CN104211816A - 一种tat-pap融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

一种TAT-PAP融合蛋白，由人类Ⅰ型免疫缺陷病毒HIV-Ⅰ的转录反式激活因子TAT的蛋白转导域PTD和前列腺酸性磷酸酶PAP形成。其制备方法为：选取两端分别含有Nco I和Xho I酶切位点序列的pTAT-HA表达载体；合成pUC57-PAP载体；将pTAT-HA表达载体和pUC57-PAP载体进行双酶切，分别回收；获得pTAT-PAP重组表达质粒载体；将其转化大肠杆菌DE3感受态细胞；诱导融合蛋白表达即得。本发明不仅保留了TAT原有的穿透力，且对外源蛋白PAP的活性几乎没有影响，使TAT-PAP融合蛋白，在大分子蛋白质药物对于糖尿病神经病理性痛的临床应用中具有广阔的前景。

Description

一种TAT-PAP融合蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于蛋白转导技术领域，具体涉及一种TAT-PAP融合蛋白，本发明还涉及该TAT-PAP融合蛋白的制备方法和应用。

背景技术

糖尿病神经病理性痛是糖尿病最严重的并发症之一，是由慢性糖尿病状态下外周感觉神经广泛变性和炎性脱髓鞘所引起，主要表现为双侧下肢远侧端产生自发痛(spontaneous pain)，异常疼痛(allodynia)和痛觉过敏(hyperalgesia)，使肢体功能异常，因而对患者身心造成严重危害。目前临床上对于糖尿病神经病理性痛的治疗，除了针对病因严格控制血糖，改善微循环外，一些经典的镇痛药物，如吗啡、非甾体类抗炎药等，对糖尿病性痛的缓解疗效甚微；有证据显示三环类抗抑郁药和抗惊厥药，如阿米替林、加巴喷丁等，对糖尿病神经病理性痛有一定的镇痛作用，但其副作用如嗜睡、眩晕、低血压、心律失常，幻觉等，严重制约了药物的临床应用。因此如何更有效的治疗糖尿病神经病理性痛成为目前临床亟待解决的问题，而阐明糖尿病性痛的机制和研发新型镇痛药物则意义重大。

前列腺酸性磷酸酶(prostatic acid phosphatase，PAP)是一种非特异性外核苷酸酶，早期曾被称为氟化物耐受的酸性磷酸酶(fluoride-resistant acidphosphatase，FRAP)或硫胺素单磷酸酶(thiamine monophosphatase，TMPase)。PAP在体内有两种存在形式，分泌型PAP(S-PAP)和跨膜型PAP(TM-PAP)。S-PAP由前列腺上皮细胞合成并分泌，正常状态下，在血中含量极低，只有疾病状态(如前列腺癌)时，才大量进入血液。长期以来，S-PAP一直被当作前列腺癌的肿瘤标记物用于临床诊断。而TM-PAP则主要表达于非前列腺组织，如神经组织、肝脏等的细胞膜上。在神经系统中，TM-PAP主要表达于脊髓背角(spinal dorsal horn，SDH)II层内的初级传入终末和背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)的小型神经元。无论哪种PAP，在结构上都包含一个信号肽和酸性磷酸酶结构域，只是TM-PAP在C端多了一个跨膜结构域。PAP是通过产生腺苷而发挥镇痛作用的。Zylka小组的研究发现，敲除PAP基因的小鼠，由慢性炎性痛和神经病理性痛所诱导的热痛敏和机械痛敏都明显增强，提示PAP可能在疼痛过程中起到了一定的作用。疼痛-功能学相互关联的研究中发现，鞘内注射PAP蛋白可使野生型和神经损伤所致的神经病理性痛模型小鼠出现较强的镇痛和抗痛觉过敏作用；重要的是PAP的镇痛效果与吗啡相比，作用时间更持久，作用效果更明显，可达吗啡的8倍，且未观察到成瘾及耐受等不良反应。进一步的实验证实了PAP是通过将胞外的单磷酸腺苷(AMP)去磷酸化生成腺苷，后者活化脊髓背角的腺苷受体而发挥镇痛作用的。Sowa等研究表明PAP的镇痛效果具有pH依赖性，在pH为5.6时，PAP的酶活性最高，其镇痛效果最佳。综上所述，PAP是一种极具开发潜力的镇痛药物。然而，外源性的PAP蛋白难以穿过血脊屏障，使其进一步的研究和临床应用受到了极大的限制。

