PT1715887E - Conjugados da hormona de crescimento humana monopegilada n-terminalmente, processo para a sua preparação e métodos para utilização destes - Google Patents

Conjugados da hormona de crescimento humana monopegilada n-terminalmente, processo para a sua preparação e métodos para utilização destes Download PDF

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PT1715887E
PT1715887E PT05702331T PT05702331T PT1715887E PT 1715887 E PT1715887 E PT 1715887E PT 05702331 T PT05702331 T PT 05702331T PT 05702331 T PT05702331 T PT 05702331T PT 1715887 E PT1715887 E PT 1715887E
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Description

1 ΡΕ1715887
DESCRIÇÃO
"CONJUGADOS DA HORMONA DE CRESCIMENTO HUMANA MONOPEGILADA N-TERMINALMENTE, PROCESSO PARA A SUA PREPARAÇÃO E MÉTODOS PARA UTILIZAÇÃO DESTES" 0 presente pedido de patente reivindica prioridade em relação ao pedido US N° 10/771895 apresentado em 4 de Fevereiro de 2004, que é aqui incorporado como referência na sua globalidade tal como ai escrito.
DOMÍNIO DO INVENTO O presente pedido de patente descreve uma modificação quimica, incluindo PEGilação, da Hormona de Crescimento humana (hGH) e variantes agonistas desta, através da qual as propriedades químicas e/ou fisiológicas da hGH podem ser alteradas. A hGH PEGilada pode ter um maior tempo de residência no plasma, uma menor velocidade de desaparecimento, uma maior estabilidade, uma menor antigenicidade, uma menor heterogeneidade de PEGilação ou uma combinação destes. O presente pedido de patente descreve também processos para a modificação da hGH. O presente invento refere-se a composições farmacêuticas compreendendo a hGH modificada. Uma outra forma de concretização é a utilização da hGH modificada no tratamento de anomalias de crescimento e de desenvolvimento. - 2 - ΡΕ1715887
ANTECEDENTES DO INVENTO A hormona de crescimento humana (hGH) é uma proteína que compreende uma cadeia única de 191 aminoácidos reticulados através de duas pontes de dissulfureto e a forma monomérica possui um peso molecular de 22 kDa. A GH humana é secretada pela glândula pituitária e pode ser também produzida através de engenharia genética recombinante. A hGH provocará o crescimento em todos os tecidos corporais que sejam capazes de crescer. A hGH desempenha um importante papel não apenas na promoção do crescimento, na fase de crescimento em seres humanos, mas também na manutenção da composição, anabolismo e metabolismo dos lípidos do corpo normal (K. Barneis e U. Keller, Baillieres Clin. Endocrinol. Metab. 10:337 (1996)). A hGH recombinante está disponível desde há vários anos. Dois tipos de preparações de hGH recombinante terapeuticamente úteis estão presentes no mercado : o autêntico, e.g. • TM Genotropm ou Nutropin™ e um análogo com um resíduo de metionina adicional na extremidade N- terminal, e.g. TM Somatonorm . A hGH é utilizada para estimular o crescimento linear em doentes com nanismo hipopituitário também referido como Deficiência da Hormona de Crescimento (GHD) ou síndroma de Turner, mas outras indicações foram também sugeridas incluindo o tratamento de longo prazo da deficiência de crescimento em crianças que nasceram pequenas para a idade gestacional (SGA), para o tratamento de doentes com o síndroma de Prader-Willi, - 3 - ΡΕ1715887 insuficiência renal crónica (CRI), debilitação por SIDA e Envelhecimento. Os doentes com deficiência de GH no adulto (aGHD) têm vários problemas, tais como as alterações caracteristicas na composição do corpo incluindo o aumento da massa gorda, uma diminuição da massa muscular e do fluido extracelular e a redução da densidade mineral óssea, anormalidades metabólicas dos lipidos e problemas cardiovasculares. Muitos destes problemas são melhorados através da terapia de substituição da hGH (J. Verhelst J. e R. Abs. Drugs; 62: 2399 (2002).
Um importante efeito biológico da hormona de crescimento (GH) é o de promover o crescimento em mamíferos jovens e a manutenção dos tecidos em mamíferos mais velhos. Os sistemas de órgãos afectados incluem o esqueleto, o tecido conjuntivo, músculos e vísceras, tais como fígado, intestinos e rins. As hormonas de crescimento exercem o seu efeito através da interacção com receptores específicos nas membranas das células alvo. A hGH é um membro de uma família de hormonas homólogas que incluem somatotrofinas coriónicas, prolactinas e outras variantes genéticas e de espécies ou hormona de crescimento (Nicoll, C. S. et al. al. (1986) Endocrine Reviews 7: 169). A hGH não é usual entre estas dado que apresenta uma larga especificidade de espécies e se liga quer ao receptor somatogénico clonado (Leung, D. W. et al. al. [1987] Nature 330; 537) quer ao receptor da prolactina (Boutin, J.M. et al. [1988] cell 53: 69) . O gene clonado para a hGH foi expresso numa forma secretada na Escherichia coli (Chang, C.N. et al. [1987] - 4 - ΡΕ1715887 gene 55:189) e o seu ADN e a sequência de aminoácidos foi relatada (Goeddel, et al. (1979) Nature 281: 544; Gray et al. [1985] Gene 39: 247). A hormona de crescimento humana (hGH) participa na maior parte da regulação do crescimento e do desenvolvimento humano normal. Esta hormona pituitária apresenta uma grande quantidade de efeitos biológicos incluindo o crescimento linear (somatogénese), lactação, activação de macrófagos, efeitos do tipo insulina e diabetogénicos entre outros (Chawla, R.K. (1983) Ann. Ver. Med. 34, 519; Edwards, C.K. et al. (1988) Science 239, 769; Thomer, M.O. et al. (1988) J. Clin. Invest. 81: 745). A deficiência em hormona de crescimento humano nas crianças conduz ao nanismo, que tem sido tratado com sucesso desde há mais de uma década por administração exógena de hGH.
Nos adultos, assim como nas crianças, a hGH mantém a composição do corpo normal aumentando a retenção do azoto e a estimulação do crescimento do músculo esquelético e mobilizando a gordura corporal. 0 tecido adiposo visceral responde particularmente à hGH. Adicionalmente a uma maior lipólise, a hGH diminui a assimilação de triglicéridos na gordura corporal armazenada. As concentrações no soro do IGF-I (Factor de crescimento do tipo insulina-I), e IGFBP3 (proteína de ligação 3 do factor de crescimento do tipo insulina) são aumentadas pela hGH. - 5 - ΡΕ1715887 A hormona de crescimento humana (hGH) é um polipéptido de cadeia única consistindo de 191 aminoácidos (peso molecular de 21 500). As ligações dissulfureto ligam as posições 53 e 165 e as posições 182 e 189. Niall, Nature, New Biology, 230:90 (1971). A hGH é um potente agente anabólico, especialmente devido à retenção de azoto, fósforo, potássio e cálcio. O tratamento de ratazanas hipofisectomizadas com GH pode restaurar, pelo menos, uma porção da taxa de crescimento das ratazanas. Moore et al., Endocrinology 122: 2920-2926 (1998). De entre os seus efeitos mais actuantes em sujeitos hipopituitários (deficiência de GH) é acelerado o crescimento da cartilagem de placas do crescimento ósseo resultando num aumento de estatura. Kaplan, Growth Disorders in Children and Adolescents (Springfield, IL: Charles C. Thomas, 1964) . A hGH provoca uma variedade de efeitos fisiológicos e matabólicos em vários modelos animais incluindo o crescimento ósseo linear, lactação, activação de macrófagos, efeitos do tipo insulina e diabetogénicos e outros (R.K. Chawla et al., Annu. Rev. Med. 34:519 (1983); 0. G. P. Isaksson et al. Annu. Rev. Physiol. 47, 483 (1985); C.K. Edwards et al., Science 239, 769 (1988); M.O. Thomer e M.L. Vance, J. Clin. Invest. 82:745 (1988); J.P. Hughes e H.G. Friesen, Ann. Rev. Physiol. 47: 469 (1985)). Foi relatado que, especialmente em mulheres após a menopausa, a secreção da GH diminui com a idade. Millard et al. Neurobiol. Aging, 11: 229-235 (1990); Takahashi et al., Neuroendocrinology M, L6 137-142 (1987). Ver também Rudman - 6 - ΡΕ1715887 et al., J. Clin. Invest., 67: 1361-1369 (1981) e Blackman, Endocrinology and Aging, 16: 981 (1987). Além disto, existe um relato de algumas das manifestações do envelhecimento, incluindo a diminuição da massa muscular, a expansão da massa dos tecidos adiposos e o facto da pele ficar mais fina poderem ser reduzidas através do tratamento com a GH três vezes por semana. Ver, e.g. Rudman et al. N. Eng. J. Med., 323: 1-6 (1990) e o artigo em anexo no mesmo jornal do Dr. Vance (p. 52-54). Estes efeitos biológicos derivam da interacção entre a hGH e os receptores celulares específicos. Dois receptores humanos diferentes foram clonados, o receptor do fígado da hGH (D.W. Leung et al., Nature 330: 537 (1987) e o receptor de prolactina humano (J.M. Boutin et al., Mol. Endocrinology 3: 1455 (1989)).
Contudo, deve haver outros incluindo o receptor de somatotrofina coriónica humano (M. Freemark, M. Comer, G. Komer e S. Handwerger, Endocrinol. 120: 1865 (1987)). Estes receptores homólogos contêm um domínio de ligação da hormona extracelular glicosilada, um domínio de transmembrana único e um domínio citoplásmico, que difere consideravelmente em sequência e dimensão. Assume-se que um ou mais receptores desempenham um papel determinante da resposta fisiológica à hGH.
Observa-se, geralmente, que as proteínas fisiologicamente activas administradas num corpo podem apresentar a sua actividade farmacológica apenas durante um curto período de tempo devido à sua elevada velocidade de desaparecimento no corpo. Para além disso, a hidro- - 7 - ΡΕ1715887 fobicidade relativa destas proteínas pode limitar a sua estabilidade e/ou solubilidade.
Com o fim de diminuir a velocidade de desaparecimento, melhorar a estabilidade ou abolir a antigenicidade das proteínas terapêuticas, foram propostos alguns métodos em que as proteínas são quimicamente modificadas com polímeros solúveis em água. Uma modificação química deste tipo pode bloquear, eficazmente, um enzima proteolítico do contacto físico com o próprio esqueleto da proteína, evitando deste modo a degradação. A ligação química de certos polímeros solúveis em água pode reduzir eficazmente a eliminação renal devido a um aumento do volume hidrodinâmico da molécula. Vantagens adicionais incluem, sob certas circunstâncias, o aumento da estabilidade e do tempo de circulação da proteína terapêutica, o aumento de solubilidade e a diminuição da imunogenicidade. 0 poli (óxido de alquileno), nomeadamente o polietileno-glicol (PEG), é uma tal porção química que tem sido utilizada na produção de produtos de proteína terapêuticos (significando o verbo "pegilar" a ligação de, pelo menos uma molécula de PEG) . Foi demonstrado que a ligação do polietilenoglicol protegia contra a proteólise, Sada et al., J. Fermentation Bioengineering 71: 137-139 (1991) e estão disponíveis métodos para ligar certas porções de polietilenoglicol. Ver a patente U.S. No. 4.179.337, Davis et al., "Non-Immunogenic Polypeptides", concedida em 18 de Dezembro de 1979; e a patente U.S. No. 4.002.531, Royer, "Modifying Enzimes with Polyethylene Glycol and Product - 8 - ΡΕ1715887
Produced Thereby", concedida em 11 de Janeiro de 1977. Para uma revisão ver Abuchowski et al. em Enzymes as Drugs, J.S. Holcerberg e J. Roberts, eds. p. 367-383 (1981)). Têm sido utilizados outros polímeros solúveis em água, tais como copolimeros de etilenoglicol/propileno-glicol, carboximetilcelulose, dextrano, poli(álcool vinílico), poli(vinilpirrolidona), poli(1,3-dioxolano), poli(1,3,6-trioxano), copolimero de etileno/anidrido maleico, poliamionoácidos (quer homopolímeros quer copolimeros aleatórios).
Foi descrito um certo número de exemplos de proteínas terapêuticas pegiladas. 0 ADAGEN®, uma formulação pegilada da desaminase de adenosina, é aprovado para tratar doentes hipersensíveis ao ALL. 0 superóxido de dismutase pegilado está em testes clínicos para tratar danos na cabeça. 0 α-interferão pegilado (U.S. 5.738.846, 5.382.657) foi aprovado para tratar a hepatite; a glucocerebrosidade pegilada e a hemoglobina pegilada são relatadas como estando em testes pré-clínicos. Outro exemplos é o IL-6 pegilado, EF 0 442 724, intitulado "Modified hIL-6", que descreve moléculas de poli(etilenoglicol) adicionadas a IL-6.
Outra proteína terapêutica específica que foi quimicamente modificada é um factor de estimulação de colónias de granulócitos, (G-CSF). 0 G-CSF induz a proliferação rápida e a libertação de granulócitos - 9 - ΡΕ1715887 neutrofílicos na corrente sanguínea e, deste modo, proporciona efeito terapêutico no combate à infecção. A publicação da patente europeia EP 0 401 384, publicada em 12 de Dezembro de 1990, intitulada "Chemically Modified Granulocyte Colony Stimulating Factor", descreve materiais e métodos para preparar o G-CSF a que estão ligadas moléculas de poli(etilenoglicol) . O G-CSF modificado e análogos deste estão também relatados na patente EP 0 473 268, publicada em 4 de Março de 1992, intitulada "Continuous Release Pharmaceutical Compositions Comprising a Polypeptide Covalently Conjugated To A Water Soluble Polymer", declarando a utilização de vários G-CSF e de derivados covalentemente conjugados com um polímero de partículas solúvel em água, tal como polietilenoglicol. Um polipéptido modificado possuindo uma actividade de factor de estimulação de colónias de granulócitos é relatado na patente EP 0 335 423 publicada em 4 de Outubro de 1989. No documento U.S. 5.824.784 são proporcionados métodos para modificar N-terminalmente proteínas ou análogos destas, e composições resultantes, incluindo novas composições de G-CSF modificas qumicamente N-terminalmente. O documento U.S. 5.824.778 descreve G-CSF modificado quimicamente.
