BRPI0911780B1 - Composição farmacêutica compreendendo compostos peguilados de hormônio de crescimento humano recombinante, e profármaco - Google Patents

Composição farmacêutica compreendendo compostos peguilados de hormônio de crescimento humano recombinante, e profármaco Download PDF

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BRPI0911780B1
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Susanne Kindermann
Grethe Nørskov Rasmussen
Thomas Wegge
Kennett Sprogøe
Harald Rau
Torben Lessmann
Ulrich Hersel
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Ascendis Pharma Endocrinology Division A/S
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Abstract

compostos peguilados de hormônio de crescimento humano recombinante. a presente invenção refere-se a um hormônio de crescimento humano quimi-camente modificado (rhgh) preparado ligando um ligante transiente que compreende um polietileno glicol. a proteína quimicamente modificada pode ter uma atividade de rhgh muito mais duradoura que a do rhgh inalterado, permitindo oportunidades reduzidas de dose e horário e o rhgh modificado pode não causar lipoatrofia. também inclui métodos de uso para tratamento e/ou prevenção de doenças ou distúrbios em que o uso de hormônio de crescimento é benéfico.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[001] Esta invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo excipientes farmacêuticos adequados e também compreendendo uma quantidade clinicamente eficaz de um profármaco Peguilado de hormônio de crescimento humano recombinante (rhGH) que pode ser administrado menos frequentemente que os produtos de hormônio de crescimento humanos disponíveis e pode não causar lipoatrofia no lado de injeção. A presente invenção também refere-se a tais profármacos.
ANTECEDENTE DA TÉCNICA
[002] Hormônio de crescimento (GH) é um hormônio que estimula o crescimento e reprodução de células nos seres humanos e outros animais. É um hormônio polipeptídico de cadeia simples, de 191 aminoácidos, que é sintetizado, armazenado, e segregado pelas células somatotróficas dentro das asas laterais da glândula pituitária anterior. O hormônio é também conhecido como somatotropina quando referir ao hormônio de crescimento produzido por tecnologia de DNA recombinante, e é abreviado "rhGH".
[003] Hormônio de crescimento tem uma variedade de funções no corpo, o mais notável destas é o aumento de altura ao longo da infância e há várias doenças que podem ser tratadas através do uso terapêutico de GH.
[004] Os efeitos da deficiência de hormônio de crescimento variam, dependendo da idade que eles ocorrem. Em crianças, insuficiência de crescimento e estatura baixa são as manifestações principais da deficiência de GH. Pode também causar imaturidade sexual. Em adultos, os efeitos da deficiência são mais sutis, e podem incluir deficiências de resistência, energia, e massa óssea, como também risco cardiovascular aumentado.
[005] Há muitas causas de deficiência de GH, incluindo mutações genéticas específicas, malformações congênitas que envolvem o hipotálamo e/ou glândula pituitária, e dano à pituitária a partir de lesão, cirurgia ou doença.
[006] Deficiência é tratada através de suplementação com GH externo. Todo GH em uso atual é uma versão biossintética do GH humano, fabricado através de tecnologia de DNA recombinante. GH é usado como terapia de substituição em crianças e adultos com deficiência de GH de qualquer princípio infantil (após completar a fase de crescimento) ou princípio adulto (usualmente como resultado de um tumor pituitário adquirido). Nestes pacientes, os benefícios têm variadamente incluído massa gordurosa reduzida, massa magra aumentada, densidade óssea aumentada, perfil de lipídios melhorado, fatores de risco cardiovascular reduzidos, e bem-estar psicossocial melhorado.
[007] Genentech Inc (US) foi o primeiro em clonar rhGH e foi descrito na patente EP-B 22242. A partir de 2006, os hormônios de crescimento sintéticos disponíveis nos Estados Unidos e Europa (e seus fabricantes) incluíam Nutropin (Genentech), Humatrope (Eli Lilly), Genotropin (Pfizer), Norditropin (Novo Nordisk), Saizen (Merck Serono), e Omnitrope (Sandoz).
[008] Embora técnicas biológicas moleculares tenham dramaticamente aumentado a disponibilidade de muitas proteínas e/ou polipeptídeos (doravante referidos como proteínas), o uso terapêutico das ditas proteínas é frequentemente tempos impedidos por outros fatores, tais como meia-vida de plasma curta devido à depuração renal e mediada por receptor, agregação, degradação proteolítica, biodisponibilidade ruim e propriedades físicas que impedem formulações eficientes.
[009] Um mecanismo para intensificar a disponibilidade da proteína é por conjugação da proteína com compostos de derivatização que incluem, mas não são limitados a, polietileno glicol e polipropileno glicol. Alguns destes benefícios reconhecidos incluem: imunogenicidade e antigenicidade diminuídas, duração de ação aumentada, e propriedades farmacocinéticas alteradas. [Veronese, F. M. "Enzymes for Human Therapy: Surface Structure Modifications", Chimica Oggi, 7:53-56 (1989)] (referência 5 aqui).
[010] Mediante PEGuilação de rhGH, pode ser possível melhorar as características da molécula para uso médico aumentando sua meia- vida in vivo (aqui alcançar dosagem reduzida ou frequência de doseamento reduzida), melhorando sua estabilidade e diminuindo sua antigenicidade ou uma combinação destas.
[011] Em geral, este tipo de modificação a uma molécula é bem conhecido na técnica e há numerosas patentes disponíveis na literatura de patente descrevendo este conceito. Por exemplo, uma Eritropoietina (EPO) PEGuilada de Hofmann La Roche é descrita na EP-B 1196443 que reivindica um ligante específico compreende PEG covalentemente ligado a uma EPO, uma interferona alfa PEGuilada descrita na EP-B 975369 da companhia Nektar/La Roche e outra interferona alfa PEGuilada na EP-B 1562634 para EPO, da companhia Hofmann La Roche.
[012] Acredita-se que a Depuração in vivo de rhGH ocorra pelos seguintes dois mecanismos. O primeiro é Depuração renal onde rhGH é depurado da circulação através de filtração glomerular renal. Depuração renal de rhGH está bem documentada e PEGuilação de rhGH sintético é portanto uma escolha óbvia para solucionar este problema. Depuração renal responde por volta de 25 - 53% da Depuração total de rhGH (Girard, J. Mehls, O. J. Clin. Invest. março de 1994; 93(3): 1163-1171, referência 3 aqui).
[013] O segundo mecanismo é Depuração hepática (fígado). Absorção hepática de GH ocorre por endocitose mediada por receptor seguida por degradação lisossomal.
[014] Um terceiro mecanismo é depuração mediada por receptor em outro tecido tal como condrócito da cartilagem. Reduzindo a afinidade de ligação de GH ao receptor de GH por PEGuilação, a depuração mediada por receptor será reduzida.
[015] Porém, há problemas dedicados com a administração de rhGH. Uma desvantagem principal de rhGH subcutaneamente administrado é a ocorrência de lipoatrofia em pacientes que recebem o tratamento.
[016] Lipoatrofia é o termo médico usado para perda localizada de tecido gorduroso. Formulações de rhGH subcutaneamente administradas apresentaram problemas de lipoatrofia, que é acreditado ser causados por concentração local alta do hormônio de crescimento complexo e no sítio de injeção.
[017] Büyükgebiz A. et al., publicado em J. Pediatr. Endocrinol. Metab. janeiro-fevereiro de 1999; 12(1):95-7, descrevem um tal registro médico (referência 1 aqui). Este é um relatório de um paciente com deficiência de GH isolada devido à deleção de gene de 6,7 kb que recebeu tratamento de rhGH de dose alta e lipoatrofias locais desenvolveram-se nos sítios de injeção sem qualquer detecção de anticorpo após 6 anos de terapia. A etiologia da lipoatrofia é suspeitada ser pelo efeito lipolítico direto de doses altas de rhGH.
[018] Lipoatrofia relacionada à administração de rhGH é acreditada ser causada pela própria atividade de rhGH, através de concentrações mais altas e através de exposição prolongada. Estas concentrações mais altas ocorrem próximo dos sítios de injeções.
[019] A chance de a atividade de hormônio de crescimento alta acumular-se próximo do sítio de injeção é até mais alta no caso de que rhGH é Peguilado por causa de um tempo de permanência aumentado. No de caso formulações de rhGH Peguilado, o tecido experimentará uma exposição contínua e aumentada da atividade de hormônio de crescimento, devido ao fato que o conjugado Peguilado possui atividade necessária para atividade farmacológica e o conjugado é limitado em difusão devido ao tamanho do conjugado. O resultado é lipólise aumentada no sítio de injeção.
[020] WO-A 2005/079838 descreve hGH Peguilado, em que a metade de hGH é ligada a um polímero de polietileno glicol por meio do grupo amino funcional, que pode ser considerado como ligação permanente devido à estabilidade do grupo amino. Um exemplo de um tal composto de hGH Peguilado, que exibe lipoatrofia, é o composto PHA-794428. O composto PHA-794428 é um rhGH Peguilado e também descrito no WO-A 2005/079838 da companhia Pharmacia (adquirida por Pfizer) e também descrito em Horm. Res. 2006; 65 (supl. 4): 1-213, CF1-98 GH/IGF Treatment com o título "First in-human study of PEGilated recombinant human growth hormone", Philip Harris et al. (referência 4 aqui).
[021] De acordo com a informação de ensaio clínico como publicado em www.clinicaltrials.gov, a experimentação foi terminada em 10-dez-2007. A decisão da Pfizer para terminar o programa foi devido aos casos de lipoatrofia nos sítios de injeção que foram relatados nos estudos clínicos de Fase 2 após uma só injeção de PHA 794428.
[022] WO-A 2006/102659 (Nektar) também descreve e sugere conjugados de rhGH-PEG (tipos lineares e ramificados) por meio de ligação de amida. O problema a ser solucionado no WO-A 2006/102659 é descrito no 5° parágrafo na página 2. De acordo com o requerente, o problema a ser solucionado é frequência de dosamento reduzida. Uma vez que a terapia de rhGH tipicamente requer injeções diárias, os pacientes, e em particular, pacientes pediátricos, repugnam a inconveniência e desconforto associados a este regime. A solução descrita no WO-A da Nektar é a provisão de novos conjugados de PEG- rhGH.
[023] Na tabela 6, [0257] do WO-A pode ser visto que os conjugados de PEG-rhGH têm uma atividade relativamente baixa in vitro quando comparada ao hormônio de crescimento nativo sem PEG. Apesar das baixas atividades in vitro, os conjugados de rhGH Peguilado eram ativos in vivo. Em relação a isto, leia a seção [0261]: "Embora os resultados in vitro preliminares sugiram que aumentando a quantidade de PEG liga ao hGH reduz sua habilidade para estimular o receptor de hGH, com base nos resultados in vivo preliminares, parece que uma redução na bioatividade é mais que equilibrada através de meia-vida aumentada e/ou disponibilidade plasmática, desse modo levando a uma conclusão que os conjugados fornecidos aqui possuem um efeito farmacodinâmico superior in vivo quando comparado ao rhGH inalterado em um regime de dosamento idêntico".
[024] WO-A 2006/102659 (Nektar) não descreve ligantes autocliváveis - isto é, é simplesmente observado que conjugados de PEG-rhGH são ativos in vivo embora suas atividades in vitro sejam significativamente reduzidas. O problema da lipoatrofia não é focalizado.
[025] Uma solução para o desafio de engenheirar as propriedades desejadas de lipoatrofia reduzida e frequência de injeção reduzida em um conjugado Peguilado de hGH é o uso de uma abordagem de profármaco. Um profármaco é qualquer composto que sofre biotransformação antes de exibir seus efeitos farmacológicos. Profármacos podem, desse modo, ser vistos como fármacos contendo grupos protetores não-tóxicos especializados usados de uma maneira transiente para alterar ou eliminar as propriedades indesejáveis na molécula de origem. Neste caso, um veículo polimérico transientemente reduz a atividade do hormônio de crescimento e, por conseguinte, reduz a probabilidade de lipólise de tecido. Conjugação transiente para um veículo polimérico estenderia a meia-vida do conjugado ao mesmo tempo e, portanto, proveria para uma Depuração de ação longa do hGH.
[026] Numerosos profármacos macromoleculares são descritos na literatura onde o veículo macromolecular é ligado por meio de um grupo éster lábil ao agente medicinal (por exemplo, Y. Luo, MR Ziebell, GD Prestwich, "A Hyaluronic Acid - Taxol Antitumor Bioconjugate Targeted to Cancer Cells", Biomacromolecules 2000, 1, 208-218, J Cheng et al., Synthesis of Linear, beta-Ciclodextrin Based Polymers and Their Camptothecin Conjugates, Bioconjugate Chem. 2003, 14, 1007-1017, R. Bhatt et al., Synthesis and in Vivo Antitumor Activity of Poly(L- glutamic acid) Conjugates of 20(S)-Campththecin, J. Med. Chem. 2003, 46, 190-193; R. B. Greenwald, A. Pendri, C. D. Conover, H. Zhao, Y. H. Choe, A. Martinez, K. Shum, S. Guan, J. Med. Chem., 1999, 42, 36573667; B. Testa, J. M: Mayer in Hydrolysis in Drug and Prodrug Metabolism, Wiley-VCH, 2003, Capítulo 8). Em casos de teses, o grupo funcional conjugado da entidade bioativa é um grupo hidroxila ou um ácido carboxílico.
[027] Especialmente para biomacromoléculas, mas também para profármacos de polímero de molécula pequena, pode ser desejável ligar o veículo macromolecular aos grupos amino (isto é, término N ou grupos amino de lisina das proteínas) da entidade bioativa. Este será o caso se mascaramento da bioatividade do fármaco requerer conjugação de um certo grupo amino da entidade bioativa, por exemplo, um grupo amino localizado em um centro ativo ou uma região ou epítopo envolvidos na ligação do receptor. Também, durante a preparação do profármaco, grupos amino podem ser mais quimioluminescentemente dirigidos e servir como um instrumento melhor para conjugar o veículo e o fármaco por causa de sua maior nucleofilicidade quando comparado aos grupos hidroxílicos ou fenólicos. Isto é particularmente verdadeiro para proteínas que podem conter uma grande variedade de funcionalidades reativas diferentes. Neste caso, as reações de conjugação não-seletiva levam a misturas de produto indesejadas que requerem caracterização extensiva ou purificação e podem diminuir o rendimento da reação e eficiência terapêutica do produto.
[028] Ativação de profármaco pode ocorrer por clivagem enzimática ou não-enzimática da ligação em ponte lábil entre o veículo e a molécula do fármaco, ou uma combinação sequencial de ambos, isto é, uma etapa enzimática seguida por um rearranjo não-enzimático.
[029] No WO-A 2005/099768, macromoléculas de ligante Peguilado com ligantes autocliváveis para um grupo grande de biomoléculas incluindo somatropinas (reivindicação 6) são descritas. No WO-A 2005/099768, o problema a ser solucionado é a variabilidade de interpacientes e o efeito imprevisível da ativação do profármaco quando o mecanismo enzimático estiver envolvido (página 12, linha 17-30). Este pedido de patente descreve como uma solução um ligante aromático, que pode com base em PEG. Este ligante-PEG liga o fármaco de certo modo que a atividade do fármaco é significativamente reduzida. É ativado apenas na liberação do fármaco, que é iniciado por hidrólise. A taxa de hidrólise pode ser quimicamente controlada. Nenhuma ênfase especial é dada em GH e problemas relevantes, como lipoatrofia, em relação a este também.
[030] Em resumo, nenhuma das citações supracitadas descreve uma solução para desenvolver um rhGH de ação longa, com base em um conjugado de profármaco que pode ser administrado menos frequentemente sem aumentar a frequência de lipoatrofia.
[031] Desse modo, um objetivo da presente invenção é a provisão de um tal profármaco ou uma composição farmacêutica compreendendo o dito profármaco para reduzir a frequência de administração de rhGH usando PEG conjugado com rhGH sem significativamente induzir lipoatrofia.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[032] Consequentemente, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo excipientes farmacêuticos adequados e também compreendendo uma quantidade eficaz clínica in vivo de um conjugado de profármaco Peguilado de hormônio de crescimento humano recombinante rhGH, em que PEG é ligado a rhGH por meio de um ligante transiente auto-hidrolisável (autoclivagem); o dito conjugado de profármaco é caracterizado em que: (1): o conjugado tem uma atividade de GH que é menos que 5% do hormônio de crescimento nativo sem PEG; e (2): a taxa de auto-hidrólise do ligante é de modo que a meia-vida in vivo é de 10 horas a 600 horas.
[033] A propriedade (1) assegura que o profármaco tem uma baixa incidência de lipoatrofia apesar de ter uma duração significativamente estendida de ação in vivo. Sem estar ligado à teoria, os inventores presentes acreditam que se o profármaco tivesse uma atividade de GH mais alta, este produto ainda induziria lipoatrofia a uma frequência mais alta que os produtos de rhGH correntemente comercializados.
[034] A propriedade (2) assegura que rhGH (sem PEG) é gradualmente liberado com o passar do tempo assim pode-se administrar o produto farmacêutico de rhGH menos frequentemente que o hormônio de crescimento humano, por exemplo, apenas uma vez semanalmente ou uma vez mensalmente em vez de administrações diárias, enquanto ainda retendo eficácia total comparada ao rhGH.
[035] Preferivelmente, a meia-vida in vivo é até 5 vezes mais curta, por exemplo, 2, 3, 4, ou 5 vezes mais curta, que a meia-vida in vitro do conjugado de profármaco de hGH Peguilado correspondente. Mais preferivelmente, a meia-vida in vivoé até 3 vezes mais curta que a meia- vida in vitro do conjugado de profármaco Peguilado de hGH correspondente. O mais preferivelmente, a meia-vida in vivoé até 2 vezes mais curta ou quase idêntica à meia-vida in vitro do conjugado de profármaco Peguilado de hGH correspondente.
[036] Esta invenção aplica-se a profármacos Peguilado de rhGH, em particular a profármacos de veículos Peguilado de rhGH incluindo profármacos de veículos em cascata.
[037] Profármacos podem ser definidos como agentes terapêuticos que são inativos per se, mas são transformados de maneira previsível em metabólitos ativos (vide B. Testa, J. M: Mayer in Hydrolysis in Drug and Prodrug Metabolism, Wiley-VCH, 2003, página 4). Em sistemas de profármaco de veículo, muitos agentes medicinais são inativos ou mostram atividade biológica diminuída quando um polímero é covalentemente conjugado à molécula de fármaco. Nestes casos, uma ligação transiente do fármaco e veículo é aplicada em uma tal maneira que o agente medicinal é liberado do veículo polimérico in vivo para recuperar sua atividade biológica. A atividade biológica reduzida do profármaco quando comparado ao fármaco liberado é de vantagem se uma depuração lenta ou controlada do fármaco for desejada. Neste caso, uma quantidade relativamente grande de profármaco pode ser administrada sem efeitos colaterais concomitantes e o risco de dosagem excessiva. Depuração do fármaco ocorre com o passar do tempo, assim reduzindo a necessidade de administração repetida e frequente do fármaco.
[038] Em profármacos de veículos poliméricos, as metades biologicamente ativas são frequentemente ligadas a uma metade de veículo polimérico por uma ligação em ponte lábil formada entre a metade de veículo e um grupo funcional da molécula de fármaco. Clivagem de um profármaco de veículo gera uma entidade molecular (fármaco) de bioatividade aumentada e pelo menos um produto secundário, o veículo. Este produto secundário pode ser biologicamente inerte (por exemplo, PEG). Após clivagem, a entidade bioativa revelará pelo menos um grupo funcional previamente conjugado e assim mascarado ou protegido, e a presença deste grupo tipicamente contribui para a bioatividade.
[039] A atividade de GH pode ser medida usando métodos conhecidos na técnica. Neste respeito, ênfase é dada ao exemplo 1. Com base no fato que alguns ligantes transientes aplicáveis à presente invenção podem ter uma meia-vida in vitro de menos que 3000 h, a respectiva medição da atividade de GH é feita indiretamente determinando a atividade do GH de um respectivo conjugado de PEG compreendendo um ligante permanente em vez do ligante transiente. Isto pode ser realizado como WO2006102659 descreve na página 74 parágrafo 240, a atividade biológica de rhGH e os conjugados descritos aqui serão avaliados in vitro usando um ensaio de proliferação celular de linfoma de rato de NB2-II. Brevemente, as células NB2-II derivadas de um linfoma de rato são incubadas com rhGH que leva à ligação da molécula de rhGH a seu receptor na superfície da célula. Ligação do receptor leva à cascata de transdução de sinal que resulta na proliferação das células. Resultados do ensaio são com base no conteúdo de proteína determinado, e uma bioatividade de 100% de rhGH inalterado.
[040] Preferivelmente, para a medição da atividade de GH, o protocolo como descrito no Exemplo 24 é usado.
[041] A meia-vida in vitro pode ser medida usando métodos conhecidos na técnica. Neste respeito, ênfase é dada ao exemplo 2.
[042] Consequentemente, um segundo aspecto da invenção refere-se a uma quantidade eficaz clínica da composição farmacêutica compreendendo o profármaco Peguilado de rhGH do primeiro aspecto para uso em um método para tratamento de uma doença relacionada ao GH em um ser humano.
[043] Este segundo aspecto pode ser alternativamente formulado como um método para tratamento de uma doença relacionada ao GH em um ser humano compreendendo administrar a um ser humano uma quantidade eficaz clínica da composição farmacêutica compreendendo o profármaco Peguilado de rhGH do primeiro aspecto.
[044] Em uma situação onde a atividade residual do profármaco (como é o caso para rhGH conjugado com PEG transientemente) encontra-se significativamente reduzida quando comparado a GH nativo humano, os efeitos lipolíticos podem não ocorrer nem sequer em exposição prolongada.
[045] Os compostos aqui descritos denominados profármacos Peguilados de rhGH são conjugados que podem ter atividade residual significativamente reduzida comparada ao GH humano. Para exibir atividade terapeuticamente util, o rhGH tem que ser liberado do conjugado de profármaco, para o qual os profármacos descritos aqui necessitam sofrer uma etapa de ativação (por exemplo, mecanismos de 1,6-liberação), denominada aqui como autoclivagem, clivando o grupo PEG do fármaco. O mecanismo de 1,6-liberação é bem descrito no WO- A 2005/099768.
[046] Sem estar limitado por teoria, os inventores presentes acreditam que os conjugados de rhGH transientemente Peguilado aqui revelados significativamente reduzem a lipoatrofia por causa da baixa atividade dos conjugados de rhGH Peguilado, antes de PEG ser clivado gradualmente pelo ligante autoclivável. Isto pode assegurar que os profármacos não induzirão lipoatrofia mais frequentemente que GH humano ou outros compostos de rhGH permanentemente Peguilado como descritos acima.
