CN102989001A

CN102989001A - Peg化的重组人生长激素化合物

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Publication number: CN102989001A
Application number: CN2012103255821A
Authority: CN
Inventors: H·拉乌; S·金德曼; T·莱斯曼; G·诺斯科夫拉斯姆森; U·赫泽尔; T·韦格; K·斯普罗格
Original assignee: Ascendis Pharma AS
Current assignee: Ascension drug endocrine Limited by Share Ltd
Priority date: 2008-04-29
Filing date: 2009-04-29
Publication date: 2013-03-27
Anticipated expiration: 2029-04-29
Also published as: HUE029926T2; US20190192634A1; US10960053B2; PL3050576T3; JP2018021019A; JP6179997B2; US20210220442A1; US20160206702A1; ES2875426T3; EP3050576B1; HRP20161040T1; PT3050576T; IL228673A0; RU2014129893A; JP2011518863A; CY1117882T1; EP3050576A1; CA2915677C; CN102989001B; EP2279007A2

Abstract

本发明涉及PEG化的重组人生长激素化合物。通过加入包含聚乙二醇的暂时连接体制备的化学修饰的人生长激素(rhGH)。化学修饰的蛋白质比未修饰的rhGH具有更长的rhGH活性持续期，从而能够降低剂量和施用机会，并且修饰的rhGH不会引起脂肪萎缩。本发明还包括治疗和/或预防其中应用生长激素是有利的疾病或障碍的应用方法。

Description

PEG化的重组人生长激素化合物

本申请为2009年4月29日提交的、发明名称为“PEG化的重组人生长激素化合物”的PCT申请PCT/EP2009/055194的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2010年10月29日，申请号为200980115469.7。

技术领域

本发明涉及药物组合物，该药物组合物包含适合的药物赋形剂并且还包含临床有效量的重组人生长激素(rhGH)PEG化的前药，其比可获得的人生长激素产品可以更少频率地施用，并且可能不引起注射副作用脂肪萎缩。本发明还涉及此类前药。

背景技术

生长激素(GH)是在人和其它动物中刺激生长和细胞繁殖的激素。其是191个氨基酸、单链多肽激素，其是前叶垂体侧翼中促生长素细胞合成、贮存并且分泌的。当涉及重组DNA技术生产的生长激素时，该激素也称为促生长素并且缩写为“rhGh”。

生长激素在体内具有多种功能，最显著的功能是增加儿童期的身高，并且数种疾病可以通过GH的治疗应用来治疗。

生长激素缺乏的作用取决于他们发生的年龄而不同。在儿童期，生长不足和身材矮小症是GH缺乏的主要现象。其还可能引起性不成熟。在成年期，缺乏的作用更加明显，并且可能包括力量、精力和骨量的不足，以及心血管风险的增加。

GH缺乏存在很多原因，包括特定基因的突变、涉及下丘脑和/或垂体的先天畸形，以及损伤、手术或疾病引起的垂体损害。

缺乏是通过补充外源GH来治疗的。在目前应用中的所有GH是生物合成的人GH，通过重组DNA技术制备。在儿童期发作(在完成生长期后)或成人发作(通常是后天垂体肿瘤的结果)的GH缺乏的儿童和成年人中，GH用作替代治疗。在这些患者中，优势包括减少脂肪量、增加瘦肉量、增加骨密度、改善脂质分布、减少心血管风险因素和改善心理社会健康。

Genentech Inc(US)第一个克隆了rhGH，并且其描述于专利EP-B22242中。2006年，在美国和欧洲(以及它们的生产商)可获得的合成的生长激素包括Nutropin(Genentech)、Humatrope(Eli Lilly)、Genotropin(Pfizer)、Norditropin(Novo Nordisk)、Saizen(Merck Serono)和Omnitrope(Sandoz)。

尽管分子生物学技术已经显著地增加了很多蛋白质和/或多肽(下文称为蛋白质)的利用度，但是所述蛋白质的治疗用途时常受到其它因素的阻碍，例如由于肾和受体介导的清除引起的短的血浆半衰期、聚集、蛋白质降解、较差的生物利用度和物理性质(预先排除有效的制剂)。

增加蛋白质利用度的原理是通过将蛋白质与衍生化的化合物的缀合，所述的衍生的化合物包括但不限于聚乙二醇和聚丙二醇。公认的某些优点包括：降低免疫原性和抗原性，增加作用持续时间和改变药物动力学性质。[Veronese，F.M.“Enzymes for Human Therapy：：Surface StructureModifications(用于人类治疗的酶：表面结构修饰)”，Chimica Oggi，7：53-56(1989)](本文参考文献5)。

对于医学用途，通过PEG化的rhGH可能通过增加其体内半衰期(从而实现剂量减少或给药频率降低)、改善其稳定性和降低其抗原性或它们的组合来改善分子特性。

通常，对分子进行该类型的修饰是本领域众所周知的并且专利文献中可获得很多专利，这些专利描述了这种概念。例如EP-B 1196443中描述了Hofmann La Roche的PEG化的促红细胞生成素(EPO)，其要求包含与EPO共价键合的PEG的特别的连接体，在Nektar/La Roche公司的EP-B975369中描述了PEG化的干扰素α，并且在Hofmann La Roche公司的EP-B 1562634中描述了另一种PEG化的干扰素α。

rhGH的体内清除被认为是通过下面两种机理发生的。第一种是肾清除，其中rhGH是从循环中通过肾小球过滤清除的。rhGH的肾清除已被很好地证明，并且因此合成的rhGH的PEG化是解决该问题的一个明显的选择。肾清除占rhGH总清除的约25-53％(Girard，J.Mehls，O.J.Clin.Invest.1994年3月；93(3)：1163-1171，本文参考文献3)。

第二种机理是肝清除(肝脏)。GH的肝摄取是通过溶酶体降解后的受体介导的胞吞作用而发生的。

第三种机理是在其它组织(例如软骨的软骨细胞)中的受体介导的清除。通过PEG化降低GH对GH受体的结合亲和力，从而减少受体介导的清除。

但是，对于施用rhGH存在特有的问题。皮下施用rhGH的一个主要缺点是在接受治疗的患者中发生脂肪萎缩。

脂肪萎缩是用于脂肪组织局部丢失的医学术语。皮下施用rhGH制剂已经出现脂肪萎缩问题，其被认为是由注射部位局部高浓度的生长激素复合物引起的。

Büyükgebiz A.等人在J.Pediatr.Endoerinol.Metab，1999年1-2月；12(1)：95-7中描述了此类医学记录(本文参考文献1)。这是一个由于6.7kb基因缺失引起单独GH缺乏的患者的记录，该患者接受高剂量rhGH治疗并且在治疗6年后在注射部位发生了局部脂肪萎缩，而没有任何抗体检测。人们怀疑脂肪萎缩的病因学是高剂量rhGH的直接脂解作用。

与施用rhGh相关的脂肪萎缩被认为是由于rhGH活性本身、更高浓度和延长的暴露引起的。这些更高浓度发生在注射部位附近。

在rhGH被PEG化的情况中，由于增加停留时间，高生长激素活性在注射部位附近聚集的机会甚至更高。在PEG化的rhGH制剂的情况中，组织将经历持续并且增加暴露于生长激素活性，这是由于这样一个事实：PEG化的缀合物具有药理学活性所需的活性，并且缀合物由于缀合物的大小而扩散有限。结果是增加了注射部位的脂解作用。

WO-A 2005/079838描述了PEG化的hGH，其中hGH部分通过氨基官能团连接至聚乙二醇聚合物上，由于氨基的稳定性，其可以认为是永久的结合。此类PEG化的hGH化合物的实例(其出现脂肪萎缩)是化合物PHA-794428。化合物PHA-794428是PEG化的rhGH，并且还在Pharmacia公司(被Pfizer获得)的WO-A 2005/079838中描述，并且进一步在Horm.Res.2006；65(增刊4)：1-213，CF1-98GH/IGF Treatment with title“Firstin-human study of PEGylated recombinant human growth hormone”(题为“PEG化的重组人生长激素的首次在人类中的研究”的CF1-98GH/IGF治疗)，Philip Harris等人(本文参考文献4)中描述。

根据www.clinicaltrials.gov上公开的临床试验信息，该试验于2007年12月10日结束。Pfizer决定终止该计划是由于在2期临床研究中在单独注射PHA 794428后报道注射部位脂肪萎缩的病例。

WO-A 2006/102659(Nektar)也描述并且提出了通过酰胺键形成的rhGH-PEG缀合物(线性和分支类型)。在WO-A 2006/102659中所解决的问题描述于第2页第[0005]段。根据该申请人，所解决的问题是减少给药频率。因为rhGH治疗典型地需要每天注射，患者特别是儿科患者不喜欢这种不便和与该治疗有关的不适。Nektar的WO-A中描述的方案是提供新的PEG-rhGH缀合物。

在WO-A[0257]的表6中，可以看出与没有PEG的天然生长激素相比，PEG-rhGH缀合物具有相对低的体外活性。尽管低的体外活性，PEG化的rhGH缀合物在体内被活化。与阅读部分[0261]相关：“尽管初步的体外结果表明增加与hGH连接的PEG的量降低其刺激hGH受体的能力，基于初步的体内结果，其表明生物活性的降低超出增加半衰期和/或血浆利用度的平衡，因此得到一个结论：当在相同的给药方案中与未修饰的rhGH相比，本文提供的缀合物具有优良的药效学作用”。

WO-A 2006/102659(Nektar)没有描述可自动裂解的连接体-即简单观察到PEG-rhGH缀合物在体内被活化，尽管它们的体外活性显著降低。脂肪萎缩的问题没有解决。

为了实现将所需的性质(降低脂肪萎缩和减少注射频率)设计到hGH的PEG化的缀合物中，一种解决方法是应用前药方法。前药是在表现其药理学作用前经受生物转化的任何化合物。因此，前药可以被视为是包含特别的无毒保护基的药物，这些保护基是以暂时(transient)的方式用于改变或消除母体分子中不希望的性质。在这种情况下，聚合物载体将暂时降低生长激素的活性，从而减少组织脂解作用的可能性。同时暂时缀合至聚合物载体上将延长缀合物的半衰期，从而提供长效递送的hGH。

文献中描述了很多大分子前药，其中大分子载体是通过不稳定的酯基连接至药物上的(例如Y.Luo，MR Ziebell，GD Prestwich，“A HyaluronicAcid-Taxol Antitumor Bioconjugate Targeted to Cancer Cells(靶向癌细胞的透明质酸-紫杉醇抗肿瘤生物缀合物)”，Biomacromolecules 2000，1，208-218；J Cheng等人，Synthesis of Linear，beta-Cyclodextrin BasedPolymers and Their Camptothecin Conjugates(基于线性β-环糊精的聚合物和它们的喜树碱缀合物的合成)，Bioconjugate Chem.2003，14，1007-1017；R.Bhatt等人，Synthesis and in Vivo Antitumor Activity ofPoly(L-glutamic acid)Conjugates of 20(S)-Campththecin(20(S)-喜树碱的聚(L-谷氨酸)缀合物的合成与体内抗肿瘤活性)，J.Med.Chem.2003，46，190-193；R.B.Greenwald，A.Pendri，C.D.Conover，H.Zhao，Y.H.Choe，A.Martinez，K.Shum，S.Guan，J.Med.Chem.，1999，42，3657-3667；B.Testa，J.M：Mayer，Hydrolysis in Drug and Prodrug Metabolism(药物和前药代谢中的水解)，Wiley-VCH，2003，第8章)。在这些情况中，生物活性实体的缀合的官能团是羟基或羧酸。

特别是对于生物大分子但也对于小分子聚合物前药，希望将大分子载体连接至生物活性实体的氨基(即N-末端或蛋白质的赖氨酸氨基)上。这将是一种情况，如果掩蔽药物生物活性需要缀合生物活性实体的某个氨基，例如位于受体结合中涉及的活性中心或区域或表位的氨基。同时，在制备前药的过程中，氨基可能是更具有化学选择性并且用作缀合载体和药物的更好的柄，因为它们比羟基或酚基具有更大的亲核性。对于可能包含大量不同反应官能度的蛋白质而言，这特别正确。在这种情况中，无选择性的缀合反应引起不希望的产物混合物，其需要广泛的表征或纯化并且可能降低反应产率和产品的治疗功效。

前药活化可以通过酶或非酶裂解载体和药物分子间的不稳定桥来实现，或两者的连续组合，即酶解步骤之后进行非酶重排。

在WO-A 2005/099768中描述了含有自动裂解的连接体的PEG化的连接体分子，用于大量的生物分子，包括促生长素(权利要求6)。在WO-A2005/099768中，所解决的问题是患者间的变异性，以及当涉及酶解机理时，前药活化的不可预知的作用(第12页，第17-30行)。该申请描述了作为一种解决方法的芳族连接体，其可以基于PEG。该连接体-PEG以显著降低药物活性的方式与药物结合。只有在释放药物时它才被活化，其是通过水解开始的。水解速率可以以化学方法来控制。对于GH和相关问题、例如脂肪萎缩没有具体强调。

综上所述，以上提及的引文均没有描述基于前药缀合物来开发长效rhGH的方法，所述的缀合物可以更少频率地施用而不增加脂肪萎缩的频率。

因此，本发明的目的是提供前药或包含所述前药的药物组合物，应用与rhGH缀合的PEG减少施用频率而不显著诱导脂肪萎缩。

发明内容

发明概述

因此，本发明提供了药物组合物，该药物组合物包含适合的药物赋形剂并且还包含人体内临床有效量的重组人生长激素rhGH PEG化的前药缀合物，其中PEG通过自身可水解的(自动裂解的)暂时连接体与rhGH连接；所述的前药缀合物的特征在于：

(1)：缀合物的GH活性小于不含PEG的天然生长激素的5％；和

(2)：连接体自动水解速率是体内半衰期为10小时至600小时的速率。

性质(1)确保前药具有低的脂肪萎缩发病率，尽管具有显著延长的体内作用时间。不受理论限制，本发明人认为如果前药具有更高的GH活性，该产品将仍会以比目前市售的rhGH产品更高的频率诱导脂肪萎缩。

性质(2)确保rhGH(不含PEG)随时间逐渐释放，从而可以施用比人生长激素更少频率的rhGH药物产品，例如仅每周一次或每月一次代替每天施用，而与rhGH相比仍能保持全部功效。

优选的是，体内半衰期比相应的hGH PEG化的前药缀合物的体外半衰期短至多5倍，例如2、3、4或5倍。更优选的是，体内半衰期比相应的hGH PEG化的前药缀合物的体外半衰期短至多3倍。最优选的是，体内半衰期比相应的hGH PEG化的前药缀合物的体外半衰期短至多2倍或几乎相同。

本发明应用于rhGH PEG化的前药，特别是rhGH PEG化的载体前药，包括级联载体前药。

前药可以定义为本身没有活性但是可预计转化为活性代谢物的治疗药物(参见B.Testa，J.M：Mayer Hydrolysis in Drug and Prodrug Metabolism(药物和前药代谢中的水解)，Wiley-VCH，2003，第4页)。在载体前药系统中，当聚合物共价缀合至药物分子时，很多药物是没有活性的或表现出降低的生物活性。在这些情况中，应用药物和载体间暂时的连接，在这种方式中，药物在体内从聚合物载体上释放以恢复其生物活性。如果需要缓慢或可控释放药物，与释放的药物相比，降低生物活性的前药具有优势。在该情况中，可以施用相对大量的前药而没有伴随的副作用和过量给药的风险。药物释放是随时间发生的，从而减少重复且频繁施用药物的需要。

在聚合物载体的前药中，生物活性部分通常是通过载体部分和药物分子的官能团之间形成的不稳定的桥连接到聚合物载体部分的。载体前药的裂解产生增加生物活性的分子实体(药物)和至少一种副产物，载体。该副产物可以是生物惰性的(例如PEG)。裂解后，生物活性实体将露出至少一个之前缀合而掩蔽或保护的官能团，并且该基团的存在典型地有助于生物活性。

GH活性可以应用本领域已知的方法来测量。在这个方面，强调实施例1。基于这样一个事实：可用于本发明的某些暂时连接体可以具有小于3000小时的体外半衰期，各自GH活性测量是通过测量包含替代暂时连接体的永久连接体的各自PEG缀合物的GH活性来间接进行的。其可以如WO 2006102659第74页第0240段描述的那样进行，本文描述的rhGH和缀合物的生物活性将应用NB2-II大鼠淋巴瘤细胞增殖分析进行体外评价。简而言之，将衍生自大鼠淋巴瘤的NB2-II细胞与rhGH温育，其引起rhGH分子与细胞表面的受体结合。受体结合诱导信号转导级联，从而引起细胞增殖。分析结果是基于测定的蛋白质浓度和未修饰的rhGH的100％生物活性。

