KR102653381B1 - 신경펩티드 y 수용체의 조절제로서의 항체-커플링된 사이클릭 펩티드 티로신 티로신 화합물 - Google Patents

신경펩티드 y 수용체의 조절제로서의 항체-커플링된 사이클릭 펩티드 티로신 티로신 화합물 Download PDF

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KR102653381B1
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루이 장
마틴 에이. 케이스
샤미나 엠. 랑왈라
제임스 엔. 레너드
라울 씨. 카마초
마이클 제이. 헌터
가타리나 이. 드아퀴노
윌슨 에드워즈
로날드 브이. 스완슨
웬잉 지안
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마크 월
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Abstract

본 발명은 사이클릭 PYY 펩티드에 접합된 단일클론 항체를 포함하는 접합체를 포함한다. 본 발명은 또한 약제학적 조성물 및 이의 사용 방법에 관한 것이다. 본 신규 접합체는 본 명세서에 개시된 질병 및 장애를 예방, 치료 또는 개선하는 데 유용하다.

Description

신경펩티드 Y 수용체의 조절제로서의 항체-커플링된 사이클릭 펩티드 티로신 티로신 화합물
본 발명은 대체로 신규 항체 커플링된 사이클릭 펩티드 티로신 티로신(PYY) 접합체에 관한 것으로, 이는 신경펩티드 Y2 수용체의 조절제이다. 본 발명은 또한 약제학적 조성물 및 이의 사용 방법에 관한 것이다. 신규 항체 커플링된 화합물은, 특히 비만, 제2형 당뇨병, 대사 증후군, 인슐린 저항성, 및 이상지질혈증과 같은 질병 및 장애를 예방, 치료 또는 개선하는 데 유용하다.
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2016년 10월 27일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/413,613호 및 2016년 10월 27일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/413,586호에 대한 우선권을 주장한다. 각각의 개시내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 언급
본 출원은, 파일명이 "PRD3436 서열 목록"이고 생성 일자가 2017년 10월 23일이고 크기가 135 kb인 ASCII 포맷 서열 목록으로서 EFS-웹을 통해 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함한다. EFS-웹을 통해 제출된 서열 목록은 본 명세서의 일부이며, 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 명세서에 기재된 정보와 파일명 "PRD3436 서열 목록"을 갖는 EFS-웹을 통해 전자적으로 제출된 서열 목록 사이에 서열 번호 1-156에 대한 구조에 관하여 어떠한 불일치가 발생되는 경우에, 본 명세서의 정보가 좌우할 것이다.
신경펩티드 Y(NPY) 수용체는 "NPY 패밀리"로 불리는 펩티드 효능제(agonist)의 근연군(closely related group)에 의해 활성화되며, 이때 NPY 패밀리는 각각의 수용체 아형(sub-type)에 대해 상이한 친화성을 갖는다. NPY, 펩티드 티로신-티로신(PYY) 및 췌장 폴리펩티드(PP)(이들 모두 36개의 아미노산 길이)는 NPY 수용체 패밀리에 대한 효능제이다. NPY는 노르에피네프린 및 에피네프린과 함께 합성되고, 동시저장(co-store)되고, 방출되는 신경전달물질이다. NPY는 인간 및 설치류의 중추 신경계(CNS)에서 가장 풍부하고 널리 분포된 펩티드들 중 하나이며, 섭식 및 스트레스와 관련된 뇌의 영역에서 발현된다. 말초 신경계에서, NPY-함유 뉴런은 주로 교감신경이다. PYY는 주로 장 내분비 세포에 의해 합성되고 방출된다. 내피 세린-프로테아제인 다이-펩티딜 펩티다제 IV(DPP-IV)에 의한 NPY 및 PYY의 절단은 NPY3-36 및 PYY3-36을 생성하는데, 이들은 NPY 수용체 패밀리의 Y2 및 Y5 아형에 대한 선택적 리간드이다. PP는 인슐린, 글루카곤 또는 소마토스타틴을 저장하는 세포와 구별되는 췌도 세포에서 주로 발견된다.
5개의 별개의 NPY 수용체가 지금까지 확인되어 있으며, 이들 중 4개는 인간 생리학적 특성과 관련된 것으로 이해된다. 수용체 Y1, Y2 및 Y5는 NPY 및 PYY와 우선적으로 결합하는 반면, Y4 수용체는 PP와 우선적으로 결합한다. Y2 및 Y5 수용체는 또한 NPY3-36 및 PYY3-36에 의해 강력하게 활성화된다. 일반적으로, NPY 리간드 패밀리는 NPY 수용체 아이소형(isoform) 각각에 대한 가변 선택성을 가지며, 이때 PYY3-36은 Y2 아이소형에 대해 온화한 내지 강력한 선택성을 갖는 것으로 이전에 보고되어 있다. 이들 수용체 각각은 백일해-독소 민감성 Gαi를 통한 아데닐레이트 사이클라제의 억제를 위해 커플링된다.
PYY는 음식에 반응하여, 특히 지방 섭취 후에 내분비 L-세포로부터 분비된다. PYY1-36은 공복 상태에서 우세하며, PYY3-36은 인간에서 식사 후 발견되는 주요 형태이며, 혈장 농도는 소모된 칼로리의 수치와 음의 상관관계에 있다. PYY3-36은 인간, 원숭이, 래트, 토끼, 및 마우스에서 음식 섭취량을 감소시키는 것으로 입증되어 있다(문헌[Batterham RL et al. Nature 2002 Aug 8; 418(6898):650-4]; 문헌[Batterham RL et al. N Engl J Med 2003 Sep 4; 349(10):941-8]; 문헌[Challis BG et al., Biochem Biophys Res Commun 2003 Nov 28; 311(4):915-9]). PYY3-36의 식욕억제 효과는, Y2 수용체에서의 우선적 결합 및 Y2-결핍 마우스에서의 섭식 효능의 손실에 기초하여, Y2-매개되는 것으로 여겨진다(문헌[Batterham RL, et al. Nature 2002 Aug 8; 418(6898):650-4)]]. PYY3-36의 궁상내(intra-arcuate) 주사는 래트 및 마우스에서 음식 섭취량을 감소시키는데(문헌[Batterham et al. Nature 2002 Aug 8; 418(6898):650-4]), 이는 시상하부 Y2 수용체의 결합이 이들 효과를 매개할 수 있음을 시사한다. 섭식에 대한 급성 효과는 또한 ob/ob 마우스, DIO 마우스 및 Zucker fa/fa 마우스에서 체중에 대한 용량-의존적 효과로 변환되는 것으로 밝혀져 있다(문헌[Pittner RA et al. Int J Obes relat Metab Disord 2004 Aug; 28(8):963-71]). 게다가, PYY3―36은 또한 DIO 설치류에서 인슐린-매개 글루코스 처리 및 인슐린 감수성을 개선하는 것으로 밝혀져 있다(문헌[Vrang N et al., Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol Aug; 291(2):R367-75]). 비만대사 수술(bariatric surgery)은 증가된 순환 PYY-면역반응성을 가져오는데(문헌[le Roux CW et al., Ann Surg 2006 Jan; 243(1);108-14]), 이는 수술후 체중 손실에 있어서 역할을 하는 것으로 나타난다.
포유동물에서의 식욕 및 음식 섭취량을 제어하는 데 있어서의 역할뿐만 아니라 포유동물에서의 위장관에서의 항분비 및 흡수촉진 효과를 고려하면, PYY3-36은 비만 및 관련 질환을 치료하는 데 있어서뿐만 아니라 다수의 위장 장애에도 효과적일 수 있다. 그러나, 치료제로서의 PYY3―36 자체의 치료적 유용성은 그의 급속한 대사 및 결과적인 짧은 순환 반감기에 의해 제한된다(문헌[Torang et al., Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 310:R866-R874 (2016)]).
따라서, PYY3-36에 비하여 개선된 대사 안정성 및 약동학적 프로파일을 갖는 PYY 유사체 또는 이의 유도체를 얻는 것이 바람직하다. 생체내(in vivo)에서 오랜 반감기를 갖는 그러한 유도체는 더 긴 작용 지속시간으로 Y2 수용체 조절을 제공하여, 그들을 그러한 조절을 필요로 하는 대상체에 대한 치료제로서 적합하게 한다.
전술한 논의는 오로지 당업계에서 직면한 문제들의 성질에 대한 더 우수한 이해를 제공하기 위해 제시될 뿐이며, 어떠한 방식으로든 종래 기술에 대한 인정으로서 해석되어서도, 또는 본 명세서에서의 임의의 참고문헌의 인용이 그러한 참고문헌이 본 출원에 대한 "종래 기술"을 구성한다는 인정으로서 해석되어서도 안 된다.
일반적인 일 태양에서, 본 발명은 신규 항체 커플링된 사이클릭 펩티드 티로신 티로신(PYY) 화합물에 관한 것으로, 이는 신경펩티드 Y2 수용체의 조절제이다.
사이클릭 PYY 펩티드에 커플링된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 접합체가 본 명세서에 제공되며, 상기 사이클릭 PYY 펩티드는 화학식 I 또는 이의 유도체 또는 약제학적으로 허용되는 염으로 나타내고:
[화학식 I]
Figure 112019053646884-pct00001
(상기 식에서,
p는 0 또는 1이고;
m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고;
n은 1, 2, 3, 또는 4이고;
q는 0 또는 1이되; 단, Z30이 부재하는 경우에만 q가 1이고;
가교(BRIDGE)는 -Ph-CH2-S-, -트라이아졸릴-, -NHC(O)CH2S-, -SCH2C(O)NH-,
-(OCH2CH2)2NHC(O)CH2S, -NHC(O)-, 또는 -CH2S-이고;
Z4는 K, A, E, S, 또는 R이고;
Z7은 A 또는 K이고;
Z9는 G 또는 K이고;
Z11은 D 또는 K이고;
Z22는 A 또는 K이고;
Z23은 S 또는 K이고;
Z26은 A 또는 H이고;
Z30은 L, W, 부재, 또는 K이되;
단, q가 1인 경우에만 Z30이 부재하고;
Z34는
Figure 112019053646884-pct00002
또는
Figure 112019053646884-pct00003
이고;
Z35는
Figure 112019053646884-pct00004
,
Figure 112019053646884-pct00005
,
Figure 112019053646884-pct00006
, 또는
Figure 112019053646884-pct00007
임);
상기 유도체는 아미드화, 글리코실화, 카르바밀화, 황산화, 인산화, 환화, 지질화, 및 페길화(pegylation)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 공정에 의해 개질된 화학식 I의 화합물이다. 소정 실시 형태에서, 사이클릭 PYY 펩티드는 화학식 I의 화합물, 또는 아미드화, 지질화, 및 페길화로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 공정에 의해 개질된 화학식 I의 사이클릭 PYY 펩티드의 유도체, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
소정 실시 형태에서, 사이클릭 PYY 펩티드는,
p는 0 또는 1이고;
m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고;
n은 1, 2, 3, 또는 4이고;
q는 0 또는 1이되; 단, Z30이 부재하는 경우에만 q가 1이고;
가교는 -Ph-CH2-S-, -트라이아졸릴-, -NHC(O)CH2S-, -SCH2C(O)NH2-,
-(OCH2CH2)2NHC(O)CH2S, -NHC(O)-, 또는 -CH2S-이고;
Z4는 K, A, E, S, 또는 R이고;
Z7은 A 또는 K이며, 상기 K의 아미노 측쇄는
Figure 112019053646884-pct00008
(여기서, i는 0 내지 24의 정수이고, X는 Br, I 또는 Cl임),
-C(O)CH2Br, -C(O)CH2I, 또는 -C(O)CH2Cl로 선택적으로 치환되고;
Z9는 G 또는 K이며, 상기 K의 아미노 측쇄는
Figure 112019053646884-pct00009
(여기서, i는 0 내지 24의 정수이고, X는 Br, I 또는 Cl임),
-C(O)CH2Br, -C(O)CH2I, 또는 -C(O)CH2Cl로 선택적으로 치환되고;
Z11은 D 또는 K이며, 상기 K의 아미노 측쇄는
Figure 112019053646884-pct00010
(여기서, i는 0 내지 24의 정수이고, X는 Br, I 또는 Cl임),
-C(O)CH2Br, -C(O)CH2I, 또는 -C(O)CH2Cl로 선택적으로 치환되고;
Z22는 A 또는 K이며, 상기 K의 아미노 측쇄는
Figure 112019053646884-pct00011
(여기서, i는 0 내지 24의 정수이고, X는 Br, I 또는 Cl임),
-C(O)CH2Br, -C(O)CH2I, 또는 -C(O)CH2Cl로 선택적으로 치환되고;
Z23은 S 또는 K이며, 상기 K의 아미노 측쇄는
Figure 112019053646884-pct00012
(여기서, i는 0 내지 24의 정수이고, X는 Br, I 또는 Cl임),
-C(O)CH2Br, -C(O)CH2I, 또는 -C(O)CH2Cl로 선택적으로 치환되고;
Z26은 A 또는 H이고;
Z30은 L 또는 K이며, 상기 K의 아미노 측쇄는
Figure 112019053646884-pct00013
또는
Figure 112019053646884-pct00014
로 치환되고;
Z34는
Figure 112019053646884-pct00015
또는
Figure 112019053646884-pct00016
이고;
Z35는
Figure 112019053646884-pct00017
,
Figure 112019053646884-pct00018
,
Figure 112019053646884-pct00019
, 또는
Figure 112019053646884-pct00020
인 화학식 I 또는 이의 유도체 또는 약제학적으로 허용되는 염으로 나타낸다.
소정 실시 형태에서, 사이클릭 PYY 펩티드는,
p는 0 또는 1이고;
m은 0, 1, 2, 3, 또는 5이고;
n은 1, 2, 또는 4이고;
q는 0 또는 1이되; 단, Z30이 부재하는 경우에만 q가 1일 수 있고;
가교는 -Ph-CH2-S-, -트라이아졸릴-, -NHC(O)CH2S-, -(OCH2CH2)2NHC(O)CH2S, -NHC(O)-, 또는 -CH2S-이고;
Z4는 K, A, E, S, 또는 R이고;
Z7은 A 또는 K이며, 상기 K의 아미노 측쇄는
Figure 112019053646884-pct00021
로 치환되고,
Z9는 G 또는 K이고;
Z11은 D 또는 K이며, 상기 K의 아미노 측쇄는
Figure 112019053646884-pct00022
,
Figure 112019053646884-pct00023
,
Figure 112019053646884-pct00024
,
Figure 112019053646884-pct00025
, -C(O)CH2Br로 치환되고;
Z22는 A 또는 K이며, 상기 K의 아미노 측쇄는
Figure 112019053646884-pct00026
로 치환되고;
Z23은 S 또는 K이며, 상기 K의 아미노 측쇄는
Figure 112019053646884-pct00027
로 치환되고;
Z26은 A 또는 H이고;
Z30은 L 또는 K이며, 상기 K의 아미노 측쇄는
Figure 112019053646884-pct00028
또는
Figure 112019053646884-pct00029
로 치환되고;
Z34는
Figure 112019053646884-pct00030
또는
Figure 112019053646884-pct00031
이고;
Z35는
Figure 112019053646884-pct00032
,
Figure 112019053646884-pct00033
,
Figure 112019053646884-pct00034
, 또는
Figure 112019053646884-pct00035
인 화학식 I 또는 이의 유도체 또는 약제학적으로 허용되는 염으로 나타낸다.
소정 실시 형태에서, 사이클릭 PYY 펩티드는 서열 번호 1, 73-100, 및 147-156으로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
소정 실시 형태에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 링커(linker)를 통해 사이클릭 PYY 펩티드의 라이신 잔기에서 사이클릭 PYY 펩티드에 공유적으로 결합된다. 링커는, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)8-트라이아졸릴-CH2CH2CO-PEG4, 2 내지 24개의 PEG 단위의 PEG 사슬, 2 내지 10개의 탄소 원자를 함유하는 알킬 사슬, (Gly4Ser)j(여기서, J는 1 내지 4임), (AlaPro)u(여기서, u는 1 내지 10임), 및 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커를 포함할 수 있다.
소정 실시 형태에서, 화학식 I에서 Z7, Z9, Z11, Z22 및 Z23 중 단지 하나만이 라이신이고, 라이신은 링커를 통해 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 조작된 시스테인 잔기에 공유적으로 결합된다.
또한, 사이클릭 PYY 펩티드에 커플링된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 접합체가 제공되며, 상기 접합체는 서열 번호 102-127로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하며, 여기서 mAb는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 나타내고, ]2는 1개 또는 2개의 사이클릭 PYY 펩티드가 mAb에 공유적으로 접합됨을 나타낸다.
소정 실시 형태에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 각각 서열 번호 141, 142, 143, 144, 145, 및 146의 폴리펩티드 서열을 갖는, 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR1), HCDR2, HCDR3, 및 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR1), LCDR2, 및 LCDR3을 포함한다. 소정 실시 형태에서, 단리된 단일클론 항체는 서열 번호 137의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH), 및 서열 번호 139의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 소정 실시 형태에서, 단리된 단일클론 항체는 Fc 부분을 추가로 포함한다. 소정 실시 형태에서, 단리된 단일클론 항체는 서열 번호 138의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄(HC), 및 서열 번호 140의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄(LC)를 포함한다.
또한, 사이클릭 PYY 펩티드에 커플링된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 접합체가 제공되며, 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 각각 서열 번호 141, 142, 143, 144, 145, 및 146의 폴리펩티드 서열을 갖는, 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR1), HCDR2, HCDR3, 및 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR1), LCDR2, 및 LCDR3을 포함하며, 바람직하게는 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호 137의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH), 및 서열 번호 139의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하며, 더 바람직하게는, 상기 단일클론 항체는 서열 번호 138의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄(HC), 및 서열 번호 140의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄(LC)를 포함하고; 상기 사이클릭 PYY 펩티드는 서열 번호 1, 73-100, 및 147-156으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 서열, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하고; 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 직접적으로 또는 링커를 통해 상기 사이클릭 PYY 펩티드의 잔기 7, 9, 11, 22 또는 23에서, 바람직하게는 상기 사이클릭 PYY 펩티드의 라이신 잔기 11에서 상기 사이클릭 PYY 펩티드에 접합된다.
또한, 본 발명의 접합체를 생성하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 상기 사이클릭 PYY 펩티드의 측쇄, 바람직하게는 상기 사이클릭 PYY 펩티드의 라이신 잔기의 측쇄 상에 도입된 친전자체, 바람직하게는 브로모아세트아미드 또는 말레이미드를 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 서열 번호 143의 시스테인 잔기의 설프하이드릴 기와 반응시켜, 상기 사이클릭 PYY 펩티드와 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편 사이에 공유 결합을 생성하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명의 접합체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
또한, 비만, 제I형 또는 제II형 당뇨병, 대사 증후군, 인슐린 저항성, 내당능 장애, 고혈당증, 고인슐린혈증, 고트라이글리세라이드혈증, 선천성 고인슐린혈증(CHI)으로 인한 저혈당증, 이상지질혈증, 죽상경화증, 당뇨병성 신장병증, 및 다른 심혈관 위험 인자, 예컨대 고혈압 및 관리되지 않은 콜레스테롤 및/또는 지질 수준과 관련된 심혈관 위험 인자, 골다공증, 염증, 비알코올성 지방간 질병(NAFLD), 비알코올성 지방성 간염(NASH), 신장 질병, 및 습진으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질병 또는 장애의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 상기 질병 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위한 방법이 제공된다. 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 유효량의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
또한, 이를 필요로 하는 대상체에서 식품 섭취량을 감소시키는 방법이 제공된다. 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 유효량의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
또한, Y2 수용체 활성의 조절을 필요로 하는 대상체에서 Y2 수용체 활성을 조절하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 유효량의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
소정 실시 형태에서, 약제학적 조성물은 주사를 통해 투여된다. 소정 실시 형태에서, 약제학적 조성물은 적어도 하나의 항당뇨병제와 병용하여 투여된다. 항당뇨제는, 예를 들어 글루카곤-유사-펩티드-1 수용체 조절제일 수 있다. 소정 실시 형태에서, 약제학적 조성물은 리라글루타이드와 병용하여 투여된다.
또한, 본 발명의 접합체를 포함하며, 바람직하게는 리라글루타이드 및 주사 장치를 추가로 포함하는 키트가 제공된다.
또한, 본 발명의 약제학적 조성물을 생성하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 상기 접합체를 약제학적으로 허용되는 담체와 배합하여 상기 약제학적 조성물을 얻는 단계를 포함한다.
본 발명의 추가의 태양, 특징 및 이점은 하기의 본 발명의 상세한 설명 및 청구범위를 읽을 때 더 잘 이해될 것이다.
전술한 개요뿐만 아니라 본 출원의 바람직한 실시 형태의 하기의 상세한 설명은 첨부 도면과 함께 읽을 때 더 잘 이해될 것이다. 그러나, 본 출원은 도면에 나타낸 정확한 실시 형태로 제한되지 않음이 이해되어야 한다.
도 1: 본 발명의 일 실시 형태에 따른 일반적인 펩티드-mAb 접합 전략을 나타낸다. X는 치료적 펩티드의 측쇄 상에 도입된 친전자체, 예컨대 브로모아세트아미드 또는 말레이미드를 나타내며, 이러한 친전자체는 반감기 연장 mAb의 CDR 내로 조작된 Cys 잔기의 설프하이드릴 기와 부위 특이적으로 반응하여, 펩티드와 mAb 사이에 공유 결합을 생성한다.
도 2: PH9H5_VH(서열 번호 129) 및 PH9L3_VL(서열 번호 128)에서 치환을 위해 선택된 CDR 잔기의 요약. Cys로 치환된 잔기는 볼드체이고 밑줄이 그어져 있다.
도 3: 식이-유도 비만(DIO) 마우스에서의 화합물 1의 약동학적 특성.
도 4: 사이노몰거스 원숭이에서의 화합물 1의 약동학적 특성.
도 5: 화합물 1로 처리된 DIO 마우스에서의 음식 섭취량: 급성 투여.
도 6: 화합물 1로 처리된 DIO 마우스에서의 체중 손실: 급성 투여.
도 7: 화합물 1로 처리된 DIO 마우스에서의 음식 섭취량: 만성 투여.
도 8: 화합물 1로 처리된 DIO 마우스에서의 체중 손실: 만성 투여.
도 9: 리라글루타이드와 병용하여 화합물 1로 처리된 DIO 마우스에서의 체중 손실: 만성 투여.
도 10: 리라글루타이드 시작 3주 전, 리라글루타이드에 의한 1주의 처리, 및 리라글루타이드 투여 후 2주 동안의 평균 주간 음식 섭취량을 보여주는 그래프를 나타낸다. 3주 기저선 평균에 대한 처리의 평균 주간 음식 섭취량의 % 감소가 표시되어 있다.
도 11a 내지 도 11d: 비만 레서스 마카크(rhesus macaque)에서 글루코스, 인슐린, 및 트라이글리세라이드에 대한 리라글루타이드 추가(add-on)를 동반한 화합물 1의 효과를 보여주는 그래프를 나타낸다. 도 11a는 글루코스 수준에 대한 화합물 1 단제요법(PYY) 및 리라글루타이드 병용 요법(PYY+ 리라글루타이드)의 효과를 보여주는 그래프를 나타낸다. 도 11b는 인슐린 수준에 대한 화합물 1 단제요법(PYY) 및 리라글루타이드 병용 요법(PYY+ 리라글루타이드)의 효과를 보여주는 그래프를 나타낸다. 도 11c는 HOMA-IR 수준에 대한 화합물 1 단제요법(PYY) 및 리라글루타이드 병용 요법(PYY+ 리라글루타이드)의 효과를 보여주는 그래프를 나타낸다. 도 11d는 트라이글리세라이드 수준에 대한 화합물 1 단제요법(PYY) 및 리라글루타이드 병용 요법(PYY+ 리라글루타이드)의 효과를 보여주는 그래프를 나타낸다.
도 12a 내지 도 12d: 비만 레서스 마카크에서 콜레스테롤 및 간 효소에 대한 리라글루타이드 추가를 동반한 화합물 1의 효과의 그래프를 나타낸다. 도 12a는 콜레스테롤 수준에 대한 화합물 1 단제요법(PYY) 및 리라글루타이드 병용 요법(PYY+ 리라글루타이드)의 효과를 보여주는 그래프를 나타낸다. 도 12b는 HDL 수준에 대한 화합물 1 단제요법(PYY) 및 리라글루타이드 병용 요법(PYY+ 리라글루타이드)의 효과를 보여주는 그래프를 나타낸다. 도 12c는 ALT 수준에 대한 화합물 1 단제요법(PYY) 및 리라글루타이드 병용 요법(PYY+ 리라글루타이드)의 효과를 보여주는 그래프를 나타낸다. 도 12d는 AST 수준에 대한 화합물 1 단제요법(PYY) 및 리라글루타이드 병용 요법(PYY+ 리라글루타이드)의 효과를 보여주는 그래프를 나타낸다.
다양한 간행물, 논문, 및 특허가 배경기술에 그리고 본 명세서 전체에 걸쳐 인용되어 있거나 기재되어 있으며; 이들 참고문헌 각각은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 명세서에 포함된 문헌, 행동, 재료, 디바이스, 물품 등에 대한 논의는 본 발명에 대한 상황을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러한 논의는 이들 대상 중 임의의 것 또는 모든 것이, 개시되거나 청구된 임의의 발명에 대하여 종래 기술을 형성하는 것을 인정하는 것은 아니다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 그렇지 않으면, 본 명세서에 사용되는 소정의 용어는 본 명세서에 제시된 바와 같은 의미를 갖는다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태("a", "an", 및 "the")는, 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면, 복수의 지시 대상을 포함한다는 것에 유의해야 한다.
달리 언급되지 않는 한, 본 명세서에 기재된 농도 또는 농도 범위와 같은 임의의 수치 값은 모든 경우에 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 수치 값은 전형적으로 인용된 값의 ±10%를 포함한다. 예를 들어, 1 mg/mL의 농도는 0.9 mg/mL 내지 1.1 mg/mL를 포함한다. 마찬가지로, 1% 내지 10% (w/v)의 농도 범위는 0.9% (w/v) 내지 11% (w/v)를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는 한, 수치 범위의 사용은 모든 가능한 하위범위, 그 범위 내의 모든 개별 수치 값, 예를 들어 그러한 범위 내의 정수 및 값의 분율을 명시적으로 포함한다.
달리 지시되지 않는 한, 일련의 요소 앞의 용어 "적어도"는 일련 내의 각각의 모든 요소를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 당업자는 단지 일반적인 실험을 사용하여, 본 명세서에서 설명된 본 발명의 구체적인 실시 형태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 그러한 등가물은 본 발명에 의해 포함되도록 의도된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하다", "포함하는", "구비하다", "구비하는", "갖는다", "갖는", "함유하다" 또는 "함유하는", 또는 이들의 임의의 다른 변형은 언급된 정수 또는 정수들의 군의 포함을 내포하지만 임의의 다른 정수 또는 정수들의 군의 배제를 내포하지 않는 것으로 이해될 것이며, 비배타적 또는 개방형(open-ended)인 것으로 의도된다. 예를 들어, 요소들의 목록을 포함하는 조성물, 혼합물, 공정, 방법, 물품, 또는 장치는 반드시 그러한 요소들만으로 제한되지는 않고, 그러한 조성물, 혼합물, 공정, 방법, 물품, 또는 장치에 고유하거나 명시적으로 열거되어 있지 않은 다른 요소들을 포함할 수 있다. 또한, 명시적으로 반대로 기재되어 있지 않는 한, "또는"은 배타적 '또는'이 아니라 포괄적 '또는'을 지칭한다. 예를 들어, 조건 A 또는 B는 하기 중 어느 하나에 의해 만족된다: A가 참(또는 존재함)이고 B가 거짓(또는 존재하지 않음)임, A가 거짓(또는 존재하지 않음)이고 B가 참(또는 존재함)임, A 및 B 둘 모두가 참(또는 존재함)임.
또한, 본 명세서에서 바람직한 발명의 구성요소의 치수 또는 특성을 언급할 때 사용되는 용어 "약", "대략", "대체로", "실질적으로" 및 유사한 용어들은 기재된 치수/특성이 엄격한 경계 또는 파라미터가 아니고, 그로부터 기능적으로 동일하거나 유사한 사소한 변동은 배제하지 않음을 나타낸다는 것이 이해되어야 하며, 이는 당업자에 의해 이해되는 바와 같을 것이다. 최소한으로, 수치 파라미터를 포함하는 그러한 언급은 당업계에서 허용되는 수학적 및 산업적 원리(예를 들어, 반올림, 측정 오차 또는 다른 계통 오차, 제조 공차 등)를 사용하여, 최소 유효 숫자를 변화시키지 않게 될 변형을 포함할 것이다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열(예를 들어, 사이클릭 PYY3-36 폴리펩티드 서열, 항체 경쇄 또는 중쇄 서열)과 관련하여, 용어 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"은, 본 개시내용을 고려하여 당업계에 알려진 방법을 사용하여 시각적 검사에 의해, 또는 하기 서열 비교 알고리즘들 중 하나를 사용하여 측정되는 바와 같이, 최대 일치도(maximum correspondence)에 대해 비교되고 정렬될 때, 동일하거나, 또는 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 명시된 백분율을 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다.
서열 비교를 위하여, 전형적으로 하나의 서열이 시험 서열의 비교 대상이 되는 기준 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 시험 서열 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요에 따라 하위서열 좌표를 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 파라미터에 기초하여, 참조 서열과 대비하여 시험 서열(들)에 대한 퍼센트 서열 동일성을 계산한다.
비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 예를 들어 스미스 및 워터만 (문헌[Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)])의 국부 상동성 알고리즘에 의해, 니들만 및 분쉬 (문헌[Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)])의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 피어슨 및 립만 (문헌[Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)])의 유사성 검색 방법에 의해, 이들 알고리즘의 전산화 구현 (미국 위스콘신주 매디슨, 575 사이언스 드라이브 소재의 Genetics Computer Group의 Wisconsin Genetics Software Package의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA)에 의해, 또는 시각적 검사(전반적으로, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1995 Supplement) (Ausubel)] 참조)에 의해 수행될 수 있다.
퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하기에 적합한 알고리즘의 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이며, 이들은 각각 문헌[Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410] 및 문헌[Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402]에 기재되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 입수가능하다.
2개의 핵산 서열 또는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 추가의 지표는, 하기에 기재된 바와 같이, 제1 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드가 제2 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드와 면역학적으로 교차 반응성이라는 것이다. 따라서, 폴리펩티드가 전형적으로 제2 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 경우는, 예를 들어 이들 2개의 펩티드가 보존적 치환에 의해서만 상이한 경우뿐이다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 다른 지표는, 하기에 기재된 바와 같이, 2개의 분자가 엄격한 조건 하에서 서로 혼성화되는 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "대상체"는 임의의 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간을 의미한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "포유동물"은 임의의 포유동물을 포함한다. 포유동물의 예에는 소, 말, 양, 돼지, 고양이, 개, 마우스, 래트, 토끼, 기니 피그, 원숭이, 인간 등, 더 바람직하게는 인간이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
본 발명의 방법과 관련하여 용어 "투여하는"은, 본 발명의 접합체, 이의 형태, 조성물 또는 약제를 사용함으로써, 본 명세서에서 기재된 바와 같은 증후군, 장애 또는 질병을 치료적으로 또는 예방적으로, 예방, 치료 또는 개선하기 위한 방법을 의미한다. 그러한 방법은 유효량의 상기 접합체, 이의 형태, 조성물 또는 약제를 요법 과정 동안 상이한 시간에 또는 병용물 형태로 동시에 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 방법은 모든 공지된 치료적 처치 계획을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "유효량"은, 치료 중인 증후군, 장애 또는 질병, 또는 치료 중인 증후군, 장애 또는 질병의 증상을 예방, 치료 또는 개선하는 것을 포함하는, 연구원, 수의사, 의사, 또는 기타 임상의에 의해 모색되고 있는, 조직 시스템, 동물 또는 인간에서의 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 활성 접합체 또는 약제학적 작용제의 양을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "조성물"은 특정 양의 특정 성분을 포함하는 생성물뿐만 아니라, 특정 양의 특정 성분들의 조합으로부터 직접적으로 또는 간접적으로 생성되는 임의의 생성물을 포함하는 것으로 의도된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "커플링된"은 둘 이상의 물체를 함께 결합하거나 연결하는 것을 지칭한다. 화학적 또는 생물학적 화합물을 언급할 때, '커플링된'은 둘 이상의 화학적 또는 생물학적 화합물 사이의 공유 연결을 지칭할 수 있다. 비제한적인 예로서, 본 발명의 항체는 관심 펩티드와 커플링되어 항체 커플링된 펩티드를 형성할 수 있다. 항체 커플링된 펩티드는 항체를 펩티드에 접합시키도록 설계된 특정 화학 반응을 통해 형성될 수 있다. 소정 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 링커를 통해 본 발명의 펩티드와 공유적으로 커플링될 수 있다. 링커는, 예를 들어, 먼저 항체 또는 펩티드에 공유적으로 연결되고, 이어서 펩티드 또는 항체에 공유적으로 연결될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "링커"는 항체를 펩티드에 공유적으로 부착시키는 공유적 사슬 또는 원자 사슬을 포함하는 화학 모듈을 지칭한다. 링커는, 예를 들어, 펩티드 링커, 탄화수소 링커, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 링커, 폴리프로필렌 글리콜(PPG) 링커, 다당류 링커, 폴리에스테르 링커, PEG 및 매립된 헤테로사이클로 이루어진 하이브리드 링커, 및 탄화수소 사슬을 포함할 수 있지만 이로 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "접합체"는 약제학적으로 활성인 모이어티(moiety)에 공유적으로 커플링된 항체 또는 이의 단편을 지칭한다. 용어 "~에 접합된"은 직접적으로 또는 링커를 통해 간접적으로 약제학적으로 활성인 모이어티, 바람직하게는 치료적 펩티드에 공유적으로 결합되거나 공유적으로 연결된 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 지칭한다. 비제한적인 예로서, 항체는 본 발명의 단일클론 항체일 수 있고, 약제학적으로 활성인 모이어티는 치료적 펩티드, 예컨대 관심 사이클릭 PYY 펩티드일 수 있다.
본 명세서에 기재된 펩티드 서열은 펩티드의 N-말단 영역은 좌측에 있고 C-말단 영역은 우측에 있다는 통상의 규약에 따라 표기된다. 아미노산의 이성질체 형태가 공지되어 있지만, 이는, 달리 명시적으로 지시되지 않는 한, 표현된 아미노산의 L-형태이다.
항체
일반적인 일 태양에서, 본 발명은 신규 항체에 관한 것으로, 상기 항체는, 비표적화이도록 그리고 약제학적으로 활성인 모이어티, 예컨대 치료적 펩티드(예를 들어, 사이클릭 PYY 펩티드)를 부위-특이적 방식으로 화학적으로 접합하는(즉, 커플링하는) 데 사용될 수 있는 시스테인 잔기를 함유하도록 조작되어, 항체 커플링된 펩티드가 펩티드 단독과 대비하여 연장/증가된 반감기를 갖도록 한 것이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 항체와 관련하여 용어 "비표적화"는 생체내에서 임의의 표적에 특이적으로 결합하지 않는 항체를 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "표적에 특이적으로 결합하는" 항체는 1×10―8 M 이하, 바람직하게는 5×10―9 M 이하, 1×10―9 M 이하, 5×10―10 M 이하, 또는 1×10―10 M 이하의 KD로 표적 항원에 결합하는 항체를 지칭한다. 용어 "KD"는 해리 상수를 지칭하며, 이는 Kd 대 Ka의 비(즉, Kd/Ka)로부터 구해지고, 몰농도(M)로 표현된다. 항체에 대한 KD 값은 본 발명을 고려하여 당업계의 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 항체의 KD는 표면 플라즈몬 공명을 사용함으로써, 예컨대 바이오센서 시스템, 예를 들어 Biacore® 시스템을 사용함으로써, 또는 바이오층(bio-layer) 간섭법 기술, 예컨대 Octet RED96 시스템을 사용함으로써 결정될 수 있다. 항체의 KD 값이 작을수록, 항체가 표적 항원에 결합하는 친화도는 더 높다.
완전한 단일클론 항체 또는 이의 단편이 반감기 연장 모이어티로서 사용될 수 있다. 단일클론 항체는 생체내에서의 사용을 위해 이용되고 특성화된 충분히 연구된 단백질이며, 그렇기 때문에 생체내에서 이들의 오랜 반감기를 가능하게 하는 기전 및 생체내에서의 이들의 제거에 대한 기전이 잘 이해되어 있다. 추가적으로, 단일클론 항체의 2개의 "아암(arm)"의 공간적 분리 및 제시는 치료적 모이어티(즉, 치료적 펩티드)의 효과적인 2가 제시(bivalent presentation)에 유리할 수 있다. 독소 또는 다른 소분자 약물이 단일클론 항체에 화학적으로 결합된 치료제가 개발되어 있지만, 전형적으로는, 특정 항원에 결합하고 항체-약물 접합체가, 우선적으로 항원을 발현시킨 관심 조직/세포를 표적으로 하는 단일클론 항체를 이용하고, 전형적으로 약물/소분자는 항체의 항원 결합에 영향을 주지 않는 방식으로 항체에 부착된다.
치료적 펩티드-mAb 접합체의 경우, 반감기 연장 단일클론 항체에 의한 항원 특이적 결합은 요구되지 않는다. 이 때문에, 임의의 표적과 특이적으로 결합할 것으로 예상되지 않는 중쇄(HC) 및 경쇄(LC) 가변(V) 도메인 쌍이 본 발명의 커플링-가능 비표적화 단일클론 항체를 제조하는 데 사용된다. 커플링-가능 비표적화 단일클론 항체를 얻기 위하여, 시스테인 잔기가 선택된 비표적화 항체의 상보성 결정 영역(CDR) 중 하나 내로 조작된다. 약제학적으로 활성인 모이어티(예를 들어, 치료적 펩티드/화합물)는 비표적화 단일클론 항체의 조작된 시스테인 잔기에 대한 약제학적으로 활성인 모이어티의 접합을 가능하게 하기에 적절한 화학적 모이어티를 함유할 수 있다. 본 발명의 일 실시 형태에 따른 펩티드-단일클론 항체의 일반적인 접합 전략이 도 1에 나타나 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 넓은 의미로 사용되며, 비인간(예를 들어, 뮤린, 래트), 인간, 인간-적응화(human-adapted), 인간화 및 키메라 단일클론 항체, 항체 단편, 이중특이성 또는 다중특이성 항체, 이량체성, 사량체성, 또는 다량체성 항체, 및 단일쇄 항체를 포함한다.
임의의 척추동물 종의 항체 경쇄는 이들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 명확하게 별개의 2개의 유형, 즉 카파(κ) 및 람다(λ) 중 하나로 정해질 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인을 함유할 수 있다. 특정 실시 형태에 따르면, 본 발명의 항체는 마우스 또는 인간 항체로부터의 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 더하여, 항체는 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역으로 구성된 항원-결합 영역을 함유하며, 이들 영역 각각은 3개의 도메인(즉, 상보성 결정 영역 1 내지 3; (CDR1, CDR2, 및 CDR3))을 함유한다. 경쇄 가변 영역 도메인은 대안적으로 LCDR1, LCDR2, 및 LCRD3으로 지칭되며, 중쇄 가변 영역 도메인은 대안적으로 HCDR1, HCRD2, 및 HCDR3으로 지칭된다.
면역글로불린은 중쇄 불변 도메인 아미노산 서열에 따라, 5개의 주요 부류, 즉, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 정해질 수 있다. IgG는 5가지 유형의 면역글로불린 중 가장 안정한 것으로, 인간에서의 혈청 반감기가 약 23일이다. IgA 및 IgG는 동종형(isotype) IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 추가로 하위분류된다. 4개의 IgG 하위부류 각각은 이펙터 기능으로 알려진 상이한 생물학적 기능을 갖는다. 이들 이펙터 기능은 일반적으로 Fc 수용체(FcγR)와의 상호작용을 통해 또는 C1q 결합 및 보체 결합에 의해 매개된다. FcγR에 대한 결합은 항체 의존성 세포 매개 세포용해로 이어질 수 있으며, 한편 보체 인자에 대한 결합은 보체 매개 세포 용해로 이어질 수 있다. 치료적 펩티드의 반감기를 연장하는 능력이 이용되는 본 발명의 항체는 이펙터 기능을 갖지 않거나 최소한의 이펙터 기능을 갖지만, FcRn과 결합하는 그의 능력을 보유하며, 이의 결합은 항체가 연장된 생체내 반감기를 갖게 하는 1차 수단일 수 있다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 인간 Ig 생식세포계열 V 유전자 서열을 완전히 갖는 경쇄 가변 영역, 및 서열 번호 143의 아미노산 서열을 갖는 HCDR3을 제외한, 인간 Ig 생식세포계열 V 유전자 서열을 완전히 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것으로, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 생체내에서 어떠한 인간 항원에도 특이적으로 결합하지 않는다. 소정 실시 형태에서, 본 발명은 인간 Ig 생식세포계열 V 유전자 서열을 완전히 갖는 경쇄 가변 영역, 및 서열 번호 143의 아미노산 서열을 갖는 HCDR3을 제외한, 인간 Ig 생식세포계열 V 유전자 서열을 완전히 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 이것에 접합된 약제학적으로 활성인 모이어티(예를 들어, 본 발명의 사이클릭 PYY 펩티드)를 포함하는 접합체에 관한 것으로, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 생체내에서 어떠한 인간 항원에도 특이적으로 결합하지 않는다. 본 명세서에서, 본 발명의 실시 형태에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 관련하여, 어구 "항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 접합체 및 이것에 접합된 약제학적으로 활성인 모이어티를 포함하는 접합체"는 어구 "약제학적으로 활성인 모이어티에 접합된 항체 또는 이의 항원-결합 단편"과 상호교환 가능하게 사용된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항원-결합 단편"은 항체 단편, 예컨대 다이아바디(diabody), Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 이황화물 안정화된 Fv 단편(dsFv), (dsFv)2, 이중특이성 dsFv(dsFv-dsFv'), 이황화물 안정화된 다이아바디(ds 다이아바디), 단일쇄 항체 분자(scFv), 단일 도메인 항체(sdab), scFv 이량체(2가 다이아바디), 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체의 일부분으로부터 형성된 다중특이성 항체, 낙타화(camelized) 단일 도메인 항체, 나노바디, 도메인 항체, 2가 도메인 항체, 또는 항원에 결합하지만 완전한 항체 구조를 포함하지 않는 임의의 다른 항체 단편을 지칭한다. 항원-결합 단편은 모(parent) 항체 또는 모 항체 단편이 결합하는 것과 동일한 항원에 결합할 수 있다. 특정 실시 형태에 따르면, 항원-결합 단편은 경쇄 가변 영역, 경쇄 불변 영역, 및 Fd 세그먼트(즉, Fab 단편 내에 포함되는 중쇄의 일부분)를 포함한다. 다른 특정 실시 형태에 따르면, 항원-결합 단편은 Fab 및 F(ab')을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "단일쇄 항체"는 당업계에서의 통상적인 단일쇄 항체를 지칭하는 것으로, 이것은 약 15 내지 약 20개의 아미노산의 짧은 펩티드에 의해 연결된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "단일 도메인 항체"는 당업계에서의 통상적인 단일 도메인 항체를 지칭하는 것으로, 이것은 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 포함하거나, 또는 단지 중쇄 가변 영역만을 포함한다.
어구 "단리된 항체 또는 항체 단편"은 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체들이 실질적으로 없는 항체 또는 항체 단편을 지칭한다(예를 들어, 표적 항원과 특이적으로 결합하는 단리된 항체에는 표적 항원과 특이적으로 결합하지 않는 항체가 실질적으로 없다). 더욱이, 단리된 항체 또는 항체 단편에는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.