[047] O problema subjacente da presente invenção é também resolvido por uma composição farmacêutica compreendendo excipientes farmacêuticos adequados e também compreendendo um conjugado de profármaco do hormônio de crescimento humano (hGH) da fórmula (AA)
Figure img0001
em que hGH-NH representa o resíduo de hGH;
[048] La representa um grupo funcional que é auto-hidrolisável (autoclivável) por um grupo de indução de autoclivagem Ga; e
[049] S0é uma cadeia polimérica tendo um peso molecular de pelo menos 5 kDa e compreendendo uma pelo menos primeira estrutura de ramificação BS1, a pelo menos primeira estrutura de ramificação BS1 compreendendo uma pelo menos segunda cadeia polimérica S1 tendo um peso molecular de pelo menos 4 kDa, em que pelo menos um de S0, BS1, S1também compreende o grupo de indução de autoclivagem Ga e em que a estrutura de ramificação BS1também compreende uma pelo menos terceira cadeia polimérica S2 tendo um peso molecular de pelo menos 4 kDa ou pelo menos um de S0, S1 compreende uma pelo menos segunda estrutura de ramificação BS2 compreendendo a pelo menos terceira cadeia polimérica S2 tendo um peso molecular de pelo menos 4 kDa e em que o peso molecular do conjugado de profármaco sem o hGH-NH é pelo menos 25 kDa e no máximo 1000 kDa, preferivelmente pelo menos 25 kDa e no máximo 500 kDa, até mesmo mais preferivelmente pelo menos 30 kDa e no máximo 250 kDa, até mesmo mais preferivelmente pelo menos 30 kDa e no máximo 120 kDa, até mesmo mais preferivelmente pelo menos 40 kDa e no máximo 100 kDa, até mesmo mais preferivelmente pelo menos 40 kDa e no máximo 90 kDa.
[050] Surpreendentemente, foi verificado que a atividade residual de um profármaco da presente invenção pode ser eficientemente reduzida fornecendo um veículo polimérico tendo pelo menos 3 cadeias de um certo comprimento mínimo (como definido por seu peso molecular) e desse modo, em combinação com um ligante transiente como descrito aqui, solucionar o problema de fornecer um profármaco de hGH que possa ser administrado menos frequentemente sem aumentar o risco de lipoatrofia. O profármaco deve ser, portanto, solúvel em água.
[051] Para pelo menos profármacos bis-conjugados, o problema pode ser solucionado por uma composição farmacêutica compreendendo excipientes farmacêuticos adequados e também compreendendo um conjugado de profármaco do hormônio de crescimento humano (hGH) da fórmula (AB)
Figure img0002
em que
[052] n é 2, 3, ou 4; preferivelmente 2;
[053] hGH(-NH)n representa o resíduo de hGH;
[054] cada L é independentemente um grupo funcional permanente Lp; ou um grupo funcional La que é auto-hidrolisável (autoclivável) por um grupo de indução de autoclivagem Ga; e
[055] cada S0é independentemente uma cadeia polimérica tendo um peso molecular de pelo menos 5 kDa, em que S0é opcionalmente ramificado compreendendo uma pelo menos primeira estrutura de ramificação BS1, a pelo menos primeira estrutura de ramificação BS1 compreendendo uma pelo menos segunda cadeia polimérica S1 tendo um peso molecular de pelo menos 4 kDa, em que pelo menos um de S0, BS1, S1também compreende o grupo de indução de autoclivagem Ga e em que o peso molecular do conjugado de profármaco sem o hGH-NH é pelo menos 25 kDa e no máximo 1000 kDa, preferivelmente pelo menos 25 kDa e no máximo 500 kDa, até mesmo mais preferivelmente pelo menos 30 kDa e no máximo 250 kDa, até mesmo mais preferivelmente pelo menos 30 kDa e no máximo 120 kDa, até mesmo mais preferivelmente pelo menos 40 kDa e no máximo 100 kDa, até mesmo mais preferivelmente pelo menos 40 kDa e no máximo 90 kDa.
[056] Ainda outro aspecto da presente invenção, um conjugado de profármaco é como definido acima.
[057] As modalidades preferidas da presente invenção são descritas abaixo, por via de exemplos apenas.
DEFINIÇÕES
[058] Antes de um debate das modalidades detalhadas da invenção ser fornecido, é fornecida uma definição dos termos específicos relacionados aos aspectos principais da invenção.
[059] Em geral, todos os termos técnicos específicos aqui usados serão entendidos como a pessoa versada os entenderia no contexto técnico presente.
[060] rhGH ou hGH ou GH ou resíduo de hGH referem-se ao hormônio de crescimento humano. NH-hGH é um resíduo de hGH, em que -NH- do -NH-hGH representa um grupo amino de hGH.
[061] O termo "atividade" aqui é entendido como a habilidade do hormônio de crescimento ou um conjugado do mesmo para evocar uma resposta biológica quando administrado a um mamífero, por exemplo, em um modelo in vivo, ou para produzir uma resposta mensurável em um modelo in vitro como descrito nos exemplos.
[062] Em um sistema de profármaco, a atividade medida terá duas contribuições, uma da entidade de fármaco livre liberada e uma do conjugado de profármaco ainda não clivado. Para diferenciar a atividade do conjugado de profármaco, o termo "atividade residual" aqui é entendido como a porção da atividade de profármaco medida que pode ser atribuída ao conjugado de profármaco.
[063] O termo "autoclivagem" aqui é entendido como clivagem hidrolítica limitativa em taxa da ligação entre o ligante transiente e o rhGH da molécula de fármaco em uma solução tamponada aquosa sob condições fisiológicas de pH 7,4 e 37°C. Autoclivagem não requer a presença de enzima. Esta autoclivagem ou auto-hidrólise é controlada por um grupo de indução de autoclivagem que faz parte da molécula do profármaco. Este grupo de indução de autoclivagem pode estar presente como tal ou em uma forma mascarada de forma que desmascaramento é requerido antes do mecanismo de auto-hidrólise poder iniciar-se.
[064] Taxa de auto-hidrólise do ligante refere-se à taxa de clivagem de um profármaco Peguilado de hGH in vivo. Como efeitos enzimáticos ou outros quase sempre fazem a hidrólise do ligante do profármaco prosseguir in vivo mais rapidamente que in vitro, é definido que um profármaco de PEG de hGH cliva em uma maneira auto- hidrolítica se a meia-vida in vivo do profármaco for até 5 vezes mais curta que a meia-vida in vitro do conjugado de profármaco Peguilado de hGH correspondente.
[065] Os termos "ligação transiente" ou "ligante transiente" aqui são entendidos como descrevendo a labilidade da ligação entre PEG e rhGH em um profármaco Peguilado de rhGH. RhGH é liberado do profármaco correspondente com uma meia-vida do ligante in vivo em tais ligações transientes, até 1200 horas.
[066] O termo "conjugado" aqui é entendido como uma ou mais moléculas de PEG covalentemente ligadas ao fármaco aqui sendo hormônio de crescimento humano.
[067] O termo "conjugado transiente" refere-se aos profármacos Peguilado de hGH contendo pelo menos uma ligação transiente.
[068] O termo "conjugado permanente" refere-se aos conjugados ou profármacos Peguilado de hGH onde o polímero de PEG é conectado ao hGH por meio de ligações com uma meia-vida in vitro de pelo menos 3000 horas.
[069] Meia-vida in vitro ou meia-vida do ligante in vitroé a Depuração de 50% de hGH do profármaco Peguilado de hGH em tampão a pH 7,4 e 37°C.
[070] Os termos "meia-vida in vivo" ou "meia-vida do ligante in vivo"são entendidos como o intervalo de tempo em que 50% da proporção inicial do hormônio de crescimento são liberados da administração do profármaco Peguilado de hGH ao corpo humano, calculado levando em conta a meia-vida do conjugado correspondente do composto como descrito no exemplo 2.
[071] O termo "meia-vida do conjugado"é entendido como o intervalo de tempo em que 50% de um conjugado permanente Peguilado de hGH como definido acima é depurado da circulação sanguínea.
[072] O termo "lipoatrofia" aqui é entendido como um termo médico para perda localizada de tecido gorduroso. No contexto presente, "lipoatrofia" refere-se à lipoatrofia do sítio de injeção que significa lipólise do tecido que ocorre na proximidade rente do sítio de injeção.
[073] O termo "profármaco"aqui é entendido ser qualquer composto que sofre transformação antes de exibir seus efeitos farmacológicos totais. Classificação dos sistemas de profármaco é dada sob definições de IUPAC (http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac/medchem, acessado em 8 de março de 2004):
PROFÁRMACO
[074] Um profármaco é qualquer composto que sofre biotransformação antes de exibir seus efeitos farmacológicos. Profármacos podem ser, desse modo, vistos como fármacos contendo grupos protetores não-tóxicos especializados usados de uma maneira transiente para alterar ou eliminar as propriedades indesejáveis na molécula de origem.
PROFÁRMACO DUPLO (OU PRÓ-PROFÁRMACO)
[075] Um profármaco duplo é uma molécula biologicamente inativa que é transformada in vivo em duas etapas (enzimática e/ou quimicamente) para as espécies ativas.
PROFÁRMACO LIGADO AO VEÍCULO (PROFÁRMACO DE VEÍCULO)
[076] Um profármaco ligado ao veículo é um profármaco que contém uma ligação temporária de uma substância ativa dada com um grupo de veículo transiente que produz propriedades fisicoquímicas melhoradas ou farmacocinéticas e que pode ser facilmente removido in vivo, usualmente por uma clivagem hidrolítica.
PROFÁRMACO EM CASCATA
[077] Um profármaco em cascata é um profármaco para o qual a clivagem do grupo de veículo torna-se eficaz apenas após desmascaramento de um grupo ativador.
BIOTRANSFORMAÇÃO
[078] Biotransformação é a conversão química de substâncias por organismos vivos ou preparações enzimáticas.
[079] Correspondentemente, um grupo de indução de auto- hidrólise em cascata torna-se efetivo apenas após desmascaramento de certos elementos estruturais indutores de auto-hidrólise. Pode haver uma ou mais etapas de desmascaramento em cascata requeridas para revelar os elementos estruturais indutores de auto-hidrólise. Pelo menos uma das etapas de desmascaramento pode ser com base em uma etapa de biotransformação.
[080] O termo "uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz clínica humana in vivo de um profármaco Peguilado de hormônio de crescimento humano recombinante (rhGH)" é para ser entendido como uma quantidade que é suficientemente alta para obter um efeito clínico desejado em um ser humano após administração da composição farmacêutica ao humano - por exemplo, um efeito clínico desejado em relação ao tratamento de uma doença relacionada ao GH. No contexto presente, a pessoa versada é habitualmente capaz de ajustar a quantidade de profármaco Peguilado de hormônio de crescimento humano recombinante (rhGH) a ser administrado para adquirir um efeito clínico desejado.
[081] O termo "condição fisiológica"aqui é entendido como qualquer condição in vitro ou in vivo, idêntica ou parecida, às condições de pH e temperatura no corpo humano. Mais especificamente, condições fisiológicas estão referindo às condições por volta de pH 7,4 (pH 6,8 a pH 7,8) e cerca de 37°C (35°C a 40°C).
[082] O termo "ligante"é frequentemente usado em publicações no campo de bioconjugação e amplamente descreve estruturas químicas usadas para conectar duas entidades moleculares. Tal conectividade pode ser de natureza permanente ou transiente.
[083] Um ligante transiente é um ligante em que a conjugação de fármaco para molécula de PEGR é reversível. Isto implica que a clivagem do ligante libera o fármaco em sua forma nativa e ativa. Para estruturalmente diferenciar uma unidade de ligante transiente do veículo de polímero pode ser difícil no caso de profármacos de veículo, particularmente se o polímero for ligado permanentemente ao ligante e o produto de degradação liberado do ligante não for liberado, portanto, como consequência da clivagem do profármaco. Caracterização estrutural de um ligante é desafiante até mesmo mais se o ligante for funcionar tanto como um grupo de indução de autoclivagem como uma unidade de ramificação. Portanto, dentro do significado da presente invenção, o termo ligante pode ser usado de modo sinônimo com uma combinação de um grupo funcional La e um grupo de indução de autoclivagem Ga. Em casos onde os profármacos de veículo são descritos onde o veículo é um PEG ramificado, prefere-se usar descrições estruturais com base nas combinações de La e Ga. Em tal caso, o grupo de indução de clivagem Gaé considerado fazer parte do polímero de veículo. Variação da natureza química de Ga permite a engenharia das propriedades das propriedades de autoclivagem de um profármaco ligado a veículo correspondente em maior proporção.
[084] O termo "ligante permanente" refere-se a um conjugado de PEG para um grupo amino primário doado do hGH por formação de uma amida alifática ou carbamato alifático. Se os reagentes de PEGuilação convencionais forem usados, os conjugados resultantes são usualmente muito estáveis contra hidrólise e a taxa de clivagem da ligação de amida ou de carbamato seria muito lenta para utilidade terapêutica em um sistema de profármaco. Não obstante, tais conjugados de ligante permanente são úteis para a investigação da utilidade terapêutica de um conjugado de profármaco visto que eles permitem a avaliação da atividade residual.
[085] Se tais ligações estáveis forem empregadas em uma abordagem de profármaco, a clivagem do grupo funcional não é possível em um prazo terapeuticamente útil sem catálise enzimática.
[086] O termo "profármaco solúvel em água"significa um profármaco que é solúvel em água sob condições fisiológicas. Tipicamente, um profármaco solúvel em água transmitirá pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 95%, de luz transmitida pela mesma solução após filtração. Em uma base de peso, um polímero solúvel em água preferivelmente será pelo menos cerca de 35% (em peso) solúvel em água, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 50% (em peso), ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 70% (em peso), ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 85% (em peso), ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% (em peso) ou completamente solúvel em água.
[087] O termo "PEG" ou "resíduo de PEGuilação" é aqui usado exemplar aos polímeros solúveis em água adequados caracterizados por unidades de repetição. Polímeros adequados podem ser selecionados do grupo que consiste em polímeros de polialquilóxi, ácido hialurônico e derivados dos mesmos, poli(álcoois vinila), polioxazolinas, polianidridos, poli(orto) ésteres, policarbonatos, poliuretano, poli(ácidos acrílicos), poliacrilamidas, poliacrilatos, polimetacrilatos, poliorganofosfazenos, polissiloxanos, polivinilpirrolidona, policianoacrilatos, e poliésteres.
[088] Cadeias de PEG podem consistir em uma metade de interconexão, uma metade de polímero, e um grupo final.
[089] No caso de monoconjugados ramificados de profármacos Peguilado de hGH, a distância crítica define a distância mais curta entre o sítio de ligação da cadeia de PEG S0 a La e a primeira estrutura de ramificação BS1 medida como átomos conectados.
[090] O termo "carga de PEG"é aqui entendido como um descritor da massa molecular de uma cadeia polimérica que consiste em várias unidades de repetição ligadas ao hGH. Carga de PEG total é entendida como a massa molecular total de todas cadeias de veículo poliméricas ligadas ao hGH em uma base molecular.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA COMPREENDENDO EXCIPIENTES FARMACÊUTICOS ADEQUADOS
[091] Como conhecido à pessoa versada uma composição farmacêutica compreende excipientes e/ou veículos farmaceuticamente aceitáveis.
[092] "Farmaceuticamente aceitável" é significado abranger qualquer excipiente e/ou aditivo que não interfere com a efetividade da atividade biológica do ingrediente ativo e que, não é tóxico ao hospedeiro ao qual é administrado.
[093] Em uma modalidade preferida, a composição farmacêutica é uma composição para administração subcutânea, administração intramuscular ou injeção intravenosa. Estes são exemplos de rotas de administração preferidas para tratamento de um distúrbio/doença relevante como descritos aqui.
[094] A composição farmacêutica pode compreender outros ingredientes ativos que um profármaco Peguilado de rhGH como descrito aqui.
HORMÔNIO DE CRESCIMENTO HUMANO RECOMBINANTE (rhGH)
[095] Uma vez que o GH humano recombinante é idêntico, em sequência, ao GH humano natural, o termo hormônio de crescimento humano recombinante (rhGH) refere-se aqui também aos assim chamados equivalentes biogenéricos. Desse modo, os termos rhGH e hGH podem ser usados sinonimicamente dentro do significado da presente invenção.
[096] O termo "biogenéricos" aqui são formas genéricas entendidas de biofarmacêuticos; moléculas desenvolvidas usando processos biológicos, usualmente através de atividade de biotecnologia moderna. Farmacêuticos químicos genéricos podem ser definidos como aquelas moléculas que, quando comparadas com o produto originador: têm atividade essencialmente similar, são em essência quimicamente idênticos às suas contrapartes marcadas com ferro, são bioequivalentes, alcançam autorização de mercado através de um procedimento abreviado seguindo expiração da patente.
[097] Como conhecido pela pessoa versada, é hoje trabalho rotineiro fazer, por exemplo, alterações de amino secundárias de uns biológicos de interesse (aqui GH) sem afetar a atividade dos biológicos significativamente.
[098] Além do humano recombinante e biogenéricos, o termo hormônio de crescimento humano recombinante (rhGH) refere-se aqui também a todos os possíveis polipeptídeos de rhGH.
[099] Uma descrição precisa de possíveis polipeptídeos de rhGH é dada no WO-A 2005/079838 da Pharmacia Corporation fornecida na página 15, parágrafo 43 até, e incluindo, parágrafo 53.
[0100] O termo "polipeptídeo ou proteína de hGH de hGH", quando aqui usado, abrange todos os polipeptídeos de hGH, preferivelmente de espécies mamíferas, mais preferivelmente da espécie humana e murina, como também suas variantes, análogos, ortólogos, homólogos, e derivados, e fragmentos dos mesmos que são caracterizados por promover crescimento na fase de crescimento e manter a composição corporal normal, assimilação, e metabolismo de lipídio.
[0101] O termo "polipeptídeo ou proteína de hGH" preferivelmente refere-se ao polipeptídeo de hGH de 22 kDa tendo uma sequência como revelada em A. L. Grigorian et al., Protein Science (2005), 14, 902-913 como também suas variantes, homólogos e derivados que apresentam essencialmente a mesma atividade biológica (promover o crescimento na fase de crescimento e manter a composição corporal normal, assimilação, e metabolismo de lipídio). Mais preferivelmente, o termo "polipeptídeo ou proteína de hGH" refere-se ao polipeptídeo tendo a sequência acima mencionada.
[0102] Derivados de hGH especialmente abrangem conjugados de profármaco de hGH compreendendo polímeros permanentemente ligados, como PEG, isto é, o profármaco da presente invenção pode compreender além de um ou mais conjugados de polímero de ligante transiente outros conjugados de polímero de ligante permanente.
[0103] O termo "variantes de polipeptídeo de hGH", como aqui usado, refere-se aos polipeptídeos das mesmas espécies mas diferindo de um polipeptídeo de hGH de referência. Em geral, as diferenças são limitadas de forma que as sequências de aminoácido da referência e a variante são estritamente similares no geral e, em muitas regiões, idênticas. Preferivelmente, os polipeptídeos de hGH são pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticos a um polipeptídeo de hGH de referência, preferivelmente o polipeptídeo de hGH tendo uma sequência como indicada em A. L. Grigorian et al., Protein Science (2005), 14, 902-913. Por um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido pelo menos, por exemplo, 95% "idêntica"a uma sequência de aminoácido de consulta, é intencionado que a sequência de aminoácido do polipeptídeo sujeito seja idêntica à sequência de consulta exceto que a sequência de polipeptídeo em questão pode incluir até cinco alterações de aminoácido por cada 100 aminoácidos da sequência de aminoácido de consulta. Estas alterações da sequência de referência podem ocorrer nas posições terminais amino ou carbóxi da sequência de aminoácido de referência ou em qualquer lugar entre aquelas posições terminais, entremeada individualmente entre os resíduos na sequência de referência ou em um ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência. A sequência de consulta pode ser uma sequência de aminoácido inteira da sequência de referência ou qualquer fragmento especificado como descrito aqui.
[0104] Tais variantes de polipeptídeo de hGH podem ser variantes de ocorrência natural, tais como variantes alélicas de ocorrência natural codificadas por uma de várias formas alternadas de um hGH ocupando um locus dado em um cromossomo de um organismo, ou isoformas codificadas por variantes splice de ocorrência natural que originam de uma transcrição primária simples. Alternativamente, uma variante de polipeptídeo de hGH pode ser uma variante que não é conhecida ocorrer naturalmente e que pode ser feita usando técnicas de mutagênese conhecidas na técnica.
[0105] É conhecido na técnica que um ou mais aminoácidos podem ser deletados do término N ou término C de um peptídeo ou proteína bioativos sem perda substancial da função biológica (vide, por exemplo, Ron et al., (1993), Biol Chem., 268 2984-2988 em que a descrição é por este meio incorporada por referência em sua totalidade).
[0106] Será também reconhecido por alguém de habilidade usual na técnica que algumas sequências de aminoácido dos polipeptídeos de hGH podem ser variadas sem efeito significativo da estrutura ou função da proteína. Tais mutantes incluem deleções, inserções, inversões, repetições, e substituições selecionadas de acordo com as regras gerais conhecidas na técnica para ter pequeno efeito na atividade. Por exemplo, orientação no tocante como fazer substituições de aminoácido silenciosas fenotipicamente silenciosas são fornecidas em Bowie et al. (1990), Science 247:1306-1310, por este meio incorporada por referência em sua totalidade, em que os autores indicam que há duas abordagens principais para estudar a tolerância de uma sequência de aminoácido para alterar.
[0107] O primeiro método conta com o processo de evolução em que as mutações ou são aceitas ou rejeitadas por seleção natural. A segunda abordagem usa engenharia genética para introduzir as alterações de aminoácido nas posições específicas de um hGH clonado e seleções ou triagens para identificar sequências que mantêm a funcionalidade. Estes estudos revelaram que as proteínas são surpreendentemente tolerantes às substituições de aminoácido. Os autores também indicam que as alterações de aminoácido são prováveis de serem permissivas em uma certa posição da proteína. Por exemplo, os resíduos de aminoácido mais enterrados requerem cadeias laterais não-polares, enquanto que poucas características de cadeias laterais de superfície são em geral conservadas. Outras tais substituições fenotipicamente silenciosas são descritas em Bowie et al., (1990) supra, e as referências citadas nela.
[0108] Tipicamente visto como substituições conservadoras são as substituições, um pelo outro, entre os aminoácidos alifáticos Ala, Val, Leu e Phe, troca dos resíduos de hidroxila Ser e Thr, troca dos resíduos acídicos Asp e Glu, substituição entre os resíduos de amida Asn e Gln, troca dos resíduos básicos Lys e Arg e substituições entre os resíduos aromáticos Phe, Tyr. Além disso, os grupos seguintes de aminoácidos em geral representam alterações equivalentes: (1) Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Thr; (2) Cys, Ser, Tyr, Thr; (3) Val, Ile, Leu, Met, Ala, Phe; (4) Lys, Arg, His; (5) Phe, Tyr, Trp, His.
[0109] O termo polipeptídeo de hGH também abrange todos os polipeptídeos de hGH codificados pelos análogos de hGH, ortólogos, e/ou homólogos da espécie. Como aqui usado, o termo "análogos de hGH" refere-se aos hGHs de organismos diferentes e não relacionados que executam as mesmas funções em cada organismo, mas que não originaram de uma estrutura ancestral que os antepassados dos organismos tiveram em comum. Do contrário, hGHs análogos surgiram separadamente e depois mais tarde evoluíram para executar a mesma função (ou funções similares). Em outras palavras, polipeptídeos de análogos de hGH são polipeptídeos com sequências de aminoácido bastante diferentes mas que executam a mesma atividade biológica, a saber, promover o crescimento na fase de crescimento e manter a composição corporal normal, assimilação, e metabolismo de lipídio. Como aqui usado, o termo "ortólogos de hGH" refere-se aos hGHs dentro de duas espécies diferentes cujas sequências estão relacionadas uma com a outra por meio de um hGH homólogo comum em uma espécie ancestral mas que evoluiu para ficar diferente uma da outra. Como aqui usado, o termo "homólogos de hGH" refere-se aos hGHs de organismos diferentes que executam as mesmas funções em cada organismo e que originam de uma estrutura ancestral que os antepassados dos organismos tiveram em comum. Em outras palavras, polipeptídeos de homólogos de hGH são polipeptídeos com sequências de aminoácido bastante similares que executam a mesma atividade biológica, a saber, promover o crescimento na fase de crescimento e manter a composição corporal normal, assimilação, e metabolismo de lipídio. Preferivelmente, homólogos de polipeptídeo de hGH podem ser definidos como polipeptídeos exibindo pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade a um polipeptídeo de hGH de referência, preferivelmente o polipeptídeo de hGH tendo uma sequência como mencionada acima.
