NL1028837C2 - N-terminaal monogepegyleerde conjugaten van humaan groeihormoon en werkwijze voor de bereiding daarvan. - Google Patents
N-terminaal monogepegyleerde conjugaten van humaan groeihormoon en werkwijze voor de bereiding daarvan. Download PDFInfo
- Publication number
- NL1028837C2 NL1028837C2 NL1028837A NL1028837A NL1028837C2 NL 1028837 C2 NL1028837 C2 NL 1028837C2 NL 1028837 A NL1028837 A NL 1028837A NL 1028837 A NL1028837 A NL 1028837A NL 1028837 C2 NL1028837 C2 NL 1028837C2
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- hgh
- growth hormone
- peg
- human growth
- poly
- Prior art date
Links
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 title claims description 180
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 title claims description 180
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 title claims description 179
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 30
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 5
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 126
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 28
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 11
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- 206010056438 Growth hormone deficiency Diseases 0.000 claims description 8
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 claims description 7
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 7
- 229920001427 mPEG Polymers 0.000 claims description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- 108700031632 somatrem Proteins 0.000 claims description 5
- 208000026928 Turner syndrome Diseases 0.000 claims description 4
- 208000037824 growth disorder Diseases 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 208000012239 Developmental disease Diseases 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 1
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 66
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 48
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 42
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 38
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 38
- 241000894007 species Species 0.000 description 28
- ZTQSAGDEMFDKMZ-UHFFFAOYSA-N Butyraldehyde Chemical group CCCC=O ZTQSAGDEMFDKMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 22
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 19
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 19
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 19
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 17
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 14
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 14
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 11
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 11
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical group OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 10
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 10
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 10
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 10
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 10
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 10
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 229920000233 poly(alkylene oxides) Polymers 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 8
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 8
- HGBOYTHUEUWSSQ-UHFFFAOYSA-N valeric aldehyde Natural products CCCCC=O HGBOYTHUEUWSSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000013628 high molecular weight specie Substances 0.000 description 7
- -1 hydroxysuccinimidyl ester Chemical class 0.000 description 7
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 7
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- 201000010769 Prader-Willi syndrome Diseases 0.000 description 6
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 6
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 5
- 206010041092 Small for dates baby Diseases 0.000 description 5
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 5
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 5
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 5
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 5
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 5
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 4
- 206010013883 Dwarfism Diseases 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 4
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 4
- 229940023913 cation exchange resins Drugs 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 4
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 4
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 4
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 4
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 4
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 4
- 238000005932 reductive alkylation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 3
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 3
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N monopropylene glycol Natural products CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- AASBXERNXVFUEJ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) propanoate Chemical compound CCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O AASBXERNXVFUEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N Acetaldehyde Chemical compound CC=O IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 101000642577 Homo sapiens Growth hormone variant Proteins 0.000 description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 2
- WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N N-Vinyl-2-pyrrolidone Chemical compound C=CN1CCCC1=O WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- 241001415846 Procellariidae Species 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 2
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 2
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 2
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000001904 diabetogenic effect Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 2
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000002608 insulinlike Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 238000011866 long-term treatment Methods 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N octanoic acid Chemical compound CCCCCCCC(O)=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010001564 pegaspargase Proteins 0.000 description 2
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 2
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 2
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 235000013772 propylene glycol Nutrition 0.000 description 2
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 238000013223 sprague-dawley female rat Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASUGWWOMVNVWAW-UHFFFAOYSA-N 1-(2-methoxyethyl)pyrrole-2,5-dione Chemical compound COCCN1C(=O)C=CC1=O ASUGWWOMVNVWAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KVGOXGQSTGQXDD-UHFFFAOYSA-N 1-decane-sulfonic-acid Chemical compound CCCCCCCCCCS(O)(=O)=O KVGOXGQSTGQXDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CFBILACNYSPRPM-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[[1,3-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)propan-2-yl]amino]acetic acid Chemical compound OCC(N)(CO)CO.OCC(CO)(CO)NCC(O)=O CFBILACNYSPRPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 1
- 102000055025 Adenosine deaminases Human genes 0.000 description 1
- 101100338243 Caenorhabditis elegans hil-6 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005635 Caprylic acid (CAS 124-07-2) Substances 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 102100033299 Glia-derived nexin Human genes 0.000 description 1
- 101710183811 Glia-derived nexin Proteins 0.000 description 1
- 102000004547 Glucosylceramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010017544 Glucosylceramidase Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010019196 Head injury Diseases 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 101001075374 Homo sapiens Gamma-glutamyl hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 1
- 101001123448 Homo sapiens Prolactin receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000664737 Homo sapiens Somatotropin Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910020889 NaBH3 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010003044 Placental Lactogen Proteins 0.000 description 1
- 102000004576 Placental Lactogen Human genes 0.000 description 1
- 239000000381 Placental Lactogen Substances 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 108010002519 Prolactin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100029000 Prolactin receptor Human genes 0.000 description 1
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 1
- 101001075370 Rattus norvegicus Gamma-glutamyl hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 1
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 1
- WBWWGRHZICKQGZ-UHFFFAOYSA-N Taurocholic acid Natural products OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(=O)NCCS(O)(=O)=O)C)C1(C)C(O)C2 WBWWGRHZICKQGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 229940060205 adagen Drugs 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 229940124325 anabolic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003263 anabolic agent Substances 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 1
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229940088623 biologically active substance Drugs 0.000 description 1
- 230000036765 blood level Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 230000008468 bone growth Effects 0.000 description 1
- NNTOJPXOCKCMKR-UHFFFAOYSA-N boron;pyridine Chemical compound [B].C1=CC=NC=C1 NNTOJPXOCKCMKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000337 buffer salt Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 125000004063 butyryl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 206010016165 failure to thrive Diseases 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 210000004349 growth plate Anatomy 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000044162 human IGF1 Human genes 0.000 description 1
- 239000000960 hypophysis hormone Substances 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002563 ionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002446 octanoic acid Drugs 0.000 description 1
- 229940099216 oncaspar Drugs 0.000 description 1
- 210000004789 organ system Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000006461 physiological response Effects 0.000 description 1
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 229920003196 poly(1,3-dioxolane) Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 150000003856 quaternary ammonium compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229920005604 random copolymer Polymers 0.000 description 1
- 108010077161 rat insulin-like growth factor-1 Proteins 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001525 receptor binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000006268 reductive amination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000013878 renal filtration Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 208000002491 severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 210000002356 skeleton Anatomy 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 230000003093 somatogenic effect Effects 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013222 sprague-dawley male rat Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- WBWWGRHZICKQGZ-GIHLXUJPSA-N taurocholic acid Chemical compound C([C@@H]1C[C@H]2O)[C@@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@@H]([C@@H](CCC(=O)NCCS(O)(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@H](O)C1 WBWWGRHZICKQGZ-GIHLXUJPSA-N 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 125000004149 thio group Chemical group *S* 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/27—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Description
5 N-TERMINAAL MONOGEPEGYLEERDE CONJUGATEN VAN HUMAAN
GROEIHORMOON EN WERKWIJZE VOOR DE BEREIDING DAARVAN
GEBIED VAN DE UITVINDING
De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een 10 chemische modificatie, omvattende PEGylering, van humaan groeihormoon (hGH) en agonistische varianten daarvan, met behulp waarvan de chemische en/of fysische eigenschappen van hGH kunnen worden veranderd. Het gePEGyleerde hGH kan een verhoogde plasmaverblijfsduur, verlaagde klaringssnel-15 heid, verbeterde stabiliteit, verlaagde antigeniciteit, of verlaagde PEGyleringsheterogeniteit bezitten, of een combinatie daarvan. De onderhavige uitvinding heeft ook betrekking op werkwijzen voor de modificatie van hGH. Daarnaast heeft de onderhavige uitvinding betrekking op farma-20 ceutische preparaten die het gemodificeerde hGH bevatten. Een verdere uitvoeringsvorm is het gebruik van het gemodificeerde hGH voor de behandeling van groei- en ontwikkelingsstoornissen.
j j
25 ACHTERGROND VAN DE UITVINDING
Humaan groeihormoon (hGH) is een eiwit dat bestaat uit een enkele keten van 191 aminozuren, met twee disulfi-debruggen, en de monomere vorm heeft een molecuulgewicht van 22 kDa. Humaan GH wordt uitgescheiden door de hypofyse 30 en welke ook kan worden geproduceerd door middel van re-combinante genetische modificatie. hGH veroorzaakt groei in alle lichaamsweefsels die in staat zijn tot groei. Recombinant hGH is reeds een aantal jaren commercieel verkrijgbaar. Twee typen therapeutisch bruikbare recombinante 35 hGH-preparaten zijn op de markt: het authentieke, bv. Ge-notropine™, of Nutropine™, en een analoog met een extra methioninerest aan het N-terminale uiteinde, bv. Somato- 1028837- >1 2 norm™. hGH wordt gebruikt om lengtegroei te stimuleren in patiënten met hypopituïtaire dwerggroei, ook wel aangeduid als groeihormoondeficiëntie (GHD) of syndroom van Turner, maar andere indicaties zijn ook voorgesteld, waaronder 5 langdurige behandeling van gebrek aan groei bij kinderen die klein voor de zwangerschapsduur (SGA) werden geboren, ter behandeling van patiënten met het syndroom van Prader-Willi (PWS), chronische nierinsufficiëntie (CRI), AIDS-uittering, en veroudering.
10 Een belangrijk biologisch effect van groeihormoon (GH) is het bevorderen van groei in jonge zoogdieren en handhaving van weefsels in oudere zoogdieren. De beïnvloede orgaansystemen zijn onder meer het skelet, bindweefsel, spieren, en viscera zoals lever, darmen en nieren. Groei-15 hormonen oefenen hun effect uit door middel van wisselwerking met specifieke receptoren op de membraan van de doel-witcel. hGH is een lid van een familie van homologe hormonen, welke placentale lactogenen, prolactinen en andere genetische en soortvarianten van groeihormoon omvat (Ni-20 coll, C. S., et al. (1986) Endocrine Reviews 7:169). Van deze is hGH ongewoon in zoverre dat het een brede soort-specificiteit vertoont en bindt aan zowel de gekloonde so-matogene receptor (Leung, D. W., et al. (1987) Nature 330:537) alsook de prolactinereceptor (Boutin, J. M., et 25 al. (1988) Cell 53:69). Het gekloneerde gen voor hGH is in Escherichia coli tot expressie gebracht in een uitgescheiden vorm (Chang, C. N., et al. (1987) Gene 55:189), en de DNA- en aminozuursequentie ervan zijn gerapporteerd (Goed-del, et al. (1979) Nature 281: 544; Gray, et al. (1985) 30 Gene 39:247) .
Humaan groeihormoon (hGH) participeert in een groot deel van de regulering van normale humane groei en ontwikkeling. Dit hypofysehormoon vertoont een veelheid van biologische effecten zijn onder meer lengtegroei (somatogene-35 se), lactatie, activering van macrofagen, insulineachtige en diabetogene effecten (Chawla, R. K. (1983) Ann. Rev.
Med. 34:519; Edwards, C. K. et al. (1988) Science 239:769; 1028837 ___ _____i 3 1 1
Thomer, M. 0., et al. (1988) J. Clin. Invest. 81:745). Groeihormoondeficiëntie in kinderen leidt tot dwerggroei, wat reeds meer dan een decade succesvol wordt behandeld door exogene toediening van hGH).
