ES2587400T3 - Compuestos de hormona de crecimiento humana recombinante pegilada - Google Patents

Compuestos de hormona de crecimiento humana recombinante pegilada Download PDF

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Grethe Nørskov Rasmussen
Ulrich Hersel
Thomas Wegge
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Abstract

Composición farmacéutica que comprende excipientes farmacéuticos adecuados y que comprende también una cantidad eficaz clínica in vivo en seres humanos de un conjugado de profármaco pegilado de hormona de crecimiento humana recombinante (rhGH), en la que PEG se une a rhGH mediante un grupo de unión transitorio autohidrolizable (autoescindible); estando dicho conjugado de profármaco caracterizado porque: (1): el conjugado tiene una actividad GH que es menor del 5% de la hormona de crecimiento nativa sin PEG; y (2): la velocidad de autohidrólisis de grupo de unión es tal que la semivida in vivo es de desde 10 horas hasta 600 horas que se mide mediante inyección intravenosa en ratas del conjugado, seguido por la extracción de muestras de sangre a intervalos de tiempo, preparación de plasma y análisis de hGH usando ELISA; y en la que el conjugado de profármaco pegilado tiene la estructura química (A):**Fórmula** en la que HN-rhGH representa el residuo de rhGH unido al grupo de unión transitorio; R1, R2, R3, R4, y R5 se seleccionan independientemente de hidrógeno, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, terc-butilo; PEG representa el residuo de pegilación unido al grupo de unión transitorio; n >= 1 ó 2; y X se selecciona de alquilo C1 a C8 o heteroalquilo C1 a C12; y en la que el PEG es ramificado y contiene al menos 3 cadenas.

Description

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DESCRIPCION
Compuestos de hormona de crecimiento humana recombinante pegilada Campo de la invencion
Esta invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende excipientes farmaceuticos adecuados y que comprende tambien una cantidad cllnicamente eficaz de un profarmaco pegilado de hormona de crecimiento humana recombinante (rhGH) que puede administrarse con menos frecuencia que los productos de hormona de crecimiento humana disponibles y puede no provocar lipoatrofia en el lado de la inyeccion. La presente invencion tambien se refiere a tales profarmacos.
Antecedentes de la tecnica
La hormona de crecimiento (GH) es una hormona que estimula el crecimiento y la reproduccion celular en seres humanos y otros animales. Es una hormona polipeptldica monocatenaria, de 191 aminoacidos que se sintetiza, se almacena y se secreta por las celulas somatotropas dentro de las alas laterales de la hipofisis anterior. La hormona tambien se conoce como somatotropina cuando se hace referencia a la hormona de crecimiento producida mediante tecnologla de ADN recombinante, y se abrevia como “rhGH”.
La hormona de crecimiento tiene una variedad de funciones en el cuerpo, de las cuales la mas notoria es el aumento de la altura en toda la infancia, y existen varias enfermedades que pueden tratarse a traves del uso terapeutico de GH.
Los efectos de la deficiencia de hormona de crecimiento varlan dependiendo de la edad a la que se producen. En ninos, el retraso del crecimiento y la talla baja son las principales manifestaciones de la deficiencia de GH. Tambien puede provocar inmadurez sexual. En adultos, los efectos de la deficiencia son mas sutiles, y pueden incluir deficiencias de fuerza, energla y masa osea, as! como aumento del riesgo cardiovascular.
Existen muchas causas de la deficiencia de GH, incluyendo mutaciones de genes especlficos, malformaciones congenitas que afectan al hipotalamo y/o la hipofisis, y dano a la hipofisis debido a lesion, cirugla o enfermedad.
La deficiencia se trata a traves de complementacion con GH externa. Toda la GH en uso actual es una version biosintetica de GH humana, fabricada mediante tecnologla de ADN recombinante. Se usa GH como terapia de sustitucion en ninos y adultos con deficiencia de GH o bien de inicio en la infancia (tras completarse la fase de crecimiento) o bien de inicio en la edad adulta (habitualmente como resultado de un tumor hipofisario adquirido). En estos pacientes, los beneficios han incluido de manera variable reduccion de la masa adiposa, aumento de la masa magra, aumento de la densidad osea, perfil de llpidos mejorado, reduccion de factores de riesgo cardiovascular y bienestar psicosocial mejorado.
Genentech Inc (EE.UU.) fue el primero en clonar rhGH y se describio esto en la patente EP-B 22242. A partir de 2006, las hormonas de crecimiento sinteticas disponibles en los Estados Unidos y Europa (y sus fabricantes) inclulan Nutropin (Genentech), Humatrope (Eli Lilly), Genotropin (Pfizer), Norditropin (Novo Nordisk), Saizen (Merck Serono) y Omnitrope (Sandoz).
Aunque las tecnicas de biologla molecular han aumentado espectacularmente la disponibilidad de muchas protelnas y/o polipeptidos (denominados protelnas a continuacion en el presente documento), el uso terapeutico de dichas protelnas se ve dificultado a veces por otros factores, tales como corta semivida en plasma debido a aclaramiento renal y mediado por receptor, agregacion, degradation proteolltica, escasa biodisponibilidad y propiedades flsicas que excluyen las formulaciones eficaces.
Un mecanismo para una disponibilidad de protelnas aumentada es mediante conjugation de la protelna con
compuestos de derivatizacion, que incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol y polipropilenglicol. Algunos de
estos beneficios reconocidos incluyen: disminucion de la inmunogenicidad y antigenicidad, aumento de la duration de action y propiedades farmacocineticas alteradas. [Veronese, F.M. “Enzymes for Human Therapy: Surface Structure Modifications,” Chimica Oggi, 7:53-56 (1989)] (referencia 5 en el presente documento).
Mediante la pegilacion de rhGH, puede ser posible mejorar las caracterlsticas de la molecula para uso medico
aumentando su semivida in vivo (logrando de ese modo una reduccion de la dosificacion o reduccion de la
frecuencia de dosificacion), mejorando su estabilidad y disminuyendo su antigenicidad o una combination de los mismos.
Generalmente, este tipo de modification de una molecula se conoce bien en la tecnica y existen numerosas patentes disponibles en la bibliografla de patentes, que describen este concepto. Por ejemplo, se describe una
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eritropoyetina (EPO) pegilada de Hofmann La Roche en el documento EP-B 1196443 que reivindica un grupo de union especifico que comprende PEG unido covalentemente a EPO, se describe un interferon alfa pegilado en el documento EP-B 975369 de la empresa Nektar/La Roche y otro interferon alfa pegilado en el documento EP-B 1562634 de la empresa Hofmann La Roche.
Se cree que el aclaramiento in vivo de rhGH se produce mediante los siguientes dos mecanismos. El primero es aclaramiento renal en el que se elimina rhGH de la circulacion mediante filtracion glomerular renal. El aclaramiento renal de rhGH esta bien documentado y la pegilacion de rhGH sintetica es por tanto una eleccion obvia para resolver este problema. El aclaramiento renal representa aproximadamente el 25 - 53% del aclaramiento total de rhGH (Girard, J. Mehls, O.J. Clin. Invest. Marzo de 1994; 93(3): 1163-1171, referencia 3 en el presente documento).
El segundo mecanismo es el aclaramiento hepatico (higado). La captacion hepatica de GH se produce mediante endocitosis mediada por receptor seguida por degradacion lisosomica.
Un tercer mecanismo es aclaramiento mediado por receptor en otros tejidos tales como condrocitos del cartilago. Reduciendo la afinidad de union de GH al receptor de GH mediante pegilacion, se reducira el aclaramiento mediado por receptor.
Sin embargo, existen problemas dedicados con la administracion de rhGH. Una desventaja importante de la rhGH administrada por via subcutanea es la aparicion de lipoatrofia en pacientes que reciben el tratamiento.
La lipoatrofia es el termino medico usado para la perdida localizada de tejido adiposo. Las formulaciones de rhGH administradas por via subcutanea han presentado problemas de lipoatrofia, que se cree que esta provocada por la alta concentracion local del complejo de hormona de crecimiento y en el sitio de inyeccion.
Buyukgebiz A. et al publicado en J. Pediatr. Endocrinol. Metab. Enero-febrero de 1999; 12(1):95-7 describen un historial medico de este tipo (referencia 1 en el presente documento). Esto es un informe de un paciente con deficiencia de GH aislada debida a una delecion genica de 6,7 kb que recibio tratamiento con rhGH a alta dosis y desarrollo lipoatrofias locales en los sitios de inyeccion sin ninguna deteccion de anticuerpos despues de 6 anos de terapia. Se sospecha que la etiologia de la lipoatrofia es mediante el efecto lipolitico directo de altas dosis de rhGH.
Se cree que la lipoatrofia relacionada con la administracion de rhGH esta provocada por la propia actividad de rhGH, por mayores concentraciones y por la exposicion prolongada. Estas mayores concentraciones se producen cerca de los sitios de las inyecciones.
La probabilidad de que se acumule una alta actividad de hormona de crecimiento cerca del sitio de inyeccion es incluso mayor en caso de que se pegile la rhGH debido a un aumento del tiempo de residencia. En el caso de formulaciones de rhGH pegilada, el tejido experimental una exposicion sostenida y aumentada a la actividad de hormona de crecimiento, debido al hecho de que el conjugado pegilado presenta la actividad necesaria para la actividad farmacologica y el conjugado esta limitado por difusion debido al tamano del conjugado. El desenlace es un aumento de la lipolisis en el sitio de inyeccion.
El documento WO-A 2005/079838 describe hGH pegilada, en la que el resto de hGH se une a un polimero de polietilenglicol mediante un grupo funcional amino, que puede considerarse como una conexion permanente debido a la estabilidad del grupo amino. Un ejemplo de un compuesto de hGH de este tipo, que presenta lipoatrofia, es el compuesto PHA-794428. El compuesto pHA-794428 es una rhGH pegilada y tambien se describe en el documento WO-A 2005/079838 de la empresa Pharmacia (adquirida por Pfizer) y se describe ademas en Horm. Res. 2006; 65 (Supl. 4): 1-213, CF1-98 GH/lGF Treatment con el titulo “First in-human study of PEGylated recombinant human growth hormone”, Philip Harris et al. (referencia 4 en el presente documento).
Segun la informacion del ensayo clinico publicada en
www.clinicaltrials.gov, se termino el ensayo el 10 de diciembre de 2007. La decision de Pfizer de terminar el programa se debio a casos de lipoatrofia en el sitio de inyeccion que se notificaron en estudios clinicos de fase 2 despues de una unica inyeccion de PHA 794428.
El documento WO-A 2006/102659 (Nektar) tambien describe y sugiere conjugados rhGH-PEG (tipos lineal y ramificado) mediante enlace amida. El problema que ha de resolverse en el documento WO-A 2006/102659 se describe en el parrafo [0005] en la pagina 2. Segun el solicitante, el problema que ha de resolverse es la reduccion de la frecuencia de dosificacion. Puesto que la terapia con rhGH requiere normalmente inyecciones diarias, a los pacientes, y en particular, a los pacientes pediatricos, no les gustan las incomodidades y molestias asociadas con este regimen. La solucion descrita en el documento WO-A de Nektar es la provision de nuevos conjugados PEG- rhGH.
En tabla 6, parrafo [0257] del documento WO-A puede observarse que los conjugados PEG-rhGH tienen una actividad relativamente baja in vitro en comparacion con la hormona de crecimiento nativa sin PEG. A pesar de las
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bajas actividades in vitro, los conjugados de rhGH pegilada eran activos in vivo. En relacion con esto lease la seccion: “Aunque los resultados preliminares in vitro sugieren que el aumento de la cantidad de PEG unido a hGH reduce su capacidad para estimular el receptor de hGH, basandose en los resultados preliminares in vivo, parece que una reduccion de la bioactividad se ve mas que equilibrada por un aumento de la semivida y/o disponibilidad en plasma, conduciendo por tanto a una conclusion de que los conjugados proporcionados en el presente documento presentan un efecto farmacodinamico superior in vivo en comparacion con rhGH sin modificar en un regimen de dosificacion identico”.
El documento WO-A 2006/102659 (Nektar) no describe grupos de union autoescindibles, es decir se observa simplemente que los conjugados PEG-rhGH son activos in vivo aunque sus actividades in vitro se reducen significativamente. No se aborda el problema de la lipoatrofia.
Una solucion al reto de modificar por ingenierla las propiedades deseadas de lipoatrofia reducida y frecuencia de inyeccion reducida en un conjugado pegilado de hGH es el uso de un enfoque de profarmaco. Un profarmaco es cualquier compuesto que experimenta biotransformacion antes de presentar sus efectos farmacologicos. Los profarmacos pueden considerarse por tanto farmacos que contienen grupos protectores no toxicos especializados usados de manera transitoria para alterar o para eliminar propiedades no deseadas en la molecula original. En este caso, un portador polimerico reducirla de manera transitoria la actividad de hormona de crecimiento y, por consiguiente, reducirla la probabilidad de lipolisis del tejido. La conjugacion transitoria con un portador polimerico ampliarla al mismo tiempo la semivida del conjugado y por tanto proporcionarla una administracion de accion prolongada de hGH.
Se describen numerosos profarmacos macromoleculares en la bibliografla en los que el portador macromolecular se une mediante un grupo ester labil al agente farmaceutico (por ejemplo Y. Luo, MR Ziebell, GD Prestwich, “A Hyaluronic Acid - Taxol Antitumor Bioconjugate Targeted to Cancer Cells”, Biomacromolecules 2000, 1, 208-218, J Cheng et al, Synthesis of Linear, beta-Cyclodextrin Based Polymers and Their Camptothecin Conjugates, Bioconjugate Chem. 2003, 14, 1007-1017, R. Bhatt et al, Synthesis and in Vivo Antitumor Activity of Poly(L-glutamic acid) Conjugates of 20(S)-Campththecin, J. Med. Chem. 2003, 46, 190-193; R.B. Greenwald, A. Pendri, C.D. Conover, H. Zhao, Y.H. Choe, A. Martinez, K. Shum, S. Guan, J. Med. Chem., 1999, 42, 3657-3667; B. Testa, J.M: Mayer en Hydrolysis in Drug and Prodrug Metabolism, Wiley-VCH, 2003, capltulo 8) En estos casos, el grupo funcional conjugado de la entidad bioactiva es un grupo hidroxilo o un acido carboxllico.
Especialmente para biomacromoleculas pero tambien para profarmacos de pollmero de molecula pequena, puede ser deseable unir el portador macromolecular a grupos amino (es decir extremo grupos amino de lisina o N-terminal de protelnas) de la entidad bioactiva. Esto sera el caso si el enmascaramiento de la bioactividad del farmaco requiere conjugacion de un determinado grupo amino de la entidad bioactiva, por ejemplo un grupo amino ubicado en un centro activo o una region o epltopo implicado en la union al receptor. Ademas, durante la preparacion del profarmaco, pueden direccionarse grupos amino de manera mas quimioselectiva y servir para controlar mejor la conjugacion de portador y farmaco debido a su mayor nucleofilicidad en comparacion con grupos hidroxllicos o fenolicos. Esto es particularmente cierto para protelnas que pueden contener una gran variedad de diferentes funcionalidades reactivas. En este caso, reacciones de conjugacion no selectivas conducen a mezclas de productos no deseadas que requieren una extensa caracterizacion o purificacion y pueden disminuir el rendimiento de reaccion y la eficacia terapeutica del producto.
Puede producirse la activacion del profarmaco mediante escision enzimatica o no enzimatica del puente labil entre el portador y la molecula de farmaco, o una combinacion secuencial de ambos, es decir una etapa enzimatica seguida por una transposicion no enzimatica.
En el documento WO-A 2005/099768 se describen moleculas de grupo de union pegiladas con grupos de union autoescindibles para un gran grupo de biomoleculas incluyendo somatropinas (reivindicacion 6). En el documento WO-A 2005/099768, el problema que ha de resolverse es la variabilidad entre pacientes y un efecto impredecible de la activacion del profarmaco cuando esta implicado un mecanismo enzimatico (pagina 12, llnea 17-30). Esta solicitud describe como solucion un grupo de union aromatico, que puede basarse en PEG. Este grupo de union-PEG se une al farmaco de manera que se reduce significativamente la actividad del farmaco. Se activa solo con la liberacion del farmaco, que se inicia mediante hidrolisis. La velocidad de hidrolisis puede controlarse qulmicamente. No se da un enfasis especial a GH y problemas relevantes, como la lipoatrofia, en relacion con esto como tal.
En resumen, ninguna de las citas mencionadas anteriormente describe una solucion para desarrollar una rhGH de accion prolongada, basandose en un conjugado de profarmaco que puede administrarse con menos frecuencia sin aumentar la frecuencia de lipoatrofia.
