degisimi en azindan N 102Diyi içerir.

Bir ikinci husus içinde, mevcut bulus SEQ ID NO:1 uyarinca bir amino asit dizinine en az % 75 benzesik olan bir amino asit dizini içeren polipeptidleri saglar ve burada, (a) polipeptid pH 4'de bir PQPQLP (SEQ ID NO:34) peptidi bozundurur; (b) kalinti 467 Ser”dir, kalinti 267 Gluidur ve kalinti 271 Asp`dir; ve meydana gelen gruptan seçilmis bir veya daha fazla kalintida SEQ ID NO: 33iden bir amino asit degisimi içerir ve burada, SEQ ID NO:33,den sözü edilen bir veya daha fazla amino asit degisimi en azindan G319S, D358G, ve D368Hiyi veya SEQ ID NO:33”den sözü edilen bir veya daha fazla amino asit degisimi en azindan N291Diyi içerir. 27969.03 Birinci ve ikinci hususun çesitli uygulamalarinda, polipeptid SEQ ID NO:l veya SEQ ID NO:35 uyarinca amino asit dizinine en az % 85, % 95 veya % 100 benzesik bir amino asit dizinini içerir. Bir baska uygulamada, polipeptid SEQ ID NO:2-66`nin herhan i biri u arinca bir amino asit dizinini i erir.

Bir baska husus içinde, mevcut açiklama SEQ ID N02] uyarinca bir amino asit dizinini içeren polipeptidleri açiklar ve burada, polipeptid SEQ ID NO: 33,den en az bir amino asit degisimi içerir. Bir baska husus içinde, mevcut açiklama SEQ ID NO:35 uyarinca bir amino asit dizini içeren bir polipeptidi saglar ve burada, polipeptid SEQ ID NO:67”den en az bir amino asit degisimi içerir. Çesitli uygulamalarda, polipeptid SEQ ID NO:2-66”nin herhangi biri uyarinca bir amino asit dizinini içerir.

Bir ilave husus içinde, mevcut bulus bulusun herhangi bir hususunun veya uygulamasinin polipeptidini kodlayan nükleik asitleri saglar. Bir baska husus içinde, bulus bulusun izole edilmis nükleik asitlerini içeren nükleik asit ekspresyon vektörlerini saglar. Bir ilave uygulamada, bulus bulusun nükleik asit ekspresyon vektörlerini içeren rekombinant konak hücreleri saglar. Bir baska husus içinde, bulus bulusun polipeptidleri, nükleik asitleri, nükleik asit ekspresyon vektörlerini ve/veya rekombinant konak hücrelerini ve bir farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyiciyi içeren farmasötik bilesimleri saglar.

Bir baska husus içinde, mevcut açiklama çölyak sprue tedavisi için yöntemlerde kullanmak üzere, bulusun herhangi bir uygulamasi uyarinca bir polipeptidi veya farmasötik bilesimi veya SEQ ID NO:33 veya SEQ ID NO:67,den meydana gelen gruptan seçilmis bir amino asiti içeren bir polipeptidi saglar.

Sekillerin Kisa Açiklamasi Sekil 1. Çölyak hastaliginin tedavisinde enzim terapötiklerinin rolünü betimleyen sema. Gluten is comprised of many glycoproteins including (i- 27969.03 gliadin içeren birçok glikoproteinde içerilir. Partial proteolysis of or- gliadiniin (SEQ ID NO: 71) kismi proteolizi enflamasyona ve hastaliga götürebilen bir PQdipeptid motifinde zenginlestirilmis proteaZ-dirençli peptidler ile sonuçlanir. Midede fonksiyonel olan ve spesifik olarak immünojenik peptidleri bozundurma yetkinliginde olan bir oral enzim terapötigin ilavesi potansiyel olarak bu hastalik için bir terapötik olarak hareket edebilir.

Sekil 2. Computational models of the peptide binding sites for KumaWT ve KumaMax için peptid baglanma yerlerinin bilgisayimsal modelleri. A) KumaWT bir PR dipeptid motifi ile kompleks içinde. B) KumaMax tasarlanmis PQ dipeptid motifi ile kompleks içinde. Aktif yerdeki bilgisayimsal olarak tasarlanmis kalintilar etiketlenirler ve çubuklar halinde vurgulanirlar. Modellenmis peptidler Kumamolisin-AS”nin (PDB Rosetta Molecular Modeling Suite kullanilarak olusturuldu. Görüntüler PyMol v1.5 kullanilarak olusturuldu.

Sekil 3. Pepsin veya tripsin ile inkübasyondan sonra protein kararliligi.

Kararlilik, belirtilmis pHida, pepsin veya tripsinin mevcudiyetinde veya yoklugunda, 30 dakika inkübasyondan sonra, bir DSD-PAGE jel üzerinde gözlemlenmis olarak bozulmamis proteinin göreceli kalan fraksiyonunun niceliklendirilmesi araciligiyla ölçüldü. Her protein üç kopya olarak ölçüldü ve hata çubuklari standart sapmayi temsil ederler. Niceliklendirme Sekil 4. Bir immünojenik a9-gliadin peptid KumaMax tarafindan bozundurulur. A) Enzim olmadan, SC PEP veya KumaMaXTM ile 50 dakika inkübasyondan sonra, ana 0t9-gliadin peptidin M+H iyonunun bollugunu ölçen reaksiyon kromatograflari. B) pH 4ide inkübasyon süresinin bir fonksiyonu olarak KumaMaXTWin mevcudiyetinde kalan 019- gliadin peptidin fraksiyonu. Veriler bir standart üssel gecikme fonksiyonu kullanilarak denk getirildi. R2 degeri 0.9”dan daha büyük idi. 27969.03 Detayli Açiklama Aksi sekilde belirtilmedikçe, bu basvuru içinde, teknikler asagidakiler gibi iyi bilinen referanslarin herhangi birinde bulunabilirler: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, ark., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), Gene Expression Technology (Methods in Enzymology, Vol. 185, edited by D.

Goeddel, 1991. Academic Press, San Diego, CA), "Guide to Protein Purification" in Methods in Enzymology (M.P. Deutshcer, ed., (1990) Academic Press, Inc.); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, ark. 1990.

Academic Press, San Diego, CA), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2nd Ed. (R.I. Freshney. 1987. Liss, Inc. New York, NY), Gene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128, ed. EJ. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, N.J.), ve the Ambion 1998 Catalog (Ambion, Austin, TX).

Burada kullanildigi haliyle, belgisiz ve belgili belirtme edatlarinin tekil biçimleri, içerik açik sekilde aksini belrtmedigi sürece, çogul referanslari da içerirler. Aksi sekilde belirtilmedikçe, ve” baglaci burada “veya” baglaci ile karsilikli degistirilebilir olarak kullanilir.

Burada kullanildigi haliyle, amino asit kalintilari asagidaki sekilde kisaltilirlar: alanin (Ala; A), asparagin (Asn; N), aspartik asit (Asp, D), arginin (Arg; R), sistein (Cys; C), glutamik asit (Glu; E), glutamin (Gln, Q), glisin (Gly, G), histidin (His; H), izolözin (I1e; I), lösin (Leu; L), lisin (Lys; K), metionin (Met; M), fenilalanin (Phe; F), prolin (Pro; P), serin (Ser, S), treonin (Thr; T), triptofan (Trp; W), tirosin (Tyr', Y) ve valin (Va1; V).

Içerik açik olarak aksini belirtmedikçe, bulusun herhangi bir hususunun tüm uygulamalari kombinasyon içinde kullanilabilirler. 27969.03 Bir birinci husus içinde, mevcut açiklama SEQ ID NO:35 uyarinca bir amino asit dizinine en az % 75 benzesik olan bir amino asit dizinini içeren polipeptidleri saglar ve burada, (a) polipeptid pH 4'de bir PQPQLP (SEQ ID NO:34) peptidi bozundurur; (b) kalinti 278 Ser'dir, kalinti 78 Glu7dur ve kalinti 82 Asp,dir; ve meydana gelen gruptan seçilmis bir veya daha fazla kalintida SEQ ID NO: 67,den bir amino asit degisimini içerir.

Asagidaki örneklerde açiklanmis sekilde, bu husus uyarinca polipeptidler örnegin çölyak sprue tedavisinde kullanilabilirler. Polipeptidler, serin-karboksil peptidazlarin sedolisin ailesinin bir üyesi olarak bilinen ve onu substratini (Ser467- Glu267-Asp27l onun önceden-islemden geçirilmis biçiminde) hidrolize etmek üzere onun islemden geçirilmis biçiminde anahtar katalitik üçlü takimini Ser278-Glu78- Asp82 kullanima koyan, Kumamolisin-As'nin (SEQ ID NO:67) ya islemden geçirilmis versiyonunun veya Kumamolisin-Asmin (SEQ ID NO:33) önceden- islemden geçirilmis versiyonunun modifiye edilmis versiyonlaridirlar. Onun maksimal aktivitesi pH ~ 40 oldugu zamandir. While the native substrate for Kumamolisin-As için dogal substrat bilinmezken, asidik kosullar (4) altinda kollajeni bozundurdugu önceden gösterilmis bulunmaktadir. Ilave olarak, bu enzimin 60°C°da bir ideal sicakliklatermo-kararli oldugu, fakat 37°C°da hala önemli aktivite gösterdigi gösterilmis bulunmaktadir.

Mevcut bulusun mucitleri, Kumamolisin-As'nin çogu çölyak sprue hastalarinda immün tepkinin esas kismindan sorumlu olan ve glutenin “gliadinler” olarak bilinen prolin (P)- ve glutamin (Q)-zengin bilesenlerini bozundurma yetkinliginde oldugunu beklenmeyen sekilde kesfetmis bulunmaktadirlar. Burada tanimlanmis polipeptidler, dogal tip Kumamolisin-Aýye kiyasla, oligopeptid PQPQLPiye (gliadinin bir substrat temsilcisi) karsi, pH 4°de gelistirilmis proteaz aktivitesi gösterirler. 27969.03 Bu hususun polipeptidleri pH 4'de bir PQPQLP”yi (SEQ ID NO:34) bozundurur.

