TW200529868A - N-terminally monopegylated human growth hormone conjugates, process for their preparation, and methods of use thereof - Google Patents

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200529868 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於人類生長激素（hGH)之化學修飾，包括聚乙 二醇化作用，及其激動劑變體，藉其可改變hGH之化學及/ 或生理學特性。聚乙二醇化之hGH可具有增加的血漿滯留 期間、降低清除率、改善穩定性、減少抗原性、降低聚乙 二醇化作用異質性或其組合。本發明亦關於hGH的修飾製 程。此外，本發明亦關於包括經修飾hGH的醫藥組合物。 進一步的具體實施例是該經修飾hGH在治療生長和發育疾 病上的用途。 【先前技術】 人類生長激素（hGH)是一蛋白質，其包括191個胺基酸之 單鏈，由兩個雙硫橋交聯，且單體形式具有22 kDa之分子 量。人類GH係由腦下垂體分泌及其亦可藉重組遺傳工程製 造。hGH在所有能夠生長的體組織中引起生長。hGH不僅在 人類生長期的促進生長上，亦在正常體組成、合成代謝及 月旨質代謝上扮演重要的角色（K· Barneis·和U. Keller， Baillieres Clin. Endocrinlo. Metab. 10 ·· 337 (1996))。 重組hGH已經上市販售數年。市場上出現兩種具有治療 用途的重組hGH製品：真正的一種，例如Genotropin™、或 NutropinTM，以及在N-終端帶有額外甲硫胺酸殘基的類似 物，例如Somatonorm™。hGH係用來在罹患腦下垂體機能 不足侏儒症的患者中刺激直線生長，該症亦稱為生長激素 缺陷（GHD)或特内氏（Turner’s)徵候群，但其他的適應症亦 98715.doc 200529868 已經暗示在早產（SGA)的孩童中長期治療生長失敗、治療患 有普瑞德-威利（Pradei-Willi)徵候群（PWS)的患者、慢性腎 ， 功能不全（CRI)、AIDS消耗和衰老。成年的Cm缺陷（aGHD) • 患者有各種問題，如在體組成上獨特的變化，包括脂肪質 量的增加、降低瘦肉體質量和細胞外流體，並降低骨縣礦 物貝洽、度、月曰貝的代谢異常，以及心血管功能障礙。獨子 問題許多可藉著hGH置換療法來改善（j· Verhelst j和R.八以 • Drugs. ； 62 ： 2399 (2002)) 〇 生長激素（GH)主要的生物影響是促進年輕哺乳動物的生 長，並在較老動物中維持組織。受影響的器官系統包括骨 絡、結締組織、肌肉和内臟，如肝臟、小腸和腎臟。生長 激素經由與在標靶細胞膜上的特定受體交互作用而發揮其 影響。hGH是包括胎盤催乳激素、催乳激素和其他遺傳和 物種變體或生長激素之同種激素家族的成員（Nic〇11，c s.

等人（1986) Endocrine Reviews 7 : 169)。在這些之中，hGH φ 難得展現出廣泛的物種專一性，並與選殖的體細胞受體 (Leimg D.W·等人[1987] Nature 330 ; 537)或催乳激素受體 (B〇utin，J.M·等人[1988]Cell; 53: 69)結合。已經在大腸桿 菌中以分泌形式表現hGH的選殖基因（chang，C.N.等人 [1987] Gene 55 : 189)，並已經報告了它的DNA和胺基酸序 列（Goeddel 等人[1979] Nature 281 ·· 544; Gray 等人[1985]

Gene 39 ·· 247)。 ' 人類生長激素（hGH)參與許多正常人類生長與發育的調 郎。该腦下垂體激素顯不出眾多生物影響，包括直線生長 98715.doc 200529868 (身區體發生）、泌乳、巨嗟細胞的激活作用、類胰島素和致糖 尿病的影響等等（Chawla，R.K. (1983) Ann. Rev. Med. 34, ^ 519 ; Edwards，C.K·等人（1988) Science 239, 769 ; Thomer， ' Μ·0·等人（1988) J. Clin. Invest· 81 : 745)。在孩童中的生長 激素缺陷導致侏儒症，已經成功地藉著外源投與hGH治療 10年以上。 在成人以及在孩童中，hGH藉著增加氮的保留並刺激骨 _ 骼肌生長，並藉著動員體脂肪，維持正常的體組成。内臟 脂肪組織特別對hGH有反應。除了促進脂肪水解，hGH還降 低三酸甘油酯攝取至體脂肪儲存處内。藉著hGH增加 IGF- I (類胰島素生長因子-]；)和IGFBP3 (類胰島素生長因 子結合蛋白質3)。 人類生長激素（hGH)是單鏈多肽，由191個胺基酸組成（分 子量21，500)。二硫鍵連接位置53和165，以及位置182和 189。Niall，Nature，New Biology，230 : 90 (1971)。hGH是 φ 有潛力的合成代謝劑，尤其是歸因於氮、磷、鉀和鈣的保 留。以GH處理垂體切除的大鼠，可恢複大鼠至少一部分的 生長速率。Moore 等人，Endocrinology 122 ·· 2920-2926 (1988)。在腦下垂體機能減退之（GH-缺陷的）個體中最醒目 的影響是促進骨骼-生長板-軟骨的直線生長，結果增加身 高。Kaplan，Growth Disorders in Children and Adolescents (Springfield, IL : Charles C. Thomas，1964) o hGH在各種動物模式中引起各種生理學和代謝影響，包 括直線骨骼生長、泌乳、巨噬細胞的激活作用、類胰島素 98715.doc 200529868 和糖尿病原的影響及其他（R_K. Chawla等人，Annu. Rev· Med. 34 : 5 19 (1983) ; O.G.P. Isaksson等人，Annu. Rev. Physiol. 47, 483 (1985) ; C.K. Edwards等人，Science 239, 769 (1988) ; M.O. Thomer和 M.L. Vance，J. Clin. Invest· 82 : 745 (1988) ； J.P. Hughes^ H.G. Friesen, Ann. Rev. Physiol. 47 : 469 (1985))。已經報告了，尤其是在停經後的婦女， GH分泌隨著年齡而衰退。Millard等人，Neurobiol. Aging， 11 ·· 229-235 (1990); Takahashi等人，Neuroendocrinology Μ， L6- 137-142 (1987)。亦參見Rudman等人，J· Clin· Invest·， 67: 1361-1369 (1981)和 Blackman，Endocrinology and Aging， 16: 981 (1987)。此外，報告存有可藉著一週三次GH處理， 降低一些年齡的徵候，包括降低痩肉體質量、脂肪組織質 量的擴大，以及皮膚變薄。參見，例如Rudnam等人，N· Eng. J. Med·，323 : 1-6 (1990)，以及在相同期刊中由 Dr. Vance 發表之附錄物件（第52-54頁）。這些生物學影響衍生自hGH 與特定細胞受體的交互作用。已經選殖兩種不同的人類受 體，hGH肝臟受體（D.W· Leung等人，Nature 330: 537 (1987)) 和人類催乳激素受體（J.M. Boutin等人，]\4〇1.£11(1〇(：1411〇1(^}^ 3 : 145 5 (1989))。然而，亦可能有其他的，包括人類胎盤 催乳激素受體（M. Freemark，M. Comer，G. Komer，和 S. Hardwerger，Endocrinol. 120 ·· 1865 (1987))。這些同種受體 包括糖基化細胞外激素結合功能部位、單一穿透膜功能部 位和細胞質功能部位，其在序列和尺寸上頗為不同。假定 一或多個受體在對hGH之生理學反應上扮演決定性的角 98715.doc 200529868 色。 通常觀察到將在生理學上 顯示其藥理學活性僅持續短 清除率。此外，這些蛋白質 性及/或溶解度。 有活性之蛋白質投與身體，可 日^間’歸因於其在身體中的高 的相對忌水性可能限制其穩定 為了降低清除率，改善治療性蛋白f的穩定性或廢除抗 原性，已經提出—些方法，其中利用水·溶性聚合物以化學 方式修改該蛋白質n貞型之化學修改可有效地阻斷來自 與蛋白質主鏈本身之物理接觸的蛋白水解酵素，因此防止 降解。某些水·溶性聚合物的化學附接可有效地降低腎清 除，歸因於增加分子的流體動力學體積。額外的優點包括 在某些情況下’增加治療性蛋白質的穩定性和循環時間、 增加溶解度，並降低免疫原性。聚（烯化氧），尤其是聚（乙 二醇）(PEG)，是一種這類的化學部分，已經用來製備治療 性蛋白質產物（動詞"聚乙二醇化”意指附接至少一個pE(}分 子）。聚（乙二醇）的附接已經顯示保護對抗蛋白水解作用，

Sada等人，J. Fermentation Bioengineering 71 ·· 137-139 (1991)， 且附接某些t (乙一醇）部分的方法是可利用的。參見1979 年12月18曰發證之美國專利第4，179,337號，Davis等人，”非· 免疫原性多肽（Non-Immunogenic Polypeptides)’’ ；以及 1977年 1月11曰發證之美國專利第4,002,531號，Royer，”以聚乙二 醇修改酵素並藉此產生產物（Modifying EnZymes with

Polyethylene Glycol and Product Produced Thereby)”。至於 回顧，參見Abuchowski等人，在作為藥物之醏素Qgnzvmes as 98715.doc 200529868 2〇lgll(J-S.H〇lcerberg和 j.Roberts編輯，第 367_383 頁（1981)) 中 0 已經使用其他的水溶性聚合物，如乙二醇/丙二醇的共聚 物、羧甲基纖維素、葡料唐、聚（乙稀醇）、聚（乙稀峨嘻烧 酮）、聚（-1，3-二氧戊環）、聚（-1，3,6_三呤烷、乙烯/順丁烯二 酸酐共聚物、聚-胺基酸（均聚物或隨機共聚物）。 已經描述聚乙二醇化之治療性蛋白質的種種實例。 ADAGEN ，一種腺苷脫胺酶的聚乙二醇化調配物，批准用 來治療嚴重的混合免疫缺陷疾病。〇NCaSPAr®，一種聚乙 二醇化之L-天冬醯胺酶，已經批准用來治療過敏性all患 者。聚乙二醇化之超氧物歧化酶已經在臨床試驗中批准用 來治療頭部傷害。聚乙二醇化之α_干擾素（美國專利第 5,738,846號、5,3 82,657號)已經批准用來治療肝炎；報告了 聚乙二醇化之葡糖腦苷脂酶和聚乙二醇化之血紅素已經在 進行fcir床知測試。其他的實例是聚乙二醇化之IL_6，EF 〇 442 724 ’ 標題為”經過修改之hIL-6 (Modified hIL-6)”，其 揭示將聚（乙二醇）分子加至IL_6。 其他已經以化學方式修改的特定治療性蛋白質，是粒性 細胞菌落刺激因子（G-CSF)。〇丫仆誘導嗜中性粒性細胞的 快速增殖，並釋放至血流中，藉此在對抗感染時提供治療 影響。1 990年12月12日發表之歐洲專利公開案ep 〇 401 3 84，標題為”以化學方式修改之粒性細胞菌落刺激因子 (Chemically Modified Granulocyte Colony Stimulating Factor)"，描述製備與聚（乙二醇）分子附接之G_CSF的材料 98715.doc -10- 200529868 和方法。在1992年3月4日發表之歐洲專利〇 473 268，標題 為”連續釋放之醫藥組合物，包括與水溶性聚合物共價共輛 ^ 之多肽（Continuous Release Pharmaceutical Compositions • Comprising a Polypeptide Covalently Conjugated To A Water Soluble Polymer)”中亦報告經過修改之G-CSF及其類似 物’開始使用各種與水溶性顆粒聚合物共價共軛的g_csf 和衍生物，如聚（乙二醇）。在1989年10月4日發表之歐洲專 0 利0 335 423中’報告了具有人類粒性細胞菌落刺激因子活 性的經過修改之多肽。在美國專利第5,824,784號中提供在 N-終端修改蛋白質或其類似物的方法，以及所得的組合 物’包括新穎的在N-終端以化學方式修改之g-CSF組合 物。美國專利第5,824,778號則揭示以化學方式修改之 G-CSF 〇 關於聚（乙二醇），已經使用各種方法將聚（乙二醇）分子與 蛋白貝附接。通常，經由在蛋白質上找到的反應基團將聚 • (乙二醇）分子與該蛋白質連接。 胺基基團，像是在離胺酸殘基或在N_終端上的那些，對 這類附接是很方便的。例如，Royer(美國專利第4,〇〇2,531 號，在上）陳述使用還原性烷化作用，將聚（乙二醇）分子附 接至酵素。Chamow等人，Bi〇c〇njugate Chem 5 : 13314〇 (1994)報告經由還原性烧化作用，以單f氧基聚（乙二醇） •酐修改CD4免疫黏附素（lmmun〇adhesin)。作者報告在容許 控制整個聚乙二醇化作用# # • 子1匕作用轾度的條件下，50%的CD4-Ig被