Por tanto, es un objeto de la presente invencion la provision de un profarmaco de este tipo o una composicion farmaceutica que comprende dicho profarmaco para reducir la frecuencia de administracion de rhGH usando PEG conjugado con rhGH sin inducir significativamente lipoatrofia.
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Sumario de la invencion
Por consiguiente, la presente invencion proporciona una composition farmaceutica que comprende excipientes farmaceuticos adecuados y que comprende tambien una cantidad eficaz clinica in vivo en seres humanos de un conjugado de profarmaco pegilado de una hormona de crecimiento humana recombinante (rhGH), en la que PEG se une a rhGH mediante un grupo de union transitorio autohidrolizable (autoescindible); estando dicho conjugado de profarmaco caracterizado porque:
(1) : el conjugado tiene una actividad GH que es menor del 5% de la hormona de crecimiento nativa sin PEG; y
(2) : la velocidad de autohidrolisis de grupo de union es tal que la semivida in vivo es de desde 10 horas hasta 600 horas que se mide mediante inyeccion intravenosa en ratas del conjugado, seguido por la extraction de muestras de sangre a intervalos de tiempo, preparation de plasma y analisis de hGH usando ELISA; y
en la que el conjugado de profarmaco pegilado tiene la estructura quimica (A):
imagen1
en la que HN-rhGH representa el residuo de rhGH unido al grupo de union transitorio;
R1, R2, R3, R4 y R5 se seleccionan independientemente de hidrogeno, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, terc-butilo;
PEG representa el residuo de pegilacion unido al grupo de union transitorio; n = 1 o 2; y
X se selecciona de alquilo C1 a C8 o heteroalquilo C1 a C12; y en la que el PEG es ramificado y contiene al menos 3 cadenas.
La propiedad (1) garantiza que el profarmaco tiene una baja incidencia de lipoatrofia a pesar de tener una duration de action significativamente ampliada in vivo. Sin limitarse por la teoria, los presentes inventores creen que si el profarmaco tuviera una mayor actividad GH, este producto todavia induciria lipoatrofia a una mayor frecuencia que los productos de rhGH comercializados actualmente.
La propiedad (2) garantiza que rhGH (sin PEG) se libera gradualmente a lo largo del tiempo de modo que puede administrarse el producto farmaceutico de rhGH con menos frecuencia que la hormona de crecimiento humana, por ejemplo solo una vez a la semana o una vez al mes en vez de administraciones diarias, mientras que todavia conserva una eficacia total en comparacion con rhGH.
Preferiblemente, la semivida in vivo es hasta 5 veces mas corta, por ejemplo 2, 3, 4 o 5 veces mas corta, que la semivida in vitro del conjugado de profarmaco pegilado de hGH correspondiente. Mas preferiblemente, la semivida in vivo es hasta 3 veces mas corta que la semivida in vitro del conjugado de profarmaco pegilado de hGH correspondiente. Lo mas preferiblemente, la semivida in vivo es hasta 2 veces mas corta que o casi identica a la semivida in vitro del conjugado de profarmaco pegilado de hGH correspondiente.
Esta invencion se aplica a profarmacos pegilados de rhGH, en particular a profarmacos portadores pegilados de
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rhGH incluyendo profarmacos portadores en cascada.
Los profarmacos pueden definirse como agentes terapeuticos que son inactivos per se pero que se transforman de manera predecible en metabolitos activos (vease B. Testa, J.M: Mayer en Hydrolysis in Drug and Prodrug Metabolism, Wiley-VCH, 2003, pagina 4). En sistemas de profarmacos portadores, muchos agentes farmaceuticos son inactivos o muestran disminucion de la actividad biologica cuando se conjuga covalentemente un pollmero con la molecula de farmaco. En estos casos, se aplica una union transitoria de farmaco y portador de tal modo que el agente farmaceutico se libera del portador polimerico in vivo para volver a adquirir su actividad biologica. La actividad biologica reducida del profarmaco en comparacion con el farmaco liberado es ventajosa si se desea una liberacion lenta o controlada del farmaco. En este caso, puede administrarse una cantidad relativamente grande de profarmaco sin efectos secundarios concomitantes ni el riesgo de sobredosis. La liberacion del farmaco se produce a lo largo del tiempo, reduciendo de ese modo la necesidad de administracion repetida y frecuente del farmaco.
En profarmacos portadores polimericos, se unen a menudo restos biologicamente activos a un resto portador polimerico mediante un puente labil formado entre el resto portador y un grupo funcional de la molecula de farmaco. La escision de un profarmaco portador genera una entidad molecular (farmaco) de bioactividad aumentada y al menos un producto secundario, el portador. Este producto secundario puede ser biologicamente inerte (por ejemplo PEG). Despues de la escision, la entidad bioactiva revelara al menos un grupo funcional previamente conjugado y de ese modo enmascarado o protegido, y la presencia de este grupo contribuye normalmente a la bioactividad. Puede medirse la actividad GH usando metodos conocidos en la tecnica. A este respecto, se pone enfasis en el ejemplo 1. Basandose en el hecho de que algunos grupos de union transitorios aplicables para la presente invencion pueden tener una semivida in vitro de menor de 3000 h, se realiza la medicion de actividad GH respectiva indirectamente determinando la actividad GH de un conjugado de PEG respectivo que comprende un grupo de union permanente en vez del grupo de union transitorio. Esto puede llevarse a cabo tal como se describe en el documento WO2006102659 en la pagina 74, parrafo 0240, se evaluaran in vitro la actividad biologica de rhGH y los conjugados descritos en el presente documento usando un ensayo de proliferation de celulas de linfoma de rata NB2-II. En resumen, se incuban con rhGH celulas NB2-II derivadas de un linfoma de rata, lo que conduce a la union de la molecula de rhGH a su receptor en la superficie celular. La union al receptor induce la cascada de transduction de senales, que da como resultado la proliferacion de las celulas. Los resultados del ensayo se basan en el contenido de protelna determinado y una bioactividad del 100% de rhGH sin modificar.
Preferiblemente, para la medicion de la actividad GH se usa el protocolo descrito en el ejemplo 24.
Puede medirse la semivida in vitro usando metodos conocidos en la tecnica. A este respecto, se pone enfasis en el ejemplo 2.
Por consiguiente, un segundo aspecto de la invencion se refiere a una cantidad eficaz cllnica de la composition farmaceutica que comprende el profarmaco pegilado de rhGH del primer aspecto para su uso en un metodo para el tratamiento de una enfermedad relacionada con GH en una persona.
Este segundo aspecto puede formularse alternativamente como metodo para el tratamiento de una enfermedad relacionada con Gh en una persona que comprende administrar a una persona una cantidad eficaz cllnica de la composicion farmaceutica que comprende el profarmaco pegilado de rhGH del primer aspecto.
En una situation en la que se reduce significativamente la actividad residual del profarmaco (como es el caso para rhGH conjugada con pEg de manera transitoria) en comparacion con GH humana nativa, pueden no producirse efectos lipollticos ni siquiera en la exposition prolongada.
Los compuestos descritos en el presente documento denominados profarmacos pegilados de rhGH son conjugados que pueden tener una actividad residual significativamente reducida en comparacion con GH humana. Para presentar actividad terapeuticamente util, rhGH tiene que liberarse del conjugado de profarmaco, para lo que los profarmacos descritos en el presente documento necesitan someterse a una etapa de activation (por ejemplo, mecanismos de liberacion 1,6), denominada autoescision en el presente documento, que escinde el grupo PEG del farmaco. El mecanismo de liberacion 1,6 se describe bien en el documento WO-A 2005/099768.
Sin limitarse por la teorla, los presentes inventores creen que los conjugados de rhGH pegilada de manera transitoria dados a conocer en el presente documento reducen significativamente la lipoatrofia debido a la baja actividad de los conjugados de rhGH pegilada, antes de que se retire gradualmente el PEG por escision mediante el grupo de union autoescindible. Esto puede garantizar que los profarmacos no induciran lipoatrofia con mas frecuencia que GH humana u otros compuestos de rhGH pegilada de manera permanente tal como se describio anteriormente.
Aun otro aspecto de la presente invencion es un conjugado de profarmaco tal como se definio anteriormente.
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Se describen a continuacion realizaciones preferidas de la presente invencion, a modo de ejemplos unicamente. Definiciones
Antes de un analisis de las realizaciones detalladas de la invencion se proporciona una definicion de terminos especlficos relacionados con los aspectos principales de la invencion.
En general, todos los terminos tecnicos especlficos usados en el presente documento se entenderan como los entenderla un experto en el presente contexto tecnico.
rhGH o hGH o GH o residuo de hGH se refiere una hormona de crecimiento humana. NH-hGH es un residuo de hGH, en el que -NH- de -NH-hGH representa un grupo amino de hGH.
El termino “actividad” se entiende en el presente documento como la capacidad de la hormona de crecimiento o un conjugado de la misma, para evocar una respuesta biologica cuando se administra a un mamlfero, por ejemplo en un modelo in vivo, o para producir una respuesta medible en un modelo in vitro tal como se describe en los ejemplos.
En un sistema de profarmaco, la actividad medida tendra dos contribuciones, una de la entidad de farmaco libre liberada y otra del conjugado de profarmaco no escindido aun. Para diferenciar la actividad del conjugado de profarmaco, el termino “actividad residual” se entiende en el presente documento como la parte de la actividad de profarmaco medida que puede atribuirse al conjugado de profarmaco.
El termino “autoescision” se entiende en el presente documento como escision hidrolltica limitante de la velocidad del enlace entre el grupo de union transitorio y la molecula de farmaco rhGH en una disolucion acuosa tamponada en condiciones fisiologicas de pH 7,4 y 37°C. La autoescision no requiere la presencia de enzima. Esta autoescision o autohidrolisis se controla mediante un grupo de induccion de autoescision, que forma parte de la molecula de profarmaco. Este grupo de induccion de autoescision puede estar presente tal cual o en una forma enmascarada de modo que se requiere desenmascaramiento antes de que pueda iniciarse el mecanismo de autohidrolisis.
La velocidad de autohidrolisis de grupo de union se refiere a la velocidad de escision de un profarmaco pegilado de hGH in vivo. Como los efectos enzimaticos u otros provocan casi siempre que la hidrolisis del grupo de union de profarmaco avance mas rapido in vivo que in vitro, se define que un profarmaco de hGH-PEG se escinde de modo autohidrolltico si la semivida in vivo del profarmaco es hasta 5 veces mas corta que la semivida in vitro del conjugado de profarmaco pegilado de hGH correspondiente.
El termino “union transitoria” o “grupo de union transitorio” se entiende en el presente documento como que describe la labilidad de la union entre PEG y rhGH en un profarmaco pegilado de rhGH. En tales uniones transitorias, rhGH se libera del profarmaco correspondiente con una semivida in vivo de grupo de union de hasta 1200 horas.
El termino “conjugado” se entiende en el presente documento como una o mas moleculas de PEG unidas covalentemente al farmaco que es en el presente documento la hormona de crecimiento humana.
El termino “transitorio conjugado” se refiere a profarmacos pegilados de hGH que contienen al menos una union transitoria.
El termino “conjugado permanente” se refiere a conjugados pegilados de hGH o los profarmacos en los que el pollmero de PEG se conecta a hGH por medio de uniones con una semivida in vitro de al menos 3000 horas. La semivida in vitro o semivida in vitro de grupo de union es la liberacion del 50% de hGH del profarmaco pegilado de hGH en tampon a pH 7,4 y 37°C.
Los terminos “semivida in vivo" o “semivida in vitro de grupo de union” se entienden como el intervalo de tiempo en el que se libera el 50% de la proporcion inicial de la hormona de crecimiento del profarmaco pegilado de hGH despues de la administracion al cuerpo humano, calculado teniendo el cuenta la semivida del conjugado correspondiente del compuesto tal como se describe en el ejemplo 2.
El termino “semivida del conjugado” se entiende como el intervalo de tiempo en el que se elimina el 50% de un conjugado permanente pegilado de hGH tal como se definio anteriormente de la circulacion sangulnea.
El termino “lipoatrofia” se entiende en el presente documento como un termino medico para la perdida localizada de tejido adiposo. En el presente contexto “lipoatrofia” se refiere a lipoatrofia en el sitio de inyeccion que significa que se produce lipolisis de tejido en estrecha proximidad del sitio de inyeccion.
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El termino “profarmaco” se entiende en el presente documento que es cualquier compuesto que experimenta transformacion antes de presentar sus efectos farmacologicos completos. Se facilita la clasificacion de los sistemas de profarmaco segun las definiciones de la IUPAC (
http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac/medchem, al que se accedio el 8 de marzo 2004):
Profarmaco
Un profarmaco es cualquier compuesto que experimenta biotransformacion antes de presentar sus efectos farmacologicos. Los profarmacos pueden considerarse por tanto farmacos que contienen grupos protectores no toxicos especializados usados de manera transitoria para alterar o para eliminar propiedades no deseadas en la molecula original.
Doble profarmaco (o pro-profarmaco)
Un doble profarmaco es una molecula biologicamente inactiva que se transforma in vivo en dos etapas (enzimatica y/o qulmicamente) en la especie activa.
Profarmaco unido a portador (Profarmaco portador)
Un profarmaco unido a portador es un profarmaco que contiene una union temporal de un principio activo dado con un grupo portador transitorio que produce propiedades fisicoqulmicas o farmacocineticas mejoradas y que puede retirarse facilmente in vivo, habitualmente mediante una escision hidrolltica.
Profarmaco en cascada
Un profarmaco en cascada es un profarmaco para el que la escision del grupo portador solo se vuelve eficaz despues de desenmascarar un grupo activante.
Biotransformacion
Biotransformacion es la conversion qulmica de sustancias por organismos vivos o preparaciones de enzimas.
De manera correspondiente, un grupo de induction de autohidrolisis en cascada solo se vuelve eficaz despues del desenmascaramiento de terminados elementos estructurales de induccion de autohidrolisis. Pueden requerirse una o mas etapas de desenmascaramiento en cascada para revelar los elementos estructurales de induccion de autohidrolisis. Al menos una de las etapas de desenmascaramiento puede basarse en una etapa de biotransformacion.
El termino “una composition farmaceutica que comprende una cantidad eficaz cllnica in vivo en seres humanos de un profarmaco pegilado de hormona de crecimiento humana recombinante (rhGH)” ha de entenderse como una cantidad que es suficientemente alta como para obtener un efecto cllnico deseado en un ser humano despues de la administration de la composicion farmaceutica al ser humano, por ejemplo un efecto cllnico deseado en relation con el tratamiento de una enfermedad relacionada con GH. En el presente contexto, el experto puede ajustar de manera rutinaria la cantidad de profarmaco pegilado de hormona de crecimiento humana recombinante (rhGH) que ha de administrarse para obtener un efecto cllnico deseado.
El termino “condiciones fisiologicas” se entiende en el presente documento como cualesquiera condiciones in vitro o in vivo, identica o que se asemeje a, las condiciones de pH y temperatura en el cuerpo humano. Mas especlficamente condiciones fisiologicas se refiere a condiciones a aproximadamente pH 7,4 (de pH 6,8 a pH 7,8) y aproximadamente 37°C (de 35°C a 40°C).
El termino “grupo de union” se usa frecuentemente en publicaciones en el campo de la bioconjugacion y describe ampliamente estructuras qulmicas usadas para conectar dos entidades moleculares. Tal conectividad puede ser de naturaleza permanente o transitoria.
Un grupo de union transitorio es un grupo de union en el que la conjugation de farmaco con molecula de PEG es reversible. Esto implica que la escision del grupo de union libera el farmaco en su forma nativa y activa. Puede ser diflcil diferenciar estructuralmente una unidad de grupo de union transitorio del pollmero portador en el caso de profarmacos portadores, particularmente si el pollmero se une de manera permanente al grupo de union y por tanto no se libera el producto de degradation relacionado con el grupo de union como consecuencia de la escicion del profarmaco.
El termino “grupo de union permanente” se refiere a un conjugado de PEG con un grupo amino primario donado por
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hGH mediante la formacion de una amida alifatica o un carbamato alifatico. Si se usan reactivos de pegilacion convencionales, los conjugados resultantes son habitualmente muy estables frente a la hidrolisis y la velocidad de escision del enlace amida o carbamato serla demasiado lenta para tener utilidad terapeutica en un sistema de profarmaco. No obstante, tales conjugados de grupo de union permanente son utiles para la investigacion de la utilidad terapeutica de un conjugado de profarmaco ya que permite la evaluacion de la actividad residual.
Si van a emplearse tales uniones estables en un enfoque de profarmaco, no es posible la escision del grupo funcional en un intervalo de tiempo terapeuticamente util sin catalisis enzimatica.
