MX2010011800A - Compuestos de hormona de crecimiento humana recombinante unidos a peg. - Google Patents

Compuestos de hormona de crecimiento humana recombinante unidos a peg.

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Torben Lessmann
Susanne Kindermann
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Abstract

La presente invención se refiere a una Hormona de Crecimiento humana modificada químicamente (rhGH) que se prepara al adherir un conector transitorio el cual comprende un polietilenglicol. La proteína modificada químicamente puede tener una actividad de rhGH mucho más duradera que aquella de la rhGH no modificada, haciendo posible una dosis reducida y oportunidades de programación y la rhGH modificada no puede causar lipoatrofia. También incluye métodos de uso para el tratamiento y/o prevención de enfermedades o trastornos en los cuales es benéfico el uso de la hormona de crecimiento.

Description

COMPUESTOS DE HORMONA DE CRECIMIENTO HUMANA RECOMBINANTE UNIDOS A PEG Campo de la Invención Esta invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende excipientes farmacéuticos adecuados y que comprende también una cantidad clínicamente efectiva de un profármaco de hormona de crecimiento humana recombinante (rhGH) unido a PEG que se puede administrar con menos frecuencia que los productos disponibles de hormonas de crecimiento humanas y no puede causar lipoatrofia secundaria a la inyección. La presente invención también se refiere a estos profármacos.
Antecedentes de la Invención La hormona de crecimiento (GH) es una hormona que estimula el crecimiento y la reproducción de células en humanos y otros animales. Es una hormona de polipéptidos de cadena individual de 191 aminoácidos la cual es sintetizada, almacenada y secretada por las células somatotróficas dentro de las alas laterales de la glándula pituitaria anterior. La hormona también es conocida como somatotropina cuando se refiere a la hormona de crecimiento producida por medio de la tecnología de ADN recombinante y se abrevia como "rhGH" .
La hormona de crecimiento tiene una variedad de funciones en el cuerpo, la más notable de las cuales es el REF: 214591 incremento de la altura durante toda la niñez y existen varias enfermedades las cuales pueden ser tratadas a través del uso terapéutico de la GH.
Los efectos de la deficiencia de hormona de crecimiento varían dependiendo de la edad a la cual ocurren. En los niños, la falta de crecimiento y la estatura corta son las manifestaciones principales de la deficiencia de GH. También puede causar inmadurez sexual. En los adultos, los efectos de la deficiencia son más sutiles y pueden incluir deficiencias de fuerza, energía y masa ósea, así como también riesgo cardiovascular incrementado.
Existen muchas causas de la deficiencia de GH, que incluyen mutaciones de genes específicos, malformaciones congénitas que involucran el hipotálamo y/o la glándula pituitaria y daño a la pituitaria a partir de una lesión, cirugía o enfermedad.
La deficiencia es tratada a través de la complementación con GH externa. Toda la GH en uso actualmente es una versión biosintética de la GH humana, manufacturada por medio de la tecnología de ADN recombinante . La GH se utiliza como terapia de reemplazo en niños y adultos con deficiencia de GH de ya sea comienzo en la niñez (después de completar la fase de crecimiento) o comienzo en la adultez (usualmente como resultado de un tumor de pituitaria adquirido) . En esos pacientes, los beneficios han incluido variablemente masa adiposa reducida, masa magra incrementada, densidad ósea incrementada, perfil de lípidos mejorado, factores de riesgo cardiovascular reducidos y bienestar psicosocial mejorado.
Genentech Inc (US) fue el primero en clonar la rhGH y esto se describió en la patente EP-B 22242. A partir de 2006, las hormonas de crecimiento sintéticas disponibles en los Estados Unidos y Europa (y sus fabricantes) incluyeron NutropinMR (Genentech) , HumatropeMR (Eli Lilly) , GenotropinMR (Pfizer) , NorditropinMR (Novo Nordisk) , SaizenR (Merck Serono) y OmnitropeMR (Sandoz) .
Aunque las técnicas de biología molecular han incrementado dramáticamente la disponibilidad de muchas proteínas y/o polipéptidos (en lo sucesivo referidos como proteínas) , el uso terapéutico de las proteínas es obstaculizado a menudo por otros factores, tal como la vida media corta en el plasma debido a la eliminación renal y mediada por receptores, agregación, degradación proteolítica, pobre biodisponibilidad y propiedades físicas las cuales imposibilitan las formulaciones eficientes.
Un mecanismo para mejorar la disponibilidad de proteínas es por medio de la conjugación de la proteína con compuestos de derivatización, los cuales incluyen, pero no están limitados a, polietilenglicol y polipropilenglicol . Algunos de estos beneficios reconocidos incluyen: inmunogenecidad y antigenicidad reducidas, duración de acción incrementada y propiedades farmacocinéticas alteradas. [Veronese, F.M. "Enzymes for Human Therapy: Surface Structure Modifications" , Chimica Oggi, 7:53-56 (1989)] (En este documento la referencia 5).
Al unir la rhGH a PEG, puede ser posible mejorar las características de la molécula para el uso médico al incrementar su vida media in vivo (logrando en consecuencia una dosificación reducida o una frecuencia de dosificación reducida) , mejorando su estabilidad y disminuyendo su antigenicidad o una combinación de las mismas.
Generalmente, este tipo de modificación a una molécula es bien conocido en el campo y existen numerosas patentes disponibles en la bibliografía de patentes, que describen este concepto. Por ejemplo, una Eritropoyetina (EPO) unida a PEG de Hofmann La Roche se describe en el documento EP-B 1196443 que reclama un conector específico que comprende PEG enlazado covalentemente a EPO, un interferón alfa unido a PEG descrito en el documento EP-B 975369 de la compañía Nektar/La Roche y otro interferón alfa unido a PEG en el documento EP-B 1562634 de la compañía Hofmann La Roche .
Se cree que la eliminación in vivo de la rhGH ocurre por medio de los siguientes dos mecanismos. El primero es la eliminación renal donde la rhGH es eliminada de la circulación por medio de la filtración glomerular renal. La eliminación renal de la rhGH está bien documentada y por lo tanto, la unión de la rhGH sintética a PEG es una elección obvia para resolver este problema. La eliminación renal es responsable de alrededor de 25-53% de la eliminación total de la rhGH (Girard, J. Mehls, O.J. Clin.
Invest. Marzo de 1994; 93(3): 1163-1171, en este documento la referencia 3) .
El segundo mecanismo es la eliminación hepática (hígado) . La absorción hepática de GH ocurre por medio de la endocitosis mediada por receptores seguida por la degradación lisosómica.
Un tercer mecanismo es la eliminación mediada por receptores en otro tejido tal como los condrocitos del cartílago. Al reducir la afinidad de enlace de la GH al receptor de GH por medio de la unión a PEG, se reducirá la eliminación mediada por receptores.
Sin embargo, existen problemas especializados con la administración de la rhGH. Una desventaja principal de la rhGH administrada por la ruta subcutánea es la aparición de lipoatrofia en pacientes que reciben el tratamiento.
La lipoatrofia es el término médico utilizado para la pérdida localizada de tejido adiposo. Las formulaciones de rhGH administradas por la ruta subcutánea han exhibido problemas de lipoatrofia, lo cual se cree que es causado por la alta concentración local del complejo de hormona de crecimiento en el sitio de la inyección.
Büyükgebiz A. y colaboradores publicados en J. Pediatr. Endocrinol . Metab. Enero-Febrero de 1999; 12(1) :95-7 describen un registro médico de ese tipo (en este documento la referencia 1) . Este es un reporte de un paciente con deficiencia de GH aislada debido a una supresión de genes de 6.7 kb quien recibió un tratamiento de rhGH de dosis altas y desarrolló lipoatrofias locales en los sitios de inyección sin ninguna detección de anticuerpos después de 6 años de terapia. Se sospecha que la etiología de la lipoatrofia es por el efecto lipolítico directo de las altas dosis de rhGH.
Se cree que la lipoatrofia relacionada con la administración de rhGH es causada por la actividad de rhGH misma, por concentraciones más altas y por la exposición prolongada. Estas concentraciones más altas ocurren cerca de los sitios de inyección.
La probabilidad de que la alta actividad de la hormona de crecimiento se acumule cerca del sitio de inyección es aún más alta en el caso de que la rhGH sea unida a PEG debido a un tiempo de residencia incrementado. En el caso de las formulaciones de rhGH unidas a PEG, el tejido experimentará una exposición sostenida e incrementada a la actividad de la hormona de crecimiento, debido al hecho de que el conjugado unido a PEG posee actividad necesaria para la actividad farmacológica y el conjugando es de difusión limitada debido al tamaño .del conjugado. El resultado es una lipólisis incrementada en el sitio de inyección.
El documento WO-A 2005/079838 describe la hGH unida a PEG, en donde la porción de hGH está adherida a un polímero de polietilenglicol por vía de un grupo funcional amino, lo cual se puede considerar como una unión permanente debido a la estabilidad del grupo amino. Un ejemplo de este compuesto de hGH unida a PEG, el cual exhibe lipoatrofia, es el compuesto PHA-794428. El compuesto PHA-794428 es una rhGH unida a PEG y también se describe en el documento WO-A 2005/079838 de la compañía Pharmacia (adquirida por Pfizer) y descrita adicionalmente en Horm. Res. 2006; 65 (suppl. 4) : 1-213, CF1-98 GH/IGF Treatment con el título "First in-human study of PEGylated recombinant human growth hormone" , Philip Harris y colaboradores (en este documento la referencia 4) .
De acuerdo con la información de pruebas clínicas publicada en www.clinicaltrials.gov, la prueba se terminó el 10 de Diciembre de 2007. La decisión de Pfizer de terminar el programa fue debido a los casos de lipoatrofia en el sitio de inyección que se reportaron en los estudios clínicos de Fase 2 después de una sola inyección de PHA 794428.
El documento WO-A 2006/102659 (Nektar) también describe y sugiere conjugados de rhGH-PEG (tipos lineales y ramificados) por vía de un enlace de amida. El problema a ser resuelto en el documento WO-A 2006/102659 se describe en el párrafo
[0005] en la página 2. De acuerdo con el solicitante, el problema a ser resuelto es una frecuencia de dosificación reducida. Puesto que la terapia con rhGH requiere típicamente inyecciones diarias, los pacientes, y en particular los pacientes pediátricos, detestan la inconveniencia e incomodidad asociadas con este régimen. La solución descrita en el documento WO-A de Nektar es la provisión de nuevos conjugados de PEG-rhGH.
En la tabla 6,
[0257] del documento WO-A se puede observar que los conjugados de PEG-rhGH tienen una actividad in vitro relativamente baja en comparación con la hormona de crecimiento nativa sin PEG. A pesar de las bajas actividades in vitro, los conjugados de rhGH unidos a PEG fueron activos in vivo. En relación con esto la sección
[0261] versa: "Aunque los resultados preliminares in vitro sugieren que el incremento de la cantidad de PEG adherido a hGH reduce su capacidad para estimular el receptor de hGH, con base en los resultados preliminares in vivo, parece que una reducción en la bioactividad es más que balanceada por una vida media incrementada y/o disponibilidad en el plasma, lo que conduce de esta manera a una conclusión de que los conjugados proporcionados en este documento poseen un efecto farmacodinámico superior in vivo en comparación con la rhGH no modificada en un régimen de dosificación idéntico" .
El documento WO-A 2006/102659 (Nektar) no describe conectores autoescindibles - es decir, se observa simplemente que los conjugados de PEG-rhGH son activos in vivo aunque sus actividades in vitro se reducen significativamente. El problema de la lipoatrofia no se resuelve .
Una solución para el desafío de diseño de las propiedades deseadas de lipoatrofia reducida y frecuencia de inyección reducida en un conjugado de hGH unido a PEG es el uso de un planteamiento de profármaco. Un profármaco es cualquier compuesto que se somete a la biotransformación antes de exhibir sus efectos farmacológicos. De esta manera, los profármacos se pueden observar como fármacos que contienen grupos protectores, no tóxicos, especializados que se utilizan de una manera transitoria para alterar o eliminar propiedades indeseables en la molécula precursora. En este caso, un portador polimérico reduciría de manera transitoria la actividad de la hormona de crecimiento y reduciría consecuentemente la probabilidad de lipólisis del tejido. La conjugación transitoria a un portador polimérico extendería al mismo tiempo la vida media del conjugado y por lo tanto proporcionaría un suministro de acción prolongada de la hGH .
Numerosos profármacos macromoleculares se describen en la bibliografía donde el portador macromolecular se une por vía de un grupo éster lábil al agente medicinal (por ejemplo Y. Luo, MR Ziebell, GD Prestwich, "A Hyaluronic Acid - Taxol Antitumor Bioconjugate Targeted to Cáncer Cells" , Biomacromolecules 2000, 1, 208-218, J Cheng y colaboradores, Synthesis of Linear, beta-Ciclodextrin Based Polimers and Their Camptothecin Conjugates, Bioconjugate Chem. 2003, 14, 1007-1017, R. Bhatt y colaboradores, Synthesis and in Vivo Antitumor Activity of Poli (L-glutamic acid) Conjugates of 20 (S) -Campththecin, J. Med. Chem. 2003, 46, 190-193; R.B. Greenwald, A. Pendri, C.D. Conover, H. Zhao, Y.H. Choe, A. Martínez, K. Shum, S. Guan, J. Med. Chem., 1999, 42, 3657-3667; B. Testa, J. M : Mayer in Hidrolysis in Drug and Prodrug Metabolism, iley-VCH, 2003, Capítulo 8). En estos casos, el grupo funcional conjugado de la entidad bioactiva es un grupo hidroxilo o un ácido carboxílico.
Especialmente para las biomacromoléculas pero también para los profármacos poliméricos de moléculas pequeñas, puede ser deseable unir el portador macromolecular a grupos amino (es decir grupos amino N-terminales o de lisina de proteínas) de la entidad bioactiva. Este será el caso si el enmascaramiento de la bioactividad del fármaco requiere la conjugación de un cierto grupo amino de la entidad bioactiva, por ejemplo un grupo amino localizado en un centro activo o una región o epítopo implicado en el enlace con el receptor. También, durante la preparación del profármaco, los grupos amino pueden ser dirigidos más quimioselectivamente y pueden servir como un mejor asidero para conjugar un portador y un fármaco debido a su mayor nucleofilicidad en comparación con grupos hidroxílicos o fenólicos. Esto es particularmente cierto para las proteínas las cuales pueden contener una gran variedad de diferentes funcionalidades reactivas. En este caso, las reacciones de conjugación no selectiva conducen a mezclas de productos indeseadas las cuales requieren una caracterización o purificación extensiva y pueden disminuir el rendimiento de reacción y eficiencia terapéutica del producto.
La activación del profármaco puede ocurrir por medio de la escisión enzimática o no enzimática de la conexión lábil entre el portador y la molécula de fármaco, o una combinación secuencial de ambas, es decir un paso enzimático seguido por un reordenamiento no enzimático.
En el documento WO-A 2005/099768 se describen moléculas conectoras unidas a PEG con conectores autoescindibles para un gran grupo de biomoléculas que incluyen somatropinas (reivindicación 6). En el documento WO-A 2005/099768, el problema a ser resuelto es la variabilidad entre pacientes y el efecto impredecible de la activación del profármaco cuando está involucrado un mecanismo enzimático (página 12, líneas 17-30) . Esta solicitud describe como solución un conector aromático, el cual puede estar basado en PEG. Este conector-PEG se enlaza al fármaco de una manera en que la actividad del fármaco se reduce significativamente. Es activado únicamente con la liberación del fármaco, lo cual se inicia por medio de la hidrólisis. La velocidad de hidrólisis puede ser controlada químicamente. No se da énfasis especial a la GH y problemas relevantes, como lipoatrofia, en relación con esto como tal.
En resumen, ninguna de las citas mencionadas anteriormente describe una solución para desarrollar una rhGH de acción prolongada, con base en un conjugado de profármaco que se pueda administrar menos frecuentemente sin incrementar la frecuencia de lipoatrofia.
De esta manera, un objetivo de la presente invención es la provisión de este profármaco o una composición farmacéutica que comprenda el profármaco para reducir la frecuencia de administración de la rhGH utilizando PEG conjugado a la rhGH sin . inducir significativamente la lipoatrofia.
Breve Descripción de la Invención Por consiguiente, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende excipientes farmacéuticos adecuados y que comprende también una cantidad efectiva, clínica, in vivo, humana de un conjugado de profármaco de la hormona de crecimiento humana recombinante rhGH unido a PEG, en donde el PEG se vincula con la rhGH por vía de un conector transitorio autohidrolizable (autoescindible) ; el conjugado de profármaco se caracteriza porque : (1) : el conjugado tiene una actividad de GH la cual es menor que 5% de la hormona de crecimiento nativa sin PEG; y (2) : la velocidad de autohidrólisis del conector es tal que la vida media in vivo es de 10 horas a 600 horas.
La propiedad (1) asegura que el profármaco tenga una baja incidencia de lipoatrofia . a pesar de tener una duración de acción significativamente extendida in vivo. Sin ser limitados por una teoría, los presentes inventores creen que si el profármaco tuviera una actividad de GH más alta, este producto induciría aún la lipoatrofia en una frecuencia más alta que los productos de rhGH comercializados actualmente .
La propiedad (2) asegura que la rhGH (sin PEG) sea liberada gradualmente a través del tiempo de modo que uno puede administrar el producto farmacéutico de rhGH menos frecuentemente que la hormona de crecimiento humana, por ejemplo solo una vez a la semana o una vez al mes en lugar de las administraciones diarias, mientras que aún se retiene la eficacia completa en comparación con la rhGH.
Preferiblemente, la vida media in vivo es hasta 5 horas más corta, por ejemplo 2, 3, 4 o 5 veces más corta que la vida media in vitro del conjugado de profármaco de hGH unido a PEG correspondiente. Más preferiblemente, la vida media in vivo es hasta 3 veces más corta que la vida media in vitro del conjugado de profármaco de hGH unido a PEG correspondiente. Más preferiblemente, la vida media in vivo es hasta 2 veces más corta que o casi idéntica a la vida media in vitro del conjugado de profármaco de hGH unido a PEG correspondiente.
Esta invención tiene aplicación en los profármacos de rhGH unidos a PEG, en particular en los profármacos portadores de rhGH unidos a PEG que incluyen los profármacos portadores de cascada.
Los profármacos se pueden definir como agentes terapéuticos que son inactivos per se pero se transforman de manera predecible en metabolitos activos (véase B. Testa, J.M: Mayer in Hydrolysis in Drug and Prodrug Metabolism, Wiley-VCH, 2003, página 4) . En los sistemas de profármacos portadores, muchos agentes medicinales son inactivos o muestran una actividad biológica disminuida cuando un polímero se conjuga covalentemente con la molécula de fármaco. En esos casos, una unión transitoria del fármaco y el portador se aplica en una forma tal que el agente medicinal se libera del portador polimérico m vivo para recuperar su actividad biológica. La actividad biolqgica reducida del profármaco en comparación con el fármaco liberado es de utilidad si se desea una liberación lenta o controlada del fármaco. En este caso, una cantidad relativamente grande de profármaco se puede administrar sin efectos colaterales concomitantes y el riesgo de sobredosis. La liberación del fármaco ocurre a través del tiempo, reduciendo en consecuencia la necesidad de una administración repetida y frecuente del fármaco.
En los profármacos portadores poliméricos, las porciones biológicamente activas se vinculan frecuentemente a una porción portadora polimérica por medio de una conexión lábil formada entre la porción portadora y un grupo funcional de la molécula de fármaco. La escisión de un profármaco portador genera una entidad molecular (fármaco) de bioactividad incrementada y por lo menos un producto secundario, el portador. Este producto secundario puede ser biológicamente inerte (por ejemplo PEG) . Después de la escisión, la entidad bioactiva revelará por lo menos un grupo funcional previamente conjugado y en consecuencia enmascarado o protegido y la presencia de este grupo contribuye típicamente a la bioactividad.
La actividad de GH se puede medir utilizando métodos conocidos en el campo. En este respecto, se da énfasis al ejemplo 1. Con base en el hecho de que algunos conectores transitorios aplicables para la presente invención pueden tener una vida media in vitro menor que 3000 horas, la medición de actividad de GH respectiva se hace indirectamente al determinar la actividad de GH de un conjugado de PEG respectivo que comprende un conector permanente en lugar del conector transitorio. Esto se puede llevar a cabo como describe el documento O2006102659 en la página 74 párrafo 0240, la actividad biológica de rhGH y los conjugados descritos en el mismo se deben valorar in vitro utilizando un ensayo de proliferación de células de linfoma de rata NB2-II. En resumen, las células NB2-II derivadas de un linfoma de rata se incuban con rhGH, lo cual conduce al enlace de la molécula de rhGH con su receptor en la superficie celular. El enlace del receptor induce la cascada de transducción de señales, lo cual da por resultado la proliferación de las células. Los resultados del ensayo se basan en el contenido determinado de proteína y una bioactividad de 100% de la rhGH no modificada.
Preferiblemente, para la medición de la actividad de GH se utiliza el protocolo descrito en el Ejemplo 24.
La vida media in vitro se puede medir utilizando métodos conocidos en el campo. En este respecto, se da énfasis al ejemplo 2.
Por consiguiente, un segundo aspecto de la invención se refiere a una cantidad efectiva, clínica de la composición farmacéutica que comprende el profármaco de rhGH unido a PEG del primer aspecto para el uso en un método para el tratamiento de una enfermedad relacionada con la GH en un paciente humano.
Este segundo aspecto se puede formular alternativamente como un método para el tratamiento de una enfermedad relacionada con la GH en un paciente humano que comprende administrar a un paciente humano una cantidad efectiva, clínica de la composición farmacéutica que comprende el profármaco de rhGH unido a PEG del primer aspecto .
En una situación, donde la actividad residual del profármaco (como es el caso de la rhGH conjugada de manera transitoria con PEG) se reduce significativamente en comparación con la GH humana nativa, no pueden ocurrir efectos lipolíticos aún en una exposición prolongada.
Los compuestos descritos en este documento denominados profármacos de rhGH unidos a PEG son conjugados que pueden tener actividad residual significativamente reducida en comparación con la GH humana. Para exhibir una actividad terapéuticamente útil, la rhGH tiene que ser liberada del conjugado de profármaco, por lo cual los profármacos descritos en este documento necesitan someterse a un paso de activación (por ejemplo, 1 , 6 -mecanismos de liberación) , denominado en este documento como autoescisión, escindiendo el grupo PEG del fármaco. El 1 , 6-mecanismo de liberación se describe adecuadamente en el documento WO-A 2005/099768.
Sin ser limitados por una teoría, los presentes inventores creen que los conjugados de rhGH unidos transitoriamente a PEG descritos en este documento reducen significativamente la lipoatrofia debido a la baja actividad de los conjugados de rhGH unidos a PEG, antes de que el PEG sea escindido gradualmente por el conector autoescindible . Esto puede asegurar que los profármacos no inducirán la lipoatrofia más frecuentemente que la GH humana u otros compuestos de rhGH unidos permanentemente a PEG como se describiera anteriormente.
El problema fundamental de la presente invención también es resuelto por una composición farmacéutica que comprende excipientes farmacéuticos adecuados y que también comprende un conjugado de profármaco de la hormona de crecimiento humana (hGH) de la fórmula (AA) hGH-NH-La-S° (AA), en donde hGH-NH representa el residuo de hGH; La representa un grupo funcional, el cual es autohidrolizable (autoescindible) por un grupo que induce la autoescisión Ga; y S° es una cadena de polímero que tiene un peso molecular de por lo menos 5 kDa y que comprende por lo menos una primera estructura de ramificación BS1, por lo menos la primera estructura de ramificación BS1 comprende por lo menos una segunda cadena de polímero S1 que tiene un peso molecular de por lo menos 4 kDa, en donde por lo menos uno de S°, BS1, S1 comprende además el grupo que induce la auto-escisión Ga y en donde la estructura de ramificación BS1 comprende además por lo menos una tercera cadena de polímero S2 que tiene un peso molecular de por lo menos 4 kDa o por lo menos uno de S°, S1 comprende por lo menos una segunda estructura de ramificación BS2 que comprende por lo menos la tercera cadena de polímero S2 que tiene un peso molecular de por lo menos 4 kDa y en donde el peso molecular del conjugado de profármaco sin la hGH-NH es por lo menos 25 kDa y a lo sumo 1000 kDa, preferiblemente por lo menos 25 kDa y a lo sumo 500 kDa, aún más preferiblemente por lo menos 30 kDa y a lo sumo 250 kDa, aún más preferiblemente por lo menos 30 kDa y a lo sumo 120 kDa, aún más preferiblemente por lo menos 40 kDa y a lo sumo 100 kDa, aún más preferiblemente por lo menos 40 kDa y a lo sumo 90 kDa.
