ES2667418T3 - Composiciones y métodos para el tratamiento de la enfermedad celíaca - Google Patents

Composiciones y métodos para el tratamiento de la enfermedad celíaca Download PDF

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Abstract

Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 75 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 35, en donde (a) el polipéptido degrada un péptido PQPQLP (SEQ ID NO: 34) a pH 4; (b) el resto 278 es Ser, el resto 78 es Glu y el resto 82 es Asp; y (c) el polipéptido comprende un cambio de aminoácido de la SEQ ID NO: 67 en uno o más restos seleccionados del grupo que consiste en 73, 102, 103, 104, 130, 165, 168, 169, 172 y 179, en donde dichos uno o más cambios de aminoácidos de la SEQ ID NO: 67 incluyen al menos G130S, D169G y D179H, o dichos uno o más cambios de aminoácidos de la SEQ ID NO: 67 incluyen al menos N102D.

Description

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En una realización, los uno o más polipéptidos comprenden una secuencia de aminoácidos al menos el 75 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 35, en donde
(a)
el polipéptido degrada un péptido PQPQLP (SEQ ID NO: 34) a pH 4;
(b)
el resto 278 es Ser, el resto 78 es Glu y el resto 82 es Asp.
En realizaciones adicionales, el uno o más polipéptidos comprenden uno o más cambios de aminoácido de la SEQ ID NO: 67 (Kumamolisina-As procesada de tipo silvestre) en uno o más restos seleccionados del grupo que consiste en los restos 73, 102, 103, 104, 130, 165, 168, 169, 172 y 179 (numeración basada en la secuencia de aminoácidos de la Kumamolisina-As procesada de tipo silvestre). En realizaciones no limitantes, el uno o más cambios con respecto a la secuencia de aminoácidos de la Kumamolisina-As procesada de tipo silvestre (SEQ ID NO: 67) se
seleccionan del grupo que consiste en:
N.º de resto de TS
Cambio de AA
S73
K, G
N102
D
T103
S
D104
A, T, N
G130
S
S165
N
T168
A
D169
N, G
Q172
D
D179
S, H
En diversas realizaciones adicionales, el uno o más cambios con respecto a la secuencia de aminoácidos de la Kumamolisina-As procesada de tipo silvestre incluyen al menos N102D. En otra realización, el uno o más cambios con respecto a la secuencia de aminoácidos de la Kumamolisina-As de tipo silvestre incluyen al menos N102D y D169N o D169G. En otra realización, el uno o más cambios con respecto a la secuencia de aminoácidos de la Kumamolisina-As de tipo silvestre incluyen al menos N102D, D169G y D179H. En otra realización, el uno o más cambios con respecto a la secuencia de aminoácidos de la Kumamolisina-As de tipo silvestre incluyen al menos S73K, D104T, N102D, G130S, D169G y D179H.
En diversas realizaciones preferentes, el uno o más polipéptidos comprenden o consisten en una secuencia de aminoácidos al menos el 76%, 77 %, 78 %,79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 35. En una realización adicional, los polipéptidos comprenden o consisten en una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 35.
En diversas realizaciones adicionales, el uno o más polipéptidos comprenden o consisten en una secuencia de aminoácidos al menos el 75 % idéntica a una cualquiera de las SEQ ID NO: 36-66. Los polipéptidos representados por estas SEQ ID NO son ejemplos específicos de polipéptidos con actividad de proteasa a pH 4 mejorada frente al oligopéptido PQPQLP (SEQ ID NO: 34) (un sustrato representativo de la gliadina), en comparación con la Kumamolisina-As de tipo silvestre. En diversas realizaciones preferentes, los polipéptidos comprenden o consisten en una secuencia de aminoácidos al menos el 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de acuerdo con una cualquiera de las SEQ ID NO: 36-66. En una realización adicional, los polipéptidos comprenden o consisten en una secuencia de aminoácidos de acuerdo con una cualquiera de las SEQ ID NO: 36-66.
En una realización preferente, los polipéptidos para su uso en los métodos de este aspecto comprenden un aminoácido de acuerdo con la SEQ ID NO: 33 o un polipéptido que comprende uno o más cambios de aminoácido de la SEQ ID NO:33 (Kumamolisina-As preprocesada de tipo silvestre) en uno o más restos seleccionados del grupo que consiste en los restos 119, 262, 291, 292, 293, 319, 354, 357, 358, 361 y 368 (numeración basada en la secuencia de aminoácidos de la Kumamolisina-As de tipo silvestre). En realizaciones no limitantes, el uno o más cambios con respecto a la secuencia de aminoácidos de la Kumamolisina-As de tipo silvestre se seleccionan del grupo que consiste en:
N.º de resto de TS Cambio de AA V119 D S262 K, G
N291 D
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Ejemplos