El termino “profarmaco soluble en agua” significa un profarmaco que es soluble en agua en condiciones fisiologicas. Normalmente, un profarmaco soluble en agua transmitira al menos el 75%, mas preferiblemente al menos el 95%, de la luz transmitida por la misma disolucion despues de filtracion. En una base en peso, un pollmero soluble en agua sera preferiblemente soluble en agua en al menos aproximadamente el 35% (en peso), todavla mas preferiblemente en al menos aproximadamente el 50% (en peso), todavla mas preferiblemente en al menos aproximadamente el 70% (en peso), todavla mas preferiblemente en al menos aproximadamente el 85% (en peso), todavla mas preferiblemente en al menos aproximadamente el 95% (en peso) o completamente soluble en agua.
El termino “PEG” o “residuo de pegilacion” se usa en el presente documento a modo de ejemplo para pollmeros solubles en agua adecuados caracterizados por unidades de repeticion. Pueden seleccionarse pollmeros adecuados del grupo que consiste en pollmeros de polialquiloxilo, acido hialuronico y derivados del mismo, poli(alcoholes vinllicos), polioxazolinas, polianhldridos, poliortoesteres, policarbonatos, poliuretanos, poli(acidos acrllicos), poliacrilamidas, poliacrilatos, polimetacrilatos, poliorganofosfacenos, polisiloxanos, polivinilpirrolidona, policianoacrilatos y poliesteres.
Las cadenas de PEG pueden consistir en un resto de interconexion, un resto de pollmero y un grupo terminal.
El termino “carga de PEG” se entiende en el presente documento como un descriptor de la masa molecular de una cadena de pollmero que consiste en varias unidades de repeticion unidas a hGH. La carga de PEG total se entiende como la masa molecular total de todas las cadenas de portador polimerico unidas a hGH en una base molecular.
Descripcion detallada de la invencion
Composicion farmaceutica que comprende excipientes farmaceuticos adecuados
Tal como conoce el experto una composicion farmaceutica comprende excipientes y/o portadores farmaceuticamente aceptables.
“Farmaceuticamente aceptable” pretende englobar cualquier excipiente y/o aditivo, que no interfiere en la eficacia de la actividad biologica del principio activo y que, no es toxico para el huesped al que se administra.
En una realizacion preferida, la composicion farmaceutica es una composicion para administracion subcutanea, administracion intramuscular o inyeccion intravenosa. Esto son ejemplos de vlas de administracion preferidas para el tratamiento de un trastorno/enfermedad relevante tal como se describe en el presente documento.
La composicion farmaceutica puede comprender otros principios activos distintos de un profarmaco pegilado de rhGH tal como se describe en el presente documento.
Hormona de crecimiento humana recombinante (rhGH)
Puesto que la GH humana recombinante es de secuencia identica a la GH humana natural, el termino hormona de crecimiento humana recombinante (rhGH) tambien se refiere en el presente documento a los denominados equivalentes biogenericos. Por tanto, los terminos rhGH y hGH pueden usarse de manera sinonima dentro del significado de la presente invencion.
El termino “productos biogenericos” se entiende en el presente documento como formas genericas de productos biofarmaceuticos; moleculas desarrolladas usando procesos biologicos, habitualmente a traves de actividad de biotecnologla moderna. Los productos farmaceuticos qulmicos genericos pueden definirse como aquellas moleculas que, en comparacion con el producto original: tienen esencialmente actividad similar, son esencialmente identicas qulmicamente a sus homologos de marca, son bioequivalentes, consiguen la autorizacion de comercializacion a traves de un procedimiento abreviado tras el vencimiento de la patente.
Tal como conoce el experto, hoy en dla es trabajo de rutina realizar, por ejemplo, cambios de amino menores de un producto biologico de interes (GH en el presente documento) sin afectar significativamente la actividad del producto
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biologico.
Ademas de productos biogenericos y humanos recombinantes, el termino hormona de crecimiento humana recombinante (rhGH) tambien se refiere en el presente documento a todos los posibles polipeptidos de rhGH.
Se facilita una descripcion precisa de posibles polipeptidos de rhGH en el documento WO-A 2005/079838 de Pharmacia Corporation proporcionada en la pagina 15, parrafo 0043 hasta e inclusive el parrafo 0053.
El termino “polipeptido de hGH o protelna hGH”, cuando se usa en el presente documento, engloba todos los polipeptidos de hGH, preferiblemente de especies de mamlferos, mas preferiblemente de especies murinas y de ser humano, as! como sus variantes, analogos, ortologos, homologos, y derivados, y fragmentos de los mismos que se caracterizan por fomentar el crecimiento en la fase de crecimiento y por mantener la composition, el anabolismo y el metabolismo de llpidos corporales normales.
El termino “polipeptido de hGH o protelna hGH” se refiere preferiblemente al polipeptido de hGH de 22 kDa que tiene una secuencia dada a conocer en A.L. Grigorian et al., Protein Science (2005), 14, 902-913 as! como sus variantes, homologos y derivados que presentan esencialmente la misma actividad biologica (fomentar el crecimiento en la fase de crecimiento y mantener la composicion, el anabolismo y el metabolismo de llpidos corporales normales). Mas preferiblemente, el termino “polipeptido de hGH o protelna hGH” se refiere al polipeptido que tiene exactamente la secuencia mencionada anteriormente.
Los derivados de hGH engloban especialmente conjugados de profarmaco de hGH que comprenden pollmeros unidos de manera permanente, como PEG, es decir el profarmaco de la presente invention puede comprender, ademas de uno o mas conjugados de pollmero de grupo de union transitorio, conjugados de pollmero de grupo de union permanente adicionales.
El termino “variantes de polipeptido de hGH”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a polipeptidos de la misma especie pero que difieren de un polipeptido de hGH de referencia. Generalmente, las diferencias son limitadas de modo que las secuencias de aminoacidos de la referencia y la variante son estrechamente similares de manera global y, en muchas regiones, identicas. Preferiblemente, los polipeptidos de hGH son identicos en al menos el 70%, el 80%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% a un polipeptido de hGH de referencia, preferiblemente el polipeptido de hGH que tiene una secuencia tal como se indica en A.L. Grigorian et al., Protein Science (2005), 14, 902-913. Por un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos al menos, por ejemplo, “identica” en el 95% a una secuencia de aminoacidos de consulta, se pretende que la secuencia de aminoacidos del polipeptido objeto sea identica a la secuencia de consulta excepto porque la secuencia de polipeptido objeto puede incluir alteraciones de hasta cinco aminoacidos por cada 100 aminoacidos de la secuencia de aminoacidos de consulta. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden producirse en posiciones amino o carboxilo- terminales de la secuencia de aminoacidos de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, intercaladas o bien individualmente entre residuos en la secuencia de referencia o en uno o mas grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. La secuencia de consulta puede ser toda una secuencia de aminoacidos de la secuencia de referencia o cualquier fragmento especificado tal como se describe en el presente documento.
Tales variantes de polipeptido de hGH pueden ser variantes que se producen de manera natural, tales como variantes alelicas que se producen de manera natural codificadas por una de varias formas alternas de una hGH que ocupa un locus dado en un cromosoma de un organismo, o isoformas codificadas por variantes de corte y empalme que se producen de manera natural que se originan a partir de un solo transcrito primario. Alternativamente, una variante de polipeptido de hGH puede ser una variante que no se sabe que se produce de manera natural y puede prepararse tecnicas de mutagenesis conocidas en la tecnica. Se sabe en la tecnica que uno o mas aminoacidos pueden delecionarse del extremo N-terminal o extremo C-terminal de una protelna o un peptido bioactivo sin perdida sustancial de funcion biologica (vease por ejemplo, Ron et al., (1993), Biol Chem., 268 2984-2988).
Tambien se reconocera por un experto habitual en la tecnica que algunas secuencias de aminoacidos de polipeptidos de hGH pueden variarse sin un efecto significativo de la estructura o funcion de la protelna. Tales mutantes incluyen deleciones, inserciones, inversiones, repeticiones y sustituciones seleccionadas segun reglas generales conocidas en la tecnica de modo que tengan poco efecto sobre la actividad. Por ejemplo, se proporciona orientation sobre como producir sustituciones de aminoacidos fenotlpicamente silenciosas en Bowie et al. (1990), Science 247:1306-1310, en el que los autores indican que existen dos enfoques principales para estudiar la tolerancia al cambio de una secuencia de aminoacidos.
El primer metodo se basa en el proceso de evolution, en el que las mutaciones o bien se aceptan o bien se rechazan mediante selection natural. El segundo enfoque usa la ingenierla genetica para introducir cambios de aminoacidos en posiciones especlficas de una hGH clonada y selecciones o examenes para identificar secuencias que mantienen la funcionalidad. Estos estudios han revelado que las protelnas son sorprendentemente tolerantes a las sustituciones de aminoacidos. Los autores indican ademas que es probable que los cambios de aminoacidos
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sean permisivos en una determinada posicion de la protelna. Por ejemplo, los residuos de aminoacido mas profundos requieren cadenas laterales apolares, mientras que generalmente se conservan pocas caracterlsticas de cadenas laterales de superficie. Se describen otras de tales sustituciones fenotlpicamente silenciosas en Bowie et al., (1990) citado anteriormente, y las referencias citadas en ese documento.
Normalmente se consideran sustituciones conservativas los reemplazos, uno por otro, entre los aminoacidos alifaticos Ala, Val, Leu y Phe, el intercambio de los residuos con hidroxilo Ser y Thr, el intercambio de los residuos acidos Asp y Glu, la sustitucion entre los residuos con amida Asn y Gln, el intercambio de los residuos basicos Lys y Arg y reemplazos entre los residuos aromaticos Phe, Tyr. Ademas, los siguientes grupos de aminoacidos representan generalmente cambios equivalentes: (1) Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Thr; (2) Cys, Ser, Tyr, Thr; (3) Val, Ile, Leu, Met, Ala, Phe; (4) Lys, Arg, His; (5) Phe, Tyr, Trp, His.
El termino polipeptido de hGH tambien engloba todos los polipeptidos de hGH codificados por analogos, ortologos y/o homologos de especies de hGH. Tal como se usa en el presente documento, el termino “analogos de hGH” se refiere a hGH de organismos diferentes y no relacionados que realizan las mismas funciones en cada organismo pero que no se originaron a partir de una estructura ancestral que tuvieran en comun los ancestros de los organismos. En su lugar, las hGH analogas surgieron por separado y despues evolucionaron para realizar la misma funcion (o funciones similares). En otras palabras, los polipeptidos de hGH analogos son polipeptidos con secuencias de aminoacidos bastante diferentes pero que realizan la misma actividad biologica, concretamente fomentar el crecimiento en la fase de crecimiento y mantener la composicion, el anabolismo y el metabolismo de llpidos corporales normales. Tal como se usa en el presente documento, el termino “ortologos de hGH” se refiere a hGH dentro de dos especies diferentes cuyas secuencias estan relacionadas entre si mediante una hGh homologa en una especie ancestral pero que han evolucionado para volverse diferentes entre si. Tal como se usa en el presente documento, el termino “homologos de hGH” se refiere a hGH de diferentes organismos que realizan las mismas funciones en cada organismo y que se originan a partir de una estructura ancestral que tenlan en comun los ancestros de los organismos. En otras palabras, los polipeptidos de hGH homologos son polipeptidos con secuencias de aminoacidos bastante similares que realizan la misma actividad biologica, concretamente fomentar el crecimiento en la fase de crecimiento y mantener la composicion, el anabolismo y el metabolismo de llpidos corporales normales. Preferiblemente, los homologos de polipeptido de hGH pueden definirse como polipeptidos que presentan una identidad de al menos el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% con un polipeptido de hGH de referencia, preferiblemente el polipeptido de hGH que tiene una secuencia tal como se menciono anteriormente.
Por tanto, un polipeptido de hGH puede ser, por ejemplo: (i) uno en el que uno o mas de los residuos de aminoacido se sustituyen por un residuo de aminoacido conservado o no conservado (preferiblemente un residuo de aminoacido conservado) y tal residuo de aminoacido sustituido puede ser o no uno codificado por el codigo genetico: o (ii) uno en el que uno o mas de los residuos de aminoacido incluyen un grupo sustituyente: o (iii) uno en el que el polipeptido de hGH se fusiona con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la semivida del polipeptido (por ejemplo, polietilenglicol): o (iv) uno en el que los aminoacidos adicionales se fusionan a la forma anterior del polipeptido, tal como una secuencia secretora o llder o peptido de region de fusion IgG-Fc o una secuencia que se emplea para la purification de la forma anterior del polipeptido o una secuencia de pro-protelna. Los polipeptidos de hGH puede ser monomeros o multlmeros. Los multlmeros puede ser dlmeros, trlmeros, tetrameros o multlmeros que comprenden al menos cinco unidades monomericas de polipeptido. Los multlmeros tambien pueden ser homodlmeros o heterodlmeros. Los multlmeros pueden ser el resultado de asociaciones hidrofobas, hidrofilas, ionicas y/o covalentes y/o pueden unirse indirectamente, por ejemplo, mediante la formation de liposomas. En un ejemplo, las asociaciones covalentes son entre las secuencias heterologas contenidas en una protelna de fusion que contiene un polipeptido de hGH o fragmento del mismo (vease, por ejemplo, la patente estadounidense numero 5.478.925). En otro ejemplo, un polipeptido de hGH o fragmento del mismo se une a uno o mas polipeptidos que pueden ser o bien polipeptidos de hGH o bien polipeptidos heterologos a traves de grupos de union peptldicos tales como los descritos en el documento US 5.073.627.
Otro metodo para preparar polipeptidos de hGH multlmeros implica el uso de polipeptidos de hGH fusionados a una secuencia de polipeptido de cremallera de leucina o cremallera de isoleucina que se sabe que fomenta la multimerizacion de las protelnas en las que se encuentran usando tecnicas conocidas por los expertos en la tecnica incluyendo las ensenanzas del documento WO 94/10308. En otro ejemplo, pueden asociarse polipeptidos de hGH mediante interacciones entre la secuencia de polipeptido Flag® contenida en polipeptidos de hGH de fusion que contienen la secuencia de polipeptido Flag®. Tambien pueden generarse multlmeros de hGH usando tecnicas qulmicas conocidas en la tecnica tal como reticulation usando moleculas de grupo de union y tecnicas de optimization de la longitud de moleculas de grupo de union conocidas en la tecnica (vease, por ejemplo, el documento US 5.478.925), tecnicas conocidas en la tecnica para formar una o mas reticulaciones intermoleculares entre los residuos de cistelna ubicados dentro de la secuencia de los polipeptidos que se desea que esten contenidos en el multlmero (vease, por ejemplo, el documento US 5.478.925, adicion de cistelna o biotina al extremo C-terminal o extremo N-terminal del polipeptido de hGH y tecnicas para generar multlmeros que contienen uno o mas de estos polipeptidos modificados (vease, por ejemplo, el documento US 5.478.925), o cualquiera de las 30 tecnicas para generar liposomas que contienen multlmeros de hGH (vease, por ejemplo, la patente estadounidense
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numero 5.478.925).
Tal como se usa en el presente documento, el termino “fragmento de polipeptido de hGH” se refiere a cualquier peptido o polipeptido que comprende un tramo contiguo de una parte de la secuencia de aminoacidos de un polipeptido de hGH, preferiblemente el polipeptido que tiene la secuencia mencionada anteriormente.
Cadenas de polimero de profarmaco pegilado de rhGH - PEG preferido
Tal como se analizo anteriormente, el profarmaco pegilado de rhGH tal como se describe en el presente documento tendra una actividad relativamente baja.
Por consiguiente, en una realization preferida la carga de PEG total por molecula de hormona de crecimiento asciende a al menos 25 kDa. Generalmente la carga de PEG total sera menor de 1000 kDa. Preferiblemente, la carga de PEG es de al menos 25 kDa y como maximo de 500 kDa, incluso mas preferiblemente de al menos 30 kDa y como maximo de 250 kDa, incluso mas preferiblemente de al menos 30 kDa y como maximo de 120 kDa, incluso mas preferiblemente de al menos 40 kDa y como maximo de 100 kDa, incluso mas preferiblemente de al menos 40 kDa y como maximo de 90 kDa.
PEG puede unirse a hGH a traves de uno o mas puntos de anclaje. En caso de un punto de anclaje, el PEG correspondiente en el monoconjugado de profarmaco de hGH-PEG sera ramificado y contendra al menos 3 cadenas.
