ES2896489T3

ES2896489T3 - Composiciones y procedimientos para el tratamiento de la enfermedad esprúe celíaco

Info

Publication number: ES2896489T3
Application number: ES18162586T
Authority: ES
Inventors: Justin Siegel; David Baker; Sydney Gordon; Ingrid Pultz; Elizabeth Stanley; Sarah Wolf
Original assignee: University of Washington Center for Commercialization
Current assignee: University of Washington Center for Commercialization
Priority date: 2011-08-10
Filing date: 2012-08-10
Publication date: 2022-02-24
Anticipated expiration: 2032-08-10
Also published as: EP4023243A3; US9925249B2; JP2017221201A; US10149892B2; EP3400958B1; JP6342802B2; JP2024028452A; US20190083585A1; WO2013023151A2; TR201806885T4; US12544430B2; JP2021094031A; CY1120877T1; HUE037870T2; US10874720B2; PL2718434T3; US9707280B2; RS57234B1; US9289473B2; JP6502428B2

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al menos en un 75 % a una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 35, y un vehículo farmacéuticamente aceptable; donde (a) el polipéptido degrada un péptido PQPQLP (SEQ ID NO: 34) a un pH equivalente al pH en el estómago humano; (b) el residuo 278 es Ser, el residuo 78 es Glu y el residuo 82 es Asp; y el polipéptido comprende un cambio de aminoácido de SEQ ID NO: 67 en uno o más residuos seleccionados de entre el grupo que consiste en los residuos de aminoácidos 73, 102, 103, 104, 130, 165, 168, 169, 172 y 179; para su uso en un procedimiento de: - tratar el esprúe celíaco en una persona que lo necesite, - degradar la gliadina en una comida ingerida por un individuo que necesita dicho tratamiento, - tratar una reacción inflamatoria al gluten en una persona que lo necesite, o - tratar la intolerancia al gluten en una persona que lo necesite.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y procedimientos para el tratamiento de la enfermedad esprúe celíaco

Declaración de Apoyo Gubernamental

Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno bajo concesión de la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Defensa (DARPA) número HR0011-08-1-0085. El gobierno tiene determinados derechos con respecto a la invención.

Antecedentes

El esprúe celíaco es una enfermedad muy prevalente donde las proteínas de la dieta que se encuentran en los productos de trigo, cebada y centeno, conocidas como "glutens", evocan una respuesta inmunitaria en el intestino delgado de individuos genéticamente predispuestos. La inflamación resultante puede llevar a la degradación de las vellosidades del intestino delgado, impidiendo la absorción de nutrientes. Los síntomas pueden aparecer en la primera infancia o en etapas posteriores de la vida, y su gravedad varía ampliamente, desde diarrea, fatiga y pérdida de peso hasta distensión abdominal, anemia y síntomas neurológicos. Actualmente no existen terapias efectivas para esta enfermedad de por vida, excepto la eliminación total de los glutens de la dieta. Aunque el esprúe celíaco sigue siendo en gran parte infradiagnosticado, su prevalencia en los EE. UU. y Europa se estima en 0,5-1,0 % de la población. La identificación de enzimas naturales adecuadas como agentes terapéuticos orales para el esprúe celíaco es difícil debido a los estrictos requisitos físicos y químicos para degradar de manera específica y efectiva los péptidos derivados del gluten en el entorno duro y altamente ácido del tracto digestivo humano.

Resumen de la Invención

En un primer aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al menos en un 75 % a una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO:35, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, donde

(a) el polipéptido degrada un péptido PQPQLP (SEQ ID NO: 34) a un pH equivalente al pH en el estómago humano; (b) el residuo 278 es Ser, el residuo 78 es Glu y el residuo 82 es Asp; y

el polipéptido comprende un cambio de aminoácido de SEQ ID NO: 67 en uno o más residuos seleccionados de entre el grupo que consiste en 73, 102, 103, 104, 130, 165, 168, 169, 172 y 179; para su uso en un procedimiento de:

- tratar el esprúe celíaco en un individuo que lo necesite,

- degradar la gliadina en una comida ingerida por un individuo que necesita dicho tratamiento,

- tratar una reacción inflamatoria al gluten en un individuo que lo necesite, o

- tratar la intolerancia al gluten en un individuo que lo necesite.

En varias realizaciones del primer aspecto, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos al menos 85 %, 95 %, o 100 % idéntico a una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 35. En una realización, el polipéptido comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos según cualquiera de las SEQ ID NO:36-66.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Esquema que representa el papel de la terapéutica enzimática en el tratamiento del esprúe celíaco.

El gluten está comprendido por muchas glicoproteínas, incluida la a-gliadina. La proteólisis parcial de la a-gliadina (SEQ ID NO: 71) da como resultado péptidos resistentes a proteasas enriquecidos en un motivo dipéptido PQ que puede conducir a inflamación y enfermedad. La adición de una enzima terapéutica oral que sea funcional en el estómago y capaz de degradar específicamente los péptidos inmunogénicos podría actuar potencialmente como terapéutica para esta enfermedad.

Figura 2. Modelos computacionales de los sitios de unión de péptidos para KumaWT y KumaMax. A) KumaWT en complejo con un motivo dipéptido PR. B) KumaMax en complejo con el motivo dipéptido PQ diseñado. Los residuos diseñados computacionalmente en el sitio activo están etiquetados y resaltados en barras. Los péptidos modelados se basaron en una forma unida de Kumamolisina-AS (ID de PDB: 1T1E) y las estructuras finales se generaron usando Rosetta Molecular Modeling Suite. Las imágenes se generaron utilizando PyMol v1.5.

Figura 3. Estabilidad de las proteínas después de la incubación con pepsina o tripsina. La estabilidad se midió cuantificando la fracción restante relativa de proteína intacta como se observa en un gel SDS-PAGE después de 30 minutos de incubación en presencia o ausencia de pepsina o tripsina al pH indicado. Cada proteína se midió por triplicado y las barras de error representan la desviación estándar. La cuantificación se realizó en ImageJ™.

Figura 4. KumaMax degrada un péptido de a9-gliadina inmunogénico. A) Cromatogramas de reacción que miden la abundancia del ion M+H del péptido a9-gliadina original después de 50 minutos de incubación sin enzima, SC PEP o KumaMax™. B) La fracción de péptido de a9-gliadina que queda en presencia de KumaMax™ en función del tiempo de incubación a pH 4. Los datos se ajustaron usando una función de desintegración exponencial estándar. El valor de R2 fue superior a 0,9.

Descripción detallada

Dentro de esta aplicación, a menos que se indique lo contrario, las técnicas utilizadas se pueden encontrar en cualquiera de varias referencias conocidas tales como: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, y col., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), Gene Expression Technology (Methods in Enzymology, Vol. 185, edited by D. Goeddel, 1991. Academic Press, San Diego, CA), "Guide to Protein Purification" in Methods in Enzymology (M.P. Deutshcer, ed., (1990) Academic Press, Inc.); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, y col. 1990. Academic Press, San Diego, CA), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2a Ed. (R.I. Freshney. 1987. Liss, Inc. New York, NY), Gene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128, ed. E.J. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, N.J.), y el Catálogo Ambion 1998 (Ambion, Austin, TX).

Como se usa en esta invención, la forma singular "un(o)", "una" y "el/la" incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. "Y", como se usa en esta invención, se usa de manera intercambiable con "o" a menos que se indique expresamente lo contrario.

Como se usa en esta invención, los residuos de aminoácidos se abrevian como sigue: alanina (Ala; A), asparagina (Asn; N), ácido aspártico (Asp; D), arginina (Arg; R), cisteína (Cys; C), ácido glutámico (Glu; E), glutamina (Gln; Q), glicina (Gly; G), histidina (His; H), isoleucina (Ile; I), leucina (Leu; L), lisina (Lys; K), metionina ( Met; M), fenilalanina (Phe; F), prolina (Pro; P), serina (Ser; S), treonina (Thr; T), triptófano (Trp; W), tirosina (Tyr; Y) y valina (Val; V).

Todas las realizaciones de cualquier aspecto de la invención pueden usarse en combinación, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

(c) el polipéptido comprende un cambio de aminoácido de SEQ ID NO: 67 en uno o más residuos seleccionados de entre el grupo que consiste en 73, 102, 103, 104, 130, 165, 168, 169, 172 y 179; para su uso en un procedimiento de:

- tratar el esprúe celíaco en un individuo que lo necesite,

- tratar la intolerancia al gluten en un individuo que lo necesite.

Como se describe en los ejemplos que siguen, las composiciones farmacéuticas según la invención pueden usarse, por ejemplo, en el tratamiento del esprúe celíaco. Los polipéptidos son versiones modificadas de la versión procesada de Kumamolisina-As (SEQ ID NO:67) o la versión preprocesada de Kumamolisina-As (SEQ ID NO:33), que se conoce como un miembro de la familia sedolisina de serina-carboxil peptidasas, y utiliza la tríada catalítica clave Ser278-Glu78-Asp82 en su forma procesada para hidrolizar su sustrato (Ser^67-Glu267-Asp271 en la forma pre-procesada) Su actividad máxima es a pH ~4,0. Si bien se desconoce el sustrato nativo de Kumamolisina-As, se ha demostrado previamente que degrada el colágeno en condiciones ácidas (4). Además, se ha demostrado que esta enzima es termoestable, con una temperatura ideal a 60 °C, pero sigue mostrando una actividad significativa a 37 °C.