5 Humaan groeihormoon (hGH) is een enkelketenig poly- peptide dat bestaat uit 191 aminozuren (molecuulgewicht 21500). Disulfidebindingen koppelen posities 53 en 165 en posities 182 en 189. Niall, Nature, New Biology, 230:90 (1971) . hGH is een potent anabool middel, met name door 10 retentie van stikstof, fosfor, kalium, en calcium. Behandeling van gehypofysectomiseerde ratten met GH kan ten minste een gedeelte van de groeisnelheid van de ratten herstellen. Moore et al., Endocrinology 122:2920-2926 (1988). Een van de meest opvallende effecten ervan op hy-15 popituïtaire (GH-deficiënte) individuen is versnelde leng-tegroei van botgroeiplaatkraakbeen, resulterend in een groter postuur. Kaplan, Growth Disorders in Children and Adolescents (Springfield, IL: Charles C. Thomas, 1964).
hGH veroorzaakt een verscheidenheid aan fysiologische 20 en metabole effecten in verschillende diermodellen, waaronder lengtegroei van bot, lactatie, activering van macro-fagen, insulineachtige en diabetogene effecten, en andere (R. K. Chawla et al., Annu. Rev. Med. 34:519 (1983); 0. G. P. Isaksson et al., Annu. Rev. Physiol. 47:483 (1985); C. 25 K. Edwards et al., Science 239:769 (1988); M. O. Thomer en M. L. Vance, J. Clin. Invest. 82:745 (1988); J. P. Hughes en H. G. Friesen, Ann. Rev. Physiol. 47:469 (1985)). Er is gerapporteerd dat, speciaal in vrouwen na menopause, GH-uitscheiding afneemt met toenemende leeftijd. Millard et 30 al., Neurobiol. Aging, 11:229-235 (1990); Takahashi et al., Neuroendocrinology M, L6- 137-142 (1987). Zie ook
Rudman et al., J. Clin. Invest., 67:1361-1369 (1981) en
Blackman, Endocrinology and Aging, 16:981 (1987). Daarenboven bestaat er een rapport dat sommige van de manifesta-35 ties van veroudering, waaronder verlaagd vetvrij lichaamsgewicht, expansie van vetweefselmassa, en verdunning van de huid, kunnen worden verminderd door middel van behande- 1028837
f I
4 ling met GH, drie maal per week. Zie bv. Rudman et al., N. Eng. J. Med., 323:1-6 (1990) en het vergezellende artikel in dezelfde uitgave door Dr. Vance (pp. 52-54) . Deze biologische effecten zijn het gevolg van de wisselwerking 5 tussen hGH en specifieke celreceptoren. Twee verschillende humane receptoren zijn gekloneerd, de lever-hGH-receptor (D. W. Leung et al., Nature 330:537 (1987)) en de humane prolactinereceptor (J. M. Boutin et al., Mol. Endocrinolo-gy 3:1455 (1989)). Het is echter waarschijnlijk dat er nog 10 andere zijn, waaronder de humane placentale lactogeenre-ceptor (M. Freemark, M. Corner, G. Komer, en S. Handwerger, Endocrinol. 120:1865 (1987)). Deze homologe receptoren bevatten een geglycosyleerd extracellulair hormoonbindings-domein, één enkel transmembraandomein, en een cytoplasma-15 tisch domein dat aanzienlijk verschilt in sequentie en grootte. Er wordt aangenomen dat één of meer receptoren een bepalende rol spelen bij de fysiologische respons op hGH.
Er wordt in het algemeen waargenomen dat fysiologisch 20 actieve eiwitten die in een lichaam worden toegediend hun farmacologische activiteit slechts gedurende een korte tijdsperiode kunnen vertonen, als gevolg van de hoge kla-ringssnelheid ervan in het lichaam. Voorts kan de relatieve hydrofobiciteit van deze eiwitten de stabiliteit en/of 25 oplosbaarheid ervan beperken.
Ter wille van verlaging van de klaringssnelheid, verbetering van de stabiliteit of het tenietdoen van de anti-geniciteit van therapeutische eiwitten, zijn een aantal werkwijzen voorgesteld waarbij de eiwitten chemisch worden 30 gemodificeerd met wateroplosbare polymeren. Chemische modificatie van dit type kan een proteolytisch enzym effectief verhinderen fysisch contact te hebben met de eiwit-hoofdketen zelf, zodat degradatie wordt verhinderd. Chemische aanhechting van.bepaalde wateroplosbare polymeren kan 35 klaring via de nieren effectief verminderen als gevolg van verhoogd hydrodynamisch volume van het molecuul. Verder voordelen zijn onder meer, onder bepaalde omstandigheden, 1028837
t I
5 verhoging van de stabiliteit en circulatietijd van het therapeutische eiwit, verhoging van de oplosbaarheid, en verlaging van de immunogeniteit. Poly(alkyleenoxide), met name poly(ethyleenglycol) (PEG), is zo'n chemische groep 5 die is gebruikt bij de bereiding van therapeutische eiwit-producten (waarbij het werkwoord "pegyleren" de betekenis heeft van het aanhechten van ten minste één PËG-molecuul). Er is aangetoond dat de aanhechting van po ly (ethyleenglycol) beschermt tegen proteolyse, Sada, et 10 al., J. Fermentation Bioengineering 71:137-139 (1991), en werkwijzen voor aanhechting van bepaalde poly (ethyleenglycol) -groepen zijn beschikbaar. Zie ÜS 4,179,337, Davis et al., "Non-Immunogenic Polypeptides", verleend op 18 dec. 1979; en US 4,002,531, Royer, "Modify-15 ing Enzymes with Polyethylene Glycol and Product Produced Thereby", verleend op 11 jan. 1977. Zie voor een overzicht Abuchowski et al., in Enzymes as Drugs♦ (J. S. Holcerberg en J. Roberts, red. pp. 367-383 (1981)).
Andere wateroplosbare polymeren zijn gebruikt, zoals 20 copolymeren van ethyleenglycol/propyleenglycol, carboxyme-thylcellulose, dextran, poly(vinylalcohol), poly (vinylpyrrolidon) , poly(-1,3-dioxolaan), poly(-1,3,6- trioxaan), ethyleen/maleïnezuuranhydride-copolymeer, poly-aminozuren (hetzij homopolymeren of random copolymeren).
25 Een aantal voorbeelden van gepegyleerde therapeuti sche eiwitten zijn beschreven. ADAGEN®, en gepegyleerde formulering van adenosinedeaminase, is goedgekeurd voor behandeling van ernstige gecombineerde immuundeficiëntie. ONCASPAR®, een gepegyleerd L-asparaginase is goedgekeurd 30 voor behandeling van hypergevoelige ALL-patiënten. Gepegyleerd superoxidedismutase is gebruikt in klinische trials voor behandeling van hoofdverwonding. Gepegyleerd a-interferon (US 5,738,846, 5,382,657) is goedgekeurd voor behandeling van hepatitis; er is gerapporteerd dat gepegy-35 leerd glucocerebrosidase en gepegyleerd hemoglobine preklinisch zijn getest. Een ander voorbeeld is gepegyleerd 1028837 1 « 6 IL-6, EP O 442 724, getiteld "Modified hIL-6", beschrijft poly(ethyleenglycol)-moleculen gehecht aan IL-6.
Een ander specifiek therapeutisch eiwit, dat chemisch is gemodificeerd, is granulocyt-koloniestimulerende-factor 5 (G-CSF). G-CSF induceert de snelle proliferatie en afgifte van neutrofiele granulocyten aan de bloedstroom, en verschaft aldus therapeutisch effect bij bestrijding van infectie. EP 0 401 384, gepubliceerd op 12 dec. 1990, getiteld "Chemically Modified Granulocyte Colony Stimulating 10 Factor", beschrijft materialen en werkwijzen voor het bereiden van G-CSF waaraan poly(ethyleenglycol)-moleculen zijn gehecht. Gemodificeerd G-CSF en analogen daarvan worden ook gerapporteerd in EP 0 473 268, gepubliceerd op 4 mrt. 1992, getiteld "Continuous Release Pharmaceutical 15 Compositions Comprising a Polypeptide Covalently Conjuga-ted Το A Water Soluble Polymer", waarin het gebruik van verschillende G-CSF's en derivaten, covalent geconjugeerd aan een wateroplosbaar deeltjesvormig polymeer, zoals poly (ethyleenglycol) . Een gemodificeerd polypeptide met hu-20 maan-granulocyt-kolonie-stimulerende-factor-activiteit is gerapporteerd in EP 0 335 423, gepubliceerd op 4 okt. 1989. In US 5,824,784 worden werkwijzen verschaft voor het N-terminaal modificeren van eiwitten of analogen daarvan, en resulterende preparaten, waaronder nieuwe N-terminaal 25 chemisch gemodificeerde G-CSF-preparaten. US 5,824,778 beschrijft chemisch gemodificeerd G-CSF.
Voor poly(ethyleenglycol) is een verscheidenheid aan werkwijzen gebruikt om de poly(ethyleenglycol)-moleculen te hechten aan het eiwit. In het algemeen worden po-30 ly(ethyleenglycol)-moleculen aan het eiwit gekoppeld via een in het eiwit aanwezige reactieve groep.
Aminogroepen, zoals die in lysineresten of aan de N-terminus, zijn geschikt voor dergelijke aanhechting. Bijvoorbeeld beschrijft Royer (US 4,002,531, zie hierboven) 35 dat reductieve alkylering werd gebruikt voor aanhechting van poly(ethyleenglycol)-moleculen aan een enzym. Chamow et al., Bioconjugate Chem. 5:133-140 (1990) rapporteert de 1028837 1 β 7 modificatie van CD4-immunoadhesine met monomethoxypo-ly(ethyleenglycol)aldehyde via reductieve alkylering. De auteurs rapporteren dat 50% van het CD4-Ig MePEG-gemodificeérd werd onder omstandigheden die controle over 5 de mate van pegylering toestonden. Ibid. op pagina 137. De auteurs rapporteren ook dat het in-vitro-bindingsvermogen van het gemodificeerde CD4-Ig (aan het eiwit gp 120) verminderde in een mate die verband hield met de mate van Me-PEGylering Ibid. ÜS 4,904,584, Shaw, verleend op 27 feb. 10 1990, heeft betrekking op de modificatie van het aantal lysineresten in eiwitten voor de aanhechting van po-ly(ethyleenglycol)-moleculen via reactieve aminegroepen.
WO 93/00109 heeft betrekking op een werkwijze voor het stimuleren van de GH-responsieve weefsels van een 15 zoogdier of vogel, omvattende handhaving van een continue effectieve plasma-GH-concentratie gedurende een periode van 3 of meer dagen. Één wijze voor het bewerkstelligen van een dergelijke plasmaconcentratie wordt beschreven te geschieden met behulp van GH dat is gekoppeld aan een ma-20 cromoleculaire stof zoals PEG (polyethyleenglycol). De koppeling aan een macromoleculaire stof wordt beschreven te resulteren in een verbeterde halfwaardetijd. GePEGy-leerd humaan groeihormoon is gerapporteerd in WO 93/00109 met gebruikmaking van mPEG-aldehyde-5000 en mPEG-N-25 hydroxysuccinimidylester (mPEG-NHS-5000). Het gebruik van mPEG-NHS resulteerde in heterogene mengsels van meervoudig gePEGyleerde vormen van hGH. WO 93/00109 beschrijft ook het gebruik van mPEG-maleïmide om cysteïne-hGH-varianten te PEGyleren.
30 WO 99/03887 beschrijft een cysteïne-afwijkend groei hormoon dat gePEGyleerd is. Beweerd wordt, dat dit conju-gaat, aangeduid als BT-005, effectiever is in het stimuleren van gewichtstoename in groeihormoondeficiënte ratten en een langere halfwaardetijd heeft dan hGH.
35 GePEGyleerd humaan groeihormoon is ook gerapporteerd in Clark et al., waarbij gebruik werd gemaakt van de suc-cinimidylester van gecarboxymethyleerd PEG (Journal of Bi- 1028837 V i ) 8 ological Chemistry 271:21969-21977/ 1996). Clark et al.
beschrijven derivaten van hGH van toenemende grootte, met gebruikmaking van mPEG-NHS-5000, wat selectief conjugeert aan primaire amines. Toenemende niveaus van PEG-5 modificatie verminderde de affiniteit voor de receptor ervan en verhoogde de EC50 in een celgebaseerd assay tot 1500-voudig. Olson et al., Polymer' Preprints 38:568-569, 1997, beschrijft het gebruik van N-hydroxysuccinimide-(NHS) -PEG en succinimidylpropionaat- (SPA) -PEG om meer-10 voudig gePEGyleerde hGH-species te verwezenlijken.
WO 94/20069 beschrijft op profetische wijze gePEGy-leerd hGH als deel van een formulering voor aflevering aan de longen.
ÜS 4,179,337 beschrijft werkwijzen voor het PEGyleren 15 van enzymen en hormonen om fysiologisch actieve niet-immunogene, wateroplosbare polypeptideconjugaten te verkrijgen. GH wordt genoemd als één voorbeeld van een te PEGyleren hormoon.
EP 458064 A2 beschrijft PEGylering van geïntroduceer-20 de of natuurlijk aanwezige cysteïneresten in somatotropi-ne. EP 458064 A2 noemt voorts de inbouw van twee cysteïneresten in een lus genaamd de omega-lus, welke zou worden gevormd door resten 102-112 in wildtype rundersomatotropi-ne, meer specifiek beschrijft EP 458064 A2 de substitutie 25 van de resten met nummer 102 en 112 van rundersomatotropi-ne van, respectievelijk, Ser naar Cys en Tyr naar Cys.
WO 95/11978 stelt aanhechting voor van PEG aan de thiogroep van een cysteïnerest die hetzij aanwezig is in het oorspronkelijke molecuul of geïntroduceerd is door 30 middel van plaatsspecifieke mutagenese. WO 95/11987 heeft betrekking op PEGylering van protease nexine-1, maar PEGylering in het algemeen van hGH en andere eiwitten wordt ook voorgesteld.
WO 99/03887 beschrijft, bv., groeihormoon gemodifi-35 ceerd door middel van insertie van extra cys-25-serine-resten en aanhechting van PEG aan het geïntroduceerde cysteïneresten.
1028837 • t 9 WO 00/42175 heeft betrekking op een werkwijze voor het maken van eiwitten die vrije cysteïneresten bevat voor aanhechting van PEG. WO 00/42175 beschrijft de navolgende mutaties van hGH: T3C, S144C en T148C en de cysteïne- 5 PEGylering daarvan.
