CN114539384A - 聚乙二醇化长效生长激素及其制备方法和医药应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及聚乙二醇化长效生长激素及其制备方法和医药应用。采用本申请分支型PEG修饰的PEG‑rhGH分子为单一位点修饰，分子间一致性好，修饰和纯化工艺更可控，修饰物产率更高；在更大程度保留生长激素活性的基础上，很好地改善了其药代动力学性质，取得了意料不到的技术效果。

Description

聚乙二醇化长效生长激素及其制备方法和医药应用
技术领域
本发明涉及聚乙二醇化长效生长激素及其制备方法和医药应用。
背景技术
人生长激素(Human Growth Hormone,hGH)是由脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一种单一肽链的蛋白质激素，是人类出生后促进生长的最重要的激素，具有调节人体生长代谢等多重功能。目前美国FDA批准的rhGH适应症共11种：GHD(1985年)、慢性肾功能不全肾移植前(1993年)、HIV感染相关性衰竭综合征(1996年)、Turner综合征(Turner syndrome，1996年)、成人生长激素缺乏症(1997年)、Prader-Willi综合征(Prader-Willi syndrome，2000年)、小于胎龄儿(small for gestational age，SGA，2001年)、特发性矮身材(idiopathic short stature，ISS，2003年)、短肠综合征(2003年)、SHOX基因缺陷但不伴GHD患儿(2006年)、Noonan综合征(Noonan syndrome，2007年)。随着临床研究的不断深入，生长激素在抗衰老、骨质疏松症、心血管疾病治疗方面也有很好的疗效。
目前，国内外使用生长激素治疗儿童矮小症的用药方法为皮下注射，临床剂量为0.1～0.15IU/kg体重，使用周期往往为一年以上。但由于人生长激素的体内半衰期较短，只有0.5-2小时左右，因此需要每天注射一或两次才能达到很好的治疗效果。结果是频繁而长期的注射既增加了治疗成本，又给患者带来许多痛苦和不便，并严重降低了病人依从性，成为生长激素的市场推广及其市场成长的主要障碍。为减少用药成本和病人的痛苦、提高患者的生活质量和依从性，有必要开发生长激素的长效制剂。
聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)化技术是一项利用聚乙二醇修饰剂对蛋白质、多肽等进行化学修饰的技术。目前已有十余种聚乙二醇修饰的蛋白药物上市。PEG修饰蛋白质可以增加蛋白质的溶解性和体内循环半衰期、减少其抗原性。目前国内唯一已上市的PEG修饰的长效化生长激素产品是长春金赛的金赛增，其公开的专利CN1477126A选择N-羟基琥珀酰胺(NHS)活化的40kDa聚乙二醇修饰剂，最终产品是单修饰产物，但其中含有多种修饰异构体，且价格昂贵。CN101385858A同样公开了Y-PEG-NHS 40K随机修饰rhGH。发明人尝试用相同修饰剂修饰生长激素，但通过修饰、纯化工艺条件的反复摸索，所得修饰物始终含有多种修饰异构体。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提高聚乙二醇修饰生长激素修饰工艺及纯化工艺可控性，保证修饰物产率及均一性。
为此，本发明提供一种聚乙二醇定点修饰的生长激素，一分子生长激素的N端氨基上偶联一分子聚乙二醇，所述聚乙二醇修饰剂为分支型。采用本申请分支型PEG修饰的PEG-rhGH分子为单一位点修饰，分子间一致性好，修饰和纯化工艺更可控，修饰物产率更高。
优选地，所述聚乙二醇修饰剂为分支型聚乙二醇丙醛。
优选地，所述聚乙二醇修饰剂分子量为30-60kDa。
优选地，所述聚乙二醇修饰剂结构如式(1)所示：
Figure BDA0003365049770000021
其中，n为670至690的整数。
聚乙二醇定点修饰的生长激素的结构如式(3)所示：
Figure BDA0003365049770000022
n为670至690的整数，R代表生长激素(除N端首位苯丙氨酸外)。
优选地，所述聚乙二醇修饰剂结构如式(2)所示：
Figure BDA0003365049770000023
其中，n为335至455的整数。
聚乙二醇定点修饰的生长激素的结构如式(4)所示：
Figure BDA0003365049770000031
其中，n为335至455的整数，R代表生长激素(除N端首位苯丙氨酸外)。
本发明要解决的第二个技术问题是进一步改善聚乙二醇修饰生长激素的生物学活性和药代动力学性质。
优选地，聚乙二醇修饰剂分子量为60kDa，所述聚乙二醇修饰剂结构如式(1)所示：
Figure BDA0003365049770000032
其中，n为670至690的整数。
聚乙二醇定点修饰的生长激素的结构如式(3)所示：
Figure BDA0003365049770000033
n为670至690的整数，R代表生长激素(除N端首位苯丙氨酸外)。
本发明还提供了聚乙二醇定点修饰的生长激素的制备方法：按生长激素与PEG修饰剂摩尔比1:(1-2)的比例向生长激素溶液中加入PEG修饰剂，按PEG修饰剂与还原剂(氰基硼氢化钠)摩尔比1:(50-100)的比例，向PEG修饰剂与蛋白混合溶液中加入还原剂，缓慢搅拌至混合均匀后，于2-8℃条件下，反应18-36h。
本发明还提供了上述聚乙二醇定点修饰的生长激素在制备治疗生长激素缺乏儿童矮小症、成人生长激素缺乏、慢性肾功能不全肾移植前、HIV感染想相关性衰竭综合征、Turner综合征、Prader-Willi综合征、小于胎龄儿、特发性矮身材、短肠综合征、SHOX基因缺陷但不伴GHD患儿、Noonan综合征的药物中的应用。
本发明聚乙二醇修饰的生长激素与现有技术相比，具有如下优势：
1、采用分支型PEG修饰剂，PEG-rhGH分子为单一位点修饰，分子间一致性好，修饰和纯化工艺更可控。
2、采用分支型PEG修饰剂，通过简单的工艺控制，即可获得较高的修饰物产率。