[0110] Desse modo, um polipeptídeo de hGH pode ser, por exemplo: (i) um em que um ou mais dos resíduos de aminoácido são substituídos com um resíduo de aminoácido conservado ou não- conservado (preferivelmente um resíduo de aminoácido conservado) e tal resíduo de aminoácido substituído pode ou não ser codificado pelo código genético: ou (ii) um em que um ou mais dos resíduos de aminoácido incluem um grupo de substituinte: ou (iii) um em que o polipeptídeo de hGH é fundido em outro composto, tal como um composto para aumentar a meia-vida do polipeptídeo (por exemplo, polietileno glicol): ou (iv) um em que os aminoácidos adicionais são fundidos com a forma acima do polipeptídeo, tal como um peptídeo da região de fusão Fc de IgG ou sequência líder ou secretória ou uma sequência que é empregada para purificação da forma acima do polipeptídeo ou uma sequência de pró-proteína.
[0111] Polipeptídeos de hGH podem ser monômeros ou multímeros. Multímeros podem ser dímeros, trímeros, tetrâmeros ou multímeros compreendendo pelo menos cinco unidades de polipeptídeo monomérico. Multímeros podem também ser homodímeros ou heterodímeros. Multímeros podem ser o resultado de associações hidrofóbicas, hidrófilas, iônicas e/ou covalentes e/ou podem ser ligados indiretamente, por exemplo, por formação de lipossoma. Em um exemplo, associações covalentes estão entre as sequências heterólogas contidas em uma proteína de fusão que contém um polipeptídeo de hGH ou fragmento do mesmo (vide, por exemplo, Patente US 5.478.925, cuja descrição é por este meio incorporada por referência em sua totalidade). Em outro exemplo, um polipeptídeo de hGH ou fragmento do mesmo é unido a um ou mais polipeptídeos que podem ser polipeptídeos de hGH ou polipeptídeos heterólogos através de ligantes de peptídeo tais como aqueles descritos na US 5.073.627 (por este meio incorporada por referência).
[0112] Outro método para preparar polipeptídeos de hGH de multímeros envolve uso de polipeptídeos de hGH fundido em uma sequência de polipeptídeo de zíper de leucina ou zíper de isoleucina conhecida promover multimerização das proteínas em que eles são encontrados usando técnicas conhecidas àqueles versados na técnica incluindo os ensinamentos do WO 94/10308. Em outro exemplo, os polipeptídeos de hGH podem ser associados através de interações entre a sequência de polipeptídeo Flag® contida nos polipeptídeos de hGH de fusão contendo sequência de polipeptídeo Flag®. Multímeros de hGH podem também ser gerados usando técnicas químicas conhecidas na técnica tais como reticulação usando moléculas de ligante e técnicas de otimização do comprimento das moléculas de ligante conhecidas na técnica (vide, por exemplo, US 5.478.925), técnicas conhecidas na técnica para formar uma ou mais reticulações intermoléculas entre os resíduos de cisteína localizados dentro da sequência dos polipeptídeos desejados a serem contidos no multímero (vide, por exemplo, US 5.478.925, adição de cisteína ou biotina ao término C ou término N do polipeptídeo de hGH e técnicas para gerar multímeros contendo um ou mais destes polipeptídeos modificados (vide, por exemplo, US 5.478.925), ou quaisquer das 30 técnicas para gerar lipossomas contendo multímeros de hGH (vide, por exemplo, Patente US 5.478.925,) cujas descrições são incorporadas por referência em suas totalidades.
[0113] Como aqui usado, o termo "fragmento de polipeptídeo de hGH" refere-se a qualquer peptídeo ou polipeptídeo compreendendo um comprimento contíguo de uma parte da sequência de aminoácido de um polipeptídeo de hGH, preferivelmente o polipeptídeo tendo a sequência supracitada.
PROFÁRMACO PEGUILADO DE rhGH - CADEIAS POLIMÉRICAS DE PEG PREFERIDAS
[0114] Como debatido acima, o profármaco Peguilado de rhGH como descrito aqui terá uma atividade relativamente baixa.
[0115] Consequentemente, em uma modalidade preferida a carga de PEG total por molécula de hormônio de crescimento soma pelo menos 25 kDa. Em geral a carga de PEG total será menos de 1000 kDa. Preferivelmente, a carga de PEG é pelo menos 25 kDa e no máximo 500 kDa, até mesmo mais preferivelmente pelo menos 30 kDa e no máximo 250 kDa, até mesmo mais preferivelmente pelo menos 30 kDa e no máximo 120 kDa, até mesmo mais preferivelmente pelo menos 40 kDa e no máximo 100 kDa, até mesmo mais preferivelmente pelo menos 40 kDa e no máximo 90 kDa.
[0116] PEG pode ser ligado ao hGH através de um ou mais pontos de fixação. No caso de um ponto de fixação, PEG correspondente no monoconjugado do profármaco de PEG de hGH será ramificado e conterá pelo menos 3 cadeias. No caso de mais de um ponto de fixação, tal como em um bisconjugado, o PEG correspondente no profármaco de PEG de hGH pode ser ramificado ou linear. Bisconjugados podem conter uma ou duas ligações transientes, e PEG pode ser linear ou ramificado ou pode conter uma mistura de uma cadeia linear e uma ramificada. No caso de o bisconjugado conter uma ligação transiente e uma cadeia linear e uma ramificada, a ligação transiente pode ser em qualquer cadeia. No caso de uma cadeia de PEG ramificado ser usada, pode haver uma ou mais unidades de ramificação.
[0117] Um PEG ramificado é uma molécula de PEG que consiste em um ponto de ramificação que conecta duas ou mais cadeias de PEG, para formar uma molécula com um ponto de fixação para ligação ao hormônio de crescimento. Este poderia ser duas cadeias de PEG de 20 kDa unidas para formar uma molécula de PEG de 40 kDa ramificado. No caso onde a molécula contém dois ou três pontos de ramificação, a molécula é referida ao PEG com 3 e 4 braços, respectivamente.
[0118] Em resumo e dentro das restrições mencionadas acima, o polímero de PEG não é limitado a uma estrutura particular e pode ser linear, ramificado, ou com vários braços (por exemplo, PEG aforquilhado ou PEG ligado a um núcleo de poliol), dendrítico, ou com ligantes degradantes.
[0119] Sem estar limitado à teoria, a carga de PEG é intencionada fornecer uma massa molecular adequada para adquirir a atividade relativamente baixa requerida e não tendo uma massa molecular muito alta da PEG que poderia criar outros problemas.
[0120] A PEGuilação para GH nativo humano pode ocorrer em vários grupos de lisina ou na amina N-terminal (F1) como bem descrito por Clark et al. (referência 2 aqui) na página 21973, tabela III. Altamente, reativos são as posições F1 e LYS-140. Posições moderadamente reativas são LYS-115, LYS-38, e LYS-70. Fracamente reativas são as posições LYS-172, LYS-41, LYS-158 e LYS-168.
[0121] Em termos mais gerais, o PEG aqui usado em combinação com um ligante transiente pode reduzir o risco de lipoatrofia por escolha adequada do dito polímero. Porém, os princípios da presente invenção também aplicam-se aos polímeros diferentes de PEG. Desse modo, o termo PEG é apenas aqui usado exemplar para polímeros adequados.
[0122] Desse modo, em uma modalidade preferida, profármaco de PEG de hGH é um monoconjugado conjugado com um de seus grupos amino primário a um grupo funcional autoclivável La para uma cadeia polimérica S0. Esta cadeia polimérica S0 tem um peso molecular de pelo menos 5 kDa e compreende pelo menos uma estrutura de ramificação BS1. A estrutura de ramificação BS1 compreende uma segunda cadeia polimérica S1 tendo um peso molecular de pelo menos 4 kDa.
[0123] Como esboçado acima, pelo menos uma terceira cadeia polimérica S2é requerida tendo um peso molecular de pelo menos 4 kDa. A cadeia polimérica S2 pode ser uma parte de BS1 ou pode ser uma outra ramificação de S0 ou S1 resultando em uma outra estrutura de ramificação BS2 compreendendo S2.
[0124] Opcionalmente mais que 3 cadeias poliméricas estão presentes no conjugado de profármaco da presente invenção, por exemplo, 4, 5, 6, 7, ou 8. Porém cada cadeia polimérica também tem um peso molecular de pelo menos 4 kDa. O número total de cadeias poliméricas é no máximo limitado pelo peso total do conjugado de profármaco sendo 1000 Da (sem hGH-NH).
[0125] Desse modo, uma modalidade preferida da presente invenção refere-se a uma composição, em que pelo menos uma das estruturas de ramificação BS1, BS2 compreende uma outra quarta cadeia polimérica S3 tendo um peso molecular de pelo menos 4 kDa ou uma de S0, S1, S2 compreende uma terceira estrutura de ramificação BS3 compreendendo a pelo menos quarta cadeia polimérica S3 tendo um peso molecular de pelo menos 4 kDa.
[0126] O grupo de indução de autoclivagem Ga que é necessário para a autoclivagem de Laé compreendido por uma das estruturas de ramificação ou cadeias poliméricas.
[0127] Opcionalmente, uma das estruturas de ramificação serve como grupo Ga de forma que a estrutura de ramificação consiste em Ga (em vez de compreender o dito grupo) que é também abrangido pelo termo "compreendendo".
[0128] A preparação de um conjugado de profármaco (AA) normalmente resulta em uma mistura de conjugados onde vários grupos amino primário de hGH são conjugados resultando em diferentes profármacos monoconjugados, diferentes biconjugados, diferentes triconjugados, etc. Profármacos de PEG de hGH monoconjugados, bisconjugados ou triconjugados correspondentes podem ser separados por métodos padrões conhecidos na técnica, como cromatografia de coluna e outros.
[0129] Em monoconjugados de profármacos de PEG de hGH, as pelo menos três cadeias poliméricas S0, S1, S2contêm uma "metade de polímero", que é caracterizada por uma ou mais unidades de repetição, que podem ser fortuitamente distribuídas em blocos ou alternadas. Além disso, as pelo menos três cadeias poliméricas S0, S1, S2 mostram um grupo terminal que é tipicamente um átomo de hidrogênio ou um grupo alquila tendo de 1 a 6 átomos de carbono que podem ser ramificados ou não ramificados, por exemplo, um grupo metila, especialmente para cadeias poliméricas com base em PEG resultando nos assim chamados mPEGs.
[0130] É salientado que as metades de polímero dentro das pelo menos três cadeias poliméricas S0, S1, S2 podem ter outros substituintes semelhantes à cadeia, originando das unidades de repetição e resultando em cadeias que têm menos de 4 kDa de peso molecular e que não são consideradas como cadeias poliméricas S0, S1, S2, etc. Preferivelmente, as pelo menos três cadeias poliméricas S0, S1, S2 carregam substituintes de menos que peso molecular de 1000 Da.
[0131] Uma característica estrutural relevante de S0é sua distância crítica. A distância crítica define a distância mais curta entre o sítio de ligação de S0 a La e a primeira estrutura de ramificação BS1 medida como átomos conectados. O comprimento da distância crítica tem um efeito na atividade residual como debatido para o composto 33. A distância crítica é preferivelmente menos que 50, mais preferido menos que 20, mais preferido menos que 10.
[0132] As pelo menos três cadeias poliméricas S0, S1 e S2 tipicamente cada contém uma metade de interconexão. Gaestá presente em pelo menos uma das metades de interconexão. Para cadeias poliméricas diferentes de S0, a metade de interconexão é o elemento estrutural conectando a metade de polímero, por exemplo, de S1 com BS1 e a metade de polímero de S2 com BS2. Para S0, a metade de interconexão é o elemento estrutural que conecta La e BS1.
[0133] Metades de interconexão podem consistir em uma cadeia C1 50 alquila que é ramificada ou não ramificado e que é opcionalmente interrompida ou terminada por heteroátomo ou grupos funcionais selecionados do grupo que consiste em -O-; -S-; N(R); C(O); C(O)N(R); N(R)C(O); um ou mais carbociclos ou heterociclos, em que R é hidrogênio ou uma cadeia de C1-20 alquila que é opcionalmente interrompida ou terminada por um ou mais dos átomos supracitados ou grupos que também têm um hidrogênio como átomo terminal; e em que um carbociclo é fenila; naftila; indenila; indanila; tetralinila; C3-10 cicloalquila; e em que o heterociclo é uma heterociclila de 4 a 7 elementos; ou heterobiciclila de 9 a 11 elementos.
[0134] "C3-10 cicloalquila" ou "anel de C3-10 cicloalquila" significam uma cadeia de alquila cíclica tendo 3 a 10 átomos de carbono que podem ter ligações duplas de carbono-carbono sendo pelo menos parcialmente saturada, por exemplo, ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclo-hexila, ciclo-hexenila, ciclo-heptila, ciclooctila, ciclononila, ciclodecila. Cada hidrogênio de um carbono de cicloalquila pode ser substituído por um substituinte. Os termos "C3-10 cicloalquila" ou "anel de C3-10 cicloalquila"também incluem biciclos ligados em ponte como norbonano ou norboneno.
[0135] "Heterociclila de 4 a 7 elementos" ou "heterociclo de 4 a 7 elementos" significam um anel com 4, 5, 6 ou 7 átomos no anel que podem conter até o número máximo de ligações duplas (anel aromático ou não aromático que é completa, parcialmente ou insaturado) em que pelo menos um átomo no anel até 4 átomos no anel são substituídos por um heteroátomo selecionado do grupo que consiste em enxofre (incluindo -S(O)-, -S(O)2-), oxigênio e nitrogênio (incluindo = N(O)-) e em que o anel é ligado ao resto da molécula por meio de um átomo de carbono ou nitrogênio. Exemplos para uns heterociclos de 4 a 7 elementos são azetidina, oxetano, tietano, furano, tiofeno, pirrol, pirrolina, imidazol, imidazolina, pirazol, pirazolina, oxazol, oxazolina, isoxazol, isoxazolina, tiazol, tiazolina, isotiazol, isotiazolina, tiadiazol, tiadiazolina, tetra-hidrofurano, tetra-hidrotiofeno, pirrolidina, imidazolidina, pirazolidina, oxazolidina, isoxazolidina, tiazolidina, isotiazolidina, tiadiazolidina, sulfolano, pirano, di-hidropirano, tetra- hidropirano, imidazolidina, piridina, piridazina, pirazina, pirimidina, piperazina, piperidina, morfolina, tetrazol, triazol, triazolidina, tetrazolidina, diazepano, azepina ou homopiperazina.
[0136] "Heterobiciclila de 9 a 11 elementos" ou "heterobiciclo de 9 a 11 elementos" significam um sistema heterocíclico de dois anéis com 9 a 11 átomos no anel onde pelo menos um átomo no anel é compartilhado por anéis e que pode conter até o número máximo de ligações duplas (anel aromático ou não aromático que é completa, parcialmente ou insaturado) em que pelo menos um átomo no anel até 6 átomos no anel são substituídos por um heteroátomo selecionado do grupo que consiste em enxofre (incluindo -S(O)-, -S(O)2-), oxigênio e nitrogênio (incluindo =N(O)-) e em que o anel é ligado ao resto da molécula por meio de um átomo de carbono ou nitrogênio. Exemplos para um heterobiciclo de 9 a 11 elementos são indol, indolina, benzofurano, benzotiofeno, benzoxazol, benzisoxazol, benzotiazol, benzisotiazol, benzimidazol, benzimidazolina, quinolina, quinazolina, di- hidroquinazolina, quinolina, di-hidroquinolina, tetra-hidroquinolina, deca-hidroquinolina, isoquinolina, deca-hidroisoquinolina, tetra- hidroisoquinolina, di-hidroisoquinolina, benzazepina, purina ou pteridina. O termo heterobiciclo de 9 a 11 elementos também inclui estruturas de espiro de dois anéis como 1,4-dioxa-8- azaespiro[4.5]decano ou heterociclos ligados em ponte como 8-aza- biciclo[3.2.1]octano.
[0137] O carbociclo, heterociclo e heterobiciclo podem ser substituídos por C1-20 alquila, opcionalmente interrompida ou terminada por heteroátomo ou grupos funcionais selecionados do grupo que consiste em -O-; -S-; N(R); C(O); C(O)N(R); N(R)C(O), em que R é hidrogênio ou uma cadeia de C1-10 alquila que é opcionalmente interrompida ou terminada por um ou mais dos átomos acima mencionado ou grupos que também têm um hidrogênio como átomo terminal.
[0138] A metade de polímero das pelo menos três cadeias S0, S1, S2 forma a parte maior das cadeias, preferivelmente pelo menos 90% do peso molecular de cada cadeia, mais preferido pelo menos 95%, até mesmo mais preferido pelo menos 97,5%, até mesmo mais preferido pelo menos 99%. Desse modo, a base das cadeias é representada pela metade de polímero.
[0139] Preferivelmente, as pelo menos três cadeias S0, S1, S2são independentemente com base em um polímero selecionado do grupo que consiste em polímeros de polialquilóxi, ácido hialurônico e derivados dos mesmos, poli(álcoois vinílicos), polioxazolinas, polianidridos, poli(orto) ésteres, policarbonatos, poliuretano, ácidos poliacrílicos, poliacrilamidas, poliacrilatos, polimetacrilatos, poliorganofosfazenos, polisiloxanos, polivinilpirrolidona, policianoacrilatos, e poliésteres.
[0140] Preferivelmente, as pelo menos três cadeias S0, S1, S2são com base no mesmo polímero. Preferivelmente, as pelo menos três cadeias S0, S1, S2são com base em polímeros de polialcóxi. Até mesmo mais preferido, as pelo menos três cadeias S0, S1, S2são com base em polietileno glicol.
[0141] O mesmo se aplica para outras cadeias S3, S4, S5, etc, consequentemente.
[0142] A cadeia S0 compreende uma estrutura de ramificação BS1, de forma que S1é ligada a S0. Para a ligação de S2, a estrutura de ramificação BS1 pode ser usada ou uma outra estrutura de ramificação BS2está presente, que pode ser uma parte de S0 ou S1. Consequentemente, outras estruturas de ramificação podem estar presentes, quando as cadeias também estiverem presentes. Por exemplo, no caso de uma cadeia S3 estiver presente, ela pode ser ligada a BS1, BS2 ou uma estrutura de ramificação BS3. A estrutura de ramificação BS3, se presente, pode fazer parte de S0, S1, ou S2.
[0143] Em geral, qualquer entidade química que permita a ramificação de uma cadeia pode ser usada. Preferivelmente, as estruturas de ramificação são independentemente selecionadas do grupo que consiste em pelo menos carbociclo substituído 3 vezes, pelo menos heterociclo substituído 3 vezes, um átomo de carbono terciário, um átomo de carbono quaternário, e um átomo de nitrogênio terciário, em que os termos carbociclo e heterociclo são definidos como indicados acima.
PROFÁRMACO PEGUILADO DE rhGH - ESTRUTURAS DE LIGANTE TRANSIENTE, La, Ga
[0144] Em publicações no campo de grupos de indução de autoclivagem são chamados às vezes ligantes para separar sua estrutura do veículo. Não obstante é frequentemente difícil claramente separar estas características estruturais. Portanto, dentro do significado da presente invenção, o grupo indução de clivagem Ga é considerado fazer parte do veículo S, compreendendo pelo menos S0, S1, S2, BS1, e opcionalmente BS2. Variação da natureza química de Ga permite a engenharia das propriedades das propriedades de autoclivagem de um profármaco ligado a veículo correspondente em maior proporção.
[0145] Como debatido acima, um profármaco Peguilado, em que o fármaco é por exemplo, rhGH como descrito no pedido de patente WO- A 2005/099768, e tem uma característica de Depuração, que é descrita na mesma como o sistema de 1,6-clivagem sem a produção de compostos aromáticos tóxicos. Neste documento é amplamente descrito aqui numerosas estruturas de ligante transientes adequadas relevantes para adquirir um perfil de Depuração relevante de interesse.
[0146] Outras estruturas de ligante transiente são geralmente/amplamente descritas, por exemplo, em outros pedidos de patente de GmbH de Biossistemas Complexos tais como WO-A 2005/034909, WO-A 2005/099768, WO-A 2006/003014 e WO-A 2006/136586.
[0147] Estruturas de ligante mais transiente são descritas amplamente, por exemplo, no WO-A 99/30727 (Enzon Inc).
[0148] Para solucionar os problemas presentes para GH como debatidos aqui, os inventores presentes selecionados estruturas de ligante transiente preferidas adequadas para adquirir as propriedades funcionais relevantes aqui descritas do profármaco Peguilado de rhGH. Com base na descrição detalhada aqui das estruturas de ligante preferidas está dentro do conhecimento da pessoa versada fazer outras estruturas de ligante transiente preferidas adequadas que poderiam dar um profármaco Peguilado de rhGH com as propriedades funcionais relevantes aqui descritas.
[0149] Especialmente, as estruturas de ligante transiente adequadas que são auto-hidrolisáveis (autociváveis)) podem ser selecionadas para incorporação em S0. As estruturas de ligante aqui selecionadas são descritas em detalhes abaixo.
[0150] Idealmente, um conjugado da invenção possuirá uma ou mais das características e/ou vantagens seguintes em conjugados ou formulações de rhGH atuais; pode ser facilmente sintetizado em rendimentos bons, tem queda de meia-vida dentro da faixa preferida, pode ser purificado para fornecer composições conjugadas homogêneas, exibe atividade após autoclivagem tal como atividade in vitro e in vivo e tem efeitos farmacodinâmicos superiores ao rhGH inalterado e conjugados de rhGH previamente descritos e não causa lipoatrofia. As estruturas aqui descritas exibem propriedades de Depuração como requeridas aqui.
[0151] Em geral, profármacos ligados a veículo requerem a presença de um grupo funcional clivável que conecta o fármaco e o veículo. Na ausência de grupos de indução de auto-hidrólise, grupos funcionais que envolvem um grupo amino doado pelo fármaco tal como amida alifática ou ligações de carbamato Lasão usualmente muito estáveis contra hidrólise e a taxa de clivagem da ligação de amida seria muito lenta para utilidade terapêutica em um sistema de profármaco.
[0152] Se tais ligações estáveis forem para ser usadas no profármacos ligados a veículo, clivagem do grupo funcional não é possível em um prazo terapeuticamente útil sem biotransformação. Nestes casos, o ligante exibe um motivo estrutural que é reconhecido como um substrato por uma enzima endógena correspondente. Em um tal caso, a clivagem da ligação funcional La envolve um complexo compreendendo a enzima. Exemplos são ligantes de peptídeo que são reconhecidos por proteases endógenas e clivados enzimaticamente.
[0153] Níveis de enzima podem diferir significativamente entre os indivíduos resultando na variação biológica da ativação do profármaco pela clivagem enzimática. Os níveis de enzima podem também variar, dependendo do sítio de administração. Por exemplo, é conhecido que no caso de injeção subcutânea, certas áreas do corpo rendem efeitos terapêuticos mais previsíveis que outras. Tal nível alto de variabilidade interpacientes não é desejável. Além disso, é difícil de estabelecer uma correlação in vivo-in vitro das propriedades farmacocinéticas para tais profármacos ligados ao portador dependente da enzima. Na ausência de uma otimização de correlação in vivo-in vitro segura, um perfil de Depuração se torna uma tarefa incômoda.