MePEG-修改。同一書，為楚 曰 在弟1 3 7頁。作者亦報告了經過修 98715.doc 200529868 改之CD4-Ig在活體外（對蛋白質gp 120)之結合能力的降低 比率，與單曱氧基聚（乙二醇）化作用的程度有關聯，在同一 書中。1990年2月27發證之Shaw的美國專利第4,904,584 號，係關於在蛋白質中離胺酸殘基之數目的修改，以便經 由反應性胺基基團附接聚（乙二醇）分子。 WO 93/00109係關於刺激哺乳動物或鳥類之GH反應性組 織的方法，包括維持連續、有效之血漿GH濃度3或更多天。 陳述一種達成這類血漿濃度的方法是藉著使用與大分子物 質，如PEG (聚乙二醇）偶連的GH。陳述與大分子物質偶聯， 導致改善的半衰期。已經在WO 93/00109中報告了使用 mPEG醛-5000和mPEG N-羥基琥珀醯亞胺基酯 (mPEG-NHS-5000) PEG化的人類生長激素。使用 mPEG-NHS結果產生hGH之多重PEG化形式的異質混合 物。WO 93/00109亦揭示使用mPEG-順丁烯二醯亞胺PEG化 半胱胺酸hGH變體。 WO 99/03 8 87揭示PEG化之半胱胺酸變體生長激素。命名 為BT-005，提出該共軛物在刺激生長激素缺陷大鼠增重方 面是更有效的，且具有比hGH更長的半衰期。 在Clark等人中報告了 PEG化之人類生長激素，其使用羧 曱基化之PEG的琥珀醯亞胺酉旨（Journal of Biological Chemistry 271 ·· 21969-21977, 1996)。Clark等人描述 了使用 mPEG-NHS-5000增加尺寸的hGH衍生物，其選擇性地與一 級胺共軛。增加PEG修改的層次，降低對其受體的親和力， 並在以細胞為基礎之測定中增加EC5〇高達1500倍。Olson等 98715.doc 12 200529868 人，Polymer Preprints 38 : 568-569，1997揭示使用 N-經基 琥珀醯亞胺（NHS)(PEG)和丙酸琥珀醯亞胺酯（SPA) PEG，完 成多重PEG化之hGH物種。 WO 94/20069預言性地揭示PEG化之hGH，成為肺臟遞送 之調配物的一部分。 美國專利第4，179,337號揭示PEG化之酵素和激素，獲得 具有生理活性的非-免疫原、水溶性多肽共輛物的方法。為 了舉例說明欲PEG化的激素而提及GH。 歐洲專利458064 A2揭示在生長激素中導入或天然存在 之半胱胺酸殘基的PEG化作用。歐洲專利458064 A2更提及 在稱為Ω環之環中插入兩個半胱胺酸殘基，敘述係位在野外 型牛生長激素中殘基102-112處，更特定而言，歐洲專利 458064 A2揭示分別在牛生長激素之編號102和112的殘基 處，從Ser至Cys和Tyr至Cys的取代。 WO 95/11987提出將PEG附接至出現在親代分子中或藉 著指定位置之突變生成作用併入的半胱胺酸殘基之硫代基 團上。WO 95/11987係關於蛋白酶連接素-1的PE化作用，然 而，同樣提出hGH及其他蛋白質的一般PEG化作用。 WO 99/03887揭示，例如藉著插入額外的cys 25絲胺酸殘 基，並將PEG附接至導入之半胱胺酸殘基，來修改的生長 激素。 WO 00/42175係關於製造含有用以附接PEG之自由半胱 胺酸殘基之蛋白質的方法。WO 00/42175揭示下列的hGH突 變蛋白：T3C、S144C和T148C，以及其半胱胺酸PEG化作 98715.doc -13- 200529868 用。 WO 97/1 1 178 (以及美國專利第5849535號、美國專利第 6004931號和美國專利第6022711號）係關於使用GH變體，如 hGH之激動劑或拮抗劑。WO 97/11178亦揭示hGH之PEG化 作用，包括離胺酸PEG化作用，以及離胺酸的導入或置換（例 如K168A和K172R)。WO 97/11 178亦揭示〇120尺之取代作 用。 WO 03/044056揭示各種PEG化之hGH物種，包括分支的 40K PEG醛hGH共軛物。 PEG化之hGH的先前報告需要附接多個PEGs，其結果產 生不想要的異質性，達到比所描述之腎臟過濾之70K分子量 截止更大的流體動力學體積（Knauf，M.J.等人，J. Biol. Chem. 263 : 15064-15070, 1988) 〇 目前為了長期治療，投與rhGH是每天的，並因此極希望 更低頻率的投藥。具有較長循環半衰期之hGH分子將降低 必要的投藥次數，且可能提供更佳的治療hGH水準，伴隨 著促進治療效果。 不管許多嘗試PEG化hGH，仍對具有適當特性，成為可行 商品之PEG化hGH分子有不適當的需要。本發明提供 PEG-hGH共軛物，具有單一PEG優先附接在hGH的N-終端 苯丙胺酸處。使用已經在WO 93/00109，Clark等人（Journal of Biological Chemistry 271 : 21969-21977，1996)和 Olson 等人（Polymer Preprints 38 : 568-569，1997)中描述的 mPEG 醛-5000或mPEG N-羥基琥珀醯亞胺酯（mPEG-NHS-5000)， 98715.doc -14- 200529868

將多個低分子量（5Kd)的PEGs附接在…或ε •胺基位置（在 hGH中之Ν_終端和9離胺酸）。這結果是異質的族群。因為 說明hGH帶有9個離胺酸，可能有一些分子有1〇個則§附 接，-些有9個，一些有8個，一些有7個，一些有6個，一 些有5個，一些有4個，一些有3個，一些有2個，一些… 個而-些有0個。且在有數個的分子中，咖可能並沒•有附 接在不同分子的相同位置±。t發展治療產物時，該所得 的異質性是不利的，使共軛、純化及定出特徵變得困難、 昂貴且為高度不可逆的。其他的方法（w〇〇〇/42i75)已經使 用含有可供與PEG附接之自由半胱胺酸殘基的hGH變體。然 而，該方法可導致錯誤摺疊的蛋白質，具有錯誤配對的二 硫鍵，而結果是異質的PEG化產物，其具有附接在一些或 全部半胱胺酸上的PEG。在多個位置有多個PEGs附接，可 能導致分子在PEG與各種位置之間有較不穩定的結合，其 可變成以不同的速率解離。這使其不易精確地預測產物的 藥物動力學，結果不正確地給藥。在獲得治療性產物的管 理批准時，異質的產物亦具有不想要的問題。 因此’將希望有具有附接在單一位置之單一 pEG的peg 化hGH分子。本發明以許多方式解決該需求。 【發明内容】 本發明係關於以化學方式修改的hGH及其激動劑變體， 其具有至少一個改良的化學或生理學特性，選自但不限於 降低清除率、增加血漿滯留期間、增加穩定性、改善溶解 度和降低抗原性。因此，如同在下文中更詳細的描述，本 98715.doc -15- 200529868 發明具有許多方面是關於以化學方式修改之多肽，包括但 不限於hGH及其激動劑變體，以及使用聚（乙二醇）丁醛部分 的特定修改。 本發明亦關於產生以化學方式修改之hGH及其激動劑變 體的方法。特定而言，本發明係關於使用丁醛，產生以化 學方式修改之hGH的方法，結果產生較大的附接之N-終端 選擇性。 本發明亦關於包括以化學方式修改之hGH及其激動劑變 體’單獨或與其他治療劑混合的組合物。 本發明亦關於本發明之以化學方式修改的hGH及其激動 劑變體’單獨或與其他治療劑混合，在預防及/或治療其中 GH治療有效之病症及/或疾病上的用途。 【實施方式】 hGH及其激動劑變體是在美國專利第4,658,〇21號（曱硫 月女醯基人類生長激素-Met-1_191 hGH)和美國專利第 • 5,633,352號中描述之重組蛋白質家族的成員。在美國專利 第4,342,832號、M〇 1，980號；纟國專利第4,898,83〇號；美 國專利第5,424，199號和美國專利第5,795,745號中描述了其 重組產生和使用方法。 可在本發明中使用任何經過純化或分離的hGH或其激動 劑變體，其藉著諸如大腸桿菌之類的宿主細胞，以及藉著 ^ 使用重㉞遺傳技術轉化或轉移感染之動物細胞來產生。在 • 1992年6月11曰發表之美國專利第6，143,523號和W〇 92/0969G中描述了額外的hGH變體。其中，騎經過轉化之 98715.doc -16- 200529868 大腸桿菌產生之hGH或其激動劑變體是特佳的。可大量獲 得高純度和同質性的這類hGH或其激動劑變體。例如，可 ' 根據在美國專利第4,342,832號、4,601，980號；美國專利第 - 4,898,830號；美國專利第5,424，199號和美國專利第 5,795,745號中揭示的方法製備上文的hGH或其激動劑變 體。’’實質上具有下列之胺基酸序列” 一詞意指上文的胺基 酸序列可能包含一或多個胺基酸改變（刪除、添加、插入或 φ 置換），只要這類改變對hGH或其激動劑變體不引起任何不 利的功能非-類似性。更佳的是使用hGH或其激動劑變體， 實質上具有其中包括至少一個離胺酸、天冬胺酸、穀胺酸、 不成對的半胱胺酸殘基、自由的N_終端仏胺基基團或自由 的C-終端緩基基團的胺基酸序列。 當在本文中使用時，” hGH多肽或hGH蛋白質”一詞包括所 有的hGH夕月太’較佳的是得自哺乳動物物種，更佳的是得 自人類和老鼠物種，以及其變體、類似物、直系同源基因 • (〇rth〇1〇gS)、同系物和衍生物，及其片段，其特徵在於在生 /足進生長並維持正常體組成、合成代謝和脂質代謝。 幸乂佳的疋，，’hGH多肽或蛋白質”-詞意指SEQ ID NO : 1的 hGH多狀，及其變體、同系物和衍生物，基本上顯示出相 生物活性(在生長期促進生長，並維持正常體組成、合 j代謝和脂質代謝)。更佳的是，，，hGH多肽或蛋白質”一詞 • 意指SEQ ID NO : 1之多肽。 . "在本文中使用時，”hGH多肽變體”-詞意指得自相同物 種’但與參考hGH多狀不同的多肽。-般而言，差異是有 98715.doc 17 200529868 限的，使得參考和變體的胺基酸序列整體是極為類似的，