Bu bozundurma asagidaki örneklerde açiklanmis kosullar altinda meydana gelir. 1797dan (numaralandirma dogal tip islemden geçirilmis Kumamolisin-As amino asit dizini üzerine temellendirilir) meydana gelen gruptan seçilmis bir veya daha fazla kalintida SEQ ID NO:67`den (dogal tip islemden geçirilmis Kumamolisin- As) bir veye daha fazla amino asit degisimleri içerirler. Sinirlayici-olmayan örneklerde,d0gal tip islemden geçirilmis Kumamolisin-As amino asit dizinine (SEQ ID NO:67) göre bir veya daha fazla degisim asagidakilerden meydana gelen gruptan seçilir: WT Kalinti# AA degisimi S73 K, G N102 D T103 S D104 A, T, N Gl30 S 8165 N T168 A D169 N, G Q172 D D179 S, H Çesitli ilave sinirlayici-olmayan uygulamalarda, dogal tip islemden geçirilmis Kumamolisin-As amino asit dizinine göre bir veya daha fazla degisim en az bir N102D içerir. Bir baska uygulamada, dogal tip islemden N102D ve D169N veya D169G içerir. Bir baska uygulamada, dogal tip islemden geçirilmis Kumamolisin- As amino asit dizinine göre bir veya daha fazla degisim en az bir N102D, D169G 27969.03 ve D179H içerir. Bir baska uygulamada, dogal tip islemden geçirilmis Kumamolisin-As amino asit dizinine göre bir veya daha fazla degisim en az bir Burada kullanildigi haliyle, "en az % 75 benzesik" terimi polipeptidin onun tam uzunluk amino asit dizininde, SEQ ID NO: 35 tarafindan tanimlanmis polipeptidden % 25 veya daha az kadar (herhangi bir amino asit sübstitüsyonu, silinmeleri, ilaveleri veya içeri sokulmalari dahil) farklilik gösterdigi anlamina Çesitli tercih edilen uygulamalarda, polipeptidler SEQ ID NO: 35 uyarinca bir 98% veya 99% benzesik bir amino asit dizinini içerir veya böyle bir amino asit dizininden meydana gelir. Çesitli ilave uygulamalarda, polipeptidler SEQ ID NO,1ar:36-66,nin herhangi birine en az % 75 benzesik bir amino asit dizini içerir veya böyle bir amino asit dizininden meydana gelir. SEQ ID NO”lar tarafindan temsil edilmis polipeptidler dogal tip Kumamolisin-As'ye kiyaslandiginda, oligopeptid PQPQLPiye (SEQ ID NO:34) (gliadinin temsilvcisi bir substrat) karsi pH 4lde gelistirilmis proteaz aktivitesi ile polipeptidlerin spesifik örnekleridirler. Çesitli tercih edilen uygulamalarda, polipeptidler SEQ ID NO'1a:36-66'nin herhangi biri uyarinca bir 98% veya 99% benzesik bir amino asit dizinini içerir veya böyle bir amino asit dizininden meydana gelir. Bir ilave uygulamada, polipeptidler SEQ ID NO,lar:36- 667nin herhangi biri uyarinca bir amino asit dizinini içerir veya böyle bir amino asit dizinininden meydana gelir. 27969.03 Bu birinci hususun bir tercih edilen uygulamasinda, polipeptidler SEQ ID NO:1 uyarinca (Kumamolisin-As”nin islemden geçirilmis versiyonunun degiskeleri üzerine temellendirilmis olarak) bir amino asit dizinine en az % 75 benzesik bir amino asit dizinini içerirler ve burada, (21) polipeptid pH 4'de bir PQPQLP (SEQ ID NO:34) peptidi bozundurur; (b) kalinti 467 Ser,dir, kalinti 267 Glu”dur ve kalinti 271 Asp`dir; ve meydana gelen gruptan seçilmis bir veya daha fazla kalintida SEQ ID NO: 33an bir amino asit degisimi içerir 358, 361 ve 368”den (numaralandirma dogal tip önceden-islemden geçirilmis Kumamolisin-As amino asit dizini üzerine temellendirilir) meydana gelen gruptan seçilmis bir veya daha fazla kalintida SEQ 1D NO: 33°den (dogal tip önceden- islemden geçirilmis Kumamolisin-As) bir veya daha fazla amino asit degisimi içerir. Sinirlayici-olmayan uygulamalarda, dogal tip Kumamolisin-As amino asit dizinine göre bir veya daha fazla degisim asagidakilerden meydana gelen gruptan seçilirler: WT Kalinti# AA degisimi V1 19 D 8262 K, G N291 D T 292 S D293 A, T, N G319 S 8354 N T357 A D358 N, G Q361 S D368 S, H 27969.03 Çesitli ilave sinirlayici-olmayan uygulamalarda, dogal tip Kumamolisin-As amino asit dizinine göre bir veya daha fazla degisimler en az N291D5yi içerirler. Bir baska uygulamada, dogal tip Kumamolisin-As amino asit dizinine göre bir veya daha fazla degisim en az N291D ve 358N veya 358G,yi içerirler. Bir baska uygulamada, dogal tip Kumamolisin-As amino asit dizinine göre bir veya daha fazla degisim en az N291D, 358G ve 368H,yi içerirler. Bir baska uygulamada, dogal tip Kumamolisin-As amino asit dizinine göre bir veya daha fazla degisim en Burada kullanildigi haliyle, "en az % 75 benzesik" terimi polipeptidin onun tam uzunluk amino asit dizininde, SEQ ID NO: 1 tarafindan tanimlanmis polipeptidden % 25 veya daha az kadar (herhangi bir amino asit sübstitüsyonu, silinmeleri, ilaveleri veya içeri sokulmalari dahil) farklilik gösterdigi anlamina Çesitli tercih edilen uygulamalarda, polipeptidler SEQ ID NO: 1 uyarinca bir 98% veya 99% benzesik bir amino asit dizinini içerir veya böyle bir amino asit dizininden meydana gelir. Bir ilave uygulamada, polipeptidler SEQ ID No: 1 uyarinca bir amino asit dizini içerir veya böyle bir amino asit dizininden meydana Çesitli ilave uygulamalarda, polipeptidler SEQ ID NOS:2-32”nin herhangi birine dizininden meydana gelirler. SEQ ID NO”1ar tarafindan temsil edilmis polipeptidler dogal tip Kumamolisin-As”ye kiyaslandiginda, oligopeptid PQPQLP”ye (SEQ ID NO:34) (gliadinin temsilcisi bir substrat) karsi pH 4,de 27969.03 gelistirilmis proteaz aktivitesi ile polipeptidlerin spesifik örnekleridirler. Çesitli tercih edilen uygulamalarda, polipeptidler SEQ ID NO”la:2-32”nin herhangi biri 96%, 97%, 98% veya 99% benzesik bir amino asit dizinini içerir veya böyle bir amino asit dizininden meydana gelirler. Bir ilave uygulamada, polipeptidler SEQ bir amino asit dizinininden meydana gelirler.

Bir ikinci husus içinde, mevcut açiklama SEQ ID NO:35 uyarinca bir amino asit dizinini içeren veya böyle bir amino asit dizininden meydana gelen polipeptidleri saglar ve burada, polipeptid SEQ ID NO:67°den en az bir amino asit degisimi içerir. Asagidaki örneklerde açiklanan sekilde, bu husus uyarinca polipeptidler örnegin çölyak sprue tedavisinde kullanilabilirler. Polipeptidler dogal tip Kumamolisin-As°ye kiyaslandiginda, oligopeptid PQPQLPlye (SEQ ID NO:34) (gliadinin bir substrat temsilcisi) karsi pH 49de bir gelistirilmis proteaz aktivitesi gösteren islemden geçirilmis Kumamolisin-Asmin (SEQ ID NO:67) modifiye edilmis versiuyonlaridirlar. Bir uygulamada, polipeptidler SEQ ID NO:36 uyarinca bir amino asit dizini içerirler veya böyle bir amino asit dizininden meydana gelirler. SEQ ID NO:36 uyarinca polipeptidler dogal tip islemden geçirilmis Kumamolisin-A57ye göre bir N102D mutasyonuna sahiptirler.

Asagidaki örneklerde gösterilen sekilde, bu mutasyonu içeren polipeptidler dogal tip Kumamolisin-As`ye kiyaslandiginda, oligopeptid PQPQLP”ye (SEQ ID NO:34) karsi pH 4'de en az 10-kat gelistirilmis proteaz aktivitesine sahiptirler.

Bu ikinci hususun bir baska uygulamasinda, polipeptidler SEQ ID NO:37 uyarinca bir amino asit dizini içerir veya böyle bir amino asit dizininden meydana gelirler. SEQ ID NO:37 uyarinca polipeptidler dogal tip islemden geçirilmis Kumamolisin-As°ye göre bir N102D mutasyonuna ve bir D169N veya D169G mutasyonuna sahiptirler. Asagidaki örneklerde gösterilen sekilde, bu mutasyonu içeren polipeptidler dogal tip Kumamolisin-Ayye kiyaslandiginda, oligopeptid 27969.03 PQPQLP,ye (SEQ ID NO:34) karsi pH 43de en az 20-kat gelistirilmis proteaz aktivitesine sahiptirler.

Bu ikinci hususun bir baska uygulamasinda, polipeptidler SEQ ID NO:38 uyarinca bir amino asit dizini içerir veya böyle bir amino asit dizininden meydana gelirler. SEQ ID NO:38 uyarinca polipeptidler dogal tip islemden geçirilmis Kumamolisin-Aslye göre bir N102D mutasyonuna ve bir D169N ve bir D179H mutasyonuna sahiptirler. Asagidaki örneklerde gösterilen sekilde, dogal tip Kumamolisin-As*ye kiyaslandiginda, oligopeptid PQPQLPSye (SEQ ID NO:34) karsi pH 4'de en az 50-kat gelistirilmis proteaz aktivitesine sahiptirler.

Bu ikinci hususun bir ilave uygulamasinda, polipeptidler SEQ ID NOllarz39- 66,nin herhangi biri uyarinca bir amino asit dizinini içerir veya böyle bir amino asit dizininden meydana gelirler. Bu uygulamalar uyarinca polipeptidlerin tamaminin dogal tip Kumamolisin-AsSye kiyaslandiginda, oligopeptid PQPQLPlye (SEQ ID NO:34) karsi pH 4'de gelistirilmis proteaz aktivitesi gösterdikleri sergilenmis bulunmaktadir. Bir tercih edilen uygulamada, polipeptid SEQ ID NO:66 uyarinca bir amino asit dizini içerir veya böyle bir amino asit dizininden meydana gelir.

Bu ikinci hususun bir tercih edilen uygulamasinda, mevcut açiklama SEQ ID NO: 1 uyarinca bir amino asit dizini içeren veya böyle bir amino asit dizininden meydana gelen polipeptidleri saglar ve burada, polipeptid SEQ ID NO: 33”den en az bir amino asit degisimi içerir. Asagidaki örneklerde açiklanan sekilde, bu husus uyarinca polipeptidler örnegin çölyak sprue tedavisinde kullanilabilirler.

Polipeptidler, dogal tip Kumamolisin-As'ye kiyaslandiginda, oligopeptid PQPQLP,ye (SEQ ID NO:34) (gliadinin bir substrat temsilcisi) karsi pH 4,de gelistirilmis proteaz aktivitesi gösteren önceden-islemden geçirilmis Kumamolisin-AS°nin (SEQ ID NO: 33) müdifiye edilmis versiyonlaridirlar. Bir uygulamada, polipeptidler SEQ ID NO: 2 uyarinca bir amino asit dizini içerir veya böyle bir amino asit dizininden meydana gelirler. SEQ ID NO: 2 uyarinca 27969.03 polipeptidler dogal tip Kumamolisin-As7ye göre bir N291D mutasyonuna sahiptirler. Asagidaki örneklerde gösterilen sekilde, dogal tip Kumamolisin-As” ye kiyaslandiginda, oligopeptid PQPQLP`ye (SEQ ID NO:34) karsi pH 4,de en az -kat gelistirilmis proteaz aktivitesine sahiptirler.

Bu ikinci hususun bir baska uygulamasinda, polipeptidler SEQ ID NO: 3 uyarinca bir amino asit dizini içerir veya böyle bir amino asit dizininden meydana gelirler.

SEQ ID NO: 3 uyarinca polipeptidler önceden-islemden geçirilmis dogal tip Kumamolisin-Aslye göre bir N291D mutasyonuna ve bir D358N veya D358G mutasyonuna sahiptirler. Asagidaki örneklerde gösterilen sekilde, dogal tip Kumamolisin-As7ye kiyaslandiginda, oligopeptid PQPQLP'ye (SEQ ID NO:34) karsi pH 47de en az 20-kat gelistirilmis proteaz aktivitesine sahiptirler.

Bu ikinci hususun bir baska uygulamasinda, polipeptidler SEQ ID NO: 4 uyarinca bir amino asit dizini içerir veya böyle bir amino asit dizininden meydana gelirler.

SEQ ID NO: 4 uyarinca polipeptidler önceden-islemden geçirilmis dogal tip Kumamolisin-Aýye kiyasla, bir N29l mutasyonuna ve bir D358G veya bir D358H mutasyonuna sahiptirler. Asagidaki örneklerde gösterilen sekilde, dogal tip Kumamolisin-Aslye kiyaslandiginda, oligopeptid PQPQLP,ye (SEQ ID NO:34) karsi pH 4,de en az 50-kat gelistirilmis proteaz aktivitesine sahiptirler.

Bu ikinci hususun bir ilave uygulamasinda, polipeptidler SEQ ID NO: 2-327nin herhangi biri uyarinca bir amino asit dizini içerir veya böyle bir amino asit dizininden meydana gelirler. Bu uygulamalar uyarinca polipeptidlerin tamaminin dogal tip Kumamolisin-Aýye kiyaslandiginda, oligopeptid PQPQLP'ye (SEQ ID NO:34) karsi pH 4lde gelistirilmis proteaz aktivitesi gösterdikleri sergilenmis bulunmaktadir. Bir tercih edilen uygulamada, polipeptid SEQ ID NO:32 uyarinca bir amino asit dizini içerir veya böyle bir amino asit dizininden meydana gelir; bu polipeptidin test edilen polipeptidler arasinda oligopeptid PQPQLP”ye (SEQ ID NO:34) karsi pH 43de en etkili proteaz aktivitesine sahip oldugu asagidaki örneklerde gösterilir. 27969.03 Mevcut açiklama boyunca kullanilmis sekilde, “polipeptid” terimi dogal olarak meydana gelip gelmemesinden veya sentetik menseili olup olmamasindan bagimsiz olarak alt-ünite amino asitlerin bir dizinine atifta bulmak üzere onun en genis anlaminda kullanilirBurada açiklanmis polipeptidler L-amino asitleri, D- amino asitleri (in vivo olarak L-amino asit-Spesifik proteazlara dirençli olan) veya D- ve L-amino asitlerin bir kombinasyonunu içerebilirler. Burada tanimlanmis polipeptidler kimyasal olarak sentezlenebilirler veya rekombinant olarak ifade edilebilirler. Polipeptidler, PEGilasyon, HESilasyon veya glikosilasyon araciligiyla oldugu gibi, bir in vivo artirilmis yarilanma-ömrü yükseltmek üzere diger bilesiklere baglanti]andirilabilirler. Böylesi baglanti, teknikte uzman olanlarca ansailan sekilde, kovalent veya kovalent-olmayan olabilir. Polipeptidler saflastirma veya tespit (FLAG veya His etiketleri gibi) için kullanilabilen herhangi bir baglantilandirici dahil, herhangi bir diger uygun baglantilandiriciya baglantilandirilabilir.