Para o polietilenoglicol, tem sido utilizada uma variedade de meios para ligar as moléculas de polietilenoglicol à proteína. Geralmente, as moléculas de polietilenoglicol estão ligadas à proteína através de um grupo reactivo encontrado na proteína. - 10 - ΡΕ1715887
Os grupos amino, tais como os existentes nos grupos lisina ou na parte N-terminal, são adequados para tal ligação. Por exemplo, Royer (patente U.S. No. 4.002.531 acima) declara que foi utilizada alquilação redutora para ligação de moléculas de polietilenoglicol a um enzima. Chamow et al., Bioconjugate Chem. 5: 133-140 (1994) refere-se à modificação da imunoadesina CD4 com o aldeído de monometoxipolietilenoglicol através de alquilação redutora. Os autores relatam que 50% da CD4-Ig foi modificada com
MePEG sob condições que permitem o controlo ao longo de toda a pegilação. Id. na pág. 137. Os autores também relatam que a capacidade de ligação in vitro da CD4-Ig modificada (à proteína gp 120) diminui com uma taxa correlacionada com a extensão da MePEGilação Ibid. A patente U.S. No. 4.904.584, Shaw, concedida em 27 de Fevereiro de 1990, refere-se à modificação do número de resíduos de lisina em proteínas para a ligação das moléculas de polietilenoglicol através de grupos amina reactivos. O documento WO 93/00109 refere-se a um método para estimular os tecidos que respondem à GH de mamíferos ou de aves compreendendo a manutenção de uma concentração da GH no plasma eficaz e contínua durante um período de 3 ou mais dias. Uma via para se conseguir uma tal concentração no plasma é mencionada como sendo através da utilização da GH ligada a uma substância macromolecular, tal como o PEG (polietilenoglicol). A ligação a uma substância macromolecular é mencionada como resultando numa - 11 - ΡΕ1715887 maior meia-vida. A hormona de crescimento humana PEGilada foi relatada no documento WO 93/00109 como utilizando aldeído de mPEG-5000 e éster N-hidroxisuccinimidílico de mPEG (mPEG-NHS-5000). A utilização de mPEG-NHS resultou em misturas heterogéneas de múltiplas formas PEGiladas de hGH. O documento WO 93/00109 descreve também a utilização de mPEG-maleimida em variantes de hGH cisteína PEGiladas. O documento WO 99/03887 descreve uma variante de hormona de crescimento com cisteína que é PEGilada. Designada como BT-005, este conjugado parece ser mais eficaz para estimular o ganho de peso em ratazanas com deficiência em hormona de crescimento e ter uma meia-vida mais longa do que a hGH. A hormona de crescimento humana PEGilada foi também relatada em Clark et al. utilizando éster de succinimidílico de PEG carboximetilado (Journal of Biological Chemistry 271: 21969-21977, 1996). Clark et al. descreve derivados de hGH de dimensão crescente utilizando mPEG-NHS-5000, que conjuga selectivamente com aminas primárias. Níveis crescentes de modificação de PEG reduziram a afinidade pelo seu receptor e aumentaram a EC50 num ensaio com células até 1500 vezes. Olson et al. Polymer Prepints 38: 568-569, 1997, descreve a utilização de N-hidroxisuccinimida (NHS)PEG e propionato de succinimidilo (SPA)PEG para se conseguirem espécies de hGH PEGiladas. O documento 94/20069 descreve profeticamente a - 12 - ΡΕ1715887 hGH PEGilada como parte de uma formulação para administração pulmonar. 0 documento US 4.179.337 descreve métodos para PEGilar enzimas e hormonas para obter conjugados de polipéptidos solúveis em água, não imunogénicos fisiologicamente activos. A GH é mencionada como um exemplo de uma hormona a ser PEGilada. 0 documento EP 458064 A2 descreve a PEGilação de resíduos de cisteína introduzidos ou naturalmente presentes na somatotropina. A EP 458064 A2 menciona ainda a incorporação de dois resíduos de cisteína num ciclo designado por ciclo ómega mencionado como estando localizado nos resíduos 102-112 em somatotropina bovina do tipo selvagem, mais especificamente o documento EP 458064 A2 descreve a substituição de resíduos numerados de 102 a 112 de somatotropina bovina de Ser a Cys e Tyr a Cys, respectivamente. O documento WO 95/11987 sugere a ligação de PEG ao grupo tio de um resíduo de cisteína estando quer presente na molécula original quer introduzida por mutagénese localizada. O documento WO 95/11987 refere-se à PEGilação de nexin-1 protease mas, contudo, a PEGilação em geral da hGH e outras proteínas é também sugerida. O documento WO 99/03887 descreve, e.g. uma hormona de crescimento modificada por inserção de resíduos - 13 - ΡΕ1715887 cys 25 serina adicionais e ligação do PEG aos resíduos de cisteína introduzidos. 0 documento WO 00/42175 refere-se a um método para a produção de proteínas contendo resíduos de cisteína livres para ligação a PEG. O documento WO 00/42175 descreve as seguintes muteínas de hGH: T3C, S144C e T148C e a PEGilação de cisteína destes. O documento WO 97/11178 (assim como os US 5849535, US 6004931 e US 6022711) refere-se à utilização de variantes da GH como agonistas ou antagonistas da hGH. O documento WO 97/11178 descreve também a PEGilação da hGH, incluindo a PEGilação de lisina e a introdução ou substituição de lisina (e.g. K168A e K172R). O documento WO 97/11178 descreve também a substituição G120K. O documento WO 03/04456 descreve uma variedade de espécies de hGH PEGiladas incluindo um conjugado de hGH aldeído de 40K PEG ramificado.
Os relatos anteriores da hGH PEGilada requerem a ligação de múltiplos PEGs, o que resulta numa indesejável heterogeneidade do produto para se conseguir um volume hidrodinâmico superior à filtração nos rins com separação do peso molecular 70K, tal como descrito (Knauf, M.J et al., J. Biol. Chem. 263: 15064-7.5070, 1988).
Correntemente a administração de rhGH é diária - 14 - ΡΕ1715887 durante um certo período de tempo, e por isso uma administração menos frequente seria altamente desejável. Uma molécula de hGH com uma meia-vida de circulação diminuirá o número de administrações necessárias e proporcionará potencialmente níveis de hGh terapêuticos mais óptimos com um concomitante aumento do efeito terapêutico.
Apesar do número de tentativas de PEGilar hGH, existe ainda uma necessidade não satisfeita de uma molécula de hGH PEGilada com as propriedades adequadas para ser um produto comercial viável. 0 presente pedido de patente descreve conjugados PEG-hGH possuindo um único PEG ligado, predominantemente, na fenilalanina N-terminal da hGH, o que proporciona vantagens em relação aos outros conjugados PEG-hGH. A ligação de PEGs de baixo peso molecular (5Kd) múltiplos nos locais α ou ε-amino (término em N e nove lisinas em hGH) utilizando aldeído mPEG-5000 ou éster N-hidroxissuccinimidílico de mPEG (mPEH-NHS-5000) foi descrita no documento WO 93/00109, Clark et al. (Journal of Biological Chemistry 271: 21969-21977, 1996 e Olson et al. (Polymer Preprints 38: 568-569, 1997). Isto resulta numa população heterogénea. Como ilustração a hGH com nove lisinas pode ter algumas moléculas posuindo dez PEGs ligados, algumas com nove, algumas com oito, algumas com sete, algumas com seis, algumas com cinco, algumas com quatro, algumas com três, algumas com dois, algumas com um e algumas com zero. E entre as moléculas com vários, o PEG pode não estar ligado na mesma localização em diferentes - 15 - ΡΕ1715887 moléculas. Isto resulta em heterogeneidade e é desvantajoso quando se desenvolve um produto terapêutico fazendo a conjugação, purificação e caracterização dificil, onerosa e altamente irreprodutivel. Outra aproximação (WO 00/42175) tem sido a utilização de variantes de hGH contendo residuos de cisteina livres para ligação a PEG. Contudo, esta aproximação pode conduzir a uma proteína incorrectamente dobrada possuindo ligações de dissulfureto incorrectamente emparelhadas e resultando num produto PEGilado heterogéneo que possui o PEG ligado a algumas ou todas as cisteínas. Ao ter múltiplos PEGs ligados a múltiplos locais isso pode conduzir a moléculas que possuam ligações menos estáveis entre o PEG e os vários locais, que se podem dissociar com diferentes velocidades. Isto torna difícil predizer com precisão a farmacocinética do produto, o que resulta num doseamento impreciso. Um produto heterogéneo tem também problemas não desejados na obtenção da aprovação oficial como produto terapêutico.
Por isso, seria desejável haver e utilizar uma molécula de hGH PEGilada que possua um único PEG ligado num único local. O presente invento dirige-se a estas necessidades de várias maneiras.
SUMÁRIO DO INVENTO O presente invento refere-se à utilização da hGh qumicamente modificada e a variantes agonistas desta, que possuam, pelo menos, uma melhor propriedade química ou - 16 - ΡΕ1715887 fisiológica seleccionada de, mas não limitada, diminuição da velocidade de desaparecimento, aumento da duração da residência no plasma, maior estabilidade, maior solubilidade e menor antigenicidade. Deste modo, tal como descrito abaixo com mais detalhe, o presente pedido de patente tem um certo número de aspectos que se relacionam com a modificação química de polipéptidos incluindo, mas não limitados a, hGH e variantes agonistas desta, assim como a modificações específicas utilizando uma porção de polietilenoglicol butiraldeído. 0 presente pedido de patente descreve também métodos para a produção da hGH qumicamente modificada e de variantes agonistas desta. Particularmente, o presente pedido de patente descreve um método para a produção hGH qumicamente modificada utilizando butiraldeído, o que resulta numa maior selectividade N-terminal da ligação. 0 presente invento refere-se a composições que compreendem a hGH qumicamente modificada e variantes agonistas desta, sós ou em combinação com outro agente terapêutico. 0 presente invento refere-se também à utilização da hGH qumicamente modificada e de variantes agonistas desta do presente invento, sós ou em combinação com outro agente terapêutico, para a produção de um medicamento para utilização na prevenção e/ou tratamento de anomalias e/ou doenças em que é útil o tratamento com a GH. - 17 - ΡΕ1715887
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 é um cromatograma de HPLC da análise de mapa triptico da reacção da hGH e hGH butiraldeido ramificada 40K ou hGH aldeído ramificada 40K. 0 painel superior é o mapa triptico da hGH butiraldeido ramificada 40K. O painel do meio é o mapa triptico da hGH aldeído ramificada 40K. 0 painel inferior é o mapa triptico da hGH PEGilada. TI é o fragmento triptico N-terminal. A Figura 2 mostra a sequência de aminoácidos da hormona de crescimento humana (SEQ ID N0:1). A Figura 3 mostra a eficácia da hGH butiraldeido ramificada 40K num Teste de Ganho de Peso em Ratazanas. Ratazanas Sprague-Dawley fêmeas hipofisectomizadas foram adquiridas com a idade de 4-5 semanas (100-125 g) na Harlan Labs. Depois de entrar nas instalações dos animais, os animais foram mantidos a uma temperatura ambiente constante de 80°F e pesados, diariamente, durante 4-10 dias, de modo a estabelecer taxas de crescimento basais. Com início no dia 0, as ratazanas (~100 g) em grupos de controlo receberam então uma injecção subcutânea diária de 0,3 mg/kg de hGH (círculos a cheio), ou PBS (círculos vazios), durante onze dias consecutivos. O grupo de teste com hGH butiraldeido ramificada 40K (quadrados a cheio) recebeu doses únicas de 1,8 mg/kg de PHA-794428 nos dias 0 e 6. Havia 8-10 animais por grupo. Foi registado o crescimento médio +/- SEM (desvio padrão). - 18 - ΡΕ1715887 A Figura 4 mostra os Efeitos de Promoção do Crescimento em Resposta à Dose de hGH butiraldeido ramificada 40K em ratazanas. Este estudo de eficácia foi realizado de maneira semelhante ao descrito na Figura 3 excepto que foi administrada uma dose única variada de hGH butiraldeido ramificada 40K (dia 0, apenas) e o estudo desenvolveu-se durante 6 dias. Os grupos de controlo receberam uma vez por dia injecções quer de 0,3 mg/kg de hGH (círculos a cheio) quer de veículo PBS (círculos vazios) durante seis dias consecutivos. A hGH butiraldeido ramificada 40K foi doseada a 1,8 mg/kg (quadrados a cheio), 0,6 mg/kg (quadrados vazios), 0,2 mg/kg (triângulos a cheio) ou 0,067 mg/kg (triângulos vazios). Havia 8 animais por grupo. A Figura 5 mostra o crescimento tibial em resposta à hGH butiraldeido ramificada 40K. Ratazanas hipofisectomizadas foram tratadas tal como descrito na Figura 3. No dia 11 os animais foram sacrificados, as tíbias esquerdas foram removidas e radiografadas com raios X e o comprimento dos ossos foi medido utilizando um paquímetro. Foi registado o crescimento médio +/- desvio padrão. Os asteriscos referem-se a diferenças significativas em relação ao grupo de controlo (p<0,05). A Figura 6 mostra os níveis de IGF-1 no plasma num estudo de eficácia de seis dias. Os animais foram tratados tal como descrito na Figura 4. Foram tiradas amostras de sangue em vários períodos e os níveis de IGF-1 - 19 - ΡΕ1715887 no plasma foram determinados por ELISA. São registadas as médias +/- desvio padrão.
DESCRIÇÃO DETALHADA A hGH e as variantes agonistas desta são membros de uma família de proteínas recombinantes, descrita nos documentos US 4.658.021 (hormona de crescimento humana metionilo - Met-1-191 hGH) e US 5.633.352. A sua produção recombinante e os métodos de utilização estão detalhados nos documentos US 4.342.832, 4.601.980; US 4.898.830; US 5.424.199; e US 5.795.745.
Qualquer hGH ou variante agonista desta purificada e isolada que seja produzida por células hospedeiras, tais como a E. coli e células animais transformadas ou transfectadas utilizando técnicas de genética recombinantes, podem ser utilizadas no presente invento. Variantes de hGH adicionais são descritas nos documentos US 6.143.523 e WO 92/09690 publicada em 11 de Junho de 1992. Entre estas a hGH ou uma variante agonista desta que é produzida pela E. coli transformada, é particularmente preferida. Uma tal hGH variante agonista desta pode ser obtida em grandes quantidades com elevada pureza e homogeneidade. Por exemplo, a anterior hGH ou variante agonista desta pode ser preparada de acordo com um método descrito nos documentos US 4.342.832, 4.601.980; US 4.898.830; US 5.424.199; e US 5.795.745. O termo "possui substancialmente a sequência de aminoácidos seguinte" -20- ΡΕ1715887 significa que a sequência de aminoácidos anterior pode incluir uma ou mais alterações de aminoácidos (remoção, adição, inserção ou substituição) desde que tais alterações não provoquem qualquer não similaridade desvantajosa em função à hGH ou à variante agonista desta. É mais preferido utilizar a hGH ou a variante agonista desta tendo substancialmente uma sequência de aminoácidos em que, pelo menos, esteja incluido uma lisina, ácido aspártico, ácido glutâmico, resíduo de cisteína desemparelhado, grupo examino N-terminal livre ou grupo carboxílico C-terminal livre. O termo "polipéptido de hGH ou proteína de hGH", tal como aqui utilizado, engloba todos os polipéptidos de hGH, preferencialmente de espécies de mamíferos, mais preferencialmente das espécies humana e murina, assim como as suas variantes análogos, ortólogos, homólogos e derivados e fragmentos destas que são caracterizados por promoverem o crescimento na fase de crescimento e por manterem a composição, anabolismo e metabolismo dos lípidos do corpo normais. Preferencialmente, o termo "polipéptido ou proteína de hGH", refere-se ao polipéptido de hGH de SEQ IN NO:l assim como às suas variantes, homólogos e derivados que apresentam essencialmente a mesma actividade biológica (promovendo o crescimento na fase de crescimento e mantendo composição, anabolismo e metabolismo dos lípidos do corpo normais). Mais preferencialmente, o termo "polipéptido ou proteína de hGH", refere-se ao polipéptido de SEQ IN NO:l. - 21 - ΡΕ1715887 0 termo "variantes de polipéptido de hGH", tal como aqui utilizado, refere-se a polipéptidos da mesma espécie mas diferindo de um polipéptido de hGH de referência. Geralmente, as diferenças estão limtadas de modo a que as sequências de aminoácidos da referência e a variante sejam gobalmente muito similares e, em muitas regiões, idênticas. Preferencialmente, os polipétidos de hGH são, pelo menos, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99% idênticos a um polipéptido de hGH de referência, preferencialmente, o polipéptido de hGH de SEQ IN NO:l. Por polipétido possuindo uma sequência de aminoácidos, pelo menos, 95% "idênticos" a uma sequência de aminoácidos em questão, pretende-se que a sequência de aminoácidos do polipéptido em causa seja idêntica à sequência em questão, excepto que a sequência de polipéptido em causa pode possuir até cinco alterações de aminoácidos por cada 100 aminoácidos da sequência de aminoácidos em questão. Estas alterações da sequência de referência podem ocorrer nas posições terminais amino ou carboxi da sequência de aminoácidos de referência ou em qualquer local entre aquelas posições terminais, disseminadas quer individualmente entre os resíduos na sequência de referência quer num ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência. A sequência em questão pode ser uma sequência de aminoácido inteira da sequência de referência ou qualquer fragmento especificado tal como aqui descrito.