3、本发明的聚乙二醇修饰生长激素产品活性更高、药代动力学性质更佳。按照聚乙二醇修饰药物的一般规律，活性和药代动力学性质不可兼得，药代动力学性质的改善通常会伴随活性降低，但本申请发明人通过大量实验选择了特定的聚乙二醇修饰剂，在更大程度保留生长激素活性的基础上，很好地改善了其药代动力学性质，取得了意料不到的技术效果。
4、本发明的聚乙二醇修饰生长激素稳定性更佳。
附图说明
图1a：PEG30K-rhGH纯化色谱图。
图1b：PEG40K-rhGH纯化色谱图。
图1c：PEG60K-rhGH纯化色谱图。
图1d：PEG30K-rhGH、PEG40K-rhGH、PEG60K-rhGH的SEC-HPLC液相色谱图，从上至下依次为PEG30K-rhGH、PEG40K-rhGH、PEG60K-rhGH。
图1e：PEG30K-rhGH、PEG40K-rhGH、PEG60K-rhGH的SDS-PAGE纯度检测图，从左至右泳道依次为marker、PEG30K-rhGH、PEG40K-rhGH、PEG60K-rhGH。
图2：自制Y-PEG-NHS修饰rhGH纯化色谱图。
图3：自制3批次Y-PEG-NHS修饰rhGH及阳性对照SEC-HPLC液相色谱图。
图4：自制3批次Y-PEG-NHS修饰rhGH及阳性对照SDS-PAGE纯度检测图。
图5：PEG30K-rhGH、PEG40K-rhGH、PEG60K-rhGH与阳性对照肽图分析。
图6a：N端肽段鉴定一级质谱图。
图6b：N端肽段鉴定二级质谱图。
图6c：样品Trypsin酶解产物的TIC对比图。
图7a：标准品Maldi-Tof检测图。
图7b：PEG60K-rhGH Maldi-Tof检测图。
图8a：rhGH DLS扫描图。
图8b：PEG60K-rhGH DLS扫描图。
图8c：阳性对照DLS扫描图。
图9a：阳性对照与生长激素受体(GHR)结合、解离曲线。A10-E10代表加样孔在96孔板上的位置。
图9b：PEG60K-rhGH与生长激素受体(GHR)结合、解离曲线。A10-E10代表加样孔在96孔板上的位置。
图10：PEG30K-rhGH、PEG40K-rhGH、PEG60K-rhGH rhGH、阳性对照单次给药后大鼠体内血清中药物含量随时间的变化曲线。
图11：阳性对照与三种PEG-rhGH给药后，去垂体大鼠每天的体重增长状况。
图12：显微镜下胫骨薄片的骨骺状态。
图13：体重法与胫骨法检测终点反应值。
图14：PEG60K-rhGH不同条件下取样样品SEC-HPLC纯度
图15：阳性对照不同条件下取样样品SEC-HPLC纯度
图16：PEG60K-rhGH不同条件下取样样品粒径扫描
图17：阳性对照不同条件下取样样品粒径扫描
图18：PEG60K-rhGH样品不同条件下取样样品IEC-UPLC分析
图19：阳性对照样品不同条件下取样样品IEC-UPLC分析
图20：报告基因法检测不同时间点样品活性，以样品浓度为横坐标，以荧光响应平均值为纵坐标，用GraphPad绘制Logistic四参数曲线，计算半数有效度(EC50)。其中图20a是报告基因法检测0点及37℃10天PEG60K-rhGH及阳性对照活性；图20b是报告基因法检测0点及40℃10天PEG60K-rhGH及阳性对照活性；图20c是报告基因法检测0点及加速3个月PEG60K-rhGH活性；图20d是报告基因法检测0点及加速3个月阳性对照活性。
具体实施方式
定义：
生长激素：一方面包括与天然生长激素序列相同的各种同源物，包括但不限于Genbank登录号为AAA98618.1、CAA23779.1、CAA00065.1、AAA35891.1等所示的生长激素。另一方面包括生长激素衍生物，包括但不限于在天然生长激素序列基础上的突变体、部分蛋白、融合蛋白(包括但不限于白蛋白融合、Fc融合等)等。
GH：生长激素；rhGH：重组人生长激素。
聚乙二醇：PEG，通常经环氧乙烷聚合而成，有分支型，直链型和多臂型。一般情况下，分子量低于20,000的被称为PEG，分子量更大的被称为PEO。普通的聚乙二醇两端各有一个羟基，若一端以甲基封闭则得到甲氧基聚乙二醇(mPEG)。
聚乙二醇修饰剂：PEG修饰剂，指带有官能团的聚乙二醇衍生物，是经过活化的聚乙二醇，可用于蛋白质以及多肽药物修饰。本申请所用聚乙二醇修饰剂购自江苏众红生物工程创药研究院有限公司、北京键凯科技股份有限公司或厦门赛诺邦格生物科技股份有限公司。特定分子量的PEG修饰剂实际分子量可以是标示值的90％～110％，如PEG5K分子量可以是4.5kDa～5.5kDa。
实施例所用PEG30K具体指Y-PALD-30K，分子量为30kDa的分支型聚乙二醇丙醛，结构如式(2)所示，m为335至340的整数。
实施例所用PEG40K具体指Y-PALD-40K，分子量为40kDa的分支型聚乙二醇丙醛，结构如式(2)所示，m为450至455的整数。
实施例所用PEG60K具体指2-arm PEG 60K，分子量为60kDa的分支型聚乙二醇丙醛，结构如式(1)所示，n为670至690的整数。
实施例1不同分支型聚乙二醇丙醛修饰rhGH样品的制备与纯化
一、样品制备
(1)预处理：
取rhGh原蛋白(大肠杆菌周质分泌表达，序列与天然序列一致)，使用10kDa超滤膜包处理，置换缓冲液为磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲液pH6.0，同时浓缩至蛋白浓度10mg/mL。
(2)投料修饰
PEG30K-rhGH修饰制备：按重组人生长激素(以下简称rhGH)与Y-PALD-PEG 30K摩尔比1:2的比例向预处理过后的rhGH蛋白溶液中加入PEG，按PEG与还原剂(氰基硼氢化钠)摩尔比1:50的比例，向PEG30K与蛋白混合溶液中加入还原剂，缓慢搅拌至混合均匀后，于4℃条件下，反应24h。
PEG40K-rhGH修饰制备：按rhGH与Y-PALD-PEG 40K摩尔比1:2的比例向预处理过后的rhGH蛋白溶液中加入PEG，按PEG与还原剂(氰基硼氢化钠)摩尔比1:50的比例，向PEG40K与蛋白混合溶液中加入还原剂，缓慢搅拌至混合均匀后，于4℃条件下，反应24h。