항체 가변 영역은 3개의 "항원 결합 부위"가 개재된 "프레임워크" 영역으로 이루어진다. 항원 결합 부위는 하기의 다양한 용어를 사용하여 정의된다: (i) 상보성 결정 영역(CDR)은 VH에 3개(HCDR1, HCDR2, HCDR3), 그리고 VL에 3개(LCDR1, LCDR2, LCDR3) 존재하며, 서열 가변성에 기초하고(문헌[Wu and Kabat J Exp Med 132:211-50, 1970]; 문헌[Kabat et al Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991]), (ii) "초가변 영역", "HVR", 또는 "HV"는 VH에 3개(H1, H2, H3), 그리고 VL에 3개(L1, L2, L3) 존재하며, 초티아 및 레스크(Chothia and Lesk)에 의해 정의된 바와 같이 구조에서 초가변성인 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다(문헌[Chothia and Lesk Mol Biol 196:901-17, 1987]). 다른 용어는 "IMGT-CDR"(문헌[Lefranc et al., Dev Comparat Immunol 27:55-77, 2003]) 및 "특이성 결정 잔기 용법(Specificity Determining Residue Usage)"(SDRU)(문헌[Almagro, Mol Recognit 17:132-43, 2004])을 포함한다. IMGT(International ImMunoGeneTics) 데이터베이스(http://www_mgt_org)는 항원-결합 부위의 표준화된 넘버링과 정의를 제공한다. CDR, HV 및 IMGT 도해 사이의 관련성이 문헌[Lefranc et al., Dev Comparat Immunol 27:55-77, 2003]에 기재되어 있다.
"프레임워크" 또는 "프레임워크 서열"은 항원-결합 부위인 것으로 결정된 것 이외의 가변 영역의 나머지 서열이다. 항원 결합 부위가 전술된 바와 같은 다양한 용어에 의해 정의될 수 있기 때문에, 프레임워크의 정확한 아미노산 서열은 항원 결합 부위가 어떻게 정의되는지에 따라 달라진다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 각각 서열 번호 144, 서열 번호 145 및 서열 번호 146의 아미노산 서열의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 갖는 경쇄 가변 영역, 및 각각 서열 번호 141, 서열 번호 142 및 서열 번호 143의 아미노산 서열의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
다른 실시 형태에서, 단리된 항체는 인간 IgG4 Fc 영역으로부터 유래된 Fc 영역을 추가로 포함한다. 인간 IgG4 Fc 영역은 다른 IgG 아형과 대비하여 FcγR 및 보체 인자와 결합하는 능력을 감소시켰다. 바람직하게는, Fc 영역은 이펙터 기능을 제거하는 치환을 갖는 인간 IgG4 Fc 영역을 함유한다. 따라서, 단리된 항체는 하기 치환 중 하나 이상을 함유하는 변형된 인간 IgG4 Fc 영역을 갖는 Fc 영역을 추가로 포함한다: 잔기 233에서 글루타메이트 대신 프롤린으로의 치환, 잔기 234에서 페닐알라닌 대신 알라닌 또는 발린으로의 치환, 및 잔기 235에서 류신 대신 알라닌 또는 글루타메이트로의 치환(EU 넘버링, 문헌[Kabat, E. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. U.S. Dept. of Health and Human Services, Bethesda, Md., NIH Publication no. 91-3242]). 잔기 297(EU 넘버링)에서 Asn 대신 Ala로 치환함으로써 IgG4 Fc 영역 내의 N-연결된 글리코실화 부위를 제거하는 것은 잔류 이펙터 활성이 제거됨을 보장하는 다른 방법이다.
바람직하게는, 본 발명의 항체는 이황화 결합 및 다양한 비공유 상호작용에 의해 함께 결합된 이량체들로서 존재한다. 따라서, 본 발명의 항체에 유용한 Fc 부분은, 중쇄 이량체 형성을 안정화하고 절반-IgG4 Fc 사슬의 형성을 방지하는, 228(EU 넘버링)에서의 위치에서 치환, 예컨대 프롤린으로의 세린의 치환을 함유하는 인간 IgG4 Fc 영역일 수 있다.
다른 실시 형태에서, 재조합적으로 생성된 단일클론 항체에서 일반적으로 관찰되는 바와 같이, 중쇄 내의 C-말단 Lys 잔기는 제거된다.
"인간 항체"는 프레임워크 및 항원 결합 부위 둘 모두가 인간 기원의 서열로부터 유래되는, 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 이 항체가 불변 영역을 포함하는 경우, 불변 영역 또한 인간 기원의 서열로부터 유래된다.
인간 항체는, 항체의 가변 영역이 인간 생식세포계열 면역글로불린 또는 재배열된 면역글로불린 유전자를 사용하는 시스템으로부터 얻어지는 경우, 인간 기원의 서열"로부터 유래되는" 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 그러한 시스템은, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 파지 상에 디스플레이된 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리, 및 인간 면역글로불린 유전자좌를 담지하는 유전자도입 인간 이외의 동물, 예컨대 마우스를 포함한다. "인간 항체"는 인간 생식세포계열 또는 재배열된 면역글로불린 서열과 비교할 때 아미노산 차이를 포함할 수 있는데, 이는, 예를 들어 천연 발생 체세포 돌연변이 또는 프레임워크 또는 항원 결합 부위 내의 치환의 의도적 도입에 기인한다. 전형적으로, "인간 항체"는 아미노산 서열이 인간 생식세포계열 또는 재배열된 면역글로불린 유전자에 의해 인코딩된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다. 일부 경우에, "인간 항체"는, 예를 들어 문헌[Knappik et al., J Mol Biol 296:57-86, 2000]에 기재된 바와 같이 인간 프레임워크 서열 분석으로부터 유래되는 공통 프레임워크 서열을 함유하거나, 또는, 예를 들어 문헌[Shi et al., J Mol Biol 397:385-96, 2010] 및 국제 특허 출원 공개 WO2009/085462호에 기재된 바와 같이 파지 상에 디스플레이된 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리 내로 도입된 합성 HCDR3을 함유할 수 있다. 항원 결합 부위가 인간 이외의 종으로부터 유래되는 항체는 "인간 항체"의 정의에 포함되지 않는다.
단리된 인간화 항체는 합성 항체일 수 있다. 인간 면역글로불린 서열로부터 유래되는 인간 항체는, 합성 CDR 및/또는 합성 프레임워크를 도입시킨 파지 디스플레이와 같은 시스템을 사용하여 생성될 수 있거나, 또는 시험관내 돌연변이생성(in vitro mutagenesis)을 거쳐서 항체 특성을 개선하여, 그 결과 생체내(in vivo)에서 인간 항체 생식세포계열 레퍼토리 내에는 천연적으로 존재하지 않는 항체를 생성할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "재조합 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 항체를 포함하는데, 이러한 항체는, 예컨대 인간 면역글로불린 유전자를 위해 유전자도입 또는 염색체도입된(transchromosomal) 동물(예를 들어, 마우스)로부터 단리된 항체 또는 그로부터 제조된 하이브리도마(hybridoma), 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포로부터 단리된 항체, 재조합된 조합 항체 라이브러리(recombinant, combinatorial antibody library)로부터 단리된 항체, 및 다른 DNA 서열에 대해 인간 면역글로불린 유전자 서열의 스플라이싱을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체, 또는 Fab 아암 교환을 사용하여 시험관내에서 생성되는 항체이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "단일클론 항체"는 단일 분자 조성의 항체 분자의 제조를 지칭한다. 본 발명의 단일클론 항체는 하이브리도마 방법, 파지 디스플레이 기술, 단일 림프구 유전자 클로닝 기술에 의해, 또는 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 단일클론 항체는 인간 중쇄 도입유전자 및 경쇄 도입유전자를 포함하는 게놈을 갖는 유전자도입 비인간 동물, 예컨대 유전자도입 마우스 또는 래트로부터 획득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생성될 수 있다.
소정 실시 형태에서, 용어 "mAb"는 서열 번호 137을 포함하는 가변 중쇄(VH) 서열 및 서열 번호 139를 포함하는 가변 경쇄(VL) 서열을 갖는 단일클론 항체를 지칭한다. 소정 실시 형태에서, mAb는 서열 번호 138을 포함하는 중쇄(HC) 서열 및 서열 번호 140을 포함하는 경쇄(LC) 서열을 갖는 완전 인간 단일클론 항체이다. 소정 실시 형태에서, 서열 번호 138의 위치 446에서의 라이신 잔기는 선택적으로 누락되어 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "키메라 항체"는 면역글로불린 분자의 아미노산 서열이 2개 이상의 종으로부터 유래되는 항체를 지칭한다. 경쇄 및 중쇄 둘 모두의 가변 영역은 종종, 원하는 특이성, 친화도, 및 능력을 갖는 포유동물의 하나의 종(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼 등)으로부터 유래되는 항체의 가변 영역에 상응하며, 한편 불변 영역은 포유동물의 다른 종(예를 들어, 인간)으로부터 유래되는 항체의 서열에 상응하는데, 이는 그러한 종에서의 면역 반응의 유도를 피하기 위함이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "다중특이성 항체"는 복수의 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함하는 항체를 지칭하는데, 여기서는 복수의 면역글로불린 가변 도메인 서열의 제1 면역글로불린 가변 도메인 서열이 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖거나, 임의의 알려진 결합 특이성이 결여되어 있는 생식세포계열 서열을 포함하고, 복수의 면역글로불린 가변 도메인 서열의 제2 면역글로불린 가변 도메인 서열이 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖거나, 임의의 알려진 결합 특이성이 결여되어 있는 생식세포계열 서열을 포함하고, 제1 및/또는 제2 면역글로불린 가변 도메인은 선택적으로, 접합된 약제학적으로 활성인 모이어티(예를 들어, 치료적 펩티드)를 포함한다. 일 실시 형태에서, 제1 및 제2 에피토프는 동일한 항원, 예를 들어 동일한 단백질(또는 다량체 단백질의 하위단위) 상에 있다. 일 실시 형태에서, 제1 및 제2 에피토프는 중첩되거나 실질적으로 중첩된다. 일 실시 형태에서, 제1 및 제2 에피토프는 중첩되지 않거나 실질적으로 중첩되지 않는다. 일 실시 형태에서, 제1 및 제2 에피토프는 상이한 항원, 예를 들어 상이한 단백질(또는 다량체 단백질의 상이한 하위단위) 상에 있다. 일 실시 형태에서, 제1 및 제2 면역글로불린 가변 도메인은 동일한 접합된 약제학적으로 활성인 모이어티를 포함한다. 일 실시 형태에서, 제1 및 제2 면역글로불린 가변 도메인은 상이한 약제학적으로 활성인 모이어티를 포함한다. 일 실시 형태에서, 단지 제1 면역글로불린 가변 도메인만이 접합된 약제학적으로 활성인 모이어티를 포함한다. 일 실시 형태에서, 단지 제2 면역글로불린 가변 도메인만이 접합된 약제학적으로 활성인 모이어티를 포함한다. 일 실시 형태에서, 다중특이성 항체는 제3, 제4, 또는 제5 면역글로불린 가변 도메인을 포함한다. 일 실시 형태에서, 다중특이성 항체는 이중특이성 항체 분자, 삼중특이성 항체, 또는 사중특이성 항체 분자이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "이중특이성 항체"는 2개 이하의 에피토프 또는 2개의 항원과 결합하고/하거나 2개의 접합된 약제학적으로 활성인 모이어티(예를 들어, 동일하거나 상이한 약제학적으로 활성인 모이어티)를 포함하는 다중특이성 항체를 지칭한다. 이중특이성 항체는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖거나, 임의의 알려진 결합 특이성이 결여되어 있는 생식세포계열 서열을 포함하는 제1 면역글로불린 가변 도메인 서열, 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖거나, 임의의 알려진 결합 특이성이 결여되어 있는 생식세포계열 서열을 포함하는 제2 면역글로불린 가변 도메인 서열에 의해 특징지어지고, 제1 및/또는 제2 면역글로불린 가변 도메인은 선택적으로, 접합된 약제학적으로 활성인 모이어티를 포함한다. 일 실시 형태에서, 제1 및 제2 에피토프는 동일한 항원, 예를 들어 동일한 단백질(또는 다량체 단백질의 하위단위) 상에 있다. 일 실시 형태에서, 제1 및 제2 에피토프는 중첩되거나 실질적으로 중첩된다. 일 실시 형태에서, 제1 및 제2 에피토프는 상이한 항원, 예를 들어 상이한 단백질(또는 다량체 단백질의 상이한 하위단위) 상에 있다. 일 실시 형태에서, 제1 및 제2 면역글로불린 가변 도메인은 동일한 접합된 약제학적으로 활성인 모이어티를 포함한다. 일 실시 형태에서, 제1 및 제2 면역글로불린 가변 도메인은 상이한 약제학적으로 활성인 모이어티를 포함한다. 일 실시 형태에서, 단지 제1 면역글로불린 가변 도메인만이 접합된 약제학적으로 활성인 모이어티를 포함한다. 일 실시 형태에서, 단지 제2 면역글로불린 가변 도메인만이 접합된 약제학적으로 활성인 모이어티를 포함한다. 일 실시 형태에서, 이중특이성 항체는 제1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖거나, 임의의 알려진 결합 특이성이 결여되어 있는 생식세포계열 서열을 포함하는 제1 중쇄 가변 도메인 서열 및 경쇄 가변 도메인 서열, 및 제2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖거나, 임의의 알려진 결합 특이성이 결여되어 있는 생식세포계열 서열을 포함하는 제2 중쇄 가변 도메인 서열 및 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하고, 제1 및/또는 제2 중쇄 가변 도메인은 선택적으로, 접합된 약제학적으로 활성인 모이어티를 포함한다. 일 실시 형태에서, 제1 및 제2 중쇄 가변 도메인은 동일한 접합된 약제학적으로 활성인 모이어티를 포함한다. 일 실시 형태에서, 제1 및 제2 중쇄 가변 도메인은 상이한 접합된 약제학적으로 활성인 모이어티를 포함한다. 일 실시 형태에서, 단지 제1 중쇄 가변 도메인만이 접합된 약제학적으로 활성인 모이어티를 포함한다. 일 실시 형태에서, 단지 제2 중쇄 가변 도메인만이 접합된 약제학적으로 활성인 모이어티를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "전장 항체"는 2개의 전장 항체 중쇄 및 2개의 전장 항체 경쇄를 갖는 항체를 지칭한다. 전장 항체 중쇄(HC)는 잘 알려진 중쇄 가변 및 불변 도메인 VH, CH1, CH2, 및 CH3으로 이루어진다. 전장 항체 경쇄(LC)는 잘 알려진 경쇄 가변 및 불변 도메인 VL 및 CL로 이루어진다. 전장 항체는 어느 하나 또는 둘 모두의 중쇄에 C-말단 라이신(K)이 결여되어 있을 수 있다.
용어 "Fab-아암" 또는 "하프 분자(half molecule)"는 항원에 특이적으로 결합하는 하나의 중쇄-경쇄 쌍을 지칭한다.
전장 이중특이성 항체는, 예를 들어 2개의 단일특이성 2가 항체들 사이에서의 Fab 아암 교환(또는 하프 분자 교환)을 사용하여 생성될 수 있는데, 이는 공발현을 사용하거나 또는 무세포 환경에서의 시험관내에서, 각각의 하프 분자 내의 중쇄 CH3 계면에 치환을 도입하여 별개의 특이성을 갖는 2개의 항체 하프 분자의 이종이량체 형성을 유리하게 함으로써 행해진다. Fab 아암 교환 반응은 이황화-결합 이성질화 반응 및 CH3 도메인의 해리-회합의 결과이다. 모 단일특이성 항체의 힌지 영역 내의 중쇄 이황화물 결합은 환원된다. 모 단일특이성 항체들 중 하나의, 생성된 유리 시스테인은, 제2 모 단일특이성 항체 분자의 시스테인 잔기와 중쇄간 이황화물 결합을 형성하고, 동시에 모 항체의 CH3 도메인이 해리-회합에 의해 방출 및 재형성된다. Fab 아암의 CH3 도메인은 동종이량체화에 비하여 이종이량체화에 유리하도록 조작될 수 있다. 생성된 산물은, 각각이 별개의 에피토프와 결합할 수 있는 2개의 Fab 아암 또는 하프 분자를 갖는 이중특이성 항체이다.
항체와 관련하여 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "동종이량체화"는 동일한 CH3 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄의 상호작용을 지칭한다. 항체와 관련하여 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "동종이량체"는 동일한 CH3 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
항체와 관련하여 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "이종이량체화"는 동일하지 않은 CH3 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄의 상호작용을 지칭한다. 항체와 관련하여 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "이종이량체"는 동일하지 않은 CH3 아미노산 서열을 갖는 2개의 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
"노브-인-홀(knob-in-hole)" 전략(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO 2006/028936호 참조)이 전장 이중특이성 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다. 간략하게 말해서, 인간 IgG 내에 CH3 도메인의 계면을 형성하는 선택된 아미노산이 CH3 도메인 상호작용에 영향을 주는 위치에서 돌연변이화되어 이종이량체 형성을 촉진할 수 있다. 작은 측쇄(홀)를 갖는 아미노산이 제1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 내로 도입되고, 큰 측쇄(노브)를 갖는 아미노산이 제2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 내로 도입된다. 2개의 항체의 공발현 후에, "홀"을 갖는 중쇄와 "노브"를 갖는 중쇄의 우선적인 상호작용의 결과로서 이종이량체가 형성된다. 노브와 홀을 형성하는 예시적인 CH3 치환 쌍은 다음과 같다(제1 중쇄의 제1 CH3 도메인 내의 변형된 위치/제2 중쇄의 제2 CH3 도메인 내의 변형된 위치로서 표현됨): T366Y/F405A, T366W/F405W, F405W/Y407A, T394W/Y407T, T394S/Y407A, T366W/T394S, F405W/T394S 및 T366W/T366S_L368A_Y407V.
하나의 CH3 표면에서 양으로 하전된 잔기를, 그리고 제2 CH3 표면에서 음으로 하전된 잔기를 치환함으로써 정전기 상호작용을 사용하여 중쇄 이종이량체화를 촉진하는 것과 같은 다른 전략이 사용될 수 있으며, 이는 미국 특허 출원 공개 제2010/0015133호; 미국 특허 출원 공개 제2009/0182127호; 미국 특허 출원 공개 제2010/028637호 또는 미국 특허 출원 공개 제2011/0123532호에 기재된 바와 같다. 다른 전략에서는, 미국 특허 출원 공개 제2012/0149876호 또는 미국 특허 출원 공개 제2013/0195849호에 기재된 바와 같이 하기의 치환(제1 중쇄의 제1 CH3 도메인 내의 변형된 위치/제2 중쇄의 제2 CH3 도메인 내의 변형된 위치로서 표현됨)에 의해 이종이량체화가 촉진될 수 있다: L351Y_F405A_Y407V/T394W, T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V, T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V, L351Y_Y407A/T366A_K409F, L351Y_Y407A/T366V_K409F, Y407A/T366A_K409F, 또는 T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W.
전술된 방법에 더하여, 이중특이성 항체는, 2개의 단일특이성 동종이량체성 항체의 CH3 영역 내에 비대칭 돌연변이를 도입시키고, 이황화물 결합 이성질화를 가능하게 하는 환원성 조건에서 2개의 모 단일특이성 동종이량체성 항체로부터 이중특이성 이종이량체성 항체를 형성함으로써 무세포 환경에서 시험관내에서 생성될 수 있는데, 이는 국제 특허 출원 공개 WO2011/131746호에 기재된 방법에 따른 것이다. 이들 방법에서, 제1 단일특이성 2가 항체 및 제2 단일특이성 2가 항체는 CH3 도메인에서 이종이량체 안정성을 촉진하는 소정의 치환을 갖도록 조작되며; 이들 항체는 힌지 영역 내의 시스테인이 이황화물 결합 이성질화를 거칠 수 있게 하기에 충분한 환원성 조건 하에서 함께 인큐베이션되고; 그럼으로써 Fab 아암 교환에 의해 이중특이성 항체를 생성한다. 인큐베이션 조건은 비환원성 상태로 최적으로 회복될 수 있다. 사용될 수 있는 예시적인 환원제는 2-메르캅토에틸아민(2-MEA), 다이티오트레이톨(DTT), 다이티오에리트리톨(DTE), 글루타티온, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP), L-시스테인 및 베타-메르캅토에탄올이며, 바람직하게는 환원제는 2-메르캅토에틸아민, 다이티오트레이톨 및 트리스(2-카르복시에틸)포스핀으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예를 들어, pH 5 내지 8에서, 예를 들어 pH 7.0에서 또는 pH 7.4에서 적어도 25 mM 2-MEA의 존재 하에서 또는 적어도 0.5 mM 다이티오트레이톨의 존재 하에서 20℃ 이상의 온도에서 90분 이상 동안의 인큐베이션이 사용될 수 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 항체 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 넘버링은, 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]에 기재된 바와 같이 EU 인덱스에 따라 수행된다.
접합체
일반적인 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 포함하는 접합체에 관한 것으로, 상기 항체는 약제학적으로 활성인 모이어티, 예컨대 합성 치료적 펩티드(예를 들어, 사이클릭 PYY 펩티드)에 부위-특이적 방식으로 공유적으로 접합되어, 항체 커플링된 펩티드가 펩티드 단독과 대비하여 연장/증가된 반감기를 갖도록 한다. 본 발명은 또한 약제학적 조성물 및 이의 사용 방법에 관한 것이다. 접합체는 질병 또는 장애, 특히 비만, 제2형 당뇨병, 대사 증후군(즉, 증후군 X), 인슐린 저항성, 내당능 장애(예를 들어, 당불내성), 고혈당증, 고인슐린혈증, 고트라이글리세라이드혈증, 선천성 고인슐린증(CHI)으로 인한 저혈당증, 이상지질혈증, 죽상경화증, 당뇨병성 신장병증, 및 다른 심혈관 위험 인자, 예컨대 고혈압 및 관리되지 않은 콜레스테롤 및/또는 지질 수준과 관련된 심혈관 위험 인자, 골다공증, 염증, 비알코올성 지방간 질병(NAFLD), 비알코올성 지방성 간염(NASH), 신장 질병, 및 습진을 예방, 치료, 또는 개선하기에 유용하다.
소정 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 약제학적으로 활성인 모이어티에 접합되어 약제학적으로 활성인 모이어티의 반감기를 연장/증가시킬 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기 치환을 포함하도록 변형된다. 소정 실시 형태에서, 적어도 하나의 시스테인 잔기 치환은 항체의 상보성 결정 영역 내에 포함되어 있다. 소정 실시 형태에서, 적어도 하나의 시스테인 잔기 치환은 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 내에 있다. 소정 실시 형태에서, 적어도 하나의 시스테인 잔기 치환은 HCDR3 내에 있으며, HCDR3은 서열 번호 143의 아미노산 서열을 포함한다. 소정 실시 형태에서, 서열 번호 143의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 항체는 약제학적으로 활성인 모이어티에 접합될 수 있는 적어도 하나의 추가의 시스테인 치환을 가진다.
소정 실시 형태에서, 약제학적으로 활성인 모이어티는 링커를 포함할 수 있다. 링커는 약제학적으로 활성인 모이어티에 대한 항체의 접합을 가능하게 하도록 화학적으로 변형될 수 있다. 링커는, 예를 들어, 펩티드 링커, 탄화수소 링커, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 링커, 폴리프로필렌 글리콜(PPG) 링커, 다당류 링커, 폴리에스테르 링커, PEG 및 매립된 헤테로사이클로 이루어진 하이브리드 링커, 또는 탄화수소 사슬을 포함할 수 있지만 이로 한정되지 않는다. PEG 링커는, 예를 들어 2 내지 24개의 PEG 단위를 포함할 수 있다.
소정 실시 형태에서, 본 발명의 단일클론 항체는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 관심 약제학적으로 활성인 모이어티(예를 들어, 치료적 펩티드(들))에 접합된다. 바람직한 실시 형태에서, 비표적화 단일클론 항체는 2개의 관심 약제학적으로 활성인 모이어티에 접합된다. 단일클론 항체가, 적어도 2개의 관심 약제학적으로 활성인 모이어티에 접합되는 소정 실시 형태에서, 관심 약제학적으로 활성인 모이어티는 동일한 약제학적으로 활성인 모이어티일 수 있거나 상이한 약제학적으로 활성인 모이어티일 수 있다.
본 발명의 항체를 본 발명의 약제학적으로 활성인 모이어티와 접합하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 간략하게 말하면, 본 발명의 항체는 환원제(예를 들어, TCEP(트리스(2-카르복시에틸) 포스핀)에 의해 환원되고, (예를 들어, 단백질 A 흡착 또는 겔 여과에 의해) 정제되고, (예를 들어, 접합을 가능하게 하는 조건 하에서 환원된 항체에 동결건조된 펩티드를 제공함으로써) 약제학적으로 활성인 모이어티와 접합될 수 있다. 접합 반응 후, 접합체는 단백질 A 흡착의 최종 정제 단계를 사용하여 이온 교환 크로마토그래피 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에 의해 정제될 수 있다. 소정 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 HIC 방법을 이용하여 환원되기 전에 정제될 수 있다. 접합 방법에 관한 더 상세한 설명에 대해서는, 예를 들어, 실시예 103 및 문헌[Dennler et al., Antibodies 4:197-224 (2015)]을 참조한다.
사이클릭 PYY 펩티드에 커플링된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 접합체가 본 명세서에 제공되며, 상기 사이클릭 PYY 펩티드는 화학식 I 또는 이의 유도체 또는 약제학적으로 허용되는 염으로 나타내고:
[화학식 I]
Figure 112019053646884-pct00036
(상기 식에서,
p는 0 또는 1이고;
m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고;
n은 1, 2, 3, 또는 4이고;
q는 0 또는 1이되; 단, Z30이 부재하는 경우에만 q가 1이고;
가교는 -Ph-CH2-S-, -트라이아졸릴-, -NHC(O)CH2S-, -SCH2C(O)NH-,
-(OCH2CH2)2NHC(O)CH2S, -NHC(O)-, 또는 -CH2S-이고;
Z4는 K, A, E, S, 또는 R이고;
Z7은 A 또는 K이고;
Z9는 G 또는 K이고;
Z11은 D 또는 K이고;
Z22는 A 또는 K이고;
Z23은 S 또는 K이고;
Z26은 A 또는 H이고;
Z30은 L, W, 부재, 또는 K이되;
단, q가 1인 경우에만 Z30이 부재하고;
Z34는
Figure 112019053646884-pct00037
또는
Figure 112019053646884-pct00038
이고;
Z35는
Figure 112019053646884-pct00039
,
Figure 112019053646884-pct00040
,
Figure 112019053646884-pct00041
, 또는
Figure 112019053646884-pct00042
임);
상기 유도체는 아미드화, 글리코실화, 카르바밀화, 황산화, 인산화, 환화, 지질화, 및 페길화로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 공정에 의해 개질된 화학식 I의 화합물이다.
소정 실시 형태에서, 사이클릭 PYY 펩티드는 아미드화, 지질화, 및 페길화로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 공정에 의해 개질된 화학식 I의 사이클릭 PYY 펩티드의 유도체, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
소정 실시 형태에서, 사이클릭 PYY 펩티드는,
p는 0 또는 1이고;
m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고;
n은 1, 2, 3, 또는 4이고;
q는 0 또는 1이되; 단, Z30이 부재하는 경우에만 q가 1이고;
가교는 -Ph-CH2-S-, -트라이아졸릴-, -NHC(O)CH2S-, -SCH2C(O)NH-,
-(OCH2CH2)2NHC(O)CH2S, -NHC(O)-, 또는 -CH2S-이고;
Z4는 K, A, E, S, 또는 R이고;
Z7은 A 또는 K이며, 상기 K의 아미노 측쇄는
Figure 112019053646884-pct00043
,
Figure 112019053646884-pct00044
,
Figure 112019053646884-pct00045
, 또는
Figure 112019053646884-pct00046
(여기서, i는 0 내지 24의 정수이고, X는 Br, I 또는 Cl임),
-C(O)CH2Br, -C(O)CH2I, 또는 -C(O)CH2Cl로 선택적으로 치환되고; Z9는 G 또는 K이며, 상기 K의 아미노 측쇄는
Figure 112019053646884-pct00047
(여기서, t는 0, 1, 또는 2이고;
u는 0 또는 1이고;
v는 14, 16, 또는 18임),
Figure 112019053646884-pct00048
,
Figure 112019053646884-pct00049
,
Figure 112019053646884-pct00050
,
Figure 112019053646884-pct00051
,
Figure 112019053646884-pct00052
,
Figure 112019053646884-pct00053
,
Figure 112019053646884-pct00054
,
Figure 112019053646884-pct00055
,
Figure 112019053646884-pct00056
,
Figure 112019053646884-pct00057
(여기서, i는 0 내지 24의 정수이고, X는 Br, I 또는 Cl임), C(O)CH2Br, -C(O)CH2I, 또는 -C(O)CH2Cl로 선택적으로 치환되고;
Z11은 D 또는 K이며, 상기 K의 아미노 측쇄는
Figure 112019053646884-pct00058
(여기서, w는 0, 1, 2, 또는 4이고;
x는 0 또는 1이고;
y는 14, 16, 또는 18임),
Figure 112019053646884-pct00059
,
Figure 112019053646884-pct00060
,
Figure 112019053646884-pct00061
,
Figure 112019053646884-pct00062
(여기서, i는 0 내지 24의 정수이고, X는 Br, I 또는 Cl임),
Figure 112019053646884-pct00063
,
Figure 112019053646884-pct00064
,
Figure 112019053646884-pct00065
,
Figure 112019053646884-pct00066
,
Figure 112019053646884-pct00067
,
Figure 112019053646884-pct00068
, -C(O)CH2I,
-C(O)CH2Cl 또는 -C(O)CH2Br로 선택적으로 치환되고;
Z22는 A 또는 K이며, 상기 K의 아미노 측쇄는
Figure 112019053646884-pct00069
,
Figure 112019053646884-pct00070
,
Figure 112019053646884-pct00071
,
또는
Figure 112019053646884-pct00072
(여기서, i는 0 내지 24의 정수이고, X는 Br, I 또는 Cl임), C(O)CH2Br, -C(O)CH2I, 또는 -C(O)CH2Cl로 선택적으로 치환되고;
Z23은 S 또는 K이며, 상기 K의 아미노 측쇄는
Figure 112019053646884-pct00073
,
Figure 112019053646884-pct00074
,
Figure 112019053646884-pct00075
,
또는
Figure 112019053646884-pct00076
(여기서, i는 0 내지 24의 정수이고, X는 Br, I 또는 Cl임), C(O)CH2Br, -C(O)CH2I, 또는 -C(O)CH2Cl로 선택적으로 치환되고;
Z26은 A 또는 H이고;
Z30은 L, W, 부재, 또는 K 이되; 단, q가 1인 경우에만 Z30이 부재하며, 상기 K의 아미노 측쇄는
Figure 112019053646884-pct00077
,
Figure 112019053646884-pct00078
,
Figure 112019053646884-pct00079
,
Figure 112019053646884-pct00080
,
Figure 112019053646884-pct00081
,
Figure 112019053646884-pct00082
,
Figure 112019053646884-pct00083
,
Figure 112019053646884-pct00084
(여기서, r은 0, 1, 또는 2이고;
s는 0 또는 1이고;
q는 14, 16, 또는 18임), 또는
Figure 112019053646884-pct00085
;
Figure 112019053646884-pct00086
;
Figure 112019053646884-pct00087
;
Figure 112019053646884-pct00088
;
Figure 112019053646884-pct00089
;
Figure 112019053646884-pct00090
;
Figure 112019053646884-pct00091
;
Figure 112019053646884-pct00092
;
Figure 112019053646884-pct00093
;
Figure 112019053646884-pct00094
;
Figure 112019053646884-pct00095
;
Figure 112019053646884-pct00096
;
Figure 112019053646884-pct00097
; 또는
Figure 112019053646884-pct00098
로 선택적으로 치환되고;
Z34는
Figure 112019053646884-pct00099
또는
Figure 112019053646884-pct00100
이고;
Z35는
Figure 112019053646884-pct00101
,
Figure 112019053646884-pct00102
,
Figure 112019053646884-pct00103
, 또는
Figure 112019053646884-pct00104
인 화학식 I 또는 이의 유도체 또는 약제학적으로 허용되는 염으로 나타낸다.
소정 실시 형태에서, 사이클릭 PYY 펩티드는,
p는 0 또는 1이고;
m은 0, 1, 2, 3, 또는 5이고;
n은 1, 2, 또는 4이고;
q는 0 또는 1이되; 단, Z30이 부재하는 경우에만 q가 1이고;
가교는 -Ph-CH2-S-, -트라이아졸릴-, -NHC(O)CH2S-, -SCH2C(O)NH-,
-(OCH2CH2)2NHC(O)CH2S, -NHC(O)-, 또는 -CH2S-이고;
Z4는 K, A, E, S, 또는 R이고;
Z7은 A 또는 K이며, 상기 K의 아미노 측쇄는
Figure 112019053646884-pct00105
,
Figure 112019053646884-pct00106
, 또는
Figure 112019053646884-pct00107
로 치환되고;
Z9는 G 또는 K이며, 상기 K의 아미노 측쇄는
Figure 112019053646884-pct00108
(여기서, t는 0이고;
u는 1이고;
v는 14임)로 치환되고;
Z11은 D 또는 K이며, 상기 K의 아미노 측쇄는
Figure 112019053646884-pct00109
(여기서, w는 0 또는 4이고;
x는 1이고;
y는 14임),
Figure 112019053646884-pct00110
,
Figure 112019053646884-pct00111
,
Figure 112019053646884-pct00112
,
Figure 112019053646884-pct00113
,
Figure 112019053646884-pct00114
,
Figure 112019053646884-pct00115
, -C(O)CH2Br,
Figure 112019053646884-pct00116
,
Figure 112019053646884-pct00117
,
Figure 112019053646884-pct00118
,
Figure 112019053646884-pct00119
로 치환되고;
Z22는 A 또는 K이며, 상기 K의 아미노 측쇄는
Figure 112019053646884-pct00120
,
Figure 112019053646884-pct00121
,
Figure 112019053646884-pct00122
로 치환되고;
Z23은 S 또는 K이며, 상기 K의 아미노 측쇄는
Figure 112019053646884-pct00123
, 또는
Figure 112019053646884-pct00124
로 치환되고;
Z26은 A 또는 H이고;
Z30은 L 또는 K이며, 상기 K의 아미노 측쇄는
Figure 112019053646884-pct00125
,
Figure 112019053646884-pct00126
,
Figure 112019053646884-pct00127
,
Figure 112019053646884-pct00128
,
Figure 112019053646884-pct00129
(여기서, r은 0 또는 2이고;
s는 1이고;
q는 14, 16, 또는 18임), 또는
Figure 112019053646884-pct00130
;
Figure 112019053646884-pct00131
;
Figure 112019053646884-pct00132
;
Figure 112019053646884-pct00133
;
Figure 112019053646884-pct00134
;
Figure 112019053646884-pct00135
;
Figure 112019053646884-pct00136
;
Figure 112019053646884-pct00137
;
Figure 112019053646884-pct00138
;
Figure 112019053646884-pct00139
;
Figure 112019053646884-pct00140
;
Figure 112019053646884-pct00141
;
Figure 112019053646884-pct00142
;
Figure 112019053646884-pct00143
로 치환되고;
Z34는
Figure 112019053646884-pct00144
또는
Figure 112019053646884-pct00145
이고;
Z35는
Figure 112019053646884-pct00146
,
Figure 112019053646884-pct00147
,
Figure 112019053646884-pct00148
, 또는
Figure 112019053646884-pct00149
인 화학식 I 또는 이의 유도체 또는 약제학적으로 허용되는 염으로 나타낸다.
소정 실시 형태에서, 접합체는 사이클릭 PYY 펩티드에 접합된 단일클론 항체 또는 이의 단편을 포함하며, 사이클릭 PYY 펩티드는 서열 번호 1-100 및 서열 번호 147-156으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시 형태에서, 접합체는 사이클릭 PYY 펩티드에 접합된 단일클론 항체 또는 이의 단편을 포함하며, 사이클릭 PYY 펩티드는 서열 번호 1, 서열 번호 73-100, 및 서열 번호 147-156으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
소정 실시 형태에서, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 링커를 통해 사이클릭 PYY 펩티드의 라이신 잔기에서 사이클릭 PYY 펩티드에 공유적으로 결합된다. 링커는, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)8-트라이아졸릴-CH2CH2CO-PEG4, 2 내지 24개의 PEG 단위의 PEG 사슬, 2 내지 10개의 탄소 원자를 함유하는 알킬 사슬, (Gly4Ser)j(여기서, J는 1 내지 4임), (AlaPro)u(여기서, u는 1 내지 10임), 또는 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에 따른 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 사이클릭 PYY 펩티드의 하나 이상의 아미노산 위치, 예컨대 PYY의 아미노산 잔기 4, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 30, 또는 31에서 사이클릭 PYY 펩티드에 접합될 수 있다. 아미노산 잔기 넘버링은 hPYY3-36의 것을 따른다. 소정 실시 형태에서, 화학식 I에서 Z7, Z9, Z11, Z22 및 Z23 중 단지 하나만이 라이신이고, 라이신은 링커를 통해 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 조작된 시스테인 잔기에 공유적으로 결합된다. 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 실시 형태에 따른 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 사이클릭 PYY 펩티드의 잔기 11에서 사이클릭 PYY 펩티드에 접합된다. 다른 바람직한 실시 형태에서, 친전자체, 예컨대 브로모아세트아미드 또는 말레이미드가 사이클릭 PYY의 측쇄, 예컨대 사이클릭 PYY의 잔기 11의 라이신의 아미노 측쇄 상에 도입되고, 친전자체는 단일클론 항체 또는 이의 단편의, CDR, 바람직하게는 HCDR3 내로 조작된 Cys 잔기의 설프하이드릴 기와 특이적으로 반응하여, 사이클릭 PYY 펩티드와 단일클론 항체 또는 이의 단편 사이에 공유 결합을 생성한다. 더 바람직하게는, 사이클릭 PYY 펩티드는 서열 번호 1, 서열 번호 73-100, 및 서열 번호 147-156으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 친전자체는 직접적으로 사이클릭 PYY의 측쇄 상에 도입된다. 다른 실시 형태에서, 친전자체는 링커를 통해 간접적으로 사이클릭 PYY의 측쇄 상에 도입된다.
또한, 본 발명의 접합체를 포함하고, 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
또한, 사이클릭 PYY 펩티드에 커플링된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 접합체가 제공되며, 상기 접합체는 각각 화학식 IIIa-b, 화학식 IVa-b, 화학식 Va-b, 및/또는 화학식 VIa-b로 나타낸다.
[화학식 IIIa]
Figure 112019053646884-pct00150
[화학식 IIIb]
Figure 112019053646884-pct00151
[화학식 IVa]
Figure 112019053646884-pct00152
[화학식 IVb]
Figure 112019053646884-pct00153
[화학식 Va]
Figure 112019053646884-pct00154
[화학식 Vb]
Figure 112019053646884-pct00155
[화학식 VIa]
Figure 112019053646884-pct00156
[화학식 VIb]
Figure 112019053646884-pct00157
화학식 IIIa-b, 화학식 IVa-b, 화학식 Va-b, 및 화학식 VIa-b에서,
x는, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6, 바람직하게는 2일 수 있고;
Link1은, 예를 들어 G, βA, -COCH2OCH2CH2OCH2CH2NH-, γ-아미노부타노일, GG, -CO(CH2)mSCH2-(단, Link2가 -NH-인 경우, m은 1, 2임) 또는 결합일 수 있고;
Link2는, 예를 들어 -CH2-, 벤질, 에틸트라이아졸릴, -NH-, 또는 결합일 수 있고;
n은, 예를 들어 1, 2, 또는 3일 수 있고;
X는, 예를 들어 -S- 또는 -CH2-일 수 있고;
Z3은, 예를 들어 I 또는 결합일 수 있고;
Z4는, 예를 들어 K, S, 또는 R일 수 있고;
Z30은, 예를 들어 L, W, K(mPEG16), 또는 K(mPEG12)일 수 있고;
Z34는, 예를 들어 Q일 수 있으며, 상기 Q는 선택적으로 알파-아미드 질소 상에서 N-메틸화되고;
Z35는, 예를 들어 R일 수 있으며, 상기 R은 선택적으로 알파-아미드 질소 상에서 N-메틸화되거나, 또는 R은 탈카르보닐화되어 psi-(Z35Z36) 아미드 결합을 생성하거나, 또는 R은 알파-아미드 질소 상에서 N-메틸화되고 또한 탈카르보닐화되어 psi-(Z35Z36) 아미드 결합을 생성하고;
Z36은, 예를 들어 Y(Tyr), Cha(β-사이클로헥실알라닌), Aic(2-아미노인단-2-카르복실산) 또는 F(Phe)일 수 있으며, 상기 F는 플루오로(4-F-Phe), 클로로(4-Cl-Phe), 브로모(4-Br-Phe), 요오도(4-I-Phe), 아미노(4-NH2-Phe)로 선택적으로 파라-치환되고;
Link3은, 예를 들어, 라이신 측쇄에 대한 하기 아미드화: (PEG)8-트라이아졸릴-CH2CH2CO-PEG4(
Figure 112019053646884-pct00158
를 포함함), 2 내지 24개의 PEG 단위의 PEG 사슬(
Figure 112019053646884-pct00159
를 포함함), 2 내지 10개의 탄소 원자를 함유하는 알킬 사슬(
Figure 112019053646884-pct00160
를 포함함), (Gly4Ser)j(여기서, j는 1 내지 4임), (AlaPro)u(여기서, u는 1 내지 10임) 중 임의의 것을 포함할 수 있거나, 또는 -NH-Link3-은 결합에 의해 대체될 수 있다.
또한, 링커(L)를 통해 사이클릭 PYY 펩티드(cPYY)에 커플링된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편(mAb)을 포함하는 접합체: cPYY-L]2-mAb가 제공되며, 상기 접합체는 서열 번호 102-127로 이루어진 군으로부터 선택되는 사이클릭 PYY 서열 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하며, 여기서 mAb는 본 발명의 일 실시 형태에 따른 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 나타내고, ]2는 1개 또는 2개의 사이클릭 PYY 펩티드가 mAb에 공유적으로 접합됨을 나타낸다.
또한, 인간 PYY3-36(hPYY(3-36))과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 서열 동일성을 나타내는 PYY의 N-말단-측쇄(N-terminus to side chain) 사이클릭 유사체가 본 명세서에 제공된다. 2개의 유사체 사이의 서열 동일성을 결정하기 위한 방법의 예로서, 2개의 펩티드
Figure 112019053646884-pct00161
(서열 번호 1)과 hPYY3-36
Figure 112019053646884-pct00162
(서열 번호 101)을 정렬시킨다. hPYY(3-36)에 대한 유사체의 서열 동일성은 [정렬된 잔기의 총수 - 상이한 잔기의 수](즉, 정렬된 동일한 잔기의 수) / [hPYY3-36 내의 잔기의 총수]로 주어진다. 이 예에서, 상이한 잔기들은 D11(이는 치환된 K11로 교환되었음), 이어서 V31(이는 hC31로 교환되었음), 그리고 마지막으로 R35(이는 탈카르보닐화되었음)이다. 따라서, 상기 예에서, 서열 동일성은 (34-3)/34 × 100 이다.
사이클릭 PYY 펩티드
PYY3-36은 음식 섭취량을 억제하도록 Y2 수용체의 효능제로서 작용하는 원위 장(distal gut) 내의 L 세포에 의해 분비되는 내인성 호르몬이다. 포유동물에서의 식욕 및 음식 섭취량을 제어하는 데 있어서의 역할뿐만 아니라 포유동물에서의 위장관에서의 항분비 및 흡수촉진 효과를 고려하면, PYY3-36은 비만 및 관련 질환을 치료하는 데 있어서뿐만 아니라 다수의 위장 장애에도 효과적일 수 있다. 그러나, 치료제로서의 PYY3 ―36 자체의 치료적 유용성은 그의 급속한 대사 및 짧은 순환 반감기에 의해 제한된다. 따라서, 본 발명은 대체로 변형된 PYY3 -36 접합체에 관한 것으로, 상기 접합체는 PYY3-36 펩티드의 반감기를 연장시키고 생체내에서의 펩티드의 대사를 감소시킨다.
