CN1929857A - N－末端单聚乙二醇化人生长激素缀合物、用于制备它们的方法及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供通过将聚乙二醇丁醛部分连接到该蛋白的N－末端的苯丙氨酸上的经化学修饰的人生长激素(hGH)。根据本发明所述经化学修饰的蛋白比未经修饰的hGH可以具有长得多的持续hGH活性，能降低剂量和安排时序。本发明还包括用于治疗和/或预防其中使用生长激素是有利的疾病或病症的方法。

Description

N-末端单聚乙二醇化人生长激素缀合物、 用于制备它们的方法及其使用方法
本发明要求2004年2月4日申请的美国申请案N°10/771895的优先权，如在这里写出，将其通过全文引用作为参考。
发明领域
[001]本发明涉及化学修饰，包括人生长激素(hGH)及其激动剂变体的聚乙二醇化，通过所述的修饰可以改变hGH的化学和/或生理学性质。该聚乙二醇化的hGH可能具有增加的血浆存留持续时间、降低的清除率、提高的稳定性、降低的抗原性、降低的聚乙二醇异质性或其组合。本发明也涉及用于hGH修饰的方法。而且，本发明涉及包含经修饰的hGH的药物组合物。进一步的实施方案是经修饰的hGH用于治疗生长和发育病症的用途。
发明背景
[002]人生长激素(hGH)是一种包含一条由两个二硫桥交联的191个氨基酸的单链的蛋白质，并且单体形式具有22kDa的分子量。人GH由垂体腺分泌并且也可通过重组基因工程产生。hGH将在所有能生长的身体组织中引起生长。hGH不仅在人的生长阶段中在促进生长上起着重要的作用并且在维持正常身体组成、合成代谢和脂类代谢中也起重要作用(K.Barneis.和U.Keller，Baillieres Clin.Endocrinlo.Metab.10：337(1996))。
[003]重组hGH已经可商业获得许多年。市场上有两类在治疗上有用的重组hGH制剂：真正的重组hGH如GenotropinTM或NutropinTM和在N-末端有一额外甲硫氨酸残基的类似物如SomatonormTM。hGH可用于在患有也称为生长激素缺乏症(GHD)的垂体功能减退性侏儒症或患有特纳氏综合征的患者中刺激线性生长，但也提出将其用于其它适应症，包括在小于胎龄(SGA)出生的儿童中长期治疗生长不足、用于治疗患有帕-魏二氏综合征(PWS)、慢性肾功能不全(CRI)、艾滋消瘦和衰老的患者。成人生长激素缺陷(aGHD)患者具有多种问题，例如身体组成的特征性改变包括脂肪量增加、去脂体重和胞外液下降，以及骨矿物质密度的减少、脂质代谢异常和心血管机能障碍。许多这种问题可通过hGH补充疗法而得以改善(J.Verhelst J和R.Abs.Drugs.；62：2399(2002))。
[004]生长激素(GH)的一个主要生物效应是在幼小的哺乳动物中促进生长和在年长的哺乳动物中维持组织。受影响的器官系统包括骨骼、结缔组织、肌肉以及内脏如肝、肠和肾。生长激素通过与靶标细胞的膜上特异性受体相互作用而发挥它们的作用。hGH是一个同源激素家族的成员，所述的该同源激素包括胎盘催乳素、催乳激素以及其它基因和种变体或生长激素(Nicoll，C.S.等。(1986)EndocrineReviews 7：169)。在这些激素中，hGH不同之处在于它表现出广的种属特异性并结合至克隆的躯体原的(Leung，D.W.等，[1987]Nature330；537)或催乳激素的受体(Boutin，J.M.等，[1988]Cell；53：69)。hGH的克隆化基因已经在大肠杆菌(Escherichia coli)中以分泌形式表达(Chang，C.N.等，[1987]Gene 55：189)，并且已经报道了其DNA和氨基酸序列(Goeddel，等，[1979)Nature 281：544；Gray等[1985]Gene 39：247)。
[005]人生长激素(hGH)参与大量正常的人生长和发育调节。这种垂体激素显示出许多生物效应，包括线性生长(体质形成)、泌乳、巨噬细胞的活化、还有胰岛素样和致糖尿病效果(Chawla，R，K.(1983)Ann.Rev.Med.34，519；Edwards，C.K.等，(1988)Science239，769；Thomer，M.O.，等，(1988)J.Clin.Invest.81：745)。儿童中的生长激素缺陷导致侏儒症，该疾病已经成功地通过外源施用hGH治疗了二十多年。
[006]在成年人以及儿童中，hGH通过增加氮蓄积量和刺激骨骼肌生长并通过体脂肪的动员维持正常身体组成。内脏脂肪组织对hGH特别敏感。除了增强脂解作用，hGH降低摄取甘油三酯转化为体脂肪储存。IGF-I(胰岛素样生长激素-I)和IGFBP3(胰岛素样生长激素结合蛋白3)的血清浓度通过hGH增加。
[007]人生长激素(hGH)是由191个氨基酸组成的单链多肽(分子量为21,500)。二硫键连接位于53和165以及位于182和189。Niall，Nature，New Biology，230：90(1971)。hGH是有效的合成代谢剂，特别是因为对氮、磷、钾和钙的蓄积。用GH治疗垂体切除了的大鼠可以恢复至少部分该大鼠的生长率。Moore等，Endocrinology122：2920-2926(1988)。其中，其在垂体功能减退(GH-缺陷)受试者中的最显著效果是加速了骨-生长板-软骨的线性生长，导致身高增加。Kaplan，Growth Disorders in Children and Adolescents(Springfield，IL：Charles C.Thomas，1964)。
[008]hGH在多种动物模型中引起多种生理和代谢效应，包括线性骨生长、泌乳、巨噬细胞的激活、胰岛素样和致糖尿病效果等(R.K.Chawla等，Annu.Rev.Med.34：519(1983)；O.G.P.Isaksson等，Annu.Rev.Physiol.47，483(1985)；C.K.Edwards等，Science239，769(1988)；M.O.Thomer和M.L.Vance，J.Clin.Invest.82：745(1988)；J.P.Hughes和H.G.Friesen，Ann.Rev.Physiol.47：469(1985))。据报道，特别是在绝经期后的妇女中GH分泌随年龄下降。Millard等，Neurobiol.Aging，11：229-235(1990)；Takahashi等，Neuroendocrinology M，L6-137-142(1987)。也参见Rudman等，J.Clin.Invest.，67：1361-1369(1981)和Blackman，Endocrinologyand Aging，16：981(1987)。而且，有报道，一些衰老的表现，包括下降的去脂肪体重、脂肪组织块的扩增以及皮肤变薄，可以通过每周用GH治疗三次而得以减少。见例如，Rudman等，N.Eng.J.Med.，323：1-6(1990)和一起的Vance博士在相同杂志期(52-54页)的文章。这些生物效应源于hGH和特异性细胞受体的相互作用。两种不同的人受体即hGH肝受体(D.W.Leung等，Natuire 330：537(1987))和人催乳激素受体(J.M.Boutin等，Mol.Endocrinology.3：1455(1989))已经得以克隆。然而，有可能是其它受体，包括人胎盘催乳激素受体(M.Freemark，M.Comer，G.Komer和S.Handwerger，Endocrinol.120：1865(1987))。这些同源受体含有糖基化胞外激素结合结构域、单个跨膜结构域和胞质结构域，这些结构域在序列和大小上有相当的不同。认为一种或多种受体在对hGH的生理反应中起决定性作用。
[009]通常据观察，施用至身体内的生理活性蛋白由于它们在体内高的清除率，仅可以短时期显示它们的药理学活性。而且，这些蛋白的相对疏水性可能限制它们的稳定性和/或溶解性。
[0010]为了降低治疗性蛋白的清除率，提高其稳定性或消除其抗原性，已经提出了一些方法，其中将蛋白用水溶性聚合物进行化学修饰。这种类型的化学修饰可以有效地阻碍蛋白水解酶与蛋白主链本身的物理接触，因而防止降解。某些水溶性聚合物的化学连接由于增加了分子的流体力学体积可以有效地减少肾清除率。另外的优势包括，在某些情况下，增加治疗蛋白质的稳定性和循环时间，增加溶解性和降低免疫原性。聚(烯基氧化物)，特别是聚(乙二醇)(PEG)是已经用于制备治疗性蛋白质产品的这样一种化学部分(动词“聚乙二醇化(pegylate)”意思是连接至少一个PEG分子)。聚(乙二醇)的连接已经显示能防止蛋白质水解，Sada，等，J.FermentationBioengineering 71：137-139(1991)，并且可提供用于连接某些聚(乙二醇)部分的方法。见1979年12月18日出版的美国专利No.4,179,337，Davis等，“Non-Immunogenic Polypeptides”；和1977年1月11日出版的美国专利No.4,002,531，Royer，“ModifyingEnzymes with Polyethylene Glycol and Product Produced Thereby”。对于综述，参见Abuchowski等，Enzymes as Drugs(J.S.Holcerberg和J.Roberts编辑，367-383页(1981))。
[0011]也使用其它水溶性聚合物如乙二醇/丙二醇、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(-1，3-二氧杂环戊烷)、聚(-1，3，6-三噁烷)的共聚物、乙烯/马来酸酐共聚物、聚-氨基酸(均聚物或无规共聚物)。
[0012]许多聚乙二醇化的治疗性蛋白质的实例已经得以描述。ADAGEN，即一种腺苷脱氨酶的聚乙二醇化制剂，已经核准用于治疗严重的联合免疫缺陷病。ONCASPAR，即一种聚乙二醇化的L-天冬酰胺酶，已经核准用于治疗过敏性变态反应患者。聚乙二醇化超氧化物歧化酶已经处于用于治疗颅脑损伤的临床试验。聚乙二醇化α-干扰素(U.S.5,738,846、5,382,657)已经核准用于治疗肝炎；聚乙二醇化葡糖脑苷脂酶和聚乙二醇化血红蛋白据报道已经处于临床前试验。另外的实例是聚乙二醇化IL-6，EF 0 442 724，题为″Modified hIL-6″，其公开了加至IL-6上的聚(乙二醇)。
[0013]已经经化学修饰的另一特定治疗性蛋白质是粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。G-CSF诱导中性粒细胞快速的增殖并释放至血流中，并因而提供抗感染疗效。于1990年12月12日出版的题为“Chemically Modified Granulocyte Colony Stimulating Factor”的欧洲专利出版物EP 0 401 384描述了用于制备聚(乙二醇)连接其上的G-CSF的材料和方法。经修饰的G-CSF及其类似物也报告于发表于1992年3月4日，题为″Continuous Release PharmaceuticalCompositions Comprising a Polypeptide Covalently Conjugated ToA Water Soluble Polymer″的EP 0 473 268中，所述的专利叙述了多种共价地连接至水溶性粒子聚合物如聚(乙二醇)上的G-CSF和衍生物的用途。在1989年10月4日发表的EP 0 335 423中报道了具有人粒细胞集落刺激因子活性的经修饰的多肽。美国专利5,824,784提供了用于N-末端修饰蛋白质或其类似物的方法以及该方法得到的组合物，包括新的N-末端化学修饰的G-CSF组合物。美国专利5,824,778公开了经化学修饰的G-CSF。
[0014]对于聚(乙二醇)，许多方法已经用于将聚(乙二醇)分子连接至蛋白质上。通常，将聚(乙二醇)分子通过蛋白质上的活性基团连接至蛋白质上。
[0015]例如在赖氨酸残基或在N-末端上的那些氨基适宜用于这种连接。例如，Royer(美国专利号4,002,531，如上)声称将还原性烷基化反应用于将聚(乙二醇)连接至酶上。Chamow等，Biocon jugateChem.5：133-140(1994)报道通过还原性烷基化反应用单甲氧基聚(乙二醇)乙醛修饰CD4免疫粘合素。该作者报道在允许控制聚乙二醇化程度的条件下50％的CD4-Ig得以MePEG修饰。同上，于137页。该作者也报道经修饰的CD4-Ig体外结合能力(结合至蛋白gp120上)以与同上的聚乙二醇化(MePEGylation)程度相关的比率而下降。1990年2月27日出版的美国专利No.4,904,584，Shaw，涉及用于通过反应性氨基连接聚(乙二醇)分子的蛋白质中的赖氨酸残基数目的修饰。