WO 97/11178 (evenals ÜS 5849535, ÜS 6004931, en US 6022711) heeft betrekking op het gebruik van GH-varianten als agonisten of antagonisten van hGH. WO 97/11178 beschrijft ook PEGylering van hGH, waaronder lysine-10 PEGylering en de introductie of vervanging van lysine (bv. K168A en K172R). WO 97/11178 beschrijft ook de substitutie G120K.
WO 03/044056 beschrijft een verscheidenheid aan ge-PEGyleerde hGH-species, waaronder een vertakt-40K-PEG-15 aldehyde-hGH-conjugaat.
De voorgaande rapporten van gePEGyleerd hGH vereisen de aanhechting van meerder PEG's, wat resulteert in onwenselijke productheterogeniteit, om een hydrodynamisch volume te bereiken dat groter is dan de molecuulgewichtsdrem-20 pel van 70 kDa van de nierfiltratie zoals beschreven (Knauf, M.J. et al., J. Biol. Chem. 263:15064-15070, 1988).
Momenteel geschiedt toediening van rhGH dagelijks gedurende een lange periode, en derhalve zou een minder fre-25 quente toediening zeer wenselijk zijn. Een hGH-molecuul met een langere circulatiehalfwaardetijd zou het aantal noodzakelijke toedieningen verminderen en potentieel meer optimale therapeutische hGH-niveaus verschaffen met een daarmee gepaard gaand verhoogd therapeutisch effect.
30 Ondanks een aantal pogingen om hGH te PEGyleren, be staat er nog steeds een onvervulde behoefte aan een gePEGyleerd hGH-molecuul met de geschikte eigenschappen om een levensvatbaar commercieel product te zijn. De onderhavige uitvinding verschaft PEG-hGH-conjugaten met één enkel 35 PEG voornamelijk gehecht aan het N-terminale fenylalanine van hGH, wat voordelen verschaft ten opzichte van andere PEG-hGH-conjugaten. De hechting van meerdere PEG's met een 1028837 < % 10 laag molecuulgewicht (5 kD) aan a- of ε-amineplaatsen (N-terminus en negen lysines in hGH) met behulp van mPEG-aldehyde-5000 of mPEG-N-hydroxysuccinimidyl-ester (mPEG-NHS-5000) is beschreven in WO 93/00109, Clark et al.
5 (Journal of Biological Chemistry 271:21969-21977, 1996, en
Olsen et al. (Polymer Preprints 38:568-569, 1997). Dit resulteert in een heterogene populatie. Ter illustratie, hGH met negen lysines kan een aantal moleculen hebben met tien PEG1s eraan gehecht, een aantal met negen, een aantal met 10 acht, een aantal met zeven, een aantal met zes, een aantal met vijf, een aantal met vier, een aantal met drie, een aantal met twee, een aantal met één en een aantal met nul. En bij de moleculen met een aantal PEG’s, is de PEG mogelijk niet aan de zelfde plaats gehecht op verschillende 15 moleculen. Deze resulterende heterogeniteit is nadelig bij ontwikkeling van een therapeutisch product, want maakt conjugatie, zuivering en karakterisering moeilijk, duur, en zeer slecht reproduceerbaar. Een andere aanpak (WO 00/42175) bestaat uit het gebruik van hGH-varianten die 20 vrije cysteïneresten bevatten voor aanhechting van PEG. Deze aanpak kan echter leiden tot op onjuiste wijze gevouwen eiwit met onjuist gepaarde disulfidebindingen en resulteren in een heterogeen gePEGyleerd product waarbij de PEG is gehecht aan enkele of alle cysteïnes. Hechting van 25 meerdere PEG's aan meerder plaatsen kan leiden tot moleculen die minder stabiele bindingen bezitten tussen de PEG en de verschillende plaatsen, welke gedissocieerd kunnen raken met verschillende snelheden. Dit maakt het moeilijk om de farmacokinetiek van het product accuraat te voor-30 spellen, wat resulteert in onnauwkeurige dosering. Een heterogeen product leidt ook tot ongewenste problemen bij het verkrijgen van de voorgeschreven goedkeuring voor het therapeutische product.
Derhalve zou het wenselijk zijn om een gePEGyleerd 35 hGH-molecuul te hebben met één enkele PEG gehecht aan één enkele plaats. De onderhavige uitvinding komt op een aantal wijzen aan deze behoefte tegemoet.
102883/ • « 11
SAMENVATTING VAN DE UITVINDING
De onderhavige uitvinding heeft betrekking op chemisch gemodificeerd hGH en agonistische varianten daarvan, die ten minste één verbeterde chemische of fysiologische 5 eigenschap bezitten, gekozen uit maar niet beperkt tot verlaagde klaringssnelheid, verhoogde plasmaverblijfsduur, verhoogde stabiliteit, verhoogde oplosbaarheid, en verlaagde antigeniciteit. Zoals hieronder in meer detail beschreven, heeft de onderhavige uitvinding derhalve een 10 aantal aspecten die betrekking hebben op het chemisch modificeren van polypeptiden, waaronder maar niet beperkt tot hGH en agonistische varianten daarvan, alsook op specifieke modificaties met behulp van een poly(ethyleen-glycol)butyraldehydegroep.
15 De onderhavige uitvinding heeft ook betrekking op werkwijzen voor het produceren van het chemisch gemodificeerde hGH en agonistische varianten daarvan. In het bijzonder heeft de onderhavige uitvinding betrekking op een werkwijze voor het produceren van een chemisch gemodifi-20 ceerd hGH onder gebruik van butyraldehyde, wat leidt tot grotere N-terminale selectiviteit van aanhechting.
De onderhavige uitvinding heeft ook betrekking op preparaten die het chemisch gemodificeerde hGH en agonistische varianten daarvan omvatten.
25 Het gemodificeerde hGH en agonistische varianten daarvan van de onderhavige uitvinding kunnen bruikbaar zijn bij de behandeling van, maar niet beperkt tot, dwerg-groei (GHD), Volwassen GHD), het syndroom van Turner, langdurige behandeling van gebrek aan groei bij kinderen 30 die klein voor de zwangerschapsduur (SGA) werden geboren, ter behandeling van patiënten met het syndroom van Prader-Willi (PWS), chronische nierinsufficiëntie (CRI), AIDS-uittering, veroudering, terminale nierinsufficiëntie, en cystische fibrose.
1028837 35 « · 12
KORTE BESCHRIJVING VAN DE TEKENINGEN
Figuur 1 is een HPLC-chromatogram van trypsinedi-gestiekarteringsanalyse van de reactie van hGH en 40K-5 vertaJct-butyraldehyde-hGH of 40K-vertakt-aldehyde-hGH. Het bovenste paneel is de trypsinedigestiekartering van 40K-Vertakt-butyraldehyde-hGH. Het middelste paneel is de trypsinedigestiekartering van 40K-Vertakt-aldehyde-hGH. Het onderste paneel is de trypsinedigestiekartering van 10 ongePEGyleerd hGH. Tl is het N-terminale trypsinedigestie-fragment.
Figuur 2 toont de aminozuursequentie van humaan groeihormoon (SEQ ID NO:l).
Figuur 3 toont 40-K-Vertakt-butyraldehyde-hGH-15 effectiviteit in Ratten-Gewichtstoename-Assay. Gehypofy-sectomiseerde vrouwelijke Sprague-Dawley-ratten werden gekocht op een leeftijd van 4-5 weken (100-125 g) van Harlan Labs. Na binnenkomst in de dierverblijven werden de dieren gehouden bij een constante kamertemperatuur van 80°F en 20 dagelijks gewogen gedurende 4-1Ö dagen om basale groei-snelheden vast te stellen. Startend op dag 0 kregen ratten (-100 g) in controlegroepen vervolgens één dagelijkse sub-cutane injectie van ~0,3 mg/kg hGH (dichte cirkels), of PBS (open cirkels), gedurende elf opeenvolgende dagen. De 25 40K-Vertakt-butyraldehyde-hGH-testgroep (dichte vierkanten) ontving enkelvoudige doses van 1,8 mg/kg PHA-794428 op dagen 0 en 6. Er waren 8-10 dieren per groep. Gemiddelde groei +/- SEM is uitgezet.
Figuur 4 toont de Dosis-Responsieve Groeibevorderende 30 Effecten van 40K-Vertakt-butyraldehyde-hGH in Ratten. Dit effectiviteitsonderzoek werd uitgevoerd op een vergelijkbare wijze als beschreven in Figuur 3, met dit verschil, dat een variërende enkelvoudige dosis aan 40K-Vertakt-butyraldehyde-hGH werd toegediend (alleen op dag 0) en dat 35 het onderzoek 6 dagen liep. Controlegroepen ontvingen een-maal-dagelijkse injecties van hetzij 0,3 mg/kg hGH (dichte cirkels), of PBS-vehikel (open cirkels) gedurende zes op- 1 0 288 37 • » 13 eenvolgende dagen. 40K-Vertakt-butyraldehyde-hGH werd gedoseerd op 1,8 rag/kg {dichte vierkanten), 0,6 mg/kg (open vierkanten), 0,2 mg/kg (dichte driehoeken) of 0,067 mg/kg (open driehoeken). Er waren 8 dieren per groep.
5 Figuur' 5 toont tibiale groei in respons op 40K-
Vertakt-butyraldehyde-hGH. Gehypofysectomieerde ratten werden behandeld zoals beschreven in Figuur 3. Op dag 11 werden de dieren gedood, linker tibia werden verwijderd en onderworpen aan Röntgenfotografie en botlengtes werden ge-10 meten met behulp van een schuifmaat. Gemiddelde lengte +/-SEM is uitgezet. Sterretjes wijzen op significante verschillen ten opzichte van de controle (p<0,05).
Figuur 6 toont plasma-IGF-l-niVeaus voor een zesdaags effectiviteitsonderzoek. Dieren werden behandeld zoals be-15 schreven in Figuur 4. Bloedmonsters werden genomen op de verschillende tijden en de serum-IGF-l-niveaus werden bepaald door middel van ELISA. Uitgezet zijn gemiddelden +/-SEM.
20 GEDETAILLEERDE BESCHRIJVING
hGH en agonistische varianten daarvan zijn leden van een familie van recombinante eiwitten, beschreven in US
4,658,021 (methionyl-humaan-groeihormoon - Met-l-191-hGH) en US 5,633,352. Hun recombinante productie en gebruiks-25 werkwijzen zijn beschreven in US 4,342,832, 4,601,980; US 4,898,830; US 5,424,199; en US 5,795,745.
Elk gezuiverd en geïsoleerd hGH of agonistische variant daarvan, welke wordt geproduceerd door gastheercellen zoals E. coli en dierlijke cellen die zijn getransformeerd 30 of getransfecteerd met behulp van recombinant-genetische technieken, kan worden gebruikt in de onderhavige uitvinding. Andere hGH-varianten zijn beschreven in US 6,143,523 en WO 92/09690, gepubliceerd op 11 juni 1992. Van deze geniet hGH of agonistische variant daarvan, die wordt gepro-35 duceerd door de getransformerde E. coli in het bijzonder de voorkeur. Een dergelijk hGH of agonistische variant daarvan kan worden verkregen in grote hoeveelheden met ho- 1 02883/" t t 14 ge zuiverheid en homogeniteit. Bijvoorbeeld kan de bovengenoemde hGH of agonistische variant daarvan worden bereid volgens een werkwijze beschreven in US 4,342/832, 4,601,980; ÜS 4,898,830; ÜS 5,424,199; en US 5,795,745. De 5 term "heeft nagenoeg de volgende aminozuursequentie" betekent dat deze aminozuursequentie één of meer aminozuurver-anderingen (deletie, additie, insertie of vervanging) kan bevatten, zolang dergelijke veranderingen geen nadelige niet-vergelijkbaarheid in functie met hGH of agonistische 10 variant daarvan veroorzaken. Het heeft meer de voorkeur om het hGH óf agonistische variant daarvan te gebruiken die nagenoeg een aminozuursequentie heeft waarin ten minste één lysine, asparaginezuur, glutaminezuur, ongepaarde cys-teïnerest, een vrije N-terminale α-aminogroep of een vrije 15 C-terminale carboxylgroep aanwezig is.
Volgens de onderhavige uitvinding wordt po-ly(ethyleenglycol) covalent gebonden via aminozuurresten van hGH of agonistische variant daarvan. Een verscheidenheid aan geactiveerde poly(ethyleenglycol)en met een aan-20 tal verschillende functionele groepen, koppelgroepen, configuraties, en molecuulgewichten zijn de vakman bekend en kunnen worden gebruikt om PEG-hGH-conjugaten of PEG-hGH-agonistische-variant-conjugaten te creëren (zie voor overzichten Roberts M.J. et al., Adv. Drug Del. Rev. 54:459-25 476, 2002, Harris J.M. et al, Drug Delivery Systems 40:538-551, 2001). De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze van gebruik van aldehydechemie om selectiviteit van de PEG-groep te richten op de N-terminus, met gebruikmaking van een butyrylaldehyde-30 koppelgroep. De butyrylaldehyde-koppelgroép resulteert in verhoogde N-terminale specificiteit in vergelijking met acetaldehyde-koppelgroep (Tabel 1 en Figuur 1).