Los inventores de la presente invención han descubierto inesperadamente que Kumamolisina-As es capaz de degradar componentes ricos en prolina (P) y glutamina (Q) del gluten conocidos como 'gliadinas' que se cree que son responsables de la mayor parte de la respuesta inmune en la mayoría de los casos de pacientes con esprúe celíaco. Los polipéptidos comprendidos en la composición farmacéutica de la invención muestran una actividad de proteasa mejorada a pH 4 contra el oligopéptido PQPQLP (un sustrato representativo de la gliadina) en comparación con la Kumamolisina-As de tipo salvaje.

Los polipéptidos comprendidos en la composición farmacéutica de la invención degradan un péptido de PQPQLP (SEQ IDNO:34) a pH 4. Tal degradación se produce en las condiciones descritas en los ejemplos que siguen.

Los polipéptidos comprendidos en la composición farmacéutica de la invención comprenden uno o más cambios de aminoácidos de la SEQ ID NO: 67 (Kumamolisina-As procesada de tipo salvaje) en uno o más residuos seleccionados de entre el grupo que consiste en los residuos 73, 102, 103, 104, 130, 165, 168, 169, 172 y 179 (numeración basada en la secuencia de aminoácidos de Kumamolisina-As procesada de tipo salvaje). En realizaciones no limitantes, el uno o más cambios con respecto a la secuencia de aminoácidos de Kumamolisina-As procesada de tipo salvaje (SEQ ID NO:67) se seleccionan de entre el grupo formado por:

En varias realizaciones no limitantes adicionales, el uno o más cambios relativos a la secuencia de aminoácidos de Kumamolisina-As procesada de tipo salvaje incluyen al menos N102D. En otra realización, el uno o más cambios relativos a la secuencia de aminoácidos de Kumamolisina-As de tipo salvaje incluyen al menos N102D y D169N o D169G. En otra realización, el uno o más cambios con respecto a la secuencia de aminoácidos de Kumamolisina-As de tipo salvaje incluyen al menos N102D, D169G y D179H. En otra realización, el uno o más cambios relativos a la secuencia de aminoácidos de Kumamolisina-As de tipo salvaje incluyen al menos S73K, D104T, N102D, G130S, D169G y D179H.

Como se usa en esta invención, "al menos 75 % idéntico" significa que el polipéptido difiere en su secuencia de aminoácidos de longitud completa en menos del 25 % o menos (incluidas las sustituciones, deleciones, adiciones o inserciones de aminoácidos) del polipéptido definido por SEQ ID NO:35.

En varias realizaciones preferidas de la invención, los polipéptidos comprenden o consisten en una secuencia de aminoácidos al menos 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO:35. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO:35.

En varias realizaciones adicionales, los polipéptidos comprenden o consisten en una secuencia de aminoácidos al menos 75 % idéntica a cualquiera de las SEQ ID NOS:36-66. Los polipéptidos representados por estas SEQ ID NOS son ejemplos específicos de polipéptidos con actividad de proteasa mejorada a pH 4 contra el oligopéptido de PQPQLP (SEQ ID NO: 34) (un sustrato representativo de gliadina) en comparación con Kumamolisina-As de tipo salvaje. En varias realizaciones preferidas de la invención, los polipéptidos comprenden o consisten en una secuencia de aminoácidos al menos 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NOS:36-66. En una realización adicional, los polipéptidos comprenden o consisten en una secuencia de aminoácidos según cualquiera de las SEQ ID NOS:36-66.

Se describen polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos idéntica al menos en un 75 % a una secuencia de aminoácidos según s Eq ID NO:1 (basado en variantes de la versión preprocesada de Kumamolisina-As), donde

(a) el polipéptido degrada un péptido de PQPQLP (SEQ ID NO:34) a pH 4;

(b) el residuo 467 es Ser, el residuo 267 es Glu y el residuo 271 es Asp; y

(c) el polipéptido comprende un cambio de aminoácido de SEQ ID NO: 33 en uno o más residuos seleccionados de entre el grupo que consiste en 119, 262, 291, 292, 293, 319, 354, 357, 358, 361 y 368.

Como se usa en toda la presente solicitud, el término "polipéptido" se usa en su sentido más amplio para referirse a una secuencia de aminoácidos de subunidad, ya sea de origen natural o sintético. Los polipéptidos de la invención pueden comprender L-aminoácidos, aminoácidos D (que son resistentes a proteasas específicas de aminoácidos L in vivo) o una combinación de aminoácidos D y L. Los polipéptidos descritos en esta invención pueden sintetizarse químicamente o expresarse de forma recombinante. Los polipéptidos pueden unirse a otros compuestos para promover una vida media aumentada in vivo, tal como por PEGilación, HESilación, PASilación o glicosilación. Tal enlace puede ser covalente o no covalente como entienden los expertos en la técnica. Los polipéptidos se pueden unir a cualquier otro enlazador adecuado, incluyendo, pero sin limitarse a, cualquier enlazador que pueda usarse para purificación o detección (tales como etiquetas FLAG o His).

Se describen ácidos nucleicos aislados que codifican el polipéptido comprendido en la composición farmacéutica de cualquier realización de la invención. La secuencia de ácido nucleico aislada puede comprender ARN o ADN. Como se usa en esta invención, "ácidos nucleicos aislados" son aquellos que se han eliminado de sus secuencias de ácidos nucleicos circundantes normales en el genoma o en las secuencias de ADNc. Dichas secuencias de ácido nucleico aisladas pueden comprender secuencias adicionales útiles para promover la expresión y/o purificación de la proteína codificada, incluidas, entre otras, secuencias poliA, secuencias Kozak modificadas y secuencias que codifican etiquetas de epítopo, señales de exportación y señales secretoras, señales de localización nuclear y señales de localización de la membrana plasmática. Resultará evidente para los expertos en la técnica, basándose en las enseñanzas en esta invención, qué secuencias de ácido nucleico codificarán los polipéptidos comprendidos en la composición farmacéutica de la invención.

Se describen vectores de expresión de ácidos nucleicos que comprenden dichos ácidos nucleicos aislados unidos operativamente a una secuencia de control adecuada. "Vector de expresión recombinante" incluye vectores que unen operativamente una región o gen codificante de ácido nucleico a cualquier secuencia de control capaz de efectivar la expresión del producto génico. Las "secuencias de control" unidas operativamente a las secuencias de ácido nucleico de la invención son secuencias de ácido nucleico capaces de efectivar la expresión de las moléculas de ácido nucleico. Las secuencias de control no necesitan ser contiguas a las secuencias de ácido nucleico, siempre que funcionen para dirigir la expresión de las mismas. Así, por ejemplo, pueden estar presentes secuencias intermedias no traducidas pero transcritas entre una secuencia promotora y las secuencias de ácido nucleico y la secuencia promotora todavía puede considerarse "unida operativamente" a la secuencia codificante. Otras de tales secuencias de control incluyen, pero no se limitan a, señales de poliadenilación, señales de terminación y sitios de unión a ribosomas. Dichos vectores de expresión pueden ser de cualquier tipo conocido en la técnica, incluidos, entre otros, los vectores de expresión basados en plásmidos y virus. La secuencia de control utilizada para accionar la expresión de las secuencias de ácido nucleico descritas en un sistema de mamíferos puede ser constitutiva (accionada por cualquiera de una variedad de promotores, incluidos, entre otros, CMV, SV40, RSV, actina, EF) o inducible (accionada por cualquiera de varios promotores inducibles que incluyen, pero no se limitan a, tetraciclina, ecdisona, sensibles a esteroides). La construcción de vectores de expresión para su uso en la transfección de células procarióticas también es bien conocida en la técnica y, por tanto, puede lograrse mediante técnicas estándar. (Véase, por ejemplo, Sambrook, Fritsch, y Maniatis, in: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Gene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128, ed. E.J. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, N.J.), y el Catálogo Ambion 1998 (Ambion, Austin, TX). Estos vectores de expresión se replican típicamente en los organismos hospedadores como episomas o como una parte integral del ADN cromosomal hospedador. En una realización preferida de la invención, el vector de expresión comprende un plásmido. Sin embargo, la invención pretende incluir otros vectores de expresión que tengan funciones equivalentes, como los vectores virales.