[0016]WO 93/00109涉及用于刺激哺乳动物或鸟类的GH敏感组织的方法，包括保持连续的、有效的血浆GH浓度3天或更多天。据称一种获得这种血浆浓度的方法是通过使用结合至大分子物质如PEG(聚乙二醇)上的GH。据称结合至大分子物质上导致半衰期提高。WO 93/00109已经报道了使用mPEG乙醛-5000和mPEG N-羟基琥珀酰亚胺酯(mPEG-NHS-5000)的聚乙二醇化的人生长激素。使用mPEG-NHS得到多种hGH的聚乙二醇化形式的异质性混合物。WO 93/00109也公开了使用mPEG-马来酰亚胺来聚乙二醇化半胱氨酸hGH变体。
[0017]WO 99/03887公开了聚乙二醇化的半胱氨酸变体人生长激素。这种称为BT-005的缀合物据称比hGH能更有效地在生长激素缺陷大鼠中刺激体重增加并具有更长的半衰期。
[0018]Clark等(Journal of Biological Chemistry271：21969-21977，1996)也报道了使用羧甲基化PEG的琥珀酰亚胺酯的聚乙二醇化人生长激素。Clark等描述了增加大小的hGH衍生物，所述衍生物使用选择性结合至伯胺的mPEG-NHS-5000。增加水平的PEG修饰降低了对其受体的亲和性并增加基于细胞测定法中的EC50达1500倍。Olson等，Polymer Preprints 38：568-569，1997公开了使用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)PEG和琥珀酰亚胺丙酸酯(SPA)PEG来获得多种PEG化的hGH。
[0019]WO 94/20069预先公开了PEG化的hGH作为用于肺递送的制剂的部分。
[0020]US 4,179,337公开了将酶和激素PEG化来获得生理活性的非免疫原性、水溶性多肽缀合物的方法。作为进行PEG化激素的实例提及了GH。
[0021]EP 458064 A2公开了生长激素中引入的或天然存在的半胱氨酸残基的PEG化。EP 458064 A2进一步提到将两个半胱氨酸整合进位于野生型牛生长激素残基102-112的称为Ω环的环中，更特定地，EP458064 A2公开了将牛生长激素的102和112号残基分别由Ser置换为Cys和将Tyr置换为Cys。
[0022]WO 95/11987提出将PEG连接至半胱氨酸的硫基上，所述的半胱氨酸存在于母体分子中或通过定向突变引入。WO 95/11987涉及蛋白酶连接素-1的PEG化，然而也同样提出了一般hGH和其它蛋白的PEG化。
[0023]WO 99/03887公开了例如，通过插入额外的cys 25丝氨酸残基修饰生长激素并将PEG连接至引入的残基上。
[0024]WO 00/42175涉及产生含有用于PEG连接的游离半胱氨酸残基的蛋白的方法。WO 00/42175公开了hGH的下列突变型蛋白：T3C、S144C和T148C以及其半胱氨酸PEG化。
[0025]WO 97/11178(还有US 5849535、US 6004931和US 6022711)涉及将GH变体用作hGH的激动剂或拮抗剂。WO 97/11178也公开了hGH的PEG化，包括赖氨酸PEG化和赖氨酸的引入或置换(例如K168A和K172R)。WO 9711178也公开了G120K置换。
[0026]WO 03/044056公开了多种PEG化的hGH，包括分支40K PEG乙醛hGH缀合物。
[0027]先前PEG化的hGH的报道需要多个PEG的连接以获得大于如描述过的(Knauf，M.J.等，J.Biol.Chem.263：15064-15070，1988)肾过滤的70K分子量分离点的流体力学体积，但多个PEG连接导致不期望的产品异质性。
[0028]目前rhGH的施用是长周期每日进行，并因而较少频率施用将是非常期望的。具有更长循环半衰期的hGH分子将降低所需使用的次数并潜在地提供更优的治疗性hGH水平，同时增强疗效。
[0029]尽管进行了许多尝试去将hGH聚乙二醇化，但仍需要具有合适性质的PEG化的hGH分子成为有前途的商品。本发明提供具有单个优先在hGH的N-末端苯丙氨酸连接的PEG的PEG-hGH缀合物，所述的缀合物具有优于其它PEG-hGH缀合物的优势。在WO 93/00109，Clark等(Journal of Biological Chemistry 271：21969-21977，1996，以及Olson等，(Polymer Preprints 38：568-569，1997))，已经描述了使用mPEG乙醛-5000或mPEG N-羟基琥珀酰亚胺酯(mPEG-NHS-5000)在α-或ε-氨基位点(N-末端和在hGH中的9个赖氨酸)连接多种低分子量(5kd)PEG。这导致异质性群体。举例说明，具有9个赖氨酸的hGH可能有些分子有10个PEG连接、有些有9个连接、有些有8个连接、有些有7个连接、有些有6个连接、有些有5个连接、有些有4个连接、有些有3个连接、有些有2个连接、有些有1个连接以及有些没有PEG连接。并且，在具有数个PEG的分子中，不同分子上，PEG可能不在相同的位置连接。当开发治疗性产品时，这种产生的异质性在制造缀合物、纯化时是不利的，并且鉴定困难、成本高以及高度不可重复性。另一方法(WO 00/42175)采用含有用于PEG连接的游离半胱氨酸残基的hGH变体。然而，这种方法可以导致具有不正确配对的二硫键的不正确折叠蛋白质并导致PEG在一些或全部半胱甘酸上连接的异质性PEG化产物。多个PEG连接至多个位点可以导致在PEG和不同位点之间具有不太稳定的结合，所述的这种不太稳定的结合可以以不同的速度解离。这使得很难精确预测产物的药物动力学，导致不精确的剂量。异质性产品在获得治疗性产品的注册审批(regulatoryapproval)中也会遇到不利的问题。
[0030]因此，期望获得在单个位点上连接有单个PEG的PEG化的hGH分子。本发明以多种方式解决这种需要。
发明概述
[0031]本发明涉及经化学修饰的hGH及其激动剂变体，所述的hGH及其变体具有至少一种提高的化学或生理学性质，所述的化学或性质选自但不限于降低的清除率、提高的血浆存留持续时间、提高的稳定性、提高的溶解性和降低的抗原性。因而，如下面更详细描述的，本发明具有许多方面，所述的多个方面涉及将多肽包括但不限于hGH及其激动剂变体进行化学修饰，也涉及使用聚(乙二醇)丁醛部分的特异性修饰。
[0032]本发明也涉及产生经化学修饰的hGH及其激动剂变体的方法。特别地，本发明涉及使用丁醛产生经化学修饰的hGH的方法，所述的方法导致更大的N-末端连接选择性。
[0033]本发明也涉及组合物，所述的组合物包含单独的经化学修饰的hGH及其激动剂变体或与其它治疗剂结合组合。
[0034]本发明也涉及单独使用本发明的经化学修饰的hGH及其激动剂变体或与其它治疗剂联合使用，用于预防和/或治疗其中GH治疗是有用的病症和/或疾病。
附图的简单描述
[0035]图1是hGH与40K分支丁醛hGH或与40K分支乙醛hGH反应的胰蛋白酶图谱分析的HPLC描图。顶部图是40K分支丁醛hGH的胰蛋白酶图谱。中间图是40K分支乙醛hGH的胰蛋白酶图谱。底部的图是未经PEG化的hGH的胰蛋白酶图谱。T1是N-末端胰蛋白酶解片段。
[0036]图2显示人生长激素的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。
[0037]图3显示了40K分支丁醛hGH在大鼠体重增加测定中的效力。从Harlan Labs购买4-5周大(100-125g)的垂体切除的雌性斯普拉-道来氏大鼠。当大鼠进入动物装置时，将动物保持在80的恒定室温下并每天称重进行4-10天以便估计基本的生长率。从0天开始，然后将对照组中的大鼠(～100g)每天接受皮下注射～0.3mg/kg hGH(实心圆)或PBS(空心圆)，连续进行11天。40K分支丁醛hGH测试组(实心正方形)在第0天和第6天接受1.8mg/kg PHA-794428的单剂量。每组8-10只动物。画出平均生长+/-SEM。
[0038]图4显示了40K分支丁醛hGH在大鼠中的剂量响应的生长促进效果。这种效力研究是以与图3中描述的相似的方式进行，除了施用(仅第0天)多种单剂量40K分支丁醛hGH外，并将研究进行6天。对照组每天一次接受0.3mg/kg hGH(实心圆)或PBS载体(空心圆)注射，连续进行6天。40K分支丁醛hGH是以1.8mg/kg(实心正方形)、0.6mg/kg(空心正方形)、0.2mg/kg(实心三角形)或0.067mg/kg(空心三角形)的剂量施用。每组8只大鼠。
[0039]图5显示了响应40K分支丁醛hGH的胫骨生长。将垂体切除的大鼠如图3中描述的处理。在第11天处死动物，取出左胫骨并用X射线检测，并且用测径器测量骨头长度。画出平均长度+/-SEM。星号表示与对照组明显不同(p＜0.05)。
[0040]图6显示了六天效力研究的血浆IGF-1水平。将动物如图4中描述的处理。在不同时间取出血液样品并通过ELISA测定血清IGF-1的水平。画出平均值+/-SEM。
发明详述
[0041]hGH及其激动剂变体是重组蛋白家族的成员，所述的hGH及其激动剂变体描述于US 4,658,021(甲硫氨酰基人生长激素-Met-1-191hGH)和US 5,633,352。它们的重组产生和使用方法详细描述于US 4,342,832、4,601,980；US 4,898,830；US 5,424,199和US 5,795,745中。
[0042]任何纯化的和分离的由通过使用重组基因技术转化或转染的宿主细胞如大肠杆菌和动物细胞产生的hGH及其激动剂变体可以用于本发明。另外的hGH变体描述于US 6,143,523和1992年6月11日发表的WO 92/09690中。其中，由转化的大肠杆菌产生的hGH或其激动剂变体是特别优选的。这种hGH或其激动剂变体可以大量的以高纯度和同质性获得。例如，上面的hGH或其激动剂变体可以根据US 4,342,832、4,601,980；US 4,898,830；US 5,424,199和US 5,795,745中公开的方法制备。术语“基本具有以下氨基酸序列”指上面的氨基酸序列可以包括一个或多个氨基酸改变(缺失、加入、插入或置换)，只要这种改变不会引起任何不利的与hGH或其激动剂变体不相似的功能。更优选使用基本具有其中包括至少一个赖氨酸、天冬胆酸、谷氨酸、未配对半胱氨酸残基、游离N-末端α-氨基或游离C-末端羧基的氨基酸序列的hGH或其激动剂变体。
[0043]术语“hGH多肽或hGH蛋白质”当在此使用时，包括特征为在生长阶段促进生长并维持正常身体组成、合成代谢和脂类代谢的所有hGH多肽，优选来自哺乳类的多肽，更优选来自来自人和鼠类的多肽，以及它们的变体、类似物、直系同源物(ortholog)、同系物和衍生物及其片段。优选地，术语“hGH多肽或蛋白质”指SEQ ID NO：1的hGH多肽及其表现基本一样的生物学活性(在生长阶段促进生长并维持正常身体组成、合成代谢和脂类代谢)的变体、同系物和衍生物。更优选地，术语“hGH多肽或蛋白质”指SEQ ID NO 1的多肽。
[0044]如此处使用的术语“hGH多肽变体”指来自相同种但不同于参照hGH多肽的多肽。通常，不同之处是有限的，这样参照多肽和变体的氨基酸序列整体上是近似的，并在许多区域是相同的。优选地，hGH多肽至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％与参照hGH多肽一致，优选SEQ ID NO：1的hGH多肽。对于具有至少例如95％与查询氨基酸“一致”的氨基酸序列的多肽，其指除了每100个查询氨基酸序列的氨基酸目标多肽序列可以包含多达5个氨基酸改变外，目标多肽的氨基酸序列与查询序列一致。参照序列的这些改变可以在参照氨基酸序列的氨基端或羧基端或那些末端位置之间的任何位置出现，其独立地散布于参照序列中的残基之间或散布于参照序列内的一个或多个连续的组中。查询序列可以是参照序列的全部氨基酸序列或是如此处描述确定的任何片段。
[0045]这种hGH多肽变体可以是天然出现的变体，例如天然出现的等位基因变种，所述的等位基因变种由占据生物体染色体上给定基因座的多个备选形式的hGH之一编码，或由天然出现的源于单个原始转录本的剪接变体编码的同工型。备选地，hGH多肽变体可以是未知会天然出现的变体和可以用本领域已知的诱变技术产生的变体。
[0046]本领域已知可将一个或多个氨基酸从生物活性肽或蛋白质的N-末端或C-末端删除而基本不丧失生物学功能(见例如，Ron等，(1993)，Biol Chem.，268 2984-2988；在这里将其全文引用作为参考)。