Een uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding is een humaan-groeihormoon-PEG-conjugaat met de structuur van 35 Formule I of Formule II
102883/ « » 15
O
11
mPEO-σ—C-NH
CH2 CH3 O n
mPEG—O—C—^C-N—(CHjCHiOyCHj^C-NH-R
H B
o O
Formule I of
O
mPEG*0(CH2CH20)n(CH2)ml-NH-R
5
Formule II
waarin n een geheel getal is tussen 1 en 10; m een geheel getal is tussen 1 en 10; 10 R staat voor humaan groeihormoon, methionyl-groeihormoon of een humaan-groeihormoon-variant.
Een specifieke uitvoeringsvorm is een humaan-groeihormoon-PEG-conjugaat met de structuur;
O
II
inPEG-O—C-NH
{* CH2 O jj
mPEG-0—C—VC~N— (CH2CH20)4CH2CH2CH2Cj-NH-R ° O
15 of
O
1028837 mPEGO(CH2CH20)4CH2CH2CH2C-NH-R
• t 16 waarin R staat voor humaan groeihormoon, methionyl-groeihormoon of een humaan-groeihormoon-variant.
5 Een andere specifieke uitvoeringsvorm van de onderha vige uitvinding is humaan-groeihormoon-PEG-conjugaat waarin het humaan groeihormoon de aminozuursequentie heeft van SEQ ID NO:1.
Een specifieke uitvoeringsvorm van de onderhavige 10 uitvinding is een humaan-groeihormoon-PEG-conjugaat waarin meer dan 80%, meer bij voorkeur 81%, meer bij voorkeur 82%, meer bij voorkeur 83%, meer bij voorkeur 84%, meer bij voorkeur 85%, meer bij voorkeur 86%, meer bij voorkeur 87%, meer bij voorkeur 88%, meer bij voorkeur 89%, meer 15 bij voorkeur 90%, meer bij voorkeur 91%, meer bij voorkeur 92%, meer bij voorkeur 93%, meer bij voorkeur 94%, meer bij voorkeur 95%, meer bij voorkeur 96%, meer bij voorkeur 97%, en meer bij voorkeur 98% van het polyethyleenglycol is geconjugeerd aan het aminoterminale fenylalanine van de 20 aminozuursequentie van SEQ ID NO:l.
Een andere specifieke uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding is een humaan-groeihormoon-PEG-conjugaat waarin meer dan 90% van het polyethyleenglycol is geconjugeerd aan het aminoterminale fenylalanine van de amino- 25 zuursequentie van SEQ ID NO:l.
Een andere specifieke uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding is een humaan-groeihormoon-PEG-conjugaat waarin meer dan 95% van het polyethyleenglycol is geconjugeerd aan het aminoterminale fenylalanine van de amino- 30 zuursequentie van SEQ ID NO:l.
Een andere specifieke uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding is een humaan-groeihormoon-PEG-conjugaat waarin meer dan 98% van het polyethyleenglycol is geconju- j geerd aan een aminoterminale fenylalanine van de amino- 35 zuursequentie van SEQ ID N0:1.
Het in de onderhavige uitvinding gebruikte po- , ly(ethyleenglycol) is niet beperkt tot een bepaalde vorm 102883/
_________ _I
i I
17 of molecuulgewichtsbereik. Het molecuulgewicht van het po-ly(ethyleenglycol) kan liggen tussen ongeveer 500 en ongeveer 100000 Dalton. De term "ongeveer" geeft aan dat in preparaten van polyethyleenglycol sommige moleculen meer 5 zullen wegen, sommige minder, dan het aangegeven molecuulgewicht en dat het aangegeven molecuulgewicht betrekking heeft op het gemiddelde molecuulgewicht. Er zij begrepen dat er een zeker mate van polydispersiteit geassocieerd is met polymeren zoals poly(ethyleenglycol). Het heeft de 10 voorkeur PEG's te gebruiken met lage polydispersiteit. Gewoonlijk wordt een PEG met een molecuulgewicht van ongeveer 500 tot ongeveer 60000 gebruikt. Een specifiek PEG-molecuulgewichtsgebied van de onderhavige uitvinding is van ongeveer 1000 tot ongeveer 40000. In een andere speci-15 fieke uitvoeringsvorm is het PEG-molecuulgewicht groter dan ongeveer 5000 tot ongeveer 40000. In een andere specifieke uitvoeringsvorm loopt het PEG-molecuulgewicht van ongeveer 20000 tot ongeveer 40000. Andere groottes kunnen worden gebruikt, afhankelijk van het gewenste therapeuti-20 sche profiel (bv. gewenste duur van aanhoudende afgifte, de eventuele effecten op biologische activiteit, de mate of gebrek aan antigeniciteit en andere bekende effecten van het polyethyleen op een therapeutisch eiwit. Bijvoorbeeld kan het polyethyleenglycol een genmiddeld molecuul-25 gewicht hebben van ongeveer 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10000, 10500, 11000, 11500, 12000, 12500, 13000, 13500, 14000, 14500, 15000, 15500, 16000, 16500, 17000, 17500, 18000, 18500, 19000, 30 19500, 20000, 25000, 30000, 35000, 40000, 45000, 50000, 55000, 60000, 65000, 70000, 75000, 80000, 85000, 90000, 95000, of 100000 Dalton.
In een andere uitvoeringsvorm is het po
ly (ethyleenglycol) een vertakt PEG met meer dan één PEG-35 groep aangehecht (zie US 5,932,462; US 5,342,940; US 5,643,575; US 5,919,455; US 6,113,906; US 5,183,660; Ko-dera Y., Bioconjugate Chemistry 5:283-288 (1994); en WO
102883/
I I
18 02/09766. In een voorkeursuitvoeringsvorm is het molecuul-gewicht van elk poly(ethyleenglycol) van het vertakte PEG ongeveer 5000-20000. In een specifieke uitvoeringsvorm is het molecuulgewicht van elk poly(ethyleenglycol) van het 5 vertakte PEG ongeveer 20000.
Poly(alkyleenoxide)n, met name poly(ethyleengly-col)en, zijn worden gebonden aan hGH of agonistische variant daarvan via een terminale reactieve groep, welke al dan niet een koppelende groep (spacer) kan achterlaten 10 tussen het PEG en het eiwit. Teneinde de hGH-conjugaten of agonistische variant daarvan van de onderhavige uitvinding te vormen worden polymeren zoals poly(alkyleenoxide) omgezet in geactiveerde vormen, zoals deze term bekend is aan de vakman. De reactieve groep is bijvoorbeeld een termina-15 le reactieve groep, de een binding medieert tussen chemische groepen op het eiwit en poly(ethyleenglycol). Kenmerkend worden één of beide van de terminale polymeer-hydroxyl-eindgroepen, (i.e. de alfa- en omega-terminale hydroxylgroepen) omgezet in reactieve functionele groepen, 20 wat covalente conjugatie mogelijk maakt. Deze werkwijze wordt vaak aangeduid als "activering" en het poly (ethyleenglycol) product met de reactieve groep wordt in het navolgende aangeduid als "een geactiveerd poly (ethyleenglycol)". In een specifieke uitvoeringsvorm 25 wordt één van de terminale polymeer-hydroxyl-eindgroepen omgezet of afgedekt met een niet-reactieve groep. In een specifieke uitvoeringsvorm wordt één van de terminale polymeer-hydroxyl-eindgroepen omgezet of afgedekt met een methylgroep. Zoals hier gebruikt heeft de term "mPEG" be-30 trekking op een PEG die aan één uiteinde is afgedekt met een methylgroep. Het mPEG kan structureel worden weergegeven als
CH30-(CH2CH20)„-H
35
Polymeren die zowel a- als ε-koppelgroepen bevatten worden aangeduid als "bis-geactiveerde poly(alkyleen- 1 0 286..
I > 19 oxiden)" en worden aangeduid als "bifunctioneel". Polymeren die dezelfde reactieve groepen bevatten op a- en ω-terminale hydroxylen worden soms aangeduid als "homobi-functioneel" of "homobis-geactiveerd". Polymeren die ver-5 schillende reactieve groepen bevatten op a- en ω-terminale hydroxylen worden soms aangeduid als "heterobifunctioneel" (zie bijvoorbeeld WO 01/26692) of "heterobis-geactiveerd". Polymeren die een enkele reactieve groep bevatten worden aangeduid als "mono-geactiveerde" polyalkyleenoxiden of 10 "monofunctioneel". Andere nagenoeg niet-antigene polymeren worden op vergelijkbare wijze "geactiveerd" of "gefunctio-naliseerd".
De geactiveerde polymeren zijn aldus geschikt voor het medieren van een binding tussen chemische groepen op 15 het eiwit, zoals a- of ε-amino-, carboxyl- of thiolgroe-pen, en poly(ethyleenglycol). Bis-geactiveerde polymeren kunnen op deze wijze reageren met twee eiwitmoleculen of één eiwitmolecuul en een reactief klein molecuul in een andere uitvoeringsvorm om zo eiwitpolymeren of eiwit-20 klein-molecuul-conjugaten te vormen via verknopingen.
In één voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding worden secundaire amine- of amindekoppelingen gevormd met gebruikmaking van de N-terminale α-aminogroep of ε-aminogroepen van lysine van hGH of agonistische variant 25 daarvan en het geactiveerde PEG. In een ander voorkeursaspect van de uitvinding wordt een secundaire aminekoppeling gevormd tussen de N-terminale primaire a- of ε-aminogroep van hGH of agonistische variant daarvan en enkelvoudig of vertakte-keten-PEG-aldehyde door middel van reductieve 30 alkylering met een geschikt reductiemiddel zoals NaCNBH3, NaBH3, Pyridineboraan enz. zoals beschreven in Chamow et al., Bioconjugate Chem. 5:133-140 (1994), ÜS 4,002,531, WO 90/05534, en US 5,824,784.
In een voorkeursuitvoeringsvorm is ten minste 70%, 35 bij voorkeur ten minste 80%, bij voorkeur ten minste 81%, bij voorkeur ten minste 82%, bij voorkeur ten minste 83%, bij voorkeur ten minste 84%, bij voorkeur ten minste 85%, 1028837 20 bij voorkeur ten minste 86%, bij voorkeur ten minste 87%, bij voorkeur ten minste 88%, bij voorkeur ten minste 89%, bij voorkeur ten minste 90%, bij voorkeur ten minste 91%, bij voorkeur ten minste 92%, bij voorkeur ten minste 93%, 5 bij voorkeur ten minste 94%, bij voorkeur ten minste 95%, bij voorkeur ten minste 96%, bij voorkeur ten minste 97%, en liefst ten minste 98% van het poly (ethyleenglycol) op de aminoterminale a-aminogroep.
Conjugatiereacties, aangeduid als pegyleringsreac-10 ties, werden oorspronkelijk uitgevoerd in oplossing met een molaire overmaat aan polymeer en zonder acht te slaan op waar het polymeer zal hechten aan het eiwit. Dergelijke algemene technieken zijn echter gewoonlijk ongeschikt gebleken voor het conjugeren van bioactieve eiwitten aan 15 niet-antigene polymeren met behoud van voldoende bioacti-viteit. Één wijze om de bioactiviteit van het hGH of ago-nistische variant daarvan te behouden, is om conjugatie van die reactieve groepen van hGH of agonistische variant daarvan, die verband houden met de receptorbindings-20 plaats(en), te vermijden tijdens het polymeerkoppelings-proces. Een ander aspect van de onderhavige uitvinding is het verschaffen van een werkwijze voor het conjugeren van poly(ethyleenglycol) aan hGH of agonistische variant daarvan, waarbij hoge niveaus van overblijvende activiteit 25 worden behouden.
De chemische modificatie via een covalente binding kan worden uitgevoerd onder alle mogelijke geschikte omstandigheden die gewoonlijk worden toegepast bij een reactie van een biologisch actieve stof met het geactiveerde 30 poly(ethyleenglycol). De conjugatiereactie wordt uitgevoerd onder relatief milde omstandigheden om inactivering van het hGH of agonistische variant daarvan te vermijden. Milde omstandigheden omvatten handhaving van de pH van de reactieoplossing in het gebied van 3 tot 10 en van de re-35 actietemperatuur binnen een gebied van ongeveer 0°-37°C. In gevallen waarbij de reactieve aminozuurresten in hGH of agonistische variant daarvan vrije aminogroepen bezitten, 1028837 21 wordt de modificatie bij voorkeur uitgevoerd in een niet-beperkende lijst van geschikte buffers (pH 3 tot 10), omvattende fosfaat, MES, citraat, acetaat, succinaat of HEPES, gedurende 1-48 uur bij 4°-37°C. Wanneer N-terminale 5 aminogroepen het doelwit zijn van reagentia zoals PEG-aldehyden wordt bij voorkeur een pH van 4-7 gehandhaafd. Het geactiveerde poly(ethyleenglycol) kan worden gebruikt in een hoeveelheid van ongeveer 0,01-100 maal, bij voorkeur ongeveer 0,01-2,5 maal, de molaire hoeveelheid van 10 het aantal vrij aminogroepen van hGH of agonistische variant daarvan. Aan de andere kant wordt, wanneer reactieve aminozuurresten in hGH of agonistische variant daarvan de vrije carboxylgroepen bezitten, de modificatie bij voorkeur uitgevoerd bij een pH van ongeveer 3,5 tot ongeveer 15 5,5, bijvoorbeeld wordt de modificatie met po ly (oxyethyleendiamine) uitgevoerd in aanwezigheid van car-bodiimide (pH 4-5) gedurende 1-24 uur bij 4°-37°C. Het geactiveerde poly(ethyleenglycol) kan worden gebruikt in een hoeveelheid van 0,01-300 maal de molaire hoeveelheid van 20 het aantal vrije carboxylgroepen van hGH of agonistische variant daarvan.
