CN111848776B - 聚乙二醇修饰的rhBNP及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种聚乙二醇修饰的rhBNP及其制备方法。具体地，本发明提供了一种新的聚乙二醇修饰的rhBNP制备方法，并基于该方法制备了相应的聚乙二醇修饰的rhBNP的药物组合物。本发明的方法可以提高rhBNP的N‑末端单聚乙二醇化的专一性及产品纯度，可以得到基本均一的N‑末端单PEG修饰的rhBNP产品。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，更具体地涉及一种聚乙二醇修饰的rhBNP及其制备方法。
背景技术
B型尿钠肽，又称脑尿钠肽(Brain natriuretic peptide，BNP)，是由心肌细胞合成的具有生物学活性的天然激素，主要在心室表达，主要用于调节心脏功能。心肌细胞所分泌的BNP先以108个氨基酸组成的前体形式存在，当心肌细胞受到刺激时，在活化酶的作用下裂解为由76个氨基酸组成的无活性直线多肽氨基端片段(1-76aa)和32个氨基酸组成的有活性环状多肽BNP-32释放入血循环，分别被称为NT-proBNP和BNP。
蛋白治疗药物rhBNP的生物利用度通常受血浆半衰期的限制，并且对蛋白酶降解敏感，阻碍了最大的临床潜能。市售rhBNP均为短效产品，半衰期为18分钟，且需要慢速静脉滴注24小时以上，这给病人带来很大痛苦。
PEG-rhBNP就是用PEG(聚乙二醇)对rhBNP进行修饰，从而降低rhBNP的免疫原性并延长其半衰期。但是PEG修饰rhBNP存在多种杂质，如未反应的原料：PEG、rhBNP；如多取代的PEG-rhBNP：di-PEG-rhBNP、tri-PEG-rhBNP；如其它取代单位的PEG-rhBNP，等杂质的大量存在，对产品质量产生一定影响。
因此，本领域迫切需要开发一种新的聚乙二醇修饰的rhBNP制备方法，提高rhBNP的N-末端单聚乙二醇化的专一性及产品纯度。
发明内容
本发明的目的在于提供一种聚乙二醇修饰的rhBNP及其制备方法。
本发明另一方面还提供一种上述N-末端mono-PEG-rhBNP药物组合物，包含上述N-末端mono-PEG-rhBNP药物活性组合物及药学上可接受的载体，通常将其制成冻干制品或者液体制品，优选冻干粉针剂，这些制剂可采用本领域一般技术人员公知的相应辅料，采用相应公知的药物制剂的制备技术制得。
本发明另一方面还提供上述N-末端mono-PEG-rhBNP药物活性组合物或包含其的药物组合物在制备用于治疗以心力衰竭为特征的疾病的药物中的应用。
在本发明的第一方面，提供了一种修饰型rhBNP的制备方法，包括步骤：
(a)将rhBNP与聚乙二醇进行偶联反应，从而获得修饰型rhBNP粗品；和
(b)对步骤(a)获得的修饰型rhBNP进行纯化处理，从而获得所述的修饰型rhBNP。
在另一优选例中，所述的步骤(b)包括：
(b1)对步骤(a)获得的修饰型rhBNP进行第一次离子交换层析，利用柠檬酸和氯化钠的柠檬酸盐缓冲液进行梯度洗脱，收集经证实含修饰型rhBNP的洗脱峰，从而获得含所述修饰型rhBNP的洗脱液I，和
(b2)对步骤(b1)获得的洗脱液I进行第二次离子交换层析，利用磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液进行洗脱，收集洗脱峰，从而获得所述修饰型rhBNP。
在另一优选例中，在步骤(b1)中，利用SP Sepharose Fast Flow色谱柱进行第一次离子交换层析。
在另一优选例中，在步骤(b1)中，利用缓冲液A和缓冲液B进行梯度洗脱，其中，所述的缓冲液A为5-20mM，较佳地8-12mM的柠檬酸缓冲液，所述缓冲液B为缓冲液A的1M氯化钠的混合溶液。
在另一优选例中，在步骤(b1)中，所述的洗脱峰为经电泳证实含修饰型rhBNP的洗脱峰2。
在另一优选例中，在步骤(b1)中，利用缓冲液A对步骤(a)获得的修饰型rhBNP粗品进行稀释，稀释后的修饰型rhBNP粗品的浓度为100-350μg/mL。
在另一优选例中，在步骤(b1)中，稀释后的修饰型rhBNP的上样流速为5cm/min±20％，较佳地为4.5-5.5cm/min。
在另一优选例中，在步骤(b1)中，稀释后的修饰型rhBNP的上样量为15-25个柱体积。
在另一优选例中，在步骤(b1)中，在进行洗脱前，先用所述缓冲液A进行冲洗，较佳地，用缓冲液A以3cm/min±10％的流速冲洗2个柱体积。