Se describen células huésped que comprenden dichos vectores de expresión de ácido nucleico. Las células hospedadoras pueden ser procariotas o eucariotas. Las células se pueden transfectar o transducir de manera transitoria o estable. Dicha transfección y transducción de vectores de expresión en células procarióticas y eucarióticas se puede lograr mediante cualquier técnica conocida en la técnica, incluidas, entre otras, transformaciones bacterianas estándar, coprecipitación de fosfato cálcico, electroporación o mediada por liposomas, mediada por DEAE dextrano, transfección mediada por policatiónicos o mediada por virus. (Véase, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, y col., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2nd Ed. (R.I. Freshney. 1987. Liss, Inc. New York, NY). Un procedimiento para producir un polipéptido según la invención es una parte adicional de la invención. El procedimiento comprende las etapas de (a) cultivar un hospedador según este aspecto de la invención en condiciones que conduzcan a la expresión del polipéptido y (b) opcionalmente, recuperar el polipéptido expresado. El polipéptido expresado puede recuperarse del extracto libre de células, sedimento celular o recuperarse del medio de cultivo. Los expertos en la técnica conocen bien procedimientos para purificar polipéptidos expresados de forma recombinante.

Se describen composiciones farmacéuticas que comprenden dicho ácido nucleico, dicho vector de expresión de ácido nucleico, y/o dicha célula hospedadora recombinante y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas se pueden usar, por ejemplo, en los procedimientos que se describen a continuación. La composición farmacéutica puede comprender además de los polipéptidos, ácidos nucleicos, etc. (a) un lioprotector; (b) un tensioactivo; (c) un agente de carga; (d) un agente de ajuste de la tonicidad; (e) un estabilizador; (f) un conservante y/o (g) un tampón.

En algunas realizaciones, el tampón en la composición farmacéutica es un tampón Tris, un tampón de histidina, un tampón de fosfato, un tampón de citrato o un tampón de acetato. La composición farmacéutica también puede incluir un lioprotector, por ejemplo, sacarosa, sorbitol o trehalosa. En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica incluye un conservante, por ejemplo, cloruro de benzalconio, bencetonio, clorohexidina, fenol, m-cresol, alcohol bencílico, metilparabeno, propilparabeno, clorobutanol, o-cresol, p-cresol, clorocresol, nitrato fenilmercúrico, timerosal, ácido benzoico y diversas mezclas de los mismos. En otras realizaciones, la composición farmacéutica incluye un agente de carga, como glicina. En otras realizaciones más, la composición farmacéutica incluye un tensioactivo, por ejemplo, polisorbato-20, polisorbato-40, polisorbato-60, polisorbato-65, polisorbato-80 polisorbato-85, poloxámero-188, monolaurato de sorbitán, monopalmitato de sorbitán, monoestearato de sorbitán, sorbitán monooleato, trilaurato de sorbitán, triestearato de sorbitán, trioleaste de sorbitán o una combinación de los mismos. La composición farmacéutica también puede incluir un agente de ajuste de la tonicidad, por ejemplo, un compuesto que hace que la formulación sea sustancialmente isotónica o isoosmótica con la sangre humana. Los agentes de ajuste de la tonicidad ejemplares incluyen sacarosa, sorbitol, glicina, metionina, manitol, dextrosa, inositol, cloruro de sodio, arginina e hidrocloruro de arginina. En otras realizaciones, la composición farmacéutica incluye adicionalmente un estabilizador, p. ej., una molécula que, cuando se combina con una proteína de interés, impide o reduce sustancialmente la inestabilidad química y/o física de la proteína de interés en forma liofilizada o líquida. Estabilizadores ejemplares incluyen sacarosa, sorbitol, glicina, inositol, cloruro de sodio, metionina, arginina e hidrocloruro de arginina.

Los polipéptidos, ácidos nucleicos, etc. pueden ser el único agente activo en la composición farmacéutica, o la composición puede comprender además uno o más de otros agentes activos adecuados para un uso pretendido.

Las composiciones farmacéuticas descritas en esta invención generalmente comprenden una combinación de un compuesto descrito en esta invención y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones están sustancialmente libres de componentes no farmacéuticamente aceptables, es decir, contienen cantidades de componentes no farmacéuticamente aceptables inferiores a las permitidas por los requisitos reglamentarios de los Estados Unidos en el momento de presentar esta solicitud. En algunas realizaciones de este aspecto, si el compuesto se disuelve o suspende en agua, la composición comprende además opcionalmente un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable adicional. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas descritas en esta invención son composiciones farmacéuticas sólidas (por ejemplo, comprimidos, cápsulas, etc.).

Estas composiciones se pueden preparar de una manera bien conocida en la técnica farmacéutica y se pueden administrar por cualquier vía adecuada. En una realización preferida de la invención, las composiciones farmacéuticas se formulan para administración oral. Pueden ser necesarios o deseables vehículos farmacéuticos convencionales, bases acuosas, en polvo o aceitosas, espesantes y similares.

Por lo tanto, las composiciones pueden estar en forma de comprimidos, píldoras, polvos, pastillas, bolsitas, obleas, elíxires, suspensiones, emulsiones, soluciones, jarabes, aerosoles (como un sólido o en un medio líquido), ungüentos que contienen, por ejemplo, hasta 10 % en peso del compuesto activo, cápsulas de gelatina blandas y duras, supositorios, soluciones inyectables estériles y polvos empaquetados estériles.

Se describen procedimientos para tratar el esprúe celíaco, que comprenden administrar a un individuo con esprúe celíaco una cantidad efectiva para tratar el esprúe celíaco de uno o más polipéptidos seleccionados de entre el grupo que consiste en los polipéptidos del primer o segundo aspecto de la invención, SEQ ID NO:33, y SEQ ID NO:67.

Los inventores de la presente invención han descubierto inesperadamente que Kumamolisina-As es capaz de degradar componentes ricos en prolina (P) y glutamina (Q) del gluten conocidos como 'gliadinas' que se cree que son responsables de la mayor parte de la respuesta inmune en la mayoría de los casos de pacientes con esprúe celíaco. Los polipéptidos comprendidos en la composición farmacéutica de la invención muestran una actividad de proteasa mejorada a pH 4 contra el oligopéptido PQPQLP (SEQ ID NO:34) (un sustrato representativo de la gliadina) en comparación con la Kumamolisina-As de tipo salvaje.

El uno o más polipéptidos comprenden una secuencia de aminoácidos idéntica al menos en un 75 % a una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO:35, donde

(a) el polipéptido degrada un péptido de PQPQLP (SEQ ID NO:34) a pH 4;

(b) el residuo 278 es Ser, el residuo 78 es Glu y el residuo 82 es Asp;

y el uno o más polipéptidos comprenden uno o más cambios de aminoácidos de la SEQ ID NO: 67 (Kumamolisina-As procesada de tipo salvaje) en uno o más residuos seleccionados de entre el grupo que consiste en los residuos 73, 102, 103, 104, 130, 165, 168, 169, 172 y 179 (numeración basada en la secuencia de aminoácidos de Kumamolisina-As procesada de tipo salvaje). En realizaciones no limitantes, el uno o más cambios con respecto a la secuencia de aminoácidos de Kumamolisina-As procesada de tipo salvaje (SEQ ID NO:67) se seleccionan de entre el grupo que consiste en:

En varias realizaciones no limitantes adicionales, el uno o más cambios relativos a la secuencia de aminoácidos de Kumamolisina-As procesada de tipo salvaje incluyen al menos N102D. En otra realización, el uno o más cambios relativos a la secuencia de aminoácidos de Kumamolisina-As de tipo salvaje incluyen al menos N102D y D169N o D169G. En otra realización, el uno o más cambios relativos a la secuencia de aminoácidos de Kumamolisina-As de tipo salvaje incluyen al menos N102D y D169G o D179H. En otra realización, el uno o más cambios relativos a la secuencia de aminoácidos de Kumamolisina-As de tipo salvaje incluyen al menos S73K, D104T, N102D, G130S, D169G y D179H.

En varias realizaciones preferidas de la invención, el uno o más polipéptidos comprenden o consisten en una secuencia de aminoácidos al menos 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO:35. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO:35.

En varias realizaciones adicionales, el uno o más polipéptidos comprenden o consisten en una secuencia de aminoácidos al menos 75 % idéntica a cualquiera de las s Eq ID NOS:36-66. Los polipéptidos representados por estas SEQ ID NOS son ejemplos específicos de polipéptidos con actividad de proteasa mejorada a pH 4 contra el oligopéptido de PQPQLP (SEQ ID NO: 34) (un sustrato representativo de gliadina) en comparación con Kumamolisina-As de tipo salvaje. En varias realizaciones preferidas de la invención, los polipéptidos comprenden o consisten en una secuencia de aminoácidos al menos 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NOS:36-66. En una realización adicional, los polipéptidos comprenden o consisten en una secuencia de aminoácidos según cualquiera de las SEQ ID NOS:36-66.

Se describen procedimientos para tratar el esprúe celíaco, que comprenden administrar a un individuo con esprúe celíaco un polipéptido que comprende una cantidad efectiva de la secuencia de aminoácidos según cualquiera de las SEQ ID n Os : 1-67 para tratar el esprúe celíaco.