Un PEG ramificado es una molecula de PEG que consiste en un punto de ramification que conecta dos o mas cadenas de PEG, para formar una molecula con un punto de anclaje para la union a la hormona de crecimiento. Esto podran ser dos cadenas de PEG de 20 kDa unidas para formar una molecula de PEG de 40 kDa ramificado. En el caso en el que la molecula contiene dos o tres puntos de ramificacion, la molecula se denomina PEG con 3 y 4 brazos, respectivamente.
En resumen y dentro de las restricciones mencionadas anteriormente, el polimero de PEG no se limita a una estructura particular y puede ser ramificado, o de multiples brazos (por ejemplo PEG en horquilla o PEG unido a un poliol de nucleo), dendrltico o con grupos de union degradables.
Sin limitarse a la teorla, se pretende que la carga de PEG proporcione una masa molecular adecuada para obtener la actividad relativamente baja requerida y no tener una masa molecular demasiado alta del PEG que crearla otros problemas.
La pegilacion con GH humana nativa puede producirse en varios grupos lisina o en la amina N-terminal (F1) tal como se describe bien por Clark et al. (referencia 2 en el presente documento) en la pagina 21973, tabla III. Son altamente reactivas las posiciones F1 y LYS-140. Son posiciones moderadamente reactivas LYS-115, LYS-38 y LYS-70. Son escasamente reactivas las posiciones LYS-172, LYS-41, LYS-158 y LYS-168.
En terminos mas generales, el PEG usado en el presente documento en combination con un grupo de union transitorio puede reducir el riesgo de lipoatrofia mediante la election adecuada de dicho polimero. Sin embargo, los principios de la presente invention tambien se aplican a polimeros distintos de PEG. Por tanto, el termino PEG solo se usa en el presente documento a modo de ejemplo para polimeros adecuados.
El conjugado de profarmaco pegilado comprendido en la composition farmaceutica tiene la estructura quimica (A):
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en la que
NH-rhGH representa el residuo de rhGH unido al grupo de union transitorio;
R1, R2, R3, R4, y R5 se seleccionan independientemente de hidrogeno, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, terc-butilo,
PEG representa el residuo de pegilacion unido al grupo de union transitorio, y n = 1 o 2, y
X se selecciona de alquilo C1 a C8 o heteroalquilo C1 a C12.
El termino “heteroalquilo C1 a C12” significa una cadena de alquilo que tiene de 1 a 12 atomos de carbono que estan interrumpidos opcionalmente por heteroatomos, grupos funcionales, carbociclos o heterociclos tal como se definio anteriormente.
Se proporcionan estructuras mas preferidas estructuras mediante la formula general I, que forman parte de la estructura (A) dentro de la estructura de grupo de union aromatica general anterior:
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I
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Formula I
y en la que los ejemplos preferidos de formula I comprenden:
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Estructuras aromaticas de formula II mas preferidas, que forman parte de la estructura (A) dentro de la estructura de grupo de union aromatica general anterior:
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y en la que los ejemplos preferidos de formula II comprenden:
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Estructuras de formula III mas preferidas, que forman parte de la estructura (A) dentro de la estructura de grupo de union aromatica general anterior, en la que PEG-X es
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Formula III
y PEG-W incluye los siguientes grupos sustituyentes:
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Un ejemplo de conjugados de profarmaco preferidos se muestra a continuation:
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5 En una realization preferida, los profarmacos de la presente invention se seleccionan del grupo que consiste en
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en la que m es un numero entero desde 200 hasta 250 y n es un numero entero desde 100 hasta125;
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en la que n es un numero entero desde 400 hasta 500;
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en la que n es un numero entero desde 400 hasta 500; y
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en la que n es un numero entero desde 400 hasta 500.
Los profarmacos de la presente invencion pueden prepararse mediante metodos conocidos en la tecnica. Ensayos para determinar las propiedades funcionales de profarmaco pegilado de rhGH
Actividad y semivida del conjugado
Para determinar la actividad y la semivida del conjugado de profarmaco descrito en el presente documento, es necesario sintetizar un conjugado “permanente”, que no experimenta autohidrolisis, es decir un conjugado permanente.
5 Esto se logra sintetizando una molecula identica al profarmaco pegilado de rhGH, aparte de modificando la parte de la estructura del grupo de union, que inicia la autoescision. Tal compuesto correspondiente tendra actividad residual y semivida circulante del conjugado identicas a la del profarmaco pegilado de rhGH. Mas generalmente, para cualquier profarmaco conjugado con grupo de union transitorio autohidrolizable (autoescision) puede preverse sintetizar una molecula identica al profarmaco, aparte de la capacidad para experimentar autoescision, realizando 10 una modificacion menor de la estructura del grupo de union.
El motivo de usar el conjugado correspondiente es que si el grupo de union transitorio autohidrolizable (autoescision) tal como se describe en el presente documento se aplica al ensayo mencionado en el ejemplo 1, el conjugado comenzara obviamente de manera inmediata a liberar el farmaco sin modificar, lo que influira en los resultados del ensayo. En otras palabras, no es posible medir la actividad residual sin preparar un conjugado permanente ya que el 15 farmaco nativo inalterado, por ejemplo rhGH, se liberara y contribuira a la actividad medida. Esto resulta obvio para el experto.
Por este motivo tal como se explico anteriormente, la actividad residual de los profarmacos conjugados con grupo de union transitorio autohidrolizable (autoescision) se expresan como la actividad de los conjugados permanentes correspondientes. Los conjugados permanentes se preparan de modo similar a los profarmacos conjugados con 20 grupo de union transitorio autohidrolizable (autoescision) (ejemplos 20 a 23), pero con una modificacion menor de la estructura del grupo de union, de modo que el grupo de union ya no puede experimentar autoescision. La preparacion de conjugados permanentes se describe en el ejemplo 10 al ejemplo 19.
El profarmaco pegilado de rhGH tal como se describe en el presente documento se caracteriza porque:
(1): el conjugado tiene una actividad GH que es menor del 5% de la hormona de crecimiento nativa sin PEG; y
25 (2): la velocidad de autohidrolisis de grupo de union es tal que la semivida in vivo es de desde 10 horas hasta
600 horas que se mide mediante inyeccion intravenosa en ratas del conjugado, seguido por la extraccion de muestras de sangre a intervalos de tiempo, preparacion de plasma y analisis de hGH usando ELISA; y
en el que el conjugado de profarmaco pegilado tiene la estructura qulmica (A):
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30 en la que
HN-rhGH representa el residuo de rhGH unido al grupo de union transitorio;
R1, R2, R3, R4, y R5 se seleccionan independientemente de hidrogeno, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, terc-butilo;
PEG representa el residuo de pegilacion unido al grupo de union transitorio;
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X se selecciona de alquilo C1 a C8 o heteroalquilo C1 a C12; y en la que el PEG es ramificado y contiene al menos 3 cadenas.
El ensayo para determinar la propiedad (1) se describe en detalle en el ejemplo de trabajo 1 en el presente documento. Basandose en estas instrucciones detalladas, es trabajo de rutina para el experto medir esta actividad residual del profarmaco.
En una realizacion preferida, la actividad residual de la propiedad (1) es menor del 3%, incluso mas preferiblemente menor del 1% y lo mas preferiblemente practicamente inactiva.
El ensayo para determinar la propiedad (2) se describe en detalle en el ejemplo de trabajo 2 en el presente documento. Basandose en estas instrucciones detalladas, es trabajo de rutina para el experto medir esta velocidad de autoescision del grupo de union transitorio del profarmaco.
En una realizacion preferida, la semivida in vivo de velocidad de autoescision es tal que la semivida in vivo es de desde 20 horas hasta 300 horas, mas preferiblemente desde 20 horas hasta 150 horas, incluso mas preferiblemente desde 30 horas hasta 150 horas, incluso mas preferiblemente desde 30 horas hasta 100 horas, incluso mas preferiblemente desde 40 horas hasta 100 horas incluso mas preferiblemente desde 50 hasta 75 horas y tambien incluso mas preferiblemente desde 30 hasta 75 horas.
Correlacion in vivo e in vitro
Se sabe a partir de solicitudes de patente previas de la empresa Ascendis Pharma (Complex Biosystems Company) que existe una correlacion entre las velocidades de escision de grupo de union in vitro e in vivo. Puede predecirse facilmente la cinetica de liberacion in vivo a partir de los datos experimentales in vitro.
Lipoatrofia
Tal como se describio anteriormente, la lipoatrofia es lipolisis que se produce en estrecha proximidad del sitio de inyeccion. Por tanto, puede usarse la medicion de la lipolisis in vitro de hormona de crecimiento y conjugados de hormona de crecimiento para estimar el efecto de lipoatrofia de los conjugados.
Para determinar el efecto lipolltico del conjugado de profarmaco descrito en el presente documento, es necesario sintetizar un “conjugado permanente, que no experimenta autohidrolisis, es decir un conjugado permanente.
El ensayo para determinar la lipoatrofia se describe en detalle en el ejemplo de trabajo 3 en el presente documento. Basandose en estas instrucciones detalladas, es trabajo de rutina para el experto medir la lipoatrofia.
En una realizacion preferida, el conjugado de profarmaco pegilado de rhGH, tal como se describe en el presente documento, tiene un efecto de lipoatrofia que es comparable al de la hormona de crecimiento humana, medido segun el ensayo para determinar la lipoatrofia del ejemplo 3 y otras condiciones de regimen de dosificacion identicas.
Enfermedades relacionadas con GH
El termino una enfermedad “relacionada con GH” del segundo aspecto se refieren simplemente en el presente documento a enfermedades y estados en los que un ser humano podrla beneficiarse de GH.
Esto incluye, deficiencia de hormona de crecimiento, deficiencia de hormona de crecimiento de inicio en la edad adulta, slndrome de Turner, slndrome de Prader-Willi, slndrome del intestino corto, insuficiencia renal cronica, pequeno para la edad gestacional (SGA), emaciacion debida al SIDA, antienvejecimiento, artritis reumatoide, talla baja idiopatica, gen de caja homeo de talla baja y somatopausia. Tambien se incluye otro estado de talla baja, que incluye slndrome de Noonan, displasia esqueletica, slndrome de Down, talla baja asociada con el uso prolongado de esteroides, slndrome de Aarskog, entre otros.
Tambien se incluyen enfermedad renal cronica, artritis reumatoide juvenil; fibrosis qulstica, infeccion por VIH en ninos que reciben tratamiento de TARGA (VIH/HALS ninos); talla baja en ninos nacidos con un peso al nacer muy bajo (VLBW) pero SGA; displasia esqueletica; hipocondroplasia; acondroplasia; talla baja idiopatica (ISS); DHC en adultos; fracturas en o de huesos largos, tales como tibia, perone, femur, humero, radio, cubito, clavlcula, metacarpos, metatarsos y dedos; fracturas en o de huesos esponjosos, tales como el craneo, la base de la mano y la base del pie; pacientes despues de una cirugla de tendones o ligamentos por ejemplo en la mano, la rodilla o el hombro; osteogenesis por distraccion; trastornos que resultan de artroplastia de cadera o de discos, reparacion de
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menisco, fijacion de protesis o artrodesis vertebrales, tal como en la rodilla, cadera, el hombro, el tobillo, la muneca o la mandlbula; trastornos que resultan de la fijacion de material de osteoslntesis, tal como clavos, tornillos y placas; pseudoarticulacion o consolidacion defectuosa de fracturas; trastornos que resultan de osteatomla, por ejemplo de la tibia o el dedo gordo; trastornos que resultan de la implantacion de injertos; degeneration de cartllago articular en la rodilla provocada por traumatismo o artritis; osteoporosis en pacientes con slndrome de Turner; osteoporosis en hombres; pacientes adultos en dialisis cronica (PADC); enfermedad cardiovascular asociada con desnutricion en PADC; reversion de caquexia en PADC; cancer en PADC; enfermedad pulmonar obstructiva cronica en PADC; VIH en PADC; ancianos con PADC; enfermedad hepatica cronica en PADC, slndrome de fatiga en PADC; enfermedad de Crohn; insuficiencia hepatica; hombres con infecciones por VIH; slndrome del intestino corto; obesidad central; slndrome de lipodistrofia asociado con VIH (HALS); esterilidad masculina; pacientes despues de cirugla mayor programada, deshabituacion de alcohol/drogas o traumatismo neurologico; envejecimiento; ancianos fragiles; osteoartritis; cartllago danado de manera traumatica; disfuncion erectil; fibromialgia; trastornos de la memoria; depresion; traumatismo craneoencefalico; hemorragia subaracnoidea; un peso al nacer muy bajo; metabolico slndrome de; miopatla por glucocorticoides; y talla baja debida a tratamiento con glucocorticoides en ninos.
Figuras
En las figuras, se muestra lo siguiente.
La figura 1 muestra el analisis mediante SDS-PAGE de conjugados PEG-hGH permanentes purificados, en la que el carril 1: patron proteico de alto peso molecular pretenido HiMark™; carril 2: compuesto 23; el carril 3: compuesto 23; el carril 4: compuesto 25; el carril 5: compuesto 26, el carril 6: compuesto 33; el carril 7: compuesto 32; el carril 8: compuesto 28; el carril 9: compuesto 28; el carril 10: compuesto 28; el carril 11: compuesto 30; el carril 12: compuesto 34; el carril 13: compuesto 34; el carril 14: compuesto 27; el carril 15: compuesto 29.
La figura 2 muestra el cromatograma de exclusion molecular de la disolucion de reaction extinguida de la slntesis del conjugado 28 y el cromatograma de exclusion molecular de 28 purificado.
La figura 3 muestra la purification mediante cromatografla de intercambio cationico del conjugado 35 y el cromatograma de exclusion molecular de 35 purificado.
La figura 4 muestra la purificacion mediante cromatografla de intercambio cationico del conjugado 36 y el cromatograma de exclusion molecular de 36 purificado.
La figura 5 muestra la purificacion mediante cromatografla de intercambio cationico del conjugado 37 y el cromatograma de exclusion molecular de 37 purificado.
La figura 6 muestra cromatogramas de exclusion molecular de muestras del conjugado 35 incubadas en tampon a pH 7,4 y 37°C en diversos puntos de tiempo.
La figura 7 muestra curvas de respuesta farmacodinamica del conjugado 36.
Ejemplos
Metodos
RP-HPLC analitica y preparativa
Se realizo RP-HPLC analltica/ESI-EM en equipos de Waters que consisten en un gestor de muestras 2695, un detector de absorbancia dual 2487 y un instrumento de ESI ZQ 4000 equipado con una columna de 5 pm Reprosil Pur 300 A ODS-3 (75 x 1,5 mm) (Dr. Maisch, Ammerbuch, Alemania; velocidad de flujo: 350 pl/min, gradiente tlpico: acetonitrilo al 10-90% en agua, TFA al 0,05% a lo largo de 5 min). Para RP-HPLC preparativa, se uso un controlador Waters 600 y un detector de absorbancia dual 2487 equipado con las siguientes columnas (Reprosil Pur 300 A ODS- 3)
A) : 100x20 mm, velocidad de flujo de 10 ml/min, gradiente tlpico: acetonitrilo al 10-90% en agua, TFA al 0,1% a lo largo de 11 min o
B) : 100x40 mm (partlculas de 10 pm), velocidad de flujo de 40 ml/min, gradiente tlpico: acetonitrilo al 10-90% en agua, TFA al 0,1% a lo largo de 11 min.
Cromatografla de intercambio cationico
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Se realizo la purificacion de conjugados mediante cromatografla de intercambio cationico usando un sistema AKTA Explorer (GE Healthcare) equipado con una columna Macrocap SP. Se aplico el conjugado respectivo en tampon acetato de sodio 20 mM pH 4 a la columna que se equilibro previamente en tampon acetato de sodio 20 mM pH 4 (tampon A). Se lavo la columna con tres volumenes de columna de tampon A para retirar cualquier cantidad de reactivo PEG sin reaccionar. Se eluyeron los conjugados usando un gradiente de tampon B al 10-60% (acetato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 1 M, pH 4,5) a lo largo de 20 volumenes de columna o tampon B al 0-40% a lo largo de 20 volumenes de columna y luego B al 40-80% a lo largo de tres volumenes de columna. La velocidad de flujo era de 7 ml/min y se monitorizo el eluyente mediante detection a 280 nm.
Cromatografla de intercambio anionico
Se realizo la purificacion de conjugados mediante cromatografla de intercambio anionico usando un sistema AKTA Explorer (GE Healthcare) equipado con una columna Source Q. Se aplico el conjugado respectivo en tampon Tris 20 mM/HCl pH 7,5 (tampon C) a la columna que se equilibro previamente en tampon C. Se lavo la columna con tres volumenes de columna de tampon C para retirar cualquier cantidad de reactivo PEG sin reaccionar. Se eluyeron los conjugados usando un gradiente de tampon D al 0-20% (Tris 20 mM/HCl, cloruro de sodio 1 M, pH 7,5) a lo largo de 25 volumenes de columna. La velocidad de flujo era de 5 ml/min y se monitorizo el eluyente mediante deteccion UV a 280 nm. Alternativamente, se uso el sistema de tampon de bis-tris 20 mM/HCl, pH 6,5 (tampon E) y bis-tris 20 mM/HCl, cloruro de sodio 1 M, pH 6,5 (tampon F).