Sorprendentemente se descubrió que la actividad residual de un profármaco de la presente invención se puede reducir eficientemente al proporcionar un portador polimérico que tiene por lo menos 3 cadenas de una cierta longitud mínima (como se define por su peso molecular) y de esta manera, en combinación con un conector transitorio como se describe en este documento se resuelve el problema de proporcionar un profármaco de hGH que se puede administrar menos frecuentemente sin incrementar el riesgo de lipoatrofia. Por lo tanto, el profármaco debe ser soluble en agua .
Para los profármacos por lo menos bi-conjugados , el problema se puede resolver por medio de una composición farmacéutica que comprende excipientes farmacéuticos adecuados y que comprende también un conjugado de profármaco de la hormona de crecimiento humana (hGH) de la fórmula (AB) . . hGH-(NH-L-S°)n (AB), en donde n es 2 , 3 o 4; preferiblemente 2 ; hGH(-NH)n representa el residuo de hGH; cada L es independientemente un grupo funcional permanente L ; o un grupo funcional La, el cual es autohidrolizable (auto-escindible) por un grupo que induce la autoescisión Ga; y cada S° es independientemente una cadena de polímero que tiene un peso molecular de por lo menos 5 kDa, en donde S° es ramificado opcionalmente al comprender por lo menos una primera estructura de ramificación BS1, por lo menos la primera estructura de ramificación BS1 comprende por lo menos una segunda cadena de polímero S1 que tiene un peso molecular de por lo menos 4 kDa, en donde por lo menos uno de S°, BS1, S1 comprende además el grupo que induce la autoescisión Ga y en donde el peso molecular del conjugado de profármaco sin la hGH-NH es de por lo menos 25 kDa y a lo sumo 1000 kDa, preferiblemente de por lo menos 25 kDa y a lo sumo 500 kDa, aún más preferiblemente de por lo menos 30 kDa y a lo sumo 250 kDa, aún más preferiblemente de por lo menos 30 kDa y a lo sumo 120 kDa, aún más preferiblemente de por lo menos 40 kDa y a lo sumo 100 kDa, aún más preferiblemente de por lo menos 40 kDa y a lo sumo 90 kDa.
Todavía otro aspecto de la presente invención es un conjugado de profármaco como se definiera anteriormente.
Las modalidades preferidas de la presente invención se describen a continuación, a manera de ejemplos únicamente .
DEFINICIONES Antes del planteamiento de las modalidades detalladas de la invención se proporciona una definición de los términos específicos relacionados con los aspectos principales de la invención.
En general, todos lo términos técnicos específicos que se utilizan en este documento se deben entender como la persona experta los entendería en el presente contexto técnico .
El residuo rhGH o hGH o GH o hGH se refiere a la hormona de crecimiento humana. NH-hGH es un residuo de hGH, en donde -NH- de -NH-hGH representa un grupo amino de hGH.
El término "actividad" se entiende en este documento como la capacidad de la hormona de crecimiento o un conjugado de la misma para provocar una respuesta biológica cuando se administra a un mamífero, por ejemplo en un modelo in vivo, o para producir una respuesta mesurable en un modelo in vitro como se describe en los ejemplos.
En un sistema de profármaco, la actividad medida tendrá dos contribuciones, una de la entidad de fármaco libre liberado y una del conjugado de profármaco todavía no escindido. A fin de diferenciar la actividad del conjugado de profármaco, el término "actividad residual" se entiende en este documento como la porción de la actividad de profármaco medida que se puede atribuir al conjugado de profármaco.
El término "autoescisión" se entiende en este documento como una escisión hidrolítica limitante de la velocidad del enlace entre el conector transitorio y la molécula de fármaco de rhGH en una solución amortiguada acuosa bajo condiciones fisiológicas de pH 7.4 y 37°C. La autoescisión no requiere la presencia de una enzima. Esta autoescisión o autohidrólisis es controlada por un grupo que induce la autoescisión, el cual es parte de la molécula de profármaco. Este grupo que induce la autoescisión puede estar presente como tal o en una forma enmascarada de modo que se requiere el desenmascaramiento antes de que pueda iniciar el mecanismo de autohidrólisis.
La velocidad de autohidrólisis del conector se refiere a la velocidad de escisión de un profármaco de hGH unido a PEG in vivo. Como los efectos enzimáticos u otros efectos casi siempre causan que la hidrólisis del conector del profármaco proceda más rápido in vivo que in vitro, se define que un profármaco de hGH-PEG se escinde en una forma autohidrolítica si la vida media del profármaco in vivo es hasta 5 veces más corta que la vida media in vitro del conjugado de profármaco de hGH unido a PEG correspondiente.
El término "unión transitoria" o "conector transitorio" se entiende en este documento como que describe la labilidad de la unión entre PEG y rhGH en un profármaco de rhGH unido a PEG. En estas uniones transitorias, rhGH se libera del profármaco correspondiente con una vida media del conector in vivo de hasta 1200 horas.
El término "conjugado" se entiende en este documento como una o más moléculas de PEG enlazadas covalentemente al fármaco que es en este documento la hormona de crecimiento humana.
El término "conjugado transitorio" se refiere a los profármacos de hGH unidos a PEG que contienen por lo menos una unión transitoria.
El término "conjugado permanente" se refiere a los conjugados de hGH unidos a PEG o profármacos en donde el polímero de PEG se conecta a la hGH por medio de uniones con una vida media in vitro de por lo menos 3000 horas.
La vida media in vitro o la vida media del conector in vitro es la liberación de 50% de hGH del profármaco de hGH unido a PEG en amortiguador a pH 7.4 y 37°C.
Los términos "vida media in vivo" o "vida media del conector in vivo" se entienden como el intervalo de tiempo en el cual 50% de la proporción inicial de la hormona de crecimiento se libera del profármaco de hGH unido a PEG después de la administración al cuerpo humano, calculado al tomar en cuenta la vida media del conjugado correspondiente del compuesto como se describe en el ejemplo 2.
El término "vida media del conjugado" se entiende como el intervalo de tiempo en el cual 50% de un conjugado permanente de hGH unido a PEG como se definiera anteriormente se elimina de la circulación de la sangre.
El término "lipoatrofia" se entiende en este documento como un término médico para la pérdida localizada de tejido adiposo. En el presente contexto, "lipoatrofia" se refiere a la lipoatrofia en el sitio de la inyección que significa la lipólisis de tejido que ocurre en proximidad estrecha del sitio de inyección.
El término "profármaco" se entiende en este documento como cualquier compuesto que se somete a la trasformación antes de exhibir sus efectos farmacológicos completos. La clasificación de sistemas de profármaco es proporcionada conforme a las definiciones de IUPAC (http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac/medchem, ingresada el 8 de Marzo de 2004) : Profármaco Un profármaco es cualquier compuesto que se somete a la biotransformación antes de exhibir sus efectos farmacológicos. De esta manera, los profármacos se pueden observar como fármacos que contienen grupos protectores, no tóxicos, especializados que se utilizan de una manera transitoria para alterar o eliminar propiedades indeseables de la molécula precursora.
Profármaco doble (o pro-profármaco) Un profármaco doble es una molécula biológicamente inactiva la cual se transforma in vivo en dos pasos (enzimática y/o químicamente) a las especies activas.
Profármaco vinculado al portador (Profármaco portador) Un profármaco vinculado al portador es un profármaco que contiene una unión temporal de una sustancia activa determinada con un grupo portador transitorio que produce propiedades fisicoquímicas o farmacocinéticas mejoradas y que se puede retirar fácilmente in vivo, usualmente por medio de una escisión hidrolítica.
Profármaco de cascada Un profármaco de cascada es un profármaco para el cual la escisión del grupo portador se vuelve efectiva solo después del desenmascaramiento de un grupo activo. Biotransformación La biotransformación es la conversión química de sustancias por organismos vivos o preparaciones de enzimas.
Correspondientemente, un grupo que induce la autohidrólisis de cascada se vuelve efectivo solo después del desenmascaramiento de ciertos elementos estructurales que inducen la autohidrólisis. Puede haber uno o más pasos de desénmascaramiento de cascada requeridos para revelar los elementos estructurales que inducen la autohidrólisis. Por lo menos uno de los pasos de desenmascaramiento se puede basar en un paso de biotransformación .
El término "una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva, clínica, in vivo, humana de un profármaco de hormona de crecimiento humana recombinante (rhGH) unido a PEG" se debe entender como una cantidad que es suficientemente alta para obtener un efecto clínico deseado en un humano después de la administración de la composición farmacéutica al humano - por ejemplo un efecto clínico deseado en relación al tratamiento de una enfermedad relacionada con la GH. En el presente contexto, la persona experta es capaz de ajustar rutinariamente la cantidad de profármaco de hormona de crecimiento humana recombinante (rhGH) unido a PEG que se administra a fin de obtener un efecto clínico deseado.
El término "condición fisiológica" se entiende en este documento como cualquier condición in vitro o in vivo, idéntica o que se asemeja a, las condiciones de pH y temperatura en el cuerpo humano. Más específicamente, las condiciones fisiológicas se refieren a condiciones alrededor de pH 7.4 (de pH 6.8 a pH 7.8) y aproximadamente 37 °C (de 35°C a 40°C) .
El término "conector" se utiliza frecuentemente en publicaciones en el campo de la bioconjugación y describe ampliamente estructuras químicas que se utilizan para conectar dos entidades moleculares. Esta conectividad puede ser de carácter permanente o transitorio.
Un conector transitorio es un conector en el cual la conjugación del fármaco a la molécula de PEG es reversible. Esto implica que la escisión del conector libera el fármaco en su forma nativa y activa. Diferenciar estructuralmente una unidad de conector transitorio del portador de polímero puede ser difícil en el caso de los profármacos portadores, particularmente si el polímero se adhiere permanentemente al conector y por lo tanto el producto de degradación relacionado con el conector no se libera como consecuencia de la escisión del profármaco. La caracterización estructural de un conector es aún más desafiante si el conector está funcionando tanto como un grupo que induce la autoescisión como una unidad de ramificación. Por lo tanto, dentro del significado de la presente invención, el término conector se puede utilizar a manera de sinónimo con una combinación de un grupo funcional La y un grupo que induce la autoescisión Ga. En casos donde los profármacos portadores se describen donde el portador es un PEG ramificado, se prefiere utilizar descripciones estructurales v basadas en combinaciones de La y Ga. En este caso, el grupo que induce la escisión Ga se considera que es parte del polímero portador. La variación del carácter químico de Ga permite el diseño de las propiedades de autoescisión de un profármaco vinculado con un portador correspondiente a un grado mayor.
El término "conector permanente" se refiere a un conjugado de PEG a un grupo amino primario donado por hGH por medio de la formación de una amida alifática o carbamato alifático. Si se utilizan reactivos de unión a PEG convencionales, los conjugados resultantes son usualmente muy estables contra la hidrólisis y la velocidad de escisión del enlace de amida o carbamato sería muy lento para la utilidad terapéutica en un sistema de profármaco. No obstante, estos conjugados de conector permanente son útiles para la investigación de la utilidad terapéutica de un conjugado de profármaco ya que permiten la valoración de la actividad residual.
Si estas uniones estables se deben emplear en un planteamiento de profármaco, la escisión del grupo funcional no es posible en un margen de tiempo terapéuticamente útil sin catálisis enzimática.
El término "profármaco soluble en agua" significa un 'profármaco que es soluble en agua bajo condiciones fisiológicas. Típicamente, un profármaco soluble en agua transmitirá por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 95%, de la luz transmitida por la misma solución después del filtrado. En una base en peso, un polímero soluble en agua será preferiblemente por lo menos aproximadamente 35% (en peso) soluble en agua, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 50% (en peso) , aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 70% (en peso) , aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 85% (en peso) , aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 95% (en peso) o completamente soluble en agua .
El término "PEG" o "residuo de unión a PEG" se utiliza en este documento de manera ejemplar para polímeros solubles en agua adecuados que son caracterizados por unidades repetitivas. Los polímeros adecuados se pueden seleccionar del grupo que consiste de polímeros de polialquiloxi , ácido hialurónico y derivados del mismo, alcoholes polivinílieos , polioxazolinas , polianhídridos , poli (orto-ésteres) , policarbonatos , poliuretanos , ácidos poliacrílicos , poliacrilamidas , poliacrilatos , polimetacrilatos , poliorganofosfazenos , polisiloxanos , polivinilpirrolidona, policianoacrilatos y poliésteres.
Las cadenas de PEG pueden consistir de una porción de interconexión, una porción de polímero y un grupo final.
En el caso de los monoconjugados ramificados de profármacos de hGH unidos a PEG, la distancia crítica define la distancia más corta entre el sitio de adhesión de la cadena de PEG S° a La y la primera estructura de ramificación BS1 medida como átomos conectados.
El término "carga de PEG" se entiende en este documento como un descriptor de la masa molecular de una cadena de polímero que consiste de un número de unidades repetitivas unidas a la hGH. La caga total de PEG se entiende como la masa molecular total de todas las cadenas de portador poliméricas adheridas a la hGH en una base molecular.
Breve Descripción de las Figuras En las figuras se muestra lo siguiente.
La figura 1 muestra un análisis de SDS-PAGE de conjugados permanentes, purificados de PEG-hGH, en donde el Carril 1: Estándar de Proteína de Alto Peso Molecular Teñido Previamente HiMarkMR; carril 2: compuesto 23 ; carril 3: compuesto 23 ; carril 4: compuesto 25 ; carril 5: compuesto 26 ; carril 6: compuesto 33 ; carril 7: compuesto 32 ; carril 8: compuesto 28 ; carril 9: compuesto 28 ; carril 10: compuesto 28 ; carril 11: compuesto 30 ; carril 12: compuesto 34 ; carril 13: compuesto 34 ; carril 14: compuesto 27 ; carril 15: compuesto 29 .
Las Figuras 2A a 2B muestran la cromatografía de exclusión de tamaño de la solución de reacción enfriada rápidamente de la síntesis del conjugado 28 y la cromatografía de exclusión del tamaño del conjugado purificado 28 .
Las Figuras 3A a 3B muestran la purificación mediante la cromatografía de intercambio catiónico del conjugado 35 y el cromatograma de exclusión de tamaño del conjugado purificado 35 .
Las Figuras 4A a 4B muestran la purificación mediante la cromatografía de intercambio catiónico del conjugado 36 y el cromatograma de exclusión de tamaño del conjugado purificado 36 .
Las Figuras 5A a 5B muestran la purificación mediante la cromatografía de intercambio catiónico del conjugado 37 y el cromatograma de exclusión de tamaño del conjugado purificado 37 .
La Figura 6 muestra cromatogramas de exclusión de tamaño de muestras del conjugado 35 incubado en amortiguador a pH 7.4 y 37°C en varios puntos de tiempo.
Las Figuras 7 a 10 muestran conjugados de profármaco preferidos de la presente invención indicando S°, S1, S2, La, Ga, BS1, BS2, BS3 y la distancia crítica.
La Figura 11 muestra curvas de respuesta farmacodinámica del conjugado 36.
Descripción Detallada de la Invención Composición farmacéutica que comprende excipientes farmacéuticos adecuados Como es conocido para la persona experta, una composición farmacéutica comprende excipientes y/o portadores farmacéuticamente aceptables.
"Farmacéuticamente aceptable" tiene la intención de incluir cualquier excipiente y/o aditivo, el cual no interfiere con la efectividad de la actividad biológica del ingrediente activo y que no es tóxico para el hospedante al cual se administra.
En una modalidad preferida, la composición farmacéutica es una composición para la administración subcutánea, administración intramuscular o inyección intravenosa. Es decir ejemplos de rutas de administración preferidas para el tratamiento de un trastorno/enfermedad relevante como se describe en este documento.
La composición farmacéutica puede comprender ingredientes activos diferentes de un profármaco de rhGH unido a PEG como se describe en este documento.
Hormona de crecimiento humana recombinante (rhGH) Puesto que la GH humana recombinante es idéntica en su secuencia a la GH humana natural, el término hormona de crecimiento humana recombinante (rhGH) se refiere también en este documento a los comúnmente llamados equivalentes biogenéricos . De esta manera, los términos rhGH y hGH se pueden utilizar a manera de sinónimo dentro del significado de la presente invención.
El término "biogenéricos" se entiende en este documento como formas genéricas de productos biofarmacéuticos ; moléculas desarrolladas utilizando procesos biológicos, usualmente a través de la actividad de la biotecnología moderna. Los productos farmacéuticos, químicos, genéricos se pueden definir como aquellas moléculas las cuales, cuando se comparan con el producto originador: tienen actividad esencialmente similar, son químicamente idénticos en esencia con sus contrapartes ramificadas, son bioequivalentes , logran la autorización en el mercado a través de un procedimiento simplificado después de la expiración de la patente.
Como es conocido para la persona experta, hoy en día es un trabajo de rutina hacer por ejemplo cambios menores de amino de un producto biológico de interés (en este documento GH) sin afectar significativamente la actividad de los productos biológicos.
Además de los productos humanos recombinantes y biogenéricos , el término hormona de crecimiento humana recombinante (rhGH) se refiere también en este documento a todos los posibles polipéptidos de rhGH.
Una descripción precisa de los posibles polipéptidos de rhGH se proporciona en el documento WO-A 2005/079838 de Pharmacia Corporation proporcionada en la página 15, párrafo 0043 hasta e incluyendo el párrafo 0053.
El término "polipéptido de hGH o proteína de hGH" , cuando se utiliza en este documento, incluye todos los polipéptidos ¦ de hGH, preferiblemente de especies de mamíferos, más preferiblemente de especies humana y de murino, así como también sus variantes, análogos, ortólogos, homólogos y derivados, y fragmentos de los mismos que se caracterizan por la promoción del crecimiento en la fase de crecimiento y en el mantenimiento de la composición corporal, anabolismo y metabolismo de lípidos normales.
El término "polipéptido o proteína de hGH" se refiere preferiblemente al polipéptido de hGH de 22 kDa que tiene una secuencia como se da a conocer en A.L. Grigorian y colaboradores, Protein Science (2005), 14, 902-913 así como también sus variantes, homólogos y derivados que exhiben esencialmente la misma actividad biológica (que promueven el crecimiento en la fase de crecimiento y en el mantenimiento de la composición corporal, anabolismo y metabolismo de lípidos normales) . Más preferiblemente, el término "polipéptido o proteína de hGH" se refiere al polipéptido que tiene exactamente la secuencia mencionada anteriormente.
Los derivados de hGH incluyen especialmente los conjugados de profármaco con hGH que comprenden polímeros vinculados permanentemente, como PEG, es decir el profármaco de la presente invención puede comprender además de uno o más conjugados de polímeros conectores transitorios los conjugados de polímeros conectores permanentes adicionales.
El término "variantes de polipéptidos de hGH", como se utiliza en este documento, se refiere a polipéptidos de la misma especie pero que difieren de un polipéptido de hGH de referencia. Generalmente, las diferencias se limitan de modo que las secuencias de aminoácidos de la referencia y la variante son estrechamente similares en conjunto y, en muchas regiones, son idénticas. Preferiblemente, los polipéptidos de hGH son por lo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticos a un polipéptido de hGH de referencia, preferiblemente el polipéptido de hGH que tiene una secuencia como se indica en A.L. Grigorian y colaboradores Protein Science (2005), 14, 902-913. Por un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos por lo menos, por ejemplo, 95% "idéntica" a una secuencia de aminoácidos pregunta, se propone que la secuencia de aminoácidos del polipéptido objetivo sea idéntica a la secuencia pregunta excepto que la secuencia de polipéptidos objetivo puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos pregunta. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden ocurrir en las posiciones terminales amino o carboxi de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, intercaladas ya sea individualmente entre residuos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. La secuencia pregunta puede ser una secuencia de aminoácidos completa de la secuencia de referencia o cualquier fragmento especificado como se describe en este documento.
Estas variantes de polipéptidos de hGH pueden ser variantes presentes naturalmente, tales como variantes alélicas presentes naturalmente que son codificadas por una de varias formas alternativas de una hGH que ocupa un sitio determinado en un cromosoma de un organismo o isoformas codificadas por variantes de empalme presentes naturalmente que se originan de una transcripción primaria individual . Alternativamente, una variante de polipéptido de hGH puede ser una variante que no se sabe que está presente naturalmente y que se puede hacer utilizando técnicas de mutagénesis conocidas en el campo.
Se sabe en el campo que uno o más aminoácidos pueden ser suprimidos de la N-terminal o la C-terminal de un péptido o proteína bioactivo sin pérdida sustancial de función biológica (véase por ejemplo Ron y colaboradores (1993), Biol Chetn. , 268 2984-2988 i descripción la cual se incorpora por este acto a manera de referencia en su totalidad) .
También será reconocido por una persona de experiencia ordinaria en el campo que algunas secuencias de aminoácidos de polipéptidos de hGH se pueden variar sin afectar significativamente la estructura o función de la proteína. Estos mutantes incluyen supresiones, inserciones, inversiones, repeticiones y sustituciones seleccionados de acuerdo con las reglas generales que se conocen en el campo para tener poco efecto sobré la actividad. Por ejemplo, una guía concerniente a como hacer sustituciones de aminoácidos fenotípicamente silenciosas se proporciona en Bowie y colaboradores (1990), Science 247:1306-1310, incorporada por este acto a manera de referencia en su totalidad, en donde los autores indican que existen dos planteamientos principales para estudiar la tolerancia de una secuencia de aminoácidos al cambio.
El primer método se basa en el proceso de la evolución, en el cual las mutaciones son ya sea aceptadas o rechazadas por selección natural. El segundo planteamiento utiliza ingeniería genética para introducir cambios de aminoácidos en posiciones específicas de una hGH clonada y selecciones o muéstreos para identificar secuencias que mantienen la funcionalidad. Estos estudios han revelado que las proteínas son sorprendentemente tolerantes a las sustituciones de aminoácidos. Los autores indican además que es probable que los cambios de aminoácidos sean permisivos en cierta posición de la proteína. Por ejemplo, la mayoría de residuos de aminoácidos ocultos requieren cadenas laterales no polares, mientras que algunas características de las cadenas laterales de la superficie se conservan generalmente. Otras sustituciones fenotípicamente silenciosas de ese tipo se describen en Bowie y colaboradores (1990) supra y las referencias citadas en la misma .
Típicamente, las sustituciones observadas como conservadoras son los reemplazos, uno por otro, entre los aminoácidos alifáticos Ala, Val, Leu y Phe, intercambio de residuos de hidroxilo Ser y Thr, intercambio de residuos ácidos Asp y Glu, sustitución entre los residuos de amida Asn y Gln, intercambio de residuos básicos Lys y Arg y reemplazos entre los residuos aromáticos Phe, Tyr. Además, los siguientes grupos de aminoácidos representan generalmente cambios equivalentes: (1) Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Thr; (2) Cys, Ser, Tyr, Thr; (3) Val, lie, Leu, Met, Ala, Phe; (4) Lys, Arg, His; (5) Phe, Tyr, Trp, His.
El término polipéptido de hGH también incluye todos los polipéptidos de hGH codificados por análogos, ortólogos y/u homólogos de especie de hGH. Como se utiliza en este documento, el término "análogos de hGH" se refiere a hGHs de organismos diferentes y no relacionados los cuales desempeñan las mismas funciones en cada organismo pero los cuales no se originan de una estructura ancestral que los antepasados de los organismos tuvieron en común. En cambio, las hGHs análogas surgieron por separado y luego evolucionaron posteriormente para desempeñar la misma función (o funciones similares) . En otras palabras, los polipéptidos de hGH análogos son polipéptidos con secuencias de aminoácidos muy diferentes pero que desempeñan la misma actividad biológica, específicamente la promoción del crecimiento en la fase de crecimiento y en el mantenimiento de una composición corporal, anabolismo y metabolismo de lípidos normales. Como se utiliza en este documento, el término "ortólogos de hGH" se refiere a hGHs dentro de dos especies diferentes cuyas secuencias están relacionadas entre sí por vía de una hGH homologa común en una especie ancestral pero las cuales han evolucionado para volverse diferentes entre sí. Como se utiliza en este documento, el término "homólogos de hGH" se refiere a hGHs de diferentes ' organismos que desempeñan las mismas funciones en cada organismo y que se originan de una estructura ancestral que los antepasados de los organismos tuvieron en común. En otras palabras, los polipéptidos de hGH homólogos son polipéptidos con secuencias de aminoácidos muy similares que desempeñan la misma actividad biológica, específicamente la promoción del crecimiento en la fase de crecimiento y en el mantenimiento de la composición corporal, anabolismo y metabolismo de lípidos normales. Preferiblemente, los homólogos de polipéptidos de hGH se pueden definir como polipéptidos que exhiben por lo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con un polipéptido de hGH de referencia, preferiblemente el polipéptido de hGH que tiene una secuencia como se mencionara anteriormente.
