TW200812610A

TW200812610A - N-terminally monopegylated human growth hormone conjugates, process for their preparation, and methods of use thereof

Info

Publication number: TW200812610A
Application number: TW096134157A
Authority: TW
Inventors: Rory F Finn
Original assignee: Pharmacia Corp
Priority date: 2004-02-04
Filing date: 2005-02-03
Publication date: 2008-03-16
Also published as: ZA200706349B; EP1915999A1; ES2286787T3; TW200529868A; DK1715887T3; NO20063926L; JP2008037872A; JP2008001713A; DE602005001445T2; KR20060120240A; CN1929857A; EP1715887A1; KR20070039623A; AU2005215250A1; KR100776862B1; BRPI0507427A; PL1715887T3; WO2005079838A1; ZA200606375B; PT1715887E

Description

200812610 w , 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明係關於人類生長激素（hGH)之化學修飾，包括聚乙二醇化作用，及其激動劑變體，藉其可改變hGH之化學及/或生理學特性。聚乙二醇化之1可具有增加的血漿滯留期間、降低清除率、改善穩定性、減少抗原性、降低聚乙二醇化作用異質性或其組合。本發明亦關於hGH的修飾製程。此外，本發明亦關於包括經修飾hGH的醫藥組合鲁物。進一步的具體實施例是該經修飾hGH在治療生長和發育疾病上的用途。【先前技術】人類生長激素（hGH)是一蛋白質，其包括191個胺基酸之單鏈，由兩個雙硫橋交聯，且單體形式具有22 kDa之分子量。人類GH係由腦下垂體分泌及其亦可藉重組遺傳工程製造。hGH在所有能夠生長的體組織中引起生長。hGH不 φ 僅在人類生長期的促進生長上，亦在正常體組成、合成代謝及脂質代謝上扮演重要的角色（K_ Barneis.和U. Keller， Baillieres Clin. Endocrinlo. Metab. 10 : 337 (1996)) 〇重組hGH已經上市販售數年。市場上出現兩種具有治療用途的重組hGH製品：真正的一種，例如GenotropinTM、或NutropinTM，以及在N-終端帶有額外甲硫胺酸殘基的類似物，例如Somatonorm™。hGH係用來在罹患腦下垂體機能不足侏儒症的患者中刺激直線生長，該症亦稱為生長激素缺陷（GHD)或特内氏（Turner’s)徵候群，但其他的適應症 I24799.doc 200812610 'i 亦已經暗示在早產（SGA)的孩童中長期治療生長失敗、治療患有普瑞德-威利（Prader-Willi)徵候群（pwS)的患者、慢性腎功能不全（CRI)、AIDS消耗和衰老。成年的GH缺陷 (aGHD)患者有各種問題，如在體組成上獨特的變化，包括脂肪質量的增加、降低瘦肉體質量和細胞外流體，並降低骨骼礦物質密度、脂質的代謝異常，以及心血管功能障礙。獨子問題許多可藉著hGH置換療法來改善（J. Verhelst J和 R· Abs· Drugs· ; 62 : 2399 (2002)) 〇籲生長激素（GH)主要的生物影響是促進年輕哺乳動物的生長，並在較老動物中維持組織。受影響的器官系統包括骨骼、結締組織、肌肉和内臟，如肝臟、小腸和腎臟。生長激素經由與在標靶細胞膜上的特定受體交互作用而發揮其影響。hGH是包括胎盤催乳激素、催乳激素和其他遺傳和物種變體或生長激素之同種激素家族的成員（1^1(：〇11，（：.8· 等人（1986) Endocrine Reviews 7: 169)。在這些之中， hGH難得展現出廣泛的物種專一性，並與選殖的體細胞受體（Leung D.W·等人[1987] Nature 330 ; 537)或催乳激素受體（Boutin，J.M.等人[1988] Cell ; 53 : 69)結合。已經在大腸桿菌中以分泌形式表現hGH的選殖基因（Chang，C.N·等人[1987] Gene 55 : 189)，並已經報告了它的DNA和胺基酸序列（Goeddel 等人[1979] Nature 281 : 544; Gray 等人 [1985] Gene 39 : 247) 〇人類生長激素（hGH)參與許多正常人類生長與發育的調節。該腦下垂體激素顯示出眾多生物影響，包括直線生長 124799.doc 200812610 w V (軀體發生）、泌乳、巨噬細胞的激活作用、類胰島素和致糖尿病的影響等等（Chawla，R.K. (1983) Ann. Rev. Med. 34, 519 ; Edwards，C.K·等人（1988) Science 239，769 ; Thomer，Μ·0·等人（1988) J· Clin· Invest· 81 : 745)。在孩童中的生長激素缺陷導致侏儒症，已經成功地藉著外源投與 hGH治療1 〇年以上。在成人以及在孩童中，hGH藉著增加氮的保留並刺激骨骼肌生長，並藉著動員體脂肪，維持正常的體組成。内臟鲁脂肪組織特別對hGH有反應。除了促進脂肪水解，hGH還降低三酸甘油酯攝取至體脂肪儲存處内。藉著hGH增加 IGF- I (類胰島素生長因子 I )和IGFBP3 (類胰島素生長因子結合蛋白質3)。人類生長激素（hGH)是單鏈多肽，由191個胺基酸組成 (分子量21，500)。二硫鍵連接位置53和165，以及位置182 和 189。Niall，Nature，New Biology，230 : 90 (1971)。hGH 泰是有潛力的合成代謝劑，尤其是歸因於氮、磷、鉀和鈣的保留。以GH處理垂體切除的大鼠，可恢複大鼠至少一部分的生長速率。Moore 等人，Endocrinology 122 : 2920-2926 (1988)。在腦下垂體機能減退之（GH-缺陷的）個體中最醒目的影響是促進骨骼-生長板-軟骨的直線生長，結果增加身高。Kaplan，Growth Disorders in Children and Adolescents (Springfield，IL : Charles C, Thomas，1964) o hGH在各種動物模式中引起各種生理學和代謝影響，包括直線骨路生長、泌乳、巨嗤細胞的激活作用、類胰島素 124799.doc 200812610 麝和糖尿病原的影響及其他（R.K. Chawla等人，Annu· Rev.

Med. 34 : 519 (1983) ; O.G.P. Isaksson 等人，Annu. Rev.

Physiol· 47，483 (1985) ; C.K. Edwards等人，Science 239, 769 (1988) ·，M.O. Thomer和 M.L. Vance，J. Clin· Invest· 82 : 745 (1988) ; J.P. Hughes 和 H.G. Friesen，Ann. Rev.

Physiol. 47 : 469 (1985))。已經報告了，尤其是在停經後的婦女，GH分泌隨著年齡而衰退。Millard等人，

Neurobiol· Aging，11 : 229-235 (1990) ; Takahashi 等人，鲁 Neuroendocrinology M，L6- 137-142 (1987)。亦參見

Rudman等人，J. Clin. Invest·，67 : 136卜 1369 (1981)和

Blackman, Endocrinology and Aging, 16 : 981 (1987) 〇此外，報告存有可藉著一週三次GH處理，降低一些年齡的徵候，包括降低瘦肉體質量、脂肪組織質量的擴大，以及皮膚變薄。參見，例如Rudnam等人，N. Eng. J· Med·， 323 : 1-6 (1990)，以及在相同期刊中由Dr· Vance發表之附

錄物件（第52-54頁）。這些生物學影響衍生自hGH與特定細 W 胞受體的交互作用。已經選殖兩種不同的人類受體，hGH 肝臟受體（D.W. Leung等人，Nature 330 : 537 (1987))和人類催乳激素受體（J.M. Boutin 等人，Mol. Endocrinology· 3 : 1455 (1989))。然而，亦可能有其他的，包括人類胎盤催乳激素受體（M. Freemark，M. Comer，G. Komer，和 S. Hardwerger，EndocrinoL 120: 1865 (1987))。這些同種受體包括糖基化細胞外激素結合功能部位、單一穿透膜功能部位和細胞質功能部位，其在序列和尺寸上頗為不同。假 124799.doc 200812610 v 定一或多個受體在對hGH之生理學反應上扮演決定性的角色。通常觀察到將在生理學上有活性之蛋白質投與身體，可顯示其藥理學活性僅持續短時間，歸因於其在身體中的高清除率。此外，這些蛋白質的相對忌水性可能限制其穩定性及/或溶解度。為了降低清除率，改善治療性蛋白質的穩定性或廢除抗原性，已經提出一些方法，其中利用水-溶性聚合物以化 _ 學方式修改該蛋白質。該類型之化學修改可有效地阻斷來自與蛋白質主鏈本身之物理接觸的蛋白水解酵素，因此防止降解。某些水-溶性聚合物的化學附接可有效地降低腎清除，歸因於增加分子的流體動力學體積。額外的優點包括在某些情況下，增加治療性蛋白質的穩定性和循環時間、增加溶解度，並降低免疫原性。聚（稀化氧），尤其是聚（乙二醇）(PEG)，是一種這類的化學部分，已經用來製 $ 備治療性蛋白質產物（動詞”聚乙二醇化”意指附接至少一個 PEG分子）。聚（乙二醇）的附接已經顯示保護對抗蛋白水解作用，Sada等人，J· Fermentation Bioengineering 71 : 137-139 (1991)，且附接某些聚（乙二醇）部分的方法是可利用的。參見1979年12月18日發證之美國專利第4，179,337號，Davis等人，’’非-免疫原性多肽(Non-Immunogenic Polypeptides)";以及1977年1月11日發證之美國專利第4,002,531號，Royer， "以聚乙二醇修改酵素並藉此產生產物（Modifying Enzymes with Polyethylene Glycol and Product Produced 124799.doc 200812610 <· v Thereby)”。至於回顧，參見Abuchowski等人，在作為藥勒j 之酵素（Enzymes as DrugsKJ.S. Holcerberg和 J· Roberts編輯，第 367-383 頁（1981))中。已經使用其他的水溶性聚合物，如乙二醇/丙二醇的共聚物、羧曱基纖維素、葡聚糖、聚（乙烯醇）、聚（乙烯吡咯烧酮）、聚（-1，3 -二氧戊ί哀）、聚（·1，3,6_三口号烧、乙稀/川貝丁烯二酸酐共聚物、聚-胺基酸（均聚物或隨機共聚物）。已經描述聚乙二醇化之治療性蛋白質的種種實例。鲁 ADAGEN®，一種腺苷脫胺酶的聚乙二醇化調配物，批准用來治療嚴重的混合免疫缺陷疾病。ONCASPAR⑧，一種聚乙二醇化之L_天冬醢胺酶，已經批准用來治療過敏性 ALL患者。聚乙二醇化之超氧物歧化酶已經在臨床試驗中批准用來治療頭部傷害。聚乙二醇化之α_干擾素（美國專利第5,73 8,846號、5,382,657號）已經批准用來治療肝炎；報告了 5^乙一醇化之葡糖腦苷脂酶和聚乙二醇化之血紅素 φ 已經在進行臨床前測試。其他的實例是聚乙二醇化之比- ό ’ EF 0 442 724，標題為 f’經過修改之 (Modified hIL-6)”，其揭示將聚（乙二醇）分子加至比_6。其他已經以化學方式修改的特定治療性蛋白質，是粒性細胞菌落刺激因子（G-CSF)。G-CSF誘導嗜中性粒性細胞的快速增殖，並釋放至血流中，藉此在對抗感染時提供治療影響。1990年12月12日發表之歐洲專利公開案Ep 〇 4〇1 3 84，標題為”以化學方式修改之粒性細胞菌落刺激因子 (Chemically Modified Granulocyte Colony Stimulating 124799.doc -10 - 200812610

Factor) ’描述製備與聚（乙二醇）分子附接之g_csf的材料和方法。在1992年3月4日發表之歐洲專利〇 473 268，標題為連續釋放之醫藥組合物，包括與水溶性聚合物共價共輕之多肤（C〇minuous Release Pharmaceutical Compositions

Comprising a Polypeptide Covalently Conjugated T〇 A Water Soluble P〇lymer)”中亦報告經過修改之G-CSF及其類似物，開始使用各種與水溶性顆粒聚合物共價共軛的G_ CSF和衍生物，如聚（乙二醇）。在1989年1〇月4曰發表之歐洲專利0 335 423中，報告了具有人類粒性細胞菌落刺激因子/舌性的經過修改之多肽。在美國專利第5,824,784號中提供在N-終端修改蛋白質或其類似物的方法，以及所得的組合物，包括新穎的在N-終端以化學方式修改之〇481?組合物。美國專利第5,824,778號則揭示以化學方式修改之G-CSF 〇關於聚（乙二醇），已經使用各種方法將聚（乙二醇）分子與蛋白質附接。通常，經由在蛋白質上找到的反應基團將聚（乙二醇）分子與該蛋白質連接。胺基基團，像是在離胺酸殘基或在N_終端上的那些，對這類附接是很方便的。例如，Royer (美國專利第4,〇〇2,531 號，在上）陳述使用還原性烷化作用，將聚（乙二醇）分子附接至酵素。Chamow等人，Bioconjugate Chem. 5 : 133-140 (1994)報告經由還原性烷化作用，以單曱氧基聚（乙二醇）酐修改CD4免疫黏附素（immunoadhesin)。作者報告在容許控制整個聚乙二醇化作用程度的條件下，5〇%的〇1)4_1§被 124799.doc 11 200812610