La enfermedad celíaca es un trastorno autoinmunitario que aqueja aproximadamente al 1 % de la población 1,2. Esta enfermedad se caracteriza por una reacción inflamatoria al gluten, la proteína principal en la harina de trigo, y a las proteínas relacionadas en la cebada y el centeno2. El gluten consta de una mezcla heterogénea de las glucoproteínas gliadina y glutenina3. Tras la ingestión, la α-gliadina es parcialmente degradada a oligopéptidos por proteasas gástricas e intestinales, lo cuales son resistentes a una mayor proteólisis debido a su contenido inusualmente alto de prolina y glutamina3 (Figura 1). Los oligopéptidos inmunogénicos que son el resultado de la proteólisis incompleta están enriquecidos en el motivo PQ4,5 (Figura 1), lo que estimula la inflamación y las lesiones en el intestino de las personas con enfermedad celíaca. Actualmente, el único tratamiento para esta enfermedad es la eliminación completa del gluten de la alimentación, lo que es difícil de conseguir debido a la ubicuidad de esta proteína en los productos alimenticios actuales6.
La terapia enzimática oral (TEO), en la que se emplean proteasas administradas por vía oral para hidrolizar los péptidos inmunogénicos antes de que sean capaces de desencadenar la inflamación, se está explorando actualmente como un tratamiento para la intolerancia al gluten. Para este fin, se han considerado varias proteasas distintas debido a su especificidad de escisión tras restos de prolina o glutamina 4,7-9. Sin embargo, estas enzimas a menudo muestran características que impiden su uso en la TEO para la degradación del gluten. La mayoría de estas peptidasas presentan una actividad catalítica óptima a pH neutro; sin embargo, el pH del estómago humano varía de 2 a 4. Por lo tanto, estas enzimas son más activas cuando alcanzan el pH neutro del intestino delgado, lo que es demasiado tarde para la prevención eficaz de la enfermedad celíaca dado que este es el sitio donde se desarrolla la patología derivada del gluten 2,10. De manera adicional, varias de estas enzimas muestran inestabilidad en el bajo pH del estómago humano, son susceptibles a la proteólisis por las proteasas digestivas o requieren procedimientos exhaustivos de replegamiento durante su purificación7,11, todas características que obstaculizan los esfuerzos para su uso clínico.
La proteasa ideal para la aplicación de la TEO en el tratamiento de la intolerancia al gluten combinaría los siguientes rasgos: actividad óptima a pH bajo, purificación fácil, estabilidad en las condiciones del estómago humano y alta especificidad por los motivos de aminoácidos encontrados en los oligopéptidos inmunogénicos derivados el gluten. En este caso los inventores informan sobre el diseño técnico de una endopeptidasa que muestra estos rasgos. Los inventores identificaron una proteasa que es altamente activa en condiciones ácidas, la Kumamolisina-As (KumaWT) de la bacteria acidófila Alicyclobacillus sendaiensis, y utilizaron herramientas de modelado computacional para su diseño técnico, dirigido a la especificidad de oligopéptido deseada. La enzima diseñada de manera computacional, denominada KumaMax™, presentó una actividad proteolítica aumentada en más de 100 veces y un cambio en la especificidad del sustrato de 800 veces para el motivo PQ que se tiene como objetivo, en comparación con KumaWT de tipo silvestre. Además, KumaMax™ muestra resistencia a las proteasas gástricas comunes y se produce con altos rendimientos en E. coli, sin necesidad de replegamiento. Por lo tanto, esta proteasa y otras comunicadas en el presente documento representan candidatos terapéuticos prometedores para la enfermedad celíaca.
RESULTADOS
Selección y diseño computacional de una endopeptidasa para α-gliadina
Para diseñar técnicamente una nueva proteasa que pueda degradar los péptidos del gluten en las condiciones gástricas, los inventores se han centrado en primer lugar en identificar una proteasa apropiada como punto de partida para sus esfuerzos de diseño técnico. Idealmente, la proteasa molde combinaría estabilidad y actividad a pH bajo con una especificidad demostrada por un motivo de aminoácidos de dipéptido. Los inventores identificaron la enzima Kumamolisina-As (KumaWT) como molde, dado que esta proteasa tiene una actividad óptima en el intervalo de pH de 2-412 de manera natural, lo que coincide con los intervalos de pH aproximados del estómago humano antes y después de ingerir una comida (pH 2 y 4, respectivamente)13. KumaWT también muestra alta estabilidad y actividad a la temperatura fisiológicamente importante de 37 ºC14. Además, la purificación de esta enzima es sencilla y produce cantidades significativas utilizando métodos convencionales de producción de proteína recombinante en