PEG60K-rhGH修饰制备：按rhGH与2-arm PEG 60K摩尔比1:1的比例向预处理过后的rhGH蛋白溶液中加入PEG，按PEG与还原剂(氰基硼氢化钠)摩尔比1:50的比例，向PEG60K与蛋白混合溶液中加入还原剂，缓慢搅拌至混合均匀后，于4℃条件下，反应24h。
二、反应混合物纯化
色谱法条件如下：
纯化填料选用GE公司Q SepharoseTM High Performance介质，纯化流动相为BufferA：20mM Tris-HCl(pH8.5)；BufferB：20mM Tris-HCl+1M NaCl(pH8.5)。
上样：取反应结束后的PEG30K-rhGH修饰反应混合物，经双蒸水稀释10倍后，再经Buffer A液稀释5倍后上样纯化。上样结束后使用BufferA洗涤层析柱不少于1个柱床体积。
洗脱：设置0-15％BufferB梯度洗脱5个柱床体积，根据UV280趋势分步收集洗脱样品。纯化结果如图1a中所示。
同法纯化PEG40K-rhGH样品与PEG60K-rhGH样品。纯化结果如图1b与图1c中所示。
三、PEG偶联物样品纯度分析
(1)液相纯度分析
参考《中国药典》2015年版通则0512高效液相色谱法进行检测，检测色谱类型为SEC(分子筛色谱)，使用Waters e2695 HPLC检测，流动相为含5％异丙醇的20mM PB 7.0缓冲液，色谱柱信号BEH450 SEC 3.5μm，采集条件为214nm，采集时间为20分钟。
液相纯度分析结果如图1d所示。液相检测结果显示，按照实施例1制备的三种PEG-rhGH蛋白纯度均≥98％。
(2)SDS-PAGE纯度分析
12％的聚丙烯酰胺凝胶配制方法：分别吸取2.7mL双蒸水，3.3mL30％的Acr-Bis溶液，3.8mL浓度为1M的Tris(pH 8.8)溶液，0.1mL 10％的SDS溶液，0.1mL的10％的过硫酸铵溶液，及0.004mL的TEMED，混合均匀，制成分离胶。分别吸取2.1mL双蒸水，0.5mL30％的Acr-Bis溶液，0.38mL浓度为1.5M的Tris(pH 6.8)溶液，0.03mL 10％的SDS溶液，0.03mL的10％的过硫酸铵溶液，及0.003mL的TEMED，混合均匀，制成5％的浓缩胶。
运行电压：80V运行30min，待溴酚蓝指示剂移动至浓缩胶下方改为130V运行，直至溴酚蓝指示剂运行至分离胶底部边缘。
考马斯亮蓝染色：纯化中分段收集的样品经蛋白电泳后，将蛋白胶置于考马斯亮蓝染色液中染色30min，再放置于乙酸乙醇洗脱液中脱色过夜。
SDS-PAGE纯度分析结果如图1e所示。
电泳结果显示，实施例1制备的三种PEG-rhGH蛋白条带均一，未见其他杂带，纯度较高。
实施例2 Y-PEG-NHS修饰rhGH样品的制备与纯化
一、样品制备
参考中国发明专利CN101385858A开展Y-PEG-NHS 40K随机单位点修饰rhGH样品制备。具体方案如下：
取rhGh原蛋白，使用10kDa超滤膜包处理，置换缓冲液为50mM磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲液pH6.5-6.8，同时浓缩至蛋白浓度10mg/mL。
PEG修饰剂为聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺基脂(商品名Y-PEG-NHS 40K，购自北京键凯科技股份有限公司)，按照蛋白：PEG质量比1:6进行PEG投料，持续搅拌至Y-PEG-NHS完全溶解，于4℃反应16小时，得反应混合物。
二、反应混合物纯化
纯化填料选用GE公司Q SepharoseTM High Performance介质，纯化流动相为BufferA：20mM Tris-HCl(pH8.0)；BufferB：20mM Tris-HCl+1M NaCl(pH8.0)。
取反应结束后的修饰反应混合物，经双蒸水稀释10倍后，再经Buffer A液稀释5倍后上样纯化。上样过程中，偶联副产物NHS脂杂质不与介质结合，流穿分离。上样结束后使用BufferA洗涤层析柱不少于1个柱床体积。设置0-20％BufferB梯度洗脱5个柱床体积，根据UV280趋势分步收集洗脱样品。纯化结果如图2中所示，其中洗脱峰2为目标产品。
三、PEG偶联物样品纯度分析
(1)液相纯度分析
检测方法同实施例1。制备的3批次Y-PEG-NHS修饰rhGH与阳性对照(本申请所用阳性对照均为国内唯一已上市的PEG修饰的长效化生长激素)出峰位置一致，在SEC上呈现单峰形式，SEC纯度均达到98％以上，如图3所示。
(2)SDS-PAGE纯度分析
检测方法同实施例1。制备的3批次Y-PEG-NHS修饰rhGH及阳性对照SDS-PAGE图如图4所示。
与中国发明CN101809038A相似，本申请制备的Y-PEG-NHS 40K修饰生长激素的PEG单位点修饰产物为2条主带，推测可能是单位点修饰的位点异构造成其在SDS-PAGE上表观分子量的差异；进一步与同样采用该修饰剂制备的阳性对照进行比较，两条主条带位置及形态一致。而采用本申请分支型PEG丙醛修饰的PEG-rhGH分子为单一条带(图1e)，分子间一致性更好，产品更为可控。
四、不同PEG修饰rhGH收率比较
实施例1、2制备的不同PEG修饰rhGH收率比较如下表：
表1
样品 PEG30K-rhGH PEG40K-rhGH PEG60K-rhGH Y-PEG-NHS-rhGH
收率 71.4％ 65.7％ 61.4％ 20-30％(三批)
在收率上，采用本申请的分支型PEG修饰剂，通过简单的工艺控制，即可使分支型PEG修饰rhGH的产率维持在60％以上；而在Y-PEG-NHS修饰rhGH的反应中，由于需要控制单位点修饰产物的形成，防止多个Y-PEG-NHS偶联到1个rhGH分子上，保证不同批次修饰物中各个修饰位点偶联PEG的比例相对固定(实施例5显示其由5种不同单位点PEG修饰rhGH组成)，因此工艺调整范围(例如蛋白与PEG投料比)较窄，经多次优化，Y-PEG-NHS-rhGH收率也仅能达到25-35％左右。
综合比较认为，分支型PEG(30K、40K、60K)修饰rhGH相比Y-PEG-NHS-rhGH单位点修饰rhGH在工艺及质量上可控性更优。
实施例3不同PEG修饰rhGH PEG结合数测定