且在許多區域是相同的。較佳的是，hGH多肽與參考hGH f 多肽，較佳的是SEQ ID NO : 1之hGH多肽，是至少70%、 . 8〇%、90%、95%、96%、97%、98〇/〇或 99%相同的。具有與 問題胺基酸序列至少例如95%，，相同，，之胺基酸序列的多 肽，企圖使該主題多肽之胺基酸序列是與問題序列相同 的，除了主題多肽序列在問題胺基酸序列之每1〇〇個胺基酸 馨 中可包括咼達5個胺基酸改變。參考序列的這些改變可發生 在參考胺基酸序列的胺基或竣基終端位置，或在這些終端 位置之間的任何地方，個別地散布在參考序列中的殘基 中’或在參考序列内的一或多個相鄰集團中。問題序列可 以是參考序列的完整胺基酸序列，或根據在本文中指定的 任何片段。 這類hGH多肽變體可以是天然存在的變體，如藉著數個 hGH改變形式之一編碼的天然存在之對偶基因變體，佔據 _ 在生物之染色體上的特定位點，或由起源自單一原始轉錄 本的天然存在之接合變體編碼的同功型。或者，多肽 k體可以是不知道是天然存在的，並可使用此項技藝中已 知之突變生成技術製造的變體。 在此項技藝中已知可從具有生物活性之肽或蛋白質的 〜螭或C-終端刪除一或多個胺基酸，實質上不會喪失生物 •功能（參見例如Ron等人（1993)，Biol Chem.，⑽ .2984-2988;將其揭示内容全部以引用的方式併入本文中）。 热諳此藝者亦將承認可改變hGH多肽的一些胺基酸序 98715.doc 200529868 列，而對蛋白質之結構或功能沒有重大的影響。這類突傲 種包括刪除、插人、倒位、重複和取代，根據此項技蔽二 已知的普通規則來選擇，以致於對活性有極少的影響。例 如，在30评4等人（199〇)^6如6 247:13〇6131〇中提供了 關於如何製造在表現型上靜默（silent)之胺基酸取代的於 導，全部以引用的方式併入本文中，其中作者指出有兩^ 研究胺基酸序列對改變之容忍性的主要方法。 第一種方法依賴進化的過程，其中突變被天擇接受或拒 絕。第二種方法使用遺傳工程，在選殖之hGH的特定位置 導入胺基酸改變，並選擇或篩選以便確認維持功能性的序 列。這些研究已經顯示蛋白質對胺基酸改變是驚人地寬 容。作者更進一步指出胺基酸改變在蛋白質的某些位置可 能是容許的。例如，埋在最裡面的胺基酸殘基需要非極性 側鏈，而通常保留表面側鏈的少數特徵。在B〇wie等人（199〇) 在前’以及在本文中提及之參考文獻中，描述了其他這類 在表現型上的靜默取代。 通常將在脂肪族胺基酸Ala、Val、Leu和Phe中的彼此置 換；羥基殘基Ser和Thr的交換，酸性殘基Asp和Glii的交換， 在醯胺殘基Asii和Gin之間的取代，鹼性殘基Lys和Arg的交 換，以及在芳香族殘基Phe、Tyr中的置換視為保留性置換。 此外，下列集合之胺基酸通常代表相等的改變：（1) Ala、 Pro、Gly、Glu、Asp、Gin、Asn、Ser、Thr ; (2) Cys、Ser、 Tyr、Thr ; (3) Va卜 lie、Leu、Met、Ala、Phe ; (4) Lys、 Arg、His ; (5) Phe、Tyr、Trp、His。 -19- 98715.doc 200529868 hGH多肽一詞亦包括所有由hGH類似物、直系同源基因 及/或物種同系物編碼的hGH多肽。當在本文中使用時， n hGH類似物π —詞意指不同和無關生物的hGHs，其在每個 生物中執行相同的功能，但並非起源自該生物們之祖先共 有的祖先結構。類似的hGHs改而個別地產生，並隨後演化 以便執行相同的功能（或類似的功能）。換句話說，類似的 hGH多肽是具有相當不同胺基酸序列的多肽，但執行相同 的生物活性，即在生長期促進生長，並維持正常體組成、 合成代謝和脂質代謝。當在本文中使用時，”11(}11直系同源 基因π —詞意指在兩個不同物種内的hGHs，該序列經由在祖 先物種中之共同的同系hGH而彼此相關，但已經演化而成 為彼此不同的。當在本文中使用時，”hGH同系物"一詞意指 不同生物的hGHs，其在每個生物中執行相同的功能，並起 源自該生物們之祖先共有的祖先結構。換句話說，同系的 hGH多肽是具有相當類似之胺基酸序列的多肽，其執行相 同的生物活性，即在生長期促進生長，並維持正常體組成、 合成代謝和脂質代謝。較佳的是，可將hGH多肽同系物定 義為對參考hGH多肽，最好是SEq ID N〇 ·· 多肽顯 露出至少 40%、50%、60%、70%、80%、90%、950/0、96〇/〇、 97%、98°/〇或99°/〇同一性的多肽。 因此，根據本發明之hGH多肽可以是例如··（i)其中以保 留性或非-保留性之胺基酸殘基（最好是保留性胺基酸殘基） 取代一或多個胺基酸殘基的hGH多肽，且這類經取代之胺 基酸殘基可以是或可以不是由遺傳密碼編碼的；或〇〇其令 98715.doc -20· 200529868 一或多個胺基酸殘基包括取代基的hGH多肽；或（iii)其中該 hGH多肽與其他化合物融合的hGH多肽，如增加該多肽之半 • 衰期的化合物（例如聚乙二醇）；或（iv)其中額外的胺基酸與 上述形式之多肽融合的hGH多肽，如igG Fc融合區肽或前導 或刀/必序列，或用來純化上述形式之多肽或前_蛋白序列的 序列。 hGH多肽可以是單體或多聚體。多聚體可以是二聚體、 春三聚體、四聚體，或包括至少5個單體多肽單元的多聚體。 多聚體亦可以是同種二聚體或異種二聚體。本發明之多聚 體可能是忌水性、親水性、離子及/或共價結合的結果，並 /或可間接連接，藉著例如微脂粒形成。在一個實例中，在 έ有hGH多肽或其片段之融合蛋白中，含有在異種序列之 間的共價結合（參見，例如美國專利第5,478,925號，將其揭 不内容全部以引用的方式倂入本文中）。在其他實例中，可 經由肽交聯劑，如在美國專利第5,〇73,627號中描述的那些 •(以引用的方式倂入本文中），將hGH多肽或其片段與一或多 個多肽連接，該多肽可以是hGH多肽或異種多肽。其他製 備多聚體hGH多肽的方法涉及使用與亮胺酸拉鍊或異亮胺 酸拉鍊多肽序列融合的hGH多肽，已知其促進蛋白質的多 聚化作用（multimerization)，其中使用熟諳此藝者已知的技 術發現它們，包括w〇94/1〇3〇8之技術。在其他的實例中， • 可藉著在在含有Flag®多肽序列之融合hGH多肽中所含有的 • Flag(E)多肽序列之間的交互作用，連接hGH多肽。亦可使用 此項技藝中已知的化學技術，產製hGH多聚體，如使用交 98715.doc -21 - 200529868 聯劑分子之交聯作用，以及此項技藝中已知的交聯劑分子 長度最優化技術（參見，例如美國專利第5,478,925號），在 位在欲納入多聚體中之多肽序列内的半胱胺酸殘基之間形 成一或多個分子間交聯的此項技藝中已知之技術（參見，例 如美國專利第5,478,925號），在hGH多肽之C終端或N_終端 加入半胱胺酸或生物素，以及產製含有一或多個這些經修 改多肽之多聚體的技術（參見，例如美國專利第5,478,925 號），或30種產製含有hGH多聚體之微脂粒的任何技術（參 見，例如美國專利第5,478,925號），將其揭示内容全部以引 用的方式併入本文中。 當在本文中使用時，”hGH多肽片段” 一詞意指包括hGH 多肽’最好是SEQ ID NO : 1之多肽的一部分胺基酸序列之 相鄰跨距的任何肽或多肽。 更特定而言，hGH多肽片段包括根據本發明之hGH多肽 的至少6個，較佳的是至少8至10個，更佳的是12、15、20、 25 、 30 、 35 、 40 、 50 、 60 、 75 、 100 、 125 、 150 、 175 、 191 個連續胺基酸。可額外地將hGH多肽片段描述為hGH多肽的 亞-屬，包括至少6個胺基酸，其中將”至少6個”定義為在6 和代表hGH多肽（包括SEQ ID NO : 1之多肽）的C-終端胺基 酸之整數之間的任何整數。更包括hGH多肽片段的物種， 長度至少6個胺基酸，按照上述，就其N-終端和C-終端位置 進一步指定。’’hGH多肽片段，，一詞亦包括個別的物種，為長 度至少6個胺基酸的所有hGH多肽片段，按照上述，可藉著 N-終端和C-終端位置更特別地指定。也就是說，在列舉或 98715.doc -22- 200529868 屬於本發明之序列的任何特定胺基酸序列上，長度至少6 個相鄰胺基酸殘基之片段可佔據的N_終端和c_終端位置的 每個組合，均納入本發明中。

應注意本發明之多肽片段的上述物種，可藉著式” &至b，， 另行說明；其中”a”等於多核苷酸之最靠冰終端的胺基酸位 置，而nbn等於最靠c-終端的胺基酸位置；且其中更進一步 nan等於在1與hGH多肽序列之胺基酸數目減6之間的整數， 且其中”b”等於在7與hGH多肽序列之胺基酸數目之間的整 數；且其中’’a’’為比”b"小至少6的整數。 可使用以上的說明，立刻預見以上的hGH多肽片段，並 因此不個別地單獨列舉，以免不必要地延長本說明書。此 外以上的片#又不一定需要具有hGH生物活性，雖然具有 故些活性的多肽是本發明較佳的具體實施例，因為它們在 例如免疫測定、抗原決定位作圖、將抗原決定位附貼標籤、 作為疫苗，以及作為分子量標記上將是有用的。亦可使用 以上的片段’對多肽的特定部分產製抗體。 夕肽片段”一詞亦包括hGH多肽的功能部位。這類 月b邛位最後可包括直線或結構的基序和簽名，包括但不 於亮胺酸拉鍊、螺旋_轉-螺旋架構、轉譯後修改位置，如 基化作用位置、泛素化位置、α螺旋和卢片，編碼信號肽 信號序列，其指揮編碼蛋白質的分泌，涉及轉錄調節的 :’如同源異形盒、酸性延伸股、酵素活性位置、受質 。位置和酵素切開位置。這類功能部位可提供特殊的生』 活性，如麵或RNA-結合、蛋白f之分泌、轉錄調節、| 98715.doc -23- 200529868 素活性、受質結合活性等等。 功能部位具有通常包括在3到191個胺基酸之間的尺寸。 在較佳的具體實施例中，功能部位包括數目在6到191之間 的任何整數的胺基酸。可使用熟諳此藝者已知的任何方法 來合成功能部位，包括在本文中揭示關於製備hGH多肽的 那些，來產生抗-hGH抗體。判定構成具有特殊生物活性之 功能部位的胺基酸的方法，包括判定待測試之生物活性的 突變生成研究和測定。

在本發明之前後文中特佳的片段是保留重大生物活性的 hGH多肽，即在生長期促進生長，並維持正常體組成、合 成代謝和脂質代謝。 或者，可使用任何熟諳此藝者已知的電腦，在資料庫中 針對基序、功能部位及/或簽名審查本發明之多肽。可搜尋 的資料庫包括 Prosite (Hofmann等人，（1999) Nucl. Acids Res· 27 : 215-219 ; Bucher和 Bairoch (1994) Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology· Altman等人編輯，第 53-61 頁，AAAIPress， Menlo Park)、Pfam (Sonnhammer 等人，（1997) Proteins 28(3) : 405-20 ; Henikoff等人，（2000) Nucleic Acids Res. 28(1) : 228-30 ; Bateman等人，（2000)?411(：161。八(：1(18 1^8· 28(1): 263-6)、Blocks (Henikoff等人，（2000) Electrophoresis 21(9) : 1700-6)、Print (Attwood等人，（1996) Nucleic Acids Res. 24(1) : 182㈣8)、Prodom (Sonnhammer和 Kahn (1994) Protein Sci. 3(3) : 482-92 ; Corpet等人（2000) Nucleic Acids 98715.doc -24- 200529868

Res. 28( 1) ·· 267-9)、Sbase (Pongor等人(1993) Protein Eng. 6(4) ·· 391-5 ; Murvai等人，（2000) Nucleic Acids Res· 28(1): 260-2)、Smart (Schultz等人，（1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95，5857-5864)、Dali/FSSP (Holm和 Sander (1996) Nucleic Acids Res. 24(1) ·· 206-9 ; Holm和 Sander (1997)

Nucleic Acids Res. 25(1) : 231-4 ; Holm和 Sander (1999) Nucleic Acids Res. 27(1): 244-7)、HSSP (Sander和 Schneider (1991) Proteins 9(1) : 56-68)、CATH (Orengo等人，（1997) Structure 5(8) ·· 1093-108 ; Pearl等人，（2000)81〇(：11€111.8〇。· Trans. 28(2) ： 269-75) - SCOP (Murzinf Λ ^ (1995) J. Mol. Biol· 247(4) : 536-40 ; Lo Conte等人，（2000) Nucleic Acids Res. 28(1): 257-9)、COG (Tatusov等人，（1997) Science 278, 63 1 : 637 ; Tatusov等人，（2000) Nucleic Acids Res. 28(1): 33_6)、特定家族之資料庫及其衍生物（Nevill-Manning等 Λ ^ (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5865-5871 ； Yona 等人，（1999) Proteins 37(3) : 360-78 ; Attwood等人，（2000) Nucleic Acids Res. 28(1) : 225-7)，分別將其揭示内容全部 以引用的方式併入本文中。至於可獲得之資料庫的回顧， 參見Nucleic Acid Research (2 000)之28冊第1期，將其揭示 内容全部以引用的方式併入本文中。 ’’hGH多肽片段” 一詞亦包括攜帶抗原決定位的片段。這些 抗原決定位可以是抗原性的抗原決定位，或抗原性之抗原 決定位和免疫原性之抗原決定位兩者。將免疫原性的抗原 決定位定義為蛋白質的一部分，當該多肽是免疫原時，其 98715.doc •25- 200529868 在活體内誘發抗體反應。另一方面，將多狀中與抗體結合 的區域定義為抗原性之抗原決定位。抗原決定位在空間構 • 形上，可包括3個胺基酸那麼少，其為抗原決定位所特有 ， 的。抗原決定位通常由至少6個這類的胺基酸所組成，而更 常見的是至少8 -10個這類胺基酸。 根據本發明之攜帶hGH抗原決定位的片段可以是任何片 段，其長度在6個胺基酸到hGH多肽之全長序列之間，較佳 0 的是在6到50個胺基酸之間的片段。可按照上述，藉著相鄰 胺基酸殘基的數目（按照亞-屬），或藉著特定之N•終端和〇_ 終端位置（按照物種），指定攜帶抗原決定位的片段。 可藉著任何傳統的方法，產生功能如同抗原決定位的片 段（參見，例如Houghten (1985)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 5131-5135，以及美國專利第4,631，21號，將其揭示内 容全部以引用的方式併入本文中）。判定構成抗原決定位之 胺基酸的方法，包括X-射線結晶術、二維核磁共振和抗原 φ 決定位作圖，例如由Geysen等人，（1984)，？聊.他比八。&(1·

Sci· USA 81 : 3998-4002，· PCT公開案 WO 84/03564和 WO 84/03506描述的pepscan法，將其揭示内容全部以引用的方 式併入本文中。其他實例為jameson和W〇if，（1988)，Comp. Appl· Bio sci. 4 ·· 18 1-1 86的演算法（全部以引用的方式併入 本文中）。可使用例如電腦程式protean，使用預設參數 . (Windows 4·0 版，DNASTAR· Inc·)，進行 James〇n_w〇lf 抗原 分析。 本發明亦提供按照上述由N-終端和C-終端位置指定之任 98715.doc -26- 200529868 何hGH片段物種，或由胺基酸殘基之尺寸指定的任何片段 亞-屬的排除。可排除數個按照上述藉著N_終端和c_終端位 • f，或藉著胺基酸殘基之尺寸指定的片段為個別的物種。 • 本發明亦提供以相同的方式，排除任何hGH功能部位或攜 帶抗原決定位之片段。 Μ 可使用熟諳此藝者已知的技術，以任何適當的方式製備 本發明之hGH多肽，如從天然來源中純化、以化學方式合 • 成 '藉著重組技術產生（包括在活體外的轉譯技術），或在能 夠表現hGHcDNA的重組細胞中表現hGH多肽及其片段，或 這些方法的組合（參見，例如純化蛋白質之各種方法的，,酵 素學方法（Methods in EnZym〇l〇gy)，Academic press， 1993” ； Creighton，（1983)蛋白質：結構和分子原則 (Proteins ： Structures and Molecular Principles), W.H. Freeman & Co，第2版，τ·Ε·，New Y〇rk ;以及關於蛋白質之 化學合成的Hixnkapiller等人，（1984) Nature. 310 (5973): φ 10%11，和關於重組技術的Davis等人（1986)分子生物學的 基本方法（Basic Methods in M〇lecuiar Biology)，編輯 Elsevier Press，NY，將其揭示内容全部以引用的方式併入 本文中）。本發明之多肽最好是以經過分離之形式提供，並 可以部分是或最好是實質上經過純化的。 ’’與參考多核苷酸具有至少X%同一性的多核苷酸”和，，與 • 參考多肽具有至少X%同一性的多肽”一詞，包括其殘基（分 • 別為核苷酸或胺基酸）序列顯示出按照定義，分別與參考多 核苷酸或多肽序列相比較，低於、等於或高於X之同一性百 98715.doc -27- 200529868 分比的多核苷酸或多肽。 在兩個多核苷酸或多肽序列在比較窗上的最佳排列之 1 後，判定同一性百分比，其中在比較窗中多核苷酸或多肽 •的部分可包括一或多個殘基的添加或刪除，以便充分運用 序列排列。比較窗含有某個數目的位置（殘基或相當於殘基 之插入/刪除的間隙），該位置數目相當於窗的大小。每個窗 位置可出現下列的狀況之一： . 1 °/在第一個排列序列上的該位置上有一個殘基（核苷酸 或月女基酸）’而在第二個排列序列上之相同位置上有不同的 殘基，換句話說， 話說，第二個序列與第一個序列相比較，在該 位置有經取代的殘基。