蛋白转导技术是近些年来运用比较广泛的一项技术，可以使分子量超过100kD的蛋白质或其他大分子物质穿过细胞膜，甚至穿过血脑屏障和血脊屏障。蛋白转导技术在神经科学的研究中十分重要，因为中枢神经系统内的细胞及细胞间生理反应的主要调节物质为多肽及蛋白质，但由于肽类或蛋白类大分子药物难以通过血脑屏障和血脊屏障，从而影响了此类药物的研究与发展。研究已经证实一种来源于人类Ⅰ型免疫缺陷病毒(HIV-I)的转录反式激活因子(trans-activator of transcription,TAT)的蛋白转导域(proteintransduction domain,PTD)，能够将分子量在15～120kD的不同生物大分子(如核酸、多肽、蛋白质等)高效、快速、安全地导入细胞，且导入后仍具有生物活性，并对宿主细胞几乎没有毒性。TAT蛋白转导域的发现为蛋白质治疗带来了新的曙光，显示出巨大的应用价值。目前，TAT蛋白转导技术已经成功将BDNF、NEP1-40、GDNF、Bcl-2、JIP等功能蛋白转导进入脑组织和神经元。TAT蛋白结构域修饰的蛋白质药物目前已经用于二期临床的试验。克里姆比尔神经医学中心的M.Tymianski博士将TAT-NR2B9C(C-terminal 9amino acids of N-methyl-d-aspartate receptors-2B)用于因脑动脉瘤而引发轻微中风的患者，结果显示90％以上的患者不会引起明显的神经性伤残。92位患者接受TAT-NR2B9C治疗，93位接受安慰剂治疗，没有发现TAT-NR2B9C引起的严重不良反应事件，表明TAT介导的蛋白质药物是安全的。这是人类首次将TAT修饰的蛋白药物用于临床研究，表明TAT作为介导蛋白质药物在临床的应用成为可能。

发明内容

本发明的目的是提供一种TAT-PAP融合蛋白，能穿透血脊屏障，并用于治疗糖尿病神经病理性痛。

本发明的另一目的是提供一种TAT-PAP融合蛋白的制备方法。

本发明的第三个目的是提供上述TAT-PAP融合蛋白的应用。

本发明所采用的技术方案是，一种TAT-PAP融合蛋白，该融合蛋白是由人类Ⅰ型免疫缺陷病毒HIV-Ⅰ的转录反式激活因子TAT的蛋白转导域PTD和前列腺酸性磷酸酶PAP形成的融合蛋白TAT-PAP。

本发明的特点还在于，

该融合蛋白具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

本发明所采用的第二个技术方案是，TAT-PAP融合蛋白的制备方法，具体步骤如下：

步骤1，选取包含蛋白转导域PTD的转录反式激活因子TAT，且其两端分别含有Nco I和Xho I酶切位点序列的pTAT-HA表达载体；pTAT-HA表达载体中PTD的cDNA序列为SEQ ID NO:2所示的序列；

步骤2，从Genebank中获取前列腺酸性磷酸酶PAP的cDNA序列，经原核表达优化PAP基因序列，PAP基因序列为SEQ ID NO:3所示的序列；

步骤3，将步骤2经原核表达优化后的PAP基因序列合成为PAP基因片段，序列两端分别含有Nco I和Xho I酶切位点的序列，并装载到pUC57载体中，即为pUC57-PAP载体；

步骤4，将pTAT-HA表达载体和pUC57-PAP载体均用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，酶切条件为：37℃反应1～16h，65℃灭活20min，分别回收载体pTAT和目的基因片段PAP；

步骤5，用T4连接酶连接酶切后的载体pTAT和目的基因片段PAP，反应条件为：室温，10min，筛选阳性单克隆获得pTAT-PAP重组质粒；

步骤6，将pTAT-PAP重组质粒转化大肠杆菌DE3感受态细胞；

步骤7，诱导融合蛋白表达，即得到TAT-PAP融合蛋白。

本发明所采用的第三个技术方案是，上述TAT-PAP融合蛋白在制备治疗糖尿病神经病理性痛药物中的应用。

本发明的有益效果是，

1.本发明TAT-PAP融合蛋白，将来源于人类Ⅰ型免疫缺陷病毒HIV-1的TAT的PTD与PAP融合，构建pTAT-PAP重组表达质粒载体，经表达、纯化获得具有生物学活性的TAT-PAP融合蛋白，且具有低成本，高活性的优点。