Tais variantes de polipéptido de hGH podem ser variantes que ocorrem naturalmente, tal como as variantes - 22 - ΡΕ1715887 alélicas que ocorrem naturalmente, codificados por uma de várias formas alternativas de uma hGH que ocupa uma dada localização num cromossoma de um organismo, ou isoformas codificadas por variantes de união que ocorrem naturalmente, originadas a partir de um único transcrito primário. Alternativamente, uma variante de polipéptido de hGH pode ser uma variante que seja conhecida por ocorrer naturalmente e que pode ser feita utilizando técnicas de mutagénese conhecidas. É sabido que um ou mais aminoácidos podem ser eliminados no N terminal ou no C terminal de um péptido ou proteína bioactivos sem perda substancial de função biológica (ver, por exemplo, Ron et al., (1993), Biol. Chem., 268 2984-1988; descrição que é aqui incorporada como referência na sua globalidade). É também reconhecido por um especialista na matéria que algumas sequências de aminoácidos de polipéptidos de hGH podem variar sem efeito significativo da estrutura ou função da proteína. Tais mutantes incluem, eliminações, inserções, inversões, repetições e substituições seleccionadas de acordo com as regras gerais conhecidas na técnica, de modo a ter pouco efeito na actividade. Por exemplo, orientação sobre como substituições de aminoácidos fenotipicamente silenciosas é proporcionada em Bowie et al. (1990), Science 247: 1306-1310, aqui incorporado como referência na sua globalidade, em que os autores indicam que há duas aproximações - 23 - ΡΕ1715887 principais para estudar a tolerância de uma sequência de aminoácidos à modificação. 0 primeiro método baseia-se no processo de evolução, em que as mutações são quer aceites quer rejeitadas por selecção natural. A segunda aproximação utiliza engenharia genética para introduzir modificações de aminoácidos em posições específicas de uma hGH clonada e selecções ou análises para identificar sequências que mantenham a funcionalidade. Estes estudos revelaram que as proteínas são surpreendentemente tolerantes às substituições de aminoácidos. Os autores indicam ainda que alterações de aminoácidos são prováveis de serem permitidas numa certa posição da proteína. Por exemplo, a maior parte dos resíduos de aminoácidos existentes requer cadeias laterais não polares, enquanto que algumas características das cadeias laterais da superfície são geralmente conservadas. Outras substituições fenotipicamente silenciosas destas são descritas em Bowie et al. (1990) supra, e nas referências aí citadas.
Tipicamente vistas como substituições conservadoras são as mudanças, um pelo outro, entre os aminoácidos alifáticos Ala, Vai, Leu e Phe; a permuta de resíduos de hidroxilo Ser e Thr, a permuta de resíduos acídicos Asp e Glu, a substituição entre os resíduos amida Asn e Gin, permuta dos resíduos básicos Lys e Arg e mudanças entre os resíduos aromáticos Phe, Tyr. Adicionalmente, os grupos seguintes de aminoácidos representam geralmente alterações - 24 - ΡΕ1715887 equivalentes: (1) Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gin, Asn, Ser, Thr; (2) Cys, Ser, Tyr, Thr; (3) Vai, Ile, Leu, Met, Ala, Phe; (4) Lys, Arg, His; (5) Phe, Tyr, Trp, His. O termo polipéptido de hGH engloba também todos os polipéptidos de hGH codificados por análogos da hGH, ortólogos e/ou espécies homólogas. Tal como aqui utilizado, o termo "análogos de hGH" refere-se a hGHs de organismos diferentes ou não relacionados que desempenhem as mesmas funções em cada organismo mas que não sejam originados a partir de uma estrutura ancestral que organismos ancestrais tinham em comum. Em vez disso, hGHs análogas surgem separadamente e então, mais tarde, desenvolvem-se para desempenhar a mesma função (ou funções semelhantes) . Por outras palavras, polipétidos de hGH análogas são polipéptidos com sequências de aminoácidos bastante diferentes mas que desempenham a mesma actividade biológica, nomeadamente promoção do crescimento na fase de crescimento e a manutenção da composição, anabolismo e metabolismo dos lipidos do corpo normal. Tal como aqui utilizado, o termo "ortólogos da hGH" refere-se a hGHs em duas espécies diferentes cujas sequências estão relacionadas umas com as outras através de uma hGH homóloga comum numa espécie ancestral mas que evoluíram para se tornarem diferentes umas das outras. Tal como aqui utilizado, o termo "homólogos da hGH" refere-se a hGHs de diferentes organismos que desempenham as mesmas funções em cada organismo e que são originadas a partir de uma estrutura ancestral que os organismos ancestrais tinham em - 25 - ΡΕ1715887 comum. Por outras palavras, polipéptidos de hGH homólogos são polipéptidos com sequências de aminoácidos bastante semelhantes que desempenham a mesma actividade biológica, nomeadamente a promoção do crescimento na fase de crescimento e a manutenção da composição, anabolismo e metabolismo dos lipidos do corpo normal. De um modo preferido, os homólogos de polipéptidos da hGH podem ser definidos como polipéptidos que apresentam, pelo menos, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com um polipéptido de hGH de referência, de um modo preferido o polipéptido hGH de SEQ ID NO:l.
Deste modo, um polipéptido de hGH de acordo com o invento pode ser, por exemplo, (i) um em que um ou mais resíduos de aminoácido são substituídos com um resíduo de aminoácido conservado ou não conservado (preferencialmente um resíduo de aminoácido conservado) e tal resíduo de aminoácido substituído pode ou não ser um codificado pelo código genético: ou (ii) um em que um ou mais resíduos de aminoácido incluem um grupo substituinte: ou (iii) um em que o polipéptido de hGH é fundido com outro composto, tal como um composto para aumentar a meia-vida do polipéptido (por exemplo, polietilenoglicol) : ou (iv) um em que os aminoácidos adicionais são fundidos na forma anterior do polipéptido, tal como um péptido da região de fusão IgG Fc ou sequência líder ou de secreção ou uma sequência que seja empregue para purificação da forma acima do polipéptido ou uma sequência pró-proteína. -26- ΡΕ1715887
Os polipéptidos hGH podem ser monómeros ou multímeros. Os multímeros podem ser dímeros, trímeros, tetrameros ou multímeros compreendem, pelo menos, cinco unidades monoméricas de polipéptido. Os multímeros podem ser também homodímeros ou heterodímeros. Os multímeros do invento podem ser o resultado de associações hidrofóbicas, hidrofílicas, iónicas e/ou covalentes e/ou podem estar indirectamente ligadas, através de, por exemplo, formação de liposoma. Num exemplo, as associações covalentes estão entre as sequências heterólogas contidas numa proteína de fusão contendo um polipéptido de hGH ou um fragmento deste (ver, e.g. a Patente US Número 5.478.925, cuja descrição é aqui incorporada como referência na sua globalidade). Noutro exemplo, um polipéptido de hGH, ou fragmento deste, é juntado a um ou mais polipéptidos que podem ser quer polipéptidos de hGH quer polipéptidos heterólogos através de ligações por péptidos, tais como as descritas na patente US No. 5.073.627 (aqui incorporada como referência). Outro método para preparar polipéptidos de hGH multímeros envolve a utilização de polipéptidos de hGH fundidos a uma sequência de polipéptido zipper de isoleucina ou de leucina conhecido como promovendo a multimerização das proteínas em que estas se encontram, utilizando técnicas conhecidas pelos especialistas na matéria incluindo os ensinamentos do documento WO 95/10308. Noutro exemplo, os polipéptidos da hGH podem ser associados por interacções entre a sequência de polipéptido Flag® contida no polipéptido da hGH de fusão contendo a sequência de polipéptido Flag®. Os multímeros da hGH podem ser também gerados utilizando técnicas químicas - 27 - ΡΕ1715887 conhecidas na arte, tal como a reticulação utilizando moléculas de ligação e técnicas de optimização do comprimento da molécula de ligação conhecidas na arte (ver, e.g. US 5.478.925), técnicas conhecidas na arte para formar uma ou mais inter-moléculas de reticulação entre os resíduos de cisteína localizados dentro da sequência dos polipéptidos desejados para estarem contidos no multímero (ver e.g. US 5.478.925, adição de cisteína ou biotina ao término C ou término N do polipéptido da hGH e técnicas para gerar multímeros contendo um ou mais destes polipéptidos modificados (ver, e.g. US 5.478.925) ou qualquer uma das 30 técnicas para gerar liposomas contendo multímeros de hGH (ver, e.g. a patente US número 5.478.925), cujas descrições são aqui incorporadas como referência na sua globalidade.
Tal como aqui utilizado, o termo "fragmento de polipéptido de hGH" refere-se a qualquer péptido ou polipéptido compreendendo um pedaço contínuo de uma parte da sequência de aminoácidos de um polipéptido da hGH, preferencialmente o polipéptido de SEQ ID NO:l.
Mais especificamente, o fragmento de polipéptido de hGH compreende, pelo menos 6, preferencialmente, pelo menos 8 a 10, mais preferencialmente 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 75, 100, 125, 150, 175, 191 aminoácidos consecutivos de um polipéptido de hGH de acordo com o presente invento. O fragmento de polipéptido de hGH pode, adicionalmente, ser descrito como sub-géneros de poli- - 28 - ΡΕ1715887 péptidos de hGH compreendendo, pelo menos, 6 aminoácidos, em que "pelo menos 6" é definido como qualquer número inteiro entre 6 e o número inteiro que representa o aminoácido C-terminal de polipéptido de hGH incluindo o polipéptido de SEQ ID N0:1. Ainda incluídas estão as espécies de fragmentos de polipéptidos de hGH com, pelo menos, 6 aminoácidos de comprimento, tal como descrito acima, que são ainda especificados em termos das suas posições N-terminal e C-terminal. Também englobado pelo termo "fragmento de polipéptido de hGH" como espécies individuais estão todos os fragmentos de polipéptidos com, pelo menos, 6 aminoácidos de comprimento, tal como descrito acima, que podem ser particularmente especificados por uma posição N-terminal e C-terminal. Ou seja, cada combinação de uma posição N-terminal e C-terminal que um fragmento com, pelo menos, 6 resíduos de aminoácidos contíguos de comprimento, pode ocupar, em qualquer sequência de aminoácidos da listagem de sequências ou do presente invento, está incluída no presente invento.
Note-se que as espécies anteriores de fragmentos de polipéptidos do presente invento podem, alternativamente, ser descritas pela fórmula "a a b"; em que "a" é igual à posição do aminoácido mais N-terminal e "b" é igual à posição do aminoácido mais C-terminal do polinucleótido; e ainda em que "a" é igual a um número inteiro entre 1 e o número de aminoácidos de uma sequência de polipéptidos de hGH menos 6, e em que "b" é igual a um número inteiro entre 7 e o número de aminoácidos da sequência de polipéptidos de - 29 - ΡΕ1715887 hGH; e em que "a" é um número inteiro inferior a "b" em, pelo menos, 6.
Os fragmentos de polipéptidos de hGH anteriores podem ser imediatamente considerados utilizando a descrição anterior e não estão, por isso, listados individualmente com o fim de não alongar desnecessariamente esta memória descritiva. Além disto, os fragmentos anteriores não necessitam necessariamente de possuir uma actividade biológica da hGH, embora os polipéptidos possuindo estas actividades sejam formas de realização preferidas do invento, uma vez que estes seriam úteis, por exemplo, em testes imunológicos, no mapeamento de epitopos, na marcação de epitopos, como vacinas e como marcadores de peso molecular. Os fragmentos anteriores podem ser também utilizados para gerar anticorpos para uma porção particular do polipéptido.
Também englobado no termo "fragmento de polipéptido da hGH" estão os domínios dos polipéptidos da hGH, tais domínios podem compreender, eventualmente, motivos lineares ou estruturais e assinaturas incluindo, mas não limitados a, zippers de leucina, motivos hélice-volta-hélice, locais de modificação pós-translaccional, tais como os locais de glicosilação, locais de ubiquitinação, hélices alfa e folhas beta, sequência sinal codificando péptidos sinal que direccionam a secreção das proteínas codificadas, sequências implicadas na regulação da transcrição, tais como homeoboxes, extensões acídicas, - 30 - ΡΕ1715887 locais de activaçâo enzimática, locais de ligação a substrato e locais de clivagem enzimática. Tais dominios podem apresentar uma actividade biológica particular, tal como ligação de ADN ou ARN, secreção de proteínas, regulação da transcrição, actividade enzimática, actividade de ligação a substrato, etc.
Um domínio possui uma dimensão geralmente compreendida entre 3 e 191 aminoácidos. Numa forma de realização preferida, os domínios compreendem um certo núumero de aminoácidos que é qualquer número inteiro entre 6 a 191. Os domínios podem ser sintetizados utilizando quaisquer métodos conhecidos pelos especialistas na matéria, incluindo os aqui descritos para a preparação de polipéptidos de hGH para produzir anticorpos anti-hGH. Os métodos para determinar os aminoácidos que fazem um domínio com uma particular actividade biológica incluem estudos de mutagénese e ensaios para determinar a actividade biológica a ser testada.
Fragmentos particularmente preferidos no contexto do presente invento são polipéptidos de hGH que têm uma substancial actividade biológica, nomeadamente promovendo o crescimento na fase de crescimento e mantendo a composição, anabolismo e metabolismo dos lípidos do corpo normais.
Alternativamente, os polipéptidos do invento podem ser analisados em relação aos motivos, domínios e/ou assinaturas em bases de dados utilizando qualquer método - 31 - ΡΕ1715887 informático conhecido pelos especialistas na matéria. Bases de dados que se podem consultar incluem Prosite (Hofmman et al. (1999) Nucl. Acids Res. 27:215-219; Bucher e Bairoch (1994) Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman et al., Eds., p. 53-61, AAAIPres, Menlo Park), Pfam (Sonnhammer et al., (1997) Proteins 28(3); 405-20; Henikoff et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28(1):228 — 30; Bateman et al., (2000) Nucleic Acids Res. 28(1): 263-6); Blocks (Henikoff et al., (2000) Elecrophoresis 21(9): 1700-6), Print (Attwood et al., (1996) Nucleic Acids Res. 24(1); 182-8), Prodom (Sonnhammer e Kahn (1994) Protein Sei 3(3): 482-92; Corpet et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28(1): 267-9), Sbase (Pongor et al. (1993) Protein Eng. 6(4): 391-5; Murvai et al., (2000) Nucleic Acids Res. 28(1):260-2), Smart (Schultz et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sei USA 95, 5857-5864);
Dali/FSSP (Holm e Sander (1999) Nucleic Acids Res. 27(1) : 206—9; Holm e Sander (1997) Nucleic Acids Res. 25(1) : 231-4; Holm e Sander (1999) Nucleic Acids Res. 27 (1) :244-7), HSSP (Sander e Schneider (1991) Proteins 9(1) : 56-68), CATH (Orengo et al, (1997) Structure 5(8) : 1093-108 ; Pearl et al., (2000) Biochem. Soc. Trans. 28 (2) :269-75) , SCOP (Murzin et al., (1995) J. Mol. Biol. 247 (4) :536-40; Lo Conte et al., (2000) Nucleic Acids Res. 28(1):257-9), COG (Tatusov et al., (1997) Science 278, 631: 637; Tatusov et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95, 5865-5871; Yona et al. (1999) Proteins 37 (3) : 360 — 78;
Attwood et al., (2000) Nucleic Acids Res. 28(1):225-7) estando cada uma destas descrições aqui incorporadas como -32- ΡΕ1715887 referência na sua globalidade. Para uma revisão das bases de dados disponíveis, ver o capítulo 1 do volume 28 da Nucleic Acid Research (2000), cuja descrição é aqui incorporada como referência na sua globalidade. O termo "fragmento de polipéptido de hGH" engloba também fragmentos tendo epítopos. Estes epítopos podem ser epítopos antigénicos ou um epítopo antigénico e um epítopo imunogénico. Um epítopo imunogénico é definido como parte de uma proteína que origina uma resposta dos anticorpos in vivo quando o polipéptido é o imunogénio. Por outro lado, uma região do polipéptido a que um anticorpo se liga é definida como epítopo antigénico. Um epítopo pode compreender tão pouco como 3 aminoácidos numa conformação espacial, que é única ao epítopo. Geralmente um epítopo consiste de, pelo menos, 6 de tais aminoácidos e, mais frequentemente, pelo menos 8-10 de tais aminoácidos.