3°/在第一 一個排列序列上的該位置上有

置出現刪除。

I上有一個殘基（核苷酸 上之相同位置上沒有殘 個序列相比較，在該位 目屬於上文定義之第一類的稱為

目屬於上文定義之第二類的稱為

目屬於上文定義之第三類的稱為 98715.doc -28- 200529868 可藉著任何下列的公式來計算同一性百分比（％id): %id=R2/(Rl+R2+R3)xl00，或 %id=(R2 + R3)/(Rl+R2+R3)xl00。 可使用任何此項技藝中已知的各種序列比較演算法和程 式，進行欲比較之序列的排列。這類演算法和程式包括， 但不限於TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA、FASTDB、

WU-BLAST、Gapped-BLAST、PSI-BLAST (Pearson和 Lipman， (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 ： 2444-2448 ； Altschul 等人，（1990)，J· Mol· Biol· 215 : 403-410 ; Altschul等人， (1993)，Nature hGHtics 3 : 266-272 ; Altschul等人，（1997)， Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402; Thompson等人，（1994)，Nuc. Acids Res. 22 : 4673-4680 ; Higgins 等人，（1996)，Meth. Enzymol. 266 : 383-402 ; Brutlag 等人（1990) Comp. App. Biosci. 6 : 237-245 ; Jones 和 Swindells，（2002) Trends Biochem Sci 27 : 161-4 ; Olsen 等人（1999) Pac Symp

Biocomput，302-13)，將其揭示内容全部以引用的方式併入 本文中。 在特殊的具體實施例中，使用Smith-Waterman法與計分 矩陣，如PAM、PAM 250或更佳的是BLOSUM矩陣，如 BLOSUM60或BLOSUM62，以及預設參數（間隙開口罰點 =10，且間隙延伸罰點=1)，或利用使用者-指定之參數，最 好大於預設參數。 在其他特殊的具體實施例中，使用基本局部排列搜尋工 具（Basic Local Alignment Search Tool)(’’BLAST”）程式與預 98715.doc •29- 200529868 設參數，或利用使用者提供之經過修改的預設參數，排列 蛋白質和核酸序列。較佳的是，所使用之計分矩陣是 BLOSUM62 矩陣（Gonnet 等人，（1992)，Science 256 : 1443-1445 ; Henikoff和 Henikoff，（1993)，Proteins 17 : 49-61，將其揭示内容全部以引用的方式併入本文中）。較差 的是，亦可使用PAM或PAM250矩陣（參見，例如Schwartz 和Dayhoff，（1978)編輯，檢測距離關係的矩陣：蛋白質序列 和結構的圖冊（Matrices for Detecting Distance Relationships ·· Atlas of Protein Sequence and Structure), Washington : National Biomedical Research Foundation，將 其揭示内容全部以引用的方式併入本文中）。 在另一個特殊的具體實施例中，使用以Brutlag等人 (1990)，在前之演算法為基礎的FASTDB電腦程式，將多核 苷酸或多肽序列排成一直線。在DNA序列之FASTDB演算法 中所使用的較佳參數為：矩陣=一元的，k-元組（tuple)=4， 誤配罰點=1，連接罰點=3 0，隨機組長度=0，截止分數=1， 間隙罰點=5，間隙尺寸罰點=0.05，窗尺寸=500或主題核苷 酸序列的長度，較短的那一個。在FASTDB胺基酸排列中所 使用的較佳參數是··矩陣=PAM 0, k-元組=2,誤配罰點=1， 連接罰點=20，隨機組25長度=0，截止分數=1，窗尺寸=序 列長度，間隙罰點=5，間隙尺寸罰點=0.05，窗尺寸=500或 主題胺基酸序列的長度，較短的那一個。 根據本發明，經由hGH或其激動劑變體之胺基酸殘基， 共價結合聚（乙二醇）。具有一些不同官能基、交聯劑、組態 98715.doc -30- 200529868 和分子量之各種激活的聚（乙二醇）們為熟諳此藝者已知 的，其可用來創造PEG-hGH共軛物或PEG-hGH激動劑變體 共輛物（關於回顧，參見Roberts M.J·等人，Adv. Drug Del· Rev. 54 : 459-476，2002 ; Harris J.M.等人，Drug Delivery Systems 40 : 538-551，2001)。本發明係關於使用醛化學， 使用丁醯醛交聯劑部分，使PEG部分指向N-終端之選擇性 的方法。丁醯醛交聯劑與乙醛交聯劑相比較，結果增加了 N-終端的專一性（表1和圖1)。 本發明之具體實施例是具有式I或式II之結構的人類生長 激素-PEG共輊物

h2c h2c I CH2

I

CH H mPEG—0—C-

、J_N—(CH2CH20)n(CH2)mCHrNH-R 0

式I 或

mPEG-0(CH2CH2〇)n(CH2)mCH2-NH-R

式II 其中n為在1到10之間的整數； m為在1到10之間的整數； 98715.doc -31 - 200529868 R為人類生長激素，甲硫胺醯基生長激素或人類生長激素 變體。 在特殊的具體實施例中，n在1到5之間，且㈤在1到5之間。 在式I之特殊的具體實施例中：η為1且m為1 ; n為1且m 為2 ; η為1且!!1為3 ; η為1且m為4 ; η為1且m為5 ; η為1且m 為6 ; η為1且m為7 ; η為1且m為8 ; η為1且m為9 ; η為1且m 為10 ; η為2且m為1 ; η為2且m為2; η為2且m為3 ; η為2且m 為4; η為2且m為5; η為2且m為6 ; η為2且m為7 ; η為2且m 為8 ; η為2且m為9 ; η為2且m為10 ; n為3且m為1 ; η為3且m 為2 ; η為3且m為3 ; η為3且m為4 ; η為3且m為5 ; η為3且m 為ό ; η為3且m為7 ; η為3且m為8 ; η為3且m為9 ; η為3且m 為10 ; η為4且m為1 ; η為4且m為2 ; η為4且m為3 ; η為4且m 為4 ; η為4且m為5 ; η為4且m為6 ; η為4且m為7 ; η為4且m 為8 ; η為4且m為9 ; η為4且m為10 ; η為5且m為1 ; η為5且m 為2，η為5且m為3 ; η為5且m為4 ; η為5且m為5 ; η為5且m 為6 ; η為5且m為7 ; η為5且m為8 ; η為5且m為9 ; η為5且m 為10 ; η為6且m為1 ; η為6且m為2 ; η為6且m為3 ; η為6且m 為4 ; η為6且m為5 ; η為6且m為6 ; η為6且m為7 ; η為6且m 為8，η為6且m為9; η為6且m為10; η為7且m為1 ; η為7且m 為2 ; η為7且m為3 ; η為7且m為4 ; η為7且m為5 ; η為7且m 為6 ; η為7且m為7 ; η為7且m為8 ; η為7且m為9 ; η為7且m 為10，η為8且m為1 ; η為8且m為2 ; η為8且m為3 ; η為8且m 為4 ; η為8且m為5 ; η為8且m為6 ; η為8且m為7 ; η為8且m 為8 ; η為8且m為9; η為8且m為10; η為9且m為1 ; η為9且m 98715.doc -32- 200529868 為2 ; η為9且m為3 ; η為9且m為4 ; η為9且m為5 ; η為9且m 為6 ; η為9且m為7 ; η為9且m為8 ; η為9且m為9 ; η為9且m 為10; η為10且m為1 ; η為10且m為2; η為10且m為3; η為10 且m為4 ; η為10且m為5 ; η為10且m為6 ; η為10且m為7 ; η 為10且m為8 ; η為10且m為9 ; η為10且m為10。 特定的具體實施例為人類生長激素-PEG共軛物，具有結

mPEG—CT-C-NH

I ch2 h2c h2c 、 ch2

H H

mPEG^O—C—N C-N—(CH2CH20)4CH2CH2CH2CH2-NH-R

mPEG-0(CH2CH20)4CH2CH2CH2CH2-NH-R 其中R為人類生長激素、甲硫胺醯基人類生長激素或人類 生長激素變體。 本發明其他特定的具體實施例是人類生長激素-PEG共軛 物’其中該人類生長激素包括或由SEqID No: 1之胺基酸 序列所組成。 本發明的特定具體實施例是人類生長激素-PEG共軛物， 八中超過80 /〇，更佳的是8丨％，更佳的是，更佳的是 98715.doc -33- 200529868 83%，更佳的是84%，更佳的是85%，更佳的是86%，更佳 的是87%，更佳的是88%，更佳的是89%，更佳的是90%， 更佳的是91%，更佳的是92%，更佳的是93%，更佳的是 94%，更佳的是95%，更佳的是96%，更佳的是97%，且更 佳的是98%的聚乙二醇與SEQ ID NO : 1之胺基酸序列的胺 基-終端苯丙胺酸共軛。 本發明其他特定的具體實施例是人類生長激素-PEG共軛 物，其中超過90%的聚乙二醇與SEQ ID NO ·· 1之胺基酸序 列的胺基-終端苯丙胺酸共輛。 本發明其他特定的具體實施例是人類生長激素-PEG共軛 物，其中超過95%的聚乙二醇與SEQ ID NO : 1之胺基酸序 列的胺基-終端苯丙胺酸共軛。 本發明其他特定的具體實施例是人類生長激素-PEG共軛 物，其中超過98%的聚乙二醇與SEQ ID NO : 1之胺基酸序 列的胺基-終端苯丙胺酸共軛。 在本發明中使用的聚（乙二醇）不限於任何特殊的形式或 分子量範圍。聚（乙二醇）分子量可以在大約500到大約 100,000道爾吞之間。π大約’’一詞表示在製備聚乙二醇時， 一些分子將比所陳述之分子量更重，一些則更輕，且所陳 述之分子量意指平均分子量。當然有某些程度與聚合物， 如聚（乙二醇）有關的多分散性。最好是使用具有低多分散性 的PEGs。通常，使用具有大約500到大約60,000之分子量的 PEG。本發明之特定PEG分子量範圍是從大約1,000到大約 40,000 〇在其他特定的具體實施例中，PEG分子量是超過大 98715.doc 34- 200529868 約5,000到大約40,000。在另一個特定的具體實施例中，PEG 分子量大約20,000到大約40,000。亦可使用其他的尺寸，視 想要之治療輪廓而定（例如想要之持續釋放的期間，（若有的 話）任何對生物活性的影響，抗原性的程度或缺少，以及聚 乙烯對治療蛋白質的其他已知影響）。例如，聚乙二醇可具 有大約 200、500、1000、1500 ' 2000、2500、3000、3500、 4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、 8500' 9000、9500、10,000、10,500、11，000、11，500' 12,000、 12,500、13,000、13,500、14,000、14,500、15,000、15,500、 16.000 ' 16,500、17,000 ' 17,500、18,000 ' 18,500、19,000 ' 19,500 ' 20,000、25,000 ' 30,000 ' 35,000 > 40,000、45,000、 50.000 ' 55,000、60,000 ' 65,000 ' 70,000、75,000、80,000、 85,000、90,000、95,000或100,000道爾呑的平均分子量。 在另一個具體實施例中，聚（乙二醇）是分支的PEG，有一 個以上的PEG部分附接（參見美國專利第5,932,462號；美國 專利第5,342,940號；美國專利第5,643,575號；美國專利第 5,919,455號；美國專利第6，113,906號；美國專利第 5，183,660 號；Kodera Y·，Bioconjugate Chemistry 5 : 283-288(1994);以及WO 02/09766。在較佳的具體實施例 中，分支之PEG的每個聚（乙二醇）的分子量為大約 5,000-20,000。在特定的具體實施例中，分支之PEG的每個 聚（乙二醇）的分子量為大約20,000。 聚（烯化氧）們，特別是聚（乙二醇）們，經由終端反應基團 與hGH或其激動劑變體結合，其可以或可以不在PEG與蛋白 98715.doc -35- 200529868 質之間留下連接部分（間隔基）。為了形成本發明之hGH共扼 t或其激動劑變體，將聚合物，如聚（稀化氧则為激活形 名詞本身為熟諳此藝者已知的。反應基團，例如是 終端的反應基團，其調解在蛋白質上之化學部分血聚（乙二 醇)之間的鍵結。通常，將終端聚合物經基末端 細^端減基團）之-或兩者，轉變為反應官能基，其容 5午共彳貝的共辆作用。通當脾兮 通吊將该過程稱為，，激活作用，，，並在 ❿ :麦文二將具有反職團的聚(乙二醇)產物稱為"激活的聚 (乙一醇）。在特定的具體會絲也丨士 ^ ^ /、貫例中，將一個終端聚合物羥 末端.基團轉變，或以非·反應基團加帽。在特定的且體實 =例中’將—個終端聚合物經基末端基團轉變，或；；甲基 ==在本文中使用時，，，_，-詞意指在-端以 甲基基團加帽的PEG。在結構上可以