在另一优选例中，在步骤(b1)中，以缓冲液A和缓冲液B以5cm/min±20％的流速梯度洗脱15-25个柱体积。
在另一优选例中，在步骤(b1)中，所述梯度为0至90％±10％。
在另一优选例中，在步骤(b1)中，所述的洗脱峰为经电泳证实含修饰型rhBNP的洗脱峰4。
在另一优选例中，在步骤(b2)中，利用SP Sepharose Fast Flow色谱柱进行第二次离子交换层析。
在另一优选例中，在步骤(b2)中，利用柠檬酸-氯化钠的柠檬酸盐缓冲液对步骤(b1)获得的洗脱液I进行稀释，稀释后的修饰型rhBNP的浓度为100-350μg/mL。
在另一优选例中，在步骤(b2)中，在进行洗脱前，先用磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液进行平衡，其中，所述磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液的浓度为10-30mM，较佳地15-25mM。
在另一优选例中，在步骤(b2)中，以5cm/min±20％的流速进行冲洗。
在另一优选例中，在步骤(b2)中，所述磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液的洗脱流速为5cm/min±20％。
在另一优选例中，在步骤(b2)中，进行洗脱的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液的浓度为5-20mM，较佳地8-12mM。
在另一优选例中，在步骤(b2)中，所述洗脱为等度洗脱。
在另一优选例中，在步骤(b2)中，还包含去除洗脱峰4中包含的水分的步骤。
在另一优选例中，在步骤(a)中，在还原剂存在的条件下进行所述偶联反应，较佳地，所述的还原剂选自下组：氰基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠、醋酸硼氢化钠、硼氢化钠、或其组合。
在另一优选例中，所述的还原剂为氰基硼氢化钠。
在另一优选例中，在pH3-7，较佳地在pH4-6的条件下，进行偶联反应。
在另一优选例中，利用缓冲溶液调节pH，较佳地，所述缓冲溶液为醋酸缓冲液或柠檬酸缓冲液。
在另一优选例中，所述偶联反应的反应时间为4-20小时，较佳地为8-18小时，更佳地为10-14小时。
在另一优选例中，所述的偶联反应的反应温度为0-28℃，较佳地为10-25℃；更优选地，为15-25℃。
在另一优选例中，所述聚乙二醇与所述rhBNP的摩尔比为1：(0.2-4)，较佳地为1：(0.5-3)，更佳地为1：(0.8-2)。
在另一优选例中，所述步骤(a)包括：
(a1)将rhBNP和聚乙二醇混合，调节pH为4-6，从而获得反应混合液，其中所述聚乙二醇与所述rhBNP的摩尔比为1：(0.5-3)，
(a2)在0-28℃的条件下，将步骤(a)反应混合液在搅拌条件下反应4-20小时；
(a3)对步骤(b)所得的混合液进行分离，从而获得所述修饰型rhBNP。
在另一优选例中，步骤(a1)中，所述的反应混合物中，所述rhBNP的浓度为0.5-8mg/ml，较佳地为1-6mg/ml。
在另一优选例中，步骤(a1)中，所述的缓冲溶液为柠檬酸缓冲液或醋酸缓冲液。
在另一优选例中，步骤(a2)中，所述的反应混合物在10-25℃下反应，较佳地，在15-25℃下反应。
在另一优选例中，步骤(a2)中，在还原剂存在的条件下进行所述反应。
在另一优选例中，所述的还原剂选自下组：氰基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠、醋酸硼氢化钠、硼氢化钠、或其组合。
在另一优选例中，所述还原剂与所述rhBNP的摩尔比为(3-10)：1，较佳地为(5-7)：1。
在另一优选例中，所述的修饰型rhBNP的聚乙二醇修饰率为60-99％。
在另一优选例中，所述聚乙二醇与rhBNP的N端的丝氨酸残基偶联，较佳地，所述聚乙二醇与丝氨酸残基的氨基、羟基中的一种进行偶联。
在另一优选例中，所述修饰型rhBNP的一个或多个氨基酸残基与聚乙二醇偶联(经聚乙二醇进行偶联修饰)。
在另一优选例中，所述的rhBNP的序列如SEQ ID NO:1所示(SPKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH)。
在另一优选例中，所述的聚乙二醇(即PEG)与氨基酸残基中氨基、巯基、羧基、羟基中的至少一种进行偶联。