本发明中，可以使用如下方法比较不同PEG修饰rhGH中一分子GH结合PEG的个数。
以PEG60K-rhGH为例：
一、检测方法
使用液相色谱仪示差-紫外联用检测法。
检测色谱柱为BEH SEC
Figure BDA0003365049770000101
3.5um，7.8*300mm。流动相选用20mM pb7.0+5％异丙醇，柱温设置35℃，上样10ul。采集时间设置30min；流通池温度设置35℃；液相流流速设置为0.5ml/min。检测器使用RI+紫外(采集波长280nm)。
样品处理方法为：PEG60K-rhGH、GH原蛋白分别用pH7.0磷酸盐缓冲液稀释至1.0mg/ml；精密称取PEG60K 5mg，用pH7.0磷酸盐缓冲液准确溶解并定容至2ml，制成2.5mg/ml PEG标准品
二、结果计算
1)1mg/ml原蛋白RI下峰面积为A1；1mg/ml PEG60K-rhGH供试品RI下峰面积为A2；2.5mg/ml PEG标准品RI下峰面积为A3；
2)在PEG60K-rhGH中PEG在RI下峰面积为A2-A1；通过峰面积的对比得PEG浓度为(A2-A1)*2.5/A3
3)可计算PEG结合数＝(PEG浓度/PEG分子量)/(原蛋白浓度/原蛋白分子量)＝0.9167*(A2-A1)/A3
其中，PEG分子量以60kDa计，原蛋白分子量以22kDa计。
三、检测结果
表2
Figure BDA0003365049770000111
PEG60K-rhGH样品PEG结合数为0.97≈1个，证明了PEG60K-rhGH为单PEG修饰样品。
采用上述方法，检测其他不同PEG修饰rhGH结合数，也均为单PEG修饰。
实施例4不同PEG修饰rhGH修饰位点鉴定-液相色谱法
本发明中，可以使用如下方法对rhGH原蛋白及PEG修饰后的rhGH系列样品进行酶解、反相色谱分析，考察修饰前后肽段峰变换情况，间接定位修饰肽段。
一、样品酶解
1、预处理：供试样品统一定量至5mg/mL(浓度不足使用3kDa超滤管浓缩，浓度过高使用ddH2O稀释)。
2、蛋白质变性：取100μl供试样品溶于300μl 10M脲中，90℃金属浴，5min。
3、还原：在上述体系中加入50μl 100mM DTT，60℃水浴45min。
4、烷基化：步骤3中溶液冷却至室温，在体系中加入50μl 250mM IAM，室温避光，45min。
5、脱盐酶解：脱盐置换浴1％NH4HCO3溶液中，取100μl，加入2μl胰酶，37℃酶解12-24h后，加入10μl 50％乙酸溶液终止反应。
二、反相色谱检测
1、色谱柱：Pepticle BEH C18，1.7μm，2.1*150mm
2、流动相：A：0.1％TFA in H2O；B：0.1％TFA in ACN
3、检测波长：214nm
4、柱温：50℃
5、上样量：20-50μL
6、梯度
表3
Figure BDA0003365049770000121
三、检测结果
液相色谱检测结果如图5所示。rhGH原蛋白、PEG修饰rhGH系列样品与阳性对照样品酶解后反相色谱检测。如图虚线框中所示，在保留时间19min处，PEG(30K/40K/60K)-rhGH样品相对于原蛋白，肽段峰完全消失，其他肽段峰与原蛋白保持一致，确证为定点修饰。阳性对照样品19min处面积下降约50％，查阅资料(李晶，梁成罡等.液相肽图法推断聚乙二醇化重组人生长激素的聚乙二醇修饰位点研究[J].中国药学杂志,2012,47(08):626-630)可知阳性对照样品在N段修饰率为49％±5％，在其他5处赖氨酸位点处有8％-20％等的修饰比例，故可推定19min处为N端肽段峰。
实施例5不同PEG修饰rhGH修饰位点鉴定-LC-MS法
本发明中，可以使用如下方法对rhGH原蛋白及PEG修饰后的rhGH样品进行还原烷基化处理，酶解后采用质谱联用分析，考察修饰前后蛋白各肽段的变化，确定发生PEG修饰的肽段。
以PEG60K-rhGH为例：
一、样品酶解
1、变性还原：分别取100μg左右的样品，置1.5ml离心管中，加入适量6MGHC和1MDTT溶液，涡旋混匀，放置干式恒温器中，56℃孵育30min；
2、烷基化：分别向变性还原后的样品中加入适量1M IAM，涡旋混匀，室温避光放置45min；
3、缓冲液置换：
(1)移取450μl 2M Urea缓冲液，置10kDa超滤膜中，12000rpm条件下离心10min，活化超滤膜；
(2)将烷基化后的样品移至活化好的10kDa超滤膜中，补加2M Urea缓冲液至450μl，12000rpm条件下离心10min，弃下层滤液；
(3)向10kDa超滤膜中，补加2M Urea缓冲液至450μl，12000rpm条件下离心10min，弃下层滤液；
(4)重复步骤(3)两次，将10kDa超滤膜中上层滤液转移至离心管中；
4、酶解：分别向置换缓冲液体系后的样品中加入4μg Trypsin，涡旋混匀，放置干式恒温器中，37℃孵育16h；
5、终止酶解反应：分别向酶解后的样品中加入适量FA，使其终浓度为1％，涡旋混匀，放置进样小瓶中；
二、LC-MS联用检测
1、上机：将酶解后的样品移取至进样小瓶中，提交序列，开始采集样品三、数据采集与分析
所得质谱原始数据通过Biopharma finder进行软件分析，选择供试品理论序列为数据库，然后进行数据库匹配检索
四、检测结果
1、含有N端的肽段一级质谱图如图6a所示，二级质谱图如图6b所示，鉴定所得的PEG60K-rhGH样品N端信息如表4所示：
表4
Figure BDA0003365049770000131
2、样品Trypsin酶解产物的TIC对比图如图6c所示，选择不会发生PEG修饰的肽段(即不包含N端、不包含含有K的肽段)总峰面积对原蛋白总峰面积进行归一化处理，归一化处理前需计算出各样品对应的原蛋白校正系数，计算方式为：原蛋白总峰面积校正系数＝原蛋白中不包含K肽段总峰面积/样品中不包含K肽段总峰面积。
表5
Figure BDA0003365049770000141
根据归一化后原蛋白T1总峰面积＝原蛋白中T1总峰面积/原蛋白总峰面积校正系数、PEG修饰(％)＝100％-(样品中T1/原蛋白T1总峰面积(％))，对PEG60K-rhGH样品展开计算：