본 발명의 소정 실시 형태에서, 변형된 PYY3-36 펩티드는 사이클릭 PYY 펩티드이다. 용어 "사이클릭 PYY 펩티드", "사이클릭 PYY3-36 유사체", 및 "사이클릭 PYY3-36 펩티드 유사체"는 상호교환 가능하게 사용될 수 있다. 접합체에 사용될 수 있는 사이클릭 PYY 펩티드의 예는 2016년 10월 27일자로 출원된 미국 특허 출원 제62/413,613호, 및 대리인 문서 번호 PRD3411을 갖는, 이 출원과 동일자로 출원된 발명의 명칭이 "Cyclic peptide tyrosine tyrosine compounds as modulators of neuropeptide receptors"인 미국 특허 출원 제______호에 기재되어 있으며, 이들 두 출원 모두의 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "NTSC-PYY"는 PYY의 N-말단-측쇄 사이클릭 유사체를 기술하고자 한다.
본 명세서에 기재된 펩티드 서열은 펩티드의 N-말단 영역은 좌측에 있고 C-말단 영역은 우측에 있다는 통상의 규약에 따라 표기된다. 아미노산의 이성질체 형태가 공지되어 있지만, 이는, 달리 명시적으로 지시되지 않는 한, 표현된 아미노산의 L-형태이다. 본 발명의 분자를 설명하는 데 있어서 편의상, 다양한 아미노산(단일 문자 코드 및 3-문자 코드 둘 모두) 및 기능적 모이어티에 대한 통상적인 약어 및 비통상적인 약어가 사용된다. 이들 약어는 당업자에게 친숙하지만, 명확함을 위해 하기와 같이 열거된다: A = Ala = 알라닌; R = Arg = 아르기닌; N = Asn = 아스파라긴; D = Asp = 아스파르트산; βA = βAla = 베타-알라닌; C = Cys = 시스테인; hC = hCys = 호모시스테인; E = Glu = 글루탐산; Q = Gln = 글루타민; G = Gly = 글리신; H = His = 히스티딘; I = Ile = 아이소류신; L = Leu = 류신; K = Lys = 라이신; Nle = 노르류신; F = Phe = 페닐알라닌; P = Pro = 프롤린; S = Ser = 세린; T = Thr = 트레오닌; W = Trp = 트립토판; Y = Tyr = 티로신 및 V = Val = 발린.
편의상, 본 발명의 NTSC-PYY 펩티드를 명명하는 데 사용된 아미노산 잔기 넘버링 규약은 hPYY3-36의 것을 따른다. hPYY3-36 내의 상응하는 위치에서의 천연 잔기와 대비하여, NTSC-PYY 펩티드 내로 도입된 특정 아미노산 대체는 적절한 아미노산 코드로 표시되고, 이어서 치환의 위치가 표시된다. 따라서, NTSC-PYY 펩티드 내의 "S4"는 세린이 hPYY3-36의 상응하는 천연 lys4 잔기를 대체한 펩티드를 지칭한다. 유사하게, NTSC-PYY 펩티드 내의 "hC31"은 호모시스테인이 hPYY3-36의 상응하는 천연 val31 잔기를 대체한 펩티드를 지칭한다. NTSC-PYY 펩티드 내에서 발생하는 추가의 아미노산 대체는 이러한 규약에 따라 기재되어 있으며, 당업자에 의해 그러한 것으로 인식될 것이다.
또한 편의상, 본 발명의 NTSC-PYY 펩티드에 사용되는 명명 규칙은 사이클에 관여하는 아미노산 잔기들과 함께, 사이클에 관여하는 N-말단 잔기에서 출발하여, 좌측에서 우측 방향으로의 이들 사이의 연결기(들)를 포함시킨다. 모든 경우에, 사이클의 N-말단 아미노산 잔기는 그의 α-아미노 작용기에 의해 연결기에 연결되고, 이는 다시, NTSC-PYY 펩티드의 위치 31의 아미노산의 측쇄 잔기에 연결된다. 따라서, "사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31)"은 Ile3의 α-아미노 작용기가 메타-톨루산 잔기에 의해 아실화되고, 이의 메틸 기는 티오에테르 결합에 의해 hCys31 잔기의 측쇄에 추가로 연결된 NTSC-PYY 펩티드의 사이클을 기술하는데 사용된다. 유사하게, "사이클로-(K4-CO(CH2)2NHCOCH2-hC31)"은, 천연 Ile3 잔기가 결실되어 있고 (현재 N-말단) lys4의 α-아미노 작용기가 3-아세트아미도프로파노일 기에 의해 아실화되고, 그의 아세트아미도 메틸렌 탄소는 티오에테르 결합에 의해 hCys31 잔기의 측쇄에 연결된 NTSC-PYY 펩티드의 사이클을 기술하는 데 사용된다.
추가의 유도체화를 위한 편리한 기능적 취급을 제공하기 위하여, 라이신 잔기가 hPYY3-36 서열의 다양한 위치에 도입될 수 있다. 라이신 잔기는 단일클론 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링되도록 변형될 수 있다. 단일클론 항체에 대한 간접 커플링에서, 라이신 잔기는 사이클릭 PYY 펩티드가 단일클론 항체에 커플링될 수 있게 할 링커를 포함하도록 변형될 수 있다. 당업자는 관련된 오르토로그가 또한 그 자체로 효과적으로 사용될 수 있고 본 명세서에 고려된다는 것을 인식할 것이다.
펩티드 서열에서 나타나는 용어 "K(γ-Glu)"는 측쇄 ε-아미노 기가 글루탐산의 γ-카르복실 기에 의해 아실화된 라이신 잔기를 나타낸다.
용어 "K(γ-Glu-Pal(팔미토일))"은 측쇄 ε-아미노 기가 N-헥사데칸-1-오일글루탐산의 γ-카르복실 기에 의해 아실화된 라이신 잔기를 나타낸다.
용어 "K(γ-Glu-Stear(스테아로일))"는 측쇄 ε-아미노 기가 N-옥타데칸-1-오일글루탐산의 γ-카르복실 기에 의해 아실화된 라이신 잔기를 나타낸다.
용어 "K(γ-Glu-Arach(아라키도일))"은 측쇄 ε-아미노 기가 N-도데칸-1-오일글루탐산의 γ-카르복실 기에 의해 아실화된 라이신 잔기를 나타낸다.
용어 "K(OEG) (8-아미노-3,6-다이옥사옥타노일)"은 측쇄 ε-아미노 기가 8-아미노-3,6-다이옥사옥탄산에 의해 아실화된 라이신 잔기를 나타낸다.
용어 "(OEG)2"는 아미드 결합을 통해 연속해서 함께 연결된 2개의 OEG 단위(즉, 17-아미노-10-옥소-3,6,12,15-테트라옥사-9-아자헵타데칸산)를 나타낸다.
용어 "K(OEG)2"는 측쇄 ε-아미노 기가 17-아미노-10-옥소-3,6,12,15-테트라옥사-9-아자헵타데칸산에 의해 아실화된 라이신 잔기를 나타낸다.
용어 "K((OEG)2-γ-Glu"는 측쇄 ε-아미노 기가 (22S)-22-아미노-10,19-다이옥소-3,6,12,15-테트라옥사-9,18-다이아자트라이코산이산에 의해 그의 1-카르복실산 작용기를 통해 아실화된 라이신 잔기를 나타낸다.
용어 "K((OEG)2-γ-Stear"는 측쇄 ε-아미노 기가 (22S)-10,19-다이옥소-22-스테아르아미도-3,6,12,15-테트라옥사-9,18-다이아자트라이코산이산에 의해 그의 1-카르복실산 작용기를 통해 아실화된 라이신 잔기를 나타낸다.
용어 "K((OEG)2-γ-Glu-COC16CO2H"는 측쇄 ε-아미노 기가 (21S)-9,18,23-트라이옥소-2,5,11,14-테트라옥사-8,17,22-트라이아자노나트라이아콘탄-1,21,39-트라이카르복실산에 의해 그의 1-카르복실산 작용기를 통해 아실화된 라이신 잔기를 나타낸다.
유사하게, 용어 "K((OEG)2- γ -Glu-COC18CO2H"는 측쇄 ε-아미노 기가 (21S)-9,18,23-트라이옥소-2,5,11,14-테트라옥사-8,17,22-트라이아자헨테트라콘탄-1,21,41-트라이카르복실산에 의해 그의 1-카르복실산 작용기를 통해 아실화된 라이신 잔기를 나타낸다.
용어 "K((OEG)2-COC16CO2H)"는 측쇄 ε-아미노 기가 10,19-다이옥소-3,6,12,15-테트라옥사-9,18-다이아자헥사트라이아콘탄이산에 의해 그의 1-카르복실산 작용기를 통해 아실화된 라이신 잔기를 나타낸다.
용어 "K(PEG24-AcBr)"은 측쇄 ε-아미노 기가 N-브로모아세틸-75-아미노-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73-테트라코사옥사펜타헵타콘탄산에 의해 그의 1-카르복실산 작용기를 통해 아실화된 라이신 잔기를 나타낸다.
용어 "K(PEG12-AcBr)"은 측쇄 ε-아미노 기가 N-브로모아세틸-39-아미노-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사노나트라이아콘탄산에 의해 그의 1-카르복실산 작용기를 통해 아실화된 라이신 잔기를 나타낸다.
용어 "K(PEG6-AcBr)"은 측쇄 ε-아미노 기가 N-브로모아세틸-3-[(17-아미노-3,6,9,12,15-펜타옥사헵타데크-1-일)옥시]-프로판산에 의해 그의 1-카르복실산 작용기를 통해 아실화된 라이신 잔기를 나타낸다.
용어 "K(PEG8-트라이아졸릴-CH2CH2CO-PEG4-AcBr)"은 측쇄 -아미노 기가 27-[4-[2-[3-[2-[2-[3-(N-브로모아세틸아미노)프로폭시]에톡시]에톡시]프로필아미노카르보닐]에틸]테트라졸-1-일]-4,7,10,13,16,19,22,25-옥타옥사헵타코산산에 의해 그의 1-카르복실산 작용기를 통해 아실화된 라이신 잔기를 나타낸다.
용어 "K(mPEG16)"은 측쇄 ε-아미노 기가 4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49-헥사데카옥사펜타콘탄산에 의해 그의 1-카르복실산 작용기를 통해 아실화된 라이신 잔기를 나타낸다.
용어 "K(mPEG12)"는 측쇄 ε-아미노 기가 4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사옥타트라이아콘탄산에 의해 그의 1-카르복실산 작용기를 통해 아실화된 라이신 잔기를 나타낸다.
용어 "VitE"는 분자 내의 α-토코페롤릴 단위를 나타낸다.
용어 "AcVitE"는 페놀성 기가 에테르-결합된 메틸레닐카르복시 작용기를 갖는 α-토코페롤릴 단위를 나타낸다.
용어 "K-γ-Glu-AcVitE"는 측쇄 ε-아미노 기가 (2-(((2R)-2,5,7,8-테트라메틸-2-((4R,8R)-4,8,12-트라이메틸트라이데실)크로만-6-일)옥시)아세틸)-L-글루탐산에 의해 그의 γ-카르복실산 작용기를 통해 아실화된 라이신 잔기를 나타낸다.
본 발명의 화합물들/접합체들 중 다수는 서열의 C-말단 잔기, Y36과 그의 인접한 잔기, R35 사이에 환원된 아미드 결합을 도입하고 있다. 이러한 환원된 아미드 결합은 용어 "psi-(R35,Y36)"로 나타낸다.
본 발명의 소정 서열을 포함하는 다양한 아미노산 잔기는 메틸화된 α-아미노 기를 함유한다. 따라서, 용어 "N-Me-Q34" 또는 "N-Me-R35"는 서열의 위치 34에서 α-N-메틸화된 글루타민, 및 서열의 위치 35에서 α-N-메틸화된된 아르기닌을 각각 나타낸다.
서열 설명에서 용어 "N-Me-Q34, psi-(R35,Y36)"은 위치 34에서의 α-메틸 글루타민 잔기뿐만 아니라 잔기 R35와 Y36 사이의 환원된 아미드 결합 둘 모두를 함유하는 서열을 지칭한다.
유사하게, 서열 설명에서 용어 "N-Me-R35, psi-(R35,Y36)"은 위치 35에서의 α-메틸 아르기닌 잔기뿐만 아니라 이 잔기와 Y36 사이의 환원된 아미드 결합 둘 모두를 함유하는 서열을 지칭한다.
반감기 연장 모이어티
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 더하여, 본 발명의 접합체는, 예를 들어 공유적 상호작용을 통해, 약제학적으로 활성인 모이어티(예를 들어, 사이클릭 PYY 펩티드)의 반감기를 연장시키기 위한 하나 이상의 다른 모이어티를 도입하고 있을 수 있다. 예시적인 다른 반감기 연장 모이어티는 알부민, 알부민 변이체, 알부민-결합 단백질 및/또는 도메인, 트랜스페린 및 이의 단편 및 유사체를 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 원하는 특성을 위해 본 발명의 접합체 내로 도입될 수 있는 추가의 반감기 연장 모이어티는, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자, 예컨대 PEG5000 또는 PEG20,000, 상이한 사슬 길이의 지방산 및 지방산 에스테르, 예를 들어 라우레이트, 미리스테이트, 스테아레이트, 아라키데이트, 베헤네이트, 올레에이트, 아라키도네이트, 옥탄이산, 테트라데칸이산, 옥타데칸이산, 도코산이산 등, 폴리라이신, 옥탄, 탄수화물(덱스트란, 셀룰로스, 올리고당 또는 다당)을 포함할 수 있다. 이들 모이어티는 단백질 스캐폴드 코딩 서열과의 직접 융합체일 수 있으며, 표준 클로닝 및 발현 기법에 의해 생성될 수 있다. 대안적으로, 잘 알려진 화학적 커플링 방법을 사용하여, 본 발명의 재조합적으로 그리고 화학적으로 생성된 접합체에 이러한 모이어티를 부착할 수 있다.
예를 들어, 시스테인 잔기를 본 발명의 펩티드 분자의 C-말단에 도입시키고 잘 알려진 방법을 사용하여 페길 기를 시스테인에 부착함으로써, 페길 모이어티가 본 발명의 펩티드 분자에 부가될 수 있다.
추가 모이어티를 도입시킨 본 발명의 펩티드 분자는 몇몇 잘 알려진 검정에 의해 기능성에 대해 비교될 수 있다. 예를 들어, 단독으로의 또는 본 발명에 따른 접합체 형태의 관심 치료적 펩티드의 생물학적 또는 약동학적 활성은 공지된 시험관내(in vitro) 또는 생체내 검정을 사용하여 검정되고 비교될 수 있다.
약제학적 조성물
다른 일반적인 태양에서, 본 발명은 본 발명의 접합체 및 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적 조성물"은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 본 발명의 접합체를 포함하는 생성물을 의미한다. 본 발명의 접합체 및 화합물 및 이를 포함하는 조성물은 또한 본 명세서에 언급된 치료적 응용을 위한 약제의 제조에 유용하다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "담체"는 임의의 부형제, 희석제, 충전제, 염, 완충제, 안정화제, 가용화제, 오일, 지질, 지질 함유 베시클, 미소구체, 리포좀 캡슐화, 또는 약제학적 제형에 사용하기 위한 당업계에 잘 알려진 다른 물질을 지칭한다. 담체, 부형제, 또는 희석제의 특성은 특정 응용을 위한 투여 경로에 좌우될 것임이 이해될 것이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 본 발명에 따른 조성물의 유효성 또는 본 발명에 따른 조성물의 생물학적 활성을 방해하지 않는 비독성 물질을 지칭한다. 특정 실시 형태에 따르면, 본 개시내용을 고려하여, 항체 약제학적 조성물에 사용하기에 적합한 임의의 약제학적으로 허용되는 담체가 본 발명에 사용될 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 약제학적으로 허용되는 산성/음이온성 염은 아세테이트, 벤젠설포네이트, 벤조에이트, 바이카르보네이트, 바이타르트레이트, 브로마이드, 칼슘 에데테이트, 캄실레이트, 카르보네이트, 클로라이드, 시트레이트, 다이하이드로클로라이드, 에데테이트, 에디실레이트, 에스톨레이트, 에실레이트, 푸마레이트, 글리셉테이트, 글루코네이트, 글루타메이트, 글리콜릴아르사닐레이트, 헥실레조시네이트, 하이드라바민, 하이드로브로마이드, 하이드로클로라이드, 하이드록시나프토에이트, 요오다이드, 이세티오네이트, 락테이트, 락토바이오네이트, 말레이트, 말레에이트, 만델레이트, 메실레이트, 메틸브로마이드, 메틸니트레이트, 메틸설페이트, 뮤케이트, 나프실레이트, 니트레이트, 파모에이트, 판토테네이트, 포스페이트/다이포스페이트, 폴리갈락투로네이트, 살리실레이트, 스테아레이트, 서브아세테이트, 석시네이트, 설페이트, 탄네이트, 타르트레이트, 테오클레이트, 토실레이트 및 트라이에티오다이드를 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 유기 또는 무기 산은 또한 요오드화수소산, 과염소산, 황산, 인산, 프로피온산, 글리콜산, 메탄설폰산, 하이드록시에탄설폰산, 옥살산, 2-나프탈렌설폰산, p-톨루엔설폰산, 사이클로헥산설팜산, 사카린산 또는 트라이플루오로아세트산을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
약제학적으로 허용되는 염기성/양이온성 염은 알루미늄, 2-아미노-2-하이드록시메틸-프로판-1,3-다이올(트리스(하이드록시메틸)아미노메탄, 트로메탄 또는 "TRIS"로도 알려져 있음), 암모니아, 벤자틴, t-부틸아민, 칼슘, 클로로프로카인, 콜린, 사이클로헥실아민, 다이에탄올아민, 에틸렌다이아민, 리튬, L-라이신, 마그네슘, 메글루민, N-메틸-D-글루카민, 피페리딘, 칼륨, 프로카인, 퀴닌, 나트륨, 트라이에탄올아민, 또는 아연을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
본 발명의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 접합체를 약 0.001 mg/ml 내지 약 100 mg/ml, 약 0.01 mg/ml 내지 약 50 mg/ml, 또는 약 0.1 mg/ml 내지 약 25 mg/ml의 양으로 포함하는 약제학적 제형이 제공된다. 약제학적 제형은 pH가 약 3.0 내지 약 10, 예를 들어 약 3 내지 약 7, 또는 약 5 내지 약 9일 수 있다. 제형은 완충 시스템, 방부제(들), 장성제(tonicity agent)(들), 킬레이트제(들), 안정화제(들) 및 계면활성제(들)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 성분을 추가로 포함할 수 있다.
약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약제학적으로 활성인 성분의 제형은 당업계에, 예를 들어 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy (e.g. 21st edition (2005), and any later editions)]에 공지되어 있다. 추가의 성분의 비제한적인 예에는 완충제, 희석제, 용매, 장성 조절제, 방부제, 안정화제, 및 킬레이트제가 포함된다. 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체가 본 발명의 약제학적 조성물을 제형화하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 약제학적 조성물은 액체 제형이다. 액체 제형의 바람직한 예는 수성 제형, 즉 물을 포함하는 제형이다. 액체 제형은 용액, 현탁액, 에멀젼, 마이크로에멀젼, 겔 등을 포함할 수 있다. 수성 제형은 전형적으로 적어도 50% w/w의 물, 또는 적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95% w/w의 물을 포함한다.
일 실시 형태에서, 약제학적 조성물은, 예를 들어 주사 장치(예를 들어, 주사기 또는 주입 펌프)를 통해 주사될 수 있는 주사제로서 제형화될 수 있다. 주사는, 예를 들어 피하, 근육내, 복막내, 또는 정맥내 전달될 수 있다.
다른 실시 형태에서, 약제학적 조성물은 고체 제형, 예를 들어 냉동-건조 또는 분무-건조된 조성물이며, 이것은 그대로 사용될 수 있거나, 또는 이것에 의사 또는 환자가 사용 전에 용매 및/또는 희석제를 첨가한다. 고체 투여 형태는 정제, 예컨대 압축 정제, 및/또는 코팅된 정제, 및 캡슐(예를 들어, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐)을 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 또한, 예를 들어 사셰(sachet), 당의정, 분말, 과립, 로젠지(lozenge), 또는 재구성을 위한 분말의 형태일 수 있다.
투여 형태는 즉시 방출(이 경우에, 이들은 수용성 또는 수분산성 담체를 포함할 수 있음)일 수 있거나, 또는 이들은 지연 방출, 지속 방출, 또는 조절 방출(이 경우에, 이들은 위장관에서의 투여 형태의 용해 속도를 조절하는 수불용성 중합체를 포함할 수 있음)일 수 있다.
다른 실시 형태에서, 약제학적 조성물은 비강내, 협측내, 또는 설하 전달될 수 있다.
수성 제형 중의 pH는 pH 3 내지 pH 10일 수 있다. 본 발명의 일 실시 형태에서, 제형의 pH는 약 7.0 내지 약 9.5이다. 본 발명의 다른 실시 형태에서, 제형의 pH는 약 3.0 내지 약 7.0이다.
본 발명의 다른 실시 형태에서, 약제학적 조성물은 완충제를 포함한다. 완충제의 비제한적인 예에는 아르기닌, 아스파르트산, 바이신, 시트레이트, 인산수소이나트륨, 푸마르산, 글리신, 글리실글리신, 히스티딘, 라이신, 말레산, 말산, 소듐 아세테이트, 탄산나트륨, 인산이수소나트륨, 인산나트륨, 석시네이트, 타르타르산, 트라이신, 및 트리스(하이드록시메틸)-아미노메탄, 및 이들의 혼합물이 포함된다. 완충제는 약 0.01 mg/ml 내지 약 50 mg/ml, 예를 들어 약 0.1 mg/ml 내지 약 20 mg/ml의 농도로 개별적으로 또는 응집체로 존재할 수 있다. 이들 특정 완충제 각각을 포함하는 약제학적 조성물은 본 발명의 대안적인 실시 형태를 구성한다.
본 발명의 다른 실시 형태에서, 약제학적 조성물은 방부제를 포함한다. 완충제의 비제한적인 예에는 벤제토늄 클로라이드, 벤조산, 벤질 알코올, 브로노폴, 부틸 4-하이드록시벤조에이트, 클로로부탄올, 클로로크레졸, 클로로헥시딘, 클로르페네신, o-크레졸, m-크레졸, p-크레졸, 에틸 4-하이드록시벤조에이트, 이미드우레아, 메틸 4-하이드록시벤조에이트, 페놀, 2-페녹시에탄올, 2-페닐에탄올, 프로필 4-하이드록시벤조에이트, 소듐 데하이드로아세테이트, 티오메로살, 및 이들의 혼합물이 포함된다. 방부제는 약 0.01 mg/ml 내지 약 50 mg/ml, 예를 들어 약 0.1 mg/ml 내지 약 20 mg/ml의 농도로 개별적으로 또는 응집체로 존재할 수 있다. 이들 특정 방부제 각각을 포함하는 약제학적 조성물은 본 발명의 대안적인 실시 형태를 구성한다.
본 발명의 다른 실시 형태에서, 약제학적 조성물은 등장제(isotonic agent)를 포함한다. 실시 형태의 비제한적인 예에는 염(예컨대, 염화나트륨), 아미노산(예컨대, 글리신, 히스티딘, 아르기닌, 라이신, 아이소류신, 아스파르트산, 트립토판, 및 트레오닌), 알디톨(예컨대, 글리세롤, 1,2-프로판다이올 프로필렌글리콜, 1,3-프로판다이올, 및 1,3-부탄다이올), 폴리에틸렌글리콜(예를 들어, PEG400), 및 이들의 혼합물이 포함된다. 등장제의 다른 예는 당을 포함한다. 당의 비제한적인 예는 단당류, 이당류, 또는 다당류, 또는 수용성 글루칸(예를 들어, 프룩토스, 글루코스, 만노스, 소르보스, 자일로스, 말토스, 락토스, 수크로스, 트레할로스, 덱스트란, 풀루란, 덱스트린, 사이클로덱스트린, 알파 및 베타-HPCD, 가용성 전분, 하이드록시에틸 전분, 및 소듐 카르복시메틸셀룰로스를 포함함)일 수 있다. 등장제의 다른 예는 당 알코올이며, 여기서 용어 "당 알코올"은 적어도 하나의 -OH 기를 갖는 C(4-8) 탄화수소로서 정의된다. 당 알코올의 비제한적인 예에는 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 갈락티톨, 둘시톨, 자일리톨, 및 아라비톨이 포함된다. 이 단락에 열거된 각각의 등장제를 포함하는 약제학적 조성물은 본 발명의 대안적인 실시 형태를 구성한다. 등장제는 약 0.01 mg/ml 내지 약 50 mg/ml, 예를 들어 약 0.1 mg/ml 내지 약 20 mg/ml의 농도로 개별적으로 또는 응집체로 존재할 수 있다. 이들 특정 등장제 각각을 포함하는 약제학적 조성물은 본 발명의 대안적인 실시 형태를 구성한다.
본 발명의 다른 실시 형태에서, 약제학적 조성물은 킬레이트제를 포함한다. 킬레이트제의 비제한적인 예에는 시트르산, 아스파르트산, 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA)의 염, 및 이들의 혼합물이 포함된다. 킬레이트제는 약 0.01 mg/ml 내지 약 50 mg/ml, 예를 들어 약 0.1 mg/ml 내지 약 20 mg/ml의 농도로 개별적으로 또는 응집체로 존재할 수 있다. 이들 특정 킬레이트제 각각을 포함하는 약제학적 조성물은 본 발명의 대안적인 실시 형태를 구성한다.
본 발명의 다른 실시 형태에서, 약제학적 조성물은 안정화제를 포함한다. 안정화제의 비제한적인 예에는 하나 이상의 응집 억제제, 하나 이상의 산화 억제제, 하나 이상의 계면활성제, 및/또는 하나 이상의 프로테아제 억제제가 포함된다.
본 발명의 다른 실시 형태에서, 약제학적 조성물은 안정화제를 포함하며, 상기 안정화제는 카르복시-/하이드록시셀룰로스 및 이의 유도체(예컨대, HPC, HPC-SL, HPC-L 및 HPMC), 사이클로덱스트린, 2-메틸티오에탄올, 폴리에틸렌 글리콜(예컨대, PEG 3350), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리비닐 피롤리돈, 염(예컨대, 염화나트륨), 황-함유 물질, 예컨대 모노티오글리세롤), 또는 티오글리콜산이다. 안정제는 약 0.01 mg/ml 내지 약 50 mg/ml, 예를 들어 약 0.1 mg/ml 내지 약 20 mg/ml의 농도로 개별적으로 또는 응집체로 존재할 수 있다. 이들 특정 안정화제 각각을 포함하는 약제학적 조성물은 본 발명의 대안적인 실시 형태를 구성한다.
본 발명의 추가의 실시 형태에서, 약제학적 조성물은 하나 이상의 계면활성제, 바람직하게는 하나의 계면활성제, 적어도 하나의 계면활성제, 또는 2개의 상이한 계면활성제를 포함한다. 용어 "계면활성제"는 수용성(친수성) 부분 및 지용성(친유성) 부분으로 구성된 임의의 분자 또는 이온을 지칭한다. 계면활성제는, 예를 들어, 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제, 및/또는 쯔비터이온성 계면활성제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 계면활성제는 약 0.1 mg/ml 내지 약 20 mg/ml의 농도로 개별적으로 또는 응집체로 존재할 수 있다. 이들 특정 계면활성제 각각을 포함하는 약제학적 조성물은 본 발명의 대안적인 실시 형태를 구성한다.
본 발명의 추가의 실시 형태에서, 약제학적 조성물은 하나 이상의 프로테아제 억제제, 예컨대 EDTA, 및/또는 벤즈아미딘 염산(HCl)을 포함한다. 프로테아제 억제제는 약 0.1 mg/ml 내지 약 20 mg/ml의 농도로 개별적으로 또는 응집체로 존재할 수 있다. 이들 특정 프로테아제 억제제 각각을 포함하는 약제학적 조성물은 본 발명의 대안적인 실시 형태를 구성한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 조성물의 저장 동안 폴리펩티드의 응집체 형성을 감소시키기에 충분한 양의 아미노산 염기를 포함할 수 있다. 용어 "아미노산 염기"는 하나 이상의 아미노산(예컨대, 메티오닌, 히스티딘, 이미다졸, 아르기닌, 라이신, 아이소류신, 아스파르트산, 트립토판, 트레오닌), 또는 이들의 유사체를 지칭한다. 임의의 아미노산이 그의 유리 염기 형태 또는 그의 염 형태로 존재할 수 있다. 아미노산 염기의 임의의 입체이성질체(즉, L, D, 또는 이들의 혼합물)가 존재할 수 있다. 아미노산 염기는 약 0.01 mg/ml 내지 약 50 mg/ml, 예를 들어 약 0.1 mg/ml 내지 약 20 mg/ml의 농도로 개별적으로 또는 다른 아미노산 염기와의 배합물로 존재할 수 있다. 이들 아미노산 염기 각각을 포함하는 약제학적 조성물은 본 발명의 대안적인 실시 형태를 구성한다.
또한, 본 발명의 접합체 또는 이의 약제학적 조성물에 대한 치료적 유효 용량이 원하는 효과에 따라 달라질 것이라는 것은 당업자에게 명백하다. 따라서, 투여하고자 하는 최적 투여량은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 사용되는 특정 접합체, 투여 방식, 제제의 강도, 및 질병 상태의 진행도에 따라 변동될 것이다. 게다가, 대상체, 연령, 체중, 식이 및 투여 시간을 포함한, 치료되는 특정 대상체와 관련된 인자에 따라, 적절한 치료 수준으로 용량을 조정해야 할 것이다.
모든 적응증에 대하여, 본 발명의 접합체는 바람직하게는 단회 또는 분할 용량으로 하루에 약 1 ㎍ 내지 약 5 mg의 용량으로(예를 들어, 단회 용량은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10회의 하위용량으로 분할될 수 있음), 또는 용량당 약 0.01 ㎍/㎏ 내지 약 500 ㎍/㎏, 더 바람직하게는 약 0.05 ㎍/㎏ 내지 약 250 ㎍/㎏, 가장 바람직하게는 약 50 ㎍/㎏ 미만으로 말초적으로 투여된다. 이들 범위의 투여량은 물론 각각의 효능제의 효력(potency)에 따라 변동될 것이며, 당업자에 의해 용이하게 결정된다. 따라서, 상기 투여량은 평균적인 경우의 예이다. 물론 더 많거나 더 적은 투여량 범위가 유익한 개별적인 경우가 있을 수 있으며, 그러한 경우도 본 발명의 범주 내에 있다.
소정 실시 형태에서, 본 발명의 접합체는 약 1 ㎍ 내지 약 5 mg의 용량으로, 또는 약 0.01 ㎍/㎏ 내지 약 500 ㎍/㎏의 용량으로, 더 바람직하게는 약 0.05 ㎍/㎏ 내지 약 250 ㎍/㎏의 용량으로, 가장 바람직하게는 약 50 ㎍/㎏ 미만의 용량으로, 일정 용량의 제2 치료제(예를 들어, 리라글루타이드)와 함께 투여되며, 이때 제2 치료제는 약 1 ㎍ 내지 약 5 mg의 용량으로, 또는 약 0.01 ㎍/㎏ 내지 약 500 ㎍/㎏의 용량으로, 더 바람직하게는 약 0.05 ㎍/㎏ 내지 약 250 ㎍/㎏의 용량으로, 가장 바람직하게는 약 50 ㎍/㎏ 미만의 용량으로 투여된다.
본 발명의 접합체의 약제학적으로 허용되는 염은 무기 또는 유기 산 또는 염기로부터 형성되는 통상적인 비독성 염 또는 4차 암모늄 염을 포함한다. 그러한 산 부가 염의 예에는 아세테이트, 아디페이트, 벤조에이트, 벤젠설포네이트, 시트레이트, 캄포레이트, 도데실설페이트, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 락테이트, 말레에이트, 메탄설포네이트, 니트레이트, 옥살레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 석시네이트, 설페이트 및 타르트레이트가 포함된다. 염기 염은 암모늄 염, 나트륨 및 칼륨 염과 같은 알칼리 금속 염, 칼슘 및 마그네슘 염과 같은 알칼리 토금속 염, 다이사이클로헥실아미노 염과 같은 유기 염기와의 염 및 아르기닌과 같은 아미노산과의 염을 포함한다. 또한, 염기성 질소-함유 기는, 예를 들어 알킬 할라이드로 4차화될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 그들의 의도한 목적을 달성하는 임의의 수단에 의해 투여될 수 있다. 예에는 비경구, 피하, 정맥내, 근육내, 복막내, 경피, 협측 또는 안구 경로에 의한 투여가 포함된다. 투여는 경구 경로에 의해 행해질 수 있다. 비경구 투여를 위한 적합한 제형은 수용성 형태의 활성 접합체의 수용액, 예를 들어 수용성 염, 산성 용액, 알칼리성 용액, 덱스트로스-물 용액, 등장성 탄수화물 용액 및 사이클로덱스트린 포접 복합체를 포함한다.
본 발명은 또한 임의의 본 발명의 접합체와 약제학적으로 허용되는 담체를 혼합하는 단계를 포함하는 약제학적 조성물의 제조 방법을 포함한다. 게다가, 본 발명은 임의의 본 발명의 접합체와 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체를 혼합함으로써 제조되는 약제학적 조성물을 포함한다.
더욱이, 본 발명의 접합체는 하나 이상의 다형체 또는 무정형 결정질 형태를 가질 수 있으며, 이들은 본 발명의 범주 내에 포함되는 것으로 의도된다. 게다가, 접합체는 용매화물, 예를 들어 물과의 용매화물(즉, 수화물) 또는 통상적인 유기 용매와의 용매화물을 형성할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 용어 "용매화물"은 본 발명의 접합체와 하나 이상의 용매 분자와의 물리적 회합을 의미한다. 이러한 물리적 회합은 수소 결합을 비롯한 다양한 정도의 이온 결합 및 공유 결합을 포함한다. 경우에 따라서는, 용매화물은 예를 들어, 하나 이상의 용매 분자가 결정질 고체의 결정 격자에 포함될 경우, 단리될 수 있을 것이다. 용어 "용매화물"은 용액상(solution-phase) 및 단리가능한 용매화물 둘 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 적합한 용매화물의 비제한적인 예에는 에탄올레이트, 메탄올레이트 등이 포함된다.
본 발명은 본 발명의 접합체의 다형체 및 용매화물을 그의 범주 내에 포함하고자 한다. 따라서, 본 발명의 치료 방법에서, 용어 "투여하는"은 본 발명의 접합체, 또는 이의 다형체 또는 용매화물을 사용하여 본 명세서에 기재된 증후군, 장애 또는 질병을 치료, 개선 또는 예방하는 수단을 포함할 것이며, 이는 구체적으로 개시되어 있지 않지만 본 발명의 범주 내에 명백히 포함될 것이다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 약제로서 사용되는 본 발명의 접합체에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명의 접합체의 전구약물을 그 범주 내에 포함한다. 일반적으로, 그러한 전구약물은 필요한 접합체로 생체내에서 용이하게 전환가능한 접합체의 기능성 유도체일 것이다. 따라서, 본 발명의 치료 방법에서, 용어 "투여하는"은 구체적으로 개시된 접합체에 의해 또는 구체적으로 개시되어 있지 않을 수 있지만 환자에게 투여 후 생체내에서 명시된 접합체로 전환되는 접합체에 의한, 기재된 다양한 장애의 치료를 포함할 것이다. 적합한 전구약물 유도체의 선택과 제조를 위한 통상적인 절차는 예를 들어, 문헌["Design of Prodrugs", Ed. H. Bundgaard, Elsevier, 1985]에 기재되어 있다.
더욱이, 본 발명의 범주 내에서, 임의의 원소는, 특히 본 발명의 접합체와 관련하여 언급되는 경우, 천연 존재비 또는 동위원소적으로 풍부화된 형태로 천연 발생 또는 합성적으로 제조된 상기 원소의 모든 동위원소 및 동위원소 혼합물을 포함할 것으로 의도된다. 예를 들어, 수소에 대한 언급은 그의 범위 내에 1H, 2H(D), 및 3H(T)를 포함한다. 유사하게, 탄소 및 산소에 대한 언급은 각각 이들의 범위 내에 12C, 13C 및 14C와, 16O 및 18O를 포함한다. 동위원소는 방사성 또는 비방사성일 수 있다. 본 발명의 방사성 표지 접합체는 3H, 11C, 18F, 122I, 123I, 125I, 131I, 75Br, 76Br, 77Br 및 82Br의 군으로부터 선택되는 방사성 동위원소를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 방사성 동위원소는 3H, 11C 및 18F의 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일부 접합체는 회전장애 이성질체로서 존재할 수 있다. 회전장애 이성질체는 단일 결합을 중심으로 한 장애 회전에 의해 생긴 입체 이성질체이며, 여기서는 회전에 대한 입체 변형 장벽이 형태 이성질체를 단리할 수 있을 정도로 충분히 높다. 모든 그러한 형태 이성질체 및 이들의 혼합물이 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명에 따른 접합체가 적어도 하나의 입체 중심을 갖는 경우, 이는 그에 따라 거울상 이성질체 또는 부분입체 이성질체로서 존재할 수 있다. 모든 그러한 이성질체 및 이들의 혼합물이 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명에 따른 접합체의 제조 방법에 의해 입체 이성질체의 혼합물이 생성되는 경우, 이들 이성질체는 분취용 크로마토그래피와 같은 통상적인 기술에 의해 분리될 수 있다. 접합체는 라세미 형태로 제조될 수 있거나, 또는 거울상 이성질체 특이적(enantiospecific) 합성에 의하여 또는 분할에 의하여 개별 거울상 이성질체가 제조될 수 있다. 접합체는 예를 들어, 표준 기술, 예를 들어, (-)-다이-p-톨루오일-D-타르타르산 및/또는 (+)-다이-p-톨루오일-L-타르타르산과 같은 광학 활성 산을 이용한 염 형성과, 이어서 분별 결정화 및 유리 염기의 재생에 의한 부분입체 이성질체 쌍의 형성에 의해 그들의 구성성분 거울상 이성질체로 분할될 수 있다. 접합체는 또한, 부분입체 이성질체 에스테르 또는 아미드의 형성 후, 크로마토그래피 분리 및 키랄 보조제의 제거에 의하여 분할될 수 있다. 대안적으로, 접합체는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 또는 SFC를 통해 키랄 컬럼을 사용하여 분할될 수 있다. 일부 경우에, 1H NMR에 의해 관측될 수 있는 접합체의 회전 이성질체가 존재할 수 있으며, 이는 1H NMR 스펙트럼에서 복합 다중선 및 피크 적분을 가져온다.
본 발명의 접합체의 임의의 제조 방법 동안, 임의의 대상 분자 상의 민감성 또는 반응성 기를 보호하는 것이 필요하고/하거나 바람직할 수 있다. 이는 통상적인 보호기, 예컨대 문헌[Protective Groups in Organic Chemistry, ed.J.F.W. McOmie, Plenum Press, 1973]; 및 문헌[T.W. Greene & P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, 1991]에 기재된 것들에 의해 달성될 수 있으며, 이들 각각은 모든 목적상 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 보호기는 당업계에서 알려진 방법을 사용하여 편리한 후속 단계에서 제거될 수 있다.
사용 방법
본 발명은 Y2 수용체 매개 증후군, 장애 또는 질병의 예방, 치료 또는 개선을 필요로 하는 대상체에서 Y2 수용체 매개 증후군, 장애 또는 질병을 예방, 치료 또는 개선하기 위한 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 유효량의 접합체, 화합물, 또는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 장애, 질병, 또는 질환 또는 상기 장애, 질병, 또는 질환의 임의의 하나 이상의 증상의 예방, 치료, 발병의 지연, 또는 개선을 필요로 하는 대상체에서 장애, 질병, 또는 질환 또는 상기 장애, 질병, 또는 질환의 임의의 하나 이상의 증상을 예방, 치료, 발병의 지연, 또는 개선하기 위한 방법을 또한 제공하며, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 유효량의 접합체, 화합물, 또는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
특정 실시 형태에 따르면, 질병, 장애, 또는 질환은 비만, 제I형 또는 제II형 당뇨병, 대사 증후군(즉, 증후군 X), 인슐린 저항성, 내당능 장애(예를 들어, 당불내성), 고혈당증, 고인슐린혈증, 고트라이글리세라이드혈증, 선천성 고인슐린증(CHI)으로 인한 저혈당증, 이상지질혈증, 죽상경화증, 당뇨병성 신장병증, 및 다른 심혈관 위험 인자, 예컨대 고혈압 및 관리되지 않은 콜레스테롤 및/또는 지질 수준과 관련된 심혈관 위험 인자, 골다공증, 염증, 비알코올성 지방간 질병(NAFLD), 비알코올성 지방성 간염(NASH), 신장 질병, 및/또는 습진으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시 형태에 따르면, 치료적 유효량은 하기 효과 중 하나, 둘, 셋, 넷, 또는 그 이상을 달성하기에 충분한 요법의 양을 지칭한다: (i) 치료하고자 하는 질병, 장애, 또는 질환, 또는 이와 관련된 증상의 중증도를 감소 또는 개선함; (ii) 치료하고자 하는 질병, 장애 또는 질환, 또는 이와 관련된 증상의 지속기간을 감소시킴; (iii) 치료하고자 하는 질병, 장애 또는 질환, 또는 이와 관련된 증상의 진행을 예방함; (iv) 치료하고자 하는 질병, 장애 또는 질환, 또는 이와 관련된 증상의 퇴행을 야기함; (v) 치료하고자 하는 질병, 장애 또는 질환, 또는 이와 관련된 증상의 발생 또는 발병을 예방함; (vi) 치료하고자 하는 질병, 장애 또는 질환, 또는 이와 관련된 증상의 재발을 예방함; (vii) 치료하고자 하는 질병, 장애 또는 질환, 또는 이와 관련된 증상을 갖는 대상체의 입원을 감소시킴; (viii) 치료하고자 하는 질병, 장애 또는 질환, 또는 이와 관련된 증상을 갖는 대상체의 입원 길이를 감소시킴; (ix) 치료하고자 하는 질병, 장애 또는 질환, 또는 이와 관련된 증상을 갖는 대상체의 생존율을 증가시킴; (xi) 대상체에서 치료하고자 하는 질병, 장애 또는 질환, 또는 이와 관련된 증상을 억제하거나 감소시킴; 및/또는 (xii) 다른 요법의 예방적 또는 치료적 효과(들)를 향상시키거나 개선함.