[0047]本领域普通技术人员也将知道可以改变hGH多肽的一些氨基酸序列而对该蛋白质的结构或功能无明显的影响。这种突变体包括缺失、插入、倒位、重复和置换，所述的突变体是根据本领域已知的一般规则而选择以对活性具有很小的影响。例如，关于如何产生表型沉默氨基酸置换的指导由Bowie等，(1990)，Science 247：1306-1310提供，将其通过全文引用作为参考，其中该作者指出有两种主要的方法用于研究氨基酸序列对改变的耐受性。
[0048]第一种方法依赖进化过程，其中突变通过自然选择或得以接受或排除。第二种方法使用基因工程在克隆的hGH的特定位点引入氨基酸改变并选择或筛选以确定保持功能性的序列。这些研究已经揭示蛋白质出乎意料地对氨基酸置换耐受。作者进一步指出了在蛋白质的某些位置哪些氨基酸改变可能是允许的。例如，多数埋藏的氨基酸残基需要非极性的侧链，而表面侧链的极少特征是一般保守的。其它这种表型沉默置换在同上的Bowie等，(1990)中以及其中列出的参考文献中描述。
[0049]通常视为保守性置换的是在脂族氨基酸Ala、Val、Leu和Phe之间的相互交换；羟基残基Ser和Thr的相互交换、酸性残基Asp和Glu的相互交换、酰胺残基Asn和Gln之间的置换、碱性残基Lys和Arg的相互交换以及芳香残基Phe、Tyr中的交换。而且，下面的氨基酸组一般代表等价的改变：(1)Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gln、Asn、Ser、Thr；(2)Cys、Ser、Tyr、Thr；(3)Val、Ile、Leu、Met、Ala、Phe；(4)Lys、Arg、His；(5)Phe、Tyr、Trp、His。
[0050]术语hGH多肽也包含由hGH类似物、直系同源物和/或种同系物编码的全部hGH多肽。如此处使用，术语“hGH类似物”指不同和不相关生物体的hGH，所述的hGH在每种生物体中行使相同功能但所述hGH不是源于生物体祖先共同具有的祖先结构。相反，类似的hGH独立地产生并随后进化为行使相同功能(或相似功能)。换而言之，类似的hGH多肽是具有相当不同的氨基酸序列但行使相同生物活性，即在生长阶段促进生长并维持正常的身体成分、合成代谢和脂类代谢的多肽。如此处使用的，术语“hGH直系同源物”指在两个不同种内的hGH，所述的hGH的序列通过祖先种中共同同源的hGH相互关联，但所述的hGH已经通过进化而变得相互不同。如此处使用，术语“hGH同系物”指不同生物体的hGH，所述的hGH在每种生物体中行使相同功能并且所述hGH源于生物体祖先共同具有的祖先结构。换而言之，同系hGH多肽是具有相当相似的氨基酸序列行使相同生物活性，即在生长阶段促进生长并维持正常的身体成分、合成代谢和脂类代谢的多肽。优选地，hGH多肽同系物可以定义为表现至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％与参照hGH多肽一致的多肽，优选SEQ ID NO：1的hGH多肽。
[0051]因而，根据本发明的hGH多肽可以是，例如：(i)其中一个或多个氨基酸残基受保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)置换并且这种置换的氨基酸残基可以是或不是由遗传密码编码的hGH多肽；或(ii)其中一个或多个氨基酸残基包括取代基团的hGH多肽；或(iii)其中hGH多肽与另一种化合物如用以增加多肽的半衰期的化合物(例如聚乙二醇)融合的hGH；或(iv)其中额外的氨基酸融合至上面形式的多肽的hGH多肽，所述的额外的氨基酸为例如IgG Fc融合区多肽或前导序列或分泌序列或用于上面形式的多肽的纯化的序列或前蛋白序列；
[0052]hGH多肽可以是单体或多体。多体可以是二聚体、三聚体、四聚体或包含至少5个单体多肽单位的多体。多体也可以是同型二聚体或异质二聚体。本发明的多体可以是疏水、亲水、离子和/或共价结合的结果和/或可以通过例如脂质体结构间接连接。在一个实例中，共价结合是在包含于含有hGH多肽或其片段的融合蛋白(见例如，美国专利号5,478,925，将其公开内容在这里通过全文引用作为参考)的异源序列之间的。在另外的实例中，将hGH多肽或其片段通过肽连接物如在美国专利No.5,073,627中描述的那些肽连接物(在此通过引用作为参考)连接至一个或多个可以是hGH多肽或异源多肽的多肽上。用于制备多体hGH多肽的另一方法涉及使用融合至亮氨酸拉链或异亮氨酸拉链多肽序列的hGH多肽，所述的亮氨酸拉链或异亮氨酸拉链多肽序列已知能促进其中含有它们的蛋白的多聚化，其中所述的融合是使用本领域技术人员已知的技术，包括WO 94/10308的技术。在另一实例中，hGH多肽可以通过包含于含有Flag多肽序列的融合hGH多肽的Flag多肽序列之间的相互作用连接。hGH多体也可以使用本领域已知的化学技术如使用连接分子的交联产生，其中所述的连接分子长度优化技术为本领域已知(见例如US 5,478,925)，或使用本领域已知的技术来在期望包含于多体中的多肽序列内的半胱氨酸残基之间形成一个或多个分子间交联(见例如US 5,478,925)，加入半胱氨酸或生物素至hGH的C-末端或N-末端以及产生含有一个或多个这种经修饰的多肽的多体的技术(见，例如US 5,478,925)或用于产生含有hGH多体的脂质体的30种技术(见，例如美国专利号5,478,925)的任意技术，将其公开内容通过全文引用作为参考。
[0053]如此处使用的，术语“hGH多肽片段”指包含hGH多肽，优选SEQ ID NO：1的多肽的一部分氨基酸序列的连续一段序列的任何肽或多肽。
[0054]更特定地，hGH多肽片段包含至少6个、优选至少8-10个、更优选12、15、20、25、30、35、40、50、60、75、100、125、150、175、191个根据本发明的hGH多肽的连续氨基酸。hGH多肽片段可另外地描述为包含至少6个氨基酸的hGH多肽的亚类，其中“至少6个”定义为在6和代表hGH多肽包括SEQ ID NO：1的多肽的C-末端氨基酸的整数之间的任意整数。进一步包括的是进一步确定了它们N-末端和C-末端位置的，如上面描述长为至少6个氨基酸的hGH多肽片段的类。也包含于术语“hGH多肽片段”作为单独类的是可能由N-末端和C-末端位置特别确定了的如上描述长约至少6个氨基酸的全部多肽片段。即，在序列表或本发明任何给定氨基酸序列上的至少6个连续氨基酸残基长的片段可以占据的N-末端和C-末端位置的任意组合包含于本发明中。
[0055]明显，上面的本发明多肽片段类可以备选地通过式“a至b”描述；其中“a”等于多核苷酸的N-最末端氨基酸位置而“b”等于多核苷酸的C-最末端氨基酸位置；并且进一步来说，其中“a”等于1和hGH多肽序列的氨基酸数目减去6之间的数，而其中“b”等于7和hGH多肽序列的氨基酸数目之间的整数；并且其中“a”是比“b”至少小6的整数。
[0056]使用上面的描述可以立即想象得到上面的hGH多肽片段，并因而为了避免不必要地延长本说明书而不将其单独列出。而且，上面的片段不一定需要具有hGH生物活性，尽管具有这种活性的多肽是本发明的优选实施方案，因为它们可能可用于例如免疫测定法、表位定位、表位附加、用作疫苗以及用作分子量标记。上面的片段也可能用于产生针对多肽特定部分的抗体。
[0057]也包含于术语“hGH多肽片段”的是hGH多肽的结构域。这种结构域最终包括线性的或结构基序和信号，包括但不限于，亮氨酸拉链、螺旋-转角-螺旋基序、翻译后修饰位点如糖基化位点、泛素化作用位点、α螺旋和β片层、编码引导编码的蛋白质分泌的信号肽的信号序列、涉及转录调控的序列如同源框、酸性序列(acidicstretch)、酶活性位点、底物结合位点和酶切位点。这种结构域可以表现特殊的生物学活性如DNA或RNA-结合活性、蛋白质分泌、转录调节、酶促活性、底物结合活性等...。
[0058]结构域具有一般包含3到191个之间的氨基酸的大小。在优选的实施方案中，结构域包含6到191之间的整数个氨基酸。结构域可以用本领域技术人员已知的方法合成，包括在此公开用于制备hGH多肽来产生抗-hGH抗体的那些方法。用于测定组成具有特定生物活性的结构域的氨基酸的方法包括诱变研究和确定接受测试的生物学活性的测定法。
[0059]本发明内容中特别优选的片段是保持基本生物活性即在生长阶段促进生长并维持正常的身体组成、合成代谢和脂类代谢的hGH多肽。
[0060]备选地，本发明的多肽可以用本领域技术人员已知的计算机方法在数据库中搜索基序、结构域和/或信号。可搜索的数据库包括Prosite(Hofmann等，(1999)Nucl.Acids Res.27：215-219；Bucher和Bairoch(1994)Proceedings 2nd International Conference onIntelligent Systems for Molecular Biology。Altman等编辑，pp53-61，AAAIPress，Menlo Park)、Pfam(Sonnhammer等，(1997)Proteins 28(3)：405-20；Henikoff等，(2000)Nucleic Acids Res.28(1)：228-30；Bateman等，(2000)Nucleic Acids Res.28(1)：263-6)、Blocks(Henikoff等，(2000)Electrophoresis 21(9)：1700-6)、Print(Attwood等，(1996)Nucleic Acids Res.24(1)：182-8)、Prodom(Sonnhammer和Kahn(1994)Protein Sci.3(3)：482-92；Corpet等，(2000)Nucleic Acids Res.28(1)：267-9)、Sbase(Pongor等(1993)Protein Eng.6(4)：391-5；Murvai等，(2000)NucleicAcids Res.28(1)：260-2)、Smart(Schultz等，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.U S A 95，5857-5864)、Dali/FSSP(Holm和Sander(1996)Nucleic Acids Res.24(1)：206-9；Holm和Sander(1997)NucleicAcids Res.25(1)：231-4；Holm和Sander(1999)Nucleic Acids Res.27(1)：244-7)、HSSP(Sander和Schneider(1991)Proteins9(1)：56-68)、CATH(Orengo等，(1997)Structure 5(8)：1093-108；Pearl等，(2000)Biochem.Soc.Trans.28(2)：269-75)、SCOP(Murzin等，(1995)J.Mol.Biol.247(4)：536-40；Lo Conte等，(2000)Nucleic Acids Res.28(1)：257-9)、COG(Tatusov等，(1997)Science278，631：637；Tatusov等，(2000)Nucleic Acids Res.28(1)：33-6)、特定的家族数据库及其衍生库(Nevill-Manning等，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.95,5865-5871；Yona等，(1999)Proteins37(3)：360-78；Attwood等，(2000)Nucleic Acids Res.28(1)：225-7)，将以上每个的公开内容通过全文引用作为参考。对于可利用的数据库的综述，参见Nucleic Acid Research(2000)的第28卷第1期，将其公开内容在此通过全文引用作为参考。
[0061]术语“hGH多肽片段”也包含带有表位的片段。这些表位可以是抗原表位或既是抗原表位和免疫原表位。免疫原表位定义为当多肽是免疫原时在体内引起抗体反应的一部分蛋白质。另一方面，抗体结合至其上的多肽的区域定义为抗原表位。抗原可以在空间构象中包含最少3个氨基酸，所述的氨基酸对该表位是独特的。通常表位包括至少6个这种氨基酸，并更通常包含至少8-10个这种氨基酸。
[0062]根据本发明的带有hGH表位的片段可以是长度在6个氨基酸和hGH多肽全长序列之间的任何片段，优选在6-50个氨基酸的片段。带有表位的片段可由如上面描述的连续的氨基酸残基(作为亚类)的数目或由特定的N-末端和C-末端位置(作为类)确定。