优选的是，对于测量GH活性，应用实施例24中描述的方案。

体外半衰期可以应用本领域已知的方法来测量。在这个方面，强调实施例2。

因此，本发明的第二方面涉及临床有效量的包含第一方面的rhGHPEG化的前药的药物组合物，其用于治疗人GH相关疾病的方法中。

第二方面可以选择性地描述为治疗人GH相关疾病的方法，该方法包括给人施用临床有效量的包含第一方面的rhGH PEG化的前药的药物组合物。

在一种情况中，其中与天然的人GH相比，前药的剩余活性(对于暂时PEG缀合的rhGH的情况)被显著降低，脂解作用可能不会发生，甚至在延长暴露时。

本文描述称为rhGH PEG化的前药的化合物是缀合物，其与人GH相比具有显著降低的剩余活性。为了显示治疗有用的活性，rhGH必须从前药缀合物中释放，对于这一点，本文描述的前药需要经历活化步骤(例如1，6-释放机理)，本文称为自动裂解，将PEG基团从药物中裂解。1，6-释放机理在WO-A 2005/099768中有很好的描述。

不受理论的限制，本发明人认为本文公开的暂时PEG化的rhGH缀合物显著减少了脂肪萎缩，因为在PEG通过可自动裂解的连接体逐渐裂解之前，PEG化的rhGH缀合物具有低活性。这可以确保前药不会比人GH或上述的其它永久PEG化的rhGH化合物更频繁地诱导脂肪萎缩。

本发明潜在的问题也是通过包含适合的药物赋形剂并且还包含式(AA)的人生长激素(hGH)的前药缀合物的药物组合物来解决的

hGH-NH-L^a-S⁰(AA)

其中

hGH-NH表示hGH残基；

L^a表示官能团，其是通过自动裂解诱导基团G^a而自身可水解的(可自动裂解)；并且

S⁰是聚合物链，其分子量为至少5kDa并且包含至少第一个分支结构BS¹，至少第一个分支结构BS¹包含至少第二条分子量为至少4kDa的聚合物链S¹，其中S⁰、BS¹、S¹中至少一个进一步包含自动裂解诱导基团G^a，并且其中分支结构BS¹进一步包含至少第三条分子量为至少4kDa的聚合物链S²，或者S⁰、S¹中至少一个包含至少第二个分支结构BS²，所述的BS²包含至少第三条分子量为至少4kDa的聚合物链S²，并且其中不含hGH-NH的前药缀合物的分子量为至少25kDa并且最大1000kDa、优选至少25kDa并且最大500kDa、甚至更优选至少30kDa并且最大250kDa、甚至更优选至少30kDa并且最大120kDa、甚至更优选至少40kDa并且最大100kDa、甚至更优选至少40kDa并且最大90kDa。

令人惊讶地发现，通过提供具有某最小长度(如它们分子量所定义的)的至少3条链的聚合物载体，本发明的前药的剩余活性可以被有效地降低，从而与本文描述的暂时连接体组合解决了提供hGH前药的问题，其可以更少频率地施用并且没有增加脂肪萎缩的风险。因此，前药应当是水溶性的。

对于至少双-缀合的前药，问题可以通过包含适合的药物赋形剂并且还包含式(AB)的人生长激素(hGH)的前药缀合物的药物组合物来解决

h GH-(NH-L-S⁰)_n (AB)

其中

n是2、3或4；优选2；

hGH(-NH)_n表示hGH残基；

L各自独立地是永久官能团L^p或官能团L^a，其是通过自动裂解诱导基团G^a而自身可水解的(可自动裂解)；并且

S⁰各自独立地是分子量为至少5kDa的聚合物链，其中S⁰任选是分支的，包含至少第一个分支结构BS¹，至少第一个分支结构BS¹包含至少第二条分子量为至少4kDa的聚合物链S¹，其中S⁰、BS¹、S¹中至少一个进一步包含自动裂解诱导基团G^a，并且其中不含hGH-NH的前药缀合物的分子量为至少25kDa并且最大1000kDa、优选至少25kDa并且最大500kDa、甚至更优选至少30kDa并且最大250kDa、甚至更优选至少30kDa并且最大120kDa、甚至更优选至少40kDa并且最大100kDa、甚至更优选至少40kDa并且最大90kDa。

本发明的另一方面是以上定义的前药缀合物。

本发明优选的实施方案在下面仅通过实施例描述。

定义

在讨论本发明详述的实施方案之前，提供关于本发明主要方面的特别术语的定义。

通常，本文所用的所有特别的技术术语应当被理解为技术人员将在本技术背景中理解它们。

rhGH或hGH或GH或hGH残基指的是人生长激素。NH-hGH是hGH残基，其中-NH-hGH的-NH-表示hGH的氨基。

本文的术语“活性”应当被理解为生长激素或其缀合物当施用于哺乳动物、例如在体内模型中诱发生物学响应或在实施例描述的体外模型中产生可测量的响应的能力。

在前药系统中，测量的活性将具有两个贡献，一个来自释放的游离药物实体，并且另一个来自仍未裂解的前药缀合物。为了区分前药缀合物的活性，本文的术语“剩余活性”应当被理解为可归于前药缀合物的测量的前药活性的部分。

本文的术语“自动裂解”应当被理解为暂时连接体和药物分子rhGH之间的键在水性缓冲溶液中在pH 7.4和37℃的生理条件下限速的水解裂解。自动裂解不需要存在酶。该自动裂解或自身水解是提供自动裂解诱导基团控制的，所述的基团是前药分子的部分。该自动裂解诱导基团可以以本身存在或者以掩蔽形式存在，以便在自身水解机制启动前需要暴露。

连接体自动水解速率指的是hGH-PEG化的前药在体内的裂解速率。由于酶或其它作用几乎经常引起前药连接体体内水解比体外进行更快，如果前药的体内半衰期比相应的hGH PEG化的前药缀合物的体外半衰期短至多5倍，那么将其定义为hGH PEG前药以自动水解方式裂解。

本文的术语“暂时连接”或“暂时连接体”应当被理解为描述rhGH PEG化的前药中PEG和rhGH之间连接的不稳定性。在这种暂时连接中，rhGH从相应的前药中释放，其体内连接体半衰期为至多1200小时。

本文的术语“缀合物”应当被理解为共价键合至本文的药物(人生长激素)的一种或多种PEG分子。

术语“暂时缀合物”指的是包含至少一个暂时连接的hGH PEG化的前药。

术语“永久缀合物”指的是hGH PEG化的缀合物或前药，其中PEG聚合物是通过具有体外半衰期为至少3000小时的连接结合到hGH上。

体外半衰期或体外连接体半衰期是在pH 7.4和37℃的缓冲液中从hGH PEG化的前药中释放50％的hGH。

术语“体内半衰期”或“体内连接体半衰期”应当被理解为在施用于人体后其中50％的最初比例的生长激素从hGH PEG化的前药中释放的时间间隔，其是通过考虑如实施例2中描述的化合物相应的缀合物半衰期来计算的。

术语“缀合物半衰期”应当被理解为其中50％的以上定义的hGH PEG化的永久缀合物从血液循环中清除的时间间隔。

本文的术语“脂肪萎缩”应当被理解为用于脂肪组织局部丢失的医学术语。在本文中，“脂肪萎缩”指的是注射部位脂肪萎缩，这意味着组织脂解发生在靠近注射部位。

本文的术语“前药”应当被理解为在显示其全部药理学作用前经历转化的任何化合物。IUPAC定义下给出了前体系统的分类(http:∥www.chem.qmul.ac.uk/iupac/medchem，2004年3月8日接入)：

前药

前药是在显示其药理学作用前经历生物转化的任何化合物。因此，前药可以被认为是包含特别的无毒保护基的药物，所述保护基以暂时的方式用于改变或消除母体分子中不希望的性质。

双重前药(或前-前药)

双重前药是在体内分两步(酶和/或化学方式)转化为活性物质的生物无活性分子。

载体连接的前药(载体前药)

载体连接的前药是包含给定的活性物质与暂时载体基团的暂时连接的前药，所述的暂时载体基团产生改善的物理化学或药物动力学性质，并且其易于体内消除，通常是通过水解裂解。

级联前药

级联前药是其中载体基团的裂解仅在暴露活化基团后变成有效的前药。

生物转化

生物转化是物质通过活有机体或酶制剂的化学转化。

相应地，级联自动水解诱导基团仅在暴露某些自动水解诱导结构元件后变成有作用。为了暴露自动水解诱导结构元件，需要一个或多个级联暴露步骤。至少一个暴露步骤可以基于生物转化步骤。

术语“包含人体内临床有效量的重组人生长激素(rhGH)PEG化的前药的药物组合物”应当被理解为在将药物组合物施用于人后足够高以在人体内获得所需临床作用的量，例如与治疗GH相关疾病有关的所需的临床作用。在本文中，技术人员通常能够调整所施用的重组人生长激素(rhGH)PEG化的前药的量，以获得所需的临床作用。

本文的术语“生理条件”应当被理解为与人体的pH和温度条件相同或相似的任何体外或体内条件。更特别的是，生理条件指的是在约pH 7.4(pH 6.8至pH 7.8)和约37℃(35℃至40℃)的条件。

术语“连接体”频繁地用于生物缀合领域的出版物中并且广义地描述用于连接两个分子实体的化学结构。这种连接可以是永久的或暂时的。

暂时连接体是其中药物与PEG分子的缀合是可逆的连接体。这意味着连接体的裂解释放天然和活化形式的药物。对于载体前药，特别是如果聚合物是永久与连接体结合并且因此连接体相关的降解产物不是作为前药裂解的结果而释放的，在结构上区分暂时连接体单元和聚合物载体可能是困难的。如果连接体既是自动裂解诱导基团又是分支单元，连接体的结构特征甚至更加具有挑战性。因此，在本发明的含义中，术语连接体可以与官能团L^a和自动裂解诱导基团G^a的组合同义应用。在其中载体是分支的PEG的所述的载体前药的情况中，优选应用基于L^a和G^a组合的结构描述。在这种情况下，裂解诱导基团G^a被认为是载体聚合物的部分。G^a的化学性质的变化在很大程度上使相应的载体连接的前药的自身裂解性质得以设计。

术语“永久连接体”指的是PEG通过形成脂族酰胺或脂族氨基甲酸酯而与hGH-提供的伯氨基缀合。如果应用常规的PEG化试剂，产生的缀合物通常对于水解是非常稳定的，并且对于前药系统中的治疗用途而言，酰胺或氨基甲酸酯键的裂解速率将非常缓慢。但是，这种永久连接体缀合物用于研究前药缀合物的治疗用途，因为它们可用于评价剩余活性。

如果这种稳定的连接被用于前药方法中，在治疗应用的时间内没有酶催化，官能团的裂解是不可能的。

术语“水溶性前药”指的是在生理条件下溶于水的前药。典型的是，水溶性前药将透射至少75％、更优选至少95％的相同溶液在过滤后透射的光。按重量计，水溶性聚合物优选至少约35％(重量)溶于水，仍然更优选至少约50％(重量)，仍然更优选至少约70％(重量)，仍然更优选至少约85％(重量)，仍然更优选至少约95％(重量)或完全溶于水。

本文所用的术语“PEG”或“PEG化残基”用于例证以重复单元为特征的适合的水溶性聚合物。适合的聚合物可以选自聚烷氧基聚合物、透明质酸及其衍生物、聚乙烯醇、聚

唑啉、聚酐、聚(原酸酯)、聚碳酸酯、聚氨基甲酸酯、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚有机磷腈、聚硅氧烷、聚乙烯吡咯烷酮、聚氰基丙烯酸酯和聚酯。

PEG链可以包含相互连接的部分、聚合物部分和末端基团。

在hGH PEG化的前药的分支的单缀合物的情况中，临界距离规定为连接的原子所测量的PEG链S⁰与L^a的连接部位与第一个分支结构BS¹之间的最短距离。

本文的术语“PEG载量”应当被理解为包含连接至hGH的多个重复单元的聚合物链的分子质量的描述。总的PEG载量应当被理解为在分子基础上连接至hGH的所有聚合物载体的总的分子质量。

发明详述

包含适合的药物赋形剂的药物组合物

技术人员已知药物组合物包含可药用赋形剂和/或载体。

“可药用的”指的是包括任何赋形剂和/或添加剂，其不干扰活性成分的生物学活性的功效并且其对于所施用的宿主是无毒的。

在优选的实施方案中，药物组合物是皮下施用、肌内施用或静脉内注射的组合物。对于治疗本文描述的相关障碍/疾病，这是优选的施用途径的实例。

药物组合物可以包含除本文描述的rhGH PEG化的前药之外的其它活性成分。

重组人生长激素(rhGH)

由于重组人GH在序列上与天然人GH是相同的，本文的术语重组人生长激素(rhGH)还涉及所谓的生物仿制药(biogenerics)等同物。因此，术语rhGH和hGH在本发明的含义中可以同义应用。

本文的术语“生物仿制药”应当被理解为仿制形式的生物药物；应用生物方法，通常通过现代生物技术活动开发的分子。仿制化学药物可以被定义为当与发明人产品相比时，具有基本上类似活性、基本上化学等同于它们市售相似物、生物等价的、在专利过期后通过简短的程序获得上市许可的那些分子。

技术人员已知现在常规工作是制备例如较少氨基变化的感兴趣的生物制品(本文是GH)而不显著影响生物制品的活性。

除了重组人和生物仿制药，术语重组人生长激素(rhGH)在本文还涉及所有可能的rhGH多肽。

在Pharmacia Corporation的WO-A 2005/079838第15页第0043段至且包括第0053段中给出了可能的rhGH多肽的准确描述。

本文所用的术语“hGH多肽或hGH蛋白质”包括所有的hGH多肽，优选来自哺乳动物物种，更优选来自人和鼠科动物物种，以及它们的变体、类似物、直向同源物、同系物和衍生物以及其片段，其特征在于促进生长期的生长和维持正常的身体组分、合成代谢和脂质代谢。

术语“hGH多肽或蛋白质”优选表示具有A.L.Grigorian等人，ProteinScience (2005)，14，902-913中公开的序列的22kDa hGH多肽以及其变体、同系物和衍生物，其显示出基本上相同的生物活性(促进生长期的生长和维持正常的身体组分、合成代谢和脂质代谢)。更优选的是，术语“hGH多肽或蛋白质”指的是具有准确的上述序列的多肽。

hGH的衍生物特别包括hGH前药缀合物，其包含永久连接的聚合物，例如PEG，即本发明的前药可以包含除一种或多种暂时连接体聚合物缀合物之外的进一步的永久连接体聚合物缀合物。

本文所用的术语“hGH多肽变体”指的是来自相同物种但是与参考hGH多肽不同的多肽。通常，差别是有限的，以致参考和变体的氨基酸序列整体是非常相似的并且在很多区域是相同的。优选的是，hGH多肽至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％等同于参考hGH多肽，优选hGH多肽具有A.L.Grigorian等人，Protein Science(2005)，14，902-913中所示的序列。由于多肽的氨基酸序列至少例如95％“等同”于查询的氨基酸序列，可预期的是主题多肽的氨基酸序列等同于查询的序列，除了主题多肽序列可能包括至多5个氨基酸改变(在查询的氨基酸序列的每100个氨基酸中)。参考序列的这些改变可能发生在参考氨基酸序列的氨基或羧基末端或这些末端位置之间的任何地方，单独散布在参考序列的残基中或散布在参考序列的一个或多个邻近基团中。查询的序列可以是参考序列的全部氨基酸序列或者本文描述的任何特别的片段。

此类hGH多肽变体可以是天然存在的变体，例如天然存在的等位基因变体(其是通过占据生物体的染色体的给定基因座的数个交替形式的hGH之一编码的)，或同种型(其是通过天然存在的源于单个初级转录物的剪接变体编码的)。可选择的是，hGH多肽变体可以是不确定是否天然存在并且可以用领域已知的诱变技术制备的变体。

本领域已知一个或多个氨基酸可以从生物活性肽或蛋白质的N-末端或C-末端删除，而基本上不丢失生物功能(参见例如Ron等人，(1993)，BiolChem.，2682984-2988，将该公开的全部内容并入本文作为参考)。

本领域技术人员还认为hGH多肽的某些氨基酸序列可以是不同的而不显著影响蛋白质的结构或功能。此类突变包括根据本领域已知的通用规则所选的缺失、插入、倒位、重复和取代，以便对活性产生较小影响。例如，在Bowie等人(1990)，Science 247：1306-1310中提供了关于如何制备表型沉默氨基酸取代的指南，将其全部内容并入本文作为参考，其中作者指出了研究氨基酸序列对改变的耐受的两种主要方法。

第一种方法依赖进化过程，其中突变是被天然选择接受的或拒绝的。第二种方法应用基因工程，在克隆的hGH的特别位置引入氨基酸改变并且选择或筛选以鉴定维持功能的序列。这些研究表明蛋白质令人惊讶地耐受氨基酸取代。作者进一步指出氨基酸改变在蛋白质的某些位置可能是允许的。例如，大多数隐蔽的氨基酸残基需要非极性侧链，但是表面侧链的一些特征通常是保守的。在上文的Bowie等人(1990)以及其中引用的参考文献中描述了其它的此类表型沉默取代。