表6
Figure BDA0003365049770000142
样品肽段经LC-MS/MS分析，我们设计的PEG60K-rhGH有且仅有N端肽段上偶联有PEG修饰，修饰位点单一、可控。
不同PEG修饰rhGH修饰位点鉴定方法同上，结果汇总如下。
表7
Figure BDA0003365049770000143
如上表所示，结合样品SEC色谱图可见，尽管纯化得到了分子量一致的单位点修饰产物，但是在rhGH与Y-PEG-NHS反应过程中，共有包括N-末端、K38、K140、K145、K158等5种单位点PEG修饰rhGH产品生成，且各位点的单修饰产物在总产物的占比受反应条件影响较大，且由于分子量及分子性质，难以通过后续纯化有效分离这些单位点修饰产物，因此在产物的控制上，本申请分支型PEG修饰rhGH相较于Y-PEG-NHS修饰rhGH具有明显的优势。
实施例6 Maldi-Tof分子量检测
本发明通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(ultraflextreme MALDI-TOF/TOF)对PEG60K-rhGH样品的相对分子质量进行分析。
一、实验仪器和试剂
1、低温高速离心机5430R(Eppendorf)
2、ultraflextreme MALDI-TOF/TOF(布鲁克)
3、2,5-DHAP(布鲁克)
4、Protein StandardⅡ(布鲁克)
二、样品检测
取适量供试品置换缓冲液到超纯水中，测OD280，再用0.1％TFA-H2O稀释到相应浓度进行MALDI分子量检测。取适量供试品点至样品靶上，自然干燥后，再取适量2,5-DHAP基质溶液点至对应靶位上并自然干燥，用相同方法在样品靶位相邻位置点标准品ProteinStandardⅡ。在正离子模式下选择线性方法对样品测试范围进行校准测试，在正离子模式下选择线性方法对样品测试范围进行校准测试，在正离子模式下选择线性方法测试样品分子量。ultraflextreme MALDI-TOF/TOF产生的原始数据及图谱由FlexAnalysis软件进行数据分析。
三、检测结果
表8
Figure BDA0003365049770000151
标准品及供试品完整分子量检测图谱如图7a、图7b所示，PEG60K-rhGH的MS分子量与理论分子量基本一致(本发明中PEG60K理论分子量为60000Da±10％，每个rhGH分子连接有1个PEG60K，则理论分子量约为82125Da，实测分子量81794Da与理论分子量差异小于0.5％)，证明我们设计的PEG60K-rhGH为单个PEG修饰物。
综合实施例5、实施例6、实施例7以及实施例8，可以明确证明我们设计的PEG60K-rhGH为单个PEG定点偶联至生长激素N端的蛋白制品。
实施例7 PEG60K-rhGH粒径扫描
一、样品预处理
使用AKTA pure150层析系统，5ml Desalting预装层析柱对供试品进行脱盐处理，将待测蛋白置换入超纯水中。BCA法蛋白定量，并使用超纯水稀释至约4mg/ml，上机检测。
二、上机检测
1)开启仪器，等待30min以稳定激光光源
2)打开工作站(Zetasizer Nano Software)；等待仪器自检(指示灯变为绿色则自检成功)，进入NanoZS90系统工作站
3)依次选取工作栏上的Mesurement→Manual→Meaurement，在Manual-setting窗口单击Meaurement Type→选择Size
4)单击Labels，输入测量样品名
5)单击Mesurement，设置测量温度25℃、测量次数Automatic、测量循环次数1次
6)单击Manual选择Material Name为protein，单击Dispersant选择被分散的介质自定义的PB缓冲液体系。
7)单击Cell，选择测量池类型为ZEN0118
8)单击Result calculation，设置粒度计算模型为protein analysis
9)设置完毕，点击确认
10)取对照品和供试品约100μl，加入测量皿，打开仪器样品池盖，放入测量皿(带▼符号面朝向测量者)，点击Start即开始测量
10)测量结束，选择Records View栏下样品对应的记录条，单击状态栏上的Intensity PSD(M)，获得光强度粒度分布图/单击Intensity statistics获得光强度粒度的统计学分布详表/分别单击Number和Volume，获得数量和体积分布结果图。
三、测试结果
表9
样品名称 平均粒径(nm) 多分散系数
rhGH 5.05 0.103
PEG60K-rhGH 12.54 0.153
阳性对照 10.16 0.634
三个样品粒径扫描图谱见图8a、8b、8c，rhGH经PEG修饰后，粒径明显增加大，PEG60K-rhGH由于使用了分子量更大的PEG进行修饰，其平均粒径略大于阳性对照，从而进一步降低肾小球滤过率，更不易被生物代谢消除；同时因采用定点修饰技术，其多粒径分散度(多分散系数)更为均一，药物分子的代谢过程更为一致。
实施例8PEG60K-rhGH与阳性对照体外结合力比较
本发明中，可以使用如下方法比较PEG60K-rhGH分子与阳性对照样品与生长激素受体蛋白(GHR)的结合能力。
一、检测方法
采用分子间相互作用仪Fortebio检测生物素化GHR与供试蛋白样品的分子间相互作用力，用生物素EZ-link NHS-PEG12-Biotin标记GHR，脱盐柱脱盐。用SA传感器结合生物素化的GHR，与稀释至一定浓度的PEG60K-rhGH及阳性对照结合与解离，采用Fortbio分析软件计算分子间相互作用情况。检测结果如图9a、图9b，以及下表所示。
表10
Figure BDA0003365049770000171
二、实验结果
以上结果是4种不同稀释浓度下，阳性对照、PEG60K-rhGH与GHR的相互作用情况计算结果。其中Conc.(nM)为样品浓度，KD为解离常数，该数值越小，则分子间作用力越强；Kdis为解离速率常数，该数值越小则分子解离时间越长，提示分子作用半衰期越长。Full为可信度，数值越接近1则数据可信度越高。