En una realización de la composición farmacéutica de la invención, el uno o más polipéptidos comprenden una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO:36. Polipéptidos según SEQ ID NO:36 tienen una mutación N102D relativa a la Kumamolisina-As procesada de tipo salvaje. Como se muestra en los ejemplos que siguen, los polipéptidos que contienen esta mutación tienen una actividad de proteasa mejorada al menos 10 veces a pH 4 contra el oligopéptido PQPQLP (SEQ ID NO: 34) en comparación con Kumamolisina-As de tipo salvaje. En otra realización, el uno o más polipéptidos comprenden una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO:37. Los polipéptidos según SEQ ID NO: 37 tienen una mutación N102D y una mutación D169N o D169G con respecto a la Kumamolisina-As procesada de tipo salvaje. Como se muestra en los ejemplos que siguen, los polipéptidos que contienen esta mutación tienen una actividad de proteasa mejorada al menos 20 veces a pH 4 contra el oligopéptido PQPQLP (SEQ ID NO: 34) en comparación con Kumamolisina-As de tipo salvaje. En otra realización, el uno o más polipéptidos comprenden una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO:38. Los polipéptidos según SEQ ID NO:38 tienen una mutación N102D, una D169G y una mutación D179H en relación con la Kumamolisina-As procesada de tipo salvaje. Como se muestra en los ejemplos que siguen, los polipéptidos que contienen esta mutación tienen una actividad de proteasa mejorada al menos 50 veces a pH 4 contra el oligopéptido PQPQLP (SEQ ID NO: 34) en comparación con Kumamolisina-As de tipo salvaje. En realizaciones adicionales, el uno o más polipéptidos comprenden una secuencia de aminoácidos según cualquiera de las SEQ ID NOS:39-66. Se ha demostrado que todos los polipéptidos según estas realizaciones muestran una actividad de proteasa mejorada a pH 4 contra el oligopéptido Pq Pq Lp (SEQ ID NO: 34) en comparación con la Kumamolisina-As de tipo salvaje. En una realización preferida de la invención, el polipéptido comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO:66.

La enfermedad celíaca (también conocida como enfermedad celíaca o intolerancia al gluten) es una enfermedad muy prevalente en la que las proteínas de la dieta que se encuentran en los productos del trigo, la cebada y el centeno, conocidas como 'glutens', evocan una respuesta inmunitaria en el intestino delgado de individuos genéticamente predispuestos. La inflamación resultante puede llevar a la degradación de las vellosidades del intestino delgado, impidiendo la absorción de nutrientes. Los síntomas pueden aparecer en la primera infancia o más tarde en la vida, y varían ampliamente en severidad, desde diarrea, fatiga, pérdida de peso, dolor abdominal, hinchazón, gases excesivos, indigestión, estreñimiento, distensión abdominal, náusea/vómitos, anemia, aparición de moretones con facilidad, depresión, ansiedad, retraso del crecimiento en los niños, caída del cabello, dermatitis, ausencia de períodos menstruales, úlceras en la boca, calambres musculares, dolor en las articulaciones, hemorragias nasales, convulsiones, hormigueo o entumecimiento en manos o pies, pubertad retrasada, defectos en el esmalte de los dientes y síntomas neurológicos como ataxia o parestesia. Actualmente no existen terapias efectivas para esta enfermedad de por vida, excepto la eliminación total de los glutens de la dieta. Aunque el esprúe celíaco sigue estando infradiagnosticada en gran medida, su prevalencia en los EE. UU. y Europa se estima en un 0,5-1,0% de la población.

Como se usa en esta invención, "tratar el esprúe celíaco" significa lograr uno o más de los siguientes: (a) reducir la gravedad del esprúe celíaco; (b) limitar o impedir el desarrollo de síntomas característicos del esprúe celíaco; (c) inhibir el empeoramiento de los síntomas característicos del esprúe celíaco; (d) limitar o prevenir la recurrencia del esprúe celíaco en pacientes que han tenido previamente el trastorno; (e) limitar o prevenir la reaparición de los síntomas en pacientes que previamente presentaban síntomas de esprúe celíaco; y (f) limitar el desarrollo del esprúe celíaco en un sujeto con riesgo de desarrollar esprúe celíaco, o que todavía no muestra los efectos clínicos del esprúe celíaco.

El individuo que se va a tratar según los procedimientos de la invención puede ser cualquier individuo que padezca de esprúe celíaco, incluidos los seres humanos. El individuo puede ser uno que ya padece síntomas o uno que es asintomático.

Como se usa en esta invención, una "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad del polipéptido que es efectiva para tratar el esprúe celíaco. Los polipéptidos se formulan típicamente como una composición farmacéutica, como las descritas anteriormente, y se pueden administrar a través de cualquier vía adecuada, incluyendo por vía oral, parental, por inhalación, o por vía tópica en formulaciones de conjuntos de dosificación que contienen portadores, adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables convencionales. En una realización preferida de la invención, las composiciones y formulaciones farmacéuticas se administran por vía oral, tal como comprimidos, píldoras, grageas, elixires, suspensiones, emulsiones, soluciones o jarabes.

Los regímenes de dosificación se pueden ajustar para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica). Un intervalo de dosificación adecuado puede ser, por ejemplo, 0,1 ug/kg-100 mg/kg peso corporal; alternativamente, puede ser 0,5 ug/kg hasta 50 mg/kg; 1 ug/kg hasta 25 mg/kg, o 5 ug/kg a 10 mg/kg peso corporal. Los polipéptidos pueden administrarse en un solo bolo, o pueden administrarse más de una vez (por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o más veces) según lo determine el médico tratante.

Ejemplos

La enfermedad celíaca es un trastorno autoinmune que afecta aproximadamente 1 % de la población 12. Esta enfermedad se caracteriza por una reacción inflamatoria al gluten, la principal proteína de la harina de trigo, y a las proteínas relacionadas de la cebada y el centeno2. El gluten está compuesto por una mezcla heterogénea de las glicoproteínas gliadina y glutenina3. T ras la ingestión, la a-gliadina se degrada parcialmente por las proteasas gástricas e intestinales a oligopéptidos, que son resistentes a una proteólisis adicional debido a su contenido inusualmente alto de prolina y glutamina3 (Figura 1). Los oligopéptidos inmunogénicos que resultan de la proteólisis incompleta están enriquecidos en el motivo PQ 4£(Figura 1), que estimula la inflamación y la lesión en el intestino de las personas con esprúe celíaco. Actualmente el único tratamiento para esta enfermedad es la eliminación completa del gluten de la dieta, lo cual es difícil de lograr debido a la ubicuidad de esta proteína en los productos alimenticios modernos 6.

Se está explorando actualmente la terapia enzimática oral (TEO), donde se emplean proteasas administradas por vía oral para hidrolizar péptidos inmunogénicos antes de que sean capaces de desencadenar inflamación, como tratamiento para la intolerancia al gluten. Para este propósito, se han considerado varias proteasas diferentes debido a su especificidad para la escisión después de residuos de prolina o glutamina4'7-9 Sin embargo, estas enzimas a menudo demuestran características que dificultan su uso en TEO para la degradación del gluten. La mayoría de estas peptidasas exhiben una actividad catalítica óptima a pH neutro; sin embargo, el pH del estómago humano varía de 2 a 4. Por lo tanto, estas enzimas son más activas cuando alcanzan el pH neutro del intestino delgado, que es demasiado tarde para una prevención efectiva del esprúe celíaco, ya que este es el sitio donde se desarrolla la patología derivada del gluten2'1°. Además, varias de estas enzimas demuestran inestabilidad al pH bajo del estómago humano, son susceptibles a la proteólisis por proteasas digestivas o requieren extensos procedimientos de replegamiento durante su purificación2'11, características que dificultan los esfuerzos de uso clínico.

La proteasa ideal para la aplicación de TEO en el tratamiento de la intolerancia al gluten combinaría los siguientes rasgos: actividad óptima a pH bajo, fácil purificación, estabilidad en las condiciones del estómago humano y alta especificidad por los motivos de aminoácidos que se encuentran en oligopéptidos inmunogénicos derivados del gluten. Aquí informamos la ingeniería de una endopeptidasa que demuestra estos rasgos. Identificamos una proteasa que es altamente activa en condiciones ácidas, Kumamolisina-As (KumaWT) de la bacteria acidófila Alicyclobacillus sendaiensis, y usamos herramientas de modelado computacional para diseñarla hacia la especificidad de oligopéptidos deseada. La enzima diseñada computacionalmente, denominada KumaMax™, exhibió una actividad proteolítica más de 100 veces mayor y un cambio de 800 veces en la especificidad del sustrato para el motivo PQ diana en comparación con KumaWT de tipo salvaje. Además, KumaMax™ demuestra resistencia a las proteasas gástricas comunes y se produce con altos rendimientos en E. coli sin la necesidad de replegarse. Por tanto, esta proteasa y otras descritas en esta invención representan candidatos terapéuticos prometedores para el esprúe celíaco.