In afzonderlijke uitvoeringsvormen overschrijdt de bovengrens voor de hoeveelheid polymeer die wordt gebruikt in de conjugatiereactie ongeveer 1:1 in die zin dat het 25 mogelijk is om de geactiveerde polymeer en hGH of agonistische variant daarvan te laten reageren zonder een aanzienlijke hoeveelheid van species met een hoog molecuulge-wicht te vormen, i.e. zonder dat meer dan ongeveer 20% van de conjugaten meer dan ongeveer één streng polymegr bevat 30 per molecuul aan hGH of agonistische variant daarvan. In dit aspect van de uitvinding wordt bijvoorbeeld beoogd dat verhoudingen tot ongeveer 6:1 kunnen worden gebruikt om aanzienlijke hoeveelheden van de gewenste conjugaten te vormen die vervolgens kunnen worden geïsoleerd van alle 35 species met een hoog molecuulgewicht.
In een ander aspect van de onderhavige uitvinding kunnen bifunctioneel geactiveerde PEG-derivaten worden ge- 1028837
» I
22 bruikt om polymere hGH- of agonistische variant daarvan -PEG-moleculen te genereren waarbij meerdere hGH- of agonistische variant daarvan -moleculen worden verknoopt via PEG. Hoewel de hierin beschreven reactieomstandigheden 5 kunnen resulteren in aanzienlijke hoeeelhèden aan ongemodificeerd hGH of agonistische variant daarvan, kan het ongemodificeerde hGH of agonistische variant daarvan eenvoudig worden gerecycleerd in volgende batches voor verdere conjugatiereacties. De werkwijzen van de onderhavige uit-10 vinding genereren verrassenderwijs zeer weinig, i.e. minder dan ongeveer 30% en meer bij voorkeur, minder dan ongeveer 10%, aan species met een hoog molecuulgewicht en species die meer dan één polymeerstreng bevatten per hGH of agonistische variant daarvan. Deze reactieomstandighe-15 den staan in tegenstelling met die welke kenmerkend worden gebruikt voor polymere conjugatiereacties waarin de geactiveerde polymeer aanwezig is in verscheidene malen molai-re overmaat ten opzichte van het doelwit. In andere aspecten van de uitvinding is het polymeer aanwezig in hoeveel-20 heden van vanaf ongeveer 0,1 tot ongeveer 50 equivalenten per equivalent aan hGH of agonistische variant daarvan.
De conjugatiereacties van de onderhavige uitvinding verschaffen in eerste instantie een reactiemengsel dat of -pool die mono- en di-PEG-hGH-conjugaten, ongereageerd 25 hGH, ongereageerd polymeer, en gewoonlijk minder dan 20% species met een hoog molecuulgewicht bevat. De species met een hoog molecuulgewicht zijn onder meer conjugaten die meer dan één polymeerstreng bevatten en/of gepolymeriseer-de species van PEG-hGH of agonistische variant daarvan. 30 Nadat de ongereageerde species en species met een hoog molecuulgewicht zijn verwijderd, worden preparaten verkregen die hoofdzakelijk mono- en di-polymeer-hGH- of agonistische variant daarvan -conjugaten bevatten. Gezien het feit dat de conjugaten voor het grootste deel een enkele poly-35 meerstreng bevatten, zijn de conjugaten nagenoeg homogeen. Deze gemodificeerde hGH's of agonistische variant daarvan hebben ten minste ongeveer 0,1% van de in vitro biologi- 1028837 23 sche activiteit die behoort bij het natieve of ongemodificeerde hGH of agonistische variant daarvan, zoals gemeten met behulp van standaard FDC-Pl-celproliferatieassays (Clark et al., Journal of Biological Chemistry 271:21969-5 21977, 1996), receptorbindingsassays (US 5,057,417), of groei van gehypofysectomiseerde ratten (Clark et al., Journal of Biological Chemistry 271:21969-21977, 1996). In voorkeursaspecten van de uitvinding hebben de gemodificeerde hGH's of agonistische variant daarvan ongeveer 25% 10 van de in vitro biologische activiteit, meer bij voorkeur hebben de gemodificeerde hGH's of agonistische variant daarvan ongeveer 50% van de in vitro biologische activiteit, meer bij voorkeur hebben de gemodificeerde hGH's of agonistische variant daarvan ongeveer 75% van de in vitro 15 biologische activiteit, en meest bij voorkeur hebben de gemodificeerde hGH's of agonistische variant daarvan equivalente of verbeterde in vitro biologische activiteit.
De werkwijzen van de onderhavige uitvinding omvatten bij voorkeur nogal beperkte verhoudingen van polymeer ten 20 opzichte van hGH of agonistische variant daarvan. Zo bleken de conjugaten van hGH of agonistische variant daarvan hoofdzakelijk beperkt te zijn tot species die slechts één polymeerstreng bevatten. Verder is de aanhechting van het polymeer aan de reactieve groepen van het hGH of agonisti-25 sche variant daarvan aanzienlijk minder willekeurig dan wanneer een hogere molaire overmaat aan polymeerkoppelaar wordt gebruikt. Het in het reactiemengsel aanwezige ongemodificeerde hGH of agonistische variant daarvan kan, nadat de conjugatiereactie is gestopt, worden gerecycleerd 30 in volgende reacties, met behulp van ionenuitwisselings- of grootte-uitsluitingschromatografie of vergelijkbare scheidingstechnieken.
Een poly(ethyleenglycol)-gemodificeerd hGH of agonistische variant daarvan, namelijk chemisch gemodificeerd 35 eiwit volgens de onderhavige uitvinding, kan worden gezuiverd uit een reactiemengsel door middel van conventionele werkwijzen die worden gebruikt voor zuivering van eiwitten 1028837 < · 24 zoals dialyse, uitzouten, ultrafiltratie, ionenuitwisse-lingschromatografie, hydrofobe-interactie-chromatografie (HIC), gelchromatografie en elektroforese. Ionenuitwisse-lingschromatografie is in het bijzonder effectief in het 5 verwijderen van ongereageerd poly(ethyleenglycol) en hGH of agonistische variant daarvan. In een verder uitvoeringsvorm van de uitvinding, worden de mono- en dipoly-meer-hGH- of agonistische variant daarvan -species geïsoleerd uit het reactiemengsel teneinde species met een hoog 10 molecuulgewicht te verwijderen. Scheiding wordt bewerkstelligd door de gemengde species te plaatsen in een buf-feroplossing die ongeveer 0,5-10 mg/ml van de hGH- of agonistische variant daarvan -polymeerconjugaten bevat. Geschikte oplossingen hebben een pH van vanaf ongeveer 4 tot 15 ongeveer 10. De oplossingen bevatten bij voorkeur één of meer bufferzouten gekozen uit KC1, NaCl, K2HP04, KH2P04,
Na2HP04, NaH2P04, NaHC03, NaB04, CH3C02H, en NaOH.
Afhankelijk van de reactiebuffer moet de oplossing van het polymeerconjugaat van hGH of agonistische variant 20 daarvan mogelijk eerst bufferuitwisseling/ultrafiltratie ondergaanalvorens eventueel ongereageerd polymeer te verwijderen. De oplossing van PEG-(hGH of agonistische variant daarvan)-conjugaat kan worden ge-ultrafiltreerd over een membraan met een lage molecuulgewichtsdrempel (10000 25 tot 30000 Dalton) om de meeste ongewenste materialen zoals ongereageerd polymeer, oppervlakteactieve stoffen, indien aanwezig, en dergelijke, te verwijderen.
De fractionering van de conjugaten tot een pool die de gewenste species bevat wordt bij voorkeur uitgevoerd 30 met behulp van een ionenuitwisselingschromatografiemedium. Dergelijke media bezitten het vermogen tot het selectief binden van PEG-hGH-of agonistische variant daarvan conjugaten via verschillen in lading, die op een enigszins voorspelbare wijze variëren. De oppervlaktelading van hGH 35 of agonistische variant daarvan wordt bijvoorbeeld bepaald door het aantal beschikbare geladen groepen op het oppervlak van het eiwit. Deze geladen groepen dienen kenmerkend 1028837 25 als het punt van potentiële aanhechting van po-ly(alkyleenoxide)-polymeren. Derhalve zullen hGH- of ago-nistische variant daarvan -conjugaten een verschillende lading hebben ten opzichte van de andere species, wat se-5 lectieve isolatie mogelijk maakt.
Sterk polaire anionen- of kationenuitwisselingshar-sen, zoals respectievelijk quaternair-amine- of sulfopro-pylharsen, worden gebruikt voor de werkwijze van de onderhavige uitvinding. Ionenuitwisselingsharsen hebben speci-10 aal de voorkeur. Een niet-beperkende lijst van commercieel beschikbare kationenuitwisselingsharsen die geschikt zijn voor gebruik met de onderhavige uitvinding zijn SP-hitrap®, SP Sepharose HP® en SP Sepharose® fast flow. Andere geschikte kationenuitwisselingsharsen, bv. S- en CM-harsen, 15 kunnen ook worden gebruikt. Een niet-beperkende lijst van anionenuitwisselingsharsen, waaronder commercieel beschikbare anionenuitwisselingsharsen, die geschikt zijn voor gebruik met de onderhavige uitvinding zijn Q-hitrap®, Q Sepharose HP® en Q Sepharose® fast flow. Andere geschikte 20 kationenuitwisselingsharsen, bv. DEAE-harsen, kunnen ook worden gebruikt.
De anionen- of kationenuitwisselingshars wordt bijvoorbeeld bij voorkeur gepakt in een kolom en op conventionele wijze geëquilibreerd. Een buffer met dezelfde pH en 25 osmolaliteit als de oplossing van polymeergeconjugeerd hGH of agonistische variant daarvan, wordt gebruikt. De elu-tiebuffer bevat bij voorkeur één of meer zouten gekozen uit KC1, NaCl, K2HP04, KH2P04, Na2HP04, NaH2P04, NaHC03, Na-B04, en (NH4)2C03. De conjugaatbevattende oplossing wordt 30 vervolgens op de kolom gebracht, waarbij ongereageerd polymeer en sommige species met een hoog molecuulgewicht niet worden vastgehouden. Na voltooiing van de belading wordt een gradiënt van een elutiebuffer met een toenemende zoutconcentratie over de kolom geleid om de gewenste frac-35 tie aan polyalkyleenoxide-geconjugeerd hGH of agonistische variant daarvan te elueren. De geëlueerde samengevoegde fracties zijn na de kationen- of anionenuitwisselingsstap 102883/ 26 bij voorkeur beperkt tot uniforme polymeerconjugaten. Alle niet-geconjugeerde species van hGH of agonistische variant daarvan kan vervolgens van de kolom worden gewassen met behulp van conventionele technieken. Indien gewenst kunnen 5 mono- en meervoudig gepegyleerde species van hGH of agonistische variant daarvan verder worden gescheiden via aanvullende ionenuitwisselingschromatografie of grootte-uitsluitingschromatografie.
Technieken waarbij gebruik wordt gemaakt van meerdere 10 isokratische stappen van toenemende concentratie aan zout of pH kunnen ook worden gebruikt. Meerdere isocratische elutiestappen van toenemende concentratie zullen resulteren in de achtereenvolgende elutie van di- en vervolgens mono-hGH- of agonistische variant daarvan -polymeer-15 conjugaten.
Het temperatuurtrajeet voor elutie ligt tussen ongeveer 4°C en ongeveer 25°C. Bij voorkeur wordt elutie uitgevoerd bij een temperatuur van ongeveer 4°C tot ongeveer 22°C. Bijvoorbeeld wordt de elutie van de PEG-hGH- of ago-20 nistische variant daarvan -fractie gedetecteerd aan de hand van UV-absorptie bij 280 nm. Fractièverzameling kan worden bewerkstelligd door middel van eenvoudige tijd-elutieprofielen.