[0154] Para evitar variabilidade do sítio de injeção de paciente-para- paciente, é desejável empregar profármacos ligados a veículo que exibam cinética de clivagem em um prazo terapeuticamente útil sem o requerimento de contribuição enzimática adicional para clivagem. Especialmente para veículos de peso molecular alto, especificamente para veículos poliméricos ramificados, acesso ao grupo funcional de conexão La pode ser restringido pelas enzimas devido à aglomeração estérica. Portanto, existe uma necessidade de inventar profármacos ligados a veículo que exibam propriedades de autoclivagem.
[0155] Cinéticas de autoclivagem podem ser medidas por exemplo in vitro registrando as taxas de hidrólise na solução tamponada sem enzima.
[0156] Para introduzir labilidade hidrolítica nos grupos funcionais L tais como amidas ou carbamatos, é necessário engenheirar componentes químicos estruturais por exemplo, no veículo a fim de funcionar como grupos vizinhos em proximidade ao grupo funcional. Tais estruturas químicas de indução de autoclivagem que exercem controle na capacidade de clivagem da ligação de amida do profármaco são denominadas grupos de indução de autoclivagem Ga. Grupos de indução de autoclivagem podem ter um efeito forte sobre a taxa de hidrólise de um grupo funcional dado La.
[0157] La preferido são selecionados do grupo que consiste em C(O)-O-, e C(O)-, que formam junto com o grupo amino primário de hGH, um grupo carbamato ou amida.
[0158] Desse modo, uma composição da presente invenção é preferida, em que Laé selecionado do grupo que consiste em C(O)-O-, e C(O)-, que forma junto com o grupo amino primário de hGH, um grupo carbamato ou amida resultando na fórmula (AA1) ou (AA2)
Figure img0003
[0159] As seções seguintes listarão vários componentes estruturais que podem funcionar como grupos de indução de clivagem Ga.
[0160] O grupo Ga representa um grupo de indução de clivagem. Ga pode estar presente como tal ou como um grupo de indução de clivagem em cascata, que é desmascarado para tornar-se efetivo por meio de uma etapa de clivagem hidrolítica ou enzimática adicional. Se Ga estiver presente como tal, ele guia a auto-hidrólise de limitação de taxa de La.
Exemplos para Ga:
[0161] A. J. Garman et al. (A. J. Garman, S. B. Kalindjan, FEBS Lett. 1987, 223 (2), 361-365 1987) usaram PEG5000-anidrido maleico para a modificação reversível dos grupos amino em ativador de plasminogênio do tipo de tecido e urocinase. Regeneração de enzima funcional do conjugado de PEG-uPA sob incubação em tampão de pH 7,4 por clivagem da ligação do ácido malâmico seguiu a cinética de primeira ordem com uma meia-vida de 6,1 h.
[0162] Metades aromáticas simples podem inferir a labilidade para uma ligação de carbamato conectado (WO-A 01/47562). Por exemplo, grupo fluorenilmetila substituído ou insubstituído foi usado nas ligações de carbamato para labilizar os vários agentes bioativos em uma abordagem de profármaco (Tsubery et al. J Biol Chem 279 (2004) 38118-24). Duas cadeias de PEG foram ligadas a uma metade de fluorenila no WO-A 2007/075534.
[0163] Desse modo, Ga é um anel aromático ou fluorenilmetila diretamente liga a um grupo funcional carbamato La.
[0164] Consequentemente, uma composição da presente invenção é preferida, em que Gaé um anel aromático ou fluorenilmetila diretamente ligada a um grupo funcional carbamato formado por La e o grupo amino primário de hGH.
[0165] Alternativamente, transformação de Ga pode induzir um rearranjo molecular dentro de S0 tal como uma 1,4 ou 1,6-eliminação. O rearranjo torna La tanto mais lábil que sua clivagem é induzida. A transformação de Gaé a etapa limitativa de taxa no mecanismo de cascata. Idealmente, a taxa de clivagem da ligação temporária é idêntica à taxa de Depuração desejada para a molécula de fármaco em um cenário terapêutico dado. Em uma tal base de sistema de cascata em 1,6-eliminação, é desejável que a clivagem de La seja substancialmente instantânea após sua labilidade ter sido induzida por transformação de Ga. Além disso, é desejável que as cinéticas de clivagem limitativa de taxa prossigam em um prazo terapeuticamente útil sem o requerimento para contribuição enzimática adicional para evitar os inconvenientes associados à clivagem predominantemente enzimática debatida acima.
[0166] R. B. Greenwald, A. Pendri, C. D. Conover, H. Zhao, Y. H. Choe, A. Martinez, K. Shum, S. Guan, J. Med. Chem., 1999, 42, 36573667 & Pedido de Patente do PCT WO-A 99/30727 descreveram uma metodologia para sintetizar profármacos de poli(etileno glicol) de compostos contendo amino de molécula pequena com base em eliminação de 1,4 ou 1,6-benzila. Nesta abordagem, o grupo amino da molécula de fármaco é ligado por meio de um grupo carbamato a uma metade de benzila PEGuilada. O poli(etileno glicol) foi ligado ao grupo benzila por ligações de éster, carbonato, carbamato, ou amida. A Depuração de PEG da molécula de fármaco ocorre através de uma combinação de auto-hidrólise e clivagem enzimática. A clivagem do grupo de mascaramento de desencadeamento de Depuração é seguido nesta abordagem pela clássica e rápida eliminação de 1,4 ou 1,6- benzila. Este sistema de ligante foi também usado para conjugados de poli(etileno glicol) liberáveis de proteínas (S. Lee, R. B. Greenwald et al. Bioconj. Chem. 2001, 12 (2), 163-169). Lisozima foi usada como proteína modelo porque perde sua atividade quando PEGuilação acontece no grupo epsilon-amino dos resíduos de lisina. Várias quantidades de ligante de PEG foram conjugadas com a proteína. Regeneração da proteína nativa dos conjugados de PEG ocorreu em plasma de rato ou em tampão de pH alto não-fisiológico. Vide também F. M. H. DeGroot et al. (WO-A 2002/083180 e WO-A 2004/043493), e D. Shabat et al. (WO-A 2004/019993).
[0167] Desse modo, Laé um grupo funcional carbamato, a clivagem do dito grupo é induzida por um grupo hidroxila ou amino de Ga por meio de eliminação de 1,4 ou 1,6-benzila de S0, em que Gacontém ligações de éster, carbonato, carbamato, ou amida que sofrem transformação limitativa de taxa. Sob efeito, Ga pode ser clivado através de hidrólise.
[0168] Consequentemente, uma composição da presente invenção é preferida, em que La forma junto com o grupo amino de hGH um grupo funcional carbamato, a clivagem do dito grupo é induzida por um grupo hidroxila ou amino de Ga por meio de eliminação de 1,4 ou 1,6-benzila de S0, em que Gacontém ligações de éster, carbonato, carbamato, ou amida que sofrem transformação limitativa de taxa.
[0169] Ga pode conter um sistema de clivagem de cascata que é permitido para componentes de Ga que é composto de uma combinação estrutural que representa o precursor acima mencionado. Um precursor de Ga pode conter ligações temporárias adicionais tais como uma amida, éster ou um carbamato. A estabilidade, ou suscetibilidade à hidrólise da ligação temporária do precursor (por exemplo carbamato) pode ser guiada por propriedades auto-hidrolíticas ou pode requerer a atividade de uma enzima.
[0170] Antczak et al. (Bioorg Med Chem 9 (2001) 2843-48) descreveram um reagente que forma a base para um sistema de profármaco de cascata macromolecular por moléculas de fármaco contendo amina. Nesta abordagem, um anticorpo serve como o veículo, uma ligação estável conecta o anticorpo a um grupo ativador, carregando um grupo de mascaramento clivável. Sob remoção do grupo de mascaramento de ligação de éster, La cliva e libera o composto de fármaco.
[0171] D. Shabat et al. (Chem. Eur. 3. 2004, 10, 2626-2634) descreveram um sistema de profármaco polimérico com base em um grupo de ativação de ácido mandélico. Neste sistema, o grupo de mascaramento é ligado ao grupo ativador por uma ligação de carbamato. O grupo ativador é permanentemente conjugado a um polímero de poliacrilamida por meio de uma ligação de amida. Após ativação do grupo mascaramento por um anticorpo catalítico, o grupo mascaramento é clivado através de ciclização e o fármaco é liberado. O grupo ativador ainda é conectado ao polímero de poliacrilamida após Depuração do fármaco.
[0172] M.-R. Lee et al. descreveram (Angew. Chem. 2004, 116, 1707-17 10) um sistema de profármaco similar com base em grupo de ativação de ácido mandélico e grupo de mascaramento ligado a éster.
[0173] Não obstante, nestes ligantes uma etapa de 1,6-eliminação ainda gera um intermediário aromático altamente reativo. Até mesmo se a metade aromática permanecer permanentemente presa ao veículo polimérico, reações colaterais podem ser causadas com efeitos potencialmente tóxicos ou imunogênicos.
[0174] Greenwald et al. publicaram em 2000 um sistema de liberação de fármaco de poli(etileno glicol) de profármacos contendo amino com base em lactonização de trava de trimetila (R. B. Greenwald et al. J. Med. Chem. 2000, 43(3), 457-487; WO-A 02/089789). Neste sistema de profármaco, o ácido o-hidroxifenil-dimetilpropiônico substituído é acoplado aos grupos amino das moléculas de fármaco por uma ligação de amida. O grupo hidróxi é ligado a PEGR por um grupo éster, carbonato, ou carbamato. A etapa de determinação de taxa na liberação de fármaco é a clivagem enzimática destes grupos funcionais seguido por clivagem de amida rápida através de lactonização, liberando um produto secundário de lactona aromática.
[0175] Mais recentemente, R. B. Greenwald et al. (Greenwald et al. J. Med. Chem. 2004, 47, 726-734) descreveram um sistema de profármaco de PEG com base em ligante de amida de bis-(N-2- hidroxietil)glicina (amida de bicina). Neste sistema, duas moléculas de PEG são ligadas a uma molécula de bicina acoplada a um grupo amino da molécula de fármaco. As primeiras duas etapas na ativação do profármaco são a clivagem enzimática de ambas as moléculas de PEG. Ligações diferentes entre PEG e bicina são descritas resultando em cinética de ativação de profármaco diferente. A desvantagem principal deste sistema é a taxa de hidrólise lenta da amida de bicina conjugada com a molécula de fármaco (ty2 = 3 h em tampão de fosfato) resultando na liberação de um intermediário de profármaco modificado com bicina que pode mostrar propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas diferentes que a molécula de fármaco parental.
[0176] Mais especificamente, grupos preferidos La e Ga com metades de espaçador específicas para S0 são descritos abaixo.
[0177] Uma estrutura preferida de acordo com WO-A 2005/099768 é selecionada da fórmula geral (I) e (II):
Figure img0004
[0178] em que T representa hGH-NH; X representa uma metade de espaçador; Y1 e Y2 cada independentemente representam O, S ou NR6; Y3 representa O ou S; Y4 representa O, NR6 ou -C(R7)(R8); R3 representa uma metade selecionada do grupo que consiste em hidrogênio, grupos alquila ou heteroalquila lineares, ramificados ou cíclicos, substituídos ou insubstituídos, arilas, arilas substituídas, heteroarilas substituídas ou insubstituídas, grupos ciano, grupos nitro, halogênio, grupos carbóxi, grupos carboxialquila, grupos alquilcarbonila ou grupos carboxamidoalquila; R4 representa uma metade selecionada do grupo que consiste em hidrogênio, alquilas ou heteroalquilas lineares, ramificadas ou cíclicas, substituídas ou insubstituídas, arilas, arilas substituídas, heteroarila substituída ou insubstituída, alcóxis lineares, ramificados ou cíclicos, substituídos ou insubstituídos, heteroalquilóxis lineares, ramificados ou cíclicos, substituídos ou insubstituídos, arilóxis ou heteroarilóxis, grupos ciano e halogênio; R7 e R8são cada independentemente selecionados do grupo que consiste em hidrogênio, alquilas ou heteroalquilas lineares, ramificadas ou cíclicas, substituídas ou insubstituídas, arilas, arilas substituídas, heteroarilas substituídas ou insubstituídas, grupos carboxialquila, grupos alquilcarbonila, grupos carboxamidoalquila, grupos ciano, e halogênio; R6 representa um grupo selecionado de hidrogênio, alquilas ou heteroalquilas lineares, ramificadas ou cíclicas, substituídas ou insubstituídas, arilas, arilas substituídas e heteroarilas substituídas ou insubstituídas; R1 representa o resto de S0; W representa um grupo selecionado de alquilas lineares, ramificadas ou cíclicas, substituídas ou insubstituídas, arilas, arilas substituídas, heteroalquilas lineares, ramificadas ou cíclicas, substituídas ou insubstituídas, heteroarilas substituídas ou insubstituídas; Nu representa um nucleófilo; n representa zero ou um formador de imagem positivo; e Ar representa um hidrocarboneto aromático multissubstituído ou heterociclo aromático multissubstituído.
[0179] Dentro do significado da presente invenção, o grupo Laé representado por Y3 -C(Y5)NH- (junto com o grupo amino de hGH), Ga é representado por Nu-W-Y4-C(Y1)Y2 e Ar(R4)n-C(R3)XR1 representa S0, que também inclui pelo menos S1, S2, BS1 e opcionalmente BS2.
[0180] Em uma modalidade alternativa, S1é ligado por meio de Ar ou representa R3. Então o átomo de carbono adjacente a Y3 substituído com XR1 representa a estrutura de ramificação BS1, S1é terminado com Ar compreendendo Ga. É evidente que nesta modalidade, os termos S0 e S1são trocáveis.
[0181] Preferivelmente, na fórmula (AA) ou (AA1) S0é da fórmula (AAA1)
Figure img0005
em que
[0182] Ga tem o significado como indicado acima; S00é CH2; ou C(O);
[0183] S é uma cadeia de alquileno tendo de 1 a 20 átomos de carbono que são opcionalmente interrompidos ou terminados por um ou mais grupos, ciclos ou heteroátomos selecionados do grupo que consiste em heterociclo opcionalmente substituído; O; S; C(O); e NH;
[0184] BS1, BS2, BS3são independentemente selecionados do grupo que consiste em N; e CH.
[0185] S0B, S1Asão independentemente uma cadeia de alquileno tendo de 1 a 200 átomos de carbono que são opcionalmente interrompidos ou terminados por um ou mais grupos, ciclos ou heteroátomos selecionados do grupo que consiste em heterociclo opcionalmente substituído; O; S; C(O); e NH;
[0186]
Figure img0006
, em que cada n é independentemente um número inteiro de 100 a 500, cada n1 é independentemente 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8, e n2 é 0 ou 1.
[0187] S2, S3são independentemente hidrogênio; ou
Figure img0007
, em que cada n é independentemente um número inteiro de 100 a 500, cada n1 é independentemente 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8, e n2 é 0 ou 1, contanto que pelo menos um de S2, S3 seja diferente de hidrogênio;
[0188] R2, R3 são definidos como para a fórmula (A) abaixo.
[0189] O termo heterociclo significa um heterociclo como definido acima. Substituintes opcionais são, por exemplo, oxo (=O), onde o anel é pelo menos parcialmente saturado, uma cadeia de alquila ramificada ou não ramificada tendo de um a 6 átomos de carbono, ou halogênio. Um heterociclo substituído preferido é succinimida.
[0190] Preferivelmente, Ga na fórmula (AAA1) é OC(O)-R e R é a estrutura parcial da fórmula (I) como mostrada abaixo, em que R1, R4, R5 e n são definidos como dados abaixo.
[0191] Outra modalidade preferida é descrita no WO06136586A2. Consequentemente, as estruturas seguintes são preferidas:
Figure img0008
em que T é NH-hGH;
[0192] X é uma metade de espaçador tal como R13-Y1;
[0193] Y1 é O, S, NR6, succinimida, maleimida, ligações de carbono-carbono insaturadas ou qualquer heteroátomo contendo um par de elétron livre ou está ausente;
[0194] R13 é selecionado de alquila ou heteroalquila linear, ramificada ou cíclica, substituída ou não substituída, arilas, arilas substituídas, heteroarilas substituídas ou não substituídas;
[0195] R2 e R3 são independentemente selecionados de hidrogênio, grupos acila, ou grupos de proteção para grupos hidroxila;
[0196] R4 a R12 são independentemente selecionados de hidrogênio, X-R1, alquila ou heteroalquila linear, ramificada ou cíclica, substituída ou insubstituída, arilas, arilas substituídas, heteroarilas substituídas ou não substituídas, ciano, nitro, halogênio, carbóxi, carboxamida;
[0197] R1 é o resto de S0, compreendendo pelo menos S1, S2, BS1, e opcionalmente BS2.
[0198] Nesta modalidade, Laé um grupo amida, e Ga abrange a estrutura N-ramificada que carrega OR2/OR3.
[0199] Em ainda outra modalidade preferida, uma estrutura preferida é dada por um conjugado de profármaco D-L, em que -D é NH-hGH; e
[0200] -L é uma metade de ligante não-biologicamente ativa -L1 representada pela fórmula (I),
Figure img0009
em que
[0201] a linha pontilhada indica a ligação ao grupo amino de hGH formando uma ligação de amida;
[0202] X é C(R4R4a); N(R4); O; C(R4R4a)-C(R5R5a); C(R5R5a)- C(R4R4a); C(R4R4a)-N(R6); N(R6)-C(R4R4a); C(R4R4a)-O; ou O-C(R4R4a);
[0203] X1 é C; ou S(O);
[0204] X2 é C(R7, R7a); ou C(R7, R7a)-C(R8, R8a);
[0205] R1, R1a, R2, R2a, R3, R3a, R4, R4a, R5, R5a, R6, R7, R7a, R8, R8a são independentemente selecionados do grupo que consiste em H; e C1-4 alquila; ou
[0206] Opcionalmente, um ou mais dos pares R1a/R4a, R1a/R5a, R4a/R5a, R4a/R5a, R7a/R8a formam uma ligação química;
[0207] Opcionalmente, um ou mais dos pares R1/R1a, R2/R2a, R4/R4a, R5/R5a, R7/R7a, R8/R8asão unidos com os átomos ao estão ligados para formar uma C3-7 cicloalquila; ou heterociclila de 4 a 7 elementos;
[0208] Opcionalmente, um ou mais dos pares R1/R4, R1/R5, R1/R6, R4/R5, R7/R8, R2/R3são unidos com os átomos aos quais eles são ligados para formar um anel A;
[0209] Opcionalmente, R3/R3asão unidos ao átomo de nitrogênio ao qual eles estão ligados para formar um heterociclo de 4 a 7 elementos;
[0210] A é selecionado do grupo que consiste em fenila; naftila; indenila; indanila; tetralinila; C3-10 cicloalquila; heterociclila de 4 a 7 elementos; e heterobiciclila de 9 a 11 elementos; e
[0211] em que L1é substituído com um grupo L2-Z e opcionalmente também substituído, contanto que o hidrogênio marcado com o asterisco na fórmula (I) não seja substituído por um substituinte; em que
[0212] L2é uma ligação química simples ou um espaçador; e
[0213] Z é o resto de S0, compreendendo pelo menos S1, S2, BS1, e opcionalmente BS2.
[0214] Nesta modalidade Laé representada por um grupo amida e Gaé representado por N(H*)X1(O) e a cadeia que conecta a N incluindo os substituintes de N.
[0215] Conjugados de profármaco deste tipo são descritos no pedido de patente europeu 08150973.9.
[0216] Consequentemente, uma composição da presente invenção é preferida, em que La-S0é representado pela fórmula (AAA2),
Figure img0010
em que
[0217] a linha pontilhada indica a ligação ao grupo amino primário de hGH de forma que La e o grupo amino formam uma ligação de amida;
[0218]
Figure img0011
Figure img0012
[0219] X1é C; ou S(O);
[0220]
Figure img0013
[0221]
Figure img0014
são independentemente selecionados do grupo que consiste em H; e C1-4 alquila; ou
[0222] Opcionalmente, um ou mais dos pares R1a/R4a, R1a/R5a, R4a/R5a, R4a/R5a, R7a/R8a formam uma ligação química;
[0223] Opcionalmente, um ou mais dos pares R1/R1a, R2/R2a, R4/R4a, R /R5a, R /R7a, R /R8asão unidos com os átomos aos quais estão ligados para formar uma C3-7 cicloalquila; ou heterociclila de 4 a 7 elementos;
[0224] Opcionalmente, um ou mais dos pares R1/R4, R1/R5, R1/R , R4/R5, R7/R8, R2/R3são unidos com os átomos aos quais estão ligados para formar um anel A;
[0225] Opcionalmente, R3/R3asão unidos com o átomo de nitrogênio ao qual eles estão ligados para formar um heterociclo de 4 a 7 elementos;
[0226] A é selecionado do grupo que consiste em fenila; naftila; indenila; indanila; tetralinila; C3-10 cicloalquila; heterociclila de 4 a 7 elementos; e heterobiciclila de 9 a 11 elementos; e
[0227] em que S0é substituído com um grupo L2-Z e opcionalmente também substituído, contanto que o hidrogênio marcado com o asterisco na fórmula (I) não seja substituído por um substituinte; em que
[0228] L2é uma ligação química simples ou um espaçador; e
[0229] Z é da fórmula (AAA2a)
Figure img0015
em que
[0230]
Figure img0016
têm o significado como indicado para a fórmula (AAA1) acima.
[0231] "Alquila" significa uma cadeia de carbono reta ou ramificada. Cada hidrogênio de um carbono da alquila pode ser substituído por um substituinte.
[0232] "C1-4 alquila" significa uma cadeia de alquila tendo 1 - 4 átomos de carbono, por exemplo, se presente no término de uma molécula: metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, isobutila, sec-butila, terc-butila, ou por exemplo -CH2-, -CH2-CH2-, -CH(CH3)-, -CH2-CH2- CH2-, -CH(C2H5)-, -C(CH3)2-, quando duas metades de uma molécula forem ligadas pelo grupo alquila. Cada hidrogênio de um carbono da C14 alquila pode ser substituído por um substituinte.
[0233] "C1-6 alquila" significa uma cadeia de alquila tendo 1 - 6 átomos de carbono, por exemplo, se presente no término de uma molécula: C1-4 alquila, metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, isobutila, sec-butila; terc-butila, n-pentila, n-hexila, ou por exemplo -CH2- , -CH2-CH2-, -CH(CH3)-, -CH2-CH2-CH2-, -CH(C2H5)-, -C(CH3)2-, quando duas metades de uma molécula forem ligadas pelo grupo alquila. Cada hidrogênio de um carbono da C1-6 alquila pode ser substituído por um substituinte.
[0234] Consequentemente, "C1-18 alquila" significa uma cadeia de alquila tendo 1 a 18 átomos de carbono e "C8-18 alquila" significa uma cadeia de alquila tendo 8 a 18 átomos de carbono. Consequentemente, "C1-50 alquila" significa uma cadeia de alquila tendo 1 a 50 átomos de carbono.
[0235] "C2-50 alquenila" significa uma cadeia de alquenila ramificada ou não ramificada tendo 2 a 50 átomos de carbono, por exemplo se presente no término de uma molécula: -CH=CH2, -CH=CH-CH3, -CH2 - CH=CH2, -CH=CH-CH2-CH3, -CH=CH-CH=CH2, ou por exemplo, - CH=CH-, quando duas metades de uma molécula forem ligadas pelo grupo alquenila. Cada hidrogênio de um carbono da C2-50 alquenila pode ser substituído por um substituinte como também especificado. Consequentemente, o termo "alquenila" refere-se a uma cadeia de carbono com pelo menos uma ligação dupla de carbono-carbono. Opcionalmente, uma ou mais ligações triplas podem ocorrer.