De esta manera, un polipéptido de hGH puede ser, por ejemplo: (i) uno en el cual uno o más de los residuos de aminoácidos son sustituidos por un residuo de aminoácido conservado o no conservado (preferiblemente un residuo de aminoácido conservado) y este residuo de aminoácido sustituido puede no ser uno codificado por el código genético: o (ii) uno en el cual uno o más de los residuos de aminoácidos incluyen un grupo de sustituyentes : o (iii) uno en el cual el polipéptido de hGH de fusiona con otro compuesto, tal como un compuesto para incrementar la vida media del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol) : o (iv) uno en el cual los aminoácidos adicionales se fusionan a la forma anterior del polipéptido, tal como un péptido de región de fusión de IgG Fe o una secuencia líder o secretora o una secuencia la cual se emplea para la purificación de la forma anterior del polipéptido o una secuencia de pro-proteína.
Los polipéptidos de hGH pueden ser monómeros o multímeros. Los multímeros pueden ser dímeros, trímeros, tetrámeros o multímeros que comprenden por lo menos cinco unidades monoméricas de polipéptido. Los multímeros también pueden ser homodímeros o heterodímeros . Los multímeros pueden ser el resultado de asociaciones hidrófobas, hidrófilas, iónicas y/o covalentes y/o pueden vincularse indirectamente, por ejemplo, por medio de la formación de liposomas. En un ejemplo, las asociaciones covalentes son entre las secuencias heterólogas contenidas en una proteína de fusión que contiene un polipéptido de hGH o un fragmento del mismo (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Número 5,478,925, la descripción de la cual se incorpora por este acto a manera, de referencia en su totalidad) . En otro ejemplo, un polipéptido de hGH o un fragmento del mismo se une a uno o más polipéptidos que pueden ser ya sea polipéptidos de hGH o polipéptidos heterólogos a través de conectores de péptidos tales como aquellos descritos en el documento US 5,073,627 (incorporado por este acto a manera de referencia) .
Otro método para preparar polipéptidos de hGH multímeros involucra el uso de polipéptidos de hGH fusionados a una secuencia de polipéptido de cremallera de leucina o cremallera de isoleucina que se sabe que promueve la multimerización de las proteínas en las cuales se fusionan utilizando técnicas conocidas para aquellas personas expertas en el campo que incluyen las enseñanzas del documento WO 94/10308. En otro ejemplo, los polipéptidos de hGH se pueden asociar por medio de interacciones entre la secuencia de polipéptido FlagMR contenida en los polipéptidos de fusión de hGH que contienen la secuencia de polipéptido FlagMR. Los multímeros de hGH también se pueden generar utilizando técnicas químicas que son conocidas en el campo tal como la reticulación utilizando moléculas conectoras y técnicas de optimización de longitud de moléculas conectoras conocidas en el campo (véase, por ejemplo, el documento US 5,478,925), técnicas conocidas en el campo para formar una o más reticulaciones entre moléculas entre los residuos de cisteína localizados dentro de la secuencia de los polipéptidos que se desea que estén contenidas en el multímero (véase, por ejemplo, el documento US 5,478,925), adición de cisteína o biotina a la C-terminal o N-terminal del polipéptido de hGH y técnicas para generar multímeros que contienen uno o más de esos polipéptidos modificados (véase, por ejemplo, el documento US 5,478,925) o cualquiera de las 30 técnicas para generar liposomas que contienen multímeros de hGH (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Número 5,478,925), descripciones las cuales se incorporan a manera de referencia en su totalidad.
Como se utiliza en este documento, el término "fragmento de polipéptido de hGH" se refiere a cualquier péptido o polipéptido que comprende un tramo contiguo de una parte de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de hGH, preferiblemente el polipéptido que tiene la secuencia mencionada anteriormente.
Profármaco de rhGH unido a PEG - PEG preferido, cadenas de polímero Como se planteara anteriormente, el profármaco de rhGH unido a PEG como se describe en este documento debe tener una actividad relativamente baja.
Por consiguiente, en una modalidad preferida la carga total de PEG por molécula de hormona de crecimiento asciende a por lo menos 25 kDa . Generalmente, la carga total de PEG será menor que 1000 kDa. Preferiblemente, la carga de PEG es por lo menos 25 kDa y a lo sumo 500 kDa, aún más preferiblemente por lo menos 30 kDa y a lo sumo 250 kDa, aún más preferiblemente por lo menos 30 kDa y a lo sumo 120 kDa, aún más preferiblemente por lo menos 40 kDa y a lo sumo 100 kDa, aún más preferiblemente por lo menos 40 kDa y a lo sumo 90 kDa.
El PEG se puede adherir a la hGH a través de uno o más puntos de anclaje. En el caso de un punto de anclaje, el PEG correspondiente en el monoconjugado de profármaco de hGH-PEG se rami'ficará y contendrá por lo menos 3 cadenas. En el caso de más de un punto de anclaje, tal como en un biconjugado, el PEG correspondiente en el profármaco de hGH-PEG puede ser ramificado o lineal. Los biconjugados pueden contener una o dos uniones transitorias y el PEG puede ser lineal o ramificado o puede contener una mezcla de una cadena lineal y una cadena ramificada. En el caso de que el biconjugado contenga una unión transitoria y una cadena lineal y una cadena ramificada, la unión transitoria puede ser en cualquier cadena. En el caso de que se utilice una cadena de PEG ramificada, puede haber una o más unidades de ramificación .
Un PEG ramificado es una molécula de PEG que consiste de un punto de ramificación que conecta dos o más cadenas de PEG, para formar una molécula con un punto de anclaje para la unión a la hormona de crecimiento. Esto podría ser dos cadenas de PEG de 20 kDa unidas para formar una molécula de PEG ramificada de 40 kDa. En el caso donde la molécula contiene dos o tres puntos de ramificación, la molécula es referida como PEG de 3 y 4 brazos, respectivamente.
En resumen y dentro de las restricciones mencionadas anteriormente, el polímero de PEG no está limitado a una estructura particular y puede ser lineal, ramificado o de múltiples brazos (por ejemplo PEG bifurcado o PEG adherido a un núcleo de poliol) , dendrítico o con conectores degradables.
Sin ser limitada a una teoría, la carga de PEG tiene por objeto proporcionar una masa molecular adecuada para obtener la actividad relativamente baja que se requiere y no tener una masa molecular muy alta del PEG que podría crear otros problemas .
La unión de PEG a una GH humana nativa puede ocurrir en varios grupos de lisina o en la amina N-terminal (Fl) como es descrito adecuadamente por Clark y colaboradores (la referencia 2 en este documento) en la página 21973 tabla III. Las posiciones Fl y LYS-140 son sumamente reactivas. Las posiciones moderadamente reactivas son LYS-115, LYS-38 y LYS-70. Las posiciones LYS-172, LYS- 41, LYS-158 y LYS-168 son pobremente reactivas.
En términos más generales, el PEG utilizado en este documento en combinación con un conector transitorio puede reducir el riesgo de lipoatrofia por medio de la elección adecuada del polímero. Sin embargo, los principios de la presente invención también tienen aplicación para polímeros diferentes del PEG. De esta manera, el término PEG se utiliza en este documento solo de manera ejemplar para los polímeros adecuados.
De esta manera, en una modalidad preferida, el profármaco de hGH-PEG es un monoconjugado combinado con uno de sus grupos primarios a un grupo funcional autoescindible La a una cadena de polímero S° . Esta cadena de polímero S° tiene un peso molecular de por lo menos 5 kDa y comprende por lo menos una estructura de ramificación BS1. La estructura de ramificación BS1 comprende una segunda cadena de polímero S1, la cual tiene un peso molecular de por lo menos 4 kDa .
Como se resumiera anteriormente, se requiere que por lo menos una tercera cadena de polímero S2 tenga un peso molecular de por lo menos 4 kDa. La cadena de polímero S2 puede ser una parte de BS1 o puede ser una ramificación adicional de S° o S1 que da por resultado una estructura de ramificación adicional BS2, la cual comprende S2.
Opcionalmente , más de 3 cadenas de polímero están presentes en el conjugado de profármaco de la presente invención, por ejemplo 4, 5, 6, 7 u 8. Sin embargo, cada cadena de polímero adicional tiene un peso molecular de por lo menos 4 kDa. El número total de cadena de polímero está limitado por el peso total del conjugado de profármaco que es a lo sumo 1000 Da (sin hGH-NH) .
De esta manera, una modalidad preferida de la presente invención se refiere a una composición, en donde por lo menos una de las estructuras de ramificación BS1, BS2 comprende una cuarta cadena de polímero S3 adicional que tiene un peso molecular de por lo menos 4 kDa y una de S°, S1, S2 comprende una tercera estructura de ramificación BS3 que comprende por lo menos la cuarta cadena de polímero S3 que tiene un peso molecular de por lo menos 4 kDa.
El grupo que induce la autoescisión Ga, el cual es necesario para la autoescisión de La está comprendido por una de las estructuras de ramificación o cadenas de polímero.
Opcionalmente, una de las estructuras de ramificación sirve como el grupo Ga de modo que la estructura de ramificación consiste de Ga (en lugar de comprender el grupo) , lo cual también está incluido por el término "que comprende" .
La preparación de un conjugado de profármaco (AA) da por resultado normalmente una mezcla de conjugados, donde varios grupos amino primarios de hGH son conjugados dando por resultado diferentes profármacos mono-conjugados , diferentes profármacos bi -conjugados , diferentes profármacos tri- 'conjugados, etcétera. Los profármacos de hGH-PEG monoconjugados , biconjugados o triconjugados correspondientes se pueden separar por medio de métodos estándar que son conocidos en el campo, como la cromatografía en columna y similares.
En los monoconjugados de profármacos de hGH-PEG, por lo menos las tres cadenas de polímero S°, S1, S2 contienen una "porción de polímero", la cual se caracteriza por una o más unidades repetitivas, las cuales pueden estar distribuidas aleatoriamente, a manera de bloques o alternativamente. Además, por lo menos las tres cadenas de polímero S°, S1, S2 muestran un grupo final, el cual es típicamente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, el cual puede ser ramificado o no ramificado, por ejemplo un grupo metilo, especialmente para las cadenas de polímero a base de PEG que dan por resultado los comúnmente llamados mPEGs .
Se señala que las porciones de polímero dentro de por lo menos las tres cadenas de polímero S°, S1, S2 pueden tener sustituyentes similares a cadenas adicionales, que se originan de las unidades repetitivas y que dan por resultado cadenas que tienen menos de 4 kDa de peso molecular y las cuales no se consideran como cadenas de polímero S°, S1, S2, etcétera. Preferiblemente, por lo menos las tres cadenas de polímero S°, S1, S2 llevan sustituyentes menores de 1000 Da de peso molecular.
Una característica estructural relevante de S° es su distancia crítica. La distancia crítica define la distancia más corta entre el sitio de unión de S° a La y la primera estructura de ramificación BS1 medida como átomos conectados. La longitud de la distancia crítica tiene un efecto sobre la actividad residual como se plantea para el compuesto 33. La distancia crítica es preferiblemente menor que 50, más preferiblemente menor que 20, mucho más preferiblemente menor que 10.
Por lo menos las tres cadenas de polímero S°, S1 y S2 contienen cada una típicamente una porción de interconexión. Ga está presente en por lo menos una de las porciones de interconexión. Para las cadenas de polímero diferentes de S°, la porción de interconexión es el elemento estructural que conecta a la porción de polímero de por ejemplo S1 con BS1 y la porción de polímero de S2 con BS . Para S°, la porción de interconexión es el elemento estructural que conecta La y BS1.
Las porciones de interconexión pueden consistir de una cadena de alquilo de 1 a 50 átomos de carbono, la cual está ramificada o no ramificada y la cual es interrumpida opcionalmente o terminada por heteroátomos o grupos funcionales seleccionados del grupo que consiste de -0-; -S- ; N(R); C(0); C(0)N(R); N(R)C(0); uno o más carbociclos o heterociclos , en donde R es hidrógeno o una cadena de alquilo de 1 a 20 átomos de carbono, la cual es interrumpida opcionalmente o terminada por uno o más de los átomos o grupos mencionados anteriormente, la cual tiene además un átomo de hidrógeno como átomo terminal ; y en donde un carbociclo es fenilo; naftilo; indenilo; indanilo; tetralinilo; cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono; y en donde el heterociclo es un heterociclilo de 4 a 7 miembros; o heterobiciclilo de 9 a 11 miembros.
"Cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono" o "anillo de cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono" significa una cadena de alquilo cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, la cual puede tener enlaces dobles de carbono-carbono que son por lo menos parcialmente saturados, por ejemplo ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, ciclohexenilo, cicloheptilo, ciclooctilo, ciclononilo, ciclodecilo. Cada hidrógeno de un carbono de cicloalquilo puede ser reemplazado por un sustituyente . El término "cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono" o "anillo de cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono" también incluye biciclos conectados como norbonano o norboneno.
"Heterociclilo de 4 a 7 miembros" o "heterociclo de 4 a 7 miembros" significa un anillo con 4, 5, 6 o 7 átomos del anillo que puede contener hasta el número máximo de enlaces dobles (anillo aromático o no aromático el cual es saturado por completo, parcialmente o insaturado) en donde por lo menos un átomo del anillo hasta 4 átomos del anillo son reemplazados por un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste de azufre (incluyendo -S(0)-, -S(0)2-), oxígeno y nitrógeno (incluyendo =N(0)-) y en donde el anillo se vincula con el resto de la molécula por vía de un átomo de carbono o nitrógeno. Los ejemplos para heterociclos de 4 a 7 miembros son azetidina, oxetano, tietano, furano, tiofeno, pirrol, pirrolina, imidazol, imidazolina, pirazol, pirazolina, oxazol, oxazolina, isoxazol, isoxazolina, tiazol, tiazolina, isotiazol, isotiazolina , tiadiazol, tiadiazolina , tetrahidrofurano, tetrahidrotiofeno, pirrolidina, imidazolidina , pirazolidina, oxazolidina, isoxazolidina , tiazolidina, isotiazolidina, tiadiazolidina, sulfolano, pirano, dihidropirano, tetrahidropirano, imidazolidina, piridina, piridazina, pirazina, pirimidina, piperazina, piperidina, morfolina, tetrazol, triazol, triazolidina , tetrazolidina, diazepano, azepina u homopiperazina .
"Heterobiciclilo de 9 a 11 miembros" o "heterobiciclo de 9 a 11 miembros" significa un sistema heterocíclico de dos anillos con 9 a 11 átomos del anillo, donde por lo menos un átomo del anillo es compartido por ambos anillos y que puede contener hasta el número máximo de enlaces dobles (anillo aromático o no aromático el cual es saturado por completo, parcialmente o insaturado) en donde por lo menos un átomo del anillo hasta 6 átomos del anillo son reemplazados por un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste de azufre (incluyendo -S{0)-, -S(0)2-), oxígeno y nitrógeno (incluyendo =N(0)-) y en donde el anillo se vincula con el resto de la molécula por vía de un átomo de carbono o nitrógeno. Los ejemplos para heterobiciclo de 9 a 11 miembros son indol, indolina, benzofurano, benzotiofeno, benzoxazol, benzisoxazol , benzotiazol, benzisotiazol , bencimidazol , bencimidazolina, quinolina, quinazolina, dihidroquinazolina, quinolina, dihidroquinolina, tetrahidroquinolina , decahidroquinolina , isoquinolina, decahidroisoquinolina, tetrahidroisoquinolina , dihidroisoquinolina , benzazepina, purina o pteridina. El término heterobiciclo de 9 a 11 miembros también incluye estructuras espiro de dos anillos como l,4-dioxa-8-azaespiro [4.5] decano o heterociclos conectados como 8-aza-biciclo [3.2.1] octano.
El carbociclo, heterociclo y heterobiciclo pueden ser sustituidos por alquilo de 1 a 20 átomos de carbono, interrumpidos opcionalmente o terminados por heteroátomos o grupos funcionales seleccionados del grupo que consiste de -0-; -S-; N(R); C(0); C(0)N(R); N(R)C(0), en donde R es hidrógeno o una cadena de alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, la cual es interrumpida opcionalmente o terminada por uno o más de los átomos o grupos mencionados anteriormente, la cual tiene además un átomo de hidrógeno como átomo terminal .
La porción de polímero de por lo menos las tres cadenas S°, S1, S2 forman la mayor parte de las cadenas, preferiblemente por lo menos 90% del peso molecular de cada cadena, más preferiblemente por lo menos 95%, aún más preferiblemente por lo menos 97.5%, aún más preferiblemente por lo menos 99%. De esta manera, la base de las cadenas es representada por la porción de polímero.
Preferiblemente, por lo menos las tres cadenas S°, S1, S2 se basan independientemente en un polímero seleccionado del grupo que consiste de polímeros de polialquiloxi , ácido hialurónico y derivados del mismo, alcoholes polivinílieos , polioxazolinas , polianhídridos , poli (orto-ésteres) , policarbonatos , poliuretanos , ácidos poliacrílicos , poliacrilamidas , poliacrilatos , polimetacrilatos , poliorganofosfazenos , polisiloxanos , polivinilpirrolidona, policianoacrilatos y poliésteres.
Preferiblemente, por lo menos las tres cadenas S°, S1, S2 se basan en el mismo polímero. Preferiblemente, por lo menos las tres cadenas S°, S1, S2 se basan en polímeros de polialquiloxi. Aún más preferiblemente, por lo menos las tres cadenas S°, S1, S2 se basan en polietilenglicol .
Lo mismo tiene aplicación para las cadenas adicionales S3, S4, S5 etcétera, por consiguiente.
La cadena S° comprende una estructura de ramificación BS1, de modo que S1 se vincula con S° . Para la unión de S2 se puede utilizar la estructura de ramificación BS1 o una estructura de ramificación BS2 adicional está presente, la cual puede ser una parte de S° o S1. Por consiguiente, las estructuras de ramificación adicionales pueden estar presentes, cuando están presentes cadenas adicionales. Por ejemplo, en el caso que esté presente una cadena S3 se puede vincular a BS1, BS2 o una estructura de ramificación BS3. La estructura de ramificación BS3, si está presente, puede ser parte de S°, S1 o S2.
En general se puede utilizar cualquier entidad química, la cual permite la ramificación de una cadena. Preferiblemente, las estructuras de ramificación se seleccionan independientemente del grupo que consiste de un carbociclo sustituido por lo menos 3 veces, heterociclo sustituido por lo menos 3 veces, átomo de carbono terciario, átomo de carbono cuaternario y átomo de nitrógeno terciario, en donde los términos carbociclo y heterociclo se definen como se indicara anteriormente.
Profármaco de rhGH unido a PEG - estructuras de conectores transitorios, La, Ga En publicaciones en el campo de los grupos que inducen la autoescisión son llamados algunas veces conectores para distinguir su estructura del portador. No obstante, frecuentemente es difícil separar claramente estas características estructurales. Por lo tanto, dentro del significado de la presente invención, el grupo que induce la escisión Ga se considera que es parte del portador S, que comprende por lo menos S°, S1, S2, BS1 y opcionalmente BS2. La variación del carácter químico de Ga permite el diseño de las propiedades de autoescisión de un profármaco vinculado con un portador correspondiente a un grado mayor.
Como se planteara anteriormente, un profármaco unido a PEG, en donde el fármaco es por ejemplo rhGH como se describe en la solicitud de patente WO-A 2005/099768 y tiene una característica de liberación, la cual se describe en este documento como el sistema de escisión 1,6 sin la producción de compuestos aromáticos tóxicos. En este documento se describen ampliamente numerosas estructuras de conectores transitorios adecuadas, relevantes para obtener un perfil de liberación relevante de interés.
Otras estructuras de conectores transitorios se describen genérica/ampliamente en por ejemplo otras solicitudes de Complex Biosystems GmbH tales como los documentos WO-A 2005/034909, WO-A 2005/099768, WO-A 2006/003014 y WO-A 2006/136586.
Más estructuras de conectores transitorios se describen ampliamente en por ejemplo el documento WO-A 99/30727 (Enzon Inc) .
A fin de resolver los presentes problemas para la GH como se planteara en este documento, los presentes inventores han seleccionado estructuras de conectores transitorios preferidas, adecuadas para obtener las propiedades funcionales, relevantes descritas en este documento del profármaco de rhGH unido a PEG. Con base en la descripción detallada en este documento de las estructuras de conectores preferidas, está dentro del conocimiento de la persona experta hacer otras estructuras de conectores transitorios preferidas, adecuadas que podrían dar un profármaco de rhGH unido a PEG con las propiedades funcionales, relevantes, descritas en este documento.
Especialmente, las estructuras de conectores transitorios adecuadas, las cuales son autohidrolizables (autoescindible) se pueden seleccionar para la incorporación en S°. Las estructuras de conectores seleccionadas en este documento se describen en detalle posteriormente.
Idealmente, un conjugado de la invención poseerá una o más de las siguientes características y/o ventajas sobre los conjugados o formulaciones actuales de rhGH; se puede sintetizar fácilmente en buenos rendimientos, tiene vida media que se encuentra dentro de un rango preferido, se puede purificar para proporcionar composiciones de conjugado homogéneas, exhibe actividad después de la autoescisión tal como actividad in vitro e in vivo y tiene efectos farmacodinámicos superiores a la rhGH no modificada y conjugados de rhGH descritos previamente y no causa lipoatrofia. Las estructuras descritas en este documento exhiben propiedades de liberación como se requiere en este documento .
En general, los profármacos vinculados con un portador requieren la presencia de un grupo funcional escindible que conecta un fármaco y un portador. En ausencia de grupos que inducen la autohidrólisis , los grupos funcionales que involucran un grupo amino donado al fármaco tal como enlaces de amida alifática o carbamato La son usualmente muy estables contra la hidrólisis y la velocidad de escisión del enlace de amida sería muy lenta para la utilidad terapéutica en un sistema de profármaco.
Si estas uniones estables se deben utilizar en profármacos vinculados con un portador, la escisión del grupo funcional no es posible en un margen de tiempo terapéuticamente útil sin la biotransformación . En esos casos, el conector exhibe una configuración estructural que es reconocida como un substrato por una enzima endógena correspondiente. En este caso, la escisión del enlace funcional La involucra un complejo que comprende la enzima. Los ejemplos son conectores peptídicos que son reconocidos por proteasas endógenas y son escindidos enzimáticamente .
Los niveles de enzimas pueden diferir significativamente entre individuos dando por resultado una variación biológica de activación del profármaco por la escisión enzimática. Los niveles de enzimas también pueden variar dependiendo del sitio de administración. Por ejemplo, se sabe que en el caso de la inyección subcutánea, ciertas áreas del cuerpo producen más efectos terapéuticos predecibles que otras. Este alto nivel de variabilidad entre pacientes no es deseable. Adicionalmente , es difícil establecer una correlación in vivo-in vitro de las propiedades farmacocinéticas para estos profármacos vinculados con un portador dependientes de enzimas. En ausencia de una correlación in vivo-in vitro confiable, la optimización de un perfil de liberación se vuelve una tarea difícil .
A fin de evitar la variabilidad de paciente a paciente y del sitio de inyección, es deseable emplear profármacos vinculados con un portador que exhiban una cinética de escisión en un margen de tiempo terapéuticamente útil sin el requerimiento de una contribución enzimática adicional para la escisión. Especialmente para los portadores de alto peso molecular, específicamente para los portadores poliméricos ramificados, el acceso al grupo funcional de conexión La puede ser restringido para las enzimas debido a una aglomeración estérica. Por lo tanto, existe la necesidad de idear profármacos vinculados con un portador que exhiban propiedades de autoescisión .
La cinética de autoescisión se puede medir por ejemplo in vitro al registrar las velocidades de hidrólisis en una solución amortiguada sin enzima.
A fin de introducir la labilidad hidrolítica en los grupos funcionales L tales como amidas o carbamatos, es necesario diseñar componentes químicos estructurales en el portador a fin de que funcionen por ejemplo como grupos colindantes en proximidad con el grupo funcional. Estas estructuras químicas que inducen la autoescisión que ejercen control sobre la capacidad de escisión del enlace de amida del profármaco se denominan grupos que inducen la autoescisión Ga. Los grupos que inducen la autoescisión pueden tener un efecto fuerte sobre la velocidad de hidrólisis de un grupo funcional La determinado.
Los grupos La preferidos se seleccionan del grupo que consiste de C(0)-0- y C(0)-, los cuales forman junto con el grupo amino primario de hGH un grupo carbamato o amida.
De esta manera, se prefiere una composición de la presente invención, en donde La se selecciona del grupo que consiste de C(0)-0- y C(0)-, los cuales forman junto con el grupo amino primario de hGH un grupo carbamato o amida dando por resultado la fórmula (AA1) o (AA2) hGH-NH-C(0)0-S° (??1 ), hGH-NH-C(0)-S° (AA2).
Las siguientes secciones listarán varios componentes estructurales que pueden funcionar como grupos que inducen la escisión G .
El grupo Ga representa un grupo que induce la autoescisión. El grupo Ga puede estar presente como tal o como un grupo que induce la autoescisión de cascada, el cual es desenmascarado para volverse efectivo por medio de un paso de escisión hidrolítica o enzimática adicional. Si el grupo Ga está presente como tal, gobierna la autohidrólisis limitante de la velocidad del grupo La.