MePEG-修改。同一書，在第137頁。作者亦報告了經過修改之CD4-Ig在活體外（對蛋白質gp 120)之結合能力的降低比率，與單甲氧基聚（乙二醇）化作用的程度有關聯，在同一書中。1990年2月27發證之Shaw的美國專利第4,904,584 號，係關於在蛋白質中離胺酸殘基之數目的修改，以便經由反應性胺基基團附接聚（乙二醇）分子。 WO 93/00109係關於刺激哺乳動物或鳥類之GH反應性組織的方法，包括維持連續、有效之血漿GH濃度3或更多天。陳述一種達成這類血漿濃度的方法是藉著使用與大分子物質，如PEG (聚乙二醇）偶連的GH。陳述與大分子物質偶聯，導致改善的半衰期。已經在WO 93/00109中報告了使用mPEG醛-5 000和mPEGN-羥基琥珀醯亞胺基酯（mPEG-NHS-5000) PEG化的人類生長激素。使用mPEG-NHS結果產生hGH之多重PEG化形式的異質混合物。WO 93/00109 亦揭示使用mPEG-順丁烯二醯亞胺PEG化半胱胺酸hGH變體。 WO 99/03887揭示PEG化之半胱胺酸變體生長激素。命名為BT-005，提出該共軛物在刺激生長激素缺陷大鼠增重方面是更有效的，且具有比hGH更長的半衰期。在Clark等人中報告了 PEG化之人類生長激素，其使用羧曱基化之PEG的琥珀醯亞胺g旨（Journal of Biological Chemistry 271 : 21969-21977，1996)。Clark等人描述了使用mPEG-NHS-5000增加尺寸的hGH衍生物，其選擇性地與一級胺共軛。增加PEG修改的層次，降低對其受體的親和 124799.doc •12- 200812610 ‘ 力，並在以細胞為基礎之測定中增加EC5〇南達1 500倍。

Olson等人，Polymer Preprints 38 : 568-569，1997揭示使用 N-羥基琥珀醯亞胺（NHS)(PEG)和丙酸琥珀醯亞胺酯（SPA) PEG，完成多重PEG化之hGH物種。 WO 94/20069預言性地揭示PEG化之hGH，成為肺臟遞送之調配物的一部分。美國專利第4，179,337號揭示PEG化之酵素和激素，獲得具有生理活性的非-免疫原、水溶性多肽共輛物的方法。 _ 為了舉例說明欲PEG化的激素而提及GH。歐洲專利458064 A2揭示在生長激素中導入或天然存在之半胱胺酸殘基的PEG化作用。歐洲專利458064 A2更提及在稱為Ω環之環中插入兩個半胱胺酸殘基，敘述係位在野外型牛生長激素中殘基102-112處，更特定而言，歐洲專利458064 A2揭示分別在牛生長激素之編號102和112的殘基處，從Ser至Cys和Tyr至Cys的取代。 _ WO 95/11987提出將PEG附接至出現在親代分子中或藉著指定位置之突變生成作用併入的半胱胺酸殘基之硫代基團上。WO 95/11987係關於蛋白酶連接素-1的PE化作用，然而，同樣提出hGH及其他蛋白質的一般PEG化作用。 WO 99/03887揭示，例如藉著插入額外的cys 25絲胺酸殘基，並將PEG附接至導入之半胱胺酸殘基，來修改的生長激素。

WO 00/42175係關於製造含有用以附接PEG之自由半胱胺酸殘基之蛋白質的方法。WO 00/42175揭示下列的hGH 124799.doc •13- 200812610 Λ , 突變蛋白：T3C、S144C和T148C，以及其半胱胺酸PEG化作用。 WO 97/11178 (以及美國專利第5849535號、美國專利第 6004931號和美國專利第6022711號）係關於使用GH變體，如hGH之激動劑或拮抗劑。WO 97/11178亦揭示hGH之PEG 化作用，包括離胺酸PEG化作用，以及離胺酸的導入或置換（例如 K168A 和 K172R)。WO 97/11178 亦揭示 G120K 之取代作用。 ® WO 03/044056揭示各種PEG化之hGH物種，包括分支的 40K PEG醛hGH共軛物。 PEG化之hGH的先前報告需要附接多個PEGs，其結果產生不想要的異質性，達到比所描述之腎臟過濾之70K分子量截止更大的流體動力學體積（Knauf，M. J.等人，J. Biol. Chem· 263 ·· 15064-15070, 1988) 〇目前為了長期治療，投與rhGH是每天的，並因此極希 I 望更低頻率的投藥。具有較長循環半衰期之hGH分子將降低必要的投藥次數，且可能提供更佳的治療hGH水準，伴隨著促進治療效果。不管許多嘗試PEG化hGH，仍對具有適當特性，成為可行商品之PEG化hGH分子有不適當的需要。本發明提供 PEG_hGH共軛物，具有單一PEG優先附接在hGH的N·終端苯丙胺酸處。使用已經在WO 93/00109，Clark等人 (Journal of Biological Chemistry 271 : 21969-21977，1996) 和 Olson等人（Polymer Preprints 38 : 568-569，1997)中描述 124799.doc -14- 200812610 的mPEG醛-5000或mPEG N-羥基琥珀醯亞胺酯（mPEG-NHS-5000)，將多個低分子量（5Kd)的PEGs附接在α-或ε -胺基位置（在hGH中之Ν-終端和9離胺酸）。這結果是異質的族群。因為說明hGH帶有9個離胺酸，可能有一些分子有 10個PEGs附接，一些有9個，一些有8個’ 一些有7個，一些有6個，一些有5個，一些有4個，一些有3個，一些有2 個，一些有1個而一些有0個。且在有數個的分子中，PEG 可能並沒有附接在不同分子的相同位置上。當發展治療產物時，該所得的異質性是不利的，使共軛、純化及定出特徵變得困難、昂貴且為高度不可逆的。其他的方法（WO 00/421 75)已經使用含有可供與PEG附接之自由半胱胺酸殘基的hGH變體。然而，該方法可導致錯誤摺疊的蛋白質，具有錯誤配對的二硫鍵，而結果是異質的PEG化產物，其具有附接在一些或全部半胱胺酸上的PEG。在多個位置有多個PEGs附接，可能導致分子在PEG與各種位置之間有較不穩定的結合，其可變成以不同的速率解離。這使其不易精確地預測產物的藥物動力學，結果不正確地給藥。在獲得治療性產物的管理批准時，異質的產物亦具有不想要的問題。因此，將希望有具有附接在單一位置之單一 PEG的PEG 化hGH分子。本發明以許多方式解決該需求。【發明内容】本發明係關於以化學方式修改的hGH及其激動劑變體，其具有至少一個改良的化學或生理學特性，選自但不限於 124799.doc -15- 200812610 - 降低清除率、增加血漿滯留期間、增加穩定性、改善溶解度和降低抗原性。因此，如同在下文中更詳細的描述，本發明具有許多方面是關於以化學方式修改之多肽，包括但不限於hGH及其激動劑變體，以及使用聚（乙二醇）丁醛部分的特定修改。本發明亦關於產生以化學方式修改之hGH及其激動劑變體的方法。特定而言，本發明係關於使用丁醛，產生以化學方式修改之hGH的方法，結果產生較大的附接之N-終端 • 選擇性。本發明亦關於包括以化學方式修改之hGH及其激動劑變體’單獨或與其他治療劑混合的组合物。本發明亦關於本發明之以化學方式修改的hGH及其激動劑變體，單獨或與其他治療劑混合，在預防及/或治療其中GH治療有效之病症及/或疾病上的用途。【實施方式】 _ hGH及其激動劑變體是在美國專利第4,658,021號（甲硫胺酿基人類生長激素-Met-1-191 hGH)和美國專利第 5,633,352號中描述之重組蛋白質家族的成員。在美國專利第 4,342,832 號、4,601，980 號；美國專利第 4,898,83〇號；美國專利第5,424，199號和美國專利第5,795,745號中描述了其重組產生和使用方法。可在本發明中使用任何經過純化或分離的hGH或其激動劑變體’其藉著諸如大腸桿菌之類的宿主細胞，以及藉著使用重組遺傳技術轉化或轉移感染之動物細胞來產生。在 124799.doc -16- 200812610

1992年6月11曰發表之美國專利第6，143,523號和w〇 92/09690中描述了額外的hGH變體。其中，藉著經過轉化之大腸桿菌產生之hGH或其激動劑變體是特佳的。可大量獲得高純度和同質性的這類hGH或其激動劑變體。例如，可根據在美國專利第4,342,832號、4,601，980號，·美國專利第4,898,830號；美國專利第5,424，199號和美國專利第 5,795,745號中揭示的方法製備上文的hGH或其激動劑變體。”實質上具有下列之胺基酸序列，，一詞意指上文的胺基酸序列可能包含一或多個胺基酸改變（刪除、添加、插入或置換）'，只要這類改變對hGH或其激動劑變體不引起任何不利的功能非-類似性。更佳的是使用hGH或其激動劑變體，實質上具有其中包括至少一個離胺酸、天冬胺酸、榖胺酸、不成對的半胱胺酸殘基、自由的仏終端心胺基基團或自由的C-終端羧基基團的胺基酸序列。當在本文中使用時，"hGH多肽或hGH蛋白質”一詞包括所有的hGH多肽，較佳的是得自哺乳動物物種，更佳的是得自人類和老鼠物種，以及其變體、類似物、直系同源基因（orthologs)、同系物和衍生物，及其片段，其特徵在於在生長期I進生長’ 1維持正常體組成、纟成代謝和脂質代謝。較佳的是，"hGH多肽或蛋白質"一詞意指SEQ m NO : 1的hGH多肽，及其變體、同系物和衍生物，基本上顯示出相同的生物活性（在生長期促進生長，並維持正常體組成、合成代謝和脂質代謝）。更佳的是，，，hGH多肽或蛋白質，，一詞意指SEQ ID NO : 1之多肽。 124799.doc -17- 200812610 . 當在本文中使用時，"hGH多肽變體”一詞意指得自相同物種’但與參考hGH多肽不同的多肽。一般而言，差異是有限的’使得參考和變體的胺基酸序列整體是極為類似的’且在許多區域是相同的。較佳的是，hGH多肽與參考 hGH多肽，較佳的是seq ID NO ·· 1之hGH多肽，是至少 70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%相同的。具有與問題胺基酸序列至少例如95%"相同"之胺基酸序列的多肽，企圖使該主題多肽之胺基酸序列是與問題序列相 ® 同的’除了主題多肽序列在問題胺基酸序列之每100個胺基酸中可包括高達5個胺基酸改變。參考序列的這些改變可發生在參考胺基酸序列的胺基或羧基終端位置，或在這些終端位置之間的任何地方，個別地散布在參考序列中的殘基中’或在參考序列内的一或多個相鄰集團中。問題序列可以是參考序列的完整胺基酸序列，或根據在本文中指定的任何片段。 φ 這類h(}H多肽變體可以是天然存在的變體，如藉著數個 hGH改變形式之一編碼的天然存在之對偶基因變體，佔據在生物之染色體上的特定位點，或由起源自單一原始轉錄本的天然存在之接合變體編碼的同功型。或者，hGH多肽變體可以是不知道是天然存在的，並可使用此項技藝中已知之突變生成技術製造的變體。在此項技藝中已知可從具有生物活性之肽或蛋白質的N_ 終端或C-終端刪除一或多個胺基酸，實質上不會喪失生物功能（參見例如 Ron 等人（1993)，Bi〇1 Chem，268 2984_ 124799.doc -18- 200812610 • 2988 ;將其揭示内容全部以引用的方式併入本文中）。熟請此藝者亦將承認可改變hGH多肽的一些胺基酸序列’而對蛋白質之結構或功能沒有重大的影響。這類突變種包括刪除、插入、倒位、重複和取代，根據此項技藝中已知的普通規則來選擇，以致於對活性有極少的影響。例如’在Bowie 等人（1990)，Science 247: 1306-1310 中提供了關於如何製造在表現型上靜默（silent)之胺基酸取代的指導，全部以引用的方式併入本文中，其中作者指出有兩種 _ 研究胺基酸序列對改變之容忍性的主要方法。第一種方法依賴進化的過程，其中突變被天擇接受或拒絕。第二種方法使用遺傳工程，在選殖之hGH的特定位置導入胺基酸改變，並選擇或筛選以便確認維持功能性的序列。這些研究已經顯示蛋白質對胺基酸改變是驚人地寬容。作者更進一步指出胺基酸改變在蛋白質的某些位置可能是容許的。例如，埋在最裡面的胺基酸殘基需要非極性 _ 側鏈，而通常保留表面側鏈的少數特徵。在Bowie等人 (1990)在前，以及在本文中提及之參考文獻中，描述了其他這類在表現型上的靜默取代。通常將在脂肪族胺基酸Ala、Va卜Leu和Phe中的彼此置換；羥基殘基Ser和Thr的交換，酸性殘基Asp和Glu的交換’在醯胺殘基Asn和Gin之間的取代，鹼性殘基Lys和Arg 的交換，以及在芳香族殘基Phe、Tyr中的置換視為保留性置換。此外，下列集合之胺基酸通常代表相等的改變··（1)

Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gin、Asn、Ser、Thr ; (2) 124799.doc -19- 200812610 瓤 • Cys、Ser、Tyr、Thr ; (3) Val、lie、Leu、Met、Ala、 Phe ; (4) Lys、Arg、His ; (5) Phe、Tyr、Trp、His。 hGH多肽一詞亦包括所有由hGH類似物、直系同源基因及/或物種同系物編碼的hGH多肽。當在本文中使用時，n hGH類似物"一詞意指不同和無關生物的hGHs，其在每個生物中執行相同的功能，但並非起源自該生物們之祖先共有的祖先結構。類似的hGHs改而個別地產生，並隨後演化以便執行相同的功能（或類似的功能）。換句話春說’類似的hGH多肽是具有相當不同胺基酸序列的多肽，但執行相同的生物活性，即在生長期促進生長，並維持正常體組成、合成代謝和脂質代謝。當在本文中使用時， "hGH直系同源基因”一詞意指在兩個不同物種内的hGHs，該序列經由在祖先物種中之共同的同系hGH而彼此相關，但已經演化而成為彼此不同的σ當在本文中使用時， nhGH同系物’·一詞意指不同生物的hGHs，其在每個生物中 φ 執行相同的功能，並起源自該生物們之祖先共有的祖先結構。換句話說，同系的hGH多肽是具有相當類似之胺基酸序列的多肽，其執行相同的生物活性，即在生長期促進生長，並維持正常體組成、合成代謝和脂質代謝。較佳的是，可將hGH多肽同系物定義為對參考hGH多肽，最好是 SEQ ID NO: 1之hGH多肽顯露出至少4〇%、5〇% 6〇%、 70%、8〇%、90%、95%、96%、97%、㈣或㈣同一性的多肽。目此’根據本發明之hGH多肽可以是例如：⑴其中以保 124799.doc •20· 200812610 留性或非-保留性之胺基酸殘基（最好是保留性胺基酸殘基）取代一或多個胺基酸殘基的hGH多肽，且這類經取代之胺基酸殘基可以是或可以不是由遺傳密碼編碼的；或（H)其中一或多個胺基酸殘基包括取代基的hGH多肽；或（iii)其中該hGH多肽與其他化合物融合的hGH多肽，如增加該多肽之半衰期的化合物（例如聚乙二醇）；或（iv)其中額外的胺基酸與上述形式之多肽融合的hGH多肽，如igG Fc融合區肽或前導或分泌序列，或用來純化上述形式之多肽或前-蛋白序列的序列。 hGH多肽可以是單體或多聚體。多聚體可以是二聚體、二聚體、四聚體，或包括至少5個單體多肽單元的多聚體。多聚體亦可以是同種二聚體或異種二聚體。本發明之多聚體可能是忌水性、親水性、離子及/或共價結合的結果’並/或可間接連接，藉著例如微脂粒形成。在一個實例中，在含有hGH多肽或其片段之融合蛋白中，含有在異種序列之間的共價結合（參見，例如美國專利第5,478，925 號’將其揭示内容全部以引用的方式併入本文中）。在其他κ例中’可經由肽交聯劑，如在美國專利第5,〇73,627號中描述的那些（以引用的方式併入本文中），將hQH多肽或其片段與一或多個多肽連接，該多肽可以是hGH多肽或異種夕肽。其他製備多聚體hGH多肽的方法涉及使用與亮胺 I拉鍊或異亮胺酸拉鍊多肽序列融合的hGH多肽，已知其、蛋白貝的多I化作用（nuiitimerization)，其中使用熟。曰此藝者已知的技術發現它們，包括WO 94/10308之技 124799.doc -21 - 200812610 秦 • 術。在其他的實例中，可藉著在在含有Flag®多肽序列之融合hGH多肽中所含有的Flag®多肽序列之間的交互作用，連接hGH多肽。亦可使用此項技藝中已知的化學技術，產製hGH多聚體，如使用交聯劑分子之交聯作用，以及此項技藝中已知的交聯劑分子長度最優化技術（參見，例如美國專利第5,478,925號），在位在欲納入多聚體中之多肽序列内的半胱胺酸殘基之間形成一或多個分子間交聯的此項技藝中已知之技術（參見，例如美國專利第5,478,925號），春在hGH多肽之C終端或N_終端加入半胱胺酸或生物素，以及產製含有一或多個這些經修改多肽之多聚體的技術（參見’例如美國專利第5,478,925號），或30種產製含有hGH 多聚體之微脂粒的任何技術（參見，例如美國專利第 5,478,925號）’將其揭示内容全部以引用的方式併入本文中。當在本文中使用時，”hGH多肽片段”一詞意指包括hGH 鲁夕肽’最好疋SEQ ID NO : 1之多肽的一部分胺基酸序列之相鄰跨距的任何肽或多肽。更特定而言，hGH多肽片段包括根據本發明之多肽的至少6個，較佳的是至少8至1 〇個，更佳的是丨2、〗$、 20、25、30、35、40、50、60、75、1〇〇、125、150、 175、191個連續胺基酸。可額外地將hGH多肽片段描述為 hGH多肽的亞-屬，包括至少6個胺基酸，其中將"至少6個” 定義為在6和代表hGH多肽（包括SEQ ID NO ·· 1之多肽）的 c-終端胺基酸之整數之間的任何整數。更包括hGH多肽片 124799.doc -22- 200812610 段的物種’長度至少6個胺基酸，按照上述，就其N_終端和C-終端位置進一步指定。”hGH多肽片段” 一詞亦包括個別的物種’為長度至少6個胺基酸的所有hGH多肽片段，按照上述’可藉著N-終端和C-終端位置更特別地指定。也就疋說’在列舉或屬於本發明之序列的任何特定胺基酸序列上’長度至少6個相鄰胺基酸殘基之片段可佔據的N•終端和C-終端位置的每個組合，均納入本發明中。應注意本發明之多肽片段的上述物種，可藉著式"&至b，，另行說明；其中"a”等於多核苷酸之最靠終端的胺基酸位置，而等於最靠c-終端的胺基酸位置；且其中更進一步"a"等於在1與hGH多肽序列之胺基酸數目減6之間的整數，且其中”b”等於在7與hGH多肽序列之胺基酸數目之間的整數；且其中，，a”為比”b”小至少6的整數。可使用以上的說明’立刻預見以上的hGH多肽片段，並因此不個別地單獨列舉，以免不必要地延長本說明書。此外，以上的片段不一定需要具有hGH生物活性，雖然具有這些活性的多肽是本發明較佳的具體實施例，因為它們在例如免疫測定、抗原決定位作圖、將抗原決定位附貼標籤、作為疫苗，以及作為分子量標記上將是有用的。亦可使用以上的片段，對多肽的特定部分產製抗體。 ” hGH多肽片段”一詞亦包括hGH多肽的功能部位。這類功能部位最後可包括直線或結構的基序和簽名，包括作不限於亮胺酸拉鍊、螺旋-轉-螺旋架構、轉譯後修改位置，如糖基化作用位置、泛素化位置、α螺旋和P片，編碼作號 124799.doc .93- 200812610 . 肽的信號序列，其指揮編碼蛋白質的分泌，涉及轉錄調節的序列，如同源異形盒、酸性延伸股、酵素活性位置、受質結合位置和酵素切開位置。這類功能部位可提供特殊的生物活性，如DNA或RNA-結合、蛋白質之分泌、轉錄調節、酵素活性、受質結合活性等等。功能部位具有通常包括在3到191個胺基酸之間的尺寸。在較佳的具體實施例中，功能部位包括數目在6到191之間的任何整數的胺基酸。可使用熟諳此藝者已知的任何方法 • 來合成功能部位，包括在本文中揭示關於製備hGH多肽的那些，來產生抗-hGH抗體。判定構成具有特殊生物活性之功能部位的胺基酸的方法，包括判定待測試之生物活性的突變生成研究和測定。在本發明之前後文中特佳的片段是保留重大生物活性的 hGH多肽，即在生長期促進生長，並維持正常體組成、合成代謝和脂質代謝。或者，可使用任何熟諳此藝者已知的電腦，在資料庫中 ^ 針對基序、功能部位及/或簽名審查本發明之多肽。可搜尋的資料庫包括 Prosite (Hofmann等人，（1999) Nucl. Acids Res. 27 : 215-219 ; Bucher和 Bairoch (1994) Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology· Altman 等人編輯，第 53-61 頁， AAAIPress，Menlo Park)、Pfam (Sonnhammer等人，（1997) Proteins 28(3) : 405_20 ; Henikoff等人，（2000) Nucleic Acids Res. 28(1) : 228-30 ; Bateman等人，（2000) Nucleic 124799.doc -24- 200812610

Acids Res. 28(1): 263-6)、Blocks (Henikoff等人，（2000) Electrophoresis 21(9) : 1700-6)、Print (Attwood 等人， (1996) Nucleic Acids Res. 24(1) · 182-8) Λ Prodom (Sonnhammer和 Kahn (1994) Protein Sci. 3(3) : 482_92 ; Corpet 等人（2000) Nucleic Acids Res. 28(1) : 267-9)、 Sbase (Pongor 等人（1993) Protein Eng. 6(4) : 391-5 ; Murvai等人，（2000) Nucleic Acids Res. 28(1): 260-2)、 Smart (Schultz等人，（1998) Proc. Natl· Acad· Sci. USA 95, 5857-5864)、Dali/FSSP (Holm 和 Sander (1996) Nucleic Acids Res. 24(1) : 206-9 ; Holm和 Sander (1997) Nucleic Acids Res. 25(1) : 231-4 ; Holm和 Sander (1999) Nucleic Acids Res. 27(1) ·· 244-7)、HSSP (Sander 和 Schneider (1991) Proteins 9(1) : 56-68)、CATH (Orengo等人，（1997) Structure 5(8) : 1 〇93_ 108 ; Pearl 等人，（2000) Biochem· Soc· Trans. 28(2) : 269-75)、SCOP (Murzin等人，（1995) J. Mol· Biol· 247(4) : 536-40 ; Lo Conte等人，(2000) Nucleic Acids Res· 28(1) ·· 257-9)、COG (Tatusov 等人，（1997) Science 278，631 : 637 ; Tatusov 等人，（2000) Nucleic Acids Res. 28(1) : 33-6)、特定家族之資料庫及其衍生物 (Nevill-Manning等人 ’（1998) Proc· Natl. Acad. Sci· USA 95，5865-5871 ; Y〇na等人，（1999) Proteins 37(3) ·· 360-78 ; Attwood等人，（2000) Nucleic Acids Res· 28(1) : 225-7)，分別將其揭示内容全部以引用的方式併入本文中。至於可獲得之資料庫的回顧，參見Nucleic Acid Research 124799.doc -25- 200812610 • (2GGG)之28冊第1期，將其揭示内容全部以引用的方式併入本文中。 hGH夕肽片^又’ 一詞亦包括攜帶抗原決定位的片段。這些抗原決定位可以是抗原性的抗原決定位，或抗原性之抗原决定位# t疫原性之抗原決定位兩者m疫原性的抗原決定位定義為蛋白質的一部分，當該多肽是免疫原時，其在活體内誘發抗體反應。另一方面，將多肽中與抗體結合的區域定義為抗原性之抗原決定位。抗原決定位在空間 > 構形上，可包括3個胺基酸那麼少，其為抗原決定位所特有的。抗原決定位通常由至少6個這類的胺基酸所組成，而更常見的是至少8-10個這類胺基酸。根據本發明之攜帶hGH抗原決定位的片段可以是任何片段，其長度在6個胺基酸到hGH多肽之全長序列之間，較佳的是在6到5 0個胺基酸之間的片段。可按照上述，藉著相鄰胺基酸殘基的數目（按照亞_屬），或藉著特定之N-終端 _ 和C-終端位置（按照物種），指定攜帶抗原決定位的片段。可藉著任何傳統的方法，產生功能如同抗原決定位的片段（參見’例如 Houghten (1985)，Proc. Natl. Acad. Sci· USA 82 : 5131-5135，以及美國專利第號，將其揭示内容全部以引用的方式併入本文中）。判定構成抗原決定位之胺基酸的方法，包括X-射線結晶術、二維核磁共振和抗原決定位作圖，例如由Geysen 等人，（1984)，Proc·Natl·

Acad. Sci· USA 81 : 3998-4002 ; PCT公開案 WO 84/03564 和WO 84/03506描述的pepSCan法，將其揭示内容全部以引 124799.doc -26- 200812610 « . 用的方式併入本文中。其他實例為Jameson和Wolf，（1988)， <3〇111卩.八卩卩1.61〇8(^.4:181-186的演算法（全部以弓|用的方式併入本文中）。可使用例如電腦程式PROTEAN，使用預設參數（Windows 4.0版，DNASTAR. Inc.)，進行 Jameson-Wolf抗原分析。本發明亦提供按照上述由N-終端和C-終端位置指定之任何hGH片段物種，或由胺基酸殘基之尺寸指定的任何片段亞-屬的排除。可排除數個按照上述藉著N-終端和C-終端 • 位置，或藉著胺基酸殘基之尺寸指定的片段為個別的物種。本發明亦提供以相同的方式，排除任何hGH功能部位或攜帶抗原決定位之片段。可使用熟諳此藝者已知的技術，以任何適當的方式製備本發明之hGH多肽，如從天然來源中純化、以化學方式合成、藉著重組技術產生（包括在活體外的轉譯技術），或在能夠表現hGH cDNA的重組細胞中表現hGH多肽及其片段，或這些方法的組合（參見，例如純化蛋白質之各種方法的"酵素學方法（Methods in Enzymology)，Academic Press，1993" ; Creighton，(1983)蛋白質：結構和分子原則 (Proteins ： Structures and Molecular Principles), W.H. Freeman & Co，第2版，T.E·，New York ;以及關於蛋白質之化學合成的 Hunkapiller 等人，（1984) Nature. 310 (5973) : 105-11，和關於重組技術的Davis等人（1986)分子生物學的基本方法（Basic Methods in Molecular Biology)，編輯Elsevier Press，NY，將其揭示内容全部以引用的方式 124799.doc -27- 200812610 _ * 併入本文中）。本發明之多肽最好是以經過分離之形式提供，並可以部分是或最好是實質上經過純化的。 Π與參考多核苷酸具有至少X%同一性的多核苦酸”和”與參考多肽具有至少X%同一性的多肽” 一詞，包括其殘基（分別為核苷酸或胺基酸）序列顯示出按照定義，分別與參考多核苷酸或多肽序列相比較，低於、等於或高於X之同一性百分比的多核苦酸或多狀。在兩個多核苷酸或多肽序列在比較窗上的最佳排列之 _ 後，判定同一性百分比，其中在比較窗中多核苷酸或多肽的部分可包括一或多個殘基的添加或刪除，以便充分運用序列排列。比較窗含有某個數目的位置（殘基或相當於殘基之插入/刪除的間隙），該位置數目相當於窗的大小。每個窗位置可出現下列的狀況之一： 1°/在第一個排列序列上的該位置上有一個殘基（核苷酸或胺基酸），而在第二個排列序列上之相同位置上有不同 Φ 的殘基，換句話說，第二個序列與第一個序列相比較，在該位置有經取代的殘基。 2 V在第一個排列序列上的該位置上有一個殘基（核苷酸或胺基I)，而在第二個排列序列上之相同位置上有相同的殘基。 3V在第一個排列序列上的該位置上有一個殘基（核普酸或胺基酸）’而在第二個排列序列上之相同位置上沒有殘基，換句話說’第二個序列與第一個序列相比較，在該位置出現刪除。 124799.doc -28- 200812610 • 在比較窗中的位置數目屬於上文定義之第一類的稱為 R1 〇在比較窗中的位置數目屬於上文定義之第二類的稱為 R2。在比較窗中的位置數目屬於上文定義之第三類的稱為 R3 〇可藉著任何下列的公式來計算同一性百分比（％id): %id=R2/(Rl+R2+R3)xl00，或鲁％id=(R2+R3)/(Rl+R2+R3)xl00。可使用任何此項技藝中已知的各種序列比較演算法和程式，進行欲比較之序列的排列。這類演算法和程式包括，但不限於 TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA、 FASTDB、WU-BLAST、Gapped-BLAST、PSI-BLAST (Pearson和 Lipman，（1988)，Proc· Natl· Acad· Sci· USA 85 : 2444-2448 ; Altschul等人，（1990)，J. Mol. Biol· 215 : 403-410 ; Altschul等人，（1993)，Nature hGHtics 3 : 266-272 ; 修 Altschul等人，（1997)，Nuc. Acids Res. 25 : 3389-3402 ;