치료적 유효량 또는 투여량은 다양한 인자, 예컨대 치료하고자 하는 질병, 장애 또는 질환, 투여 수단, 표적 부위, 대상체의 생리학적 상태(예를 들어, 연령, 체중, 건강을 포함함), 대상체가 인간인지 또는 동물인지의 여부, 투여되는 다른 약, 및 치료가 예방적인지 또는 치료적인지의 여부에 따라 변동될 수 있다. 치료 투여량은 안전성 및 효능을 최적화하기 위해 최적으로 적정된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "치료하다", "치료하는", 및 "치료"는 모두 질병, 장애, 또는 질환과 관련된 하나 이상의 측정가능한 물리적 파라미터의 개선 또는 역전을 지칭하고자 하는 것이며, 이는 반드시 대상체에서 식별가능하지는 않지만, 대상체에서 식별가능할 수도 있다. 용어 "치료하다", "치료하는", 및 "치료"는 또한, 퇴행을 야기하거나, 진행을 예방하거나, 적어도 질병, 장애 또는 질환의 진행을 둔화시키는 것을 지칭할 수 있다. 특정 실시 형태에서, "치료하다", "치료하는", 및 "치료"는 질병, 장애, 또는 질환과 관련된, 경감, 발생 또는 발병의 예방, 또는 하나 이상의 증상의 지속기간의 감소를 지칭한다. 특정 실시 형태에서, "치료하다", "치료하는", 및 "치료"는 질병, 장애 또는 질환의 재발의 예방을 지칭한다. 특정 실시 형태에서, "치료하다", "치료하는", 및 "치료"는 질병, 장애 또는 질환을 갖는 대상체의 생존율의 증가를 지칭한다. 특정 실시 형태에서, "치료하다", "치료하는", 및 "치료"는 대상체에서 질병, 장애 또는 질환의 제거를 지칭한다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 비만, 또는 비만의 임의의 하나 이상의 증상의 예방, 치료, 발병의 지연, 또는 개선을 필요로 하는 대상체에서 비만, 또는 비만의 임의의 하나 이상의 증상을 예방, 치료, 발병의 지연, 또는 개선하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 유효량의 접합체, 화합물, 또는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 대상체의 체중은, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 본 발명의 접합체, 화합물, 약제학적 조성물, 형태, 또는 약제 중 임의의 것의 투여 전의 대상체의 체중과 대비하여, 또는 본 명세서에 기재된 본 발명의 접합체, 조성물, 형태, 약제, 또는 병용물 중 임의의 것을 제공받지 않은 대조 대상체와 대비하여 약 0.01% 내지 약 0.1%, 약 0.1% 내지 약 0.5%, 약 0.5% 내지 약 1%, 약 1% 내지 약 5%, 약 2% 내지 약 3%, 약 5% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 40%, 약 40% 내지 약 45%, 또는 약 45% 내지 약 50%만큼 감소된다.
일부 실시 형태에서, 체중 감소는, 예를 들어 약 1주 동안, 약 2주 동안, 약 3주 동안, 약 1개월 동안, 약 2개월 동안, 약 3개월 동안, 약 4개월 동안, 약 5개월 동안, 약 6개월 동안, 약 7개월 동안, 약 8개월 동안, 약 9개월 동안, 약 10개월 동안, 약 11개월 동안, 약 1년 동안, 약 1.5년 동안, 약 2년 동안, 약 2.5년 동안, 약 3년 동안, 약 3.5년 동안, 약 4년 동안, 약 4.5년 동안, 약 5년 동안, 약 6년 동안, 약 7년 동안, 약 8년 동안, 약 9년 동안, 약 10년 동안, 약 15년 동안, 또는 약 20년 동안 유지된다.
본 발명은 또한, 비만, 제I형 또는 제II형 당뇨병, 대사 증후군(즉, 증후군 X), 인슐린 저항성, 내당능 장애(예를 들어, 당불내성), 고혈당증, 고인슐린혈증, 고트라이글리세라이드혈증, 선천성 고인슐린혈증(CHI)으로 인한 저혈당증, 이상지질혈증, 죽상경화증, 당뇨병성 신장병증, 및 다른 심혈관 위험 인자, 예컨대 고혈압 및 관리되지 않은 콜레스테롤 및/또는 지질 수준과 관련된 심혈관 위험 인자, 골다공증, 염증, 비알코올성 지방간 질병(NAFLD), 비알코올성 지방성 간염(NASH), 신장 질병, 및 습진으로 이루어진 군으로부터 선택되는 증후군, 장애 또는 질병, 또는 상기 증후군, 장애 또는 질병의 임의의 하나 이상의 증상의 예방, 치료, 발병의 지연, 또는 개선을 필요로 하는 대상체에서 상기 증후군, 장애 또는 질병, 또는 상기 증후군, 장애 또는 질병의 임의의 하나 이상의 증상을 예방, 치료, 발병의 지연, 또는 개선하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 유효량의 접합체, 화합물, 또는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 대사 증후군은 하기 중 임의의 하나 이상을 갖는 대상체를 지칭한다: 고혈당(예를 들어, 고공복 혈당), 고혈압, 비정상적 콜레스테롤 수준(예를 들어, 낮은 HDL 수준), 비정상적 트라이글리세라이드 수준(예를 들어, 고 트라이글리세라이드), 큰 허리선(즉, 허리 둘레), 복부 영역에서의 증가된 지방, 인슐린 저항성, 당불내성, 상승된 C-반응성 단백질 수준(즉, 전염증성 상태), 및 증가된 혈장 플라스미노겐 활성 억제인자-1 및 피브리노겐 수준(즉, 전혈전 상태).
본 발명은 음식 섭취량의 감소를 필요로 하는 대상체에서 음식 섭취량을 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 유효량의 접합체, 화합물, 또는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 대상체의 음식 섭취량은, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 본 발명의 접합체, 화합물, 조성물, 형태, 약제, 또는 병용물 중 임의의 것의 투여 전의 대상체의 음식 섭취량과 대비하여, 또는 본 명세서에 기재된 본 발명의 접합체, 화합물, 조성물, 형태, 약제, 또는 병용물 중 임의의 것을 제공받지 않은 대조 대상체와 대비하여 약 0.01% 내지 약 0.1%, 약 0.1% 내지 약 0.5%, 약 0.5% 내지 약 1%, 약 1% 내지 약 5%, 약 2% 내지 약 3%, 약 5% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 40%, 약 40% 내지 약 45%, 또는 약 45% 내지 약 50%만큼 감소된다.
일부 실시 형태에서, 음식 섭취량의 감소는, 예를 들어 약 1주 동안, 약 2주 동안, 약 3주 동안, 약 1개월 동안, 약 2개월 동안, 약 3개월 동안, 약 4개월 동안, 약 5개월 동안, 약 6개월 동안, 약 7개월 동안, 약 8개월 동안, 약 9개월 동안, 약 10개월 동안, 약 11개월 동안, 약 1년 동안, 약 1.5년 동안, 약 2년 동안, 약 2.5년 동안, 약 3년 동안, 약 3.5년 동안, 약 4년 동안, 약 4.5년 동안, 약 5년 동안, 약 6년 동안, 약 7년 동안, 약 8년 동안, 약 9년 동안, 약 10년 동안, 약 15년 동안, 또는 약 20년 동안 유지된다.
본 발명은 당화 헤모글로빈(A1C)의 감소를 필요로 하는 대상체에서 당화 헤모글로빈을 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 유효량의 접합체, 화합물, 또는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 대상체의 A1C는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 본 발명의 접합체, 화합물, 조성물, 형태, 약제, 또는 병용물 중 임의의 것의 투여 전의 대상체의 A1C와 대비하여, 또는 본 명세서에 기재된 본 발명의 접합체, 화합물, 조성물, 형태, 약제, 또는 병용물 중 임의의 것을 제공받지 않은 대조 대상체와 대비하여 약 0.001% 내지 약 0.01%, 약 0.01% 내지 약 0.1%, 약 0.1% 내지 약 0.2%, 약 0.2% 내지 약 0.3%, 약 0.3% 내지 약 0.4%, 약 0.4% 내지 약 0.5%, 약 0.5% 내지 약 1%, 약 1% 내지 약 1.5%, 약 1.5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 2.5%, 약 2.5% 내지 약 3%, 약 3% 내지 약 4%, 약 4% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 6%, 약 6% 내지 약 7%, 약 7% 내지 약 8%, 약 8% 내지 약 9%, 또는 약 9% 내지 약 10%만큼 감소된다.
다른 실시 형태에서, 공복 혈당 수준의 감소를 필요로 하는 대상체에서 공복 혈당 수준을 감소시키기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 유효량의 접합체, 화합물, 또는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 공복 혈당 수준은 본 명세서에 기재된 본 발명의 접합체, 화합물, 조성물, 형태, 약제, 또는 병용물 중 임의의 것의 투여 전의 대상체의 공복 혈당 수준과 대비하여, 또는 본 명세서에 기재된 본 발명의 접합체, 화합물, 조성물, 형태, 약제, 또는 병용물 중 임의의 것을 제공받지 않은 대조 대상체와 대비하여 약 140 mg/dL 미만 내지 약 150 mg/dL, 약 140 mg/dL 미만 내지 약 130 mg/dL, 약 130 mg/dL 미만 내지 약 120 mg/dL, 약 120 mg/dL 미만 내지 약 110 mg/dL, 약 110 mg/dL 미만 내지 약 100 mg/dL, 약 100 mg/dL 미만 내지 약 90 mg/dL, 또는 약 90 mg/dL 미만 내지 약 80 mg/dL로 감소될 수 있다.
본 발명은 Y2 수용체 활성의 조절을 필요로 하는 대상체에서 Y2 수용체 활성을 조절하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 유효량의 접합체, 화합물, 또는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "조절하는"은 수용체 활성을 증가 또는 감소시키는 것을 지칭한다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 유효량의 접합체 또는 화합물 또는 이의 형태, 조성물 또는 약제는 이를 필요로 하는 대상체에게 일일 1회, 일일 2회, 일일 3회, 일일 4회, 일일 5회, 일일 6회, 일일 7회, 또는 일일 8회 투여된다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 유효량의 접합체 또는 화합물 또는 이의 형태, 조성물 또는 약제는 이를 필요로 하는 대상체에게 격일로 1회, 주 1회, 주 2회, 주 3회, 주 4회, 주 5회, 주 6회, 개월당 2회, 개월당 3회, 또는 개월당 4회 투여된다.
본 발명의 다른 실시 형태는 질병, 장애 또는 증후군, 또는 상기 질병, 장애 또는 증후군 중 임의의 것의 하나 이상의 증상의 예방, 치료, 발병의 지연, 또는 개선을 필요로 하는 대상체에서 질병, 장애 또는 증후군, 또는 상기 질병, 장애 또는 증후군 중 임의의 것의 하나 이상의 증상을 예방, 치료, 발병의 지연, 또는 개선하기 위한 방법을 포함하며, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 병용 요법으로 본 발명의 유효량의 접합체, 화합물, 또는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 소정 실시 형태에서, 병용 요법은 제2 치료제이다. 소정 실시 형태에서, 병용 요법은 외과적 요법이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 대상체에 대한 2가지 이상의 요법의 투여와 관련하여 용어 "병용하여"는 하나 초과의 요법의 사용을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 병용 요법은 이를 필요로 하는 대상체에게, 본 발명의 유효량의 접합체 또는 화합물 또는 이의 형태, 조성물 또는 약제와 병행하여, 하나 이상의 추가의 치료제, 또는 하나 이상의 외과적 요법을 투여하는 것을 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 추가의 치료제 또는 외과적 요법은 본 발명의 유효량의 접합체와 동일한 날에 투여될 수 있으며, 다른 실시 형태에서, 하나 이상의 추가의 치료제 또는 외과적 요법은 본 발명의 유효량의 접합체 또는 화합물과 동일한 주 또는 동일한 달에 투여될 수 있다.
질병 또는 장애가 비만, 제II형 당뇨병, 대사 증후군, 인슐린 저항성 및 이상지질혈증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 소정 실시 형태에서, 제2 치료제는 항당뇨병제일 수 있다. 소정 실시 형태에서, 항당뇨병제는 글루카곤-유사 펩티드-1(GLP-1) 수용체 조절제일 수 있다.
본 발명은 또한 병용 요법을 사용하여 본 명세서에 기재된 질병, 장애, 증후군, 또는 증상 중 임의의 것의 예방, 치료, 발병의 지연, 또는 개선을 필요로 하는 대상체에서 상기 질병, 장애, 증후군, 또는 증상 중 임의의 것을 예방, 치료, 발병의 지연, 또는 개선하는 것을 고려하며, 상기 병용 요법은 이를 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 유효량의 접합체, 화합물, 또는 약제학적 조성물을 하기 치료제들 중 임의의 하나 이상과 병용하여 투여하는 것을 포함한다: 다이펩티딜 펩티다제-4(DPP-4) 억제제(예를 들어, 시타글립틴, 삭사글립틴, 리나글립틴, 알로글립틴 등); GLP-1 수용체 효능제(예를 들어, 단시간-작용형 GLP-1 수용체 효능제, 예컨대 엑세나타이드 및 릭시세나타이드; 중간시간-작용형 GLP-1 수용체 효능제, 예컨대 리라글루타이드; 장시간-작용형 GLP-1 수용체 효능제, 예컨대 연장-방출형 엑세나타이드, 알비글루타이드, 둘라글루타이드); 나트륨-글루코스 공동-수송체-2(SGLT-2) 억제제(예를 들어, 카나글리포진, 다파글리포진, 엠파글리포진 등); 담즙산 봉쇄제(예를 들어, 콜레세벨람 등); 도파민 수용체 효능제(예를 들어, 신속-방출형 브로모크립틴). 바이구아나이드(예를 들어, 메트포르민 등); 인슐린; 옥신토모듈린; 설포닐우레아(예를 들어, 클로르프로파미드, 글리메피라이드, 글리피자이드, 글리부라이드, 글리벤클라미드, 글리보누라이드, 글리속세파이드, 글리클로피라미드, 톨라자미드, 톨부타미드, 아세토헥사미드, 카부타미드 등); 및 티아졸리딘다이온(예를 들어, 피오글리타존, 로시글리타존, 로베글리타존, 시글리타존, 다글리타존, 엔글리타존, 네토글리타존, 리보글리타존, 트로글리타존 등). 일부 실시 형태에서, 추가의 치료제(들)의 용량은 본 발명의 접합체 또는 화합물과 병용하여 주어질 때 감소된다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 접합체 또는 화합물과 병용하여 사용되는 경우, 추가의 치료제(들)는 각각 단독으로 사용되는 경우보다 더 낮은 용량으로 사용될 수 있다.
소정 실시 형태에서, 질병 또는 장애가 비만, 제I형 또는 제II형 당뇨병, 대사 증후군(즉, 증후군 X), 인슐린 저항성, 내당능 장애(예를 들어, 당불내성), 고혈당증, 고인슐린혈증, 고트라이글리세라이드혈증, 선천성 고인슐린증(CHI)으로 인한 저혈당증, 이상지질혈증, 죽상경화증, 당뇨병성 신장병증, 및 다른 심혈관 위험 인자, 예컨대 고혈압 및 관리되지 않은 콜레스테롤 및/또는 지질 수준과 관련된 심혈관 위험 인자, 골다공증, 염증, 비알코올성 지방간 질병(NAFLD), 비알코올성 지방성 간염(NASH), 신장 질병, 및 습진으로 이루어진 군으로부터 선택되는 경우, 제2 치료제는 리라글루타이드일 수 있다.
본 발명은 또한 병용 요법을 사용하여 본 명세서에 기재된 질병, 장애, 증후군, 또는 증상 중 임의의 것의 예방, 치료, 발병의 지연, 또는 개선을 필요로 하는 대상체에서 상기 질병, 장애, 증후군, 또는 증상 중 임의의 것을 예방, 치료, 발병의 지연, 또는 개선하는 것을 고려하며, 상기 병용 요법은 이를 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 유효량의 접합체, 화합물, 또는 약제학적 조성물을 외과적 요법과 병용하여 투여하는 것을 포함한다. 소정 실시 형태에서, 외과적 요법은 하기와 같을 수 있다: 비만대사 수술(예를 들어, 위 우회술, 예컨대 루와이 위 우회술; 위소매 절제술; 조정가능한 위 밴드 수술; 십이지장 교체를 갖는 담도췌장 우회술; 위내 풍선; 위주름 성형술; 및 이들의 조합).
하나 이상의 추가의 치료제 또는 외과적 요법이 본 발명의 유효량의 접합체 또는 화합물과 동일한 날에 투여되는 실시 형태에서, 본 발명의 접합체 또는 화합물은 추가의 치료제 또는 외과적 요법 전에, 그 후에, 또는 그와 동시에 투여될 수 있다. 용어 "병용하여"의 사용은 요법이 대상체에게 투여되는 순서를 제한하지 않는다. 예를 들어, 대상체에게 제2 요법을 투여하기 전에(예를 들어, 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 16시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주, 또는 12주 전에), 그와 동시에, 또는 그 후에(예를 들어, 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 16시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주, 또는 12주 후에) 제1 요법(예를 들어, 본 명세서에 기재된 조성물)이 투여될 수 있다.
실시 형태
본 발명은 또한 하기의 비제한적인 실시 형태를 제공한다.
실시 형태 1은 사이클릭 PYY 펩티드에 커플링된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 접합체로서, 상기 사이클릭 PYY 펩티드는 화학식 I 또는 이의 유도체 또는 약제학적으로 허용되는 염으로 나타내고:
[화학식 I]
Figure 112019053646884-pct00163
(상기 식에서,
p는 0 또는 1이고;
m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고;
n은 1, 2, 3, 또는 4이고;
q는 0 또는 1이되; 단, Z30이 부재하는 경우에만 q가 1이고;
가교는 -Ph-CH2-S-, -트라이아졸릴-, -NHC(O)CH2S-, -SCH2C(O)NH-,
-(OCH2CH2)2NHC(O)CH2S, -NHC(O)-, 또는 -CH2S-이고;
Z4는 K, A, E, S, 또는 R이고;
Z7은 A 또는 K이고;
Z9는 G 또는 K이고;
Z11은 D 또는 K이고;
Z22는 A 또는 K이고;
Z23은 S 또는 K이고;
Z26은 A 또는 H이고;
Z30은 L, W, 부재, 또는 K이되;
단, q가 1인 경우에만 Z30이 부재하고;
Z34는
Figure 112019053646884-pct00164
또는
Figure 112019053646884-pct00165
이고;
Z35는
Figure 112019053646884-pct00166
,
Figure 112019053646884-pct00167
,
Figure 112019053646884-pct00168
, 또는
Figure 112019053646884-pct00169
임);
상기 유도체는 아미드화, 글리코실화, 카르바밀화, 황산화, 인산화, 환화, 지질화, 및 페길화로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 공정에 의해 개질된 화학식 I의 화합물이다.
실시 형태 2는, 실시 형태 1에 있어서, 상기 사이클릭 PYY 펩티드는 아미드화, 지질화, 및 페길화로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 공정에 의해 개질된 화학식 I의 사이클릭 PYY 펩티드의 유도체, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, 접합체이다.
실시 형태 3은, 실시 형태 1에 있어서, 상기 사이클릭 PYY 펩티드는,
p는 0 또는 1이고;
m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고;
n은 1, 2, 3, 또는 4이고;
q는 0 또는 1이되; 단, Z30이 부재하는 경우에만 q가 1이고;
가교는 -Ph-CH2-S-, -트라이아졸릴-, -NHC(O)CH2S-, -SCH2C(O)NH2-,
-(OCH2CH2)2NHC(O)CH2S, -NHC(O)-, 또는 -CH2S-이고;
Z4는 K, A, E, S, 또는 R이고;
Z7은 A 또는 K이고;
Z9는 G 또는 K이고;
Z11은 D 또는 K이고;
Z22는 A 또는 K이고;
Z23은 S 또는 K이고;
Z26은 A 또는 H이고;
Z30은 L 또는 K이며, 상기 K의 아미노 측쇄는
Figure 112019053646884-pct00170
또는
Figure 112019053646884-pct00171
로 치환되고;
Z34는
Figure 112019053646884-pct00172
또는
Figure 112019053646884-pct00173
이고;
Z35는
Figure 112019053646884-pct00174
,
Figure 112019053646884-pct00175
,
Figure 112019053646884-pct00176
, 또는
Figure 112019053646884-pct00177
인 화학식 I 또는 이의 유도체 또는 약제학적으로 허용되는 염으로 나타내는, 접합체이다.
실시 형태 4는, 실시 형태 1에 있어서, 상기 사이클릭 PYY 펩티드는,
p는 0 또는 1이고;
m은 0, 1, 2, 3, 또는 5이고;
n은 1, 2, 또는 4이고;
q는 0 또는 1이되; 단, Z30이 부재하는 경우에만 q가 1일 수 있고;
가교는 -Ph-CH2-S-, -트라이아졸릴-, -NHC(O)CH2S-, -SCH2C(O)NH2-,
-(OCH2CH2)2NHC(O)CH2S, -NHC(O)-, 또는 -CH2S-이고;
Z4는 K, A, E, S, 또는 R이고;
Z7은 A 또는 K이고;
Z9는 G 또는 K이고;
Z11은 D 또는 K이고;
Z22는 A 또는 K이고;
Z23은 S 또는 K이고;
Z26은 A 또는 H이고;
Z30은 L 또는 K이며, 상기 K의 아미노 측쇄는
Figure 112019053646884-pct00178
또는
Figure 112019053646884-pct00179
로 치환되고;
Z34는
Figure 112019053646884-pct00180
또는
Figure 112019053646884-pct00181
이고;
Z35는
Figure 112019053646884-pct00182
,
Figure 112019053646884-pct00183
,
Figure 112019053646884-pct00184
, 또는
Figure 112019053646884-pct00185
인 화학식 I 또는 이의 유도체 또는 약제학적으로 허용되는 염으로 나타내는, 접합체이다.
실시 형태 5는 사이클릭 PYY 펩티드에 커플링된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 접합체로서, 상기 접합체는 화학식 IIIa-b, 화학식 IVa-b, 화학식 Va-b, 및/또는 화학식 VIa-b로 나타내며, 화학식 IIIa-b, 화학식 IVa-b, 화학식 Va-b, 및 화학식 VIa-b에서,
x는, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6, 바람직하게는 2일 수 있고;
Link1은, 예를 들어 G, βA, -COCH2OCH2CH2OCH2CH2NH-, γ-아미노부타노일, GG, -CO(CH2)mSCH2-(단, Link2가 -NH-인 경우, m은 1, 2임) 또는 결합일 수 있고;
Link2는, 예를 들어 -CH2-, 벤질, 에틸트라이아졸릴, -NH-, 또는 결합일 수 있고;
n은, 예를 들어 1, 2, 또는 3일 수 있고;
X는, 예를 들어 -S- 또는 -CH2-일 수 있고;
Z3은, 예를 들어 I 또는 결합일 수 있고;
Z4는, 예를 들어 K, S, 또는 R일 수 있고;
Z30은, 예를 들어 L, W, K(mPEG16), 또는 K(mPEG12)일 수 있고;
Z34는, 예를 들어 Q일 수 있으며, 상기 Q는 선택적으로 알파-아미드 질소 상에서 N-메틸화되고;
Z35는, 예를 들어 R일 수 있으며, 상기 R은 선택적으로 알파-아미드 질소 상에서 N-메틸화되거나, 또는 R은 탈카르보닐화되어 psi-(Z35Z36) 아미드 결합을 생성하거나, 또는 R은 알파-아미드 질소 상에서 N-메틸화되고 또한 탈카르보닐화되어 psi-(Z35Z36) 아미드 결합을 생성하고;
Z36은, 예를 들어 Y(Tyr), Cha(β-사이클로헥실알라닌), Aic(2-아미노인단-2-카르복실산) 또는 F(Phe)일 수 있으며, 상기 F는 플루오로(4-F-Phe), 클로로(4-Cl-Phe), 브로모(4-Br-Phe), 요오도(4-I-Phe), 아미노(4-NH2-Phe)로 선택적으로 파라-치환되고;
Link3은, 예를 들어, 라이신 측쇄에 대한 하기 아미드화: (PEG)8-트라이아졸릴-CH2CH2CO-PEG4(
Figure 112019053646884-pct00186
를 포함함), 2 내지 24개의 PEG 단위의 PEG 사슬(
Figure 112019053646884-pct00187
를 포함함), 2 내지 10개의 탄소 원자를 함유하는 알킬 사슬(
Figure 112019053646884-pct00188
를 포함함), (Gly4Ser)j(여기서, j는 1 내지 4임), (AlaPro)u(여기서, u는 1 내지 10임) 중 임의의 것을 포함할 수 있거나, 또는 -NH-Link3-은 결합에 의해 대체될 수 있다.
실시 형태 6은, 실시 형태 1에 있어서, 상기 사이클릭 PYY 펩티드는 서열 번호 1 내지 100으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 접합체이다.
실시 형태 7은, 실시 형태 1 내지 실시 형태 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 링커를 통해 상기 사이클릭 PYY 펩티드의 라이신 잔기에서 상기 사이클릭 PYY 펩티드에 공유적으로 결합되는, 접합체이다.
실시 형태 8은, 실시 형태 7에 있어서, 상기 링커는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)8-트라이아졸릴-CH2CH2CO-PEG4, 2 내지 24개의 PEG 단위의 PEG 사슬, 2 내지 10개의 탄소 원자를 함유하는 알킬 사슬, (Gly4Ser)j(여기서, J는 1 내지 4임), (AlaPro)u(여기서, u는 1 내지 10임), 및 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나를 포함하는, 접합체이다.
실시 형태 9는, 실시 형태 8에 있어서, 화학식 I에서 Z7, Z9, Z11, Z22 및 Z23 중 단지 하나만이 라이신이고, 상기 라이신은 상기 링커를 통해 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 조작된 시스테인 잔기에 공유적으로 결합되는, 접합체이다.
실시 형태 10은 사이클릭 PYY 펩티드에 커플링된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 접합체로서, 상기 접합체는 서열 번호 102-127로 이루어진 군으로부터 선택되는 구조 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하며,
여기서 mAb는 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 나타내고, ]2는 1개 또는 2개의 상기 사이클릭 PYY 펩티드가 상기 mAb에 공유적으로 접합됨을 나타낸다.
실시 형태 11은, 실시 형태 1 내지 실시 형태 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 각각 서열 번호 141, 142, 143, 144, 145, 및 146의 폴리펩티드 서열을 갖는, 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR1), HCDR2, HCDR3, 및 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR1), LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는, 접합체이다.
실시 형태 12는, 실시 형태 11에 있어서, 단리된 단일클론 항체는 서열 번호 137의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH), 및 서열 번호 139의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는, 접합체이다.
실시 형태 13은, 실시 형태 12에 있어서, Fc 부분을 추가로 포함하는, 접합체이다.
실시 형태 14는, 실시 형태 13에 있어서, 서열 번호 138의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄(HC), 및 서열 번호 140의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄(LC)를 포함하는, 접합체이다.
실시 형태 15는, 실시 형태 1 내지 실시 형태 14 중 어느 하나의 접합체를 생성하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 사이클릭 PYY 펩티드의 측쇄, 바람직하게는 상기 사이클릭 PYY 펩티드의 라이신 잔기의 아미노 측쇄 상에 도입된 친전자체, 바람직하게는 브로모아세트아미드 또는 말레이미드를 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 서열 번호 143의 시스테인 잔기의 설프하이드릴 기와 반응시켜, 상기 사이클릭 PYY 펩티드와 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편 사이에 공유 결합을 생성하는 단계를 포함한다.
실시 형태 16은, 실시 형태 1 내지 실시 형태 14 중 어느 한 항의 접합체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물이다.
실시 형태 17은 비만의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 상기 비만을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 이를 필요로 하는 상기 대상체에게 실시 형태 16의 유효량의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
실시 형태 18은, 실시 형태 17에 있어서, 이를 필요로 하는 상기 대상체에 대한 상기 유효량의 약제학적 조성물의 투여는 상기 약제학적 조성물의 투여 전의 상기 대상체의 체중과 대비하여 약 5% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 20%, 또는 약 20% 내지 약 25%의 체중 감소를 가져오는, 방법이다.
실시 형태 19는 비만, 제I형 또는 제II형 당뇨병, 대사 증후군, 인슐린 저항성, 내당능 장애, 고혈당증, 고인슐린혈증, 고트라이글리세라이드혈증, 선천성 고인슐린혈증(CHI)으로 인한 저혈당증, 이상지질혈증, 죽상경화증, 당뇨병성 신장병증, 및 다른 심혈관 위험 인자, 예컨대 고혈압 및 관리되지 않은 콜레스테롤 및/또는 지질 수준과 관련된 심혈관 위험 인자, 골다공증, 염증, 비알코올성 지방간 질병(NAFLD), 비알코올성 지방성 간염(NASH), 신장 질병, 및 습진으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질병 또는 장애의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 상기 질병 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 이를 필요로 하는 상기 대상체에게 제16항의 유효량의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
실시 형태 20은, 실시 형태 19에 있어서, 상기 질병 또는 장애는 비만인, 방법이다.
실시 형태 21은, 실시 형태 19에 있어서, 상기 질병 또는 장애는 제I형 당뇨병인, 방법이다.
실시 형태 22는, 실시 형태 19에 있어서, 상기 질병 또는 장애는 제II형 당뇨병인, 방법이다.
실시 형태 23은, 실시 형태 19에 있어서, 상기 질병 또는 장애는 대사 증후군인, 방법이다.
실시 형태 24는, 실시 형태 19에 있어서, 상기 질병 또는 장애는 신장 질병인, 방법이다.
실시 형태 25는, 실시 형태 19에 있어서, 상기 질병 또는 장애는 비알코올성 지방성 간염(NASH)인, 방법이다.
실시 형태 26은, 실시 형태 19에 있어서, 상기 질병 또는 장애는 비알코올성 지방간 질병(NAFLD)인, 방법이다.
실시 형태 27은 음식 섭취량의 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 음식 섭취량을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 이를 필요로 하는 상기 대상체에게 실시 형태 16의 유효량의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
실시 형태 28은, 실시 형태 27에 있어서, 이를 필요로 하는 상기 대상체에 대한 상기 유효량의 약제학적 조성물의 투여는 상기 약제학적 조성물의 투여 전의 상기 대상체의 음식 섭취량과 대비하여 약 5% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 40%, 약 40% 내지 약 45%, 또는 약 45% 내지 약 50%의 음식 섭취량의 감소를 가져오는, 방법이다.
실시 형태 29는 Y2 수용체 활성의 조절을 필요로 하는 대상체에서 상기 Y2 수용체 활성을 조절하는 방법으로서, 상기 방법은 이를 필요로 하는 상기 대상체에게 실시 형태 16의 유효량의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
실시 형태 30은, 실시 형태 17 내지 실시 형태 29 중 어느 하나에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 주사를 통해 투여되는, 방법이다.
실시 형태 31은, 실시 형태 30에 있어서, 상기 주사는 피하, 근육내, 복막내, 또는 정맥내 전달되는, 방법이다.
실시 형태 32는, 실시 형태 17 내지 실시 형태 31 중 어느 하나에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 제2 치료제와 병용하여 투여되는, 방법이다.
실시 형태 33은, 실시 형태 32에 있어서, 상기 질병 또는 장애는 비만, 제2형 당뇨병, 대사 증후군, 인슐린 저항성 및 이상지질혈증으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 제2 치료제는 적어도 하나의 항당뇨병제인, 방법이다.
실시 형태 34는, 실시 형태 33에 있어서, 상기 항당뇨병제는 글루카곤-유사-펩티드-1 수용체 조절제인, 방법이다.
실시 형태 35는, 실시 형태 32에 있어서, 상기 제2 치료제는 리라글루타이드인, 방법이다.
실시 형태 36은, 실시 형태 17 내지 실시 형태 35 중 어느 하나에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 이를 필요로 하는 상기 대상체에게 매일, 매주, 또는 매달 투여되는, 방법이다.
실시 형태 37은, 실시 형태 36에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 일일 1회, 2회, 3회, 4회, 5회 또는 6회 투여되는, 방법이다.
실시 형태 38은, 실시 형태 36에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 주당 1회, 2회, 3회, 4회, 5회 또는 6회 투여되는, 방법이다.
실시 형태 39는, 실시 형태 36에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 개월당 1회, 2회, 3회, 또는 4회 투여되는, 방법이다.
실시 형태 40은, 실시 형태 1 내지 실시 형태 14 중 어느 하나의 접합체 또는 실시 형태 16의 약제학적 조성물을 포함하는 키트로서, 바람직하게는 상기 키트는 유효량의 제2 치료제를 추가로 포함하며, 더 바람직하게는, 상기 키트는 유효량의 리라글루타이드를 추가로 포함한다.
실시 형태 41은, 실시 형태 40에 있어서, 상기 키트는 주사 장치를 추가로 포함하는, 키트이다.
실시 형태 42는 실시 형태 1 내지 실시 형태 14 중 어느 하나의 접합체를 포함하는 약제학적 조성물을 생성하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 접합체를 약제학적으로 허용되는 담체와 배합하여 상기 약제학적 조성물을 얻는 단계를 포함한다.
실시예
합성
본 발명의 화합물 또는 접합체는 당업자에게 공지된 일반적인 합성 방법에 따라 합성될 수 있다. 합성에 관한 하기의 설명은 예시적인 목적을 위한 것이며, 어떠한 방식으로든 본 발명의 제한인 것으로 의미되지 않는다.
본 발명의 NTSC 사이클릭 PYY(NTSC-PYY) 유사체 또는 유도체는 아미노산들 사이의 연속적인 펩티드 결합의 형성을 위한 다양한 공지된 통상적인 절차에 의해 합성될 수 있으며, 자동화 펩티드 합성기, 전통적인 벤치 합성, 두 접근법의 조합을 사용하여 문헌[Merrifield (J. Am. Chem. Soc., 1963, 85, 2149-2154)]에 전반적으로 기재된 바와 같이, 고상 펩티드 합성(SPPS)에 의해 우선적으로 수행된다. 펩티드 합성에 대한 통상적인 절차는 하나의 아미노산 잔기의 유리 아미노 기(이 잔기의 다른 반응성 작용기는 적합하게 보호되어 있음)와 다른 아미노산의 유리 카르복실기(이 잔기의 반응성 작용기는 또한 적합하게 보호되어 있음) 사이의 축합을 수반한다. 펩티드 결합 형성에 전형적으로 이용되는 축합제의 예에는 1-하이드록시벤즈트라이아졸 (HOBT) 또는 에틸 시아노(하이드록시이미노)아세테이트(옥시마 퓨어(Oxyma Pure))를 동반하거나 동반하지 않는 다이아이소프로필카르보다이이미드(DIC), 2-(1H-벤조트라이아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸아미늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU), 2-(1H-7-아자벤즈트라이아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸아미늄 헥사플루오로포스페이트(HATU), 2-(6-클로로-1H-벤즈트라이아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸아미늄 헥사플루오로포스페이트(HCTU), 1-시아노-2-에톡시-2-옥소에틸리덴아미노옥시-트리스-피롤리디노-포스포늄 헥사플루오로포스페이트(피옥심), 2-(1H-벤조트라이아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸아미늄 테트라플루오로보레이트(TBTU) 브로모-트리스-피롤리디노-포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyBroP) 등이 포함된다.
자동화 펩티드 합성 방법은 문헌[Yu (J. Org. Chem., 1992, 57, 4781-4784)]에 기재된 바와 같이, 그리고 더욱 최근에는 문헌[Palasek (J. Pept. Sci., 2007, 13, 143-148)]에 의해 정교해진 바와 같이, 실온(rt)에서, 또는 승온에서, 바람직하게는 마이크로파 가열의 인가를 통해 수행될 수 있다.
본 발명의 화합물(C-말단 아미드)은 N-α-FMOC(9-플루오레닐메틸옥시카르보닐) 보호된 아미노산 방법을 사용하여 편리하게 제조될 수 있으며, 여기서는 적합하게 보호된 N-α-FMOC 보호된 아미노산의 카르복시 말단이 적합한 커플링제를 사용하여 통상적인 고상 수지 상에 커플링된다. 적합한 통상적인 구매가능한 고상 수지는 링크 아미드 MBHA 수지, 링크 아미드 AM 수지, Tentagel S RAM 수지, FMOC-PAL-PEG PS 수지, SpheriTide 링크 아미드 수지, ChemMatrix 링크 수지, Sieber 아미드 수지, TG Sieber 수지 등을 포함한다. 이어서, 수지-결합된 FMOC-아미노산은 N,N-다이메틸포름아미드(DMF) 또는 1-메틸-2-피롤리돈(NMP) 중 20% 피페리딘에 노출시킴으로써 탈보호될 수 있으며, 이의 처리는 FMOC 보호기를 선택적으로 제거하는 역할을 한다. 이어서, 추가의 FMOC-보호된 아미노산이 후속으로 순차적으로 커플링되고 탈보호되어, 원하는 수지-결합된 보호된 펩티드를 생성한다. 소정의 경우에, FMOC 탈보호 조건을 견뎌낼 펩티드 서열 내의 다른 아민에 대한 직교 반응성 보호기를 이용하는 것이 필요할 수 있다. 보호기, 예컨대 4-메틸트라이틸(Mtt) 또는 4-메톡시트라이틸(Mmt)(둘 모두 1% 트라이플루오로아세트산(TFA)/다이클로로메탄(DCM) 처리에 의해 제거가능함), 또는 바람직하게는 알릴옥시카르보닐(alloc; Pd(PPh3)4(테트라키스(트라이페닐포스핀)팔라듐(0))/PhSiH3(페닐실란) 처리에 의해 제거가능함), 1-(4,4-다이메틸-2,6-다이옥소사이클로헥스-1-일리덴)에틸(Dde; 2 내지 3% 하이드라진/DMF에 의한 처리에 의해 제거가능함) 및 1-(4,4-다이메틸-2,6-다이옥소사이클로헥스-1-일리덴)-3-메틸부틸(ivDde; 2 내지 3% 하이드라진/DMF에 의한 처리에 의해 제거가능함)이 그러한 경우에 효과적으로 사용될 수 있다.
통상적인 펩티드 합성 방법에서, 알파 아미노산의 반응성 측쇄는 일반적으로 합성 전체에 걸쳐 적합한 보호기로 보호되어 그들이 커플링 및 탈보호 프로토콜에 대해 불활성이 되게 한다. 아미노산 측쇄에 대한 다수의 보호기가 당업계에 공지되어 있지만, 본 발명에서는 하기 보호기가 가장 바람직하다: 세린, 트레오닌, 글루탐산, 아스파르트산 및 티로신의 경우 tert-부틸(t-Bu); 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 호모시스테인 및 히스티딘의 경우 트라이틸(Trt); 트립토판의 경우 tert-부틸옥시카르보닐(Boc) 및 라이신의 경우 ε-아미노 기; 그리고 아르기닌의 경우 2,2,4,6,7-펜타메틸다이하이드로벤조푸란-5-설포닐(Pbf)을 포함한다. 이들 보호기는 강산 처리 시에, 예컨대 고농도의 트라이플루오로아세트산(TFA)을 사용하여 제거된다.
SPPS의 완료 시에, 수지-결합된, 측쇄-보호된 펩티드는 탈보호되고, 동시에, 카르보양이온 포착제, 예컨대 트라이아이소프로필실란(TIPS), 물, 페놀 및 아니솔의 다양한 조합과 함께 (TFA)로 주로 이루어진 절단 칵테일을 사용하여 수지로부터 절단된다. 이어서, 차가운 에테르를 사용한 펩티드/칵테일 여과액의 침전에 의해 조(crude) 고체 펩티드가 단리된다. Sieber 수지-결합된, 보호된 펩티드의 특별한 경우에, 수지로부터의 보호된 펩티드의 절단은 측쇄 탈보호를 야기하지 않으면서 DCM 중 1 내지 2% TFA에 의한 반복된 처리 시에 유리하게 달성될 수 있다. 일단 단리되면, 보호된 펩티드의 추가의 조작은 용액상 반응에서 수행될 수 있다. 마지막으로, 보호된 펩티드는 절단 칵테일에 의한 별도의 처리를 사용하여 전역적으로(globally) 탈보호되고 전술된 바와 같이 침전될 수 있다. 이어서, 이렇게 얻어진 조 펩티드는 유기 공용매, 예컨대 아세토니트릴 또는 에탄올을 함유하는 대체로 수성(aq)인 용매 시스템 중에 저농도(약 4 mg/mL 미만)로 용해된다. 이어서, 용액의 pH를 5를 초과하여 상승시킬 때, 펩티드는 분자내 환화 반응을 거쳐서 본 발명의 상응하는 조 NTSC PYY 유사체를 형성한다. 이렇게 형성된 NTSC PYY 유사체는 당업계에 일반적으로 공지된 정제 기술을 사용하여 정제될 수 있다. 본 발명에 사용되는 바람직한 펩티드 정제 방법은 역상 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)이다. 이어서, 정제된 펩티드는 액체 크로마토그래피/질량 분석(LC/MS)에 의해 특성화된다.
본 명세서에 기재된 하기 실시예 및 실시 형태는 단지 예시적인 목적을 위한 것이고, 그에 비추어 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 시사될 것이고, 이는 본 출원의 사상 및 범위 그리고 첨부된 청구범위의 범주 내에 포함되어야 함이 이해된다. 본 명세서에 인용된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 모든 목적을 위하여 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
일반적인 반응도식
C-말단 아미드 NTSC-PYY 펩티드의 합성에 대한 일반적인 합성 절차는 2016년 10월 27일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/413,613호, 및 대리인 문서 번호 PRD3411을 갖는, 이 출원과 동일자로 출원된 발명의 명칭이 "Cyclic peptide tyrosine tyrosine compounds as modulators of neuropeptide receptors"인 미국 특허 출원 제______호에 기재되어 있다. 두 출원 모두의 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
실시예 1: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 1의 합성
Figure 112019053646884-pct00189
반응도식 14. Fmoc-psi-[Arg(Pbf)-(N-Boc)Tyr(tBu)]-OH의 합성
1. Fmoc- psi -[Arg(Pbf)-(N-Boc)Tyr(tBu)]-OH의 합성
A. H2N-Tyr(tBu)-OAll의 합성
DMF(500 mL) 중 Fmoc-Tyr(tBu)-O(69 g, 150.15 mmol) 및 K2CO3(62 g, 445.36 mmol)의 빙랭 용액에 알릴브로마이드(72 g, 595.16 mmol)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 3시간 동안 교반하였다. 이어서, 얼음/물(1 L)을 첨가하고, 혼합물을 EtOAc로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 건조시키고(Na2SO4), 감압 하에서 농축시켜, 황색 오일로서 Fmoc-Tyr(tBu)-OAll을 얻었다. DMF(600 mL) 중 Fmoc-Tyr(tBu)-OAll(70 g, 140.1 mmol)의 빙랭 용액에 피페리딘(150 mL)을 20분의 기간에 걸쳐 적가하였다. 3시간 후에, 반응 용액을 물/얼음(1 L)에 붓고, EtOAc(2 × 2 L)로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 건조시키고(Na2SO4), 감압 하에서 농축시켰다. 이렇게 얻어진 잔류물을 EtOAc/석유 에테르(10:1)로 용리하는 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여, 황색 오일로서 34 g의 H2N-Tyr(tBu)-OAll을 얻었다.
B. Fmoc-Arg(Pbf)-N(Me)OMe(2)의 합성
DCM(500 mL) 중 Fmoc-Arg(Pbf)-OH(1) (64.8 g, 99.88 mmol), N,O-다이메틸하이드록실아민 하이드로클로라이드(20 g, 206.2 mmol) 및 HATU(57 g, 149.91 mmol)의 빙랭 혼합물에 DIEA(52 g, 402.2 mmol)를 10분의 기간에 걸쳐 적가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반되게 하였다. 이어서, 반응물을 물/얼음(1 L)에 붓고, DCM(1 L)으로 추출하였다. 유기 추출물을 건조시키고(Na2SO4), 감압 하에서 농축시켜, 황색 고체로서 70 g의 조 Fmoc-Arg(Pbf)-N(Me)OMe(2)를 얻었으며, 이를 추가의 정제 없이 사용하였다.
C. Fmoc-Arg(Pbf)-CHO(3)의 합성
불활성 질소 분위기 하에서 THF(1 M, 107 mL, 0.107 mmol) 중 LAH의 냉각된(-78℃) 용액에 THF(100 mL) 중 Fmoc-Arg(Pbf)-N(Me)OMe(2) (50 g, 72.3 mmol)의 냉각된(-50℃) 용액을 캐뉼라를 통해 1시간의 기간에 걸쳐 적가하였다. -78℃에서 5시간 동안 교반한 후에, 혼합물을 1 N HCl 용액(300 mL)에 붓고, 추가 1 N HCl을 필요에 따라 첨가하여 pH를 4로 조정하고, 이어서 EtOAc(2 × 2 L)로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 건조시키고(Na2SO4), 감압 하에서 농축시켜, 황색 고체로서 45 g의 조 Fmoc-Arg(Pbf)-CHO(3)를 얻었으며, 이를 추가의 정제 없이 사용하였다.