2.本发明TAT-PAP融合蛋白具有TAT可进行蛋白传送的特点，突破了蛋白质所携带的生物信息通常只能经由细胞膜受体和信号转导系统传递到细胞内的局限，有效解决了大分子蛋白质不能主动穿透血脊屏障的问题。本发明将TAT-PTD基因与外源蛋白PAP基因连接，表达融合蛋白TAT-PAP，不仅保留了TAT原有的穿透力，且对外源蛋白PAP的活性几乎没有影响，使TAT-PAP融合蛋白，在大分子蛋白质药物对于糖尿病神经病理性痛的临床应用中具有广阔的前景。

附图说明

图1是SDS-PAGE分析的TAT-PAP融合蛋白表达和纯化图；

图2是TAT-PAP融合蛋白和标准品的pH值与酶活性的关系曲线；

图3是TAT-PAP融合蛋白和标准品的浓度与酶活性的关系曲线；

图4是TAT-PAP融合蛋白在脊髓组织表达的图；

图5是腹腔注射TAT-PAP融合蛋白后糖尿病神经病理性痛模型大鼠机械痛行为的变化；

图6是腹腔注射TAT-PAP融合蛋白后糖尿病神经病理性痛模型大鼠热痛行为的变化。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

本发明TAT-PAP融合蛋白，该融合蛋白是由人类Ⅰ型免疫缺陷病毒HIV-Ⅰ的转录反式激活因子TAT的蛋白转导域PTD和前列腺酸性磷酸酶PAP形成的融合蛋白TAT-PAP。

该融合蛋白具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

本发明TAT-PAP融合蛋白，将来源于人类Ⅰ型免疫缺陷病毒HIV-1的TAT的PTD与PAP融合，构建pTAT-PAP重组表达质粒载体，经表达、纯化获得具有生物学活性的TAT-PAP融合蛋白，且具有低成本，高活性的优点。

本发明TAT-PAP融合蛋白具有TAT可进行蛋白传送的特点，突破了蛋白质所携带的生物信息通常只能经由细胞膜受体和信号转导系统传递到细胞内的局限，有效解决了大分子蛋白质不能主动穿透血脊屏障的问题。本发明将TAT-PTD基因与外源蛋白PAP基因连接，表达融合蛋白TAT-PAP，不仅保留了TAT原有的穿透力，且对外源蛋白PAP的活性几乎没有影响，使TAT-PAP融合蛋白，在大分子蛋白质药物对于糖尿病神经病理性痛的临床应用中具有广阔的前景。

上述TAT-PAP融合蛋白的制备方法，具体步骤如下：

步骤1，选取包含蛋白转导域PTD的转录反式激活因子TAT，且其两端分别含有Nco I和Xho I酶切位点序列的pTAT-HA表达载体；pTAT-HA表达载体中PTD的cDNA序列为SEQ ID NO:2所示的序列；

步骤2，从Genebank中获取前列腺酸性磷酸酶PAP的cDNA序列，经原核表达优化PAP基因序列，PAP基因序列为SEQ ID NO:3所示的序列；

步骤3，将步骤2经原核表达优化后的PAP基因序列合成为PAP基因片段，序列两端分别含有Nco I和Xho I酶切位点的序列，并装载到pUC57载体中，即为pUC57-PAP载体；

步骤4，将pTAT-HA表达载体和pUC57-PAP载体均用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，酶切条件为：37℃反应1～16h，65℃灭活20min，分别回收载体pTAT和目的基因片段PAP；

步骤5，用T4连接酶连接酶切后的载体pTAT和目的基因片段PAP，反应条件为：室温，10min，筛选阳性单克隆获得pTAT-PAP重组质粒；

步骤6，将pTAT-PAP重组质粒转化大肠杆菌DE3感受态细胞；

将20μl的pTAT-PAP重组质粒加入到100μl的大肠杆菌DE3感受态细胞中，冰浴5min后均匀涂于预热后的氨苄抗性LB平板上，37℃孵育过夜至有单克隆DE3菌落；