Thompson等人，（1994)，Nuc. Acids Res. 22 : 4673-4680 ; Higgins 等人，（1996)，Meth. Enzymol. 266 ： 383-402 ； Brutlag等人（1990) Comp. App· Biosci. 6 ·· 237-245 ; Jones 和 Swindells，（2002) Trends Biochem Sci 27 : 161-4 ; Olsen 等人（1999) Pac Symp Biocomput，302-13)，將其揭示内容全部以引用的方式併入本文中。在特殊的具體實施例中，使用Smith-Waterman法與計分 124799.doc -29- 200812610 1、 , 矩陣，如PAM、PAM 250或更佳的是BLOSUM矩陣，如 BLOSUM60或BLOSUM62，以及預設參數（間隙開口罰點 =10，且間隙延伸罰點=1)，或利用使用者-指定之參數，最好大於預設參數。在其他特殊的具體實施例中，使用基本局部排列搜尋工具（Basic Local Alignment Search Tool)(’’BLAST”）程式與預設參數，或利用使用者提供之經過修改的預設參數，排列蛋白質和核酸序列。較佳的是，所使用之計分矩陣是 • BLOSUM62矩陣（Gonnet等人，(1992)，Science 256 : 1443- 1445 ; Henikoff和 Henikoff，（1993)，Proteins 17 : 49-61，將其揭示内容全部以引用的方式拚入本文中）。較差的是，亦可使用PAM或PAM250矩陣（參見，例如Schwartz和 Dayhoff，(1978)編輯，檢測距離關係的矩陣··蛋白質序列和結構的圖冊（Matrices for Detecting Distance Relationships : Atlas of Protein Sequence and Structure), Washington ： National Biomedical Research Foundation，將其揭示内容全部以引用的方式併入本文中）。在另一個特殊的具體實施例中，使用以Brutlag等人 (1990)，在前之演算法為基礎的FASTDB電腦程式，將多核苷酸或多肽序列排成一直線。在DNA序列之FASTDB演算法中所使用的較佳參數為：矩陣=一元的，k_元魬 (tuple)=4，誤配罰點=1，連接罰點=30，隨機組長度=0，截止分數=1，間隙罰點=5，間隙尺寸罰點=0.05，窗尺寸 = 500或主題核苷酸序列的長度，較短的那一個。在 124799.doc -30- 200812610 普 FASTDB胺基酸排列中所使用的較佳來書· 乂双疋•矩陣=PAm 二，匕元組=2,誤配罰點=1，連接罰點=2〇，隨機組25長度 =0，戴止分數=1，窗尺寸=序列長度，間隙罰點y，間隙尺寸罰點=0.05，窗尺寸=500或主題胺基酸序列的長度，較短的那一個。根據本發明，經由hGH或其激動劑變體之胺基酸殘基，共價結合聚（乙二醇）。具有一些不同官能基、交聯劑、組態和分子量之各種激活的聚（乙二醇）們為熟諳此藝者已知籲的，其可用來創造PEG-h(m共軛物或PEG_hGH激動劑變體共軛物（關於回顧，參見Roberts M.J·等人，Adv. Drug Del. Rev· 54 : 459-476, 2002 ; Harris J.M·等人，Drug Delivery Systems 40 : 53 8-551，2001)。本發明係關於使用酸化學，使用丁醯酸交聯劑部分，使PEG部分指向N-終端之選擇性的方法。丁醢酸交聯劑與乙駿交聯劑相比較，結果增加了 N-終端的專一性(表1和圖1)。 _ 本發明之具體實施例是具有式I或式II之結構的人類生長激素_PEG共軛物〇

II

mPEG-〇—C-NH ch2 h2c h2c ch2

H JH、H

mPEG-〇—C—N C~N—(CH2CH20)n(CH2)mCH2-NH-R

Η II

式I 124799.doc -31- 200812610 Vi 或

mPEG-0(CH2CH20)n(CH2)mCH2-NH-R

式II 其中n為在1到10之間的整數； m為在1到10之間的整數； R為人類生長激素，甲硫胺醯基生長激素或人類生長激素變體。在特妹的具體實施例中，η在1到5之間，且瓜在^彳^之間。在式I之特殊的具體實施例中：η為為1 ; 11為1且瓜為2 ; η為1且m為3 ; η為1且m為4 ; n為1且瓜為5 ; n為丨且瓜為6 ; η為1且m為7 ; 4丨且4 1JLm為9 ; 為以瓜為10 ; η為2且m為1 ; n為2且m為2 ; n為2且m為3 ; 且 m為4 ; n為2且m為5 ; η為2且m為6 ; n為2且m為7 ; 且 hi為8 ; n為2且m為9，· η為2且m為10 ; n為3且且m為2 ; n為3且m為3 ; η為3且m為4 ; η為3JLm為5 ; n為3 且m為6 ; η為3且m為7 ; η為3且m為8 ; η為3且m為9 ; η為3 且πι為1〇 ; η為斗且㈤為i ; η為4且瓜為2 ; η為纽拉為3 ; η為 4且111為4 ; 11為4且m為5 ; η為4且m為6 ; η為4且m為7 ; η為 4且m為8 ; η為4且m為9 ; η為4且m為10 ; η為5且m為1 ; η 為5且m為2 ; η為5且m為3 ; η為5且m為4 ; η為5且m為5 ; η 為5且m為6 ; η為5且m為7 ; η為5且m為8 ; η為5且m為9 ; η 為5且瓜為10 ; η為6且m為1 ; η為6且m為2 ; η為6且m為3 ; 124799.doc -32- 200812610 η為6且m為4 ; η為· 也r 马且瓜為5, n為6且m為6; n為 η為6且_8 ; ;福6且_ ι们福7且瓜為 1 ·; η為7且_2 ;…且瓜…；…且•福了且瓜為為且m為6，η為7且m為7; η為7且^^為“福以⑽為 9;福7且_1();福8且瓜以；為2; n為8且瓜為3 ; η為8且m為4 ; η為8且瓜為5 ;福8且瓜為6 ;福8且瓜

為7 ; η為8且m為8 ;福8且瓜為9 ;福8且_1();福9且 m為1，· η為9且!!1為2 ; n為9且43 ;瞒”—斗；福9且 m為5 ; η為9且m為6 ; n為9且瓜為7 ;福”㈤為8 ; n為9且 m為9 ; η為9且m為10 ; η為ΐ(^η^ ! ; η為1〇且m為2 ; η為 10且m為3 ; η為1〇且m為4 ; η為10且m為5 ; η為10且m為 ό ; η為10且m為7 ; n為⑺且㈤為^ ; η為10且m為9 ; η為10且 m 為 10。特定的具體實施例為人類生長激素-PEG共軛物，具有結構：〇

II mPEG—CT-C-NH CH2 h2c h2c 0 CH Η

mFEG-0—C—N〆、〇N—(CH，CH，0)4CH，CH2CH2CHr：NH-R H li - 或 124799.doc -33- 200812610

mPEG-0(CH2CH20)4CH2CH2CH2CHrNH-R 其中R為人類生長激素、曱硫胺醯基人類生長激素或人類生長激素變體。本發明其他特定的具體實施例是人類生長激素-PEG共軛物，其中該人類生長激素包括或由SEQ ID NO : 1之胺基酸序列所組成。本發明的特定具體實施例是人類生長激素-PEG共軛物，其中超過80%，更佳的是81%，更佳的是82%，更佳的是 83%，更佳的是84%，更佳的是85%，更佳的是86%，更佳的是87%，更佳的是88%，更佳的是89%，更佳的是90%，更佳的是91%，更佳的是92%，更佳的是93%，更佳的是 94%，更佳的是95%，更佳的是96%，更佳的是97%，且更佳的是98%的聚乙二醇與SEQ ID NO : 1之胺基酸序列的胺基-終端苯丙胺酸共軛。本發明其他特定的具體實施例是人類生長激素-PEG共軛物，其中超過90%的聚乙二醇與SEQ ID NO : 1之胺基酸序列的胺基-終端苯丙胺酸共軛。本發明其他特定的具體實施例是人類生長激素-PEG共軛物，其中超過95%的聚乙二醇與SEQ ID NO : 1之胺基酸序列的胺基-終端苯丙胺酸共軛。本發明其他特定的具體實施例是人類生長激素-PEG共軛物，其中超過98%的聚乙二醇與SEQ ID NO : 1之胺基酸序列的胺基-終端苯丙胺酸共軛。在本發明中使用的聚（乙二醇）不限於任何特殊的形式或 I24799.doc -34- 200812610 r . 分子量範圍。聚（乙二醇）分子量可以在大約500到大約 100,000道爾呑之間。”大約”一詞表示在製備聚乙二醇時，一些分子將比所陳述之分子量更重，一些則更輕，且所陳述之分子量意指平均分子量。當然有某些程度與聚合物，如聚（乙二醇）有關的多分散性。最好是使用具有低多分散性的PEGs。通常，使用具有大約500到大約60,000之分子量的PEG。本發明之特定PEG分子量範圍是從大約1，000到大約40,000。在其他特定的具體實施例中，PEG分子量是 • 超過大約5,000到大約40,000。在另一個特定的具體實施例中，PEG分子量大約20,000到大約40,000。亦可使用其他的尺寸，視想要之治療輪廓而定（例如想要之持續釋放的期間，（若有的話）任何對生物活性的影響，抗原性的程度或缺少，以及聚乙烯對治療蛋白質的其他已知影響）。例如，聚乙二醇可具有大約200、500、1000、1500、2000、 2500、3000 ' 3500、4000、4500、5000、5500、6000 > 6500 、 7000 、 7500 ' 8000 、 8500 、 9000 、 9500 、 10,000 、 10,500 ^ 11，000 、 11,500、 12,000、 12,500、 13,000 、 13,500、 14,000、 14,500 > 15,000、 15,500、 16,000、 16,500、 17,000 > 17,500、 18,000、 18,500、 19,000 > 19,500 > 20,000、 25,000 ^ 30,000 ^ 35,000 > 40,000、 45,000、 50,000、 55,000、 60,000 > 65,000 〜 70,000 - 75,000、80,000 ^ 85,000、90,000、95,000 或 100,000 道爾吞的平均分子量。在另一個具體實施例中，聚（乙二醇）是分支的peg，有 124799.doc -35- 200812610 ，一個以上的PEG部分附接（參見美國專利第5,932,462號；美國專利第5,342,940號；美國專利第5,643,575號；美國專利第5,919,455號；美國專利第6，113,906號；美國專利第 5，183,660 號；〖〇(1抑丫.^1〇(：〇1^1^16 0：1^11^^ 5:283- 288(1994);以及WO 02/09766。在較佳的具體實施例中，分支之PEG的每個聚（乙二醇）的分子量為大約5,〇〇〇_ 20,000。在特定的具體實施例中，分支之pEG的每個聚（乙二醇）的分子量為大約20,000。 # 聚（烯化氧）們’特別是聚（乙二醇）們，經由終端反應基團與hGH或其激動劑變體結合，其可以或可以不在pEG與蛋白質之間留下連接部分（間隔基）。為了形成本發明之 hGH共軛物或其激動劑變體，將聚合物，如聚（烯化氧）轉變為激活形式，該名詞本身為熟諳此藝者已知的。反應基團，例如是終端的反應基團，其調解在蛋白質上之化學部分與聚（乙二醇）之間的鍵結。通常，將終端聚合物羥基末 • 端·基團（即終端經基基團）之一或兩者，轉變為反應官能基，其容許共價的共耗作用。通常將該過程稱為"激活作用”，並在後文中將具有反應基團的聚（乙二醇）產物稱為 ”激活的.聚（乙二醇）"。在特定的具體實施例中，將一個终端：合物羥基末端-基團轉變'，或以非_反應基團加帽。在特定的具體實施例中，將一個終端聚合物經基末端·基圏 2變’或以甲基基團加帽。當在本文中使用時，"剛❼ 岡意指在一端以甲基基團加帽的pEG。在結構上可以 124799.doc -36 - 200812610 CH30- (CH2CH20)n—η 來表示mPEG。