CH3〇、(CH2CH2〇)n-H 來表示mPEG。 將含有《和ε連接基團兩者的聚合物稱為"雙·激活的聚 (婦化氧）"，並稱為”雙功能的”。有時將細和ε終端經基上 合有相同反應基團的平人4 ®自〇祆。物稱為，，同種雙功能的”或”同種 ^激活的"。有時將在《和£終端經基上含有不同反應基團 的聚合物稱為”異種镂Α Λ 雙力月匕的（參見，例如w〇 〇 1/26692)或” 異種雙-激活的”。將冬古 3有早一反應基團的聚合物稱為"單_ 激活的，丨聚烯化氧式” s 取人 虱次早-功能的"。其他實質上低-抗原性的 ϋ是類似"激活的"或，，功能化的"。 98715.doc -36- 200529868 因此，激活的聚合物適合用來調解在蛋白質上之化學部 分，如α _或ε _胺基、羧基或硫醇基團與聚（乙二醇）之間的 鍵結。雙·激活之聚合物可以此方式與兩個蛋白質分子反 應，或在另一個具體實施例中與一個蛋白質分子和一個反 應性小分子反應，經由交聯作用，有效地形成蛋白質聚合 物或蛋白質-小分子共軛物。 在本發明一個較佳的具體實施例中，使用hGH或其激動 劑變體之離胺酸的N-終端α -胺基基團或ε -胺基基團和激 活之PEG，形成二級胺或醯胺鍵結。在本發明另一個較佳 的觀點中，藉著還原性烷化作用，利用適當的還原劑，如 NaCNBH3、NaBH3、吡啶硼烷等等，按照在Cham〇w等人，

Bi〇conjUgate Chem. 5 : 133-140 (1994);美國專利第 4,002,531號；W0 90/05534和美國專利第5,824,784號中的 描述，在hGH或其激動劑變體之N-終端一級0_或ε _胺基義 團與單鏈或支鏈PEG酸之間形成二級胺鍵結。 在較佳的具體實施例中，最好有至少7〇%，較佳的是至 少80%，較佳的是至少81%，較佳的是至少82%，較佳的是 至少83%，較佳的是至少84%，較佳的是至少85%，較佳的 是至少86%，較佳的是至少87%，較佳的是至少88%，較佳 的是至少89%，較佳的是至少9〇%，較佳的是至少9丨％，較 佳的是至少92%，較佳的是至少93%，較佳的是至少94〇/。， 車父佳的疋至少95%，較佳的是至少96%，較佳的是至少 97%，且最好是至少98%的聚（乙二醇）在胺基終端α _胺基基 團上。 98715.doc -37- 200529868 共輛反應’稱為聚乙二醇化反應，在歷史上是在溶液中 進行，利用莫耳過量的聚合物’且不管該聚合物將附接在 蛋白質的何處。然而，這類普通技術，通常已經證實對於 將生物活性之蛋白質與低-抗原性聚合物共輕，同時仍保留 足夠之生物活性是不充分的。一種維持hGH或其激動劑變 體生物活性的方法，實質上是避免那些咖或其激動劑變 體的反應基團在聚合物偶聯過程中與受體結合位置(們)結 合。本發明的其他觀點是提供將聚（乙二醇）與hGH或其激動° 劑k體共軛，維持高水準之保留活性的製程。 可在任何適當的條件下，通常為生物活性物質與激活之 聚（乙二醇）之反應中所採用的條件下，進行經由共價鍵的化 學修改。在相對上較溫和的條件下進行共軛反應，以避免 使hGH或其激動劑變體失活。溫和的條件包括將反應溶液 的pH值維持在3至1〇的範圍内，並將溫度維持在從大約 〇°-37°C的範圍内。在其中在hGH或其激動劑變體中之反應 性胺基酸殘基具有自由胺基基團的案例中，最好是在適當 之緩衝溶液（pH 3至1〇)的非限制性一覽表，包括磷酸鹽、 mes、#檬酸鹽、乙酸鹽、琥酸鹽或HEPES中，在 下進行以上的修改1 -48小時。在以試劑，如PEG醛瞄準N_ 終端胺基基團時，最好維持在pH4-7下。可以hGH或其激動 劑變體之自由胺基基團數目的莫耳含量之大約〇〇1_1〇〇倍 使用激活的聚（乙一醇），最好是大約〇 〇 · 5倍。另一方面， 在hGH或其激動劑變體中之反應性胺基酸殘基具有自由的 羧基基團之處，可在從大約3·5到大約5·5之pH值中進行以 98715.doc -38- 200529868 =改，例如，在碳化二酿亞胺(PH 4_5)的存在下，在 _ C進行利用聚（氧乙稀二胺）的修改以小時。可以應 :〇;激動劑變體之自由缓基基團數目的莫耳含量之大約 • _300倍使用激活的聚（乙二醇）。 八^分開的具體實施例中，在共輛反應中所包含之聚合物 含置的上限，超過大約i : i至可能使激活之聚合物與應 或^激動劑變體反應，但不形成相當大量之高分子量物種 的程度’即在超過大約2〇%的共輛物中，每分子咖或其激 動劑變體含有大約一股以上的聚合物。例如，企圖在本發 明的該項觀點中，可使用高達大約6: 1之比例，形成大量 的想要共輛物’隨後可從任何高分子量的物種中將其分離。 在本發明的其他觀點中，可使用雙功能_激活的pEG衍生 物，產生聚合的hGH或其激動劑變體_PE(}分子，其中多個 hGH或其激動劑變體分子經由pEG交聯。雖然在本文中描述 的反應條件結果可能產生大量未經修改的hGH或其激動劑 艾體，但該未經修改的hGH或其激動劑變體可迅速地再循 %至將來下一批的額外共軛反應内。本發明之製程驚人地 產生極少的，即低於大約3〇%，更佳的是低於大約1〇%之高 分子量物種，且該物種每hGH或其激動劑變體含有丨股以上 的聚合物股。這些反應條件相對於聚合共軛反應常用的那 些’其中激活之聚合物對於標靶，以數·倍莫耳過量存在。 在本發明之其他觀點中，聚合物以每當量hGH或其激動劑 變體從大約0.1到大約50當量的量存在。在本發明的另一項 觀點中’聚合物以每當量hGH或其激動劑變體從大約1到大 98715.doc -39- 200529868 約ίο當量的量存在。 本發明之共軛反應最初提供含有單-和二-PEG-hGH共軛 - 物、未反應之hGH、未反應之聚合物的反應混合物或集合， • 通常還有低於大約20%的高分子量物種。該高分子量物種 包括含有一個以上聚合物股及/或聚合之PEG-hGH或其激 動劑變體物種的共軛物。在已經移除未反應物種和高分子 量物種之後，回收主要含有單-和二-聚合物-hGH或其激動 g 劑變體共軛物的組合物。已知共軛物大部分包括單股聚合 物的事實，故該共軛物實質上是均質的。使用標準FDC-P1 細胞增殖測定（Clark 專人 Journal of Biological Chemistry 271 : 21969_21977，1996)、受體結合測定（美國專利第 5,05 7,417號），或垂體切除之大鼠生長（(：1心等人；〇11服1(^

Biological Chemistry 271 : 21969-21977，1996)，測量到這 些經過修改的hGH或其激動劑變體，具有至少大約〇1%的 聯想到天然或未經修改之hGH或其激動劑變體的活體外生 φ 物活性。然而，在本發明較佳的觀點中，經過修改的hem 或其激動劑變體具有大約25%的活體外生物活性，更佳的 是，經過修改的hGH或其激動劑變體具有大約5〇%的活體外 生物活性，更佳的是，經過修改的hGH或其激動劑變體具 有大約75%的活體外生物活性，而最佳的是，經過修改的 hGH或其激動劑變體具有相等或改良的活體外生物活性。 • 本發明之製私最好兮可包括有限比例的聚合物對hGH或 . 其激動劑變體。因此，已經發現hGH或其激動劑變體共軛 物優先文限於僅含有一股聚合物的物種。此外，聚合物對 98715.doc -40- 200529868 hGH或其激動劑變體反應基團的附接，比使用較高莫耳過 量的聚合物交聯劑時，實質上更不隨便。出現在反應池中 . 未經修改的hGH或其激動劑變體，在已經中止該共軛反應 . 之後，可使用離子交換或尺寸排阻層析法或類似的分離技 術，再循環至未來的反應内。 可藉著用來純化蛋白質的傳統方法，如透析、鹽析、超 過濾、離子父換層析法、忌水性交互作用層析法（H][C)、凝 春膠層析法和電泳，從反應混合物中純化聚（乙二酵）_修改之 hGH或其激動劑變體，即根據本發明之以化學方式修改的 蛋白質。在移除未反應之聚（乙二醇）和；hGH或其激動劑變體 時，離子父換層析法是特別有效的。在本發明更進一步的 具體實施例中，從反應混合物中分離單_和二_聚合物_h(}H 或其激動劑變體物種，以便移除高分子量物種，以及未經 修改之hGH或其激動劑變體。藉著將混合的物種放在含有 從大約0.5-10毫克/毫升hGH或其激動劑變體-聚合物共軛物 φ 的緩衝溶液中，完成分離作用。適當的溶液具有從大約4 到大約10的pH值。該溶液最好含有一或多種緩衝鹽類，選 自 KC1、NaCl、K2HP04、KH2P〇4、Na2HP〇4、NaH2P〇4、 NaHC03、NaB04、CH3C02H和 NaOH。 依據反應緩衝溶液，首先必須使hGH或其激動劑變體聚 合物共輛物溶液經歷緩衝溶液交換/超過濾，以便移除任何 • 未反應的聚合物。例如，可通過低分子量截止（10,000至 . 30,000道爾呑）膜，超過濾PEG-hGH或其激動劑變體共輛物 溶液’移除大多數不想要的物質，如未反應的聚合物、（若 98715.doc -41 - 200529868 存在）界面活性劑或其類似物。 最好是使用離子交換層析介質，將共軛物分級分離成含 有想要物種之集合。這類介質能夠經由電荷差異(其以多少 可預期的方式改變）’選擇性地與PEG_hGH或其激動劑變體 共輛物結合。例如，藉著在蛋白質表面上可利用之帶電荷 基團的數目’判定hGH或其激動劑變體的表面電荷。這些 帶電荷的基團通常作為聚⑽化氧）聚合物可能的附接點 此，咖或其激動劑變體共辆物將具有與其他物種不同的 電荷，而容許選擇性分離。 士本發明之方法，分別使用強極性的陰離子或陽離子交換 '十月曰如四級月女或硫丙基樹月旨。離子交換樹脂是特佳的。 非限制性的—覽表包括市售之陽離子交換樹脂，適合用於 本發明的是SP-hitrap®、SP瓊脂糖Ηρ®和㈣脂糖⑧速流。 亦可使用其他適合的陽離子交換樹脂，例如咏⑽樹脂。 陰離子交換樹脂的非限制性一覽表，包括市售的陰離子交

換樹脂，適合用於本發明的终hitrap⑧、Q缓脂糖HP⑧和Q 瓊月曰糖it流。亦可使用其他適合的陰離子交換相十脂，例如 D E A E樹月旨。 例如，最好將陰離子或陽離子交換樹脂放在管柱中，並 以傳統的方法平衡。使用具有與聚合物共耗之hGH或其激 動劑變體溶液相同之pH值和渗透性的緩衝溶液H緩衝 溶液最好含有一或多個鹽類，選自κα、Nac卜Κ2Ηρ〇4、 κη2ρ〇4、Na2HP〇4、NaH2P〇4、NaHc〇3 NaB〇4 和 (NH4)2C03。然後使含有共輛物之溶液吸附至不保留未反應 98715.doc -42- 200529868

之聚合物和一些高分Jf吾％ & A 卜 于里物種的f柱上。在裝載完成時， 在吕柱上她用S有漸增鹽濃度的洗脫緩衝溶液之梯度流， •洗脫想要的聚烯化氧·共輛之hGH或其激動劑變體的溶離 •份。在陽離子或陰離子交換分離步驟之後，最好將洗脫集 合的溶離份限於均-的聚合物共輛物。然後可從管柱中， 精者傳統的技術，洗回任何未共輛的⑽或其激動劑變體 物種。若需要，可經由額外的離子交換層析法或尺寸排阻 層析法，進—步從彼此中分離單和多聚乙：醇化的咖或 其激動劑變體物種。 亦可使用利用漸增鹽濃度或pH值之多重等度（is〇cratic) 步驟的技術。漸增濃度的多重等度洗脫步驟，結果將是二_ 然後是單-hGH或其激動劑變體-聚合物共輛物的連續洗脫。 洗脫的溫度範圍是在大約4〇c到大約25〇c之間。最好在從 大約4°C到大約22°C的溫度下進行洗脫。例如，可藉著在28〇 毫微米處的UV吸光度，檢測PEG-hGH或其激動劑變體溶離 • 份的洗脫。可經由簡單的時間洗脫輪廓達成溶離份收集。 在將聚（乙二醇）聚合物與hGH或其激動劑變體部分共軛 的製私中，可使用界面活性劑。適當的界面活性劑包括離 子-型製劑，如十二烷基硫酸鈉（SDS)。亦可使用其他的離 子丨生界面活性劑，如十二烧基硫酸鐘、四級銨化合物、牛 磺膽酸、辛酸、癸烷磺酸等等。亦可使用非_離子性的界面 - 活性劑。例如，可使用諸如聚（氧乙烯）脫水山梨糖醇（吐 • 舰）、聚（氧乙烯）醚類（三通）之類的材料。亦參見Neugebauer，