其中大肠杆菌DE3感受态细胞用CaCl₂法制备：

(1)挑取大肠杆菌DE3单个菌落涂于无氨苄抗性的LB平板上，37℃过夜；

(2)按照2％体积比扩大培养2.5h，到细菌的对数生长期(OD值约0.4)；

(3)4℃，3000rpm离心10min后，倒掉培养液，加入TSS溶液重悬；

(4)超净工作台内，冰上分装，-80℃保存备用；

步骤7，诱导融合蛋白表达，即得到TAT-PAP融合蛋白；

(1)挑取单克隆DE3菌株放入5ml含100mg/L氨苄的LB平板中，37℃振荡过夜，次日取出1ml菌液，余下4ml菌液加入IPTG(1：1000)反应4h后再取出其中的1ml菌液；

(2)煮沸法裂解DE3细菌，释放出蛋白；

(3)SDS-PAGE凝胶电泳鉴定目的蛋白TAT-PAP有无表达，以及在IPTG诱导前后表达的差异；

(4)用考马斯亮兰R250将表达后的全菌蛋白染色，确认诱导表达的条件和阳性克隆菌落，然后在16～22℃，0.2mM的IPTG条件下大量表达蛋白。

本发明TAT-PAP融合蛋白的亲和纯化和鉴定：

(1)用100ml洗涤液平衡Ni-NTA柱子后，将用直径为0.22μm滤膜过滤后的大肠杆菌裂解液上清上样，流速保持在20～30ml/h；

(2)用100ml洗涤缓冲液洗涤TAT-PAP融合蛋白，去除非特异性结合的蛋白；

(3)适量的洗脱缓冲液洗脱融合蛋白TAT-PAP；

(4)超声破碎诱导表达蛋白的细菌，释放出的目的蛋白通过Ni离子整合的亲和层析柱，纯化后超滤浓缩为2mg/ml，置于-80℃冰箱备用，经蛋白印迹和蛋白质N端测序验证，其氨基酸序列同SEQ ID NO:1。

图1是SDS-PAGE分析的TAT-PAP融合蛋白表达和纯化图。由图1可知，纯化后的融合蛋白TAT-PAP蛋白大小约为48kD，条带单一，表达量大。

本发明融合蛋白TAT-PAP的活性测定：

(1)根据PAP ELISA试剂盒说明书进行融合蛋白TAT-PAP活性检测，先设立标准品浓度梯度4000pg/ml，用稀释液梯度稀释标准品，最高浓度为4000pg/ml，最低为直接加入标准品稀释液的0pg/ml；同时设立标准品pH值梯度，最高pH值为10，最低pH值为2；

(2)将TAT-PAP融合蛋白上清液分3孔加入96孔板内(100μl/孔)，室温静置孵育2h，同时设立空白对照孔(只加TMB显色液和终止液)；

(3)依次加入PAP抗体工作液、HRP酶结合物工作液和TMB显色液各100μl/孔，室温避光孵育20min～1h，每步之间均用洗涤液洗板；

(4)加入终止液(50μl/孔)，轻轻混匀后移至酶标仪，测量OD 450值，以OD值为纵坐标，标准品浓度或pH值为横坐标，绘制标准曲线。根据样品的OD值可在标准品线上查出其浓度或pH值。

图2是TAT-PAP融合蛋白和标准品的pH值与酶活性的关系曲线，可见pH5～6时融合蛋白相对活性最大，但仍低于标准品；图3是TAT-PAP融合蛋白和标准品的浓度与酶活性的关系曲线，可见融合蛋白浓度越高酶活性越大，相同浓度时其活性低于标准品。