Bir üçüncü husus içinde, mevcut açiklama burada tanimlanmis herhangi bir hususun veya uygulamanin polipeptidini kodlayan nükleik asitleri saglar. lzole edilmis nükleik asit dizini RNA veya DNA içerebilir. Burada kullanildigi haliyle, kusatan nükleik asit dizinlerinden giderilmis bulunanlardir. Böylesi izole edilmis nükleik asit dizinleri poliA dizinlerini, modifiye edilmis Kozak dizinlerini, epitop etiketlerini, ihraç sinyallerini ve salgisal sinyalleri, nükleer lokalizasyon sinyallerini ve plazma membrani lokalizasyon sinyallerini kodlayan dizinleri içeren kodlanmis proteinin ekspresyonunu ve/veya saflastirilmasini yükseltmek için kullanisli ilave dizinleri içerebilirler. Buradaki ögretiler üzerine temellendirilmis olarak, hangi nükleik asit dizinlerinin burada tanimlanmis polipeptidleri kodlayacaklari teknikte uzman olanlar için açik olacaktir.

Bir dördüncü husus içinde, mevcut açiklama burada tanimlanmis uygulamanin herhangi birinin bir uygun kontrol dizinine çalisir sekilde baglantilandirilmis izole 27969.03 edilmis nükleik asitini içeren nükleik asit ekspresyon vektörlerini saglar. gen ürününün ekspresyonunu etkili hale getirme yetkinliginde olan herhangi bir kontrol dizinine çalisabilir sekilde baglantilandiran vektörleri içerir. Burada tanimlanmis nükleik asit dizinlerine çalisabilir sekilde baglantilandirilmis “kontrol dizinleri” nükleik asit moleküllerinin ekspresyonunu etkili hale getirme yetkinliginde olan nükleik asit dizinleridirler. Kontrol dizinleri, onlar onun ekspresyonunu yönlerdirmek üzere fonksiyon gösterdikleri sürece, nükleik asit dizinleri ile bitisik olmak ihtiyacinda degillerdir. Dolayisiyla, örnegin, müdahaleci translasyona ugramamis fakat transkripsiyonu olmus dizinler bir aktiflestirici dizin ve nükleik asit dizinleri arasinda mevcut olabilir ve aktirlestirici dizin hala kodlama dizinine “çalisir sekilde baglantilandirilmis” olarak düsünülebilir. Diger böylesi kontrol dizinleri poliadenilasyon sinyallerini, sonlandirma sinyallerini ve ribozom baglanma yerlerini içerirler. Böylesi ekspresyon vektörleri, plazmid ve Virüs-bazli ekspresyon vektörlerini içeren, teknikte bilinen herhangi bir tip olabilir. Bir memeli sisteminde açiklanmis nükleik asit dizinlerinin ekspresyonunu sürmek üzere kullanilmis kontrol dizinleri yapisal (CMV, S40, RSV, aktin, EF dahil, aktiflestiricilerin bir çesitliliginin herhangi biri araciligiyla sürülmüs) veya uyarilabilir inducible (tetrasiklin, ekdizondriven, steroid-tepkili dahil, uyarilabilir aktiflestiricilerin bir dizisinin herhangi biri tarafindan sürülmüs) olabilirler. Ayni zamanda, prokaryotik hücrelere nükleik asit vermede kullanim için ekspresyon vektörlerinin insa edilmesi teknikte iyi bilinir ve dolayisiyla, standart teknikler araciligiyla gerçeklestirilebilir. (Örnegin, Sambrook, Fritsch, and Maniatis, in: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, , Humana Press Inc., Clifton, N.J.), vethe Ambion 1998 Catalog (Ambion, Austin, TX) yayinlarina bakiniz). Ekspresyon vektörü ya bir epizom olarak veya konak kromozomal DNAlsi içine tümlesiklesme araciligiyla konak organizmalarda kopyalanabilir olmak zorundadir. Bir tercih edilen uygulamada, ekspresyon vektörü bir plazmid içerir. Ancak, bulus virütik vektörler gibi esdeger 27969.03 fonksiyonlara hizmet eden diger ekspresyon vektörlerini de içermek üzere amaçlanir.

Bir besinci husus içinde, mevcut açiklama burada tanimlanmis nükleik asit ekspresyon vektörlerini içeren rekombinant konak hücrelerini saglar. Konak hücreleri ya prokaryotik veya ökaryotik olabilirler. Hücreler geçici olarak veya kararli olarak nükleik asit verilmesine veya kalit aktarimina tabi tutulabilirler.

Ekspresyon vektörlerinin prokaryotik ve ökaryotik hücreler içine böylesi nükleik asit aktarimina veya kalit aktarimina tabi tutulmasi, standart bakteriuyel transfornmasyonlari, kalsiyum fosfat es-çökeltmesini, elektroporasyonu veya lipozom aracili-, DEAE dekstran aracili-, polikatyonik aracili- veya virüs aracili- transfeksdiyonu içeren, teknike bilinen herhangi bir teknik araciligiyla gerçeklestirilebilir. (Örnegin, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, ark., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2nd Ed. (R.I. Freshney. 1987. Liss, Inc.

New York, NY yayinina bakiniz). Bulus uyarinca bir polipeptidi üretmenin bir yöntemi mevcut açiklamanin bir ilave parçasidir. Yöntem (a) açiklamanin bu hususu uyarinca polipeptidin ekspresyonuna olanak saglayan kosullar altinda bir konagin kültürlenmesinin ve (b) istege bagli olarak, ifade edilmis peptidin geri kazanilmasinin adimlarini içerir. Ifade edilmis polipeptid hücre-ari ekstrakttan, hücre peletinden geri kazanilabilir veya kültür ortamindan geri kazanilabilir.

Rekombinant olarak ifade edilmis polipetidleri satlastirmak üzere yöntemler teknikte uzman bir kisi tarafindan iyi bilinirler.

Bir altinci husus içinde, mevcut açiklama burada tanimlanmis herhangi bir hususun veya uygulamanin polipeptidini, nükleik asitini, nükleik asit ekspresyon vektörünü ve/veya rekombinant konak hücresini ve bir farmasötik olrak kabul edilebilir tasiyiciyi içeren farmasötik bilesimleri saglar. Burada açiklanmis farmasötik bilesimler örnegin asagida tanimlanmis yöntemlerde kullanilabilirler.

Farmasötik bilesim burada açiklanmis polipeptidlere, nükleik asitlere vbflerine ilave olarak, (a) bir liyoprotektani; (b) bir yüzey aktif maddeyi; (e) bir dolgu 27969.03 maddesini; (d) bir tonisite ayarlayan ajani; (e) bir kararli hale getiriciyi; (I) bir koruyucuyu ve/veya (g) bir tamponu içerebilir.

Bazi uygulamalarda, farmasötik bilesim içindeki tampon bir Tris tamponu, bir hidstidin tamponu, bir fosfat tamponu, bir sitrat tamponu veya bir asetat tamponudur. Farmasötik bilesim ayni zamanda, örnegin bir sakaroz, sorbitol veya trehaloz gibi, bir liyoprotektan içerebilir. Belirli uygulamalarda, farmasötik bilesim örnegin, benzalkonyum klorür, benzetonyum, kloroheksidin, fenol, m- kresol, benzil alkol, metilparaben, propilparaben, klorobütaniol, o-kresol, p- kresol, fenilmerkürik nitrat, timerosal, benzoik asit ve onlarin çesitli karisimlari gibi, bir koruyucuyu içerir. Diger uygulamalarda, farmasötik bilesim glisin benzeri bir dolgu maddesi içerir. Yine diger uygulamalarda, farmaötik bilesim örnegin, polisorbat-ZO, polisorbat-40, polisorbat-60, polisorbat-65, polisorbat-SO polisorbat-SS, poloksamer-l88, sorbitan monolaurat, sorbitan monopalmitat, sorbitan monostearat, sorbitan monooleat, sorbitan trilaurat, sorbitan tristearat, sorbitan trioleast veya onlarin bir kombinasyonu gibi, bir yüzey aktif maddeyi içerir. Farmasötik bilesim ayni zamanda, örnegin formülasyonu insan kani ile önemli derecede izotonik veya izoosmatik hale getiren bir tonisite ayarlayici ajani içerebilir. Örnek niteligindeki tonisite ayarlayici ajanlar sakarozu, sorbitolü, glisini, metionini, mannitolü, dekstrozu, inositolü, sodyum klorürü, arginini ve arginin hidroklorürü içerirler. Diger uygulamalarda, farmasötik bilesim ilave olarak, örnegin ilgilenilen bir protein ile kombine edildigi zaman, lipolize veya sivi biçiminde ilgilenilen proteinin kimyasal ve/veya fiziksel kararsizligini önemli derecede önleyen veya azaltan bir molekül olan, bir kararli hale getiriciyi içerir. Örnek niteligindeki kararli hale getiriciler sakkrozu, sorbitolü, glisini, inositolü, sodyum klorürü, metionini, arginini ve arginin hidroklorürü içerirler.

Burada tanimlanmis polipeptidler, nükleik asitler Vb.”leri farmasötik bilesim içindeki tek aktif ajan olabilir veya bilesim ilave olarak, bir amaçlanmis kullanim için uygun bir veya daha fazla diger aktif ajani içerebilir. 27969.03 Burada tanimlanmis farmasötik bilesimler genel olarak burada tanimlanmis bir bilesigin ve bir farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicinin, seyrelticinin veya eksipiyanin bir kombinasyonunu içerirler. Böylesi bilesimler farmasötik olarak kabul edilebilir-olmayan bilesenlerden önemli derecede aridirler ve örnegin, bu basvurunun dosyalanmasi zamanindaki ABD düzenleyici gereklilikler tarafindan izin verilenden daha düsük olarak farmasötik olarak kabul edilebilir-olmayan bilesenlerin miktarlarini içerirler. Bu hususun bazi uygulamalarinda, eger bilesik su içinde çözülürse veya süspansiyonlastirilirsa, bilesim istege bagli olarak, bir ilave farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyiciyi, seyrelticiyi veya eksipiyani ilave olarak içerir. Diger uygulamalarda, burada tanimlanmis farmasötik bilesimler kati farmasötik bilesimlerdir (örnegin, tablet, kapsüller, vb.).

Bu bilesimler farmasötik teknikte iyi bilinen herhangi bir yaklasim içinde hazirlanabilirler ve herhangi bir uygun yolla verilebilirler. Bir tercih edilen uygulamada, farmasötik bilesimler ve formülasyonlar oral verilis için tasarlanirlar.

Geleneksel farmasötik tasiyicilar, sulu, toz veya yagli bazlar gerekli olabilirler veya istenebilirler.

Farmasötik bilesimler tabletleri, haplari, tozlari, pastilleri, saseleri, kaseleri, iksirleri, süspansiyonlari, emülsiyonlari, çözeltileri, suruplari, aerosolleri (bir kati veya sivi ortam içinde), örnegin aktif bilesigi agirlikça % 101 kadar içeren merhemleri, yumusak ve sert jelatin kapsülleri, steril enjekte edilebilir çözeltileri ve steril paketlenmis tozlari içeren, herhangi bir uygun biçimde olabilirler.

Bir yedinci husus içinde, mevcut açiklama, çölyak sprue tedavisi için, bulusun birinci ve ikinci hususlarinin polipeptidlerinden SEQ ID NO:33 ve SEQ ID NO:67 meydana gelen gruptan seçilmis bir veya daha fazla polipeptidin çölyak sprue hastaligini tedavi etmek üzere etkili olan bir miktarinin bir bireye verilmesini içeren yöntemleri saglar. 27969.03 Mevcut bulusun mucitleri Kumamolisin-Ashin çogu çölyak sprue hastalarinda immün tepkinin esas kismindan sorumlu olan ve glutenin “gliadinler” olarak bilinen prolin (P)- ve glutamin (Q)-zengin bilesenlerini bozundurma yetkinliginde oldugunu beklenmeyen sekilde kesfetmis bulunmaktadirlar. Burada tanimlanmis polipeptidler, dogal tip Kumamolisin-As”ye kiyasla, 01ig0peptid PQPQLPiye (SEQ ID NO: 34) (gliadinin bir substrat temsilcisi) karsi, pH 47de gelistirilmis proteaz aktivitesi gösterirler.