RESULTADOS

Selección y diseño computacional de una a-gliadina endopeptidasa

Para diseñar una nueva proteasa que pueda degradar los péptidos del gluten en condiciones gástricas, primero nos enfocamos en identificar una proteasa apropiada como punto de partida para nuestros esfuerzos de ingeniería. Idealmente, la proteasa molde combinaría estabilidad y actividad a pH bajo con especificidad demostrada por un motivo aminoácido dipéptido. Identificamos la enzima Kumamolisina-As (KumaWT) como molde, ya que esta proteasa naturalmente tiene una actividad óptima en el intervalo de pH de 2-4—, que coincide con los intervalos de pH aproximados en el estómago humano antes y después de ingerir una comida (pH 2 y 4, respectivamente)13. KumaWT también demuestra una alta estabilidad y actividad a la temperatura fisiológicamente relevante de 37 °C i 4. Además, la purificación de esta enzima es sencilla y produce cantidades significativas utilizando procedimientos estándar de producción de proteínas recombinantes en E. coli14, una propiedad importante tanto para el cribado de bibliotecas mutantes como para su última generación en grandes lotes para su uso en TEO. Finalmente, KumaWT reconoce naturalmente un motivo dipéptido específico en oposición a la especificidad de un solo aminoácido14. Esta es una propiedad importante para un tratamiento con proteasa oral que debe tomarse durante la digestión, ya que la especificidad del dipéptido debería resultar en una inhibición competitiva reducida por otros péptidos derivados de alimentos en el estómago.

Una TEO efectiva para la enfermedad celíaca probablemente demostraría especificidad para la prolina-glutamina (PQ), debido a la frecuente aparición de este dipéptido en oligopéptidos inmunogénicos derivados del gluten (Figura 1). KumaWT tiene una fuerte especificidad por la prolina en la posición P2 de su sustrato peptídico, coincidiendo con uno de los residuos de aminoácidos de interés para la degradación de péptidos de a-gliadina inmunogénicos. En el sitio PI, se ha establecido que KumaWT prefiere los aminoácidos cargados positivamente arginina o lisina14. A pesar de esta preferencia, KumaWT también es capaz de reconocer la glutamina en la posición PI, aunque a un nivel significativamente menor en comparación con su reconocimiento de arginina o lisina14. Esta ligera propensión innata a reconocer la glutamina en la posición PI sugiere que KumaWT puede ser susceptible de reingeniería para preferir la glutamina en esta posición. En el sitio P1', KumaWT demuestra una amplia especificidad, lo cual es deseable ya que el residuo en la posición después del motivo PQ varía entre los diferentes péptidos inmunogénicos, como se muestra en la Figura 1.

Dadas estas características de KumaWT, nuestro objetivo principal era rediseñar computacionalmente el bolsillo de unión S1 de KumaWT de modo que preferiría un motivo dipéptido PQ sobre los sustratos PR o PK nativos. Utilizando Rosetta Molecular Modeling Suite, modelamos el dipéptido PR en el bolsillo de unión S1 de KumaWT utilizando la estructura cristalina resuelta de esta enzima (ID de PDB: 1T1E). Esto reveló que dos aminoácidos cargados negativamente, D358 y D368, probablemente facilitan la unión de los aminoácidos cargados positivamente en la posición P1 (Figura 2A). La especificidad nativa para la prolina en P2 parece derivarse en gran parte de una interacción hidrófoba de este residuo de aminoácido con el anillo aromático de W318 en el bolsillo S2 de la enzima. Como se desea la especificidad de la posición PI para la prolina en nuestra variante de enzima, mantuvimos este triptófano nativo durante el diseño del bolsillo S1.

Para rediseñar la especificidad del sustrato KumaWT del bolsillo S1 para preferir la glutamina en la posición PI, generamos mutaciones teóricas en el bolsillo de unión KumaWT utilizando la interfaz Foldit para Rosetta Molecular Modeling Suite. Un tetrapéptido que representa un motivo inmunogénico común que se encuentra en toda la a-gliadina, PQLP (SEQ ID NO: 68), se modeló en las posiciones de los sitios activos P2 a P2'. Esta estructura ya contenía un polipéptido unido en el sitio activo, por lo que los residuos de este polipéptido se mutaron usando Rosetta al motivo tetrapéptido PQLP (SEQ ID NO: 68). Un total de 75 residuos dentro de una esfera de 8 A del tetrapéptido se asignaron al azar a cualquiera de los 20 aminoácidos naturales con el fin de encontrar mutaciones que favorecieran la unión de glutamina en el bolsillo S1. Estas mutaciones se aceptaron si la energía total del nuevo complejo enzima-sustrato PQLP se reducía en relación con el sustrato nativo o no aumentaba en más de 5 unidades de energía Rosetta. Para acomodar el aminoácido neutro más pequeño, glutamina, enfocamos nuestros esfuerzos computacionales en 1) eliminar la carga negativa del bolsillo S1 durante el procedimiento de diseño, 2) llenar el espacio abierto que resultó de la sustitución del aminoácido grande arginina por glutamina. y 3) proporcionar enlaces de hidrógeno al grupo funcional amida de la glutamina. Este modelo computacional produjo 107 diseños novedosos que contienen de 1 a 7 mutaciones simultáneas. A continuación, se construyeron estas proteínas diseñadas y se evaluó su actividad catalítica contra un péptido PQLP (SEQ ID NO: 68).

Para probar la actividad de cada una de estas proteasas diseñadas contra el motivo PQLP (SEQ ID NO: 68), se incorporaron las mutaciones deseadas en la secuencia de nucleótidos nativa usando mutagénesis dirigida al sitio, y se produjeron variantes de enzimas mutantes en células BL21 (DE3) de E. coli . A continuación, estas variantes de enzima se examinaron para determinar la actividad enzimática en lisados de células completas clarificados a pH 4 utilizando el análogo de hexapéptido de a-gliadina desactivado fluorescentemente QXL520-PQPQLP-K (5-FAM) -NH2 (FQ) (SEQ ID NO: 69) como un sustrato. De las 107 variantes de enzima probadas en este ensayo, el 13 % dio como resultado una pérdida de función enzimática, el 32 % no demostró una diferencia significativa en la actividad en relación con KumaWT y el 55 % dio como resultado un aumento en la actividad observada contra este sustrato. A continuación, se purificaron veintiocho de las variantes enzimáticas más prometedoras que mostraron un aumento significativo en la actividad en los lisados celulares para obtener una comparación precisa de la actividad enzimática con la de KumaWT. Después de la purificación y corrección de la concentración de proteínas, las actividades de estas enzimas variaron de 2 a 120 veces más activas que KumaWT (Tabla 1). La variante más activa, que se denominó KumaMax™, fue seleccionada para una caracterización adicional.

Tabla 1 Tasa de cambio en la actividad hidrolítica en el motivo PQ de todos los mutantes purificados y secuenciados, en relación con la Kumamolisina-As de tipo salvaje. Estos son los resultados de la tasa de cambio (calculada como se describe en la Tabla complementaria 1) para todos los mutantes que se purificaron, secuenciaron y probaron frente a Kumamolisina de tipo salvaje en el ensayo de proteína pura. El ensayo se realizó a pH 4, con una concentración final de enzima de 0,0125mg/mL y concentración de sustrato de 5 pM.

KumaMax™ contiene siete mutaciones de la secuencia de aminoácidos de tipo salvaje: V119D, S262K, N291D, D293T, G319S, D358G, D368H (Figura 2B). De estas, las mutaciones G319S, D358g y D368H parecen introducir sinérgicamente un nuevo enlace de hidrógeno con el residuo de glutamina deseado en la posición P1. Según el modelo, la mutación G319S parece introducir un grupo hidroxilo que se encuentra a 2,5 A del oxígeno carbonilo de la amida de glutamina, lo que potencialmente contribuye a un nuevo enlace de hidrógeno que interactúa con la glutamina en el bolsillo de PI. Se predice que la mutación D368H estabilizará el hidroxilo de serina y, a su vez, la mutación D358G permite estéricamente su posición en el sitio activo. Además de proporcionar una nueva interacción deseada con la glutamina según el modelo, estas tres mutaciones también eliminan los dos residuos ácidos que se predice que estabilizarán el residuo de arginina cargado positivamente en el sustrato KumaWT nativo (Figura 2). V119D, que se incorporó inesperadamente durante la mutagénesis dirigida al sitio, se encuentra en el dominio del propéptido y, por lo tanto, no afecta la actividad catalítica de la enzima madura. Las otras tres mutaciones no hacen contacto directo con los residuos en los bolsillos P2-P2' y, por lo tanto, probablemente introducen interacciones con otros componentes del hexapéptido, el fluoróforo o el inhibidor. Está claro que estas mutaciones son importantes para la mejora catalítica general observada, ya que el triple mutante G319S/D358G/D368H solo demostró solamente un aumento de 7 veces en la actividad catalítica sobre KumaWT; aproximadamente 17 veces más bajo que lo determinado para KumaMax™

Caracterización cinética y especificidad del sustrato

Se encontró que las eficiencias catalíticas para KumaMax™ y KumaWT contra el análogo de sustrato de gluten inmunogénico FQ, calculadas ajustando una curva de velocidad versus sustrato sobre un sustrato de 6-100 j M, fueron 568 M^{‘ 1}s^{' 1}y 4,9 M^’V , respectivamente (Tabla 2). Estos valores son consistentes con la observación de que KumaMax™ demostró un aumento de 120 veces en la actividad enzimática hacia el sustrato FQ en el cribado de actividad inicial mencionado anteriormente. Desafortunadamente, no se observó una saturación significativa de la velocidad a estas concentraciones de sustrato y, por lo tanto, no se pudieron determinar las constantes cinéticas individuales k^caty K^{m .}Esto no es sorprendente ya que los análisis previos de las constantes cinéticas de KumaWT reportan una Km de 40 j M. Por tanto, no se esperaría una saturación significativa a concentraciones de sustrato inferiores a 100 j M.