本发明TAT-PAP融合蛋白转导功能的鉴定：

1.TAT-PAP融合蛋白穿过血脊屏障转导入脊髓组织的鉴定：

(1)腹腔注射250nmol的TAT-PAP融合蛋白后0h、2h、4h和6h，取出大鼠的腰膨大节段脊髓，30％蔗糖溶液中，4℃放置48h；

(2)按冠状面对脊髓进行冰冻切片，片厚30μm，PBS溶液漂洗后放入抗体板；

(3)在抗体板中依次加入PAP抗体、生物素标记的二抗和ABC复合物，室温孵育8～12h，每步之后均用PBS溶液漂洗；

(4)DAB显色，室温20min后加入双氧水终止反应，脱水透明后封片。

图4是TAT-PAP融合蛋白在脊髓组织表达的DAB染色图，从图中可见，4h和6h组中PAP免疫阳性产物明显增多。标尺为50μm。

本发明在糖尿病神经病理性痛模型大鼠腹腔注射TAT-PAP融合蛋白0h、2h、4h和6h后，麻醉处死大鼠取出脊髓，进行冰冻切片，DAB染色结果显示，注射后4h和6h，观察到脊髓背角中PAP免疫阳性产物较未给药的0h对照组明显增多，表明TAT-PAP融合蛋白能穿透血脊屏障，具有细胞膜转导作用。

本发明TAT-PAP融合蛋白对糖尿病神经病理性痛模型大鼠的镇痛作用的鉴定：

1.糖尿病神经病理性痛模型大鼠制备

以60mg/kg剂量一次性给予大鼠腹腔注射链脲菌素，72h后剪尾静脉测血糖>16.7mol/L的大鼠为糖尿病模型大鼠。进而对糖尿病模型大鼠在第7d时的机械痛阈值(PWT)和热痛潜伏期(PWL)进行检测，取相比正常对照组痛阈明显降低(PWT<8g或PWL<8s)的糖尿病模型大鼠作为糖尿病神经病理性痛模型大鼠。

2.TAT-PAP融合蛋白对糖尿病神经病理性痛模型大鼠的镇痛作用

在糖尿病神经病理性痛模型大鼠痛敏最强烈的第14d腹腔注射250nmol的TAT-PAP分别测定注射后0h、2h、4h和6h的痛阈变化。此外，在制备TAT-PAP融合蛋白的同时，PAP氨基酸乱序的TAT-PAPs也同样被表达作为对照。

图5是腹腔注射TAT-PAP融合蛋白后0h、2h、4h和6h糖尿病神经病理性痛模型大鼠机械痛行为的变化；图6为热痛行为变化。由图5、图6可见给药4h后模型大鼠痛行为有所缓解，直至6h，与同一时间对照组TAT-PAPs相比差异均有统计学意义。

将本发明TAT-PAP融合蛋白腹腔注射到大鼠体内，4h后即可明显缓解模型大鼠的痛行为。

本发明TAT-PAP融合蛋白具有能穿透血脊屏障，且转导效率高的特点，可用于包括神经病理性痛、炎性痛和癌性痛等多种疼痛的治疗。

Claims (4)

1.一种TAT-PAP融合蛋白，其特征在于，该融合蛋白是由人类Ⅰ型免疫缺陷病毒HIV-Ⅰ的转录反式激活因子TAT的蛋白转导域PTD和前列腺酸性磷酸酶PAP形成的融合蛋白TAT-PAP。

2.根据权利要求1所述的TAT-PAP融合蛋白，其特征在于，该融合蛋白具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的TAT-PAP融合蛋白的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

步骤1，选取包含蛋白转导域PTD的转录反式激活因子TAT，且其两端分别含有Nco I和Xho I酶切位点序列的pTAT-HA表达载体；pTAT-HA表达载体中PTD的cDNA序列为SEQ ID NO:2所示的序列；

步骤2，从Genebank中获取前列腺酸性磷酸酶PAP的cDNA序列，经原核表达优化PAP基因序列，PAP基因序列为SEQ ID NO:3所示的序列；

步骤3，将步骤2经原核表达优化后的PAP基因序列合成为PAP基因片段，序列两端分别含有Nco I和Xho I酶切位点的序列，并装载到pUC57载体中，即为pUC57-PAP载体；

步骤4，将pTAT-HA表达载体和pUC57-PAP载体均用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，酶切条件为：37℃反应1～16h，65℃灭活20min，分别回收载体pTAT和目的基因片段PAP；

步骤5，用T4连接酶连接酶切后的载体pTAT和目的基因片段PAP，反应条件为：室温，10min，筛选阳性单克隆获得pTAT-PAP重组质粒；

步骤6，将pTAT-PAP重组质粒转化大肠杆菌DE3感受态细胞；

步骤7，诱导融合蛋白表达，即得到TAT-PAP融合蛋白。

4.根据权利要求1或2所述的TAT-PAP融合蛋白在制备治疗糖尿病神经病理性痛药物中的应用。