Um fragmento tendo um epítopo de hGH de acordo com o invento pode ser qualquer fragmento com um comprimento que esteja entre 6 aminoácidos e a sequência de comprimento completo de um polipéptido de hGH, preferencialmente um fragmento entre 6 e 50 aminoácidos. Os fragmentos tendo epítopos podem ser especificados quer através do número de resíduos de aminoácidos contíguos (como um sub-género) quer através de posições N-terminais e C-terminais específicas (como espécies), tal como descrito acima. - 33 - ΡΕ1715887
Os fragmentos que funcionam como epítopos podem ser produzidos através de qualquer meio convencional (Ver, e.g. Huoghten (1985), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:5131-5135 e U.S. 4.631.21, cujas descrições são aqui incorporadas como referência na sua globalidade) . Métodos para determinar os aminoácidos que fazem um epitopo incluem cristalografia de raios X, ressonância magnética nuclear bidimensional e mapeamento de epitopos, e.g. o método Pepscan descrito por Geysen et al., (1984), Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 81: 3998-4002; Publicações PCT WO 84/03564 e WO/03506, cujas descrições são aqui incorporadas como referência na sua globalidade. Outro exemplo é o algoritmo de Jameson e Wolf, (1988), Comp. Appl. Biosci. 4:181-186 (referência aqui incorporada como referência na sua globalidade). A análise antigénica de Jameson-Wolf, por exemplo, pode ser realizada utilizando o programa de computador PROTEAN, utilizando parâmetros por defeito (Versão 4.0 Windows, DNASTAR, Inc.). O presente invento proporciona também a exclusão de quaisquer espécies de fragmentos de hGH especificados pelas posições N-terminal e C-terminal ou de qualquer fragmento sub-género especificado pela dimensão em resíduos de aminoácidos, tal como descrito acima. Qualquer número de fragmentos especificado pelas posições N-terminal e C-terminal ou pela dimensão em resíduos de aminoácidos, tal como descrito acima, pode ser excluído como espécie individual. O presente invento proporciona também a exclusão de qualquer domínio de hGH ou de fragmento - 34 - ΡΕ1715887 contendo epítopo da mesma maneira.
Os polipéptidos de hGH do presente invento podem ser preparados de qualquer maneira adequada. Tais polipéptidos de hGH e fraqmentos destes podem ser purificados a partir de fontes naturais, sintetizados quimicamente, produzidos através de técnicas de recombinação incluindo técnicas de translação in vitro ou expressão numa célula recombinante para expressar cADN hGH, ou uma combinação destes métodos, utilizando técnicas conhecidas pelos especialistas na matéria (Ver, por exemplo, "Methods in Enzymology, Academic Press, 1993", para uma variedade de métodos para purificar proteínas; Creighton, (1983) Proteins: Structures and Molecular Principies, W.H. Freeman & Co. 2nd, T.E., New York; e Hunkapiller et al., (1984) Nature, 310 (5973): 105-11 para síntese química de proteínas e Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, ed., Elsevier Press, NY para técnicas de recombinação, cujas descrições são aqui incorporadas como referência na sua globalidade). Os polipéptidos do presente invento são, preferencialmente, proporcionados numa forma isolada, e podem ser parcialmente, ou preferencialmente, substancialmente purificados.
Os termos "polinucleótidos possuindo pelo menos x% de identidade com um polinucleótido de referência" e "polipéptidos possuindo pelo menos x% de identidade com um polinucleótido de referência" englobam polinucleótidos ou polipéptidos cuja sequência de resíduos (nucleótidos ou - 35 - ΡΕ1715887 aminoácidos, respectivamente) apresentam uma percentagem de identidade, tal como definido abaixo, igual ou superior a x em comparação com a referida sequência de polinucleótido ou polipéptido de referência, respectivamente. A percentagem de identidade é determinada após alinhamento óptimo de duas sequências de polinucleótidos ou polipéptidos ao longo de uma janela de comparação, em que a porções das sequências de polinucleótidos ou polipéptidos na janela de comparação pode compreender adições ou eliminações de um ou mais resíduos de modo a optimizar o alinhamento da sequência. A janela de comparação contém um certo número de posições (quer um resíduo quer um intervalo correspondendo a uma inserção/eliminação de um resíduo), correspondendo este número de posições à dimensão da janela. Cada posição da janela pode apresentar uma das situações seguintes:
Io/ Existe um resíduo (nucleótido ou aminoácido) nesta posição na primeira sequência alinhada e um resíduo diferente na mesma posição na segunda sequência alinhada, por outras palavras a segunda sequência tem um resíduo substituído nesta posição em comparação com a primeira sequência. 2°/ Existe um resíduo (nucleótido ou aminoácido) nesta posição na primeira sequência alinhada e o mesmo resíduo na mesma posição na segunda sequência alinhada. - 36 - ΡΕ1715887 3°/ Existe um resíduo (nucleótido ou aminoácido) nesta posição na primeira sequência alinhada e não existe resíduo na mesma posição na segunda sequência alinhada, por outras palavras a segunda sequência apresenta uma eliminação nesta posição em comparação com a primeira sequência. 0 número de posições na janela de comparação que pertence à primeira categoria definida acima é designada por Rl. 0 número de posições na janela de comparação que pertence à segunda categoria definida acima é designada por R2. 0 número de posições na janela de comparação que pertence à terceira categoria definida acima é designada por R3. A percentagem de identidade (%id) pode ser calculada através de qualquer uma das seguintes fórmulas: %id=R2/(R1+R2+R3)xlOO, ou
%id=(R2+R3)/(R1+R2+R3)xlOO 0 alinhamento das sequências para comparar pode - 37 - ΡΕ1715887 ser realizado utilizando qualquer um da variedade de algoritmos e programas de comparação de sequências conhecidos na arte. Tais algoritmos e programas incluem, mas não estão limitados de modo nenhum a; TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA, FASTDB, WU-BLAST, Gapped-BLAST, PSI-BLAST (Pearson e Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 2444-2448; Altschul et al., (1990), J. Mol. Biol. 215:403-410; Altschul et al. (1993), Nature hGHtics 3:266-272; Altschul et al., (1997), Nuc. Acids Res. 25:3389-3402; Thompson et al., (1994), Nuc. Acids Res., 22:4673-4680; Higgins et al., (1996), Meth. Enzymol. 266:383-402; Brutlag et al. (1990) Comp. App. Biosci. 6:237-245; Jones e Swindells, (2002), Trends Biochem Sci27:161-4; Olsen et al. (1999) Pac Symp Biocomput; 302-13), cujas descrições são aqui incorporadas como referência na sua globalidade.
Numa forma de concretização particular, o método de Smith-Waterman é utilizado com uma matriz de pontuação, tal como PAM, PAM 250 ou, preferencialmente, com matrizes BLOSUM, tal como BLOSUM 60 ou BLOSUM 62 e com parâmetros por defeito (Penalidade de Abertura do Intervalo = 10 e Penalidade de Extensão do Intervalo =1) ou com parâmetros especificados pelo utilizador, preferencialmente, superiores aos parâmetros por defeito.
Noutra forma de concretização particular, as sequências de proteínas e ácidos nucleicos são alinhadas utilizando os programas da Ferramenta de Pesquisa de Alinhamento Local Básico ("BLAST") com os parâmetros por - 38 - ΡΕ1715887 defeito ou com os parâmetros modificados proporcionados pelo utilizador. Preferencialmente, a matriz de pontuação utilizada é a matriz BLOSUM 62 (Gonnet et al., (1992), Science 256: 1443-1445; Henikoff e Henikoff, (1993), proteins 17:49-61, cujas descrições são aqui incorporadas como referência na sua globalidade). Menos preferencialmente, as matrizes PAM ou PAM250 podem ser também utilizadas (ver, e.g., Scwartz e Dayhoff, (1978), eds. Matrices for Detecting Distance Relationships: Atlas of Protein Sequence and Structure, Washington: National Biomedical Research Foundation, cuja descrição é aqui incorporada como referência na sua globalidade).
Ainda noutra forma de concretização particular, as sequências de polinucleótidos ou de polipéptidos são alinhadas utilizando o programa de computador FASTDB com base no algoritmo de Brutlag et al. (1990), supra. Os parâmetros preferidos utilizados num alinhamento FASTDB de sequências de ADN são:
Matriz = unitária; k-tuplo = 4; Penalidade de Incompatibilidade = 1; Penalidade de Junção = 30; Aleatoriedade do Comprimento do Grupo = 0, Pontuação de Corte = 1; Penalidade do Intervalo = 5; Penalidade da Dimensão do Intervalo = 0,05; Dimensão da Janela = 500 ou o comprimento da sequência do nucleótido sujeito, o que for mais curto. Parâmetros preferidos utilizados num alinhamento FASTDB de aminoácidos são: Matriz = PAM 0, k-tuplo = 2; Penalidade de Incompatibilidade = 1; Penalidade - 39 - ΡΕ1715887 de Junção = 20; Aleatoriedade do Comprimento do Grupo = 0, Pontuação de Corte = 1; Dimensão da Janela = comprimento da sequência; Penalidade do Intervalo = 5; Penalidade da Dimensão do Intervalo = 0,05; Dimensão da Janela = 500 ou o comprimento da sequência do nucleótido sujeito, o que for mais curto.
De acordo com o presente invento, o polietileno-glicol está covalentemente ligado através dos resíduos de aminoácidos da hGH ou da variante agonista desta. Uma variedade de polietilenoglicóis activados possuindo um certo número de diferentes grupos funcionais, agentes de ligação, configurações e pesos moleculares são conhecidos pelos especialistas na matéria, que podem ser utilizados para criar conjugados de PEG-hGH ou conjugados da variante agonista de PEG-hGH (para revisões ver Roberts M.J. et al., Adv. Drug Del. Ver. 54:459-476, 2002), Harris J.M. et al., Drug Delivery Systems 40:538-551, 2001). O presente invento refere-se a um método de utilização da químida dos aldeídos para dirigir selectivamente a porção PEG à parte N-terminal utilizando uma porção de agente de ligação de butiraldeído. O agente de ligação do butiraldeído resulta num aumento das especificidade N-terminal em comparação com o agente de ligação de acetaldeído (Tabela 1 e Figura 1).
Uma forma de concretização do presente invento é um conjugado de hormona do crescimento humano possuindo a estrutura de Fórmula I ou de Fórmula II ΡΕ1715887 - 40 - ο
.mPSe~0-C**NH
HjC
O κίΡεο*“ί5™“θ f m h
tf (;CHsCH3OM€H?)*CHrHH--R « |
Formula I
mPEG-0 (CH2CH20)n (CH2)mCH2-NH-R Fórmula II em que n é um número inteiro entre 1 e 10; m é um número inteiro entre 1 e 10; R é uma hormona de crescimento humano, hormona de crescimento metionilo ou uma variante da hormona de crescimento.
Numa forma de concretização particular n está entre 1 e 5 e m está entre 1 e 5.
Numa forma de concretização particular da Fórmula i; n é 1 e m é 1; n é 1 e m é 2; n é 1 e m é 3; n é 1 e m é 4; n é 1 e m é 5; n é 1 e m é 6; n é 1 e m é 7; n é 1 e m é 8; n é 1 e m é 9; n é 1 e m é 10; n é 2 e m é 1; n é 2 e m é 2; n é 2 e m é 3; n é 2 e m é 4; n é 2 e m é 5; n é 2 e m é 6; n é 2 e m é 7; n é 2 e m é 8; n é 2 e m é 9; n é 2 e m - 41 - ΡΕ1715887 é 10 f n é 3 e m é 1; n . é 3 e m é 2; n é 3 e m é 3; n é 3 e m é 4; n é 3 e m é 5 t n é 3 e m é 6; n é 3 e m é 7; n . é 3 e m é 8; n é 3 e m . é : 9 t n é 3 ! e m é 10; n é 4 e m é 1; n é 4 e m é 2; n é 4 e m é 3 ; n é 4 e m é 4; n é 4 e m é 5; n é 4 e m é 6; n é 4 e m é 7 ; n é 4 e m é 8; n é 4 e m é 9; n é 4 e m é 10 f n é 5 e m é 1; n é 5 e m i é 2; n é 5 e m é 3; n é 5 e m é 4; n é 5 m é 5 ; n é 5 e m é 6; n é 5 e m é 7; n é 5 e m é 8; n é 5 e m é g '; n é ! 5 e m é 10; n é 6 e m é 1; n é 6 e m é 2; n é 6 e m é 3; n é 6 e m é 4; n é 6 e m é 5; n é 6 e m é 6; n é 6 e m é 7; n é 6 e m é 8; n é 6 e m é 9; n é 6 e m é 10 f n é 7 e m é 1; n é 7 e m < è 2; n é 7 e m é 3; n é 7 e m é 4; n é 7 e m e 5; n é 7 e m é 6; n é 7 e m é 7; n é 7 e m é 8; n é 7 e m é 9; n é 7 e m é 10; n é 8 e m é 1; n é 8 e m é 2; n é 8 e m é 3; n é 8 e m é 4; n é 8 e m é 5; n é 8 e m é 6; n é 8 e m é 7; n é 8 e m é 8; n é 8 e m é 9; n é 8 e m é 10 ; n é 9 e m i 0 L; n é 9 e m é 2; n é 9 e m é 3; n é 9 e m é 4 f n f a 9 e m é 5; 1 n é : 9 e m é 6; n é i 9 e m é 7; n é 9 e m é 8 r n < 9 e m é 9; 1 n é ! 9 e m é 10; n é 10 e m é 1; n é 10 e m é 2; n é 10 e m é 3; n é 10 e m é i 4 f n é 10 e m é 5; n é 10 e m é 6; n é 10 e m é 7; : n é 10 e m é 8; n é 10 e m é 9 ; n < 0 10 e m é 10.
Uma forma de concretização específica é um conjugado de hormona de crescimento humano-PEG tendo a estrutura: ΡΕ1715887 - 42 - f «Λ Ί M->C Ί çh2 í *
H
,.C'H ϊηΡ&3“"0—'C'' -N'"' 'C-ís
H II mPEG-0 (CH2CH2O) 4CH2CH2CH2-NH-R em que R é a hormona de crescimento humano, hormona de crescimento humano metionilo ou uma variante da hormona de crescimento humano.
Outra forma de concretização específica do presente invento é o conjugado de hormona de crescimento humano-PBG em que a hormona de crescimento humano compreende ou consiste numa sequência de aminoácido de SEQ ID NO:1. A presente invenção descreve um conjugado de hormona de crescimento humana· -PEG em que mais de 80%, mais preferencialmente 81%, mais preferencialmente 82%, mais preferencialmente 83%, mais preferencialmente 84%, mais preferencialmente 85%, mais preferencialmente 86%, mais preferencialmente 87%, mais preferencialmente, 88%, mais preferencialmente 89%, mais preferencialmente 90%, mais preferencialmente 91%, mais preferencialmente 92%, mais preferencialmente 93%, mais preferencialmente 94%, mais - 43 - ΡΕ1715887 preferencialmente 95%, mais preferencialmente 96%, mais preferencialmente 97%, mais preferencialmente 98% do polietilenoglicol está conjugado com a fenilalanina amino-terminal da sequência de aminoácido SEQ ID N0:1.
Uma forma de concretização do presente invento é a utilização de um conjugado de hormona de crescimento humana-PEG em que mais de 90% do polietilenoglicol está conjugado com a fenilalanina amino-terminal da sequência de aminoácido SEQ ID NO:l.