Ejemplos para el grupo Ga: A.J. Garman y colaboradores (A.J. Garman, S.B. Kalindjan, FEBS Lett . 1987, 2.23 (2), 361-365 1987) utilizaron PEG5000-anhídrido maleico para la modificación reversible de grupos amino en el activador de plasminógeno de tipo tejido y urocinasa. La regeneración de la enzima funcional del conjugado de PEG-uPA con la incubación en un amortiguador de pH 7.4 por medio de la escisión de la unión de ácido maleámico siguió la cinética de primer orden con una vida media de 6.1 horas.
Las porciones aromáticas simples pueden inferir labilidad a un enlace de carbamato conectado (documento WO-A 01/47562) . Por ejemplo, el grupo fluorenilmetilo sustituido o no sustituido se utilizó para volver lábiles las uniones de carbamato para varios agentes bioactivos en un planteamiento de profármaco (Tsubery y colaboradores J Biol Chem 279 (2004) 38118-24) . Dos cadenas de PEG se vincularon a una porción de fluorenilo en el documento WO-A 2007/075534.
De esta manera, el grupo Ga es un anillo aromático o fluorenilmetilo vinculado directamente a un grupo funcional carbamato La.
Por consiguiente, se prefiere una composición de la presente invención, en donde Ga es un anillo aromático o fluorenilmetilo unido directamente a un grupo funcional carbamato formado por La y el grupo amino primario de hGH.
Alternativamente, la transformación de Ga puede inducir a un reordenamiento molecular dentro de S° tal como una eliminación de 1,4 o 1,6. El reordenamiento vuelve a L mucho más lábil de modo que se induce su escisión. La transformación de Ga es el paso limitante de la velocidad en el mecanismo de cascada. Idealmente, la velocidad de escisión de la unión temporal es idéntica a la velocidad de liberación deseada para la molécula de fármaco en un escenario terapéutico determinado. En esta base de sistema de cascada en la eliminación de 1,6, es deseable que la escisión de L sea sustancialmente instantánea después de que se ha inducido su labilidad por medio de la transformación de Ga. Además, es deseable que la cinética de escisión limitante de la velocidad proceda en un margen de tiempo terapéuticamente útil sin el requerimiento de una contribución enzimática adicional a fin de evitar las desventajas asociadas con la escisión predominantemente enzimática que se planteara anteriormente.
R.B. Greenwald, A. Pendri, C.D. Conover, H. Zhao, Y.H. Choe, A. Martínez, K. Shum, S. Guan, J. Med. Chem., 1999, 42, 3657-3667 y la Solicitud de Patente del PCT WO-A 99/30727 describieron una metodología para sintetizar profármacos con poli (etilenglicol ) de compuestos de moléculas pequeñas que contenían amino a base de la eliminación de 1,4- o 1,6-bencilo. En este planteamiento, el grupo amino de la molécula de fármaco se vincula por vía de un grupo carbamato a una porción de bencilo unida a PEG. El poli (etilenglicol ) se unió al grupo bencilo por medio de enlaces de éster, carbonato, carbamato o amida. La liberación del PEG de la molécula de fármaco ocurre a través de una combinación de autohidrólisis y escisión enzimática. La escisión del grupo de enmascaramiento que desencadena la liberación es seguida en este planteamiento por la eliminación clásica y rápida de 1,4- o 1,6-bencilo. Este sistema conector también se utilizó para los conjugados de poli (etilenglicol) liberables de proteínas (S. Lee, R.B. Greenwald y colaboradores Bioconj . Chem. 2001, 12(2), 163- 169) . La lisozima se utilizó como una proteína modelo debido a que pierde su activad cuando la unión a PEG toma lugar en el grupo épsiIon-amino de los residuos de lisina. Varias cantidades del conector de PEG se conjugaron con la proteína. La regeneración de la proteína nativa de los conjugados de PEG ocurrió en plasma de rata o en amortiguador de pH alto no fisiológico. Véase también F.M.H. DeGroot y colaboradores (documentos WO-A 2002/083180 y WO-A 2004/043493) y D. Shabat y colaboradores (documento WO-A 2004/019993) .
De esta manera, La es un grupo funcional carbamato, la escisión del grupo es inducida por un grupo hidroxilo o amino de Ga por vía de la eliminación de 1,4- o 1,6-bencilo de S°, en donde Ga contiene enlaces de éster, carbonato, carbamato o amida que se someten a la transformación limitante de la velocidad. En efecto, Ga puede ser escindido por medio de la hidrólisis.
Por consiguiente, se prefiere una composición de la presente invención, en donde L forma junto con el grupo amino de hGH un grupo funcional carbamato, la escisión del grupo es inducida por un grupo hidroxilo o amino de Ga por vía de la eliminación de 1,4- o 1,6-bencilo de S°, en donde Ga contiene enlaces de éster, carbonato, carbamato o amida que se someten a la transformación limitante de la velocidad .
Ga puede contener un sistema de escisión de cascada que se hace posible por medio de componentes de Ga que están compuestos de una combinación estructural que representa el precursor mencionado anteriormente. Un precursor de Ga puede contener uniones temporales adicionales tal como una amida, un éster o un carbamato. La estabilidad, o susceptibilidad a la hidrólisis de la unión temporal del precursor (por ejemplo carbamato) puede ser gobernada por propiedades autohidrolíticas o puede requerir la actividad de una enzima .
Antczak y colaboradores (Bioorg Med Chem 9 (2001) 2843-48) describen un reactivo el cual forma la base de un sistema de profármaco de cascada macromolecular para moléculas de fármaco que contienen amina. En este planteamiento, un anticuerpo sirve como el portador, un enlace estable conecta el anticuerpo a un grupo de activación, que lleva un grupo de enmascaramiento escindible. Con la remoción del grupo de enmascaramiento vinculado con éster, La escinde y libera el compuesto de fármaco .
D. Shabat y colaboradores (Chem. Eur. 3. 2004, 10, 2626-2634) describen un sistema de profármaco polimérico a base de un grupo de activación de ácido mandélico. En este sistema, el grupo de enmascaramiento se vincula con el grupo de activación por medio de un enlace de carbamato. El grupo de activación se conjuga permanentemente a un polímero de poliacrilamida por vía de un enlace de amida. Después de la activación del grupo de enmascaramiento por un anticuerpo catalítico, el grupo de enmascaramiento es escindido por medio de la ciclización y el fármaco se libera. El grupo de activación está aún conectado al polímero de poliacrilamida después de la liberación del fármaco.
M.-R. Lee y colaboradores describen (Angew. Chem. 2004, 116, 1707-17 10) un sistema de profármaco similar a base de un grupo de activación de ácido mandélico y un grupo de enmascaramiento vinculado con éster.
No obstante en estos conectores un paso de eliminación de 1,6 genera aún un producto intermedio aromático sumamente reactivo. Aún si la porción aromática permanece adherida permanentemente al portador polimérico, se pueden causar reacciones secundarias con efectos potencialmente tóxicos o inmunogénicos .
Greenwald y colaboradores publicaron en 2000 un sistema de suministro de fármaco con poli (etilenglicol) de profármacos que contienen amino a base de la lactonización de bloqueo de trimetilo (R.B. Greenwald y colaboradores J.Med.Chem. 2000, 43(3), 457-487; documento O-A 02/089789). En este sistema de profármaco, el ácido o-hidroxifenil-dimetilpropiónico sustituido se acopla a grupos amino de moléculas de fármaco por medio de un enlace de amida. El grupo hidroxi se vincula al PEG por medio de un grupo éster, carbonato o carbamato. El paso que determina la velocidad en la liberación de fármaco es la escisión enzimática de esos grupos funcionales seguida por la escisión rápida de amida or medio de la lactonización, liberando un producto secundario de lactona aromático.
Más recientemente, R.B. Greenwald y colaboradores (Greenwald y colaboradores J. Med.Chem. 2004, 47, 726-734) describieron un sistema de profármaco con PEG a base de un conector de amida de bis- (?-2-hidroxietil) glicina (amida de bicina) . En este sistema, dos moléculas de PEG se vinculan con una molécula de bicina acoplada a un grupo amino de la molécula de fármaco. Los primeros dos pasos en la activación del profármaco es la escisión enzimática de ambas moléculas de PEG. Diferentes uniones entre PEG y bicina se describen dando por resultado diferentes cinéticas de activación de profármaco. La desventaja principal de este sistema es la baja velocidad de hidrólisis de la amida de bicina conjugada a la molécula de fármaco (ti/2 = 3 horas en amortiguador de fosfato) dando por resultado la liberación de un producto intermedio de profármaco modificado con bicina que puede mostrar diferentes propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas que la molécula de fármaco precursora.
Más específicamente, los grupos preferidos La y Ga con porciones separadoras específicas para S° se describen posteriormente .
Una estructura preferida de acuerdo con el documento O-A 2005/099768 se selecciona de la fórmula general (I) y (II) : en donde T representa hGH-NH; X representa una porción separadora; Yi e Y2 representan cada uno independientemente 0, S o NR6 ; Y3 representa 0 o S; Y4 representa 0, NR6 o -C(R7) (Re) ; R3 representa una porción seleccionada del grupo que consiste de hidrógeno, grupos alquilo o heteroalquilo lineales, ramificados o cíclicos, sustituidos o no sustituidos, grupos arilo, grupos arilo sustituidos, grupos heteroarilo sustituidos o no sustituidos, grupos ciano, grupos nitro, átomos de halógeno, grupos carboxi, grupos carboxialquilo, grupos alquilcarbonilo o grupos carboxamidoalquilo ; R4 representa una porción seleccionada del grupo que consiste de hidrógeno, grupos alquilo o heteroalquilo lineales, ramificados o cíclicos, sustituidos o no sustituidos, grupos arilo, grupos arilo sustituidos, grupo heteroarilo sustituido o no sustituido, grupos alcoxi lineales, ramificados o cíclicos, sustituidos o no sustituidos, grupos heteroalquiloxi , grupos ariloxi o grupos heteroariloxi lineales, ramificados o cíclicos, sustituidos o no sustituidos, grupos ciano y átomos de halógeno; R7 y R8 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, grupos alquilo o heteroalquilo lineales, ramificados o cíclicos, sustituidos o no sustituidos, grupos arilo, grupos arilo sustituidos, grupos heteroarilo sustituidos o no sustituidos, grupos carboxialquilo , grupos alquilcarbonilo, grupos carboxamidoalquilo , grupos ciano y átomos de halógenos; R6 representa un grupo seleccionado de hidrógeno, grupos alquilo o heteroalquilo lineales, ramificados o cíclicos, sustituidos o no sustituidos, grupos arilo, grupos arilo sustituidos y grupos heteroarilo sustituidos o no sustituidos; Ri representa el resto de S° ; W representa un grupo seleccionado de grupos alquilo lineales, ramificados o cíclicos, sustituidos o no sustituidos, grupos arilo, grupos arilo sustituidos, grupos heteroalquilo lineales, ramificados o cíclicos, sustituidos o no sustituidos, grupos heteroarilo sustituidos o no sustituidos; u representa un nucleófilo; n representa cero o un generador de imágenes positivo; y Ar representa un hidrocarburo aromático mult i - sustituido o heterociclo aromático multi- sust ituido .
Dentro del significado de la presente invención, el grupo La es representado por Y3-C ( Y5) NH-(junto con el grupo amino de hGH) , Ga es representado por Nu-W-Y4-C ( Yi) Y2 y Ar (R4) n-C (R3) XRi representa S°, el cual incluye además por lo menos S1, S2 , BS1 y opcionalment e BS2.
En una modalidad alternativa, S1 se une por vía de Ar o representa R3. Entonces el átomo de carbono adyacente a Y3 sustituido por XR1 representa la estructura ramificada BS1, S1 es terminado con Ar que comprende Ga . Es evidente que en esta modalidad los términos S° y S1 son intercambiables.
Preferiblemente, en la fórmula (AA) o (AA1)S° es de la fórmula (AAA1) en donde Ga tiene el significado indicado anteriormente ; S00 es CH2; o C(0) ; S0A es una cadena de alquileno que tiene de 1 a 20 átomos carbono, la cual es interrumpida o terminada opcionalmente por o más grupos, ciclos o heteroátomos seleccionados del grupo que consiste de heterociclo sustituido opcionalmente; 0; S; C(0) ; y NH ; BS1 , BS2 , BS3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de N; y CH.
S0B, son independientemente una cadena de alquileno que tiene de 1 a 200 átomos de carbono, la cual es interrumpida o terminada opcionalmente por uno o más grupos, ciclos o heteroátomos seleccionados del grupo que consiste de heterociclo sustituido opcionalmente; O ; S ; C (O) ; y NH ; Soc , S1B , son (C(0) )„2 ( CH2 ) nl (OCH2CH2)nOCH3, en donde cada n es independientemente un número entero de 100 a 500, cada ni es independientemente 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, y n2 es 0 o 1.
S2, S3 son independientemente hidrógeno; o ( C(0) )n2(CH2) ni(OCH2CH2) nOCH3 , en donde cada n es independientemente un número entero de 100 a 500, cada ni es independientemente 0, 1, 2, 3, '4, 5, 6, 7 u 8, y n2 es 0 o 1, con la condición de que por lo menos uno de S2, S3 sea diferente de hidrógeno; R2, R3 son definidos como en la fórmula (A) posterior.
El término heterociclo significa un heterociclo como se definiera anteriormente. Los sustituyentes opcionales son, por ejemplo oxo (=0) , donde el anillo es saturado por lo menos parcialmente, una cadena de alquilo ramificada o no ramificada que tiene de uno a 6 átomos de carbono o halógeno. Un heterociclo sustituido preferido es succinimida.
Preferiblemente, Ga en la fórmula (AAA1) es OC(0)-R y R es la estructura parcial de la fórmula (I) como se muestra posteriormente, en donde Rl, R4, R5 y n se definen posteriormente.
Otra modalidad preferida se describe en el documento WO06136586A2. Por consiguiente, se prefieren las siguientes estructuras : en donde T es NH-hGH; X es una porción separadora tal como R13-Y1; Yl es 0, S, NR6, succinimida, maleimida, enlaces de carbono-carbono insaturados o cualquier heteroátomo que contiene un par de electrones libre o está ausente; R13 se selecciona de alquilo o heteroalquilo lineal, ramificado o cíclico, sustituido o no sustituido, grupos arilo, grupos arilo sustituidos, grupos heteroarilo sustituidos o no sustituidos; R2 y R3 se seleccionan independientemente de hidrógeno, grupos acilo o grupos protectores para grupos hidroxilo; R4 a R12 se seleccionan independientemente de hidrógeno, X-Rl, alquilo o heteroalquilo lineal, ramificado o cíclico, sustituido o no sustituido, grupos arilo, grupos arilo sustituidos, grupos heteroarilo sustituidos o no sustituidos, ciano, nitro, halógeno, carboxi , carboxamida ; Rl es el resto de S°, que comprende por lo menos S1, S2 , BS1, y opcionalmente BS2.
En esta modalidad, La es un grupo amida, y Ga comprende la estructura N-ramificada que lleva OR2/OR3.
En todavía otra modalidad preferida, una estructura preferida es proporcionada por un conjugado de profármaco D-L, en donde -D es NH-hGH; y -L es una porción conectora no activa biológicamente -L1 representada por la fórmula (I) , en donde la línea punteada indica la unión al grupo amino de hGH al formar un enlace de amida; X es C(R4R4a); N(R4); 0; C (RVa) -C (R¾¾) ; C (R¾5a) -C (R4R4a) ; C (R4R4a) -N(R6) ; N(R6)-C(R4R4a); CiRWO; o 0-C(RR4a) ; X1 es C; o S(0) ; X2 es C(R7, R7a); o C(R7, R7a)-C(R8, R83) ; R1, Rla, R2, R2a, R3, R3a, R4a, R5, R¾, R6, R7, R7a, R8, Rte se seleccionan independientemente del grupo que consiste de H; y alquilo de 1 a 4 átomos de carbono; u Opcionalmente, uno o más de los pares Rla/Ra, R^/R53, R^/R53, R4a/R5a, R7a/R8a forman un enlace químico; Opcionalmente, uno o más de los pares R1/Rla, R2/R2a, R/R4a, R5/R5a, R7/R7a, R8/R8a se unen junto con el átomo al cual están adheridos para formar un cicloalquilo de 3 a 7 átomos de carbono; o heterociclilo de 4 a 7 miembros; Opcionalmente, uno o más de los pares R1/R4, R1/R5, R1/R6, R4/R5, R7/R8, R2/R3 se unen junto con los átomos a los cuales están adheridos para formar un anillo A; Opcionalmente, R3/R3 se unen junto con el átomo de nitrógeno al cual están adheridos para formar un heterociclo de 4 a 7 miembros; A se selecciona del grupo que consiste de fenilo; naftilo; indenilo; indanilo; tetralinilo; cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono; heterociclilo de 4 a 7 miembros; y heterobiciclilo de 9 a 11 miembros; y en donde L1 es sustituido por un grupo L2-Z y es sustituido opcionalmente de manera adicional, con la condición de que el hidrógeno marcado con el asterisco en la fórmula (I) no sea reemplazado por un sustituyante; en donde L2 es un enlace químico individual o un separador; y Z es el resto de S°, que comprende por lo menos S1, S2, BS1, y opcionalmente BS2.
En esta modalidad, La es representado por un grupo amida y G3 es representado por N(H*)X1(0) y la cadena que se conecta a N incluye sustituyentes de N.
Los conjugados de profármaco de este tipo se describen en la solicitud de Patente Europea No. 08150973.9.
Por consiguiente, se prefiere una composición de la presente invención, en donde La-S° es representado por la fórmula (AAA2) , en donde la línea punteada indica la unión al grupo amino primario de hGH de tal manera que La y el grupo amino forman un enlace de amida; X es C(R4R4a); N(R4); O; C (R4R4a) -C (R¾5a) ; C (RR5a) -C (R4R4a) ; C (R4R4a) -N(R6) ; N(R6) -C(R4R4a) ; C(RR4a) -O; o 0-C(R4R4a) ; XI es C; o S(0) ; X2 es C(R7, R7a); o C(R7, R7a)-C(RS, R8a) ; , ü-Kla, , toe seleccionan independientemente del grupo que consiste de H; y alquilo de 1 a 4 átomos de carbono; u Opcionalmente, uno o más de los pares Rla/R4a, Rla/R5a, Ra/R5a, R4a/R5a, R7a/R8a forman un enlace químico; Opcionalmente, uno o más de los pares R1/Rla, R2/R2a, R4/Ra, R5/R5a, R7/R7a, R8/R8a se unen junto con el átomo al cual están adheridos para formar cicloalquilo de 3 a 7 átomos de carbono; o heterociclilo de 4 a 7 miembros; Opcionalmente, uno o más de los pares R1/R4, R1/R5, R1/R6, R4/R5, R7/R8, R2/R3 se unen junto con los átomos a los cuales están adheridos para formar un anillo A; Opcionalmente, R3/R3a se unen junto con el átomo de nitrógeno al cual están adheridos para formar un heterociclo de 4 a 7 miembros; A se selecciona del grupo que consiste de fenilo; naftilo indenilo; indanilo; tetralinilo; cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono; heterociclilo de 4 a 7 miembros; y heterobiciclilo de 9 a 11 miembros; y en donde S° es sustituido por un grupo L2-Z y es' sustituido opcionalmente de manera adicional, con la condición de que el hidrógeno marcado con el asterisco en la fórmula (I) no sea reemplazado por un sustituyente; en donde L2 es un enlace químico individual o un separador; y Z es de la fórmula (AAA2a) en donde S00, S0A, SCB, Soc, S , S18, S2, S3, BS1, BS2 y BS3 tienen el significado indicado para la fórmula (AAA1) anterior.
"Alquilo" significa una cadena recta o una cadena de carbono ramificada. Cada hidrógeno de un carbono de alquilo puede ser reemplazado por un sustituyente.
"Alquilo de 1 a 4 átomos de carbono" significa una cadena de alquilo que tiene 1 - 4 átomos de carbono, por ejemplo si está presente en el extremo de una molécula: metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo tere-butilo o por ejemplo, -CH2-, -CH2-CH2-, -??(a?3)-, -a¼-a¼-a½-/ -CH(C2H5)-, -C(CH3)2-, cuando dos porciones de una molécula son vinculadas por el grupo alquilo. Cada hidrógeno de un carbono de alquilo de 1 a 4 átomos de carbono puede ser reemplazado por un sustituyente.
"Alquilo de 1 a 6 átomos de carbono" significa una cadena de alquilo que tiene 1 - 6 átomos de carbono, por ejemplo si está presente en el extremo de una molécula: alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo; tere-butilo, n-pentilo, n-hexilo 0 por ejemplo -CH2-, -CH2-CH2-, -CH(CH3)-, -CH2-CH2-CH2- , -CH(C2H5)-, -C(CH3)2-, cuando dos porciones de una molécula son vinculadas por el grupo alquilo. Cada hidrógeno de un carbono de alquilo de 1 a 6 átomos de carbono "puede ser reemplazado por un sustituyente .
Por consiguiente, "alquilo de 1 a 18 átomos de carbono" significa una cadena de alquilo que tiene de 1 a 18 átomos de carbono y "alquilo de 8 a 18 átomos de carbono" significa una cadena de alquilo que tiene de 8 a 18 átomos de carbono. Por consiguiente, "alquilo de 1 a 50 átomos de carbono" significa una cadena de alquilo que tiene de 1 a 50 átomos de carbono.
"Alquenilo de 2 a 50 átomos de carbono" significa una cadena de alquenilo ramificada o no ramificada que tiene de 2 a 50 átomos de carbono, por ejemplo si está presente en el extremo de una molécula: -CH=CH2, -CH=CH-CH3, -CH2-CH=CH2, -CH=CH-CH2-CH3, -CH=CH-CH=CH2 o por ejemplo -CH=CH-, cuando dos porciones de una molécula son vinculadas por el grupo alquenilo. Cada hidrógeno de un carbono de alquenilo de 2 a 50 átomos de carbono puede ser reemplazado por un sustituyente como se especifica adicionalmente . Por consiguiente, el término "alquenilo" se refiere a una cadena de carbono con por lo menos un enlace doble de carbono-carbono. Opcionalmente, pueden aparecer uno o más enlaces triples.
"Alquinilo de 2 a 50 átomos de carbono" significa una cadena de alquinilo ramificada o no ramificada que tiene de 2 a 50 átomos de carbono, por ejemplo si está presente en el extremo de una molécula: -C=CH, -CH2-C=CH, CH2-CH2-C=CH, CH2-C=C-CH3, o por ejemplo -C=C- cuando dos porciones de una molécula son vinculadas por el grupo alquinilo. Cada hidrógeno de un carbono de alquinilo de 2 a 50 átomos de carbono puede ser reemplazado por un sustituyente como se especifica adicionalmente . Por consiguiente, el término "alquinilo" se refiere a una cadena de carbono con por lo menos un enlace triple de carbono-carbono . Opcionalmente, pueden aparecer uno o más enlaces dobles.
"Cicloalquilo de 3 a 7 átomos de carbono" o "anillo de cicloalquilo de 3 a 7 átomos de carbono" significa una cadena de alquilo cíclico que tiene de 3 a 7 átomos de carbono, el cual puede tener enlaces dobles de carbono-carbono que son saturados por lo menos parcialmente, por ejemplo ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, ciclohexenilo, cicloheptilo . Cada hidrógeno de un carbono de cicloalquilo puede ser reemplazado por un sustituyente. El término "cicloalquilo de 3 a 7 átomos de carbono" o "anillo de cicloalquilo de 3 a 7 átomos de carbono" también incluye biciclos conectados como norbonano o norboneno. Por consiguiente, "cicloalquilo de 3 a 5 átomos de carbono" significa cicloalquilo que tiene de 3 a 5 átomos de carbono.
Por consiguiente, "cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono" significa alquilo cíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, por ejemplo cicloalquilo de 3 a 7 átomos de carbono; ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, ciclohexenilo, cicloheptilo, ciclooct-ilo, ciclononilo, ciclodecilo. El término "cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono" también incluye carbomono- y -biciclos por lo menos parcialmente saturados.
"Halógeno" significa fluoro, cloro, bromo o yodo. Se prefiere generalmente que halógeno sea fluoro o cloro.
"Heterociclilo de 4 a 7 miembros" o "heterociclo de 4 a 7 miembros" significa un anillo con 4, 5, 6 o 7 átomos del anillo que puede contener hasta el número máximo de enlaces dobles (anillo aromático o no aromático el cual es saturado por completo, parcialmente o insaturado) en donde por lo menos un átomo del anillo hasta 4 átomos del anillo son reemplazados por un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste de azufre (incluyendo -S(O)-, -S(0)2-), oxígeno y nitrógeno (incluyendo =N(0)-) y en donde el anillo se vincula al resto de la molécula por vía de un átomo de carbono o nitrógeno. Los ejemplos para heterociclos de 4 a 7 miembros son azetidina, oxetano, tietano, furano, tiofeno, pirrol, pirrolina, imidazol, imidazolina, pirazol, pirazolina, oxazol, oxazolina, isoxazol, isoxazolina, tiazol, tiazolina, isotiazol, isotiazolina, tiadiazol, tiadiazolina, tetrahidrofurano, tetrahidrotiofeno, pirrolidina, imidazolidina, pirazolidina, oxazolidina, isoxazolidina, tiazolidina, isotiazolidina, tiadiazolidina, sulfolano, pirano, dihidropirano, tetrahidropirano, imidazolidina, piridina, piridazina, pirazina, pirimidina, piperazina, piperidina, morfolina, tetrazol, triazol, triazolidina, tetrazolidina, diazepano, azepina u homopiperazina.