[0063]用作表位的片段可以通过任何常规的方法产生(见例如，Houghten(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：5131-5135和U.S.4,631,21，在此将其公开内容通过全文引用作为参考)。用于确定组成表位的氨基酸的方法包括X-射线晶体衍射、2-维核磁共振和表位定位，例如由Geysen等，(1984)、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：3998-4002；PCT出版物WO 84/03564和WO 84/03506描述的Pepscan方法，在此将其公开内容通过全文引用作为参考。另一实例是Jameson和Wolf，(1988)，Comp.Appl.Biosci.4：181-186的算法(所述的参考通过将其全文引用作为参考)。Jameson-Wolf抗原分析，例如，可以用计算机程序PROTEAN，使用默认参数(Windows 4.0版，DNASTAR公司)进行。
[0064]本发明也提供了对如上描述的由N-末端和C-末端位置确定的任何hGH片段类或由氨基酸残基的大小确定的任何片段亚类的排除。如上描述的由N-末端和C-末端位置或由氨基酸大小确定的任何数量的片段可能作为单独的类而得以排除。本发明也以相同的方式提供对任何hGH结构域或带有表位的片段的排除。
[0065]本发明的hGH多肽可以以合适的方式制备。这种hGH多肽及其片段可以使用本领域技术人员已知的技术(见例如，“Methods inEnzymology，Academic Press，1993”，参见其中多种用于纯化蛋白的方法；Creighton，(1983)Proteins：Structures and MolecularPrinciples，W.H.Freeman & Co.2nd Ed.，T.E.，New York；和Hunkapiller等，(1984)Nature.310(5973)：105-11，参见蛋白质的化学合成，以及Davis等，(1986)Basic Methods in MolecularBiology，ed.，Elsevier Press，NY，用于重组技术，其公开内容在此通过全文引用作为参考)从天然来源纯化、经化学合成、通过重组技术包括体外翻译技术或在能表达hGH cDNA的重组细胞中表达，或这些方法的组合而产生。本发明的多肽优选以分离的形式提供，并且可以是部分纯化或优选基本纯化的。
[0066]术语“具有与参照多核苷酸至少x％一致的多核苷酸”和“具有与参照多肽至少x％一致的多肽”包含其残基(分别为核苷酸或氨基酸)序列分别较于所述的参照多核苷酸或多肽序列，显示的一致性百分数，如下定义的，等于或高于x的多核苷酸或多肽。
[0067]在两个多核苷酸或多肽序列在比较窗口上最佳比对后确定一致性百分数，其中在比较窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分可能包含一个或多个残基的添加或缺失以便使序列比对最优。比较窗口包含某一数目的位置(对应于残基插入/缺失的残基或缺口)，该位置数目对应于窗口大小。每个窗口位置可以表示一种下列情况：
1°/有一个残基(核苷酸或氨基酸)在第一个比对序列的该位置上并且一不同的残基在第二个比对序列的相同位置上，换而言之，第二个序列较于第一个序列在该位置上具有一置换的残基。
2°/有一个残基(核苷酸或氨基酸)在第一个比对序列的该位置上并且相同的残基在第二个比对序列的相同位置上。
3°/有一个残基(核苷酸或氨基酸)在第一个比对序列的该位置上并且没有氨基酸在第二个比对序列的相同位置上，换而言之，第二个序列较于第一个序列在该位置上显示缺失。
在属于第一个上面定义的类的比较窗口内的位置的数目称为R1。
在属于第二个上面定义的类的比较窗口内的位置的数目称为R2。
在属于第三个上面定义的类的比较窗口内的位置的数目称为R3。
[0068]一致性百分数(％id)可以通过任何以下的式子计算：
％id＝R2/(R1+R2+R3)×100，或
％id＝(R2+R3)/(R1+R2+R3)×100
[0069]用于比较的序列的比对可以用本领域已知的多种序列比较算法和程序的任意一种进行。这种算法和程序包括，但不限于，TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA、FASTDB、WU-BLAST、Gapped-BLAST、PSI-BLAST(Pearson和Lipman，(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444-2448；Altschul等，(1990)，J.Mol.Biol.215：403-410；Altschul等，(1993)，Nature hGHtics 3：266-272；Altschul等(1997)，Nuc.Acids Res.25：3389-3402；Thompson等，(1994)，Nuc.Acids Res..22：4673-4680；Higgins等，(1996)，Meth.Enzymol.266：383-402；Brutlag等，(1990)Comp.App.Biosci.6：237-245；Jones和Swindells，(2002)Trends Biochem Sci27：161-4；Olsen等，(1999)Pac Symp Biocomput；302-13)，将其公开内容通过全文引用作为参考。
[0070]在一特别的实施方案中，将Smith-Waterman方法与打分矩阵如PAM、PAM 250，优选与BLOSUM矩阵如BLOSUM60或BLOSUM62并用默认参数(空位开放罚分＝10和空位拓展罚分＝1)或优选用优于默认参数的用户确定的参数使用。
[0071]在另一特别的实施方案中，将蛋白质和核酸序列用BasicLocal Alignment Search Tool(“BLAST”)程序采用默认参数或采用用户提供的修改的参数进行比对。优选地，使用的打分矩阵是BLOSUM62矩阵(Gonnet等，(1992)，Science 256：1443-1445；Henikoff和Henikoff，(1993)，Proteins 17：49-61，将其公开内容在此通过全文引用作为参考)。较少优选地，也可使用PAM或PAM250矩阵(见，例如，Schwartz和Dayhoff，(1978)，编辑，Matrices for DetectingDistance Relationships：Atlas of Protein Sequence andStructure，Washington：National Biomedical ResearchFoundation，将其公开内容在此通过全文引用作为参考)。
[0072]在另一特别的实施方案中，多核苷酸或多肽序列用基于Brutlag等，(1990)，同上，的FASTDB计算机程序进行比对。用于DNA序列的FASTDB比对的优选参数是：Matrix＝Unitary，k-tuple＝4，Mismatch Penalty＝1，Joining Penalty＝30，Randomization GroupLength＝0，Cutoff Score＝1，Gap Penalty＝5，Gap Size Penalty＝0.05，Window Size＝500或目标核苷酸序列的长度，选较短的。用于FASTDB氨基酸序列比对的优选参数是：Matrix＝PAM 0，k-tuple＝2，MismatchPenalty＝1，Joining Penalty＝20，Randomization Group25Length＝0，Cutoff Score＝1，Window Size＝序列长度，Gap Penalty＝5，Gap SizePenalty＝0.05，Window Size＝500或目标氨基酸序列的长度，选较短的。
[0073]根据本发明，聚(乙二醇)通过hGH或其激动剂变体的氨基酸残基共价地结合。多种具有许多不同官能团、连接物、构型和分子量的活化的聚(乙二醇)为本领域技术人员已知，所述的活化聚(乙二醇)可以用于产生PEG-hGH缀合物或PEG-hGH激动剂变体缀合物(有关综述参见，Roberts M.J.等，Adv.Drug Del.Rev.54：459-476，2002；Harris J.M.等，Drug Delivery Sytems 40：538-551，2001)。本发明涉及使用丁醛连接部分用醛化学来引导PEG部分选择性结合至N-末端的方法。丁醛连接物较于乙醛连接物导致增加的N-末端特异性(表1和图1)。
[0074]本发明的一个实施方案是具有式I或式II的结构的人生长激素-PEG缀合物：
或
                mPEG-O(CH2CH2O)n(CH2)mCH2-NH-R
                            式II
其中
n是在1和10之间的整数；
m是在1和10之间的整数；
R是人生长激素，甲硫氨酰生长激素或人生长激素变体。
[0075]在一特别的实施方案中，n是在1和5之间以及m是在1和5之间。
[0076]在一特别的式I的实施方案中：n是1以及m是1；n是1以及m是2；n是1以及m是3；n是1以及m是4；n是1以及m是5；n是1以及m是6；n是1以及m是7；n是1以及m是8；n是1以及m是9；n是1以及m是10；n是2以及m是1；n是2以及m是2；n是2以及m是3；n是2以及m是4；n是2以及m是5；n是2以及m是6；n是2以及m是7；n是2以及m是8；n是2以及m是9；n是2以及m是10；n是3以及m是1；n是3以及m是2；n是3以及m是3；n是3以及m是4；n是3以及m是5；n是3以及m是6；n是3以及m是7；n是3以及m是8；n是3以及m是9；n是3以及m是10；n是4以及m是1；n是4以及m是2；n是4以及m是3；n是4以及m是4；n是4以及m是5；n是4以及m是6；n是4以及m是7；n是4以及m是8；n是4以及m是9；n是4以及m是10；n是5以及m是1；n是5以及m是2；n是5以及m是3；n是5以及m是4；n是5以及m是5；n是5以及m是6；n是5以及m是7；n是5以及m是8；n是5以及m是9；n是5以及m是10；n是6以及m是1；n是6以及m是2；n是6以及m是3；n是6以及m是4；n是6以及m是5；n是6以及m是6；n是6以及m是7；n是6以及m是8；n是6以及m是9；n是7以及m是10；n是7以及m是1；n是7以及m是2；n是7以及m是3；n是7以及m是4；n是7以及m是5；n是7以及m是6；n是7以及m是7；n是7以及m是8；n是7以及m是9；n是7以及m是10；n是8以及m是1；n是8以及m是2；n是8以及m是3；n是8以及m是4；n是8以及m是5；n是8以及m是6；n是8以及m是7；n是8以及m是8；n是8以及m是9；n是8以及m是10；n是9以及m是1；n是9以及m是2；n是9以及m是3；n是9以及m是4；n是9以及m是5；n是9以及m是6；n是9以及m是7；n是9以及m是8；n是9以及m是9；n是9以及m是10；n是10以及m是1；n是10以及m是2；n是10以及m是3；n是10以及m是4；n是10以及m是5；n是10以及m是6；n是10以及m是7；n是10以及m是8；n是10以及m是9；n是10以及m是10。
[0077]一特定的实施方案是具有以下结构的人生长激素-PEG缀合物：
Figure A20058000739300251
或
            mPEG-O(CH2CH2O)4CH2CH2CH2CH2-NH-R
其中，R是人生长激素、甲硫氨酰基人生长激素或人生长激素变体。
[0078]本发明本发明另一特定的实施方案是人生长激素-PEG缀合物，其中人生长激素包含或由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成。
[0079]本发明的一特定实施方案是人生长激素-PEG缀合物，其中大于80％、更优选81％、更优选82％、更优选83％、更优选84％、更优选85％、更优选86％、更优选87％、更优选88％、更优选89％、更优选90％、更优选91％、更优选92％、更优选93％、更优选94％、更优选95％、更优选96％、更优选97％、更优选98％的聚乙二醇结合至SEQ ID NO：1的氨基酸序列的氨基-末端的苯丙氨酸上。
[0080]本发明的另一特定实施方案是其中大于90％的聚乙二醇结合至SEQ ID NO：1的氨基酸序列氨基-末端的苯丙氨酸上的人生长激素-PEG缀合物上。
[0081]本发明的另一特定实施方案是其中大于95％的聚乙二醇结合至SEQ ID NO：1的氨基酸序列氨基-末端的苯丙氨酸上的人生长激素-PEG缀合物上。