去垢劑在生物學和生物化學上之特性和用途的指南（A 98715.doc -43- 200529868

Guide to the Properties and Uses of Detergents in Biology and Bi〇chemiStry)(1992) Calbiochem Corp。對在本發明之 製耘中所使用之界面活性劑的唯一限制，是在不引起 或其激動劑變體的實質不可逆之變性，且不完全抑制聚合 物共軛作用的條件和濃度下使用它們。該界面活性劑以從 大約0.01-0.5% ;較佳的是從0.05_〇·5% ;而最佳的是從大約 0.075-0.25%的量出現在反應混合物中。亦嘗試界面活性劑 的混合物。 認為界面活性劑在聚合物共軛過程，提供了暫時的、可 逆的保護系統。已經顯示界面活性劑在選擇性地阻止聚合 物共軛上是有效的，同時容許以離胺酸為基礎或以胺基_終 端為基礎之共輛作用進行。 本發明之聚（乙二醇）-修改的hGH或其激動劑變體具有更 持久的藥理學效力，這可能賦與它在活體内延長的半衰期。 本發明其他的具體實施例係關於預防及/或治療其中使 用GH，最好是hGH有利之疾病或病症的方法，包括對需要 其之患者投與在治療上有效之含量的本發明之聚（乙二醇 經過修改的hGH或其激動劑變體，單獨或與其他的治療劑 併用。本發明亦關於使用本發明之聚（乙二醇）_修改的hGH 或其激動劑變體，來製造用以預防及/或治療其中使用gh， 最好是hGH有利之疾病或病症的醫藥品。此外，本發明亦 關於包括本發明之聚（乙二醇）_修改的hGH或其激動劑變體 的西藥組合物，以便預防及/或治療其中使用GH，最好是 hGH有利之疾病或病症。 98715.doc •44- 200529868 -中使用GH有利之疾病或病症，包括但不限於生長激素 缺(GHD)、成人生長激素缺陷⑽岡、特内氏徵候群、 •在早產（SGA)的孩童中的生長失敗、普瑞德-威利徵候群 (:ws)、慢性腎功能不全（CRI)、Ams消耗、衰老、末期腎 衰竭、姨囊性纖維變性、勃起功能障礙、HIV脂肪代謝障礙、 纖維肌痛、骨質疏鬆症、記憶障礙、克隆氏价。心)症、 骨骼發育異常、創傷性腦傷、蜘蛛膜下腔出血、紐甚氏 • (N00麵，s)徵候群、唐氏症、特發性矮小⑽）、末期;病 (ESRD)、極低出生體重（VLBW)、骨髓幹細胞解救、代謝徵 候群、糖皮質激素肌病、在孩童中歸因於糖皮質激素户療 的矮小，以及困擾矮小早老孩童的生長失敗。 。 在本！s明更特定的具體實施例中，使用本發明之聚（乙二 醇修改的hGH或其激動劑變體，預防及/或治療病症^ 病，選自GHD、aGHD、SGA、pws、特内氏徵候群和⑽ 所組成之群。 • 在本發明其他更特定的具體實施例中，使用本發明之聚 (乙二醇）-修改的hGH或其激動劑變體，預防及/或治療病症 或疾病，選自特發性矮小、極低出生體重、創傷性腦傷、 代谢徵候群和紐曼氏徵候群所組成之群。 本發明其㈣具體實施例係關於包括本發明之聚（乙二 醇修改的hGH或其激動劑變體，翠獨或與其他治療_ 用，以及至少一種在藥學上可接受之賦形劑或載劑的醫藥 •組合物。然後可將本發明之聚（乙二醇）_修改的咖或並激 動劑變體調配成藥物，其亦含有在藥學上可接受之稀釋 98715.doc -45- 200529868 劑、製備等張溶液之製劑、pH_調節劑及其類似物，以便將 它們投與患者。 • 依據治療的目的，可將以上的藥物皮下、肌肉内、靜脈 内肺臟、皮内或口服投藥。劑量亦可以待治療之患者的 病症種類和狀況為基礎，正常藉著注射是在01毫克到5毫 克之間，而對成人口服投藥則是在毫克到50毫克之間。 田在本文中使用時，本發明之聚（乙二醇）_修改的hGH或 • 其激動劑變體可與其他的治療劑併用。當在本文中使用 時，”共同-投藥”、”共同-投與”和”併用，，一詞，企圖意指化 合物A和一或多個其他治療劑，且提及並包括下列的： 同時將A和治療劑（們）的這類組合投與需要治療的患 此時將這類組份調配在一起成為單一的劑量形式，在 實質上相同的時間將該組份釋放至患者， _實質上同時將A和治療劑（們）的這類組合投與需要治療 的患者，此時將這類組份彼此分開調配，成為分開的劑量 春=式，其可由患者在實質上相同的時間内攝取，於是在實 質上相同的時間將該組份釋放至患者， -將A和治療劑(們)的這類組合連續投與需要治療的患 者’此時將這類組份彼此分開調配，成為分開㈣量形式， 其可由患者在連續的時間内攝取，在每次投藥之間有明顯 的時間間隔’於是在實質上不同的時間將該組份釋放至患 者，及 ._將八和治療劑(們)的這類組合連續投與需要治療的患 者，此時將這類組份調配在一起成為單—劑量形式，其以 98715.doc •46- 200529868 控制方式釋放士含a +從邊紐份，於是可在相同及/或不同的時間，將 匕二同牯、連續及/或重複地投與患者。 v # A ' I在藥學上可接受之鹽類及/或其衍生形式倂用 之其他治療劑的適當實例，包括但不限於··芳構化酶 (aromatase)抑制劑，如依西美坦0xeniestane)、福麥斯坦 (formestane)、炎讲、， 文 士合美坦（atamestane)、法倔嗤（fadrozole)、 ^ ( etr〇z〇le)、伏氯σ坐（vorozole)和阿那曲嗤 (anastrozole); ή 丄 )目由的脂肪酸調節劑，包括纖維酸（fibric acid) 4亍生物（士非諾貝特（fen〇fibrate)、氯貝丁酉旨（ci〇fibrate)、吉 非貝”（g mfibr〇zil)、苯扎貝特（bezafibrate)和環丙貝特 (P e))和於驗酸衍生物，如阿西莫司（acipimox);胰 島素敏化^ 包括但不限於雙胍類（biguanides)，如甲福明 Cmetfoimin；)、PPar γ胰島素敏化劑和p塞唑丹尼酮類 (thiazolodeni〇nes)，如曲利太宗（tr〇giitaz〇ne)和羅格列酮 (rosiglitazone)，曲利太宗，5_[[4-[3,心二氫 _6_ 羥基-2,5,7,8_ 四甲基·2Η_>苯并哌喃-2-基]甲氧基]苯基]甲基3-2,4-嘧唑 烧一酮 V411 (DIABII，Glaucanin)，外匕格列 S 同（Pioglitazone) (ACTOS，AD 4833, U 72107, U 72107A，U 72107E，ZACTOS) 化學名：2,4〜塞唑烷二酮，5-[[4-[2-(5-乙基-2-吡啶基）乙氧 基]苯基]甲基]-單鹽酸鹽，（a/-);羅格列酮（Avandia，BRL 49653，BRL 49653C)化學名：2,4” 塞唑烷二酮，5-[[4-[2-(甲 基-2-p比咬胺基（pyridinylarnino))乙氧基]苯基]甲基；25藉薩 羅丁（Bexarotene)- 口服（LGD 1069 口服、塔格瑞亭（Targretin) 口服、塔袼瑞亭、塔格瑞泰（Tarsretyn) 口服、塔格瑞辛 -47· 98715.doc 200529868 (Targrexin) 口服）化學名：4-[l-(3,5,5,8,8-五甲基-5,6,7,8-四 氫-2-萘基）乙烯基]苯曱酸：ZD 2079，（ICI D 2079)(化學名： R)-N-[2-4-(羧甲基）3〇苯氧基]乙基]-N-(2-羥基-2-苯乙基）氯 化錄：奈特格列酮（Netoglitazone)(伊沙格列S同（Isaglitazone)， ]^(^ 555，11\\/7 241947)(化學名：5-[6-(2-氟苄氧基）萘-2-基 甲基]嘍唑烷-2,4-二酮）；INS(D-手性（chiro)-肌醇）（化學名： 0-1，2,3,4,5,6-六羥基環己烷），€^ 2344(0«^ 25 93);德利波 坦（Dexlipotam)，化學名：5(R)-(1，2_二硫戊環-3-基）潘塔洛 35 酸（pentaloic 35 acid) ; HQL 975，化學名：3-[4-[2-(5-曱 基-2-苯基崎唑-4-基）乙氧基]苯基]-2(S)-(丙胺基）丙酸；YM 268，化學名：5,5’-亞甲基-雙（1，4-伸苯基）雙亞甲基雙（嘧唑 烷·2,4-二酮）。I PPAR激動劑，在發展之下，包括：瑞格利 札（Reglitazar)(JTT 501，PNU 182716, PNU 716)(化學名··伸 異嘮唑啶-3,5-二酮，i4-[[4-(2-苯基-5-甲基）-1，3-吟唑基]乙 氧苯基-4]甲基-，(4RS)) ; I (RP 297，化學名：10 5-(2,4-二 氧噻唑烷-5-基甲基）-2-甲氧基-N-[4-(三氟甲基）苄基苯甲醯 胺；R 119702 (CI 1037, CS 011)化學名：（/-)-5-[4-(5-曱氧 基-1H-苯并咪唑-2-基甲氧基）苄基]嘧唑啉-2,4-二酮；鹽酸 鹽；15 DRF 2189，化學名：5-[[4-[2-(1-啕哚基）乙氧基]笨 基]甲基]嘧唑烷-2,4-二酮；皮質固醇合成抑制劑，如酮康 σ坐（Ketoconazole)、益康嗤（econazole)或口米康口坐 (miconazole);生長激素，如重組人生長激素（solnatropin) 或索馬特諾（somatonorm)及其衍生物，如人類生長激素融合 蛋白，如長效重組人生長激素（ALBUTROPIN);聚乙二醇 98715.doc -48- 200529868

生長激素，如半胱胺酸-聚乙二醇化之生長激素、ΒΤ 005 (Bolder BioTechnology Inc·);生長激素促分泌素，像是例 如 SM 130686 (Sumitomo)、卡普莫林（capromorelin) (Pfizer)、美卡舍明（mecasermin)(Fujisawa)、舍莫瑞林 (sermorelin)(Salk Institute，Bio-Technology General)、人蛋 氨生長素（somatrem)、生長素介素（somatomedin)(C Llorente ; Pharmacia Corporation)、艾沙瑞林（examorelin)、 塔比瑞林（tabimorelin); CP 464709 (Pfizer)、LY 426410 和 LY 444711 (Lilly);如同在 WO 2002057241 中揭示的 8-(胺基 烷氧基亞胺基）-8H-二苯并[a，e]三唑并[4,5-c]環庚烯、在WO 2002056873中揭示的2-經取代之二苯并[a，e]l，2,3-三唑 [4,5<][7]輪烯-8-酮、如同在美國專利第4,411，890號和公開 案WO 89/071 10、WO 89/0711 1中描述之生長激素釋放肽 GHRP-6 和 GHRP-1、B-HT920、海沙瑞林（hexarelin)，以及 在WO 93/04081中描述的GHRP-2，或生長激素釋放激素 (GHRH，亦稱為GRF)及其類似物，生長素介素包括IGF-1 和IGF-2及其衍生物，如索瑪托康（SomatoKine)-類胰島素生 長因子-1與其結合蛋白質的重組融合、BP-3、ce-2-腎上腺素 能的激動劑，如可樂定（clonidine)、賽拉唤（xylazine)、地 托味定（detomidine)和美托σ米咬（medetomidine)，或5-經色胺 5HTID激動劑，如舒寧催坦（surnitriptan)，或抑制生長激素 釋放抑制因子或其釋放的製劑，如毒扁豆驗（physostigmine) 和 p比斯的明（pyridostigmine)、ThGRF 1-44 (Theratechnologies); L 165166 (Merck & Company);如同在 WO 9858947 中描述的二 98715.doc -49- 200529868 肽衍生物、二肽基肽酶ιν的抑制劑，如在美國專利第 6521644 號、WO 95/15309 和 WO 98/19998 中描述的胺醯基 吡咯啶腈；/3-胺基雜環二肽基肽酶抑制劑，如在美國專利 第20030100563號和WO 2003082817中描述的那些；如同在 美國專利第20030055261號、美國專利第20030040483號、 歐洲專利 18 072、歐洲專利 83 864、WO 89/07110、WO 89/01711、WO 89/10933、WO 88/9780、WO 83/02272、WO 91/18016、WO 92/01711、WO 93/04081、WO 9514666、歐 洲專利0923539、美國專利第5,206,235號、5,283,241號、 5,284,841 號、5,3 10,737 號、5,317,017?虎、5,374,721 號、 5,430，144 號、5,434,261 號、5,438，136 號、5,494,919 號、 5,494,920 號、5,492,916 號、5,536,716 號和 5,578,593 號、 WO 94/13 696、WO 94/193 67、WO 95/03289、WO 95/03290、 WO 95/0963 3、WO 95/11029、WO 95/125 98、WO 95/13069、 WO 95/14666、WO 95/16675、WO 95/16692、WO 95/17422、 WO 95/17423、WO 95/343 1 1和 WO 96/02530 中描述的生長 激素釋放化合物、如同在美國專利第5804578號、美國專利 第5783582號、WO 2004007468中描述的六氫吡啶、吡咯啶 和六氫-1H-吖庚因、醯胺基螺六氫吡啶，如在WO 0104119 中描述的那些、2-胺基-5-嘧啶乙酸化合物，包括2-[(5,6-二 甲基-2-苯并咪唑基）胺基]-4-羥基-6-甲基-5-嘧啶乙酸（2)和 2-[(5,6-二甲基-2-苯并咪唑基）胺基]-4-羥基-6-甲基-5-嘧啶 乙酸乙酯，如同在美國專利第6329383號中描述的、如同在 歐洲專利1 155014中描述的苯并咪唑、與GRF有關的類似肽 98715.doc -50- 200529868 基化合物和美國專利第4,411，890號的肽、促性腺激素釋放 激素的拮抗劑，如在WO 0170228、WO 0170227、WO 0170228、WO 0069433、W00004013、WO 995156、WO 9951595、WO 9951231-4、WO 9941251-2、WO 9921557、 WO 9921553中描述的那些，以及如同在WO 0053602、WO 0053 185、WO 0053181、WO 0053180、WO 0053179、WO 0053178、美國專利第6288078號中描述的6_吖⑼哚化合 物，IGF-1促分泌素；類胰島素生長因子_2 (1(^-2或生長素 介素A)和IGF-2促分泌素；肌抑素（my〇statin)拮抗劑和抑制 纖維母細胞生長因子受體-3 (FGFR-3)酪胺酸激酶的化合 物〇 I曰物質最好亦包括在 ，，口一奶 的非限制性-覽表包括聚（烯化氧）均聚物，&聚（乙二醇） 或聚（丙一醇）、聚（氧乙烯化之多元醇），其共聚物及其嵌段 共聚物，其限制條件為保留㈣段共聚物的水溶性。 >以peg·為基礎之聚合物的另_種選擇，可使用實際上低-〜原f生的材料，如葡聚糖、聚（乙烯t各院酮）、聚（丙稀酿 )聚(乙烯酉予)、以碳水化合物為基礎之聚合物，及其類 :::確實，可以類似轉變聚⑽化氧)所使用的方式，完成 物質之…'終端基團的激活作用，德 表僅：广將是明顯的。熟諸此藝者將了解前述的-覽 的聚合材料。為了丄 有在本文中描述之品質 技藝中了解在# χ 實際上低-抗原性”意指在此項 了解在喷乳動物中為無毒性，且不誘發可察覺之免 98715.doc -51 - 200529868 疫原反應的所有材料 定義 表： g 公克 mg 毫克 ml 或 mL 毫升 RT 室溫 PEG 聚（乙 覽 在本揭示内容中所述所有之公開案、專利和 的完整内容，係以引用的方★极λ 士丄 巧案 。丨用的方式併入本文中，就如同〜 地及個別地將各個公開幸 I 、又 系專利或專利申請案以引用 式併入一般。 旧方 雖然為了更清楚地了解，ρ — 胖已心精者解釋和實例詳細地 述前述的本發明，但熟諳此藝者將可從本發明的教育^ 點，輕易地知曉可進行不違背本發明之精神及範圍的變化 和修改。僅為了解釋之目的， & t、下列的貫例，並非企圖 限制已經在上文中廣泛描述的本發明之範圍。 在：列的實例中，hGH為SEQIDN0:1。當然可以類似 =後、Λ Λ例中舉例的方式，將多肽之hGH或其激動劑變體 家族的其他成員聚乙二醇化。 實例 實例1