Een oppervlakteactieve stof kan worden gebruikt bij 25 de werkwijzen van conjugatie van het poly(ethyleenglycol)-polymeer met de hGH- of agonistische variant daarvan -groep. Geschikte oppervlakteactieve stoffen zijn onder meer middelen van het ionische type zoals natriumdodecyl-sulfaat (SDS). Andere ionische oppervlakteactieve stoffen 30 zoals lithiumdodecuylsulfaat, quaternaire ammoniumverbin-dingen, taurocholzuur, caprylzuur, decaansulfonzuur, enz. kunnen ook worden gebruikt. Nonionische oppervlakteactieve stoffen kunnen ook worden gebruikt. Bijvoorbeeld kunnen materialen zoals poly{oxyethyleen)sorbitanen (Tweens), po-35 ly(oxyethyleen)ethers (Tritons) worden gebruikt. Zie ook Neugebauer, A Guide To the Properties and üses of Deter-gents in Biology and Biochemistry (1992) Calbiochem. Corp.
102ÖÖO/ 27
De enige beperkingen aan de in de werkwijzen van de uitvinding gebruikte oppervlakteactieve stoffen zijn dat zij worden gebruikt onder omstandigheden en in concentraties die geen noemenswaardige irreversibele denaturatie van het 5 hGH of agonistische variant daarvan veroorzaken en poly-meerconjugatie niet volledig remmen. De oppervlakteactieve stoffen zijn in de reactiemengsels aanwezig in hoeveelheden van ongeveer 0,01-0,5%; bij voorkeur van 0,05-0,5%; en meest bij voorkeur van ongeveer 0,075-0,25%. Mengsels van 10 de oppervlakteactieve stoffen worden ook beoogd.
Er wordt aangenomen dat de oppervlakteactieve stoffen een tijdelijk, reversibel beschermend systeem verschaffen tijdens het polymeerconjugatieproces. Er is gebleken dat oppervlakteactieve stoffen effectief zijn bij het selec-15 tief ontmoedigen van polymeerconjugatie terwijl zij toelaten dat lysine-gebaseerde of aminoterminus^-gebaseerde conjugaties voortgaan.
Het onderhavige poly(ethyleenglycol)-gemodificeerde hGH of agonistische variant daarvan heeft een langduriger 20 farmacologisch effect, wat mogelijk kan worden toegeschreven aan de langere halfwaardetijd ervan in vivo.
Verder wordt opgemerkt dat het onderhavige poly (ethyleenglycol) -gemodificeerde hGH of agonistische variant daarvan bruikbaar kan zijn voor de behandeling van 25 hypopituïtaire dwerggroei (GHD),het syndroom van Turner, groeifalen bij kinderen die klein voor de zwangerschaps-duur (SGA) werden geboren, ter behandeling van patiënten met het syndroom van Prader-Willi (PWS), chronische nier-insufficiëntie (CRI), AIDS-uittering, en veroudering.
30 Het onderhavige poly(ethyleenglycol)-gemodificeerde hGH of agonistische variant daarvan kan worden geformuleerd in farmaceutica die ook een farmaceutisch aanvaardbaar verdunningsmiddel, een middel voor het bereiden van een isotone oplossing, een pH-conditioner, en dergelijke, 35 bevatten teneinde hen toe te dienen in een patiënt.
Deze farmaceutica kunnen subcutaan, intramusculair, intraveneus, pulmonaal, intradermaal, of oraal worden toe- 1028837 28 gediend, afhankelijk van het doel van de behandeling. Een dosis kan ook worden gebaseerd op de aard en toestand van de aandoening van een te behandelen patiënt, en ligt gewoonlijk tussen 0.1 mg en 5 mg bij injectie en tussen 0,1 5 mg en 50 mg. bij een orale toediening voor een volwassene.
De gebruikte polymere stoffen zijn bij voorkeur ook wateroplosbaar bij kamertemperatuur. Een niet-beperkende lijst van dergelijke polymeren omvat poly(alkyleenoxide)-homopolymeren zoals poly(ethyleenglycol) of poly- 10 (propyleenglycolen), poly(geoxyethyleneerde polyolen), co-polymeren daarvan en blokcopolymeren daarvan, op voorwaarde dat de wateroplosbaarheid van de blokcopolymeren wordt gehandhaafd.
Als een alternatief voor PEG-gebaseerde polymeren 15 kunnen effectief niet-antigene materialen zoals dextran, poly(vinylpyrrolidonen), poly(acrylamiden), poly(vinyl-alcoholen), koolhydraatgebaseerde polymeren, en dergelijke worden gebruikt. De activering van a- en ε-terminale groepen van deze polymere stoffen kan worden bewerkstelligd op 20 wijzen die vèrgelijkbaar zijn als die welke gebruikt worden om poly(alkyleenoxides) om te zetten, en zal de vakman derhalve duidelijk zijn. De vakman zal zich realiseren dat de voorgaande lijst slechts illustratief is en dat alle polymeermaterialen die de hier beschreven kwaliteiten be-25 zitten worden beoogd. In de context van de onderhavige uitvinding wordt met "effectief niet-antigeen" alle materialen bedoeld die in het vakgebeid bekend zijn als niet-toxisch en als niet leidend tot een aanzienlijke immunoge-ne respons in zoogdieren.
30 Definities
Het navolgende is een lijst van afkortingen en de bijbehorende betekenissen zoals hier uitwisselbaar worden gebruikt: g gram 35 mg milligram . ml milliliter RT kamertemperatuur '1 028837 29 PEG poly(ethyleenglycol)
De volledige inhoud van alle publicaties, octrooi-schriften, en octrooiaanvragen worden hier bij referentie 5 opgenomen alsof elke afzonderlijke publicatie, octrooi- schrift, of octrooiaanvrage specifiek en afzonderlijk is aangeduid als bij verwijzing opgenomen.
Hoewel de onderhavige uitvinding in enig detail is beschreven bij wijze van illustratie en voorbeeld, ter 10 wille van duidelijk begrip, zal het de vakman in het licht van de leringen van de onderhavige uitvinding duidelijk zijn dat veranderingen en modificaties kunnen worden gemaakt zonder af te wijken van de geest en strekking van de onderhavige uitvinding. De navolgende voorbeelden worden 15 slechts verschaft ter verduidelijking en zijn niet bedoeld om de strekking van de uitvinding die hierboven in algemene termen is beschreven, te beperken.
In de navolgende voorbeelden is het hGH dat van SEQ ID NO:1. Er zij begrepen dat andere leden van de polypep-20 tidefamilie van hGH of agonistische variant daarvan ook zouden worden gepegyleerd op een vergelijkbare wijze als uiteengezet in de navolgende voorbeelden.
VOORBEELDEN
25
Voorbeeld 1. Vertakt 40000 MW PEG-butyrylaldehyde-hGH
f
mPEG-O—C-NH
H2C
h2c
f Jh H
mP£G-0—C—N g-N—(CH2CH20)4CH2CH2CH2CH
1028837 30
Dit voorbeeld toont een werkwijze voor het genereren van nagenoeg homogene preparaten van N-terminaal monoge-pegyleerd hGH door middel van reductieve alkylering. Me-thoxy-vertakt PEG-butyraldehyde-reagens met een MW van on-5 geveer 40000 (Shearwater Corp.) werd door middel van reductieve aminering selectief gekoppeld aan de N-terminus van hGH door gebruik te maken van het verschil in relatieve pKa-waarde van het primaire amine aan de N-terminus ten opzichte van pKa-waarden van primaire aminen op de ε-10 positie van lysineresten. Men liet hGH-eiwit, opgelost in een concentratie van 10 mg/ml in 25 mM Hepes (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH 7,0, (eventueel 25 mM MES (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH 6,0, 10 mM Natriumacetaat (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH 4,5) reageren met me-15 thoxy-PEG-butyraldehyde, M-PEG-ALD (Shearwater Corp.,
Huntsville, AL) door toevoeging van M-PEG-ALD tot een relatieve molaire verhouding PEG:hGH van 2:1. Reacties werden gekatalyseerd door toevoeging van stock 1 M NaCNBH4 (Sigma Chemical, St. Louis, MO), opgelost in H2O, tot een 20 eindconcentratie van 10-50 mM. Reacties werden uitgevoerd in het donker bij RT gedurende 18-24 uur. Reacties werden gestopt door toevoeging van 1 M Tris (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH ~7,6 tot een eindoncentratie aan Tris van 50 mM, of verdund in geschikte buffer voor onmiddellijke zui-25 vering.
Tabel 1 toont het percentage, zoals bepaald door middel van grootte-uitsluitingschromatografie, aan multi-gePEGyleerde species, mono-gePEGyleerd conjugaat, ongereageerd PEG, en uiteindelijke zuiveringsopbrengst voor 40K 30 vertakt PEG-aldehyde en 40K vertakt PEG-butyrylaldehyde. Het PEG-butyrylaldehyde resulteert in toegenomen mono-gePEGyleerd conjugaat, verlaagde niveaus aan ongereageerd PEG, en toegenomen uiteindelijke opbrengst in vergelijking tot PEG-aldehyde.
35 _TABEL 1_
Vergelijking van 40K Vertakt PEG-ALD-hGH en 40K vertakt 1028837 _31_ _PEG-Butyrylaldehyde-hGH_
Species in het re- 40K PEG-aldehyde- 40K PEG-butyryl-actiemengsel _ hGH aldehyde-hGH
BsnBaBSB&BEB^^^aBBBnHaBaea: η··ημμ^βηη····· multi-PEG-product__4/02%__:_5/03%_ mono-PEG-product__48/70%__61/02%_ ongereageerd hGH__41/80% 29/20% BCBB»s=aBaB^^^B8aBgBBi ntNWiMwn··^······ Üiteindelijke zui- 30,80% 44,70% veringsopbrengst __
Voorbeeld 2. Onvertakt 30000 MW PEG-butyrylaldehyde-
hGH
Methoxy-lineair 30000 MW PEG-butyrylaldehydereagens 5 wordt gekoppeld aan de N-terminus van hGH met behulp van de voor Voorbeeld 1 beschreven werkwijze.
Voorbeeld 3. Onvertakt 20000 MW PEG-butyrylaldehyde-
hGH
10 Methoxy-lineair 20000 MW PEG-butyrylaldehydereagens wordt gekoppeld aan de N-terminus van hGH met behulp van de voor Voorbeeld 1 beschreven werkwijze.
15
Voorbeeld 4. Zuivering van Gepegyleerd hGH Gepegyleerde hGH-species werden gezuiverd uit het re-actiemengsel tot >95% (SEC-analyse) met behulp van een enkelvoudige ionenuitwisselingschromatografiestap.
20
Anionenuitwisselingschromatografie
De PEG-hGH-species werden gezuiverd uit het reactie-mengsel tot >95% (SEC-analyse) met behulp van een enkelvoudige ionenuitwisselingschromatografiestap. Mono- 25 gepegyleerd hGH werd gezuiverd van ongemodificeerd hGH en multi-gepegyleerde hGH-species met behulp van anionenuit-wisselingschromatografie. Een typerend 20K butyrylaldehy-de-hGH-reactiemengsel (5-100 mg eiwit), zoals hierboven beschreven, werd gezuiverd op een Q-Sepharose-Hitrap-kolom ,1 0 288 37 32 (1 of 5 ral) (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) of Q-Sepharose-fast-flow-kolom (26/20, 70 ml bedvolume) (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), geëquili-breerd in 25 mM HEPES, pH 7,3 (Buffer A). Het reactiemeng-5 sel werd 5-10X verdund met buffer A en op de kolom gebracht met een stroomsnelheid van 2,5 ml/min. De kolom werd gewassen met 8 kolomvolumes buffer A. Vervolgens werden de verschillende hGH-species van de kolom geëlueerd in 80-100 kolomvolumes buffer A en een lineaire NaCl-gradiënt 10 van 0-100 mM. Het eluens werd gevolgd aan de hand van absorptie bij 280 nm (A280) en fracties van 5 ml werden opgevangen. Fracties werden samengevoegd naar gelang de mate van pegylering, bv. mono, di, tri, enz. (vastgesteld zoals in voorbeeld 15). Het samenvoegsel werd vervolgens gecon-15 centreerd tot 0,5-5 mg/ml in een Centriprep YM10-concentrator (Amicon, Technology Corporation, North-borough, MA) . Eiwitconcentratie van het samenvoegsel werd bepaald aan de hand van A2eo met gebruikmaking van een ex-tinctiecoëfficiënt 0,78.