[0082]本发明的另一特定实施方案是其中大于98％的聚乙二醇结合至SEQ ID NO：1的氨基酸序列氨基-末端的苯丙氨酸上的人生长激素-PEG缀合物上。
[0083]用于本发明的聚(乙二醇)不限于任何特殊形式或分子量范围。聚(乙二醇)分子量可以在约500和约100,000道尔顿之间。术语“大约”表示在聚乙二醇制备中，一些分子将比规定的分子量重一点，一些轻一点，所述的规定的分子量指平均分子量。可以理解，有一些程度的与聚合物如聚(乙二醇)相关的多分散性。优选使用具有低分散性的PEG。通常，使用具有约500-约60,000的分子量的PEG。本发明的特定PEG分子量范围是约1,000-约40,000。在另一特定实施方案中，PEG分子量大于约5,000-约40,000。在另一特定实施方案中，PEG分子量约20,000-约40,000。取决于期望的治疗性质(例如，期望的持续释放的持续时间，如果有的话，对生物活性的影响，抗原性的程度或抗原性的缺少以及其它已知的聚乙烯对治疗蛋白的影响)，可以使用其它大小的PEG。例如，聚乙二醇可以具有的平均分子量为约200、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10,000、10,500、11,000、11,500、12,000、12,500、13,000、13,500、14,000、14,500、15,000、15,500、16,000、16,500、17,000、17,500、18,000、18,500、19,000、19,500、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、55,000、60,000、65,000、70,000、75,000、80,000、85,000、90,000、95,000或100,000道尔顿。
[0084]在另一实施方案中，聚(乙二醇)是具有多于一个PEG部分连接的分支PEG(U.S.5,932,462；U.S.5,342,940；U.S.5,643,575；U.S.5,919,455；U.S.6,113,906；U.S.5,183,660；Kodera Y.，Bioconjugate Chemistry 5：283-288(1994)；和WO 02/09766)。在一优选的实施方案中，分支PEG的每个聚(乙二醇)的分子量约为5,000-20,000。在一特定的实施方案中，分支PEG的每个聚(乙二醇)的分子量约为20,000。
[0085]聚(烯基氧化物)，特别是聚(乙二醇)通过末端活性基团结合至hGH或其激动剂变体上，所述的结合在PEG和蛋白质之间可能留下或不留下连接部分(间隔臂)。为了形成本发明的hGH缀合物或其激动剂变体，将聚合物如聚(乙二醇)转化为活化形式，这方面是本领域技术人员已知的。反应性基团例如是末端反应性基团，所述的该基团介导蛋白质上的化学部分和聚(乙二醇)之间的键。通常，将一个或两个末端的聚合物羟基末端基团(即α和ω末端羟基基团)转化为反应性官能团，所述的官能团使得能共价结合。该过程常常称为“活化”并且具有反应性基团的聚(乙二醇)产物此后称为“活化的聚(乙二醇)”。在一特定的实施方案中，将一个末端的聚合物羟基末端基团转化为或用非反应性基团保护。在一特定的实施方案中，将一个末端的聚合物羟基末端基团转化为或用甲基保护。如此处使用的，术语“mPEG”指一端用甲基保护的PEG。mPEG在结构上可以表示为：
                CH3O-(CH2CH2O)n-H
[0086]含有α和ε连接基团的聚合物称为“双活化聚(乙烯基氧化物)”并称为“双官能团的”。在α和ε末端羟基含有相同反应性基团的聚合物有时称为“同双官能”或“同双-活化”。在α和ε末端羟基上含有不同反应性基团的聚合物有时称为“异双官能”(见例如WO01/26692)或“异双-活化”。含有单个反应性基团的聚合物称为“单活化”聚烯基氧化物或“单-官能”。其它基本非抗原聚合物也类似地经“活化”或“官能化”。
[0087]活化的聚合物因而适于介导蛋白质上的化学部分如α-或ε-氨基、羧基或巯基与聚(乙二醇)之间的键。双活化的聚合物可以以这种方式与两个蛋白质分子或在另一实施方案中与一个蛋白质分子和一个反应性小分子反应以通过交联有效地形成蛋白聚合物或蛋白-小分子缀合物。
[0088]在本发明的一个优选实施方案中，用hGH或其激动剂变体的N-末端赖氨酸的α-氨基或ε-氨基与活化的PEG形成仲胺或酰胺键。在本发明的另一优选方面，如Chamow等，Bioconjugate Chem.5：133-140(1994)，美国专利号4,002,531，WO 90/05534以及美国专利号5,824,784中描述的，通过使用合适的还原剂如NaCNBH3、NaBH3、吡啶甲硼烷等的还原性烷基化，在hGH或其激动剂变体的N-末端赖氨酸的α-氨基或ε-氨基与单链或支链PEG乙醛之间形成仲胺键。
[0089]在一优选的实施方案中，至少70％、优选至少80％、优选至少81％、优选至少82％、优选至少83％、优选至少84％、优选至少85％、优选至少86％、优选至少87％、优选至少88％、优选至少89％、优选至少90％、优选至少91％、优选至少92％、优选至少93％、优选至少94％、优选至少95％、优选至少96％、优选至少97％，以及最优选至少98％的聚(乙二醇)是在氨基末端的α-氨基上。
[0090]称为聚乙二醇化反应的结合反应过去在具有摩尔过量的聚合物的溶液中进行并不考虑聚合物将结合至蛋白质的何处。然而，这种普通的技术通常已经证明结合生物活性蛋白质至非抗原聚合物同时保持足够生物活性是不充分的。一种保持hGH或其激动剂变体生物活性的方法是在聚合物结合过程中基本避免那些hGH或其激动剂变体的与受体结合位点相关的反应性基团的结合。本发明的另一方面是提供将聚(乙二醇)结合至hGH或其激动剂变体上而保持高水平的存留活性的方法。
[0091]通过共价键的化学修饰可以在通常在生物活性物质与活化的聚(乙二醇)的反应中采用的任何合适的条件下进行。结合反应在相对温和的条件下进行以避免失活hGH或其激动剂变体。温和的条件包括保持反应溶液的pH为3-10并且反应温度约在0℃-37℃内。在hGH或其激动剂变体的活性氨基酸残基具有游离的氨基的情况下，上述修饰优选地在一系列合适的缓冲液(pH 3-10)中在4℃-37℃下进行1-48小时，所述的缓冲液包括磷酸盐缓冲液、MES、柠檬酸缓冲液、醋酸缓冲液、琥珀酸缓冲液或HEPES，但不限于此。在用试剂如PEG乙醛攻击N-末端氨基时，优选保持pH 4-7。活化的聚(乙二醇)可以以约0.01-100倍，优选约0.01-2.5倍于hGH或其变体游离氨基数目的摩尔量使用。在另一方面，如果hGH或其激动剂变体的反应性氨基酸残基具有游离羧基，上述修饰优选在4℃-37℃下约3.5-约5.5的pH中进行1-24小时，例如，用聚(氧乙基二胺)修饰是在存在碳二亚胺(pH 4-5)时进行。活化的聚(乙二醇)可以以0.01-300倍于hGH或其激动剂变体游离羧基数目的摩尔量使用。
[0092]在单独的实施方案中，结合反应中包括的聚合物的量的上限超过约1∶1的量，所述量为有可能使活化的聚合物和hGH或其激动剂变体反应而不形成相当量的高分子量种类的量，所述的相当量的高分子种类即为多于约20％的缀合物每分子hGH或其激动剂变体含有多于约-条链的聚合物。例如，在本发明的这方面，考虑可将多达约6∶1的比率用于形成显著量的期望缀合物，所述期望的缀合物随后可以从任何高分子量种类分离。
[0093]在本发明的另一方面，双官能活化的PEG衍生物可以用于产生聚合的hGH或其激动剂变体-PEG分子，其中多个hGH或其激动剂变体分子通过PEG交联。虽然这里描述的反应条件可以得到显著量的未经修饰的hGH或其激动剂变体，但这些未经修饰的hGH或其激动剂变体可以方便地再循环进将来的反应中进行另外的结合反应。本发明的方法令人惊奇地产生十分少的，即少于约30％并更优选地，少于约10％的高分子量种类和每个hGH或其激动剂变体含有多于一个聚合物链的种类。这些反应条件将与通常用于其中的活化聚合物对靶标数倍摩尔过量的聚合物结合反应的那些反应条件相比较。在本发明的另外方面，聚合物以每当量hGH或其激动剂变体约0.1-50当量的量存在。在本发明的另外方面，聚合物以每当量hGH或其激动剂变体约1-10当量的量存在。
[0094]本发明的结合反应最初提供含有单-和二-PEG-hGH缀合物、未反应的hGH、未反应的聚合物以及通常少于约20％高分子量种类的反应混合物或合并的库。高分子量种类包括含有多于一条聚合物链和/或聚合化的PEG-hGH或其激动剂变体种类的缀合物。在已经移除未反应的种类和高分子量种类后，回收主要含有单-和二-聚合物-hGH或其激动剂变体缀合物的组合物。假定缀合物大部分包括单条聚合物链，则该缀合物基本是均质的。当使用标准的FDC-P1细胞增殖测定法(Clark等，Journal of Biological Chemistry 271：21969-21977，1996)、受体结合测定法(US 5,057,417)或垂体切除的大鼠的生长(Clark等，Journal of Biological Chemistry 271：21969-21977，1996)测量时，这些经修饰的hGH或其激动剂变体具有至少约0.1％的与天然或未经修饰的hGH或其激动剂变体相关的体外生物活性。然而在本发明优选的方面，经修饰的hGH或其激动剂变体具有约25％的体外生物活性，更优选地，经修饰的hGH或其激动剂变体具有约50％的体外生物活性，更优选地，经修饰的hGH或其激动剂变体具有约75％的体外生物活性，并且最优选地经修饰的hGH或其激动剂变体具有相等的活提高的体外生物活性。
[0095]本发明的方法优选包括相当有限的聚合物与hGH或其激动剂变体的比率。因而，已经发现hGH或其激动剂变体缀合物主要限于含有仅一条聚合物链的种类。而且，聚合物与hGH或其激动剂变体活性基团的连接比使用更高摩尔过量的聚合物连接物时具有相当少的随机性。在已经将结合反应淬灭后，使用离子交换或分子排阻色谱或类似分离技术可将存在于反应混合物中的未经修饰的hGH或其激动剂变体再循环进将来的反应中。
[0096]聚(乙二醇)-修饰的hGH或其激动剂变体，即根据本发明的化学修饰蛋白可以通过用于纯化蛋白的常规方法如透析、盐析、超滤、离子交换色谱、疏水作用色谱(HIC)、凝胶色谱和电泳从反应混合物中分离。离子交换色谱在除去未反应的聚(乙二醇)和hGH或其激动剂变体中是特别有效的。在本发明的进一步实施方案中，将单-和二-聚合物-hGH或其激动剂变体种类从反应混合物中分离以除去高分子量种类和未修饰的hGH或其激动剂变体。通过将混合的种类置于含有约0.5-10mg/mL hGH或其激动剂变体-聚合物缀合物的缓冲溶液中分离是有效的。合适的溶液具有约4-约10的pH。溶液优选含有一种或多种选自KCl、NaCl、K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO4、NaHCO3、NaBO4、CH3CO2H和NaOH的缓冲盐。
[0097]取决于反应缓冲液，hGH或其激动剂变体聚合物缀合物溶液可能首先必须进行缓冲液交换/超滤以除去任何未反应的聚合物。例如PEG-hGH或其激动剂变体缀合物溶液可以穿过低分子量筛截(10,000-30,000道尔顿)膜进行超滤以除去大部分不需要的物质例如未反应的聚合物，如果有表面活性剂，除去表面活性剂等。
[0098]优选用离子交换色谱介质将缀合物分级分离进含有期望的种类的库中。这种介质能通过以某种程度上可预测的方式变化的电荷的差异选择性结合PEG-hHG或其激动剂变体缀合物。例如，hGH或其激动剂变体的表面电荷通过蛋白表面上的可提供的带电基团的数目而测定。这些带电基团通常作为聚(烯基氧化物)聚合物潜在的连接点。因此，hGH或其激动剂变体缀合物将具有与其它种类不同的电荷而使得能选择性分离。
[0099]将强极性阴离子或阳离子交换树脂如分别是季铵或磺丙基树脂用于本发明方法。特别优选离子交换树脂。一系列包括的适用于本发明的商业化阳离子交换树脂是SP-hitrap、SP Sepharose HP和SP Sepharosefast flow，但不限于此。也可以使用其它合适的阳离子交换树脂例如S和CM树脂。一系列适用于本发明的阴离子交换树脂，包括可商业提供的阴离子交换树脂，是Q-hitrap、Q Sepharose HP和Q sepharosefast flow，但不限于此。也可以使用其它合适的阳离子交换树脂例如DEAE树脂。