在另一优选例中，所述的聚乙二醇为甲氧基聚乙二醇(即mPEG)及其衍生物。
在另一优选例中，所述聚乙二醇为烷基化聚乙二醇或醛基化聚乙二醇。
在另一优选例中，所述甲氧基聚乙二醇衍生物的通式如下：
mPEG-X,
其中，X为官能团。
在另一优选例中，所述的官能团为烷基化官能团或酰基化官能团。
在另一优选例中，所述官能团为烷基化官能团，且所述的聚乙二醇为mPEG-醛、mPEG-三氟乙磺酸。
在另一优选例中，所述聚乙二醇选自下组：甲氧基聚乙二醇甲醛、甲氧基聚乙二醇乙醛、甲氧基聚乙二醇丙醛、甲氧基聚乙二醇丁醛、甲氧基聚乙二醇戊醛、或其组合。
在另一优选例中，所述聚乙二醇为甲氧基聚乙二醇丙醛。
在另一优选例中，所述官能团为酰基化官能团，且所述的聚乙二醇为mPEG-对硝基苯碳酸酯。
在另一优选例中，所述聚乙二醇的分子量为5KD-80KD，较佳地为10-30KD，更佳地为15-25KD。
在另一优选例中，所述聚乙二醇的分子量选自下组：5KD、10KD、20KD、30KD、40KD、50KD、或其组合。
在另一优选例中，所述聚乙二醇的分子量为10KD、20KD或30KD，较佳地为20KD。
在另一优选例中，所述的聚乙二醇通过rhBNP的N端氨基修饰于所述的rhBNP上。
在另一优选例中，所述修饰型rhBNP的N端氨基与聚乙二醇偶联。
在另一优选例中，所述修饰型rhBNP的N端氨基与聚乙二醇醛衍生物进行偶联。
在另一优选例中，所述修饰型rhBNP为N-末端mono-PEG-rhBNP。
在另一优选例中，所述的组合物包含修饰型rhBNP和聚乙二醇，其中，所述修饰型rhBNP的含量≥80％，较佳地≥85％，更佳地≥92％；
并且，所述修饰型rhBNP中，仅rhBNP的N端丝氨酸残基的氨基、羟基中的一种与聚乙二醇偶联。
在另一优选例中，所述修饰型rhBNP仅包含一个与N端丝氨酸残基偶联的聚乙二醇。
在另一优选例中，所述的组合物是权利要求1所述方法制备的。
在另一优选例中，所述组合物中聚乙二醇的含量≤2％，较佳地≤1.3％，更佳地≤0.9％。
在另一优选例中，所述组合物中还包含选自下组的杂质：
在另一优选例中，所述组合物中还包含选自下组的杂质：
rhBNP、未修饰的rhBNP、非N-末端mono-PEG-rhBNP、di-PEG-rhBNP、tri-PEG-rhBNP、或其组合。
在另一优选例中，所述杂质的含量≤6.5％，较佳地≤3.8％，更佳地≤2％。
在另一优选例中，所述组合物中还包含未修饰的rhBNP，并且所述未修饰的rhBNP的含量≤2％，较佳地≤1.8％。
在另一优选例中，所述非N-末端mono-PEG-rhBNP是由rhBNP的三个赖氨酸残基中的任一个与聚乙二醇偶联所形成的。
在另一优选例中，所述di-PEG-rhBNP是由rhBNP的三个赖氨酸残基中的任两个与聚乙二醇偶联所形成的。
在另一优选例中，所述tri-PEG-rhBNP是由rhBNP的三个赖氨酸残基同时与聚乙二醇偶联所形成的。
在另一优选例中，所述的非N-末端mono-PEG-rhBNP、di-PEG-rhBNP、tri-PEG-rhBNP中，rhBNP的N端的丝氨酸残基可以与聚乙二醇偶联，也可以不与聚乙二醇偶联。
在另一优选例中，所述的组合物利用权利要求1所述的方法制备。
在另一优选例中，所述的组合物为药物组合物。
在另一优选例中，所述的组合物还包含药学上可接受的载体。
在另一优选例中，用于制备治疗心脏疾病的药物。
在另一优选例中，所述的心脏疾病包括心力衰竭。
在另一优选例中，所述的心脏疾病为人心脏疾病。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了PEG10KD-rhBNP(实施例2制备)阳离子交换色谱法层析洗脱示意图(从左到右峰分别为多修饰峰、单修饰峰、未修饰峰，分别为洗脱峰1、洗脱峰2、洗脱峰3)
图2显示了PEG20KD-rhBNP/BNP药-时曲线，其中，上方曲线为PEG20KD-rhBNP的药-时曲线，下方曲线为BNP的药-时曲线。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现一种新的聚乙二醇修饰的rhBNP制备方法，并基于该方法制备了相应的聚乙二醇修饰的rhBNP的药物组合物。本发明的方法可以提高rhBNP的N-末端单聚乙二醇化的专一性及产品纯度，可以得到基本均一的N-末端单PEG修饰的rhBNP产品。
本申请的发明人长期致力于PEG化rhBNP的研究工作，通过对用现有技术方法制备得到的PEG-rhBNP产品进行研究，发现产品中主要存在以下杂质：