典型地所见的保守取代是脂族氨基酸Ala、Val、Leu和Phe间的互相代替、残基Ser和Thr的羟基互换、酸性残基Asp和Glu的互换、酰胺残基Asn和Gln之间的取代、碱性残基Lys和Arg的互换以及芳族残基Phe、Tyr之间的代替。另外，下列氨基酸组通常表示等价改变：(1)Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gln、Asn、Ser、Thr；(2)Cys、Ser、Tyr、Thr；(3)Val、Ile、Leu、Met、Ala、Phe；(4)Lys、Arg、His；(5)Phe、Tyr、Trp、His。

术语hGH多肽还包括由hGH类似物、直向同源物和/或物种同系物编码的所有hGH多肽。本文所用的术语“hGH类似物”指的是不同的和不相关的有机体的hGH，其在各自的有机体中表现出相同的功能，但是其不是源于有机体祖先共有的祖先结构。代替地，类似的hGH单独出现，后来进化表现出相同的功能(或类似的功能)。换言之，类似的hGH多肽是具有非常不同的氨基酸序列但是表现出相同的生物活性(即在促进生长期的生长和维持正常的身体组分、合成代谢和脂质代谢)的多肽。本文所用的术语“hGH直向同源物”指的是两种不同的物种内的hGH，其序列通过祖先物种中共有的同源hGH而互相关联，但是其已经进化变成互相不同。本文所用的术语“hGH同系物”指的是不同有机体的hGH，其在各自的有机体内表现出相同的功能，并且其源于有机体祖先共有的祖先结构。换言之，同系hGH多肽是具有非常相似的氨基酸序列的多肽，其表现出相同的生物活性，即促进生长期的生长和维持正常的身体组分、合成代谢和脂质代谢。优选的是，hGH多肽同系物可以定义为多肽表现出至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％等同于参考hGH多肽，优选具有以上提及的序列的hGH多肽。

因此，hGH多肽可以是例如：(i)其中一个或多个氨基酸残基是用保守的或非保守的氨基酸残基(优选保守的氨基酸残基)取代的，并且这种取代的氨基酸残基可能是或可能不是由遗传密码编码的；或(ii)其中一个或多个氨基酸残基包含取代基；或(iii)其中hGH多肽是与另一种化合物融合的，所述的化合物例如增加多肽半衰期的化合物(例如聚乙二醇)；或(iv)其中另外的氨基酸是融合到以上形式的多肽上的，例如IgG Fc融合区肽或者前导或分泌序列或者用于纯化以上形式的多肽的序列或者蛋白质序列。

hGH多肽可以是单体或多聚体。多聚体可以是二聚体、三聚体、四聚体或包含至少5个单体多肽单元的多聚体。多聚体还可以是同二聚体或异二聚体。多聚体可以是疏水、亲水、离子和/或共价联合的结果，和/或可以是间接连接的，通过例如脂质体形成。在一个实例中，共价联合是在包含hGH多肽或其片段的融合蛋白中所包含的异源序列之间(参见例如美国专利号5,478,925，将该公开的全部内容并入本文作为参考)。在另一个实例中，hGH多肽或其片段是连接到一种或多个多肽上，所述的多肽可以是hGH多肽或通过肽连接体形成的异源多肽，例如US.5,073,627中描述的那些(将其并入本文作为参考)。

制备多聚体hGH多肽的另一种方法涉及应用融合到已知促进蛋白质的多聚化的亮氨酸拉链或异亮氨酸拉链多肽序列上的hGH多肽，其中发现应用本领域技术人员已知的技术包括WO 94/10308的教导。在另一个实例中，hGH多肽可以通过含有

多肽序列的融合hGH多肽中所含的

多肽序列之间的相互作用而联合。hGH多聚体还可以应用本领域已知的化学技术来产生，例如应用连接分子交联和本领域已知的连接体分子长度优化技术(参见例如US 5,478,925)、本领域已知的在位于多聚体中包含的所需的多肽序列内的半胱氨酸残基间形成一个或多个分子内交联的技术(参见例如US 5,478,925，将半胱氨酸或生物素添加到hGH多肽的C-末端或N-末端)，以及产生包含一个或多个这些修饰的多肽的多聚体的技术(参见例如US 5,478,925)，或者产生包含hGH多聚体的脂质体的30种技术中的任何一种(参见例如美国专利号5,478,925)，将该公开的全部内容并入本文作为参考。

本文所用的术语“hGH多肽片段”指的是包含hGH多肽的连续跨度的部分氨基酸序列的任何肽或多肽，优选具有以上提及的序列的多肽。

rhGH PEG化的前药-优选的PEG，聚合物链

如上所述，本文描述的rhGH PEG化的前药应该具有相对低的活性。

因此，在一个优选的实施方案中，每个生长激素分子的总的PEG载量总计至少25kDa。通常，总的PEG载量将小于1000kDa。优选的是，PEG载量为至少25kDa并且最大500kDa、甚至更优选至少30kDa并且最大250kDa、甚至更优选至少30kDa并且最大120kDa、甚至更优选至少40kDa并且最大100kDa、甚至更优选至少40kDa并且最大90kDa。

PEG可以通过一个或多个锚定点与hGH连接。在一个锚定点的情况中，hGH PEG前药单缀合物中的相应PEG将是分支的并且包含至少3条链。在多于一个锚定点的情况中，例如双缀合物，hGH PEG前药中的相应PEG可以是分支的或线性的。双缀合物可以包含一个或两个暂时连接，并且PEG可以是线性的或分支的或者包含一个线性链和一个分支链的混合物。在这种情况中，双缀合物包含一个暂时连接以及一个线性链和一个分支链，暂时连接可以在其中任一链上。在这种情况中，应用分支的PEG链，可以存在一个或多个分支单元。

分支的PEG是包含连接两条或多条PEG链的分支点的PEG分子，从而与连接生长激素的一个锚定点形成分子。其可以是两条20kDa的PEG链，连接形成一条分支的40kDa的PEG分子。在其中分子包含两个或三个分支点的情况中，该分子分别表示具有3和4个臂的PEG。

总之并且在以上提及的限制内，PEG聚合物不限于特别的结构并且可以是线性的、分支的或多个臂的(例如叉状PEG或与多元醇核连接的PEG)、树枝状的或含有可降解的连接体。

不受理论的限制，PEG载量旨在提供适合的分子质量，从而获得所需的相对低的活性，并且不含有太高分子质量的PEG，太高分子质量的PEG可能导致其它问题。

对天然人GH进行PEG化可以发生在数个赖氨酸基团上或者发生在N-末端胺上(F1)，如Clark等人(本文参考文献2)的第21973页表III所描述的。高度反应性是位点F1和LYS-140。中度反应位点是LYS-115、LYS-38和LYS-70。弱反应性是位点LYS-172、LYS-41、LYS-158和LYS-168。

在更通用的术语中，在本文中与暂时连接体组合应用的PEG可以通过适合选择所述的聚合物来降低脂肪萎缩的风险。但是，本发明的原理还适用于除PEG之外的聚合物。因此，术语PEG在本文中仅用作适合聚合物的实例。

因此，在优选的实施方案中，hGH PEG前药是伯胺基团之一与聚合物链S⁰的可自动裂解的官能团L^a缀合的单缀合物。该聚合物链S⁰的分子量为至少5kDa并且包含至少一个分支结构BS¹。分支结构BS¹包含第二个聚合物链S¹，其分子量为至少4kDa。

如上所述，需要至少第三个聚合物链S²，其分子量为至少4kDa。聚合物链S²可以是BS¹的部分或者可以是S⁰或S¹的进一步的分支，从而引起进一步的分支结构BS²，其包含S²。

在本发明的前药缀合物中存在任选多于3条聚合物链，例如4、5、6、7或8条。但是，每条进一步的聚合物链的分子量为至少4kDa。聚合物链的总数是受前药缀合物的总重量(最大1000Da(不包含hGH-NH))限制。

因此，本发明优选的实施方案涉及组合物，其中分支结构BS¹、BS²中至少一个包含进一步的第四条聚合物链S³，其分子量为至少4kDa，或者S⁰、S¹、S²之一包含第三个分支结构BS³，其包含至少第四条聚合物链S³，其分子量为至少4kDa。

分支结构或聚合物链之一包含自动裂解诱导基团G^a，其是L^a的自动裂解所必需的。

任选的是，分支结构之一用作基团G^a，从而分支结构包含G^a(代替包含所述的基团)，其也包括在术语“包括”中。

前药缀合物(AA)的制备通常产生缀合物的混合物，其中hGH的数个伯胺基团缀合，引起不同的单缀合的、不同的双缀合的、不同的三缀合的等前药。相应的单缀合、双缀合或三缀合的hGH PEG前药可以通过本领域已知的标准方法来分离，例如柱色谱法等。

在hGH PEG前药的单缀合物中，至少三条聚合物链S⁰、S¹、S²包含“聚合物部分”，其特征在于一个或多个重复单元，这些重复单元可以是随机的、嵌段的(block wise)或交替分布的。另外，至少三条聚合物链S⁰、S¹、S²显示末端基团，其典型的是氢原子或具有1至6个碳原子的烷基，其可以是分支的或不分支的，例如甲基，特别是对于基于PEG的聚合物链，引起所谓的mPEG。

需要指出的是，在至少三条聚合物链S⁰、S¹、S²中的聚合物部分可以进一步含有链样取代基，其源于重复单元并且引起具有小于4kDa分子量的链，并且不认为该链是聚合物链S⁰、S¹、S²等。优选的是，至少三条聚合物链S⁰、S¹、S²具有小于1000Da分子量的取代基。

S⁰的相关结构特征是其临界距离。临界距离定义了连接的原子所测量的S⁰与L^a的连接位点与第一个分支结构BS¹之间的最短距离。临界距离的长度对剩余活性有影响，如化合物33所讨论的。临界距离优选小于50、更优选小于20、最优选小于10。

至少三条聚合物链S⁰、S¹、S²典型地各自含有互连部分。在至少一个互连部分中存在G^a。对于除S⁰之外的聚合物链，互连部分是连接例如S¹的聚合物部分与BS¹以及S²的聚合物部分与BS²的结构元件。对于S⁰，互连部分是连接L^a和BS¹的结构元件。

互连部分可以包括C_1-50烷基链，其是分支的或不分支的并且其任选被杂原子或官能团间断或终止，所述的杂原子或官能团选自-O-、-S-、N(R)、C(O)、C(O)N(R)、N(R)C(O)、一个或多个碳环或杂环，其中R是氢或C_1-20烷基链，其任选被一个或多个上述原子或基团间断或终止，其进一步含有氢作为末端原子；并且其中碳环是苯基、萘基、茚基、茚满基、四氢化萘基、C_3-10环烷基；并且其中杂环是4至7元杂环基或9至11元杂二环基。

“C_3-10环烷基”或“C_3-10环烷基环”表示含有3至10个碳原子的环烷基链，其可以含有至少部分饱和的碳-碳双键，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基。环烷基碳上的每个氢可以被取代基代替。术语“C_3-10环烷基”或“C_3-10环烷基环”还包括桥连的二环，例如降冰片烷(norbonane)或降冰片烯(norbonene)。

“4至7元杂环基”或“4至7元杂环”表示含有4、5、6或7个环原子的环，其可以含有至多最大数量的双键(芳族或非芳族环，其是完全饱和的、部分饱和的或不饱和的)，其中至少一个环原子至至多4个环原子被杂原子代替，所述的杂原子选自硫(包括-S(O)-、-S(O)₂-)、氧和氮(包括＝N(O)-)，并且其中环是通过碳或氮原子与分子的其它部分连接的。4至7元杂环的实例是氮杂环丁烷、氧杂环丁烷、硫杂环丁烷、呋喃、噻吩、吡咯、吡咯啉、咪唑、咪唑啉、吡唑、吡唑啉、

唑、

唑啉、异

唑、异

唑啉、噻唑、噻唑啉、异噻唑、异噻唑啉、噻二唑、噻二唑啉、四氢呋喃、四氢噻吩、吡咯烷、咪唑烷、吡唑烷、

唑烷、异

唑烷、噻唑烷、异噻唑烷、噻二唑烷、环丁砜、吡喃、二氢吡喃、四氢吡喃、咪唑烷、吡啶、哒嗪、吡嗪、嘧啶、哌嗪、哌啶、吗啉、四唑、三唑、三唑烷、四唑烷、二氮杂环庚烷、氮杂

或高哌嗪。

“9至11元杂二环基”或“9至11元杂二环”表示含有9至11个环原子的两个环的杂环系统，其中至少一个环原子被两个环共享并且其可以包含至多最大数量的双键(芳族或非芳族环，其是完全饱和的、部分饱和的或不饱和的)，其中至少一个环原子至至多6个环原子被杂原子代替，所述的杂原子选自硫(包括-S(O)-、-S(O)₂-)、氧和氮(包括＝N(O)-)，并且其中环通过碳或氮原子与分子的其它部分连接。9至11元杂二环的实例是吲哚、二氢吲哚、苯并呋喃、苯并噻吩、苯并

唑、苯并异

唑、苯并噻唑、苯并异噻唑、苯并咪唑、苯并咪唑啉、喹啉、喹唑啉、二氢喹唑啉、喹啉、二氢喹啉、四氢喹啉、十氢喹啉、异喹啉、十氢异喹啉、四氢异喹啉、二氢异喹啉、苯并氮杂嘌呤或蝶啶。术语9至11元杂二环还包括两个环的螺环结构，例如1，4-二氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸烷，或者桥连的杂环，例如8-氮杂-二环[3.2.1]辛烷。

碳环、杂环和杂二环可以被C_1-20烷基取代，任选被杂原子或官能团间断或终止，所述的杂原子或官能团选自-O-、-S-、N(R)、C(O)、C(O)N(R)、N(R)C(O)，其中R是氢或C_1-10烷基链，其任选被一个或多个上述原子或基团间断或终止，其进一步含有氢作为末端原子。

至少三条链S⁰、S¹、S²的聚合物部分形成链的主要部分，优选至少90％的每条链的分子量、更优选至少95％、甚至更优选至少97.5％、甚至更优选至少99％。因此，链的主要部分是由聚合物部分来表示的。

优选的是，至少三条链S⁰、S¹、S²独立地基于聚合物，所述的聚合物选自聚烷氧基聚合物、透明质酸及其衍生物、聚乙烯醇、聚

优选的是，至少三条链S⁰、S¹、S²是基于相同的聚合物。优选的是，至少三条链S⁰、S¹、S²是基于聚烷氧基聚合物。甚至更优选的是，至少三条链S⁰、S¹、S²基于聚乙二醇。

相应地，也适用于进一步的链S³、S⁴、S⁵等。

链^S0包含分支结构BS¹，从而S¹与S⁰连接。对于S²的连接，可以应用分支结构BS¹或存在进一步的分支结构BS²，其可以是S⁰或S¹的部分。因此，当存在进一步的链时，可以存在进一步的分支结构。例如，在存在链S³的情况中，其可以与BS¹、BS²或分支结构BS³连接。分支结构BS³，如果存在，可以是S⁰、S¹或S²的部分。

通常，可以应用允许分支的链的任何化学实体。优选的是，分支结构独立地选自至少3-倍取代的碳环、至少3-倍取代的杂环、叔碳原子、季碳原子和叔氮原子，其中术语碳环和杂环如上面所定义的。

rhGH PEG化的前药-暂时连接体结构，L ^a 、G ^a

在本领域的出版物中，自动裂解诱导基团有时被称为连接体，以区分它们与载体的结构。但是，通常难以清楚地分离这些结构特征。因此，在本发明的含义中，裂解诱导基团G^a被认为是载体S的部分，所述的载体S包含至少S⁰、S¹、S²、BS¹和任选的BS²。G^a化学性质的变化在很大程度上使得相应载体连接的前药的自我裂解性质得以设计。

如上面所讨论的，PEG化的前药，其中药物是例如专利申请WO-A2005/099768中描述的rhGH，并且具有释放特征，其中其被描述为1，6裂解系统，而没有产生有毒的芳族化合物。在该文献中，广泛描述了很多相关的适合的暂时连接体结构，以获得感兴趣的相关释放分布。其它暂时连接体结构通常/广泛描述于例如其它复杂生物系统GmbH申请中，例如WO-A 2005/034909、WO-A 2005/099768、WO-A 2006/003014和WO-A2006/136586。

在例如WO-A 99/30727(Enzon Inc)中广泛描述了更多的暂时连接体结构。

为了解决本文讨论的GH的问题，本发明已经选择了适合的优选的暂时连接体结构，以获得本文描述的rhGH PEG化的前药的相关的功能性质。基于本文详述的优选的连接体结构，在技术人员的知识范围内可以制备其它适合的优选的暂时连接体结构，其可以得到具有本文描述的相关功能性质的rhGH PEG化的前药。

特别的是，可以选择适合的暂时连接体结构(其是可自身水解的(可自动裂解))掺入至S⁰。下面详细描述本文所选的连接体结构。

理想的是，本发明的缀合物将具有一种或多种以下特征和/或优于目前rhGH缀合物或制剂的优点：可以易于以高产率合成、半衰期在优选的范围内、可以纯化以提供均匀的缀合物组合物、在自动裂解后表现出活性，例如体外和体内活性，并且具有优于未修饰的rhGH和先前描述的rhGH缀合物的药效学作用并且不引起脂肪萎缩。本文描述的结构表现出本文所需的释放性质。