[00100]例如，通过常规方法优选地将阴离子或阳离子交换树脂填充至柱中并平衡。使用具有与缀合聚合物的hGH或其激动剂变体溶液相同pH和重量摩尔渗透压浓度的缓冲液。洗脱缓冲液优选含有一种或多种选自KCl、NaCl、K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO4、NaHCO3、NaBO4和(NH4)2CO3的盐的缓冲液。然后将含有缀合物的溶液吸附于柱上而其中没有保留未反应的聚合物和一些高分子种类。上样完成后，将具有渐增盐浓度的梯度洗脱缓冲液施加至柱上以洗脱期望的聚烯基氧化物-缀合的hGH或其激动剂变体级分。在阳离子或阴离子交换分离步骤后，洗脱的合并的级分优选限于相同的聚合物缀合物。然后通过常规技术从柱上洗脱，可将任何未缀合的hGH或其激动剂变体种类回收。如果需要，可进一步通过另外的离子交换色谱或分子排阻色谱将单和多聚乙二醇化hGH或其激动剂变体种类相互分离。
[00101]也可以使用利用多个渐增浓度的盐或pH的恒溶剂洗脱步骤的技术。多个渐增浓度的恒溶剂洗脱步骤将导致相继洗脱二-和单-聚合物缀合物-hGH或其激动剂变体。
[00102]洗脱的温度范围是约4℃和约25℃之间。优选地，洗脱在约4℃至约22℃下进行。例如，PEG-hGH或其激动剂变体级分的洗脱通过在280nm下的UV吸收度检测。通过简单的时间洗脱曲线完成级分收集。
[00103]表面活性剂可用于聚(乙二醇)聚合物与hGH或其激动剂变体部分缀合的过程中。合适的表面活性剂包括离子型剂如十二烷基磺酸钠(SDS)。也可使用其它离子型表面活性剂如十二烷基磺酸锂、季铵化合物、牛磺胆酸、辛酸、癸烷磺酸等。也可以使用非离子表面活性剂。例如，可以使用材料如聚(氧乙烯)山梨聚糖类(吐温类)、聚(氧乙烯)酯类(Triton类)。也见Neugebauer，A Guide to theProperties and Uses of Detergents in Biology and Biochemistry(1992)Calbiochem公司。用于本发明方法中的表面活性剂的唯一限制是它们在不会引起hGH或其激动剂变体基本不可逆地变性和不会完全抑制聚合物缀合的条件和浓度下使用。表面活性剂以约0.01-0.5％，优选以约0.05-0.5％，最优选以约0.075-0.25％的量存在于反应混合物中。也考虑表面活性剂的混合物。
[00104]据认为，表面活性剂在聚合物缀合过程中提供暂时的、可逆保护体系。表面活性剂已经显示能有效地选择性阻碍聚合物缀合而允许基于赖氨酸的或基于氨基末端的缀合进行。
[00105]本发明的聚(乙二醇)修饰的hGH或其激动剂变体具有更持久的药理学效果，这可能归结于其延长的体内半衰期。
[00106]本发明的另一实施方案涉及用于预防和/或治疗其中使用GH，优选hGH是有利的疾病或病症的方法，所述的方法包括将治疗有效量的本发明的聚(乙二醇)修饰的hGH或其激动剂变体单独地或与其它治疗剂联合施用至需要它们的患者上。本发明也涉及本发明的聚(乙二醇)修饰的hGH或其激动剂变体在生产用于预防和/或治疗其中使用GH，优选hGH是有利的疾病或病症的药物中的用途。而且，本发明也涉及包含本发明的聚(乙二醇)修饰的hGH或其激动剂变体的药物组合物，所述的药物组合物用于预防和/或治疗其中使用GH，优选hGH是有利的疾病或病症。
[00107]其中使用GH是有利的疾病或病症包括，但不限于生长激素缺乏(GHD)、成人生长激素缺陷(aGHD)、特纳氏综合征、短于胎龄出生(SGA)的儿童的生长不足、帕-魏二氏综合征(PWS)、慢性肾功能不全(CRI)、艾滋消瘦和衰老、晚期肾功衰竭、囊性纤维化、勃起功能障碍、HIV脂肪营养障碍、纤维肌痛、骨质疏松症、记忆障碍、抑郁症、克隆氏症、骨骼发育不良、外伤性脑损伤、蛛网膜下腔出血、努南综合征、唐氏综合征、先天性身材矮小症(ISS)、晚期肾脏疾病(ESRD)、极低出生体重(VLBW)、骨髓干细胞救援、代谢综合征、糖皮质激素肌病、儿童中由于糖皮质激素治疗引起的身材矮小症以及矮小早熟儿童伴随的生长不足。
[00108]在本发明一更特定的实施方案中，本发明的聚(乙二醇)修饰的hGH及其激动剂变体用于预防和/或治疗选自GHD、aGHD、SGA、PWS、特纳氏综合征和CRI的疾病。
[00109]在本发明的另一更特定的实施方案，本发明的聚(乙二醇)修饰的hGH或其激动剂变体用于预防和/或治疗选自先天性身材矮小症、极低出生体重、外伤性脑损伤、代谢综合征和努南综合征的病症或疾病。
[00110]本发明的另一实施方案涉及包含单独的本发明的聚(乙二醇)修饰的hGH或其激动剂变体或与其它治疗剂的组合，以及至少一种可药用赋形剂或载体的药物组合物。然后可将本发明的聚(乙二醇)修饰的hGH或其激动剂变体配制成也含有可药用稀释剂、用于制备等渗溶液的试剂、pH调节剂等的药物制剂以便将它们施用至患者。
[00111]取决于治疗目的，可将上面的药物制剂经皮下、肌内、静脉内、肺、皮内或经口施用。剂量也可以基于接受治疗患者的疾病的种类和状况，通常对成人通过注射的剂量是0.1mg-5mg，经口服施用的剂量为0.1mg-50mg。
[00112]如此处使用，本发明的聚(乙二醇)修饰的hGH或其激动剂变体可以与另外的治疗剂联合使用。如此处使用的，提到化合物A和一种或多种其它治疗剂时，术语“共施用”、“共施用的”和“与...联合”意在表示如下，以及剂量如下并包括以下：
-当将这些组分一起配制成单剂型时，同时施用A和治疗剂的这种组合至需要治疗的患者，所述的剂型基本以相同的时间释放所述的组分至所述的患者。
-当这些组分相互分开配制成单独的剂型时，基本同时施用A和治疗剂的这种组合至需要治疗的患者，所述的单独剂型基本同时由患者摄取，因此所述的组分基本同时释放至所述的患者。
-当这些组分相互分开配制成单独的剂型时，相继施用A和治疗剂的这种组合至需要治疗的患者，在每次施用之间有明显的时间间隔，其中所述的单独剂型以连续的次数由患者摄取，因此所述的组分以基本不同的次数释放至所述的患者；以及
-当将这些组分一起配制成以可控制的方式释放所述组分的单剂型时，相继施用A和治疗剂的这种组合至需要治疗的患者，因此所述的组分由患者以相同和/或不同次数同时、连续和/或重叠施用。
[00113]可以与A联合使用的其它治疗剂、它们的可药用盐和/或它们的衍生形式的合适实例包括但不限于：芳香酶抑制剂如依西美坦、福美坦、阿他美坦、法倔唑、来曲唑、伏氯唑和阿纳托唑；游离脂肪酸调节剂，包括fibric酸衍生物(例如非诺贝特、氯贝特、吉非贝齐、苯扎贝特和环丙贝特)和烟酸衍生物如阿西莫司；胰岛素致敏剂，包括但不限于，双胍类如二甲双胍、PPARγ胰岛素致敏剂和thiazolodenione类如曲格列酮和罗格列酮，曲格列酮为5-[[4-[3，4-二氢-6-羟基-2，5，7，8-四甲基-2H-]-苯并吡喃-2-基)甲氧基]苯基]甲基3-2，4-噻唑烷二酮V411(DIABII，Glaucanin)，匹格列酮(ACTOS，AD 4833，U 72107，U 72107A，U 72107E，ZACTOS)，其化学名为：2，4-噻唑烷二酮、5-[[4-[2-(5-乙基-2-吡啶基)乙氧基]苯基]甲基]-，一氢氯化物，(a/-)；罗格列酮(Avandia，BRL 49653，BRL 49653C)化学名为：2，4-噻唑烷二酮、5-[[4-[2-(甲基-2-吡啶基arnino)乙氧基]苯基]甲基]；口服25贝沙罗汀(口服LGD 1069、口服Targretin、Targretin、口服Targretyn、口服Targrexin)，其化学名为：4-[1-(3，5，5，8，8-五甲基-5，6，7，8-四氢-2-萘基)乙烯基]苯甲酸；ZD 2079、(ICI D 2079)(化学名：R)-N-[2-4-(羧甲基)30苯氧基]乙基)-N-(2-羟基-2-苯乙基)氯化铵：Netoglitazone，(Isaglitazone、MCC 555、RWJ 241947)(化学名：5-[6(2-氟苄氧基)萘-2-基甲基]噻唑烷-2，4-二酮)；INS(D-手性-肌醇)(化学名：D-1，2，3，4，5，6-六羟基环己烷)，ON 2344(DRF 2593)；Dexlipotam，化学名：5(R)-(1，2-二硫杂环戊烷-3-基)pentaloic 35酸；HQL 975，化学名：3-[4-[2-(5-甲基-2-苯基唑-4-基)乙氧基]苯基]-2(S)-(丙氨基)丙酸；YM 268，化学名：5，5′-亚甲基-双(1，4-亚苯基)双亚甲基双(噻唑烷-2，4-二酮)。处于开发的I PPAR激动剂，包括：Reglitazar(JTT 501，PNU 182716，PNU 716)(化学名：异噁唑烷-3，5-二酮，i 4-[[4-(2-苯基-5-甲基)-1，3-噁唑基]乙氧基苯基-4]甲基-，(4RS))；I(RP 297，化学名：105-(2，4-二氧代噻唑烷-5-基甲基)-2-甲氧基-N-[4-(三氟甲基)苄基苯酰胺；R 119702(CI 1037，CS 011)，化学名：(/-)-5-[4-(5-甲氧基-1H苯并咪唑-2-基甲氧基)苯甲基]噻唑啉-2，4-二酮；盐酸盐；15 DRF 2189，化学名称：5-[[4-[2-(1-吲哚基)乙氧基]苯基]甲基]噻唑烷-2，4-二酮；皮质醇合成抑制剂如酮康唑、益康唑或咪康唑；生长激素如生长激素(somatropin)或基因重组生长激素(somatonorm)及其衍生物例如人生长激素融合蛋白如ALBUTROPIN；聚乙二醇生长激素例如半胱氨酸-乙二醇化生长激素、BT005(Bolder BioTechnology公司)；生长激素促分泌素例如SM 130686(Sumitomo)卡普瑞林(Pfizer)、美卡舍明(Fujisawa)、舍莫瑞林(Salk研究所，Bio-Technology General)、基因重组生长激素(somatrem)、促生长激素(C Llorente；Pharmacia公司)艾沙瑞林、他莫瑞林；CP 464709(Pfizer)、LY 426410和LY 444711(Lilly)；如WO2002057241公开的8-(氨基烷氧基亚氨基)-8H-二苯并[a，e]三唑[4，5-c]环庚烯类、如WO2002056873描述的2-取代的二苯并[a，e]1，2，3-三唑[4，5-c][7]轮烯-8-酮、如美国专利No.4,411,890和出版物WO 89/07110、WO 89/07111描述的生长激素释放肽GHRP-6和GHRP-1、如WO 93/04081中描述的B-HT920、hexarelin和GHRP-2或生长激素释放激素(GHRH，也命名为GRF)及其类似物、促生长激素包括IGF-1和IGF-2及其衍生物如SomatoKine-胰岛素样生长激素-1及其结合蛋白的一种重组融合蛋白、BP-3、α-2-肾上腺能激动剂如可乐定、甲苯噻嗪、地托咪定和美托咪定或5-羟色胺5HTID激动剂如surnitriptan或抑制促生长素抑制素或其释放的药剂如毒扁豆碱和吡斯的明、ThGRF 1-44(Theratechnologies)；L 165166(Merck& Company)；如WO9858947描述的二肽衍生物、如US6521644、WO95/15309和WO98/19998描述的二肽基肽酶IV抑制剂如氨基-酰吡咯烷腈；β-氨基杂环二肽基肽酶抑制剂如在US20030100563和WO2003082817中描述的那些；如US20030055261、US20030040483、EP 18 072、EP 83 864、WO 89/07110、WO 89/01711、WO 89/10933、WO 88/9780、WO 83/02272、WO 91/18016、WO 92/01711、WO 93/04081、WO 9514666、EP0923539、美国专利号5,206,235、5,283,241、5,284,841、5,310,737、5,317,017、5,374,721、5,430,144、5,434,261、5,438,136、5,494,919、5,494,920、5,492,916、5,536,716和5,578,593、WO 94/13696、WO 94/19367、WO 95/03289、WO 95/03290、WO 95/09633、WO 95/11029、WO 95/12598、WO 95/13069、WO 95/14666、WO 95/16675、WO 95/16692、WO 95/17422、WO 95/17423、WO 95/34311和WO 96/02530描述的生长激素释放化合物、如US5804578、US5783582、WO2004007468描述的哌啶类、吡咯烷类和六氢-1H-氮杂类、AMIDOSPIROPIPERIDINES，例如在WO0104119中描述的那些、2-氨基-5-嘧啶乙酸化合物，包括如US6329383描述的2-[(5，6-二甲基-2-苯并咪唑基)氨基]-4-羟基-6-甲基-5-嘧啶乙酸盐(2)和2-[(5，6-二甲基-2-苯并咪唑基)氨基]-4-羟基-6-甲基-5-嘧啶乙酸乙酯、如EP1155014描述的苯并咪唑类、涉及GRF的类似肽基化合物和美国专利4,411,890的肽、促性腺激素释放激素的拮抗剂如在WO0170228、WO0170227、WO0170228、WO0069433、WO0004013、W0995156、WO9951595、WO9951231-4、WO9941251-2、WO9921557、WO9921553中描述的那些以及如WO0053602、WO0053185、WO0053181、WO0053180、WO0053179、WO0053178、US6288078中描述的6-氮杂吲哚化合物；IGF-1促分泌素；胰岛素样生长激素-2(IGF-2或促生长激素A)和IGF-2促分泌素；myostatin拮抗剂和抑制成纤维细胞生长激素受体-3(FGFR-3)酪氨酸激酶的化合物。