Outra forma de concretização do presente invento é a utilização de um conjugado de hormona de crescimento humana-PEG em que mais de 95% do polietilenoglicol está conjugado com a fenilalanina amino-terminal da sequência de aminoácido SEQ ID NO:l. O polietilenoglicol utilizado no presente invento não está restringido a qualquer forma particular ou gama de peso molecular. O peso molecular de polietilenoglicol pode estar entre cerca de 500 e cerca de 100 000 Dalton. O termo "cerca" indica que em preparações de polietilenoglicol algumas moléculas pesarão mais, algumas menos, do que o peso molecular mencionado e o peso molecular mencionado refere-se ao peso molecular médio. Entende-se que existe algum grau de polidispersidade associado aos polímeros, tais como o polietilenoglicol. É preferível utilizar PEGs com baixa dispersidade. Normalmente é utilizado um PEG com um peso molecular de cerca de 500 até cerca de 60 000. Uma - 44 - ΡΕ1715887 gama de peso molecular específica do presente invento é de cerca de 1 000 até cerca de 40 000. Noutra forma de concretização específica o peso molecular do PEG é de cerca de 20 000 até cerca de 40 000. Outras dimensões podem ser utilizadas, dependendo do perfil terapêutico desejado (e.g. duração da libertação sustenta desejada, dos efeitos se existirem na actividade biológica, do grau ou da falta de antigenicidade e outros efeitos conhecidos do polietileno numa proteína terapêutica. Por exemplo, o polietilenoglicol pode ter um peso molecular médio de cerca de 200, 500, 1 000, 1 500, 2 000, 2 500, 3 000, 3 500, 4 000, 4 500, 5 000, 5 500, 6 000, 6 500, 7 000, 7 500, 8 000, 8 500, 9 000, 9 500, 10 000, 10 500, 11 000, 11 500, 12 000, 12 500, 13 000, 13 500, 14 000, 14 500, 15 000, 15 500, 16 000, 16 500, 17 000, 17 500, 18 000, 18 500, 19 000, 19 500, 20 000, 25 000, 30 000, 35 000, 40 000, 45 000, 50 000, 55 000, 60 000, 65 000, 70 000, 75 000, 80 000, 85 000, 90 000, 95 000 ou 100 000 Dalton.
Noutra forma de concretização o polietilenoglicol é um PEG ramificado possuindo mais do que uma porção PEG ligada (ver U.S. 5.932.462; U.S. 5.342.940; U.S. 5.643.575; U.S. 5.919.455; U.S. 6.113.906; U.S. 5.183.660; Kodera Y., Bioconjugate Chemistry 5:283-288 (1994); e WO 02/09766. Numa forma de concretização preferida o peso molecular de cada polietilenoglicol do PEG ramificado é de cerca de 5 000-20 000. Numa forma de concretização específica o peso molecular de cada polietilenoglicol do PEG ramificado é de cerca de 20 000. - 45 - ΡΕ1715887
Os poli(óxido de alquileno)s, nomeadamente os polietilenoglicóis, são ligados à hGH ou a uma variante agonista desta através de um grupo reactivo terminal que pode, ou não, deixar uma porção de ligação (espaçador) entre o PEG e a proteína. De modo a formar os conjugados de hGH ou da variante agonista desta do presente invento, polímeros tais como poli(óxido de alquileno) são convertidos em formas activas, em que tal termo é conhecido pelos especialistas na matéria. 0 grupo reactivo, por exemplo, é um grupo reactivo terminal que intermédia uma ligação entre as porções químicas na proteína e o polietilenoglicol. Tipicamente um ou ambos os grupos terminais hidroxilo do polímero terminal (i.e. os grupos hidroxilo terminais alfa e ómega) são convertidos em grupos funcionais reactivos o que permite uma conjugação covalente. Este processo é frequentemente referido como "activação" e o produto de polietilenoglicol possuindo o grupo reactivo é, daqui para a frente, referido como "um polietilenoglicol activado". Numa forma de concretização específica um dos grupos terminais hidroxilo do polímero terminal é convertido ou bloqueado com um grupo não reactivo. Numa forma de concretização específica um dos grupos terminais hidroxilo do polímero terminal é convertido ou bloqueado com um grupo metilo. Tal como aqui utilizado, o termo "mPEG" refere-se a um PEG que está bloqueado numa extremidade com um grupo metilo. 0 mPEG pode ser representado estruturalmente como
CH30- (CH2CH20)n-H - 46 - ΡΕ1715887
Polímeros contendo grupos de ligação α e ε são referidos como "poli(óxido de alquileno)s bis-activados" e são referidos como "bifuncionais". Polímeros contendo o mesmo grupo reactivo nos hidroxilos terminais α e ε são, por vezes, referidos como "homobifuncionais" ou "homobis-activados". Polímeros contendo diferentes grupos reactivos em hidroxilos terminais α e ε são, por vezes, referidos como "heterobifuncionais" (ver, por exemplo, WO 01/26692) ou "heterobis-activados". Polímeros contendo um único grupo reactivo são referidos como poli(óxido de alquileno)s "monoactivados" ou "monofuncionais". Outros polímeros substancialmente não antigénicos são similarmente "activados" ou "funcionalizados".
Os polímeros activados são, deste modo, adequados para mediarem uma ligação entre porções químicas na proteína, tal como grupos α e ε-amino, carboxilo ou tióis e polietilenoglicol. Polímeros bis-activados podem reagir desta maneira com duas moléculas de proteínas ou uma molécula de proteína e uma molécula pequena reactiva noutra forma de concretização para formar eficazmente polímeros de proteína ou conjugados de molécula pequena-proteína através de ligações reticuladas.
Numa forma de concretização preferida do invento as ligações de amina secundária ou amida são formadas utilizando o grupo α-amino N-terminal ou grupos ε-amino de lisina da hGH ou da variante agonista desta e o PEG activado. Noutra forma de concretização preferida do - 47 - ΡΕ1715887 invento uma ligação de amina secundária é formada entre o grupo α e ε-amino promário N-terminal da hGH ou da variante agonista desta e o PEG aldeído de cadeia linear ou ramificada através de alquilação redutora com um agente de redução adequado, tal como NaCNBH3, NaBH3, Piridina Borano etc. tal como descrito em Chamow et al., Bioconjugate Chem. 5: 133-140 (1994), Pat US No. 4.002.531, WO 90/05534 e patente US 5.824.784.
Numa forma de concretização preferida, pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 81%, preferencialmente pelo menos 82%, preferencialmente pelo menos 83%, preferencialmente pelo menos 84%, preferencialmente pelo menos 85%, preferencialmente pelo menos 86%, preferencialmente pelo menos 87%, preferencialmente pelo menos 88%, preferencialmente pelo menos 89%, preferencialmente pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 91%, preferencialmente pelo menos 92%, preferencialmente pelo menos 93%, preferencialmente pelo menos 94%, preferencialmente pelo menos 95%, preferencialmente pelo menos 96%, preferencialmente pelo menos 97%, preferencialmente pelo menos 98% do polietilenoglicol está no grupo α-amino terminal.
Reacções de conjugação, referidas como reacções de pegilação, foram historicamente realizadas em solução com um excesso molar de polímero e sem se ver onde é que o polímero se ligará à proteína. Tais técnicas gerais, contudo, têm tipicamente provado ser inadequadas para - 48 - ΡΕ1715887 conjugar proteínas bioactivas a polímeros não antigénicos embora mantendo bioactividade suficiente. Uma via para manter a bioactividade da hGH ou da variante agonista desta é a de evitar substancialmente a conjugação daqueles grupos reactivos da hGH ou da variante agonista desta associados ao(s) local(is) de ligação ao receptor no processo de ligação ao polímero. Outro aspecto do presente pedido de patente é o de proporcionar um processo para a conjugação do polietilenoglicol com a hGH ou a variante agonista desta mantendo níveis elevados de actividade retida. A modificação química através de uma ligação covalente pode ser realizada sob qualquer condição adequada geralmente adoptada numa reacção de uma substância biologicamente activa com o polietilenoglicol activado. A reacção de conjugação é realizada sob condições relativamente suaves para evitar a inactivação da hGH ou da variante agonista desta. Condições suaves incluem a manutenção do pH da solução reacccional na gama de 3 a 10 e as temperaturas reaccionais na gama de cerca de 0-37°C. Nos casos em que os resíduos de aminoácidos reactivos na hGH ou na variante agonista desta possuem grupos amino livres, a modificação acima é realizada preferencialmente numa lista não limitativa de tampões adequados (pH 3 a 10), incluindo fosfato, MES, citrato, acetato, succinato ou HEPES, durante 1-48 horas a 4-37°C. Ao marcar os grupos amino N-terminais com reagentes tais como PEG aldeídos, um pH 4-7 é preferencialmente mantido. O polietilenoglicol activado pode ser utilizado cerca de 0,01-100 vezes, preferencial- - 49 - ΡΕ1715887 mente cerca de 0,01-2,5 vezes, a quantidade molar do número de grupos amino livres da hGH ou da variante agonista desta. Por outro lado, quando os resíduos de aminoácidos reactivos na hGH ou na variante agonista desta possuem grupos carboxilo livres, a modificação acima é preferencialmente realizada com um pH de cerca de 3,5 até cerca de 5,5, por exemplo, a modificação com poli(oxi-etilenodiamina) é realizada na presença de carbodiimida (pH 4,5) durante 1-24 horas a 4-37°C. O polietilenoglicol pode ser utilizado 0,01-300 vezes a quantidade molar do núumero de grupos carboxilo da hGH ou da variante agonista desta.
Em formas de concretização separadas, o limite superior da quantidade de polímero incluído nas reacções de conjugação excede cerca de 1:1 desde que seja possível reagir o polímero activado e a hGH ou a variante agonista desta sem formar uma quantidade substancial de espécies de alto peso molecular, i.e. mais do que cerca de 20% dos conjugados contendo mais do que cerca de uma cadeia de polímero por molécula de hGH ou da variante agonista desta. Por exemplo, está contemplado neste aspecto do invento que razões de até 6:1 podem ser empregues para formar quantidades significativas dos conjugados necessários que podem consequentemente ser isolados de qualquer espécie de alto peso molecular.
Noutro aspecto deste pedido de patente, podem ser utilizados derivados de PEG activado bifuncionalmente para gerar moléculas poliméricas de hGH ou da variante agonista -50- ΡΕ1715887 desta-PEG em que múltiplas moléculas de hGH ou da variante agonista desta são retuculadas com o PEG. Embora as condições reaccionais aqui descritas possam resultar em quantidades significativas de hGH ou da variante agonista desta não modificada, a hGH ou a variante agonista desta não modificada podem ser prontamente recicladas em lotes futuros para reacções de conjugação adicionais. Os processos do presente invento geram, surpreendentemente, muito poucas, i.e. menos do que cerca de 30% e, mais preferencialmente, menos do que cerca de 10% de espécies de alto peso molecular contendo mais de uma cadeia de polímero por hGH ou a variante agonista desta. Estas condições reaccionais são contrastadas com as tipicamente utilizadas para reacções de conjugação poliméricas em que o polímero activado está presente num excesso molar de várias vezes em relação ao alvo. Noutros aspectos do pedido de patente, o polímero está presente em quantidades de cerca de 0,1 até cerca de 50 equivalentes por equivalente de hGH ou da variante agonista desta. Noutros aspectos do pedido de patente, o polímero está presente em quantidades de cerca de 1 até cerca de 10 equivalentes por equivalente de hGH ou da variante agonista desta.
As reacções de conjugação do presente pedido de patente proporcionam inicialmente uma mistura reaccional contendo conjugados mono e di-PEG-hGH, hGH por reagir, polímero por reagir e, usualmente, menos do que cerca de 20% de espécies de alto peso molecular. As espécies de alto peso molecular incluem conjugados contendo mais do que uma - 51 - ΡΕ1715887 cadeia de polímero e/ou espécies de PEG-hGH ou a variante agonista desta polimerizadas. Após as espécies por reagir e as espécies de alto peso molecular terem sido removidas, as composições contendo principalmente conjugados de mono e dipolímeros-hGH ou a variante agonista desta e recuperados.
Dado o facto de os conjugados na sua maior parte incluírem uma cadeia única de polímero, os conjugados são substancialmente homogéneos. Esta hGH ou a variante agonista desta modificada tem, pelo menos 0,1% da actividade biológica in vitro associada à hGH ou à variante agonista desta, nativa ou não modificada, medida utilizando ensaios de proliferação de células FDC-P1, (Clark et al. Journal of Biological Chemistry 271: 21969-21977, 1996), ensaios de ligação a receptores (US 5.057.417) ou crescimento de ratazanas hipofisectomizadas (Clark et al. Journal of Biological Chemistry 271: 21969-21977, 1996). Em aspectos preferidos deste pedido de patente, contudo, a hGH ou variante agonista desta modificada tem cerca de 25% da actividade biológica in vitro, mais preferencialmente, a hGH ou variante agonista desta modificada tem cerca de 50% da actividade biológica in vitro, mais preferencialmente, a hGH ou variante agonista desta modificada tem cerca de 75% da actividade biológica in vitro e, muito preferencialmente, a hGH ou variante agonista desta tem uma actividade biológica in vitro equivalente ou melhorada. O processo do presente invento inclui, preferencialmente, razões bastante limitadas de polímero em relação à hGH ou à variante agonista desta. Deste modo, os - 52 - ΡΕ1715887 conjugados de hGH ou da variante agonista desta foram verificados como sendo predominantemente limitados a espécies contendo apenas uma cadeia de polímero. Para além disso, a ligação do polímero aos grupos reactivos da hGH ou da variante agonista desta é susbtancialmente aleatória quando são utilizados grandes excessos molares de polímero de ligação. A hGH ou a variante agonista desta não modificada presente na reacção, após a reacção de conjugação ter terminado, pode ser reciclada para futuras reacções utilizando cromatografia de permute iónica ou de exclusão por tamanho ou técnicas de separação semelhantes.
Uma proteína de polietilenoglicol-hGH ou variante agonista desta modificada, nomeadamente quimicamente modificada de acordo com o presnte pedido de patente, pode ser purificada a partir de uma mistura reaccional através de métodos convencionais que são utilizados para a purificação de proteínas, tais como diálise, salificação, ultrafiltração, cromatografia de permuta iónica, cromatografia de interaçcção hidrofóbica (HIC), cromatografia em gel e electroforése. A cromatografia de permuta iónica é particularmente eficaz na remoção de polietilenoglicol e hGH ou variante agonista desta por reagir. Numa outra forma de concretização do pedido de patente, as espécies de mono e dipolímero-hGH ou variante agonista desta são isoladas da mistura reaccional para remover espécies de alto peso molecular e a hGH ou variante agonista desta não modificada. A separação é efectuada colocando as espécies misturadas numa solução tampão - 53 - ΡΕ1715887 contendo cerca de 0,5-10 mg/ml dos conjugados de hGH ou da variante agonista desta-polímero. Soluções adequadas possuem um pH de cerca de 4 até cerca de 10. As soluções contêm, preferencialmente, um ou mais sais tampão seleccionados de KC1, NaCl, K2HPO4, KH2PO4, Na2HP04, NaH2P04, NaHC03, NaB04, CH3C02H e NaOH.
Dependendo do tampão reaccional, a solução de conjugado de hGH ou da variante agonista desta-polímero pode sofrer primeiro permuta de tampão/ultrafiltração para remover qualquer polímero por reagir. Por exemplo, a solução de conjugado de PEG-hGH ou variante agonista desta pode ser ultrafiltrada numa membrana de separação de baixo peso molecular (10 000 a 30 000 Dalton) para remover a maior parte dos materiais indesejados, tais como polímero por reagir, tensioactivos, se presentes, e outros do género. O fraccionamento dos conjugados numa sequenciação contendo as espécies desejadas é, preferencialmente, realizado utilizando um meio de cromatografia de permuta iónica. Um tal meio é capaz de ligar selectivamente conjugados de PEG-hGH ou variante agonista desta através das diferenças de carga, o que varia de uma maneira de algum modo previsível. Por exemplo, a carga da superfície da hGH ou variante agonista desta é determinada pelo número de grupos carregados disponíveis na superfície da proteína. Estes grupos carregados servem tipicamente como ponto de ligação potencial de polímeros de poli(óxido de alquileno). - 54 - ΡΕ1715887
Em consequência, os conjugados de hGH ou da variante agonista desta terão uma carga diferente das outras espécies para permitir um isolamento selectivo.