Tabla 2. Constantes cinéticas de sustratos peptídicos para KumaMax™ y KumaWT. La eficiencia catalítica (k^cat/K^MMV ) tanto para KumaWT como KumaMa™ para el péptido PQPQLP (Qu) desactivado con fluorescencia (Fl) (SEQ ID NO: 34) se ajustó a una curva lineal ya que no se observó saturación hasta el sustrato 100 j M. La señal de fluorescencia se cuantificó como se describe en Materiales y Procedimientos con una curva estándar que explica la inactivación del sustrato de la fluorescencia del producto. La eficacia catalítica de los péptidos unidos a pNA se determinó de forma similar y se describe en Materiales y Procedimientos. Todos los ajustes tuvieron al menos seis tasas medidas de forma independiente con un R²superior a 0,9. n.d. no detectado.

Si bien el aumento de la actividad de KumaMax™ en comparación con KumaWT contra el sustrato hexapéptido PQPQLP (SEQ ID NO: 34) inactivado por fluorescencia sugiere que KumaMax tiene una mayor preferencia por un motivo dipéptido PQ, no informa directamente sobre la especificidad del sustrato. Para confirmar que la especificidad de KumaMax™ de hecho se había alterado para preferir el dipéptido PQ sobre el dipéptido PR nativo de KumaWT, se proporcionaron cuatro péptidos en forma de succinil-alanina-P2-P1-P1' como sustratos para ambas enzimas con el fin de para evaluar la especificidad P2 y P1. Estos péptidos contenían el indicador p-nitroanilina (pNA) en la posición P1', lo que permite una lectura espectrométrica de la escisión del péptido. Los cuatro péptidos albergaban los siguientes aminoácidos en las posiciones P2 y P1, respectivamente: prolina-glutamina (PQ), prolina-arginina (PR), glutaminaprolina (QP) y prolina-glutamato (PE). Las eficiencias catalíticas se calcularon para cada sustrato y se informan en la Tabla 2. Como en la determinación de actividades catalíticas contra el sustrato FQ, no se observó saturación de actividad en estos péptidos por KumaWT o KumaMax™. Esto sugiere que el grupo pNA puede interrumpir parcialmente la unión en el bolsillo P1', ya que se probaron concentraciones de sustrato de hasta 1 mM, mucho más allá de los niveles de saturación informados previamente para sustratos KumaWT alternativos.

En este ensayo de especificidad, KumaMax™ demostró su nivel más alto de actividad en el sustrato PQ, el dipéptido que había sido diseñado para preferir. Si bien KumaMax™ no se diseñó explícitamente para demostrar una disminución en la especificidad para el motivo PR o para otros motivos, su mayor especificidad para PQ podría disminuir su actividad para motivos no diana. De hecho, KumaMax™ no mostró actividad catalítica significativa contra los sustratos QP o PR en este ensayo (Tabla 2). De acuerdo con informes anteriores14, KumaWT exhibió su nivel más alto de actividad en el motivo PR. KumaWT demostró niveles de actividad significativamente más bajos en los otros tres sustratos peptídicos. Si bien la actividad catalítica de KumaWT en el motivo dipéptido PQ se ha informado anteriormente14, no se observó actividad significativa en el sustrato dipéptido PQ en este ensayo, lo que puede deberse a los efectos disruptivos del pNA en la unión de este péptido al sitio activo de la enzima. Ambas enzimas demostraron actividad hacia el sustrato isostérico PE, que se predice que tiene carga neutra a pH 4; sin embargo, KumaMax™ demostró una disminución de aproximadamente 5 veces en la actividad sobre el sustrato del péptido PE en comparación con su actividad sobre el sustrato PQ, lo que ilustra su perfecta selectividad por el motivo dipéptido PQ.

Como se mencionó anteriormente, actualmente se están explorando varias enzimas como TEO para la enfermedad celíaca. Dos de estas enzimas son formas modificadas genéticamente de la prolil endopeptidasa SC PEP y la endoproteasa específica de glutamina EP-B215. Para comparar las eficiencias catalíticas de estas proteasas con las de KumaMax™, las enzimas SC PEP y EP-B2 nativas se expresaron en células BL21(DE3) de E. coli, se purificaron y se evaluaron sus actividades catalíticas. SC-PEP demostró una eficacia catalítica de 1,6 M 'V en el análogo del sustrato de gluten FQ a pH 4, lo que representa un nivel de actividad aproximadamente 350 veces menor en este sustrato que KumaMax™. A pH 4, Sc PEP no mostró ninguna actividad significativa en ninguno de los cuatro sustratos de péptidos unidos a pNA, incluyedo QP. Aunque estudios previos que utilizan péptidos ligados a pNA similares han demostrado actividad de SC PEP en estos sustratos, esos ensayos se realizaron a un pH de 4,5 o superior15. Al igual que otros grupos, encontramos que SC PEP demostró niveles significativos de actividad sobre el sustrato QP a pH 7, con una eficiencia catalítica de 2390 M'1s'1, confirmando así que esta SC PEP recombinante era completamente funcional (datos no mostrados). Esto es consistente con la bibliografía anterior que informa que SC PEP tiene niveles bajos o insignificantes de actividad catalítica en el intervalo de pH del estómago y, por lo tanto, solo se espera que sea efectivo una vez que los péptidos de a-gliadina hayan llegado al intestino delgado1516.

Para EP-B2, solo se detectaron niveles muy bajos de actividad en el sustrato FQ a pH 4, y no se observó actividad en ninguno de los cuatro sustratos peptídicos de pNA (datos no mostrados). Esto es incompatible con informes anteriores de la actividad de EP-B2 utilizando sustratos comparables11. EP-B2 es una enzima difícil de purificar, ya que forma cuerpos de inclusión en E. coli y requiere replegamiento para obtener la enzima activa. No pudimos obtener proteína soluble usando procedimientos previamente informados para el replegamiento de EP-B2111718, por lo que usamos un procedimiento de replegamiento en columna que resultó en la producción de proteína soluble. Aunque este EP-B2 soluble demostró la actividad de autoprocesamiento esperada a pH 411 (datos no mostrados), la falta de actividad de esta enzima sugiere que puede no haberse replegado correctamente usando nuestros procedimientos. Esto podría deberse a etiquetas de extremos N y C alternativas que surgen del uso de diferentes vectores de expresión de proteínas y justifica una mayor investigación.

Estabilidad de la proteasa.

Además de demostrar actividad catalítica a pH bajo, cualquier proteína terapéutica destinada a su uso en el tracto digestivo humano debe presentar resistencia a la degradación por proteasas digestivas. Dos de las proteasas más abundantes en el estómago y el intestino delgado son la pepsina y la tripsina, respectivamente. La pepsina demuestra una actividad proteolítica óptima en el intervalo de pH bajo del estómago, mientras que la tripsina es principalmente activa en el pH más neutro del intestino delgado. Para evaluar la resistencia de KumaMax™ a la degradación por estas proteasas, 0,01 o 0,1 mg/mL de KumaMax™ se incubaron con cada proteasa, en sus respectivos intervalos de pH óptimos, a 0,1mg/mL, que es una concentración fisiológicamente relevante tanto de pepsina como de tripsina. SC PEP y EP-B2 se incluyeron como controles, ya que se ha establecido que EP-B2 es resistente a la pepsina pero susceptible a la tripsina, y SC PEP demuestra susceptibilidad a ambas proteasas11'15. Cada proteína se incubó en presencia o ausencia de la proteasa respectiva durante 30 minutos, después de lo cual las proteínas se inactivaron por calor y la fracción no proteolizada restante se determinó usando un gel SDS-PAGE (Figura 3).

En este ensayo, KumaMax™ demostró una alta estabilidad contra la pepsina y la tripsina, con aproximadamente un 90 % de proteína intacta restante después de media hora de incubación con cualquiera de las proteasas (Figura 3). De acuerdo con informes anteriores, Sc PEP mostró susceptibilidad tanto a la pepsina como a la tripsina, quedando menos del 20 % de la enzima después de la incubación con estas proteasas. Como se esperaba, la tripsina proteolizó eficazmente el EP-B2 con menos del 10 % restante después de la incubación, pero no se observó una degradación significativa del EP-B2 en presencia de pepsina. Para confirmar que la degradación de la proteína observada se debió a la actividad de la proteasa y no al autoprocesamiento enzimático, cada enzima se incubó a pH 4 o 7 y se analizó la proteólisis aparente en ausencia de otras proteasas en el transcurso de una hora (datos no mostrados). KumaMax™ y EP-B2, pero no SC PEP, demostraron autoprocesamiento del propéptido a la forma de enzima activa en menos de 10 minutos a pH 4. Las tres proteínas permanecieron > 90 % estables en el transcurso de una hora. Ninguna de estas proteínas mostró niveles significativos de autoprocesamiento o proteólisis durante la incubación durante una hora a pH 7.