20
Kationenuitwisselingschromatografie
Kationenuitwisselingschromatografie wordt uitgevoerd op een SP-Sepharose-high-performance-kolom (Pharmacia XK 26/20, 70 ml bedvolume), geëquilibreerd in 10 mM natri- 25 umacetaat, pH 4,0 (Buffer B). Het reactiemengsel wordt 10X verdund met buffer B en op de kolom gebracht met een stroomsnelheid van 5 ml/min. Daarna wordt de kolom gewassen met 5 kolomvolumes buffer B, gevolgd door 5 kolomvolumes 12% Buffer C (10 mM acetaat pH 4,5, 1 M NaCl). Vervol-30 gens worden de hGH-species van de kolom geëlueerd met een lineaire gradiënt van 12 naar 27% buffer C in 20 kolomvolumes. Het eluens wordt gevolgd bij 280 nm en fracties van 10 ml werden opgevangen. Fracties worden samengevoegd naar gelang de mate van pegylering (mono, di, tri, enz), door 35 middel van bufferwisseling overgebracht in 10 mM acetaat-buffer pH 4,5 en geconcentreerd tot 1-5 mg/ml in een geroerde cel uitgerust met een Amicon YM10-membraan. Eiwit- 1 0288 ^ 33 concentratie van de pool werd bepaald aan de hand van A2eo met gebruikmaking van een extinctiecoëfficiënt 0,78.
Voorbeeld 5. Biochemische Karakterisering 5 Het gezuiverde gepegyleerde hGH-samenvoegingen werden gekarakteriseerd door middel van niet-reducerende SDS-PAGE, niet-denaturerende grootte-uitsluitingschromato-grafie, en peptidekartering.
10 Grootte-uitsluitings-vloeistofchromatografie met groot scheidend vermogen (SEC-HPLC)
Niet-denaturerende SEC-HPLC
De reacties van Methoxy-PEG met verscheidene aanhech-15 tingschemieën, groottes, koppelgroepen, en geometrieën, met hGH, anionenuitwisselingzuiveringssamenvoegsels en gezuiverde eindproducten werden beoordeeld met behulp van niet-denaturerende SEC-HPLC. Analytische niet-denaturerende SEC-HPLC werd uitgevoerd met behulp van een kolom, 20 Superdex 200, 7,8 mm X 30 cm, (Amersham Bioscience, Pisca- taway, NJ) in 20 mM Fosfaat pH 7,2, 150 mM NaCl bij een stroomsnelheid van 0,5 ml/min (eventueel Tosohaas G4000PWXL Amersham Bioscience, Piscataway, NJ). PEGylering verhoogt het hydrodynamisch volume van het eiwit sterk, 25 resulterend in een verschuiving naar een kortere retentie- tijd. Nieuwe species werden waargenomen in de PEG-aldehyde-hGH-reactiemengsel naast niet-gemodificeerd hGH. Deze gePEGyleerde en niet-gePEGyleerde species werden gescheiden door middel van Q-Sepharose-chromatografie, en de 30 resulterende gezuiverde mono-PEG-Aldehyde-hGH-species ble ken vervolgens te elueren als een enkelvoudige piek op niet-denaturerende SEC (>95% zuiverheid). De Q-Sepharose-chromatografiestap verwijderde effectief vrij PEG, hGH, en multi-gePEGyleerde hGH-species van het mono-gepegyleerde 35 hGH.
1028837 34
Denaturerende SEC-HPLC
De reactie van de butyrylaldehyde-polyethyleen-glycolen met hGH, anionenuitwisselingszuivering, en gezuiverde eindproducten worden beoordeeld met behulp van dena-5 turerende SEC-HPLC. Analytische denaturerende SEC-HPLC wordt uitgevoerd met behulp van een Tosohaas 3000SWXL-kolom 7,8 mm X 30 cm (Tosohaas Pharmacia Biotech, Piscata-way, NJ) in 100 mM Fosfaat pH 6,8, 0,1% SDS bij een stroomsnelheid van 0,8 ml/min. PEGylering verhoogt het hy-10 drodynamisch volume van het eiwit sterk, resulterend in een verschuiving naar een kortere retentietijd. GePEGy-leerde en niet-gePEGyleerde species worden gescheiden door middel van Q-Sepharose-chromatografie.
15 SDS-PAGE/PVDF-overdracht SDS-PAGE werd gebruikt om de reactie van PEG-butyrylaldehyde met hGH en de gezuiverde eindproducten te beoordelen. SDS-PAGE werd uitgevoerd op 1 mm dikke 10-20%-Tris-tricine-gelen (Invitrogen, Carlsbad, CA) onder redu-20 cerende en niet-reducerende omstandigheden en gekleurd met behulp van een Novex Colloidal Coomassie™ G-250 kleurings-kit (Invirogen, Carlsbad, CA). Bandjes worden geblot op PVDF-membraan voor daaropvolgende N-terminale sequentie-identificatie.
25 Analytische anionenuitwisselings-HPLC
Het PEG-butyrylaldehyde/hGH-reactiemengsel, anionen-uitwisselingzuiveringsfracties, en gezuiverde eindproducten werden beoordeeld met behulp van analytische anionenuitwisselings-HPLC. Analytische anionenuitwisselings-HPLC 30 werd uitgevoerd met behulp van een Tosohaas Q5PW- of DEAE-PW-anionenuitwisselingskolom, 7,5 mm X 75 mm (Tosohaas Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) in 50 mM Tris pH 8,6 bij een stroomsnelheid van 1 ml/min. Monsters werden geë-lueerd met een lineaire gradiënt van 5-200 mM NaCl.
35 1028837 ψ 35 N-terminale sequentie en peptidekartering
Geautomatiseerde Edman-degradatiechemie werd gebruikt om de NH2-terminale eiwitsequentie te bepalen. Een Applied Biosystems Model 494 Procise sequentieerapparaat (Perkin 5 Elraer, Well'esley, MA) werd gebruikt voor de degradatie. De respectievelijke PTH-AA-derivaten werden geïdentificeerd door middel van RP-HPLC-analyse op een on-line-wijze met behulp van een Applied Biosystems Model 140C PTH analyse-apparaat uitgerust met een Perkin Elmer/Brownlee 2,1 mm 10 i.d. PTH-C18-kolom.
Trypsinedigestie werd uitgevoerd bij een concentratie van 1 mg/ml en kenmerkend wordt 50 pg materiaal gebruikt per digestie. Trypsine werd zodanig toegevoegd dat de ver- ! houding trypsine tot PEG-hGH 1:30 (w/w) bedroeg. Tris- i j 15 buffer was aanwezig in een concentratie van 30 mM, pH 7,5.
Monsters werden geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 16 ±0,5 uur. Reacties werden gestopt door middel van toevoeging van 50 μΐ 1 N HC1 per ml digestieoplossing. Monsters werden verdund, voorafgaand aan het plaatsen van de 20 monsters in de autosampler, tot een eindconcentratie van 0,25 mg/ml in 6,25% acetonitril. Acetonitril werd eerst toegevoegd (tot 19,8% acetonitril), voorzichtig gemengd, en vervolgens wordt water toegevoegd tot het eindvolume (vier maal het startvolume). Extra digestieoplossing kan 25 worden verwijderd en tot 1 week bij -20°C worden opgeslagen.
Een Waters Alliance 2695 HPLOsysteem werd gebruikt ! voor analyse, maar andere systemen zouden vergelijkbare resultaten moeten opleveren. De gebruikte kolom was een 30 Astec 04 polymere 25 cm X 4,6 mm kolom met deeltjes van 5 pm. Experimenten werden uitgevoerd bij kamertemperatuur op een typische belading van 50 pg eiwit per monster. Buffer A is 0,1% trifluorazijnzuur in water; buffer B is 0,085% trifluorazijnzuur in acetonitril. De gebruikte gradiënt 35 was als volgt:
Tijd A% B% C% D% Debiet Curve 1028837 36 0,00 0,0 0,0 100,0 0,0 1,000 1 90.00 0,0 0,0 55,0 45,0 1,000 6 90.10 0,0 0,0 0,0 100,0 1,000 6 91.00 0,0 0,0 0,0 100,0 1,000 6 91.10 0,0 0,0 100,0 0,0 1,000 6 95.00 0,0 0,0 100,0 0,0 1,000 6
De kolom wordt verwarmd tot 40°C met behulp van een verwarmingsmantel. Pieken werden gedetecteerd met behulp van een Waters 996 PDA-detector waarmee gegevens werden 5 verzameld tussen 210 en 300 nm. Het hieruit gehaalde chro-matogram bij 214 nm werd gebruikt voor monsteranalyse.
Trypsinedigestiekartering werd uitgevoerd voor hGH, 40 K vertakt PEG-aldehyde, en 40 K vertakt butyrylaldehyde (Figuur 1) . Het N-terminale trypsinedigestiefragment werd 10 aangeduid als T-l. Het percentage T-l dat aanwezig was in vergelijking tot niet-gePEGyleerd hGH is weergegeven in Tabel 2. Deze gegevens suggereren dat 90% van de PEG-modificatie heeft plaatsgevonden op de N-terminus, terwijl de rest blijkbaar is gekoppeld aan één van een aantal mo-15 gelijke lysineresten, bij gebruik van PEG-aldehyde, in vergelijking tot meer dan 98% op de N-terminus bij gebruik van PEG-butyrylaldehyde.
20 ___TABEL 2__ % T-l aanwezig % T-l aanwezig in vergelijking tot niet-gePEGyleerd ___hGH_ hGH___28,0%__ PEG-aldehyde/hGH__2, 6%__9,2%_ PEG- 0,3% 1,2% butyrylaldehyde/hGH_____
Voorbeeld 6. Farmacologische studies 1028837 37
Rattengewichtstoename
Vrouwelijke Sprague-Dawley-ratten, gehypofysectomi-seerd bij Taconic Labs, werden voorgescreend op groeisnel-5 heid gedurende een periode van 7 tot 11 dagen. Ratten werden verdeeld in groepen van acht. Groep 1 bestaat uit ratten die hetzij dagelijks of op dag 0 en dag 6 een subcuta-ne dosis vehikel ontvingen. Groep 2 ontving dagelijks een subcutarte dosis GH (30 μg/rat/dosis) . Groep 3 ontving sub-10 cutane doses GH op dag 0 en dag 6 (180 pg/rat/dosis) .
Groep 4 ontving subcutane doses van PEG-GH's op dag 0, 6 (180 pg/rat/dosis). Gehypofysectomiseerde ratten werden gevolgd op gewichtstoename door weging ten minste om de andere dag tijdens het onderzoek. Figuur 3 & 4.
15
Rattentibialengte
Dieren in 11-daagse gewichtstoenamestudies werden gedood op dag 11, linker tibia's werden verwijderd en onderworpen aan röntgenfotografie en botlengtes werden gemeten 20 met behulp van een schuifmaat. Figuur 5.
IGF-l-studies
Dieren uit zesdaagse gewichtstoenamestudies werden gebruikt. Bloedmonsters werden genomen op de verschillende 25 tijden tijdens het onderzoek en de serum-IGF-l-niveaus werden bepaald met behulp van ELISA. Figuur 6. Farmacokinetische studies
Farmacokinetische.studies werden uitgevoerd in normale gecannuleerde mannelijke Sprague-Dawley-ratten. Injec-30 ties werden uitgevoerd als een enkele subcutane bolus van 100 pg/kg/rat GH of PEG-GH waarbij zes ratten werden gebruikt per groep. Bloedmonsters werden genomen gedurende één tot vijf dagen naar gelang nodig voor vaststelling van relevante PK-parameters. GH- en PEG-GH-bloedniveaus werden 35 bij elke bemonstering gevolgd met behulp van een immuunas-say.
1028837
' I
38 hGH-immuunassay
Eiwitconcentratieniveaus van hGH en gepegyleerd hGH in muizen- en cynomolgus-apenplasma werden bepaald met behulp van het hGH AutoDELFIA kit fluorescentie-immuunassay 5 (PerkinElmer). Ratten- en menselijke IGF-l-niveaus werden gevolgd met behulp van een immuunassay-kit (Diagnostic System Laboratories).
Niet-compartimentele farmacokinetische eigenschappen voor 10 hGH-PEG-conjugaat van Voorbeeld 1 in andere primaten dan de mens
Het hGH-PEG-conjugaat van Voorbeeld 1 werd toegediend aan cynomolgus-apen als intraveneuze (iv) of subcutane (sc) bolusinjecties van 0,18 mg/kg {Tabel 3). PK-parame-15 ters werden bepaald uit gemiddelde gegevens voor n=3 dieren. Plasmaconcentraties werden bepaald met behulp van het hGH AutoDELFIA kit fluorescentie-immuunassay (PerkinElmer) en een standaardcurve die vooraf was bepaald voor het PEG-GH-conjugaat.
20 _TABEL 3_
Dosis (mg/kg)__iv 0,18 / sc 0,18_ CL, iv (ml/h/kg)__OJj_
Vss (ml/kg)__28,0_
Tl/2, iv (h)__25,0_
Tl/2, sc (h)__61,0_ SC AÜC (pg/ml*h)__195_ SC Biobeschikbaarheid (%)__84_
Tmax, sc (h)__32_ 1028837
Claims (11)
- 5 -CONCLUSIES-
- 1. Humaan-groeihormoon-PEG-conjugaat met de structuur van Formule I of Formule II o II mPEG—O—C-NH CH, ! I H2C ! 1| fH2 II H raPEG-0—C—N C~N—(CH:CH;0)n(CH;)mC-NH-R H o II ° O 10 Formule I of O mPEG-0(CH2CH20)n{CH2)mj-NH-R i '
- 15 Formule II waarin n een geheel getal tussen 1 en 10 is; m een geheel getal tussen 1 en 10 is; R staat voor humaan groeihormoon of methionyl-humaan-20 groeihormoon. 1028837 Humaan-groeihormoon-PEG-conjugaat volgens conclusie 1 met de structuur: O II mPEG-O—C-NH ch2 hÏ Hlï CHj H /CHv. H mPEO-O—C—N C-N—(CH,CH.O)4CH-CH-,CH,C-NH-R H H ‘ ‘ ΊΙ 0 o of o mPEG-OiCHjCHjO^CHjCHjCHjjNH-R waarin R staat voor humaan groeihormoon of methionyl-5 humaan-groeihormoon.