Cromatografla de exclusion molecular analitica
Se realizo un analisis mediante cromatografla de exclusion molecular analitica en un sistema AKTA Explorer (GE Healthcare). Se analizaron muestras usando una columna Superdex 200 o Sepharose 6 (10 x 300 mm) y se uso fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 135 mM, pH 7,4 como fase movil. La velocidad de flujo para la columna era de 0,75 ml/min y se detectaron la hGH y los conjugados polimero-hGH eluidos a 215 nm y 280 nm.
Determination de actividad de reactivos de mPEG-grupo de union activados por pfp
Se disolvio una cantidad definida de reactivo de mPEG-grupo de union activado por pfp (3-5 mg) en 100 ml de agua. Se anadieron 10 ml de NaOH 0,5 M y se hizo reaccionar la mezcla de reaction durante 60 min a 40°C. Se anadieron 1,5 ml de TFA y se analizo el 10% de esta mezcla mediante RP-HPLC analitica. Se registraron los cromatogramas a 260 y 280 nm. Se integro el pico correspondiente a pentafluorofenol. Se compararon los valores determinados con una curva de calibration adecuada generada mediante el analisis de cantidades definidas de pfp mediante RP- HPLC analitica y la integration de los cromatogramas registrados a 260 y 280 nm.
Analisis mediante SDS-PAGE
Se analizaron los conjugados mPEG-hGH permanentes usando geles de Tris-acetato NuPAGE® Novex (1,5 mm de grosor, 15 carriles), tampon de corrida de Tris-acetato-SDS NuPAGE, patron proteico de alto peso molecular pretenido HiMark™ y Simply Blue™ SafeStain (Invitrogen). En cada carril, se aplicaron 0,2-0,6 mg de conjugado y se realizaron la electroforesis y la tincion posterior segun el protocolo del proveedor.
Ejemplo 1: Ensayo para medir la actividad de hGH y el profarmaco pegilado de hGH
Se mide la actividad biologica de hGH usando ensayos convencionales conocidos por el experto en la tecnica. Tal como se describe en el documento EP1715887B1 y tambien tal como se analizo anteriormente, puede medirse la actividad biologica asociada con la hGH nativa o modificada (por ejemplo una hGH pegilada), usando ensayos de proliferation de celulas FDC-P1 convencionales, (Clark et al, Journal of Biological Chemistry 271: 21969-21977) o ensayo de union a receptor (documento US5057417).
En la linea 8 (pagina 14) de la patente EP1715887B1, se describe que la actividad in vitro preferida tiene que ser tan alta como sea posible, lo mas preferido la hGH modificada tiene una actividad biologica equivalente o mejorada in vitro. En la presente invention, la actividad biologica tiene que ser tan baja como sea posible en comparacion con hGH nativa. Por tanto, los presentes inventores hicieron completamente lo opuesto en comparacion con la tecnica anterior descrita en el documento EP1715887B1.
Ensayo in vitro
Se determinan las actividades in vitro de los conjugados PEG-hGH permanentes descritos en los ejemplos a continuation usando uno o mas ensayos convencionales para evaluar la actividad biologica in vitro. Los ensayos convencionales que pueden emplearse incluyen ensayos de proliferacion celular usando, por ejemplo, celulas fDC- PI (vease, por ejemplo, Clark et al., Journal of Biological Chemistry, 271:21969-21977, 1996) o celulas Ba/F3-hGHR,
que expresan receptores para hGH, hGH delta 135-146, o celulas de linfoma de rata Nb2, que proliferan en respuesta a hGH mediante los receptores lactogenicos (vease, por ejemplo, Alam, K. S., et al., J. Biotech 28 de febrero de 2000, 78(1), 49-59). Tambien pueden usarse ensayos de union a receptor (vease, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5.057.417).
5 Nb2-11 es un clon de la llnea de linfoma de rata Nb-2 que se derivo de un trasplante de un linfoma que se desarrollo
en el timo/ganglio linfatico de una rata de raza noble (Nb) macho tras el tratamiento prolongado con estrogenos. Las celulas son del origen de celulas pre-T y su proliferacion depende de lactogenos de mamlfero, tales como prolactina. Nb2-11 tambien pueden estimularse de manera mitogena mediante IL-2. La inyeccion de celulas Nb2 en ratas Nb da lugar a tumores malignos que son altamente sensibles al tratamiento con alcaloides de la vinca. El analisis 10 cariotlpico ha mostrado que la llnea celular tiene solo cinco anomallas cromosomicas bien desarrolladas. Las celulas no expresan inmunoglobulina de superficie, y se confirma su dependencia de los lactogenos. Estan disponibles protocolos para el uso celulas Nb2-11 en bioensayos de ECACC a peticion.
Tal como se describe en el documento WO2006102659 en la pagina 74, parrafo 0240, ejemplo 7, la actividad biologica de hGH y los conjugados descritos en el presente documento se evaluara in vitro usando un ensayo de 15 proliferacion de celulas de linfoma de rata NB2-11. En resumen, se incuban celulas NB2-11 derivadas de un linfoma de rata con hGH, lo que conduce a la union de la molecula de hGH a su receptor en la celula superficie. La union a receptor induce la cascada de transduccion de senales, lo que da como resultado la proliferacion de las celulas. Los resultados del ensayo se basan en el contenido de protelna determinado, y una bioactividad del 100% de hGH sin modificar.
20 Conclusion:
Basandose en las instrucciones detalladas de este ejemplo 1 es trabajo de rutina para el experto medir esta actividad residual del profarmaco.
Ejemplo 2: Ensayo para medir la velocidad de autoescision del grupo de union transitorio del profarmaco.
Determinacion de semivida in vitro
25 Para la determinacion de la velocidad de escision de grupo de union in vitro de conjugados PEG-grupo de union- hGH, se disuelven los compuestos en tampon a pH 7,4 (por ejemplo fosfato de sodio 10 mM, NaCl 140 mM, EDTA 3 mM) y se filtra la disolucion a traves de un filtro de 0,22 pm y se incuba a 37°C. Se toman muestras a intervalos de tiempo y se analizan mediante RP-HPLC o cromatografla de exclusion molecular a 215 nm. Se integran los picos correspondientes a hGH liberada y se representan graficamente frente al tiempo de incubacion. Se aplica software 30 de ajuste de curvas para determinar velocidad de escision de primer orden.
Determinacion de la semivida in vivo y correlacion de semivida in vitro/in vivo
Se determinan velocidades de escision de grupo de union in vivo comparando la farmacocinetica de los conjugados PEG-hGH permanentes con el conjugado transitorio PEG-grupo de union-hGH respectivo que porta el mismo resto de PEG despues de inyeccion intravenosa en la rata.
35 En primer lugar, se inyecta el conjugado PEG-hGH permanente por via intravenosa en ratas y se toman muestras de sangre a intervalos de tiempo, se prepara plasma y se analiza para determinar hGH usando un ELISA.
En segundo lugar, se inyecta el conjugado PEG-hGH transitorio por via intravenosa en ratas, se toman muestras de sangre a intervalos de tiempo, se prepara plasma y se analiza para determinar hGH usando un ELISA.
Se calcula la semivida in vivo a partir de la razon de concentracion de hGH de conjugado transitorio dividida entre la 40 concentracion de hGH de conjugado permanente en los puntos de tiempo respectivos y el ajuste de curvas. Se comparan los datos con las mediciones de semivida in vitro.
Conclusion
Basandose en las instrucciones detalladas de este ejemplo 2 es trabajo de rutina para el experto medir la semivida in vivo del profarmaco pegilado de hGH.
45 Ejemplo 3: Ensayo para medir la lipoatrofia
Tal como se dijo anteriormente, el compuesto PHA-794428 es una hGH pegilada y se describe en la patente EP1715887 de la empresa Pharmacia. Segun
www.clinicaltrials.gov, se termino el estudio el 10 de diciembre de
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2007. La decision de Pfizer de terminar el programa se debio a casos de lipoatrofia en el sitio de inyeccion que se notificaron en estudios clinicos de fase 2 despues de una unica inyeccion de PHA 794428. Lipoatrofia es el termino que describe la perdida localizada de tejido adiposo y es visible en seres humanos como orificios en la piel (visibles a simple vista).
Ensayo
Existen varios metodos in vitro descritos en la tecnica en la medida de la lipoatrofia. Se describe una propuesta en la publicacion J. Anim. Sci (1972), 35: 794-800 (L.J. Machlin) en la pagina 795. Se encuentra otra descripcion en Int. J. Cancer; 80, 444 - 447 (1999).
Generalmente, puede medirse la lipoatrofia tal como se propone a continuacion.
El efecto lipolitico puede determinarse usando un ensayo in vitro que consiste en adipocitos de mamifero aislados, preferiblemente adipocitos murinos. Se incubaron las muestras que iban a someterse a ensayo en condiciones fisiologicamente relevantes con un numero predeterminado de adipocitos en tampon bicarbonato de Krebs-Ringer que contenia los nutrientes apropiados durante hasta 6 horas. Se determina la concentracion de glicerol liberado mediante metodos convencionales, por ejemplo enzimaticamente o mediante una deteccion radiometrica. Se analizan muestras de control que contienen adipocitos solos para determinar la liberacion espontanea de glicerol.
El efecto lipolitico de hormona de crecimiento humana recombinante nativa sin modificar y hormona de crecimiento humana recombinante pegilada de manera permanente se compara con el de hormona de crecimiento humana recombinante pegilada de manera transitoria.
Conclusion
Basandose en las instrucciones detalladas de este ejemplo 3 es trabajo de rutina para el experto medir el efecto de lipoatrofia.
Ejemplo 4 Sfntesis del reactivo de grupo de union permanente 12a y los reactivos de grupo de union transitorio 12b y 12c
Sintesis del compuesto 6
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Se disolvio 6-amino-hexan-1-ol (2,85 g, 24,3 mmol) en HBr ac. (al 48%, 10 ml, 89 mmol) y se agito a 80°C durante 3 h. Se evaporo el HBr en exceso a 50-65°C y 15 Torr y se seco el residuo a vacio.
1: Rendimiento de 6,07 g (96%)
EM [M+H]+ = 180,3 g/mol (PM+H calculado = 180,0 g/mol)
Se anadio DBU (3,5 ml, 23,2 mmol) a una suspension de clorhidrato de 6-bromohexilamina 1 (3,03 g, 11,6 mmol) y se anadieron trifenil-metanotiol (2,14 g, 7,74 mmol) en DCM (25 ml) y DMSO (13 ml). Se agito la mezcla de reaccion durante 30 min a temperatura ambiente y se diluyo con agua (150 ml).
Se extrajo la fase acuosa con eter y se evaporo la fase organica combinada. Se purifico 2 mediante RP-HPLC.
2: Rendimiento de 1,17 g (40%)
EM [M+H]+ = 376,7 g/mol (PM+H calculado = 376,2 g/mol)
Se anadio DBU (4,56 ml, 30,0 mmol) a acido 6-bromo-hexanoico (3,90 g, 20,0 mmol) y trifenil-metanotiol (11,1 g, 40,0 mmol) en DCM (40 ml). Despues de agitar a temperatura ambiente durante 1 h, se anadio H2SO4 1 M enfriado con hielo (50 ml) y se extrajo la mezcla con DCM. Se seco la fase organica combinada sobre Na2SO4 y se concentro a vacio. Se purifico el compuesto 3 mediante cromatografia en columna sobre gel de silice (200 ml) usando heptano/acetato de etilo (4/1, Rf=0,2) como fase movil.
3: Rendimiento de 5,83 g (75%)
Se anadio DMAP (37 mg, 0,31 mmol) a acido 6-tritilsulfanil-hexanoico 3 (5,83 g, 14,9 mmol), tiazolidin-2-ona (3,56 g, 29,9 mmol) y diciclohexilcarbodiimida (3,08, 14,9 mmol) en DCM (100 ml). Despues de agitar a temperatura ambiente durante 1 h se anadio HCl 1 M (0,6 ml) y se filtro la mezcla. Se concentro el filtrado a vacio y se purifico 4 mediante cromatografia en columna sobre gel de silice (180 ml) usando heptano/acetato de etilo (1/1) como fase movil.
4: Rendimiento de 7,15 g (97%) como un aceite amarillo
Se anadio una disolucion de 1 -(2-tioxo-tiazolidin-3-il)-6-tritilsulfanil-hexan-1-ona 4 (1,53 g, 3,11 mmol) en THF (13 ml) a lo largo de un periodo de 2 min a 6-tritilsulfanil-hexilamina 2 (1,17 g, 3,11 mmol) en DMSO (1 ml) y THF (5 ml). Despues de la adicion de trietilamina (435 ml, 3,11 mmol) se agito la mezcla de reaccion durante 90 min a temperatura ambiente. Se anadieron eter (200 ml) y agua (100 ml) y se separaron las fases. Despues de la extraccion de la fase acuosa con eter, se secaron las fases organicas combinadas sobre Na2SO4 y se concentraron a vacio. Se purifico el compuesto 5 mediante cromatografia en columna sobre gel de silice (150 ml) usando heptano/acetato de etilo (2/1, Rf=0,1) como fase movil.
5: Rendimiento de 1,23 g (53%)
EM [M+Na]+ = 770,6 g/mol (PM+Na calculado = 770,4 g/mol)
Bajo nitrogeno, se puso una disolucion 1 M de LiAlH4 en THF (1,2 ml, 4,8 mmol) en un matraz seco y se anadio una disolucion de 5 (509 mg, 0,680 mmol) en 10 ml de THF a lo largo de 4 min. Se agito la mezcla a reflujo durante 2 h, hasta que se mostro la conversion completa del material de partida mediante cromatografia en capa fina (heptanos/acetato de etilo 1:1). Se extinguio cuidadosamente la mezcla de reaccion con una suspension 10:1 de agua en dietil eter hasta que se hubo detenido el desprendimiento de gas. Se vertio la mezcla en 50 ml de una disolucion saturada de tartrato de potasio y sodio y se agito durante 90 min. Se anadieron 90 ml de acetato de etilo y se separaron las fases. Se extrajo la fase acuosa con acetato de etilo (4 x 20 ml), y se lavo la fase organica combinada con salmuera (30 ml), se seco sobre MgSO4, se filtro y se concentro para dar un aceite transparente. Se adsorbio 6 sobre silice y se purifico mediante cromatografia ultrarrapida (30 g de silice, CH2Ch/MeOH 20:1 (v/v) + NEt3 al 0,1%). Se obtuvo el producto como un aceite viscoso blanquecino.
6: Rendimiento de 270 mg (54%)
EM [M+H]+ = 734,4 g/mol (PM+H calculado = 734,4 g/mol)
Rf = 0,28 (CH2Cl2/MeOH 19:1)
Sintesis del compuesto 9
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Se anadio AlCl3 (23,0 g, 172,3 mmol) a anhldrido glutarico (10,0 g, 86,2 mmol) en anisol (85 ml, 781 mmol). Se calento la mezcla de reaccion hasta 110°C durante 2 h, se enfrio hasta temperatura ambiente, se vertio sobre HCl 3 N/hielo y se extrajo con diclorometano. Se extrajo la fase acuosa con diclorometano (4 x 20 ml), y se lavaron las fracciones organicas combinadas con salmuera (30 ml), se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron para dar un aceite rojo que se recristalizo en tolueno. Se obtuvo el producto 7 como un solido blanquecino.
7: Rendimiento de 5,2 g (48%)
EM [M+Na]+ = 245,8 (PM+Na calculado = 245,1 g/mol)
Se anadio AlCl3 (9,0 mg, 68 mmol) a 7 (5,0 g, 23 mmol) en 1,2-dicloroetano. Se agito la mezcla de reaccion durante 14 h a 85°C y posteriormente se enfrio hasta temperatura ambiente. Se anadio HCl 1 N enfriado con hielo (50 ml) y se extrajo la mezcla con acetato de etilo (4 x 30 ml). Se secaron las fracciones organicas combinadas sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron a vaclo para dar un solido de color rojo claro que se uso en la siguiente etapa sin purificacion adicional.