D. Fmoc-psi-[Arg(Pbf)-Tyr(tBu)]-OAll(4)의 합성
THF(200 mL), MeOH(200 mL) 및 HOAc(15 mL) 중 단계 C로부터의 Fmoc-Arg(Pbf)-CHO(3)(45 g, 71.12 mmol) 및 단계 A로부터의 H2N-Tyr(tBu)-OAll(32 g, 115.37 mmol)의 빙랭 용액에 시아노붕수소화나트륨(18.0 g, 286.4 mmol)을 30분의 기간에 걸쳐 일부씩 첨가하고, 생성된 용액을 실온에서 하룻밤 교반하였다. 반응물을 포화 NaHCO3 수용액(500 mL)을 첨가하여 켄칭(quenching)하고, 혼합물을 EtOAc(2 × 2 L)로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 건조시키고(Na2SO4), 감압 하에서 농축시켰다. 잔류물을 EtOAc/석유 에테르(10:1)로 용리하는 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여, 황색 고체로서 40 g의 Fmoc-psi-[Arg(Pbf)-Tyr(tBu)]-OAll(4)을 얻었다.
E. Fmoc-psi-[Arg(Pbf)-N(Boc)Tyr(tBu)]-OAll(5)의 합성
MeCN(240 mL) 중 Fmoc-psi-[Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-OAll](4) (53 g, 59.28 mmol)의 용액에 다이-tert-부틸 다이카르보네이트(20 g, 91.3 mmol)를 첨가하고, 생성된 용액을 50℃에서 하룻밤 교반하였다. 이어서, 혼합물을 감압 하에서 농축시키고, 잔류물을 EtOAc/석유 에테르(1:1)로 용리하는 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여, 황색 고체로서 32 g의 Fmoc-psi-[Arg(Pbf)-N(Boc)Tyr(tBu)]-OAll(5)을 얻었다.
F. Fmoc-psi-[Arg(Pbf)-N(Boc)Tyr(tBu)]-OH(6)의 합성
질소 불활성 분위기 하에서 DCM(600 mL) 중 Fmoc-psi-[Arg(Pbf)-N(Boc)Tyr(tBu)]-OAll(5) (32 g, 32 mmol)의 냉각된(-30℃) 용액에 Pd(PPh3)4(3.0 g, 4.33 mmol)를 첨가한 후, N-메틸아닐린(10 g, 93 mmol)을 30분의 기간에 걸쳐 적가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 이어서 감압 하에서 농축시켰다. 잔류물을 EtOAc/석유 에테르(1:1)로 용리하는 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여, 황색을 띤 고체로서 26.8 g의 Fmoc-psi-[Arg(Pbf)-N(Boc)Tyr(tBu)]-OH(6)를 얻었다. 1H NMR (300 ㎒, CD3OD) δ 7.75-7.77 (2H, m), 7.59-7.60 (2H, m), 7.32-7.33 (4H, m), 7.09-7.11 (2H, m), 6.87-7.00 (2H, m), 4.27-4.50 (3H, m),3.30-3.50 (4H, m), 3.02-3.23 (3H, m), 2.75- 2.98 (3H, m), 2.57 (3H, s), 2.48 (3H, s), 2.00 (3H,s), 1.31-1.41 (28H, m). LC/MS (ES, m/z): C52H67N5O10S에 대한 질량 계산치: 953.46, 실측치: 954.55 [M+H]+.
2. Sieber 수지 상에의 Fmoc- psi -(R35-N(Boc)-Y36)의 로딩
프릿화된 마이크로파 반응 용기(CEM Corporation에 의해 공급됨) 내에서, NovaSyn TG Sieber 수지(Novabiochem에 의해 공급됨)(0.2 mmol)를 DMF(10 mL) 중 20% 피페리딘으로 처리하고, CEM 마이크로파 반응기 내에서 50℃에서 2.5분 동안 가열하였다. 반응물을 드레인(drain)하고, 수지를 DMF로 세척하고, CEM 마이크로파 반응기 내에서 50℃에서 5분 동안 DMF 중 20% 피페리딘으로 다시 처리하였다. 수지를 드레인하고 DMF로 세척한 후에, 탈보호 처리를 1회 더 반복하였다. 이어서, 수지를 DMF(4 mL) 중 상기로부터 얻어진 Fmoc-psi-[Arg(Pbf)-(N-Boc)Tyr(tBu)]-OH(3 내지 5 당량), HATU(2.75 내지 4.8 당량) 및 DIEA(6 내지 10 당량)의 용액으로 처리하고, 실온에서 6 내지 24시간 동안 혼합하였다. 혼합물을 드레인하고, 수지를 DMF로 광범위하게 세척하고, 이어서 50℃에서 5분 동안 마이크로파 조건 하에서 DMF(5 mL) 중 20% Ac2O로 처리하여 캡핑하였다. 반응물을 드레인하고, 수지를 DMF 및 DCM으로 광범위하게 세척하였다.
3. Fmoc-βA-IKPEAPGEK(Alloc)ASPEELNRYYASLRHYLNL(hC) TRQ( psi -R35Y36)-Sieber 수지의 합성
사전 로딩된 (psi-R35,Y36)-Sieber 수지(0.2 mmol) 상에의 아미노산 연장을 CEM Liberty Blue 마이크로파 펩티드 합성기 상에서 수행하였다. 표준 α-Fmoc-보호된 아미노산을, 커플링제로서 HBTU/DIEA를 사용하여 50℃에서 15분 동안 초기 수지 로딩량에 대해 3.8배 과량으로 이중-커플링하였다. Fmoc-Arg(Pbf)-OH는 2-단계 프로토콜(실온에서 25분, 이어서 50℃에서 15분)을 사용하여 이중 커플링하였고, Fmoc-His(Trt)-OH는 2-단계 프로토콜(실온에서 4분, 이어서 50℃에서 8분)을 사용하여 이중-커플링하였다.
4. Fmoc -βA - IKPEAPGEK(NH 2 )ASPEELNRYYASLRHYLNL (hC) TRQ ( psi - R35Y36 )- Sieber 수지의 합성: Alloc 탈보호
상기로부터 생성된 수지를 탈산소화된 DCM(10 mL) 중 페닐실란(25 당량)의 용액으로 처리하였다. 약 2분 동안 교반한 후에, DCM(10 mL) 중 Pd(PPh3)4(0.5 당량)의 용액을 첨가하고, 수지 혼합물을 아르곤 하에서 30분 동안 교반하였다. 반응물을 드레인하고, 수지를 탈산소화된 DCM으로 세척하였다. 새로운 시약으로 탈보호를 반복하고, 이후에 반응물을 드레인하고, 수지를 DCM 및 DMF로 광범위하게 세척하였다.
5. Fmoc-βA-IKPEAPGEK(NH-dPEG 12 -NHFmoc)ASPEELNRYY ASLRHYLNL(hC)TRQ( psi -R35Y36)-Sieber 수지의 합성: 11K 상에의 N-Fmoc dPEG 12 카르복실산의 커플링
상기로부터의 Alloc-탈보호된 펩티드-Sieber 수지를 50℃에서 15분 동안 CEM 마이크로파 반응기 내에서 DMF(7 mL) 중 N-Fmoc-dPEG12-카르복실산(5 당량), HBTU(4.8 당량) 및 DIEA(10당량)의 용액으로 처리하였으며, 이 시간쯤에 반응은 음성 카이저 시험을 나타내었다. 반응물을 드레인하고, 수지를 DMF 및 DCM으로 광범위하게 세척하였다.
6. BrCH 2 COHN-βA-IKPEAPGEK(NH-dPEG 12 -NHCOCH 2 Br)ASPEEL NRYYASLRHYLNL(hC)TRQ( psi -R35Y36)-Sieber 수지의 합성: βA 및 dPEG 12 에서의 비스-브로모아세틸화
상기 수지를 CEM 마이크로파 반응기 내에서 50℃에서 5분 동안 DMF 중 새로운 20% 피페리딘을 사용하여 Fmoc-탈보호를 거쳤다. 탈보호를 2회 반복하였다. 이렇게 얻어진 Fmoc-탈보호된 펩티드-수지를 CEM 마이크로파 반응기 내에서 50℃에서 10분 동안 DMF(5 mL) 중 브로모아세트산 무수물(20 당량)의 용액으로 처리하였으며, 이 시간쯤에 반응은 음성 카이저 시험을 나타내었다. 반응물을 드레인하고, 수지를 DMF 및 DCM으로 광범위하게 세척하고, 이어서 건조시켰다.
7. BrCH 2 COHN-βA-IKPEAPGEK(NH-dPEG 12 -NHCOCH 2 Br)ASPEEL NRYYASLRHYLNL(hC)TRQ( psi -R35Y36)-CONH 2 의 합성: 수지로부터의 절단 및 전역적 탈보호
건조된 수지를 DCM(10 mL) 중 1.5% TFA의 용액으로 처리하고, 5 내지 10분 동안 혼합하고, 이어서 여과하였다. 이러한 처리를 각각의 처리마다 새로운 칵테일을 사용하여 추가 9회 반복하였다. 이어서, 합한 여과액을 합하고 농축시켜, 황색 포말로서 조 보호된 펩티드를 얻었다. 이 포말을 실온에서 2.5시간 동안 20 mL의 절단 칵테일(TFA/페놀/H2O/TIPS = 88/5/5/2)로 처리하고, 이어서 질소 스트림 하에서 약 2.5 mL의 부피로 농축시키고, 이어서 차가운 에테르(40 mL)를 첨가하여 펩티드를 침전시켰다. 혼합물을 원심분리하고(5분; 5000 rpm) 디캔팅(decanting)하였다. 이 공정을 2회 더 반복하여, 황백색(off-white) 분말로서 조 펩티드를 얻었다.
대안적으로, 수지를 DCM 중 1 내지 2% TFA에 의한 전처리 없이 절단 칵테일로 처리하여 완전 탈보호된 펩티드를 얻었다.
8. 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 1: 환화 절차 A 및 정제
상기로부터의 조 펩티드를 탈산소화된 50% MeCN/물 중에 용해시키고(5 내지 10 mg/mL), EDTA(1 mM)를 선택적으로 첨가하였다. 이어서, 7.5 w/v % NaHCO3 용액의 첨가를 통해 반응 용액의 pH를 약 8로 상승시켰다. 생성된 용액을 실온에서 0.5 내지 2.5시간 동안 교반하고, 이어서 TFA의 첨가에 의해 pH를 1 미만으로 산성화하였다. 이어서, 용액을 감압 하에서 실온에서 원래 부피(약 24 mL)의 약 절반으로 농축시켰다. 생성된 용액을 역상 분취용 HPLC에 의해 정제하였다. Varian Pursuit XRs C18 컬럼(30 × 250 mm, 100 Å, 5 μm)을 사용하는 Gilson HPLC 2020 퍼스널 정제 시스템 상에서 정제를 수행하였다. 이동상은, 36분에 걸쳐 20% B의 초기 농도로부터 50% B의 최종 농도에 이르는 범위의, 완충액 A(물 중 0.1% TFA) 및 완충액 B(MeCN 중 0.1% TFA)의 구배 용리로 이루어졌다. 220 및 254 nm에서 UV 검출을 모니터링하였다. 상기에서와 동일한 컬럼 유형(4.6 × 250 mm, 5 μm)을 사용하는 Agilent 1100 HPLC 시스템 상에서의 분석용 HPLC에 의해 생성물-함유 분획을 분석하였다. 순수한 분획을 합하고, 이어서 동결건조시켜, 면-유사(cotton-like) 고체로서 생성물을 얻었다. LCMS: 12.27분에서의 생성물 피크에 대해 1225.5 (M+4H)/4, 1633.4 (M+3H)/3 및 2450.0 (M+2H)/2 (LC: Atlantis T3 C18 컬럼, 5 um, 4.6 × 250 mm, 1.0 mL/min, 15 내지 60% 구배).
실시예 2: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 2의 합성
1. H 2 N-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNL(hC) TRQRY-PAL-PEG 수지의 합성
반응도식 1에 나타낸 바와 같이, 0.1 mmol의 규모로 저 로딩 링크 아미드 수지, 바람직하게는 Fmoc-PAL-PEG PS 수지(약 0.16 내지 0.2 meq/g, Applied Biosystems에 의해 공급됨)를 사용하여 CEM Liberty Blue Microwave 펩티드 합성기 상에서, 전술된 바와 같이 Fmoc 전략을 사용하여 보호된 펩티딜 수지를 합성하였다. 표준 Fmoc-보호된 아미노산을 커플링제로서 DIC/옥시마를 사용하고 약 90℃의 반응 온도를 4분 동안 사용하여 수지 로딩량에 대해 5배 과량으로 커플링하였다. Fmoc-Arg(Pbf)-OH는 각각 4분 동안 90℃에서 이중 커플링하였고, Fmoc-His(Trt)-OH는 다음 2-단계 프로토콜을 사용하여 커플링하였다: 실온에서 4분, 이어서 50℃에서 8분. 90℃에서 1.5분 동안 DMF 중 20% 피페리딘(탈보호 용액)을 사용하여 단일 Fmoc 탈보호를 수행하였다.
2. m -BrCH 2 PhCOHN-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNL(hC) TRQRY-PAL-PEG 수지의 합성
상기로부터의 Fmoc-탈보호된 펩티드-수지(0.1 mmol)를 마이크로파 반응기 내에서 75℃에서 15분 동안 DMF(4 mL) 중 m-브로모메틸벤조산(20 당량) 및 DIC(10 당량)의 용액으로 처리하였으며, 이 시간쯤에 반응은 일반적으로 카이저 닌하이드린 시험에 따라 완료된 것으로 판단되었다(문헌[Kaiser, et al., Anal. Biochem., 1970, 34, 595-598]). 커플링이 불완전한 것으로 판단된 경우에, 새로운 시약을 사용하여 커플링을 반복하였다. 반응물을 드레인하고, 수지를 DMF 및 DCM으로 광범위하게 세척하였다.
3. m -BrCH 2 PhCOHN-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNL(hC) TRQRY-CONH 2 의 합성: 탈보호 및 수지로부터의 절단
이어서, 상기로부터의 수지를 TFA/물/페놀/TIPS(88:5:5:2)로 이루어진 절단 칵테일(10 mL / 0.1 mmol 규모)로 처리하고, 38℃에서 40분 동안 마이크로파 반응기 내에서 가열하고, 이어서 여과하였다. 수지를 TFA로 세척하고, 합한 여과액을 질소 스트림 하에서 약 2.5 mL의 부피로 농축시키고, 펩티드를 차가운 다이에틸 에테르(40 mL)의 첨가에 의해 침전시켰다. 펩티드/에테르 현탁액을 원심분리하고, 에테르 층을 디캔팅하였다. 펩티드 펠릿을 에테르 중에 재현탁시키고, 원심분리하고, 디캔팅하고, 이 공정을 3회째로 반복하였다. 이렇게 얻어진 조 펩티드를 온화한 질소 스트림 하에서 건조시켰다.
4. 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 2: 환화 절차 A 및 정제
상기로부터의 조 펩티드를 4 mg/mL 이하의 농도로, 탈산소화된 MeCN/물(60% MeCN) 중에 용해시켰다. 이어서, NH4OAc 수용액(200 mM, pH 8.4)의 첨가를 통해 펩티드 용액의 pH를 약 7 내지 9로 상승시키고, 생성된 용액을 LCMS에 따라 환화가 완료될 때까지(전형적으로, 3 내지 4시간) 실온에서 교반하였다. 환화 반응 혼합물을 TFA의 첨가에 의해 pH 1.5 내지 3으로 산성화하고, 용액을 농축시켜 대부분의 유기 공용매를 약간의 혼탁이 일어나는 시점까지 제거하였다. 최소량의 MeCN을 필요에 따라 다시 첨가하여 혼합물이 균질하게 되게 하고, 이어서 생성된 용액을 C18 Varian Pursuit XRs C18 (21×250 mm, 100 Å, 5 μm) 컬럼을 사용하여 다회의 주입으로 분취용 HPLC에 의해 직접 정제하였다. 이동상은, 45분에 걸쳐 20% B의 초기 농도로부터 40% B의 최종 농도에 이르는 범위의, 완충액 A(물 중 0.1% TFA) 및 완충액 B(MeCN 중 0.1% TFA)의 구배 용리로 이루어졌다. 220 및 254 nm에서 UV 검출을 모니터링하였다. 적절한 컬럼을 사용하는 Agilent 1100 HPLC 시스템 상에서의 분석용 HPLC에 의해 생성물-함유 분획을 분석하였다. 순수한 분획을 합하고, 농축시켜 유기 상의 대부분을 제거하고, 이어서 동결건조시켰다.
실시예 3: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 3의 합성
1. (H 2 N)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNL-(아지도-norLeu)-TRQRYPAL-PEG 수지의 합성
위치 31에서 Fmoc-hCys(trt)-OH 대신에 Fmoc-아지도norLeu-OH를 사용하여, 실시예 2, 단계 1에 기재된 방법에 따라 0.1 mmol 규모로 수지-결합된 펩티드를 제조하였다.
2. (HCCH(CH 2 ) 2 CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNL-(아지도-norLeu)-TRQRYPAL-PEG 수지의 합성
DIC/HOBT 프로토콜을 사용하여 마이크로파 조건 하에서(75℃, 10분) 상기 수지 상에 4-펜틴산을 커플링하였다. 반응물을 드레인하고, 수지를 DMF 및 DCM으로 광범위하게 세척하였다.
3. (HCCH(CH 2 ) 2 CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNL-(아지도-norLeu)-TRQRYPAL-CONH 2 의 합성
상기 수지를 마이크로파 조건 하에서(38℃, 40분) TFA/DODT/H2O/TIS(92.5:2.5:2.5:2.5)로 이루어진 10 mL의 절단 칵테일로 처리하였다. 반응물을 드레인하고, 수지를 TFA(10 mL)로 세척하였다. 이어서, 합한 여과액을 질소 스트림 하에서 약 2.5 mL의 부피로 농축시켰다. 이어서, 차가운 에테르(40 mL)를 첨가하여 펩티드를 침전시키고, 혼합물을 원심분리하고(5분; 5000 rpm), 디캔팅하였다. 이 공정을 2회 더 반복하여, 황백색 분말로서 조 펩티드를 얻었다.
4. 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 3
2 mL의 탈산소화된 H2O 중 7 mg의 CuSO4를 제조하였다. 5.4 mL의 EtOH 및 0.6 mL의 MeCN 중 30 mg의 TBTA를 제조하였다. 0.94 mL의 CuSO4 용액과 4.8 mL의 TBTA 용액을 예비혼합하였다. 3 mL의 탈산소화된 H2O 중 30 mg의 소듐 아스코르베이트를 제조하였다.
20 mL의 탈산소화된 물 중 단계 3으로부터의 조 아지도-함유 펩티드 용액(100 mg)의 용액에 예비혼합된 CuSO4/TBTA 용액을 첨가한 후, 2.4 mL의 소듐 아스코르베이트 용액을 첨가하였다(용액은 즉시 유백색으로 되었다). 혼합물을 40℃로 가온하고, 1.5시간 동안 교반하고, 이 시점에서 LCMS 분석은 완전한 반응을 나타내었다. 혼합물을 물(0.1% TFA)을 사용하여 약 40 mL로 희석시키고; 혼합물을 원심분리하고, 상층액을 역상 분취용 HPLC에 의해 정제하였다. 35℃에서 Varian Pursuit XRs C18 컬럼(21 × 250 mm, 100 Å, 5 μm)을 사용하여 정제를 수행하였다. 이동상은, 35분에 걸쳐 10% B의 초기 농도로부터 18% B의 중간 농도로(21 mpm), 그리고 이어서 33% B의 최종 농도에 이르는(10.5 mpm) 범위의, 완충액 A(물 중 0.1% TFA) 및 완충액 B(MeCN 중 0.1% TFA)의 구배 용리로 이루어졌다. 220 및 254 nm에서 UV 검출을 모니터링하였다. 상기에서와 동일한 컬럼 유형(4.6 × 250 mm, 5 μm)을 사용하는 Agilent 1100 HPLC 시스템 상에서의 분석용 HPLC에 의해 생성물-함유 분획을 분석하였다. 순수한 분획을 합하고, 이어서 동결건조시켜, 면-유사 고체로서 생성물을 얻었다.
실시예 4: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 4의 합성
1. (Dde)K(NH 2 )ASPEELNRYYASLRHYLNL(hC) TRQRY-PAL-PEG 수지의 합성
실시예 2, 단계 1에 기재된 방법을 사용하여, 수지-결합된 펩티드를 제조하였다.
2. (Dde)K(NH-Glu-(OtBu)NH 2 )ASPEELNRYYASLRHYLNL(hC) TRQRY-PAL-PEG 수지의 합성
DIC/옥시마 커플링 방법을 사용하여 마이크로파 조건 하에서(90℃, 6분; dc) 상기 수지 상에 Fmoc-Glu-OtBu(5 당량)를 커플링하였다. 수지를 드레인하고, DMF로 세척하였다. 이어서, 3-단계 프로토콜(75℃에서 0.5분 동안; 75℃에서 3분 동안; 75℃에서 3분 동안) (각각의 단계마다 DMF 세척이 행해짐)을 사용하여 DMF 중 20% 피페리딘을 사용하여 Fmoc 탈보호를 수행하였다.
3. (Dde)K(NH-Glu-(OtBu)NH-Pal)ASPEELNRYYASLRHYLNL(hC) TRQRY-PAL-PEG 수지의 합성
DIC/옥시마 커플링 방법을 사용하여 마이크로파 조건 하에서(90℃, 5분) 상기 수지 상에 팔미트산(5 당량)을 커플링하였다. 수지를 드레인하고, DMF 및 DCM으로 광범위하게 세척하였다.
4. (H 2 N)K(NH-Glu-(OtBu)NH-Pal)ASPEELNRYYASLRHYLNL(hC) TRQRY-PAL-PEG 수지의 합성
상기 수지를 DMF로 세척한 후, 그것을 실온에서 5분 동안 DMF 중 2% 하이드라진의 용액으로 처리하고(6 mL / 0.1 mmol 수지), 이어서 드레인하고, DMF로 세척하였다. 이 처리를 추가 5회 반복하였다.
5. (H 2 N)IKPEAPGEK(NH-Glu-(OtBu)NH-Pal)ASPEELNRYYASLRHYLNL(hC) TRQRY-PAL-PEG 수지의 합성
실시예 2, 단계 1에 기재된 방법을 사용하여, 나머지 아미노산 커플링을 수행하였다.
6. 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 4
실시예 2, 단계 2 내지 단계 4에 기재된 방법을 사용하여 합성의 나머지 부분을 수행하였다. 실온에서 Varian Pursuit XRS C18 컬럼(21 × 250 mm, 100 Å, 5 μm)을 사용하여 생성물 정제를 수행하였다. 이동상은, 5분에 걸쳐 23% B로부터 33% B의 중간 농도로(21 mpm), 그리고 이어서 55분에 걸쳐 48% B의 최종 농도에 이르는(10.5 mpm) 범위의, 완충액 A(물 중 0.1% TFA) 및 완충액 B(MeCN 중 0.1% TFA)의 구배 용리로 이루어졌다.
실시예 5: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 5의 합성
단계 3에서 팔미트산 대신에 α-토코페릴옥시아세트산(AcVitE)(8)을 사용하여, 실시예 4에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 실온에서 Agilent 300SB C8 컬럼(21 × 250 mm, 100 Å, 5 μm)을 사용하여 생성물 정제를 수행하였다. 이동상은, 5분에 걸쳐 35% B의 초기 농도로부터 45% B의 중간 농도로(21 mpm), 그리고 이어서 60분에 걸쳐 60% B의 최종 농도에 이르는(10.5 mpm) 범위의, 완충액 A(물 중 0.1% TFA) 및 완충액 B(MeCN 중 0.1% TFA)의 구배 용리로 이루어졌다.
실시예 6: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 6의 합성
1. (HCCH(CH 2 ) 2 CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNK(Dde)-(아지도-norLeu)-TRQRY-PAL-PEG 수지의 합성
실시예 3, 단계 1에서, 위치 30에서 Fmoc-Leu-OH 대신에 Fmoc-Lys(Dde)-OH를 사용하고, 이 단계에서 위치 2에 4-펜틴산(이중 커플링됨)을 도입한 후, 위치 3에 Fmoc-Ile-OH를 도입하여, 실시예 3, 단계 1에 기재된 바와 같이 수지-결합된 펩티드를 제조하였다.
2. (HCCH(CH 2 ) 2 CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNK(NH 2 )-(아지도-norLeu)-TRQRY-PAL-PEG 수지의 합성
상기 수지를 실온에서 5분 동안 DMF 중 3% 하이드라진으로 처리하고(8 mL / 0.1 mmol 규모), 이어서 혼합물을 드레인하고, DMF로 세척하였다. 이 절차를 약 5회 반복하였으며, 이후에 수지를 DMF로 그리고 이어서 DCM으로 광범위하게 세척하였다.
3. (HCCH(CH 2 ) 2 CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNK(NH-γ-Glu-AcVitE)-(아지도-norLeu)-TRQRY-PAL-PEG 수지의 합성
5분의 커플링 시간으로 실시예 2, 단계 1에 기재된 커플링 프로토콜을 사용하여, Fmoc-Glu-OtBu를 상기 수지 상에 커플링하였다. 3-단계 마이크로파 프로토콜(75℃, 0.5분; 75℃, 3분; 75℃, 3분)을 사용하여 DMF 중 20% 피페리딘으로 처리함으로써 수지를 탈보호하고, 이후에 수지를 DMF 및 DCM으로 광범위하게 세척하였다. 이어서, Fmoc-Glu-OtBu를 커플링하기 위해 사용된 것과 동일한 절차를 사용하여, α-토코포릴옥시아세트산(AcVitE)(8)을 수지 상에 커플링하였다.
4. (HCCH(CH 2 ) 2 CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNK(NH-γ-Glu-AcVitE)-(아지도-norLeu)-TRQRY-CONH 2 의 합성
실시예 3, 단계 3에 기재된 절차를 사용하여, 상기 수지로부터의 펩티드의 절단 및 침전을 수행하였다.
5. 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 6
실시예 3, 단계 4에 기재된 절차를 사용하여 표제 화합물을 제조하였다. 35℃에서 Varian Pursuit XRs C8 컬럼(21 × 250 mm, 100 Å, 5 μm) 상에서 생성물 정제를 수행하였다. 이동상은, 5분에 걸쳐 35% B의 초기 농도로부터 48% B의 중간 농도로(21 mpm), 그리고 이어서 40분에 걸쳐 63% B의 최종 농도에 이르는(10.5 mpm) 범위의, 완충액 A(물 중 0.1% TFA) 및 완충액 B(MeCN 중 0.1% TFA)의 구배 용리로 이루어졌다.
실시예 7: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 7의 합성
위치 11 대신에 위치 9에 K(NH-γ-Glu-Pal) 잔기를 도입하여, 실시예 4에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 실온에서 Agilent 300SB C8 컬럼(21 × 250 mm, 100 Å, 5 μm)을 사용하여 생성물 정제를 수행하였다. 이동상은, 40분에 걸쳐 23% B의 초기 농도로부터 43% B의 중간 농도로(21 mpm), 그리고 이어서 43% B의 최종 농도에 이르는(10.5 mpm) 범위의, 완충액 A(물 중 0.1% TFA) 및 완충액 B(MeCN 중 0.1% TFA)의 구배 용리로 이루어졌다. 80분에 걸쳐 25% B의 초기 농도로부터 35% B의 중간 농도로(21 mpm), 그리고 이어서 45% B의 최종 농도에 이르기까지(10.5 mpm)의 구배를 사용하여 실온에서 Waters T3 C18 컬럼(250 × 19 mm, 100 Å, 5 μm) 상에서 불순한 생성물-함유 분획을 재정제하였다.
실시예 8: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 8의 합성
위치 11 대신에 위치 30에 K(NH-γ-Glu-Pal) 잔기를 도입하여, 실시예 4에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 35℃에서 Agilent 300SB C8 컬럼(21 × 250 mm, 100 Å, 5 μm)을 사용하여 생성물 정제를 수행하였다. 이동상은, 40분에 걸쳐 21% B의 초기 농도로부터 31% B의 중간 농도로(21 mpm), 그리고 이어서 41% B의 최종 농도에 이르는(10.5 mpm) 범위의, 완충액 A(물 중 0.1% TFA) 및 완충액 B(MeCN 중 0.1% TFA)의 구배 용리로 이루어졌다. 80분에 걸쳐 21% B의 초기 농도로부터 31% B의 중간 농도로(21 mpm), 그리고 이어서 40% B의 최종 농도에 이르기까지(10.5 mpm)의 구배를 사용하여 실온에서 Waters T3 C18 컬럼(250 × 19 mm, 100 Å, 5 μm) 상에서 불순한 생성물-함유 분획을 재정제하였다.
실시예 9: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 9의 합성
1. H 2 N-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNL(hC) TRQ( psi -R35Y36)-Sieber 수지의 합성
5배 과량의 보호된 아미노산을 사용하는 변형을 가하여, 실시예 1, 단계 3에 기재된 바와 같이, 실시예 1, 단계 2로부터의 사전 로딩된 (psi-R35, Y36)-Sieber 수지 상에 아미노산 연장을 수행하였다.
2. m -BrCH 2 PhCOHN-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNL(hC) TRQ( psi -R35Y36)-Sieber 수지의 합성
75℃ 대신에 50℃에서 커플링을 수행하는 변형을 가하여, 실시예 1, 단계에 기재된 절차에 따라 상기 수지 상에 m-브로모메틸벤조산을 커플링하였다.
3. 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 9
실시예 1, 단계 7 및 단계 8에 기재된 절차에 따라 상기 수지로부터 표제 화합물을 제조하였다. 35℃에서 Varian Pursuit XRs C18 컬럼(21 × 250 mm, 100 Å, 5 μm)을 사용하여 생성물 정제를 수행하였다. 이동상은, 10분에 걸쳐 10% B의 초기 농도로부터 18% B의 중간 농도로(21 mpm), 그리고 이어서 35분에 걸쳐 33% B의 최종 농도에 이르는(10.5 mpm) 범위의, 완충액 A(물 중 0.1% TFA) 및 완충액 B(MeCN 중 0.1% TFA)의 구배 용리로 이루어졌다.
실시예 10: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 10의 합성
단계 3에서, 위치 30에서 Fmoc-Leu-OH 대신에 Dde-Lys(Fmoc)-OH를 그리고 팔미트산 대신에 α-토코페릴옥시아세트산(AcVitE)(8)을 사용하여, 실시예 4에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 실온에서 Agilent 300SB C8 컬럼(21 × 250 mm, 100 Å, 5 μm)을 사용하여 생성물 정제를 수행하였다. 이동상은, 10분에 걸쳐 30% B의 초기 농도로부터 40% B의 중간 농도로(21 mpm), 그리고 이어서 35분에 걸쳐 55% B의 최종 농도에 이르는(21 mpm) 범위의, 완충액 A(물 중 0.1% TFA) 및 완충액 B(MeCN 중 0.1% TFA)의 구배 용리로 이루어졌다. 5분에 걸쳐 35% B의 초기 농도로부터 43% B의 중간 농도로(21 mpm), 그리고 이어서 40분에 걸쳐 58% B의 최종 농도에 이르기까지(10.5 mpm)의 변형된 구배를 사용하여 불순한 생성물-함유 분획을 재정제하였다.
실시예 11: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 11의 합성
1. (Alloc)K(NH 2 )-(hC)-TRQ( psi -R35Y36)-Sieber 수지
위치 30에서 Fmoc-Leu-OH 대신에 Alloc-Lys(Fmoc)-OH를 사용하여, 실시예 9, 단계 1에 기재된 절차에 따라 상기 수지를 제조하였다.
2. (Alloc)K(NH-γ-Glu-AcVitE)-(hC)-TRQ( psi -R35Y36)-Sieber 수지의 합성
Fmoc-Glu-OtBu 및 α-토코페릴옥시아세트산(AcVitE)(8) (각각 5 당량)을 50℃에서 15 내지 20분 동안 마이크로파 조건 하에서 HBTU/DIEA-매개 커플링을 사용하여 상기 수지 상에 순차적으로 커플링하였다.
3. H 2 N-K(NH-γ-Glu-AcVitE)-(hC)-TRQ( psi -R35Y36)-Sieber 수지의 합성
실시예 1, 단계 4에 기재된 절차에 따라 alloc 보호기를 제거하였다.
4. 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 11
NH4OAc 완충액 대신에 1 M TRIS/HCl 완충액(pH 7.5)을 사용하여 환화를 달성하는 변형을 가하여, 실시예 9, 단계 1 내지 단계 3에 기재된 절차에 따라 상기 수지로부터 표제 화합물을 제조하였다. 35℃에서 Varian Pursuit XRs C18 컬럼(21 × 250 mm, 100 Å, 5 μm)을 사용하여 생성물 정제를 수행하였다. 이동상은, 10분에 걸쳐 10% B의 초기 농도로부터 18% B의 중간 농도로(21 mpm), 그리고 이어서 35분에 걸쳐 33% B의 최종 농도에 이르는(10.5 mpm) 범위의, 완충액 A(물 중 0.1% TFA) 및 완충액 B(MeCN 중 0.1% TFA)의 구배 용리로 이루어졌다.
실시예 12: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 12의 합성
단계 1에서, 위치 35에서 Fmoc-Arg(pbf)-OH 대신에 Fmoc-N-Me-Arg(pbf)-OH를 사용하고, 이와 함께, NH4OAc 완충액 대신에 1 M NaHCO3 완충액을 사용하여 환화를 달성하는 변형을 가하여, 실시예 2에 기재된 바와 같은 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 실온에서 Varian Pursuit XRs C18 컬럼(30 × 250 mm, 100 Å, 5 μm)을 사용하여 생성물 정제를 수행하였다. 이동상은, 36분에 걸쳐 10% B로부터 60% B에 이르는(30 mpm) 범위의, 완충액 A(물 중 0.1% TFA) 및 완충액 B(MeCN 중 0.1% TFA)의 구배 용리로 이루어졌다.
실시예 13: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 13의 합성
단계 2에서, α-토코페릴옥시아세트산(AcVitE)(8) 대신에 팔미트산을 사용하고, 이와 함께, 용매로서 MeCN/H2O 대신에 60% EtOH/H2O를 사용하고, NH4OAc 완충액 대신에 포화 NaHCO3 수용액을 사용하여 환화를 달성하는 변형을 가하여, 실시예 11에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 실온에서 Waters XBridge C18 OBD 컬럼(50 × 250 mm, 5 μm)을 사용하여 생성물 정제를 수행하였다. 이동상은, 5분에 걸쳐 15% B의 초기 농도로부터 20% B의 중간 농도로(100 mpm), 그리고 이어서 40분에 걸쳐 35% B의 최종 농도에 이르는(100 mpm) 범위의, 완충액 A(물 중 10 mM NH4OH, 약 pH 9) 및 완충액 B(MeCN)의 구배 용리로 이루어졌다.
실시예 14: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 14의 합성
단계 1에서 위치 11 대신에 위치 30에 Lys(NH-γ-Glu-Pal) 잔기를 도입하고, 위치 35에서 Fmoc-Arg(pbf)-OH 대신에 Fmoc-N-Me-Arg(pbf)-OH를 사용하고, 이와 함께, 단계 6에서 NH4OAc 완충액 대신에 1 M NaHCO3 완충액을 사용하여 환화를 달성하는 변형을 가하여, 실시예 4에 기재된 바와 같은 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 실온에서 Varian Pursuit XRs C18 컬럼(30 × 250 mm, 100 Å, 5 μm)을 사용하여 생성물 정제를 수행하였다. 이동상은, 36분에 걸쳐 20% B로부터 70% B에 이르는(30 mpm) 범위의, 완충액 A(물 중 0.1% TFA) 및 완충액 B(MeCN 중 0.1% TFA)의 구배 용리로 이루어졌다. 25분에 걸쳐 30 내지 50% B의 구배를 사용하여(30 mpm) 실온에서 Varian Pursuit XRs 다이페닐 컬럼(30 × 100 mm, 100 Å, 5 μm) 상에서 불순한 분획을 재정제하였다.
실시예 15: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 15의 합성
위치 11 대신에 위치 30에 Lys(NH-γ-Glu-Pal) 잔기를 도입하고, 위치 3에서의 Fmoc-Ile-OH 커플링 대신에 Fmoc-βAla-OH를 사용하고, 이와 함께, NH4OAc 완충액 대신에 1 M NaHCO3 완충액을 사용하여 환화를 달성하고, 하기 절차를 사용하여 단계 6(실시예 2로부터 단계 2)에서 m-브로모메틸벤조산 대신에 브로모아세트산 무수물과의 커플링을 사용하는 변형을 가하여, 실시예 4에 기재된 바와 같은 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. Fmoc-탈보호된 펩티드-수지(0.1 mmol)를 마이크로파 반응기 내에서 50℃에서 5 내지 10분 동안 DMF(5 mL) 중 브로모아세트산 무수물(10 당량)의 용액으로 처리하였으며, 이 시간쯤에 반응은 일반적으로 카이저 닌하이드린 시험에 따라 완료된 것으로 판단되었다. 커플링이 불완전한 것으로 판단된 경우에, 새로운 시약을 사용하여 커플링을 반복하였다. 실온에서 Varian Pursuit XRs C18 컬럼(30 × 250 mm, 100 Å, 5 μm)을 사용하여 생성물 정제를 수행하였다. 이동상은, 36분에 걸쳐 20% B로부터 60% B에 이르는(30 mpm) 범위의, 완충액 A(물 중 0.1% TFA) 및 완충액 B(MeCN 중 0.1% TFA)의 구배 용리로 이루어졌다. 25분에 걸쳐 30 내지 50% B의 구배를 사용하여(30 mpm) 실온에서 Varian Pursuit XRs 다이페닐 컬럼(30 × 100 mm, 100 Å, 5 μm) 상에서 불순한 분획을 재정제하였다.
실시예 16: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 16의 합성
위치 11 대신에 위치 30에 Lys(NH-γ-Glu-Pal) 잔기를 도입하고, 위치 3에서 Fmoc-Ile-OH 커플링을 생략하고, 단계 6(실시예 2로부터의 단계 2)에서 m-브로모메틸벤조산 대신에 p-브로모메틸벤조산을 사용하여, 실시예 4에 기재된 바와 같은 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 추가적으로, NH4OAc 완충액 대신에 1 M NaHCO3 완충액을 사용하여 환화를 달성하였다. 실온에서 Varian Pursuit XRs C18 컬럼(30 × 250 mm, 100 Å, 5 μm)을 사용하여 생성물 정제를 수행하였다. 이동상은, 36분에 걸쳐 20% B로부터 70% B에 이르는(30 mpm) 범위의, 완충액 A(물 중 0.1% TFA) 및 완충액 B(MeCN 중 0.1% TFA)의 구배 용리로 이루어졌다. 25분에 걸쳐 30 내지 50% B의 구배를 사용하여(30 mpm) 실온에서 Varian Pursuit XRs 다이페닐 컬럼(30 × 100 mm, 100 Å, 5 μm) 상에서 불순한 분획을 재정제하였다.
실시예 17: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 17의 합성
단계 1에서, 위치 11 대신에 위치 30에 Lys(NH-γ-Glu-Pal) 잔기를 도입하고, 위치 4에서 Fmoc-Lys(Boc)-OH 대신에 Fmoc-Ala-OH를 사용하여, 실시예 4에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 단계 6에서 NH4OAc 완충액 대신에 TRIS/HCl 완충액(1 M, pH 7.5)을 사용하여 환화를 달성하였다. 실온에서 Agilent Polaris C18-A 컬럼(30 × 250 mm, 100 Å, 5 μm)을 사용하여 생성물 정제를 수행하였다. 이동상은, 5분에 걸쳐 20% B의 초기 농도로부터 35% B의 중간 농도로(40 mpm), 그리고 이어서 40분에 걸쳐 45% B의 최종 농도에 이르는(40 mpm) 범위의, 완충액 A(물 중 0.1% TFA) 및 완충액 B(MeCN 중 0.1% TFA)의 구배 용리로 이루어졌다.
실시예 18: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 18의 합성
단계 1에서, 위치 11 대신에 위치 30에 Lys(NH-γ-Glu-Pal) 잔기를 도입하고, 위치 4에서 Fmoc-Lys(Boc)-OH 대신에 Fmoc-Glu(OtBu)-OH를 사용하여, 실시예 4에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 단계 6에서 NH4OAc 완충액 대신에 TRIS/HCl 완충액(1 M, pH 7.5)을 사용하여 환화를 달성하였다. 실온에서 Agilent Polaris C18-A 컬럼(30 × 250 mm, 100 Å, 5 μm)을 사용하여 생성물 정제를 수행하였다. 이동상은, 5분에 걸쳐 20% B의 초기 농도로부터 35% B의 중간 농도로(40 mpm), 그리고 이어서 40분에 걸쳐 45% B의 최종 농도에 이르는(40 mpm) 범위의, 완충액 A(물 중 0.1% TFA) 및 완충액 B(MeCN 중 0.1% TFA)의 구배 용리로 이루어졌다.
실시예 19: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 19의 합성
단계 1에서, 위치 11 대신에 위치 30에 Lys(NH-γ-Glu-Pal) 잔기를 도입하고, 위치 35에서 Fmoc-Arg(pbf)-OH 대신에 Fmoc-N-Me-Arg(pbf)-OH를 사용하고, Fmoc-hCys(trt)-OH 대신에 Fmoc-Cys(trt)-OH를 사용하고, 단계 6(실시예 2로부터의 단계 2)에서 m-브로모메틸벤조산 대신에 p-브로모메틸벤조산을 사용하여, 실시예 4에 기재된 바와 같은 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다.
단계 6(실시예 2로부터의 단계 3 및 단계 4)에 대해 하기 변형을 가하였다: 환화 전에 얻어진 조 펩티드를 실온에서 Varian Pursuit XRs C18 컬럼(30 × 250 mm, 100 Å, 5 μm)을 사용하여 정제하였다. 이동상은, 36분에 걸쳐 20% B로부터 70% B에 이르는(30 mpm) 범위의, 완충액 A(물 중 0.1% TFA) 및 완충액 B(MeCN 중 0.1% TFA)의 구배 용리로 이루어졌다. 생성물-함유 분획을 합하고, 고체 NaHCO3로 처리하여 pH를 약 7 내지 8로 상승시켰으며; 생성된 용액을 실온에서 4시간 동안 교반하고, 이어서 TFA를 사용하여 pH 4로 산성화하였다. 용액을 5 내지 10 mL의 부피로 농축시키고, MeCN을 첨가하여 임의의 침전물을 가용화하였다. 36분에 걸쳐 20 내지 60% B의 구배를 사용하여(30 mpm), 상기에서와 같이 생성물 정제를 수행하였다.
실시예 20: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 20의 합성
단계 1에서, 위치 11 대신에 위치 30에 Lys(NH-γ-Glu-Pal) 잔기를 도입하고, 위치 35에서 Fmoc-Arg(pbf)-OH 대신에 Fmoc-N-Me-Arg(pbf)-OH를 사용하고, Fmoc-hCys(trt)-OH 대신에 Fmoc-Cys(trt)-OH를 사용하여, 실시예 4에 기재된 바와 같은 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 조 선형 펩티드를 실시예 19에 기재된 변형에 따라 정제하고 환화하였다. 36분에 걸쳐 20 내지 60% B의 구배를 사용하여(30 mpm), 최종 생성물 정제를 수행하였다.
실시예 21: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 21의 합성
단계 1에서, 위치 11 대신에 위치 30에 Lys(NH-γ-Glu-Pal) 잔기를 도입하고, 위치 26에서 Fmoc-His(trt)-OH 대신에 Fmoc-Ala-OH를 사용하고, 위치 4에서 Fmoc-Lys(Boc)-OH 대신에 Fmoc-Ala-OH를 사용하여, 실시예 4에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 단계 6에서 NH4OAc 완충액 대신에 TRIS/HCl 완충액(1 M, pH 7.5)을 사용하여 환화를 달성하였다. 실온에서 Agilent Polaris C18-A 컬럼(30 × 250 mm, 100 Å, 5 μm)을 사용하여 생성물 정제를 수행하였다. 이동상은, 5분에 걸쳐 20% B의 초기 농도로부터 35% B의 중간 농도로(40 mpm), 그리고 이어서 40분에 걸쳐 45% B의 최종 농도에 이르는(40 mpm) 범위의, 완충액 A(물 중 0.1% TFA) 및 완충액 B(MeCN 중 0.1% TFA)의 구배 용리로 이루어졌다.