Bir uygulamada, bir veya daha fazla polipeptid SEQ ID NO:35 uyarinca bir amino asit dizinine en az % 75 benzesik bir amino asit dizinini içerir ve burada, (a) polipeptid ph 47de bir PQPQLP (SEQ ID NO:34) peptidi bozundurur; (b) kalinti 278 Ser”dir, kalinti 78 Glu”dur ve kalinti 82 Asp'dir. geçirilmis Kumamolisin-As amino asit dizini üzerine temellendirilir) meydana gelen gruptan seçilmis bir veya daha fazla kalintida SEQ ID NO:67iden (dogal tip islemden geçirilmis Kumamolisin-As) bir veye daha fazla amino asit degisimleri içerirler. Sinirlayici-olmayan örneklerde, dogal tip islemden geçirilmis Kumamolisin-As amino asit dizinine (SEQ ID NO:67) göre bir veya daha fazla degisim asagidakilerden meydana gelen gruptan seçilir: WT Residue# AA change S73 K, G N102 D T103 S D104 A, T, N Gl30 S 8165 N T168 A D169 N, G Ql72 D D179 S, H 27969.03 Çesitli ilave uygulamalarda, dogal tip islemden geçirilmis Kumamolisin-As amino asit dizinine göre bir veya daha fazla degisim en azindan N102D,yi içerir. Bir baska uygulamada, dogal tip islemden geçirilmis Kumamolisin-As amino asit dizinine göre bir veya daha fazla degisim en azindan N102D ve D169N*yi veya D169G'yi içerir. Bir baska uygulamada, dogal tip islemden geçirilmis Kumamolisin-As amino asit dizinine göre bir veya daha fazla degisim en azindan N102D, D169G ve D179H,yi içerir. Bir baska uygulamada, dogal tip islemden geçirilmis Kumamolisin-As amino asit dizinine göre bir veya daha fazla degisim Çesitli tercih edilen uygulamada, bir veya daha fazla polipeptid SEQ ID NO: 35 96%, 97%, 98% veya 99% benzesik bir amino asit dizinini içerir veya böyle bir amino asit dizininden meydana gelirler. Bir ilave uygulamada, polipeptidler SEQ dizininden meydana gelirler. Çesitli ilave uygulamalarda, bir veya daha fazla polipeptid SEQ ID NO`larz36- 66°nin herhangi birine en az % 75 benzesik bir amino asit dizini içerir veya böyle bir amino asit dizininden meydana gelir. SEQ ID NOllar tarafindan temsil edilmis polipeptidler dogal tip Kumamolisin-ASSye kiyaslandiginda, oligopeptid PQPQLPiye (SEQ ID NO:34) (gliadinin temsilcisi bir substrat) karsi pH 4Sde gelistirilmis proteaz aktivitesi ile polipeptidlerin spesifik örnekleridirler. Çesitli tercih edilen uygulamalarda, polipeptidler SEQ ID NOslaz36-66”nin herhangi biri 27969.03 96%, 97%, 98% veya 99% benzesik bir amino asit dizinini içerir veya böyle bir amino asit dizininden meydana gelir. Bir ilave uygulamada, polipeptidler SEQ ID NO,lar:36-66,nin herhangi biri uyarinca bir amino asit dizinini içerir veya böyle bir amino asit dizinininden meydana gelir.

Bir tercih edilen uygulamada, bu hususn yöntemlerinde kullanim için polipeptidler SEQ ID NO: 33 uyarinca bir amino asit içerirler veya bir polipeptid (numaralandirma dogal tip önceden-islemden geçirilmis Kumamolisin-As amino asit dizini üzerine temellendirilir) meydana gelen gruptan seçilmis bir veya daha fazla kalintida SEQ ID NO: 33,den (dogal tip önceden-islemden geçirilmis Kumamolisin-As) bir veya daha fazla amino asit degisimi içerir. Sinirlayici- olmayan uygulamalarda, dogal tip Kumamolisin-As amino asit dizinine göre bir veya daha fazla degisim asagidakilerden meydana gelen gruptan seçilirler: WT Residue# AA change V1 19 D 8262 K, G N29l D T292 S D293 A, T, N G319 S 8354 N T 357 A D358 N, G Q361 D D368 S, H 27969.03 Çesitli ilave sinirlayici-olmayan uygulamalarda, dogal tip Kumamolisin-As amino asit dizinine göre bir veya daha fazla degisimler en az N29lD7yi içerirler. Bir baska uygulamada, dogal tip Kumamolisin-As amino asit dizinine göre bir veya daha fazla degisim en az N291D ve 358N veya 358Giyi içerirler. Bir baska uygulamada, dogal tip Kumamolisin-As amino asit dizinine göre bir veya daha dogal tip Kumamolisin-As amino asit dizinine göre bir veya daha fazla degisim en Çesitli tercih edilen uygulamalarda, bulusun bu hususunun yöntemlerinde kullanim için polipeptidler SEQ ID NO: 1 uyarinca bir amino asit dizinine en az amino asit dizinini içerir veya böyle bir amino asit dizininden meydana gelirler.

Bir ilave uygulamada, polipeptidler SEQ ID NO: 1 uyarinca bir amino asit dizinini içerir veya böyle bir amino asit dizininden meydana gelirler. Çesitli tercih edilen uygulamalarda, bulusun bu hususunun yöntemlerinde kullanim için polipeptidler SEQ ID NOS:2-32”nin herhangi birine en az % 75 benzesik bir amino asit dizinini içerir veya böyle bir amino asit dizininden meydana gelirler. SEQ ID NO”lar tarafindan temsil edilmis polipeptidler dogal tip Kumamolisin-Aslye kiyaslandiginda, oligopeptid PQPQLP'ye (SEQ ID NO:34) (gliadinin temsilcisi bir substrat) karsi pH 4`de gelistirilmis proteaz aktivitesi ile polipeptidlerin spesifik örnekleridirler. Çesitli tercih edilen uygulamalarda, bulusun bu hususunun yöntemlerinde kullanim için polipeptidler SEQ ID N0,la:2-32'nin herhangi biri uyarinca bir amino asit dizinine en az 76%, 77%, dizinini içerir veya böyle bir amino asit dizininden meydana gelirler. Bir ilave uygulamada, polipeptidler SEQ ID NO°lar:2-32°nin herhangi biri uyarinca bir amino asit dizinini içerir veya böyle bir amino asit dizinininden meydana gelirler. 27969.03 Bir sekizinci husus içinde, mevcut açiklama, çölyak sprue hastaligini tedavi etmek üzere, SEQ ID NO: l-67`nin herhangi biri uyarinca amino asit dizininin bir etkili miktarini içeren bir polipeptidin çölyak sprue ile bir bireye verilmesini içeren çölyak sprue hastaligini tedavi etmek için yöntemleri saglar.

Bir uygulamada, verilmis polipeptidler SEQ ID NO:2 uyarinca bir amino asit dizinini içerir veya böyle bir amino asit dizininden meydana gelirler. SEQ ID No:2 uyarinca polipeptidler dogal tip Kumamolisin-As”ye göre bir N29lD mutasyonuna sahiptirler. Asagidaki örneklerde gösterilen sekilde, bu mutasyonu içeren polipeptidler dogal tip Kumamolisin-Aslye kiyaslandiginda, oligopeptid PQPQLPye (SEQ ID NO:34) karsi pH 4°de en az lO-kat gelistirilmis proteaz aktivitesine sahiptirler.

Bu ikinci hususun bir uygulamasinda, verilmis polipeptidler SEQ ID No:3 uyarinca bir amino asit dizinini içerir veya böyle bir amino asit dizininden meydana gelirler. SEQ ID No:3 uyarinca polipeptidler dogal tip Kumamolisin- As/ye göre bir N291D mutasyonuna ve bir D358N veya D358G mutasyonuna sahiptirler. Asagidaki örneklerde gösterilen sekilde, bu mutasyonu içeren polipeptidler dogal tip Kumamolisin-As”ye kiyaslandiginda, oligopeptid PQPQLP”ye (SEQ ID NO:34) karsi pH 47de en az 20-kat gelistirilmis proteaz aktivitesine sahiptirler.

Bu ikinci hususun bir baska uygulamasinda, verilmis polipeptidler SEQ ID NO:4 uyarinca bir amino asit dizinini içerir veya böyle bir amino asit dizininden meydana gelirler. SEQ ID No:4 uyarinca polipeptidler dogal tip Kumamolisin- As,ye göre bir N291D mutasyonuna, bir D358G veya bir D368H mutasyonuna sahiptirler. Asagidaki örneklerde gösterilen sekilde, bu mutasyonu içeren polipeptidler dogal tip Kumamolisin-As”ye kiyaslandiginda, oligopeptid PQPQLPye (SEQ ID NO:34) karsi pH 4Sde en az 50-kat gelistirilmis proteaz aktivitesine sahiptirler. 27969.03 Bu ikinci hususun bir ilave uygulamasinda, verilmis polipeptidler SEQ ID NOS:5- 32°nin herhangi biri uyarinca bir amino asit dizinini içerir veya böyle bir amino asit dizininden meydana gelirler. Bu uygulamalar uyarinca polipeptidlerin tamaminin dogal tip Kumamolisin-Aýye kiyaslandiginda, oligopeptid PQPQLP”ye (SEQ ID NO:34) karsi pH 4'de gelistirilmis proteaz aktivitesi gösterdikleri sergilenmis bulunmaktadir. Bir tercih edilen uygulamada, polipeptid SEQ ID NO:32 uyarinca bir amino asit dizini içerir veya böyle bir amino asit dizininden meydana gelir; bu polipeptidin test edilen polipeptidler arasinda oligopeptid PQPQLFye (SEQ ID NO:34) karsi pH 4lde en etkili proteaz aktivitesine sahip oldugu asagidaki örneklerde gösterilir.

Bir baska uygulamada, bir veya daha fazla polipeptid SEQ ID NO:36 uyarinca bir amino asit dizini içerir. SEQ ID NO:36 uyarinca polipeptidler dogal tip islemden geçirilmis Kumamolisin-As'ye göre bir N102D mutasyonuna sahiptirler.

Asagidaki örneklerde gösterilen sekilde, dogal tip Kumamolisin-As, ye kiyaslandiginda, oligopeptid PQPQLP”ye (SEQ ID NO:34) karsi pH 4,de en az lO-kat gelistirilmis proteaz aktivitesine sahiptirler. Bir baska uygulamada, bir veya daha fazla polipeptid SEQ ID NO:37 uyarinca bir amino asit dizinini içerir.

SEQ ID NO:37 uyarinca polipeptidler dogal tip islemden geçirilmis mutasyonuna sahiptirler. Asagidaki örneklerde gösterilen sekilde, bu mutasyonu içeren polipeptidler dogal tip Kumamolisin-As”ye kiyaslandiginda, oligopeptid PQPQLP'ye (SEQ ID NO:34) karsi pH 4”de en az 20-kat gelistirilmis proteaz aktivitesine sahiptirler. Bir baska uygulamada, bir veya daha fazla polipeptid SEQ polipeptidler dogal tip islemden geçirilmis Kumamolisin-ASye göre bir N102D mutasyonuna ve bir D169G veya Dl79H mutasyonuna sahiptirler. Asagidaki örneklerde gösterilen sekilde, bu mutasyonu içeren polipeptidler dogal tip Kumamolisin-As°ye kiyaslandiginda, oligopeptid PQPQLP”ye (SEQ ID NO:34) karsi pH 4”de en az lO-kat gelistirilmis proteaz aktivitesine sahiptirler. Ilave 27969.03 uygulamalarda, bir veya daha fazla polipeptid SEQ ID NOS:39-66,nin herhangi biri uyarinca bir amino asit dizinini içerir. Bu uygulamalar uyarinca polipeptidlerin tamaminin dogal tip Kumamolisin-As`ye kiyaslandiginda, oligopeptid PQPQLPiye (SEQ ID NO:34) karsi pH 4ide gelistirilmis proteaz aktivitesi gösterdikleri sergilenmis bulunmaktadir. Bir tercih edilen uygulamada, polipeptid SEQ ID NO:66 uyarinca bir amino asit dizini içerir veya böyle bir amino asit dizininden meydana gelir. Çölyak sprue (ayni zamanda, çölyak hastaligi veya gluten tolere edememe olarak bilinir) bugday, arpa ve çavdarda bulunan “glutenler, olarak bilinen diyet proteinlerinin genetik olarak yatkin bireylerin ince bagirsaklarinda bir immün tepki uyandiran bir yüksek derecede yaygin hastaliktir. Sonuçtaki enflamasyon ince bagirsagin besinlerin absorpsiyonunu engelleyen bagirsak içi kilimsi çikintilarinin bozunmasina götürebilir. Semptomlar erken çocuklukta veya yasamda daha sonra ortaya çikabilir ve siddetlikte, ishal, yorgunluk, agirlik kaybi, abdominal agri, siskinlik, asiri gaz, hazimsizlik, peklik, abdominal siskinlik, bulanti/kusma, anemi, kolaylikla berelenme, depresyon, kaygi, çocularda büyüme gecikmesi, saç kaybi, dermatit, kaçmis adet zamanlari, agiz ülserleri, kas kramplari, eklem agrisi, burun kanamalari, nöbet geçirme, ellerde ve ayaklarda karincalanma veya his kaybi, gecikmis ergenlik, dis enamelinde çürümeler ve kas esgüdüm yetersizligi veya parestezi gibi nörolojik semptomlara kadar genis aralik içinde yer alabilir. Diyette glutenlerin toplam olarak ortadan kaldirilmasi hariç, halen bu yasam boyu hastalik için hiçbir etkili terapi yoktur. Her ne kadar çölyak sprue büyük ölçüde teshislendirilmemis olarak kalirsa da, ABD ve Avrupa`da onun yayginligi popülasyonun % 0.5-1,i olarak tahmin edilir.

Burada kullanildigi haliyle, "çölyak sprue tedavisi” asagidakilerden birinin veya daha fazlasinin gerçeklestirilmesi anlamina gelir: (a) çölyak sprue siddetinin azaltilmasi; (b) çölyak sprue karakteristigi olan semptomlarin gelismesinin sinirlanmasi veya önlenmesi; (c) çölyak sprue karakteristigi olan semptomlarin kötülesmesinin inhibe edilmesi; (d) daha önceden rahatsizliga sahip olmus 27969.03 bulunan hastalarda çölyak sprue°nun yeniden nüksetmesinin sinirlanmasi veya önlenmesi; (e) çölyak sprue için daha önceden semptomatik olan hastalarda semptomlarin yeniden nüksetmesinin sinirlanmasi veya önlenmesi; (f) çölyak sprue gelistirme riskinde olan veya henüz çölyak sprue klinik etkilerini göstermeyen bir öznede çölyak sprue gelismesinin sinirlanmasi.