[0236] "C2-50 alquinila" significa uma cadeia de alquinila ramificada ou não ramificada tendo 2 a 50 átomos de carbono, por exemplo, se presente no término de uma molécula: -C^CH, -CH2-C=CH, CH2-CH2- C=CH, CH2-C=C-CH3, ou por exemplo -C^C- quando duas metades de uma molécula forem ligadas pelo grupo alquinila. Cada hidrogênio de um carbono da C2-50 alquinila pode ser substituído por um substituinte como também especificado. Consequentemente, o termo "alquinila" refere-se a uma cadeia de carbono com pelo menos uma ligação tripla de carbono-carbono. Opcionalmente, uma ou mais ligações duplas podem ocorrer.
[0237] "C3-7 cicloalquila" ou "anel de C3-7 cicloalquila" significa uma cadeia de alquila cíclica tendo 3 a 7 átomos de carbono que podem ter ligações duplas de carbono-carbono sendo pelo menos parcialmente saturada, por exemplo, ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclo-hexila, ciclo-hexenila, ciclo-heptila. Cada hidrogênio de um carbono de cicloalquila pode ser substituído por um substituinte. O termo "C3-7 cicloalquila" ou "anel de C3-7 cicloalquila" também inclui biciclos ligados em ponte como norbonano ou norboneno. Consequentemente, "C3-5 cicloalquila" significa uma cicloalquila tendo 3 a 5 átomos de carbono.
[0238] Consequentemente, "C3-10 cicloalquila" significa uma alquila cíclica tendo 3 a 10 átomos de carbono, por exemplo, C3-7 cicloalquila; ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclo-hexila, ciclo-hexenila, ciclo- heptila, ciclo-octila, ciclononila, ciclodecila. O termo "C3-10 cicloalquila" também inclui pelo menos carbomono e biciclos parcialmente saturados.
[0239] "Halogênio" significa flúor, cloro, bromo ou iodo. É em geral preferido que o halogênio seja flúor ou cloro.
[0240] "Heterociclila de 4 a 7 elementos" ou "heterociclo de 4 a 7 elementos" significa um anel com 4, 5, 6 ou 7 átomos no anel que podem conter até o número máximo de ligações duplas (anel aromático ou não aromático que é completa, parcialmente ou insaturado) em que pelo menos um átomo no anel até 4 átomos no anel são substituídos por um heteroátomo selecionado do grupo que consiste em enxofre (incluindo - S(O)-, -S(O)2-), oxigênio e nitrogênio (incluindo =N(O)-) e em que o anel é ligado ao resto da molécula por meio de um átomo de carbono ou nitrogênio. Exemplos para um heterociclo de 4 a 7 elementos são azetidina, oxetano, tietano, furano, tiofeno, pirrol, pirrolina, imidazol, imidazolina, pirazol, pirazolina, oxazol, oxazolina, isoxazol, isoxazolina, tiazol, tiazolina, isotiazol, iso-tiazolina, tiadiazol, tiadiazolina, tetra- hidrofurano, tetra-hidrotiofeno, pirrolidina, imidazolidina, pirazolidina, oxazolidina, isoxazolidina, tiazolidina, isotiazolidina, tiadiazolidina, sulfolano, pirano, di-hidropirano, tetra-hidropirano, imidazolidina, piridina, piridazina, pirazina, pirimidina, piperazina, piperidina, morfolina, tetrazol, triazol, triazolidina, tetrazolidina, diazepano, azepina ou homopiperazina.
[0241] "Heterobiciclila de 9 a 11 elementos" ou "heterobiciclo de 9 a 11 elementos" significa um sistema heterocíclico de dois anéis com 9 a 11 átomos no anel onde pelo menos um átomo no anel é compartilhado pelos anéis e que pode conter até o número máximo de ligações duplas (anel aromático ou não aromático que é completa, parcialmente ou insaturado) em que pelo menos um átomo no anel até 6 átomos no anel são substituídos por um heteroátomo selecionado do grupo que consiste em enxofre (incluindo -S(O)-, -S(O)2-), oxigênio e nitrogênio (incluindo =N(O)-), e em que o anel é ligado ao resto da molécula por meio de um átomo de carbono ou nitrogênio. Exemplos para um heterobiciclo de 9 a 11 elementos são indol, indolina, benzofurano, benzotiofeno, benzoxazol, benzisoxazol, benzotiazol, benzisotiazol, benzimidazol, benzimidazolina, quinolina, quinazolina, di- hidroquinazolina, quinolina, di-hidroquinolina, tetra-hidroquinolina, deca-hidroquinolina, isoquinolina, deca-hidroisoquinolina, tetra- hidroisoquinolina, di-hidroisoquinolina, benzazepina, purina ou pteridina. O termo heterobiciclo de 9 a 11 elementos também inclui estruturas de espiro de dois anéis como de 1,4-dioxa-8- azaespiro[4.5]decano ou heterociclos ligados em ponte como 8-aza- biciclo[3.2.1]octano.
[0242] Preferivelmente, La-S0é selecionado do grupo que consiste em
Figure img0017
Figure img0018
[0243] em que R é H; ou C1-4 alquila; Y é NH; O; ou S; e R1, R1a, R2, R2a, R3, R3a, R4, X, X1, X2têm o significado como indicado acima.
[0244] Até mesmo mais preferido, La-S0é selecionado do grupo que consiste em
Figure img0019
Figure img0020
Figure img0021
Figure img0022
Figure img0023
em que
[0245] R tem o significado como indicado acima.
[0246] Pelo menos um (até quatro) hidrogênio é substituído por um grupo L2-Z. No caso de mais de um grupo L2-Z Westiver presente cada L2 e cada Z podem ser selecionados independentemente. Preferivelmente, apenas um grupo L2-Z está presente.
[0247] Em geral, S0 pode ser substituído com L2-Z em qualquer posição além da substituição do hidrogênio marcado com um asterisco nas fórmulas acima. Preferivelmente, um a quatro do hidrogênio dado por R, R1 a R8 diretamente ou como hidrogênio da C1-4 alquila ou outros grupos e anéis dados pela definição de R e R1 a R8é substituído por L2- Z.
[0248] Além disso, S0 pode ser opcionalmente também substituído. Em geral, qualquer substituinte pode ser usado até onde o princípio da clivagem não é afetado.
[0249] Preferivelmente, um ou mais outros substituintes opcionais são independentemente selecionados do grupo que consiste em halogênio; CN; COOR9; OR9; C(O)R9; C(O)N(R9R9a); S(O)2N(R9R9a); S(O)N(R9R9a); S(O)2R9; S(O)R9; N(R9)S(O)2N(R9aR9b); SR9; N(R9R9a); NO2; OC(O)R9; N(R9)C(O)R9a; N(R9)S(O)2R9a; N(R9)S(O)R9a; N(R9)C(O)OR9a; N(R9)C(O)N(R9aR9b); OC(O)N(R9R9a); T; C1-50 alquila; C2-50 alquenila; ou C2-50 alquinila, em que T; C1-50 alquila; C2-50 alquenila; e C2-50 alquinila são opcionalmente substituídas com um ou mais R10, que são os mesmos ou diferentes e em que C1-50 alquila; C2-50 alquenila; e C2-50 alquinila são opcionalmente interrompidos por um ou mais grupos selecionados do grupo que consiste em T, -C(O)O-; -O-; -C(O)-; -C(O)N(R11)-; -S(O)2N(R11)-; -S(O)N(R11)-; -S(O)2-; -S(O)-; - N(R11)S(O)2N(R11a)-; -S-; -N(R11)-; -OC(O)R11; -N(R11)C(O)-; - N(R11)S(O)2-; -N(R11)S(O)-; -N(R11)C(O)O-; -N(R11)C(O)N(R11a)-; e - OC(O)N(R11R11a);
[0250] R9, R9a, R9bsão independentemente selecionados do grupo que consiste em H; T; e C1-50 alquila; C2-50 alquenila; ou C2-50 alquinila, em que T; C1-50 alquila; C2-50 alquenila; e C2-50 alquinila são opcionalmente substituídos com um ou mais R10, que são os mesmos ou diferentes e em que C1-50 alquila; C2-50 alquenila; e C2-50 alquinila são opcionalmente interrompidas por um ou mais grupos selecionados do grupo que consiste em T, -C(O)O-; -O-; -C(O)-; -C(O)N(R11)-; - S(O)2N(R11)-; -S(O)N(R11)-; -S(O)2-; -S(O)-; -N(R11)S(O)2N(R11a)-; -S-; - N(R11)-; -OC(O)R11; -N(R11)C(O)-; -N(R11)S(O)2-; -N(R11)S(O)-; - N(R11)C(O)O-; -N(R11)C(O)N(R11a)-; e -OC(O)N(R11R11a);
[0251] T é selecionado do grupo que consiste em fenila; naftila; indenila; indanila; tetralinila; C3-10 cicloalquila; heterociclila de 4 a 7 elementos; ou heterobiciclila de 9 a 11 elementos, em que T é opcionalmente substituído com um ou mais R10, que são os mesmos ou diferentes;
[0252] R10é halogênio; CN; oxo (=O); COOR12; OR12; C(O)R12; C(O)N(R12R12a); S(O)2N(R12R12a); S(O)N(R12R12a); S(O)2R12; S(O)R12; N(R12)S(O)2N(R12aR12b); SR12; N(R12R12a); NO2; OC(O)R12; N(R12)C(O)R12a; N(R12)S(O)2R12a; N(R12)S(O)R12a; N(R12)C(O)OR12a; N(R12)C(O)N(R12aR12b); OC(O)N(R12R12a); ou C1-6 alquila, em que C1-6 alquila é opcionalmente substituída com um ou mais halogênios que são os mesmos ou diferentes;
[0253] R11, R11a, R12, R12a, R12bsão independentemente selecionados do grupo que consiste em H; ou C1-6 alquila, em que C1-6 alquila é opcionalmente substituída com um ou mais halogênios que são os mesmos ou diferentes.
[0254] O termo "interrompido" significa que entre dois carbonos é inserido um grupo no término da cadeia de carbono entre o carbono e o hidrogênio.
[0255] L2é uma ligação química simples ou um espaçador. No caso de L2 ser um espaçador, é preferivelmente definido como o um ou mais substituintes opcionais definidos acima, contanto que L2 seja substituído com Z.
[0256] Consequentemente, quando L2 for diferente de uma ligação química simples, L2-Z é COOR9; OR9; C(O)R9; C(O)N(R9R9a); S(O)2N(R9R9a); S(O)N(R9R9a); S(O)2R9; S(O)R9; N(R9)S(O)2N(R9aR9b); SR9; N(R9R9a); OC(O)R9; N(R9)C(O)R9a; N(R9)S(O)2R9a; N(R9)S(O)R9a; N(R9)C(O)OR9a; N(R9)C(O)N(R9aR9b); OC(O)N(R9R9a); T; C1-50 alquila; C2-50 alquenila; ou C2-50 alquinila, em que T; C1-50 alquila; C2-50 alquenila; e C2-50 alquinila são opcionalmente substituídos com um ou mais R10, que são os mesmos ou diferentes e em que C1-50 alquila; C2-50 alquenila; e C2-50 alquinila são opcionalmente interrompidas por um ou mais grupos selecionados do grupo que consiste em -T-, -C(O)O-; -O-; -C(O)- ; -C(O)N(R11)-; -S(O)2N(R11)-; -S(O)N(R11)-; -S(O)2-; -S(O)-; - N(R11)S(O)2N(R11a)-; -S-; -N(R11)-; -OC(O)R11; -N(R11)C(O)-; - N(R11)S(O)2-; -N(R11)S(O)-; -N(R11)C(O)O-; -N(R11)C(O)N(R11a)-; e - OC(O)N(R11R11a);
[0257] R9, R9a, R9bsão independentemente selecionados do grupo que consiste em H; Z; T; e C1-50 alquila; C2-50 alquenila; ou C2-50 alquinila, em que T; C1-50 alquila; C2-50 alquenila; e C2-50 alquinila são opcionalmente substituídos com um ou mais R10, que são os mesmos ou diferentes e em que C1-50 alquila; C2-50 alquenila; e C2-50 alquinila são opcionalmente interrompidas por um ou mais grupos selecionados do grupo que consiste em T, -C(O)O-; -O-; -C(O)-; -C(O)N(R11)-; - S(O)2N(R11)-; -S(O)N(R11)-; -S(O)2-; -S(O)-; -N(R11)S(O)2N(R11a)-; -S-; - N(R11)-; -OC(O)R11; -N(R11)C(O)-; -N(R11)S(O)2-; -N(R11)S(O)-; - N(R11)C(O)O-; -N(R11)C(O)N(R11a)-; e -OC(O)N(R11R11a);
[0258] T é selecionado do grupo que consiste em fenila; naftila; indenila; indanila; tetralinila; C3-10 cicloalquila; heterociclila de 4 a 7 elementos; ou heterobiciclila de 9 a 11 elementos, em que t é opcionalmente substituído com um ou mais R10, que são os mesmos ou diferentes;
[0259] R10é Z; halogênio; CN; oxo (=O); COOR12; OR12; C(O)R12; C(O)N(R12R12a); S(O)2N(R12R12a); S(O)N(R12R12a); S(O)2R12; S(O)R12; N(R12)S(O)2N(R12aR12b); SR12; N(R12R12a); NO2; OC(O)R12; N(R12)C(O)R12a; N(R12)S(O)2R12a; N(R12)S(O)R12a; N(R12)C(O)OR12a; N(R12)C(O)N(R12aR12b); OC(O)N(R12R12a); ou C1-6 alquila, em que C1-6 alquila é opcionalmente substituída com um ou mais halogênios, que são os mesmos ou diferentes;
[0260] R11, R11a, R12, R12a, R12bsão independentemente selecionados do grupo que consiste em H; Z; ou C1-6 alquila, em que C16 alquila é opcionalmente substituída com um ou mais halogênios, que são os mesmos ou diferentes;
[0261] contanto que um de R9, R9a, R9b, R10, R11, R11a, R12, R12a, R12b é Z.
[0262] Estruturas aromáticas até mesmo em geral mais preferidas são listadas abaixo.
Figure img0024
em que
[0263] NH-rhGH representa o resíduo de rhGH ligado ao ligante transiente;
[0264] R1, R2, R3, R4, e R5são selecionados independentemente de hidrogênio, metila, etila, propila, isopropila, butila, isobutila, butila terciária,
[0265] PEG representa o resíduo de PEGuilação ligado ao ligante transiente, e n = 1 ou 2, e
[0266] X é selecionado de C1 a C8 alquila ou C1 a C12 heteroalquila.
[0267] O termo "C1 a C12 heteroalquila" significa uma cadeia de alquila tendo 1 a 12 átomos de carbono que são opcionalmente interrompidos por heteroátomos, grupos funcionais, carbociclos ou heterociclos como definidos acima.
[0268] Em uma modalidade preferida, na fórmula (A) Laé representado pelo grupo carbamato ligado a rhGH, Gaé representado pelo grupo de oxigênio aromático, a carbonila ligada a este, e o substituinte ligado à carbonila como mostrado na fórmula I.
[0269] Estruturas mais preferidas são dadas pela fórmula geral I, que fazem parte da estrutura (A) dentro da estrutura do ligante aromático geral acima:
Figure img0025
[0270] e onde exemplos preferidos da fórmula I compreendem:
Figure img0026
[0271] Estruturas aromáticas mais preferidas da fórmula II, que fazem parte da estrutura (A) dentro da estrutura do ligante aromático geral acima:
Figure img0027
[0272] e onde exemplos preferidos da fórmula II compreendem:
Figure img0028
[0273] Fórmula e onde exemplos preferidos da fórmula que Il compreendem:
[0274] Estruturas mais preferidas da fórmula III, que fazem parte da estrutura (A) dentro da estrutura do ligante aromático geral acima, em que PEG-X é
Figure img0029
[0275] e PEG-W inclui os grupos de substituintes seguintes:
Figure img0030
[0276] Um exemplo de conjugados de profármaco preferidos é mostrado abaixo:
Figure img0031
Figure img0032
[0277]
Figure img0033
[0278] R é selecionado de hidrogênio, metila, etila, propila e butila,
[0279] X é selecionado de C1 a C8 alquila ou C1 a C12 heteroalquila.
[0280] Também nas modalidades preferidas e mais preferidas, PEGM significa preferivelmente o resto de S0, compreendendo pelo menos S1, S2, BS1 e opcionalmente BS2.
[0281] Em uma modalidade preferida, os profármacos da presente invenção são selecionados do grupo que consiste em
Figure img0034
em que
[0282] m é um número inteiro de 200 a 250 e n é um número inteiro de 100 a 125;
Figure img0035
em que
[0283] n é um número inteiro de 400 a 500;
Figure img0036
em que
[0284] n é um número inteiro de 400 a 500; e
Figure img0037
em que
[0285] n é um número inteiro de 400 a 500.
[0286] Profármacos da presente invenção podem ser preparados por métodos conhecidos na técnica. Porém especialmente para os compostos da fórmula (AA1), prefere-se construir a molécula de profármaco em uma síntese convergente fornecendo uma primeira molécula de precursor compreendendo um ou mais grupos tiol e um grupo carbonato ativado e uma segunda molécula de precursor compreendendo um grupo maleimida para reagir em uma reação de adição que resulta na formação de um grupo tio succinimida e reagir aquela molécula de precursor combinada com hGH para render um composto da fórmula (AA1).
[0287] Consequentemente, outro aspecto da presente invenção é um método para a preparação de um composto da fórmula hGH-NH- C(O)O-S0 (AA1), em que S0 tem o significado como indicado acima e compreende pelo menos um grupo
Figure img0038
[0288] o método compreende as etapas seguintes: (a) reagir um composto da fórmula ROC(O)O-S0'-SH (AA1') com um composto da fórmula (AA2'),
Figure img0039
[0289] em que R é um resto adequado para um grupo carbonato ativado e em que S0' e S0''são selecionados para render S0 compreendendo o pelo menos um grupo,
Figure img0040
[0290] resultando em um composto da fórmula ROC(O)O-S0, e (b) reagir o composto da fórmula ROC(O)O-S0 com hGH- NH2, em que hGH-NH2 representa hGH com um de seus grupos amino primários para render um composto da fórmula (AA1).
[0291] Grupos R adequados para os grupos funcionais carbonato incluem grupos alquila substituída ou carbocíclica ou heterocíclica, como arila ou cicloalquila, como o grupo pentafluorofenila ou NHS.
Ensaios para Determinar as Propriedades Funcionais de Profármaco Peguilado DE rhGH Atividade e Meia-vida do Conjugado
[0292] Para determinar a atividade e a meia-vida do conjugado de profármaco descrito aqui, é necessário sintetizar um conjugado "permanente", que não sofre auto-hidrólise - isto é, um conjugado permanente.
[0293] Isso é alcançado sintetizando uma molécula idêntica ao profármaco Peguilado de rhGH, além de modificar a parte da estrutura do ligante, que inicia a autoclivagem. Tal composto correspondente terá atividade residual e meia-vida circulante do conjugado idênticas às do profármaco Peguilado de rhGH. Mais em geral, para quaisquer profármacos conjugados de ligante transiente auto-hidrolisáveis (autoclivagem) pode ser previsto sintetizar uma molécula idêntica ao profármaco, separadamente para a habilidade de sofrer autoclivagem, fazendo modificação secundária na estrutura do ligante.
[0294] A razão para usar o conjugado correspondente é que se o ligante transiente auto-hidrolisável (autoclivagem) como descrito aqui for aplicado no ensaio mencionado no Exemplo 1, o conjugado começará de imediato obviamente a liberar fármaco inalterado que influenciará os resultados do ensaio. Em outras palavras, não é possível medir a atividade residual sem preparar um conjugado permanente visto que o fármaco nativo inalterado por exemplo, rhGH, será liberado e contribuirá para a atividade medida. Isso é óbvio para a pessoa versada.
[0295] Por este motivo como explicado, a atividade residual acima dos profármacos conjugados de ligante transiente auto-hidrolisáveis (autoclivagem) é expressada como a atividade dos conjugados permanentes correspondentes. Os conjugados permanentes são preparados em uma maneira similar aos profármacos conjugados de ligante transiente auto-hidrolisáveis (autoclivagem) (exemplos 20 ao 23), mas com uma modificação secundária na estrutura do ligante, de forma que o ligante já não pode sofrer autoclivagem. A preparação dos conjugados permanentes é descrita no Exemplo 10 ao Exemplo 19. De acordo com uma modalidade do profármaco Peguilado de rhGH da presente invenção como descrito aqui é caracterizado por: (1): quando PEG for ligado a rhGH no conjugado de profármaco, o profármaco tem uma atividade de GH que é menos que 5% do hormônio de crescimento nativo sem PEG para evitar lipoatrofia do lado da injeção; e (2): PEG é ligado a rhGH por meio de um ligante transiente auto-hidrolisável (autoclivagem), em que a taxa de auto-hidrólise do ligante é de modo que a meia-vida in vivoé de 10 horas a 600 horas.
[0296] O ensaio para determinar a propriedade (1) é descrito em detalhes no exemplo de trabalho 1 aqui. Com base nestas instruções detalhadas, é trabalho rotineiro para a pessoa versada medir esta atividade residual do profármaco.
[0297] Em uma modalidade preferida, a atividade residual da propriedade (1) é menos que 5%, mais preferivelmente menos que 3%, até mesmo mais preferivelmente menos que 1% e o mais preferivelmente virtualmente inativa.
[0298] O ensaio para determinar a propriedade (2) é descrito em detalhes no exemplo de trabalho 2 aqui. Com base nestas instruções detalhadas, é trabalho rotineiro para a pessoa versada medir esta taxa de autoclivagem do ligante transiente do profármaco.
[0299] Em uma modalidade preferida, a meia-vida in vivo da taxa de autoclivagem é de modo que a meia-vida in vivoé de 20 horas a 300 horas, mais preferivelmente de 20 horas a 150 horas, até mesmo mais preferivelmente de 50 a 75 horas e também até mesmo mais preferivelmente de 30 a 75 horas.
CORRELAÇÃO in vivo E in vitro
[0300] É conhecido dos pedidos de patente anteriores da companhia Ascendis Pharma (Complex Biosystems Company) que há correlação boa entre as taxas de clivagem do ligante in vitro e in vivo. Cinéticas de liberação in vivo podem ser facilmente prognosticadas dos dados experimentais in vitro.
LIPOATROFIA
[0301] Como descrito acima, lipoatrofia é lipólise que ocorre em proximidade estrita do sítio de injeção. Portanto, medição da lipólise in vitro do hormônio de crescimento e conjugados de hormônio de crescimento pode ser usada para estimar os efeitos da lipoatrofia dos conjugados.
[0302] Para determinar o efeito lipolítico do conjugado de profármaco descrito aqui, é necessário sintetizar um conjugado "permanente", que não sofre auto-hidrólise - isto é, um conjugado permanente.
[0303] O ensaio para determinar lipoatrofia é descrito em detalhe no exemplo de trabalho 3 aqui. Com base nestas instruções detalhadas é trabalho rotineiro para a pessoa versada medir lipoatrofia.
[0304] Em uma modalidade preferida, o conjugado de profármaco Peguilado de rhGH, como descrito aqui, tem um efeito de lipoatrofia que é comparável ao hormônio de crescimento humano, medido de acordo com o ensaio para determinar lipoatrofia do exemplo 3 e outras condições de regime de dosagem idênticas.