[00114]包括的聚合物也优选在室温下是水溶性的。一系列这种聚合物包括聚(烯基氧化物)均聚物如聚(乙二醇)或聚(丙二醇)、聚(氧乙烯化的多元醇)、其共聚物及其嵌段共聚物，但不限于此，只要嵌段共聚物的水溶性得以保持。
[00115]作为基于PEG的聚合物的备选，也可使用有效地非抗原材料如葡聚糖、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(聚丙烯酰胺)、聚(乙烯醇)、基于碳水化合物的聚合物等。实际上，这些聚合物的α-和ε-末端基团的活化可以以类似于用来转化聚(烯基氧化物)的方式有效地进行，并因而对一般技术人员是显而易见的。本领域普通技术人员将认识到，前面的名单仅是说明性的并且所有具有这里描述的性质的聚合物得以考虑。对本发明来说，“有效地非抗原的”指本领域已知无毒的并不会在哺乳动物中引起明显的免疫源应答的所有材料。
定义
[00116]以下是在此可以互换使用的缩写和相应含义的列表：
g       克
mg      毫克
ml或mL  毫升
RT      室温
PEG     聚(乙二醇)
[00117]正如特定地和独立地指出通过引用作为参考的每个独立的出版物、专利或专利申请，在该公开内容中引用的所有出版物、专利和专利申请的全部内容在此通过引用作为参考。
[00118]虽然为了清楚理解的目的已经通过说明和实例的方式相当详细地描述了前述的发明，但按照本发明的技术本领域技术人员将很容易明白可以做出改变和修饰而不脱离本发明的精神和范围。仅为了例证目的提供下面的实施例并且不意于限制本发明的范围，本发明的范围已经在上面以广泛的条款得以描述。
[00119]在下面的实施例中，hGH是SEQ ID NO：1的hGH。可以理解，hGH或其激动剂变体家族多肽的其它成员也可以类似于后面实施例中示范的方式进行聚乙二醇化。
实施例
实施例1
分支的40,000MW PEG-丁醛hGH
[00120]本实施例说明通过还原性烷基化产生基本均一的在N-末端单聚乙烯化的hGH制剂的方法。利用N-末端伯胺相对pKa值对赖氨酸残基ε-氨基位点伯胺的pKa值的不同，通过还原性氨基化将约40,000MW(Shearwater Corp.)的甲氧基-分支PEG丁醛试剂选择性地结合至hGH的N-末端。通过加入M-PEG-ALD以产生2∶1的相对PEG∶hGH摩尔比，使以10mg/mL溶解于25mM Hepes(Sigma Chemical圣路易斯，密苏里州)pH 7.0(任选25mM MES(Sigma Chemical，圣路易斯，密苏里州)pH 6.0、10mM乙酸钠(Sigma Chemical，圣路易斯，密苏里州)pH 4.5)中的hGH蛋白质与甲氧基-PEG-丁醛、M-PEG-ALD(Shearwater公司，Huntsville，AL)反应。通过加入溶解于水中的1M NaCNBH4储液(Sigma Chemical，圣路易斯，密苏里州)至10-50mM终浓度而催化反应。反应于RT下在黑暗中进行18-24小时。通过加入1M Tris(Sigma Chemical，圣路易斯，密苏里州)～pH 7.6达到50mM的Tris终浓度停止反应或将反应物稀释进合适的缓冲剂来立即纯化。
[00121]表1显示通过分子排阻色谱测定的多-聚乙二醇化种类、单-聚乙二醇化缀合物、未反应的PEG的百分比，以及40K分支PEG-乙醛和40K分支PEG-丁醛的最终纯化产量。与PEG-乙醛相比PEG-丁醛导致增加的单聚乙二醇化缀合物、降低的未反应PEG水平和增加的终产量。
表1
  40K分支PEG-ALD-hGH和40K分支PEG-丁醛-hGH的比较
  反应混合物中的种类
  40K PEG-乙醛hGH   40K PEG-丁醛-hGH
  多-PEG产物   4.02％   5.03％
  单-PEG产物   48.70％   61.02％
  未反应的hGH   41.80％   29.20％
  最终纯化产量   30.80％   44.70％
实施例2
直链30,000MW PEG-丁醛hGH
[00122]使用实施例1描述的方法将甲氧基-直链30,000MWPEG-丁醛试剂结合至hGH的N-末端。
实施例3
直链20,000MW PEG-丁醛hGH
[00123]使用实施例1描述的方法将甲氧基-直链20,000MWPEG-丁醛试剂结合至hGH的N-末端。
实施例4
聚乙二醇化hGH的纯化
[00124]使用单个离子交换色谱步骤将聚乙二醇化hGH种类从反应混合物中纯化至＞95％(SEC分析)。
阴离子交换色谱
[00125]用单个阴离子交换色谱步骤将PEG hGH种类从反应混合物中纯化至＞95％(SEC分析)。使用阴离子交换色谱将单-聚乙二醇化hGH从未经修饰的hGH和多-聚乙二醇化hGH中纯化。如上所述，将典型的20K丁醛hGH反应混合物(5-100mg蛋白质)于在25mM HEPES，pH 7.3(缓冲液A)中平衡的Q-Sepharose Hitrap柱(1或5mL)(Amersham Pharmacia Biotech，皮斯卡塔韦，新泽西)或Q-Sepharosefast flow柱(26/20，70mL柱床体积)上纯化。用缓冲液A将反应混合物稀释5-10倍并以2.5mL/分钟的流速上样至柱中。用8柱体积缓冲液A洗涤该柱。随后，用80-100柱体积缓冲液A和0-100mM的线性NaCl梯度将多种hGH种类从柱中洗脱。在280nm(A280)的吸光度监控洗脱液，5mL的级份得以收集。根据聚乙二醇化程度如单、二、三聚乙二醇化等(如实施例15中评估的)合并级分。随后将合并的级分在Centriprep YM10浓缩器(Amicon，Technology公司，Northborough，MA)中浓缩至0.5-5mg/mL。使用0.78的消光系数，通过A280测定合并的级分的蛋白浓度。
阳离子交换色谱
[00126]阳离子交换色谱在平衡于10mM乙酸钠pH 4.0(缓冲液B)中的SP Sepharose高效柱(Pharmacia XK 26/20，70ml柱床体积)上进行。用缓冲液B将反应混合物稀释10倍并以5mL/分钟的流速上样至柱中。接着用5柱体积的缓冲液B洗涤该柱，随后用5柱体积12％的缓冲液C(10mM醋酸盐pH 4.5，1M NaCl)洗涤。然后，用20柱体积12-27％缓冲液C的线性梯度将PEG-hGH种类从柱中洗脱。在280nm下监控洗脱液，10mL的级分得以收集。根据聚乙二醇化程度(单、双、三等)合并级分，将其交换进10mM醋酸盐pH 4.5缓冲液中并在具有Amicon YM10膜的stirred cell中浓缩至1-5mg/mL。使用0.78的消光系数，通过A280nm测定合并的级分的蛋白浓度。
实施例5
生化鉴定
[00127]经纯化的聚乙二醇化hGH合并的级分通过非还原性SDS-PAGE、未变性分子排阻色谱和肽谱法鉴定。
分子排阻高效液相色谱法(SEC-HPLC)
未变性SEC-HPLC
[00128]连接化学、大小、连接物和几何多样的甲氧基-PEG与hGH的反应、阴离子交换纯化合并的级分和最终纯化产物使用未变性SEC-HPLC评估。分析非变性SEC-HPLC以0.5mL/分钟流速，在20mM磷酸盐pH 7.2、150mM NaCl中，使用柱Superdex 200 7.8mm×30cm(Amersham Bioscience，皮斯卡塔韦，新泽西)(任选TosohaasG4000PWXL Amersham Bioscience，皮斯卡塔韦，新泽西)进行。聚乙二醇化极大地增加了蛋白的流体力学体积，导致转变为较早的保留时间。新种类及未经修饰的hGH可在PEG乙醛hGH反应混合物中观察到。将这些聚乙二醇化的和非聚乙二醇化的种类在Q-Sepharose色谱上分离，并且得到的纯化的单PEG-乙醛hGH种类随后显示为在未变性SEC上作为单峰洗脱(＞95％纯度)。Q-Sepharose色谱步骤有效地将游离PEG、hGH和多聚乙二醇化hGH种类从单-聚乙二醇化hGH除去。
变性SEC-HPLC
[00129]使用变性的SEC-HPLC评估丁醛聚乙二醇与hGH的反应、阴离子交换纯化和最终纯化产物。以0.8mL/分钟流速，在100mM磷酸盐pH 6.8，0.1％SDS中使用Tosohaas 3000SWXL柱7.8mm×30cm(Tosohaas Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)进行分析变性SEC-HPLC。聚乙二醇化极大地增加了蛋白质的流体力学体积，导致转变为较早的保留时间。将聚乙二醇化的和未聚乙二醇化的种类在Q-Sepharose色谱上分离。
SDS PAGE/PVDF转换
[00130]将SDS-PAGE用于评估PEG丁醛与hGH的反应和纯化的终产物。将SDS-PAGE于还原和未还原条件下在1mm厚的10-20％Tristricine凝胶(Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)上进行并用Novex Colloidal CoomassieTMG-250染色试剂盒(Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)染色。将带印记至PVDF膜上用于随后的N-末端序列鉴定。
分析阴离子交换HPLC
[00131]使用分析阴离子交换HPLC评估PEG丁醛/hGH反应混合物、阴离子交换纯化级分和最终纯化产物。以1mL/分钟的流速，在50mMTris ph 8.6中使用Tosohaas Q5PW或DEAE-PW阴离子交换柱，7.5mm×75mm(Tosohaas Pharmacia Biotech，皮斯卡塔韦，新泽西)进行分析阴离子交换HPLC。用5-200mM NaCl的线性梯度洗脱样品。
N-末端序列和肽谱法
[00132]将自动化埃德曼降解化学用于测定NH2-末端蛋白质序列。将Applied Biosystems Model 494 Procise测序仪(Perkin Elmer，韦尔斯利，麻省)用于降解。各个PTH-AA衍生物采用装配有PerkinElmer/Brownlee 2.1mm i.d.PTH-C18柱的Applied Biosystems Model140C PTH分析仪以在线的方式通过RP-HPLC分析而鉴定。
[00133]以1mg/mL的浓度进行胰蛋白酶消化，并且通常每次消化使用50μg材料。加入胰蛋白酶使得胰蛋白酶与PEG-hGH的比率为1∶30(w/w)。Tris缓冲液为30mM，pH 7.5。将样品在室温下孵育16±0.5小时。每mL消化溶液加入50μL 1N的HCl淬灭反应。在将样品置于自动采样器中前，将样品在6.25％的乙腈中稀释至0.25mg/ml的终浓度。首先加入乙腈(19.8％的乙腈)，轻微搅拌，并随后加入水至终体积(初始体积的4倍)。可将额外的消化溶液移出并于-20℃存储一周。
[00134]将Waters Alliance 2695HPLC系统用于分析，但其它的方法应该产生类似的结果。使用的柱是具有5μm粒子的基于AstecC-4聚合物的25cm×4.6mm柱。通常以每样品50μg蛋白质上样，在周围温度下进行实验。缓冲液A是水中的0.1％的三氟乙酸；缓冲液B是乙腈中的0.085％的三氟乙酸。梯度如下：
时间     A％    B％    C％    D％    流量    曲线
0.00     0.0    0.0    100.0  0.0    1.000   1
90.00    0.0    0.0    55.0   45.0   1.000   6
90.10    0.0    0.0    0.0    100.0  1.000   6
91.00    0.0    0.0    0.0    100.0  1.000   6