- 3. Humaan-groeihormoon-PEG-conjugaat volgens conclusie 1 met de structuur: f mPEG-O—C-NH CHj HjC HjC CH2 o f § ^CH H mPEG-O—C—N C-N—(CH2CH20)4CH2CH2CH2C-NH-R H « II
- 0 O 10 waarin R staat voor humaan groeihormoon of methionyl-humaan-groeihormoon.
- 4. Conjugaat volgens conclusie 1, 2 of 3, waarbij het 15 humaan groeihormoon een aminozuursequentie van SEQ ID NO:l omvat. 1028837
- 5. Humaan-groeihormoon-PEG-conjugaat volgens conclusie 1/ 2, 3 of 4, waarbij meer dan 90% van het polyethy-leenglycol is geconjugeerd aan een aminoterminaal fenyl-alanine van de aminozuursequentie van SEQ ID NO:l. 5
- 6. Humaan-groeihormoon-PEG-conjugaat volgens conclusie 1, 2, 3 of 4, waarbij meer dan 95% van het polyethy-leenglycol is geconjugeerd aan een aminoterminaal fenyl-alanine van de aminozuursequentie van SEQ ID N0:1. 10
- 7. Humaan-groeihormoon-PEG-conjugaat volgens conclusie 1, 2, 3, 4, 5 of 6, waarbij elk mPEG een molecuulge-wicht van ongeveer 20 kDa heeft.
- 8. Preparaat omvattende het humaan-groeihormoon-PEG- conjugaat volgens conclusie 1, 2, 3, 4, 5, 6 of 7 en ten minste één farmaceutisch aanvaardbare drager.
- 9. Gebruik van het humaan-groeihormoon-PEG-conjugaat 20 volgens conclusie 1, 2, 3, 4, 5, 6 of 7 voor de vervaardiging van een geneesmiddel voor de behandeling van een groei- of ontwikkelingsstoornis, zoals groeihormoondefici-entie (GHD), het syndroom van Turner, chronische nierin-j sufficiëntie of. kleinheid voor de zwangerschapsduur (SGA) 25 is. -o-o-o- 1028837
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US42782302P | 2002-11-20 | 2002-11-20 | |
| US42782302 | 2002-11-20 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL1028837A1 NL1028837A1 (nl) | 2005-08-30 |
| NL1028837C2 true NL1028837C2 (nl) | 2006-08-14 |
Family
ID=32825103
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL1024831A NL1024831C2 (nl) | 2002-11-20 | 2003-11-20 | N-terminaal monogepegyleerde conjugaten van humaan groeihormoon en werkwijze voor de bereiding daarvan. |
| NL1028837A NL1028837C2 (nl) | 2002-11-20 | 2005-04-21 | N-terminaal monogepegyleerde conjugaten van humaan groeihormoon en werkwijze voor de bereiding daarvan. |
| NL1032282A NL1032282C2 (nl) | 2002-11-20 | 2006-08-07 | N-terminaal monogepegyleerde conjugaten van humaan groeihormoon en werkwijze voor de bereiding daarvan. |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL1024831A NL1024831C2 (nl) | 2002-11-20 | 2003-11-20 | N-terminaal monogepegyleerde conjugaten van humaan groeihormoon en werkwijze voor de bereiding daarvan. |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL1032282A NL1032282C2 (nl) | 2002-11-20 | 2006-08-07 | N-terminaal monogepegyleerde conjugaten van humaan groeihormoon en werkwijze voor de bereiding daarvan. |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20040127417A1 (nl) |
| AR (1) | AR042103A1 (nl) |
| GT (1) | GT200300250A (nl) |
| NL (3) | NL1024831C2 (nl) |
| PA (1) | PA8588901A1 (nl) |
| PE (1) | PE20040797A1 (nl) |
| SV (1) | SV2004001674A (nl) |
| TW (1) | TWI281864B (nl) |
| UY (1) | UY28085A1 (nl) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030171285A1 (en) * | 2001-11-20 | 2003-09-11 | Finn Rory F. | Chemically-modified human growth hormone conjugates |
| KR100974843B1 (ko) * | 2002-09-09 | 2010-08-11 | 넥타르 테라퓨틱스 | 수용성 중합체 알카날 |
| DE60332358D1 (de) * | 2002-09-09 | 2010-06-10 | Hanall Pharmaceutical Co Ltd | Protease-resistente modifizierte interferon alpha polypeptide |
| KR101238517B1 (ko) * | 2002-12-26 | 2013-02-28 | 마운틴 뷰 파마슈티컬즈, 인크. | 생물학적 효능이 향상된 인터페론-베타의 중합체 접합체 |
| US20040136952A1 (en) * | 2002-12-26 | 2004-07-15 | Mountain View Pharmaceuticals, Inc. | Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity |
| US20070105770A1 (en) * | 2004-01-21 | 2007-05-10 | Novo Nordisk A/S | Transglutaminase mediated conjugation of peptides |
| EP1715895A2 (en) * | 2004-02-09 | 2006-11-02 | Pharmacia Corporation | Chemically-modified human growth hormone receptor antagonist conjugates |
| WO2006042847A2 (en) * | 2004-10-18 | 2006-04-27 | Novo Nordisk A/S | Method for the preparation of oxime, thiazolidine, dithiane, dithiolane or hydrazone linked analogues of growth hormone |
| WO2006042848A2 (en) * | 2004-10-18 | 2006-04-27 | Novo Nordisk A/S | Growth hormone conjugates |
| US7998930B2 (en) | 2004-11-04 | 2011-08-16 | Hanall Biopharma Co., Ltd. | Modified growth hormones |
| EP1861125A2 (en) * | 2005-03-23 | 2007-12-05 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Conjugates of an hgh moiety and peg derivatives |
| KR20080038391A (ko) * | 2005-08-30 | 2008-05-06 | 노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트 | 페그화 성장 호르몬의 액체 제제 |
| WO2007097934A2 (en) * | 2006-02-17 | 2007-08-30 | Elusys Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for using erythrocytes as carriers for delivery of drugs |
| US9175061B2 (en) * | 2006-07-07 | 2015-11-03 | Novo Nordisk Health Care Ag | Protein conjugates and methods for their preparation |
| WO2008051383A2 (en) * | 2006-10-19 | 2008-05-02 | Amgen Inc. | Use of alcohol co-solvents to improve pegylation reaction yields |
| EP2157432A1 (en) * | 2008-08-15 | 2010-02-24 | Qiagen GmbH | Method for analysing a complex sample by mass spectrometry |
| US9849188B2 (en) | 2009-06-08 | 2017-12-26 | Amunix Operating Inc. | Growth hormone polypeptides and methods of making and using same |
| EP3355384A1 (en) * | 2017-01-31 | 2018-08-01 | Universite De Liege | Flexible thin-films for battery electrodes |
| CN114539384A (zh) * | 2020-11-19 | 2022-05-27 | 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 | 聚乙二醇化长效生长激素及其制备方法和医药应用 |
Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4179337A (en) * | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
| US4002531A (en) * | 1976-01-22 | 1977-01-11 | Pierce Chemical Company | Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby |
| US4342832A (en) * | 1979-07-05 | 1982-08-03 | Genentech, Inc. | Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes |
| US5618697A (en) * | 1982-12-10 | 1997-04-08 | Novo Nordisk A/S | Process for preparing a desired protein |
| US4904584A (en) * | 1987-12-23 | 1990-02-27 | Genetics Institute, Inc. | Site-specific homogeneous modification of polypeptides |
| WO1990006952A1 (en) * | 1988-12-22 | 1990-06-28 | Kirin-Amgen, Inc. | Chemically modified granulocyte colony stimulating factor |
| US5342940A (en) * | 1989-05-27 | 1994-08-30 | Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited | Polyethylene glycol derivatives, process for preparing the same |
| JP3051145B2 (ja) * | 1990-08-28 | 2000-06-12 | 住友製薬株式会社 | 新規なポリエチレングリコール誘導体修飾ペプチド |
| US5252714A (en) * | 1990-11-28 | 1993-10-12 | The University Of Alabama In Huntsville | Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde |
| US5919455A (en) * | 1993-10-27 | 1999-07-06 | Enzon, Inc. | Non-antigenic branched polymer conjugates |
| US5643575A (en) * | 1993-10-27 | 1997-07-01 | Enzon, Inc. | Non-antigenic branched polymer conjugates |
| US5824784A (en) * | 1994-10-12 | 1998-10-20 | Amgen Inc. | N-terminally chemically modified protein compositions and methods |
| US5932462A (en) * | 1995-01-10 | 1999-08-03 | Shearwater Polymers, Inc. | Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces |
| US5672662A (en) * | 1995-07-07 | 1997-09-30 | Shearwater Polymers, Inc. | Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications |
| DE69635026T2 (de) * | 1995-09-21 | 2006-05-24 | Genentech Inc., San Francisco | Varianten des menschlichen wachstumshormons |
| WO2000042175A1 (en) * | 1999-01-14 | 2000-07-20 | Bolder Biotechnology Inc. | Methods for making proteins containing free cysteine residues |
| SE9904502D0 (sv) * | 1999-12-09 | 1999-12-09 | Pharmacia & Upjohn Ab | Production of peptides |
-
2003
- 2003-11-19 PA PA20038588901A patent/PA8588901A1/es unknown
- 2003-11-19 TW TW092132405A patent/TWI281864B/zh not_active IP Right Cessation
- 2003-11-20 AR ARP030104295A patent/AR042103A1/es unknown
- 2003-11-20 PE PE2003001178A patent/PE20040797A1/es not_active Application Discontinuation
- 2003-11-20 NL NL1024831A patent/NL1024831C2/nl not_active IP Right Cessation
- 2003-11-20 SV SV2003001674A patent/SV2004001674A/es not_active Application Discontinuation
- 2003-11-20 GT GT200300250A patent/GT200300250A/es unknown
- 2003-11-20 UY UY28085A patent/UY28085A1/es not_active Application Discontinuation
- 2003-11-20 US US10/718,340 patent/US20040127417A1/en not_active Abandoned
-
2005
- 2005-04-21 NL NL1028837A patent/NL1028837C2/nl not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-08-07 NL NL1032282A patent/NL1032282C2/nl not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GT200300250A (es) | 2004-08-18 |
| NL1024831A1 (nl) | 2004-05-26 |
| PE20040797A1 (es) | 2004-12-10 |
| US20040127417A1 (en) | 2004-07-01 |
| TW200418878A (en) | 2004-10-01 |
| AR042103A1 (es) | 2005-06-08 |
| UY28085A1 (es) | 2004-07-30 |
| PA8588901A1 (es) | 2005-02-04 |
| TWI281864B (en) | 2007-06-01 |
| NL1028837A1 (nl) | 2005-08-30 |
| SV2004001674A (es) | 2004-05-17 |
| NL1032282C2 (nl) | 2007-03-09 |
| NL1024831C2 (nl) | 2005-04-28 |
| NL1032282A1 (nl) | 2006-11-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NL1028837C2 (nl) | N-terminaal monogepegyleerde conjugaten van humaan groeihormoon en werkwijze voor de bereiding daarvan. | |
| NL1029828C2 (nl) | Conjugaten van glycerol-vertakt polyethyleenglycol en menselijk groeihormoon, werkwijzen voor de bereiding daarvan en werkwijzen voor gebruik daarvan. | |
| KR100776862B1 (ko) | 엔 말단 모노피이지화된 인간 성장 호르몬 접합체, 그의제조 방법, 및 그의 사용 방법 | |
| JP2006321808A (ja) | 化学的に修飾されたヒト成長ホルモンコンジュゲート | |
| US20030171285A1 (en) | Chemically-modified human growth hormone conjugates | |
| US20040038892A1 (en) | Chemically-modified human growth hormone conjugates | |
| US20090203589A1 (en) | Chemically modified human growth hormone receptor antagonist conjugates | |
| MXPA06008888A (en) | N-terminally monopegylated human growth hormone conjugates, process for their preparation, and methods of use thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| AD1A | A request for search or an international type search has been filed | ||
| RD2N | Patents in respect of which a decision has been taken or a report has been made (novelty report) |
Effective date: 20060403 |
|
| PD2B | A search report has been drawn up | ||
| VD1 | Lapsed due to non-payment of the annual fee |
Effective date: 20090601 |