將3有α和ε連接基團兩者的聚合物稱為"雙-激活的聚 (烯^氧），’，並稱為，，雙功能的”。有時將在終端經基上含有相同反應基團的聚合物稱為"同種雙功能的"或"同種雙-激活的"。有時將在_ ε終㈣基上含有不同反應基團的聚合物稱為"異種雙功能的”(參見，例如w〇 01/26692)或"異種雙·激活的"。冑含有單_反應基團的聚合物稱為”單-激活的"聚烯化氧或”單·功能的"。其他實質上低-抗原性的聚合物是類似"激活的”或"功能化的"。因此’激活的聚合物適合用來調解在蛋白質上之化學部分，如α -或ε -胺基、羧基或硫醇基團與聚（乙二醇）之間的鍵結。雙-激$之聚合物可以&方式肖兩㈣白質分子反應，或在另一個具體實施例中與一個蛋白質分子和一個

反應性小分子反應，經由交聯作用，有效地形成蛋白質聚合物或蛋白質-小分子共軛物。在本發明一個較佳的具體實施例中，使用hGH或其激動劑變體之離胺酸的N·終端α-胺基基團或胺基基團和激活之PEG，形成二級胺或醯胺鍵結。在本發明另一個較佳的觀點中，藉著還原性烷化作用，利用適當的還原劑，如 NaCNBH3、NaBH3、峨咬爛烷等等，按照在Ch_w等人 ’ Bioconjugate Chem. 5 : 133_140 (1994);美國專利第 4,002,531號，WO 90/05534和美國專利第5,824,784號中的描述’在hGH或其激動劑變體之N•終端一級^-或ε_胺基 124799.doc •37- 200812610 基團與單鏈或支鏈PEG醛之間形成二級胺鍵結。

在較佳的具體實施例中，最好有至少70%，較佳的是至少80% ’較佳的是至少8 1%，較佳的是至少82〇/❶，較佳的是至少83%，較佳的是至少84%，較佳的是至少85%，較佳的是至少86%，較佳的是至少87%，較佳的是至少 88%，較佳的是至少89% ,較佳的是至少9〇%，較佳的是至少91%，較佳的是至少92%，較佳的是至少93%，較佳的是至少94%，較佳的是至少95%，較佳的是至少，較佳的是至少97%，且最好是至少98%的聚（乙二醇）在胺基終端α -胺基基團上。共輛反應，稱為聚乙二醇化反應，在歷史上是在溶液中進行，利用莫耳過量的聚合物，且不管該聚合物將附接在蛋白負的何4然而，這類普通技術，通常已經證實對於將生物活性之蛋白質與低.抗原性聚合物共輛，同時仍保留足夠之生物活性是不充分的。_種維持咖或其激動劑變體生物活性的方法，眚所l 0> 實貝上疋避免那些hGH或其激動劑變體的反應基團在聚合物偶聯過程中與受體結合位置⑹ 結合。本發明的其他觀點是提供將聚（乙二醇）與應或其激動劑變體共軛’維持高水準之保留活性的製程。可在任何適當的條件 ^ 卜通吊為生物活性物質與激活之 I (乙二醇）之反應中所採的條件下，進行經由共價鍵的化予修改。在相對上較溫和的、、免使hGH或其激動劑變體” 仃-、&應’以避 ^ ^ ^ / 。溫和的條件包括將反應溶 /夜的pH值維持在3至1〇圍内’並將溫度維持在從大約 124799.doc -38- 200812610 0°-37°C的範圍内。在其中在hGH或其激動劑變體中之反應性胺基酸殘基具有自由胺基基團的案例中，最好是在適當之缓衝溶液（pH 3至10)的非限制性一覽表，包括磷酸鹽、 MES、檸檬酸鹽、乙酸鹽、琥珀酸鹽或HEPES中，在4。_ 37C下進行以上的修改丨_48小時。在以試劑，如ρΕ(}醛瞄準N-終鳊胺基基團時，最好維持在4_7下。可以或其激動劑變體之自由胺基基團數目的莫耳含量之大約〇 . 〇 ΐ loo倍使用激活的聚（乙二醇），最好是大約〇〇1_2 5倍。另一方面，在hGH或其激動劑變體中之反應性胺基酸殘基具有自由的羧基基團之處，可在從大約3·5到大約5·5之？11值中進仃以上的修改，例如，在碳化二醯亞胺（ρΗ 4_5)的存在下，在4。-37。(：進行利用聚（氧乙烯二胺）的修改卜以小時。可以hGH或其激動劑變體之自由羧基基團數目的莫耳合Ϊ之大約0.01-300倍使用激活的聚（乙二醇）。

在分開的具體實施例中，在共輛反應中所包含之聚合物含量的上限，超過大約1至可能使激活之聚合物與hGH 或其激動劑變體反應，的程度，即在超過大约激動劑變體含有大約一 ’但不形成相當大量之高分子量物種

.......叫说〜伙仕彳可高分子量的物種中將其分離。在本發明的其他觀點中，可使用雙功能-激活的咖街生物，產生聚合的hGH或其激動劑變體_PEG分子，其中多個 124799.doc •39· 200812610 hGH或其激動劑變體分子經由PEG交聯。雖然在本文中描述的反應條件結果可能產生大量未經修改的hGH或其激動劑變體，但該未經修改的hGH或其激動劑變體可迅速地再循環至將來下一批的額外共輛反應内。本發明之製程驚人地產生極少的，即低於大約30%，更佳的是低於大約1〇% 之高分子量物種，且該物種每hGH或其激動劑變體含有j 股以上的聚合物股。這些反應條件相對於聚合共軛反應常用的那些，其中激活之聚合物對於標靶，以數_倍莫耳過量存在。在本發明之其他觀點中，聚合物以每當量hGH或其激動劑變體從大約0 · 1到大約5 0當量的量存在。在本發明的另一項觀點中，聚合物以每當量hGH或其激動劑變體從大約1到大约10當量的量存在。本發明之共軛反應最初提供含有單-和二_PEG-hGH共輛物、未反應之hGH、未反應之聚合物的反應混合物或集合，通常還有低於大約20%的高分子量物種。該高分子量物種包括含有一個以上聚合物股及/或聚合之PEG-hGH或其激動劑變體物種的共軛物。在已經移除未反應物種和高分子量物種之後，回收主要含有單-和二-聚合物_hGH或其激動劑變體共輥物的組合物。已知共轆物大部分包括單股聚合物的事實，故該共輛物實質上是均質的。使用標準 FDC-P1 細胞增殖測定（Clark 等人 Journal of Biological Chemistry 271 : 21969-21977，1996)、受體結合測定（美國專利第5,057,417號），或垂體切除之大鼠生長（Clark等人 Journal of Biological Chemistry 271 ： 21969-21977, 124799.doc -40- 200812610 1996)，測量到這些經過修改的hGH或其激動劑變體，具有至少大約0.1%的聯想到天然或未經修改之hGH或其激動劑變體的活體外生物活性。然而，在本發明較佳的觀點中，經過修改的hGH或其激動劑變體具有大約25%的活體外生物活性，更佳的是，經過修改的hGH或其激動劑變體具有大約50%的活體外生物活性，更佳的是，經過修改的hGH 或其激動劑變體具有大約75%的活體外生物活性，而最佳的是，經過修改的hGH或其激動劑變體具有相等或改良的活體外生物活性。本發明之製程最好寧可包括有限比例的聚合物對hGH或其激動劑變體。因此，已經發現hGH或其激動劑變體共軛物優先受限於僅含有一股聚合物的物種。此外，聚合物對 hGH或其激動劑變體反應基團的附接，比使用較高莫耳過量的聚合物交聯劑時，實質上更不隨便。出現在反應池中未經修改的hGH或其激動劑變體，在已經中止該共軛反應之後，可使用離子交換或尺寸排阻層析法或類似的分離技術，再循環至未來的反應内。可藉著用來純化蛋白質的傳統方法，如透析、鹽析、超過濾、離子交換層析法、忌水性交互作用層析法（HIC)、减膠層析法和電泳，從反應混合物中純化聚（乙二醇）_修改之hGH或其激動劑變體，即根據本發明之以化學方式修改的蛋白質。在移除未反應之聚（乙二醇）和hGH或其激動劑變體時，離子交換層析法是特別有效的。在本發明更進一步的具體實施例中，從反應混合物中分離單_和二_聚合物_ 124799.doc -41 · 200812610 hGH或其激動劑變體物種，以便移除高分子量物種，以及未經修改之hGH或其激動劑變體。藉著將混合的物種放在含有從大約0.5-10毫克/毫升hGH或其激動劑變體-聚合物共輛物的緩衝溶液中，完成分離作用。適當的溶液具有從大約4到大約10的pH值。該溶液最好含有一或多種緩衝鹽類，選自 KC1、NaCl、K2HP04、KH2P〇4、Na2HP〇4、

NaH2P〇4、NaHC〇3、NaB〇4、CH3C〇2j^Na〇H。

依據反應緩衝溶液，首先必須使hGH或其激動劑變體聚合物共軛物溶液經歷緩衝溶液交換/超過濾，以便移除任何未反應的聚合物。例如，可通過低分子量截止（1〇,〇〇〇至 3〇,〇〇〇道爾吞）膜，超過濾pEG_hGH或其激動劑變體共軛物溶液，移除大多數不想要的物質，如未反應的聚合物、 (若存在）界面活性劑或其類似物。最好是使用離子交換層析介質，將共軛物分級分離成含有二要物種之集合。這類介質能夠經由電荷差異（其以多乂可預期的方式改變），選擇性地與pEG· hGH或其激動劑變體共扼物結合。例如，藉著在蛋白質表面上可利用之帶二1 I團的數目，判定hGH或其激動劑變體的表面電荷。、言τ電荷的基團通常作為聚（烯化氧）聚合物可能的附接點。因此，hG'pf斗、孙Λ ▲ Η或其激動劑變體共軛物將具有與其他物種不同的電荷，而容許選擇性分離。本發明之方、:i ν 法’为別使用強極性的陰離子或陽離子交換知f脂，如四纽晚斗、 π ^ 胺或硫丙基樹脂。離子交換樹脂是特佳的。非限制性的_ ^ . > 一寬表包括市售之陽離子交換樹脂，適合用於 124799.doc -42- 200812610 本發明的是SP_hitrap®、SP瓊脂糖HP、0 sp瓊脂糖φ速流。亦可使用其他適合的陽離子交換樹脂，例如^和CM樹脂。陰離子交換樹㈣非限制性-覽表，包括市售的陰離子交換樹脂，適合用於本發明的是Q_hitrap®、㈣脂糖_和q 瓊脂糖⑧速流。亦可使用其他適合的陰離子交換樹脂，例如DEAE樹脂。

例如，最好將陰離子或陽離子交換樹脂放在管柱中，並以傳統的方法平衡。使用具有與聚合物共軛之hGH或其激 =劑變體溶液相同之阳值和渗透性的緩衝溶液。洗脫緩衝溶液最好含有"*或多個鹽類，選自KC1、助、K2HP〇4、〇4 Na2HP〇4、NaH2P〇4、NaHC03、NaB〇4 和 (H4)2C〇3。然後使含有共軛物之溶液吸附至不保留未反應之聚：物和一些高分子量物種的管柱上。在裝載完成在s柱上知用3有漸增鹽濃度的洗脫緩衝溶液之梯度 ’洗脫想要的聚婦化氧_共輕之咖或其激動劑變體的溶離伤。在陽離子或陰離子交換分離步驟之後，最好將洗脫集合的溶離份限於均—的聚合物共輛物' 然後可從管柱中’藉著傳統的技術，、、丰门/ 變體物種。若的^或其激動劑了！由額外的離子交換層析法或尺寸排阻層析法，進一步從彼此中分離單和多聚乙二醇化的 hGH或其激動劑變體物種。半亦可使用利用漸增鹽濃度或PH值之多重等度（isocratic) 乂驟的技術。漸增濃度的多重等度洗脫步驟，結果將是 --然後是早-hGH或其激動劑變體-聚合物共軛物的連續洗 124799.doc -43- 200812610 脫。洗脫的溫度範圍是在大約4 °C到大約2 5 °C之間。最好在攸大約4 C到大約2 2 C的溫度下進行洗脫。例如，可藉著在280毫微米處的UV吸光度，檢測pEG-hGH或其激動劑變體溶離份的洗脫。可經由簡單的時間洗脫輪廓達成溶離份收集。

在將聚（乙二醇）聚合物與hGH或其激動劑變體部分共輛的製程中，可使用界面活性劑。適當的界面活性劑包括離子-型製劑，如十二烷基硫酸鈉（SDS)。亦可使用其他的離子f生界面活性劑，如十二烧基硫酸鐘、四級銨化合物、牛磺膽酸、辛酸、癸烷磺酸等等。亦可使用非_離子性的界面活性劑。例如，可使用諸如聚（氧乙烯）脫水山梨糖醇（溫）、聚（氧乙烯）醚類（三通）之類的材料。亦參 Neugebauer，去垢劑在生物學和生物化學上之特性和用的指南（A Guide t0 the Properties and Uses 〇f