Resinas de permuta aniónica ou catiónica fortemente polares, tais como resinas de amina quaternária ou de sulfopropilo, respectivamente, são utilizadas no método do presente pedido de patente. As resinas de permuta iónica são especialmente preferidas. Uma lista não limitativa de resinas de permuta catiónica comercialmente disponíveis para utilização com o presente invento inclui SP-hitrap®, SP Sepharose HP® e SP Sepharose® fast flow. Outras resinas de permuta catiónicas adequadas e.g. resinas S e CM podem ser também utilizadas. Uma lista não limitativa de resinas de permuta aniónica, incluindo resinas de permuta aniónica comercialmente disponíveis, adequadas para utilizar no presente invento são Q-hitrap®, Q Sepharose HP® e Q Sepharose® fast flow. Outras resinas de permuta aniónica adequadas, e.g. resinas de DEAB podem ser também utilizadas.
Por exemplo, a resina de permuta aniónica ou catiónica é, preferencialmente, colocada numa coluna e equilibrada através de meios convencionais. É utilizado um tampão possuindo o mesmo pH e osmolalidade do polímero conjugado com hGH ou variante agonista desta. 0 tampão de eluição contém, preferencialmente, um ou mais sais seleccionados de KC1, NaCl, K2HP04, KH2P04, Na2HP04, NaH2P04, NaHCCh, NaB04, e (NH4)2C03. A solução contendo conjugado é - 55 - ΡΕ1715887 então adsorvida na coluna com polímero por reagir e não sendo retidas algumas espécies de elevado peso molecular. No final da carga, um gradiente de tampão de eluição com concentrações de sal crescentes é aplicado à coluna para eluir a fracção desejada do conjugado de poli(óxido de alquileno)-hGH ou variante agonista desta. As fracções eluídas são, preferencialmente, limitadas a conjugados de polímeros uniformes após o passo de separação de permuta catiónica ou aniónica. Qualquer espécie não conjugada de hGH ou variante agonista desta pode então ser lexiviada da coluna através de técnicas convencionais. Se desejado, espécies de hGH ou da variante agonista desta mono ou multi pegiladas podem ser ainda separadas umas das outras através de cromatografia de permuta iónica ou cromatografia de exclusão por tamanho adicional.
Podem ser também utilizadas técnicas que utilizam passos isocráticos múltiplos de concentração crescente de sal ou de pH. Os passos de eluição isocrática múltiplos de concentração crescente resultarão na eluição sequencial de conjugados de di e então mono hGH ou variante agonista desta-polímero. A gama de temperatura para eluição está entre cerca de 4°C e cerca de 25°C. Preferencialmente, a eluição é realizada a uma temperatura de cerca de 4°C até cerca de 22°C. Por exemplo, a eluição de PEG-hGH é detectada por absorvância de UV a 280 nm. A recolha das fracções pode ser conseguida através de perfis de eluição no tempo simples. - 56 - ΡΕ1715887
Pode ser utilizado um tensioactivo nos processos de conjugação do polímero de polietilenoglicol com a porção de hGH ou da variante agonista desta. Tensioactivos adequados incluem agentes do tipo iónico, tais como dodecilsulfato de sódio (SDS). Podem ser também utilizados tensioactivos não iónicos tais como o dodecilsulfato de lítio, compostos de amónio quaternário, ácido taurocólico, ácido caprilico, ácido decanossulfónico etc. Podem ser também utilizados tensioactivos não iónicos. Por exemplo, podem ser utilizados materiais, tais como sorbitan de polioxietileno (Tweens), éteres de polioxietileno (Tritons). Ver também Neugebauer, A Guide To the Properties and Uses of Detergents in Biology and Biochemistry (1992) Calbiochem Corp. As únicas limitações dos tensioactivos utilizados nos processos aqui descritos são que estes são utilizados sob condições e com concentrações que não provocam substancial desnaturação irreversível da hGH ou da variante agonista desta e não inibem completamente a conjugação dos polímeros. Os tensioactivos estão presentes na mistura reaccional em quantidades de cerca de 0,01-0,5%; preferencialmente de 0,05-0,5%, e muito preferencialmente de cerca de 0,075-0,25%. As misturas de tensioactivos estão também contempladas.
Pensa-se que os tensioactivos proporcionam um sistema de protecção reversível temporário durante o processo de conjugação com o polímero. Os tensioactivos demonstraram ser eficazes a desencorajar selectivamente a conjugação de polímero ao mesmo tempo que permitem que - 57 - ΡΕ1715887 prossiga a conjugação com base em lisina ou com base no amino terminal. 0 presente polietilenoglicol-hGH ou variante agonista desta modificado possui um efeito farmacológico mais persistente que pode ser possivelmente atribuído à sua mais prolongada meia-vida in vivo.
Outra forma de concretização do pedido de patente relaciona-se com métodos para a prevenção e/ou o tratamento de uma doença ou anomalia em que a utilização da GH, preferencialmente da hGH é benéfica, compreendendo a administração a um paciente que disso necessite de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polietilenoglicol-hGh modificada do invento ou variante agonista desta, só ou em combinação com outro agente terapêutico. 0 presente invento refere-se especificamente à utilização de um polietilenoglicol-hGH modificado do invento ou variante agonista desta na produção de um medicamento para a prevenção e/ou o tratamento de uma doença ou uma anomalia em que a utilização da GH, preferencialmente a hGH é benéfica. Adicionalmente, o invento refere-se também a uma composição farmacêutica compreendendo um polietilenoglicol-hGh modificado do invento ou variante agonista desta para a prevenção e/ou tratamento de uma doença ou anomalia em que a utilização da GH, preferencialmente da hGH é benéfica.
As doenças ou anomalias em que a utilização da GH é benéfica incluem, mas não estão limitadas a, Deficiência - 58 - ΡΕ1715887 da Hormona de Crescimento (GHD), deficiência da hormona de crescimento no adulto (aGHD) , síndroma de Turner, deficiência de crescimento em crianças que nasceram pequenas para a idade gestacional (SGA), síndroma de Prader-Willi (PWS), insuficiência renal crónica (CRI), Debilitação por SIDA, Envelhecimento, Falha Renal em estado final, Fibrose Cística, Disfunção Eréctil, lipodistrofia de HIV, Fibromialgia, Osteoporose, Problemas de Memória, Depressão, Doença de Crohn, Displasias Esqueléticas, danos traumáticos no cérebro, Hemorragia Subaracnóide, Síndroma de Noonan, Síndroma de Down, Baixa Estatura Idiopática (ISS), Doença Renal em Fase Final (ESRD), nascimento com peso muito baixo (VLBW), recolha de células estaminais da medula óssea e deficiência de crescimento em crianças prematuras pequenas.
Numa forma de concretização mais específica do invento, o polietilenoglicol-hGH modificado do pedido de patente ou variantes agonistas desta é utilizado na prevenção e/ou tratamento de doenças ou anomalias seleccionados do grupo consistindo de baixa estatura idiopática, nascimento com peso muito baixo, danos traumáticos no cérebro, síndroma metabólico, hemorragia subaracnóide, baixa estatura devida a tratamentos com glucocorticóides em crianças; deficiência de crescimento em crianças prematuras pequenas e síndroma de Noonan.
Outra forma de concretização do invento está relacionada com composições farmacêuticas compreendendo um - 59 - ΡΕ1715887 polietilenoglicol-hGH modificado do invento ou variantes agonistas desta, só ou em combinação com outro agente terapêutico e, pelo menos, excipiente ou portador farmaceuticamente aceitável. 0 presente polietilenoglicol-hGH modificado ou variante agonistas desta pode ser formulado em produtos farmacêuticos contendo também um diluente farmaceuticamente aceitável, um agente para preparar uma solução isotónica, um condicionador de pH e outros do género, de modo a administrá-lo a um doente.
Os produtos farmacêuticos anteriores podem ser administrados subcutaneamente, intramuscularmente, intravenosamente, pulmunoramente, intradermicamente, ou oralmente, dependendo do propósito do tratamento. Uma dose pode ser também baseada no tipo de condição da doença de um doente a ser tratado, sendo normalmente entre 0,1 mg e 5 mg para injecção e entre 0,1 mg e 50 mg para administração oral num adulto.
Tal como aqui utilizado, o polietilenoglicol-hGH modificado ou variantes agonistas desta do presente invento pode ser utilizado em combinação com outro agente terapêutico. Tal como aqui utilizados, os termos "co-administração", "co-administrado" e "em combinação com", referindo-se aos compostos A e a um ou mais agentes terapêuticos, pretendem significar e referem-se a e incluem o seguinte: - administração simultânea de uma tal combinação - 60 - ΡΕ1715887 de A e agente (s) terapêutico (s) a um doente que necessite do tratamento, quando tais componentes são formulados em conjunto numa forma de dosagem única que liberte os referidos componentes subatancialmente ao mesmo tempo ao referido doente, - administração substancialmente simutânea de uma tal combinação de A e de agente (s) terapêutico (s) a um doente que necessite de tratamento, quando tais tratamentos são formulados separados uns dos outros em formas de dosagem separadas que são tomadas substancialmente ao mesmo tempo pelo referido doente, depois do que os referidos componentes são libertados substancialmente ao mesmo tempo no referido doente, - administração sequencial de tal combinação de A e de agente(s) terapêutico(s) a um doente que necessite de tratamento, quando tais tratamentos são formulados separados uns dos outros em formas de dosagem que são tomadas em tempos consecutivos pelo referido doente com um intervalo de tempo significativo entre cada administração, depois do que os referidos componentes são libertados em tempos substancialmente diferentes no referido doente; e - administração sequencial de tal combinação de A e de agente (s) terapêutico (s) a um doente que necessite de tratamento, quando tais tratamentos são formulados em conjunto numa forma de dosagem única que liberta os referidos componentes de maneira controlada, depois do que - 61 - ΡΕ1715887 estes são concorrentemente, consecutivamente e/ou sobre-postamente administrados no mesmo e/ou em tempos diferentes ao referido doente.
Exemplos adequados de outros agentes terapêuticos que podem ser utilizados em combinação com A, os seus sais farmaceuticamente aceitáveis e/ou formas derivadas incluem, mas não estão limitados a: inibidores da aromatase, tais como o exemestano, formestano, atamestano, fadrozole, letrozole, vorozole e anastrozole; reguladores dos ácidos gordos livres incluindo derivados de ácido fibrico (tais como o fenofibrato, clofibrato, gemfibrozil, bezafibrato e ciprofibrato) e derivados do ácido nicotinico, tais como o acipimox; agentes de sensibilização da insulina incluindo, mas não limitados a, biguanidas tais como metformin, agentes de sensibilização da insulina PPAR gama e tiazolodenionas, tais como troglitazona e rosiglitazona Troglitazona, 5- [ [4-[3,4-di-hidro-6-hidroxi-2,5,7,8-tetra-metil-2H]-benzopiran-2-il)metoxi]fenil]metil-2,4-tiazoli-dinediona V411 (BIABII, Glaucanin) Pioglitazona (ACTOS, AD 4833, U 72107, U 72107A, U 72197E, ZACTOS) Nome Quimico: 2,4-tiazolidinediona, 5- [ [4- [2- (5-etil-2-piridinil)etoxi]-fenil]metil], monocloridrato, (a/-); Rosiglitazona (Avandia, BRL 49653, BRL 49653C) Nome Quimico: 2,4-tiazolidinediona, 5-[[4-[2-(metil-2-piridinilamino)etoxi]-fenil]metil]; 25 Bexarotene-oral (LGD 1069 oral, Targretin oral, targretin, Targretyn oral Targrexin oral) Nome Químico: ácido 4-[1-(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetra- hidro-2-naftil)etenil]benzóico; ZD 2079 , (ICI D 2079) Nome - 62 - ΡΕ1715887
Químico: cloreto de (R)-N-[2,4-(carboximetil)-30- fenoxi]etil)-N-(2-hidroxi-2-fenetil)amónio; Netoglitazona, (Isaglitazona, MCC 555, RWJ 241947) (Nome Químico: 5—[6 (2 — fluorobenziloxi)naftalen-2-ilmetil]tiazolidina-2,4-diona); INS (D-quiro-inositol) (Nome Químico: D-l,2,3,4,5,6-hexa-hidrociclo-hexano), ON 2344 (DRF 2593); Dexlipotam, Nome Químico: ácido 5 (R) -(1,2-ditiolan-2-il)pentalóico; HQL 975, Nome Químico: ácido 3-[4[2-(5-metil-2-feniloxazol-4- il)etoxi]fenil]-2(S)-(propilamino)propiónico; YM 268, Nome Químico: 5,5'-metileno-bis-(1,4-fenileno)-bis-metileno-bis-(tiazolidina-2,4-diona). Os agonistas de IPPAR sob desenvolvimento incluem: Reglitazar (JTT 501, PNU 182716, PNU 716) (Nome Químico: isoxazolidien-3, 5-diona, 4— [ [4— (2— fenil-5-metil)-1,3-oxazolil]etoxifenil-4]metilo, (4RS); I (RP 297, Nome Químico 10 5— (2,4-dioxotiazolidin-5- ilmetil)-2-metoxi-N-[4-(trifluorometil)benzilbenzamida; R 119702 (Cl 1037, CS 011), Nome Químico: (/ —)—5—[4 — (5— metoxi-lH-benzimidazol-2-ilmetiloxi)benzil]tiazolin-2,4-diona; cloridrato; 15 DRF 2189, Nome Químico: 5—[[4—[2—(1— indolil)etoxi]fenil]metil]tiazolidina-2,4-diona; inibidores da síntese de cortisol, tais como Ketoconazole, econazole ou miconazole; hormonas de crescimento, tais como somatropina ou somatonorma e os seus derivados, tais como proteínas de fusão da hormona de crescimento humana, tais como ALBUTROPIN; polietilenoglicol-hormonas de crescimento, tais como hormona de crescimento pegilada com cisteína, BT 005 (Bolder BioTechnology Inc.); secretagogos de hormona de crescimento, tais como, por exemplo, SM 130686 (Sumitomo) capromorelin (Pfizer), Mecasermina (Fijisawa), sermorelina - 63 - ΡΕ1715887 (Salk Institute, Bio-Technology General), somatrem, somatomedina (C Llorente; Pharmacia Corporation) examorelina, tabimorelina; CP 464709 (Pfizer), LY 426410 e LY 444711 (Lily); 8-(aminoalcoxiimino)-8H-dibenzo[a,e]tri-azolo[4,5-c]ciclo-heptenos, tal como descrito no documento WO 2002057241, dibenzo[a,e]-1,2,3-triazolo[4,5-c][7]-anulen-8-onas 2-substituidas, tal como descrito no documento WO 2002056873, péptidos da hormona de crescimento GHRP-6 e GHRP-1, tal como descritos na patente U.S. No. 4.411.890 e publicações WO 89/07110 e WO 89/07111, B-HT920, Hexarelina e GHRP-2, tal como descrito no documento WO 93/04081 ou a hormona de libertação da hormona de crescimento (GHRH), também designada GRF) e os seus análogos, somatomedinas incluindo IGF-1 e IGF-2 e os seus derivados, tais como SomatoKine. uma fusão recombinante do factor 1 de crescimento do tipo insulina e a sua proteína de ligação, BP-3, agonistas alfa-2-adrenérgicos, tais como clonidina, xilazina, detomidina e medetomidina ou agonistas 5HTID de serotonina, tais como surnitriptano ou agentes que inibem a somatostatina ou a sua libertação como fisostogmina e piridostigmina, ThGRF 1-44 (Theratechnologies); L 165166 (Merck & Company); derivados dipéptidos, tais como descritos em WO 9858947, inibidores da dipeptidil peptidase IV, tais como amino-acilpirrolidina-nitrilo, tal como descrito nos documentos US 20030100563 e WO 98/19998; inibidores da dipeptidil peptidase beta-amino heterocíclicos, tais como os descritos nos documentos US 20030100563 e WO 2003082817; compostos de libertação da hormona de crescimento, tais como os - 64 - ΡΕ1715887
descritos nos documentos US 20030055261, US 20030040483, EP 18072, EP 83864, WO 89/07110, WO 89/01711, WO 89/10933, WO 88/9780, WO 83/02272, WO 91/18016, WO 92/01711, WO 93/04081, WO 9514666, EP 0923539, Patente U.S. Nos. 5.206.235, 5.283.241, 5.284.841, 5.310.737, 5.317.017, 5.374.721, 5.430.144, 5.434.261, 5.438.136, 5.494.919,
5.494.920, 5.492.916, 5. 536.716 e 5.578.593, WO 94/13696, WO 94/19367, WO 95/03289, WO 95/03290, WO 95/09633, WO 95/11029, WO 95/12598, WO 95/13069; WO 95/14666, WO
95/16675, WO 95/16692, WO 95/17422, WO 95/17423, WO
95/34311 e WO 96/02530, piperidinas, pirrolidinas e hexa-hidro-lH-axepinas, tais como descritas nos documentos US 804578, US 5783582, WO 2004007468, AMIDO-ESPIROPIPERIDINAS, tais como as descritas no documento WO 010419, compostos do ácido 2-amino-5-pirimidinaacético, incluindo ácido 2—[(5,6— dimetil-2-benzoimidazolil)amino]-4-hidroxi-6-metil-5-pirimidina-acético (2) e éster etílico do ácido 2—[(5,6— dimetil-2-benzoimidazolil)amino]-4-hidroxi-6-metil-5-pirimidina-acético, tal como descrito no documento US 63299383, benzimidazoles tal como descritos no documento EP 1155014, compostos de peptidilo análogos relacionados com a GRF e os péptidos da patente U.S. 4.411.890, antagonistas da hormona de libertação da gonadotropina, tais como os descritos nos documentos WO 0170228, WO 0170227, WO 0170228, WO 0069433, WO 0004013, WO 995156, WO 9951595, WO 9951231-4, WO 9941251-2, WO 9921557, WO 9921553 e COMPOSTOS 6-AZAINDOLE, tais como descritos nos documentos WO 0053601, WO 0053185, WO 0053181, WO 0053180, WO 0053179, WO 0053178, US 6288078; secretagogos de IGF-1; factor 2 de crescimento - 65 - ΡΕ1715887 do tipo insulina (IGF-1 ou somatomedina A) e secretagogos de IGF-2; antagonistas da miostatina e compostos que inibem a tirosina cinase do receptor 3 do crescimento dos fibroblastos (FGFR-3) .