表中数据显示，阳性对照样品与PEG60K-rhGH解离常数均为10-10级，该数值表明分子间两种蛋白与GHR间作用力极强；阳性对照样品解离速率为1.05×10-4远高于PEG60K-rhGH的解离速率7.05×10-5，表明PEG60K-rhGH作用时间更长，提示PEG60K-rhGH半衰期更长。
实施例9不同PEG修饰的rhGH在大鼠体内药代比较
本发明中，不同聚乙二醇定点修饰的rhGH可以通过以下方法测定其在大鼠体内的药代并与市售商品进行比较。
一、分组与实验设计
根据实验第一天测定的动物体重，按体重随机分组分为4组，每组6只，雌雄各半，染色编号。给药浓度均为0.1mg/mL，给药剂量均为0.5mg/kg。
二、给药与一般临床观察
本实验给药途径为：皮下注射。
给药频率：单次给药，于实验的第一天给药一次。
给药方法：PEG30K-rhGH组、PEG40K-rhGH组、PEG60K-rhGH组、阳性对照组分别给予相应的供试品。用1mL一次性无菌注射器及相应规格针头，准确抽取相应容量的供试品，皮下多点注射，不超过0.5-1ml/100g。
观察动物：所有动物。
观察频率及时间：检疫期和试验期间每天至少观察一次。
观察内容：包括但不限于动物死亡或濒死，以及精神状态、行为活动、进食情况、粪便性状等情况。
三、血样采集
检测动物：所有动物。
检测时间：分别于0min(给药前)、30min、1h、2h、4h、8h、24h、2d、3d、5d、7d、8d各采血一次，共采血12次，采血量：50-100μl血清，用于药代动力学参数的测定。
四、药代检测
采用ELISA测定血清中PEG-rhGH药物浓度的方法进行检测，具体实施方法如下：
1、包被：使用PB7.4稀释包被GH20(公司自制)抗体至4μg/mL,加样(100μl/孔)，4℃包被过夜；
2、封闭：使用2％BSA in PBST(200μl)加入每孔进行封闭，置于37℃恒温孵育箱约2小时；
3、标准品和质控品的配制：使用大鼠血清稀释各修饰蛋白标准品和质控品至适宜浓度(标准曲线范围0-192ng/ml，质控品范围3-96ng/ml)，加样前使用封闭液1/5稀释；待测血清样品直接1/5封闭液稀释至适宜浓度(以落在标曲中点附近为佳)；酶标版每孔100μl加样，37℃200rpm振荡孵育约2小时。
4、检测抗体的配制：将酶标抗体GH18-HRP和GH24-HRP(公司自制)使用封闭液均按照1/4K稀释，100μl/孔加样，37℃200rpm孵育约60分钟
5、显色：使用TMB II号显色液(湖北英创生物)100μl/孔加样，37℃孵育显色15分钟。
6、终止：使用2M硫酸50μl/孔加样进行终止。
7、使用BIOTEK SynergyH1酶标仪读数，读取波长为450nm。
8、使用OriginPro 8软件对标准曲线进行拟合，并代入待测血清样本读数进行计算。以给药时间为X轴，血清中药物浓度为Y轴，拟合药代曲线。
五、检测结果
药代检测结果显示，相同给药剂量下，PEG60K-rhGH在大鼠体内可以获得较高的暴露量。药代曲线如图10所示。同等给药剂量下，PEG60K-rhGH药峰浓度Cmax＝224.2ng/ml，高于其他两种修饰产品(PEG30K-rhGH Cmax＝22.5ng/ml，PEG40K-rhGH Cmax＝85.6ng/ml)，高于阳性对照样品(Cmax＝98.0ng/ml)。PEG60K-rhGH半衰期(t1/2＝40h)高于阳性对照(t1/2＝32h)和PEG30K-rhGH(t1/2＝20h)、PEG40K-rhGH(t1/2＝30h)。同时，PEG60K-rhGH在体内的暴露量(AUC＝8069.92h·ng/ml)也高于阳性对照(AUC＝4164.40h·ng/ml)和PEG30K-rhGH(AUC＝1584.15h·ng/ml)、PEG40K-rhGH(AUC＝3528.12h·ng/ml)
实施例10不同PEG修饰rhGH样品的生物学效应比较
本发明中，不同聚乙二醇定点修饰的rhGH可以通过以下方法与市售商品进行生物学效应比较。
一、模型制备
选择体重在60-80g的SD大鼠，以10％水合氯醛按照3.5ml/kg的剂量麻醉动物，待动物翻正反射消失后，保定动物，颈部备皮，皮肤消毒；沿颈中部近下颚处作一2cm纵向切口，分开颌下腺，暴露胸甲状肌，在此肌肉右侧近咽部钝性分离血管神经，直至骨板；擦去骨板上的肌肉，找到枕骨脊，沿枕骨脊继续向头部剥离两侧肌肉组织，直至可见“T”型凸起及蝶枕骨联合；在蝶枕骨联合上方2mm处，即垂体窝附近，用2mm钻头钻通骨板；通过钻孔吸取垂体，检查垂体是否为三叶。术部止血后逐层缝合肌肉皮肤，术后肌注氨苄西林钠抗感染。
二、给药
给药动物：4组动物，8只/组
给药途径：颈部皮下注射
给药期限和频率：供试品包括PEG30K-rhGH、PEG40K-rhGH、PEG60K-rhGH、阳性对照。供试品单次给药，给药剂量均为1.2mg/kg。
三、检测方法
(1)体重法
样品给药后7天，每天称量大鼠体重，并依次记录。每只动物给药后体重增加的克数作为反应值。动物体重变化如图11所示，PEG60K-rhGH组给药后4天内动物体重获得了持续、明显的增长，第四天体重最高点相比PEG30K-rhGH、PEG40K-rhGH有明显优势，相对阳性对照组高出19.8％；实验终点反应值如图13所示，单次给药8天后，PEG60K-rhGH组体重增加相比PEG30K-rhGH、PEG40K-rhGH有明显增加，且比阳性对照组高21.3％，即同等给药剂量下，PEG60K-rhGH相当于阳性对照的1.2倍，优势相当明显。
(2)胫骨法
待体重法测试结束后，处死大鼠，取下两腿胫骨，置10％甲醛溶液保存，从胫骨近心端顶部中间沿矢状面切开，置10％甲醛溶液中保存，水洗10分钟后，置丙酮溶液中10分钟，水洗3分钟，置2％硝酸银溶液中染色2分钟，水洗后置水中强光照射至变棕黑色，于10％硫代硫酸钠溶液固定30分钟，置80％乙醇溶液中供测量用。测量时沿剖面切1mm左右薄片，置显微镜下测量胫骨骨骺板宽度。
显微镜观察结果如图12所示，实验终点反应值如图13所示。单次给药8天后，PEG60K-rhGH组胫骨生长相比PEG30K-rhGH组增长量高出25.8％，相比PEG40K-rhGH组增长量高出18.3％，，相比阳性对照组，骨骺宽度高出12.8％，进一步确证使用PEG60K修饰的GH具有明显结构优势，从而使得去垂体大鼠生长更为显著。