(1)未反应完的原料，如：PEG，rhBNP；
(2)其它取代位置的单(mono)取代PEG-rhBNP；
(3)多取代的PEG-rhBNP，如di-PEG-rhBNP、tri-PEG-rhBNP；
(4)其它杂质。
发明人通过大量研究发现，当产品中N末端mono-PEG-rhBNP纯度达到92％以上，上述(2)-(3)类杂质总和含量≤7.8％，且(1)类杂质中BNP含量≤4％，(4)类杂质含量＜0.2％时，产品质量基本均一，且动物实验表明产品安全有效。因此，发明人对用现有技术方法制备得到的PEG-rhBNP粗品的纯化方法进行了研究，终于找到一种能够使N末端mono-PEG-rhBNP纯度达到96％以上，且各类杂质能够降到上述指标甚至更低以下，从而提高了PEG-rhBNP的质量稳定性，保障了其临床用药安全。
在此基础上，本发明的提供了一种N-末端mono-PEG-rhBNP药物活性组合物，其特征在于，包括以下组分：
组分I：N-末端mono-PEG-rhBNP，纯度≥92.0％；
组分II：选自rhBNP、非N-末端mono-PEG-rhBNP、di-PEG-rhBNP、tri-PEG-rhBNP中的一种或几种，0≤含量≤6.5％，且0≤rhBNP含量≤2.0％；
组分III:PEG，0≤含量≤1.3％；以及残余量杂质，含量＜0.2％。
在另一优选例中，所述药物活性组合物包括以下组分：
组分I：N-末端mono-PEG-rhBNP，纯度≥95.0％；
组分II：选自rhBNP、非N-末端mono-PEG-rhBNP、di-PEG-rhBNP、tri-PEG-rhBNP中的一种或几种，0≤含量≤3.8％，且0≤rhBNP含量≤1.8％；
组分III:PEG，0≤含量≤1.0％；以及残余量杂质，含量＜0.2％。
在另一优选例中，所述药物活性组合物包括以下组分：
优选地，组分I：纯度≥97.0％；
组分II：选自rhBNP、di-PEG-rhBNP中的一种或两种，0≤含量≤2.0％；组分III：0≤PEG含量≤0.9％。以及残余量杂质，含量＜0.1％。
上述任一药物活性组合物中，所述PEG优选为分子量为20kDa的PEG10kDa的PEG或者5kDa的PEG中一种。
rhBNP序列中的3个赖氨酸为PEG的结合位点，因此，上述药物活性组合物中，所述mono-PEG-rhBNP指的是，3个结合位点中，任一位点与PEG结合的PEG-rhBNP；
非N-末端mono-PEG-rhBNP指的是，除N-末端外，其它任一结合位点形成的mono-PEG-rhBNP；所述di-PEG-rhBNP指的是，3个结合位点中任意两个位点结合PEG的PEG-rhBNP；所述tri-PEG-rhBNP指的是，3个结合位点结合PEG的PEG-rhBNP。
本发明中，所述组分I的纯度为SEC-HPLC法测定的结果(具体方法参照《中国药典》，2015年)
本发明还提供了一种上述N-末端mono-PEG-rhBNP药物活性组合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)离子交换色谱法层析a:将N-末端mono-PEG-rhBNP粗品用SP Sepharose FastFlow离子交换色谱法层析，包括上样、冲洗、梯度洗脱步骤；
(2)离子交换色谱法层析b：将离子交换层析富含N-末端mono-PEG-rhBNP的收集峰用SP Sepharose Fast Flow柱进行析，包括上样、后平衡、洗脱步骤，得N-末端mono-PEG-rhBNP。
上述制备方法中，离子交换色谱法层析a和离子交换色谱法层析b上样所用缓冲液相同，为10mM柠檬酸缓冲液，任选地，可加入少量表面活性剂，所述表面活性剂优选为0.004％吐温-80溶液，下文中将10mM柠檬酸缓冲液简称为缓冲液A；离子交换色谱法层析中的梯度洗脱步骤所用缓冲液为10mM柠檬酸缓冲液与氯化钠溶液，所述氯化钠溶液浓度优选为1M，所述表面活性剂优选为0.004％吐温-80溶液，下文将缓冲液A与1M氯化钠的混合溶液简称缓冲液B。
进一步地，所述N-端mono-PEG-rhBNP药物活性组合物的制备方法，包括以下步骤:
(1)离子交换色谱法层析a：将N-末端PEG-rhBNP粗品用SP Sepharose Fast Flow离子交换色谱法层析，包括：
①上样：将N-末端PEG-rhBNP粗品以缓冲液A稀释上样；
②冲洗：以缓冲液A冲洗15-25个柱体积；
③梯度洗脱：以缓冲液A及缓冲液B梯度洗脱，收集经电泳证实含修饰型rhBNP的第二个洗脱峰，即洗脱峰2；