As substâncias poliméricas incluídas são também preferencialmente solúveis em água à temperatura ambiente. Uma lista não limitativa de tais polímeros inclui homopolímeros de poli(óxido de alquileno), tais como o polietilenoglicol ou polipropilenoglicóis, poli(polióis oxietilenados), copolímeros destes de compolímeros em bloco destes, desde que seja mantida a solubilidade em água dos copolímeros em bloco.
Como alternativa aos polímeros à base de PEG, podem ser utilizados materiais não antigénicos, tais como dextrano, polivinilpirrolidonas, poliacrilamidas, poli-(álcoois vinílicos), polímeros à base de hidratos de carbono e outros do género. Na verdade, a activação de grupos α e ε-terminais destas substâncias poliméricas pode ser efectuada de maneira semelhante à utilizada para converter poli(óxidos de alquileno) e, deste modo, ser evidente para os especialiastas na matéria. Os especialistas na matéria considerarão que a lista anterior é meramente ilustrativa e que todos os materiais poliméricos que tenham as qualidades aqui descritas estão contemplados. Para fins do presente invento, "eficazmente não antigénico" significa todos os materiais conhecidos na arte como sendo não tóxicos e não promovendo uma resposta - 66 - ΡΕ1715887 imunogénica apreciável em mamíferos.
Definições A seguir existe uma lista de abreviações e dos significados correspondentes tal como aqui utilizados interpermutavelmente: g grama(s) mg miligrama (s) ml ou mL mililitro(s) RT temperatura ambiente PEG polietilenoglicol 0 conteúdo completo de todas as publicações, patentes, e pedidos de patente citados nesta descrição são aqui incorporados como referência como se cada publicação, patente ou pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado como referência.
Embora o invento precedente tenha sido descrito com algum detalhe através de ilustração e exemplo com o fim de clarificar o entendimento, tornar-se-á rapidamente evidente para um especialista na matéria à luz dos ensinamentos deste invento que alterações e modificações podem ser efectuadas sem se sair do espírito e do domínio do presente invento. Os exemplos seguintes são proporcionados apenas para fins de exemplificação e não - 67 - ΡΕ1715887 pretendem limitar o domínio do invento, que foi descrito atrás em termos largos.
Nos exemplos seguintes, a hGH é a de SEQ ID N0:1. Entende-se que outros membros da família de polipéptidos da hGH ou da variante agonista desta podem ser também pegilados de maneira semelhante à exemplificada nos exemplos subsequentes.
EXEMPLOS
Exemplo 1 PEG-butiraldeído hGH ramificado de PM 40 000
O
ií ihC '1 CHj ; f J^K » ffiFEÔ^ N CH.CfhCHjCH.
Η fi " ' I o , h
Este exemplo demonstra um método para produzir preparações substancialmente homogéneas de hGH monopegilada N-terminalmente através de alquilação redutora. Um reagente de PEG metoxi ramificado-butiraldeído com um PM de aproximadamente 40 000 (Sherwater Corp.) foi selectivamente ligado através de aminação redutora à parte N-terminal da - 68 - ΡΕ1715887 hGH usufruindo da diferença no valor de pKa relativo da amina primária na parte N-terminal versus os valores de pKa das aminas primárias na posição ε-amino dos resíduos de lisina. A proteína de hGH dissolvida a 10 mh/ml em Hepes 25 mM (Sigma Chemical, St. Louis, MO), pH 7,0, (opcionalmente MES 25 mM (Sigma Chemical, St. Louis, MO), pH 6,0, acetato de sódio (Sigma Chemical, St. Louis, MO), pH 4,5), foi feita reagir com Metoxi-PEG-Butiraldeído, M-PEG-ALD (Sherwater Corp., Huntsville, AL) , por adição de M-PEG-ALD para originar uma razão molar relativa de PEG:hGH de 2:1. As reacções foram catalisadas por adição de NaCNBH4 1M (Sigma Chemical, St. Louis, MO), dissolvido em H2O, até uma concentração final de 10-50 mM. As reacções foram realizadas no escuro à RT durante 18-24 horas. As reacções foram paradas por adição de Tris 1 M (Sigma Chemical, St. Louis, MO), ~pH 7,6 até uma concentração final de Tris de 50 mM ou diluída num tampão apropriado para purificação imediata. A Tabela 1 mostra a percentagem, determinada por Cromatografia por Exclusão de Tamanho de espécies multi-PEGiladas, conjugados mono-PEGilados, PEG por reagir e um rendimento de purificação final para PEG ramificado-aldeído 40K e PEG ramificado-butiraldeído 40K. O PEG-butiraldeído resulta num rendimento final aumentado de conjugado mono-PEGilado, diminuídos níveis de PEG por reagir e um maior rendimento final em comparação com o PEG-aldeído. - 69 - ΡΕ1715887 TABELA 1
Comparação de PEG ramificado-ALD-hGH 40K e PEG ramificado- butiraldeído-hGH 40K Espécies na mistura reaccional PEG-aldeído hGH 40K PEG-butiraldeído-hGH 40K Produto multi-PEG 4,02% 5, 03% Produto mono-PEG 48,70% 61,02% hGH por reagir o\° O oo \—1 29,20% Rendimento final de purificação 30,80% 44,70%
Exemplo 2 PEG-butiraldeído hGH linear de PM 30 000
Reagente de PEG-butiraldeído metoxi-linear de PM 30 000 é ligado à parte N-terminal da hGH utilizando o procedimento descrito no Exemplo 1.
Exemplo 3 PEG-butiraldeído hGH linear de PM 20 000
Reagente de PEG-butiraldeído metoxi-linear de PM - 70 - ΡΕ1715887 20 000 é ligado à parte N-terminal da hGH utilizando o procedimento descrito no Exemplo 1.
Exemplo 4
Purificação de hGH Pegilada
Espécies de hGH Pegilada foram purificadas a partir da mistura reaccional até >95% (análise SEC) utilizando um passo de cromatografia de permuta aniónica simples. A hGH mono-pegilada foi purificada a partir de hGH não modificada e de espécies multi-pegiladas de hGH utilizando cromatografia de permuta aniónica. Uma mistura reaccional de hGH butiraldeido 20K típica (5-100 mg de proteína), tal como descrito atrás, foi purificada numa coluna de Q-Sepharose Hitrap (1 ou 5 ml) (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) equilibrada em HEPES 25 mM, pH 7,3 (Tampão A). A mistura reaccional foi diluída 5-10X com tampão A e carregada para a coluna com um caudal de 2,5 ml/min. A coluna foi lavada com 8 volumes de coluna de tampão A. Subsequentemente, as várias espécies de hGH foram eluídas da coluna com 80-100 volumes de coluna de tampão A e um gradiente de NaCl linear de 0-100 mM. O eluente foi monitorizado por absorvância a 280 nm (A2so) e foram recolhidas fracções de 5 ml. As fracções foram reunidas em relação à extensão da pegilação, e.g. mono, di, tri etc. (avaliadas como no exemplo 15) . As fracções reunidas foram então concentradas a 0,5-5-mg/ml num concentrador Centriprep YM10 (Amicon, Techmology Corporation, - 71 - ΡΕ1715887
Northborough, MA). A concentração das fracções reunidas foi determinada por A280 utilizando um coeficiente de extinção de 0,78.
Cromatografía de Permuta Catiónica
Foi realizada cromatografía de permuta catiónica numa coluna de alta eficiência de SP Sepharose (Pharmacia XK 26/20, 70 ml de volume de leito) equilibrada com acetato de sódio 10 mM, pH 4,0 (Tampão B) . A mistura reaccional é diluída 10X num tampão B e carregada para uma coluna com um caudal de 5 ml/min. A seguir a coluna é lavada com 5 volumes da coluna de tampão B, seguido de 5 volumes da coluna de tampão C a 12% (acetato 10 mM, pH 4,5, NaCl 1M) . Subsequentemente, as espécies de PEG-hGH são eluídas da coluna com um gradiente linear de 12 a 27% de tampão C em 20 volumes de coluna. O eluente é monitorizado a 280 nm e foram recolhidas fracções de 10 ml. As fracções são reunidas de acordo com a extensão da pegilação (mono, di, tetra etc.), permutadas em tampão de acetato 10 mM, pH 4,5 e concentradas até 1-5 mg/ml numa célula agitada com uma membrana Amicon YM10. A concentração da proteína das fracções reunidas é determinada por A280 utilizando um coeficiente de extinção de 0,78. - 72 - ΡΕ1715887
Exemplo 5
Caracterização bioquímica
As fracções reunidas de hGH pegilada purificadas foram caracterizadas SDS-PAGE não redutor, Cromatografia de Exclusão de Tamanho não denaturante e mapeamento de péptidos.
Cromatografia liquida de Alta Eficiência por Exclusão de Tamanho SEC-HPLC não desnaturante A reacção de metoxi-PEG de várias químicas de ligação, dimensões, agentes de ligação e geometrias com a hGH, as fracções reunidas de purificação por permuta aniónica e os produtos purificados finais foram avaliados utilizando SEC-HPLC não desnaturante. A SEC-HPLC não desnaturante analítica é realizada utilizando uma coluna Superdex 200 7,8 mm X 30 cm, (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ) em fosfato 20 mM, pH 7,2, NaCl 150 mM com um caudal de 0,5 ml/min (opcionalmente Tosohaas G4000PWXL Amersham Bioscience, Piscataway, NJ). A PEGilaçâo aumenta o volume hidrodinâmico da proteína resultante com um desvio para um tempo de retenção inferior. Foram observadas novas espécies na mistura reaccional de PEG aldeído hGH em conjunto com hGH não modificada. Estas espécies PEGiladas e não PEGiladas foram separadas por cromatografia em Q- - 73 - ΡΕ1715887
Sepharose e foi mostrado que as espécies mono PEG-aldeido hGH resultantes, subsquentemente, eluiam como um único pico em SEC não desnaturante (>95% pureza) . 0 passo de cromatografia em Q-Sepharose removeu eficazmente espécies livres de PEG, hGH e hGH multi PEGiladas da hGH mono PEGilada. SEC-HPLC desnaturante A reacção de polietilenoglicóis butiraldeido com hGH, purificação por permuta aniónica e produtos purificados finais são avaliados utilizando SEC-HPLC desnaturante. A SEC-HPLC desnaturante analítica é realizada utilizando uma coluna Tosohaas 3000WXL 7,8 mm X 30 cm (Tosohaas Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) em Fosfato 100 mM, pH 6,8, SDS a 0,1% com um caudal de 0,8 1/min. A PEGilação aumenta grandemente o volume hidrodinâmico da proteína resultante com um desvio para um tempo de retenção mais curto. As espécies PEGiladas e não PEGiladas são separadas por cromatografia em Q-Sepharose.
Transferência SDS PAGE/PVDF
Foi utilizado SDS-PAGE para avaliar a reacção de PEG butiraldeido com a hGH e os produtos finais purificados. O SDS-PAGE foi realizado utilizando geles Tris tricina 10-20% com 1 mm de espessura (Invitrogen, Carlsbad, CA) sob condições de redução e não redução e corou-se utilizando um kit de mancha Novex Colloidal Coomassie™ G- - 74 - ΡΕ1715887 250 (Invitrogen, Carlsbad, CA) . As bandas foram manchadas numa membrana de PVDF para identificação subsequente da sequência N-terminal. HPLC de permuta aniónica analítica A mistura reaccional PEG butiraldeído/hGH, fracções de purificação de permuta aniónica e produtos purificados finais foram avaliados utilizando HPLC de permuta aniónica analítica. A HPLC de permuta aniónica analítica foi realizada utilizando uma coluna de permuta aniónica Tosohaas Q5PW ou DEAE-PW, 7,5 mm x 75 mm (Tosohaas Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) em Tris 50 mM, pH 8,6 com um caudal de 1 ml/min. As amostras foram eluídas com um gradiente linear de NaCl 5-200 mM.
Sequência N-terminal e Mapeamento do Péptido
Foi utilizada química de degradação de Edman automática para determinar a sequência de proteína NH2-terminal. Foi empregue um sequenciador Applied Biosystems Modelo 494 Proceise (Perkin Elmer, Wellesley, MA) para a degradação. Os derivados PTH-AA respectivos foram identificados por análise de RP-HPLC on-line empregando um analisador Applied Biosystems Modelo 140C PTH equipado com uma coluna Perkin Elmer/Brownlee d.i. 2,1 mm PTH-C18.
Foi realizada digestão tríptica com uma concentração de 1 mg/ml e tipicamente é utilizado 50 yg de - 75 - ΡΕ1715887 material por digestão. Foi adicionada tripsina de modo a que a razão de tripsina em relação ao PEG-hGH fosse de 1:30 (p/p) . Foi usado tampão Tris a 30 mM, pH 7,5. As amostras foram incubadas à temperatura ambiente durante 16 + 0,5 horas. As reacções foram terminadas por adição de 50 μΐ de HC1 IN por ml de solução de digestão. As amostras foram diluidas, antes de se colocar as amostras no amostrador automático, até uma concentração final de 0,25 mg/ml em acetonitrilo 6,25%. O acetonitrilo foi primeiro adicionado (até 19,8% de acetonitrilo), misturado suavemente, e então foi adicionada água até ao volume final (quatro vezes o volume de partida). A solução de digestão extra pode ser removida e armazenada até 1 semana a -20°C.
Um sistema de HPLC Waters Alliance 2695 foi utilizado para análise, mas outros sitemas podem produzir resultados semelhantes. A coluna utilizada foi uma coluna Astec C-4 polimérica 25 cm x 4,6 mm, com partículas de 5 ym. As experiências foram realizadas à temperatura ambiente com uma carga típica de 50 yg de proteína por amostra. O tampão A é ácido trifluoroacético 0,1% em água; o tampão B é ácido trifluoroacético 0,085% em acetonitrilo. O gradiente foi o seguinte:
Tempo A% B% c% D% Fluxo 0,00 0,0 0,0 100,0 0,0 1,000 90, 00 0,0 0,0 55, 0 45,0 1,000 90,10 0,0 0,0 0,0 100,0 1,000 O O \—1 03 0,0 0,0 0,0 100,0 1,000
Curva 1 6 6 6 - 76 - ΡΕ1715887 91,10 O O o o 100,0 o o 1,000 6 95, 00 o o o o 100,0 o o 1,000 6 A coluna é aquecida a 40°C utilizando uma camisa de aquecimento. Os picos foram detectados utilizando um detector Waters de recolha de dados entre 210 e 300 nm. O cromatograma obtido a 214 nm foi utilizado para análise da amostra.