通常，载体连接的前药需要存在连接药物和载体的可裂解的官能团。在缺乏自动水解诱导基团的情况中，涉及药物提供的氨基(例如脂族酰胺或氨基甲酸酯键L^a)的官能团通常对于水解是非常稳定的，并且酰胺键的裂解速率对于前药系统中的治疗用途将非常缓慢。

如果此类稳定连接被用于载体连接的前药中，在没有生物转化的治疗应用期间，官能团的裂解是不可能的。在这些情况中，连接体显示出结构基序，其作为底物被相应的内源性酶识别。在这种情况中，官能键L^a的裂解涉及包含酶的复合物。实例是肽连接体，其被内源性蛋白酶识别并且酶解。

酶的水平在个体间显著不同，这导致通过酶裂解引起的前药活化的生物学差异。酶的水平还取决于施用部位而不同。例如已知在皮下注射的情况中，身体的某些区域产生比其它区域更可预料的治疗作用。这种高水平的患者间变异性是不希望的。另外，对于这种西酶-依赖的载体连接的前药，难以建立体内-体外药物动力学性质的对应关系。在缺乏可靠的体内-体外对应关系时，优化释放分布变成一项麻烦的工作。

为了避免患者间和注射部位的变异性，需要应用载体连接的前药，其在治疗应用时期内表现出裂解动力学而无需额外的酶帮助裂解。特别是对于高分子量载体，特别是对于分支的聚合物载体，对于酶由于空间位阻，获得连接官能团L^a可能受到限制。因此，需要设计表现自身裂解性质的载体连接的前药。

自动裂解动力学可以例如通过在不含酶的缓冲溶液中记录水解速率来体外测定。

为了将水解不稳定性引入到官能团L(例如酰胺或氨基甲酸酯)中，需要将结构化学组分设计到载体中，以发挥作用，例如作为接近官能团的邻近基团。此类自动裂解诱导化学结构(其对前药酰胺键的可裂解性产生控制)称为自动裂解诱导基团G^a。自动裂解诱导基团可以对给定的官能团L^a的水解速率具有很强的作用。

优选的L^a选自C(O)-O-和C(O)-，其与hGH的伯氨基一起形成氨基甲酸酯或酰胺基团。

因此，优选本发明的组合物，其中L^a选自C(O)-O-和C(O)-，其与hGH的伯氨基一起形成氨基甲酸酯或酰胺基团，产生式(AA1)或(AA2)

hGH-NH-C(O)O-S⁰(AA1)

hGH-NH-C(O)-S⁰ (AA2)

以下部分将列出多种结构组分，其可以用作裂解诱导基团G^a。

基团G^a表示自动裂解诱导基团。G^a可以以本身存在或者作为级联自动裂解诱导基团存在，其是暴露的以通过另外的水解或酶裂解步骤变得有效。如果G^a以本身存在，其控制L^a的限速自动水解。

G^a的实例：

A.J.Garman等人(A.J.Garman，S.B.Kalindjan，FEBS Lett.1987，223(2)，361-3651987)将PEG5000-马来酸酐用于组织型纤溶酶原激活物和尿激酶中氨基的可逆修饰。PEG-uPA缀合物的功能酶的再生是在pH 7.4缓冲液中温育，通过裂解马来酰胺酸连接，一级动力学半衰期为6.1小时。

单一的芳族部分可能意味着连接的氨基甲酸酯键的不稳定性(WO-A01/47562)。例如，在前药方法中应用取代的或未取代的芴基甲基，使得氨基甲酸酯连接对多种生物活性试剂不稳定(Tsubery等人，J Biol Chem 279(2004)38118-24)。在WO-A 2007/075534中两条PEG链与芴基部分连接。

因此，G^a是直接与氨基甲酸酯官能团L^a连接的芳族环或芴基甲基。

因此，优选本发明的组合物，其中G^a是直接与由L^a和hGH的伯氨基形成的氨基甲酸酯官能团连接的芳族环或芴基甲基。

可选择的是，G^a的转化可以诱导S⁰内的分子重排，例如1，4或1，6-消除。该重排使得L^a非常不稳定以至于被诱导裂解。G^a的转化是级联机制中的限速步骤。理想的是，暂时连接的裂解速率等同于给定的治疗方案中药物分子预期释放速率。在这种基于1，6-消除的级联系统中，需要L^a的裂解在其不稳定性被G^a的转化诱导后基本上是同时发生的。另外，需要限速裂解动力学是在治疗应用期间进行，而无需另外的酶帮助，从而避免以上讨论的与大部分酶裂解相关的缺点。

R.B.Greenwald，A.Pendri，C.D.Conover，H.Zhao，Y.H.Choe，A.Martinez，K.Shum，S.Guan，J.Med.Chem.，1999，42，3657-3667和PCT专利申请WO-A 99/30727描述了合成含氨基小分子化合物(基于1，4-或1，6-苄基消除)的聚乙二醇前药的方法。在该方法中，药物分子的氨基是通过氨基甲酸酯基团与PEG化的苄基部分连接的。聚乙二醇通过酯、碳酸酯、氨基甲酸酯或酰胺键与苄基连接。药物分子中PEG的释放是通过自动水解和酶裂解的组合来发生的。在该方法中，释放触发掩蔽基团的裂解之后是经典的且快速的1，4-或1，6-苄基消除。该连接体系统还用于蛋白质的可释放的聚乙二醇缀合物(S.Lee，R.B.Greenwald等人.Bioconj.Chem.2001，12(2)，163-169)。将溶菌酶用作模型蛋白，因为当PEG化发生在赖氨酸残基的ε-氨基时其失去其活性。多种量的PEG连接体与蛋白质缀合。PEG缀合物中天然蛋白质的再生发生在大鼠血浆中或发生在非生理的高pH缓冲液中。还参见F.M.H.DeGroot等人(WO-A 2002/083180和WO-A2004/043493)和D.Shabat等人(WO-A 2004/019993)。

因此，L^a是氨基甲酸酯官能团，所述基团的裂解是通过G^a的羟基或氨基经S⁰的1，4-或1，6-苄基消除来诱导的，其中G^a包含酯、碳酸酯、氨基甲酸酯或酰胺键，其经历限速转化。事实上，G^a可以通过水解裂解。

因此，优选本发明的组合物，其中L^a与hGH的氨基一起形成氨基甲酸酯官能团，所述基团的裂解是通过G^a的羟基或氨基经S⁰的1，4-或1，6-苄基消除来诱导的，其中G^a包含酯、碳酸酯、氨基甲酸酯或酰胺键，其经历限速转化。

G^a可以包含由G^a组分激活的级联裂解系统，其包括代表上述前体的结构组合。G^a的前体可以包含另外的暂时连接，例如酰胺、酯或氨基甲酸酯。前体的暂时连接(例如氨基甲酸酯)对水解的稳定性或敏感性可以由自动水解性质控制或需要酶活性。

Antczak等人(Bioorg Med Chem 9(2001)2843-48)描述了一种试剂，对于含胺的药物分子，其形成了大分子级联前药系统的基础。在该方法中，抗体用作载体，稳定的键将抗体与活化的基团连接，带有可裂解的掩蔽基团。在除去酯连接的掩蔽基团后，La裂解并且释放药物化合物。

D.Shabat等人(Chem.Eur.3.2004，10，2626-2634)描述了基于扁桃酸活化基团的聚合物前药系统。在该系统中，掩蔽基团是通过氨基甲酸酯键与活化基团连接的。活化基团通过酰胺键与聚丙烯酰胺聚合物永久缀合。通过催化抗体活化掩蔽基团后，掩蔽基团通过环化裂解并且释放药物。药物释放后，活化基团仍然与聚丙烯酰胺聚合物连接。

M.-R.Lee等人(Angew.Chem.2004，116，1707-1710)描述了基于扁桃酸活化基团和酯连接的掩蔽基团的类似前药系统。

但是，在这些连接中，1，6消除步骤仍然产生高活性芳族中间体。即使芳族部分与聚合物载体保持永久连接，也可能引起潜在毒性或免疫原性作用的副反应。

Greenwald等人在2000年公开了基于三甲基锁合内酯化作用的含氨基的前药的聚乙二醇药物递送系统(R.B.Greenwald等人，J.Med.Chem.2000，43(3)，457-487；WO-A 02/089789)。在该前药系统中，取代的邻-羟基苯基-二甲基丙酸通过酰胺键与药物分子的氨基偶联。羟基通过酯、碳酸酯或氨基甲酸酯基团与PEG连接。药物释放的速率确定步骤是内酯化作用(释放芳族内酯副产物)的快速酰胺裂解后的这些官能团的酶裂解。

最近，R.B.Greenwald等人(Greenwald等人，J.Med.Chem.2004，47，726-734)描述了基于双-(N-2-羟基乙基)对羟苯基甘氨酸酰胺(N-二(羟乙基)甘氨酸酰胺)连接体的PEG前药系统。在该系统中，两个PEG分子与N-二(羟乙基)甘氨酸分子(其与药物分子的氨基偶联)连接。在前药活化中第一个两步是两个PEG分子的酶裂解。所述的PEG和N-二(羟乙基)甘氨酸之间不同的连接引起不同的前药活化动力学。该系统的主要缺点是与药物分子缀合的N-二(羟乙基)甘氨酸的缓慢水解速率(在磷酸缓冲液中t_1/2＝3小时)，这引起N-二(羟乙基)甘氨酸修饰的前药中间体的释放，与母体药物分子相比，这可能表现出不同的药物动力学和药效学性质。

更特别的是，对于S⁰，以下描述了具有特别间隔部分的优选的基团L^a和G^a。

根据WO-A 2005/099768，优选的结构选自通式(I)和(II)：

其中T表示hGH-NH；X表示间隔部分；Y₁和Y₂各自独立地表示O、S或NR₆；Y₃表示O或S；Y₄表示O、NR₆或-C(R₇)(R₈)；R₃表示选自下列的基团：氢、取代的或未取代的线性、分支或环状烷基或杂烷基、芳基、取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基、氰基、硝基、卤素、羧基、羧基烷基、烷基羰基或酰胺基烷基；R₄表示选自下列的基团：氢、取代的或未取代的线性、分支或环状烷基或杂烷基、芳基、取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基、取代的或未取代的线性、分支或环状烷氧基、取代的或未取代的线性、分支或环状杂烷基氧基、芳基氧基或杂芳基氧基、氰基和卤素；R₇和R₈各自独立地选自：氢、取代的或未取代的线性、分支或环状烷基或杂烷基、芳基、取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基、羧基烷基、烷基羰基、酰胺基烷基、氰基和卤素；R₆表示选自下列的基团：氢、取代的或未取代的线性、分支或环状烷基或杂烷基、芳基、取代的芳基和取代的或未取代的杂芳基；R₁表示S⁰的剩余部分；W表示选自下列的基团：取代的或未取代的线性、分支或环状烷基、芳基、取代的芳基、取代的或未取代的线性、分支或环状杂烷基、取代的或未取代的杂芳基；Nu表示亲核基团；n表示0或正整数(positive imager)；并且Ar表示多取代的芳族烃或多取代的芳族杂环。

在本发明的含义中，基团L^a由Y₃-C(Y₅)NH-(与hGH的氨基一起)表示，G^a由Nu-W-Y₄-C(Y₁)Y₂表示，并且Ar(R₄)_n-C(R₃)XR₁表示S⁰，其进一步包含至少S¹、S²、BS¹并且任选BS²。

在可选择的实施方案中，S¹通过Ar连接或者表示R₃。然后，邻近Y₃的被XR¹取代的碳原子表示分支结构BS¹，S¹用包含G^a的Ar终止。在该实施方案中很显然术语S⁰和S¹是可互换的。

优选的是，式(AA)或(AA1)S⁰是式(AAA1)

其中

G^a具有以上所示的含义；

S⁰⁰是CH₂或C(O)；

S^0A是含有1至20个碳原子的亚烷基链，其任选被一个或多个选自下列的基团、环或杂原子间断或终止：任选取代的杂环、O、S、C(O)和NH；

BS¹、BS²、BS³独立地选自N和CH。

S^0B、S^1A独立地是含有1至200个碳原子的亚烷基链，其任选被一个或多个选自下列的基团、环或杂原子间断或终止：任选取代的杂环、O、S、C(O)和NH；

S^0C、S^1B是(C(O))_n2(CH₂)_n1(OCH₂CH₂)_nOCH₃，其中n各自独立地是100至500的整数，n1各自独立地是0、1、2、3、4、5、6、7或8，并且n2是0或1；

S²、S³独立地是氢或(C(O))_n2(CH₂)_n1(OCH₂CH₂)_nOCH₃，其中n各自独立地是100至500的整数，n1各自独立地是0、1、2、3、4、5、6、7或8，并且n2是0或1，条件是S²、S³中至少一个不是氢；

R²、R³如下面式(A)所定义的。

术语杂环表示以上定义的杂环。任选取代基是例如氧代(＝O)，其中环是至少部分饱和的、分支或不分支的含有1至6个碳原子的烷基链，或卤素。优选的取代的杂环是琥珀酰亚胺。

优选的是，式(AAA1)中G^a是OC(O)-R，并且R是以下所示的式(I)的部分结构，其中R1、R4、R5和n如以下所定义的。

WO 06136586A2中描述了另一个优选的实施方案。因此，优选以下结构：

其中T是NH-hGH；

X是间隔部分，例如R13-Y1；

Y1是O、S、NR6、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、不饱和的碳-碳键或包含自由电子对的任何杂原子，或者Y1不存在；

R13选自取代的或未取代的线性、分支或环状烷基或杂烷基、芳基、取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基；

R2和R3独立地选自氢、酰基或羟基的保护基；

R4至R12独立地选自氢、X-R1、取代的或未取代的线性、分支或环状烷基或杂烷基、芳基、取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基、氰基、硝基、卤素、羧基、酰胺；

R1是S⁰的剩余部分，包含至少S¹、S²、BS¹并且任选BS²。

在该实施方案中，L^a是酰胺基，并且G^a包括含有OR₂/OR₃的N-分支结构。

在另一个优选的实施方案中，前药缀合物D-L给出了优选的结构，其中

-D是NH-hGH；并且

-L是式(I)表示的非生物活性连接体部分-L¹，

其中虚线表示通过形成酰胺键与hGH的氨基连接；

X是C(R⁴R^4a)、N(R⁴)、O、C(R⁴R^4a)-C(R⁵R^5a)、C(R⁵R^5a)-C(R⁴R^4a)、C(R⁴R^4a)-N(R⁶)、N(R⁶)-C(R⁴R^4a)、C(R⁴R^4a)-O或O-C(R⁴R^4a)；

X¹是C或S(O)；

X²是C(R⁷，R^7a)或C(R⁷，R^7a)-C(R⁸，R^8a)；

R¹、R^1a、R²、R^2a、R³、R^3a、R⁴、R^4a、R⁵、R^5a、R⁶、R⁷、R^7a、R⁸、R^8a独立地选自H和C_1-4烷基；或者

任选的是，一个或多个成对R^1a/R^4a、R^1a/R^5a、R^4a/R^5a、R^4a/R^5a、R^7a/R^8a形成化学键；

任选的是，一个或多个成对R¹/R^1a、R²/R^2a、R⁴/R^4a、R⁵/R^5a、R⁷/R^7a、R⁸/R^8a与它们连接的原子一起形成C_3-7环烷基或4至7元杂环基；

任选的是，一个或多个成对R¹/R⁴、R¹/R⁵、R¹/R⁶、R⁴/R⁵、R⁷/R⁸、R²/R³与它们连接的原子一起形成环A；

任选的是，R³/R^3a与它们连接的氮原子一起形成4至7元杂环；

A选自苯基、萘基、茚基、茚满基、四氢化萘基、C_3-10环烷基、4至7元杂环基和9至11元杂二环基；并且

其中L¹被一个L²-Z基团取代并且任选进一步被取代，条件是式(I)中用星号标记的氢不被取代基代替；其中

L²是单个化学键或间隔臂；并且

Z是S⁰的剩余部分，包含至少S¹、S²、BS¹并且任选BS²。

在该实施方案中，L^a由酰胺基表示，并且G^a由N(H^＊)X¹(O)和与N(包括N的取代基)连接的链表示。

欧洲专利申请号08150973.9中描述了该类型的前药缀合物。

因此，优选本发明的组合物，其中L^a-S⁰由式(AAA2)表示

其中虚线表示与hGH的伯氨基连接，从而L^a和氨基形成酰胺键；

X¹是C或S(O)；

X²是C(R⁷，R^7a)或C(R⁷，R^7a)-C(R⁸，R^8a)；

任选的是，R³/R^3a与它们连接的氮原子一起形成4至7元杂环；

其中S⁰被一个基团L²-Z取代并且任选进一步被取代，条件是式(I)中用星号标记的氢不被取代基代替；其中

L²是单个化学键或间隔臂；并且

Z是式(AAA2a)