实施例11 PEG60K-rhGH体内生物学活性检测
参照《中国药典》2015版1219生长激素生物测定法开展实验。
一、动物造模
选择体重在60-80g的SD大鼠(实验动物来源：湖南斯莱克景达实验动物有限公司；实验动物生产许可证号：SCXK(湘)2019-0004；实验动物质量合格证编号：1107271911006162；本机构实验动物使用许可证号：SYXK(苏)2016-0036)，以10％水合氯醛按照3.5ml/kg的剂量麻醉动物，待动物翻正反射消失后，保定动物，颈部备皮，皮肤消毒；沿颈中部近下颚处作一2cm纵向切口，分开颌下腺，暴露胸甲状肌，在此肌肉右侧近咽部钝性分离血管神经，直至骨板；擦去骨板上的肌肉，找到枕骨脊，沿枕骨脊继续向头部剥离两侧肌肉组织，直至可见“T"型凸起及蝶枕骨联合；在蝶枕骨联合上方2mm处，即垂体窝附近，用2mm钻头钻通骨板；通过钻孔吸取垂体，检查垂体是否为三叶。术部止血后逐层缝合肌肉皮肤，术后肌注氨苄西林钠抗感染。
二、分组给药
取去垂体手术后2-3周，体重变化小于手术前±10％的大鼠，按照体重随机分成6组，每组8只动物，每只编号并记录体重。分组包括：GH国家标准品，(中国食品药品检定研究院提供，规格为3IU·mg-1·支-1)设高(0.045mg·ml-1，0.5ml·只-1)、低(0.011mg·ml-1，0.5ml·只-1)剂量组，每日给药1次，连续6日；供试品rhGH(自制，PEG60K-rhGH修饰所用原蛋白批次)高(0.045mg·ml-1，0.5ml·只-1)、低(0.011mg·ml-1，0.5ml·只-1)剂量组，每日给药1次，连续6日；供试品PEG60K-rhGH高(0.135mg·ml-1，0.033ml·只-1)、低(0.011mg·ml-1，0.5ml·只-1)剂量组，单词给药，与标准品及rhGH供试品给药的第一天同时一次性给药。于标准品及rhGH供试品组最后1次给药后24h处死大鼠，检测体重和胫骨骨骺板宽度。按《中国药典》2015版1219生长激素生物测定法和通则1431生物检定统计法处理数据。
三、测定结果
动物体重统计见下表，测得自制的rhGH样品生物效价为3.57IU/mg，PEG60K-rhGH效价为7.63IU/mg。可见修饰后蛋白比需每天给药的rhGH具有更高的促进动物机体生长的生物活性和长效药理作用，且我们设计的PEG60K-rhGH动物体内生物学效价可达修饰前rhGH的2倍以上。
表11
Figure BDA0003365049770000221
实施例12 PEG60K-rhGH与阳性对照稳定性研究比较
一、试验方案
本申请设计通过较长的PEG支链达到对rhGH有效的包裹与保护作用，同时通过N端定点的修饰方式保证药物有效分子的一致性，从而实现进一步的质量可控，提高rhGH在体内外的稳定性，使得药物有效分子PEG-GH在体外以高度均一的形式存在，在给药过程中能保持有效分子整齐的进入体内，进而达到更持续、更稳定的发挥rhGH生物学效应的目的。
本实施例通过PEG60K-rhGH与目前在售的PEG-GH商品，在不同体外环境下的稳定性考察研究，从纯度、电荷异构体、粒径、蛋白修饰、体外活性变化情况等方面，对比并展示PEG60K-rhGH的稳定性。
表12
Figure BDA0003365049770000231
二、研究结果
(1)纯度及粒径扫描分析
液相分析、SDS-PAGE鉴别方法同实施例1，粒径扫描检测方法同实施例9。
PEG60K-rhGH色谱结果如图14所示，PEG60K-rhGH经高温破坏后，在40℃10天条件下主峰前可见少量聚集体增加，增加比例约2％左右；在37℃(近似体温条件)下，10天放置未见SEC纯度改变；加速条件(25℃60％RH)同样未见改变。
在售的PEG-GH商品色谱结果如图15所示，40℃高温10天破坏后，SEC图谱可见异常，RT11min处主峰面积显著下降，RT7min处见杂质峰形成；在37℃(近似体温条件)下，10天放置后SEC见主峰下降，峰前有多个杂峰形成；加速条件未见纯度明显改变。
粒径扫描与SDS-PAGE分析，粒径如图16所示，PEG60K-rhGH各条件下样品粒径一致，粒径大小与此前结构确证结果一致。PEG-GH商品检测结果如图17及下表所示，在40℃与37℃条件下可见不同程度的粒径增加，其中40℃中溶液内物质粒径增加至59.73nm，约为原样的4倍。
表13
Figure BDA0003365049770000232
对40℃样品开展SDS-PAGE鉴别，条带未见异常。
综上推测，该批次阳性对照在本次37℃与40℃放置过程中，分子可能产生了非共价键形式的集聚，有可能产生对样品生物学效应造成一定的影响。PEG60K-rhGH在37℃与40℃放置过程中未产生明显的纯度改变。加速条件下，两种样品暂未见纯度显著改变。
(2)电荷异构体分析
本实施例采用如下方式检测蛋白电荷异构体，检测设备为Waters ACQUITY UPLCH-CLASS：
表14
Figure BDA0003365049770000241
PEG60K-rhGH与阳性对照不同稳定性考察时间点的电荷异构体色谱图如图18、图19所示，积分后可得：
表15
Figure BDA0003365049770000242
表16
Figure BDA0003365049770000251
PEG60K-rhGH37℃条件10天未见电荷异构体明显增加，至20天时增加至约10％；40℃条件下10天增加至约20％；加速条件下，1个月增加至8％左右，加速3个月增加至14％。
阳性对照在本色谱法条件下，主峰在RT9-10min之间，在放置过程中，可见主峰下降，且在RT10-11min有明显的碱性峰生成，特别是37℃与40℃下，整体峰形发生较大改变，样品37℃条件下可见50％以上的电荷异构体增加；40℃下样品主峰几乎不可辨，考虑与此前SEC结果存在有一定对应性。加速条件，1个月可见电荷异构体增加至13.29％，3个月增加至接近40％。
(3)基于LC-MS方法的蛋白氨基酸氧化、脱酰胺分析