(2)离子交换色谱法层析b：将离子交换层析a收集峰2用SP Sepharose Fast Flow进行离子交换色谱法层析换液，包括：
①上样：将离子交换层析(1)收集峰2用缓冲液A上样；
②后平衡：用缓冲液C进行平衡；
③洗脱：以缓冲液50％C洗脱，收集洗脱峰4，洗脱峰4即N-末端PEG-rhBNP；
所述缓冲液A为10mM柠檬酸缓冲液；
所述缓冲液B为缓冲液A与1M氯化钠的混合溶液；
所述缓冲液C为20mM磷酸氢二钠和一水磷酸二氢钠缓冲液。
更进一步的，所述N-末端mono-PEG-rhBNP药物活性组合物的制备方法，包括以下步骤:
(1)离子交换色谱法层析：将N-末端PEG-rhBNP粗品用SP Sepharose Fast Flow离子交换色谱法层析，包括：
①上样：将N-末端PEG-rhBNP粗品以缓冲液A稀释至100-350μg/mL，以5cm/min±20％的流速上样；
②冲洗：以缓冲液A以3cm/min±10％的流速冲洗2个柱体积；
③梯度洗脱：以缓冲液A及缓冲液B以5cm/min±20％的流速梯度洗脱20个柱体积，所述梯度为0至90％±10％，收集经证实含修饰型rhBNP的洗脱峰2；
(2)离子交换色谱法层析：将离子交换层析(1)收集峰2用SPSepharose Fast Flow进行离子交换色谱法层析换液，包括：
①上样：将将离子交换层析a用缓冲液A稀释至100-350μg/mL,以5cm/min±20％的流速上样；
②后平衡：用缓冲液C以5cm/min±20％的流速进行平衡；
③洗脱：以缓冲液50％C以5cm/min±20％的流速洗脱，收集洗脱峰4，洗脱峰4即N-末端PEG-rhBNP。
所述PEG10KD-rhBNP洗脱峰1-3参见附图1。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明的修饰型rhBNP半衰期长，给药频次小。
(b)本发明的修饰型rhBNP所用的序列与人体异源性小，不易产生免疫反应。
(c)本发明的修饰型rhBNP操作简便。
(d)本发明的修饰型rhBNP生物活性高于其它长效修饰方式。
(e)本发明的修饰型rhBNP无毒副作用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1 5KD mPEG丙醛与rhBNP的反应
量取16ml生物合成的浓度为4mg/ml的rhBNP，称取92.38mg 5KD mPEG丙醛(甲氧基聚乙二醇丙醛)溶于量取的rhBNP，用柠檬酸缓冲液调节pH5，25℃条件下混匀5分钟(rhBNP与5KD mPEG丙醛的摩尔比为1:1)。添加还原剂三乙酰氧基硼氢化钠(rhBNP与三乙酰氧基硼氢化钠的摩尔比为1:5)，反应10小时。
通过阳离子交换层析柱，使用酸性pH的NaCl梯度，在SP Sepharose Fast Flow柱(GE)上将聚乙二醇化的化合物与游离PEG及游离多肽分离，得到PEG 5KD-rhBNP。
实施例2 10KD mPEG丙醛与rhBNP的反应
量取16ml生物合成的浓度为4mg/ml的rhBNP，称取184.76mg 10KD mPEG丙醛(甲氧基聚乙二醇丙醛)溶于量取的rhBNP，用柠檬酸缓冲液调节pH4.8，25℃条件下混匀5分钟(rhBNP与10KD mPEG丙醛的摩尔比为1:1)。添加还原剂氰基硼氢化钠(rhBNP与氰基硼氢化钠的摩尔比为1:7)，反应14小时。
通过阳离子交换层析柱，使用酸性pH的NaCl梯度，在SP Sepharose Fast Flow柱(GE)上将聚乙二醇化的化合物与游离PEG及游离多肽分离，得到PEG10KD-rhBNP。
实施例3 20KD mPEG丙醛与rhBNP的反应
量取8ml生物合成的浓度为4mg/ml的rhBNP，称取184.76mg 20KD mPEG丙醛(甲氧基聚乙二醇丙醛)溶于量取的rhBNP，用柠檬酸缓冲液调节pH5，25℃条件下混匀4分钟(rhBNP与20KD mPEG丙醛的摩尔比为1:1)。添加还原剂氰基硼氢化钠(rhBNP与三乙酰氧基硼氢化钠的摩尔比为1:5)，反应10小时。
通过阳离子交换层析柱，使用酸性pH的NaCl梯度，在SP Sepharose Fast Flow柱(GE)上将聚乙二醇化的化合物与游离PEG及游离多肽分离，得到PEG20KD-rhBNP。
实施例4离子交换色谱法层析
(1)第一次离子交换色谱法层析：将N-末端PEG-rhBNP粗品用SP Sepharose FastFlow离子交换色谱法层析，包括：