"Heterobiciclilo de 9 a 11 miembros" o "heterobiciclo de 9 a 11 miembros" significa un sistema heterocíclico de dos anillos con 9 a 11 átomos del anillo, donde por lo menos un átomo del anillo es compartido por ambos anillos y que puede contener hasta el número máximo de enlaces dobles (anillo aromático o no aromático el cual es saturado por completo, parcialmente o insaturado) en donde por lo menos un átomo del anillo hasta 6 átomos del anillo son reemplazados por un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste de azufre (incluyendo -S(0)-, -S(0)2-), oxígeno y nitrógeno (incluyendo =N(0)-) y en donde el anillo es vinculado al resto de la molécula por vía de un átomo de carbono o nitrógeno. Los ejemplos para un heterobiciclo de 9 a 11 miembros son indol, indolina, benzofurano, benzotiofeno, benzoxazol, benzisoxazol , benzotiazol, benzisotiazol , bencimidazol , bencimidazolina, quinolina, quinazolina, dihidroquinazolina, quinolina, dihidroquinolina, tetrahidroquinolina, decahidroquinolina, isoquinolina, · decahidroisoquinolina, tetrahidroisoquinolina, dihidroisoquinolina, benzazepina, purina o pteridina. El término heterobiciclo de 9 a 11 miembros también incluye estructuras espiro de dos anillos como 1, 4-dioxa-8-azaespiro [4.5] decano o heterociclos conectados como 8-aza-biciclo [3.2.1] octano.
Preferiblemente, La-S° se selecciona del grupo que consiste de en donde R es H; o alquilo de 1 a 4 átomos de carbono; Y es NH; O o S; y R1 , Rla, R2 , R2a, R3 , R3a, R4 , X, X1, X2 tienen el significado como se indicara anteriormente.
Aún más preferiblemente, L1-S° se selecciona del grupo que consiste de ?? ?? ? ?? en donde R tiene el significado indicado anteriormente.
Por lo menos un (hasta cuatro) átomo de hidrógeno es reemplazado por un grupo L2-Z. En caso de que más de un grupo L2-Z esté presente cada L2 y cada Z se puede seleccionar independientemente. Preferiblemente, solo está presente un grupo L2-Z.
En general, S° puede ser sustituido por L2-Z en cualquier posición prescindiendo del reemplazo del hidrógeno marcado con un asterisco en las fórmulas anteriores. Preferiblemente, de uno a cuatro del hidrógeno proporcionado por R, R1 a R8 directamente o como hidrógeno del grupo alquilo de 1 a 4 átomos de carbono o grupos adicionales y anillos proporcionados por la definición de R y R1 a R8 son reemplazados por L2-Z.
Adicionalmente , S° puede ser sustituido además opcionalmente . En general, cualquier sustituyante se puede utilizar en cuanto que no se afecte el principio de escisión .
Preferiblemente, uno o más sustituyentes opcionales adicionales se seleccionan independientemente del grupo que consiste de halógeno; CN; COOR9; OR9; C(0)R9; C (0) N (R9R9a) ; S(0)2N(R9R9a) ; S(0)N(R9R9a) ; S(0)2R9; S(0)R9; N (R9) S (O) 2N (R9aR9b) ; SR9; N(R9R9a) ; N02 ; 0C(0)R9; N (R9) C (0) R9a ; N (R9) S (0) 2R9a ; N(R9)S(0)R9a; N(R9)C(0)OR9a; N (R9 ) C (0) N (R9aR9b) ; OC (0) N (R9R9a) ; T; alquilo de 1 a 50 átomos de carbono; alquenilo de 2 a 50 átomos de carbono; o alquinilo de 2 a 50 átomos de carbono, en donde T; alquilo de 1 a 50 átomos de carbono; alquenilo de 2 a 50 átomos de carbono; y alquinilo de 2 a 50 átomos de carbono son sustituidos opcionalmente por uno o más R10, los cuales son los mismos o diferentes y en donde alquilo de 1 a 50 átomos de carbono; alquenilo de 2 a 50 átomos de carbono; y alquinilo de 2 a 50 átomos de carbono son interrumpidos opcionalmente por uno o más grupos seleccionados del grupo que consiste de T, -C(0)0-; -0-; -C(0)-; -C (0) N (R11) - ; -SÍO^NÍR11) -; -S (O) N (R11) - ; -S(0)2-; -S (0) - ; -N {R11) S (0) 2N (Rlla) -; -S-; -N (R11) - ; -OCtOjR11; -N (R11) C (0) - ; -¥í{R11)S(0)2- ; -NCR^SÍO) -; -N (R11) C (O) O- ; -N (R11 ) C (0) N (Rlla) -y -OCÍOÍNÍR^R113) ; R9, R9a, R9b se seleccionan independientemente del grupo que consiste de H; T; y alquilo de 1 a 50 átomos de carbono; alquenilo de 2 a 50 átomos de carbono; o alquinilo de 2 a 50 átomos de carbono, en donde T; alquilo de 1 a 50 átomos de carbono; alquenilo de 2 a 50 átomos de carbono; y alquinilo de 2 a 50 átomos de carbono son sustituidos opcionalmente por uno o más R10, los cuales son los mismos o diferentes y en donde alquilo de 1 a 50 átomos de carbono; alquenilo de 2 a 50 átomos de carbono; y alquinilo de 2 a 50 átomos de carbono son interrumpidos opcionalmente por uno o más grupos seleccionados del grupo que consiste de T, -C(0)0-; -0-; -C(O)-; -C (0)N (R11) - ; -S (0) 2N (R11) - ; -S (O) N (R11) - ; -S(0)2-; -S(0)-; -N(R11)S(0)2N(Rlla) -; -S-; -N (R11) - ; -0C(0)R11; -N(R")C(0) -; -N(R11)S(0)2-; -N (R11) S (0) - ; -N (R11) C (0) 0- ; -N(R1:l)C(0)N(Rlla) - y -0C (O) N (RlxRlla) ; T se selecciona del grupo que consiste de fenilo; naftilo; indenilo; indanilo; tetralinilo; cicloalquiló de 3 a 10 átomos de carbono; heterociclilo de 4 a 7 miembros; o heterobiciclilo de 9 a 11 miembros, en donde T es sustituido opcionalmente por uno o más R10, los cuales son los mismos o diferentes ; R10 es halógeno; CN; oxo (=0); COOR12; OR12 ; C(0)R12; C(0)N(R12R12a) ; S(0)2N(R12R12a) ; S (0) N (R12R12a) ; S(0)2R12; S(0)R12; N(R12)S (0)2N(R12aR12b) ; SR12 ; N(R1R12a); N02 ; 0C(0)R12; N(R12)C(0)R12a; N(R12) S (0) 2R12a; N (R1 ) S (O) R1 a; N (R12) C (O) 0R12a; N(R1 )C(0)N(R12aR12b) ; OC (0) N (R12R12a) ; o alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, en donde alquilo de 1 a 6 átomos de carbono es sustituido opcionalmente por uno o más átomos de halógeno, los cuales son los mismos o diferentes; R11, Rlla, R12, R12a, R12b se seleccionan independientemente del grupo que consiste de H; o alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, en donde alquilo de 1 a 6 átomos de carbono es sustituido opcionalmente por uno o más átomos de halógeno, los cuales con los mismos o diferentes .
El término "interrumpido" significa que entre dos átomos de carbono se inserta un grupo o en el extremo de la cadena de carbono entre el carbono y él hidrógeno.
L2 es un enlace químico individual o un separador. En caso de que L2 sea un separador, se define preferiblemente como uno o más de los sustituyentes opcionales definidos anteriormente, con la condición de que L2 sea sustituido por Z.
Por consiguiente, cuando L2 es diferente de un enlace químico individual, L2-Z es COOR9 ; OR9 ; C(0)R9; C (0) N (R9R9a) ; S (0) 2N (R9R9a) ; S (0) N (R9R9a) ; S(0)2R9; S(0)R9; N (R9) S (0) 2N (R9aR9b) ; SR9 ; N(R9R9a); OC(0)R9; N (R9 ) C (O) Ra ; N (R9) S (0) 2 9a; N (R9) S (O) R9a ; N (R9) C (O) 0R9a ; N (R9) C (0)N (R9aR9b) ; 0C (0) N (R9R9a) ; T; alquilo de 1 a 50 átomos de carbono; alquenilo de 2 a 50 átomos de carbono; o alquinilo de 2 a 50 átomos de carbono, en donde T; alquilo de 1 a 50 átomos de carbono; alquenilo de 2 a 50 átomos de carbono; y alquinilo de 2 a 50 átomos de carbono son sustituido opcionalmente por uno o más R10 , los cuales son los mismos o diferentes y en donde alquilo de 1 a 50 átomos de carbono; alquenilo de 2 a 50 átomos de carbono; y alquinilo de 2 a 50 átomos de carbono son interrumpidos opcionalmente por uno o más grupos seleccionados del grupo que consiste de -T-, -C(0)0-; -O- -C(O)-; -C(0)N(R1X) -; -S(0)2N(R11) -; -S (O) N (R11) - ; -S(0)2-; -S(O)-; -N (R11) S (O) 2N (Rlla) - ; -S- ; -N (R11 ) - ; -0C(0)Rn; -N(R11)C(0) -; -N (R11) S (0) 2- ; -N (R11) S (O) - ; -NÍR^CÍOJO-; -N(R11)C(0)N(Rlla) - y -0C (0) N (R1:LRlla) ; R9 , R9a, R9b se seleccionan independientemente del grupo que consiste de H; Z; T; y alquilo de 1 a 50 átomos de carbono; alquenilo de 2 a 50 átomos de carbono; o alquinilo de 2 a 50 átomos de carbono, en donde T; alquilo de 1 a 50 átomos de carbono; alquenilo de 2 a 50 átomos de carbono; y alquinilo de 2 a 50 átomos de carbono son sustituidos opcionalmente por uno o más R10 , los cuales son los mismos o diferentes y en donde alquilo de 1 a 50 átomos de carbono; alquenilo de 2 a 50 átomos de carbono; y alquinilo de 2 a 50 átomos de carbono son interrumpidos opcionalmente por uno o más grupos seleccionados del grupo que consiste de T, -C(0)0-; -0-; -C(0)-; -C(0)N(Ru)-; -S (0) 2N (R11) - ; -S (0) N (R11) - ; -S(0)2-; -S(O)-; -N (R11) S (O) 2N (Rlla) - ; -S-; -N (R11 ) - ; -OCÍOÍR11; -N(R11)C(0) -; -NÍR11) S (0)2- ; -N (R11) S (0) - ; -N (R11) C (0) 0- ; -N(R11)C(0)N(Rlla) - y -0C (O) N (R1:LRlla) ; T se selecciona del grupo que consiste de fenilo; naftilo; indenilo; indanilo; tetralinilo; cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono; heterociclilo de 4 a 7 miembros; o heterobiciclilo de 9 a 11 miembros, en donde t es sustituido opcionalmente por uno o más R10, los cuales son los mismos o diferentes ; R10 es Z; halógeno; CN; oxo (=0); C00R12; 0R12; C(0)R12; C(0)N(R12R12a) ; S (O) 2N (R1 R12a) ; S (O) N (R12R12a) ; S(0)2R12; S(0)R12; N(R12)S(0)2N(R12aR12b) ; SR12 ; N(R12R12a) ; N02 ; 0C(0)R12; N(R12)C(0)R12a; N(R12)S(0)2R12a; N (R12) S (O) R12a; N (R12) C (0) 0R12a ; N(R12)C(0)N(R12aR12b) ; 0C (O) N (R12R12a) ; o alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, en donde alquilo de 1 a 6 átomos de carbono es sustituido opcionalmente por uno o más átomos de halógeno, los cuales pueden ser los mismos o diferentes; R11, Rlla, R12, R12a, R12b se . seleccionan independientemente del grupo que consiste de H; Z; o alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, en donde alquilo de 1 a 6 átomos de carbono es sustituido opcionalmente por uno o más átomos de halógeno, los cuales son los mismos o diferentes; con la condición de que uno de R9, R9a, R9b, R10, R11, Rlla, R12, R1 a, R12b es Z.
Aún más preferiblemente, las estructuras aromáticas generales se listan a continuación.
(A), en donde NH-rhGH representa el residuo de rhGH adherido al conector transitorio; Rl, R2 , R3 , R4 y R5 se seleccionan independientemente de hidrógeno, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, butilo terciario, PEG representa el residuo de unión a PEG adherido al conector transitorio, y n = 1 o 2, y X se selecciona de alquilo de 1 a 8 átomos de carbono o heteroalquilo de 1 a 12 átomos de carbono.
El término "heteroalquilo de 1 a 12 átomos de carbono" significa una cadena de alquilo que tiene de 1 a 12 átomos de carbono la cual es interrumpida opcionalmente por heteroátomos , grupos funcionales, carbociclos o heterociclos como se definiera anteriormente.
En una modalidad preferida, en la fórmula (A) La es representado por el grupo carbamato adherido a rhGH, Ga es representado por el grupo de oxígeno aromático, el carbonilo adherido a éste, y el sustituyente adherido al carbonilo como se muestra en la fórmula I.
Las estructuras más preferidas se proporcionan por la fórmula general I, las cuales son parte de la estructura (A) dentro de la estructura general del conector aromático: Fórmula I y donde los ejemplos preferidos de la fórmula I comprenden: Las estructuras aromáticas más preferidas de la fórmula II, las cuales son parte de la estructura (A) dentro de la estructura general del conector aromático anterior: ?? Las estructuras más preferidas de la fórmula III, las cuales son parte de la estructura (A) dentro de la estructura general del conector aromático anterior, en donde PEG-X es PEG W Fórmula III y PEG-W incluye los siguiente grupos sustituyentes : ejemplo de los conjugados de profármaco preferidos se muestra a continuación: ciona de hidrógeno, metilo, etilo, propilo y butilo, X se selecciona de alquilo de 1 a 8 átomos de carbono o heteroalquilo de 1 a 12 átomos de carbono.
También en las modalidades preferidas y más preferidas PEG significa preferiblemente el resto de S°, que comprende por lo menos S1, S2, BS1 y opcionalmente BS2.
En una modalidad preferida, los profármacos de la presente invención se seleccionan del grupo que consiste de en donde m es un número entero de 200 a 250 y n es un número entero de 100 a 125; en donde n es un número entero de 400 a 500; en donde n es un número entero de 400 a 500; y en donde n es un número entero de 400 a 500.
Los profármacos de la presente invención se pueden preparar por medio de métodos conocidos en el campo. Sin embargo, especialmente para los compuestos de la fórmula (AA1) se prefiere acumular la molécula de profármaco en una síntesis convergente al proporcionar una primera molécula precursora que comprende uno o más grupos tiol y un grupo carbonato activado y una segunda molécula precursora que comprende un grupo maleimida para reaccionar en una reacción de adición que da por resultado la formación de un grupo tio-succinimida y hacer reaccionar esa molécula precursora combinada con hGH para producir un compuesto de la fórmula (AA1 )' .
Por consiguiente, otro aspecto de la presente invención es un método para la preparación de un compuesto de la fórmula hGH-NH-C (O) 0-S° (AA1) , en donde S° tiene el significado que se indicara anteriormente y comprende por lo menos un grupo el método comprende los siguientes pasos: (a) hacer reaccionar un compuesto de la fórmula R0C(0)0- S°'-SH (???') con un compuesto de la fórmula (AA2 ' ) , en donde R es un apoyo adecuado para un grupo carbonato activado y en donde S0' y S°" se seleccionan para producir S° que comprende por lo menos el grupo , dando por resultado un compuesto de la fórmula ROC(0)0-S°, y (b) hacer reaccionar el compuesto de la fórmula ROC(0)0- S° con hGH-NH2, en donde hGH-NH2 representa hGH con uno de sus grupos amino primarios para producir un compuesto de la fórmula (AA1) .
Los grupos R adecuados para los grupos funcionales carbonato incluyen alquilo sustituido o grupos carbocíclicos o heterocíclicos , como arilo o cicloalquilo, similares al grupo pentafluorofenilo o NHS .
Ensayos para determinar las propiedades funcionales del profármaco de rhGH unido a PEG Actividad y vida media del conjugado Para determinar la actividad y la vida media del conjugado de profármaco descrito en este documento, es necesario sintetizar un conjugado "permanente", el cual no se somete a la autohidrólisis - es decir un conjugado permanente .
Esto se logra al sintetizar una molécula idéntica •al profármaco de rhGH unido a PEG, prescindiendo de la modificación de la parte de la estructura conectora, la cual inicia la autoescisión . Este compuesto correspondiente tendrá actividad residual y vida media en circulación del conjugado idénticas a aquellas del profármaco de rhGH unido a PEG-. Más generalmente, para cualquier profármaco conjugado con conectores transitorios autohidrolizables (autoescindibles) se puede idear el sintetizar una molécula idéntica al profármaco, prescindiendo de la capacidad para someterse a la autoescisión, al hacer una modificación menor a la estructura de los conectores.
La razón para utilizar el conjugado correspondiente es que si el conector transitorio autohidrolizable (autoescindible) como se describe en este documento se aplica en el ensayo mencionado -en el Ejemplo 1, el conjugado comenzará de inmediato obviamente a liberar fármaco no modificado, lo cual influirá en los resultados del ensayo. En otras palabras, no es posible medir la actividad residual sin preparar un conjugado permanente ya que el fármaco nativo sin cambios por ejemplo rhGH será liberado y contribuirá a la actividad medida. Esto es obvio para la persona experta.
Por esta razón como se explicara anteriormente, la actividad residual de los profármacos conjugados con conectores transitorios autohidrolizables (autoescindibles) se expresa como la actividad de los conjugados permanentes correspondientes. Los conjugados permanentes se preparan de una forma similar a los profármacos conjugados con conectores transitorios autohidrolizables (autoescindibles) (ejemplos 20 hasta 23) , pero con una modificación menor en la estructura de los conectores, de modo que el conector ya no se puede someter a la autoescisión. La preparación de conjugados permanentes se describe en el Ejemplo 10 hasta el Ejemplo 19. De acuerdo con una modalidad de la presente invención, un profármaco de rhGH unido a PEG como se describe en este documento se caracteriza porque: (1) : cuando el PEG se vincula a la rhGH en el conjugado de profármaco, el profármaco tiene una actividad de GH con menos de 5% de la hormona de crecimiento nativa sin PEG para evitar la lipoatrofia secundaria a la inyección; y (2) : el PEG se vincula con la rhGH por vía de un conector transitorio autohidrolizable (autoescindible) , en donde la velocidad de autohidrólisis del conector es tal que la vida media in vivo es de 10 horas a 600 horas .
El ensayo para determinar la propiedad (1) se describe en detalle en el ejemplo de trabajo 1 en este documento. Con base en esas instrucciones detalladas, es un trabajo de rutina para la persona experta medir esta actividad residual del profármaco.
En una modalidad preferida, la actividad residual de la propiedad (1) es menor que 5%, más preferiblemente menor que 3%, aún más preferiblemente menor que 1% y mucho más preferiblemente es virtualmente inactiva.
El ensayo para determinar la propiedad (2) se describe en detalle en el ejemplo de trabajo 2 en este documento. Con base en esas instrucciones detalladas, es un trabajo de rutina para la persona experta medir esta velocidad de autoescisión del conector transitorio del profármaco .
En una modalidad preferida, la vida media in vivo de la velocidad de autoescisión es tal que la vida media in vivo es de 20 horas a 300 horas, más preferiblemente de 20 horas a 150 horas, aún más preferiblemente de 30 horas a 150 horas, aún más preferiblemente de 30 horas a 100 horas, aún más preferiblemente de 40 horas a 100 horas, aún más preferiblemente de 50 a 75 horas y también aún más preferiblemente de 30 a 75 horas.
Correlación in vivo e in Vitro Se sabe a partir de solicitudes de patentes previas de la compañía Ascendis Pharma (Complex Biosystems Company) que existe una buena correlación entre las velocidades de escisión de conectores in vitro e in vivo. La cinética de liberación in vivo se puede predecir fácilmente a partir de los datos experimentales in vitro.
Lipoatrofia Como se describiera anteriormente, la lipoatrofia es la lipólisis que ocurre en proximidad estrecha del sitio de inyección. Por lo tanto, la medición de la lipólisis in vitro de la hormona de crecimiento y conjugados de hormona de crecimiento se pueden utilizar para calcular el efecto de lipoatrofia de los conjugados.
Para determinar el efecto lipolítico del conjugado de profármaco descrito en este documento, es necesario sintetizar un conjugado "permanente", el cual no se somete a la autohidrólisis - es decir un conjugado permanente.
El ensayo para determinar la lipoatrofia se describe en detalle en el ejemplo de trabajo 3 en este documento. Con base en esas instrucciones detalladas, es trabajo de rutina para la persona experta medir la lipoatrofia.
En una modalidad preferida, el conjugado de profármaco de rhGH unido a PEG, como se describe en este documento, tiene un efecto de lipoatrofia que es comparable a la hormona de crecimiento humana, medido de acuerdo con el ensayo para determinar la lipoatrofia del ejemplo 3 y otras condiciones de régimen de dosificación idénticas.
Enfermedades relacionadas con la GH El término "una enfermedad relacionada con la GH" del segundo aspecto se refiere en este documento simplemente a enfermedades y condiciones donde un humano se podría beneficiar de la GH.
Este incluye, pero no está limitado a, deficiencia de hormona de crecimiento, deficiencia de hormona de crecimiento que inicia en la adultez, síndrome de Turner, síndrome de Prade-Willi, síndrome de intestino corto, insuficiencia renal crónica, talla pequeña para la edad gestacional (SGA) , desgaste por el SIDA, antienvejecimiento, artritis reumatoide, estatura pequeña idiopática, gen homeobox de estatura corta y somatopausia . También está incluida otra condición de estatura corta, la cual incluye el síndrome de Noonan, displasia esquelética, síndrome de Down, estatura corta asociada con el uso prolongado de esteroides, síndrome de Aarskog, entre otras.
También está incluida la enfermedad renal crónica, artritis reumatoide juvenil; fibrosis cística, infección por HIV en niños que reciben tratamiento de HAART (niños con HIV/HALS) ; estatura corta en niños nacidos con un peso muy bajo (VLBW) excepto SGA; displasia esquelética; hipocondroplasia; acondroplasia estatura corta idiopática (ISS) ; GHD en adultos; fracturas en o de huesos largos, tales como tibia, fíbula, fémur, húmero, radio, cubito, clavícula, metacarpo, metatarso y dígito; fracturas en o de huesos esponjosos, tal como el cráneo, la base de la mano y la base del pie; pacientes después de la cirugía de tendones o ligamentos en por ejemplo la mano, rodilla u hombro; osteogénesis por distracción; trastornos resultantes del reemplazo de cadera o discos, reparación de meniscos, fusiones espinales o fijación de prótesis, tal como en la rodilla, cadera, hombro, codo, muñeca o quijada; trastornos resultantes de la fijación de material de osteosíntesis , tales como clavos, tornillos y placas; falta de unión o unión incorrecta de fracturas; trastornos resultantes de osteotomía, por ejemplo, de tibia o primer dedo del pie; trastornos resultantes del implante de injertos; degeneración del cartílago articular en la rodilla causada por traumatismo o artritis; osteoporosis en pacientes con síndrome de Turner; osteoporosis en hombres; pacientes adultos en diálisis crónica (APCD) ; enfermedad cardiovascular asociada con la desnutrición en APCD; inversión de caquexia en APCD; cáncer en APCD; enfermedad pulmonar, abstracta, crónica en APCD; HIV en APCD; personas de edad avanzada con APCD; enfermedad hepática crónica en APCD, síndrome de fatiga en APCD; enfermedad de Crohn; función deteriorada del hígado; varones con infecciones de HIV; síndrome de intestino corto; obesidad central; síndrome de lipodistrofia asociada con HIV (HALS) ; infertilidad masculina; pacientes después de una cirugía optativa mayor, desintoxicación de alcohol/drogas o traumatismo neurológico; envejecimiento; personas de edad avanzada débiles; osteoartritis ; cartílago dañado de manera traumática; disfunción eréctil; fibromialgia ; trastornos de memoria; depresión; lesión traumática cerebral; hemorragia subaracnoidea; peso muy bajo al nacer; síndrome metabólico; miopatía glucocorticoide ; y estatura corta debida al tratamiento con glucucorticoides en niños.