其中S⁰⁰、S^0A、S^0B、S^0C、S^1A、S^1B、S²、S³、BS¹、BS²和BS³具有以上式(AAA1)中所示的含义。

“烷基”表示直链或分支的碳链。烷基碳的每个氢可以被取代基代替。

“C_1-4烷基”表示含有1-4个碳原子的烷基链，例如如果出现在分子的末端：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基，或者当分子的两个部分通过烷基连接时例如-CH₂-、-CH₂-CH₂-、-CH(CH₃)-、-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH(_C2H₅)-、-C(CH₃)₂-。C_1-4烷基碳的每个氢可以被取代基代替。

“C_1-6烷基”表示含有1-6个碳原子的烷基链，例如如果出现在分子的末端：C_1-4烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正己基，或者当分子的两个部分通过烷基连接时例如-CH₂-、-CH₂-CH₂-、-CH(CH₃)-、-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH(C₂H₅)-、-C(CH₃)₂-。C_1-6烷基碳的每个氢可以被取代基代替。

因此，“C_1-18烷基”表示含有1-18个碳原子的烷基链，并且“C_8-18烷基”表示含有8-18个碳原子的烷基链。因此，“C_1-50烷基”表示含有1-50个碳原子的烷基链。

“C_2-50链烯基”表示含有2-50个碳原子的分支或不分支的链烯基链，例如如果出现在分子的末端：-CH＝CH₂、-CH＝CH-CH₃、-CH₂-CH＝CH₂、-CH＝CH-CH₂-CH₃、-CH＝CH-CH＝CH₂，或者当分子的两个部分通过链烯基连接时例如-CH＝CH-。C_2-50链烯基碳的每个氢可以被进一步指定的取代基代替。因此，术语“链烯基”涉及含有至少一个碳碳双键的碳链。任选的是，可以出现一个或多个三键。

“C_2-50炔基”表示含有2-50个碳原子的分支或不分支的炔基链，例如如果出现在分子的末端：-C≡CH、-CH₂-C≡CH、CH₂-CH₂-C≡CH、CH₂-C≡C-CH₃，或者当分子的两个部分通过炔基连接时例如-C≡C-。C_2-50炔基碳的每个氢可以被进一步指定的取代基代替。因此，术语“炔基”涉及含有至少一个碳碳三键的碳链。任选的是，可以出现一个或多个双键。

“C_3-7环烷基”或“C_3-7环烷基环”表示含有3-7个碳原子的环烷基链，其中可以含有碳-碳双键(至少部分饱和的)，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、环庚基。环烷基碳的每个氢可以被取代基代替。术语“C_3-7环烷基”或“C_3-7环烷基环”还包括桥连的二环，例如降冰片烷或降冰片烯。因此，“C_3-5环烷基”表示含有3-5个碳原子的环烷基。

因此，“C_3-10环烷基”表示含有3-10个碳原子的环烷基，例如C_3-7环烷基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基。术语“C_3-10环烷基”还包括至少部分饱和的碳单-和二环。

“卤素”表示氟、氯、溴或碘。通常优选的卤素是氟或氯。

“4至7元杂环基”或“4至7元杂环”表示含有4、5、6或7个环原子的环，其可以含有至多最大数量的双键(芳族或非芳族环，其是完全饱和的、部分饱和的或不饱和的)，其中至少一个环原子至至多4个环原子被杂原子代替，所述的杂原子选自硫(包括-S(O)-、-S(O)₂-)、氧和氮(包括＝N(O)-)，并且其中环是通过碳或氮原子与分子的剩余部分连接的。4至7元杂环的实例是氮杂环丁烷、氧杂环丁烷、硫杂环丁烷、呋喃、噻吩、吡咯、吡咯啉、咪唑、咪唑啉、吡唑、吡唑啉、

唑、

唑啉、异唑、异

唑烷、异

或高哌嗪。

“9至11元杂二环基”或“9至11元杂二环”表示含有9至11个环原子的两个环的杂环系统，其中至少一个环原子被两个环共享并且其可以包含至多最大数量的双键(芳族或非芳族环，其是完全饱和的、部分饱和的或不饱和的)，其中至少一个环原子至至多6个环原子被杂原子代替，所述的杂原子选自硫(包括-S(O)-、-S(O)₂-)、氧和氮(包括＝N(O)-)，并且其中环是通过碳或氮原子与分子的剩余部分连接的。9至11元杂二环的实例是吲哚、二氢吲哚、苯并呋喃、苯并噻吩、苯并

唑、苯并异

优选的是，L^a-S⁰选自

其中R是H或C_1-4烷基；Y是NH、O或S；并且R¹、R^1a、R²、R^2a、R³、R^3a、R⁴、X、X¹、X²具有以上所示的含义。

甚至更优选的是，L^a-S⁰选自

其中R具有以上所示的含义。

至少1个(至多4个)氢被基团L²-Z代替。在存在多于一个基团L²-Z的情况中，每个L²和每个Z可以独立地选择。优选的是，仅存在一个基团L²-Z。

通常，S⁰可以被L²-Z在远离上式中用星号标记的氢的代替的任何位置被取代。优选的是，R、R¹至R⁸直接给定的1至4个氢或C_1-4烷基或进一步的基团的氢以及R和R¹至R⁸定义的环的氢被L²-Z代替。

另外，S⁰可以任选进一步被取代。通常，可以应用任何取代基，只要不影响裂解原则。

优选的是，一个或多个进一步的任选取代基独立地选自卤素、CN、COOR⁹、OR⁹、C(O)R⁹、C(O)N(R⁹R^9a)、S(O)₂N(R⁹R^9a)、S(O)N(R⁹R^9a)、S(O)₂R⁹、S(O)R⁹、N(R⁹)S(O)₂N(R^9aR^9b)、SR⁹、N(R⁹R^9a)、NO₂、OC(O)R⁹、N(R⁹)C(O)R^9a、N(R⁹)S(O)₂R^9a、N(R⁹)S(O)R^9a、N(R⁹)C(O)OR^9a、N(R⁹)C(O)N(R^9aR^9b)、OC(O)N(R⁹R^9a)、T、C_1-50烷基、C_2-50链烯基或C_2-50炔基，其中T、C_1-50烷基、C_2-50链烯基和C_2-50炔基任选被一个或多个相同或不同的R¹⁰取代，并且其中C_1-50烷基、C_2-50链烯基和C_2-50炔基任选被选自下列的一个或多个基团间断：T、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(R¹¹)-、-S(O)₂N(R¹¹)-、S(O)N(R¹¹)-、-S(O)₂-、-S(O)-、-N(R¹¹)S(O)₂N(R^11a)-、-S-、-N(R¹¹)-、-OC(O)R¹¹、-N(R¹¹)C(O)-、-N(R¹¹)S(O)₂-、-N(R¹¹)S(O)-、-N(R¹¹)C(O)O-、-N(R¹¹)C(O)N(R^11a)-和OC(O)N(R¹¹R^11a)；

R⁹、R^9a、R^9b独立地选自：H、T和C_1-50烷基、C_2-50链烯基或C_2-50炔基，其中T、C_1-50烷基、C_2-50链烯基和C_2-50炔基任选被一个或多个相同或不同的R¹⁰取代，并且其中C_1-50烷基、C_2-50链烯基和C_2-50炔基任选被一个或多个选自以下的基团间断：T、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(R¹¹)-、-S(O)₂N(R¹¹)-、-S(O)N(R¹¹)-、-S(O)₂-、-S(O)-、-N(R¹¹)S(O)₂N(R^11a)-、-S-、-N(R¹¹)-、-OC(O)R¹¹、-N(R¹¹)C(O)-、-N(R¹¹)S(O)₂-、-N(R¹¹)S(O)-、-N(R¹¹)C(O)O-、-N(R¹¹)C(O)N(R^11a)-和-OC(O)N(R¹¹R^11a)；

T选自苯基、萘基、茚基、茚满基、四氢化萘基、C_3-10环烷基、4至7元杂环基或9至11元杂二环基，其中T任选被一个或多个相同或不同的R¹⁰取代；

R¹⁰是卤素、CN、氧代(＝O)、COOR¹²、OR¹²、C(O)R¹²、C(O)N(R¹²R^12a)、S(O)₂N(R¹²R^12a)、S(O)N(R¹²R^12a)、S(O)₂R¹²、S(O)R¹²、N(R¹²)S(O)₂N(R^12aR^12b)、SR¹²、N(R¹²R^12a)、NO₂、OC(O)R¹²、N(R¹²)C(O)R^12a、N(R¹²)S(O)₂R^12a、N(R¹²)S(O)R^12a、N(R¹²)C(O)OR^12a、N(R¹²)C(O)N(R^12aR^12b)、OC(O)N(R¹²R^12a)或C_1-6烷基，其中C_1-6烷基任选被一个或多个相同或不同的卤素取代；

R¹¹、R^11a、R¹²、R^12a、R^12b独立地选自H或C_1-6烷基，其中C_1-6烷基任选被一个或多个相同或不同的卤素取代。

术语“间断”表示在两个碳之间或在碳链末端的碳和氢之间插入基团。

L²是单个化学键或间隔臂。在L²是间隔臂的情况中，其优选被定义为一个或多个以上定义的任选取代基，条件是L²被Z取代。

因此，当L²不是单个化学键时，L²-Z是COOR⁹、OR⁹、C(O)R⁹、C(O)N(R⁹R^9a)、S(O)₂N(R⁹R^9a)、S(O)N(R⁹R^9a)、S(O)₂R⁹、S(O)R⁹、N(R⁹)S(O)₂N(R^9aR^9b)、SR⁹、N(R⁹R^9a)、OC(O)R⁹、N(R⁹)C(O)R^9a、N(R⁹)S(O)₂R^9a、N(R₉)S(O)R^9a、N(R⁹)C(O)OR^9a、N(R⁹)C(O)N(R^9aR^9b)、OC(O)N(R⁹R^9a)、T、C_1-50烷基、C_2-50链烯基或C_2-50炔基，其中T、C_1-50烷基、C_2-50链烯基和C_2-50炔基任选被一个或多个相同或不同的R¹⁰取代，并且其中C_1-50烷基、C_2-50链烯基和C_2-50炔基任选被一个或多个选自下列的基团间断：-T-、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(R¹¹)-、-S(O)₂N(R¹¹)-、-S(O)N(R¹¹)-、-S(O)₂-、-S(O)-、-N(R¹¹)S(O)₂N(R^11a)-、-S-、-N(R¹¹)-、-OC(O)R¹¹、-N(R¹¹)C(O)-、-N(R¹¹)S(O)₂-、-N(R¹¹)S(O)-、-N(R¹¹)C(O)O-、-N(R¹¹)C(O)N(R^11a)-和-OC(O)N(R¹¹R^11a)；

R⁹、R^9a、R^9b独立地选自H、Z、T和C_1-50烷基、C_2-50链烯基或C_2-50炔基，其中T、C_1-50烷基、C_2-50链烯基和C_2-50炔基任选被一个或多个相同或不同的R¹⁰取代，并且其中C_1-50烷基、C_2-50链烯基和C_2-50炔基任选被一个或多个选自以下的基团间断：T、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(R¹¹)-、-S(O)₂N(R¹¹)-、-S(O)N(R¹¹)-、-S(O)₂-、-S(O)-、-N(R¹¹)S(O)₂N(R^11a)-、-S-、-N(R¹¹)-、-OC(O)R¹¹、-N(R¹¹)C(O)-、-N(R¹¹)S(O)₂-、-N(R¹¹)S(O)-、-N(R¹¹)C(O)O-、-N(R¹¹)C(O)N(R^11a)-和-OC(O)N(R¹¹R^11a)；

R¹⁰是Z、卤素、CN、氧代(＝O)、COOR¹²、OR¹²、C(O)R¹²、C(O)N(R¹²R^12a)、S(O)₂N(R¹²R^12a)、S(O)N(R¹²R^12a)、S(O)₂R¹²、S(O)R¹²、N(R¹²)S(O)₂N(R^12aR^12b)、SR¹²、N(R¹²R^12a)、NO₂、OC(O)R¹²、N(R¹²)C(O)R^12a、N(R¹²)S(O)₂R^12a、N(R¹²)S(O)R^12a、N(R¹²)C(O)OR^12a、N(R¹²)C(O)N(R^12aR^12b)、OC(O)N(R¹²R^12a)或C_1-6烷基，其中C_1-6烷基任选被一个或多个相同或不同的卤素取代；

R¹¹、R^11a、R¹²、R^12a、R^12b独立地选自H、Z或C_1-6烷基，其中C_1-6烷基任选被一个或多个相同或不同的卤素取代；

条件是R⁹、R^9a、R^9b、R¹⁰、R¹¹、R^11a、R¹²、R^12a、R^12b之一是Z。

下面列出了甚至更优选的通用芳族结构。

其中NH-rhGH表示与暂时连接体连接的rhGH残基；

R1、R2、R3、R4和R5独立地选自氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基，

PEG表示与暂时连接体连接的PEG化的残基，

并且n＝1或2，并且

X选自C1至C8烷基或者C1至C12杂烷基。

术语“C1至C12杂烷基”表示含有1-12个碳原子的烷基链，其任选被以上定义的杂原子、官能团、碳环或杂环间断。

在优选的实施方案中，在式(A)中，L^a由与rhGH连接的氨基甲酸酯表示，G^a由与羰基连接的芳族氧基团表示，并且与羰基连接的的取代基如式I所示。

通式I给出了更优选的结构，在以上通用芳族连接体结构中，其是结构(A)的部分：

式I

并且其中式I的优选实例包括：

更优选的式II的芳族结构，在以上通用芳族连接体结构中，其是结构(A)的部分：

式II

并且其中式II的优选实例包括：

更优选的式III的结构，在以上通用芳族连接体结构中，其是结构(A)的部分，其中PEG-X是

式III

并且PEG-W包括以下取代基：

以下显示了优选的前药缀合物的一个实例：

R选自氢、甲基、乙基、丙基和丁基。

X选自C1至C8烷基或者C1至C12杂烷基。

在优选的和更优选的实施方案中，PEG优选表示S⁰的剩余部分，包含至少S¹、S²、BS¹并且任选BS²。

在优选的实施方案中，本发明的前药选自

其中m是整数200至250，并且n是整数100至125；

其中n是整数400至500；

其中n是整数400至500；和

其中n是整数400至500。

本发明的前药可以通过本领域已知的方法来制备。但是，特别是对于式(AA1)化合物，优选以汇集合成构建前药分子，通过提供包含一个或多个硫羟基和活化的碳酸酯基团的第一个前体分子和包含马来酰亚胺的第二个前体分子，在加成反应中反应，引起硫代琥珀酰亚胺基团的形成，并且将合并的前体分子与hGH反应，得到式(AA1)化合物。

因此，本发明的另一个方面是制备式hGH-NH-C(O)O-S⁰(AA1)化合物的方法，其中S⁰具有以上所示的含义并且包括至少一个基团

该方法包括以下步骤：

(a)将ROC(O)O-S⁰’-SH(AA1’)化合物与式

(AA2’)化合物反应，其中对于活化的碳酸酯基团R是适合的剩余部分，并且其中选择S⁰’和S⁰”以产生包含至少一个基团

的S⁰，从而产生式ROC(O)O-S⁰化合物，以及

(b)将式ROC(O)O-S⁰化合物与hGH-NH₂反应，其中hGH-NH₂表示含有其伯氨基之一的hGH，从而产生式(AA1)化合物。

对于碳酸酯官能团，适合的R基团包括取代的烷基或碳环或杂环，例如芳基或环烷基，基团例如五氟苯基或NHS基团。

测量rhGH PEG化的前药的功能性质的试验

缀合物的活性和半衰期

为了测量本文描述的前药缀合物的活性和半衰期，需要合成不经历自动水解的“永久”缀合物，其是永久缀合物。

这是通过合成与rhGH PEG化的前药相同的分子来实现的，除了修改引发自动裂解的连接体结构部分。此类相应的化合物将具有剩余活性以及与rhGH PEG化的前药相同的缀合物的循环半衰期。更通常的是，对于任何可自身水解(自动裂解)的暂时连接体缀合的前药，通过对连接体结构进行较小修改，可以合成与前药相同的分子，除了经历自动裂解的能力。

应用相应的缀合物的原因是，如果在实施例1提及的试验中应用本文描述的可自身水解(自动裂解)的暂时连接体，显然缀合物将立即开始释放未修饰的药物，这将影响分析结果。换言之，没有制备永久缀合物而测量剩余活性，这是不可能的，因此未改变的天然药物(例如rhGH)将被释放并且对测量活性起作用。这对于技术人员来说是很显然的。

由于以上解释的原因，可自身水解(自动裂解)的暂时连接体缀合的前药的剩余活性被表示为相应的永久缀合物的活性。永久缀合物以类似于可自身水解(自动裂解)的暂时连接体缀合的前药(实施例20至23)的方式制备，但是在连接体结构中有较小修改，从而连接体不再能够经历自动裂解。实施例10至实施例19中描述了永久缀合物的制备。