실시예 22: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 22의 합성
단계 1에서, 위치 11 대신에 위치 30에 Lys(NH-γ-Glu-Pal) 잔기를 도입하고, 위치 26에서 Fmoc-His(trt)-OH 대신에 Fmoc-Ala-OH를 사용하고, 위치 4에서 Fmoc-Lys(Boc)-OH 대신에 Fmoc-Glu(OtBu)-OH를 사용하여, 실시예 4에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 단계 6에서 NH4OAc 완충액 대신에 TRIS/HCl 완충액(1 M, pH 7.5)을 사용하여 환화를 달성하였다. 실온에서 Agilent Polaris C18-A 컬럼(30 × 250 mm, 100 Å, 5 μm)을 사용하여 생성물 정제를 수행하였다. 이동상은, 5분에 걸쳐 20% B의 초기 농도로부터 33% B의 중간 농도로(40 mpm), 그리고 이어서 40분에 걸쳐 43% B의 최종 농도에 이르는(40 mpm) 범위의, 완충액 A(물 중 0.1% TFA) 및 완충액 B(MeCN 중 0.1% TFA)의 구배 용리로 이루어졌다.
실시예 23: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 23의 합성
단계 2에서, α-토코페릴옥시아세트산(AcVitE)(8) 대신에 옥타데칸이산, 모노-tert-부틸 에스테르(AstaTech, Inc.로부터 입수가능함)를 사용하고, 50℃에서 30분 동안 HATU/DIEA를 그리고 용매로서 DMF 대신에 NMP를 사용하는 커플링 프로토콜을 사용하고, 단계 2에서, Fmoc-Glu-OtBu를 커플링하기 전에 탠덤 형태로(in tandem) Fmoc-OEG-OH의 2개의 단위를 커플링하여, 실시예 11에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 조 선형 펩티드를, 20 내지 60% B의 구배를 사용하여, 실시예 19에 기재된 변형에 따라 정제하고 환화하였다. 36분에 걸쳐 20 내지 70% B의 구배를 사용하여(30 mpm), 최종 생성물 정제를 수행하였다.
실시예 24: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 24의 합성
옥타데칸이산, 모노-tert-부틸 에스테르 대신에 20-(tert-부톡시)-20-옥소아이코산산(Key Organics, Inc.로부터 입수가능함)을 사용하여, 실시예 23에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 조 선형 펩티드를, 20 내지 60% B의 구배를 사용하여, 실시예 19에 기재된 변형에 따라 정제하고 환화하였다. 36분에 걸쳐 20 내지 60% B의 구배를 사용하여(30 mpm), 최종 생성물 정제를 수행하였다.
실시예 25: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 25의 합성
단계 2에서, α-토코페릴옥시아세트산(AcVitE)(8) 대신에 스테아르산을 사용하고, 50℃에서 30분 동안 HATU/DIEA를 사용하는 커플링 프로토콜을 사용하고, DMF 대신에 용매로서 NMP를 사용하여, 실시예 11에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 조 선형 펩티드를, 20 내지 80% B의 구배를 사용하여, 실시예 19에 기재된 변형에 따라 정제하고 환화하였다. 36분에 걸쳐 20 내지 80% B의 구배를 사용하여(30 mpm), 최종 생성물 정제를 수행하였다.
실시예 26: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 26의 합성
단계 2에서, α-토코페릴옥시아세트산(AcVitE)(8) 대신에 아라키드산을 사용하고, 50℃에서 30분 동안 HATU/DIEA를 사용하는 커플링 프로토콜을 사용하고, DMF 대신에 용매로서 NMP를 사용하여, 실시예 11에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 조 선형 펩티드를, 20 내지 90% B의 구배를 사용하여, 실시예 19에 기재된 변형에 따라 정제하고 환화하였다. 36분에 걸쳐 20 내지 90% B의 구배를 사용하여(30 mpm), 최종 생성물 정제를 수행하였다.
실시예 27: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 27의 합성
탠덤 Fmoc-OEG-OH 커플링 후에 Fmoc-Glu-OtBu의 커플링을 생략한 것을 제외하고는, 실시예 23에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 조 선형 펩티드를, 20 내지 60% B의 구배를 사용하여, 실시예 19에 기재된 변형에 따라 정제하고 환화하였다. 36분에 걸쳐 20 내지 60% B의 구배를 사용하여(30 mpm), 최종 생성물 정제를 수행하였다.
실시예 28: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 28의 합성
α-토코페릴옥시아세트산(AcVitE)(8) 대신에 팔미트산을 사용하고, 위치 3에서 Fmoc-Ile-OH의 커플링을 생략하고, 단계 4(실시예 9, 단계 2)에서 m-브로모메틸벤조산 대신에 p-브로모메틸벤조산을 사용하여, 실시예 11에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 조 선형 펩티드를, 20 내지 60% B의 구배를 사용하여, 실시예 19에 기재된 변형에 따라 정제하고 환화하였다. 36분에 걸쳐 20 내지 60% B의 구배를 사용하여(30 mpm), 최종 생성물 정제를 수행하였다.
실시예 29: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 29의 합성
α-토코페릴옥시아세트산(AcVitE)(8) 대신에 팔미트산을 사용하고, 위치 3에서 Fmoc-Ile-OH 대신에 Fmoc-βAla-OH를 사용하고, 실시예 15에 기재된 변형을 사용하여 단계 4(실시예 9, 단계 2)에서 m-브로모메틸벤조산 대신에 브로모아세트산 무수물을 커플링하여, 실시예 11에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 조 선형 펩티드를, 20 내지 60% B의 구배를 사용하여, 실시예 19에 기재된 변형에 따라 정제하고 환화하였다. 36분에 걸쳐 20 내지 60% B의 구배를 사용하여(30 mpm), 최종 생성물 정제를 수행하였다.
실시예 30: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 30의 합성
α-토코페릴옥시아세트산(AcVitE)(8) 대신에 팔미트산을 사용하고, 위치 3에서 Fmoc-Ile-OH 대신에 Fmoc-Aβυ-OH를 사용하고, 실시예 15에 기재된 변형을 사용하여 단계 4(실시예 9, 단계 2)에서 m-브로모메틸벤조산 대신에 브로모아세트산 무수물을 커플링하여, 실시예 11에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 조 선형 펩티드를, 20 내지 60% B의 구배를 사용하여, 실시예 19에 기재된 변형에 따라 정제하고 환화하였다. 36분에 걸쳐 20 내지 60% B의 구배를 사용하여(30 mpm), 최종 생성물 정제를 수행하였다.
실시예 31: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 31의 합성
옥타데칸이산, 모노-tert-부틸 에스테르 대신에 스테아르산을 사용하여, 실시예 23에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 조 선형 펩티드를, 20 내지 60% B의 구배를 사용하여, 실시예 19에 기재된 변형에 따라 정제하고 환화하였다. 36분에 걸쳐 20 내지 60% B의 구배를 사용하여(30 mpm), 최종 생성물 정제를 수행하였다.
실시예 32: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 32의 합성
단계 2에서, α-토코페릴옥시아세트산(AcVitE)(8) 대신에 팔미트산을 사용하고, 위치 26에서 Fmoc-His(trt)-OH 대신에 Fmoc-Ala-OH를 사용하고, 단계 4(실시예 9, 단계 1)에서 위치 4에서 Fmoc-Lys(Boc)-OH 대신에 Fmoc-Ala-OH를 사용하여, 실시예 11에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 단계 6에서 NH4OAc 완충액 대신에 TRIS/HCl 완충액(1 M, pH 7.5)을 사용하여 환화를 달성하였다. 실온에서 Agilent Polaris C18-A 컬럼(30 × 250 mm, 100 Å, 5 μm)을 사용하여 생성물 정제를 수행하였다. 이동상은, 5분에 걸쳐 20% B의 초기 농도로부터 35% B의 중간 농도로(40 mpm), 그리고 이어서 40분에 걸쳐 45% B의 최종 농도에 이르는(40 mpm) 범위의, 완충액 A(물 중 0.1% TFA) 및 완충액 B(MeCN 중 0.1% TFA)의 구배 용리로 이루어졌다.
실시예 33: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 33의 합성
단계 2에서 α-토코페릴옥시아세트산(AcVitE)(8) 대신에 팔미트산을 사용하고, 단계 4(실시예 9, 단계 1)에서 위치 34에서 Fmoc-Gln(trt)-OH 대신에 Fmoc-N(Me)-Gln(trt)-OH를 사용하여, 실시예 11에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 이 경우에, 용매로서 NMP를 사용하고 HATU/DIEA 프로토콜(1시간, 단일 커플링)을 사용하여 실온에서 커플링을 수행하였으며; Fmoc-N(Me)-Gln(trt)-OH 및 Fmoc-Arg(pbf)-OH를 이중 커플링하였다. 전체에 걸쳐 2-단계 Fmoc 탈보호 프로토콜을 사용하였다(DMF 중 20% 피페리딘; 실온; 10분, 15분). 조 선형 펩티드를, 20 내지 70% B의 구배를 사용하여, 실시예 19에 기재된 변형에 따라 정제하고 환화하였다. 36분에 걸쳐 20 내지 70% B의 구배를 사용하여(30 mpm), 최종 생성물 정제를 수행하였다.
실시예 34: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 34의 합성
α-토코페릴옥시아세트산(AcVitE)(8) 대신에 팔미트산을 사용하고, 위치 31에서 Fmoc-hCys(trt)-OH 대신에 Fmoc-Cys(trt)-OH를 사용하고, 위치 3에서 Fmoc-Ile-OH 대신에 6-Fmoc-아미노헥산산을 사용하고, 실시예 15에 기재된 변형을 사용하여 단계 4(실시예 9, 단계 2)에서 m-브로모메틸벤조산 대신에 브로모아세트산 무수물을 커플링하여, 실시예 11에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. NH4OAc 완충액 대신에 NaHCO3 수용액(2 N)을 사용하여 환화를 달성하였다. 실온에서 Varian Pursuit XRs C18 컬럼(30 × 250 mm, 100 Å, 5 μm)을 사용하여 생성물 정제를 수행하였다. 이동상은, 36분에 걸쳐 20% B로부터 70% B에 이르는(30 mpm) 범위의, 완충액 A(물 중 0.1% TFA) 및 완충액 B(MeCN 중 0.1% TFA)의 구배 용리로 이루어졌다.
실시예 35: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 35의 합성
하기의 변형을 가하여, 실시예 9에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다: 실시예 1, 단계 1에 기재된 절차에 따라, Fmoc-Arg(Pbf)-OH 대신에 Fmoc-N-Me-Arg(pbf)-OH로부터 제조된 Fmoc-psi-[N-Me-Arg(Pbf)-N(Boc)Tyr(tBu)]-OH를 Fmoc-psi-[Arg(Pbf)-N(Boc)Tyr(tBu)]-OH(6) 대신에 사용하여, 여기서 사용되는 로딩된 Sieber 수지를 제조하였으며; 위치 30에서 Leu 대신에 Fmoc-Lys(Pal-Glu-OtBu)-OH(활성 펩티드로부터의 것)를 사용하였으며; 단계 2에서 m-브로모메틸벤조산 대신에 m-클로로메틸벤조산을 사용하였으며; 용매로서 NMP를 사용하여 실온에서 커플링을 수행하고, HATU/DIEA 프로토콜(1시간, 단일 커플링)을 사용하였으며; Fmoc-Arg(pbf)-OH를 이중 커플링하였다. 전체에 걸쳐 2-단계 Fmoc 탈보호 프로토콜을 사용하였다(DMF 중 20% 피페리딘; 실온; 10분, 15분). 조 선형 펩티드를, 20 내지 70% B의 구배를 사용하여, 실시예 19에 기재된 변형에 따라 정제하고 환화하였다. 36분에 걸쳐 20 내지 70% B의 구배를 사용하여(30 mpm), 최종 생성물 정제를 수행하였다.
실시예 36: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 36의 합성
위치 3에서 Fmoc-Ile-OH 대신에 Fmoc-βAla-OH를 사용하고, 실시예 15에 기재된 변형을 사용하여 단계 4(실시예 9, 단계 2)에서 m-브로모메틸벤조산 대신에 브로모아세트산 무수물을 커플링하여, 실시예 35에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 실시예 19의 변형된 후처리(workup)는 생략하였다. Fmoc-βAla-OH를 마이크로파 조건 하에서 50℃에서 20분 동안 커플링하였다. NH4OAc 완충액 대신에 포화 NaHCO3 수용액을 사용하여 환화를 달성하였다. 실온에서 Varian Pursuit XRs C18 컬럼(30 × 250 mm, 100 Å, 5 μm)을 사용하여 생성물 정제를 수행하였다. 이동상은, 36분에 걸쳐 20% B로부터 70% B에 이르는(30 mpm) 범위의, 완충액 A(물 중 0.1% TFA) 및 완충액 B(MeCN 중 0.1% TFA)의 구배 용리로 이루어졌다.
실시예 37: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 37의 합성
위치 31에서 Fmoc-hCys(trt)-OH 대신에 Fmoc-Cys(trt)-OH를 사용하고, 위치 30에서 Fmoc-Leu-OH 대신에 Fmoc-Lys(Pal-Glu-OtBu)-OH(Active Peptide로부터의 것)를 사용하여, 실시예 9에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 게다가, 단계 1에서, Fmoc-Abu-OH를 서열 상의 위치 2에 부가하고, 실시예 15에 기재된 변형을 사용하여, 단계 2에서 m-브로모메틸벤조산 대신에 브로모아세트산 무수물과의 커플링을 사용하였다. 단계 3에서 NH4OAc 완충액 대신에 포화 NaHCO3 수용액을 사용하여 환화를 달성하였다. 실온에서 Varian Pursuit XRs C18 컬럼(30 × 250 mm, 100 Å, 5 μm)을 사용하여 생성물 정제를 수행하였다. 이동상은, 36분에 걸쳐 20% B로부터 70% B에 이르는(30 mpm) 범위의, 완충액 A(물 중 0.1% TFA) 및 완충액 B(MeCN 중 0.1% TFA)의 구배 용리로 이루어졌다.
실시예 38: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 38의 합성
하기의 변형을 가하여, 실시예 35에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다: 50℃에서 20분 동안 마이크로파 조건을 사용하여 단계 1에 따라, Fmoc-βAla-OH를 서열 상의 위치 2에 부가하고, 실시예 15에 기재된 변형을 사용하여, 단계 2에서 m-브로모메틸벤조산 대신에 브로모아세트산 무수물과의 커플링을 사용하였다. NH4OAc 완충액 대신에 포화 NaHCO3 수용액을 사용하여 환화를 달성하였다. 실온에서 Varian Pursuit XRs C18 컬럼(30 × 250 mm, 100 Å, 5 μm)을 사용하여 생성물 정제를 수행하였다. 이동상은, 36분에 걸쳐 20% B로부터 80% B에 이르는(30 mpm) 범위의, 완충액 A(물 중 0.1% TFA) 및 완충액 B(MeCN 중 0.1% TFA)의 구배 용리로 이루어졌다.
실시예 39: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 39의 합성
단계 2에서 α-토코페릴옥시아세트산(AcVitE)(8) 대신에 아라키드산을 사용하여, 실시예 11에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 단계 4(실시예 9, 단계 1)에서 위치 4에서 Fmoc-Lys(Boc)-OH 대신에 Fmoc-Ser(tBu)-OH를 사용하고, 단계 4(실시예 9, 단계 2)에서 m-브로모메틸벤조산 대신에 m-클로로메틸벤조산을 사용하였다. 용매로서 MeCN/H2O 대신에 60% EtOH/H2O를 사용하고, 단계 4에서 NH4OAc 완충액 대신에 포화 NaHCO3 수용액을 사용하여 환화를 달성하였다. 실온에서 Waters XBridge C18 OBD 컬럼(50 × 250 mm, 5 μm)을 사용하여 생성물 정제를 수행하였다. 이동상은, 5분에 걸쳐 20% B의 초기 농도로부터 25% B의 중간 농도로(100 mpm), 그리고 이어서 40분에 걸쳐 40% B의 최종 농도에 이르는(100 mpm) 범위의, 완충액 A(물 중 10 mM NH4OH, 약 pH 9) 및 완충액 B(MeCN)의 구배 용리로 이루어졌다.
실시예 40: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 40의 합성
1. (HCCH(CH 2 ) 2 CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNK(Dde)-(아지도-norLeu)-TRQ( psi -R35Y36)-Sieber 수지의 합성
용매로서의 NMP, 5배 과량의 보호된 아미노산 및 HATU/DIEA 프로토콜(1시간, 단일 커플링)을 사용하여 실온에서, 실시예 1, 단계 2로부터의 사전 로딩된 (psi-R35, Y36)-Sieber 수지(0.1 mmol) 상에의 아미노산 연장을 수행하였으며; Fmoc-Arg(pbf)-OH 및 Fmoc-His(trt)-OH를 이중 커플링하였다. 전체에 걸쳐 2-단계 Fmoc 탈보호 프로토콜을 사용하였다(DMF 중 20% 피페리딘; 실온; 10분, 15분).
2. (HCCH(CH 2 ) 2 CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNK(NH 2 )-(아지도-norLeu)-TRQ( psi -R35Y36)-Sieber 수지의 합성
상기 수지를 실온에서 2분 동안 DMF 중 2% 하이드라진으로 처리하고(12 mL / 0.2 mmol 규모), 이어서 혼합물을 드레인하였다. 이 절차를 약 4회 반복하였으며, 이후에 수지를 DMF로 그리고 이어서 DCM으로 광범위하게 세척하였다.
3. (HCCH(CH 2 ) 2 CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNK((OEG) 2 -γ-Glu-Pal)-(아지도-norLeu)-TRQ( psi -R35Y36)-Sieber 수지의 합성
상기 수지를 실온에서 1.5시간 동안 HBTU/DIEA 프로토콜을 사용하여 (S)-10,19-다이옥소-22-팔미트아미도-3,6,12,15-테트라옥사-9,18-다이아자트라이코산이산(5 당량)[단계 G에서 18-tert-부톡시-18-옥소옥타데칸산 대신에 팔미트산으로 치환함으로써, 중간체 3의 합성에 대해 기재된 절차에 따라 제조됨]과 커플링하였다. 수지를 드레인하고, DMF 및 DCM으로 광범위하게 세척하였다.
4. (HCCH(CH 2 ) 2 CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNK((OEG) 2 -γ-Glu-Pal)-(아지도-norLeu)-TRQ( psi -R35Y36)-CONH 2 의 합성
건조된 수지를 DCM(20 mL) 중 2% TFA의 용액으로 처리하고, 20분 동안 혼합하고, 이어서 여과하였다. 이러한 처리를 각각의 처리마다 새로운 칵테일을 사용하여 추가 2회 반복하였다. 이어서, 합한 여과액을 합하고 농축시켜, 황색 포말로서 조 보호된 펩티드를 얻었다. 이 포말을 실온에서 2.5시간 동안 20 mL의 절단 칵테일(TFA/H2O/TIPS = 95/2.5/2.5)로 처리하고, 이어서 질소 스트림 하에서 약 2.5 mL의 부피로 농축시켰다. 이어서, 차가운 에테르(40 mL)를 첨가하여 펩티드를 침전시키고, 혼합물을 원심분리하고(5분; 5000 rpm), 디캔팅하였다. 이 공정을 2회 더 반복하여, 황백색 분말로서 조 펩티드를 얻었다.
대안적으로, 수지를 DCM 중 1 내지 2% TFA에 의한 전처리 없이 절단 칵테일로 처리하여 완전 탈보호된 펩티드를 직접 얻었다. 조 펩티드를 Varian Pursuit XRs C18 컬럼(30 × 250 mm, 100 Å, 5 μm)을 사용하여 역상 분취용 HPLC에 의해 정제하였다. 이동상은, 36분에 걸쳐 20% B로부터 70% B에 이르는 범위의, 완충액 A(물 중 0.1% TFA) 및 완충액 B(MeCN 중 0.1% TFA)의 구배 용리로 이루어졌다. 220 및 254 nm에서 UV 검출을 모니터링하였다. 상기에서와 동일한 컬럼 유형(4.6 × 250 mm, 5 μm)을 사용하는 Agilent 1100 HPLC 시스템 상에서의 분석용 HPLC에 의해 생성물-함유 분획을 분석하였다. 순수한 분획을 합하고, 이어서 동결건조시켜, 면-유사 고체로서 생성물을 얻었다. LCMS: 16.87분에서의 생성물 피크에 대해 1211.8 (M+4H)/4, 1615.4 (M+3H)/3 및 2422.9 (M+2H)/2 (LC: Atlantis T3 C18 컬럼, 5 μm, 4.6 × 250 mm, 1.0 mL/min, 30 내지 60% 구배).
5. 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 40
1 mL의 H2O 중 5.1 mg의 CuSO4를 제조하였다. 3 mL의 EtOH 중 10.4 mg의 TBTA를 제조하였다. 400 μL의 CuSO4 용액과 3 mL의 TBTA 용액을 예비혼합하였다. 2 mL의 H2O 중 13 mg의 소듐 아스코르베이트를 제조하였다.
4 mL의 HEPES(0.1 M, pH 7.4) 중 단계 4로부터의 정제된 아지도-함유 펩티드(37 mg)의 용액에 1.7 mL의 예비혼합된 CuSO4/TBTA 용액을 첨가한 후, 1 mL의 소듐 아스코르베이트 용액을 첨가하였다. 반응 용액이 투명해질 때까지 EtOH/H2O 비를 조정하였다. 혼합물을 실온에서 교반하고, HPLC로 모니터링하였다. 30분 후에, 반응을 완료하였다. 혼합물을 pH 4로 조정하고, 역상 분취용 HPLC에 의해 정제하였다. Varian Pursuit XRs C18 컬럼(30 × 250 mm, 100 Å, 5 μm)을 사용하여 정제를 수행하였다. 이동상은, 36분에 걸쳐 20% B로부터 60% B에 이르는 범위의, 완충액 A(물 중 0.1% TFA) 및 완충액 B(MeCN 중 0.1% TFA)의 구배 용리로 이루어졌다. 220 및 254 nm에서 UV 검출을 모니터링하였다. 상기에서와 동일한 컬럼 유형(4.6 × 250 mm, 5 μm)을 사용하는 Agilent 1100 HPLC 시스템 상에서의 분석용 HPLC에 의해 생성물-함유 분획을 분석하였다. 순수한 분획을 합하고, 이어서 동결건조시켜, 면-유사 고체로서 생성물을 얻었다.
실시예 41: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 41의 합성
단계 3에서 (S)-10,19-다이옥소-22-팔미트아미도-3,6,12,15-테트라옥사-9,18-다이아자트라이코산이산 대신에 L-글루탐산, N-(1-옥소헥사데실)-, 1-(1,1-다이메틸에틸) 에스테르를 사용하여, 실시예 40에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다.
실시예 42: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 42의 합성
단계 3에서 (S)-10,19-다이옥소-22-팔미트아미도-3,6,12,15-테트라옥사-9,18-다이아자트라이코산이산 대신에 (S)-22-(tert-부톡시카르보닐)-43,43-다이메틸-10,19,24,41-테트라옥소-3,6,12,15,42-펜타옥사-9,18,23-트라이아자테트라테트라콘탄-1-산(16) (중간체 2)을 사용하여, 실시예 40에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다.
실시예 43: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 43의 합성
1. (Alloc)Lys((OEG) 2 -γ- Glu -NH 2 )-( hC )- TRQ ( psi - R35Y36 )- Sieber 수지의 합성
용매로서의 NMP, 5배 과량의 보호된 아미노산 및 HATU/DIEA 프로토콜(1시간, 단일 커플링)을 사용하여 실온에서, 실시예 1, 단계 2로부터의 사전 로딩된 (psi-R35, Y36)-Sieber 수지(0.1 mmol) 상에의 아미노산 연장을 수행하였으며; Fmoc-Arg(pbf)-OH를 이중 커플링하였다. 전체에 걸쳐 2-단계 Fmoc 탈보호 프로토콜을 사용하였다(DMF 중 20% 피페리딘; 실온; 10분, 15분).
2. (Alloc)Lys((OEG) 2 -γ-Glu-Pal)-(hC)-TRQ( psi -R35Y36)-Sieber 수지의 합성
용매로서 NMP를 그리고 50℃에서 20 내지 30분 동안 HATU/DIEA를 사용하는 마이크로파 조건을 사용하여, 팔미트산을 단계 1로부터의 수지 상에 커플링하였다.
3. (H 2 N)Lys((OEG) 2 --γ-Glu-Pal)-(hC)-TRQ( psi -R35Y36)-Sieber 수지의 합성
실시예 1, 단계 4에 기재된 절차에 따라 상기 수지의 alloc 보호기를 제거하였다.
4. 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 43
단계 2에서 m-브로모메틸벤조산 대신에 m-클로로메틸벤조산을 사용하여, 실시예 9, 단계 1 내지 단계 3에 기재된 절차에 따라 상기 수지로부터 표제 화합물을 제조하였다. 조 선형 펩티드를, 20 내지 60% B의 구배를 사용하여, 실시예 19에 기재된 변형에 따라 정제하고 환화하였다. 36분에 걸쳐 20 내지 60% B의 구배를 사용하여(30 mpm), 최종 생성물 정제를 수행하였다.
실시예 44: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 44의 합성
탠덤 Fmoc-OEG-OH 단위 및 Fmoc-Glu-OtBu 단위가 단계 1 대신에 단계 2에서 도입되도록 변형된, 실시예 43에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 단계 2에서, 팔미트산 대신에 옥타데칸이산, 모노-tert-부틸 에스테르(AstaTech, Inc.)를 사용하고, 위치 30 대신에 위치 11에 링커-지질 서열을 도입하였다. 조 선형 펩티드를, 20 내지 70% B의 구배를 사용하여, 실시예 19에 기재된 변형에 따라 정제하고 환화하였다. 36분에 걸쳐 20 내지 70% B의 구배를 사용하여(30 mpm), 최종 생성물 정제를 수행하였다.
실시예 45: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 45의 합성
탠덤 Fmoc-OEG-OH 단위 대신에 Fmoc-dPEG24-카르복실산을 사용하고, 팔미트산과 함께, 단계 2에 도입되도록 변형된, 실시예 43에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 위치 30 대신에 위치 11에 링커-지질 서열을 도입하였다. 조 선형 펩티드를, 20 내지 90% B의 구배를 사용하여, 실시예 19에 기재된 변형에 따라 정제하고 환화하였다. 36분에 걸쳐 20 내지 90% B의 구배를 사용하여(30 mpm), 최종 생성물 정제를 수행하였다.
실시예 46: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 46의 합성
위치 30에서 Leu 대신에 Fmoc-Lys(Pal-Glu-OtBu)-OH(Active Peptide로부터의 것)를 사용하여, 실시예 9에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 게다가, 50℃에서 20분 동안 마이크로파 조건을 사용하여 단계 1에 따라, Fmoc-βAla-OH를 서열 상의 위치 2에 부가하고, 실시예 15에 기재된 변형을 사용하여, 단계 2에서 m-브로모메틸벤조산 대신에 브로모아세트산 무수물과의 커플링을 사용하였다. 고체의 조 선형 펩티드를, 20 내지 70% B의 구배를 사용하여, 실시예 19에 기재된 변형에 따라 정제하고 환화하였다. 36분에 걸쳐 20 내지 70% B의 구배를 사용하여(30 mpm), 최종 생성물 정제를 수행하였다.
실시예 47: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 47의 합성
위치 11 대신에 위치 7에 링커-지질 서열을 도입하여, 실시예 44에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 실온에서 Varian Pursuit XRs C18 컬럼(30 × 250 mm, 100 Å, 5 μm)을 사용하여 생성물 정제를 수행하였다. 조 선형 펩티드를, 20 내지 60% B의 구배를 사용하여, 실시예 19에 기재된 변형에 따라 정제하고 환화하였다. 36분에 걸쳐 20 내지 60% B의 구배를 사용하여(30 mpm), 최종 생성물 정제를 수행하였다.
실시예 48: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 48의 합성
30분의 커플링 시간과 함께, 단계 2에서 팔미트산 대신에 옥타데칸이산, 모노-tert-부틸 에스테르(AstaTech, Inc.)를 사용하고, 위치 30 대신에 위치 22에 링커-지질 서열을 도입하여, 실시예 43에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 조 선형 펩티드를, 20 내지 70% B의 구배를 사용하여, 실시예 19에 기재된 변형에 따라 정제하고 환화하였다. 36분에 걸쳐 20 내지 70% B의 구배를 사용하여(30 mpm), 최종 생성물 정제를 수행하였다.
실시예 49: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 49의 합성
단계 2에서 α-토코페릴옥시아세트산(AcVitE)(8) 대신에 16-테트라하이드로피란-2-일옥시팔미트산을 사용하고, 단계 4(실시예 9, 단계 2)에서 m-브로모메틸벤조산 대신에 m-클로로메틸벤조산을 사용하여, 실시예 11에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 용매로서 MeCN/H2O 대신에 60% EtOH/H2O를 사용하고, 단계 4에서 NH4OAc 완충액 대신에 포화 NaHCO3 수용액을 사용하여 환화를 달성하였다. 실온에서 Waters XBridge C18 OBD 컬럼(50 × 250 mm, 5 μm)을 사용하여 생성물 정제를 수행하였다. 이동상은, 5분에 걸쳐 20% B의 초기 농도로부터 10% B의 중간 농도로(100 mpm), 그리고 이어서 40분에 걸쳐 30% B의 최종 농도에 이르는(100 mpm) 범위의, 완충액 A(물 중 10 mM NH4OH, 약 pH 9) 및 완충액 B(MeCN)의 구배 용리로 이루어졌다.
실시예 50: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 50의 합성
위치 30 대신에 위치 23에 링커-지질 서열을 도입하여, 실시예 48에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다.
실시예 51: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 51의 합성
단계 1에서, 위치 30에서 Fmoc-Leu-OH 대신에 Fmoc-Lys(Pal-Glu-OtBu)-OH(Active Peptide로부터의 것)를 그리고 위치 4에서 Fmoc-Lys(Boc)-OH 대신에 Fmoc-Ser(tBu)-OH를 사용하여, 실시예 9에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 용매로서 MeCN/H2O 대신에 60% EtOH/H2O를 사용하고, 단계 4에서 NH4OAc 완충액 대신에 포화 NaHCO3 수용액을 사용하여 환화를 달성하였다. 실온에서 Waters XBridge C18 OBD 컬럼(50 × 250 mm, 5 μm)을 사용하여 생성물 정제를 수행하였다. 이동상은, 5분에 걸쳐 10% B의 초기 농도로부터 20% B의 중간 농도로(100 mpm), 그리고 이어서 40분에 걸쳐 30% B의 최종 농도에 이르는(100 mpm) 범위의, 완충액 A(물 중 10 mM NH4OH, 약 pH 9) 및 완충액 B(MeCN)의 구배 용리로 이루어졌다. 5분에 걸쳐 10% B의 초기 농도로부터 20% B의 중간 농도로(100 mpm), 그리고 이어서 60분에 걸쳐 30% B의 최종 농도에 이르는(100 mpm) 것으로 구성된 구배를 사용하여 불순한 분획을 재크로마토그래피하였다.
실시예 52: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 52의 합성
단계 2에서, 탠덤 Fmoc-OEG-OH 단위 대신에 Fmoc-dPEG12-카르복실산을 사용하고, 그것을 Fmoc-Glu-OtBu 및 팔미트산과 함께 도입하여, 실시예 43에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 위치 30 대신에 위치 11에 링커-지질 서열을 도입하였다. 조 선형 펩티드를, 20 내지 70% B의 구배를 사용하여, 실시예 19에 기재된 변형에 따라 정제하고 환화하였다. 36분에 걸쳐 20 내지 70% B의 구배를 사용하여(30 mpm), 최종 생성물 정제를 수행하였다.
실시예 53: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 53의 합성
Fmoc-dPEG12-카르복실산 대신에 탠덤 형태로 4개의 Fmoc-OEG-OH 단위를 사용하여, 실시예 52에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다.
실시예 54: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 54의 합성
2개의 Fmoc-OEG-OH 단위 대신에 탠덤 형태로 2개의 Fmoc-OEG-OH 단위를 도입하여, 실시예 53에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다.
실시예 55: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 55의 합성
위치 30 대신에 위치 23에 링커-지질 서열을 도입하여, 실시예 43에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 조 선형 펩티드를, 20 내지 70% B의 구배를 사용하여, 실시예 19에 기재된 변형에 따라 정제하고 환화하였다. 36분에 걸쳐 20 내지 70% B의 구배를 사용하여(30 mpm), 최종 생성물 정제를 수행하였다.
실시예 56: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 56의 합성
단계 2에서 α-토코페릴옥시아세트산(AcVitE)(8) 대신에 (4'-클로로바이페닐-4-일)-아세트산을 사용하고, 단계 4(실시예 9, 단계 2)에서 m-브로모메틸벤조산 대신에 m-클로로메틸벤조산을 사용하여, 실시예 11에 기재된 방법을 사용하여 표제 화합물을 제조하였다. 용매로서 MeCN/H2O 대신에 60% EtOH/H2O를 사용하고, 단계 4에서 NH4OAc 완충액 대신에 포화 NaHCO3 수용액을 사용하여 환화를 달성하였다. 실온에서 Waters XBridge C18 OBD 컬럼(50 × 250 mm, 5 μm)을 사용하여 생성물 정제를 수행하였다. 이동상은, 40분에 걸쳐 10% B로부터 28% B에 이르는(100 mpm) 범위의, 완충액 A(물 중 10 mM NH4OH, 약 pH 9) 및 완충액 B(MeCN)의 구배 용리로 이루어졌다.
실시예 57: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 57의 합성
단계 2에서 α-토코페릴옥시아세트산(AcVitE)(8) 대신에 3-[(2,4-다이클로로페녹시)펜-4-일]프로피온산을 사용하고, 단계 4(실시예 9, 단계 2)에서 m-브로모메틸벤조산 대신에 m-클로로메틸벤조산을 사용하여, 실시예 11에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 용매로서 MeCN/H2O 대신에 60% EtOH/H2O를 사용하고, 단계 4에서 NH4OAc 완충액 대신에 포화 NaHCO3 수용액을 사용하여 환화를 달성하였다. 실온에서 Waters XBridge C18 OBD 컬럼(50 × 250 mm, 5 μm)을 사용하여 생성물 정제를 수행하였다. 이동상은, 40분에 걸쳐 10% B로부터 30% B에 이르는(80 mpm) 범위의, 완충액 A(물 중 10 mM NH4OH, 약 pH 9) 및 완충액 B(MeCN)의 구배 용리로 이루어졌다. 생성물-함유 분획을 합하고, TFA로 산성화하고, 농축시키고, 실온에서 Agilent Polaris C18-A 컬럼(30 × 250 mm, 100 Å, 5 μm) 상에서 재크로마토그래피하였다. 이동상은, 45분에 걸쳐 20% B의 초기 농도로부터 15% B의 중간 농도로(40 mpm), 그리고 45% B의 최종 농도에 이르는(40 mpm) 범위의, 완충액 A(물 중 0.1% TFA) 및 완충액 B(MeCN 중 0.1% TFA)의 구배 용리로 이루어졌다.
실시예 58: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 58의 합성
단계 2에서 α-토코페릴옥시아세트산(AcVitE)(8) 대신에 11-(4-플루오로페닐}운데칸산을 사용하고, 단계 4(실시예 9, 단계 2)에서 m-브로모메틸벤조산 대신에 m-클로로메틸벤조산을 사용하여, 실시예 11에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 용매로서 MeCN/H2O 대신에 60% EtOH/H2O를 사용하고, 단계 4에서 NH4OAc 완충액 대신에 포화 NaHCO3 수용액을 사용하여 환화를 달성하였다. 실온에서 Waters XBridge C18 OBD 컬럼(50 × 250 mm, 5 μm)을 사용하여 생성물 정제를 수행하였다. 이동상은, 40분에 걸쳐 15% B로부터 35% B에 이르는(100 mpm) 범위의, 완충액 A(물 중 10 mM NH4OH, 약 pH 9) 및 완충액 B(MeCN)의 구배 용리로 이루어졌다.
실시예 59: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 59의 합성
단계 2를 생략하고, 단계 1에 팔미트산 커플링을 포함시켜, 실시예 43에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 위치 11 대신에 위치 22에 링커-지질 서열을 도입하였다. 조 선형 펩티드를, 20 내지 70% B의 구배를 사용하여, 실시예 19에 기재된 변형에 따라 정제하고 환화하였다. 36분에 걸쳐 20 내지 70% B의 구배를 사용하여(30 mpm), 최종 생성물 정제를 수행하였다.
실시예 60: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 60의 합성
4개의 Fmoc-OEG-OH 단위 대신에 2개의 Fmoc-OEG-OH 단위를 탠덤 형태로 도입하고, 위치 11 대신에 위치 7에 링커-지질 서열을 도입하여, 실시예 53에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 조 선형 펩티드를, 20 내지 80% B의 구배를 사용하여, 실시예 19에 기재된 변형에 따라 정제하고 환화하였다. 36분에 걸쳐 20 내지 80% B의 구배를 사용하여(30 mpm), 최종 생성물 정제를 수행하였다.
실시예 61: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 61의 합성
단계 2에서 α-토코페릴옥시아세트산(AcVitE)(8) 대신에 11-[(4-트라이플루오로메틸)페닐]운데칸산을 사용하고, 단계 4(실시예 9, 단계 2)에서 m-브로모메틸벤조산 대신에 m-클로로메틸벤조산을 사용하여, 실시예 11에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 용매로서 MeCN/H2O 대신에 60% EtOH/H2O를 사용하고, 단계 4에서 NH4OAc 완충액 대신에 포화 NaHCO3 수용액을 사용하여 환화를 달성하였다. 실온에서 Waters XBridge C18 OBD 컬럼(50 × 250 mm, 5 μm)을 사용하여 생성물 정제를 수행하였다. 이동상은, 40분에 걸쳐 15% B로부터 35% B에 이르는(100 mpm) 범위의, 완충액 A(물 중 10 mM NH4OH, 약 pH 9) 및 완충액 B(MeCN)의 구배 용리로 이루어졌다.
실시예 62: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 62의 합성
단계 2에서 α-토코페릴옥시아세트산(AcVitE)(8) 대신에 11,11,11-트라이플루오로운데칸산을 사용하고, 단계 4(실시예 9, 단계 2)에서 m-브로모메틸벤조산 대신에 m-클로로메틸벤조산을 사용하여, 실시예 11에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 용매로서 MeCN/H2O 대신에 60% EtOH/H2O를 사용하고, 단계 4에서 NH4OAc 완충액 대신에 포화 NaHCO3 수용액을 사용하여 환화를 달성하였다. 실온에서 Waters XBridge C18 OBD 컬럼(50 × 250 mm, 5 μm)을 사용하여 생성물 정제를 수행하였다. 이동상은, 40분에 걸쳐 10% B로부터 28% B에 이르는(100 mpm) 범위의, 완충액 A(물 중 10 mM NH4OH, 약 pH 9) 및 완충액 B(MeCN)의 구배 용리로 이루어졌다.
실시예 63: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 63의 합성
단계 2에서 α-토코페릴옥시아세트산(AcVitE)(8) 대신에 15,15,15-트라이플루오로펜타데칸산을 사용하고, 단계 4(실시예 9, 단계 2)에서 m-브로모메틸벤조산 대신에 m-클로로메틸벤조산을 사용하여, 실시예 11에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 용매로서 MeCN/H2O 대신에 60% EtOH/H2O를 사용하고, 단계 4에서 NH4OAc 완충액 대신에 포화 NaHCO3 수용액을 사용하여 환화를 달성하였다. 실온에서 Waters XBridge C18 OBD 컬럼(50 × 250 mm, 5 μm)을 사용하여 생성물 정제를 수행하였다. 이동상은, 40분에 걸쳐 15% B로부터 30% B에 이르는(100 mpm) 범위의, 완충액 A(물 중 10 mM NH4OH, 약 pH 9) 및 완충액 B(MeCN)의 구배 용리로 이루어졌다.
실시예 64: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 64의 합성
단계 2에서 α-토코페릴옥시아세트산(AcVitE)(8) 대신에 16-에톡시팔미트산을 사용하고, 단계 4(실시예 9, 단계 2)에서 m-브로모메틸벤조산 대신에 m-클로로메틸벤조산을 사용하여, 실시예 11에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 용매로서 MeCN/H2O 대신에 60% EtOH/H2O를 사용하고, 단계 4에서 NH4OAc 완충액 대신에 포화 NaHCO3 수용액을 사용하여 환화를 달성하였다. 실온에서 Waters XBridge C18 OBD 컬럼(50 × 250 mm, 5 μm)을 사용하여 생성물 정제를 수행하였다. 이동상은, 40분에 걸쳐 15% B로부터 30% B에 이르는(100 mpm) 범위의, 완충액 A(물 중 10 mM NH4OH, 약 pH 9) 및 완충액 B(MeCN)의 구배 용리로 이루어졌다.
실시예 65: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 65의 합성
단계 2에서 α-토코페릴옥시아세트산(AcVitE)(8) 대신에 13,13,14,14,15,15,16,16,16-D9-팔미트산(Cambridge Isotopes)을 사용하고, 단계 4(실시예 9, 단계 2)에서 m-브로모메틸벤조산 대신에 m-클로로메틸벤조산을 사용하여, 실시예 11에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 용매로서 MeCN/H2O 대신에 60% EtOH/H2O를 사용하고, 단계 4에서 NH4OAc 완충액 대신에 포화 NaHCO3 수용액을 사용하여 환화를 달성하였다. 실온에서 Waters XBridge C18 OBD 컬럼(50 × 250 mm, 5 μm)을 사용하여 생성물 정제를 수행하였다. 이동상은, 5분에 걸쳐 15% B로부터 20% B로(100 mpm), 그리고 이어서 40분에 걸쳐 35% B에 이르는(100 mpm) 범위의, 완충액 A(물 중 10 mM NH4OH, 약 pH 9) 및 완충액 B(MeCN)의 구배 용리로 이루어졌다.
실시예 66: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 66의 합성
단계 2에서 α-토코페릴옥시아세트산(AcVitE)(8) 대신에 11-[(2,4-비스(트라이플루오로메틸)페닐]운데칸산을 사용하고, 단계 4(실시예 9, 단계 2)에서 m-브로모메틸벤조산 대신에 m-클로로메틸벤조산을 사용하여, 실시예 11에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 용매로서 MeCN/H2O 대신에 60% EtOH/H2O를 사용하고, 단계 4에서 NH4OAc 완충액 대신에 포화 NaHCO3 수용액을 사용하여 환화를 달성하였다. 실온에서 Waters XBridge C18 OBD 컬럼(50 × 250 mm, 5 μm)을 사용하여 생성물 정제를 수행하였다. 이동상은, 40분에 걸쳐 15% B로부터 35% B에 이르는(100 mpm) 범위의, 완충액 A(물 중 10 mM NH4OH, 약 pH 9) 및 완충액 B(MeCN)의 구배 용리로 이루어졌다.
실시예 67: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 67의 합성
단계 2에서 α-토코페릴옥시아세트산(AcVitE)(8) 대신에 11-[(3,5-비스(트라이플루오로메틸)페닐]운데칸산을 사용하고, 단계 4(실시예 9, 단계 2)에서 m-브로모메틸벤조산 대신에 m-클로로메틸벤조산을 사용하여, 실시예 11에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 용매로서 MeCN/H2O 대신에 60% EtOH/H2O를 사용하고, 단계 4에서 NH4OAc 완충액 대신에 포화 NaHCO3 수용액을 사용하여 환화를 달성하였다. 실온에서 Waters XBridge C18 OBD 컬럼(50 × 250 mm, 5 μm)을 사용하여 생성물 정제를 수행하였다. 이동상은, 40분에 걸쳐 15% B로부터 35% B에 이르는(100 mpm) 범위의, 완충액 A(물 중 10 mM NH4OH, 약 pH 9) 및 완충액 B(MeCN)의 구배 용리로 이루어졌다.