分支的 40,000 MW PEG_丁醯醛hGH 98715.doc -52- 200529868 ο

II

mPEG—Cr^C-NH CH〇 h2c h2c ch2 o II mPEG—0—C-

H 、(:-N—(CH2CH20)4CH2CH2CH2gH O 0 本實例證實藉著還原性烷化作用產生實質上均質的N-終 端單聚乙二醇化hGH之製備物的方法。經由還原性胺化作 用，利用在N-終端的一級胺之相對pKa值對在離胺酸殘基之 ε -胺基位置的一級胺之pKa值上的差異，選擇性地將大約

40.000 MW (Shearwater Corp·)之甲氧基-分支之 PEG-丁醯 醛試劑與hGH之N-終端偶聯。以10毫克/毫升將hGH蛋白質 溶解於 25 mM Hepes (Sigma Chemical，St. Louis, MO) pH 7.0 (可任選 25 mM MES (Sigma Chemical，St. Louis，MO) pH 6.0、10 mM 乙酸納（Sigma Chemical, St. Louis，MO) pH 4.5)，並藉著加入M-PEG-ALD，使其與甲氧基-PEG-丁醯 酸，M-PEG-ALD (Shearwater Corp.，Huntsville，AL)反應， 產生2: 1之相對PEG: hGH莫耳比例。藉著加入1M NaCNBH4 母液（Sigma Chemical，St. Louis, MO)，溶解於水中，至10-50 mM之終濃度，來催化反應。在室溫下在暗處進行該反應 18-24小時。藉著加入 1M Tris (Sigma Chemical，St. Louis， MO)約pH 7·6，至50 mM之終Tris濃度，或為了立刻醇化而 以適當的緩衝溶液稀釋，中止該反應。 表1顯示由多-聚乙二醇化物種、單-聚乙二醇化共輛物、 98715.doc -53- 200529868 未-反應PEG ’以及40K分支的PEG -駿和40K分支的PEG-乙 醯醛之純化終產量之尺寸排阻層析法判定的百分比。PEG-丁醯醛結果增加了單-聚乙二醇化之共輛物，降低未-反應 PEG的含量，並與PEG·駿相比車交，增力口了終產量。 表1 40K分支之PEG-ALD-hGH與40K分支之PEG- 丁醯醛-hGH的比較 在反應混合物中的物種： 40KPEG-醛 hGH 40K PEG-丁醯醛-hGH 多-PEG產物 4.02% 5.03% 單-PEG產物 48.70% 61.02% 未-反應的hGH 41.80% 29.20% 純化終產量 30.80% 44.70% 實例2

直鏈 30,000 MW PEG-丁醯醛 hGH 使用關於實例1描述的程序，將甲氧基-直線30,000 MW PEG-丁醯醛試劑與hGH之N-終端偶聯。 實例3

直鏈 20,000 MW PEG-丁醯醛 hGH 使用關於實例1描述的程序，將甲氧基-直線20,000 MW PEG-丁醯醛試劑與hGH之N-終端偶聯。 實例4 聚乙二醇化hGH的純化作用 使用單一離子層析步驟，從反應混合物中純化聚乙二醇 化之hGH物種至95% (SEC分析）。 98715.doc -54- 200529868 陰離子交換層析法 使用單一陰離子交換層析步驟，從反應混合物中純化 PEG hGH物種至95% (SEC分析）。使用陰離子交換層析法， 從未經修改之hGH和多-聚乙二醇化之hGH物種中純化單· 聚乙二醇化之hGH。按照上述，在以25 mM HEPES，pH 7.3 (緩衝溶液A)平衡之Q-瓊脂糖Hitrap管柱（1或5毫 升）(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)或 Q-複脂 糖速流管柱（26/20，70毫升床體積）(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)上純化代表性的20K丁醯駿hGH反 應混合物（5-100毫克蛋白質）。以緩衝溶液A將反應混合物 稀釋5-10X’並乙2.5毫升/分鐘之流速裝入管柱中。以8倍管 柱體積的緩衝溶液A沖洗該管柱。隨後，以80-100倍管柱體 積的緩衝溶液A和(MOO mM之直線NaCl梯度，從管柱中洗 脫出各種hGH物種。藉著在280毫微米（A28〇)處的吸光度監 視洗脫物，並收集5毫升的溶離份。按照聚乙二醇化的程度 集合溶離份，例如單、二、三等等（按照在實例15中的評估）。 然後在 Centriprep YM10 濃縮器（Amicon，Technology

Corporation，Northborough，ΜΑ)上將集合濃縮至 〇·5_5 毫克/ 毫升。藉著八28〇判定集合的蛋白質濃度，使用0.78之消光係 數。 陽離子交換層析法 在以10 mM乙酸鈉pH 4.0 (緩衝溶液B)平衡之SP境脂糖 高效率管柱（Pharmacia XK 26/20，70毫升床體積）上，進行 陽離子交換層析法。以緩衝溶液B稀釋該反應混合物丨〇 X， 98715.doc -55- 200529868 並以5毫升/分鐘之流速裝入管柱中。接下來以5倍管桎體積 之緩衝溶液B沖洗管柱，接著是5倍管柱體積的12%緩衝溶 液C (10 mM乙酸鹽pH 4.5，1 M NaCl)。隨後，以20倍管柱 體積之12至27%緩衝溶液C的直線梯度，從管柱中洗脫出 PEG-hGH物種。藉著在280毫微米處監視洗脫物，並收集1〇 毫升的溶離份。按照聚乙二醇化的程度集合溶離份，（單、 二、三等等），交換至1〇 mM乙酸鹽pH 4.5緩衝溶液中，並 在適合Amicon YM10膜的攪拌細胞中，濃縮至1-5毫克/毫 升。藉著A280毫微米判定集合的蛋白質濃度，使用0.78之 消光係數。 實例5 生化特徵 藉著非-還原SDS-PAGE、非-變性尺寸排阻層析法和肽作 圖，定出經過純化之聚乙二醇化hGH集合的特徵。 尺寸排阻高效率液相層析法（SEC-HPLC)

非·變性SEC-HELP 使用非·變性SEC-HPLC，評估各種附接化學、尺寸、交 聯劑和幾何學之甲氧基-PEG與hGH的反應、陰離子交換純 化集合，以及經過純化之終產物。使用管柱Superdex 200 7.8 毫米 X 30公分（Amersham Bioscience，Piscataway，NJ)，以 〇·5毫升/分鐘之流速，利用20 mM磷酸鹽pH 7.2，150 mM NaCl (或可選擇 Tosohaas G4000PWXL Amersham Bioscience，Piseataway，NJ)，進行分析非-變性 SEC-HPLC。 聚乙二醇化作用大大地增加了蛋白質的流體動力學體積， 98715.doc -56- 200529868 結果轉變了較早的保留時間。在PEG醛hGH反應混合物連同 未經修改之hGH中觀察到新物種。在Q-瓊脂糖層析上分離 這些聚乙二醇化和未-聚乙二醇化的物種，且隨後顯示所得 的經過純化之單PEG-醛hGH物種，在非-變性SEC上為單一 高峰的洗脫物（>95%純度）。Q-瓊脂糖層析步驟有效地從單-聚乙二醇化之hGH中，移除了自由的PEG、hGH和多聚乙二 醇化hGH物種。

變性 SEC-HPLC 使用變性SEC-HPLC評估丁醯醛聚乙二醇與hGH的反 應、陰離子交換純化作用和經過純化之終產物。使用 Tosohaas 3000SWXL 管柱 7.8 毫米 X 30 公分（Tosohaas Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)，以 0.8 毫升/分鐘之流 速，利用100 mM磷酸鹽pH 6.8, 0.1% SDS，進行分析變性 SEC-HPLC。聚乙二醇化作用大大地增力α 了蛋白質的流體動 力學體積，結果轉變了較早的保留時間。在Q-瓊脂糖層析 上分離聚乙二醇化和未-聚乙二醇化的物種。 SDS PAGE/PVDF轉移 使用SDS-PAGE評估PEG丁醯醛與hGH的反應，以及經過 純化的終產物。在還原和非-還原條件下，在1毫米厚的 10-20% Tris麥黃酮凝膠（Invitrogen，Carlsbad，CA)上，進行 SDS-PAGE，並使用Novex膠態考馬斯藍™ G-250染色套組 (In vitro gen，Carlsbad，CA)染色。為了後續的N-終端序列確 認，將墨點沾染在PVDF膜上。

分析陰離子交換HPLC 98715.doc -57- 200529868 使用分析陰離子交換HPLC，評估PEG 丁醯醛/hGH反應混 合物、陰離子交換純化溶離份和經過純化之終產物。使用