根据本发明的一个实施方案，本文描述的rhGH PEG化的前药的特征在于：

(1)：当PEG在前药缀合物中与rhGH连接时，前药的GH活性小于不含PEG的天然生长激素的5％，以避免注射副作用脂肪萎缩；和

(2)：PEG通过可自身水解(自动裂解)的暂时连接体与rhGH连接，其中连接体自动水解速率是体内半衰期为10小时至600小时的速率。

测量性质(1)的试验在本文的工作实施例1中详细描述。根据这些详细的说明，对于技术人员来说，测量该前药的剩余活性是常规工作。

在优选的实施方案中，性质(1)的剩余活性小于5％、更优选小于3％、甚至更优选小于1％并且最优选实际上无活性。

测量性质(2)的试验在本文中的工作实施例2中详细描述。基于这些详细的说明，对于技术人员来说，测量前药的暂时连接体的自动裂解速率是常规工作。

在优选的实施方案中，自动裂解速率体内半衰期体内半衰期为20小时至300小时、更优选20小时至150小时、甚至更优选30小时至150小时、甚至更优选30小时至100小时、甚至更优选40小时至100小时、甚至更优选50至75小时并且还甚至更优选30至75小时。

体内和体外的对应关系

从Ascendis Pharma公司(Complex Biosystems Company)的先前专利申请中已知，体外和体内连接体裂解速率存在良好的对应关系。体内释放动力学可以容易地从体外试验数据中预测。

脂肪萎缩

如上所述，脂肪萎缩是在接近注射部位发生的脂解作用。因此，测量生长激素和生长激素缀合物的体外脂解作用可以用于评估缀合物的脂肪萎缩作用。

为了测量本文描述的前药缀合物的脂解作用，需要合成不经历自动水解的“永久”缀合物，其是永久缀合物。

测量脂肪萎缩的试验在本文中的工作实施例3中详细描述。基于这些详细的说明，对于技术人员来说，测量脂肪萎缩是常规工作。

在优选的实施方案中，本文描述的rhGH PEG化的前药缀合物具有脂肪萎缩作用，这是与人生长激素可比较的，测量是根据实施例3的测量脂肪萎缩的试验和其它相同的给药方案条件。

GH相关的疾病

本文第二方面的术语“GH相关的”疾病简单地涉及其中人可以从GH获益的疾病和障碍。

这包括但不限于生长激素缺乏、成人发生的生长激素缺乏、特纳综合征、普-威综合征、短肠综合征、慢性肾功能不全、小于胎龄(SGA)、AIDS消瘦、抗衰老、类风湿性关节炎、原发性身材矮小、身材矮小同源基因和躯体停滞。还包括其它身材矮小病症，其包括努南综合征、骨骼发育不良、唐氏综合征、与延长类固醇应用相关的身材矮小、奥斯科格综合征等。

还包括慢性肾脏疾病；幼年型类风湿关节炎；囊性纤维化；接受HAART治疗的儿童中的HIV感染(HIV/HALS儿童)；极低出生体重(VLBW)但是SGA的儿童的身材矮小；骨骼发育不良；软骨发育不良；软骨发育不全；原发性身材矮小(ISS)；成年人的GHD；长骨骨折，所述的长骨例如胫骨、腓骨、股骨、肱骨、桡骨、尺骨、锁骨、掌骨、matatarsea、指骨；松质骨骨折，所述的松质骨例如头盖骨(scull)、手的根部和足的根部(base of food)；例如手、膝或肩的腱或韧带手术后的患者；内脱位骨生成；例如在膝、髋、肩、肘、腕或颌中髋或盘代替、关节盘修复、脊柱融合术或假体固定术引起的障碍；固定骨合成材料(例如钉、螺丝和板)引起的障碍；骨折不连接或畸形愈合；骨切开术(例如胫骨或第一趾骨)引起的障碍；移植物植入引起的障碍；外伤或关节炎引起的膝关节软骨降解；特纳综合征患者的骨质疏松症；男性骨质疏松症；慢性透析的成年患者(APCD)；APCD中的营养不良相关心血管疾病；APCD中的恶病质逆转；APCD中的癌症；APCD中的慢性抽象性肺部疾病(chronic abstractivepulmonal disease)；APCD中的HIV；具有APCD的老年人；APCD中的慢性肝病；APCD中的疲劳综合征；克隆病；受损的肝功能；HIV感染的男性；短肠综合征；向心性肥胖；HIV相关的脂肪营养不良综合征(HALS)；男性不育；大部分选择性外科手术后的患者；酒精/药物解毒作用或神经创伤；老化；虚弱老人；骨关节炎；外伤损伤的软骨；勃起功能障碍；纤维肌痛；记忆障碍；抑郁；外伤性脑损伤；蛛网膜下腔出血；极低出生体重；代谢综合征；糖皮质激素肌病；和由于儿童糖皮质激素治疗引起的身材矮小。

附图说明

附图如下所示。

图1显示纯化的永久PEG-hGH缀合物的SDS-PAGE分析，其中泳道1：HiMark^TM预染的高分子量蛋白质标准；泳道2：化合物23；泳道3：化合物23；泳道4：化合物25；泳道5：化合物26；泳道6：化合物33；泳道7：化合物32；泳道8：化合物28；泳道9：化合物28；泳道10：化合物28；泳道11：化合物30；泳道12：化合物34；泳道13：化合物34；泳道14：化合物27；泳道15：化合物29。

图2显示合成缀合物28的猝灭反应溶液的尺寸排阻色谱和纯化的28的尺寸排阻色谱。

图3显示缀合物35的阳离子交换色谱纯化和纯化的35的尺寸排阻色谱。

图4显示缀合物36的阳离子交换色谱纯化和纯化的36的尺寸排阻色谱。

图5显示缀合物37的阳离子交换色谱纯化和纯化的37的尺寸排阻色谱。

图6显示缀合物35在pH 7.4缓冲液和37℃下温育多个时间点的样品的尺寸排阻色谱。

图7至10显示S⁰、S¹、S²、L^a、G^a、BS¹、BS²、BS³所示的优选的本发明的前药缀合物和临界距离。

图11显示缀合物36的药效响应曲线。

详细地，图7和8显示(AA1、AAA1)型的示例性结构35和38，其中包含G^a以及BS¹和BS²的至少5kDa聚合物链的S⁰标记为S⁰；由L^a和hGH的伯氨基形成的氨基甲酸酯基团标记为L^a；BS¹包含标记为S¹的至少4kDa聚合物链，其中S¹包含BS³，其包含标记为S³的至少4kDa聚合物链。BS²包含标记为S²的至少4kDa聚合物链。图7中临界距离为18个原子并且图8中临界距离为4个原子。

在图9和10中，显示了(AA2、AAA2)型的示例性结构，其中由L^a和hGH的伯氨基形成的酰胺基标记为L^a，并且与L^a连接的剩余部分标记为S⁰，其包含G^a，并且“PEG”表示S⁰的剩余部分，其包含至少BS¹、S¹和S²(没有全部显示)。

具体实施方式

实施例

方法

分析型和制备型RP-HPLC

分析型RP-HPLC/ESI-MS在Waters仪器上进行，该仪器包括2695样品管理站、2487二元吸收检测器和装有5μm Reprosil Pur

ODS-3柱(75×1.5mm)的ZQ 4000ESI仪器(Dr.Maisch，Ammerbuch，德国；流速：350μL/分钟，典型的梯度：10-90％在水中的乙腈，0.05％TFA，历经5分钟)。

对于制备型RP-HPLC，应用装有以下的柱(Reprosil Pur

ODS-3)的Waters 600控制器和2487二元吸收检测器

A)：100×20mm，10mL/分钟流速，典型的梯度：10-90％在水中的乙腈，0.1％TFA，历经11分钟

或者

B)：100×40mm(10μm颗粒)，40mL/分钟流速，典型的梯度：10-90％在水中的乙腈，0.1％TFA，历经11分钟。

阳离子交换色谱

缀合物的阳离子交换色谱纯化在装有Macrocap SP柱的

Explorer系统(GE Healthcare)上进行。将在20mM乙酸钠缓冲液(pH 4)中的不同缀合物应用于在20mM乙酸钠缓冲液pH 4(缓冲液A)中预平衡的柱上。将柱用三倍柱体积的缓冲液A洗涤以除去任何未反应的PEG试剂。将缀合物应用10-60％缓冲液B(20mM乙酸钠、1M氯化钠，pH 4.5)经20倍柱体积，或者0-40％缓冲液B经20倍柱体积，然后40-80％B经3倍柱体积的梯度进行洗脱。流速为7mL/分钟，并且洗脱液通过在280nm处检测来监控。

阴离子交换色谱

缀合物的阴离子交换色谱纯化在装有Source Q柱的Explorer系统(GE Healthcare)上进行。将在20mM Tris/HCl缓冲液pH 7.5(缓冲液C)中的不同缀合物应用于在缓冲液C中预平衡的柱上。将柱用3倍柱体积的缓冲液C洗涤以除去任何未反应的PEG试剂。将缀合物应用0-20％缓冲液D (20mM Tris/HCl、1M氯化钠，pH 7.5)的梯度经25倍柱体积洗脱。流速为5mL/分钟并且洗脱液通过在280nm处UV检测来监控。可选择的是，应用缓冲液系统20mM双-tris/HCl，pH 6.5(缓冲液E)和20mM双-tris/HCl、1M氯化钠，pH 6.5(缓冲液F)。

分析型尺寸排阻色谱

分析型尺寸排阻色谱分析在

Explorer系统(GE Healthcare)上进行。样品应用Superdex 200或Sepharose 6柱(10×300mm)分析，并且将20mM磷酸钠、135mM氯化钠，pH 7.4用作流动相。柱流速为0.75mL/分钟，并且将洗脱的hGH和聚合物-hGH缀合物在215nm和280nm处检测。

pfp-活化的mPEG-连接体试剂的活性测量

将确定量的pfp-活化的mPEG-连接体试剂(3-5mg)溶于100μL水中。加入10μL 0.5M NaOH并且将反应混合物在40℃下反应60分钟。加入1.5μL TFA，并且将10％的该混合物通过分析型RP-HPLC分析。色谱图在260和280nm处记录。将对应于五氟苯酚的峰积分。将测量值与适合的标准曲线比较，该标准曲线是通过RP-HPLC分析确定量的pfp产生的，并且在260和280nm处记录色谱图的积分。

SDS-PAGE分析

永久mPEG-hGH缀合物应用

Novex Tris-乙酸盐凝胶(1.5mm厚，15个泳道)、NuPAGE Tris-乙酸盐SDS-运行缓冲液、HiMark^TM预染高分子量蛋白质标准和Simply Blue^TM SafeStain(Invitrogen)分析。在每个泳道中应用0.2-0.6μg缀合物，并且电泳和随后的染色是根据供应商的方案进行的。

实施例1：测量hGH PEG化的前药和hGH活性的试验

hGH的生物活性是通过应用本领域技术人员已知的标准方法来测量的。如EP 1715887B1中所描述的以及以上所讨论的，与天然或修饰的hGH(例如PEG化的hGH)相关的生物活性可以应用标准FDC-P1细胞增殖试验(Clark等人，Journal of Biological Chemistry 271：21969-21977)或受体结合试验(US 5057417)来测量。

在专利EP1715887B1的第8行(第14页)，其描述了优选的体外活性必须尽可能高，最优选的修饰的hGH具有等于或改善的体外生物活性。在本发明中，与天然hGH相比，生物活性必须尽可能低。因此，与EP1715887B1中描述的现有技术相比，本发明人进行的完全相反。

体外试验

以下实施例描述的永久PEG-hGH缀合物的体外活性是应用一种或多种评价体外生物活性的标准方法来测量的。可以应用的标准试验包括细胞增殖试验，应用例如FDC-PI细胞(参见例如Clark等人，Journal ofBiological Chemistry，271：21969-21977，1996)或表达hGH、hGH δ135-146受体的Ba/F3-hGHR细胞或者Nb2大鼠淋巴瘤细胞(其通过催乳受体对hGH响应而增殖)(参见例如Alam，K.S.等人，J.Biotech 2000，Feb.28，78(1)，49-59)。还可以应用受体结合试验(参见例如美国专利申请号5,057,417)。

Nb2-11是Nb-2大鼠淋巴瘤系的克隆，其衍生自淋巴瘤的移植物，该移植物是在延长雌二醇治疗后的雄性诺布尔(Nb)品种大鼠的胸腺/淋巴结中发展的。细胞是前T细胞源，并且它们的增殖取决于哺乳动物催乳激素，例如催乳素。Nb2-11还可以通过IL-2进行促有丝分裂刺激。将Nb2细胞注入Nb大鼠引起恶性肿瘤，这些肿瘤对长春花生物碱的治疗非常敏感。核型分析表明细胞系仅具有5个发育良好的染色体异常。细胞不表达表面免疫球蛋白，并且确定它们催乳激素依赖性。在生物分析中应用Nb2-11的方案是从ECACC请求可获得的。

如WO2006102659在第74页第0240段实施例7所描述的，本文描述的hGH和缀合物的生物活性应该应用NB2-11大鼠淋巴瘤细胞增殖试验进行体外评价。简而言之，将衍生自大鼠淋巴瘤的NB2-11细胞与hGH温育，其引起hGH分子与其细胞表面受体结合。受体结合诱导信号转导级联，其引起细胞增殖。试验结果是基于测量的蛋白质含量和100％生物活性的未修饰的hGH。

结论：

基于实施例1的详细说明，对于技术人员来说测量前药的该剩余活性是常规工作。

实施例2：测量前药的暂时连接体的自动裂解速率的试验

体外半衰期的测量

对于PEG-连接体-hGH缀合物的体外连接体裂解速率的测量，将化合物溶于pH 7.4的缓冲液(例如10mM磷酸钠、140mM NaCl、3mM EDTA)中，并且将溶液经0.22μm滤膜过滤并且在37℃下温育。在时间间隔下取样并且提供RP-HPLC或尺寸排阻色谱在215nm处分析。将对应于释放的hGH的峰积分并且对温育时间作图。应用曲线拟合软件测量一级裂解速率。

体内半衰期测量以及体外/体内半衰期的对应关系

连接体体内裂解速率是通过比较永久PEG-hGH缀合物和不同的带有相同PEG部分的暂时PEG-连接体-hGH缀合物在静脉内注射至大鼠后的药物代谢动力学来测量的。

首先，将永久PEG-hGH缀合物静脉内注射至大鼠中并且在时间间隔内取血样，制备血浆并且应用ELISA分析hGH。

其次，将暂时PEG-hGH缀合物静脉内注射至大鼠中并且在时间间隔内取血样，制备血浆并且应用ELISA分析hGH。

体内半衰期是不同时间点和曲线拟合的暂时缀合物的hGH浓度与永久缀合物的所测得的hGH浓度的比值来计算的。将数据与体外半衰期测量比较。

结论

基于该实施例2的详细说明，对于技术人员来说测量hGH-PEG化前药的体内半衰期是常规工作。

实施例3：测量脂肪萎缩的试验

如上所述，化合物PHA-794428是PEG化的-hGH并且在Pharmacia公司的专利EP 1715887中描述。根据www.clinicaltrials.gov，研究是在2007年12月10日终止的。Pfizer(Pharmacia)决定终止该计划是由于注射部位的脂肪萎缩的情况，脂肪萎缩是在2期临床研究中在单独注射PHA 794428后报道的。脂肪萎缩是描述脂肪组织局部丢失的术语，并且在人体上作为皮肤中的空洞是可见的(通过眼睛可见)。

试验

本领域在测量脂肪萎缩方面描述了数种体外方法。出版物J.Anim.Sci(1972)，35：794-800(L.J.Machlin)第795页描述了一种方案。Int.J.Cancer；80，444-447(1999)中发现了另一种描述。

通常，脂肪萎缩可以如以下所建议的测量。

脂解作用可以应用包括分离的哺乳动物脂肪细胞(优选鼠科脂肪细胞)的体外试验来测量。将试验样品在生理相关的条件下与预定数量的脂肪细胞在包含适合的营养素的Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液中温育至多6小时。释放的甘油浓度是通过标准方法(例如酶)或通过放射检测来测量的。分析包含单独脂肪细胞的对照样品以测量自发的甘油释放。

将天然未修饰的重组人生长激素和永久PEG化的重组人生长激素的脂解作用与暂时PEG化的重组人生长激素的脂解作用进行比较。

结论

基于实施例3的详细说明，对于技术人员来说测量脂肪萎缩作用是常规工作。

实施例4永久连接体试剂12a和暂时连接体试剂12b和12c的合成

化合物6的合成

将6-氨基-己-1-醇(2.85g，24.3mmol)溶于HBr水溶液(48％，10mL，89mmol)中并且在80℃下搅拌3小时。将过量的HBr在50-65℃和15Torr下蒸发并且将残留物真空干燥。

1：产量6.07g(96％)

MS[M+H]⁺＝180.3g/mol(MW+H计算值＝180.0g/mol)。

将DBU (3.5mL，23.2mmol)加入至6-溴己基胺氢溴酸盐1(3.03g，11.6mmol)的悬浮液中，并且加入在DCM(25mL)和DMSO(13mL)中的三苯基-甲硫醇(2.14g，7.74mmol)。将反应混合物在室温下搅拌30分钟并且用水(150mL)稀释。