실시예 68: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 68의 합성
1. (Fmoc)-βA-IKPEAPGEK(Alloc)ASPEELNRYYASLRHYLNCVTRQ( psi -R35Y36)-Sieber 수지의 합성
용매로서의 DMF, 6배 과량의 보호된 아미노산 및 HATU/DIEA 프로토콜(10분, 이중 커플링)을 사용하여 실온에서, 실시예 1, 단계 2로부터의 사전 로딩된 (psi-R35, Y36)-Sieber 수지(0.1 mmol) 상에의 아미노산 연장을 수행하였다. 전체에 걸쳐 2-단계 Fmoc 탈보호 프로토콜을 사용하였다(DMF 중 20% 피페리딘; 실온; 10분, 15분).
2. (Fmoc)-βA-IKPEAPGEK((OEG) 2 -γ-Glu-NHCO(CH 2 ) 16 CO 2 tBu)-ASPEELNRYYASLRHYLNCVTRQ( psi -R35Y36)-Sieber 수지의 합성
각각의 처리마다 10분의 변형된 반응 시간을 사용하여, 실시예 1, 단계 4에 기재된 방법에 따라 상기 수지의 탈보호를 수행하였다. 이어서, DMF 중에서 HATU/DIEA 프로토콜(1시간, 실온)을 사용하여, 수지를 중간체 2(15) (5 당량)와 커플링하였다.
3. (BrAc)-βA-IKPEAPGEK((OEG) 2 -γ-Glu-NHCO(CH 2 ) 16 CO 2 tBu)-ASPEELNRYYASLRHYLNCVTRQ( psi -R35Y36)-Sieber 수지의 합성
Fmoc 탈보호(20% 피페리딘/DMF) 후에, 상기 수지를 브로모아세트산 무수물(10 당량; 실온, 30분)로 처리하여 브로모아세틸화 수지를 얻었다.
4. (BrAc)-βA-IKPEAPGEK((OEG) 2 -γ-Glu-NHCO(CH 2 ) 16 CO 2 tBu)-ASPEELNRYYASLRHYLNCVTRQ( psi -R35Y36)-CONH 2 의 합성
상기 수지를 실온에서 1.5시간 동안 TFA/H2O/TIPS(95:2.5:2.5)로 이루어진 절단 칵테일로 처리하였다. 조 펩티드를 실시예 1, 단계 7에 기재된 절차에 따라 에테르를 사용하여 침전시켰다.
5. 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 68
상기에서 얻은 조 펩티드를 10 mg/mL의 농도로 10% MeCN/H2O 중에 용해시키고, TEA를 첨가하여 용액 pH를 8 내지 9로 상승시켰다. 실온에서 약 20분 동안 교반한 후, TFA를 첨가하여 pH를 2로 낮추고, 이 용액을 Kinetics C18 Evo 컬럼(30 × 100 mm, 100 Å, 5 μm) 상에서 분취용 HPLC에 의해 직접 정제하였다. 이동상은, 22분에 걸쳐 20% B로부터 60% B에 이르는 범위의, 완충액 A(물 중 0.1% TFA) 및 완충액 B(MeCN 중 0.1% TFA)의 구배 용리로 이루어졌다. 220 및 254 nm에서 UV 검출을 모니터링하였다. 순수한 분획을 합하고, 이어서 동결건조시켜, 면-유사 고체로서 생성물을 얻었다.
실시예 69: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 69의 합성
1. (Boc)-G-ISPEAPGEK(dde)ASPEELNRYYASLRHYLNLE(OAllyl)TRQ( psi -R35Y36)-Sieber 수지의 합성
용매로서의 DMF, 6배 과량의 보호된 아미노산 및 HATU/NMM 프로토콜(10분, 이중 커플링)을 사용하여 실온에서 실시예 1, 단계 2로부터의 사전 로딩된 (psi-R35, Y36)-Sieber 수지(0.1 mmol) 상에의 아미노산 연장을 수행하였다. 전체에 걸쳐 2-단계 Fmoc 탈보호 프로토콜을 사용하였다(DMF 중 20% 피페리딘; 실온; 10분, 15분).
2. (Boc)-G-ISPEAPGEK(dde)ASPEELNRYYASLRHYLNLE(NHS)TRQ( psi -R35Y36)-Sieber 수지의 합성
각각의 처리마다 10분의 변형된 반응 시간을 사용하여, 실시예 1, 단계 4에 기재된 방법에 따라 상기 수지의 Alloc-탈보호를 수행하였다. 이어서, DMF 중에서 HATU/DIEA 프로토콜(1시간, 실온, 이중 커플링)을 사용하여, 수지를 NHS(10 당량)와 커플링하였다.
3. (NH 2 )-G-ISPEAPGEK(dde)ASPEELNRYYASLRHYLNLE(NHS)TRQ( psi -R35Y36)의 합성
상기 수지를 실온에서 1.5시간 동안 TFA/H2O/TIPS(95:2.5:2.5)로 이루어진 절단 칵테일로 처리하였다. 조 펩티드를 실시예 1, 단계 7에 기재된 절차에 따라 에테르를 사용하여 침전시켰다.
4. 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 69
상기에서 얻어진 조 펩티드를 80 mg/mL의 농도로 DMSO 중에 용해시키고, TEA(25 당량)를 첨가하여 락탐화를 달성하였다. 실온에서 약 30분 동안 교반한 후, 반응물을 10% MeCN/물로 10배 희석시키고, pH를 2로 조정하고, 조 펩티드를 Kinetics C18 Evo 컬럼(30 × 100 mm, 100Å, 5 μm) 상에서 분취용 HPLC에 의해 직접 정제하였다. 이동상은, 22분에 걸쳐 10% B로부터 60% B에 이르는 범위의, 완충액 A(물 중 0.1% TFA) 및 완충액 B(MeCN 중 0.1% TFA)의 구배로 이루어졌다. 220 및 254 nm에서 UV 검출을 모니터링하였다. 순수한 분획을 합하고, 이어서 동결건조시켜 K(Dde)-보호된 펩티드를 얻었다. 실온에서 30분 동안 2% 하이드라진/DMF(10 mg 펩티드/ml)를 사용하여 Dde 보호기를 제거하였다. 반응물을 10% MeCN/물로 10배 희석시키고, TFA를 사용하여 pH를 2로 조정하고, 조 펩티드 용액을 상기에서와 같이 정제하여, 면-유사 고체로서 생성물을 얻었다.
실시예 70: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 70의 합성
위치 30에서 Fmoc-Leu-OH 대신에 Fmoc-E(OAll)-OH를 사용하고, 위치 31에서 Fmoc-E(OAll)-OH 대신에 Fmoc-Val-OH를 사용하여, 실시예 69에서의 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다.
실시예 71: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 71의 합성
1. (Boc)-G-ISPEAPGEK(dde)ASPEELNRYYASLRHYLN E(OAllyl)VTRQ(N-Me-R)Y-NovaSyn TGR 수지의 합성
실시예 69, 단계 1에 기재된 절차를 사용하여, NovaSyn TGR 수지(0.1 mmol) 상에의 아미노산 연장을 수행하였다.
2. 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 71
실시예 69, 단계 2 내지 단계 4에 기재된 절차에 따라 상기 수지로부터 표제 화합물을 제조하였다.
실시예 72: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 72의 합성
1. (S)-22-(tert-부톡시카르보닐)-43,43-다이메틸-10,19,24,41-테트라옥소-3,6,12,15,42-펜타옥사-9,18,23-트라이아자테트라테트라콘탄-1-산 N-하이드록시석신이미드 에스테르의 합성
1.0 ml의 DMF 중 (S)-22-(tert-부톡시카르보닐)-43,43-다이메틸-10,19,24,41-테트라옥소-3,6,12,15,42-펜타옥사-9,18,23-트라이아자테트라테트라콘탄-1-산(중간체 2(16)) (54.0 mg, 0.063 mmol), N-하이드록시석신이미드(14.6 mg, 0.127 mmol), 및 HATU(24.1 mg, 0.063 mmol)의 용액에 DIEA(0.022 ml, 0.127 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하고, 추가의 정제 없이 다음 단계에 직접 사용하였다.
2. 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 72의 합성
DMF(0.2 mL) 중 [사이클로-(G2-E30), S4, K11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36(실시예 70에서 제조됨) (4 mg, 0.96 μmol)의 용액에 24 μL의 N-하이드록시 에스테르 용액(단계 1에서 제조됨), 및 TEA(0.66 μL; 5 당량)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반하였다. 반응물을 10% MeCN/물로 10배 희석시키고, TFA를 사용하여 pH를 2로 조정하고, 조 펩티드를 Kinetics C18 Evo 컬럼(30 × 100 mm, 100 Å, 5 μm) 상에서 분취용 HPLC에 의해 직접 정제하였다. 이동상은, 22분에 걸쳐 10% B로부터 60% B에 이르는 범위의, 완충액 A(물 중 0.1% TFA) 및 완충액 B(MeCN 중 0.1% TFA)의 구배 용리로 이루어졌다. 220 및 254 nm에서 UV 검출을 모니터링하였다. 순수한 분획을 합하고, 이어서 동결건조시켜 t-부틸 에스테르-보호된 펩티드를 얻었다. t-부틸 에스테르 보호기를 실온에서 1.5시간 동안 TFA/H2O/TIPS(95:2.5:2.5)의 혼합물을 사용하여 제거하였다. 혼합물을 농축시키고, 펩티드를 상기에서와 같이 정제하여, 면-유사 고체로서 생성물을 얻었다.
실시예 73: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 73의 합성
단계 5에서 N-Fmoc-dPEG12-카르복실산 대신에 N-Fmoc-dPEG6-카르복실산을 사용하여, 실시예 1에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다.
실시예 74: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 74의 합성
단계 5의 PEG 링커 커플링을 생략한 것을 제외하고는, 실시예 1에 기재된 바와 같은 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다.
실시예 75: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 75의 합성
단계 3에서, 위치 31에서 Fmoc-hC(trt)-OH 대신에 Fmoc-C(trt)-OH를 사용하고, Fmoc-βA-OH 커플링 단계를 생략하여, 실시예 1에 기재된 바와 같은 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다.
실시예 76: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 76의 합성
변형된 단계 3 및 단계 4를 사용하여, 실시예 1에 기재된 바와 같은 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다. 단계 A에서는, Fmoc-K(Alloc)-OH 및 Fmoc-K(dde)-OH를 각각 위치 30 및 위치 11에 사용하였다. 위치 30의 Alloc을 Pd(PPh3)4-페닐실란으로 탈보호한 후, mPEG16-카복실산을 HAT-DIPEA와 커플링하였다. 단계 4에서는, DMF 중 2% 하이드라진을 사용하여 위치 11의 dde를 제거하였다.
실시예 77: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 77의 합성
단계 A에서 mPEG16-카르복실산 대신에 mPEG12-카르복실산을 사용하고, 단계 5에서 Fmoc-dPEG12-카르복실산 커플링 단계를 생략하여, 실시예 76에 기재된 바와 같은 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다.
실시예 78: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 78의 합성
단계 3에서 Fmoc-Q(trt)-OH 대신에 Fmoc-N-Me-Q(trt)-OH를 사용하여, 실시예 1에 기재된 바와 같은 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다.
실시예 79: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 79의 합성
단계 1B에서 Fmoc-R(pbf)-OH 대신에 Fmoc-N-Me-R(pbf)-OH를 사용하여, 실시예 1에 기재된 바와 같은 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다.
실시예 80: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 80의 합성
단계 3에서, 위치 4에서 Fmoc-K(Boc)-OH 대신에 Fmoc-R(pbf)-OH를 사용하고, 위치 30에서 Fmoc-L-OH 대신에 Fmoc-W(Boc)-OH를 사용하여, 실시예 79에 기재된 바와 같은 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다.
실시예 81: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 81의 합성
단계 3에서, 위치 31에서 Fmoc-hC(trt)-OH 대신에 Fmoc-C(trt)-OH를 사용하고, Fmoc-βA-OH 대신에 Fmoc-γ-아미노부탄산을 사용하여, 실시예 80에 기재된 바와 같은 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다.
실시예 82: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 82의 합성
단계 3에서, 위치 31에서 Fmoc-βA-OH 대신에 Fmoc-PEG2-카르복실산을 그리고 Fmoc-hC(trt)-OH 대신에 Fmoc-C(trt)-OH를 사용할 뿐만 아니라, Fmoc-Ile-OH의 커플링을 생략하여, 실시예 1에 기재된 바와 같은 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다.
실시예 83: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 83의 합성
단계 3에서, 위치 31에서 Fmoc-hC(trt)-OH 대신에 Fmoc-K(N3)-OH를 사용하고, Fmoc-βA-OH 대신에 펜트-4-인산을 사용하여, 실시예 1에 기재된 바와 같은 절차에 따라, 그리고 하기에서와 같은 환화 절차 B에 따라 표제 화합물을 제조하였다.
환화 절차 B: 2 mL의 HEPES(pH 7.4) 중 PEG12-AcBr이 위치 11에 도입된 완전 탈보호된 펩티드(38 mg, 0.0067 mmol)의 용액에 1.7 mL의 예비혼합된 CuSO4/TBTA 용액(이 용액은 물(0.4 mL) 중 2.2 mg의 CuSO4의 용액을 EtOH 중 11 mg의 TBTA의 용액과 혼합함으로써 제조함)을 첨가한 후, 물(1 mL) 중 7 mg의 소듐 아스코르베이트를 첨가하였다. 투명한 반응 용액을 실온에서 그대로 혼합하면서 HPLC에 의해 모니터링하였다. 30분 후에, 반응이 완료되었으며, 반응 혼합물을 TFA를 사용하여 pH 4로 조정하고, HPLC 정제(Pursuit XRS 5 250x30 mm C18 컬럼, 30 mpm 유량으로 이동, 214 nM 파장을 모니터링함, 36분에 걸쳐 20 내지 60% ACN-물/물(둘 모두 TFA를 함유함)의 범위의 구배를 사용함)를 거쳤다. 원하는 분획을 수집하고 동결건조시켰다.
실시예 84: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 84의 합성
Fmoc-βA-OH 커플링 단계를 생략하고, 단계 5에서 Fmoc-dPEG12-카르복실산 대신에 N3-PEG8-카르복실산을 사용하고, 단계 3에서 브로모아세트산 무수물 아실화 대신에 DIC와의 3-(브로모메틸)벤조산 커플링을 사용하고, 하기에서와 같은 환화 절차 C에 따라, 실시예 1에 기재된 바와 같은 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다.
환화 절차 C: 5 mL의 탈기된 물 중 완전 탈보호된 펩티드(20 mg, 0.0035 mmol)의 용액에, NaHCO3 수용액을 첨가하여 반응 혼합물을 pH 6.4 이상으로 조정하였다. 20분 후에, LCMS는 반응이 완료되었음을 나타내었으며, 반응 혼합물을 TFA를 사용하여 pH 4로 조정하고, HPLC 정제(Pursuit XRS 5 250x30 mm C18 컬럼, 30 mpm 유량으로 이동, 214 nM 파장을 모니터링함, 36분에 걸쳐 10 내지 60% ACN-물/물(둘 모두 TFA를 함유함)의 범위의 구배를 사용함)를 거쳤다. 원하는 분획을 수집하고 동결건조시켰다.
환화 후에, 환화된 중간체를 N-(1-브로모-2-옥소-7,10,13-트라이옥사-3-아자헥사데칸-16-일)펜트-4-인아미드를 사용하여 환화 절차 B에 따라 클릭 화학(click chemistry)에 의해 링커 연장을 거쳤는데, 이때 상기 물질은 HATU-DIPEA를 사용하여 N-Boc-PEG4-NH2를 펜트-4-인산과 커플링한 후, TFA에 의한 Boc의 탈보호 및 TEA의 존재 하에서의 브로모아세트산 무수물에 의한 아실화를 수행함으로써 제조하였다.
실시예 85: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 85의 합성
위치 11 대신에 위치 23에 PEG12-AcBr 링커를 도입하여, 실시예 1에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다.
실시예 86: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 86의 합성
위치 11 대신에 위치 22에 PEG12-AcBr 링커를 도입하여, 실시예 1에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다.
실시예 87: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 87의 합성
위치 11 대신에 위치 7에 PEG12-AcBr 링커를 도입하여, 실시예 1에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다.
실시예 88: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 88의 합성
단계 3에서, 위치 31에서 Fmoc-hC(trt)-OH 대신에 Fmoc-V-OH를 사용하고, 위치 30에서 Fmoc-L-OH 대신에 Fmoc-C(trt)-OH를 사용하고, Fmoc-βA-OH 대신에 Fmoc-G-OH를 사용하여, 실시예 1에 기재된 바와 같은 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다.
실시예 89: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 89의 합성
환원된 다이펩티드를 제조하는 단계 1을 생략하고, 단계 2에서 Fmoc-psi-(R35-N(Boc)-Y36)-OH 로딩 대신에 Fmoc-Y(tBu)-OH 로딩 후의 Fmoc-(N-Me)R-OH와의 커플링을 사용하여, 실시예 88에 기재된 바와 같은 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다.
실시예 90: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 90의 합성
단계 3에서 Fmoc-G-OH 대신에 Fmoc-βA-OH를 사용하여, 실시예 89에 기재된 바와 같은 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다.
실시예 91: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 91의 합성
단계 3에서 위치 30에서 Fmoc-C(trt)-OH 대신에 Fmoc-hC(trt)-OH를 사용하여, 실시예 89에 기재된 바와 같은 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다.
실시예 92: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 92의 합성
단계 3에서, 위치 31에서 Fmoc-V-OH 대신에 Fmoc-hC(trt)-OH를 사용하고, 위치 30에서 Fmoc-C(trt)-OH 대신에 Fmoc-L-OH를 사용하여, 실시예 90에 기재된 바와 같은 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다.
실시예 93: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 93의 합성
단계 3에서, 위치 31에서 Fmoc-hC(trt)-OH 대신에 Fmoc-V-OH를 사용하고, 위치 30에서 Fmoc-L-OH 대신에 Fmoc-C(trt)-OH를 사용하고, N-말단에서 Fmoc-βA-OH 대신에 Fmoc-G-OH를 사용하여, 실시예 1에 기재된 바와 같은 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다.
실시예 94: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 94의 합성
단계 3에서, 위치 31에서 Fmoc-hC(trt)-OH 대신에 Fmoc-V-OH를 사용하고, 위치 30에서 Fmoc-L-OH 대신에 Fmoc-C(trt)-OH를 사용하여, 실시예 1에 기재된 바와 같은 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다.
실시예 95: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 95의 합성
단계 3에서, 위치 31에서 Fmoc-hC(trt)-OH 대신에 Fmoc-V-OH를 사용하고, 위치 30에서 Fmoc-L-OH 대신에 Fmoc-Glu(OAlloc)-OH를 사용하고, 위치 11에서 Fmoc-Lys(Alloc)-OH 대신에 Fmoc-Lys(dde)-OH를 사용하고, 위치 4에서 Fmoc-K(Boc)-OH 대신에 Fmoc-Ser(tBu)-OH를 사용하고, N-말단에서 Fmoc-βA-OH 대신에 Boc-G-OH를 사용하여, 실시예 1에 기재된 바와 같은 절차에 따라 (0.05 mmol 규모로) 표제 화합물을 제조하였다.
상기로부터 생성된 수지에, 탈산소화된 DCM(10 mL), 페닐실란(10 당량), 및 DCM(1 mL) 중 Pd(PPh3)4(0.2 당량)의 용액을 첨가하고, 혼합물을 10분 동안 교반하였다. 반응물을 드레인하고, 수지를 탈산소화된 DCM으로 세척하고, 탈보호를 1회 반복하였다.
상기로부터 생성된 수지에 DMF(10 ml), HATU(5 당량), 및 DIEA(10 당량)를 첨가하고, 혼합물을 5분 동안 교반하고, 이어서 DMF 중 N-하이드록시석신이미드(10 당량)의 용액을 첨가하고, 추가 20분 동안 교반하였다. 수지를 여과하고, 절차를 1회 반복하였다.
상기로부터의 수지를 실온에서 2시간 동안 TFA/TIPS/물(95/2.5/2.5)(10 ml) 중에서 탈보호하였다. 절단 칵테일을 대략 1 ml로 농축시키고, 이어서 40 ml의 에테르에 첨가하였다. 생성된 침전물을 원심분리에 의해 수집하고, N2 하에서 건조시켰다.
상기로부터 생성된 물질을 9 mL의 DMSO 중에 용해시키고, 이것에 10 당량의 TEA를 첨가하고, 반응이 실온에서 3시간 동안 진행되게 하였다. 생성된 용액을 물을 사용하여 30 ml로 희석시키고, pH를 2로 조정하고, 물(0.1% TFA) 중 20 내지 40% ACN의 선형 구배로 용리하는 30 mm × 250 mm C18 컬럼 상에서 RP-HPLC에 의해 30분만에 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 동결건조시켰다.
이어서, 상기로부터 생성된 물질을 1 내지 2% 하이드라진/DMF(1 mL)로 처리하여 라이신으로부터 Dde를 제거하였다. 생성된 혼합물을 물을 사용하여 10 ml로 희석시키고, pH를 2로 조정하고, 이어서 상기에서와 같이 RP-HPLC에 의해 정제하였다.
이어서, 생성된 생성물을 10% ACN/물 중에 용해시키고, pH를 10으로 조정하고, 브로모아세트산 N-하이드록시석신이미드 에스테르의 용액(3 당량의 0.1 M/DMF 용액)을 첨가하고, 반응이 실온에서 10분 동안 진행되게 하였다. 생성된 혼합물을 물을 사용하여 10 ml로 희석시키고, pH를 2로 조정하고, 이어서 상기에서와 같이 RP-HPLC에 의해 정제하여 표제 화합물을 얻었다.
실시예 96: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 96의 합성
단계 5에서 N-Fmoc-dPEG12-카르복실산 대신에 N-Fmoc-dPEG24-카르복실산을 사용하여, 실시예 1에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다.
실시예 97: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 97의 합성
단계 3에서 Fmoc-βA-OH 대신에 Fmoc-G-OH를 사용하여, 실시예 1에 기재된 바와 같은 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다.
실시예 98: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 98의 합성
단계 5에서 Fmoc-dPEG12-카르복실산 커플링 단계를 생략한 것을 제외하고는, 실시예 89에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다.
실시예 99: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 99의 합성
단계 5에서 Fmoc-dPEG12-카르복실산 커플링 단계를 생략한 것을 제외하고는, 실시예 90에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다.
실시예 100: 사이클릭 PYY 유사체 서열 번호 100의 합성
단계 5에서 Fmoc-dPEG12-카르복실산 커플링 단계를 생략한 것을 제외하고는, 실시예 94에 기재된 절차에 따라 표제 화합물을 제조하였다.
실시예 101: mAb MSCB97의 확인 및 생성
조작을 위한 출발 V 영역으로서의 PH9L3 VL 및 PH9H5 VH의 선택
PH9L3(서열 번호 128)으로 지정된 항체 경쇄 가변 영역(VL)(문헌[Teplyakov et al., "Structural diversity in a human antibody germline library," mAbs Aug-Sep 8(6):1045-63 (2016))]) 및 PH9H5(서열 번호 129)로 지정된 항체 중쇄 가변 영역(VH)(문헌[Teplyakov et al., "Structural diversity in a human antibody germline library," mAbs Aug-Sep 8(6):1045-63 (2016)])을 펩티드 접합을 위해 가능해지도록 mAb를 조작할 출발 가변 영역으로서 선택하였다. PH9L3은 인간 Ig 생식세포계열 V 유전자 서열로 완전히 구성되며, 그렇기 때문에 고친화성 항원-특이적 결합을 야기할, 생체내 친화성 성숙 과정으로부터의 어떠한 서열 돌연변이도 함유하지 않는다. PH9H5의 CDR3은 그 VH에서 인간 생식세포계열 V 유전자 서열로 구성되지 않는 유일한 세그먼트이다. PH9H5의 CDR3은 항-인간 CCL2 항체, CNTO 888로부터 유래되며, 서열 번호 130으로 제공된다. PH9H5/PH9L3 VH/VL 쌍을 함유하는 Fab를 생성하였다.
PH9L3, PH9H5, 및 이들 서열과 가장 유사한 인간 Ig 생식세포계열 V-영역 및 J-영역 서열을 정렬하여 이들 생식세포계열 서열에 대한 서열 동일성 또는 유사성을 결정하였다. PH9H5는, 인간 Ig 생식세포계열 유전자 IGHV3-23*01(PubMed ID: M99660)(서열 번호 132) 및 인간 IGHJ1*01(PubMed ID: J00256)(서열 번호 133)의 연결(concatenation)(서열 번호 131)에 대해, VH CDR3(이는 PH9H5의 경우 서열 번호 130임)에 있어서의 PH9H5 아미노산 서열과 상기 연결된 인간 IGHV3-23*01-IGHJ1*01 서열 사이의 유일한 차이를 두고서, 정렬되었다.
PH9L3은, 인간 Ig 생식세포계열 유전자 IGKV3-11*01(PubMed ID: X01668)(서열 번호 135) 및 IGKJ1*01(PubMed ID: J00242)(서열 번호 136)의 연결(서열 번호 134)에 대해, V 유전자/J 유전자 접합부에 있어서의 1 편차라는 유일한 차이를 두고서, 정렬되었다.
PH9H5 및 PH9L3의 Cys 치환된 변이체의 설계 및 생성
V 영역의 3개의 모든 CDR에 걸쳐 선택된 CDR 잔기에서 단일 Cys 치환을 함유하는 PH9H5 VH의 변이체를 인간 IgG1 불변 영역을 갖는 완전한 중쇄로서 포유류 숙주 발현 벡터 내로 설계, 생성 및 클로닝하였다. 접합을 위해 더 접근가능한 것으로 보이는 치환을 위한 CDR 잔기의 선택을 돕기 위해 PH9H5/PH9L3 Fab 구조를 이용하였으며, 변이체들 중 일부에서는, 추가의 글리신(Gly) 잔기를, 도입된 Cys 잔기의 어느 한쪽에 삽입하여, 접합을 위한 Cys의 접근성을 잠재적으로 증가시켰다. 인간 카파 불변 영역을 갖는 완전한 경쇄로서 발현 벡터 내로 클로닝한 것을 제외하고는, PH9L3 VL의 유사한 변이체를 설계하고 생성하였다. PH9H5 단일 Cys 변이체의 총 24개의 발현 작제물 및 PH9L3 단일 Cys 변이체의 총 22개의 발현 작제물을 생성하였다. PH9H5_VH(서열 번호 129) 및 PH9L3_VL(서열 번호 128) 내에서의 치환을 위해 선택된 잔기가 도 2에 요약되어 있다.
생성된 발현 작제물을 사용하여, 각각의 PH9H5 기반 HC Cys 변이체 작제물을 야생형 PH9L3 LC 작제물을 사용하여 일시적으로 공동-형질감염시킴으로써, 또는 각각의 PH9L3 기반 LC Cys 변이체 작제물을 야생형 PH9H5 HC 작제물을 사용하여 일시적으로 공동-형질감염시킴으로써 Cys 변이체를 발현시켰다. 초기 시험 형질감염은 발현 숙주로서 HEK-유래 Expi293을 사용하였으며, 20 ml 규모였다. HC 및 LC Cys 변이체 둘 모두의 대부분은 배양 상층액으로부터의 변이체 단백질 정량화에 기초하여 잘 발현되었다.
5개의 초기 HC Cys 변이체, MSCB33 내지 MSCB37을 750 ml 규모로 Expi293에서 발현시키고, 변이체 단백질을 정제하였다. 정제된 변이체의 정제 수율 및 품질 특성은 상당히 유사하였고, 초기 펩티드 접합 반응에서 정제된 단백질을 사용하기에 충분하였다.
PH9H5-기반 HC Cys 변이체에 대한 펩티드 접합의 평가
MSCB33 단백질 및 다른 변이체 단백질의 분석 질량 결정은, 접합을 위해 조작된 Cys에서의 시스테인 부가물의 존재(mAb당 2개)뿐만 아니라, 재조합적으로 생성된 mAb에서 일반적으로 관찰되는 HC C-말단 Lys 잔기의 제거를 나타내었다. 접합을 위한 변이체 mAb를 제조하기 위하여, mAb 내의 천연 이황화물 결합을 유지하도록 개발된 환원 과정에 의해 부가물을 제거하였다(실시예 103 참조). 인간 옥신토모듈린(OXM) 펩티드 유사체(GCG Aib2, Glu16,24, Arg20, Leu27, Lys30-ε-(PEG12)-NH2)를 이용한 초기 시험 접합을 5개의 모든 HC Cys 변이체 mAb에 대해 말레이미드 화학을 사용하여 행하였다. 접합 효율은 mAb 변이체들 사이에서 상이하였으며, 이것을 접합 반응 생성물 및 각각의 상대 백분율에 의해 정성적으로 추산하였다. 최대 백분율의 동종이량체 생성물에 의해 측정될 때, 최대 효율은, 플랭킹 Gly 잔기를 함유하는 다른 I102C 변이체와 비교하여, MSCB33에 대해 관찰되었으며, Y103C 변이체 MSCB35 또는 MSCB37의 경우에는 접합이 거의 또는 전혀 관찰되지 않았다.
다양한 CDR 내에 조작된 시스테인 치환(PH9H5_VH(서열 번호 129) 내의 T28C, S30C, 및 S54C 치환, 및 PHpL3_VL(서열 번호 128) 내의 S30C 및 S92C 치환)을 갖는, 몇몇 다른 HC 및 LC Cys 변이체를 Expi293에서 대규모로 발현시켰다. 이들 정제된 단백질로부터 환원에 의한 Cys 부가물의 제거는 어려웠고 이들 변이체는 더 이상 조사하지 않았다. 대부분의 Cys 변이체에 대해 어려움이 관찰되었고 I102C PH9H5 변이체 mAb, MSCB33에 대해 초기의 우수한 접합 효율이 관찰되었기 때문에, 프로세스 개발 및 추가의 조작 노력은 이 특정 변이체에 초점을 맞추었다.
MSCB33의 Fc 조작
생체내에서의 Fc 기능을 감소시키기 위해, MSCB33을 침묵 인간 IgG4_PAA Fc를 함유하도록 재조작하였다. 인간 IgG4_PAA는 (IMGT에 정의된 바와 같은 IGHG4*01 대립유전자에 기초하는) 인간 IgG4 동종이인자형(allotype) nG4m(a) 상에 돌연변이 S228P/F234A/L235A를 갖는다. MSCB33의 VH가 IgG4_PAA Fc에 융합된 발현 작제물을 생성하고, MSCB33 발현에 사용된 것과 동일한 LC 발현 작제물과 함께 사용하여, MSCB97로 지정된 MSCB33의 IgG4_PAA 변이체를 생성하였다. MSCB97 VH, HC, VL 및 LC의 아미노산 서열은 각각 서열 번호 137, 138, 139, 및 140으로 제공된다.
MSCB97의 시험 발현을 Expi293 세포에서 20 ml 규모로 일시적으로 행하였으며, 이러한 mAb 변이체는 잘 발현되었다. 대규모 Expi293 발현 실시로부터 MSCB97을 정제하였다. MSCB97의 정제 수율은 264.53 mg/L였고, 이 품질은 85% 단량체 종으로 결정되었다. 후속의 대규모 발현 실시 및 정제는 수율 및 품질이 유사하거나 더 우수하였으며, 이러한 mAb를 생성할 수 있는 일관성을 나타내었다.
MSCB97에 대한 펩티드 접합 및 접합 반응 확장성의 평가
LC-HC 이황화물 연결성은 IgG1 동종형과 IgG4 동종형 사이에 상이하며, 이에 따라 TCEP 환원 및 전술된 OXM-말레이미드 시험 펩티드의 접합을 사용하여 환원 및 말레이미드 접합을 시험하였으며, IgG1 mAb MSCB33으로부터 IgG4_PAA mAb MSCB97로 변환가능한 것으로 확인되었다. 말레이미드 접합으로부터 생성된 결합은 잠재적으로 가역적인 것으로 알려져 있으며, 이에 따라 더 안정한 결합을 생성하는 브로모아세트아미드 접합 화학을 채택하였으며, 출발 MSCB97에 기초하여 10 mg 규모로 성공적으로 구현하였다.
브로모아세트아미드 화학을 통해 생성된 OXM 유사체 GCG Aib2, Glu16,24, Arg20, Leu27, Lys30-ε-(PEG12)-NH2 (MSCB97-OXM1)의 MSCB97 접합체를 검정하여 시험관내 GLP-1R 및 GCGR 효력을 결정하였다. 참조 펩티드 및 참조 비구조화된 폴리펩티드 접합체와 대비한 효력은 합리적이었으며, MSCB33(IgG1)과 동일한 펩티드로 생성된 접합체의 것과 유사하였다. 이는, 동종형인 MSCB97(IgG4_PAA)과 MSCB33(IgG1) 사이의 단 하나의 차이가 동일한 펩티드를 함유하는 접합체의 효력에 영향을 주지 않음을 입증하였다. 추가적으로, 이들 데이터는 바람직한 시험관내 효력이 생체내에서 안정한 결합을 생성하는 브로모아세트아미드 화학으로 생성된 펩티드-mAb 접합체에서 보유될 수 있음을 보여주었다. 다른 OXM 유사체를 또한 MSCB97에 접합시키고, 이들 접합체의 시험관내 효력을 검정하였다. 이들 접합체는 MSCB97-OXM1과 유사한 GLP-1R 및 GCGR 효력을 가져서, 펩티드 효력을 보유하면서, 다양한 펩티드를 MSCB97에 접합시키는 능력을 강조하였다.
인간 CCL2에 결합하는 펩티드-MSCB97 접합체의 평가
MSCB97이 특이적 항원 결합의 결여를 위해 선택되고 조작되었지만, 이 mAb가 결합할 수 있는 가능성이 가장 높은 항원은, 만약 존재한다면, VH CDR3의 기원에 기초한 인간 CCL2일 것이다. OXM 펩티드 유사체 또는 PYY 펩티드 유사체를 갖는 2개의 펩티드-MSCB97 접합체를 사용하여, MSCB97이 임의의 특이적 CCL2 결합을 보여주는지의 여부를 평가하였다.
잠재적인 CCL2 결합을 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 직접 측정하였는데, 여기서는 접합체를 항-Fc 포획 방법을 사용하여 표면-고정화하였다. 구매가능한 항-CCL2 마우스 mAb는 양성 대조군으로서 역할을 하였으며, 2개의 비특이적 인간 항체, CNTO 9412 및 HH3B33은 음성 대조군으로서의 역할을 하였다. 모든 대조군을 유사하게 표면-고정화하고, 재조합 인간 CCL2를 최대 400 nM의 농도로, 고정화된 접합체 및 대조군 위로 유동시켰다. 사전-확립된 검정 기준에 기초하여, 특이적 항원 결합을 나타내는 CCL2 축적이 양성 대조군에 대해서는 관찰되었지만, 음성 대조군에 대해서도 또는 어느 것의 펩티드-MSCB97 접합체에 대해서도 관찰되지 않았다. 이는, 펩티드-mAb 접합체의 관련 치료적 형태의 MSCB97에 인간 CCL2 결합이 결여되어 있음을 확인시켜 주었다.
실시예 102: mAb의 발현 및 정제
완전 인간 단일클론 항체(mAb)는 당업계에 공지된 표준 방법을 사용하여 포유류 발현 숙주에서 재조합적으로 발현되고 세포 배양 상층액으로부터 정제될 수 있다. 예를 들어, mAb의 경쇄(LC) 및 중쇄(HC) - 이들 각각은 분비를 가능하게 하는 적절한 신호 펩티드를 포함함 - 를 인코딩하는 cDNA 서열이 표준 분자 생물학 방법을 사용하여 별도의 포유류 발현 벡터 내로 또는 단일 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 사용되는 발현 벡터는 구매가능한 것들 중 임의의 것, 예컨대 pEE12.4, pcDNA™3.1(+) 또는 pIRESpuro3 또는 유사한 기능성을 갖는 임의의 맞춤형 발현 벡터일 수 있다. 그러한 벡터에서, mAb의 중쇄 및 경쇄의 전사는 각각 hCMV-MIE 프로모터와 같은 임의의 공지된 효과적인 프로모터에 의해 구동된다. QIAGEN 플라스미드 미디 키트(Midi Kit)와 같은 표준 방법을 사용하여 별개의 LC 및 HC 발현 작제물 또는 LC 및 HC 둘 모두를 발현하는 단일 작제물을 위해 형질감염 등급 플라스미드 DNA를 준비한다.
제조사의 설명서에 따라, 지질계 형질감염 시약, 예컨대 Freestyle™ Max 형질감염 시약에 의한 형질감염을 위해 정제된 플라스미드 DNA를 준비하고, 이어서 표준 포유류 발현 숙주 세포주, 예컨대 CHO-S 또는 HEK 293-F 내로 형질감염시킨다. mAb LC 및 HC가 별개의 발현 작제물에 의해 인코딩되는 경우, 2개의 작제물은 동시에 형질감염된다. 형질감염 전과 후에, 포유류 세포를 표준 세포 배양 방법에 따라 유지를 위해 또는 mAb 발현을 위해 배양하는데, 여기서는 유지할 세포 밀도 범위, 사용할 배양 배지, 및 후속의 다른 세포 배양 조건을, 이용되는 특정 포유류 숙주 세포주에 의해 결정한다. 이들 파라미터는 전형적으로, 세포주를 입수한 벤더에 의해 또는 과학 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, CHO-S 세포를, 37℃ 및 8% CO2로 설정된 가습된 인큐베이터 내에서 125 RPM으로 진탕하는, 현탁 상태의 CHO Freestyle™ 배지 중에 유지하고, 세포 농도가 ml당 1.5 내지 2.0 × 106개 세포일 때 분할한다.
mAb를 발현하는 일시적으로 형질감염된 포유류 세포로부터의 세포 배양 상층액을, 형질감염 후 수일째에 수확하고, 원심분리에 의해 청징화하고, 여과한다. CHO-S 세포에 대한 발현의 지속기간은 전형적으로 4일이지만, 조정될 수 있으며 상이한 포유류 숙주 세포주에 대해 상이할 수 있다. 대규모 형질감염물(10 리터 초과)은 Centramate와 같은 농축기를 사용하여 10배 농축된다. 단백질 A 수지에 mAb를 결합시키고, 수지를 세척하고, 낮은 pH 완충액을 사용하여 단백질을 용리하기 위한 표준 방법을 이용하여, 단백질 A 친화성 컬럼, 예컨대 HiTrap MabSelect Sure를 사용하여, 청징화된 상층액으로부터 mAb를 정제한다. 단백질 분획을 pH 7 완충액이 담긴 튜브 내로 용리함으로써 즉시 중화시키고, 피크 분획을 풀링하고, 여과하고, 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.2)에 대해 4℃에서 하룻밤 투석시킨다. 투석 후, mAb를 다시 여과하고(0.2 μ 필터), 280 nm에서의 흡광도에 의해 단백질 농도를 결정한다. 정제된 mAb 단백질의 품질은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 및 분석용 크기 배제 HPLC에 의해 평가하고, 내독소 수준은 리물루스 변형세포 용해물(LAL) 검정을 사용하여 측정한다. 정제된 mAb는 4℃에서 저장한다.
일시적으로 형질감염된 CHO 세포로부터의 MSCB97의 발현 및 정제
ExpiCHO-S™ 세포(미국 매사추세츠주 월섬 소재의 ThermoFisher Scientific; 카탈로그 번호 A29127)에서, 제조사의 권장사항에 따라 MSCB97 발현 작제물의 정제된 플라스미드 DNA에 의한 세포의 일시적 형질감염에 의해 MSCB97을 발현시켰다. 간략하게 말하면, 37℃, 8% CO2 및 125 RPM으로 설정된 진탕 인큐베이터 내에서 ExpiCHO™ 발현 배지(ThermoFisher Scientific, 카탈로그 번호 A29100) 중에 ExpiCHO-S™ 세포를 현탁 상태로 유지하였다. 형질감염 당일에 세포 생존력을 98% 또는 그보다 더 우수하게 유지하면서 ml당 6.0 × 106개 세포로의 희석이 달성될 수 있도록, 세포를 계대하였다. ExpiFectamine™ CHO 형질감염 키트(ThermoFisher Scientific 카탈로그 번호 A29131)를 사용하여 일시적 형질감염을 행하였다. 형질감염시키려는 희석된 세포 매 ml마다, 1 마이크로그램의 플라스미드 DNA를 사용하고, OptiPRO™ SFM 복합체 형성 배지 중에 희석시킨다. ExpiFectamine™ CHO 시약을 1:3 비(v/v, DNA:시약)로 사용하고, 또한 OptiPRO™ 중에 희석시킨다. 희석된 DNA와 형질감염 시약을 1분 동안 배합하여, DNA/지질 복합체 형성을 가능하게 하고, 이어서 세포에 첨가하였다. 하룻밤 인큐베이션 후에, ExpiCHO™ 공급물 및 ExpiFectamine™ CHO 증강제를 세포에 첨가하였다. 세포를 32℃에서 5일 동안 진탕하면서 배양한 후, 배양 상층액을 수집하였다.
일시적으로 형질감염된 ExpiCHO-S™ 세포로부터의 배양 상층액을 원심분리(30분, 6000 rpm) 후에 여과(0.2 μ PES 막, Corning)를 통해 청징화함으로써 수집하였다. 대규모 형질감염물(5 내지 20 리터)을 먼저 Pall Centramate 접선 유동 여과(Tangential Flow Filtration) 시스템을 사용하여 10배 농축시켰다. 10x DPBS(둘베코 인산염 완충 식염수) (pH 7.2)를 1x 최종 농도로 상층액에 첨가한 후, AKTA FPLC 크로마토그래피 시스템을 사용하여, 수지 ml당 약 20 mg 단백질의 상대 농도로, 평형화된(DPBS, pH 7.2) HiTrap MabSelect Sure 단백질 A 컬럼(GE Healthcare; 영국 리틀 칼폰트 소재) 상에 로딩하였다. 로딩 후에, 컬럼을 10 컬럼 부피의 DPBS(pH 7.2)로 세척하였다. 단백질을 10 컬럼 부피의 0.1 M 소듐 아세테이트(pH 3.5)로 용리하였다. 단백질 분획을 용리 분획 부피의 20%로 2.0 M Tris(pH 7)가 담긴 튜브 내로 용리함으로써 즉시 중화시켰다. 피크 분획을 풀링하고, 필요한 경우 추가의 Tris를 사용하여 pH를 약 5.5로 조정하였다. 정제된 단백질을 여과하고(0.2 μ), BioTek SynergyHT™ 분광광도계 상에서 280 nm에서의 흡광도에 의해 농도를 결정하였다. 정제된 단백질의 품질을 SDS-PAGE 및 분석용 크기 배제 HPLC(Dionex HPLC 시스템)에 의해 평가하였다. 비탁(turbidometric) LAL 검정(Pyrotell®-T, Associates of Cape Cod)을 사용하여 내독소 수준을 측정하였다.
실시예 103: mAb와 사이클릭 PYY 유사체의 접합
방법 A: TCEP에 의한 mAb의 부분 환원
TRIS-아세테이트 완충액(20 mL, EDTA 중 1 mM) 중 mAb의 10 mg/mL 용액을 3 당량의 TCEP로 처리하였다. 용액을 pH 6으로 조정하였으며, 실온에서 1시간 후에 질량 분석계를 이용한 고압 액체 크로마토그래피(LCMS)는 위치 C102에서의 이황화물 부가물이 완전히 환원되었음을 나타내었다. 환원된 mAb를 단백질 A 흡착 및 용리(4 CV 100 mM 아세트산)에 의해 정제하여 180 mg의 환원된 mAb를 얻었다.