En detalle, las Figuras 7 y 8 muestran las estructuras ejemplares 35 y 38 del tipo (AA1, AAA1) , donde por lo menos la cadena de polímero de 5 kDa de S° que comprende Ga y BS1 y BS2 está marcada como S° ; el grupo carbamato que resulta de La y el grupo amino primario de hGH están marcados como La; BS1 comprende por lo menos la cadena de polímero de 4 kDa marcada como S1, en donde S1 comprende BS3, el cual comprende por lo menos la cadena de polímero de 4 kDa marcada como S3. BS2 comprende por lo menos la cadena de polímero de 4 kDa marcada como S2. La distancia crítica es proporcionada por 18 átomos para la Figura 7 y 4 átomos para la Figura 8.
En las Figuras 9 y 10, se muestran estructuras ejemplares del tipo (AA2 , AAA2), en donde el grupo amida resultante de La y el grupo amino primario de hGH están marcados como La y el residuo adherido a La está marcado como S° que comprende Ga y "PEG" que representa el resto de S° que comprende por lo menos BS1, S1 y S2 (no todos mostrados) .
EJEMPLOS Métodos RP-HPLC analítica y preparativa La RP-HPLC/ESI -MS analítica se realizó en un equipo Waters que consistía de un administrador de muestras 2695, un Detector de Absorbancia Doble 2487 y un instrumento de ESI ZQ 4000 equipado con columnas Reprosil Pur 300 Á ODS-3 de 5 (75 x 1.5 mm) ,(Dr. Maisch, Ammerbuch, Alemania; velocidad de flujo: 350 µ??/??? ??:?, gradiente típico: 10-90% de acetonitrilo en agua, 0.05% de TFA durante 5 minutos). Para la RP-HPLC preparativa se utilizó un controlador Waters 600 y un Detector de Absorbancia Doble 2487 equipado con las siguientes columnas (Reprosi1 Pur 300 Á ODS-3) A) : 100x20 mm, velocidad de flujo de 10 mL/minuto, gradiente típico: 10-90% de acetonitrilo en agua, 0.1% de TFA durante 11 minutos o B) : 100x40 mm (partículas de 10 µ??) , velocidad de flujo de 40 mL/minuto, gradiente típico: 10-90% de acetonitrilo en agua, 0.1% de TFA durante 11 minutos.
Cromatografía de intercambio catiónico La purificación de conjugados por medio de la cromatografía de intercambio catiónico se realizó utilizando un sistema ÁKTA Explorer (GE Healthcare) equipado con una columna Macrocap SP. El conjugado respectivo en amortiguador de acetato de sodio 20 mM pH 4 se aplicó a la columna que se equilibró previamente en amortiguador de acetato de sodio 20 mM pH 4 (amortiguador A) . La columna se lavó con tres volúmenes de columna del Amortiguador A para retirar cualquier reactivo de PEG sin reaccionar. Los conjugados se eluyeron utilizando un gradiente de 10-60% del amortiguador B (acetato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 1 M, pH 4.5) sobre 20 volúmenes de columna o 0-40% del amortiguador B sobre 20 volúmenes de columna y luego 40-80% de B sobre tres volúmenes de columna. La velocidad de flujo fue 7 ml/minuto y el eluyente se supervisó por medio de la detección a 280 nm.
Cromatografía de intercambio aniónico La purificación de conjugados por medio de la cromatografía de intercambio aniónico se realizó utilizando un sistema ÁKTA Explorer (GE Healthcare) equipado con una columna Source Q. El conjugado respectivo en amortiguador de Tris/HCl 20 mM pH 7.5 (amortiguador C) se aplicó a la columna que se equilibró previamente en el amortiguador C. La columna se lavó con tres volúmenes de columna del amortiguador C para retirar cualquier reactivo de PEG sin reaccionar. Los conjugados se eluyeron utilizando un gradiente de 0-20% del amortiguador D (Tris/HCl 20 mM, cloruro de sodio 1 M, pH 7.5) sobre 25 volúmenes de columna. La velocidad de flujo fue 5 ml/minuto y el eluyente se supervisó por medio de la detección de UV a 280 nm. Alternativamente, se utilizó el sistema de amortiguador de bis-tris/HCl 20 mM, pH 6.5 (amortiguador E) y bis-tris/HCl 20 mM, cloruro de sodio 1 M, pH 6.5 (amortiguador F) .
Cromatografía de exclusión de tamaño analítica El análisis de la cromatografía de exclusión de tamaño analítica se realizó en un sistema ÁKTA Explorer (GE Healthcare) . Las muestras se analizaron utilizando una columna Superdex 200 o Sepharose 6 (10 x 300 mm) y fosfato de sodio 20 mM, se utilizó cloruro de sodio 135 mM, pH 7.4 como la fase móvil. La velocidad de flujo para la columna fue 0.75 ml/minuto y la hGH eluida y los conjugados de polímero-hGH se detectaron a 215 nm y 280 nm.
Determinación de actividad de reactivos de mPEG-conector activados con pfp Una cantidad definida de reactivo de mPEG-conector activado con pfp (3-5 mg) se disolvió en 100 µ?; de AGUA. 10 µ?_ de NaOH 0.5 M se agregaron y la mezcla de reacción se hizo reaccionar durante 60 minutos a 40 °C. Se agregó 1.5 ]1? de TFA y 10% de esta mezcla se analizó por medio de la RP-HPLC analítica. Los cromatogramas se registraron a 260 y 280 nm. Se integró el pico que correspondía al pentafluorofenol . Los valores determinados se compararon con una curva de calibración apropiada que se generó al analizar las cantidades definidas de pfp por medio de la RP-HPLC analítica y la integración de cromatogramas registrados a 260 y 280 nm.
Análisis de SDS-PAGE Los conjugados permanentes de mPEG-hGH se analizaron utilizando geles de Tris-Acetato NuPAGE NovexMR (1.5 mm de espesor, 15 carriles), Amortiguador de Corrida de Tris-Acetato SDS NuPAGEMR, Estándar de Proteína de Alto Peso Molecular Pre-teñido HiMarkMR y Simply Blue SafeStainMR (Invitrogen) . En cada carril se aplicaron 0.2-0.6 µ9 de conjugado y la electroforesis y la tinción subsecuente se realizaron de acuerdo con el protocolo del proveedor.
Ejemplo 1: Ensayo para medir el profármaco de hGH unido a PEG y la actividad de hGH La actividad biológica de hGH se mide al utilizar ensayos estándar que son conocidos para la persona experta en el campo. Como se describe en el documento EP1715887B1 y también como se plantea anteriormente, la actividad biológica asociada con la hGH nativa o modificada (por ejemplo una hGH unida a PEG), se puede- medir utilizando ensayos de proliferación de células estándar FDC-P1 (Clark y colaboradores, Journal of Biological Chemistry 271: 21969-21977) o un ensayo de enlace de receptor (documento US5057417) .
En la línea 8 (página 14) de la patente EP1715887B1, se describe que la actividad preferida in vitro tiene que ser tan alta como sea posible, más preferiblemente la hGH modificada tiene una actividad biológica in vitro equivalente o mejorada. En la presente invención, la actividad biológica tiene que ser tan baja como sea posible en comparación con la hGH nativa. De esta manera, los presentes inventores hicieron completamente lo opuesto en comparación con la técnica anterior descrita en el documento EP1715887B1.
Ensayo in vitro Las actividades in vitro de los conjugados permanentes de PEG-hGH descritos en los ejemplos posteriores se determinaron utilizando uno o más ensayos estándar para valorar la actividad biológica in vitro. Los ensayos estándar que se pueden emplear incluyen ensayos de proliferación de células utilizando, por ejemplo, células FDC-PI (véase, por ejemplo, Clark y colaboradores, Journal of Biological Chemistry, 271:21969-21977, 1996), o células Ba/F3 -hGHR, las cuales expresan receptores de hGH, hGH delta 135-146, o células de linfoma de rata Nb2 , las cuales proliferan en resp e?ta a la hGH por vía de receptores lactogénicos (véase, por ejemplo, Alam, K. S. y colaboradores, J. Biotech 2000, 28 de Febrero, 78(1), 49-59) . Los ensayos de enlace de receptores (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5,057,417) también se pueden utilizar.
Nb2-ll es un clon de la línea de linfoma de rata Nb-2 el cual se derivó de un trasplante de un linfoma que se desarrolló en el timo/nódulo linfático de una rata macho de la cepa noble (Nb) después del tratamiento prolongado con estrógeno. Las células son del origen de pre-células T y su proliferación es dependiente de lactógenos de mamífero, tal como prolactina. Nb2-ll también puede ser estimulado mitogénicamente por IL-2. La inyección de células Nb2 en ratas Nb da origen a tumores malignos que son sumamente sensibles al tratamiento con alcaloides de vinca. El análisis cariotípico ha mostrado que la línea de células tiene únicamente cinco anormalidades de cromosomas bien desarrolladas. Las células no expresan inmunoglobul ina de la superficie y su dependencia a lactógenos está confirmada. Los protocolos para el uso de células Nb2-ll en bioensayos están disponibles de ECACC cuando se soliciten.
Como describe el documento O2006102659 en la página 74 párrafo 0240 ejemplo 7, la actividad biológica de hGH y los conjugados descritos en este documento se deben valorar in vitro utilizando un ensayo de proliferación de células de linfoma de rata NB2-11. En resumen, las células NB2-11 derivadas de un linfoma de rata se incuban con hGH, lo cual conduce al enlace de la molécula de hGH a su receptor en la superficie celular. El enlace del receptor induce la cascada de transducción de señales, lo cual da por resultado la proliferación de las células. Los resultados del ensayo se basan en el contenido de proteína determinado y una bioactividad al 100% de hGH no modificada.
Conclusión : Con base en las instrucciones detalladas de este ejemplo 1 es un trabajo de rutina para la persona experta medir esta actividad residual del profármaco.
Ejemplo 2; Ensayo para medir la velocidad de autoescisión del conector transitorio del profármaco .
Determinación de la vida media in vitro Para la determinación de la velocidad de escisión del conector in vitro de los conjugados de PEG-conector-hGH, los compuestos se disuelven en amortiguador a pH 7.4 (por ejemplo fosfato de sodio 10 mM, NaCl 140 mM, EDTA 3 mM) y la solución se filtra a través de un filtro de 0.22 µp? y se incuba a 37 °C. Las muestras se toman en intervalos de tiempo y se analizan por medio de la RP-HPLC o la cromatografía de exclusión de tamaño a 215 nm. Los picos que corresponden a la hGH liberada se integran y se colocan en un diagrama contra el tiempo de incubación. Un software de ajuste de curva se aplica para determinar las velocidades de escisión de primer orden.
Determinación de vida media in vivo y correlación de vida media in vitro/in vivo Las velocidades de escisión de los conectores in vivo se determinan al comparar la farmacocinética de los conjugados permanentes de PEG-hGH con el conjugado transitorio, respectivo de PEG-conector-hGH que lleva la misma porción de PEG después de la inyección intravenosa en la rata.
En primer lugar, el conjugado permanente de PEG-hGH se inyecta por la ruta intravenosa en ratas y se toman muestras de sangre en intervalos de tiempo, el plasma se prepara y se analiza por la hGH utilizando un ensayo ELISA.
En segundo lugar, el conjugado transitorio de PEG-hGH se inyecta por la ruta intravenosa en ratas, se toman muestras de sangre en intervalos de tiempo, el plasma se prepara y se analiza por la hGH utilizando un ensayo ELISA.
La vida media in vivo se calcula a partir de la relación de la concentración de hGH del conjugado transitorio dividida por la concentración determinada de hGH del conjugado permanente en los puntos de tiempo respectivos y el ajuste de curva. Los datos se comparan con las mediciones de vida media in vitro.
Conclusión Con base en las instrucciones detalladas de este ejemplo 2, es un trabajo de rutina para la persona experta medir la vida media in vivo del profármaco de hGH unido a PEG.
Ej emplo 3 ; Ensayo para medir la Lipoatrofia Como se mencionara anteriormente, el compuesto PHA- 794428 es una hGh unida a PEG y se describe en la patente EP1715887 de la compañía Pharmacia. De acuerdo con www.clinicaltrials.gov, el estudio se terminó el 10 de Diciembre del 2007. La decisión de Pfizer (Pharmacia) para terminar el programa fue debido a casos de lipoatrofia en el sitio de inyección que se reportaron en los estudios clínicos de Fase 2 después de una sola inyección de PHA 794428. La lipoatrofia es el término que describe la pérdida localizada de tejido adiposo y es visible en humanos como huecos en la piel (visibles por los ojos) .
Ensayo Existen varios métodos in vitro descritos en el campo para medir la lipoatrofia. Una propuesta se describe en la publicación J. Anim. Sci (1972), 35: 794-800 (L.J. Machlin) en la página 795. Otra descripción se encuentra en Int. J. Cáncer; 80, 444 - 447 (1999).
Generalmente, la lipoatrofia se puede medir como se propone a continuación.
El efecto lipolítico se puede determinar utilizando un ensayo in vitro que consiste de adipocitos de mamífero aislados, preferiblemente adipocitos de murino. Las muestras a ser sometidas a ensayo se incubaron en condiciones fisiológicamente relevantes con un número predeterminado de adipocitos en amortiguador de bicarbonato de Krebs-Ringer que contenía nutrientes apropiados durante hasta 6 horas . La concentración de glicerol liberado se determina por medio de métodos estándar, por ejemplo enzimáticamente o por medio de una detección radiométrica . Las muestras de control que contienen adipocitos solos se analizan para determinar la liberación espontánea de glicerol.
El efecto lipolítico de la hormona de crecimiento humana, recombinante , no modificada, nativa y la hormona de crecimiento humana recombinante unida permanentemente a PEG se compara con aquel de la hormona de crecimiento humana recombinante unida transitoriamente a PEG.
Conclusión Con base en las instrucciones detalladas de este ejemplo 3, es un trabajo de rutina para la persona experta medir el efecto de lipoatrofia.
Ej emplo 4 Síntesis del reactivo de conector permanente 12a y reactivos de conectores transitorios 12b y 12c Síntesis del compuesto 6 H,N HBr (48%), 3h, 80°C BrH Trt-SH, DBU, DMSO, DCM, 30 min, t a , Trt-SH, DBU, DCM, 2 h, ta., El 6-amino-hexan-l-ol (2.85 g, 24.3 mmol) se disolvió en HBr acuoso (48%, 10 mL, 89 mmol) y se agitó a 80 °C durante 3 horas. El HBr en exceso de evaporó a 50-65 °C y 1999.83 pascales (15 Torr) y el residuo se secó in vacuo. 1: Rendimiento 6.07 g (96%) MS [M+H]+ = 180.3 g/mol (PM+H calculado = 180.0 g/mol) El DBU (3.5 mL, 23.2 mmol) se agregó a una suspensión de bromhidrato de 6 -bromohexilamina 1 (3.03 g, 11.6 mmol) y trifenil -metanotiol (2.14 g, 7.74 mmol) en DCM (25 mL) y se agregó DMSO (13 mL) . La mezcla de reacción se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente y se diluyó con agua (150 mL) .
La capa acuosa se extrajo con éter y la fase orgánica combinada se evaporó. El compuesto 2 se purificó por medio de la RP-HPLC. 2: Rendimiento 1.17 g (40%) MS [M+H]+ = 376.7 g/mol (PM+H calculado = 376.2 g/mol) El DBU (4.56 mL, 30.0 mmol) se agregó al ácido 6-bromo-hexanoico (3.90 g, 20.0 mmol) y trifenil -metanotiol (11.1 g, 40.0 mmol) en DCM (40 mL) . Después de la agitación a temperatura ambiente durante 1 hora se agregó H2S04 1 M helado (50 mL) y la mezcla se extrajo con DCM. La fase orgánica combinada se secó sobre Na2S04 y se concentró in vacuo. El compuesto 3 se purificó por medio de la cromatografía en columna de gel de sílice (200 mL) utilizando heptano/acetato de etilo (4/1, Rf=0.2) como fase móvil . 3: Rendimiento 5.83 g (75%) El DMAP (37 mg, 0.31 mmol) se agregó al ácido 6-tritilsulfanil-hexanoico 3 (5.83 g, 14.9 mmol), tiazolidin-2-ona (3.56 g, 29.9 mmol) y diciclohexilcarbodiimida (3.08, 14.9 mmol) en DCM (100 mL) . Después de la agitación a temperatura ambiente durante 1 hora se agregó HC1 1 M (0.6 mL) y la mezcla se filtró. El producto filtrado se concentró in vacuo y el compuesto 4 se purificó por medio de la cromatografía en columna de gel de sílice (180 mL) utilizando heptano/acetato de etilo (l/l) como fase móvil. 4: Rendimiento 7.15 g (97%) como un aceite color amarillo Una solución de la 1- (2-tioxo-tiazolidin-3-il) -6-tritilsulfanil-hexan-l-ona 4 (1.53 g, 3.11 mmol) en THF (13 mL) se agregó durante un período de 2 minutos a la 6-tritilsulfanil-hexilamina 2 (1.17 g, 3.11 mmol) en DMSO (1 mL) y THF (5 mL) . Después de la adición de trietilamina (435 L, 3.11 mmol) la mezcla de reacción se agitó durante 90 minutos a temperatura ambiente. Se' agregó éter (200 mL) y agua (100 mL) y las fases se separaron. Después de la extracción de la fase acuosa con éter, las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2S04 y concentraron in vacuo. El compuesto 5 se purificó por medio de la cromatografía en columna de gel de sílice (150 mL) utilizando heptano/acetato de etilo (2/1, Rf=0.1) como fase móvil. 5: Rendimiento 1.23 g (53%) MS [M+Na]+ = 770.6 g/mol (PM+Na calculado = 770.4 g/mol) Bajo nitrógeno, una solución 1 M de LiAlH en THF (1.2 mi, 4.8 mmol) se colocó en un matraz seco y una solución del compuesto 5 (509 mg, 0.680 mmol) en 10 mi de THF se agregó durante 4 minutos. La mezcla se agitó bajo reflujo durante 2 horas, hasta que se mostró la conversión completa del material de partida por medio de la cromatografía de capa delgada (heptanos/acetato de etilo 1:1) . La mezcla de reacción se enfrió rápidamente de manera cuidadosa con una suspensión 10:1 de agua en éter dietílico hasta que la emisión de gas se había detenido. La mezcla se vertió en 50 mi de una solución saturada de tartrato de sodió-potasio y se agitó durante 90 minutos. 90 mi de acetato de etilo se agregaron y las fases se separaron. La fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (4 x 20 mi) y la fase orgánica combinada se lavó con salmuera (30 mi) , se secó sobre MgS0 , se filtró y se concentró para proporcionar un aceite transparente. El compuesto 6 se adsorbió sobre sílice y se purificó por medio de la cromatografía con evaporación instantánea (30 g de sílice, CH2Cl2/MeOH 20:1 (v/v) + 0.1% de NEt3) . El producto se obtuvo como un aceite viscoso color blanquecino. 6: Rendimiento 270 mg (54%) MS [M+H]+ = 734.4 g/mol (PM+H calculado = 734.4 g/mol) Rf = 0.28 (CH2Cl2/MeOH 19:1) Síntesis del compuesto 9 El AICI3 (23.0 g, 172.3 mmol) se agregó a anhídrido glutárico (10.0 g, 86.2 mmol) en anisol (85 mL, 781 mmol). La mezcla de reacción se calentó a 110 °C durante 2 horas, se enfrió a temperatura ambiente, se vertió sobre HCl 3 N/hielo y se extrajo con diclorometano . La fase acuosa se extrajo con diclorometano (4 x 20 mi) y las fracciones orgánicas, combinadas se lavaron con salmuera (30 mi) , se secaron sobre MgS04, se filtraron y se concentraron para proporcionar un aceite color rojo que se recristalizó de tolueno. El producto 7 se obtuvo como un sólido color blanquecino. 7: rendimiento 5.2 g (48%) MS [M+Na]+ = 245.8 ( PM+Na calculado = 245.1 g/mol) El A1C13 (9.0 mg, 68 mmol) se agregó al producto 7 (5.0 g, 23 mmol) en 1 , 2 -dicloroetano . La mezcla de reacción se agitó durante 14 horas a 85 °C y se enfrió subsecuentemente a temperatura ambiente. El HC1 1 N helado (50 mL) se agregó y la mezcla se extrajo con acetato de etilo (4 x 30 mL) . Las fracciones orgánicas combinadas se secaron sobre Na2S04; se filtraron y se concentraron in vacuo para proporcionar un sólido color rojo claro que se utilizó en el siguiente paso sin purificación adicional. 8: Rendimiento 3 g (62%) MS [M+H]+ = 209.1 (PM+H calculado = 209.1 g/mol) La diciclohexilcarbodiimida (532 mg, 2.6 mmol), el ácido 8 (403 mg, 1.9 mmol), HOSu (297 mg, 2.6 mmol) y colidina (1.0 mL, 7.8 mmol) en DC (10 mL) se agitaron durante 90 minutos a temperatura ambiente. Después de la remoción de la diciclohexilurea por medio de la filtración, la amina 6 (947 mg, 1.3 mmol) en DCM (5 mL) y DIEA (450 µL, 2.6 mmol) se agregaron al producto filtrado y la mezcla se hizo reaccionar durante 14 horas a temperatura ambiente. El H2S04 1 N (2 x 50 mL) se agregó y las fases se separaron. La fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (4 x 20 mi) y la fase orgánica combinada se lavó con salmuera (30 mi) , se secó sobre MgS04, se filtró y se concentró in vacuo. Los residuos se purificaron por medio de la cromatografía en columna de gel de sílice (150 mL) utilizando heptano/acetato de etilo (1/2, Rf=0.66) como fase móvil. 9: Rendimiento 819 mg (69%) MS [M+Na]+ = 946.4 (PM+Na calculado = 946.4 g/mol) Síntesis del reactivo de conector permanente 12a y los reactivos de conectores transitorios 12b y 12c a: R1 = R2 = Et b: R1 = Et, R2 = 2-(dietilamino)etilo c: R1 = Me, R2 = 3-(dimet¡lamino)propilo El compuesto 9 (1 eq. , 175 mg( 0.19 mmol) se disolvió en THF seco (1.5 mL) , p-nitrofenilcloroformiato (1.1 eq. , 42 mg, 0.21 mmol) y DIPEA (2 eq. , 66 µ?, 0.38 mmol) se agregaron y la mezcla se agitó durante 60 minutos a temperatura ambiente. La di-etilamina (Rl = R2 = Et, 2 eq. , 39 µ?, 0.38 mmol) se agregó y la agitación continuó durante 15 minutos.. El solvente se retiró in vacuo, se agregaron 100 µ? de AcOH y el compuesto 10a se purificó por medio de la RP-HPLC.