将水层用醚萃取并且将合并的有机相蒸发。将2通过RP-HPLC纯化。

2：产量1.17g(40％)

MS[M+H]⁺＝376.7g/mol(MW+H计算值＝376.2g/mol)。

将DBU(4.56mL，30.0mmol)加入至在DCM(40mL)中的6-溴-己酸(3.90g，20.0mmol)和三苯基-甲硫醇(11.1g，40.0mmol)中。在室温下搅拌1小时后，加入冰冷的1M H₂SO₄(50mL)并且将混合物用DCM萃取。将合并的有机相经Na₂SO₄干燥并且真空浓缩。将化合物3通过硅胶柱色谱(200mL)纯化，应用庚烷/乙酸乙酯(4/1，R_f＝0.2)作为流动相。

3：产量5.83g(75％)。

将DMAP(37mg，0.31mmol)加入至在DCM(100mL)中的6-三苯甲基硫烷基-己酸3(5.83g，14.9mmol)、噻唑烷-2-酮(3.56g，29.9mmol)和二环己基碳二亚胺(3.08，14.9mmol)中。在室温下搅拌1小时后，加入1MHCl(0.6mL)并且将混合物过滤。将滤液真空浓缩，并且将4通过硅胶柱色谱(180mL)纯化，应用庚烷/乙酸乙酯(1/1)作为流动相。

4：产量7.15g(97％)，为黄色油状物。

历经2分钟，将1-(2-硫代氧代-噻唑烷-3-基)-6-三苯甲基硫烷基-己-1-酮4(1.53g，3.11 mmol)的THF(13mL)溶液加入至在DMSO(1mL)和THF (5mL)中的6-三苯甲基硫烷基-己基胺2(1.17g，3.11mmol)中。加入三乙胺(435μL，3.11mmol)后，将反应混合物在室温下搅拌90分钟。加入醚(200mL)和水(100mL)并且将各相分离。将水相用醚萃取后，将合并的有机相经Na₂SO₄干燥并且真空浓缩。将化合物5通过硅胶柱色谱(150mL)纯化，应用庚烷/乙酸乙酯(2/1，R_f＝0.1)作为流动相。

5：产量1.23g(53％)

MS[M+Na]⁺＝770.6g/mol(MW+Na计算值＝770.4g/mol)

在氮气下，将1M LiAlH₄的THF(1.2mL，4.8mmol)溶液置于干燥烧瓶中，并且历经4分钟加入5(509mg，0.680mmol)的10mLTHF溶液。将混合物在回流下搅拌2小时，直至通过薄层色谱(庚烷/乙酸乙酯1∶1)显示原料完全转化。将反应混合物用10∶1水在乙醚中的悬浮液小心猝灭，直至气体放出停止。将混合物倾倒入50mL酒石酸钠钾饱和溶液中并且搅拌90分钟。加入90mL乙酸乙酯并且将各相分离。将水相用乙酸乙酯萃取(4×20mL)，并且将合并的有机相用盐水(30mL)洗涤，经MgSO₄干燥，过滤并且浓缩，得到透明油状物。将6吸附到硅胶上并且通过快速色谱(30g硅胶，CH₂Cl₂/MeOH 20∶1(v/v)+0.1％NEt₃)纯化。获得产物，为类白色粘稠油状物。

6：产量270mg(54％)

MS[M+H]⁺＝734.4g/mol(MW+H计算值＝734.4g/mol)

R_f＝0.28(CH₂Cl₂/MeOH 19∶1)

化合物9的合成

将AlCl₃(23.0g，172.3mmol)加入至在茴香醚(85mL，781mmol)中的戊二酸酐(10.0g，86.2mmol)中。将反应混合物加热至110℃达2小时，冷却至室温，倾倒入3N HCl/冰中并且用二氯甲烷萃取。将水相用二氯甲烷(4×20mL)萃取，并且合并的有机级分用盐水(30mL)洗涤，经MgSO₄干燥，过滤并且浓缩，得到红色油状物，将其在甲苯中重结晶。获得产物7，为类白色固体。

7：产量5.2g(48％)

MS [M+Na]⁺＝245.8(MW+Na计算值＝245.1g/mol)。

将AlCl₃(9.0mg，68mmol)加入至在1，2-二氯乙烷中的7(5.0g，23mmol)中。将反应混合物在85℃下搅拌14小时，随后冷却至室温。加入冰冷的1N HCl(50mL)，并且将混合物用乙酸乙酯(4×30mL)萃取。将合并的有机级分经Na₂SO₄干燥，过滤并且真空浓缩，得到淡红色固体，将其用于下一步而无需进一步纯化。

8：产量3g(62％)

MS[M+H]⁺＝209.1(MW+H计算值＝209.1g/mol)。

将在DCM(10mL)中的二环己基碳二亚胺(532mg，2.6mmol)、酸8(403mg，1.9mmol)、HOSu(297mg，2.6mmol)和可力丁(1.0mL，7.8mmol)在室温下搅拌90分钟。通过过滤除去二环己基脲后，在滤液中加入在DCM(5mL)中的胺6(947mg，1.3mmol)和DIEA(450μL，2.6mmol)，并且将混合物在室温下反应14小时。加入1N H₂SO₄(2×50mL)并且将各相分离。将水相用乙酸乙酯(4×20mL)萃取，并且将合并的有机相用盐水(30mL)洗涤，经MgSO₄干燥，过滤并且真空浓缩。将残留物通过硅胶柱色谱(150mL)纯化，应用庚烷/乙酸乙酯(1/2，R_f＝0.66)作为流动相。

9：产量819mg(69％)

MS[M+Na]⁺＝946.4(MW+Na计算值＝946.4g/mol)。

永久连接体试剂12a和暂时连接体试剂12b和12c的合成

将9(1当量，175mg，0.19mmol)溶于干燥的THF(1.5mL)中，加入对-硝基苯基氯甲酸酯(1.1当量，42mg，0.21mmol)和DIPEA(2当量，66μL，0.38mmol)并且将混合物在室温下搅拌60分钟。加入二乙胺(R1＝R2＝Et，2当量，39μL，0.38mmol)并且继续搅拌15分钟。将溶剂真空除去，加入100μL AcOH，并且将10a通过RP-HPLC纯化。

MS[M+Na]⁺＝1045.9(MW+Na计算值＝1045.5g/mol)

将NaBH₄(5当量，37mg，0.95mmol)加入至含有10a的HPLC级分(乙腈/H₂O～3/1(v/v)+0.1％TFA)中并且将混合物在室温下反应10分钟。加入另外部分的NaBH₄(5当量，37mg，0.95mmol)并且将反应混合物搅拌直至LC/MS分析显示原料完全转化(在室温下10分钟)。将11a通过RP-HPLC纯化并且冻干。

11a：产量95mg(49％以9为基准)

MS[M+Na+H]⁺＝1047.7(MW+Na计算值＝1047.5g/mol)。

将9(1当量，175mg，0.19mmol)溶于干燥的THF(1.5mL)中，加入对-硝基苯基氯甲酸酯(1.1当量，42mg，0.21mmol)和DIPEA(2当量，66μL，0.38mmol)并且将混合物在室温下搅拌60分钟。加入N，N，N’-三乙基-乙烷-1，2-二胺(R1＝Et，R2＝2-(二乙基氨基)乙基，2当量，68μL，0.38mmol)，并且继续搅拌15分钟。加入100μL 的AcOH，将溶剂真空除去并且将10b通过RP-HPLC纯化并且冻干。

10b：产量147mg，为TFA盐(65％)

MS[M+Na]⁺＝1116.4(MW+Na计算值＝1116.6g/mol)。

10c是如上合成的，应用N，N，N’-三甲基-丙烷-1，3-二胺(R1＝Me，R2＝3-(二甲基氨基)丙基，56μL，0.38mmol)作为二胺。

10c：产量134mg，为TFA盐(59％)

MS[M+Na]⁺＝1088.4(MW+Na计算值＝1088.6g/mol)。

将NaBH₄(46mg，1.2mmol)分两份加入至在MeOH/水＝95∶5(v/v)(3mL)中的10b(147mg，0.12mmol)中，并且将混合物在室温下搅拌1小时。加入AcOH (300μL)并且浓缩后，将产物11b通过RP-HPLC纯化并且冻干。

11b：产量107mg，为TFA盐(73％)

MS[M+Na]⁺＝1118.4(MW+Na计算值＝1118.6g/mol)

11c是根据相同的方案合成的。

11c：产量65mg，为HCl盐(54％)，由134mg原料制备

MS [M+Na]⁺＝1090.4(MW+Na计算值＝1090.6h/mol)。

在氮气气氛下，将双-五氟苯基-碳酸酯(2.5当量，25mg，63μmol)、DMAP(1mg)和DIEA(5当量，22μL，127μmol)加入至在干燥乙腈(0.5mL)中的11a(1当量，26mg，26μmol)中。将反应混合物在室温下搅拌30分钟，冷却至0℃，并且用AcOH(200μL)酸化。将产物12a通过RP-HPLC纯化并且冻干。

12a：产量13mg(42％)

MS[M+Na]⁺＝1258.2(MW+Na计算值＝1257.5g/mol)。

12b和12c相应地分别由11b(56mg，48μmol)和11c(88mg，73μmol)制备。

12b：产量63mg，为TFA盐(93％)

MS[M+H]⁺＝1306.3(MW+H计算值＝1306.6g/mol)。

12c：产量41mg，为TFA盐(41％)

MS [M+H]⁺＝1278.4(MW+Na计算值＝1278.5g/mol)。

实施例5永久连接体试剂14a和暂时连接体试剂14c的合成

13a和13c如WO 2005/099768A2中描述的合成。

在氮气气氛下，将双五氟苯基碳酸酯(631mg，1.6mmol)、DMAP(20mg，0.16mmol)和DIEA(556μL，3.2mmol)加入至在干燥乙腈(5mL)中的13a(364mg，0.64mmol)中。将反应混合物在室温下搅拌15分钟，冷却至0℃，并且用乙酸(1mL)酸化。将产物14a通过RP-HPLC纯化并且冻干。

14a：产量379mg(77％)

MS[M+Na]⁺＝800.4(MW+Na计算值＝800.3g/mol)。

14c相应地由13c(97mg，130μmol)制备。

14c：产量114mg，为TFA盐(94％)

MS [M+H]⁺＝821.5(MW+H计算值＝821.3g/mol)。

实施例6永久连接体试剂15的合成

将戊二酸酐(0.41mmol)、胺6(200mg，0.27mmol)、DIPEA(72μL，0.41mmol)和DMAP(11mg，0.09mmol)在乙腈(3mL)中在80℃下搅拌2小时。将混合物冷却至室温并且加入乙酸(200μL)。将产物15通过RP-HPLC纯化并且冻干。

15：产量130mg(57％)

MS[M+Na]⁺＝870.2(MW+Na计算值＝870.4g/mol)。

实施例7活化的mPEG-连接体试剂的合成

mPEG-马来酰亚胺原料：

与硫羟基反应后的mPEG残基(以下结构中的R3)：

永久pfp-活化的mPEG-连接体试剂17aa、17ab、17ac、17ad以及暂时pfp-活化的mPEG-连接体试剂17b、17ca和17cb的合成

将碳酸酯12a(13mg，10μmol)在10μL AcOH、700μL HFIP、1μLTFA和2μL TES中在室温下搅拌10分钟。将挥发性组分在氮气气流下除去，并且将16a通过RP-HPLC纯化。

16a：产量3.8mg(5μmol)

MS[M+H]⁺＝751.3(MW+H计算值＝751.3g/mol)。

16b和16c相应地分别由12b(7.7mg，5.4μmol)和12c(2mg，1.5μmol)制备。

16b：产量2.5mg(2.7μmol)

MS [M+Na]⁺＝845.1(MW+Na计算值＝844.3g/mol)。

16c：产量0.5mg(0.6μmol)

MS[M+Na]⁺＝816.6(MW+Na计算值＝816.3g/mol)。

将mPEG-马来酰亚胺1B(NOF，日本)(521mg，12.7μmol)加入至在4mL 3/1(v/v)乙腈/水+0.1％TFA中的3.5mg(3.9μmol)16c中。加入200μL的0.5M磷酸盐缓冲液pH 7.4，并且将混合物在室温下反应10分钟。加入1μL(13μmol)巯基乙醇并且通过加入TFA将反应混合物酸化至pH4-5。将17ca通过RP-HPLC纯化并且冻干。

17ca：产量220mg(pfp-碳酸酯活性82％)。

17cb如17ca所描述的那样合成，应用16c(3.5mg，3.9μmol)和mPEG-马来酰亚胺2B(656mg，16μmol)。

17cb：产量130mg(pfp-碳酸酯活性85％)。

将184mg(88μmol)mPEG-马来酰亚胺1A(NOF，日本)加入至在4mL 1/1(v/v)乙腈/水+0.1％TFA中的16a(2.0mg，2.7μmol)中。加入200μL的0.5M磷酸盐缓冲液pH 7.4，并且将混合物在室温下反应10分钟。加入0.2μL(1.6μmol)巯基乙醇并且通过加入TFA将反应混合物酸化至pH2-3。将17aa通过RP-HPLC从未反应的PEG中分离并且冻干。

17aa：产量90mg(pfp-碳酸酯活性88％)。

17ab如上述那样合成，应用16a(3.8mg，5.0μmol)和680mg(16μmol)mPEG-马来酰亚胺1B(NOF，日本)。

17ab：产量250mg(pfp-碳酸酯活性83％)。

17ac如上述那样合成，应用16a(2.5mg，3.3μmol)和200mg(9.5μmol)mPEG-马来酰亚胺2A(Jenkem，中国)。

17ac：产量80mg(pfp-碳酸酯活性80％)。

17ad可以如上述那样合成，应用16a和mPEG-马来酰亚胺2B。

17b可以如17cb中描述的那样合成，应用16b和mPEG-马来酰亚胺1B。

实施例8pfp-活化的永久mPEG连接体试剂19aa和19ab以及暂时永久mPEG-连接体试剂19c的合成

将碳酸酯14c(20mg，21μmol)在10μL AcOH、400μLHFIP和5μLTES中在室温下搅拌10分钟并且冷却至0℃。加入冰冷的乙腈/水＝9/1(v/v)，并且将18c通过RP-HPLC纯化并且冻干。

18c：产量5.0mg，为TFA盐(7.2μmol)

MS [M+H]⁺＝579.6(MW+H计算值＝579.2g/mol)。

18a如上述那样合成，应用碳酸酯14a(24mg，31μmol)。

18a：产量8.0mg(15μmol)

MS[M+H]⁺＝536.2(MW+H计算值＝536.5g/mol)。

将205mg(5μmol)mPEG-马来酰亚胺3A(NOF，日本)加入至在2mL1/1(v/v)乙腈/水+0.1％TFA中的18a(4.0mg，7.5μmol)中。加入100μL的0.5M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，并且将混合物在室温下反应10分钟。通过加入TFA将反应混合物酸化至pH 2-3，并且将19aa通过RP-HPLC从未反应的PEG中分离并且冻干。

19aa：产量125mg(pfp-碳酸酯活性85％)。

19ab相应地由410mg(5μmol)mPEG-马来酰亚胺3B(NOF，日本)和18a(4.0mg，7.5μmol)制备。

19ab：产量265mg(pfp-碳酸酯活性87％)。

19c相应地由205mg mPEG-马来酰亚胺3A和18c(5mg，7.2μmol)制备。

19c：产量120mg(pfp-碳酸酯活性88％)。

实施例9：永久4-臂分支的80kDa mPEG-NHS酯衍生物22的合成

将酸15(12mg，14μmol)在1mL TFA、1mL DCM和10μL TES中在室温下搅拌10分钟。将挥发性组分在氮气流下除去，并且将二硫醇20通过RP-HPLC纯化。

20：产量2.9mg(8μmol)

MS[M+Na]⁺＝386.8(MW+Na计算值＝386.2g/mol)。

将在170μL乙腈中的20(1mg，2.8μmol)加入至在4mL 1/1(v/v)乙腈/水+0.1％TFA中的mPEG-马来酰亚胺1B(NOF，日本)(380mg，9.2μmol)中。加入200μL的0.5M磷酸盐缓冲液pH 7.4，并且将混合物在室温下反应10分钟。加入0.6μL(7.8μmol)巯基乙醇，并且通过加入TFA将反应混合物酸化至pH 4-5。将缓冲液换成0.005％HCl(HiPREP脱盐柱，26/10GE healthcare)，并且将21冻干而无需进一步纯化。

21：产量320mg。

将21溶于50mL甲苯中，并且将聚合物溶液应用Dean-Stark分水器在回流下共沸干燥2小时。然后，将聚合物溶液冷却至室温。通过加入冷冻的醚(60mL)将干燥的mPEG-连接体试剂21沉淀。

将在DCM中的二环己基碳二亚胺(1.2mg，6μmol)加入至21(240mg，3μmol)和N-羟基-琥珀酰亚胺(0.7mg，6μmol)的DCM(3mL)溶液中。将反应混合物在室温下搅拌14小时，并且通过加入冷的醚(20mL)将22沉淀。将产物22真空干燥。