Biology and Bi〇chemistry)(l992) Calbi〇chem c〇rp。對本發明之製程中所使用之界面活性劑的唯—限制.，是在引起hGH或其激動劑變體的實質不可逆之變性，且不完抑制聚合物共輛作用的條件和濃度下使用它們。該界: 性劑以從大約0.01-0.5% ;李交佳的是從〇〇5_〇·5% ;而最的是從大約0抓〇.25%的量出現在反應混合物中。亦嘗界面活性劑的混合物。認為界面活性劑在聚合物共輛過程，提供了暫時的、逆的保護系統。已經顯示界面活性劑在選擇性地阻止聚 124799.doc -44· 200812610 為，物共軛上是有效的，同時容許以離胺酸為基礎或以胺基終端為基礎之共輛作用進行。本發明之聚（乙二醇修改的hGH或其激動劑變體具有更持久的藥理學效力，這可能賦與它在活體内延長的半衰期。又本發明其他的具體實施例係關於預防及/或治療其中使用GH，最好是hGH有利之疾病或病症的方法，包括對需要其之患者投與在治療上有效之含量的本發明之聚（乙二醇> _ 、經過修改的hGH或其激動劑變體，單獨或與其他的治療劑併用。本發明亦關於使用本發明之聚（乙二醇）·修改的hGH 或其激動劑變體，來製造用以預防及/或治療其中使用 GH，最好是hGH有利之疾病或病症的醫藥品。此外，本發明亦關於包括本發明之聚（乙二醇）_修改的hGH或其激動劑變體的醫藥組合物，以便預防及/或治療其中使用gh，最好是hGH有利之疾病或病症。 • 其中使用GH有利之疾病或病症，包括但不限於生長激素缺陷（GHD)、成人生長激素缺陷（aGHD)、特内氏徵候群、在早產（SGA)的孩童中的生長失敗、普瑞德_威利徵候群（PWS)、慢性腎功能不全（CRI)、aiDS消耗、衰老、末期腎衰竭、胰囊性纖維變性、勃起功能障礙、Hiv脂肪代謝障礙、纖維肌痛、骨質疏鬆症、記憶障礙、克隆氏 (Crohn’s)症、骨骼發育異常、創傷性腦傷、蜘蛛膜下腔出血、紐曼氏（Noonan，s)徵候群、唐氏症、特發性矮小 (ISS)、末期腎病（ESRD)、極低出生體重”乙3|)、骨髓幹 124799.doc -45- 200812610 % 細胞解救、代謝徵候群、糖皮質激素肌病、在孩童中歸因於糖皮質激素治療的矮小，以及困擾矮小早老孩童的生長失敗。在本發明更特定的具體實施例中，使用本發明之聚（乙二醇）-修改的hGH或其激動劑變體，預防及/或治療病症或疾病，選自GHD、aGHD、SGA、PWS、特内氏徵候群和 CRI所組成之群。

在本發明其他更特定的具體實施例中，使用本發明之聚 (乙二醇修改的hGH或其激動劑變體，預防及/或治療病症或疾病，選自特發性矮小、極低出生體重、創傷性腦傷、代謝彳政候群和紐曼氏徵候群所組成之群。本發明其他的具體實施例係關於包括本發明之聚（乙二醇)_修改的hGH或其激動劑變體，單獨或與其他治療劑併用，以及至少-種在藥學上可接受之賦形劑或載劑的醫藥組合物。然後可將本發明之聚（乙二醇）_修改的⑽时盆激動劑變體調配成藥物，其亦含有在藥學上可接受之稀釋劑、製備等張溶液之製劑、ρΗ_調節劑及其類似物，以便將它們投與患者。〜依據治療的目的’可將以上的藥物皮下、肌肉内、靜内、肺臟、皮内或口服投藥。劑量亦可以待治療之病症種類和狀況為基礎，正t藉著注射是纽丨毫克❸ 克之間’㈣成人口服投藥則是在01 間。當在本文中使用時，本發明之聚（乙二醇）-修改的hGH或 124799.doc -46- 200812610 其激動劑變體可與其他的治療日丰，"丑F7此# 田在本文中使用 :人物ΑΓ又樂”、"共同-投與"和"併用”-詞，企圖意指 ::和—或多個其他治療劑’且提及並包括下列的·· _同時將Α和治療劑（們）的這類組 , . L 〇db ^ 口仅興而要治療的患者此時將這類組份調配在一起成為| ^ &风馮早一的劑量形式，在霄貝上相同的時間將該組份釋放至患者，貝同時將A和治療劑(們)的這類組合投與需要治療的患者，此時將這類組份彼此分開調配，成為分開的劑量 :式’其可由患者在實質上相同的時間内攝取，於是在實質上相同的時間將該組份釋放至患者，將A和冶療劑(們)的這類組合連續投與需要治療的患者’此時將這類組份彼此分開調配，成為分開的劑量：式’其可由患者在連續的時間内攝取，在每次投藥之間有明顯的時間間隔’於是在實質上不同的時間將該組份釋放至患者，及

將A和治療劑（們）的這類組合連續投與需要治療的患者此時將這類組份調配在一起成為單一劑量形式，其以控制方式釋放該組份，於是可在相同及/或不同的時間，將它們同時、連續及/或重複地投與患者。可與A、其在藥學上可接受之鹽類及/或其衍生形式併用之其他治療劑的適當實例，包括但不限於··芳構化酶 (aromatase)抑制劑，如依西美坦（exemestane)、福麥斯坦 (formestane)、安塔美坦（atamestane)、法倔嗤（fadr〇z〇1e)、來托嗤（letrozole)、伏氯嗤（voroz〇ie)和阿那曲〇坐 124799.doc •47- 200812610 ‘ （anastrozole);自由的脂肪酸調節劑，包括纖維酸（fibric acid)衍生物（如非諾貝特（fenofibrate)、氯貝丁酯 (clofibrate)、吉非貝齊（gemfibrozil)、苯扎貝特 (bezafibrate)和環丙貝特（ciproHbrate))和於驗酸衍生物，如阿西莫司（acipimox);胰島素敏化劑，包括但不限於雙脈類（biguanides)，如曱福明（metformin)、PPAR γ騰島素敏化劑和ρ塞峻丹尼酮類（thiazolodeniones)，如曲利太宗 (troglitazone)和羅格列酮（rosiglitazone)，曲利太宗，5-鲁 [[4-[3,4-二氫-6-羥基-2,5,7,8-四甲基-2H+苯并哌喃-2-基] 甲氧基]苯基]甲基3-2,4_嘧唑烷二酮V411 (DIABII， Glaucanin)，外匕格列酮（Pioglitazone) (ACTOS，AD 4833，U 72107, U 72107A，U 72107E，ZACTOS)化學名：2,4-p塞唑烷二酮，5-[[4-[2-(5-乙基-2-吡啶基）乙氧基]苯基]甲基]-單鹽酸鹽，（a/-);羅格列酮（Avandia，BRL 49653，BRL 49653C)化學名：2,4-嘧唑烷二酮，5-[[4-[2-(甲基-2-吡啶 I 胺基（pyridinylarnino))乙氧基]苯基]曱基；25蓓薩羅丁 (Bexarotene)-口服（LGD 1069 口服、塔格瑞亭（Targretin) 口服、塔格瑞亭、塔格瑞泰（Targretyn) 口服、塔格瑞辛 (Targrexin) 口服）化學名：4-[1-(3,5,5,8,8-五甲基-5,6,7,8-四氫-2-萘基）乙烯基]苯甲酸：ZD 2079，（ICI D 2079)(化學名：R)-N-[2-4-(羧甲基）30苯氧基]乙基]-N-(2_羥基-2-苯乙基）氣化銨：奈特格列酮（Netoglitazone)(伊沙格列酮 (Isaglitazone)，MCC 555, RWJ 241947)(化學名：5-[6-(2-氟苄氧基）萘-2-基甲基]嘧唑烷-2,4-二酮）；INS(D-手性 I24799.doc -48- 200812610 (chiro)-肌醇）（化學名：〇-1，2,3,4,5,6-六羥基環己烷），€^ 2344(DRF 2593);德利波坦（Dexlipotam)，化學名：5(R)-(1，2-二硫戊環-3·基）潘塔洛 35 酸（pentaloic 35 acid) ; HQL 975，化學名：3·[4-[2-(5-甲基-2-苯基吟唑-4-基）乙氧基] 苯基]-2(S)-(丙胺基)丙酸；ΥΜ 268，化學名：5,5f-亞甲基-雙（1，4-伸苯基）雙亞甲基雙〇塞唑烷-2,4-二酮）。I PPAR激動劑，在發展之下，包括：瑞格利札（Reglitaza〇(JTT 501， PNU 182716，PNU 716)(化學名：伸異嘮唑啶-3,5-二酮，i 4-[[4·(2-苯基-5-甲基）-l，3-噚唑基]乙氧苯基-4]曱基-，(4RS)) ; I (RP 297，化學名：10 5-(2,4·二氧碟嗤烧·5·基甲基）-2-甲氧基-Ν-[4-(三氟甲基）苄基苯甲醯胺；R 119702 (CI 1037, CS 011)化學名：（/-)-5-[4-(5-曱氧基-111-苯并咪唑-2-基甲氧基）苄基]嘧唑啉-2,4-二酮；鹽酸鹽；15 DRF 2189，化學名：5-[[4-[2-(1-吲哚基）乙氧基]苯基]曱基]嘧嗤烧-2,4-二酮；皮質固醇合成抑制劑，如酮康唑 (Ketoconazole)、益康嗤（econazole)或味康嗤 (miconazole)；生長激素，如重組人生長激素（somatropin) 或索馬特譜（somatonorm)及其衍生物，如人類生長激素融合蛋白，如長效重組人生長激素（ALBUTROPIN);聚乙二醇生長激素，如半胱胺酸-聚乙二醇化之生長激素、BT 005 (Bolder BioTechnology Inc.);生長激素促分泌素，像是例如 SM 130686 (Sumitomo)、卡普莫林（capromorelin) (Pfizer)、美卡舍明（mecasermin)(Fujisawa)、舍莫瑞林 (sermorelin)(Salk Institute，Bio-Technology General)、人蛋 124799.doc -49- 200812610 氨生長素（somatrem)、生長素介素（somatomedin)(C Llorente ; Pharmacia Corporation)、艾沙瑞林 (examorelin)、塔比瑞林（tabimorelin) ; CP 464709 (Pfizer)、LY 426410 和 LY 444711 (Lilly);如同在 WO 2002057241中揭示的8-(胺基烷氧基亞胺基）_8H-二苯并[a，e] 三唑并[4,5-c]環庚烯、在WO 2002056873中揭示的2-經取代之二苯并|>#]1，2,3-三唑[4,5-〇][7]輪烯-8-酮、如同在美國專利第4,411，890號和公開案WO 89/07110、WO 89/07111中描述之生長激素釋放肽GHRP-6和GHRP-1、B-HT920、海沙瑞林（hexarelin)，以及在WO 93/0408 1中描述的GHRP-2，或生長激素釋放激素（GHRH，亦稱為GRF)及其類似物，生長素介素包括IGF-1和IGF-2及其衍生物，如索瑪托康（SomatoKine)-類胰島素生長因子-1與其結合蛋白質的重組融合、BP-3、α-2-腎上腺素能的激動劑，如可樂定（clonidine)、賽拉嗪（xylazine)、地托哺定（detomidine)和美托哺咬（medetomidine)，或5-經色胺5HTID激動劑，如舒寧催坦（surnitriptan)，或抑制生長激素釋放抑制因子或其釋放的製劑，如毒扁豆驗（physostigmine)和峨斯的明 (pyridostigmine)、ThGRF 1-44 (Theratechnologies) ; L 165166 (Merck & Company);如同在WO 9858947中描述的二肽衍生物、二肽基肽酶IV的抑制劑，如在美國專利第6521644 號、WO 95/15309和WO 98/19998中描述的胺醯基吡咯啶腈；β-胺基雜環二肽基肽酶抑制劑，如在美國專利第 20030100563號和WO 2003082817中描述的那些；如同在 124799.doc -50- 200812610 γ 美國專利第20030055261號、美國專利第20030040483號、

歐洲專利 18 072、歐洲專利 83 864、WO 89/07110、WO 89/01711、WO 89/10933、WO 88/9780、WO 83/02272、 WO 91/18016、WO 92/01711、WO 93/04081、WO 9514666、歐洲專利0923539、美國專利第5,206,235號、 5,283,241 號、5,284,841 號、5,310,737 號、5,317,017 號、 5,374,721 號、5,430,144 號、5,434,261 號、5,438，136 號、 5,494,919 號 ' 5,494,920 號、5,492,916 號、5,536,716 號和 • 5,578,593 號、WO 94/13696、WO 94/19367、WO

95/03289、WO 95/03290、WO 95/09633 ^ WO 95/11029、 WO 95/12598、WO 95/13069、WO 95/14666、WO 95/16675、WO 95/16692、WO 95/17422、WO 95/17423、 WO 95/343 11和WO 96/02530中描述的生長激素釋放化合物、如同在美國專利第5804578號、美國專利第5783582 號、WO 2004007468中描述的六氫ρ比咬、叶1：洛σ定和六氫· 1Η-吖庚因、醯胺基螺六氫吡啶，如在WO 0104119中描述的那些、2-胺基-5-嘧啶乙酸化合物，包括2-[(5,6-二曱基-2-苯并咪唑基）胺基]-4-羥基-6-曱基-5-嘧啶乙酸（2)和2-[(5,6-二甲基-2-苯弁味嗅基）胺基]-4·經基-6-曱基-5-嗔咬乙酸乙酯，如同在美國專利第6329383號中描述的、如同在歐洲專利1155014中描述的苯并咪唑、與GRF有關的類似肽基化合物和美國專利第4,411,890號的肽、促性腺激素釋放激素的拮抗劑，如在WO 0170228、WO 0170227、WO 0170228、WO 0069433、W00004013、WO 995156 ' WO 124799.doc -51 - 200812610 9951595、WO 9951231-4、WO 9941251-2、WO 9921557、 WO 99215 53中描述的那些，以及如同在WO 0053602、WO 0053185、WO 0053181、WO 0053180、WO 0053179、WO 0053178 '美國專利第6288078號中描述的6-吖吲哚化合物；IGF-1促分泌素；類胰島素生長因子_2 (IGF-2或生長素介素A)和IGF-2促分泌素；肌抑素（myostatin)拮抗劑和抑制纖維母細胞生長因子受體-3 (FGFR_3)酪胺酸激酶的化合物。