MS [M+Na]+ = 1045.9 (PM+Na calculado = 1045.5 g/mol) El NaB¾ (5 eq. , 37 mg, 0.95 mmol) se agregó al compuesto 10a que contenía la fracción de HPLC (acetonitrilo/H20 ~ 3/1 (v/v) + 0.1% de TFA) y la mezcla se hizo reaccionar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Una porción adicional de NaB¾ (5 eq. , 37 mg, 0.95 mmol) se agregó y la mezcla de reacción se agitó hasta que la conversión completa del material de inicio fue indicada por medio del análisis de LC/MS (10 minutos a temperatura ambiente) . El compuesto lia se purificó por medio de la RP-HPLC y se liofilizó. lia: Rendimiento 95 mg (49% con base en el compuesto 9) MS [M+Na+H]+ = 1047.7 (PM+Na calculado = 1047.5 g/mol) El compuesto 9 (1 eq. , 175 mg, 0.19 mmol) se disolvió en THF seco (1.5 mL) , p-nitrofenilcloroformiato (1.1 eq., 42 mg, 0.21 mmol) y DIPEA (2 eq. , 66 µ?, 0.38 mmol) se agregaron y la mezcla se agitó durante 60 minutos a temperatura ambiente. La ?,?,?' -trietil-etano-l,2-diamina (Rl = Et, R2 = 2- (dietilamino) etilo, 2 eq. , 68 µ?, 0.38 mmol) sé agregó y la agitación continuó durante 15 minutos. 100 µ? de AcOH se agregaron, el solvente se retiró in vacuo y el compuesto 10b se purificó por medio de la RP-HPLC y se liofilizó. 10b: Rendimiento 147 mg como sal de TFA (65%) MS [M+Na]+ = 1116.4 (PM+Na calculado = 1116.6 g/mol) El compuesto 10c se sintetizó como se describiera anteriormente utilizando ?,?,?' -trimetil-propano-1, 3-diamina (Rl = Me, R2 = 3- (dimetilamino)propilo, 56 |¿L, 0.38 mmol) como diamina. 10c: Rendimiento 134 mg como sal de TFA (59%) MS [M+Na]+ = 1088.4 (PM+Na calculado = 1088.6 g/mol) El NaB¾ (46 mg, 1.2 mmol) se agregó al compuesto 10b (147 mg, 0.12 mmol) en MeOH/agua = 95:5 (v/v) (3 mL) en dos dosis y la mezcla se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la adición de AcOH (300 }iL) y la concentración, el producto llb se purificó por medio de la RP-HPLC y se liofilizó. llb: Rendimiento 107 mg como sal de TFA (73%) MS [M+Na]+ = 1118.4 (PM+Na calculado = 1118.6 g/mol) El compuesto 11c se sintetizó de acuerdo con el mismo protocolo. 11c: Rendimiento 65 mg como sal de HCl (54%) a partir de 134 mg de material de partida MS [M+Na]+ = 1090.4 (PM+Na calculado = 1090.6 g/mol) Bajo una atmósfera de nitrógeno el bis-pentafluorofenil- carbonato (2.5 eq. , 25 mg, 63 µp???) , DMAP (1 mg) y DIEA (5 eq. , 22 |il, 127 µ?t??) se agregaron al compuesto lia (1 eq. , 26 mg, 26 µpt??) en acetonitrilo seco (0.5 mL) . La mezcla de reacción se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente, se enfrió a 0°C y se acidificó .con AcOH (200 |iL) . El producto 12a se purificó por medio de la RP-HPLC y se liofilizó. 12a: Rendimiento 13 mg (42%) MS [M+Na]+ = 1258.2 (PM+Na calculado = 1257.5 g/mol) Los compuestos 12b y 12c se prepararon por consiguiente a partir del compuesto 11b (56 mg, 48 jimol) y el compuesto 11c (88 mg, 73 fJmol) , respectivamente. 12b: Rendimiento 63 mg como sal de TFA (93%) MS [M+H]+ = 1306.3 (PM+H calculado = 1306.6 g/mol) 12c: Rendimiento 41 mg como sal de TFA (41%) MS [M+H]+ = 1278.4 (PM+Na calculado = 1278.5 g/mol) Ejemplo 5 Síntesis del reactivo de conector permanente 14a y reactivos de conectores transitorios 14c R1 = R2 = etilo R1 = Me, R2 = 3-{dimetilamino)propilo Los compuestos 13a y 13c se sintetizaron como se describe en el documento WO2005/099768A2.
Bajo una atmósfera de nitrógeno, el bispentafluorofenilcarbonato (631 mg, 1.6 mmol), DMAP (20 mg, 0.16 mmol) y DIEA (556 µ?, 3.2 mmol) se agregaron al compuesto 13a (364 mg, 0.64 mmol) en acetonitrilo seco (5 mL) . La mezcla de reacción se agitó durante 15 minutos a temperatura ambiente, se enfrió a 0°C y se acidificó con ácido acético (1 mL) . El producto 14a se purificó por medio de la RP-HPLC y se liofilizó. 14a: Rendimiento 379 mg (77%) MS [M+Na]+ = 800.4 (PM+Na calculado = 800.3 g/mol) El compuesto 14c se preparó de acuerdo con esto a partir del compuesto 13c (97 mg, 130 |Jmol) . 14c: Rendimiento 114 mg como sal de TFA (94%) MS [M+H]+ = 821.5 (PM+H calculado = 821.3 g/mol) Ejemplo 6 Síntesis de reactivo del conector permanente 15 El anhídrido glutárico (0.41 mmol), la amina 6 (200 mg, 0.27 mmol), DIPEA (72 µL, 0.41 mmol) y DMAP (11 mg, 0.09 mmol) se agitaron en acetonitrilo (3 mL) durante 2 horas a 80°C. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente y se agregó ácido acético (200 µ??) . El producto 15 se purificó por medio de la RP-HPLC y se liofilizó. 15: Rendimiento 130 mg (57%) MS [M+Na]+ = 870.2 (PM+Na calculado = 870.4 g/mol) Ejemplo 7 Síntesis de reactivos activados de mPEG-conector Materiales de partida de mPEG-maleimida : mPEG-maleimida 1A: PM = aprox. 20 kDa (n = aprox. 200-250) mPEG-maleimida 1B: PM = aprox. 40 kDa (n = aprox. 400-500) mPEG-maleimida 2A: PM = aprox. 20 kDa (n = aprox. 200-250) mPEG-maleimida 2B: PM = aprox. 40 kDa (n = aprox. 400-500) mPEG-maleimida 3A: PM = aprox. 40 kDa (n = aprox. 100-125; m = aprox. 200-250) mPEG-maleimida 3B: PM = aprox. 80 kDa (n = aprox. 200-250; m = aprox. 400-500) Los. residuos de mPEG después de hacer reaccionar on el grupo tiol (R3 en las estructuras posteriores) : residuo de mPEG-succinimida 1 AA: PM = aprox. 20 kDa (n = aprox. 200-250) residuo de mPEG-succinimida 1BA: PM = aprox. 40 kDa (n = aprox. 400-500) residuo de mPEG-succinimida 2AA: PM = aprox. 20 kDa (n = aprox. 200-250) residuo de mPEG-succinimida 2BA: PM = aprox. 0 kDa (n = aprox. 400-500) residuo de mPEG-succinimida 3AA: PM = aprox. 40 kDa (n = aprox. 100-125; m = aprox. 200-250) residuo de mPEG-succinimida 3BA: PM = aprox. 80 kDa (n = aprox. 200-250; m = aprox. 400-500) La línea punteada vertical representa el sitio de unión al grupo tiol en la estructura respectiva.
Síntesis de reactivos de conectores permanentes de mPEG activados por pfp 17aa, 17ab , 17ac , 17ad y reactivos de conectores transitorios de mPEG activados por pfp 17b, 17ca y 17 cb 12a 12b El carbonato 12a (13 mg, 10 µ????) se agitó en 10 de AcOH, 700 µ?· de HFIP, 1 µ?? de TFA y 2 µ??? de TES durante minutos a temperatura ambiente. Los componentes volátiles se retiraron en una corriente de nitrógeno y el compuesto 16a se purificó por medio de la RP-HPLC. 16a: Rendimiento 3.8 mg (5 µp???) MS [M+H]+ = 751.3 (P +H calculado = 751.3 g/mol) Los compuestos 16b y 16c se prepararon por consiguiente a partir del compuesto 12b (7.7 mg, 5.4 µp???) y el compuesto 12c (2 mg, 1.5 µ????) , respectivamente. 16b: Rendimiento 2.5 mg (2.7 µp???) MS [M+Na]+ = 845.1 (PM+Na calculado = 844.3 g/mol) 16c : Rendimiento 0.5 mg (0.6 µ????) MS [M+Na]+ = 816.6 (PM+Na calculado = 816.3 g/mol) La mPEG-maleimida IB (NOF, Japón) (521 mg, 12.7 µt???) se agregó a 3.5 mg (3.9 µt???) del compuesto 16c en 4 mL de acetonitrilo/agua 3/1 (v/v) + 0.1% de TFA. 200 µL del amortiguador de fosfato 0.5 M pH 7.4 se agregaron y la mezcla se hizo reaccionar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se agregó 1 µL (13 µp???) de mercaptoetanol y la mezcla de reacción se acidificó a pH 4-5 por medio de la adición de TFA. El compuesto 17ca se purificó por medio de la RP-HPLC y se liofilizó. 17ca: Rendimiento 220 mg (actividad de pfp-carbonato 82%) El compuesto 17cb se sintetizó como se describiera para el compuesto 17ca utilizando el compuesto 16c (3.5 mg, 3.9 µp???) y la mPEG-maleimida 2B (656 mg, 16 µ????) . 17cb: Rendimiento 130 mg (actividad de pf -carbonato 85%) 184 mg (8.8 µp???) de mPEG-maleimida 1A (NOF , Japón) se agregaron al compuesto 16a (2.0 mg, 2.7 n 4 mL de acetonitrilo/agua 1/1 (v/v) + 0.1% de TFA. 200 µ??. de amortiguador de fosfato 0.5 M pH 7.4 se agregaron y la mezcla se hizo reaccionar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se agregaron 0.2 µ?^ (1.6 µt???) de mercaptoetanol y la mezcla de reacción se acidificó a pH 2-3 por medio de la adición de TFA. El compuesto 17aa se separó de los PEGs sin reaccionar por medio de la RP-HPLC y se liofilizó. 17aa: Rendimiento 90 mg (actividad de pfp-carbonato 88%) El compuesto 17ab se sintetizó como se describiera anteriormente utilizando el compuesto 16a (3.8 mg, 5.0 µp???) y 680 mg (16 µp???) de mPEG-maleimida IB (NOF, Japón) . 17ab: Rendimiento 250 mg (actividad de pfp-carbonato 83%) El compuesto 17ac se sintetizó como se describiera anteriormente utilizando el compuesto 16a (2.5 mg, 3.3 µt???) y 200 mg (9.5 µ????) de mPEG-maleimida 2A (Jenkem, PR China). 17ac: Rendimiento 80 mg (actividad de pf -carbonato 80%) El compuesto 17ad se puede sintetizar como se describiera anteriormente utilizando el compuesto 16a y mPEG-maleimida 2B.
El compuesto 17b se puede sintetizar como se describiera para el compuesto 17cb utilizando el compuesto 16b y mPEG-maleimida IB.
Ejemplo 8 Síntesis de reactivos de conectores permanentes de mPEG activados por pfp 19aa y 19ab y reactivo de mPEG- conector transitorio permanente 19c 14a 14c El carbonato 14c (20 mg , 21 µp???) se agitó en 10 µ?, de AcOH, 400 µ?? de HFIP y 5 µ?, de TES durante 10 minutos a temperatura ambiente y se enfrió a 0°C. Se agregó acetonitrilo helado/agua = 9/1 (v/v) y el compuesto 18c se separó por medio de RP-HPLC y se liofilizó. 18c: Rendimiento 5.0 mg como sal de TFA (7.2 µp???) MS [M+H] + = 579.6 (P +H calculado = 579.2 g/raol) El compuesto 18a se sintetizó como se describiera anteriormente utilizando el carbonato 14a (24 mg„ 31 µ????) . 18a: Rendimiento 8.0 mg (15 µp???) MS [M+H] + = 536.2 (PM+H calculado = 536.5 g/mol) 205 mg (5 µt???) de mPEG-maleimida 3A (NOF, Japón) se agregaron al compuesto 18a (4.0 mg , 7.5 µp???) en 2 mL de acetonitrilo/agua 1/1 (v/v) + 0.1% de TFA. 100 µ?> de amortiguador de fosfato 0.5 M (pH 7.4) se agregaron y la mezcla se hizo reaccionar durante 10 minutos a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se acidificó a pH 2-3 por medio de la adición de TFA y el compuesto 19aa se separó de los PEGs sin reaccionar por medio de la RP-HPLC y se liofilizó. 19aa: Rendimiento 125 mg (actividad de p fp - c arbonato 85%) El compuesto 19ab se preparó de acuerdo con esto a partir de 410 mg (5 µp???) de mPEG-male imida 3B (NOF, Japón) y el compuesto 18a (4.0 mg , 7.5 µ????) . 19ab: Rendimiento 265 mg (actividad de pf - carbonato 87%) El compuesto 19c se preparó de acuerdo con esto a partir de 205 mg de mPEG-maleimida 3A y 18c (5 mg, 7.2 µt???) 19c: Rendimiento 120 mg (actividad de p fp - carbonato 88%) Ejemplo 9; Síntesis del derivado de mPEG-éster de NHS de 80 kDa ramificado de 4 brazos permanente 22 1 7 El ácido 15 (12 mg, 14 µp???) se agitó en 1 mL de TFA, 1 mL de DCM y 10 µL de TES durante 10 minutos a temperatura ambiente. Los componentes volátiles se retiraron en una corriente de nitrógeno y el ditiol 20 se purificó por medio de la RP-HPLC. 20: Rendimiento 2.9 mg (8 µp???) MS [M+Na] + = 386.8 (PM+Na calculado = 386.2 g/mol) El compuesto 20 (1 mg, 2.8 µt???) en 170 µL de acetonitrilo se agregó a la mPEG-maleimida IB (NOF, Japón) (380 mg, 9.2 µp???) en 4 mL de acetonitrilo/agua 1/1 (v/v) + 0.1% de TFA. 200 µL de amortiguador de fosfato 0.5 M pH 7.4 se agregaron y la mezcla se hizo reaccionar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se agregaron 0.6 µL (7.8 µp???) de mercaptoetanol y la mezcla de reacción se acidificó a pH 4-5 por medio de la adición de TFA. El amortiguador se cambió a HC1 al 0.005% (columna de desalinización HiPREP, 26/10 GE healthcare) y el compuesto 21 se liofilizó sin purificación adicional. 21: Rendimiento 320 mg El compuesto 21 se disolvió en 50 mL de tolueno y la solución de polímero se secó de manera azeotrópica durante dos horas bajo reflujo utilizando una trampa de Dean-Stark. La solución de polímero entonces se enfrió a temperatura ambiente. El reactivo de mPEG-conector seco 21 se precipitó por medio de la adición de éter enfriado (60 mL) . La diciclohexilcarbodiimida (1.2 mg, 6 µt???) en DCM se agregó a una solución del compuesto 21 (240 mg, 3 µt???) y N-hidroxi-succinimida (0.7 mg, 6 µ????) en DCM (3 mL) . La mezcla de reacción se agitó durante 14 horas a temperatura ambiente y el compuesto 22 se precipitó por medio de la adición de éter frío (20 mL) . El producto 22 se secó in vacuo. 22: Rendimiento 200 mg Ejemplo 10: Síntesis del monoconjugado de mPEG-hGH vinculado a amida permanente 23 y el biconjugado de mPEG2-hGH 24 utilizando el derivado de mPEG-hexanoato de succinimidilo de 40kDa lineal Se cambió el amortiguador de la hGH a borato de sodio 50 mM pH 8.5 (alternativamente, se puede utilizar borato de sodio pH 8 o borato de sodio pH 9) . La concentración de hGH fue aproximadamente 2.5 mg/ml . Un exceso molar de tres veces de derivado de mPEG-hexanoato de succinimidilo de 40 kDa (NOF, Japón) con relación a la cantidad de hGH se disolvió en agua para formar una solución de reactivo al 20% (p/v) (alternativamente, se puede utilizar un exceso molar de cuatro veces o cinco veces) . La solución de reactivo se agregó a la solución de hGH y se mezcló. La mezcla de reacción se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente y se enfrió rápidamente con hidroxilamina a temperatura ambiente y pH 7 durante dos horas. La mezcla de reacción enfriada rápidamente se analizó por medio de la cromatografía de exclusión de tamaño. El monoconjugado 23 y el biconjugado 24 se purificaron por medio de la cromatografía de intercambio catiónico. Alternativamente, la cromatografía de intercambio aniónico se puede utilizar para la purificación. Los conjugados purificados se analizaron por medio de SDS-PAGE (Figura 1) .
Ejemplo 11; Síntesis del monoconjugado de mPEG-hGH vinculado a amida permanente 25 y el biconjugado de mPEG-hGH 26 utilizando el derivado de mPEG-éster de NHS de 40kDa ramificado El monoconj ugado de mPEG-hGH permanente 25 y el biconjugado 26 se sintetizaron de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 10 utilizando el derivado de mPEG-éster de NHS de 40 kDa ramificado (NOF, Japón) . Los conjugados purificados se analizaron por medio de SDS-PAGE (Figura 1) .
E j em lo 12 : Síntesis del monoconj ugado de mPEG-hGH vinculado a amida permanente 27 utilizando el derivado de mPEG- éster de NHS de 80kDa ramificado de 4 brazos El monoconj ugado de mPEG-hGH permanente 27 se describió de acuerdo con el Ejemplo 10 utilizando el derivado de mPEG-éster de NHS de 80kDa ramificado de 4 brazos 22. El compuesto purificado 27 se analizó por medio de SDS-PAGE (Figura 1) .
Ejemplo 13; Síntesis del monoconj ugado de mPEG-hGH vinculado a carjbamato permanente 28 utilizando el derivado de PEG-pentafluorofenilcarbonato de 40kDa ramificado de 4 brazos 17aa El amortiguador de la hGH se cambió a borato de sodio 50 raM pH 9 (alternativamente, se puede utilizar borato de sodio pH 8.5 o borato de sodio pH 8) . La concentración de hGH fue aproximadamente 2.5 mg/ml. Un exceso molar de cuatro veces del reactivo de mPEG-conector de 40kDa ramificado de 4 brazos permanente 17aa con relación a la cantidad de hGH se disolvió en agua para formar una solución de reactivo al 20% (p/v) . La solución de reactivo se agregó a la solución de hGH y se mezcló. La mezcla de reacción se incubó durante 1.5 horas a temperatura ambiente y se enfrió rápidamente por medio de la incubación en hidroxilamina 100 mM a pH 7 y a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción enfriada rápidamente se analizó por medio de la cromatografía de exclusión de tamaño (Figura 2A) . El monoconj ugado de mPEG-conector-hGH permanente 28 se purificó por medio de la cromatografía de intercambio aniónico a pH 7.5 y se analizó por medio de SDS-PAGE (Figura 1) y la cromatografía de exclusión de tamaño (Figura 2B) .
Ejemplo 14: Síntesis del monoconj ugado de mPEG-hGH vinculado a carbamato permanente 29 utilizando el derivado de mPEG-pentafluorofenilcarbonato de 80kDa ramificado de 4 brazos El monoconj ugado de mPEG-hGH vinculado a carbamato permanente 29 se sintetizó de acuerdo con el Ejemplo 13 utilizando el derivado de mPEG-carbonato de pentafluorofenilo de 80kDa ramificado de 4 brazos 17ab. El compuesto purificado 29 se analizó por medio de SDS-PAGE (Figura 1) .
Ejemplo 15: Síntesis del monoconjugado de mPEG-hGH vinculado a carbamato permanente 30 utilizando el derivado de mPEG- pentafluorofeni1carbonato de 40kDa ramificado de 4 brazos 17ac El monoconjugado de mPEG-hGH permanente 30 se sintetizó de acuerdo con el Ejemplo 13 utilizando el derivado de mPEG-carbonato de pentafluorofenilo de 40kDa ramificado de 4 brazos 17ac. El compuesto purificado 30 se analizó por medio de SDS-PAGE (Figura 1) .
Ejemplo 16: Síntesis del monoconjugado de mPEG-hGH permanente 31 utilizando el derivado de mPEG-pentafluorofenilcarbonato de 80kDa ramificado de 4 brazos El monoconjugado de mPEG-hGH permanente 31 se puede sintetizar de acuerdo con el Ejemplo 13 utilizando el derivado de mPEG- carbonato de pentafluorofenilo de 80kDa ramificado de 4 brazos 17ad.
Ejemplo 17: Síntesis del monoconjugado de mPEG-hGH vinculado a carbamato permanente 32 utilizando el derivado de mPEG-pentafluorofenilcarbonato de 40kDa ramificado de 4 brazos El monoconjugado de mPEG-hGH vinculado a carbamato permanente 32 se sintetizó de acuerdo con el Ejemplo 13 utilizando el derivado de mPEG-carbonato de pentafluorofenilo de 40kDa ramificado de 4 brazos 19aa. El compuesto purificado 32 se analizó por medio de SDS-PAGE (Figura 1) .
E emplo 18; Síntesis del monoconjugado de mPEG-hGH vinculado a carbamato permanente 33 utilizando el derivado de mPEG-pentafluorofenilcarbonato de 80kDa ramificado de 4 brazos El monoconjugado de mPEG-hGH permanente 33 se sintetizó de acuerdo con el Ejemplo 13 utilizando el derivado de mPEG- carbonato de pentafluorofenilo de 80kDa ramificado de 4 brazos 19ab. El compuesto purificado 33 se analizó por medio de SDS-PAGE (Figura 1) .
Ejemplo 19; Síntesis del monoconjugado de mPEG-hGH vinculado a amina permanente 34 utilizando el derivado de mPEG-propionaldehído de 40kDa ramificado 34 El amortiguador de la hGH se cambió a amortiguador de MES 50 mM pH 6 (alternativamente se puede utilizar amortiguador de HEPES pH 7) y la concentración de la hGH se ajustó a 1.5 mg/ml . Un exceso molar de tres veces de mPEG-propionaldehído de 40 kDa (GL2-400AL3, NOF, Japón) con relación a la cantidad de hGH se disolvió en agua para formar una solución de reactivo al 25% (p/v) . La solución de reactivo se agregó a la solución de hGH y se mezcló. Una alícuota de una solución madre 1 M de cianoborohidruro de sodio en agua se agregó para proporcionar una concentración final de 25 mM en la mezcla de reacción. La solución se incubó durante 18 horas a temperatura ambiente en la oscuridad. La reacción se enfrió rápidamente por medio de la adición de amortiguador de Tris. La mezcla de reacción se analizó por medio de la cromatografía de exclusión de tamaño y el conjugado 34 se purificó por medio de la cromatografía de intercambio catiónico. El monoconjugado de mPEG-hGH purificado 34 se analizó por medio de SDS-PAGE (Figura 1) .
Ejemplo 20: Síntesis del monoconjugado de mPEG-hGH vinculado a carbamato transitorio 35 utilizando el derivado de mPEG- pentafluorofenilcarbonato de 40kDa ramificado de 4 brazos transitorio 19c El amortiguador de la .hGH se cambió a borato de sodio 50 mM pH 9 (alternativamente, se puede utilizar borato de sodio pH 8.5 o borato de sodio pH 8) y la concentración de hGH se ajustó a 2.5 mg/ml. Un exceso molar de cuatro veces del reactivo de mPEG-cónector transitorio 19c con relación a la cantidad de hGH se disolvió en agua para formar una solución de reactivo al 20% (p/v) . La solución de reactivo se agregó a la solución de hGH y se mezcló. La mezcla de reacción se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente y se enfrió rápidamente por medio de la incubación en hidroxilamina 100 mM a H 7 y a temperatura ambiente durante 2 horas . El monoconjugado de mPEG-conector-hGH se purificó por medio de la cromatografía de intercambio aniónico a pH 6.5 (Figura 3A) y se analizó por medio de la cromatografía de exclusión de tamaño (Figura 3B) .
Ejemplo 21: Síntesis del monoconjugado de mPEG-conector-hGH transitorio 36 utilizando un derivado de mPEG-pentafluorofenilcarbonato de 80kDa ramificado de 4 brazos El amortiguador de la hGH se cambió a borato de sodio 100 mM pH 9 (alternativamente, se puede utilizar borato de sodio pH 8.5 o borato de sodio pH 8) y la concentración de hGH se ajustó a 10 mg/ml . Un exceso molar de cuatro veces del reactivo de mPEG-conector de 80kDa ramificado de 4 brazos transitorio 17ca con relación a la cantidad de hGH se disolvió en agua para formar una solución de reactivo al 25% (p/v) . La solución de reactivo se agregó a la solución de hGH y se mezcló. La mezcla de reacción se incubó durante 45 minutos a temperatura ambiente y se enfrió rápidamente por medio de la incubación en hidroxilamina 100 mM a pH 7 y a temperatura ambiente durante 2 horas. El monoconj ugado de mPEG- conector-hGH 36 se purificó por medio de la cromatografía de intercambio catiónico (Figura 4A) y se analizó por medio de la cromatografía de exclusión de tamaño (Figura 4B) .
Ejemplo 22; Síntesis del monoconjugado de mPEG-hGH transitorio 37 utilizando el derivado de mPEG- pentafluorofenilcarbonato de 80kDa ramificado de 4 brazos 17cb El conjugado de PEG-conector-hGH 37 se sintetizó como se describiera de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 21 utilizando el reactivo de mPEG-conector activado 17cb. El cromatograma de intercambio catiónico y el cromatograma de exclusión de tamaño analítico se muestran en las Figuras 5A y 5B, respectivamente.
Ejemplo 23; Síntesis del monoconjugado de mPEG-hGH vinculado a carbamato transitorio 38 utilizando el derivado de mPEG-pentafluorofenilcarbonato de 80kDa ramificado de 4 brazos 17b conjugado de mPEG-conector-hGH vinculado a carbamato transitorio 38 se puede sintetizar como se describiera en el Ejemplo 21 utilizando el reactivo de mPEG-conector de 80kDa ramificado de 4 brazos transitorio 17b.
E j emplo 24 : Ensayo para medir la act ividad del profármaco de hGH unido a PEG y hGH Es un trabajo de rutina para la persona experta determinar la actividad residual del profármaco polimérico expresada por la actividad del conjugado de polímero permanente correspondiente utilizando ensayos estándar como se describe en el e j emplo 1.