Doenças Relacionadas AO GH
[0305] O termo "uma doença relacionada ao GH" do segundo aspecto simplesmente aqui refere-se às doenças e condições onde um ser humano poderia se beneficiar do GH.
[0306] Esta inclui, mas não é limitada a, deficiência de hormônio de crescimento, deficiência de hormônio de crescimento de princípio adulto, síndrome de Turner, síndrome de Prader-Willi, síndrome de intestino curto, insuficiência renal crônica, pequeno para idade gestacional (SGA), definhamento por AIDS, antienvelhecimento, artrite reumatoide, estatura pequena idiopática, gene homeobox de estatura curta e somatopausa. Incluído é também outra condição de estatura curta que inclui síndrome de Noonan, displasia esquelética, síndrome de Down, estatura curta associada ao uso de esteroide prolongado, síndrome de Aarskog, entre outros.
[0307] Também inclusas são doença renal crônica, artrite reumatoide juvenil; fibrose cística, infecção de HIV em crianças que recebem tratamento de HAART (crianças de HIV/HALS); estatura curta em crianças nascidas com peso muito baixo ao nascimento (VLBW) mas SGA; displasia esquelética; hipocondroplasia; acondroplasia; estatura curta idiopática (ISS); GHD em adultos; fraturas em ou de ossos longos, tais como tíbia, fíbula, fêmur, úmero, rádio, ulna, clavícula, metacarpo, metatarso, e dígito; fraturas em ou de ossos esponjosos, tais como o crânio, base da mão, e base do pé; pacientes após cirurgia de tendão ou de ligamento, por exemplo, na mão, joelho, ou ombro; oteogênese de distração; distúrbios resultantes de substituição de quadril ou disco, reparo de menisco, fusões espinhais ou fixação de prótese, tal como no joelho, quadril, ombro, cotovelo, pulso ou mandíbula; distúrbios resultantes de fixar de material de osteossíntese, tal como unhas, parafusos e placas; não-união ou mal-união das fraturas; distúrbios resultantes de osteatomia, por exemplo da tíbia ou 1° dedo do pé; distúrbios resultantes da implantação de enxerto; degeneração de cartilagem articular no joelho causado por trauma ou artrite; osteoporose em pacientes com síndrome de Tuner; osteoporose em homens; pacientes adultos em diálise crônica (APCD); doença cardiovascular associada à mal nutrição em APCD; reversão de caquexia em APCD; câncer em APCD; doença pulmonar abstrativa crônica em APCD; HIV em APCD; ancião com APCD; doença hepática crônica em APCD, síndrome de fadiga em APCD; doença de Crohn; função hepática lesada; machos com infecções de HIV; síndrome do intestino curto; obesidade central; síndrome associada a HIV de lipodistrofia (HALS); infertilidade masculina; pacientes após cirurgia eletiva principal, destoxificação de álcool/droga ou trauma neurológico; envelhecimento; ancião débil; osteoartrite; cartilagem traumaticamente danificada; disfunção erétil; fibromialgia; distúrbios de memória; depressão; lesão de cérebro traumática; hemorragia subaraquinoide; peso muito baixo ao nascimento; síndrome metabólica; miopatia de glicocorticoide; e estatura curta devido ao tratamento de glicocorticoide em crianças.
Figuras
[0308] Nas figuras é mostrado o seguinte.
[0309] A figura 1 mostra análise de SDS-PAGE de conjugados de PEG-hGH permanentes purificados, em que Rota 1: Padrão de Proteína de Peso Molecular Alto Pré-tingida HiMark®; rota 2: composto 23; rota 3: composto 23; rota 4: composto 25; rota 5: composto 26, rota 6: composto 33; rota 7: composto 32; rota 8: composto 28; rota 9: composto 28; rota 10: composto 28; rota 11: composto 30; rota 12: composto 34; rota 13: composto 34; rota 14: composto 27; rota 15: composto 29.
[0310] A figura 2 mostra cromatograma por exclusão de tamanho da solução de reação extinta da síntese de conjugado 28 e cromatograma por exclusão de tamanho de 28 purificado
[0311] A figura 3 mostra purificação por cromatografia de troca de cátion do conjugado 35 e cromatograma por exclusão de tamanho de 35 purificado.
[0312] A figura 4 mostra purificação por cromatografia de troca de cátion do conjugado 36 e cromatograma por exclusão de tamanho de 36 purificado.
[0313] A figura 5 mostra purificação por cromatografia de troca de cátion do conjugado 37 e cromatograma por exclusão de tamanho de 37 purificado.
[0314] A figura 6 mostra cromatograma por exclusão de tamanho das amostras do conjugado 35 incubado em tampão a pH 7,4 e 37°C em vários pontos de tempo.
[0315] A figura 7 a 10 mostram conjugados de profármaco preferidos da presente invenção indicando S0, S1, S2, La, Ga, BS1, BS2, BS3 e a distância crítica.
[0316] A figura 11 mostra as curvas de resposta farmacodinâmicas do conjugado 36.
[0317] Em detalhes, as figuras 7 e 8 mostram estruturas exemplares 35 e 38 do tipo (AA1, AAA1), onde a cadeia polimérica de pelo menos 5 kDa de S0 compreendendo Ga e BS1 e BS2é marcada como S0; o grupo carbamato resultante de La e o grupo amino primário de hGH é marcado como La; BS1 compreende a cadeia polimérica de pelo menos 4 kDa marcada como S1, em que S1 compreende BS3 compreendendo a cadeia polimérica de pelo menos 4 kDa marcada como S3. BS2 compreende a cadeia polimérica de pelo menos 4 kDa marcada como S2. A distância crítica é dada através de 18 átomos para a A figura 7 e 4 átomos para a A figura 8.
[0318] Nas figuras 9 e 10, as estruturas exemplares do tipo (AA2, AAA2) são mostrados, em que o grupo amida resultante de La e o grupo amino primário de hGH são marcados como La e o resíduo ligado a La é marcado S0 compreendendo Ga e "PEG" representando o resto de S0 compreendendo pelo menos BS1, S1 e S2 (nem todos mostrados).
EXEMPLOS Métodos RP-HPLC Analítica e Preparativa
[0319] RP-HPLC/ESI-MS Analítica foi executada em equipamento de Waters que consiste em um gerenciador de amostra2695, um Detector de Absorbância Dual 2487, e um instrumento de ESI ZQ 4000 equipado com umas colunas de 5 μm Reprosil Pur 300 Â ODS-3 (75 x 1,5 mm) (Dr. Maisch, Ammerbuch, Alemanha; taxa de fluxo: 350 μL/min, gradiente típico: 10-90% de acetonitrila em água, 0,05% de TFA por 5 min).
[0320] Para RP-HPLC preparativa, um controlador Waters 600 e um Detector de Absorbância Dual 2487 foram usados equipados com as colunas seguintes (Reprosil Pur 300 Â ODS-3) A): 100x20 mm, taxa de fluxo 10 mL/min, gradiente típico: 10-90% de acetonitrila em água, 0,1% de TFA por 11 min ou B): 100x40mm (partículas de 10 μm), taxa de fluxo 40 mL/min, gradiente típico: 10-90% de acetonitrila em água, 0,1% de TFA por 11 min.
Cromatografia de Troca de Cátion
[0321] A purificação dos conjugados através de cromatografia de troca de cátion foi executada usando um sistema de ÃKTA Explorer (GE Healthcare) equipado com uma coluna Macrocap SP. O respectivo conjugado em 20 mM de tampão de acetato de sódio pH 4 foi aplicado à coluna que foi pré-equilibrada em 20 mM pH4 de tampão de acetato de sódio (tampão A). A coluna foi lavada com três volumes de coluna de Tampão A para remover qualquer reagente de PEG não reagido. Os conjugados foram eluídos usando um gradiente de 10-60% de tampão B (20 mM de acetato de sódio, 1 M de cloreto de sódio, pH 4,5) por 20 volumes de coluna ou 0-40% de tampão B por 20 volumes de coluna e depois 40-80% de B por três volumes de coluna. A taxa de fluxo foi 7 ml/min e o eluente foi monitorado por detecção a 280 nm.
Cromatografia de Troca de Ânion
[0322] A purificação dos conjugados através de cromatografia de troca de ânion foi executada usando um Sistema ÃKTA Explorer (GE Healthcare) equipado com uma Coluna Source Q. O respectivo conjugado em 20 mM de tampão de Tris/HCl pH 7,5 (tampão C) foi aplicado à coluna que foi preequilibrada em tampão C. A coluna foi lavada com três volumes de coluna de tampão C para remover qualquer reagente de PEG não-reagido. Os conjugados foram eluídos usando um gradiente de 0-20% de tampão D (20 mM de Tris/HCl, 1 M de cloreto de sódio, pH 7,5) por 25 volumes de coluna. A taxa de fluxo foi 5 ml/min e o eluente foi monitorado por detecção de UV a 280 nm. Alternativamente, o sistema de tampão 20 mM de bis-Tris/HCl, pH 6,5 (tampão E) e 20 mM de bis-Tris/HCl, 1 M de cloreto de sódio, pH 6,5 (tampão F) foi usado.
Cromatografia Analítica por Exclusão de Tamanho
[0323] Análise de cromatografia analítica por exclusão de tamanho foi executada em um sistema AKTA Explorer (GE Healthcare). As amostras foram analisadas usando uma coluna Superdex 200 ou Sepharose 6 (10 x 300 mm) e 20 mM de fosfato de sódio, 135 mM de cloreto de sódio, pH 7,4 foram usados como a fase móvel. A taxa de fluxo para a coluna foi 0,75 ml/min e o hGH eluído e conjugados de polímero-hGH foram detectados a 215 nm e 280 nm.
Determinação da Atividade dos Reagentes de Ligante de MPEG- LIGANTE Ativado por PFP
[0324] Uma quantidade definida de reagente de ligante de mPEG ativado por pfp (3-5 mg) foi dissolvida em 100 μL de ÁGUA. 10 μL de 0,5 M NaOH foram adicionados e a mistura de reação foi reagida por 60 min a 40°C. 1,5 μL de TFA foi adicionado e 10% desta mistura foram analisados por RP-HPLC analítica. Os cromatogramas foram registrados a 260 e 280 nm. O pico que corresponde ao pentafluorofenol foi integrado. Determinados valores foram comparados com uma curva de calibração apropriada gerada analisando as quantidades definidas de pfp por RP-HPLC analítica e integração de cromatograma registrada a 260 e 280 nm.
Análise de SDS-page
[0325] Os conjugados de mPEG-hGH permanentes foram analisados usando géis de Tris-Acetato NuPAGE® Novex (1,5 mm de espessura, 15 rotas), tampão de Operação de SDS de Tris-acetato NuPAGE, Padrão de Proteína de Peso Molecular Alto Pré-tingido HiMark® e Simply Blue® SafeStain (Invitrogen). Em cada rota 0,2-0,6 μg de conjugado é aplicado e a eletroforese e tingimento subsequentes executados de acordo com o protocolo do provedor.
EXEMPLO 1: Ensaio para medir atividade de profármaco Peguilado de hGH e de hGH
[0326] A atividade biológica de hGH é medida usando ensaios padrões conhecidos à pessoa versada na técnica. Como descrito na EP1715887B1 e como também debatido acima, a atividade biológica associada ao hGH nativo ou modificado (por exemplo, um hGH Peguilado), pode ser medida usando ensaios padrões de proliferação celular de FDC-P1, (Clark et al., Journal of Biological Chemistry 271: 21969-21977) ou ensaio de ligação de receptor (US5057417).
[0327] Na linha 8 (página 14) da patente EP1715887B1, é descrito que a atividade in vitro preferida tem que ser tão alta quanto possível, mais preferido que o hGH modificado tem atividade biológica in vitro equivalente ou melhorada. Na invenção atual, a atividade biológica tem de ser tão baixa quanto possível comparada ao hGH nativo. Desse modo, os inventores atuais fizeram completamente o oposto comparado à técnica anterior descrita na EP1715887B1.
Ensaio in vitro
[0328] As atividades in vitro dos conjugados permanentes de PEG- hGH descritos nos exemplos abaixo são determinadas usando um ou mais ensaios padrões para avaliar a atividade biológica in vitro. Ensaios padrões que podem ser empregados incluem ensaios de proliferação de célula usando, por exemplo, Células de FDC-PI (vide, por exemplo, Clark et al., Journal of Biological Chemistry, 271:21969-21977, 1996), ou células Ba/F3-hGHR que expressam receptores para hGH, hGH delta 135-146, ou células de linfoma de rato Nb2 que proliferam em resposta ao hGH por meio dos receptores lactogênicos (vide, por exemplo, Alam, K. S., et al., J. Biotech 2000, 28 de fevereiro, 78(1), 4959). Ensaios de ligação de receptor (vide, por exemplo, Pat. U. S. 5.057.417) podem também ser usados.
[0329] Nb2-11 é um clone da linhagem de linfoma de rato Nb-2 que foi derivado de um transplante de um linfoma que desenvolveu no nó do timo/linfa de um rato da cepa nobre (Nb) seguindo tratamento prolongado de estrogênio. As células são da origem de pré-células T e sua proliferação é dependente dos lactogênios mamíferos, tais como prolactina. Nb2-11 pode também ser mitogenicamente estimulado por IL-2. Injeção de células de Nb2 em ratos Nb dá origem a tumores malignos que são altamente sensíveis ao tratamento com alcaloides de vinca. Análise cariotípica mostrou que a linhagem celular tem apenas cinco anormalidades de cromossomo bem desenvolvidas. As células não expressam imunoglobulina de superfície, e sua dependência de lactogênios é confirmada. Protocolos para o uso de células Nb2-11 em bioensaios estão disponíveis de ECACC sob solicitação.
[0330] Como WO2006102659 descreve na página 74, parágrafo 240, exemplo 7, a atividade biológica de hGH e dos conjugados descritos aqui será avaliada in vitro usando um ensaio de proliferação de célula de linfoma de rato NB2-11. Brevemente, células NB2-1 derivadas de um linfoma de rato são incubadas com hGH que leva à ligação da molécula de hGH a seu receptor na superfície da célula. Ligação de receptor leva à cascata de transdução de sinal que resulta em proliferação das células. Resultados do ensaio estão com base no conteúdo de proteína determinado, e uma bioatividade de 100% de hGH inalterado.
Conclusão:
[0331] Com base nas instruções detalhadas deste exemplo 1 é trabalho rotineiro para a pessoa versada medir esta atividade residual do profármaco.
EXEMPLO 2: Ensaio para medir taxa de autoclivagem do ligante transiente do profármaco. Determinação da Meia-vida in vitro
[0332] Para determinação da taxa de clivagem do ligante in vitro dos conjugados de PEG-ligante-hGH, os compostos são dissolvidos em tampão em pH 7,4 (por exemplo 10 mM de fosfato de sódio, 140 mM de NaCl, 3 mM de EDTA) e a solução é filtrada através de um filtro de 0,22 μm e incubada a 37°C. As amostras são colhidas em intervalos de tempo e analisadas por RP-HPLC ou cromatografia por exclusão de tamanho a 215 nm. Picos que correspondem a hGH liberado são integrados e representados versus tempo de incubação. Software de ajuste de curva é aplicado para determinar as taxas de clivagem de primeira ordem.
Determinação de meia-vida in vivo ecorrelação de meia-vida in vitro/in vivo
[0333] Taxas de clivagem do ligante in vivosão determinadas comparando a farmacocinética dos conjugados permanentes de PEG- hGH com o respectivo conjugado transiente de PEG-ligante-hGH que carrega a mesma metade de PEG após injeção intravenosa em rato.
[0334] Primeiramente, conjugado permanente de PEG-hGH é intravenosamente injetado em ratos e as amostras de sangue são tiradas em intervalos de tempo, preparadas em plasma, e analisadas para hGH usando um ELISA.
[0335] Em segundo lugar, conjugado transiente de PEG-hGH é intravenosamente injetado em ratos, as amostras de sangue são tiradas em intervalos de tempo, preparadas em plasma, e analisadas para hGH usando um ELISA.
[0336] Meia-vida in vivoé calculada da razão da concentração de hGH de conjugado transiente dividida pela concentração determinada de hGH de conjugado permanente nos respectivos pontos de tempo e ajuste de curva. Os dados são comparados às medições de meia-vida in vitro.
Conclusão
[0337] Com base nas instruções detalhadas deste exemplo 2 é trabalho rotineiro para a pessoa versada medir a meia-vida in vivo do profármaco Peguilado de hGH.
EXEMPLO 3: Ensaio para medir lipoatrofia
[0338] Como dito acima composto PHA-794428 é um hGH Peguilado e descrito na patente EP1715887 da companhia Pharmacia. De acordo com www.clinicaltrials.gov, o estudo foi terminado em 10- dez-2007. Decisão de Pfizer (Pharmacia) para terminar o programa foi devido aos casos de lipoatrofia no sítio de injeção que foram relatados os estudos de Fase Clínica 2 após uma injeção sozinha de PHA 794428. Lipoatrofia é o termo que descreve a perda localizada de tecido gorduroso e é visível em seres humanos como orifícios na pele (visível a olho).
Ensaio
[0339] Há vários métodos in vitro descritos na técnica em lipoatrofia de medida. Uma proposta é descrita na publicação J. Anim. Sci (1972), 35: 794-800 (J. Machlin) na página 795. Outra descrição é encontrada em Int. J. Cancer; 80, 444 - 447 (1999).
[0340] Em geral, lipoatrofia pode ser medida como proposto abaixo.
[0341] Efeito lipolítico pode ser determinado usando um ensaio in vitro que consiste em adipócitos de mamífero isolados, adipócitos murinos preferíveis. Amostras a ser ensaiadas foram incubadas em condições fisiologicamente relevantes com um número predeterminado de adipócitos em tampão de bicarbonato de Krebs-Ringer que contém nutrientes apropriados por até 6 horas. A concentração de glicerol liberado é determinada através de métodos padrões, por exemplo, enzimaticamente ou por uma detecção radiométrica. As amostras de controle contendo adipócitos sozinhos são analisadas para determinar a liberação de glicerol espontânea.
[0342] O efeito lipolítico de hormônio de crescimento de humano recombinante inalterado nativo e hormônio de crescimento humano recombinante permanentemente Peguilado é comparado ao do hormônio de crescimento humano recombinante transientemente Peguilado.
Conclusão
[0343] Com base nas instruções detalhadas deste exemplo 3 é trabalho rotineiro para a pessoa versada medir o efeito de lipoatrofia. EXEMPLO 4: Síntese de reagente de ligante permanente 12a e reagentes de ligante transiente 12b e 12c Síntese do Composto 6
Figure img0041
[0344] 6-amino-hexan-1-ol (2,85 g, 24,3 mmols) foi dissolvido em HBr aq. (48%, 10 ml, 89 mmols) e agitado a 80°C por 3 h. HBr em excesso foi evaporado a 50-65°C e 1,99 KPa(15 Torr) e o resíduo foi secado a vácuo. 1: Rendimento 6,07g (96%) MS [M+H]+ = 180,3 g/mol (MW+H calculado = 180,0 g/mol)
[0345] DBU (3,5 ml, 23,2 mmols) foi adicionado a uma suspensão de bromato de 6-bromoexilamina 1 (3,03 g, 11,6 mmols) e trifenil- metanotiol (2,14 g, 7,74 mmols) em DCM (25 ml) e DMSO (13 ml) foi adicionado. A mistura de reação foi agitada por 30 min em temperatura ambiente e diluída com água (150 ml).
[0346] A camada aquosa foi extraída com éter e a fase orgânica combinada foi evaporada. 2 foi purificado por RP-HPLC. 2: Rendimento 1,17g (40%) MS [M+H]+ = 376,7 g/mol (MW+H calculado = 376,2 g/mol)
[0347] DBU (4,56 mL, 30,0 mmols) foi adicionado a ácido 6-bromo- hexanoico (3,90 g, 20,0 mmols) e trifenil-metanotiol (11,1 g, 40,0 mmols) em DCM (40 mL). Após agitar em temperatura ambiente por 1 h, 1 M H2SO4 gelado (50 ml) foi adicionado e a mistura foi extraída com DCM. A fase orgânica combinada foi secada em Na2SO4 e concentrada a vácuo. Composto 3 foi purificado através de cromatografia de coluna de sílica-gel (200 ml) usando heptano/acetato de etila (4/1, Rf = 0,2) como a fase móvel. 3: Rendimento 5,83 g (75%)
[0348] DMAP (37 mg, 0,31 mmol) foi adicionado a ácido 6- tritilsulfanil-hexanoico 3 (5,83 g, 14,9 mmols), tiazolidino-2-ona (3,56 g, 29,9 mmols), e diciclo-hexilcarbodiimida (3,08, 14,9 mmols) em DCM (100 mL). Após agitar em temperatura ambiente por 1 h, 1 M HCl (0,6 ml) foi adicionado e a mistura foi filtrada. O filtrado foi concentrado a vácuo e 4 foi purificado através de cromatografia de coluna de sílica-gel (180 ml) usando heptano/acetato de etila (1/1) como a fase móvel. 4: Rendimento 7,15 g (97%) como óleo amarelo
[0349] Uma solução de 1-(2-tioxo-tiazolidin-3-il)-6-tritilsulfanil- hexan-1-ona 4 (1,53 g, 3,11 mmols) em THF (13 ml) foi adicionada em um período de 2 min a 6-tritilsulfanil-hexilamina 2 (1,17 g, 3,11 mmols) em DMSO (1 ml) e THF (5 mL). Após adição de trietilamina (435 μL, 3,11 mmols), a mistura de reação foi agitada por 90 min em temperatura ambiente.