LC-MS样品预处理、上机检测方法同实施例7，所得质谱原始数据通过Biopharmafinder进行软件分析，通过对蛋白肽段样品质谱一级全扫的质荷比值(m/z)及二级HCD碰撞碎裂后的质荷比值(m/z)分别与理论值相比较，确定氧化、脱酰胺等修饰发生的肽段和位点。
检测PEG60K-rhGH与阳性对照不同条件下取样样品的氨基酸氧化比例，两种样品M14位点的氧化比例在各放置条件下均未超过5％，也未发生异常增加，整体变化情况及变化率近似。
检测PEG60K-rhGH与阳性对照不同条件下取样样品的氨基酸脱酰胺比例情况如下：
表17
Figure BDA0003365049770000252
表18
Figure BDA0003365049770000261
检测结果显示：N99位点脱酰胺比例在各放置条件下均未超过5％，也未发生异常增加，整体变化情况及变化率近似。两种PEG-GH电荷异构体的产生以N149位点的脱酰胺为主导，对于该位点的保护作用，本次研究可见PEG60K-rhGH显著优于阳性对照产品，在37℃与40℃条件下，保护效果PEG60K-rhGH优于阳性对照约5～10％。对于加速条件，PEG60K-rhGH加速1月N149位点脱酰胺增加约2％，加速3月相对加速1月增加约6％；而阳性对照样品，加速1月N149位点脱酰胺增加约5.5％，加速3月相对加速1月显著增加25.5％，即有近40％的分子产生了脱酰胺修饰。
对比LC-MS(以N149脱酰胺占比结果为主计算)与上文(2)中的IEC检测所得的电荷异构体比例结果，以PEG60K-rhGH加速条件及阳性对照加速条件为例，PEG60K-rhGH IEC检测电荷异构体含量加速3月相对于加速1月增加6.5％，LC-MS检测加速3月相对加速1月变化率约6％；而阳性对照样品IEC检测电荷异构体含量加速3月相对于加速1月增加25.7％，同时LC-MS检测加速3月相对加速1月变化率约25.5％。两种检测方法得到了较好的互相印证，结果可信度较高。
进一步分析脱酰胺位点，我们可以看到，尽管采用了N端修饰，但是PEG60K-rhGH分子中所使用的长链V型PEG结构对于rhGH分子远端的N149位点仍然起到了较好的保护作用，有效提高了rhGH分子的稳定性。
(4)体外生物学活性
本实施例基于报告基因法，对两种样品稳定性考察各时间点取样进行体外生物学活性比较。本实施例所用报告基因法，系将含有人生长激素刺激反应元件SG和荧光素酶基因Luc的质粒转染到CHO-K1细胞中，构建细胞系GHR-SG-Luc-CHO-K1,作为生物学活性测定细胞。当人生长激素与细胞膜上的受体GHR结合后，通过信号转导，激活人生长激素刺激反应元件SG，启动荧光素酶Luc的表达，表达量与人生长激素的生物学活性成正相关，加入荧光素酶底物后，测定其发光强度，以此测定人生长激素生物学活性。
两种样品体外生物学活性检测结果如图20所示，检测结果显示，两种样品体外生物学活性保留情况见下表：
表19
Figure BDA0003365049770000271
*样品按不同取样时间点分4次检测，根据报告基因法方法学原理，计算活性保留率＝该次检测中的对照品(0点样品)EC50值/该次检测中供试品EC50值
两种样品在加速条件下活性保留存在一定波动，但整体未见显著改变的趋势。但在37℃与40℃条件下，阳性对照样品呈现出了体外活性保留率显著下降的情况。分析认为，在本实施例(1)纯度检测中，该批次阳性对照样品在高温下发生的非共价集聚可能为导致其体外生物学结合效应不佳的原因。PEG60K-rhGH在各放置条件下整体活性未受较大影响，在体外活性上体现出相对较好的稳定性。
本实施例中多个研究条件下PEG60K-rhGH均体现了较好的质量稳定性，我们认为PEG60K-rhGH质量更为可控，在体外能较好的保持高纯度与高均一性，所使用的PEG对rhGH起到了有效的包裹与保护作用。同时，由于PEG60K-rhGH在37℃下能维持相对长时间(20天)的稳定性，其分子具备在实际体温环境下持续、稳定发挥生物学效能的潜力，可作为临床期间延长给药周期方案可行性的侧面支持点之一。

Claims (8)

1.聚乙二醇定点修饰的生长激素，一分子生长激素的N端氨基上偶联一分子聚乙二醇，所述聚乙二醇修饰剂为分支型。
2.权利要求1所述的聚乙二醇定点修饰的生长激素，其特征在于所述聚乙二醇修饰剂为分支型聚乙二醇丙醛。
3.权利要求1所述的聚乙二醇定点修饰的生长激素，其特征在于所述聚乙二醇修饰剂分子量为30-60kDa。
4.权利要求3所述的聚乙二醇定点修饰的生长激素，其特征在于聚乙二醇修饰剂分子量为60kDa。
5.权利要求2所述的聚乙二醇定点修饰的生长激素，其特征在于聚乙二醇修饰剂结构如式(1)或式(2)所示：
Figure FDA0003365049760000011
其中n是670至690的整数；
Figure FDA0003365049760000012
其中n是335至455的整数。
6.权利要求5所述的聚乙二醇定点修饰的生长激素，其特征在于聚乙二醇定点修饰的生长激素的结构如式(3)或式(4)所示：
Figure FDA0003365049760000013
n是670至690的整数，R代表生长激素(除N端首位苯丙氨酸外)；
Figure FDA0003365049760000014
n为335至455的整数，R代表生长激素(除N端首位苯丙氨酸外)。
7.权利要求1-6任一项聚乙二醇定点修饰的生长激素的制备方法：按生长激素与PEG修饰剂摩尔比1:(1-2)的比例向生长激素溶液中加入PEG修饰剂，按PEG修饰剂与还原剂(氰基硼氢化钠)摩尔比1:(50-100)的比例，向PEG修饰剂与蛋白混合溶液中加入还原剂，缓慢搅拌至混合均匀后，于2-8℃条件下，反应18-36h。
8.权利要求1-6任一项聚乙二醇定点修饰的生长激素在制备治疗生长激素缺乏儿童矮小症、成人生长激素缺乏、慢性肾功能不全肾移植前、HIV感染想相关性衰竭综合征、Turner综合征、Prader-Willi综合征、小于胎龄儿、特发性矮身材、短肠综合征、SHOX基因缺陷但不伴GHD患儿、Noonan综合征的药物中的应用。
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