Degradación de un péptido de a9-gliadina inmunogénico

El nivel significativo de actividad catalítica exhibida por KumaMax™ en análogos de péptidos inmunogénicos (Tabla 2) demuestra ser prometedor para el uso de KumaMax™ como terapéutico en TEO para la intolerancia al gluten. Sin embargo, estos ensayos no evalúan directamente la capacidad de esta enzima para degradar péptidos inmunogénicos relevantes derivados del gluten. Por lo tanto, examinamos la actividad proteolítica directa de KumaMax™ hacia un péptido inmunodominante presente en a9-gliadina, QLQPFPQPQLPY (SEQ ID NO: 70).

KumaMax se incubó con 500 pM del péptido a9-gliadina a 37 °C en pH 4 a aproximadamente una relación molar de enzima a péptido de 1:100, que representa una concentración fisiológicamente relevante de este péptido en el estómago humano. Se incluyó SC PEP en este experimento con fines comparativos, ya que esta enzima demuestra una actividad significativamente menor contra el sustrato FQ que KumaMax™. Las muestras de la incubación se inactivaron cada 10 minutos en acetonitrilo al 80 % para detener la reacción de proteólisis. La fracción restante de péptido inmunogénico intacto se determinó mediante espectroscopía de masas por cromatografía líquida de alta resolución, donde se monitoreó el ion parental M+H del péptido a9-gliadina. KumaMax™ demostró un alto nivel de actividad contra el péptido inmunogénico en este ensayo, ya que más del 95 % del péptido inmunogénico se proteolizó después de una incubación de 50 minutos con KumaMax™, mientras que no se observó una degradación significativa del péptido en presencia de SC PEP o en ausencia de proteasa (Figura 4A). La vida media del péptido en presencia de KumaMax™ se determinó representando gráficamente la fracción de péptido restante frente al tiempo de incubación, y se calculó que era de 8,5 ± 0,7 minutos (Figura 4B).

DISCUSIÓN

La terapia con enzimas es un procedimiento atractivo para el tratamiento de la enfermedad celíaca, ya que esta forma de tratamiento no requiere inyección intravenosa. Sin embargo, es un desafío identificar una proteasa apropiada para su uso en TEO que demuestre todas las propiedades necesarias para ser un tratamiento efectivo para la enfermedad celíaca. Específicamente, una proteasa ideal para su uso en TEO mantendría la actividad en un intervalo de pH de 2 4 a 37 °C y resistiría la degradación por las proteasas digestivas comunes. Además, la proteína terapéutica idealmente demostraría una rigurosa especificidad por un motivo común que se encuentra en péptidos inmunogénicos derivados del gluten. Por último, la proteína debe producirse fácilmente mediante procedimientos recombinantes. Si bien es poco probable que una sola enzima natural abarque todas estas propiedades, demostramos que una proteína que contiene varias de estas características importantes se puede diseñar para demostrar las cualidades que faltan mediante análisis computacional, mutagénesis y cribado.

La proteasa diseñada, KumaMax™, demostró un alto nivel de actividad y especificidad hacia el motivo dipéptido PQ deseado (Tabla 2). La especificidad para el motivo PQ, a diferencia del motivo PR nativo, se deriva potencialmente de la adición de nuevos enlaces de hidrógeno en el bolsillo S1 de KumaMax que, según el modelo, hacen contactos directos con la glutamina en este motivo dipéptido (Figura 2B). Este cambio de especificidad no solo dirige la actividad contra un motivo que se encuentra comúnmente en todo el gluten, sino que también disminuye en gran medida la actividad contra sustratos no diana (Tabla 2). La incapacidad de una proteasa oral para reconocer sustratos no dirigidos es una característica importante, ya que reduce la inhibición competitiva por la gran cantidad de otros péptidos producidos en el estómago durante la digestión de una comida. KumaMax™ o KumaWT pueden actuar potencialmente como plataformas para diseñar una mayor especificidad, ya que KumaWT ha demostrado cierto nivel de selectividad más allá de los sitios P2 y P1-. Usando este procedimiento, podría generarse un panel de proteasas personalizadas específicas para epítopos inmunogénicos únicos.

PROCEDIMIENTOS

Expresión y purificación de proteínas

Los genes que codifican cada proteína de interés, alojados en el plásmido pET29b, se transformaron en células BL21(DE3) de Escherichia coli. Se recogieron colonias individuales, se inocularon en Terrific Broth™ con 50 pg/pL Kanamicina (TB+Kan), y se incubaron durante la noche a 37 °C. Se agregaron 500 uL del cultivo nocturno a 500 ml de medio de autoinducción (5 g de triptona, 2,5 g de extracto de levadura, 465 ml de ddH²O) y se agitó a 37 °C durante aproximadamente 4 horas. A continuación se agregaron los componentes de autoinducción (500 uL MgSO⁴, 500 uL 1000x metales de traza, 25 mL 20x NPS, 10 mL 20x 5052, 500 uL 50 mg/mL Kan). A continuación, los cultivos se agitaron a 18°C durante 30 horas antes de centrifugarlos. Los sedimentos se resuspendieron en 10 ml de PBS 1x, a continuación se lisaron mediante sonicación con 5 ml de tampón de lisis (HEPES 50 mM, NaCl 500 mM, bME 1 mM, 2 mg/mL lisozima, 0,2 mg/mL DNasa, ddH²O) y se centrifugaron. A continuación, las proteínas se purificaron sobre columnas de afinidad de cobalto TALON de 1 mL. KumaMax, KumaWT y SC Pep se lavaron tres veces con 20 mL de tampón de lavado (imidazol 10 mM, HEPES 50 mM, NaCl 500 mM, bME 1 mM, ddH²O) y a continuación se eluyeron en 15 ml de tampón de elución (imidazol 200 mM, HEPES 50 mM, NaCl 500 mM, bME 1 mM). EP-B2 tuvo que replegarse en la columna, por lo que, después de la lisis, los sedimentos se resuspendieron en 10 mL de tampón EP-B2, que se diferencia del tampón de lavado solo en que se diluye en clorhidrato de guanidina en lugar de ddH²O para permitir la desnaturalización de los cuerpos de inclusión EP-B2. Esta resuspensión se sedimentó y el sobrenadante (que contenía EP-B2 desnaturalizado) se filtró con un filtro de 0,8 pm sobre la columna. Se lavó EP-B2 una vez con 20 mL del tampón EP-B2, antes de lavarse dos veces con 20 mL del tampón de lavado para replegar la proteína en la columna. La proteína se eluyó con 15 ml de tampón de elución. Todas las proteínas se concentraron desde 15 ml hasta ~500 uL, a continuación se dializaron una vez en 1 L de tampón de diálisis (glicerol al 20 %, HEPES 50 mM, NaCl 500 mM, bME 1 mM). La concentración de proteína se calculó espectrofotométricamente con coeficientes de extinción de 53.985 M ^cirr¹para KumaWT y todas las variantes de KumaWT, 152.290 M^cirr¹para SC Pep, y 58.245 M^{' 1}cm^{' 1}para EP-B2.

Procedimiento de cribado

La mutagénesis de Kunkel se utilizó para generar mutaciones en KumaWT. Las colonias individuales recogidas de las placas se cultivaron en placas de 96 pocillos profundos. Después de lisar las células con tampón Triton (1 % 100X Triton, 1 mg/mL lisozima, 0,5 mg/mL DNasa, 1x PBS), el sobrenadante se ajustó a pH 4 con un tampón de acetato de sodio 100 mM. Para cribar crudamente la actividad contra el sustrato FQ, se añadieron 10 uL de sobrenadante a 90 uL de sustrato 5 pM en una placa negra de 96 pocillos, y se midió la fluorescencia a intervalos de 30 segundos durante 1 hora.