8: Rendimiento de 3 g (62%)
EM [M+H]+ = 209,1 (PM+H calculado = 209,1 g/mol)
Se agitaron diciclohexilcarbodiimida (532 mg, 2,6 mmol), el acido 8 (403 mg, 1,9 mmol), HOSu (297 mg, 2,6 mmol) y colidina (1,0 ml, 7,8 mmol) en DCM (10 ml) durante 90 min a temperatura ambiente. Despues de la retirada de diciclohexilurea mediante filtracion, se anadieron la amina 6 (947 mg, 1,3 mmol) en DCM (5 ml) y DIEA (450 ml, 2,6 mmol) al filtrado y se hizo reaccionar la mezcla durante 14 h a temperatura ambiente. Se anadio H2SO4 1 N (2 x 50 ml) y se separaron las fases. Se extrajo la fase acuosa con acetato de etilo (4 x 20 ml), y se lavo la fase organica combinada con salmuera (30 ml), se seco sobre MgSO4, se filtro y se concentro a vaclo. Se purificaron los residuos mediante cromatografla en columna sobre gel de sllice (150 ml) usando heptano/acetato de etilo (1/2, Rf = 0,66) como fase movil.
9: Rendimiento de 819 mg (69%)
EM [M+Na]+ = 946,4 (PM+Na calculado = 946,4 g/mol)
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Sintesis del reactivo de grupo de union permanente 12a y el reactivo de grupo de union transitorio 12b y 12c
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a: R1 = R2 = Et
b: R1 = Et, R2 = 2-(dietilamino)etilo c: R1 = Me, R2 = 3-(dimetilamino)propilo
Se disolvio 9 (1 eq., 175 mg, 0,19 mmol) en THF seco (1,5 ml), se anadieron cloroformiato de p-nitrofenilo (1,1 eq., 42 mg, 0,21 mmol) y DIPEA (2 eq., 66 ml, 0,38 mmol) y se agito la mezcla durante 60 min a temperatura ambiente. Se anadio dietilamina (R1 = R2 = Et, 2 eq., 39 ml, 0,38 mmol) y se continuo con la agitacion durante 15 min. Se elimino el disolvente a vaclo, se anadieron 100 ml de AcOH y se purifico 10a mediante RP-HPLC.
EM [M+Na]+ = 1045,9 (PM+Na calculado = 1045,5 g/mol)
Se anadio NaBH4 (5 eq., 37 mg, 0,95 mmol) a la fraccion de HPLC que contenla 10a (acetonitrilo/H2O ~ 3/1 (v/v) + TFA al 0,1%) y se hizo reaccionar la mezcla durante 10 min a temperatura ambiente. Se anadio una porcion adicional de NaBH4 (5 eq., 37 mg, 0,95 mmol) y se agito la mezcla de reaccion hasta que se indico la conversion completa del material de partida mediante analisis de CL/EM (10 min a temperatura ambiente). Se purifico 11a mediante RP-HPLC y se liofilizo.
11a: Rendimiento de 95 mg (49% basado en 9)
EM [M+Na+H]+ = 1047,7 (PM+Na calculado = 1047,5 g/mol)
Se disolvio 9 (1 eq., 175 mg, 0,19 mmol) en THF seco (1,5 ml), se anadieron cloroformiato de p-nitrofenilo (1,1 eq., 42 mg, 0,21 mmol) y DIPEA (2 eq., 66 ml, 0,38 mmol) y se agito la mezcla durante 60 min a temperatura ambiente. Se anadio N,N,N'-trietil-etano-1,2-diamina (R1 = Et, R2 = 2-(dietilamino)etilo, 2 eq., 68 ml, 0,38 mmol) y se continuo con la agitacion durante 15 min. Se anadieron 100 ml de AcOH, se elimino el disolvente a vaclo y se purifico 10b mediante RP-HPLC y se liofilizo.
10b: Rendimiento de 147 mg como sal de TFA (65%)
EM [M+Na]+ = 1116,4 (PM+Na calculado = 1116,6 g/mol)
Se sintetizo 10c tal como se describio anteriormente usando N,N,N'-trimetil-propano-1,3-diamina (R1 =Me, R2 = 3-
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(dimetilamino)propilo, 56 ml, 0,38 mmol) como diamina.
10c: Rendimiento de 134 mg como sal de TFA (59%)
EM [M+Na]+ = 1088,4 (PM+Na calculado = 1088,6 g/mol)
Se anadio NaBH4 (46 mg, 1,2 mmol) a 10b (147 mg, 0,12 mmol) en MeOH/agua = 95:5 (v/v) (3 ml) en dos dosis y se agito la mezcla durante 1 h a temperatura ambiente. Despues de la adicion de AcOH (300 ml) y concentration, se purifico el producto 11 b mediante RP-HPLC y se liofilizo.
11b: Rendimiento de 107 mg como sal de TFA (73%)
EM [M+Na]+ = 1118,4 (PM+Na calculado = 1118,6 g/mol)
Se sintetizo 11c segun el mismo protocolo.
11c: Rendimiento de 65 mg como sal de HCl (54%) a partir de 134 mg de material de partida EM [M+Na]+ = 1090,4 (PM+Na calculado = 1090,6 g/mol)
Bajo una atmosfera de nitrogeno, se anadieron carbonato de bis-pentafluorofenilo (2,5 eq., 25 mg, 63 mmol), DMAP (1 mg) y DIEA (5 eq., 22 ml, 127 mmol) a 11a (1 eq., 26 mg, 26 mmol) en acetonitrilo seco (0,5 ml). Se agito la mezcla de reaction durante 30 min a temperatura ambiente, se enfrio hasta 0°C y se acidifico con AcOH (200 ml). Se purifico el producto 12a mediante RP-HPLC y se liofilizo.
12a: Rendimiento de 13 mg (42%)
EM [M+Na]+ = 1258,2 (PM+Na calculado = 1257,5 g/mol)
Se prepararon 12b y 12c de manera correspondiente a partir de 11b (56 mg, 48 mmol) y 11c (88 mg, 73 mmol), respectivamente.
12b: Rendimiento de 63 mg como sal de TFA (93%)
EM [M+H]+ = 1306,3 (PM+H calculado = 1306,6 g/mol)
12c: Rendimiento de 41 mg como sal de TFA (41%)
EM [M+H]+ = 1278,4 (PM+Na calculado = 1278,5 g/mol)
Ejemplo 5 Sintesis del reactivo de grupo de union permanente 14a y los reactivos de grupo de union transitorio 14c
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a: R1 = R2 = etilo
c: R1 = Me, R2 = 3-(dimetilamino)propilo
Se sintetizaron 13a and13c tal como se describe en el documento WO2005/099768A2.
Bajo una atmosfera de nitrogeno, se anadieron carbonato de bispentafluorofenilo (631 mg, 1,6 mmol), DMAP (20 mg, 0,16 mmol) y DIEA (556 ml, 3,2 mmol) a 13a (364 mg, 0,64 mmol) en acetonitrilo seco (5 ml). Se agito la mezcla de reaccion durante 15 min a temperatura ambiente, se enfrio hasta 0°C y se acidifico con acido acetico (1 5 ml). Se purifico el producto 14a mediante RP-HPLC y se liofilizo.
14a: Rendimiento de 379 mg (77%)
EM [M+Na]+ = 800,4 (PM+Na calculado = 800,3 g/mol)
Se preparo 14c de manera correspondiente a partir de 13c (97 mg, 130 mmol).
14c: Rendimiento de 114 mg como sal de TFA (94%)
10 EM [M+H]+ = 821,5 (PM+H calculado = 821,3 g/mol)
Ejemplo 6 Sintesis del reactivo de grupo de union permanente 15
imagen21
Se agitaron anhfdrido glutarico (0,41 mmol), la amina 6 (200 mg, 0,27 mmol), DIPEA (72 ml, 0,41 mmol) y DMAP (11 mg, 0,09 mmol) en acetonitrilo (3 ml) durante 2 h a 80°C. Se enfrio la mezcla hasta temperatura ambiente y se 15 anadio acido acetico (200 ml). Se purifico el producto 15 mediante RP-HPLC y se liofilizo.
15: Rendimiento de 130 mg (57%)
EM [M+Na]+ = 870,2 (PM+Na calculado = 870,4 g/mol)
Ejemplo 7 Sintesis de reactivos de mPEG-grupo de union activados
Materiales de partida de mPEG-maleimida:
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mPEG-maleimida 1A: PM = aprox. 20 kDa (n = aprox. 200-250) mPEG-maleimida 1B: PM = aprox. 40 kDa (n = aprox. 400-500)
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mPEG-maleimida 2B: PM = aprox. 40 kDa (n = aprox. 400-500)
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mPEG-maleimida 3B: PM = aprox. 80 kDa (n = aprox. 200-250; m = aprox. 400-500)
Residuos de mPEG despues de reaccionar con grupo tiol (R3 en las estructuras a continuation):
imagen25
residuo de mPEG-succinimida 1AA: PM = aprox. 20 kDa (n = aprox. 200-250) 10 residuo de mPEG-succinimida 1BA: PM = aprox. 40 kDa (n = aprox. 400-500)
imagen26
residuo de mPEG-succinimida 2BA: PM = aprox. 40 kDa (n = aprox. 400-500)
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residuo de mPEG-succinimida 3AA: PM = aprox. 20 kDa (n = aprox. 100-125; m = aprox. 200-250) residuo de mPEG-succinimida 3BA: PM = aprox. 40 kDa (n = aprox. 200-250; m = aprox. 400-500)
La linea discontinua vertical indica el sitio de union al grupo tiol en la estructura respectiva
Sintesis de los reactivos de mPEG-grupo de union activados por pfp permanentes 17aa, 17ab, 17ac, 17ad y los reactivos de mPEG-grupo de union activados por pfp transitorios 17b, 17ca y 17cb
imagen28
16a: R1=R2=etilo
16b: R=etilo, R2=2-(dietilamino)etilo 16c: R1=Me, R2=3-(dimetilamino)propilo
17aa: R1=R2=etilo, R3=1AA
17ab: R1=R2=etilo, R3=1BA
17ac: R1=R2=etilo, R3=2AA
17ad: R1=R2=etilo, R3=2BA
17b: R=etilo, R2=2-(dietilamino)etilo, R3=1BA
17ca: R1=Me, R2=3-(dimetilamino)propilo, R3=1BA
17cb: R1=Me, R2=3-(dimetilamino)propilo, R3=2BA
Se agito el carbonato 12a (13 mg, 10 mmol) en 10 ml de AcOH, 700 ml de HFIP, 1 ml de TFA y 2 ml de TES durante 10 min a temperatura ambiente. Se eliminaron los componentes volatiles en una corriente de nitrogeno y se purifico 16a mediante RP-HPLC.
16a: Rendimiento de 3,8 mg (5 mmol)
5 EM [M+H]+ = 751,3 (PM+H calculado = 751,3 g/mol)
Se prepararon 16b y 16c de manera correspondiente a partir de 12b (7,7 mg, 5,4 mmol) y 12c (2 mg, 1,5 mmol), respectivamente.
16b: Rendimiento de 2,5 mg (2,7 mmol)
EM [M+Na]+ = 845,1 (PM+Na calculado = 844,3 g/mol)
10 16c: Rendimiento de 0,5 mg (0,6 mmol)
EM [M+Na]+ = 816,6 (PM+Na calculado = 816,3 g/mol)
Se anadio la mPEG-maleimida 1B (NOF, Japon) (521 mg, 12,7 mmol) a 3,5 mg (3,9 mmol) de 16c en 4 ml de acetonitrilo/agua 3/1 (v/v) + TFA al 0,1%. Se anadieron 200 ml de tampon fosfato 0,5 M pH 7,4 y se hizo reaccionar la mezcla durante 10 min a temperatura ambiente. Se anadio 1 ml (13 mmol) de mercaptoetanol y se acidifico la mezcla 15 de reaccion hasta pH 4-5 mediante la adicion de TFA. Se purifico 17ca mediante RP-HPLC y se liofilizo.
17ca: Rendimiento de 220 mg (actividad de pfp-carbonato del 82%)
Se sintetizo 17cb tal como se describe para 17ca usando 16c (3,5 mg, 3,9 mmol) y la mPEG-maleimida 2B (656 mg, 16 mmol).
17cb: Rendimiento de 130 mg (actividad de pfp-carbonato del 85%)
20 Se anadieron 184 mg (8,8 mmol) de la mPEG-maleimida 1A (NOF, Japon) a 16a (2,0 mg, 2,7 mmol) en 4 ml de acetonitrilo/agua 1/1 (v/v) +TFA al 0,1%. Se anadieron 200 ml de tampon fosfato 0,5 M pH 7,4 y se hizo reaccionar la mezcla durante 10 min a temperatura ambiente. Se anadieron 0,2 ml (1,6 mmol) de mercaptoetanol y se acidifico la mezcla de reaccion hasta pH 2-3 mediante la adicion de TFA. Se separo 17aa de PEG sin reaccionar mediante RP-
HPLC y se liofilizo.
17aa: Rendimiento de 90 mg (actividad de pfp-carbonato del 88%)
Se sintetizo 17ab tal como se describio anteriormente usando 16a (3,8 mg, 5,0 pmol) y 680 mg (16 pmol) de la mPEG-maleimida 1B (NOF, Japon).
5 17ab: Rendimiento de 250 mg (actividad de pfp-carbonato del 83%)
Se sintetizo 17ac tal como se describio anteriormente usando 16a (2,5 mg, 3,3 pmol) y 200 mg (9,5 pmol) de la mPEG-maleimida 2A (Jenkem, RP de China).
17ac: Rendimiento de 80 mg (actividad de pfp-carbonato del 80%)
Puede sintetizarse 17ad tal como se describio anteriormente usando 16a y la mPEG-maleimida 2B.
10 Puede sintetizarse 17b tal como se describe para 17cb usando 16b y la mPEG-maleimida 1B.
Ejemplo 8 Sintesis de los reactivos de mPEG-grupo de union permanentes activados por pfp 19aa y 19ab y el reactivo de mPEG-grupo de union permanente transitorio 19c
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18a: R1=R2=etilo
18b: R1=Me, R2=3-(dimetilamino)propilo
19aa: R1=R2=etilo, R3=3AA 19ab: R1=R2=etilo, R3=3BA
19ac: R1=Me, R2=3-(dimetilamino)propilo, R3=3AA
Se agito el carbonato 14c (20 mg, 21 pmol) en 10 pl de AcOH, 400 pl de HFIP y 5 pl de TES durante 10 min a temperatura ambiente y se enfrio hasta 0°C. Se anadio acetonitrilo/agua=9/1 (v/v) enfriado con hielo y se separo 18c
mediante RP-HPLC y se liofilizo.
18c: Rendimiento de 5,0 mg como sal de TFA (7,2 mmol)
EM [M+H]+ = 579,6 (PM+H calculado = 579,2 g/mol)
Se sintetizo 18a tal como se describio anteriormente usando el carbonato 14a (24 mg, 31 mmol).
5 18a: Rendimiento de 8,0 mg (15 mmol)
EM [M+H]+ = 536,2 (PM+H calculado = 536,5 g/mol)
Se anadieron 205 mg (5 mmol) de la mPEG-maleimida 3A (NOF, Japon) a 18a (4,0 mg, 7,5 mmol) en 2 ml de acetonitrilo/agua 1/1 (v/v) + TFA al 0,1%. Se anadieron 100 ml de tampon fosfato 0,5 M (pH 7,4) y se hizo reaccionar la mezcla durante 10 min a temperatura ambiente. Se acidifico la mezcla de reaccion hasta pH 2-3 mediante la 10 adicion de TFA y se separo 19aa de PEG sin reaccionar mediante RP-HPLC y se liofilizo.
19aa: Rendimiento de 125 mg (actividad de pfp-carbonato del 85%)
Se preparo 19ab de manera correspondiente a partir de 410 mg (5 mmol) de la mPEG-maleimida 3B (NOF, Japon) y 18a (4,0 mg, 7,5 mmol).
19ab: Rendimiento de 265 mg (actividad de pfp-carbonato del 87%)
15 Se preparo 19c de manera correspondiente a partir de 205 mg de la mPEG-maleimida 3A y 18c (5 mg, 7,2 mmol)
19c: Rendimiento de 120 mg (actividad de pfp-carbonato del 88%)
Ejemplo 9: Sintesis del derivado de ester de NHS-mPEG de 80 kDa ramificado de 4 brazos permanente 22
imagen30
Se agito el acido 15 (12 mg, 14 mmol) en 1 ml de TFA, 1 ml de DCM y 10 ml de TES durante 10 min a temperatura ambiente. Se eliminaron los componentes volatiles en una corriente de nitrogeno y se purifico el ditiol 20 mediante RP-HPLC.