①上样：将N-末端PEG-rhBNP粗品以缓冲液A(10mM柠檬酸缓冲液)稀释至100-350μg/mL，以5cm/min±20％的流速上样；
②冲洗：以缓冲液A以3cm/min±10％的流速冲洗2个柱体积；
③梯度洗脱：以缓冲液A及缓冲液B(缓冲液A的1M氯化钠的混合溶液)以5cm/min±20％的流速梯度洗脱20个柱体积，所述梯度为0至90％±10％，收集经电泳检验含目标产物的洗脱峰；
(2)第二次离子交换色谱法层析：将第一次离子交换层析收集经电泳检验含目标产物的洗脱峰用SP Sepharose Fast Flow进行离子交换色谱法层析换液，包括步骤：
①上样：将第一次离子交换层析的含目标产物的洗脱峰(第一次离子交换层析的收集峰2)用缓冲液A稀释至100-350μg/mL，以5cm/min±20％的流速上样；
②后平衡：用缓冲液C(20mM磷酸氢二钠和一水磷酸二氢钠缓冲液)以5cm/min±20％的流速进行平衡；
③洗脱：以缓冲液50％C(20mM磷酸氢二钠和一水磷酸二氢钠缓冲液)以5cm/min±20％的流速洗脱，收集含目标产物的洗脱峰(洗脱峰4)，即获得N-末端PEG-rhBNP。
实施例5体外活性测定
根据BNPR信号转导通路，BNP与天然受体结合后，可激活其胞内区的鸟苷酸环化酶活性，催化GTP转化为cGMP,继而发挥生物学效应，通过竞争性的Elisa试验方法检测BNP刺激后293GCAC3细胞(GCA高表达的人肾上皮细胞系)分泌到细胞上清中的cGMP含量变化，即可判断BNP活性能力。
接种293GCAC3细胞至96孔板，细胞密度为1.0*105个/ml。加入不同浓度的工作标准品和供试品适量,37℃培养箱中培养1.5h，取细胞上清液50ul至96孔酶标板中，酶标板预先加入合适浓度抗cGMP多抗溶液，600rpm震荡3小时，弃去上清，加100ul显色液，室温避光10-15min,加100ul终止液，显色反应结束后15min在酶标仪450nm处检测样品吸光值并计算酶活。
数据处理和统计分析
EC50为引起50％最大效应时的浓度值，可以反映出配体对受体的激动活性，是研究配体和受体之间结合、激动的一个重要指标。利用cGMP的表达量对应药物刺激的浓度可以用SoftMax软件绘制出rhBNP(SEQ ID NO：1)、PEG5KD-rhBNP(实施例1制备)、PEG10KD-rhBNP(实施例2制备)和PEG20KD-rhBNP(实施例3制备)的EC50曲线。
计算方法为：
以样品的稀释倍数为X轴，以其450nm吸光度为Y轴，用SoftMax软件以四参数回归计算法进行处理，拟合方程为
ABCD为四个曲线拟合参数，四个参数生物学意义为：
A:上平台OD值
B：斜率
C：供试样品生物学活性，即半数有效稀释倍数
体外活性测定的实验结果，如表1所示，显示了基于未修饰的rhBNP，各个修饰的rhBNP的生物学活性比值。
表1
实施例6静脉推注给药对戊巴比妥钠致心衰新西兰兔的治疗作用
按照实施例3中方法用20KD PEG丙醛修饰rhBNP,纯化后得到高纯度的PEG20-rhBNP，用于后续动物实验。
约6-8月龄新西兰兔32只随机分为4组：
1)PBS对照组。
2)9μg/kg PEG20KD-rhBNP组；
3)18μg/kg PEG20KD-rhBNP组；
4)27μg/kg PEG20KD-rhBNP组；
戊巴比妥至心衰模型成模，立即以9ug/kg、18ug/kg、27ug/kg进行冲击剂量治疗，分别以0.045ug/kg/min、0.090ug/kg/min、0.135ug/kg/min给药。
开始给药后60分钟及给药结束后120分钟进行血流动力学检查。左心室收缩压见表2。
表2
*给药组与溶媒对照组比较*p<0.05**p<0.01溶媒对照组，因心衰时间较长未给予治疗最终导致死亡
新西兰兔体重(3.5kg±0.3kg)，单次耳缘静脉推注给药2小时候后，左心室收缩压(LVSP)升高，表明本品对左心功能改善和恢复均有药效作用，且呈剂量相关性。
实施例7高剂量静脉推注对新西兰兔的毒性试验
按照实施例3中方法用20KD PEG丙醛修饰rhBNP,纯化后得到高纯度的PEG20-rhBNP，用于后续动物实验。
约6-8月龄新西兰兔32只随机分为4组：
1)9μg/kg PEG20KD-rhBNP组；
2)36μg/kg PEG20KD-rhBNP组；
3)90μg/kg PEG20KD-rhBNP组；
4)PBS对照组