聚合物質最好亦包括在室溫下為水溶性的。這類聚合物的非限制性一覽表包括聚（烯化氧）均聚物，如聚（乙二醇）或聚（丙二醇）、聚（氧乙烯化之多元醇），其共聚物及其嵌段共聚物’其限制條件為保留該嵌段共聚物的水溶性。以PEG為基礎之聚合物的另一種選擇，可使用實際上低-抗原性的材料，如葡聚糖、聚（乙烯吡咯烷酮）、聚（丙稀醯胺）、聚（乙烯醇）、以碳水化合物為基礎之聚合物，及其類似物。確實，可以類似轉變聚（烯化氧）所使用的方式，完成這些聚合物質之…和ε'终端基團的激活作用，並因此對熟諳此藝者而言將是明顯的。熟諳此藝者將了解前述的-覽表僅作為解釋之用，並嘗試所有具有在本文中描述之品質的聚合材料。為了本發明，"實際上低·抗原性" 意指在此項技藝中了解在哺乳動物中為無毒性，且不誘發可察覺之免疫原反應的所有材料。定義下列的是在本文中交替使用之縮寫與相對應意義的一覽 124799.doc -52- 200812610 表： g 公克 mg 毫克 ml 或 mL 毫升 RT 室溫 PEG 聚（乙二醇) 在本揭示内容中所述所有之 66 &敕咖… 開案、專利和專利申請案地:二Γ係以引用的方式併入本文中，就如同已特定 =個別地將各個公開案、專利或專利申請案以引用的方式併入一般。雖然為了更清楚地了解，已經藉著解釋和實例詳細地描述刖述的本發明，但熟諳此藝者將可從本發明的教育觀點，輕易地知曉可進行不達背本發明之精神及範圍的變化和修改僅為了解釋之目的，提供下列的實例，並非企圖限制已經在上文中廣泛描述的本發明之範圍。在下列的實例中，hGH為SEQIDN。：卜#然可以類似在後續實例中舉例的方式，將多肽之hGH或其激動劑變體家族的其他成員聚乙二醇化。實例實例1 分支的40,000]^^?£〇_丁醯醛11〇11 124799.doc •53· 200812610 Ο II mPEG-〇—C-NH ch2 h2c h2c ch2 9 .CH. mPEG"~O—C- 、C_N—(CH2CH20)4CH2CH2CH2^：H π 〇

本實例證實藉著還原性烷化作用產生實質上均質的N·終端單聚乙二醇化hGH之製備物的方法。經由還原性胺化作用，利用在N-終端的一級胺之相對pKa值對在離胺酸殘基之ε -胺基位置的一級胺之pKa值上的差異，選擇性地將大約 40,000 MW (Shearwater Corp·)之甲氧基-分支之 PEG-丁醯醛試劑與hGH之N-終端偶聯。以10毫克/毫升將hGH蛋白質溶解於 25 mM Hepes (Sigma Chemical，St. Louis，MO) pH 7.0 (可任選 25 mM MES (Sigma Chemical，St· Louis， MO) pH 6.0、10 mM 乙酸納（Sigma Chemical，St· Louis， MO) pH 4.5)，並藉著加入M-PEG-ALD，使其與甲氧基-PEG-丁醢酸，M-PEG-ALD (Shearwater Corp.，Huntsville， AL)反應，產生2 ·· 1之相對PEG : hGH莫耳比例。藉著加入 1M NaCNBH4母液（Sigma Chemical，St. Louis，MO)，溶解於水中，至10_50 mM之終濃度，來催化反應。在室溫下在暗處進行該反應18-24小時。藉著加入1M Tris (Sigma Chemical，St. Louis，MO)約 pH 7.6，至 50 mM 之終 Tris 濃度，或為了立刻醇化而以適當的緩衝溶液稀釋，中止該反應0 124799.doc -54- 200812610 . 表1顯示由多-聚乙二醇化物種、單-聚乙二醇化共軛物、未-反應PEG，以及40K分支的PEG-醛和40K分支的 PEG-乙醯醛之純化終產量之尺寸排阻層析法判定的百分比。PEG- 丁醯駿結果增加了單·聚乙二醇化之共輛物，降低未-反應PEG的含量，並與PEG-醛相比較，增加了終產量。表1 40K分支之PEG-ALD-hGH與40K分支之PEG-丁醯醛-hGH的比較在反應混合物中的物種： 40KPEG-醛 hGH 40K PEG-丁醯醛-hGH 多-PEG產物 4.02% 5.03% 單-PEG產物 48.70% 61.02% 未-反應的hGH 41.80% 29.20% 純化終產量 30.80% 44.70% 實例2

直鏈30,000 MW PEG-丁醯醛hGH 使用關於實例1描述的程序，將甲氧基-直線30,000 MW PEG-丁醯醛試劑與hGH之N-終端偶聯。實例3

直鏈 20,000 MW PEG-丁醯醛 hGH 使用關於實例1描述的程序，將曱氧基直線20,000 MW PEG-丁醯醛試劑與hGH之N-終端偶聯。實例4 聚乙二醇化hGH的純化作用 124799.doc -55- 200812610 , 使用單一離子層析步驟，從反應混合物中純化聚乙二醇化之hGH物種至95% (SEC分析）。陰離子交換層析法使用單一陰離子交換層析步驟，從反應混合物中純化 PEG hGH物種至95% (SEC分析）。使用陰離子交換層析法，從未經修改之hGH和多·聚乙二醇化之hGH物種中純化單-聚乙二醇化之hGH。按照上述，在以25 mM HEPES，pH 7.3 (緩衝溶液A)平衡之Q-瓊脂糠Hitrap管柱（1或5毫鲁升）(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)或 Q-瓊脂糖速流管柱（26/20，70毫升床體積）(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)上純化代表性的 20K丁醯醛hGH反應混合物（5-100毫克蛋白質）。以緩衝溶液A將反應混合物稀釋5-10X，並乙2.5毫升/分鐘之流速裝入管柱中。以8倍管柱體積的緩衝溶液A沖洗該管柱。隨後，以 80·100倍管柱體積的緩衝溶液A和0·100mM之直線NaCl梯 $ 度，從管柱中洗脫出各種hGH物種。藉著在280毫微米 (A28〇)處的吸光度監視诜脫物，並收集5毫升的溶離份。按照聚乙二醇化的程度集合溶離份，例如單、二、三等等 (按照在實例15中的評估）。然後在Centriprep YM10濃縮器 (Amicon，Technology Corporation，Northborough，MA)上將集合濃縮至〇·5-5毫克/毫升。藉著A28q判定集合的蛋白質濃度，使用0.78之消光係數。陽離子交換層析法在以10 mM乙酸納pH 4.0 (緩衝溶液B)平衡之SP瓊脂糖 124799.doc -56- 200812610 -λ , 高效率管柱（Pharmacia ΧΚ 26/20，70毫升床體積）上，進行陽離子交換層析法。以緩衝溶液Β稀釋該反應混合物1〇 X，並以5毫升/分鐘之流速裝入管柱中。接下來以5倍管柱體積之缓衝溶液Β沖洗管柱，接著是5倍管柱體積的12%缓衝溶液C (10 mM乙酸鹽pH 4.5，1 M NaCl)。隨後，以2〇倍管柱體積之12至27%緩衝溶液C的直線梯度，從管柱中洗脫出PEG-hGH物種。藉著在280毫微米處監視洗脫物，並收集10毫升的溶離份。按照聚乙二醇化的程度集合溶離鲁份，（單、二、三等等），交換至10 mM乙酸鹽pH 4 · 5緩衝溶液中，並在適合Amicon YM10膜的檀拌細胞中，濃縮至 1-5毫克/毫升。藉著A280毫微米判定集合的蛋白質濃度，使用0.78之消光係數。實例5 生化特徵藉著非-還原SDS-PAGE、非-變性尺寸排阻層析法和肽 I 作圖，定出經過純化之聚乙二酵化hGH集合的特徵。尺寸排阻高效率液相層析法（SEC-HPLC)

非一變性SEC-HELP 使用非-變性SEC-HPLC，評估各種附接化學、尺寸、交聯劑和幾何學之曱氧基-PEG與hGH的反應、陰離子交換純化集合，以及經過純化之終產物。使用管柱Superdex 200 7.8 毫米 X 30公分（Amersham Bioscience，Piscataway，NJ)，以〇·5毫升/分鐘之流速，利用20 mM磷酸鹽pH 7.2, 150 mM NaCl (或可選擇 Tosohaas G4000PWXL Amersham 124799.doc -57- 200812610

Bioscience, Piscataway，NJ)，進行分析非變性 SEC-HPLC。聚乙二醇化作用大大地增加了蛋白質的流體動力學體積，結果轉變了較早的保留時間。在PEG醛hGH反應混合物連同未經修改之hGH中觀察到新物種。在Q-瓊脂糖層析上分離這些聚乙二醇化和未-聚乙二醇化的物種，且隨後顯示所得的經過純化之單PEG-醛hGH物種，在非-變性SEC上為單一高峰的洗脫物（>95%純度）。Q-瓊脂糖層析步驟有效地從單-聚乙二醇化之hGH中，移除了自由的 PEG、hGH和多聚乙二醇化hGH物種。

變性 SEC-HPLC 使用變性SEC-HPLC評估丁醯醛聚乙二酵與hGH的反應、陰離子交換純化作用和經過純化之終產物。使用

Tosohaas 3000SWXL 管柱 7.8 毫米 X 30 公分（Tosohaas Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)，以 0·8 毫升 / 分鐘之流速，利用100 mM磷酸鹽pH 6.8，0.1% SDS，進行分析變性 SEC-HPLC。聚乙二醇化作用大大地增力口了蛋白質的流體動力學體積，結果轉變了較早的保留時間。在Q-瓊脂糠層析上分離聚乙二醇化和未-聚乙二醇化的物種。 SDS PAGE/PVDF轉移使用SDS-PAGE評估PEG丁醯醛與hGH的反應，以及經過純化的終產物。在還原和非-還原條件下，在1毫米厚的 10-20% Tris麥黃酮凝膠（Invitrogen，Carlsbad，CA)上，進行SDS-PAGE，並使用Novex膠態考馬斯藍tm G-250染色套組（Invitrogen，Carlsbad，CA)染色。為了後續的N-終端序 124799.doc -58 - 200812610 . 列確認，將墨點沾染在PVDF膜上。