5 20: Rendimiento de 2,9 mg (8 mmol)
EM [M+Na]+ = 386,8 (PM+ Na calculado = 386,2 g/mol)
Se anadio 20 (1 mg, 2,8 mmol) en 170 ml de acetonitrilo a la mPEG-maleimida 1B (NOF, Japon) (380 mg, 9,2 mmol) en 4 ml de acetonitrilo/agua 1/1 (v/v) + TFA al 0,1%. Se anadieron 200 ml de tampon fosfato 0,5 M pH 7,4 y se hizo reaccionar la mezcla durante 10 min a temperatura ambiente. Se anadieron 0,6 ml (7,8 mmol) de mercaptoetanol y se 10 acidifico la mezcla de reaccion hasta pH 4-5 mediante la adicion de TFA. Se cambio el tampon a HCl al 0,005% (columna de desalacion HiPREP, 26/10 GE Healthcare) y se liofilizo 21 sin purification adicional.
21: Rendimiento de 320 mg
Se disolvio 21 en 50 ml de tolueno y se seco de manera azeotropica la disolucion de polfmero durante dos horas a reflujo usando una trampa Dean-Stark. Entonces se enfrio la disolucion de polfmero hasta temperatura ambiente. Se 15 precipito el reactivo de mPEG-grupo de union 21 secado mediante la adicion de eter helado (60 ml). Se anadio diciclohexilcarbodiimida (1,2 mg, 6 mmol) en DCM a una disolucion de 21 (240 mg, 3 mmol) y N-hidroxisuccinimida (0,7 mg, 6 mmol) en DCM (3 ml). Se agito la mezcla de reaccion durante 14 h a temperatura ambiente y se precipito
22 mediante la adicion de eter frlo (20 ml). Se seco a vaclo el producto 22.
22: Rendimiento de 200 mg
Ejemplo 10: Sfntesis de monoconjugado mPEG-hGH con enlaces amida permanente 23 y el bisconjugado mPEG2-hGH 24 usando el derivado de hexanoato de succinimidilo-mPEG de 40 kDa lineal
imagen31
imagen32
5
Se cambio el tampon de hGH a borato de sodio 50 mM pH 8,5 (alternativamente pueden usarse borato de sodio pH 8 o borato de sodio pH 9). La concentracion de hGH era de aproximadamente 2,5 mg/ml. Se disolvio un exceso molar de tres veces de derivado de hexanoato de succinimidilo-mPEG de 40 kDa (NOF, Japon) con relacion a la 10 cantidad de hGH en agua para formar una disolucion de reactivo al 20% (p/v) (alternativamente puede usarse un exceso molar de cuatro veces o cinco veces). Se anadio la disolucion de reactivo a la disolucion de hGH y se mezclo. Se incubo la mezcla de reaccion durante 2 h a temperatura ambiente y se extinguio con hidroxilamina a temperatura ambiente y pH 7 durante dos horas. Se analizo la mezcla de reaccion extinguida mediante cromatografla de exclusion molecular. Se purificaron el monoconjugado 23 y el bisconjugado 24 mediante 15 cromatografla de intercambio cationico. Alternativamente, puede usarse cromatografla de intercambio anionico para la purification. Se analizaron los conjugados purificados mediante SDS-PAGE (figura 1).
Ejemplo 11: Sfntesis del monoconjugado mPEG-hGH con enlaces amida permanente 25 y el bisconjugado mPEG-hGH 26 usando el derivado de ester de NHS-mPEG de 40 kDa ramificado
20
imagen33
imagen34
Se sintetizaron el monoconjugado mPEG-hGH permanente 25 y el bisconjugado 26 segun el procedimiento descrito en el ejemplo 10 usando el derivado de ester de NHS-mPEG de 40 kDa ramificado (NOF, Japon). Se analizaron los conjugados purificados mediante SDS-PAGE (figura 1).
Ejemplo 12: Sfntesis del monoconjugado mPEG-hGH con enlaces amida permanente 27 usando el derivado 25 de ester de NHS-mPEG de 80 kDa ramificado de 4 brazos
imagen35
Se describio el monoconjugado mPEG-hGH permanente 27 segun el ejemplo 10 usando el derivado de ester de NHS-mPEG de 80 kDa ramificado de 4 brazos 22. Se analizo mediante SDS-PAGE 27 purificado (figura 1).
Ejemplo 13: Sintesis del monoconjugado m-PEG-hGH con enlaces carbamato permanente 28 usando el 5 derivado de carbonato de pentafluorofenilo-mPEG de 40 kDa ramificado de 4 brazos 17aa
imagen36
Se cambio el tampon de hGH a borato de sodio 50 mM pH 9 (alternativamente pueden usarse borato de sodio pH 8,5 o borato de sodio pH 8). La concentration de hGH era de aproximadamente 2,5 mg/ml. Se disolvio un exceso molar de cuatro veces del reactivo de grupo de union-mPEG de 40 kDa ramificado de 4 brazos permanente 17aa 10 con relation a la cantidad de hGH Se disolvio en agua para formar una disolucion de reactivo al 20% (p/v). Se anadio la disolucion de reactivo a la disolucion de hGH y se mezclo. Se incubo la mezcla de reaction durante 1,5 h a temperatura ambiente y se extinguio mediante incubation en hidroxilamina 100 mM a pH 7 y temperatura ambiente durante 2 h. Se analizo la mezcla de reaccion extinguida mediante cromatograffa de exclusion molecular (parte superior de la figura 2). Se purifico el monoconjugado mPEG-grupo de union-hGH permanente 28 mediante 15 cromatograffa de intercambio anionico a pH 7,5 y se analizo mediante SDS-PAGE (figura 1) y cromatograffa de exclusion molecular (parte inferior de la figura 2).
Ejemplo 14: Sintesis del monoconjugado m-PEG-hGH con enlaces carbamato permanente 29 usando el derivado de carbonato de pentafluorofenilo-mPEG de 80 kDa ramificado de 4 brazos
imagen37
Se sintetizo el monoconjugado m-PEG-hGH con enlaces carbamato permanente 29 segun el ejemplo 13 usando el derivado de carbonato de pentafluorofenilo-mPEG de 80 kDa ramificado de 4 brazos 17ab. Se analizo mediante SDS-PAGE 29 purificado (figura 1).
5 Ejemplo 15: Sfntesis del monoconjugado m-PEG-hGH con enlaces carbamato permanente 30 usando el derivado de carbonato de pentafluorofenilo-mPEG de 40 kDa ramificado de 4 brazos 17ac
imagen38
Se sintetizo el monoconjugado mPEG-hGH permanente 30 segun el ejemplo 13 usando el derivado de carbonato de pentafluorofenilo-mPEG de 40 kDa ramificado de 4 brazos 17ac. Se analizo mediante SDS-PAGE 30 purificado 10 (figura 1).
Ejemplo 16: Sfntesis del monoconjugado mPEG-hGH permanente 31 usando el derivado de carbonato de pentafluorofenilo-mPEG de 80 kDa ramificado de 4 brazos
imagen39
Puede sintetizarse el monoconjugado mPEG-hGH permanente 31 segun el ejemplo 13 usando el derivado de carbonato de pentafluorofenilo-mPEG de 80 kDa ramificado de 4 brazos 17ad.
Ejemplo 17: Sfntesis del monoconjugado m-PEG-hGH con enlaces carbamato permanente 32 usando el 5 derivado de carbonato de pentafluorofenilo-mPEG de 40 kDa ramificado de 4 brazos
imagen40
Se sintetizo el monoconjugado m-PEG-hGH con enlaces carbamato permanente 32 segun el ejemplo 13 usando el derivado de carbonato de pentafluorofenilo-mPEG de 40 kDa ramificado de 4 brazos 19aa. Se analizo mediante SDS-PAGE 32 purificado (figura 1).
10 Ejemplo 18: Sfntesis del monoconjugado m-PEG-hGH con enlaces carbamato permanente 33 usando el derivado de carbonato de pentafluorofenilo-mPEG de 80 kDa ramificado de 4 brazos
imagen41
Se sintetizo el monoconjugado mPEG-hGH permanente 33 segun el ejemplo 13 usando el derivado de carbonato de pentafluorofenilo-mPEG de 80 kDa ramificado de 4 brazos 19ab. Se analizo mediante SDS-PAGE 33 purificado (figura 1).
Ejemplo 19: Sfntesis del monoconjugado mPEG-hGH con enlaces amina permanente 34 usando el derivado 5 de propionaldehfdo-mPEG de 40 kDa ramificado
imagen42
34
Se cambio el tampon de hGH un tampon MES 50 mM pH 6 (alternativamente se uso tampon HEPES pH 7) y se ajusto la concentracion de hGH a 1,5 mg/ml. Se disolvio un exceso molar de tres veces de propionaldehldo-mPEG de 40 kDa (GL2-400AL3, NOF, Japon) con relacion a la cantidad de hGH en agua para formar una disolucion de 10 reactivo al 25% (p/v). Se anadio la disolucion de reactivo a la disolucion de hGH y se mezclo. Se anadio una allcuota de una disolucion madre 1 M de cianoborohidruro de sodio en agua para dar una concentracion final de 25 mM en la mezcla de reaccion. Se incubo la disolucion durante 18 h a temperatura ambiente en la oscuridad. Se extinguio la reaccion mediante la adicion de tampon Tris. Se analizo la mezcla de reaccion mediante cromatografla de exclusion molecular y se purifico el conjugado 34 mediante cromatografla de intercambio cationico. Se analizo mediante SDS- 15 PAGE el monoconjugado mPEG-hGH 34 purificado (figura 1).
Ejemplo 20: Sfntesis del monoconjugado mPEG-hGH con enlaces carbamato transitorio 35 usando el derivado de carbonato de pentafluorofenilo-mPEG de 40 kDa ramificado de 4 brazos transitorio 19c
imagen43
Se cambio el tampon de hGH a borato de sodio 50 mM pH 9 (alternativamente pueden usarse borato de sodio pH 20 8,5 o borato de sodio pH 8) y se ajusto la concentracion de hGH a 2,5 mg/ml. Se disolvio un exceso molar de cuatro
veces del reactivo de mPEG-grupo de union transitorio 19c con relacion a la cantidad de hGH en agua para formar una disolucion de reactivo al 20% (p/v). Se anadio la disolucion de reactivo a la disolucion de hGH y se mezclo. Se incubo la mezcla de reaccion durante 1 h a temperatura ambiente y se extinguio mediante incubacion en hidroxilamina 100 mM a pH 7 y temperatura ambiente durante 2 h. Se purifico el monoconjugado mPEG-grupo de 25 union-hGH mediante cromatografla de intercambio anionico a pH 6,5 (figura 3 top) y se analizo mediante cromatografla de exclusion molecular (parte inferior de la figura 3).
Ejemplo 21: Sfntesis del monoconjugado mPEG-grupo de union-hGH transitorio 36 usando el derivado de carbonato de pentafluorofenilo-mPEG de 80 kDa ramificado de 4 brazos
imagen44
Se cambio el tampon de hGH a borato de sodio 100 mM pH 9 (alternativamente pueden usarse borato de sodio pH 8,5 o borato de sodio pH 8) y se ajusto la concentracion de hGH a 10 mg/ml. Se disolvio un exceso molar de cuatro veces del reactivo de grupo de union-mPEG de 80 kDa ramificado de 4 brazos transitorio 17ca con relacion a la 5 cantidad de hGH en agua para formar una disolucion de reactivo al 25% (p/v). Se anadio la disolucion de reactivo a la disolucion de hGH y se mezclo. Se incubo la mezcla de reaccion durante 45 min a temperatura ambiente y se extinguio mediante incubacion en hidroxilamina 100 mM a pH 7 y temperatura ambiente durante 2 h. Se purifico el monoconjugado mPEG-grupo de union-hGH 36 mediante cromatografla de intercambio cationico (parte superior de la figura 4) y se analizo mediante cromatografla de exclusion molecular (parte de inferior de la figura 4).
10 Ejemplo 22: Sfntesis del monoconjugado mPEG-hGH transitorio 37 usando el derivado de carbonato de pentafluorofenilo-mPEG de 80 kDa ramificado de 4 brazos 17cb
imagen45
Se sintetizo el conjugado mPEG-grupo de union-hGH 37 tal como se describe segun el procedimiento descrito en el ejemplo 21 usando el reactivo de mPEG-grupo de union activado 17cb.
15 En la figura 5, se muestran el cromatograma de intercambio cationico y el cromatograma de exclusion molecular analltica en la parte superior e inferior, respectivamente.
Ejemplo 23: Sfntesis del monoconjugado mPEG-hGH con enlaces carbamato transitorio 38 usando el derivado de carbonato de pentafluorofenilo-mPEG de 80 kDa ramificado de 4 brazos 17b
imagen46
Puede sintetizarse el conjugado mPEG-grupo de union-hGH con enlaces carbamato transitorio 38 tal como se describe en el ejemplo 21 usando el reactivo de grupo de union-mPEG de 80 kDa ramificado de 4 brazos transitorio 17b.
5 Ejemplo 24: Ensayo para medir la actividad de hGH y el profarmaco pegilado de hGH
Es trabajo de rutina para el experto determinar la actividad residual del profarmaco polimerico tal como se expresa mediante la actividad del pollmero conjugado de pollmero permanente correspondiente usando ensayos convencionales tal como se describe en el ejemplo 1.
Especlficamente, se hicieron crecer celulas NB2-11 en medios libres de suero con complemento de hGH 100 ng/ml. 10 Para el ensayo de proliferation in vitro, se lavo dos veces una suspension celular que contenla 2x105 celulas/ml con medio libre de suero y libre de hGH y se dispenso a una placa de microtitulacion de fondo plano de 96 pocillos (104 celulas/pocillo). Se sometieron a prueba los compuestos por triplicado en una serie de etapas de valoracion (9 etapas, usando una dilution de factor 3 entre cada etapa). Se incubaron las celulas con disoluciones de compuesto durante 48 horas seguido por incubation durante 2,5 horas con el reactivo de proliferacion celular WST-1. Se 15 determino la proliferacion de NB2-11 mediante la lectura de la densidad optica en un lector de ELISA y se represento graficamente la respuesta en funcion de la concentration y se determinaron los valores de CE50. Se muestran los resultados como el % de bioactividad residual in vitro en relation con hGH sin modificar, que se proporciona en la tabla 1.
En los experimentos in vitro tal como se describio anteriormente, se uso hGH nativa (fuente Novo Nordisk, 20 Dinamarca) como compuesto de referencia. Se uso la misma preparation de hGH para la slntesis de los conjugados PEG-hGH permanentes.
Tabla 1
Compuesto
Caracterizacion in vitro: actividad in vitro de conjugados permanentes
HGH nativa (hGH, Novo Nordisk, Dinamarca)
100%
23
10,3%
24
0,4%
25
4,4%
26
0,2%
27
0,7%
5
10
15
20
25
30
Compuesto
Caracterizacion in vitro: actividad in vitro de conjugados permanentes
28
2,3%
29
0,7%
30
2,0%
32
6,3%
33
2,2%
34
4,8%
Tabla 1: Bioactividad in vitro de conjugados de hGH pegilados de manera permanente en comparacion con hGH nativa (Norditropin, Novo Nordisk, Dinamarca).
Conclusion:
Tal como se observa a partir de la tabla 1, mediante la conjugacion de una molecula de PEG adecuada con hGH, puede reducirse la actividad in vitro de la hGH pegilada hasta menos del 5% de la actividad de la hGH nativa sin conjugar. Por ejemplo, la conjugacion de un pEg ramificado de 4x20 kDa con hGH reduce la actividad residual hasta el 0,7% del patron de hGH sin conjugar.
Ademas, a partir de estos resultados tambien se descubrio sorprendentemente, que la actividad residual de la hormona de crecimiento pegilada esta relacionada no solo con el tamano del PEG unido, sino tambien con el grado de ramificacion y el de separacion entre la hGH y los puntos de ramificacion dentro de la estructura de PEG.
PEG lineal
Especlficamente, la union de un PEG lineal de 40 kDa a hGH da como resultado una actividad in vitro del 10,3% (compuesto 23) en comparacion con hGH nativa.
PEG ramificado
Cuando se une un PEG ramificado de 2x20 kDa (compuesto 25), se reduce adicionalmente la actividad in vitro hasta el 4,4% en comparacion con hGH nativa.
Ademas, cuando se une un PEG de 4x20 kDa con una corta separacion entre la y los puntos de ramificacion dentro del PEG reactivo (compuestos 27 y 29) se reduce incluso mas la actividad in vitro hasta el 0,7% respectivamente en comparacion con hGH nativa.
Sorprendentemente, cuando se une un PEG de 4x20 kDa con un espaciador relativamente largo entre la hormona de crecimiento humana y el primer punto de ramificacion dentro del reactivo de PEG (por ejemplo, el compuesto 33) se reduce menos la actividad in vitro (2,2%) mostrado la importancia del espaciador entre el grupo funcional de hGH y el primer punto de ramificacion dentro del reactivo de PEG ramificado.