Burada tanimlanmis yöntemler uyzrinca tedavi edilecek birey, insan özneler dahil, çölyak sprueidan muzdarip olan herhangi bir birey olabilir. Birey semptomlardan halen muzdarip olan biri veya asemptomatik olan biri olabilir.

Burada kullanildigi haliyle, bir "etkili miktar" çölyak sprue tedavisi için etkili olan bir miktara atifta bulunur. Polipeptidler tipik sekilde, yukarida tanimlanmis sekildeki bir farmasötik bilesim olarak formüle edilebilirler ve gleneksel farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicilari, yardimci maddeleri ve araçlari içeren doz birimi fonnülasyonlarinda oral olarak, parenteral olarak, inhalasyon spreyi araciligiyla veya topikal olarak verilisi içeren herhangi bir uygun yol araciligiyla verilebilirler. Bir tercih edilen uygulamada, farmasötik bilesim ve formülasyonlar tabletler, haplar, pastiller, iksirler, süspansiyonlar, emülsiyonlar, çözeltiler veya suruplar araciligiyla olan gibi oral olarak verilirler.

Doz rejimleri optimum istenilen yaniti (örnegin, bir terapötik veya profilaktik yanit) saglamak üzere ayarlanabilirler. Bir uygun doz örnegin, 0.1 ug/kg-100 mg/kg vücut agirligi araliginda olabilir; alternatif olarak, 0.5 ug/kg ila 50 mg/kg; 1 ug/kg to 25 mg/kg veya 5 ug/kg ila 10 mg/kg vücut agirligi araliginda olabilir.

Polipeptidler bir ilgili hekim tarafindan belirlenmis sekilde, bir tekli kapsülde dagitima ugratilabilir veya birden daha fazla kez (Örnegin, 2, 3, 4, 5 veya daha fazla kez) verilebilir. Örnekler 27969.03 Çölyak hastaligi bir otoimmün bozukluk olup popülasyonun yaklasik olarak % l”ini etkileri-g. Bu hastalik bugday ununun ana proteini olan glutene ve arpa çavdardaki ilgili proteinlere bir enflamatuar reaksiyon tarafindan karakterize edilirz. Gluten glikoproteinler gliadin ve gluteninin bir heterojen karisimindan meydana getirilirâ. Yutulma üzerine, 0t- gliadin gastrik ve intestinal proteazlar tarafindan oligopeptidlere kismi olarak bozundurulur ve bunlar onlarin olagandisi yüksek prolin ve glutamin içeriklerinden dolayi ilave proteolize dirençlidirlerg (Sekil 1). Tamamlanmamis proteolizden kaynaklanan immünojenik oligopeptidler PQ motifinde zenginlestirilirlerÃLÃ(Sekil 1) ve bu durum, Çölyak hastaligi ile insanlarin ince bagirsaklarinda enflamasyonu ve yaralanmayi uyarii'. Bu hastalik için halihazirdaki tek tedavi diyetten glutenin tamamen çikarilmasidir, fakat modern gida ürünlerinde bu proteinin ayni anda birçok yerde mevcut olmasindan dolayi elde edilmesi zor bir durumdurg.

Onlarin enflamasyonu tetikleme yetkinligini kazanmasindan önce immünojenik peptidleri hidrolize etmek üzere içinde oral olarak verilen proteazlarin kullanima konuldugu oral enzim terapisi (OET) gluten intoleransi için bir tedavi olarak halen arastirilir. Bu amaçla, ya prolin veya glutamin kalintilarindan sonra yarilma için onlarin spesifisitelerinden dolayi birkaç farkli proteaz düsünülmüs bulunmaktadirî'ü. Ancak, bu enzimler siklikla gluten bozundurmasi için onlarin OET”de kullanimini engelleyen karakteristikler sergilerler. Bu peptidazlarin çogu nötral pH7da optimal katalitik aktivite sergilerler; ancak insan midesinin pH”i 2 ila 4 araligi içindedir. Dolayisiyla, bu enzimler, bunlar pH-nötr ince bagirsaklara ulastigi zaman en aktif hale gelirler ve dolayisiyla bu durum, gluten-türevli patolojinin gelistigi yer oldugundan dolayi, Çölyak hastaliginin etkili olarak önlenmesi için çok gecikmis bir durumdur&. Ilave olarak, bu enzimlerin birkaçi insan midesinin düsük pH”inda kararsizlik sergilerler ve sindirici proteazlar tarafindan proteolize yatkindirlar veya klinik kullanim için çabalara ket vuran tüm karakteristikler olan onlarin saflastirilmasiw sirasindaki kapsamli yeniden- katlama prosedürlerini gerektirirler. 27969.03 Gluten intoleransinin tedavisinde OET'nin uygulanmasi için ideal proteaz asagidaki özellikleri kombine edecektir: düsük pH,da optimal aktivite, kolay saflastirilma, insan midesinin kosullari altinda kararlilik ve gluten-türevli immünojenik oligopeptidlerde bulunan amino asit motifleri için yüksek spesifisite. Burada, biz bu özellikleri sergileyen bir endopeptidazin mühendisligini raporlariz. Biz asidik kosullarda yüksek derecede aktif olan, asidofilik bakteri Alicyclobacillus sendaiensifden Kumamolisin-As (KumaWT) olarak isimlendirilen bir proteazi kimliklendirdik ve istenilen oligopeptid spesifisitesine dogru onu mühendislige tabi tutmak üzere hesaplamasal modelleme araci olarak kullandik. KumaMaxTM olarak isimlendirilmis olan bu hesaplamasal olarak tasarlanmis enzim IOO-kat üzerinde artmis proteolitik aktivite ve içinde dogal tip KumaWT” ye kiyasla hedeflenmis PQ motifi için substrat spesifisitesinde bir 800- kat degisme sergiledi. Ilave olarak, KumaMaXTM olagan gastik proteazlara direnç gösterir ve yeniden-katlama için ihtiyaç olmadan, E. C01i`de yüksek verimlerle üretilir. Dolayisiyla, burada raporlanmis bu proteaz ve digerleri Çölyak hastaligi için gelecek vadeden terapötik adaylari temsil ederler.

SONU! ;LAR Bir a-Gliadin Endopeptidazin Seçilmesi ve Hesaplamasal Tasarimi Gastrik kosullar altinda gluten peptidlerini bozundurabilen bir yeni proteazi mühendislige tabi tutmak için, biz ilk olarak, bizim mühendislik çabalarimiz için bir baslangiç noktasi olarak bir uygun proteazi kimliklendirme üzerine odaklandik. Ideal olarak, sablon proteaz bir dipeptid amino asit motifi için sergilenmis spesifisite ile düsük pHada kararliligi ve aktiviteyi kobine edecektir.

Biz enzim Kumamolisin-As' (KumaWT) bir sablon olarak kimliklendirdik, çünkü bu proteaz bir yemegin yutulmasindan önce ve sonra insan midesindeki yaklasik pH araliklari (sirasiyla, pH 2 ve 4)& ile eslesen 2-4'lük2 araligi üzerinden optimal aktiviteye dogal olarak sahiptir. KumaWT ayni zamanda. fizyolojik olarak ilgili sicaklik 3›7°C”da'-4 yüksek kararlilik ve aktivite sergiler. Ilave olarak, bu enzimin 27969.03 sailastirilmasi kolaydir ve E.coliideH standart rekombinant protein üretim yöntemleri kullanilarak önemli miktarlari verir ve bu durum, hem mutant kütüphanelerini taramada ve hem de OETade kullanim için büyük partiler halinde onun nihai olusturulmasi için bir önemli özelliktir. Son olarak, KumaWT tekil amino asit spesifisitesine zit olarak, bir spesifik dipeptid motifini dogal olarak tanirl-4. Dipcptid spesifisitesi mide içinde diger gida-türevli peptidler tarafindan azaltilmis yarismaci inhibisyonla sonuçlanacagindan dolayi, sindirim sirasinda alinmasi amaçlanan bir oral proteaz terapötik için bu bir önemli özelliktir. Çölyak hastaligi için bir etkili OET olasi olarak, immünojenik gluten-türevli oligopeptidlerde bu dipeptidin siklikla meydana gelmesinden dolayi, Prolin- Glutamin )PQ) için spesifisite sergileyecektir (Sekil 1). KumaWT onun peptid substratinin P2 konumunda prolin için bir güçlü spesifisiteye sahiptir ve bu immünojenik (x-gliadin peptidlerin bozunmasi için ilgilenilen amino asit kalintilarinin biri ile eslesir. Pl yerinde, KumaWTinin pozitif olarak yüklendirilmis amino asitler arginin veya lisini tercih ettigi olusturulmus bulunmaktadir& Bu tercihe ragman, KumaWT ayni zamanda, arginin veya lisini onuntanimasina kiyasla, yine bir önemli olarak azalmis seviyede, Pl konumunda glutamini tanima yetkinligindedirß. Pl konumunda glutamini tanimak üzere bu hafif özünde olan egilim KumaWTinin bu konumda glutamini tercih etmek üzere yeniden-mühendislige tabi tutulmak için uygun olabilirligini önerir. Pl” yerinde, KumaWT genis spesifisite sergiler ve Sekil lide betimlendigi gibi, farkli immünojenik peptidler arasinda PQ motifinden sonraki konumda kalinti degistiginden dolayi, bu istenebilir.

KumaWT°nin karakteristiklerinden dolayi, bizim birincil hedefimiz onun dogal PR veya PK substratslari üzerine bir PQ dipeptid motifini tercih edecegi sekilde, KumaWT°nin Sl baglanma paketini hesaplamasal olarak yeniden-tasarlamak idi.

Rosetta Molecular Modeling Suite kullanilarak, biz bu enzimin çözünmüs kristal yapisini (PDB ID: lTlE) kullanarak KumaWTinin Sl baglanma paketinde dipeptidi modellemeye tabi tuttuk. Bu durum iki negatif olarak yüklenmis amino asit D358 ve D368”in Pl konumunda pozitif olarak yüklenmis amino asitlerin 27969.03 baglanmasini olasi olarak kolaylaylastirdigini ortaya koydu (Sekil 2A). Prolin için P2°deki dogal spesifisite büyük ölçüde, bu amino asit kalintisinin enzimin S2 cebindeki W3l8`in aromatik halkasi ile bir hidrofobik karsilikli etkilesiminden türetilmis gibi görünür. Prolin için Pl konumunun spesifisitesi bir enzim degiskemizde istenildiginden dolayi, biz Sl cebinin tasarlanmasi sirasinda bu dogal triptofani muhafaza ettik.

Pl konumunda glutaamini tercih etmek üzere Sl cebinin KumaWT substrat spesifisitesini yeniden-tasarlamak üzere, biz Rosetta Molecular Modeling Suite için Foldit arayüzünü kullanarak KumaWT baglanma cebinde teorik mutasyonlar olusturduk. a-Gliadin, PQLP (SEQ ID NO:68) boyunca bulunan bir ortak immünojenik motifi temsil eden bir tetrapeptid P27den P27 “ye kadar aktif yer konumlari içine modellendi. Bu yapi halihazirda aktif yerde bir polipeptid bagi içerdi ve böylece, bu polipeptidin kalintilari PQLP (SEQ ID NO:68) tetrapeptid motifine Rosetta kullanilarak mutasyona tabi tutuldu. Tetrapeptidin bir 8Ã küresi içinde 75 kalintinin bir toplami Sl cebinde glutaminin baglanmasini olumlayacak mutasyonlari bulmak için 20 dogal olarak meydana gelen amino asitlerin herhangi birine rasgelelestirildi. Eger yeni olusturulmus enzim-PQLP substrat kompleksinin toplam enerjisi dogal substrata göre ya azxaltilmissa veya 5 Rosetta enerji biriminden daha fazla artirilmadiysa, bu mutasyonlar kabul edildi. Daha küçük, nötr amino asit glutamini barindirmak üzere, bir kendimizin hesapsal çabalarimizi 1) tasarim islemi sirasinda Sl cebinin negatif yükünün giderilmesi, 2) büyük amino asit argininin glutamin ile degistirilmesinden sonuçlanan açik boslugun doldurulmasi ve 3) glutaminin amid fonksiyonel grubuna hidrojen baglarinin saglanmasi üzerine odakladik. Bu hesapsal modelleme liden 7lye eszamanli mutasyonlari içeren 107 yeni tasarim ortaya koydu. Bu tasarlanmis proteinler ondan sonra insa edildi ve bir PQLPiye (SEQ ID NO: 68) karsi onlarin katalitik aktiviteleri degerlendirildi.