[0350] Éter (200 ml) e água (100 ml) foram adicionados e as fases separadas. Após extração da fase aquosa com éter as fases orgânicas combinadas foram secadas em Na2SO4 e concentradas a vácuo. Composto 5 foi purificado através de cromatografia de coluna de sílica- gel (150 ml) usando heptano/acetato de etila (2/1, Rf=0,1) como a fase móvel. 5: Rendimento 1,23 g (53%) MS [M+Na]+ = 770,6 g/mol (MW+Na calculado = 770,4 g/mol)
[0351] Sob nitrogênio, uma solução de 1 M de LiAlH4 em THF (1,2 ml, 4,8 mmols) foi colocada em um frasco seco, e uma solução de 5 (509 mg, 0,680 mmol) em 10 ml de THF foi adicionada por 4 min. A mistura foi agitada sob refluxo por 2 h, até conversão completa do material de partida ter sido mostrada através de cromatografia de camada fina (heptanos/acetato de etila 1:1). A mistura de reação foi extinguida cuidadosamente com uma suspensão de 10:1 de água em éter dietílico até que a evolução de gás tivesse parado. A mistura foi vertida em 50 ml de uma solução saturada de tartarato de potássio de sódio e agitada por 90 min. 90 ml de acetato de etila foram adicionados e as fases foram separadas. A fase aquosa foi extraída com acetato de etila (4 x 20 ml), e a fase orgânica combinada foi lavada com salmoura (30 ml), secada em MgSO4, filtrada, e concentrada para dar um óleo transparente. 6 foi adsorvido em sílica e purificado através de cromatografia instantânea (30 g sílica, CH2Cl2/MeOH 20:1 (v/v) + 0,1% de NEt3). O produto foi obtido como um óleo viscoso branco-sujo. 6: Rendimento 270 mg (54%) MS [M+H]+ = 734,4 g/mol (MW+H calculado = 734,4 g/mol) Rf = 0,28 (CH2Cl2/Me0H 19:1) Síntese do Composto 9
Figure img0042
[0352] AlCl3 (23,0 g, 172,3 mmols) foi adicionado a anidrido glutárico (10,0 g, 86,2 mmols) em anisol (85 mL, 781 mmols). A mistura de reação foi aquecida a 110°C por 2 h, esfriada para temperatura ambiente, vertida em 3 N de HCl/gelo e extraída com diclorometano. A fase aquosa foi extraída com diclorometano (4 x 20 ml), e as frações orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (30 ml), secadas em MgSO4, filtradas e concentradas para dar um óleo vermelho que foi recristalizado de tolueno. Produto 7 foi obtido como um sólido branco- sujo. 7: Rendimento 5,2 g (48%) MS [M+Na]+ = 245,8 (MW+Na calculado = 245,1 g/mol)
[0353] AlCl3 (9,0 mg, 68 mmols) foi adicionado a 7 (5,0 g, 23 mmols) em 1,2-dicloroetano. A mistura de reação foi agitada por 14 h a 85°C e subsequentemente esfriada para temperatura ambiente. 1 N de HCl gelado (50 ml) foi adicionado e a mistura foi extraída com acetato de etila (4 x 30 mL). As frações orgânicas combinadas foram secadas em Na2SO4, filtradas e concentradas a vácuo para dar para um sólido vermelho claro que foi usado na próxima etapa sem outra purificação. 8: Rendimento 3 g (62%) MS [M+H]+ = 209,1 (MW+H calculado = 209,1 g/mol)
[0354] Diciclo-hexilcarbodiimida (532 mg, 2,6 mmols), ácido 8 (403 mg, 1,9 mmol), HOSu (297 mg, 2,6 mmols), e colidina (1,0 mL, 7,8 mmols) em DCM (10 ml) foram agitados por 90 min em temperatura ambiente. Após remoção da diciclo-hexilureia através de filtração, amina 6 (947 mg, 1,3 mmol) em DCM (5 ml) e DIEA (450 μL, 2,6 mmols) foi adicionada ao filtrado e a mistura foi reagida por 14 h em temperatura ambiente. 1 N de H2SO4 (2 x 50 ml) foi adicionado e as fases foram separadas. A fase aquosa foi extraída com acetato de etila (4 x 20 ml), e a fase orgânica combinada foi lavada com salmoura (30 ml), secada em MgSO4, filtrada e concentrada a vácuo. Os resíduos foram purificados através de cromatografia de coluna de sílica-gel (150 ml) usando heptano/acetato de etila (1/2, Rf = 0,66) como a fase móvel. 9: Rendimento 819 mg (69%) MS [M+Na]+ = 946,4 (MW+Na calculado = 946,4 g/mol) Síntese de Reagente de Ligante Permanente 12A e Reagente de Ligante Transiente 12B E 12C
Figure img0043
[0355] 9 (1 eq., 175 mg, 0,19 mmol) foi dissolvido em THF seco (1,5 mL), p-nitrofenilcloroformato (1,1 eq., 42 mg, 0,21 mmol) e DIPEA (2 eq., 66 μl, 0,38 mmol) foi adicionado e a mistura foi agitada por 60 min em temperatura ambiente. Dietilamina (R1 = R2 = Et, 2 eq., 39 μl, 0,38 mmol) foi adicionado e agitação foi continuada por 15 min. O solvente foi removido a vácuo, 100 μl de AcOH foram adicionados e 10a foi purificado por RP-HPLC. MS [M+Na]+ = 1045,9 (MW+Na calculado = 1045,5 g/mol)
[0356] NaBH4 (5 eq., 37 mg, 0,95 mmol) foi adicionado a 10a contendo fração de HPLC (acetonitrila/H20 ~ 3/1 (v/v) + 0,1% de TFA) e a mistura foi reagida por 10 min em temperatura ambiente. Uma porção adicional de NaBH4 (5 eq., 37 mg, 0,95 mmol) foi adicionada e a mistura de reação foi agitada até conversão completa do material de partida fosse indicado por análise de LC/MS (10 min em temperatura ambiente). 11a foi purificado por RP-HPLC e liofilizado. 11a: Rendimento 95 mg (49% com base em 9) MS [M+Na+H]+ = 1047,7 (MW+Na calculado = 1047,5 g/mol)
[0357] 9 (1 eq., 175 mg, 0,19 mmol) foi dissolvido em THF seco (1,5 mL), p-nitrofenilcloroformato (1,1 eq., 42 mg, 0,21 mmol) e DIPEA (2 eq., 66 μl, 0,38 mmol) foi adicionado e a mistura foi agitada por 60 min em temperatura ambiente. N,N,N'-Trietil-etano-1,2-diamina (R1 = Et, R2 = 2- (dietilamino)etila, 2 eq., 68 μl, 0,38 mmol) foi adicionado e agitação foi continuada por 15 min. 100 μl de AcOH foi adicionado, o solvente foi removido a vácuo e 10b foi purificado por RP-HPLC e liofilizado. 10b: Rendimento 147 mg como sal de TFA (65%) MS [M+Na]+ = 1116,4 (MW+Na calculado = 1116,6 g/mol)
[0358] 10c foi sintetizado como descrito acima usando N,N,N'- trimetil-propano-1,3-diamina (R1 = Me, R2 = 3-(dimetilamino)propila, 56 μl, 0,38 mmol) como diamina. 10c: Rendimento 134 mg como sal de TFA (59%) MS [M+Na]+ = 1088,4 (MW+Na calculado = 1088,6 g/mol)
[0359] NaBH4 (46 mg, 1,2 mmol) foi adicionado a 10b (147 mg, 0,12 mmol) em MeOH/água = 95:5 (v/v) (3 ml) em duas doses e a mistura foi agitada por 1 h em temperatura ambiente. Após adição de AcOH (300 μl) e concentração, o produto 11 b foi purificado por RP-HPLC e liofilizado. 11 b: Rendimento 107 mg como sal de TFA (73%) MS [M+Na]+ = 1118,4 (MW+Na calculado = 1118,6 g/mol)
[0360] 11c foi sintetizado de acordo com o mesmo protocolo. 11c: Rendimento 65 mg como sal de HCl (54%) de 134 mg de material de partida MS [M+Na]+ = 1090,4 (MW+Na calculado = 1090,6 g/mol)
[0361] Sob uma atmosfera de nitrogênio, bis-pentafluorofenil- carbonato (2,5 eq., 25 mg, 63 μmols), DMAP (1 mg), e DIEA (5 eq., 22 μL, 127 μmols) foram adicionados a 11a (1 eq., 26 mg, 26 μmols) em acetonitrila seca (0,5 mL). A mistura de reação foi agitada por 30 min em temperatura ambiente, esfriada para 0°C, e acidificada com AcOH (200 μL). Produto 12a foi purificado por RP-HPLC e liofilizado. 12a: Rendimento 13 mg (42%) MS [M+Na]+ = 1258,2 (MW+Na calculado = 1257,5 g/mol)
[0362] 12b e 12c foram preparados consequentemente de 11 b (56 mg, 48 μmols) e 11c (88 mg, 73 μmols), respectivamente. 12b: Rendimento 63 mg como sal de TFA (93%) MS [M+H]+ = 1306,3 (MW+H calculado = 1306,6 g/mol) 12c: Rendimento 41 mg como sal de TFA (41%)
[0363] MS [M+H]+ = 1278,4 (MW+Na calculado = 1278,5 g/mol) EXEMPLO 5: Síntese do Reagente de Ligante Permanente 14A e Reagentes de Ligante Transiente 14C
Figure img0044
13a e 13c foram sintetizados como descrito no WO2005/099768A2.
[0364] Sob uma atmosfera de bispentafluorofenilcarbonato de nitrogênio (631 mg, 1,6 mmol), DMAP (20 mg, 0,16 mmol), e DIEA (556 μL, 3,2 mmols) foram adicionados a 13a (364 mg, 0,64 mmol) em acetonitrila seca (5 mL). A mistura de reação foi agitada por 15 min em temperatura ambiente, esfriada para 0°C, e acidificada com ácido acético (1 mL). Produto 14a foi purificado por RP-HPLC e liofilizado. 14a: Rendimento 379 mg (77%) MS [M+Na]+ = 800,4 (MW+Na calculado = 800,3 g/mol)
[0365] 14c foi preparado consequentemente de 13c (97 mg, 130 μmol). 14c: Rendimento 114 mg como sal de TFA (94%) MS [M+H]+ = 821,5 (MW+H calculado = 821,3 g/mol) EXEMPLO 6: Síntese do Reagente de Ligante Permanente 15
Figure img0045
[0366] Anidrido glutárico (0,41 mmol), amina 6 (200 mg, 0,27 mmol), DIPEA (72 μl, 0,41 mmol), e DMAP (11 mg, 0,09 mmol) foram agitados em acetonitrila (3 ml) por 2h em 80°C. A mistura foi esfriada para temperatura ambiente e ácido acético (200 μl) foi adicionado. Produto 15 foi purificado por RP-HPLC e liofilizado. 15: Rendimento 130 mg (57%) MS [M+Na]+ = 870,2 (MW+Na calculado = 870,4 g/mol) EXEMPLO 7: Síntese dos Reagentes de Ligante de MPEG Ativados
[0367] Materiais de partida de mPEG-maleimida:
Figure img0046
mPEG-maleimida 1A: MW = ca. 20 kDa (n = ca. 200-250) mPEG-maleimida 1 B: MW = ca. 40 kDa (n = ca. 400-500)
Figure img0047
mPEG-maleimida 2A: MW = ca. 20 kDa (n = ca. 200-250) mPEG-maleimida 2B: MW = ca. 40 kDa (n = ca. 400-500)
Figure img0048
mPEG-maleimida 3A: MW = ca. 40 kDa (n = ca. 100-125; m = ca. 200250) mPEG-maleimida 3B: MW = ca. 80 kDa (n = ca. 200-250; m = ca. 400500)
[0368] Resíduos de mPEG após reagir com o grupo tiol (R3 nas estruturas abaixo):
Figure img0049
resíduo de mPEG-succinimida 1AA: MW = ca. 20 kDa (n = ca. 200-250) resíduo de mPEG-succinimida 1BA: MW = ca. 40 kDa (n = ca. 400-500)
Figure img0050
resíduo de mPEG-succinimida 2AA: MW = ca. 20 kDa (n = ca. 200-250) resíduo de mPEG-succinimida 2BA: MW = ca. 40 kDa (n = ca. 400-500)
Figure img0051
resíduo de mPEG-succinimida 3AA: MW = ca. 40 kDa (n = ca. 100-125; m = ca. 200-250) resíduo de mPEG-succinimida 3BA: MW = ca. 80 kDa (n = ca. 200-250; m = ca. 400-500)
[0369] A linha pontilhada vertical denota o sítio de ligação para o grupo tiol na respectiva estrutura Síntese dos Reagentes de Ligante de MPEG Ativado por PFP Permanentes 17AA, 17AB, 17AC, 17AD, e Reagentes de Ligante de MPEG Reagentes Ativado por PFP Transientes 17B, 17CA, E 17CB
Figure img0052
[0370] Carbonato 12a (13 mg, 10 μmols) foi agitado em 10 μl de AcOH, 700 μL de HFIP, 1 μL de TFA e 2 μl de TES por 10 min em temperatura ambiente. Os componentes voláteis foram removidos em um fluxo de nitrogênio e 16a foi purificado por RP-HPLC. 16a: Rendimento 3,8 mg (5 μmols) MS [M+H]+ = 751,3 (MW+H calculado = 751,3 g/mol)
[0371] 16b e 16c foram preparados consequentemente de 12b (7,7 mg, 5,4 μmols) e 12c (2 mg, 1,5 μmol), respectivamente. 16b: Rendimento 2,5 mg (2,7 μmol) MS [M+Na]+ = 845,1 (MW+Na calculado = 844,3 g/mol) 16c: Rendimento 0,5 mg (0,6 μmol) MS [M+Na]+ = 816,6 (MW+Na calculado = 816,3 g/mol)
[0372] mPEG-maleimida 1B (NOF, Japão) (521 mg, 12,7 μmols) foi adicionado a 3,5 mg (3,9 μmols) de 16c em 4 mL de 3/1 (v/v) acetonitrila/água + 0,1% de TFA. 200 μL de 0,5 M de tampão de fosfato pH 7,4 foram adicionados e a mistura foi reagida por 10 min em temperatura ambiente. 1 μl (13 μmols) de mercaptoetanol foi adicionado e a mistura de reação foi acidificada para pH 4-5 por adição de TFA. 17 ca foi purificado por RP-HPLC e liofilizado. 17ca: Rendimento 220 mg (atividade de carbonato de pfp 82%)
[0373] 17cb foi sintetizado como descrito para 17ca usando 16c (3,5 mg, 3,9 μmols) e mPEG-maleimida 2B (656 mg, 16 μmols).
[0374] 17cb: Rendimento 130 mg (atividade de carbonato de pfp 85%)
[0375] 184 mg (8,8 μmols) de mPEG-maleimida 1A (NOF, Japão) foram adicionados a 16a (2,0 mg, 2,7 μmols) em 4 mL de 1/1 (v/v) acetonitrila/água + 0,1% de TFA. 200 μl de 0,5 M de tampão de fosfato foram adicionados pH 7,4 e a mistura foi reagida por 10 min em temperatura ambiente. 0,2 μl (1,6 μmol) de mercaptoetanol foi adicionado e a mistura de reação foi acidificada a pH 2-3 por adição de TFA. 17aa foi separado dos PEGs não-reagidos por RP-HPLC e liofilizados.
[0376] 17aa: Rendimento 90 mg (atividade de carbonato de pfp 88%)
[0377] 17ab foi sintetizado como descrito acima usando 16a (3,8 mg, 5,0 μmols) e 680 mg (16 μmols) de mPEG-maleimida 1B (NOF, Japão).
[0378] 17ab: Rendimento 250 mg (atividade de carbonato de pfp 83%)
[0379] 17ac foi sintetizado como descrito acima usando 16a (2,5 mg, 3,3 μmols) e 200 mg (9,5 μmols) de mPEG-maleimida 2A (Jenkem, PR China).
[0380] 17ac: Rendimento 80 mg (atividade de carbonato de pfp 80%)
[0381] 17ad pode ser sintetizado como descrito acima usando 16a e mPEG-maleimida 2B.
[0382] 17b pode ser sintetizado como descrito para 17cb usando 16b e mPEG-maleimida 1B. EXEMPLO 8: Síntese dos Reagentes de Ligante de MPEG Permanentes Ativados por PFP 19AA e 19AB e Reagente de Ligante de MPEG Permanente Transiente 19C
Figure img0053
[0383] Carbonato 14c (20 mg, 21 μmols) foi agitado em 10 μl de AcOH, 400 μL de HFIP, e 5 μL de TES por 10 min em temperatura ambiente e esfriado para 0°C. Acetonitrila/água gelados = 9/1 (v/v) foram adicionados e 18c foi separado por RP-HPLC e liofilizado.
[0384] 18c: Rendimento 5,0 mg como sal de TFA (7,2 μmols)
[0385] MS [M+H]+ = 579,6 (MW+H calculado = 579,2 g/mol)
[0386] 18a foi sintetizado como descrito acima usando carbonato 14a (24 mg, 31 μmols).
[0387] 18a: Rendimento 8,0 mg (15 μmols)
[0388] MS [M+H]+ = 536,2 (MW+H calculado = 536,5 g/mol)
[0389] 205 mg (5 μmols) de mPEG-maleimida 3A (NOF, Japão) foram adicionados a 18a (4,0 mg, 7,5 μmols) em 2 mL de 1/1 (v/v) acetontirila/água + 0,1% de TFA. 100 μL de 0,5 M de tampão de fosfato (pH 7,4) foram adicionados e a mistura foi reagida por 10 min em temperatura ambiente. A mistura de reação foi acidificada em pH 2-3 por adição de TFA e 19aa foi separada dos PEGs não-reagidos por RP- HPLC e liofilizada.
[0390] 19aa: Rendimento 125 mg (atividade de carbonato de pfp 85%)
[0391] 19ab foi preparado consequentemente de 410 mg (5 μmols) de mPEG-maleimida 3B (NOF, Japão) e 18a (4,0 mg, 7,5 μmols).
[0392] 19ab: Rendimento 265 mg (atividade de carbonato de pfp 87%)
[0393] 19c foi preparado consequentemente de 205 mg de mPEG- maleimida 3A e 18c (5 mg, 7,2 μmols)
[0394] 19c: Rendimento 120 mg (atividade de carbonato de pfp 88%) EXEMPLO 9: Síntese de Derivado de Éster de MPEG-NHS de 80 KDA Ramificado de 4 Braços Permanente 22
Figure img0054
[0395] Ácido 15 (12 mg, 14 μmols) foi agitado em 1 mL de TFA, 1 mL de DCM, e 10 μL de TES por 10 min em temperatura ambiente. Os componentes voláteis foram removidos em um fluxo de nitrogênio e o ditiol 20 foi purificado por RP-HPLC. 20: Rendimento 2,9 mg (8 μmols) MS [M+Na]+ = 386,8 (MW+ Na calculado = 386,2 g/mol)
[0396] 20 (1 mg, 2,8 μmols) em 170 μL de acetonitrila foi adicionado a mPEG-maleimida 1B (NOF, Japão) (380 mg, 9,2 μmols) em 4 mL de 1/1 (v/v) acetonitrila/água + 0,1% de TFA. 200 μL de 0,5 M de tampão de fosfato foram adicionados pH 7,4 e a mistura foi reagida por 10 min em temperatura ambiente. 0,6 μL (7,8 μmols) de mercaptoetanol foi adicionado e a mistura de reação foi acidificada para pH 4-5 por adição de TFA. O tampão foi trocado para 0,005% de HCl (coluna de dessalgação HiPREP, 26/10 GE Healthcare) e 21 foi liofilizado sem outra purificação. 21: Rendimento 320 mg
[0397] 21 foi dissolvido em 50 mL de tolueno e a solução de polímero foi azeotropicamente secada por duas horas sob refluxo usando uma captura Decano-Stark. A solução de polímero foi depois esfriada para temperatura ambiente. O reagente de ligante de mPEG secado 21 foi precipitado por adição de éter esfriado (60 mL). Diciclo- hexilcarbodiimida (1,2 mg, 6 μmols) em DCM foi adicionada a uma solução de 21 (240 mg, 3 μmol) e N-hidróxi-succinimida (0,7 mg, 6 μmols) em DCM (3 mL). A mistura de reação foi agitada por 14 h em temperatura ambiente e 22 foi precipitado por adição de éter frio (20 mL). Produto 22 foi secado a vácuo. 22: Rendimento 200 mg EXEMPLO 10: Síntese de Monoconjugado de mPEG-HGH LIGADO a amida permanente 23 e Bisconjugado de mPEG2-HGH 24 Usando Derivado de MPEG-Hexanoato de Succinimidila Linear de 40 kDa
Figure img0055
Figure img0056
[0398] hGH foi trocado em tampão para 50 mM de borato de sódio pH 8,5 (alternativamente borato de sódio pH 8 ou borato de sódio pH 9 podem ser usados). A concentração de hGH foi aproximadamente 2,5 mg/mL. Um excesso molar de três vezes de derivado de 40 kDa de mPEG-hexanoato de succinimidila (NOF, Japão) com relação à quantidade de hGH foi dissolvido em água para formar uma solução a 20% (p/v) de reagente (alternativamente um excesso molar de quatro vezes ou cinco vezes pode ser usado). A solução de reagente foi adicionada à solução de hGH e misturada. A mistura de reação foi incubada por 2h em temperatura ambiente e extinguida com hidroxilamina em temperatura ambiente e pH 7 por duas horas. A mistura de reação extinta foi analisada através de cromatografia por exclusão de tamanho. O monoconjugado 23 e bisconjugado 24 foram purificados através de cromatografia de troca de cátion. Alternativamente, cromatografia de troca de ânion pode ser usada para purificação. Os conjugados purificados foram analisados através de SDS-PAGE (figura 1). EXEMPLO 11: Síntese de Monoconjugado de mPEG-HGH Ligado a Amida permanente 25 e Bisconjugado de mPEG-HGH 26 Usando Derivado de Éster de MPEG-NHS Ramificado de 40 kDa
Figure img0057
Figure img0058
[0399] Monoconjugado de mPEG-hGH permanente 25 e bisconjugado 26 foram sintetizados de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 10 usando derivado de éster de mPEG-NHS ramificado de 40 kDa (NOF, Japão). Os conjugados purificados foram analisados através de SDS-PAGE (figura 1). EXEMPLO 12: Síntese de Monoconjugado de mPEG-HGH Ligado a Amida permanente 27 usando Derivado de Éster de mPEG-NHS Ramificado de 4 Braços de 80 kDa
Figure img0059
[0400] Monoconjugado de MPEG-hGH permanente 27 foi descrito de acordo com o Exemplo 10 usando derivado de éster de mPEG-NHS ramificado de 80 kDa 22. 27 purificado foi analisado através de SDS- PAGE (figura 1). EXEMPLO 13: Síntese de Monoconjugado de mPEG-HGH Ligado a Carbamato Permanente 28 Usando Derivado de mPEG- Pentafluorofenilcarbonato de 4 Braços Ramificado de 40 kDa 17aa
Figure img0060
[0401] hGH foi trocado em tampão para 50 mM de borato de sódio pH 9 (alternativamente borato de sódio pH 8,5 ou borato de sódio pH 8 pode ser usado). A concentração de hGH foi aproximadamente 2,5 mg/mL de um excesso molar de quatro vezes de reagente de ligante de mPEG de 4 braços permanente ramificado de 40 kDa 17aa com relação à quantidade de hGH foi dissolvido em água para formar uma solução de reagente a 20% (p/v). A solução de reagente foi adicionada à solução de hGH e misturada. A mistura de reação foi incubada por 1,5 h em temperatura ambiente e extinguida incubando em 100 mM de hidroxilamina em pH 7 e temperatura ambiente por 2 h. A mistura de reação extinta foi analisada através de cromatografia por exclusão de tamanho (figura 2, topo). Monoconjugado de mPEG-hGH-ligado permanente 28 foi purificado através de cromatografia de troca de ânion em pH 7,5 e analisado através de SDS-PAGE (figura 1) e cromatografia por exclusão de tamanho (figura 2, fundo). EXEMPLO 14: Síntese de Monoconjugado de mPEG-HGH Ligado a Carbamato Permamente 29 Usando Derivado de mPEG- Pentafluorofenilcarbonato de 4 Braços Ramificado de 80 kDa
Figure img0061
Monoconjugado de mPEG-hGH ligado a carbamato permanente 29 foi sintetizado de acordo com o Exemplo 13 usando derivado de mPEG- carbonato de pentafluorofenila de 4 braços ramificado de 80 kDa 17ab. 29 purificado foi analisado através de SDS-PAGE (figura 1). EXEMPLO 15: Síntese de Monoconjugado de mPEG-HGH Ligado a Carbamato Permanente 30 Usando Derivado de mPEG- Pentafluorofenilcarbonato de 4 Braços Ramificado de 40 kDa 17AC
Figure img0062
[0402] Monoconjugado de mPEG-hGH permanente 30 foi sintetizado de acordo com o Exemplo 13 usando derivado de mPEG- carbonato de pentafluorofenila de 4 braços ramificado de 40 kDa 17ac. 30 purificado foi analisado através de SDS-PAGE (figura 1). EXEMPLO 16: Síntese de Monoconjugado de mPEG-HGH permanente 31 usando Derivado de mPEG-Pentafluorofenilcarbonato de 4 Braços Ramificado de 80 kDa
Figure img0063
Monoconjugado de mPEG-hGH permanente 31 pode ser sintetizado de acordo com o Exemplo 13 usando derivado de mPEG-carbonato de pentafluorofenila de 4 braços ramificado de 80 kDa 17ad. EXEMPLO 17: Síntese de Monoconjugado de mPEG-HGH Ligado a Carbamato permanente 32 usando Derivado de mPEG- Pentafluorofenilcarbonato de 4 Braços Ramificado de 40 kDa
Figure img0064
[0403] Monoconjugado de mPEG-hGH ligado a carbamato permanente 32 foi sintetizado de acordo com o Exemplo 13 usando derivado de mPEG-carbonato de pentafluorofenila de 4 braços ramificado de 40 kDa 19aa. 32 purificado foi analisado através de SDS- PAGE (figura 1). EXEMPLO 18: Síntese de Monoconjugado de mPEG-HGH ligado a Carbamato permanente 33 usando Derivado de mPEG- Pentafluorofenilcarbonato de 4 Braços Ramificado de 80 kDa
Figure img0065
[0404] Monoconjugado de MPEG-hGH permanente 33 foi sintetizado de acordo com o Exemplo 13 usando derivado de mPEG- carbonato de pentafluorofenila de 4 braços ramificado de 80 kDa 19ab. 33 purificado foi analisado através de SDS-PAGE (figura 1). EXEMPLO 19: Síntese de Monoconjugado de mPEG-HGH ligado a Amina permanente 34 usando Derivado de mPEG-Propionaldeído Ramificado de 40 kDa
Figure img0066
hGH foi trocado em tampão para 50 mM de tampão de MES pH 6 (alternativamente tampão de HEPES pH 7 foi usado) e a concentração de hGH foi ajustada em 1,5 mg/mL. Um excesso molar de três vezes de mPEG-propionaldeído de 40 kDa (GL2-400AL3, NOF, Japão) com relação à quantidade de hGH foi dissolvido em água para formar uma solução de reagente a 25% (p/v). A solução de reagente foi adicionada à solução de hGH e misturada. Uma alíquota de uma solução de matéria-prima a 1 M de cianoboroidreto de sódio em água foi adicionada para dar uma concentração final de 25 mM na mistura de reação. A solução foi incubada por 18 h em temperatura ambiente na escuridão. A reação foi extinguida pela adição de tampão de Tris. A mistura de reação foi analisada por cromatografia por exclusão de tamanho e 34 conjugado foi purificado através de cromatografia de troca de cátion. Monoconjugado de mPEG-hGH purificado 34 foi analisado através de SDS-PAGE (figura 1). EXEMPLO 20: Síntese de Monoconjugado de mPEG-HGH ligado a Carbamato Transiente 35 usando Derivado de mPEG- Pentafluorofenilcarbonato de 4 Braços Transiente Ramificado de 40 kDa 19c
Figure img0067
[0405] hGH foi trocado em tampão para 50 mM de borato de sódio pH 9 (alternativamente borato de sódio pH 8,5 ou borato de sódio pH 8 podem ser usados) e a concentração de hGH foi ajustada para 2,5 mg/mL. Um excesso molar de quatro vezes de reagente de ligante de mPEG transiente 19c com relação à quantidade de hGH foi dissolvido em água para formar uma solução de reagente a 20% (p/v). A solução de reagente foi adicionada à solução de hGH e misturada. A mistura de reação foi incubada por 1 h em temperatura ambiente e extinguida incubando em 100 mM de hidroxilamina em pH 7 e temperatura ambiente por 2 h. Monoconjugado de mPEG-ligante-hGH foi purificado através de cromatografia de troca de ânion a pH 6,5 (figura 3 topo) e analisado através de cromatografia por exclusão de tamanho (figura 3 fundo). EXEMPLO 21: Síntese de Monoconjugado de mPEG-Ligante-hGH Transiente 36 usando Derivado de mPEG-Pentafluorofenilcarbonato de 4 Braços Ramificado de 80 kDa
Figure img0068
[0406] hGH foi trocado em tampão para 100 mM de borato de sódio pH 9 (alternativamente borato de sódio pH 8,5 ou borato de sódio pH 8 podem ser usados) e a concentração de hGH foi ajustada para 10 mg/mL. Um excesso molar de quatro vezes de reagente de ligante de mPEG de 4 braços transiente ramificado de 80 de kDa 17ca com relação à quantidade de hGH foi dissolvido em água para formar uma solução de reagente a 25% (p/v). A solução de reagente foi adicionada à solução de hGH e misturada. A mistura de reação foi incubada por 45 min em temperatura ambiente e extinguida incubando em 100 mM de hidroxilamina em pH 7 e temperatura ambiente por 2 h. Monoconjugado mPEG-ligante-hGH 36 foi purificado através de cromatografia de troca de cátion (figura 4 topo) e analisado através de cromatografia por exclusão de tamanho (figura 4 fundo). EXEMPLO 22: Síntese de Monoconjugado de mPEG-HGH Transiente 37 usando Derivado de mPEG-Pentafluorofenilcarbonato de 4 Braços Ramificado de 80 kDa 17cb
Figure img0069
[0407] Conjugado de PEG-ligante-hGH 37 foi sintetizado como descrito de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 21 usando ligante de mPEG reagente ativado 17cb. O cromatograma de troca de cátion e cromatograma por exclusão de tamanho analítico são mostrados na A figura 5 topo e fundo, respectivamente. EXEMPLO 23: Síntese de Monoconjugado de mPEG-HGH ligado a Carbamato Transiente 38 usando Derivado de mPEG- Pentafluorofenilcarbonato de 4 Braços Ramificado de 80 kDa 17b
Figure img0070
Conjugado de mPEG-ligante-hGH transiente ligado a carbamato 38 pode ser sintetizado como descrito no Exemplo 21 usando reagente de ligante de mPEG de 4 braços transiente ramificado de 80 kDa 17b. EXEMPLO 24: Ensaio para Medir Profármaco Peguilado de hGH e Atividade de hGH
[0408] É trabalho rotineiro para a pessoa versada determinar a atividade residual do profármaco polimérico como expresso pela atividade do conjugado de polímero permanente correspondente usando ensaios padrões como descritos no exemplo 1.