La conjugacion de mas de un resto de PEG a la hGH para formar bisconjugados de PEG reduce la actividad in vitro hasta menos del 0,5%. (por ejemplo, compuestos 24 y 26).
Ejemplo 25: Determinacion de la velocidad de autoescision in vitro de los conjugados 35, 36, 37 y 38
Se determino la velocidad de autoescision de los conjugados 35, 36 y 37 a pH 7,4 y 37°C tal como se describe en el ejemplo 2. Se determinaron semividas de autoescision de aproximadamente 75 h para estos conjugados. La figura 6 muestra cromatogramas de exclusion molecular de muestras de 35 incubado analizadas despues de 0 h, 8 h, 47 h, 97 h y 168 h que muestran la liberacion lenta de hGH del conjugado 35 a lo largo del tiempo. Puede determinarse la velocidad de autoescision del conjugado 38 de manera correspondiente y proporciona semividas de aproximadamente 50h.
Ejemplo 26: Ensayo para medir la semivida terminal in vivo de los profarmacos pegilados de hGH tal como se expresa mediante la semivida del conjugado permanente correspondiente in vivo
Se determino la farmacocinetica de los conjugados permanentes despues de la inyeccion intravenosa de 0,25 mg (equivalentes de hGH) en ratas. Para seleccionar un conjugado adecuado para inyecciones semanales en seres humanos, es deseable una semivida en plasma de mas de 10 horas en la rata.
Se administro por via intravenosa una dosis unica de 0,25 mg de hGH o 0,25 mg de conjugado PEG-hGH 5 permanente (dosis basada en hGH) por rata a ratas Wistar macho (200-250 g). Se usaron dos grupos de dos animales cada uno para cada compuesto. Se extrajeron 200-300 ml de sangre completa por via sublingual para obtener 100 ml de plasma con Ca-heparina por animal y punto de tiempo. Se tomaron muestras despues de 0,5, 3, 24, 48, 72 y 96 h para el grupo 1 y despues de 5, 8, 32, 56, 80 y 168 h para el grupo 2. Se almacenaron las muestras de plasma muestras a -80°C hasta que se sometieron a ensayo.
10 Se midieron las concentraciones de hGH y conjugado PEG-hGH usando un kit de ELISA para hGH (DSL). Se calcularon las concentraciones en plasma a partir de una curva de calibration de HGH o el conjugado respectivo y se representaron graficamente frente al tiempo, y se calculo la semivida terminal (t1/2) usando un modelo de un solo compartimento. En la tabla 2, se tabula el resultado de la determination de la semivida.
Para seleccionar un conjugado adecuado para inyecciones semanales en seres humanos, se realizaron estudios
15 farmacocineticos en ratas. Como la semivida de conjugados pegilados en ratas estan en el intervalo de 5 veces mas rapido que en seres humanos, la semivida de una hGH pegilada en ratas debe ser de aproximadamente 10 horas o mayor. Para obtener una estimation de la semivida del profarmaco pegilado de hGH conjugado sin escision del grupo de union, se inyecta en rata el conjugado correspondiente conjugado de manera permanente.
En la tabla 2, se tabulan los resultados de las determinaciones de la semivida in vivo.
Compuesto
Caracterizacion in vitro: semivida in vitro de conjugados permanentes
HGH nativa (hGH, Novo Nordisk, Dinamarca)
20 minutos
23
4 horas
25
5 horas
26
11 horas
27
13 horas
20 Tabla 2: Semivida de conjugados PEG-hGH permanentes en ratas Conclusion:
A partir de la tabla 1 y la tabla 2, resulta obvio que la que actividad residual se correlaciona de manera inversa con semivida, por ejemplo un alto grado de actividad residual provoca una elimination mas rapida. Esto es tlpico para conjugados eliminados mediante mecanismos de aclaramiento mediado por receptor.
25 Ademas, para obtener un profarmaco pegilado de hGH que pueda administrarse una vez a la semana en seres humanos y con una baja actividad residual, se prefiere una molecula de PEG con uno o mas puntos de ramification y con un peso molecular de 40 kDa o menor. Alternativamente, la conjugation de PEG a mas de un sitio en hGH para formar bisconjugados PEG-hGH da como resultado una semivida terminal larga.
Ejemplo 27 Estudio farmacodinamico del conjugado mPEG-grupo de union-hGH con enlaces carbamato 30 transitorio 36 y hormona de crecimiento humana en macacos cangrejeros
El objetivo de este estudio era comparar la respuesta farmacodinamica en macacos cangrejeros de una dosis del conjugado mPEG-grupo de union-hGH con enlaces carbamato transitorio 36 con dosificacion una vez al dla de hormona de crecimiento humana durante una semana.
Se estudiaron los siguientes grupos de dosificacion:
5
10
15
20
25
30
Artlculo de prueba
Dosis Via de dosificacion Momento de la dosis
Hormona de crecimiento humana
0,3 mg/kg/dla s.c. Dias 1,2, 3, 4, 5, 6, 7
Conjugado mPEG-grupo de union-hGH con enlaces carbamato transitorio 36
5 mg/kg s.c. Dla 1
Conjugado mPEG-grupo de union-hGH con enlaces carbamato transitorio 36
10 mg/kg s.c. Dla 1
Vehlculo (acido succlnico 10 mM, trehalosa 92 mg/ml, pH 4,0)
0 mg/kg s.c. Dla 1
Puesto que el conjugado mPEG-grupo de union-hGH con enlaces carbamato transitorio 36 se pegila de manera transitoria usando un grupo PEG de 80 kDa, las cantidades de hGH en los grupos de dosificacion de 5 y 10 mg/kg de conjugado mPEG-grupo de union-hGH con enlaces carbamato transitorio 36 fueron de aproximadamente 1 y 2 mg/kg, respectivamente. Asl, la cantidad de hGH en el grupo de 10 mg/kg de conjugado mPEG-grupo de union-hGH con enlaces carbamato transitorio 36 fue equivalente a una dosis diaria de 0,3 mg/kg de hGH.
Se inyecto cada artlculo de prueba por via subcutanea a 2 macacos cangrejeros (1 macho, 1 hembra) usando un volumen de dosis de 1 ml/kg. La edad y el peso de los animales fueron de 2,5-3 anos y 2,0-2,5 kg, respectivamente.
Se tomaron muestras de sangre de la vena/arteria femoral para la determinacion de concentraciones en suero de IGF-1, un marcador farmacodinamico para la hormona de crecimiento humana.
Se tomaron las muestras de sangre en los siguientes puntos de tiempo: 0 (antes de la dosis), 3, 6, 12, 24, 36, 48, 72, 96, 120 y 144 horas despues de la dosificacion en el dla 1.
Se tomaron muestras de sangre, se permitio que coagulasen y se almacenaron en un bloque de hielo o hielo fundente hasta que se centrifugaron. Despues de la centrifugacion, se tomaron allcuotas de las muestras de suero en viales etiquetados previamente y se taparon de manera hermetica. Se almacenaron los viales a -70°C tras tomarse allcuotas en viales.
Se midieron los niveles de IGF-1 en las muestras de suero muestras usando el kit de ELISA para IGF-1 humano Quantikine (R&D Systems) que se habla adaptado y validado para su uso en la determinacion de los niveles de IGF- 1 en suero de macaco cangrejero.
En la figura 7 se muestra la respuesta farmacodinamica de los artlculos de prueba. Tanto la administracion diaria de hGH como una administracion del conjugado mPEG-grupo de union-hGH con enlaces carbamato transitorio 36 aumento los niveles de IGF-1 con respecto a los niveles medidos en el grupo de vehlculo. Una administracion de 5 mg/kg del conjugado mPEG-grupo de union-hGH con enlaces carbamato transitorio 36 fue equivalente a la administracion diaria de hGH mientras que se mostro que una administracion de 10 mg/kg del conjugado mPEG- grupo de union-hGH con enlaces carbamato transitorio 36 era superior a hGH diariamente. Esto indico claramente que una dosis una vez a la semana del conjugado mPEG-grupo de union-hGH con enlaces carbamato transitorio 36 era superior a una dosis diaria equivalente de hGH.
Abreviaturas:
DBU 1,3-diazabiciclo[5.4.0]undeceno
DCM diclorometano
DIEA diisopropiletilamina
DMAP dimetilamino-piridina
DMF N,N-dimetilformamida
5
10
15
20
25
DMSO dimetilsulfoxido
eq. equivalente estequiometrico
fmoc 9-fluorenilmetoxicarbonilo
HFIP hexafluoroisopropanol
HOSu N-hidroxisuccinimida
LCMS espectrometrla de masas-cromatografla de llquidos acoplada
Mal maleimidopropionilo
EM espectro de masas
PM peso molecular
PEG polietilenglicol
RP-HPLC cromatografla de llquidos de alta resolucion de fase inversa
Rf factor de retencion
t.a. temperatura ambiente
SEC cromatografla de exclusion molecular
Suc succinimidopropionilo
TES trietilsilano
TFA acido trifluoroacetico
THF tetrahidrofurano
Trt tritilo
Lista de bibliograffa
1. Buyukgebiz A. et al J. Pediatr. Endocrinol. Metab. Enero-febrero de 1999; 12(1):95-7
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4. Philip Harris et al. Horm. Res. 2006; 65 (Supl. 4): 1-213, CF1-98 GH/IGF Treatment con el tltulo “First in-human study of PEGylated recombinant human growth hormone”.
5. Veronese, F.M. “Enzymes for Human Therapy: Surface Structure Modifications,” Chimica Oggi, 7:53-56 (1989).

Claims (13)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Composicion farmaceutica que comprende excipientes farmaceuticos adecuados y que comprende tambien una cantidad eficaz clmica in vivo en seres humanos de un conjugado de profarmaco pegilado de hormona de crecimiento humana recombinante (rhGH), en la que PEG se une a rhGH mediante un grupo de union transitorio 5 autohidrolizable (autoescindible); estando dicho conjugado de profarmaco caracterizado porque:
    (1) : el conjugado tiene una actividad GH que es menor del 5% de la hormona de crecimiento nativa sin PEG; y
    (2) : la velocidad de autohidrolisis de grupo de union es tal que la semivida in vivo es de desde 10 horas hasta 600 horas que se mide mediante inyeccion intravenosa en ratas del conjugado, seguido por la extraccion de muestras de sangre a intervalos de tiempo, preparacion de plasma y analisis de hGH usando ELISA; y
    10 en la que el conjugado de profarmaco pegilado tiene la estructura quimica (A):
    imagen1
    en la que
    HN-rhGH representa el residuo de rhGH unido al grupo de union transitorio;
    R1, R2, R3, R4, y R5 se seleccionan independientemente de hidrogeno, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, 15 isobutilo, terc-butilo;
    PEG representa el residuo de pegilacion unido al grupo de union transitorio; n = 1 o 2; y
    X se selecciona de alquilo C1 a C8 o heteroalquilo C1 a C12; y
    en la que el PEG es ramificado y contiene al menos 3 cadenas.
    20 2. Composicion farmaceutica segun la reivindicacion 1, en la que la velocidad de autohidrolisis es tal que la semivida
    in vivo es hasta 5 veces mas corta que la semivida in vitro del conjugado de profarmaco pegilado de hGH correspondiente.
  2. 3. Composicion farmaceutica segun la reivindicacion 2, en la que la semivida in vivo es hasta 3 veces mas corta que la semivida in vitro del conjugado de profarmaco pegilado de hGH correspondiente.
    25 4. Composicion farmaceutica segun la reivindicacion 2 o 3, en la que la semivida in vivo es hasta 2 veces mas corta
    que o casi identica a la semivida in vitro del conjugado de profarmaco pegilado de hGH correspondiente.
  3. 5. Composicion farmaceutica segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la composicion es una composicion para administracion subcutanea, administracion intramuscular o inyeccion intravenosa.
  4. 6. Composicion farmaceutica segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el profarmaco pegilado tiene 30 una carga de PEG total por molecula de hormona de crecimiento que asciende a al menos 25 kDa.
  5. 7. Composicion farmaceutica segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la estructura parcial de formula (I) dentro de la estructura (A) segun la reivindicacion 1, que es
    imagen2
    se selecciona del grupo que consiste en:
    imagen3
    5
  6. 8. Composicion farmaceutica segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la estructura parcial de formula (II) dentro de la estructura (A) segun la reivindicacion 1, que es
    imagen4
    se selecciona del grupo que consiste en:
    imagen5
  7. 9. Composicion farmaceutica segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que PEG-X en la formula (A) segun la reivindicacion 1 es PEG-W de formula III:
    imagen6
    5 en la que PEG-W se selecciona del grupo que consiste en:
    imagen7
    5
    10
    15
    20
    25
    imagen8
    imagen9
  8. 10. Composicion farmaceutica segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la estructura del conjugado de profarmaco es:
    imagen10
  9. 11. Composicion farmaceutica segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la velocidad de autoescision de grupo de union in vivo es tal que la semivida in vivo es de desde 20 hasta 300 horas.
  10. 12. Composicion farmaceutica segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la velocidad de autoescision de grupo de union in vivo es tal que la semivida in vivo es de desde 20 hasta 150 horas.
  11. 13. Composicion farmaceutica segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la velocidad de autoescision de grupo de union in vivo es tal que la semivida in vivo es de desde 30 hasta 100 horas.
  12. 14. Composicion farmaceutica segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la velocidad de autoescision de grupo de union in vivo es tal que la semivida in vivo es de desde 30 hasta 75 horas.
  13. 15. Cantidad eficaz cllnica de la composicion farmaceutica segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para su uso en un metodo para el tratamiento de una enfermedad relacionada con GH en una persona, en la que dicha enfermedad se selecciona de deficiencia de hormona de crecimiento, deficiencia de hormona de crecimiento de inicio en la edad adulta; slndrome de Turner; slndrome de Prader-Willi; slndrome del intestino corto; insuficiencia renal cronica; pequeno para la edad gestacional (SGA); emaciacion debida al SIDA; antienvejecimiento; artritis reumatoide; talla baja idiopatica; gen de caja homeo de talla baja; somatopausia; slndrome de Noonan; displasia esqueletica; slndrome de Down; talla baja asociada con el uso prolongado de esteroides; slndrome de Aarskog; enfermedad renal cronica; artritis reumatoide juvenil; fibrosis qulstica; infeccion por VIH en ninos que reciben tratamiento de TARGA; talla baja en ninos nacidos con un peso al nacer muy bajo pero SGA; displasia esqueletica; hipocondroplasia; acondroplasia; talla baja idiopatica; DHC en adultos; fractura en o de huesos largos; fracturas en o de huesos esponjosos; pacientes despues de una cirugla de tendones o ligamentos; osteogenesis por distraccion;
    trastornos que resultan de artroplastia de cadera o de discos, reparacion de menisco, fijacion de protesis o artrodesis vertebrales; trastornos que resultan de la fijacion de material de osteoslntesis; pseudoarticulacion o consolidacion defectuosa de fracturas; trastornos que resultan de osteatomla; trastornos que resultan de la implantacion de injertos; degeneration de cartllago articular en la rodilla provocada por traumatismo o artritis; osteoporosis en 5 pacientes con slndrome de Turner; osteoporosis en hombres; pacientes adultos en dialisis cronica (PADC); enfermedad cardiovascular asociada con desnutricion en PADC; reversion de caquexia en PADC; cancer en PADC; enfermedad pulmonar obstructiva cronica en PADC; VIH en PADC; ancianos con PADC; enfermedad hepatica cronica en PADC; slndrome de fatiga en PADC; enfermedad de Crohn; insuficiencia hepatica; hombres con infection por VIH; slndrome del intestino corto; obesidad central; slndrome de lipodistrofia asociado a VIH; esterilidad 10 masculina; pacientes despues de cirugla mayor programada, deshabituacion de alcohol o drogas, traumatismo neurologico; envejecimiento; ancianos fragiles; osteoartritis; cartllago danado de manera traumatica; disfuncion erectil; fibromialgia; trastornos de la memoria; depresion; traumatismo craneoencefalico; hemorragia subaracnoidea; un peso al nacer muy bajo; slndrome metabolico; miopatla por glucocorticoides; y talla baja debida a tratamiento con glucocorticoides en ninos.
    15 16. Profarmaco seleccionado del grupo que consiste en
    imagen11
    en la que m es un numero entero desde 200 hasta 250 y n es un numero entero desde 100 hasta125;
    imagen12
    en la que n es un numero entero desde 400 hasta 500;
    imagen13
    en la que n es un numero entero desde 400 hasta 500; y
    imagen14
    en la que n es un numero entero desde 400 hasta 500.
    5
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