Bu tasarlanmis proteinlerin her birinin aktivitesini PQLP (SEQ ID NO:68) motifine karsi test etmek üzere, istenilen mutasyonlar yer yönlendirmeli 27969.03 mutajenöz kullanilarak dogal nükleotid dizini içine birlestirildi ve mutant enzim degiskeleri E. Coli BL21(DE3) hücrelerinde üretildi. Bu enzim degiskeleri ondan sonra, bir substrat olarak floresan olarak su verilmis a-gliadin heksapeptid analogu QXL kullanilarak, pH 4”de, berraklastirilmis tam hücre lizatlarinda enzimatik aktivite yönünden tarandi. Bu tayinde test edilmis 107 enzim degiskesinin % 13,ü enzimatik fonksiyonda bir kayip ile sonuçlandi, % 32”si KumaWTye göre aktivitede bir önemli fark sergilemedi ve % 55,i bu substrata karsi gözlemlenmis aktivitede bir artis ile sonuçlandi. Ondan sonra, hücre lizatlarinda aktivitede bir önemli artis sergileyen ve en çok gelecek vadeden enzim degiskelerinin yirmisekizi KumaWT7ninkine enzimatik aktivitenin bir dogru karsilastirmasini elde etmek için saflastirildi. Saflastirmadan ve protein konsantrasyonu için düzeltmeden sonra, bu enzimlerin aktiviteleri KumaTW,den 2-kat ila 120-kat arasindaki aralikta artti (Tablo 1). KumaMaxTM olarak isimlendirilen en aktif degiske ilave karakterizasyon için seçildi.

Tablo 1 Dogal fenotip Kumamolisin-As9ye göre tüm saflastirilmis ve dizinlenmis mutantlarin PQ aktivitesi üzerine hidrolitik aktivitede katlama degisimi.

Dogal Fenotip Kumamolisin-As,ye Dogal Fenotip Kumamolisin- Mutasyonlar (Önceden-islemden As,ye göre PQ Hidrolizinin geçirilmis) Aktivitesindeki Katlama Degisimi Dogal F enotip (WT) 1.0 T357A 2.0 G319S, D368S 2.0 D358G 3.0 D293A 3.0 D358N 4.0 D358G, D368H 6.0 N29lD, Q361D 7.5 N29lD 10.0 27969.03 (devami) Dogal Fenotip Kumamolisin- Mutasyonlar (Önceden-islemden Asiye göre PQ Hidrolizinin geçirilmis) Aktivitesindeki Katlama Degisimi N291D, D293A 15.0 N291D, D358N 18.9 D368H D368H D368H Q361D,D368H D368H D358G, D368H 27969.03 Bunlar saflastirilmis, dizinlendirilmis ve saf protein tayininde dogal tip Kumamolisin7e karsi test edilmis olan tüm mutantlar için kat-degisim sonuçlaridirlar (Tablo 1°e ek olarak tanimlanmis sekilde hesaplanmis. Tayin pH 49de, 0.0125 mg/mL enzim nihai konsantrasyonu ve 5 mM”lik substrat konsantrasyonu ile yer aldi.

KumaMaxTM dogal tip amino asit dizininden yedi mutasyon içerir: Vll9D, mutasyonlar G319S, D358G ve D368H konum Pl°de istenilen glutamin kalintisi ile bir yeni hidrojen bagini sinerjistik olarak tanitir gibi görünürler. Modellenen sekilde, G319S mutasyonu glutamin amidin karbonil oksijeninden 2.5Ä mesafede yerlesik olan, Pl cebinde glutamin ile karsilikli etkilesimde bulunan bir yeni hidrojen bagina potansiyel olarak katkida bulunan bir hidroksil grubunu içeri tanitir gibi görünmektedir. D368H mutasyonunun tion is predicted to stabilize the serin hidroksili kararli hale getirdigi öngörülür ve aktif yerde onun konumuna sonuç olarak D358G mutasyonu tarafindan steriksel olarak izin verilir.

Modellenmis sekilde glutamin ile bir yeni istenilen karsilikli etkilesimi saglamaya ilave olarak, bu üç mutasyon ayni zamanda, dogal KumaWT substratindaki pozitif olarak yüklenmis arginin kalintisini kararli hale getirdigi öngörülen iki asidik kalintiyi giderir (Sekil 2). Yer yönlendirmeli mutajenöz sirasinda beklenmeyen sekilde birlestirilmis V119D peptid alaninda yerlestirilir ve dolayisiyla, olgun enzimin katalitik aktivitesini etkilemez. Diger üç mutasyon P2-P2, ceplerinde kalintilar ile dogrudan temasta bulunmaz ve dolayisiyla, heksapeptid, Ilorofor veya su vericinin diger bilesenleri ile olasi olarak karsilikli etkilesimleri içeri sokar. G319S/D358G/D368H üçlü mutant tek basina Kuma WT'ye göre katalitik aktivitede sadece bir 7-kat artis sergilendiginden; kabaca KumaMaxTM için belirlenmis olandan l7-kat daha düsük oldugundan dolayi, bu üç mutasyonun gözlemlenmis toplam katalitik aktivite yükseltilmesi yönünden önemli olduklari açiktir.

Kinetik Karakterizasyon ve Substrat Spesifisitesi 27969.03 6-100 mM substrat üzerinden bir hiza karsi substrat egrisinin yerlestirilmesi araciligiyla hesaplanmis sekilde, FQ immünojenik gluten substrat] analoguna karsi KumaMaxTM ve KumaWT katalitik verimliliklerin sirasiyla 568 M`ls`l ve 4.9 M"'5"l olacagi bulundu (Tablo 2). Bu degerler, yukarida sözü edilen baslangiç aktivite taramasinda, KumaMaXTWin FQ substratina dogru enzimatik aktivitede l20-kat'lik bir artis sergiledigi gözlemi ile tutarlidirlar. Maalesef, bu substrat konsantrasyonlarinda hiçbir önemli hiz doygunlugu gözlemlenmedi ve dolayisiyla, bireysel kinetik sabitler kcat ve KM belirlenemediler. KumaWT,nin kinetik sabitlerinin önceki analizleri 40 mM”lik bir Km raporladigindan dolayi, bu durum süepriz degildir. Dolayisiyla, 100 mM1dan daha az substrat konsantrasyonlarinda hiçbir önemli doygunluk beklenmeyecektir.

Tablo 2. KumaMaxTM ve KumaWT için peptid substratlarinin Kinetik Sabitlen'.

Katalitik Verimlilik M"ls"1 PQPQLP- pN A pNA pNA pNA Floresan (F1) olarak su verilmis (Qu) PQPQLP (SEQ ID NO:34) peptidi için KumaWT ve KumaMaTWin her ikisine birden yönelik katalitik verimlilik (kcat/KM M-ls-l), 100 mM,a kadar hiçbir doygunluk gözlemlenmediginden dolayi, bir lineer egriye yerlestirildi. Floresans sinyali ürün floresansin substrat su verilmesi için hesaba katilan bir satandart egri ile Malzemeler ve YÖntemlefde tanimlanmis sekilde niceliklendirildi. pNA-baglantilandirilmis peptidler için katalitik verimlilik bir benzer yaklasim içinde belirlendi ve Malzemeler ve Yöntemler bölümünde tanimlanir. Tüm yerlestirmeler 0.9 n.d.”den daha büyük 27969.03 olan bir R25nin belirlenmemesiyle en az alti bagimsiz olarak ölçülmüs oranlara sahipti.

Floresan olarak su verilmis PQPQLP (SEQ ID NO:34) heksapeptid substratina karsi KumaWT`ye kiyasla substrate KumaMaXTM'in artirilmis aktivitesi KumaMaXHn bir PQ dipeptid motifi için artirilmis tercihe sahip oldugunu önerirken, o dogrudan substrat spesifisitesi üzerine raporlama yapmaz.

KumaMaxTWin spesifisitesinin KumaWTnin dogal PR dipeptidi üzerine PQ dipeptidini tercih etmek üzere gerçekten degistirilmis bulundugunu teyid etmek üzere, Süksinil-Alanin-P2-Pl-Pl, biçiminde dört peptid P2 ve Pl spesifisitesini degerlendirmek için her iki enzime substratlar olarak saglandi. Bu peptidler Pl, konumunda, peptid yarilmasinin bir spektrometrik okumasina izin veren raporlayici p-nitroanilini (pNA) içerdi. Dört peptid P2 ve P] konumlarinda sirasiyla asagidaki amino asitleri barindirdi: prolin-glutamin (PQ), prolin-arginin (PR), glutamin-prolin (QP) ve prolin-glutamat (PE). Katalitik verimlilikler her substrat için hesaplandi ve Tablo 2°de raporlanirlar. FQ substratina karsi katalitik aktivitelerin belirlenmesinde oldugu gibi, As in the determination of catalytic activities against the FQ substrate, no saturation of activity on these peptides by KumaWT veya KumaMaXTM tarafindan bu peptidler üzerinde aktivitenin hiçbir doygunlugu gözlemlenmedi. Bu durum, alternatif KumaWT substratlari için önceden raporlanmis doygunluk seviyelerinin iyice ötesinde olan 1 mM”a kadar substrat konsantrasyonlari test edildiginden dolayi, pNA grubunun Placebinde baglanmayi kismi olarak kesintiye ugratabildigini önerir.

Bu spesifisite tayininde, KumaMaXTM tercih etmek üzere tasarlanmis bulunan dipeptid olan PQ substrati üzerinde aktivitenin onun en yüksek seviyesini sergiledi. KumaMaXTM PR motifi veya diger motifler için spesifisitede bir azalma sergilemek üzere anlatimsal olarak tasarlanmazken, onun PQ için artmis spesifisitesi hedeflenmemis motifler için onun aktivitesini azaltabilirdi.

Gerçektende, KumaMaxTM bu tayinde QP veya PR substratlarina karsi hiçbir önemli katalitik aktivite sergilemedi (Tablo 2). Önceki raporlarla tutarlilik 27969.03 içindeki, KumaWT aktivitenin onun en yüksek seviyesini PR motifi üzerinde sergiledi. KumaWT üç diger peptid substrati üzerinde aktivitenin önemli derecede daha düsük seviyelerini gösterdi. PQ dipeptid motifi üzerinde KumaWTinin katalitik aktivitesi daha önceden raporlanmis bulunmaktaykenü, PQ dipeptid substrati üzerinde hiçbir önemli aktivite bu tayinde gözlemlenmedi ve bu durum, bu peptidin baglanmasi üzerinde pNA”nin enzim baglanma yerine kesintiye ugratici etkilerinden dolayi olabilir. Her iki enzim de pH 47de nötr yüke sahip oldugu öngörülen izoterik substrat PEiye dogru aktivite sergilediler; ancak, KumaMaxTM, onun PQ substrati üzerindeki aktivitesine kiyasla, PE peptidi substrati üzerinde kaba olarak bir 5-kat,lik aktivite azalmasi sergiledi ve bu durum, onun PQ dipeptid motifi için özellikli seçiciligini gösterir. Önceden tartisilmis sekilde, Çölyak hastaligi için OET olarak halihazirda arastirilan birkaç enzim vardir. Bu enzimlerin ikisi prolil endopeptidaz SC PEP'in ve glutamin-spesifik endoproteaz EP-B215`in mühendislige tabi tutulmus] biçimleridirler. Bu proteazlarin katalitik verimliligini KumaMaxTM katalitik verimliligi ile karsilastirmak üzere, dogal SC PEP ve EPB2 enzimleri E. Coli BL21(DE3) hücrelerinde ekspresyona tabi tutuldu, saflastirildi ve onlarin katalitik aktivitesi degerlendirildi. SC-PEP, pH 4ide, FQ gluten substrati analogu üzerinde 1.6 M`ls`lilik bir katalitik verimlilik sergiledi ve bu durum, bu substrat üzerinde KumaMaxTWdekinden aktivitenin kaba olarak 350-kat'lik daha düsük seviyeyi temsil eder. pH 4°de, SC PEP dört pNA baglantili peptid substratlarinin herhangi biri üzerinde QP dahil herhangi bir önemli aktivite sergilemedi. Her ne kadar benzer pNA-baglantili peptidler kullanilan önceki çalismalar bu substratlar üzerinde SC PEP°in aktivitesini göstermis bulunmaktalarsa da, bu tayinler bir pH 2.5 degerinde veya daha yüksek degerde gerçeklestirildi; Diger gruplar benzeri, biz SC PEPiin 2390 M_'s`l”lik bir katalitik verimlilik ile pH Tde QP substrati üzerinde aktiviteninin önemli seviyelerini gösterdigini ve böylece, bu rekombinant SC PEPiin tamamen fonksiyonel oldugunun teyid edildigini (veriler gösterilmemistir) bulduk. Bu durum SC PEPsin midenin pH araliginda katalitik aktivitenin düsükten ihmal edilebilire kadar seviyelerine sahip oldugunu ve 27969.03 dolayisiyla, oi-gliadin peptidler bir kez ince bagirsaklara ulasmis oldugunda etkili olmasinin beklenilecegini raporlayaii onceki literatur_6 ile tutarlidir.