Específicamente, las células NB2-11 se desarrollaron en medios libres de suero con 100 ng/ml de complemento de hGH . Para el ensayo de proliferación in vitro, la suspensión de células que contenía 2xl05 células/ml se lavó dos veces con medio libre de suero y medio libre de hGH y se suministró dentro de una placa de microtítulo de fondo plano de 96 pocilios (104 células/pocilio) . Los compuestos se sometieron a prueba por triplicado en una serie de pasos de titulación (9 pasos, utilizando una dilución de factor 3 entre cada paso) . Las células con soluciones de compuestos se incubaron durante 48 horas seguido por la incubación durante 2.5 horas con reactivo de proliferación de células WST-1. La proliferación de NB2-11 se determinó por medio de la lectura de densidad óptica en un lector de ELISA y la respuesta se colocó en un diagrama como una función de concentración y se determinaron los valores EC50. Los resultados se muestran como %, la bioactividad in vitro residual en relación con la hGH no modificada se proporciona en la tabla 1.
En los experimentos in vitro descritos anteriormente, la hGH nativa (fuente Novo Nordisk, Dinamarca) se utilizó como compuesto de referencia. La misma preparación de hGH se utilizó para la síntesis de los conjugados de PEG-hGH permanentes.
Tabla 1 Tabla 1: Bioactividad in vitro de conjugados de hGH unidos a PEG permanentemente en comparación con la hGH nativa (Norditropin, Novo Nordisk, Dinamarca) .
Conclusión: Como se observa a partir de la tabla 1, por medio de la conjugación de una molécula' adecuada de PEG a la hGH, la actividad in vitro de la hGH unida a PEG se puede reducir a menos de 5% de la actividad de la hGH nativa no conjugada. Por ejemplo, la conjugación de un PEG ramificado 4x20kDa a la hGH reduce la actividad residual a 0.7% del estándar de hGH no conj ugada .
Adicionalmente , a partir de estos resultados también se descubrió sorprendentemente que la actividad residual de la hormona de crecimiento unida a PEG esta relacionada no únicamente al tamaño del PEG adherido, sino también al grado de ramificación y la separación entre la hGH y los puntos de ramificación dentro de la estructura del PEG .
PEG lineal Específicamente, la unión de un PEG lineal 40kDa a la hGH da por resultado una actividad in vitro de 10.3% (compuesto 23) en comparación con la hGH nativa.
PEG ramificado Cuando un PEG ramificado 2x20kDa se adhiere (compuesto 25) , la actividad in vitro se reduce adicionalmente a 4.4% en comparación con la hGH nativa.
Además, cuando un PEG 4x20kDa con una separación corta entre la hGH y los puntos de ramificación dentro del reactivo de PEG se adhiere (compuestos 27 y 29) la actividad in vitro se reduce aún más a respectivamente 0.7% en comparación con la hGH nativa.
Sorprendentemente, cuando un PEG 4x20kDa con un separador relativamente largo entre la hormona de crecimiento humana y el primer punto de ramificación dentro del reactivo de PEG se adhiere (por ejemplo el compuesto 33) la actividad in vitro se reduce menos (2.2%) mostrando la importancia del separador entre el grupo funcional de hGH y el primer punto de ramificación dentro del reactivo de PEG ramificado .
La conjugación de más de una porción de PEG a la hGH para formar bi-conjugados de PEG reduce la actividad in vitro a menos de 0.5%. (Por ejemplo los compuestos 24 y 26) . Ejemplo 25; Determinación de la velocidad de autoescisión in vitro de los conjugados 35, 36, 37 y 38 La velocidad de autoescisión de los conjugados 35, 36 y 37 a pH 7.4 y 37 °C se determinó como se describe en el Ejemplo 2. Las vidas medias de autoescisión de aproximadamente 75 horas se determinaron para estos conjugados. La Figura 6 muestra cromatogramas de exclusión de tamaño de muestras del conjugado incubado 35 que se analizaron después de 0 horas, 8 horas, 47 horas, 97 horas y 168 horas mostrando una liberación lenta de hGH del conjugado 35 a través del tiempo. La velocidad de autoescisión del conjugado 38 se puede determinar de acuerdo con esto y proporciona vidas medias de aproximadamente 50 horas.
Ejemplo 26: Ensayo para medir la vida media in vivo terminal de los profármacos de hGH unidos a PEG expresada por la vida media del conjugado permanente, correspondiente in vivo La farmacocinética de los conjugados permanentes se determinó después de la inyección intravenosa de 0.25 mg (equivalentes de hGH) en ratas. A fin de seleccionar un conjugado que es adecuado para inyecciones semanales en humanos, es deseable una vida media en el plasma de más de 10 horas en la rata.
Una dosis individual de 0.25 mg de hGH o 0.25 mg de conjugado de PEG-hGH permanente (dosis basada en la hGH) por rata se administró por la ruta intravenosa a ratas macho Wistar (200-250 g) . Dos grupos de dos animales cada uno se utilizaron para cada compuesto. 200-300 µ? de sangre entera se retiraron por la ruta sublingual para obtener 100 µ? de plasma con Ca-Heparina por animal y punto de tiempo. Las muestras se recolectaron después de 0.5 , 3, 24, 48, 72 y 96 horas para el grupo 1 y después de 5, 8, 32, 56, 80 y 168 horas para el grupo 2. Las muestras de plasma se almacenaron a -80°C hasta el ensayo.
Las concentraciones de hGH y conjugado de PEG-hGH se midieron utilizando un kit ELISA de hGH (DSL) . Las concentraciones en el plasma se calcularon a partir de una curva de calibración del conjugado respectivo o hGH y se colocaron en un diagrama contra el tiempo y la vida media terminal {t1/2) se calculó utilizando un modelo de compartimiento individual. El resultado de la determinación de la vida media se presenta en la tabla 2.
A fin de seleccionar un conjugado que es adecuado para inyecciones semanales en humanos se realizaron estudios farmacocinéticos en ratas. Como la vida media de los conjugados unidos a PEG en ratas esta en el rango de 5 veces más rápido que en humanos, la vida media de una hGH unida a PEG en ratas debe ser aproximadamente 10 horas o mayor. A fin de obtener un cálculo de la vida media del profármaco conjugado de hGH unido a PEG sin escisión del conector, el conjugado correspondiente unido permanentemente se inyecta en una rata .
Los resultados de las determinaciones de la vida media in vivo se presentan en la Tabla 2.
Tabla 2 Compuesto Caracterización in vivo: vida media in vivo de conjugados permanentes hGH nativa (Novo 20 minutos Nordisk, Dinamarca) 23 4 horas 25 5 horas 26 11 horas 27 13 horas Tabla 2: Vida media de conjugados de PEG-hGH permanentes en ratas Conclusión : A partir de la tabla 1 y la tabla 2 es obvio que la actividad residual se correlaciona inversamente con la vida media por ejemplo un alto grado de actividad residual causa una eliminación más rápida. Esto es típico para los conjugados eliminados por mecanismos de eliminación mediados por receptores.
Adicionalmente , a fin de obtener un profármaco de hGH unido a PEG que se pueda administrar una vez a la semana en humanos y con una actividad residual baja, se prefiere una molécula de PEG con uno o más puntos de ramificación y con un peso molecular de 40kDa o superior. Alternativamente, la conjugación de PEG a más de un sitio en la hGH para formar biconjugados de PEG-hGH da por resultado una vida media terminal larga.
Ejemplo 27 Estudio farmacodinámico del conjugado de mPEG- conector-hGH vinculado a carbamato transitorio 36 y la hormona de crecimiento humana en Monos Cynomolgus El objetivo de este estudio fue comparar la respuesta farmacodinámica en monos cynomolgus de una dosis del conjugado de mPEG-conector-hGH vinculado a carbamato transitorio 36 con una dosificación de hormona de crecimiento humana al día durante una semana.
Se estudiaron los siguientes grupos de dosificación': Puesto que el conjugado de mPEG-conector-hGH vinculado a carbamato transitorio 36 está unido a PEG de manera transitoria utilizando un grupo de PEG de 80kDa, las cantidades de hGH en los grupos de dosificación del conjugado de mPEG-conector-hGH vinculado a carbamato transitorio de 5 y 10 mg/kg fueron aproximadamente 1 y 2 mg/kg, respectivamente. Por lo tanto, la cantidad de hGH en el grupo de 10 mg/kg del conjugado de mPEG-conector-hGH vinculado a carbamato transitorio 36 fue equivalente a una dosis diaria de 0.3 mg/kg de' hGH.
Cada artículo de prueba se inyectó por la ruta subcutánea en 2 monos cynomolgus (1 macho, 1 hembra) utilizando un volumen de dosis de 1 ml/kg. La edad y peso de los animales fueron 2.5-3 años y 2.0-2.5 kilogramos, respectivamente .
Las muestras de sangre se recolectaron de la arteria/vena femoral para la determinación de las concentraciones en el suero de IGF-1, un marcador farmacodinámico para la hormona de crecimiento humana. La muestra de sangre se recolectó en los siguientes puntos de tiempo: 0 (predosis) , 3, 6, 12, 24, 36, 48, 72, 96, 120 y 144 horas después de la dosificación en el Día 1.
Las muestras de sangre se recolectaron, se dejaron coagular y luego se almacenaron en un bloque de hielo o hielo húmedo hasta que se centrifugaron. Después de la centrifugación, las muestras de suero se prorratearon en frasquitos pre-etiquetados y se taparon herméticamente. Los frasquitos se almacenaron a -70°C con el prorrateo en los frasquitos.
Los niveles de IGF-1 en las muestras de suero se midieron utilizando el kit de ELISA de IGF-1 Humano QuantikineMR (R&D systems) que había sido adaptado y validado para el uso en la determinación de los niveles de IGF-1 en 15 el suero de monos cynomolgus.
La respuesta farmacodinámica de los artículos de prueba se muestra en la Figura 11. Tanto la administración diaria de hGH como una administración del conjugado de mPEG-conector-hGH vinculado a carbamato transitorio 36 incrementaron los niveles de IGF-1 sobre los niveles medidos en el grupo de vehículo. Una administración de 5 mg/kg de conjugado de mPEG-conector-hGH vinculado a carbamato transitorio 36 fue equivalente a la administración diaria de hGH mientras que una administración de 10 mg/kg del conjugado de mPEG-conector-hGH vinculado a carbamato transitorio 36 se mostró que era superior a la hGH diaria. Esto indicó claramente que una dosis una vez a la semana del conjugado de mPEG-conector-hGH vinculado a carbamato transitorio 36 fue superior a una dosis diaria equivalente de hGH.
Abreviaciones : DBU 1 , 3 -diazabiciclo [5.4.0] undeceno DCM dielorómetaño DIEA diisopropiletilamina DMAP dimetilamino-piridina DMF N, -dimetilformamida DMSO sulfóxido de dimetilo eq equivalente estequimétrico fmoc 9- fluorenilmetoxicarbonilo HFIP hexafluoroisopropanol HOSu N-hidroxisuccinimida LCMS cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas Mal maleimidopropionilo MS espectro de masas PM masa molecular PEG polietilenglicol RP-HPLC cromatografía líquida de alto desempeño de fase inversa f factor de retención t .a temperatura ambiente SEC cromatografía de exclusión de tamaño Suc succinimidopropionilo TES trietilsilano TFA ácido trifluoroacético THF tetrahidrofurano Trt tritilo LISTA DE REFERENCIAS 1. Büyukgebiz A. y colaboradores J. Pediatr. Endocrinol . Metab. Enero-Febrero de 1999; 12(l) :95-7 2. Clark y colaboradores, 1996, Journal of Biological Chemistry 271: 21969-21977 3. Girard, J. Mehls, O., J. Clin Invest. Marzo de 1994; 93 (3) : 1163-1171 4. Philip Harris y colaboradores Horm. Res. 2006; 65 (suppl. 4) : 1-213, CF1-98 GH/IGF Treatment with title "First in-human study of PEGylated recombinant human growth hormone" . 5. Veronese, F. M. "Enzymes for Human Therapy: Surface Structure Modifications" , Chimica Oggi , 7:53-56 (1989).
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (37)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende excipientes farmacéuticos adecuados y también comprende una cantidad efectiva, clínica, in vivo, humana de un conjugado de profármaco de hormona de crecimiento humana recombinante (rhGH) unido a PEG, en donde el PEG se vincula a la rhGH por vía de un conector transitorio autohidrolizable (autoescindible) ; el conjugado de profármaco se distingue porque: (1) : el conjugado tiene una actividad de GH la cual es menor que 5% de la hormona de crecimiento nativa sin PEG; y (2) : la velocidad de autohidról i s i s del conector es tal que la vida media in vivo es de 10 horas a 600 horas.
2. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porqué la velocidad de autohidról i s i s es tal que la vida media in vivo es hasta 5 veces más corta que la vida media in vitro del conjugado de profármaco de hGH unido a PEG correspondiente.
3. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la vida media in vivo es hasta 3 veces más corta que la vida media in vitro del conjugado de profármaco de hGH unido a PEG correspondiente.
4. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 2 o 3, caracterizada porque la vida media in vivo es hasta 2 veces más corta o casi idéntica a la vida media in vitro del conjugado de profármaco de hGH unido a PEG correspondiente .
5. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la composición es una composición para la administración subcutánea, la administración intramuscular o la inyección intravenosa.
6. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque el profármaco unido a PEG tiene una carga total de PEG por molécula de hormona de crecimiento que asciende a por lo menos 25 kDa .
7. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el conjugado de profármaco tiene la estructura química (A) : en donde HN-rhGH representa el residuo de rhGH adherido al conector transitorio; Rl , R2 , R3 , R4 y R5 se seleccionan independientemente de hidrógeno, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, butilo terciario; PEG representa el residuo de unión a PEG adherido al conector transitorio; n = 1 o 2 ; y X se selecciona de alquilo de 1 a 8 átomos de carbono o heteroalquilo de 1 a 12 átomos de carbono.
8. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque la estructura parcial de la fórmula (I) dentro de la estructura (A) de conformidad con la reivindicación 7, la cual es se selecciona del grupo que consiste de:
9. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque la estructura parcial de la fórmula (II) dentro de la estructura (A) de conformidad con la reivindicación 7, la cual es se selecciona del grupo que consiste de:
10. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque PEG-X en la fórmula (A) de conformidad con la reivindicación 7 es PEG-W de la fórmula III: X PEG W ("i). en donde PEG-W se selecciona del grupo que consiste de
11. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque la estructura de conjugado de profármaco es:
12. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque la estructura de conjugado de profármaco es: en donde PEG y NH-rhGH tienen el significado como se indicara en la reivindicación 7; R se selecciona de hidrógeno, metilo, etilo, propilo y butilo; y X se selecciona de alquilo de 1 a 8 átomos de carbono o heteroalquilo de 1 a 12 átomos de carbono.
13. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la velocidad de autoescisión del conector in vivo es tal que la vida media in vivo es de 20 a 300 horas.
14. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la velocidad de autoescisión del conector in vivo es tal que la vida media in vivo es de 20 a 150 horas.
15. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la velocidad de autoescisión del conector in vivo es tal que la vida media in vivo es de 30 a 100 horas.
16. La composición farmacéutica de conformidad con cua'lquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la velocidad de autoescisión del conector in vivo es tal que la vida media in vivo es de 30 a 75 horas.
17. Una cantidad efectiva clínica de la composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 caracterizada porque es para el uso en un método para el tratamiento de una enfermedad relacionada con la GH en un paciente humano.
18. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende excipientes farmacéuticos adecuados y también comprende un conjugado de profármaco de la hormona de crecimiento humana (hGH) de la fórmula (AA) hGH-NH-La-S° (AA), en donde hGH-NH representa el residuo de hGH; La representa un grupo funcional, el cual es autohidrolizable (autoescindible) por un grupo que induce la autoescisión Ga; y S° es una cadena de polímero que tiene un peso molecular de por lo menos 5 kDa y que comprende por lo menos una primera estructura de ramificación BS1, por lo menos la primera estructura de ramificación BS1 comprende por. lo menos una segunda cadena de polímero S1 que tiene un peso molecular de por lo menos 4 kDa, en donde por lo menos uno de S°, BS1, S1 comprende además el grupo que induce la auto-escisión Ga y en donde la estructura de ramificación BS1 comprende además por lo menos una tercera cadena de polímero S2 que tiene un peso molecular de por lo menos 4 kDa o por lo menos uno de S°, S1 comprende por lo menos una segunda estructura de ramificación BS2 que comprende por lo menos la tercera cadena de polímero S2 que tiene un peso molecular de por lo menos 4 kDa y en donde el peso molecular del conjugado de profármaco sin la hGH-NH es por lo menos 25 kDa y a lo sumo 1000 kDa.
19. La composición de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque el peso molecular del conjugado de profármaco sin la hGH-NH es por lo menos 30 kDa y a lo sumo 120 kDa.
20. La composición de conformidad con la reivindicación 18 o 19, caracterizada porque el peso molecular del conjugado de profármaco sin la hGH-NH es por lo menos 40 kDa y a lo sumo 100 kDa.
21. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, caracterizada porque el peso molecular del conjugado de profármaco sin la hGH-NH es por lo menos 40 kDa y a lo sumo 90 kDa.
22. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, caracterizada porque La se selecciona del grupo que consiste de C(0)-0- y C(0)-, los cuales forman junto con el grupo amino primario de la hGH un grupo carbamato o amida que da por resultado la fórmula (AA1) o (AA2) hGH-NH-C(0)0-S° (AA1), hGH-NH-C(0)-S° (AA2).
23. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22, caracterizada porque La forma junto con el grupo amino de la hGH un grupo funcional carbamato, la escisión del grupo es inducida por un grupo hidroxilo o amino de Ga por' vía de la eliminación de 1,4- o 1,6-bencilo de S°, en donde Ga contiene enlaces de éster, carbonato, carbamato o amida que se someten a la transformación limitante de la velocidad.
24. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, caracterizada porque Ga es un anillo aromático o fluorenilmetilo adherido directamente a grupo funcional carbamato formado por La y el grupo amino primario de hGH.
25. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 24, caracterizada porque por lo menos una de las estructuras de ramificación BS1, BS2 comprende una cuarta cadena de polímero adicional S3 que tiene un peso molecular de por lo menos 4 kDa o uno de S°, S1, S2 comprende una tercera estructura de ramificación BS3 que comprende por lo menos la cuarta cadena de polímero S3 que tiene un peso molecular de por lo menos 4 kDa.
26. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 25, caracterizada porque por lo menos las tres cadenas S°, S1, S2 se basan independientemente en un polímero seleccionado del grupo que consiste de polímeros de polialquiloxi , ácido hialurónico y derivados del mismo, alcoholes polivinílieos , polioxazolinas , polianhídridos , poli (orto-ésteres) , policarbonatos , poliuretanos , ácidos poliacrílicos , poliacrilamidas , poliacrilatos , polimetacrilatos , poliorganofosfazenos , polisiloxanos , polivinilpirrolidona , policianoacrilatos y poliésteres .
27. La composición de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque por lo menos las tres cadenas S°, S1, S2 se basan en un polímero de polialcoxi .
28. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 27, caracterizada porque la distancia más corta entre el sitio de unión de S° a La y la primera estructura de ramificación BS1 medida como átomos conectados es menor que 50 átomos.
29. La composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque la distancia más corta es menor que 20 átomos.
30. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 29, caracterizada porque S° es de la fórmula (AAA1) en donde Ga tiene el significado de conformidad con la reivindicación 18; ,00 es CH2; o C(O) ; ,0A es una cadena de alquileno que tiene de 1 a 20 átomos de carbono, la cual es interrumpida o terminada opcionalmente por uno o más grupos, ciclos o heteroátomos seleccionados del grupo que consiste de un heterociclo sustituido opcionalmente; 0; S; C(0); y NH; BS1, BS2, BS3 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de N; y CH, S0B, S1A son independientemente una cadena de alquileno que tiene de 1 a 200 átomos de carbono, la cual es interrumpida o terminada opcionalmente por un o más grupos, ciclos o heteroátomos seleccionados del grupo que consiste de heterociclo sustituido opcionalmente ; O; S; C(0); y NH; Soc, S1B, son (C(0) )n2(CH2)ni(OCH2CH2)nOCH3, en donde cada n es independientemente un número entero de 100 a 500, cada ni es independientemente 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, y n2 es 0 o 1. S2, S3 son independientemente hidrógeno; o (C (O) ) n2 (CH2) ni (OCH2CH2) nOCH3, en donde cada n es independientemente un número entero de 100 a 500, cada ni es independientemente 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, y n2 es 0 o 1, con la condición de que por lo menos uno de S2, S3 sea diferente de hidrógeno; R2, R3 son de conformidad con la reivindicación 5 para la fórmula (A) .
31. La composición de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque Ga es 0C(0)-R y R es la estructura parcial de la fórmula (I) de conformidad con la reivindicación 6, en donde Rl, R4 , R5 y n son de conformidad con la reivindicación 7.
32. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22 y 25 a 26, caracterizada porque La-S° es representado por la fórmula (AAA2) , (AAA2), en donde la línea punteada indica la unión al grupo amino primario de hGH de modo que La y el grupo amino forman un enlace de amida; X es C(RR4A); N(R4); 0; C (R4R4A) -C (R5RA) ; C (R5R5A) -C (R4R4A) ; C(R4R4A)-N(R6); N(R6)-C(R4R4A) ; C(R4Ra)-0; o O-C(R4R4A); X1 es C; O S(0) ; X2 es C(R7, RA); o C(R7, R7A)-C(R8, R8A) ; Dl Dla D2 Tj2a 3 R3a p4 „4a p5 R5a p6 ?7 p7a p8 p8a , r , / rv oc seleccionan independientemente del grupo que consiste de H; y alquilo de 1 a 4 átomos de carbono; u Opcionalmente, uno o más de los pares RLA/RA, RLA/R5 , RA/RA, R4A/R5A, R7/R8A forman un enlace químico; Opcionalmente, uno o más de los pares R1/RLA, R2/R2A, R4/R4A, R5/R5A, R7/R7A, R8/R8A se unen junto con el átomo al cual están adheridos para formar cicloalquilo de 3 a 7 átomos de carbono; o heterociclilo de 4 a 7 miembros; Opcionalmente, uno o más de los pares R R4, R1/R5, R1/R6, R/R5, R7/R8, R2/R3 se unen junto con los átomos a los cuales están adheridos para formar un anillo A; Opcionalmente, R3/R3A se unen juntó con el átomo de nitrógeno al cual están adheridos para formar un heterociclo de 4 a 7 miembros; A se selecciona del grupo que consiste de fenilo; naftilo; indenilo; indanilo; tetralinilo; cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono heterociclilo de 4 a 7 miembros; y heterobiciclilo de 9 a 11 miembros; y en donde S° es sustituido por un grupo L2-Z y es sustituido opcionalmente de manera adicional, con la condición de que el hidrogeno marcado con el asterisco en la fórmula (I) no sea reemplazado por un sustituyente; en donde L2 es un enlace químico individual o un separador; y Z es de la fórmula (AAA2a) en donde S00, S0B, Soc, S1A, S1B( S2, S3, BS1, BS2 y BS3 tienen el significado indicado para la fórmula (AAA1) de conformidad con la reivindicación 30.
33. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende excipientes farmacéuticos adecuados y que también comprende un conjugado de profármaco de la hormona de crecimiento humana (hGH) de la fórmula (AB) hGH-(NH-L-S°)n (AB), en donde n es 2, 3 o 4; hGH(-NH)n representa el residuo de hGH; cada L es independientemente un grupo funcional permanente Lp; un grupo funcional La, el cual es autohidrolizable (auto-escindible) por un grupo que induce . la autoescisión Ga; y cada S° es independientemente una cadena de polímero que tiene un peso molecular de por lo menos 5 kDa, en donde S° es ramificado opcionalmente al comprender por lo menos una primera estructura de ramificación BS1, por lo menos la primera estructura de ramificación BS1 comprende por lo menos una segunda cadena de polímero S1 que tiene un peso molecular de por lo menos 4 kDa, en donde por lo menos uno de S°, BS1, S1 comprende además el grupo que induce la autoescisión Ga y en donde el peso molecular del conjugado de profármaco sin la hGH- H es de por lo menos 25 kDa y a lo sumo 1000 kDa.
34. La composición de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque n es 2.
35. Un profármaco, caracterizado porque es de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 34.
36. Un profármaco, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de en donde m es un número entero de 200 a 250 y n es un número entero de 100 a 125; en donde n es un número entero de 400 a 500; en donde n es un número entero de 400 a 500; y en donde n es un número entero de 400 a 500.
37. Un método para la preparación de un compuesto de la fórmula hGH-NH-C (0) 0-S° (AA1) , en donde S° tiene el significado de conformidad con la reivindicación 18 y comprende por lo menos un grupo caracterizado porque comprende los siguientes pasos: (a) hacer reaccionar un compuesto de la fórmula ROC (0) 0-S°-SH (???') con un compuesto de la fórmula (AA2 ' ) , en donde R es un apoyo adecuado para un grupo carbonato activado y en donde S0' y S°" se seleccionan para producir S° que comprende por lo menos el grupo , dando por resultado un compuesto de la fórmula R0C(0)0-S°, y (b) hacer reaccionar el compuesto de la fórmula R0C(0)0-S° con hGH-NH2, en donde hGH-NH2 representa hGH con uno de sus grupos amino primarios para producir un compuesto de la fórmula (AA1) .
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