Mapas tripticos foram realizados para a hGH, PEG ramificado-aldeido 40K e butiraldeido ramificado 40 K (Figura 1) . 0 fragmento triptico N-terminal foi referido como sendo T-l. A percentagem de T-l presente em comparação com hGH não PEGilada é mostrada na tabela 2. Estes dados sugerem que 90% da modificação do PEG está na parte N-terminal com o remanescente aparentemente ligado a um de vários resíduos de lisina possíveis utilizando PEG-aldeído em comparação com mais de 98% na parte N-terminal utilizando PE-butiraldeído. TABELA 2 % T-l presente %T-1 presente em comparação com a hGH não PEGilada hGH 28,0% PEG-aldeído/hGH 2,6% 9,2% PEG-butiraldeído/hGH 0,3% 1,2% - 77 - ΡΕ1715887
Exemplo 6
Estudos de Farmacodinâmica
Ganho de peso da ratazana
Ratazanas Sprague Dawley fêmeas, hipo-isectomizadas da Taconic Labs, foram pré-seleccionadas em relação à taxa de crescimento durante um período de 7 a 11 dias. As ratazanas foram divididas em grupos de oito. 0 grupo consistia de ratazanas a quem foi dada quer diariamente quer no dia 0 e no dia 6 doses subcutâneas de veículo. Ao grupo 2 foi dada diariamente uma dose subcutânea de GH (30 yg/ratazana/dose). Ao grupo 3 foram dadas doses subcutâneas de GH no dia 0 e no dia 6 (180 yg/ratazana/dose). Ao grupo 4 foram dadas doses subcutâneas de PEG ramificado-butiraldeído-hGH nos dias 0, 6 (180 yg/ratazana/dose). As ratazanas hipofisectomizadas foram monitorizadas relativamente ao peso ganho, pelo menos, dia sim dia não durante o estudo. Figura 3 & 4.
Comprimento da tíbia da ratazana
Os animais do estudo de aumento de peso no dia 11 foram sacrificados, as tíbias esquerdas foram removidas e radiografadas e os comprimentos dos ossos foram medidos utilizando uma paquímetro. Figura 5 - 78 - ΡΕ1715887
Estudos de IGF-1
Foram utilizados animais do estudo de aumento de peso em seis dias. Foram recolhidas amostras de sangue em vários tempos durante o estudo e os niveis de IGF-1 no soro foram determinados por ELISA. Figura 6
Estudos de bioquímica no soro
Foram utilizados animais do estudo de aumento de peso em 11 dias, para avaliar os valores de bioquímica no soro no dia 7 a seguir à administração cumulativa de 1,8 mg/kg no dia 0 e 6, tal como mostrado na Tabela 3
Tabela 3
Ensaio Veículo hGH (11 dias a 300 pg/kg/dia) PEG-hGH (1,8 mg/kg no dia 0 e 6) ALB (g/dl) 4,07 ± 0,04 4,06 ± 0,05 4,18 ± 0,03*+ ALP (U/l) 311 ± 15 309 ± 16 280 ± 14 ALT (U/l) 53,6 ± 2,4 51,1 ± 2,2 51,3 ±2,6 AST (U/l) 149 ± 7 131 ± 4 137 ± 11 BLIN (mg/dl) 37,4 ± 1,6 26,7 ± 1,5* 27,9 ± 0,6* Ca2+ (mg/dl) 10,9 ± 0,1 11,5 ± 0,1* 11,0 ± 0,1+ Chol (mg/dl) 85,1 ± 2,8 7 6,9 + 3,6* 115,3 + 2,8*+ CRE (mg/dl) 0,62 ± 0,02 0,60 ± 0,01 0,59 + 0,01 Glucose (mg/dl) 73,4 ± 4,7 79,6 ± 4,7 67,1 + 8,9 Phos (mg/dl) 8,26 ± 0,28 9,59 ± 0,16* 8,42 + 0,23+ - 79 - ΡΕ1715887 TP (g/1) 6,36 + O \—1 o co + 0,10 6,39 ± 0,06 TBA (ymol/1) 10,0 + 0,5 7,6 + 0,4* 11,0 ± 0,4 + SDH (U/l) 11, 9 + 1,0 9,7 + 1,4 10,6 ± 0,7 Triglicéridos 57,4 + 4,0 47,8 + 5,7 45,7 ± 3, 9* (mg/dl) LDH (U/l) 786 + 72 762 + 94 914 ± 189 Na+ (mmol/1) 147 + 0,5 146 + 0,8 145 ± 0,6* K+ (mmol/1) 5,94 ± 0,09 6, 31 ± 0,16* 6,71 ± 0,17*+ C1‘(mmol/1) 103 + 0,5 102 + 0,5 102 ± 0,6 * ρ<0,10 vs veículo, + p<0,05 vs hGH ALB, albumina; ALP, fosfatase alcalina; ALT, alanina aminotransferase; AST, aspartato aminotransferase; BUN, azoto de ureia no sangue; Ca2+, cálcio; Chol, colesterol; CRE, creatinina; Phos, fosfato; TP, proteína total; TBA, ácido biliar total; SDH, sorbitol desidrogenase; LDH, desidrogenase láctica; Na+, sódio; K+, potássio; Cl~, cloro. A concentração de azoto da ureia no sangue no dia 11 diminuiu significativamente (p<0,10) na mesma extensão relativa ao grupo veículo nos animais tratados com hGH e PHA-794428. Isto é indicativo da diminuição da utilização de azoto como resultado de nova síntese de proteína durante o crescimento aumentado.
Estudos Farmacocinéticos
Foram realizados estudos farmacocinéticos em ratazanas Sprague Dawley machos canuladas. Foram dadas injecções num bolus subcutâneo simples de 100 yg/kg/rato de - 80 - ΡΕ1715887
Gh ou PEG-GH utilizando seis ratos por grupo. Foram tomadas amostras de sangue ao longo de uma cinco dias, tal como apropriado para avaliação de parâmetros de PK relevantes. Os niveis de GH e de PEG-GH no sangue foram monitorizados em cada amostragem utilizando um ensaio imunológico.
Ensaio imunológico da hGH
Os niveis de concentração da proteína de hGH e da hGH pegilada no plasma de ratos e de macacos cinomolgus foram determinados utilizando o kit de fluorescência AutoDELFA para ensaio imunológico da hGH (Perkin Elmer). Os níveis de IGF-1 em ratazanas e humanos foram monitorizados através do kit de ensaio imunológico (Diagnostic System Laboratories).
Propriedades Framacocinéticas Não Comportamentaís de Conjugado de hGH-PEG do Exemplo 1 em Primatas Não
Humanos O conjugado de hGH-PEG do Exemplo 1 foi administrado a macacos cinomolgus em injecções bolus intravenosa (iv) ou subcutânea (sc) a 0,18 mg/kg (Tabela 4) . Os parâmetros de PK foram determinados utilizando os dados médios para n=3 animais. As concentrações no plasma foram medidas utilizando o kit do ensaio imunológico de fluorescência AutoDELFA (Perkin Elmer) e uma curva padrão pré-determinada para o conjugado PEG-GH. - 81 - ΡΕ1715887
Tabela 4
Dose (mg/kg) iv 0,18/sc 0,18 CL, iv (ml/h/kg) 0,8 Vss (ml/kg) 28,0 Tl/2, iv (h) 25, 0 Tl/2, sc (h) 61,2 SC AUC (yg/ml*h) 195 Biodisponibilidade SC (%) 84 Tmax, sc (h) 32 - 82 - ΡΕ1715887 LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Pharmacia Corporation Finn, Rory
HUMANA A SUA
<120> CONJUGADOS DA HORMONA DE CRESCIMENTO MONOPEGILADA N-TERMINALMENTE, PROCESSO PARA
PREPARAÇÃO E MÉTODOS PARA UTILIZAÇÃO DESTES
<130> 32152A <150> 10/771895 <151> 2004-02-04 <16 0> 1 <170> Patentln versão 3.2
<210> 1 <211> 191 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 1

Claims (3)

    ΡΕ1715887 - 83 - I?fte 9*0 Th*' Ile 9*0 L®U Se* Arg La» Phe Asp Asa Ais Set L&» A*g 1 5 " 10 IS Ma Kis Arg Leu His 61o Leu Ala fôts Asp T&r Tyr Gin Glu Phe Glu 20 25 35 61» Ala Ty* % te Fr© Lys Glu 61o tye *yr Ser íhe Leu Gla Asa ft*o 3S 40 45 61a Tlar Sor Leu cys Pfee Set 61 u Sor lio Sn» tfcr Pro #e* Ae» Asg 50 55 60 Glu Glu Th* Gin Gin Lys Ser Aon Leu Slu Leu Leu Ârg lie Ser Leu «5 70 75 80 Leu Leu 11« 6Xa Ser Trp Leu 6iu Pro vai Gl« Ser Leu Arg Ser ¥al 8S 00 05 9bô Ais As» Ser Leu vai tyr Gly Ala Ser Asp ser Se» vai tyr Asp ISO 10$ 110 Leu Leu Lys Asp Leu 61u 61a Gly Lis 61a thr Leu Met Sly Arg Leu 115 i.2Õ 525 Glu &ep Sly Ser f*o Arg Thr Gly Gin Kl® Pha j,y» 61« Tkr Tyr Ser 130 135 140 sys Pbe Aep Th* As» Ser His As» Asp Asp Ala L«u Leu Lys Se» Tyr 145 ISO 15¾ los Gly Leu seu Tyr Cys 15 5 the Arg Lys Asp «et Asp Lys vai Glu Tbr Fhe 170 175 Leu Are He Vai Gin ISO Cys Arg Ssr vai Gl» Gly Ser Cys Gly Fhe 185 ISO Lisboa 17 de Agosto de 2007 ΡΕ1715887 1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de uma hGH modificada com polietilenoglicol possuindo a estrutura de fórmula I ou II, Fórmula I mPEG-0 (CH2CH20) n (CH2) mCH2-NH-R Fórmula II em que n é um número inteiro entre 1 e 10; m é um número inteiro entre 1 e 10; R é uma hormona de crescimento humano, hormona de crescimento metionilo, só ou em combinação com outro agente terapêutico na produção de um medicamento para a prevenção e/ou o tratamento de uma doença ou anomalia em que a utilização da hormona de crescimento seja benéfica, em que a doença ou - 2 - ΡΕ1715887 anomalia é seleccionada do grupo constituído por dano traumático do cérebro, hemorragia subaracnóide, síndroma de Noonan, baixa estatura idiopática (ISS), peso muito baixo no nascimento (VLBW), baixa estatura devida a tratamento com glucorticóides em crianças e deficiência de crescimento em crianças prematuras pequenas. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a referida doença ou anomalia em que a utilização de GH é benéfica é a ISS. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que n é igual a 4 e m é igual a 3. 4. Utilização de acordo com a reivindicação 3, em que a referida hGH modificada com polietilenoglicol possui a estrutura de fórmula I com n igual a 4 e m igual a 3. 5. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que a referida hormona de crescimento humano compreende a sequência de aminoácido SEQ ID NO:1. 6. Utilização de acordo com a reivindicação 5, em que mais do que 90% do referido polietilenoglicol é conjugado com uma fenilalanina amino-terminal da sequência de aminoácido SEQ ID NO:l. - 3 - ΡΕ1715887 7. Utilização de acordo com a reivindicação 5, em que mais do que 95% do referido polietilenoglicol é conjugado com uma fenilalanina amino-terminal da sequência de aminoácido SEQ ID N0:1. 8. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que cada mPEG possui um peso molecular de cerca de 20 kDa. 9. Composição compreendendo o conjugado de hormona de crescimento humano-PEG de fórmula I ou II em combinação com outro agente terapêutico e, pelo menos, um portador farmaceuticamente aceitável: O 3 «^ch>~c™|ík wi WiC H *. â focraula I mPEG-Ο (CH2CH20)n (CH2)mCH2-NH-R Fórmula II em que n é um número inteiro entre 1 e 10; m é um número inteiro entre 1 e 10; - 4 - ΡΕ1715887 R é uma hormona de crescimento humano ou hormona de crescimento metionilo. 10. Composição da reivindicação 9, em que a referida hGH modificada com polietilenoglicol possui a estrutura de fórmula I em que n é igual a 4 e m é igual a 3. Lisboa, 17 de Agosto de 2007 PE1715887 1/6- FIG, 1 ΡΕ1715887 - 2/6 - FIG.2 Phe Pro Thr Ile PrO Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn 12 Ala mt Leu Arg Ala Sis Arg Leu His Gin Leu Ala 24 Phe hsp 'Th.r Tyr Gin. Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ilu 35 Er© Lys> Glu Gin Lys Tyr Ser Phe Leu Gin Asn Pro 48 Gin Slnr Ser LfêU Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr 60 Pro Ser Asa Arg Glu Glu Thr Gin Gin Lys Ser Asn 72 Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu 11« Gin 84 Ser Trp Leu Glu. Pro vai Gin. Ser use Arg Ser Vai Sê Phe Ale Asn Ser Leu Vai Tyr Gly Ala Ser Asp Ser 108 Asn Vai Tyr ABp Leu Leu Lys ASP Leu Glu Glu ^ K* νϊ-ty 120 lie Glu Thr Léu Het Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser 132 Pro Arg Thr Gly Gla 11« phe Lys Gin Thr Tyr Ser 144 Lys Phe ASp ίΤΥΚ-ν λ -V A uU Asn Ser Sis A$n Asp Asp Ala Leu 156 Leu uys Asn lyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys 168 Asp Met ASp Lys Vai Glu Thr Phe Leu Arg 11« Vai 180 .Λ> 'Sí „ Cys Arg Ser Vai Glu Gly Ser Cys Gly Phe 131 SEQ. ID NO.: 1 ΡΕ1715887 -3/6- ΡΕ1715887 -4/6- χ 31 .X ¢5 OOle ·*- ^ (η θθω m ω&. a, cl ^ O) CS j^ ^ ^ Q) "ãiCTi C to Oi d d c Φ ffi X lo g>0 skt jj CS ࣠h O) ΡΕ1715887 -5/6 ί * * \L· Veículo hGh diariamente <10,6 40K ButÂíd PEG- hGH t— co « “T- “Tr"""·-τ' Τ' Ο n rt ο m 04 c Φ *—* ΡΕ1715887 6/6
  1. -1 - ΡΕ1715887 REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO A seguir listam-se as referências citadas pelo requerente somente para conveniência do leitor. Tal listagem não faz parte do documento da patente europeia. Embora tenha sido tomado grande cuidado na compilaçaõ das referências erros e omissões não podem ser considereados excluídos e o EPO rejeita qualquer responsabilidade a esse respeito. Documentos de patentes citatos na descrição WO $951SS$ A [$1121 W09SS12314 A[0112J WO §9412512 A [0112] W09921SS7A[$Í12] W09S215S3A[Ô112| WO 0053852 A [0112] WO 0053185 A [0112] WO 0053151 A [0112] WO 0053150 A [0112] WO 0053179 A [0112] WG0053178 A [0112] US 6255073 S [0112] WO §602530 A {011Ϊ] US S3S4578 A[S112} US S783S82 A [0112] WO 2Q04S0748SÂ[S«2J WG 010«n k pi12 j USf32§3SSB[<5112] EP 1155014 A [§112] WO 0175225 A [3112] WO 0173227 A [0112] WO 0069^33 A [0112] WO 0004013 A [0112] VVO S95158 Α{δ112] Literatura não-patentes citada na descrição -2 ΡΕ1715887 • K. 8ARRE».; Ο, KE1LER, Bsmres ¢,¾ Bwfa-cmίσ. Meia1996, vai 10, 33? [6333] * J, VERHELST J ;; R. ABS. Dni§s. 2802. «3Í.
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