EP-B2 için, pH 49de, FQ substrati üzerinde, aktiviteninin sadece çok düsük seviyeleri tespit edildi ve dört pNA peptid substratinin herhangi biri üzerinde hiçbir aktivite gözlemlenmedi (veriler gösterilmemistir). Bu durum karsilastirilabilir substratlar kullanilan EP-B2 aktivitesinin önceki raporlari ile tutarsizdiru, EP-B2 0 E. coli içinde dahi] olma cisimcikleri olusturdugundan ve aktif enzimi elde etmek üzere yeniden-katlanma gerektirdiginden dolayi, saflastirilmasi zor bir enzimdir. Biz EP-B2,nin yeniden-katlanmasi için daha önceden rapor edilmis yöntemlerili '7 '8 kullanarak çözünebilir proteini elde etme yetkinliginde olmadik ve dolayisiyla, biz üretilmis çözünebilir protein ile sonuçlanan sekilde, bir kolon-üzeri yeniden-katlanma islemi kullandik. Her ne kadar bu çözünebilir protein EP-B2 pH 4”de beklenilen kendiliginden islemgeçme aktivitesini gösterdiyse deu (veriler gösterilmemistir), bu enzimin aktivitesinin yoklugu onun bizim yöntemlerimiz kullanilarak düzgün sekilde yeniden- katlanamayabilirligini önerir. Bu durum farkli protein ekspresyonu vektörlerinin kullanimindan kaynaklanan alternatif N ve C-terminali etiketlerinden dolayi olabilir ve ilave arastirmayi gerektirir.

Proteaz Kararliligi Düsük pH'da katalitik aktiviteyi göstermeye ilave olarak, insan sindirim sisteminde kullanim için amaçlanmis herhangi bir protein terapötik sindirim proteazlari tarafindan bozundurulmaya direnç göstermek zorundadir. Midedeki ve ince bagirsaktaki en bol proteazlarin ikisi sirasiyla pepsin ve tripsindir. Pepsin midenin düsük pH araliginda optimal proteolitik aktiviteyi sergilerken, tripsin esas olarak ince bagirsagin daha nötr pH”mda aktiftir. Bu proteazlar tarafindan bozundurulmaya KumaMaxTMHn direncini degerlendirmek üzere, 0.01 veya 0.1 mg/mL KumaMaxTM 0.1mg/mL9de onlarin ilgili pH araliklarinda her proteaz ile inkübe edildi ve bunlar hem pepsinin ve hem de tripsinin fizyolojik olarak ilgili 27969.03 bir konsantrasyonudur. SC PEP ve EP-B2 kontrollar olarak içerildi ve EP-B27nin pepsine dirençli fakat tripsine yatkin oldugu ortaya çikarilmis bulundu ve SC PEP her iki proteaza da yatkinlik sergilediw. Her protein ilgili proteazin mevcudiyetinde veya yoklugunda 30 dakika süreyle inkübe edildi ve bundan sonra, proteinler isi yoluyla inaktif hale getirildi ve kalan proteolize-ugramamis fraksiyon bir SDS-PAGEjeli kullanilarak belirlendi (Sekil 3).

Bu tayinde, KumaMaXTM her bir proteaz ile yarim saat inkübasyondan sonra kalan kaba olarak % 90 bozulmamis protein ile pepsin ve tripsinin her ikisine karsi yüksek kararlilik sergiledi (Sekil 3). Önceki raporlarla tutarli olarak, SC PEP hem pepsine ve hem de tripsine duyarlilik sergiledi ve burada, bu proteazlar ile inkübasyondan sonra enzimin % 20”sinden daha azi kaldi. Beklenilen sekilde, tripsin EP-B2'yi etkili olarak proteolize tabi tuttu ve inkübasyondan sonra, % 109dan daha az bir miktar kaldi, fakat pepsinin mevcudiyetinde EP-B2”nin hiçbir önemli bozunmasi gözlemlenmedi. Gözlemlenmis protein bozunmasinin proteaz aktivitesinden dolayi oldugunu ve enzimatik kendinden-islemden geçirmeden dolayi olmadigini teid etmek üzere, her enzim ya pH 4”de veya 7'de inkübe edildi ve görünür proteoliz bir saatlik bir süre üzerinden diger proteazlarin yoklugunda analiz edildi (veriler gösterilmemistir). KumaMaXTM ve EP-BZ, fakat SC PEP degil, pH 4`de 10 dakikadan kisa bir sürede pro-peptidden aktif enzim biçimine kendiliginden-islemden geçme sergiledi. Tüm üç protein bir saatlik sürede > % 90 miktarinda kararlilik gösterdiler. Bu proteinlerin hiçbiri pH Tde bir saat süreyle inkübasyon sirasinda kendiliginden-islemden geçmenin veya proteolizin Önemli seviyelerini göstermediler.

Bir Immünojenik a9-Gliadin Peptidin Bozundurulmasi lmmünojenik peptid analoglari üzerinde (Tablo 2) KumaMaxTM tarafindan sergilenmis katalitik aktivitenin önemli seviyesi gluten intoleransi için OETade bir terapötik olarak KumaMaxTWin kullanimina yönelik gelecek sergiler. Ancak, bu tayinler glutenden türetilmis ilgili immünojenik peptidleri bozundurmak üzere bu 27969.03 enzimin yetkinligini dogrudan degerlendirmezler. Dolayisiyla, biz 0t9-gliadin*de mevcut bir iimüno-baskin peptid olan QLQPFPQPQLPY°ye (SEQ ID NO:70) dogru KumaMaXTWin dogrudan proteolitik aktivitesini inceledik.

KumaMax a9-gliadin peptidin 500 pMHyla, pH 49de, 37°Cida insan midesinde bu peptidin bir fizyolojik olarak ilgili konsantrasyonunu temsil eden, 1210091ük enzim ve peptid molar oraniylainkübe edildi. SC PEP karsilastirma bakimindan bu denyde içerildi, çünkü bu enzim FQ substrata karsi KumaMaxTWdakinden önemli derecede daha az aktivite gösterir. Inkübasyondan numunelere proteoliz reaksiyonunu durdurmak için her on dakikada bir % 80 asetonitril içinde su verildi. Bozunmamis immünojenik peptidin kalan fraksiyonu yüksek performansli sivi kromatografisi kütle spektroskopisi kullanilarak belirlendi ve burada, (19- gliadin peptidin M+H ana iyonu izlendi. KumaMaXTM bu tayinde immünojenik peptide karsi aktivitenin bir yüksek seviyesini sergiledi ve burada, immünojenik peptidin % 95”den fazlasi KumaMaXTM ile bir 50 dakikalik inkübasyondan sonra proteolize tabi tutulmus bulunurken, peptidin hiçbir önemli bozunmasi SCPEP”in mevcudiyetinde veya proteazin yoklugunda gözlemlenmedi (Sekil 4A). The half- life of the peptide in the presence of KumaMaxTMHn mevcudiyetinde peptidin yarilanma ömrü kalan peptidin fraksiyonunun inkübasyon süresine karsi grafiklendirilmesi araciligiyla belirlendi ve 8.5 ± 0.7 dakika olacak sekilde hesaplandi (Sekil 4B).

TARTISMA Tedavisinin bu biçimi intravenöz enjeksiyona gerek göstermediginden dolayi, enzim terapisi çölyak hastaliginin tedavisi için çekici bir yöntemdir. Ancak, Çölyak hastaligi için bir etkili terapötik olmasina için gerekli tüm özellikleri sergileyen OETSde kullanim için bir uygun proteazi kimliklendirmek bir müsabakadir. Spesifik olarak, OET,de kullanim için bir ideal proteaz 37°C,da 2-4 arasindaki pH araliginda aktivitesini muhafaza edecek ve olagan sindirimsel proteazlar tarafindan bozundurulmaya dirençli olacaktir. Ilave olarak, protein 27969.03 terapötik ideal olarak, immünojenik gluten-türevli peptidlerde bulunan bir ortak motif için zorlayici spesifisite gösterecektir. Son olarak, protein rekombinant yöntemler kullanilarak kolayca üretilmelidir. Bir tekli dogal enzimin bu proteinlerin tümünü sarmalayacagi olasi degilken, biz bu önemli karakteristiklerin birkaçini içeren bir proteinin hesapsal analiz, mutajenöz ve tarama araciligiyla bu yetkinliklerin yoksunlugunu göstermek üzere mühendislige tabi tutulabilirligini gösteririz.

Mühendislige tabi tutulmus proteaz, KumaMaXTM, istenilen PQ dipeptid motifi üzerinde aktivitenin bir yüksek seviyesini ve ona dogru spesifisiteyi gösterdi (Table 2). Dogal PR motifine zit olarak, PQ motifi için spesifisite, modellenen sekilde, bu dipeptid motifinde glutamin ile dogrudan temaslar yapan KumaMaxHn Sl cebinde yeni hidrojen baglarinin ilavesinden potansiyel olarak türer (Sekil 2B).

Bu spesifisite degisimi sadece aktiviteyi gluten içinde yaygin olarak bulunan bir motife karsi yönlendirmekle kalmaz, fakat ayni zamanda, hedeflenmis-olmayan substratlara karsi aktiviteyi büyük ölçüde azaltir (Table 2). Bir oral proteaz için hedeflenmis-olmayan substratlari tanimak üzere yetkinsizlik, 0 bir yemegin sindirimi sirasinda midede üretilmis diger peptidlerin bir büyük sayisi tarafindan yarismali inhibisyonu azalttigindan dolayi, bir önemli karakteristiktir.

KumaMaxTM veya KumaWT, KumaWT P2 ve Pl yerlerinin ötesine seçiciligin bazi seviyelerini göstermis bulundugundanE dolayi, daha büyük spesifisiteyi mühendislige tabi tutmak için platformlar seklinde potansiyel olarak faaliyet gösterebilir Bu yöntem kullanilarak, benzersiz immünojenik epitoplar için spesifik özellestirilmis proteazlarin bir paneli olusturulabilir.

YÖNTEMLER Protein Ekspresyonu ve Saflastirilmasi pET29b plazmidi içinde barindirilmis ilgilenilen her proteini kodlayan genler Escherichia coli BL21 (DE3) hücreleri içine dönüstürüldü. Bireysel koloniler 27969.03 toplandi, 50 ug/pL Kanamisin (TB+Kan) ile Terrific BrothTM içine inoküle edildi ve gece boyunca 37°C”da inkübe edildi. 500 uL geceboyu kültürü 500 mL otoindüksiyon ortamina (5 g tripton, 2.5 g maya ekstrakti, ilave edildi ve 37°Cada kabaca 4 saat süreyle çalkalandi ve ondan sonra, otoindüksiyon bilesenleri (( eser metaller, 25 mL 20x NPS, 10 mL )( 5052, ilave edildi. Ondan sonra, kültürler dönüs hizinin yavaslatilmasindan önce, 18°C,da 30 saat süreyle çalkalandi. Peletler 10 mL 1x PBS içinde yeniden-süspansiyonlastirildi ve ondan sonra, 5 mL lizis tamponu (50 mM HEPES, 500 inM NaCl, l mM bME, 2 mg/rnL lisozim, 0.2 mg/mL DNase, dngO) ile sonikasyon araciligiyla çzündürüldü ve dönüs hizi yavaslatildi. Ondan sonra, proteinler lmL TALON kobalt yatkinlik kolonlari üzerinden saflastirildi. KumaMax, KumaWT ve SC Pep 20 mL yikama tamponu (10 mM imidazole, 50 mM HEPES, ile üç kez yikandi ve ondan sonra, 15 mL elusyon tamponu (200 mM imidazole, 50 mM HEPES, içinde ayristirildi. EP-B2 kolon üzerinde yeniden-katlanmak zorunlulugunda idi ve böylece çözündürülmeden sonra, peletler 10 mL EP-B2 tamponu içinde yeniden-süspansiyonlastirildi ve bu tampon, EP-B2 dahil edilme cisimciklerinin denature olmasina izin vermek için, sadece dngO yerine guanidin hidroklorür seyreltilmis oldugundan yikama tamponundan farklilik gösterir. Bu yeniden-süspansiyon peletlendi ve süzüntü (denature EP-B2 içeren) kolon üzerinde bir 0.8mm filtre ile filtre edildi. EP-B2, kolon üzerinde proteini yeniden-katlamak üzere 20 mL yikama tamponu ile iki kez yikanmadan önce, 20 mL EP-B2 tamponu ile yikandi. Protein 15 m1 elusyon tamponu ile ayristirildi. Tüm proteinler were concentrated from 15 mL`den ~500 uL'ye kadar konsantre hale getirildi ve ondan sonra, 1 L diyaliz tamponu (20% gliserol, 50 mM HEPES, içinde bir kez diyalizlendi.

Protein konsantrasyonu KumaWT ve tüm KumaWT degiskeleri için 53,985 M` yokolma katsayilari ile spektrofotometrik olarak hesaplandi.

Tarama Yöntemi 27969.03 Kunkel mutajenözü KumaWT”ye mutasyonlar olusturmak üzere kullanildi.

Bireysel koloniler 96-derin yuva plakalarda büyütülmüs plakalardan toplandi.