根据新西兰兔体重(3.5kg±0.3kg)，单次耳缘静脉推注给药。观察连续给药14天内新西兰兔死亡情况。直至观察期结束，本发明组无一例新西兰兔死亡，均活动自如，而对照组中则出现1只新西兰兔死亡。结果表明：对照组的生理毒性要大于本发明组。
实施例8 PEG20-rhBNP药代动力学测定
8只10kg Beagle犬，随机分成2组，每组雌雄各半，分别股静脉注射实施例2中PEG20-rhBNP、rhBNP(新活素，阳性对照)。rhBNP注射剂量为9ug/kg，PEG20-rhBNP剂量均为45μg/kg，注射体积1ml/kg。PEG20-rhBNP注射后0、5min、15min、30min、1、4、8、12、24、48、72、120h股静脉取血，置于1％肝素抗凝处理过的1.0ml离心管中，4℃，3000rpm离心10min收集血浆，-20℃保存。采用ELISA试剂盒(Abcam公司，英国)本试验采用直接化学发光技术进行全自动双抗夹心免疫测定方法，采用一定量的双单克隆抗体，测定各时间点血浆中BNP含量。
结果显示，PEG20-rhBNP有一个缓慢释放过程，其半衰期T/2为20h；rhBNP半衰期约为18min；药-时曲线及血药浓度如图2所示。
对比例1
实验方法与实施例4基本相同，其区别仅在于将10mM磷酸盐缓冲液作为离子交换层析的缓冲液A。
结果显示，利用磷酸盐缓冲液进行纯化，分离峰重叠多，不易将单修饰峰和多修饰峰和未修饰峰很好地分开，纯化效果不及实施例4的柠檬酸缓冲液。
对比例2
实验方法与实施例4基本相同，其区别仅在于将上样流速设置为3cm/min、4cm/min、5cm/mim、6cm/mim、7cm/mim和8cm/mim。
结果显示，流速小于等于4cm/min时，出峰慢，峰型矮，易出现并肩峰，分离时间翻倍，流速大于等于7cm/min，样品同时出峰，不易分离。流速为5cm/mim、6cm/mim时分离效果较好，流速为5cm/mim时效果最好。
对比例3
实验方法与实施例4基本相同，其区别仅在于将缓冲液A(柠檬酸缓冲液)的浓度设置为6mM、8mM、10mM、12mM和14mM。
结果显示，缓冲液浓度低于6mM,收获的目标产物含有较多杂质，高于14mM时，收获的目标产物仅占缓冲液10mM时的60％，而缓冲液浓度设置10mM时候，能很好的兼顾纯度和收获的目标产物收率。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 江苏璟泽生物医药有限公司
上海景泽生物技术有限公司
成都泽研生物技术有限公司
<120> 聚乙二醇修饰的rhBNP及其制备方法
<130> P2019-1946
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Arg Lys Met Asp
1 5 10 15
Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu Arg Arg His
20 25 30
Claims (18)
1.一种修饰型rhBNP的制备方法，其特征在于，包括步骤：
(a)将rhBNP与聚乙二醇进行偶联反应，从而获得修饰型rhBNP粗品；和
(b)对步骤(a)获得的修饰型rhBNP进行纯化处理，从而获得所述的修饰型rhBNP；
其中，
所述聚乙二醇为甲氧基聚乙二醇丙醛；
所述聚乙二醇为分子量为20KD；
所述的rhBNP的序列为SEQ ID NO:1:SPKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH；
所述的步骤(b)包括：
(b1)对步骤(a)获得的修饰型rhBNP进行第一次离子交换层析，利用柠檬酸和氯化钠的柠檬酸盐缓冲液进行梯度洗脱，收集经证实含修饰型rhBNP的洗脱峰，从而获得含所述修饰型rhBNP的洗脱液I，和
(b2)对步骤(b1)获得的洗脱液I进行第二次离子交换层析，利用磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液进行洗脱，收集经证实含修饰型rhBNP的洗脱峰，从而获得所述修饰型rhBNP；
在步骤(b1)中，利用SP Sepharose Fast Flow色谱柱进行第一次离子交换层析；
利用缓冲液A和缓冲液B进行梯度洗脱，其中，所述的缓冲液A为5-14mM柠檬酸缓冲液，所述缓冲液B为缓冲液A的1M氯化钠的混合溶液；
利用缓冲液A对步骤(a)获得的修饰型rhBNP粗品进行稀释，稀释后的修饰型rhBNP粗品的浓度为100-350μg/mL；稀释后的修饰型rhBNP的上样流速为5cm/min±20％；