分析陰離子交換HPLC 使用分析陰離子交換HPLC，評估PEG 丁醯醛/hGH反應混合物、陰離子交換純化溶離份和經過純化之終產物。使用Tosohaas Q5PW或DEAE-PW陰離子交換管柱，7.5毫米 x75 毫米（Tosohaas Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)，進行分析陰離子交換HPLC，以1毫升/分鐘之流速，使用50 mM Tris pH 8.6。以5-200 mM NaCl之直線梯度洗脫該試 • 樣。 N-終端序列和肽作圖使用自動化的Edman降解化學，判定NH2-終端的蛋白質序列。使用 Applied Biosystems 494型 Procise定序器（perkin Elmer，Wellesley，ΜΑ)進行降解作用。藉著Rp_HPLC分析，使用適合Perkin Elmer/Browmlee 2·1毫米直徑之PTH-C18管枉的Applied Biosystems 140C型ΡΤΗ分析器，以連線方式確認個別的PTH-AA衍生物。以1毫克/毫升之濃度進行胰蛋白酶消化，每次消化通常使用5 0微克的材料。加入胰蛋白酶，使得胰蛋白酶對PEG-hGH的比例為1 : 30 (重量/重量）。Tris緩衝溶液以30 mM， pH 7.5存在。在室溫下培養試樣16±〇·5小時。藉著每毫升消化溶液加入50微升1N HC1中止該反應。在將試樣放置在自動進樣器中之前，先以6.25%乙腈稀釋試樣，至0.25毫克/毫升之終濃度。首先加入乙腈（至19.8%乙腈），溫和地混合，然後加入水至終體積（原始體積的四倍）。可移除額 124799.doc -59- 200812610 , 外的消化溶液，並在-2(TC下儲存長達1週。使用Waters Alliance 2695 HPLC系統進行分析，但其他的系統應該產生類似的結果。所使用的管柱為Astec C-4聚合25公分x4.6毫米管柱，具有5微米之顆粒。在周圍溫度下進行實驗，通常每個試樣裝載50微克蛋白質。缓衝溶液 A為在水中之0.1%三氟乙酸；缓衝溶液B為在乙腈中之 0.085%三氟乙酸。梯度如下：時間 A% B% C% D% 流速曲線 0.00 0.0 0.0 100. 0 0.0 1.000 1 90.00 0.0 0,0 55.0 45.0 1.000 6 90.10 0.0 0·0 0.0 100. 0 1.000 6 91.00 0.0 0.0 0.0 100. 0 1.000 6 91.10 0.0 0.0 100.0 0.0 1.000 6 95.00 0.0 0.0 100.0 0.0 1.000 6 使用熱套管將管柱加熱至40°C。使用Waters 996 PDA偵測器檢測高峰，收集在210到300毫微米處的數據。至於試樣分析，使用在214毫微米處的萃取層析譜。對hGH、40K分支的PEG-醛和40K分支的丁醯醛進行胰蛋白酶作圖（圖1)。將N-終端胰蛋白酶片段稱為T-1。在表2 中出示與未聚乙二醇化之hGH相比較，T-1出現的百分比。該數據暗示使用PEG-醛，有90%的PEG修改是在N-終端，剩下的似乎連接數個可能的離胺酸之一，與使用PEG-丁醯醛的相比較，其有超過98%的在N-終端。表2 T_1出現％與未聚乙二醇化之hGH 相比較，T-1%出現％ hGH 28.0% 124799.doc •60- 200812610 PEG-醛/hGH 2.6% 9.2% PEG-丁醯醛/hGH 0.3% 1.2% 實例6 藥物動力學研究大鼠增重預先針對生長速率，篩選在Taconic實驗室切除垂體的雌性Sprague Dawley大鼠7至11天的期間。將大鼠分成8 組。第1組包括每天或第〇和第6天得到皮下劑量之媒劑的大鼠。第2組每天得到皮下劑量的Gh (30微克/大鼠/劑量）。第3組在第〇和第6天得到皮下劑量的GH (180微克/大鼠/劑量）。第4組在第〇,6天得到皮下劑量的40K分支之 PEG-丁醯盤-hGH (180微克/大鼠/劑量）。藉著在研究期間至少每隔一天秤重，監視垂體切除大鼠的體重增加。圖 3&4 〇大鼠脛股長度在第Π天時犧牲在11天增重研究中的動物，移出左邊的脛股’進行χ_光攝影並使用測徑器測量骨頭的長度。 IGF-1研究使用得自6天增重研究的動物。在研究期間的各種時間採取企液試樣，並藉著ELISA判定血清含量。血清生化研究使用在11天增重研究中的動物，在第7天按照在表3中出示的，在第0和6天h8毫克/公斤的累積投藥之後，評估血清生化值。表3 124799.doc -61- 200812610 /尺J心媒劑 hGH PEG-hGH (11天以300微克/(第〇和6天1.8毫克/ AT Ώ -- 公斤/天）公斤） /\ι^ϊ3 (克/分升） ALP 4.〇7±0·〇4 311±ι5 4.06±0.05 4.18 土 0.03*τ (單位/公升） ALT 309士16 280士14 53·6±2·4 (單位/公升） AST 51·1 士 2.2 51·3 士 2.6 149+7 (單位/公升） BUN 131±4 137+11 37·4±1.6 (毫克/分升） Ca2+ 26.7+1.5* 27.9±0·6* 1〇·9±〇·ι (毫克/分升） Choi 11.5±0.1* ll.OiO.l1 85·1+2.8 (宅克/分升） CRE 76·9±3·6* 115.3±2.8*卞 °·62±0.02 (毫克/分升） 0·60±0·01 0·59±0.01 葡萄糖 (毫克/分升） Phos 73·4±4·7 79.6±4.7 67·1±8·9 (毫克/分升) 8·26±〇.28 9.59 + 0.16* 8.42±0.23f TP 6·36±〇.ι〇 (克/分升） TBA 6·48±0·10 6·39±0·06 1〇·〇±〇.5 (微莫耳/公升） 7·6±0·4* 11.0±0.4卞 SDH ^-9 + 1.0 (單位/公升） 9·7±1·4 10·6±0·7 三酸甘油酯 (毫克/分升） 57·4±4·〇 47.8±5.7 45·7±3·9* LDH 786±72 (單位/公升） Na+ 762±94 914±189 (|莫耳/公升） ^7+0.5 146±0.8 145±0·6* (毫莫耳/公升、 C1· ) 5·94±〇·〇9 6·31±0·16* 6.71±0.17*f (毫莫耳/公升）^3 + 0.5 102±0.5 10210.6 124799.doc •62- 200812610 *ρ<0·10對媒劑，1p<0 05 對 hGH。 ALB，白蛋白；ALP，鹼性磷酸酶；ALT，丙胺酸轉氨酶；AST，天冬胺酸轉胺酶；bun，血中尿素氮；Ca2+，鈣；Choi，膽固醇；CRE，肌酸酐；Phos，磷酸鹽；TP，總蛋白質；TBA，總膽汁酸；SDH，山梨醇脫氫酶； LDH，乳酸脫氫酶；Na+，鈉；K+，鉀；Cr，氯。

在第11天時，在PHA-794428-處理之動物中，以與媒劑組相同的程度，血中尿素氮濃度明顯地增加（ρ<0·10)。這表示由於在促進生長期間新蛋白質合成的結果，而增加氮的利用。藥物動力學研究在正常、裝有套管的Sprague-Dawley雄性大鼠中進行藥物動力學的研究。每組使用6隻大鼠，以1〇〇微克/公斤/大鼠GH或PEG-GH的單一皮下團塊進行注射。在1至5天内適當地採取血液試樣，以便評估相關的PK參數。在每次採樣時，使用免疫-測定監視GH和PEG-GH血液含量。 hem免疫測定使用hGH AutoDELFIA套組螢光免疫測定（PerkinEimer)，判定在老鼠和食蟹猴（cynomolgus monkey)血漿中之和聚乙二醇化hGH的蛋白質濃度水準。藉著免疫測定套矣且 (Diagnostic 含量。

System

Laboratories)監視大鼠和人類的中之未·區實例1之hGH-PEG共軛物在非-人類的靈長動物別的藥物動力學特性 124799.doc -63- 200812610 以0.18毫克/公斤靜脈内（iv)或皮下（sc)團塊注射，將實例1之hGH-PEG共扼物投與食蟹狼（表4)。使用n=3動物的平均數據，判定PK參數。使用AutoDELFIA套組螢光測定 (PerkinElmer)，以及為PEG-GH共軛物預先-判定的標準曲線，測量血漿濃度。表4 劑量(毫克/公斤）靜脈内0.18/皮下0.18 CL，靜脈内(毫升/小時/公斤） 0.8 Vss(毫升/公斤） 28.0 iy2，靜脈内(小時） 25.0 ρ/2，皮下(小時） 61.2 SCAUC(微克/毫升*小時） 195 SC生物利用性(％) 84 Tmax，皮下(小時） 32 【圖式簡單說明】圖1為hGH和40K分支之丁醯醛hGH或40K分支之醛hGH 的反應之胰蛋白酶作圖分析的HPLC追蹤。上圖為40K分支之丁醛hGH的胰蛋白酶圖。中圖為40K分支之醛hGH的胰蛋白酶圖。下圖為未聚乙二醇化之hGH的胰蛋白酶圖。T1 為N-終端的胰蛋白酶片段。圖2顯示人類生長激素的胺基酸序列（SEQ ID NO: 1)。圖3顯示在大鼠增重測定中，40K分支之丁醛hGH的效力。從Harlan Labs購買4·5週（100-125克）之垂體切除的雌性Sprague-Dawley大鼠。當進入動物設施時，將動物維持在80°F的恆定溫度下，並每天秤重4_10天，以便建立基礎生長速率。在第0天開始，在對照組中的大鼠（約100克）接受每天一次皮下注射大約0.3毫克/公斤hGH (實心圓形）或 124799.doc -64- 200812610 € v PBS (空心圓形），連續11天。40K分支之丁醛hGH試驗組 (實心正方形）在第0天和第6天，接受1.8毫克單一劑量的卩11八-794428。每組有8-10之大鼠。將平均生長土8£]^作圖。圖4顯示40K分支之丁醛hGH在大鼠中的劑量-反應性生長促進影響。以類似在圖3中描述之方式進行該效力研究，除了投與改變的單一劑量40K分支之丁醛hGH (僅在第〇天），並執行研究6天。對照組接受每天一次注射〇·3毫克/ _ 公斤hGH (實心圓形）或PBS媒劑（空心圓形），連續6天。 40K分支之丁醛hGH的劑量為ι·8毫克/公斤（實心正方形）、〇·6毫克/公斤（空心正方形）、〇·2毫克/公斤（實心三角形）或 0.067毫克/公斤（空心三角形）。每組有8隻動物。圖5顯示脛骨反映40K分支之丁醛hGH的生長。按照在圖 3中的描述處理垂體切除的大鼠。在第n天時，犧牲動物，移出左脛骨，並進行X-光攝影，使用測徑器測量骨頭 φ 長度。將平均長度土SEM作圖。星號代表與對照組的明顯差異（p<0.05)。圖6顯示6天效力研究的血漿沁^丨含量。按照圖4的描述處理動物。在各種時間採取血液試樣，並藉著eLISA判定血清IGF-1含量。將平均值±SEM作圖。 124799.doc • 65 - 200812610 . 序列一覽表 <110> Pharmacia Corporation .Finn, Rory <120> N•端單聚乙二醇化之人類生長激素共軛物，彼等之製法及其使用方法

<130> 32152A <140>094103308 <141>2005-02-03 <150> 10/771895 <151> 2004-02-04 <160> 1

<170> Patentln version 3.2 <210> 1 <211> 191 ' <212>蛋白質 <213>人類 <400> 1

Phe Pro Thr lie Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg 1 5 10 15

Ala His Arg Leu His Gin Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gin Glu Phe Glu 20 25 30

Glu Ala Tyr lie Pro Lys Glu Gin Lys Tyr Ser Phe Leu Gin Asn Pro 35 40 45

Gin Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser lie Pro Thr Pro Ser Asn Arg 50 55 60

Glu Glu Thr Gin Gin Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg lie Ser Leu 65 70 75 80

Leu Leu lie Gin Ser Trp Leu Glu Pro Val Gin Ser Leu Arg Ser Val 85 90 95

Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp 100 105 110

Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly lie Gin Thr Leu Met Gly Arg Leu 115 120 125 124799.doc 200812610 d

Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gin lie Phe Lys Gin Thr Tyr Ser 130 135 140

Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr 145 150 155 160

Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe 165 170 175

Leu Arg lie Val Gin Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 180 185 190

2- 124799.doc

Claims

200812610 A , 十、申請專利範圍： 1. 一種具有式I或II結構之聚（乙二醇）·修改之hGH於預防及/ 或治療其中使用生長激素是有利的疾病或病症之用途： II mPEG-O^C-NH ch2 h2c h2c ch2 ❿ 、(:一N—(CH2CH2〇)n(CH2)mCHrNH-R o >u II /CH> mPEG-0—C—N H 式I 或 mPEG-0(CH2CH20〉n(CH2>mCHrNH-R 式II 其中 n為在1到10之間的整數； m為在1到10之間的整數； R為人類生長激素或甲硫胺醯基生長激素，單獨或與其他治療劑併用，其中使用生長激素有利的該疾病或病症，係選自生長激素缺陷（Growth hormone deficiency，GHD)、成人生長激素缺陷（Adult growth hormone deficiency，aGHD)、特内氏徵候群（Turner’s syndrome)、早產（Short for gestational age，SGA)孩童的 124799.doc 200812610 A " 生長失敗、普瑞德-威利徵候群（Prader-Willi syndrome， PWS)丨艾性腎功能不全（Chronic renal insufficiency， AIDS)、AIDS消耗、衰老、末期腎衰竭及胰囊性纖維變性（Cystic Hbrosis)所組成之群。 2·如請求項1之用途，其中該疾病或病症係選自生長激素缺陷、成人生長激素缺陷、特内氏徵候群、早產孩童的生長失敗、普瑞德-威利徵候群及慢性腎功能不全所組成之群。 _ 3·如請求項1之用途，其中η等於4且m等於3。 4.如明求項1之用途，其中該聚（乙二醇）_修改之hGH具有式Ϊ之結構，其中η等於4且m等於3。 5·如請求項1至4中任一項之用途，其中該人類生長激素包括SEQ ID NO : 1之胺基酸序列。 6·如請求項1至4中任一項之用途，其中超過9〇%的該聚（乙二醇）與SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的胺基_終端苯丙胺酸共軛。 7·如請求項6之用途，其中超過95〇/0的該聚（乙二醇）與SEQ ID NO : i之胺基酸序列的胺基_終端苯丙胺酸共軛。 8·如請求項1至4及6中任一項之方法，其中每個mpE(}具有大約20 kDa之分子量。 9· 一種包括式I或II之人類生長激素-peg共軛物，連同其他治療劑，以及至少一種在藥學上可接受之載劑的組合物： 124799.doc II200812610 mPEG-O-C-NH CH, h2c h2c JCH mPEG-0—C_ H N—(CH2CH20)n(CH2)mCHrNH-R 式I 或

mPEG-0(CH2CH20)n(CH2)mCH2-NH-R 式II 其中 n為在1到10之間的整數； m為在1到10之間的整數； R為人類生長激素或甲硫胺醯基生長激素。

其中該組合物係用於預防及/或治療其中使用生長激素是有利的疾病或病症，且該疾病或病症係選自生長激素缺陷（Growth hormone deficiency，GHD)、成人生長激素缺陷(Adult growth hormone deficiency，aGHD)、特内氏徵候群（Turner 丨 s syndrome)、早產（Short for gestational age (SGA)孩童的生長失敗、普瑞德·威利徵候群（卩1^(161·-Willi syndrome，PWS)、慢性腎功能不全（Chronic renal insufficiency，AIDS)、AIDS消耗、衰老、末期腎衰竭及姨囊性纖維變性（Cystic fibrosis)所組成之群。 124799.doc 200812610 1〇.如凊未項9之組合物’其巾或病症係選自生長激素缺陷、成人生長激素缺陷、特内氏徵候群、早產孩童的生長失敗、普瑞德·威利徵候群及慢性腎功能不全所組成之群。 U·如請求項9之組合物，其中該聚（乙二醇）·修改之hGH具有式I之結構，其中n等於4且瓜等於3。 124799.doc