Ensayo de enzima purificada

Se secuenciaron las variantes de Kumamolisina-As que mostraron la mayor actividad en el sustrato FQ en el cribado de actividad, y a continuación se purificaron a pequeña escala. Se agregaron 500 uL de cultivos de TB+Kan durante la noche a 50 mL TB+Kan y se cultivaron a 37 °C hasta alcanzar una densidad óptica de 0,5-0,8. Se añadió IPTG a 0,5 mM y los cultivos se expresaron a 22 °C durante 16-24 horas. Las células se centrifugaron, se resuspendieron en 500 uL de tampón de lavado (1x PBS, imidazol 5 mM, ddH²O), se transfirieron a un tubo Eppendorf de 2 mL y se lisaron en 1 ml de tampón de lisis (1x PBS, imidazol 5 mM, 2x Bug Buster™, 2 mg/mL lisozima, 0,2 mg/mL DNasa, ddH²O). Después de la centrifugación, se decantó el sobrenadante en un tubo nuevo. Se colocaron columnas con 200 uL de resina de cobalto TALON en tubos Eppendorf, y el sobrenadante se vertió sobre las columnas y se agitó durante 20 minutos antes de centrifugar y descartar el flujo continuo. Las proteínas se lavaron tres veces con 500 ul de tampón de lavado, descartando el flujo entre lavados. Las enzimas se eluyeron en 200 pl de tampón de elución (1x PBS, imidazol 200 mM, ddH²O), y las concentraciones se calcularon espectrofotométricamente usando un coeficiente de extinción de 53.985 M ^cirr1.

Para el ensayo, los mutantes de Kumamolisina-As se incubaron durante 15 minutos en un tampón de acetato de sodio de pH 4100 mM. Se añadió enzima a un sustrato 5 pM de modo que la concentración final de proteína fuera de 0,0125 mg/mL. La fluorescencia se midió a intervalos de 30 segundos durante 1 hora.

Caracterización citogenética

La proclividad de la variante enzimática para la degradación del gluten se midió mediante hidrólisis del análogo de hexapéptido de a-gliadina desactivado fluorescentemente QXL520-PQPQLP-K (5-FAM) -NH2 (FQ) (SEQ ID NO:69) como sustrato. Cada enzima se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos en tampón de acetato de sodio 100 mM pH 4. Después de 15 minutos, se agregaron 50 uL de sustrato fluorescente con una concentración final entre 100, 50, 25, 12,5, 6,25 y 0 pM de péptido, y se mantuvieron concentraciones de 0,05 pM KumaMax™, 0,5 pM KumaWT, 0,5 pM SC Pep y EP-B2 0,5 pM en todas las variaciones en la concentración de sustrato. La placa se leyó inmediatamente en el espectrofotómetro durante una hora, usando una longitud de onda de 455 nm para la excitación y leyendo una longitud de onda de 485 nm para la emisión.

Las enzimas también se probaron para determinar su especificidad para diferentes motivos dipéptidos utilizando una variedad de sustratos cromogénicos que liberan p-nitroanilina (pNA) tras la hidrólisis: [Suc-APQ-pNA], [Suc-AQP-pNA], [Suc-APE-pNA], y [Suc-APR-pNA]. Nuevamente, cada enzima se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos en tampón de acetato de sodio 100 mM pH 4. Después de 15 minutos, se agregaron 20 uL de sustrato a la incubación de la enzima para que las concentraciones finales de sustrato oscilaran entre 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31.25, 15,625 y 0 pM, y todas las enzimas que se estaban probando terminaron en una concentración de 0,5 pM. La placa se leyó inmediatamente en el espectrofotómetro durante una hora, controlando la absorción por las reacciones a 385 nm.

La curva estándar para el péptido fluorescente implicaba mezclar el sustrato y el producto en concentraciones variables en tampón de pH 4. Las concentraciones de sustrato fueron 100, 50, 25, 12,5, 6,25 y 0 pM, y las concentraciones de producto fueron 20, 5, 1,25, 0,3125, 0,078125, 0 pM.

La curva estándar para el péptido absorbente implicaba concentraciones de producto de 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,5625, 0,78125, 0,390625, 0,1953125, 0,09765625 y 0 pM diluido en tampón de pH 4.

Estabilidad de la proteasa.

La estabilidad enzimática se determinó en presencia de las proteasas digestivas, pepsina y tripsina. Se incubaron KumaWT, KumaMax™, SC Pep y EP-B2 en un tampón que coincidía con el entorno de pH nativo de cada proteasa digestiva. Se usó acetato de sodio 100 mM pH 3,5 para preincubar las enzimas para los ensayos de digestión con pepsina, y tampón de diálisis de pH 7,5 (ver "Expresión y purificación de proteínas") para los ensayos de digestión con tripsina. Cada enzima experimental se incubó a 37 °C durante 15 minutos en cada tampón, a una concentración de 0,2 mg/mL.

Después de la preincubación en el tampón apropiado, se añadió proteasa digestiva 0,1 mg/mL. Las reacciones se realizaron por triplicado y se incubaron a 37 °C durante 30 minutos. Agregar SDS y hervir durante 5 minutos aseguró la inactivación de la proteasa digestiva. Un gel SDS-PAGE permitió la cuantificación de la degradación de la enzima, utilizando ImageJ.

La tasa de autoproteólisis de proteínas se determinó a pH 4 y 7,5 en ausencia de pepsina o tripsina. Cada enzima, a una concentración de 0,2 mg/mL, se incubó en acetato de sodio 100 mM a pH 4 y tampón de diálisis a pH 7,5. Se tomaron puntos de tiempo a los 20, 40 y 60 minutos. Se añadió SDS y las alícuotas se hirvieron durante 5 minutos para asegurar la desnaturalización de las enzimas y la inhibición de la autoproteolisis adicional. De nuevo, un gel SDS-PAGE junto con ImageJ permitió la cuantificación de la autoproteólisis enzimática.

Ensayo de degradación de gliadina LCMS

La actividad enzimática en a9-gliadina de longitud completa se midió mediante espectrometría de masas por cromatografía líquida de alta resolución. Para cada enzima, se añadieron 7 pL de tampón de acetato de sodio 1M pH 4 a 28 pL de enzima 5 pM y se incubaron junto con tubos separados de 3 pL de gliadina a 37 °C durante 15 minutos. A continuación, se añadieron a cada tubo de gliadina 27 pL de cada mezcla de enzimas y 27 pL de tampón de diálisis como control. Estos se incubaron una vez más a 37 °C y se tomaron muestras de 5 pL a los 10, 20, 30, 40 y 50 minutos. Cada muestra de punto de tiempo se inactivó en 95 pL de acetonitrilo al 80 % con 1 % ácido fórmico y aproximadamente 33 pM de leupeptina. Las muestras se analizaron en HPLC para comparar la degradación de gliadina por las diferentes proteasas a lo largo del tiempo.

Bibliografía

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al menos en un 75 % a una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 35, y un vehículo farmacéuticamente aceptable; donde

el polipéptido comprende un cambio de aminoácido de SEQ ID NO: 67 en uno o más residuos seleccionados de entre el grupo que consiste en los residuos de aminoácidos 73, 102, 103, 104, 130, 165, 168, 169, 172 y 179;

para su uso en un procedimiento de:

- tratar el esprúe celíaco en una persona que lo necesite,

- tratar una reacción inflamatoria al gluten en una persona que lo necesite, o

- tratar la intolerancia al gluten en una persona que lo necesite.

2. La composición farmacéutica para su uso en un procedimiento según la reivindicación 1, donde el procedimiento trata el esprúe celíaco en un individuo que lo necesita.

3. La composición farmacéutica para usar en un procedimiento según la reivindicación 1, donde el procedimiento es degradar la gliadina en una comida ingerida por un individuo que necesita tal tratamiento.

4. La composición farmacéutica para usar en un procedimiento según la reivindicación 1, donde el procedimiento trata una reacción inflamatoria al gluten en un individuo que lo necesita.

5. La composición farmacéutica para su uso en un procedimiento según la reivindicación 1, donde el procedimiento trata la intolerancia al gluten en un individuo que lo necesita.

6. La composición para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde la composición farmacéutica se administra durante la digestión.

7. La composición farmacéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde la composición farmacéutica se administra antes o después de la ingestión de una comida.

8. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 7, donde la comida comprende gluten.

9. La composición farmacéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 7-8, donde la comida comprende uno o más ingredientes seleccionados de entre el grupo que consiste en trigo, cebada y centeno.

10. La composición farmacéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al menos en un 90 % a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35.

11. La composición farmacéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al menos en un 95 % a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35.

12. La composición farmacéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde uno o más cambios de aminoácidos se seleccionan de entre el grupo que consiste en:

residuo 102 D,

residuo 103 : S;

residuo 104 A, T y N

residuo 130 : S;

residuo 165 N;

residuo 168 : A;

residuo 169 N, y G;

residuo 172 : D; y

residuo 179 S y H.

13. La composición farmacéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, donde si el cambio de aminoácido es en el residuo 73, el aminoácido del residuo 73 no es N.

14. La composición farmacéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-13, donde el cambio de aminoácido de la SEQ ID NO:67 está en uno o más residuos seleccionados de entre el grupo que consiste en los residuos de aminoácidos 102, 103 y 104.

15. La composición farmacéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-14, donde el cambio de aminoácido de la SEQ ID NO:67 está en uno o más residuos seleccionados de entre el grupo que consiste en los residuos de aminoácidos 130, 165, 168 y 169.

16. La composición farmacéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-15, donde el cambio de aminoácido de la SEQ ID NO:67 está en el residuo de aminoácido 179.

17. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-16, donde el pH es de 2 a 4.

18. La composición farmacéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-16, donde el pH es 4.