22：产量200mg。

实施例10：应用线性40kDa mPEG-琥珀酰亚胺基己酸酯衍生物合成永久酰胺-连接的mPEG-hGH单缀合物23和mPEG₂-hGH双缀合物24

将hGH缓冲液换成50mM硼酸钠pH 8.5(可选择的是，可以应用硼酸钠pH 8或硼酸钠pH 9)。hGH的浓度为约2.5mg/mL。将相对hGH的量为三倍摩尔过量的40kDa mPEG-琥珀酰亚胺基己酸酯衍生物(NOF，日本)溶于水中以形成20％(w/v)试剂溶液(可选择的是，可以应用四倍或五倍摩尔过量)。将试剂溶液加入至hGH溶液并且混合。将反应混合物在室温下温育2小时并且在室温和pH 7下用羟基胺猝灭2小时。将猝灭的反应混合物通过尺寸排阻色谱分析。将单缀合物23和双缀合物24通过阳离子交换色谱纯化。可选择的是，可以将阴离子交换色谱用于纯化。将纯化的缀合物通过SDS-PAGE分析(图1)。

实施例11：应用分支的40kDa mPEG-NHS酯衍生物合成永久酰胺-连接的mPEG-hGH单缀合物25和mPEG-hGH双缀合物26

永久mPEG-hGH单缀合物25和双缀合物26根据实施例10中描述的方法合成，应用分支的40kDa mPEG-NHS酯衍生物(NOF，日本)。将纯化的缀合物通过SDS-PAGE分析(图1)。

实施例12：应用4-臂分支的80kDa mPEG-NHS酯衍生物合成永久酰胺-连接的mPEG-hGH单缀合物27

永久mPEG-hGH单缀合物27根据实施例10所描述的，应用4-臂分支的80kDa mPEG-NHS酯衍生物22。将纯化的27通过SDA-PAGE分析(图1)。

实施例13：应用4-臂分支的40kDa mPEG-五氟苯基碳酸酯衍生物17aa合成永久氨基甲酸酯-连接的mPEG-hGH单缀合物28

将hGH缓冲液换成50mM硼酸钠pH 9(可选择的是，可以应用硼酸钠pH 8.5或硼酸钠pH 8)。hGH的浓度为约2.5mg/mL。将相对hGH的量四倍摩尔过量的永久4-臂分支的40kDa mPEG-连接体试剂17aa溶于水中以形成20％(w/v)试剂溶液。将试剂溶液加入至hGH溶液中并且混合。将反应混合物在室温下温育1.5小时并且通过在pH 7和室温下在100mM羟基胺中温育2小时来猝灭。将猝灭的反应混合物通过尺寸排阻色谱分析(图2上)。将永久mPEG-连接体-hGH单缀合物28通过pH 7.5的阴离子交换色谱纯化，并且通过SDS-PAGE(图1)和尺寸排阻色谱(图2下)分析。

实施例14：应用4-臂分支的80kDa mPEG-五氟苯基碳酸酯衍生物合成永久氨基甲酸酯-连接的mPEG-hGH单缀合物29

永久氨基甲酸酯-连接的mPEG-hGH单缀合物29根据实施例13合成，应用4-臂分支的80kDa mPEG-五氟苯基碳酸酯衍生物17ab。将纯化的29通过SDS-PAGE分析(图1)。

实施例15：应用4-臂分支的40kDa mPEG-五氟苯基碳酸酯衍生物17ac合成永久氨基甲酸酯-连接的mPEG-hGH单缀合物30

永久mPEG-hGH单缀合物30根据实施例13合成，应用4-臂分支的40kDa mPEG-五氟苯基碳酸酯衍生物17ac。

将纯化的30通过SDS-PAGE分析(图1)。

实施例16：应用4-臂分支的80kDa mPEG-五氟苯基碳酸酯衍生物合成永久mPEG-hGH单缀合物31

永久mPEG-hGH单缀合物31可以根据实施例13合成，应用4-臂分支的80kDa mPEG-五氟苯基碳酸酯衍生物17ad。

实施例17：应用4-臂分支的40kDa mPEG-五氟苯基碳酸酯衍生物合成永久氨基甲酸酯-连接的mPEG-hGH单缀合物32

永久氨基甲酸酯-连接的mPEG-hGH单缀合物32根据实施例13合成，应用4-臂分支的40kDa mPEG-五氟苯基碳酸酯衍生物19aa。将纯化的32通过SDS-PAGE分析(图1)。

实施例18：应用4-臂分支的80kDa mPEG-五氟苯基碳酸酯衍生物合成永久氨基甲酸酯-连接的mPEG-hGH单缀合物33

永久mPEG-hGH单缀合物33根据实施例13合成，应用4-臂分支的80kDa mPEG-五氟苯基碳酸酯衍生物19ab。

将纯化的33通过SDS-PAGE分析(图1)。

实施例19：应用分支的40kDa mPEG-丙醛衍生物合成永久胺-连接的mPEG-hGH单缀合物34

将hGH缓冲液换成50mM MES缓冲液pH 6(可选择的是，应用HEPES缓冲液pH 7)，并且将hGH的浓度调节至1.5mg/mL。将相对hGH的量三倍摩尔过量的40kDa mPEG-丙醛(GL2-400AL3，NOF，日本)溶于水中以形成25％(w/v)试剂溶液。将试剂溶液加入至hGH溶液中并且混合。加入一等份1M氰基硼氢化钠在水中的储备液以在反应混合物中终浓度为25mM。将溶液在室温下避光温育18小时。将反应通过加入Tris缓冲液猝灭。将反应混合物通过尺寸排阻色谱分析，并且将缀合物34通过阳离子交换色谱纯化。将纯化的mPEG-hGH单缀合物34通过SDS-PAGE分析(图1)。

实施例20：应用暂时4-臂分支的40kDa mPEG-五氟苯基碳酸酯衍生物19c合成暂时氨基甲酸酯-连接的mPEG-hGH单缀合物35

将hGH缓冲液换成50mM硼酸钠pH 9(可选择的是，可以应用硼酸钠pH 8.5或硼酸钠pH 8)，并且将hGH的浓度调节至2.5mg/mL。将相对hGH的量四倍摩尔过量的暂时mPEG-连接体试剂19c溶于水中以形成20％(w/v)试剂溶液。将试剂溶液加入至hGH溶液中并且混合。将反应混合物在室温下温育1小时并且通过在pH 7和室温下在100mM羟基胺中温育2小时来猝灭。将mPEG-连接体-hGH单缀合物通过阴离子交换色谱在pH 6.5下纯化(图3上)，并且通过尺寸排阻色谱分析(图3下)。

实施例21：应用4-臂分支的80kDa mPEG-五氟苯基碳酸酯衍生物合成暂时mPEG-连接体-hGH单缀合物36

将hGH缓冲液换成100mM硼酸钠pH 9(可选择的是，可以应用硼酸钠pH 8.5或硼酸钠pH 8)，并且将hGH的浓度调节至10mg/mL。将相对hGH的量四倍摩尔过量的暂时4-臂分支的80kDa mPEG-连接体试剂17ca溶于水中以形成25％(w/v)试剂溶液。将试剂溶液加入至hGH溶液中并且混合。将反应混合物在室温下温育45分钟并且通过在pH 7和室温下在100mM羟基胺中温育2小时来猝灭。将mPEG-连接体-hGH单缀合物36通过阳离子交换色谱纯化(图4上)，并且通过尺寸排阻色谱分析(图4下)。

实施例22：应用4-臂分支的80kDa mPEG-五氟苯基碳酸酯衍生物17cb合成暂时mPEG-hGH单缀合物37

PEG-连接体-hGH单缀合物37根据实施例21中描述的方法合成，应用活化的mPEG-连接体试剂17cb。

图5上和下分别显示了阳离子交换色谱图和分析型尺寸排阻色谱图。

实施例23：应用4-臂分支的80kDa mPEG-五氟苯基碳酸酯衍生物17b合成暂时氨基甲酸酯-连接的mPEG-hGH单缀合物38

暂时氨基甲酸酯-连接的mPEG-连接体-hGH缀合物38可以如实施例21中所描述的那样合成，应用暂时4-臂分支的80kDa mPEG-连接体试剂17b。

实施例24：测量hGH PEG化的前药和hGH活性的试验

对于技术人员来说，测量聚合物前药的剩余活性是常规工作，如应用实施例1中描述的标准试验，通过相应永久聚合物缀合物的活性来表示。

特别的是，将NB2-11细胞与100ng/mL hGH补充物在无血清的培养基中培养。对于体外增殖试验，将含有2×10⁵个细胞/mL的细胞悬浮液用无血清并且无hGH的培养基洗涤两次，并且分散至96-孔平底微量滴定板中(10⁴个细胞/孔)。将系列稀释步骤(9步，每步间应用的稀释因子为3)的化合物进行试验，一式三份。将细胞和化合物溶液温育48小时，随后与细胞增殖试剂WST-1温育2.5小时。将NB2-11增殖通过在ELISA读板器中的光密度读数来测量，并且将响应作为浓度的函数制图，并且测量EC50值。结果显示为％剩余体外生物活性，相对于未修饰的hGH，如表1所提供的。

在上述体外试验中，天然hGH(来源Novo Nordisk，丹麦)用作参考化合物。相同的hGH制备方法用于合成永久PEG-hGH缀合物。

表1

表1：与天然hGH(Norditropin，Novo Nordisk，丹麦)相比，永久PEG化的hGH缀合物的体外生物活性。

结论：

由表1可见，通过将适合的PEG分子与hGH缀合，PEG化的hGH的体外活性可以降低至小于天然未缀合的hGH的5％。例如，将分支的PEG 4×20kDa与hGH缀合，将剩余活性降低至未缀合的hGH标准的0.7％。

另外，从这些结果来看，还惊讶地发现，PEG化的生长激素的剩余活性不仅与连接的PEG大小相关，而且与分支程度以及hGH与PEG结构中的分支点的间距相关。

线性PEG

特别的是，与天然hGH相比，将40kDa线性PEG与hGH连接引起10.3％的体外活性(化合物23)。

分支的PEG

与天然hGH相比，当连接分支的2×20kDa PEG(化合物25)时，体外活性进一步降低至4.4％。

另外，与天然hGH相比，当连接具有短间距(hGH与PEG试剂中的分支点间的距离)的4×20kDa PEG(化合物27和29)时，体外活性甚至进一步分别降低至0.7％。

令人惊讶的是，当连接具有相对长间距(人生长激素与PEG试剂中的第一个分支点间的距离)的4×20kDa PEG(例如化合物33)时，体外活性降低较小(2.2％)，这表明hGH官能团与分支的PEG试剂中第一个分支点的间距的重要性。

将多于一个PEG部分与hGH缀合以形成双PEG-缀合物，体外活性降低至低于0.5％(例如化合物24和26)。

实施例25：测量缀合物35、36、37和38的体外自动裂解速率

在pH 7.4和37℃下，缀合物35、36和37的自动裂解速率如实施例2中所描述的测量。测量的这些缀合物的自动裂解半衰期约为75小时。图6显示了温育的样品35在0小时、8小时、47小时、97小时和168小时后分析的尺寸排阻色谱图，其表明hGH从缀合物35中随时间缓慢释放。相应地测量了缀合物38的自动裂解速率，并且半衰期约为50小时。

实施例26：测量hGH PEG化前药的终点体内半衰期的试验，所述的半衰期是以相应的永久缀合物体内半衰期表示的

永久缀合物的药物动力学是在静脉内注射0.25mg(hGH等价物)至大鼠后测量的。为了选择适合于人每周注射的缀合物，需要大于10小时的大鼠血浆半衰期。

将每只大鼠单剂量0.25mg hGH或0.25mg永久PEG-hGH缀合物(基于hGH剂量)静脉内施用于Wistar大鼠(200-250g)中。将两组动物(每组两只)用于每种化合物。200-300μL全血是舌下采集的，每只动物和每个时间点获得100μL肝素钙血浆。对于组1，样品是在0.5、3、24、48、72和96小时后采集的，对于组2，样品是在5、8、32、56、80和168小时后采集的。血浆样品存于-80℃直至试验。

hGH和PEG-hGH缀合物浓度应用hGH ELISA试剂盒(DSL)测量。血浆浓度从不同的缀合物或hGH和对时间绘制的标准曲线计算，并且应用单室模型计算终点半衰期(t_1/2)。表2列出了半衰期的测量结果。

为了选择适合于人每周注射的缀合物，进行了大鼠中的药物动力学研究。由于PEG化的缀合物在大鼠中的半衰期比在人体中快5倍的范围，PEG化的hGH在大鼠中的半衰期应该为约10小时或更长。为了获得估计的无连接体裂解的缀合的hGH PEG化的前药的半衰期，将永久缀合的相应的缀合物注射至大鼠中。

表2列出了体内半衰期的测量结果。

表2

化合物	体内特征：永久缀合物的体内半衰期
		天然hGH(Novo Nordisk，丹麦)	20分钟
23	4小时
		25	5小时
26	11小时
		27	13小时

表2：永久PEG-hGH缀合物在大鼠中的半衰期

结论：

从表1和表2清楚地看出，剩余活性与半衰期成相反关系，例如高度的剩余活性引起更快的消除。对于缀合物典型地是通过受体介导的清除机制来消除的。

另外，为了获得可以在人体中每周施用一次并且具有低剩余活性的hGH PEG化的前药，优选具有一个或多个分支点和40kDa或更大的分子量的PEG分子。可选择的是，PEG与hGH上的多于一个位点缀合以形成双PEG-hGH缀合物，这引起长的终止半衰期。

实施例27：暂时氨基甲酸酯-连接的mPEG-连接体-hGH缀合物36和人生长激素在食蟹猴(Cynomolgus Monkey)中的药效研究

本研究的目的是比较一个剂量的暂时氨基甲酸酯-连接的mPEG-连接体-hGH缀合物36与每日一次人生长激素给药一周在食蟹猴中的药效响应。

研究以下给药组：

由于暂时氨基甲酸酯-连接的mPEG-连接体-hGH缀合物36是应用80kDa PEG基团进行的暂时PEG化，因此在5和10mg/kg暂时氨基甲酸酯-连接的mPEG-连接体-hGH缀合物36给药组中hGH的量分别为约1和2mg/kg。因此，在暂时氨基甲酸酯-连接的mPEG-连接体-hGH缀合物36的10mg/kg组中hGH的量等同于0.3mg/kg hGH的日剂量。

应用1mL/kg的剂量体积，将每种检品皮下注射至2只食蟹猴(一只雄性，1只雌性)中。动物的年龄和体重分别为2.5-3岁和2.0-2.5kg。

从股动脉/静脉中采集血样用于测量IGF-1的血清浓度，IGF-1是人生长激素的药效标志物。血样在以下时间点采集：在第1天给药后的0(前剂量)、3、6、12、24、36、48、72、96、120和144小时。

采集血样，使其凝结，然后贮存于冰块上或湿冰上直至离心。离心后，将血清样品等份分装至预标记的小瓶中并且紧紧盖好。在等份分装至小瓶的基础上将小瓶在-70℃下贮存。

血清样品中的IGF-1水平应用Quantikine人IGF-1ELISA试剂盒(R&D系统)测量，该试剂盒已经适合并且确认用于测量食蟹猴血清中的IGF-1水平。

图11显示了检品的药效响应。与载体组测量的水平相比，每日hGH施用和一次施用暂时氨基甲酸酯-连接的mPEG-连接体-hGH缀合物36都增加了IGF-1水平。一次施用5mg/kg暂时氨基甲酸酯-连接的mPEG-连接体-hGH缀合物36等同于每日hGH施用，而一次施用10mg/kg暂时氨基甲酸酯-连接的mPEG-连接体-hGH缀合物36显示出优于每日hGH。这清楚地表明每周一次剂量的暂时氨基甲酸酯-连接的mPEG-连接体-hGH缀合物36优于相等日剂量的hGH。

缩略语：

DBU 1，3-二氮杂二环[5.4.0]十一烯

DCM 二氯甲烷

DIEA 异丙基乙基胺

DMAP 甲基氨基-吡啶

DMF N，N-二甲基甲酰胺

DMSO 二甲亚砜

eq 化学计算当量

fmoc 9-芴基甲氧基羰基

HFIP 六氟异丙醇

HOSu N-羟基琥珀酰亚胺

LCMS 质谱偶联的液相色谱

Mal 马来酰亚胺基丙酰基

MS 质谱

MW 分子量

PEG 聚乙二醇

RP-HPLC 反相高效液相色谱

R_f 保留因子

r.t. 室温

SEC 尺寸排阻色谱

Suc 琥珀酰亚胺基丙酰基

TES 三乙基硅烷

TFA 三氟乙酸

THF 四氢呋喃

Trt 三苯甲基

参考文献

1.Büyükgebiz A.等人，J.Pediatr.Endocrinol.Metab.，1999，1-2月；12(1)：95-7。

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3.Girard，J.Mehls，O.，J.Clin Invest.1994，3月；93(3)：1163-1171。

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