91.10    0.0    0.0    100.0  0.0    1.000   6
95.00    0.0    0.0    100.0  0.0    1.000   6
[00135]使用加热外套将柱加热至40℃。用Waters 996 PDA检测器收集210和300nm之间的数据来检测峰。将在214nm提取的色谱用于样品分析。
[00136]对hGH、40K分支PEG-醛和40K分支丁醛进行胰蛋白酶图谱分析(图1)。N-末端胰蛋白酶片段称为T-1。与未聚乙二醇化的hGH比较的百分比存在的T-1在表2中显示。该数据显示，使用PEG-醛90％的PEG修饰是在N-末端，而其它明显地连接至数个可能的赖氨酸残基之一上，而使用PEG-丁醛，多于98％的修饰是在N-末端。
表2
％存在的T-1  与未聚乙二醇化的hGH比较的％存在的T-1
  hGH   28.0％
  PEG-乙醛/hGH   2.6％  9.2％
  PEG-丁醛/hGH   0.3％  1.2％
实施例6
药效研究
大鼠体重增加
[00137]对在Taconic Lab经垂体切除的雌性Sprague Dawley大鼠根据生长率进行为期7-11天的预筛选。将大鼠分为8组。组1的大鼠每日或第0天和第6天皮下剂量施用载体。组2的大鼠每日皮下剂量施用GH(30μg/大鼠/剂量)。组3大鼠第0天和第六天皮下剂量施用GH(180μg/大鼠/量)。组4大鼠第0天、第六天皮下剂量施用40k分支PEG-丁醛-hGH(180μg/大鼠/量)。通过在研究过程中至少每隔一日称重来监控垂体切除大鼠的体重增加。图3&4。
大鼠胫骨长度
[00138]在第11日处死在11日体重增加研究中的动物，取出左侧胫骨用X-射线检测并且使用测径器测量骨的长度。图5
IGF-1研究
[00139]使用来自六-天体重增加研究的动物。在研究过程中于不同时间取出血液样品并通过ELISA测定血清IGF-1的水平。图6
血清生化研究
[00140]如表3所示，将在11日体重增加研究中的动物在第0天和第六天累积施用1.8mg/kg后在第7天用于评估血清的生化值。
表3
化验物 载体   hGH(11日300μg/kg/日)   PEG-hGH(第0天和第六天1.8mg/kg)
  ALB(g/dL)ALP(U/L)ALT(U/L)AST(U/L)BUN(mg/dL)Ca2+(mg/dL)胆固醇(mg/dL)CRE(mg/dL)葡萄糖(mg/dL)磷酸盐(mg/dL)TP(g/dL)   4.07±0.04311±1553.6±2.4149±737.4±1.610.9±0.185.1±2.80.62±0.0273.4±4.78.26±0.286.36±0.10   4.06±0.05309±1651.1±2.2131±426.7±1.5*11.5±0.1*76.9±3.6*0.60±0.0179.6±4.79.59±0.16*6.48±0.10   4.18±0.03*280±1451.3±2.6137±1127.9±0.6*11.0±0.1115.3±2.8*0.59±0.0167.1±8.98.42±0.236.39±0.06
化验物 载体   hGH(11日300μg/kg/日)   PEG-hGH(第0天和第六天1.8mg/kg)
  TBA(μmol/L)SDH(U/L)甘油三酯(mg/dL)LDH(U/L)Na+(mmol/L)K+(mmol/L)Cl-(mmol/L)   10.0±0.511.9±1.057.4±4.0786±72147±0.55.94±0.09103±0.5   7.6±0.4*9.7±1.447.8±5.7762±94146±0.86.31±0.16*102±0.5   11.0±0.410.6±0.745.7±3.9*914±189145±0.6*6.71±0.17*102±0.6
*p＜0.10比载体，p＜0.05比hGH
ALB，白蛋白；ALP，碱性磷酸酯酶；ALT，丙氨酸转氨酶；AST，天冬氨酸转氨酶；BUN，血尿素氮；Ca2+，钙；Chol，胆固醇；CRE，肌酐；Phos，磷酸盐；TP，蛋白总量；TBA，总胆汁酸；SDH，山梨醇脱氢酶；LDH，乳酸脱氢酶；Na+，钠；K+，钾；Cl-，氯。
[00141]在11日，相对于用载体处理的组，用hGH和PHA-794428处理的动物中血尿素氮浓度以相同程度明显减少(p＜0.10)。这表明由于增强的生长过程中新蛋白质的合成使氮的利用增强。
药物代谢动力学研究
[00142]药物代谢动力学研究在正常的、有插管的Sprague-Dawley雄性大鼠中进行。每组使用6只大鼠，以单次皮下推注的形式注射100μg/kg/大鼠的GH或PEG-GH。适当地在1-5日提取血样用于检测相应的PK参数。使用免疫测定法监控每一样品的GH和PEG-GH的血中浓度。
hGH免疫测定
[00143]使用hGH AutoDELFIA试剂盒荧光免疫测定法(PerkinElmer)测定小鼠和短尾猴血浆中的hGH和聚乙二醇化的hGH的蛋白浓度水平。大鼠和人IGF-1水平通过免疫测定试剂盒(Diagnostic System Laboratories)监控。
非人灵长类中实施例1的hGH-PEG缀合物的无房室药物代谢动力学性质。
[00144]将实施例1的hGH-PEG缀合物以0.18mg/kg静脉内(iv)或皮下(sc)推注注射施用给短尾猴(表4)。用n＝3只动物的平均数据测定PK参数。使用AutoDELFIA试剂盒荧光免疫测定法(PerkinElmer)和预先测定的PEG-GH缀合物的标准曲线来测量血浆浓度。
表4
  量(mg/kg)   静脉内0.18/皮下0.18
  CL、静脉内(ml/hr/kg)   0.8
  Vss(ml/kg)   28.0
  T1/2，静脉内(小时)   25.0
  T1/2，皮下(小时)   61.2
  SC AUC(μg/ml*小时)   195
  SC生物药效率(％)   84
  Tmax，皮下(小时)   32
                                序列表
                                序列表
<110>Pharmacia Corporation
     Finn，Rory
<120>N-末端单聚乙二醇化人生长激素缀合物、用于制备它们的方法及其使用方法
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<160>1
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>191
<212>PRT
<213>智人
<400>1
Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg
1               5                   10                  15
Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu
            20                  25                  30
Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro
        35                  40                  45
Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg
    50                  55                  60
Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu
65                  70                  75                  80
Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Ser Leu Arg Ser Val
                85                  90                  95
Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp
            100                 105                 110
Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu
        115                 120                 125
Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser
    130                 135                 140
Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr
145                 150                 155                 160
Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe
                165                 170                 175
Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
            180                 185                 190

Claims (10)

1.一种用于预防和/或治疗其中使用生长激素是有利的疾病或病症的方法，所述的方法包括给需要它的患者单独施用治疗有效量的具有式I或II结构的聚(乙二醇)-修饰的hGH，
Figure A2005800073930002C1
                       式I
或
           mPEG-O(CH2CH2O)n(CH2)mCH2-NH-R
                       式II
其中
n是1-10之间的整数；
m是1-10之间的整数；
R是人生长激素或甲硫氨酰生长激素，
或与另外的治疗剂联合施用，其中，所述的使用生长激素是有利的疾病或病症选自勃起机能障碍、HIV脂肪营养障碍、纤维肌痛、骨质疏松症、记忆障碍、抑郁症、克隆氏症、骨骼发育不良、外伤性脑损伤、蛛网膜下腔出血、努南氏综合征、唐氏综合征、先天性身材矮小症(ISS)、晚期肾脏疾病(ESRD)、极低出生体重(VLBW)、骨髓干细胞救援、代谢综合征、糖皮质激素肌病、儿童中由于糖皮质激素治疗引起的身材矮小症以及矮的早熟儿童伴随的生长不足。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述的其中使用GH是有利的疾病或病症选自先天性身材矮小症、极低出生体重、外伤性脑损伤、代谢综合征和努南综合征。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中n等于4并且m等于3。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述的聚(乙二醇)修饰的hGH具有n等于4并且m等于3的式I结构。
5如权利要求1所述的方法，其中所述的人生长激素含有SEQID NO：1的氨基酸序列。
6.如权利要求5所述的方法，其中大于90％的所述的聚乙二醇结合至SEQ ID NO：1的氨基酸序列的氨基末端苯丙氨酸上。
7.如权利要求6所述的方法，其中大于95％的所述的聚乙二醇结合至SEQ ID NO：1的氨基酸序列的氨基末端苯丙氨酸上。
8.如权利要求1所述的方法，其中每个mPEG具有约20kDa的分子量。
9.一种组合物，其包含式I或II的人生长激素-PEG的缀合物与另一种治疗剂以及至少一种可药用载体的组合，
                      式I
或
         mPEG-O(CH2CH2O)n(CH2)mCH2-NH-R
                      式II
其中
n是1-10之间的整数；
m是1-10之间的整数；
R是人生长激素或甲硫氨酰生长激素。
10.如权利要求9所述的组合物，其中所述的聚(乙二醇)修饰的hGH具有n等于4并且m等于3的式I结构。
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