Triton tamponu (1% 100X Triton, 1 mg/mL lysozyme, 0.5 mg/mL DNase, 1x PBS) ile hücrelerin çözündürülmesinden sonra, süzüntü bir 100 mM sodyum asetat tamponu ile pH 4,e ayarlandi. FQ substratina karsi aktivite yönünden ham olarak tarama yapmak üzere, 10 uL süzüntü bir 96-yuvali siyah plaka içinde 90 uL mM substrata ilave edildi ve Iloresans 1 saat süreyle 30-saniye araliklarla Saflastirilmis Enzim Tayini Aktivite ekraninda FQ substrati üzerinde en aktiviteyi gösteren Kumamolisin- As7nin degiskeleri dizinlendirildi ve ondan sonra, küçük ölçekli olarak saflastirildi. 500 uL TB+Kan geceboyu kültürleri 50 mL TB+Kan'a ilave edildi ve ilave edildi ve kültürler 16-24 saat süreyle 22°Cida ekspresyona tabi tutuldu.

Hücrelerin dönüs hizi yavaslatildi, 500 uL yikama tamponu (lx PES, 5 mM imidazol, ddHZO) içinde yeniden-süspansiyonlastirildi, bir 2 mL Eppendorf tüpüne transfer edildi ve 1 mL lizis tamponu (1x PES, 5 mM imidazol, 2x Bug BusterTM, 2 mg/mL lisozim, 0.2 mg/mL DNase, dngO) içinde çözündürüldü.

Santrifüjden sonra, süzüntü bir taze tüp içine dekante edildi. 200 uL TALON cobalt reçine ile kolonlar Eppendorf tüplerine yerlestirildi ve süzüntü kolonlar üzerinden bosaltildi ve dönüs hizinin yavaslatilmasindan ve akisin atilmasindan önce 20 dakika süreyle sallandi. Proteinler 500 uL yikama tamponu ile üç kez yikandi ve yikamalar arasinda içerden akis atildi. Enzimler were eluted in 200 uL elusyon tamponu (lx PBS, içinde ayristirildi ve konsantrasyonlar 53,985 Miicmililik bir yokolma katsayisi kullanilarak spektrofotometrik olarak hesaplandi. 27969.03 Tayin için, Kumamolisin-As mutantlari pH 4 100 mM sodyum asetat tamponu içinde 15 dakika süreyle inkübe edildi. Enzim 5 mM substrata ilave edildi ve böylece, nihai protein konsantrasyonu 0.0125 mg/mL idi. Floresans 1 saat süreyle -saniyelik araliklarda ölçüldü.

Kinetik Karakterizasyon Gluten bozundurulmasi için enzim degiske egilimi bir substrat olarak floresan sekilde su verilmis d-gliadin heksapeptid analogunun QXL520-PQPQLP-K(5- FAM)-NH2 (FQ) (SEQ NO:69) hidrolizi araciligiyla ölçüldü. Her enzim oda sicakliginda, 15 dakika süreyle 100 mM pH 4 sodyum asetat tamponu içinde mM peptid arasindaki nihai konsantrasyon araliklarinda ilave edildi ve substrat konsantrasyonundaki tüm degiskeler boyunca 0.05 mM KumaMaxTM, 0.5 mM KumaWT, 0.5 mM SC Pep ve 0.5 mM EP-B2 konsantrasyon1ari muhafaza edi1di.

Plaka uyarim için 455 nm dalga boyu kullanilarak ve emisyon için 485 nm dalgaboyunda okunarak spektrofotometre üzerinde derhal bir saat süreyle okundu.

Enzimler ayni zamanda, hidroliz üzerine p-nitroalanini serbest birakan kromojenik substratlarin: [Suc-APQ-pNA], [Suc-AQP-pNA], [Suc-APE-pNA], and [Suc-APR-pNA] bir çesitliligi kullanilarak farkli dipeptid motiüerine spesifisite yönünden test edildi. Tekrar, her enzim oda sicakliginda, 15 dakika süreyle 100 mM pH 4 sodyum asetat tamponu içinde inkübe edildi. 15 dakika sonra, 20 uL substrat enzim inkübasyonuna ilave edildi ve böylece, substratin arasinda araliklandirildi ve test edilmis olan tüm enzimler 0.5 mM,11k bir konsantrasyonda sonlandi. Plaka spektrofotometre üzerinde bir saat süreyle derhal okundu ve reaksiyonlar araciligiyla absorpsiyon 385nm9de izlendi.

Floresant peptid için standart egri pH 4 tamponu içinde substrain ve ürünün beraberce degisen konsantrasyonlarda karistinlmasini içerdi. Substrat 27969.03 Absorbe edici peptid için standart egri pH 4 tampon içinde seyreltilmis 100, 50, mM7lik ürün konsantrasyonlarini içerdi.

Proteaze Kararliligi Enzim kararliligi sindirimle ilgili proteazlar pepsin ve tripsin mevcudiyetinde belirlendi. KumaWT, KumaMax TM, SC Pep ve EP-B2 her sindirimle ilgili proteazin dogal pH ortamiyla eslesen tampon içinde inkübe edildi. pH 3.5 100 mM sodyum asetat pepsin sindirim tayinleri için ve pH 7.5 diyaliz tamponu ("Protein Ekspresyonu ve Saflastirilmasi" bölümüne bakiniz) tripsinsindirim tayinleri için enzimleri ön-inkübasyona tabi tutmak üzere kullanildi. Her deneysel enzim 0.2 mg/mUlik bir konsantrasyonda, her tampon içinde, 37°C`da 15 dakika süreyle inkübe edildi.

Uygun tampon içinde ön-inkübasyondan sonra, 0.1 mg/mL sindirim proteazi ilave edildi. Reaksiyonlar üçlemeler olarak gerçeklestirildi ve 37°C9da 30 dakika süreyle inkübe edildi. SDS ilave edilmesi ve 5 dakika süreyle kaynatma sindirimle ilgili proteaz inaktivasyonunu garanti altina aldi. Bir SDS-PAGE jeli, Image] kullanilaraki enzim bozunmasinin niceliklendirilmesine izin verdi.

Protein kendiliginden-islemden geçmenin orani pepsinin veya tripsinin yoklugunda pH 4 ve 7.5”de belirlendi. Her enzim, 0.2 mg/mL konsantrasyonunda, was incubated in pH 4 100 mM sodyum asetat içinde ve pH 7.5 diyaliz tamponu içinde inkübe edildi 20, 40 ve 609inci dakikalarda zaman noktalari alindi. SDS ilave edildi ve bölüntüler enzimlerin denaturizasyonunu ve ilave kendiliginden- proteolizin inhibisyonunu garanti altina almak üzere 5 dakika süreyle kaynatildi. 27969.03 Tekrar, ImageJ ile baglanti içinde bir SDS-PAGE jel enzim kendiliginden- proteolizinin niceliklendirilmesine izin verdi.

LCMS Gliadin Bozunma Tayini Enzyme activity on Tam-uzunluklu d9-gliadin üzerinde enzim aktivitesi yüksek performansli sivi kromatografisi kütle spektrometrisi kullanilarak ölçüldü. Her enzim için, 7 pL pH 4 lM sodyum asetat tamponu 5 mM enzimin 28 pUsine ilave edildi ve 15 dakika süreyle 37°C”da, 3 pL gliadinin ayri tüpleri halinde inkübe edildi. Sonra, her enzim karisiminin 27 pLssi ve bir kontrol olarak dializ tamponunun 27 nL'si gliadinin her tüpüne ilave edildi. Bunlar 37°C”da bir kez alindi. Her zaman-noktasi numunesine 1% fonnik asit ve yaklasik olarak 33 “M leupeptin ile % 80 asetonitrilin 95 nL°sinde su verildi. Numuneler zaman içinde farkli proteazlar tarafindan gliadinin bozundurulmasini karsilastirmak üzere HPLC üzerinde analiz edildi.

Referanslar 1. Armstrong, MJ., Hegade, V.S. & Robins, G. Advances in coeliac 2. Sollid, L.M. Coeliac disease: dissecting a complex inflammatory 3. Wieser, H. Chemistry of gluten proteins. Food Microbiol 24, 115-9 (2007). 4. Shan, L. ark. Structural basis for gluten intolerance in celiac sprue.

. Shan, L. Identification and analysis of multivalent proteolytically resistant peptides from gluten: implicatoins for celiac sprue. Journal of Proteome Research (2005). 27969.03 6. Chand, N. & Mihas, A.A. Celiac disease: current concepts in diagnosis and treatment. J Clin Gastroenterol 40, 3-14 (2006). 7. Shan, L., Marti, T., Sollid, L.M., Gray, G.M. & Khosla, C. Comparative biochemical analysis of three bacterial prolyl endopeptidases: implications 8. Siegel, M. ark. Rational design of combination enzyme therapy for celiac 9. Stepniak, D. ark. Highly efficient gluten degradation With a newly identified prolyl endoprotease: implications for celiac disease. Am J Physiol . Ehren, J. ark. A food-grade enzyme preparation with modest gluten detoxification properties. PLoS One 4, e63l3 (2009). 11. Bethune, M.T., Strop, P., Tang, Y., Sollid, L.M. & Khosla, C.

Heterologous expression, purification, refolding, and structural-functional characterization of EP-B2, a self-activating harley cysteine endoprotease. 12. Okubo, A. ark. Processing, catalytic activity and crystal structures of kumamolisin-As With an engineered active Site. FEBS J 273, 2563-76 (2006). 13. Gardner, J .D., Ciociola, A.A. & Robinson, M. Measurement of meal- stimulated gastric acid secretion by in vivo gastric autotitration. J Appl 14. Wlodawer, A. ark. Crystallographie and biochemical investigations of kumamolisin-As, a serine-carboxyl peptidase with collagenase activity. J . Ehren, J., Govindarajan, S., Moron, B., Minshull, J. & Khosla, C.

Protein engineering of improved prolyl endopeptidases for celiac sprue 16. Bethune, M.T. & Khosla, C. Oral enzyme therapy for celiac sprue.

Claims (4)

1. ISTEMLER 1. SEQ ID NO: 35 uyarinca bir amino asit dizinine en az % 75 benzesik bir amino asit dizinini içeren bir polipeptid ve burada: (a) polipeptid pH 4ide bir PQPQLP (SEQ ID NO:34) peptidi bozundurur; (b) kalinti 278 Seridir, kalinti 78 Glu,dur ve kalinti 82 Aspidir; ve meydana gelen gruptan seçilmis bir veya daha fazla kalintida SEQ ID NO: 67iden bir amino asit degisimini içerir ve burada, SEQ ID 673den sözü edilen bir veya daha fazla amino asit degisimi en azindan G130S, D169G ve Dl79H°yi veya SEQ ID NO:67iden sözü edilen bir veya daha fazla amino asit degisimi en azindan N102D,yi içerir.
2. 2. SEQ 1D NO: 1 uyarinca bir amino asit dizinine en az % 75 benzesik bir amino asit dizinini içeren bir polipeptid ve burada: (a) polipeptid pH 4°de bir PQPQLP (SEQ ID NO:34) peptidi bozundurur; (b) kalinti 467 Seridir, kalinti 267 Glu'dur ve kalinti 271 Aspidir; ve meydana gelen gruptan seçilmis bir veya daha fazla kalintida SEQ ID NO: 337den bir amino asit degisimi içerir ve burada, SEQ ID NO:337den sözü edilen bir veya daha fazla amino asit degisimi en azindan G319S, D358G, ve D368H°yi veya SEQ ID NO:33,den sözü edilen bir veya daha fazla amino asit degisimi en azindan N291D”yi içerir.
3. 3. SEQ ID NO: 67iden sözü edilen bir veya daha fazla amino asit degisiminin en az N 102Diyi içerdigi, Istem lain polipeptidi.
4. 4. SEQ ID NO:33iden sözü edilen bir veya daha fazla amino asit degisiminin en az N291D”yi içerdigi, Istem 2”nin polipeptidi. SEQ ID NO:l veya SEQ ID NO:35 uyarinca bir amino asit dizinine en az % polipeptidi. SEQ ID NO:1 veya SEQ ID NO:35 uyarinca bir amino asit dizinine en az % polipeptidi. SEQ ID NO:35 kalintilar 1-378 uyarinca bir amino asit dizinini içeren, Istem lsin polipeptidi. SEQ ID NO:1 kalintilar 1-567 uyarinca bir amino asit dizinini içeren, Istem 2°nin polipeptidi. asit dizinini içerdigi, Istemler `l-8iin herhangi birinin polipeptidi. Polipeptidin SEQ ID NO:32 kalintilar 1-567 veya SEQ ID NO:66 kalintilar 1- 378 uyarinca bir amino asit dizinini içerdigi, Istemler 1-9”un herhangi birinin polipeptidi. Istemler l-10”un herhangi birinin polipeptidini kodlayan bir izole edilmis nükleik asit. Istem ll,in izole edilmis nükleik asitini içeren bir nükleik asit ekspresyon vektörü. Istem 12anin nükleik asit ekspresyon vektörünü içeren bir rekombinant konak 14. Istemler l-10”un herhangi birinin polipeptidini, Istem llsin nükleik asitini, Istem 125nin nükleik asit ekspresyon vektörünü ve/veya Istem 13iün rekombinant konak hücresini ve bir farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyiciyi içeren, bir farmasötik bilesim.