在步骤(b2)中，利用SP Sepharose Fast Flow色谱柱进行第二次离子交换层析；且
进行洗脱的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液的浓度为5-20mM。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(b1)中，所述的洗脱峰为经电泳证实含修饰型rhBNP的洗脱峰2。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(b1)中，所述的缓冲液A为8-12mM的柠檬酸缓冲液。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(b1)中，在进行洗脱前，先用所述缓冲液A进行冲洗。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(b1)中，稀释后的修饰型rhBNP的上样流速为4.5-5.5cm/min。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(b2)中，利用柠檬酸-氯化钠的柠檬酸盐缓冲液对步骤(b1)获得的洗脱液I进行稀释，稀释后的修饰型rhBNP的浓度为100-350μg/mL。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(b2)中，在进行洗脱前，先用磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液进行平衡，其中，所述磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液的浓度为10-30mM。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(b2)中，所述磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液的洗脱流速为5cm/min±20％。
9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(b2)中，进行洗脱的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲液的浓度为8-12mM。
10.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(b2)中，所述洗脱为等度洗脱。
11.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(a)中，在还原剂存在的条件下进行所述偶联反应，所述的还原剂选自下组：氰基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠、醋酸硼氢化钠、硼氢化钠、或其组合。
12.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在pH4-6的条件下，进行偶联反应。
13.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述偶联反应的反应时间为4-20小时。
14.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述聚乙二醇与所述rhBNP的摩尔比为1：(0.2-4)。
15.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述聚乙二醇与rhBNP的N端的丝氨酸残基偶联。
16.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述聚乙二醇与所述rhBNP的摩尔比为1：(0.2-4)。
17.一种含修饰型rhBNP的组合物，其特征在于，所述的组合物包含修饰型rhBNP和聚乙二醇，其中，所述修饰型rhBNP的含量≥80％；
并且，所述修饰型rhBNP中，仅rhBNP的N端丝氨酸残基的氨基、羟基中的一种与聚乙二醇偶联，且所述的组合物是权利要求1所述方法制备的。
18.一种权利要求17所述的组合物的用途，其特征在于，用于制备治疗心脏疾病的药物。
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