E. coli14, una propiedad importante tanto para la exploración de bibliotecas mutantes como para su generación final en grandes lotes para uso en TEO. Para finalizar, KumaWT reconoce de forma natural un motivo de dipéptido específico en oposición a la especificidad por un solo aminoácido14. Esta es una propiedad importante para un producto terapéutico de proteasa oral que se pretenda tomar durante la digestión, dado que la especificidad por un dipéptido debería dar como resultado una inhibición competitiva reducida por otros péptidos procedentes de los alimentos en el estómago.
Una TEO eficaz para la enfermedad celíaca probablemente demostraría especificidad por prolina-glutamina (PQ), debido a la frecuente aparición de este dipéptido en los oligopéptidos inmunogénicos derivados del gluten (Figura 1). KumaWT tiene una fuerte especificidad por la prolina en la posición P2 de su sustrato peptídico, emparejándose con uno de los restos de aminoácido de interés para la degradación de los péptidos de α-gliadina inmunogénicos. En el sitio P1, se ha establecido que KumaWT prefiere los aminoácidos con carga positiva arginina o lisina14. A pesar de esta preferencia, KumaWT también tiene la capacidad de reconocer en la posición P1 a la glutamina, aunque a un nivel significativamente disminuido en comparación con su reconocimiento de arginina o lisina14. Esta ligera
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Mutaciones en la Kumamolisina-As (preprocesada) de tipo silvestre
Cambio en veces de la actividad de hidrólisis de PQ con respecto a la Kumamolisina-As de tipo silvestre
G319S, D358G, D368H
7,0
N291D, Q361D
7,5
S354N, D358G, D368H
9,0
N291D
10,0
N291D, D293A, Q361D, D358N
14,8
N291D, D293A
15,0
N291D, D293A, D358G, Q361D
15,0
N291D, D358N
18,9
N291D, Q361D, D358G
20,0
N291D, G319S, D358G, Q361D, D368H
23,1
N291D, D293A, D358N
24,0
S262G, T292S, N291D, G319S, D358G, D368H
29,0
N291D, D293A, G319S, D358G, Q361D, D368H
40,9
T292S, N291D, G319S, D358G, D368H
49,0
N291D, G319S, S354N, D358G, Q361D, D368H
50,0
N291D, G319S, S354N, D358G, D368H
54,6
N291D, D293A, G319S, S354N, D358G, Q361D, D368H
58,0
D293T, N291D, G319S, D358G, D368H
58,0
S262K, D293N, N291D, G319S, D358G, D368H
62,0
N291D, G319S, D358G, D368H
93,0
V119D, S262K, D293T, N291D, G319S, D358G, D368H
120,0
Estos son los resultados de cambio en veces (calculados como se describe en la Tabla Complementaria 1) para todos los mutantes que se purificaron, secuenciaron y probaron frente a Kumamolisina de tipo silvestre en el ensayo de proteína pura. El ensayo tuvo lugar a pH 4, con una concentración final de enzima de 0,0125 mg/ml y una
5 concentración de sustrato de 5 μM.
KumaMax™ contiene siete mutaciones con respecto a la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre: V119D, S262K, N291D, D293T, G319S, D358G, D368H (Figura 2B). De estas, las mutaciones G319S, D358G y D368H parecen introducir de manera sinérgica un nuevo enlace de hidrógeno con el resto de glutamina deseado en la posición P1.10 Según se modeló, la mutación G319S parece introducir un grupo hidroxilo que se emplaza a 2,5 Å del oxígeno del carbonilo de la amida de la glutamina, lo que posiblemente aporta un nuevo enlace de hidrógeno que interactúa con la glutamina en el bolsillo P1. Se predice que la mutación D368H estabiliza el hidroxilo de la serina y su posición en el sitio activo está a su vez permitida desde el punto de vista estérico por la mutación D358G. Además de proporcionar una nueva interacción deseada con la glutamina según se modeló, estas tres mutaciones también 15 eliminan los dos restos ácidos que se predice que estabilizan el resto de arginina con carga positiva en el sustrato de KumaWT nativa (Figura 2). V119D, que se incorporó inesperadamente durante la mutagénesis dirigida, se emplaza en el dominio de propéptido y, por lo tanto, no afecta a la actividad catalítica de la enzima madura. Las otras tres mutaciones no hacen contacto directo con los restos en los bolsillos P2 -P2' y, por lo tanto, probablemente introducen interacciones con otros componentes del hexapéptido, el fluoróforo o el desactivador. Está claro que
20 estas mutaciones son importantes para la potenciación catalítica total observada, dado que solo el triple mutante G319S/D358G/D368H demostró solamente un aumento de 7 veces de la actividad catalítica sobre KumaWT; aproximadamente 17 veces menor que la determinada para KumaMax™.
14
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