[0409] Especificamente, células NB2-11 foram crescidas em meios livres de soro com 100 ng/ml de suplemento de hGH. Para o ensaio de proliferação in vitro, a suspensão de célula contendo 2x105células/ml foi lavada duas vezes com meio livre de soro e livre de hGH e dispensada em uma placa de microtitulação de fundo chato de 96 poços (104células/poço). Os compostos foram testados em triplicata em uma série de etapas de titulação (9 etapas, usando um fator 3 de diluição entre cada etapa). As células foram incubadas com soluções do composto por 48 horas seguido por incubação por 2,5 horas com reagente de proliferação de célula WST-1. Proliferação de NB2-11 foi determinada por densidade óptica lendo em uma leitora de ELISA e a resposta representada em gráfico como uma função de concentração e valores de EC50 determinada. Os resultados são mostrados como % de bioatividade residual in vitro em relação ao hGH inalterado e fornecidos na tabela 1.
[0410] Nos experimentos in vitro como descrito acima, hGH nativo (fonte Novo Nordisk, Dinamarca) foi usado como o composto de referência. A mesma preparação de hGH foi usada para a síntese dos conjugados de PEG-hGH permanente. TABELA 1
Figure img0071
Figure img0072
Tabela 1: Bioatividade in vitro de conjugados de hGH permanentemente Peguilado quando comparados ao hGH nativo (Norditropin, Novo Nordisk, Dinamarca).
Conclusão:
[0411] Como visto da tabela 1, por conjugação de uma molécula de PEG adequada com hGH, a atividade in vitro do hGH Peguilado pode ser reduzida para menos que 5% da atividade do hGH não conjugado nativo. Por exemplo, conjugação de um PEG 4x20 kDa ramificado com hGH reduz a atividade residual para 0,7% do hGH não conjugado padrão.
[0412] Além disso, destes resultados foi também surpreendentemente verificado que a atividade residual do hormônio de crescimento Peguilado não só está relacionada ao tamanho da PEG ligada, mas também ao grau de ramificação e ao espaçamento entre o hGH e os pontos de ramificação dentro da estrutura de PEG.
PEG Linear
[0413] Especificamente, ligação de um PEG de 40 kDa linear a hGH resulta em uma atividade in vitro de 10,3% (composto 23) comparada ao hGH nativo.
PEG Ramificado
[0414] Quando um PEG de 2x20 kDa ramificado for ligado (composto 25), a atividade in vitro é também reduzida para 4,4% comparada ao hGH nativo.
[0415] Também, quando um PEG de 4x20 kDa com um espaçamento curto entre o hGH e os pontos de ramificação dentro do reagente de PEG for ligado (composto 27 e 29) a atividade in vitroé até mesmo também reduzida para respectivamente 0,7% comparada ao hGH nativo.
[0416] Surpreendentemente, quando um PEG de 4x20 kDa com um espaçador longo relativo entre o hormônio de crescimento humano e o primeiro ponto de ramificação dentro do reagente de PEG for ligado (por exemplo composto 33) a atividade in vitroé menos reduzida (2,2%) mostrando a importância do espaçador entre o grupo funcional de hGH e o primeiro ponto de ramificação dentro do reagente de PEG ramificado.
[0417] Conjugação de mais que uma metade de PEG com o hGH para formar conjugados de bisPEG reduz a atividade in vitro para menos que 0,5% (por exemplo composto 24 e 26). EXEMPLO 25: Determinação da Taxa de Autoclivagem IN VITRO do Conjugado 35, 36, 37, E 38
[0418] A taxa de autoclivagem do conjugado 35, 36 e 37 em pH 7,4 e 37°C foi determinada como descrito no Exemplo 2. Meias-vidas de autoclivagem de aproximadamente 75 h foram determinadas para estes conjugados. A figura 6 mostra cromatograma por exclusão de tamanho das amostras de 35 incubado analisadas após 0 h, 8 h, 47 h, 97 h, e 168 h mostrando liberação lenta de hGH do conjugado 35 com o passar do tempo. Taxa de autoclivagem do conjugado 38 pode ser determinada consequentemente e dá meias-vidas de ca. 50 h. EXEMPLO 26: Ensaio para Medir Meia-vida IN VIVO Terminal dos Profármacos Peguilado de HGH Conforme Expressa pela Meia-vida do Conjugado permanente Correspondente in vivo
[0419] A farmacocinética dos conjugados permanentes foi determinada após injeção intravenosa de 0,25 mg de (equivalentes de hGH) em ratos. Para selecionar um conjugado adequado para injeções semanais em seres humanos, uma meia-vida em plasma de mais que 10 horas no rato é desejável.
[0420] Uma dose única de 0,25 mg de hGH ou 0,25 mg de conjugado PEG-hGH permanente (dose com base em hGH) por rato foi administrada intravenosamente em ratos Wistar machos (200-250 g). Dois grupos de dois animais cada foram usados para cada composto. 200-300 μl de sangue total foram retirados sublingualmente para obter 100 μl de plasma de Ca-heparina por animal e ponto de tempo. As amostras foram colhidas após 0,5, 3, 24, 48, 72 e 96 h para o grupo 1 e após 5, 8, 32, 56, 80 e 168 h para o grupo 2. As amostras de plasma foram armazenadas a -80°C até ensaiadas.
[0421] Concentrações de hGH e do conjugado de PEG-hGH foram medidas usando um kit de ELISA para hGH (DSL). As concentrações de plasma foram calculadas de uma curva de calibração do respectivo conjugado ou hGH e representadas em gráfico versus tempo, e a meia- vida terminal (t%) foi calculada usando um modelo de compartimento simples. O resultado da determinação da meia-vida é tabulado na tabela 2.
[0422] A fim de selecionar um conjugado adequado para injeções semanais em humanos, estudos farmacocinéticos em ratos foram executados. Como a meia-vida dos conjugados Peguilado em ratos é na faixa de 5 vezes mais rápido que em seres humanos, a meia-vida de um hGH Peguilado em ratos deve ser aproximadamente 10 horas ou mais muito tempo. Para obter uma estimativa da meia-vida do profármaco Peguilado de hGH conjugado semclivagem do ligante, o conjugado correspondente permanentemente conjugado é injetado no rato.
[0423] Os resultados das determinações da meia-vida in vivo estão tabulados na Tabela 2. TABELA 2
Figure img0073
Tabela 2: Meia-vida dos conjugados de PEG-hGH permanentes em ratos
Conclusão:
[0424] Da tabela 1 e tabela 2 é óbvio que a atividade residual correlata inversamente com a meia-vida por exemplo, um grau alto de atividade residual causa eliminação mais rápida. Este é típico para conjugados eliminados por mecanismos de Depuração mediados por receptor.
[0425] Além disso, para obter um profármaco Peguilado de hGH que pode ser administrado uma vez semanalmente em seres humanos e com uma baixa atividade residual, uma molécula de PEG com um ou mais pontos de ramificação e com um peso molecular de 40 kDa ou acima é preferido. Alternativamente, conjugação de PEG para mais de um sítio em hGH para formar conjugados de bisPEG-hGH resulta em uma meia-vida terminal longa. EXEMPLO 27: Estudo Farmacodinâmico de Conjugado de mPEG- ligante-hGH Ligado a Carbamato Transiente 36 e Hormônio de Crescimento Humano em Macacos Cinomólogos
[0426] O objetivo deste estudo foi comparar a resposta farmacodinâmica em macacos cinomólogos de uma dose de conjugado de mPEG-ligante-hGH ligado a carbamato transiente carbamato 36 com doseamento de hormônio de crescimento humano uma vez diariamente durante uma semana. Os grupos de doseamento seguintes foram estudados:
Figure img0074
[0427] Uma vez que o conjugado de mPEG-ligante-hGH ligado a carbamato transiente 36 é transientemente Peguilado usando um grupo PEG de 80 kDa, as quantidades de hGH nos grupos de doseamento de conjugado de mPEG-ligante-hGH ligado a carbamato transiente 36 de 5 e 10 mg/k foram aproximadamente 1 e 2 mg/kg, respectivamente. Consequentemente, a quantidade de hGH no grupo de 10 mg/kg de conjugado de mPEG-ligante-hGH ligado a carbamato transiente 36 foi equivalente a uma dose diária de 0,3 mg/kg de hGH.
[0428] Cada artigo de teste foi injetado subcutaneamente em 2 macacos cinomólogos (1 macho, 1 fêmea) usando um volume de dose de 1 ml/kg. A idade e peso dos animais eram de 2,5 - 3 anos e 2,0-2,5 kg, respectivamente.
[0429] As amostras de sangue foram colhidas da artéria/veia femoral para determinação das concentrações de soro de IGF-1, um marcador farmacodinâmico para hormônio de crescimento humano. A amostra de sangue foi colhida nos pontos de tempo seguintes: 0 (pré- dose), 3, 6, 12, 24, 36, 48, 72, 96, 120, e 144 horas após dosamento no Dia 1.
[0430] As amostras de sangue foram colhidas, deixadas se coagular, e depois armazenadas em um bloco de gelo ou gelo molhado até centrifugadas. Após centrifugação, as amostras de soro foram aliquotadas em frascos pré-rotulados e firmemente tampados. Os frascos foram armazenados a -70°C sob separação em frascos.
[0431] Níveis de IGF-1 nas amostras de soro foram medidos usando o kit ELISA Quantikine Human IGF-1 (R&D Systems) que tinha sido adaptado e validado para o uso em determinar os níveis de IGF-1 em soro de macaco cinomólogo.
[0432] A resposta farmacodinâmica dos artigos de teste é mostrada na A figura 11. Tanto administração de hGH diário como uma administração de conjugado de mPEG-ligante-hGH ligado a carbamato transiente 36 aumentaram os níveis de IGF-1 nos níveis medidos no grupo de veículo. Uma administração de 5 mg/kg de conjugado de mPEG-ligante-hGH ligado a carbamato transiente 36 foi equivalente à administração de hGH diário enquanto uma administração de 10 mg/kg de conjugado de mPEG-ligante-hGH ligado a carbamato transiente 36 foi mostrada ser superior que hGH diário. Isto claramente indicou que uma dose de uma vez por semana de conjugado de mPEG-ligante-hGH ligado a carbamato transiente 36 foi superior a uma dose diária equivalente de hGH. Abreviações: DBU 1,3-diazabiciclo[5,4,0]undeceno DCM Diclorometano DIEA Diisopropiletilamina DMAP Dimetilamino-piridina DMF N,N-dimetilformamida DMSO dimetilsulfóxido Eq equivalente estequiométrico fmoc 9-fluorenilmetoxicarbonila HFIP Hexafluoroisopropanol HOSu N-hidroxissuccinimida LCMS Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa MaI Maleimidopropionila MS Espectro de massa MW Massa molecular PEG Polietileno glicol RP-HPLC Cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa Rf Fator de retenção r.t. Temperatura ambiente SEC Cromatografia por exclusão de tamanho Suc Succinimidopropionila TES Trietilsilano TFA Ácido trifluoroacético THF Tetra-hidrofurano Trt Tritila LISTA DE REFERÊNCIA 1. Büyükgebiz A. et al. J. Pediatr. Endocrinol. Metab. jan-fev de 1999; 12(1):95-7 2. Clark et al., 1996, Journal of Biological Chemistry 271: 21969-21977 3. Girard, J. Mehls, O., J. Clin Invest. março de 1994; 93(3): 1163-1171 4. Philip Harris et al. Horm. Res. 2006; 65 (supl. 4): 1-213, CF1-98 GH/IGF Tratamento com o título "First in-human study of PEGylated recombinant human growth hormone". 5. Veronese, F. M. "Enzymes for Human Therapy: Surface Structure Modifications", Chimica Oggi, 7:53-56 (1989).

Claims (17)

1. Composição farmacêutica compreendendo excipientes farmacêuticos adequados e adicionalmente compreendendo uma quantidade eficaz clínica humana in vivo de um conjugado de profármaco PEGuilado de hormônio de crescimento humano recombinante (rhGH), em que PEG é ligado a rhGH por meio de um ligante transiente auto-hidrolisável (autoclivagem); em que o dito conjugado de profármaco é caracterizado pelo fato de que: (1): o conjugado tem uma atividade de GH que é menos que 5% do hormônio de crescimento nativo sem PEG; (2): a taxa de auto-hidrólise do ligante é tal que a meia-vida in vivoé de 10 horas a 600 horas, que é medida injetando-se o conjugado intravenosamente em ratos, seguido por tirar amostras de sangue em intervalos de tempo, preparar plasma, e analisar hGH usando ELISA; e em que o conjugado de profármaco PEGuilado tem a estrutura química (A):
Figure img0075
em que HN-rhGH representa o resíduo de rhGH ligado ao ligante transiente; R1, R2, R3, R4, e R5 são selecionados independentemente de hidrogênio, metila, etila, propila, isopropila, butila, isobutila, butila terciária; PEG representa o resíduo de PEGuilação ligado ao ligante transiente; n = 1 ou 2; e X é selecionado de C1 a C8 alquila ou C1 a C12 heteroalquila; e em que o PEG é ramificado e contém pelo menos 3 cadeias.
2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a taxa de auto-hidrólise é tal que a meia-vida in vivoé até 5 vezes mais curta que a meia-vida in vitro do conjugado de profármaco PEGuilado de hGH correspondente.
3. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a meia-vida in vivoé até 3 vezes mais curta que a meia-vida in vitro do conjugado de profármaco PEGuilado de hGH correspondente.
4. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizada pelo fato de que a meia-vida in vivoé até 2 vezes mais curta ou quase idêntica à meia-vida in vitro do conjugado de profármaco PEGuilado de hGH correspondente.
5. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a composição é uma composição para administração subcutânea, administração intramuscular ou injeção intravenosa.
6. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o profármaco PEGuilado tem uma carga de PEG total por molécula de hormônio de crescimento que soma pelo menos 25 kDa.
7. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a estrutura parcial da fórmula (I) dentro da estrutura (A) da reivindicação 1, que é
Figure img0076
, é selecionada do grupo que consiste em:
Figure img0077
8. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a estrutura parcial da fórmula (II) dentro da estrutura (A) da reivindicação 1, que é
Figure img0078
é selecionada do grupo que consiste em:
Figure img0079
9. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que PEG-X na fórmula (A) da reivindicação 1 é PEG-W da fórmula III:
Figure img0080
em que PEG-W é selecionado do grupo que consiste em:
Figure img0081
10. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a estrutura do conjugado de profármaco é:
Figure img0082
11. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que a taxa de autoclivagem do ligante in vivoé tal que a meia-vida in vivoé de 20 a 300 horas.
12. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que a taxa de autoclivagem do ligante in vivoé tal que a meia-vida in vivoé de 20 a 150 horas.
13. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que a taxa de autoclivagem do ligante in vivoé tal que a meia-vida in vivoé de 30 a 100 horas.
14. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que a taxa de autoclivagem do ligante in vivoé tal que a meia-vida in vivoé de 30 a 75 horas.
15. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato de ser para uso no tratamento de uma doença relacionada ao GH em um ser humano.
16. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que a doença relacionada ao GH é selecionada do grupo que consiste em deficiência de hormônio de crescimento; deficiência de hormônio de crescimento de princípio adulto; síndrome de Turner; síndrome de Prader-Willi; síndrome de intestino curto; insuficiência renal crônica; pequeno para idade gestacional (SGA); definhamento por AIDS; antienvelhecimento; artrite reumatoide; estatura pequena idiopática; gene homeobox de estatura curta; somatopausa; síndrome de Noonan; síndrome de Down; estatura curta associada ao uso de esteroide prolongado; síndrome de Aarskog; doença renal crônica; artrite reumatoide juvenil; fibrose cística; infecção por HIV em crianças que recebem tratamento de HAART; estatura curta em crianças nascidas com peso muito baixo ao nascimento mas SGA; displasia esquelética; hipocondroplasia; acondroplasia; estatura curta idiopática (ISS); GHD em adultos; fraturas em ou de ossos longos; pacientes após cirurgia de tendão ou de ligamento; oteogênese de distração; distúrbios resultantes de substituição de quadril ou disco, reparo de menisco, fusões espinhais ou fixação de prótese; distúrbios resultantes de fixação de material de osteossíntese; não-união ou mal- união das fraturas; distúrbios resultantes de osteatomia; distúrbios resultantes da implantação de enxerto; degeneração de cartilagem articular no joelho causado por trauma ou artrite; osteoporose em pacientes com síndrome de Tuner; osteoporose em homens; pacientes adultos em diálise crônica (APCD); doença cardiovascular associada à mal nutrição em APCD; reversão de caquexia em APCD; câncer em APCD; doença pulmonar abstrativa crônica em APCD; HIV em APCD; ancião com APCD; doença hepática crônica em APCD; síndrome de fadiga em APCD; doença de Crohn; função hepática lesada; machos com infecção por HIV; obesidade central; síndrome de lipodistrofia associada a HIV; infertilidade masculina; pacientes após cirurgia eletiva principal, destoxificação de álcool ou droga, trauma neurológico; envelhecimento; ancião débil; osteoartrite; cartilagem traumaticamente danificada; disfunção erétil; fibromialgia; distúrbios de memória; depressão; lesão de cérebro traumática; hemorragia subaraquinoide; peso muito baixo ao nascimento; síndrome metabólica; miopatia de glicocorticoide; e estatura curta devido ao tratamento de glicocorticoide em crianças.
17. Profármaco, caracterizado pleo fato de ser selecionado do grupo que consiste em
Figure img0083
em que m é um número inteiro de 200 a 250 e n é um número inteiro de 100 a 125;
Figure img0084
em que n é um número inteiro de 400 a 500;
Figure img0085
em que n é um número inteiro de 400 a 500; e
Figure img0086
em que n é um número inteiro de 400 a 500.
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