Tosohaas Q5PW或DEAE-PW陰離子交換管柱，7.5毫米x75 毫米（Tosohaas Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)，進行分 析陰離子交換HPLC，以1毫升/分鐘之流速，使用5〇 mM Tris pH 8.6。以5-200 mM NaCl之直線梯度洗脫該試樣。 N-終端序列和肽作圖 使用自動化的Edman降解化學，判定NH2-終端的蛋白質 序列。使用 Applied Biosystems 494型 Procise定序器（Perkin Elmer，Wellesley，ΜΑ)進行降解作用。藉著rp-HPLC分析， 使用適合Perkin Elmer/Browmlee 2.1毫米直徑之PTH-C18管 柱的Applied Biosystems 140C型PTH分析器，以連線方式確 認個別的PTH-AA衍生物。 以1毫克/毫升之濃度進行胰蛋白酶消化，每次消化通常 使用50微克的材料。加入胰蛋白酶，使得胰蛋白酶對 PEG-hGH的比例為1 : 30 (重量/重量）。Tris緩衝溶液以30 mM，pH 7.5存在。在室溫下培養試樣16士0.5小時。藉著每 毫升消化溶液加入50微升IN HC1中止該反應。在將試樣放 置在自動進樣器中之前，先以6.25%乙腈稀釋試樣，至0.25 毫克/毫升之終濃度。首先加入乙腈（至19.8%乙腈），溫和地 混合，然後加入水至終體積（原始體積的四倍）。可移除額外 的消化溶液，並在-20°C下儲存長達1週。 使用Waters Alliance 2695 HPLC系統進行分析，但其他的 系統應該產生類似的結果。所使用的管柱為Astec C-4聚合 98715.doc -58- 200529868 25公分x4.6毫米管柱，具有5微米之顆粒。在周圍溫度下進 行實驗，通常每個試樣裝載50微克蛋白質。緩衝溶液A為在 水中之0.1 %三氟乙酸；緩衝溶液B為在乙腈中之0.085%三 氟乙酸。梯度如下： 時間 A% B% G% D% 流速 曲線 0.00 0.0 0.0 100. 0 0.0 1.000 1 90.00 0.0 0.0 55.0 45.0 1.000 6 90.10 0·0 0.0 0.0 100.0 1.000 6 91.00 0.0 0.0 0.0 100.0 1.000 6 91.10 0.0 0.0 100.0 0.0 1.000 6 95.00 0.0 0.0 100.0 0.0 1.000 6 使用熱套管將管柱加熱至40°C。使用Waters 996 PDA偵測 器檢測高峰，收集在210到300毫微米處的數據。至於試樣 分析，使用在214毫微米處的萃取層析譜。 對hGH、4ΘΚ分支的PEG-醛和40K分支的丁醯醛進行胰蛋 白酶作圖（圖1)。將N-終端胰蛋白酶片段稱為T-1。在表2中 出示與未聚乙二醇化之hGH相比較，T_ 1出現的百分比。該 數據暗示使用PEG-醛，有90%的PEG修改是在Ν-終端，剩 下的似乎連接數個可能的離胺酸之一，與使用PEG-丁醯醛 的相比較，其有超過98%的在N_終端。 表2 Τ-l出現％ 與未聚乙二醇化之hGH 相比較，丁-1%出現％ hGH 28.0% PEG-醛/hGH 2.6% 9.2% PEG-丁醯醛/hGH 0.3% 1.2% 實例6 藥物動力學研究 98715.doc -59- 200529868 大鼠增重 預先針對生長速率，篩選在Taconic實驗室切除垂體的雌 性Sprague Dawley大鼠7至11天的期間。將大鼠分成8組。第 1組包括每天或第〇和第6天得到皮下劑量之媒劑的大鼠。第 2組每天得到皮下劑量的GH (30微克/大鼠/劑量）。第3組在 第〇和第6天得到皮下劑量的gh (180微克/大鼠/劑量）。第4 組在第〇,6天得到皮下劑量的4〇κ分支之PEG- 丁醯酸-hGH (180微克/大鼠/劑量）。藉著在研究期間至少每隔一天枰 重’監視垂體切除大鼠的體重增加。圖3&4。 大鼠脛股長度 在第11天時犧牲在11天增重研究中的動物，移出左邊的 脛股，進行X-光攝影並使用測徑器測量骨頭的長度。 IGF-1研究 使用得自6天增重研究的動物。在研究期間的各種時間採 取血液試樣，並藉著ELISA判定血清IGF-1含量。 企清生化研究 使用在11天增重研究中的動物，在第7天按照在表3中出 示的，在第0和6天1.8毫克/公斤的累積投藥之後，評估血清 生化值。 表3 測定 媒劑 hGH PEG-hGH (11天以300微克/(第〇和6天1.8毫克/ 公斤/天） 公斤） ALB (克/分升） 4_07 士 0_04 4.06±0.05 4.18±0.03*t ALP (單位/公升） 311土 15 309土16 280士14 98715.doc -60- 200529868

ALT (單位/公升） AST (單位/公升） BUN (毫克/分升） Ca2+ (毫克/分升） Choi (毫克/分升） CRE (毫克/分升） 葡萄糖 (毫克/分升） Phos (毫克/分升） TP (克/分升） TBA (微莫耳/公升） SDH (單位/公升） 三酸甘油酯 (毫克/分升） LDH (單位/公升） Na+ (宅莫耳/公升） K+ (毫莫耳/公升） cr (毫莫耳/公升） 53.6土2·4 149 + 7 37·4±1·6 10·9±0·1 85.1±2.8 0·62±0·02 73.4±4·7 8·26±0·28 6·36±0·10 10.0±0·5 11·9±1·0 57·4±4·0 786±72 147 土 0·5 5·94±0·09 103 + 0.5 51.1 士 2.2 131±4 26·7±1·5* 11.5±0.1* 76·9±3·6* 0·60±0·01 79·6±4.7 9.59±0.16* 6·48±0·10 7·6±0·4* 9·7±1·4 47.8±5.7 762±94 146 + 0.8 6·31±0·16* 102 + 0.5 51·3 土 2·6 137+11 27·9±0·6* 11.0 + 0.11* 115.3±2.8*卞 0·59±0·01 67.1 + 8.9 8-4210.231^ 6·39±0·06 11.0±0.4f 10_6±0·7 45·7±3·9* 914±189 145±0·6* 6.71±0.17*t 102 + 0.6 *Ρ<0·10對媒劑，tp<〇 〇5 對 hGH。 ALB ’白蛋白；alp，鹼性磷酸酶；ALT，丙胺酸轉氨酶； AST ’天冬胺酸轉胺酶；bun，血中尿素氮；Ca2+，鈣； Choi ’膽固醇；CRE，肌酸酐；Ph〇s，磷酸鹽；TP，總蛋 98715.doc -61 - 200529868 白質；ΤΒΑ，總膽汁酸；SDH，山梨醇脫氫酶；LDH，乳 酸脫氫酶；Na+，鈉；K+，鉀；C1·，氣。 在第11天時，在PHA-794428-處理之動物中，以與媒劑組 相同的程度，血中尿素氮濃度明顯地增加（ρ<〇.1〇)。這表示 由於在促進生長期間新蛋白質合成的結果，而增加氮的利 用。 藥物動力學研究 在正常、裝有套管的Sprague-Dawley雄性大鼠中進行藥 物動力學的研究。每組使用6隻大鼠，以100微克/公斤/大鼠 GH或PEG-GH的單一皮下團塊進行注射。在1至5天内適當 地採取血液試樣，以便評估相關的PK參數。在每次採樣時， 使用免疫-測定監視GH和PEG-GH血液含量。 hGH免疫測定 使用hGH AutoDELFIA套組榮光免疫測定（PerkinElmer)，判 定在老鼠和食蟹猴（cynomolgus monkey)血漿中之hGH和聚 乙二醇化hGH的蛋白質濃度水準。藉著免疫測定套組 (Diagnostic System Laboratories)監視大鼠和人類 IGF-1 的 含量。 實例1之hGH-PEG共輛物在非-人類的靈長動物中之未-區 別的藥物動力學特性 以0.18毫克/公斤靜脈内（iv)或皮下（sc)團塊注射，將實例 1之hGH-PEG共軛物投與食蟹猴（表4)。使用n=3動物的平均 數據，判定PK參數。使用AutoDELFIA套組螢光測定 (PerkinElmer)，以及為PEG-GH共軛物預先-判定的標準曲 98715.doc -62- 200529868 線，測量血漿濃度。 表4 劑量(毫克/公斤） 靜脈内0.18/皮下0.18 CL，靜脈内(毫升/小時/公斤） 0.8 Vss(毫升/公斤） 28.0 T%，靜脈内(小時） 25.0 iy2，皮下(小時） 61.2 SCAUC(微克/毫升*小時） 195 SC生物利用性(％) 84 Tmax，皮下(小時） 32 【圖式簡單說明】 圖1為hGH和40K分支之丁醯醛hGH或40K分支之醛hGH 的反應之胰蛋白酶作圖分析的HPLC追蹤。上圖為40K分支 之丁醛hGH的胰蛋白酶圖。中圖為40K分支之醛hGH的胰蛋 白酶圖。下圖為未聚乙二醇化之hGH的胰蛋白酶圖。T1為 N-終端的胰蛋白酶片段。 圖2顯示人類生長激素的胺基酸序列（SEQ ID NO: 1)。 圖3顯示在大鼠增重測定中，40K分支之丁醛hGH的效 力。從Harlan Labs購買4-5週（100-125克）之垂體切除的雌性 Sprague-Dawley大鼠。當進入動物設施時，將動物維持在 80°F的恆定溫度下，並每天秤重4-10天，以便建立基礎生 長速率。在第0天開始，在對照組中的大鼠（約100克）接受每 天一次皮下注射大約〇·3毫克/公斤hGH (實心圓形）或PBS (空心圓形），連續11天。40K分支之丁醛hGH試驗組（實心正 方形）在第0天和第6天，接受1.8毫克單一劑量的 卩11八-794428 〇每組有8-10之大鼠。將平均生長土8£以作圖。 圖4顯示40K分支之丁醛hGH在大鼠中的劑量-反應性生 98715.doc -63- 200529868 長促進影響。以類似在圖3中描述之方式進行該效力研究， 除了投與改變的單一劑量40K分支之丁醛hGH (僅在第0 天），並執行研究6天。對照組接受每天一次注射〇·3毫克/ 公斤hGH (實心圓形）或PBS媒劑（空心圓形），連續6天。40Κ 分支之丁酸hGH的劑量為1.8毫克/公斤（實心正方形）、〇·6 毫克/公斤（空心正方形）、〇·2毫克/公斤（實心三角形）或0·067 毫克/公斤（空心三角形）。每組有8隻動物。 圖5顯示脛骨反映40Κ分支之丁醛hGH的生長。按照在圖3 中的描述處理垂體切除的大鼠。在第11天時，犧牲動物， 移出左脛骨，並進行X-光攝影，使用測徑器測量骨頭長度。 將平均長度士SEM作圖。星號代表與對照組的明顯差異 (ρ<0·05)。 圖6顯示6天效力研究的血漿IGF-i含量。按照圖4的描述 處理動物。在各種時間採取血液試樣，並藉著ELISA判定 血清IGF-1含量。將平均值土 SEM作圖。

98715.doc 64- 200529868 序列一覽表 <110> Pharmacia Corporation Finn, Rory <120> Ν·端單聚乙二醇化之人類生長較雜物，彼等之製法及其使用方法 <130> 32152Α <140>094103308 <141>2005-02-03 <150> 10/771895 <151> 2004-02-04 <160> 1

<170> Patentln version 3.2 <210> 1 <211> 191 ' <212>蛋白質 <213>人類 <400> 1

Phe Pro Thr lie Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg 1 5 10 15

Ala His Arg Leu His Gin Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gin Glu Phe Glu 20 25 30

Glu Ala· Tyr lie Pro Lys Glu Gin Lys Tyr Ser Phe Leu Gin Asn Pro 35 40 45

Gin Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser lie Pro Thr Pro Ser Asn Arg 50 55 60

Glu Glu Thr Gin Gin Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg lie Ser Leu 65 70 75 80

Leu Leu lie Gin Ser Trp Leu Glu Pro Val Gin Ser Leu Arg Ser Val 85 90 95

Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp 100 105 110

Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly lie Gin Thr Leu Met Gly Arg Leu 115 120 125 98715.doc 200529868

Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gin lie Phe Lys Gin Thr Tyr Ser 130 135 140

Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr 145 150 155 160

Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe 165 170 175

Leu Arg lie Val Gin Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 180 185 190

2- 98715.doc

Claims (1)

1. 200529868 十、申請專利範圍： 1. 一種預防及/或治療其中使用生長激素是有利的疾病或病 . 症之方法，包括對需要其之患者投與在治療上有效之含 • 量的聚（乙二醇）·修改之hGH，其具有式！或^之結構： mPEG—0ϋ - NH CH,

   mPEG-Ο—C- h2c CH, (CH2CH20)n(CH2)mCH2-NH-R 式I 或 mPEG-0(CH2CH20)n(CH2)mCHrNH-R 式II 其中 n為在1到l〇之間的整數； m為在1到10之間的整數； R為人類生長激素或甲硫胺醯基生長激素， 單獨或與其他治療劑倂用，其中使用生長激素有利的 該疾病或病症，係選自勃起功能障礙、HIV脂肪代謝障 礙、纖維肌痛、骨質疏鬆症、記憶障礙、抑鬱、克隆氏 症、骨路發育異常、創傷性腦傷、蜘蛛膜下腔出血、紐 98715.doc 200529868 曼氏徵候群、唐氏症、特 rESRn,, 竹i〖生矮小（ISS)、末期腎病 、域出生體重（VLBW)、骨鑛幹細胞解救、代謝 二:、手、糖皮質激素肌病、在孩童中歸因於糖皮質激素 治療的矮小，以及困擾矮小 ” 七被 支攻J干老孩里的生長失敗所組成 之鮮。 2.=請求項i之方法’其中該使用仙有利之疾病或病症係選

   、特务性矮小、極低出生體重、創傷性腦傷、代謝徵候 群和紐曼氏徵候群所組成之群。 3·如請求項1或2之方法，其中n等於々且㈤等於3。 4·如請求項3之方法，其中該聚（乙二醇）_修改之咖具有式 I之結構，其中η等於4且1!1等於3。 5.如請求項丄之方法，其中該人類生長激素包括seqid NO : 1之胺基酸序列。 6·如請求項5之方法，其中超過9〇%的該聚（乙二醇）與seq ID NO :丨之胺基酸序列的胺基_終端苯丙胺酸共軛。 7·如請求項6之方法，其中超過95%的該聚（乙二醇）與SEQ ID NCn 1之胺基酸序列的胺基-終端苯丙胺酸共軛。 8·如請求項！之方法，其中每個mPEG具有大約2() kDa之分 子量。 9· 一種包括式I或II之人類生長激素-peg共軛物，連同其他 治療劑，以及至少一種在藥學上可接受之載劑的組合物： 98715.doc 200529868 ο II mPEG—Ο—C~NH CH〇 h2c h2c I CH2 JCU o II mPEG^O~C- H -N ’ 、C一N—(CH2CH20)n(CH2)mCH2_NH-R H i! 式i 或

   mPEG-0(CH2CH20)n(CH2)mCH2-NH-R 式II 其中 n為在1到10之間的整數； m為在1到10之間的整數； R為人類生長激素或甲硫胺醯基生長激素。 10.如請求項9之組合物，其中該聚（乙二醇）-修改之hGH具有 式I之結構，其中η等於4且m等於3。 98715.doc