환원된 mAb와 사이클릭 PYY 유사체의 접합
동결건조된 펩티드(mAb에 대해 5 당량)를 전술된 환원된 mAb에 첨가하였다. EDTA를 1 mM의 최종 농도로 첨가하고, pH를 7로 조정하였다. 농도를 8 mg/mL로 조정하고, 실온에서 16시간 동안 온화하게 교반하면서 반응이 진행되게 하였다. TCEP(mAb에 대해 0.5 당량)를 첨가하고, 온화하게 교반하면서 실온에서 4시간 동안 반응이 추가로 진행되게 하였으며, 이 시간 후에 고분자량(MW) 종은 3% 미만으로 감소되었다.
반응 혼합물을 pH 5.5로 조정하고, 20 CV에 걸쳐 구배 100% A(100 mM TRIS-아세테이트(pH 5.5)) 내지 100% B(100 mM TRIS-아세테이트(pH 5.5); 0.5 M NaCl)를 사용하여 CaptoSP 수지 상에서 이온 교환 크로마토그래피로 정제하였다. 원하는 접합체를 함유하는 분획을 풀링하고, 140 mg의 접합체를 회수하여, 소량의 미반응 펩티드를 사용하여 공용리(coelute)하였다. 최종 정제는 단백질 A 흡착 및 용리(4 CV 100 mM 아세트산)에 의해 수행되었다. 생성물의 pH를 6으로 조정하여 90% 초과의 순도로 120 mg의 접합체(60% 수율)를 얻었으며, 이때 고분자량 종은 3% 미만이었다.
방법 B
mAb의 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 정제
TRIS-아세테이트 완충액 중 mAb의 20 mg/mL 용액을 소수성 상호작용 컬럼(TOSOH TSKgel 페닐 7.5×21 cm) 상에 로딩하고, 선형 구배(0 내지 70% B/A, 용매 A: 5% iPrOH, 1 M (NH4)2SO4, 100 mM 인산염 완충액(pH 6.0); 용매 B: 20% iPrOH, 100 mM 인산염 완충액)로 용리하였다. mAb 단량체 피크를 풀링하고, 농축시키고(5 내지 10 mg/mL), 3-(N-모르폴리노) 프로판설폰산(MOPS) 완충액(100 mM, pH 5.5)에 대해 투석시켰다.
TCEP에 의한 부분 환원 및 환원된 mAb와 사이클릭 PYY 유사체의 접합
정제된 mAb(27 mL, 9.28 mg/mL)에 4 당량 TCEP, 이어서 EDTA(1 mM)를 첨가하였다. 실온에서 2시간 후에, LCMS는 위치 C102에서의 이황화물 부가물이 완전히 환원되었음을 나타내었다. 환원된 mAb를 Zebra 탈염 스핀 컬럼(7x10 mL, 7 K MWCO, MOPS 100 mM, pH 5.5에 의한 사전-평형)으로 처리하여, 유리된 시스테인/GSH를 제거하였다. 환원된 mAb의 합한 분획(28 mL)에 Milli Q 등급 물 중 PYY 펩티드의 용액(mAb에 대해 6.5 당량, 15 내지 20 mg/mL)을 첨가한 후, EDTA(1 mM)를 첨가하였다. 1 N NaOH를 적가함으로써 반응물의 pH를 7.2 내지 7.4로 조정하였다. 온화하게 교반하면서, 반응이 실온에서 18시간 동안 진행되게 하였다. 추가의 0.5 당량 TCEP를 첨가한 후에 추가 12시간 동안 반응을 계속하여, 반응 과정 동안 형성된 mAb-mAb 이량체를 환원시키고, 원하는 mAb 동종이량체로의 전환을 가능하게 하였다. 2 M 아세트산의 첨가에 의해 반응물의 pH를 pH 5.5로 낮추고, 조(crude) 접합체를 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 정제하고, 선형 구배(0 내지 100% B/A, 용매 A: 5% iPrOH, 1 M (NH4)2SO4, 100 mM 인산염 완충액(pH 6.0); 용매 B: 20% iPrOH, 100 mM 인산염 완충액)로 용리하였다. 최종 정제를 단백질 A 흡착(PBS) 및 용리(NaOAc, pH 3.5)에 의해 수행하였다. 생성물의 pH를 6으로 조정하고, PBS에 대해 투석시켜 최종 샘플(56%)을 얻었다.
대안적으로, mAb를 GSH 및/또는 Cys를 사용하여 환원시켰다. 접선 유동 여과(TFF)에 의한 환원제의 제거 후에, 선택적으로 0.2 내지 0.5 당량의 TCEP의 존재 하에서, 과량의 펩티드를 환원된 mAb에 첨가하였다.
실시예 104: mAb 접합체의 특성화
PYY-mAb 접합체의 분석 특성화를 (i) 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), (ii) LC-ESIMS에 의한 온전한 질량 측정, (iii) 크기-배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 수행하였다. PYY-mAb 접합체의 분석 특성화의 결과 및 접합 방법이 표 1에 나타나 있다.
[표 1]
Figure 112019053646884-pct00190
실시예 105: 시험관내 검정
인간, 래트, 마우스 및 레서스 원숭이 Y2 수용체, 및 인간 Y1, Y4 및 Y5 수용체를 발현하는 클론 세포(HEK 또는 CHO)에서 시험관내에서 NPY 수용체를 활성화시키는 능력에 대해 화합물 1을 평가하였다. PYY3-36, NPY 및 PP를 연구 대조군으로서 이들 검정에 포함시켰다.
세포주
NPY 수용체를 발현하는 안정한 형질감염된 클론 세포주를 cAMP 검정에서 사용하기 위해 개발하였다. 간략하게 말하면, Lipofectamine 2000 키트(Invitrogen)를 그의 프로토콜에 따라 사용하여, 인간 Y2 수용체(수탁 번호: NM_000910.2), 인간 Y5 수용체(수탁 번호: NM_006174.2), 마우스 Y2 수용체(수탁 번호: NM_008731) 및 레서스 원숭이 Y2 수용체(수탁 번호: NM_001032832)에 대한 코딩 서열을 지니는 발현 플라스미드에 의해 HEK293 세포주를 형질감염시켰다. 형질감염 후 48시간 후에, 선택 배지(10% 소태아 혈청(FBS), 50 I.U. 페니실린, 50 ㎍/ml 스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민, 1 mM 소듐 피루베이트 및 600 ㎍/ml G418을 함유하는 DMEM 고 글루코스)로 세포를 재플레이팅하였다. 세포를 2주 동안 선택 배지 중에 유지한 후, 제한 희석 방법을 사용하여 단일 클론을 선택하였다. 후속으로, 형질감염된 세포를 10% 소태아 혈청, 1% L-글루타민, 1% 소듐 피루베이트, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 600 ㎍/ml G418이 보충된 DMEM-고 글루코스 배지(Cellgro) 중에서 배양함으로써 유지하였다.
게다가, CHO-K1 세포주를 DiscoverX Corporation으로부터 입수하여, 인간 Y1 수용체(카탈로그 번호: 93-0397C2) 및 인간 Y4 수용체(카탈로그 번호: 95-0087C2)를 발현시켰다. DiscoverX 세포를 G418 선택(800 ㎍/mL) 하에서 10% FBS가 보충된 F12 배지(Gibco) 중에서 배양하였다. 래트 Y2 수용체를 Promega Corporation으로부터 입수된 Glo-Sensor CHO-K1 세포주에서 발현시켰다. 이들 세포를 발광 기반 cAMP 검정을 위하여 pGloSensor™-23F cAMP 플라스미드로 형질감염시켰지만, 이들 세포는 Perkin-Elmer LANCE cAMP 검정에 사용하기 위해 시험되고 검증되어 왔었다. 래트 Y2 세포를 10% FBS 및 800 ㎍/ml G418이 보충된 F12 배지(Gibco) 중에서 성장시켰다.
모든 세포주를 바이알 내에 뱅킹하고(4 × 106개 세포/바이알), 사용 시까지 액체 질소 중에 저장하였다. 검정 전날, 바이알을 해동시키고, 15 ml의 적절한 배지에 첨가하였다. 세포를 450 × g로 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 흡인하고, 세포를 0.2 × 106개 세포/ml의 밀도로, G418을 함유하지 않는 배지 중에 재현탁시켰다. Biocoat 콜라겐-코팅된 백색 384웰 플레이트 내로 5000개 세포/웰의 최종 밀도로 세포를 분배하였다(25 μl/웰). 세포 플레이트를 37℃의 가습된 조직 배양 인큐베이터 내에서 5% CO2/90% O2 분위기 하에서 하룻밤 인큐베이션하였다.
실험 프로토콜
cAMP 검정은 다양한 수용체 검정에 대해 동일하였다. LANCE cAMP 키트(Perkin Elmer Corporation; 미국 매사추세츠주 월섬 소재)를 모든 실험에서 사용하여 세포내 cAMP 수준을 정량화하였다. 검정 당일에, 세포 배지를 세포로부터 디캔팅하고, 6 μl의 펩티드(2X 농도)를 웰에 첨가하였다. 펩티드를 자극 완충액 중에 11 포인트 용량 반응(100 nM 또는 10 μM에서 시작하여 1:3 연속 희석물을 사용함)으로서 구성하였다. 자극 완충액은 HBSS(행크 평형 염 용액) 중 5 mM HEPES(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산), 500 μM IBMX 및 0.1% 소혈청 알부민(BSA)으로 이루어진다. 다음으로, 포스콜린(2X, 5 μM 최종 농도) 및 LANCE cAMP 항체(1:100)를 함유하는 자극 완충액 6 μl를 세포에 첨가하였다. 실온에서 25분 동안 인큐베이션한 후에, 12 μl의 검정 검출 혼합물을 각각의 웰에 첨가하였다. 검출 혼합물은 LANCE cAMP 키트와 함께 제공된 검출 완충액 중에 비오틴-cAMP(1:750) 및 유로퓸-W8044(1:2250)를 희석시킴으로써 제조하였다. 플레이트를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 Envision 플레이트 판독기(여기 320 nm, 방출 615 nm 및 665 nm) 상에서 TR-FRET 검정으로서 판독하였다. 채널 1 형광(615 nm에서의 상대 형광 단위) 및 채널 2 형광(665 nm에서의 상대 형광 단위)을 그들의 비와 함께 엑셀 파일로 내보내기하였다.
데이터 분석
Envision 플레이트 판독기로부터의 데이터를 (615 nm/665 nm) × 10,000으로 계산된 상대 형광 단위(RFU)로서 표현하였다. 모든 샘플은 3회 반복하여 측정하였다. Eudean Shaw에 의해 설계된 Crucible 사내 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다. 각각의 웰 내의 미지의 cAMP 농도를 각각의 플레이트 내에 포함된 기지의 cAMP 농도의 기준 표준물로부터 보간하였다. Janssen R&D의 Non-Clinical Statistics & Computing 부서에 의해 구현된 R 환경(오픈 소스 http://cran.us.r-project.org/) 내에서 비선형 가중 최소 제곱 적용을 사용하는 4-P 모델에 대해 적합화된 로그 화합물 농도에 대해 cAMP 농도 값을 도표로 나타냄으로써, EC50, Log(EC50), 사면(HillSlope)(nH), 상부, 및 하부와 같은 파라미터를 도출하였다.
[표 2]
Figure 112019053646884-pct00191
[표 3]
Figure 112019053646884-pct00192
실시예 106: 생체내 마우스 안정성 검정
수컷 C57BL/6N 마우스(9 내지 12주령)를 Taconic Laboratory로부터 입수하였다. 12시간 명/암 주기를 갖는 온도 제어실에 AlphaDri 잠자리를 갖는 케이지마다 마우스를 1 마리씩 수용하였다. 마우스는 물에 대한 자유식 접근이 허용되었고, 고지방 식이(5001, Lab Diet)로 유지되었다.
마우스에 1 mg/㎏ 화합물을 피하 투여하였다. 3 마리의 동물로부터의 대략 100 μL의 혈액을 꼬리 자름(tail snip)을 통해 t = 4, 24, 및 48시간째에 수집하였다. 시점당 2 마리 또는 3 마리의 동물로부터의 혈액(대략 600 μL)을 또한 심장 천자를 통해 t = 4, 24 및 48시간째에 수집하였다. 혈액 샘플을 4% 비율의 완전 프로테아제 억제제 용액 및 1% 비율의 DPPIV 억제제를 함유하는 K3E(EDTA) 튜브에 수집하였다. 매 시점마다 수집 후 30분 이내에 세포 회수를 위해 혈액 샘플을 젖은 얼음 상에 놓은 후, 냉장 조건(약 5℃) 하에서 10분 동안 10,000 rpm으로 원심분리하고, 모든 이용가능한 혈장을 96웰 플레이트에 옮겼다. 웰 플레이트를 -80℃ 냉동기 내에 저장하였다. 하기에 기재된 LCMS 방법을 사용하여 화합물의 수준을 측정하였다. 데이터는 표 4에 나타나 있다.
온전한 접합체의 % 잔존율 결정을 위한 질량 분석 검정
혈장 샘플을 항-인간 Fc 항체를 사용하여 면역친화성 포획에 의해 처리한 후, 삼중 TOF(비행 시간) 질량 분석계 상에서의 역상 LC-고해상 풀 스캔 MS 분석에 의해 처리하였다. 원시(raw) MS 스펙트럼을 디컨볼루션하여, 주입된 샘플 내의 성분들의 분자량을 구하였다. 온전한 접합체의 분자 이온의 피크를 변화되지 않은 온전한 접합체의 정량화를 위해 사용하였다. 별도의 검정에서, 혈장 샘플을 항-인간 Fc 항체를 사용하여 면역친화성 포획에 의해 처리한 후, 트립신 분해 및 삼중 사중극자 질량 분석계 상에서의 역상 LC-MSMS 분석에 의해 처리하였다. mAb의 Fc 상에 위치된 펩티드를 총 mAb의 정량화를 위해 모니터링하였다. 두 검정 모두에 대해, 기준 표준물을 혈장 중에 섞어서 표준 곡선 및 품질 대조군 샘플을 제조하고, 생성된 샘플들과 동일한 시간에 동일한 절차를 사용하여 처리하였다. 총 mAb의 농도에 대한 온전한 접합체의 농도의 비를 % 잔존율로 계산하였다.
[표 4]
Figure 112019053646884-pct00193
실시예 107: 약동학적 특성(PK)
DIO 마우스 PK
수컷 DIO C57BL/6N 마우스(20주령, 고지방 식이 14주)를 Taconic Laboratory로부터 입수하였다. 12시간 명/암 주기를 갖는 온도 제어실에 AlphaDri 잠자리를 갖는 케이지마다 마우스를 1 마리씩 수용하였다. 마우스는 물에 대한 자유식 접근이 허용되었고, 고지방 식이(D12492, Research Diet)로 유지되었다.
마우스에 1 mg/㎏ 화합물 1을 피하(s.c.) 투여하고, 매 시점마다 3 마리의 동물을 희생시키고, t = 4, 8, 24, 48, 72, 120 및 168시간째에 혈액을 수집하였다. 3 마리의 미감작
Figure 112019053646884-pct00194
동물로부터의 혈액을 또한 수집하였다. 70% CO2 및 30% O2 혼합물로 유도된 가스 마취 하에 있는 동안 단두 후에 각각의 동물로부터의 대략 300 μL의 혈액을 경정맥을 통해 수집하였다. 혈액 샘플(대략 300 μL)을 12 μl(4% 비율)의 완전 프로테아제 억제제 용액 및 3 μL(1% 비율)의 DPP-IV 억제제를 함유하는 K3E(EDTA) 코팅된 Sarstedt Microvette® 튜브에 수집하였다. 매 시점마다 수집 후 30분 이내에 세포 회수를 위해 혈액 샘플을 젖은 얼음 상에 놓은 후, 냉장 조건(약 5℃) 하에서 약 4분 동안 10,000 rpm으로 원심분리하고, 모든 이용가능한 혈장을 96웰 플레이트에 옮겼다. 웰 플레이트를 -80℃ 냉동기 내에 넣을 때까지 드라이아이스 상에 저장하였다. 데이터는 표 5 및 도 3에 나타나 있다.
래트 PK
화합물 1을 PBS(pH 7.0 내지 7.6) 중 1.0 mg/㎏의 용량 수준으로 수컷 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 래트(미국 매사추세츠주 윌밍턴 소재의 Charles River Laboratories)에 피하 및 정맥내 투여하였다. 대략 500 μL의 혈액을 복재 정맥을 통해 시점당 3 마리의 동물로부터 수집하였다(투여 후 t = 1, 4, 24, 48, 72, 96, 168, 및 240시간째). 70% CO2 및 30% O2 혼합물로 유도된 가스 마취 하에 있는 동안 단두 후에, 투여 후 336시간째의 혈액 샘플을 경정맥을 통해 수집하였다. 혈액 샘플을 20 μl(4% 비율)의 완전 프로테아제 억제제 용액 및 5 μL(1% 비율)의 DPPIV 억제제를 함유하는 K3E(EDTA) 코팅된 Sarstedt Microvette® 튜브에 수집하였다. 매 시점마다 수집 후 60분 이내에 세포 회수를 위해 혈액 샘플을 젖은 얼음 상에 놓은 후, 냉장 조건(약 5℃) 하에서 약 4분 동안 10,000 rpm으로 원심분리하고, 모든 이용가능한 혈장을 96웰 플레이트에 옮겼다. 하기에 기재된 LCMS 방법을 사용하여 화합물 1의 수준을 측정하였다. 데이터는 표 6에 나타나 있다.
사이노몰거스 원숭이(사이노) PK
모든 동물은 투여 전 적어도 8시간 동안 그리고 혈액 샘플 수집의 처음 4시간 내내 절식시켰다. 3 마리의 동물은 1 mg/㎏ 화합물 1의 단회 IV 용량을 제공받았으며, 3 마리의 동물은 1 mg/㎏ 화합물 1의 단회 SC 용량을 제공받았다. 투여 전, 및 투여 후 1, 6, 10, 24, 36, 48, 72, 120, 168, 240, 336, 432, 및 504시간째에 혈액을 수집하였다. IV 군의 경우 투여 후 0.5시간째에 추가의 샘플을 수집하였다. 각각의 동물로부터의 대략 1 ml의 혈액을 4% 비율의 완전 프로테아제 억제제 용액 및 1% 비율의 DPPIV 억제제를 함유하는 K3E(EDTA) 코팅된 Sarstedt Microvette® 튜브에 수집하였다. 매 시점마다 수집 후 30분 이내에 혈액 샘플을 젖은 얼음 상에 놓은 후, 원심분리하고, 생성된 혈장을 3회분으로 분할하고 3개의 반복된 96웰 플레이트 내로 옮겼다. 웰 플레이트를 -80℃ 냉동기 내에 넣을 때까지 드라이아이스 상에 저장하였다. 데이터는 표 7 및 도 4에 나타나 있다.
혈장 수준의 결정을 위한 온전한 질량 분석 검정
혈장 샘플을 항-인간 Fc 항체를 사용하여 면역친화성 포획에 의해 처리한 후, 삼중 TOF(비행 시간) 질량 분석계 상에서의 역상 LC-고해상 풀 스캔 MS 분석에 의해 처리하였다. 원시 MS 스펙트럼을 디컨볼루션하여, 주입된 샘플 내의 성분들의 분자량을 구하였다. 온전한 접합체의 분자 이온의 피크를 정량화를 위해 사용하였다. 기준 표준물을 혈장 중에 섞어서 표준 곡선 및 품질 대조군 샘플을 제조하고, 생성된 샘플들과 동일한 시간에 동일한 절차를 사용하여 처리하였다. DIO 마우스, 래트, 및 사이노에 대한 PK 데이터가 표 5, 표 6, 및 표 7에 각각 나타나 있다. DIO 마우스 및 사이노에 대한 PK 데이터는 또한 도 3 및 도 4에 각각 나타나 있다.
[표 5]
Figure 112019053646884-pct00195
[표 6]
Figure 112019053646884-pct00196
[표 7]
Figure 112019053646884-pct00197
실시예 108: 생체내 효능 연구
식이-유도 비만(DIO) 마우스에서의 체중 손실: 급성 투여
화합물 1을 단회 투여 후에 수컷 DIO C57B1/6 마우스에서 음식 섭취량 및 체중을 감소시키는 그의 능력에 대하여 평가하였다. 수컷 DIO C57BL/6N 마우스(20주령, 고지방 식이 14주)를 Taconic Laboratory로부터 입수하였다. 12시간 명/암 주기를 갖는 온도 제어실에 AlphaDri 잠자리를 갖는 케이지마다 마우스를 1 마리씩 수용하였다. 마우스는 물에 대한 자유식 접근이 허용되었고, 고지방 식이(D12492, Research Diet)로 유지되었다. 동물들을 실험 시작 전 적어도 1주 동안 시설에 순응시켰다.
투여 전날, 마우스를 개별 체중에 기초하여 8 마리의 동물로 된 코호트로 그룹을 나누었다. 다음날 3:00 내지 4:00 pm에, 동물들의 체중을 측정하고, 피하(s.c.) 투여를 통해 비히클(dPBS, pH 7.2), 0.1, 0.3, 1.0, 3.0, 또는 7.5 nmol/㎏ 용량의 화합물 1, 또는 0.3 nmol/㎏의 둘라글루타이드로 처리하였다. 투여 후 24시간, 48시간 및 72시간째에 체중 및 음식 섭취량을 측정하고, 체중 손실 및 음식 섭취량 감소의 백분율을 계산하였다. Prism에서 이원 반복 측정 분산분석(two-way repeated measures ANOVA)을 터키 사후 검정과 함께 사용하여 통계학적 분석을 수행하였다. 모든 데이터는 평균 ± SEM으로 제시되어 있다(도 5 및 도 6).
식이-유도 비만 마우스에서의 체중 손실: 만성 투여
화합물 1을 8일의 기간에 걸쳐 수컷 DIO C57B1/6 마우스에서 반복 투여 시에 음식 섭취량 및 체중을 감소시키고 글루코스 항상성을 개선하는 그의 능력에 대해 평가하였다. 수컷 DIO C57BL/6N 마우스(20주령, 고지방 식이 14주)를 Taconic Laboratory로부터 입수하였다. 12시간 명/암 주기를 갖는 온도 제어실에 AlphaDri 잠자리를 갖는 케이지마다 마우스를 1 마리씩 수용하였다. 마우스는 물에 대한 자유식 접근이 허용되었고, 고지방 식이(D12492, Research Diet)로 유지되었다. 동물들을 실험 시작 전 적어도 1주 동안 시설에 순응시켰다.
투여 전날, 마우스를 개별 체중에 기초하여 그룹을 나누었다. 다음 8일에 대해 매일 3:00 내지 4:00 pm에, 동물의 체중 및 음식 섭취량을 측정하였다. 동물들을 매일 피하 투여를 통해 0.3 nmol/㎏의 비히클(dPBS, pH 7.2) 또는 둘라글루타이드로 처리하거나, 또는 매 3일마다 피하 투여를 통해 0.1, 0.3, 1.0, 3.0 nmol/㎏ 용량의 화합물 1로 처리하였다. 8일 후에, 마우스를 5시간 동안 절식시키고, 이어서 t = 0에서 2 g/㎏ 볼루스의 글루코스를 경구 제공하였다. 글루코스 시험투여(challenge) 후 t = 0, 30, 60, 90, 및 120분째에, 혈당을 측정하고, t = 0, 30, 및 90분째에 혈액을 채취하여 혈장 인슐린을 측정한다. Prism에서 일원 분산분석 또는 이원 반복 측정 분산분석을 터키 사후 검정과 함께 사용하여 통계학적 분석을 수행하였다. 모든 데이터는 평균 ± SEM으로 제시되어 있다(도 7, 도 8, 및 표 8 내지 표 11).
[표 8]
Figure 112019053646884-pct00198
[표 9]
Figure 112019053646884-pct00199
[표 10]
Figure 112019053646884-pct00200
[표 11]
Figure 112019053646884-pct00201
리라글루타이드와 병용 시의 식이-유도 비만 마우스에서의 체중 손실: 만성 투여
장시간 작용형 GLP-1 효능제, 리라글루타이드와 병용하여 화합물 1을 9일의 기간에 걸쳐 수컷 DIO C57B1/6 마우스에서 반복 투여 시에 음식 섭취량 및 체중을 감소시키고 글루코스 항상성을 개선하는 그의 능력에 대해 평가하였다.
수컷 DIO C57BL/6N 마우스(20주령, 고지방 식이 14주)를 Taconic Laboratory로부터 입수하였다. 12시간 명/암 주기를 갖는 온도 제어실에 AlphaDri 잠자리를 갖는 케이지마다 마우스를 1 마리씩 수용하였다. 마우스는 물에 대한 자유식 접근이 허용되었고, 고지방 식이(D12492, Research Diet)로 유지되었다. 동물들을 실험 시작 전 적어도 1주 동안 시설에 순응시켰다.
투여 전날, 신체 조성을 MRI에 의해 측정하고, 마우스를 개별 체중에 기초하여 그룹을 나누었다. 일수 0에서 3:00 내지 3:00 pm에, 동물의 체중 및 음식 섭취량을 측정하였다. 단일 처리군 내의 동물들을 매일 피하 투여를 통해 비히클(dPBS, pH 7.2) 또는 10 nmol/㎏의 리라글루타이드로 처리하거나, 또는 매 3일마다 피하 투여를 통해 0.1 또는 1.0 nmol/㎏ 용량의 화합물 1로 처리하였다. 병용군 내의 동물들은 매일 리라글루타이드(10 nmol/㎏)를 그리고 매 3일마다 0.1 또는 1.0 nmol/㎏ 용량의 화합물 1을 제공받았다. 일수 8에, 신체 조성을 MRI에 의해 측정하였다. 일수 9에, 마우스를 5시간 동안 절식시키고, 공복 혈당 및 인슐린을 측정하였다. Prism에서 일원 분산분석 또는 이원 반복 측정 분산분석을 터키 사후 검정과 함께 사용하여 통계학적 분석을 수행하였다. 모든 데이터는 평균 ± SEM으로 제시되어 있다(도 9 및 표 12 내지 표 17).
[표 12]
[표 13]
[표 14]
Figure 112019053646884-pct00204
[표 15]
Figure 112019053646884-pct00205
[표 16]
Figure 112019053646884-pct00206
[표 17]
Figure 112019053646884-pct00207
실시예 109: 스프라그-돌리 래트에서 음식 섭취량 및 체중에 대한 화합물 1의 단회 용량의 효과
화합물 1을 단회 투여 후에 스프라그-돌리에서 음식 섭취량 및 체중을 감소시키는 그의 능력에 대하여 평가하였다. 동물들을 200 내지 225 g의 체중으로 Charles River Labs (미국 매사추세츠주 윌밍턴 소재)로부터 입수하고, 전달한지 1주 이내에 사용하였다. 이들을 케이지당 1 마리씩, 12시간 명/암 주기를 갖는 온도-제어된 방 내에서 풍부화(enrichment)를 위한 플라스틱 튜브 및 Alpha dri 잠자리에 수용하였다. 이들은 물에 자유식으로 접근되게 하고, 실험실용 설치류 식이가 급식되었다: Irradiated Certified PicoLab® 설치류 식이(Rodent Diet) 20, 5K75* (미국 펜실베이니아주 퀘이커타운 소재의 ASAP를 통해 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 Purina Mills로부터 공급됨). 투여 전에 각각의 래트에 대해 동물 체중을 측정하고 기록하였다.
투여 전날, 래트를 개별 체중에 기초하여 8 마리의 동물로 된 코호트로 그룹을 나누었다. 다음날, 동물들의 체중을 측정하고, 피하 투여를 통해 비히클(dPBS, pH 7.2), 0.1, 0.3, 1.0, 또는 3.0 nmol/㎏ 용량의 화합물 1, 또는 0.3 nmol/㎏의 둘라글루타이드로 처리하였다. 투여 후 1일, 2일 및 3일째에 체중 및 음식 섭취량을 측정하고, 체중 손실 및 음식 섭취량 감소의 백분율을 계산하였다. Prism에서 이원 반복 측정 분산분석을 터키 사후 검정과 함께 사용하여 통계학적 분석을 수행하였다. 모든 데이터는 평균 ± SEM으로 제시되어 있다(표 18 내지 표 20).
[표 18]
Figure 112019053646884-pct00208
[표 19]
Figure 112019053646884-pct00209
[표 20]
Figure 112019053646884-pct00210
실시예 110: 비만 레서스 마카크에서 단독으로의 또는 리라글루타이드와의 병용물로의 화합물 1의 효과
화합물 1을 비만 레서스 마카크에서 음식 섭취량을 감소시키는 그의 능력에 대해 평가하였다. 리라글루타이드가 효능 있는 용량의 화합물 1과 공동투여될 때 관찰된 추가의 효능을 또한 평가하였다. 먼저, 간소화된 용량-범위 연구를 수행하여, 공동투여 동안 사용될 리라글루타이드의 용량을 결정하였다. 6 마리의 동물은 3주 동안 식염수를 일일 1회 sc 투여받았다. 음식 섭취량을 매일 측정하고, 3주의 비히클 처리에 걸친 평균 일일 섭취량으로서 기저선 음식 섭취량을 설정하였다. 이어서, 6 마리의 동물을 하기의 2개의 군으로 나누었다: 0.01 mg/㎏(n=3) 및 0.02 mg/㎏(n=3). 기저선 대비 음식 섭취량에 대한 효과를 결정하기 위해 그리고 최대 내성 용량을 확인하기 위해, 각각은 1주 동안 일일 피하 용량의 리라글루타이드를 제공받았다. 또한, 리라글루타이드 처리를 중단한 후 2주 동안 음식 섭취량을 측정하였다. 모든 데이터는 평균 주간 음식 섭취량 ± SEM으로 제시되어 있다(도 10).
10 마리의 비만 레서스 마카크를 사용하여 화합물 1의 효능을 평가하였다. 2주의 기저선 기간 후, 화합물 1을 4주 동안 매일 s.c. 투먹이였다. 동물에게 화합물 1을 0.01 mg/㎏으로 7일, 먹이서 0.03 mg/㎏으로 7일, 이어서 0.015 mg/㎏으로 9일 동안 투여하고, 마지막으로 5일 동안 0.015 mg/㎏의 화합물 1을 0.01 mg/㎏의 리라글루타이드와 병용하여 공동투여하였다. 음식 섭취량을 매일 모니터링하고, 체중을 매주 측정하였다. 글루코스, 인슐린, 총 콜레스테롤, HDL, LDL, ALT 및 AST 수준을 기저선에서, 화합물 1의 처리 후에, 그리고 병용 처리 후에 평가하였다. 모든 데이터는 평균 ± SEM으로 제시먹이 있다(표 21 및 표 22, 및 도 11 및 도 12).
[표 21]
Figure 112019053646884-pct00211
[표 22]
Figure 112019053646884-pct00212
당업자는 광범위한 본 발명의 개념으로부터 벗어나지 않고서 전술된 실시 형태들에 변경이 이루어질 수 있다는 것을 알 것이다. 따라서, 본 발명은 개시된 특정 실시 형태로 제한되는 것이 아니라, 본 명세서에 의해 한정되는 바와 같은 본 발명의 사상 및 범주 내의 변형들을 포함하도록 의도됨이 이해된다.
본 명세서에 인용된 모든 문헌은 참고로 포함된다.
본 발명의 예시적인 사이클릭 PYY 서열 또는 이의 접합체는 하기를 포함한다:
서열 번호 1
명칭: [사이클로-(βA2-COCH2-hC31), K(PEG12-AcBr)11, psi-(35R,36Y)]-PYY2-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00213
서열 번호 2
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00214
서열 번호 3
명칭: [사이클로-(I3-CO(CH2)2트라이아졸릴-Nle31)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00215
서열 번호 4
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-Pal)11]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00216
서열 번호 5
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-AcVitE)11]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00217
서열 번호 6
명칭: [사이클로-(I3-CO(CH2)2트라이아졸릴-Nle31), K(γ-Glu-AcVitE)11]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00218
서열 번호 7
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-Pal)9]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00219
서열 번호 8
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-Pal)30]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00220
서열 번호 9
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), psi-(R35Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00221
서열 번호 10
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-AcVitE)30]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00222
서열 번호 11
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-AcVitE)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00223
서열 번호 12
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), (N-Me-R35)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00224
서열 번호 13
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-Pal)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00225
서열 번호 14
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-Pal)30, (N-Me-R35)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00226
서열 번호 15
명칭: [사이클로-(K4-CO(CH2)2NHCOCH2-hC31), K(γ-Glu-Pal)30]-PYY4-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00227
서열 번호 16
명칭: [사이클로-(K4-p-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-Pal)30]-PYY4-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00228
서열 번호 17
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), A4, K(γ-Glu-Pal)30]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00229
서열 번호 18
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), E4, K(γ-Glu-Pal)30]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00230
서열 번호 19
명칭: [사이클로-(I3-p-COPhCH2- C31), K(γ-Glu-Pal)30, (N-Me-R35)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00231
서열 번호 20
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-C31), K(γ-Glu-Pal)30, (N-Me-R35)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00232
서열 번호 21
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), A4, A26, K(γ-Glu-Pal)30]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00233
서열 번호 22
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), E4, A26, K(γ-Glu-Pal)30]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00234
서열 번호 23
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), K((OEG)2-γ-Glu-COC16CO2H)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00235
서열 번호 24
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), K((OEG)2-γ-Glu-COC18CO2H)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00236
서열 번호 25
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-Stear)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00237
서열 번호 26
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-Arach)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00238
서열 번호 27
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), K((OEG)2-COC16CO2H)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00239
서열 번호 28
명칭: [사이클로-(K4-p-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-Pal)30, psi-(R35,Y36)]-PYY4-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00240
서열 번호 29
명칭: [사이클로-(K4-CO(CH2)2NHCOCH2-hC31), K(γ-Glu-Pal)30, psi-(R35,Y36)]-PYY4-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00241
서열 번호 30
명칭: [사이클로-(K4-CO(CH2)3NHCOCH2-C31), K(γ-Glu-Pal)30, psi-(R35,Y36)]-PYY4-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00242
서열 번호 31
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), K((OEG)2-γ-Glu-Stear)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00243
서열 번호 32
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), A4, A26, K(γ-Glu-Pal)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00244
서열 번호 33
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-Pal)30, (N-Me-Q34), psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00245
서열 번호 34
명칭: [사이클로-(K4-CO(CH2)5NHCOCH2-C31), K(γ-Glu-Pal)30, psi-(R35,Y36)]-PYY4-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00246
서열 번호 35
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-Pal)30, (N-Me-R35), psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00247
서열 번호 36
명칭: [사이클로-(K4-CO(CH2)2NHCOCH2-hC31), K(γ-Glu-Pal)30, (N-Me-R35), psi-(R35,Y36)]-PYY4-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00248
서열 번호 37
명칭: [사이클로-(I3-CO(CH2)3NHCOCH2-C31), K(γ-Glu-Pal)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00249
서열 번호 38
명칭: [사이클로-(I3-CO(CH2)2NHCOCH2-hC31), K(γ-Glu-Pal)30, (N-Me-R35), psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00250
서열 번호 39
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), S4, K(γ-Glu-Arach)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00251
서열 번호 40
명칭: [사이클로-(I3-CO(CH2)2트라이아졸릴-Nle31), K((OEG)2-γ-Glu-Pal)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00252
서열 번호 41
명칭: [사이클로-(I3-CO(CH2)2트라이아졸릴-Nle31), K(γ-Glu-Pal)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00253
서열 번호 42
명칭: [사이클로-(I3-CO(CH2)2트라이아졸릴-Nle31), K((OEG)2-γ-Glu-COC16CO2H)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00254
서열 번호 43
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), K((OEG)2-γ-Glu-Pal)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00255
서열 번호 44
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), K((OEG)2-γ-Glu-COC16CO2H)11, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00256
서열 번호 45
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(COCH2CH2(OCH2CH2)24NH-γ-Glu-Pal)11, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00257
서열 번호 46
명칭: [사이클로-(I3-CO(CH2)2NHCOCH2-hC31), K(γ-Glu-Pal)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00258
서열 번호 47
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), K((OEG)2-γ-Glu-COC16CO2H)7, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00259
서열 번호 48
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), K((OEG)2-γ-Glu-COC16CO2H)22, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00260
서열 번호 49
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-(Pal-16-OH))30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00261
서열 번호 50
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), K((OEG)2-γ-Glu-COC16CO2H)23, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00262
서열 번호 51
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), S4, K(γ-Glu-Pal)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00263
서열 번호 52
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(COCH2CH2(OCH2CH2)12NH-γ-Glu-Pal)11, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00264
서열 번호 53
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), K((OEG)4-γ-Glu-Pal)11, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00265
서열 번호 54
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), K((OEG)2-γ-Glu-Pal)11, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00266
서열 번호 55
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), K((OEG)2-γ-Glu-Pal)23, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00267
서열 번호 56
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-COCH2Ph-(4-ClPh)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00268
서열 번호 57
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-CO(CH2)2PhO-(2,4-Cl2Ph)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00269
서열 번호 58
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-CO(CH2)10-(4-F-Ph))30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00270
서열 번호 59
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), K((OEG)2-γ-Glu-Pal)22, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00271
서열 번호 60
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), K((OEG)2-γ-Glu-Pal)7, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00272
서열 번호 61
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-CO(CH2)10-(4-F3C-Ph))30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00273
서열 번호 62
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-CO(CH2)10-CF3)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00274
서열 번호 63
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-CO(CH2)13-CF3)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00275
서열 번호 64
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-(Pal-16-OEt))30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00276
서열 번호 65
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-CO(CH2)11(CD2)3CD3)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00277
서열 번호 66
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-CO(CH2)10-(2,4-(CF3)2-Ph))30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00278
서열 번호 67
명칭: [사이클로-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(γ-Glu-CO(CH2)10-(3,5-(CF3)2-Ph))30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00279
서열 번호 68
명칭: [사이클로-(I3-CO(CH2)2NHCOCH2- C30), K((OEG)2-γ-Glu-COC16CO2H)11, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00280
서열 번호 69
명칭: [사이클로-(G2-E31), S4, K11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00281
서열 번호 70
명칭: [사이클로-(G2-E30), S4, K11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00282
서열 번호 71
명칭: [사이클로-(G2-E30), S4, K11, (N-Me-R35)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00283
서열 번호 72
명칭: [사이클로-(G2-E30), S4, K((OEG)2-γ-Glu-COC16CO2H)11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00284
서열 번호 73
명칭: [사이클로-(βA2-COCH2-hC31), K(PEG6-AcBr)11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00285
서열 번호 74
명칭: [사이클로-(βA2-COCH2-hC31), K(AcBr)11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00286
서열 번호 75
명칭: [사이클로-(I3-COCH2-C31), K(PEG12-AcBr)11, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00287
서열 번호 76
명칭: [사이클로-(βA2-COCH2-hC31), K(PEG12-AcBr)11, K(mPEG16)30, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00288
서열 번호 77
명칭: [사이클로-(βA2-COCH2-hC31), K(AcBr)11, K(mPEG12)20, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00289
서열 번호 78
명칭: [사이클로-(βA2-COCH2-hC31), K(PEG12-AcBr)11, (N-Me)Q34, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00290
서열 번호 79
명칭: [사이클로-(βA2-COCH2-hC31), K(PEG12-AcBr)11, N-Me-R35, psi-(R35,36Y)]-PYY2-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00291
서열 번호 80
명칭: [사이클로-(βA2-COCH2-hC31), R4, K(PEG12-AcBr)11, W30, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00292
서열 번호 81
명칭: [사이클로-(3I-COCH2CH2CH2NHCOCH2-C31), R4, K(PEG12-AcBr)11, W30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00293
서열 번호 82
명칭: [사이클로-(K4-OEG-COCH2-C31), K(PEG12-AcBr)11, psi-(R35,Y36)]-PYY4-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00294
서열 번호 83
명칭: [사이클로-(I3-COCH2CH2트라이아졸릴Nle31), K(PEG12-AcBr)11, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조
Figure 112019053646884-pct00295
서열 번호 84
명칭: [사이클로-(I3-m-CO-벤질-hC31), K(PEG8-트라이아졸릴-CH2CH2CO-PEG4-AcBr)11, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00296
서열 번호 85
명칭: [사이클로-(βA2-COCH2-hC31), K(PEG12-AcBr)23, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36, 구조:
Figure 112019053646884-pct00297
서열 번호 86
명칭: [사이클로-(βA2-COCH2-hC31), K(PEG12-AcBr)22, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00298
서열 번호 87
명칭: [사이클로-(βA2-COCH2-hC31), K(PEG12-AcBr)7, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00299
서열 번호 88
명칭: [사이클로-(G2-COCH2-C30), K(PEG12-AcBr)11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00300
서열 번호 89
명칭: [사이클로-(G2-COCH2-C30), K(PEG12-AcBr)11, N-Me-R35]-PYY2-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00301
서열 번호 90
명칭: [사이클로-(βA2-COCH2-C30), K(PEG12-AcBr)11, N-Me-R35]-PYY2-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00302
서열 번호 91
명칭: [사이클로-(G2-COCH2-hC30), K(PEG12-AcBr)11, N-Me-R35]-PYY2-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00303
서열 번호 92
명칭: [사이클로-(βA2-COCH2-hC31), K(PEG12-AcBr)11, N-Me-R35]PYY2-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00304
서열 번호 93
명칭: [사이클로-(G2-COCH2-hC30), K(PEG12-AcBr)11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00305
서열 번호 94
명칭: [사이클로-(βA2-COCH2-C30), K(PEG12-AcBr)11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00306
서열 번호 95
명칭: [사이클로-(G2-E30), S4, K(AcBr)11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00307
서열 번호 96
명칭: [사이클로-(βA2-COCH2-hC31), K(PEG24-AcBr)11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00308
서열 번호 97
명칭: [사이클로-(G2-Ac-hC31), K(PEG12-AcBr)11, psi-(R35-Y36)]-PYY2-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00309
서열 번호 98
명칭: [사이클로-(G2-COCH2-C30), K(AcBr)11, N-Me-R35]-PYY2-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00310
서열 번호 99
명칭: [사이클로-(βA2-COCH2-C30), K(AcBr)11, N-Me-R35]-PYY2-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00311
서열 번호 100
명칭: [사이클로-(βA2-COCH2-C30), K(AcBr)11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00312
서열 번호 101
hPYY3-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00313
서열 번호 102
명칭: [사이클로-(βA2-COCH2-hC31), K(PEG12)11, psi-(35R,36Y)]-PYY2-36 mAb 동종이량체 접합체 (화합물 1)
구조:
Figure 112019053646884-pct00314
서열 번호 103
명칭: [사이클로-(βA2-COCH2-hC31), K(PEG6)11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 mAb 동종이량체 접합체 (화합물 2)
구조:
Figure 112019053646884-pct00315
서열 번호 104
명칭: [사이클로-(βA2-COCH2-hC31), K11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 mAb 동종이량체 접합체 (화합물 3)
구조:
Figure 112019053646884-pct00316
서열 번호 105
명칭: [사이클로-(I3-COCH2-C31), K(PEG12)11, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 mAb 동종이량체 접합체 (화합물 4)
구조:
Figure 112019053646884-pct00317
서열 번호 106
명칭: [사이클로-(βA2-COCH2-hC31), K(PEG12)11, K(mPEG16)30, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 mAb 동종이량체 접합체 (화합물 5)
구조:
Figure 112019053646884-pct00318
서열 번호 107
명칭: [사이클로-(βA2-COCH2-hC31), K11, K(mPEG12)20, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 mAb 동종이량체 접합체 (화합물 6)
구조:
Figure 112019053646884-pct00319
서열 번호 108
명칭: [사이클로-(βA2-COCH2-hC31), K(PEG12)11, (N-Me)Q34, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 mAb 동종이량체 접합체 (화합물 7)
구조:
Figure 112019053646884-pct00320
서열 번호 109
명칭: [사이클로-(βA2-COCH2-hC31), K(PEG12)11, N-Me-R35, psi-(R35,36Y)]-PYY2-36 mAb 동종이량체 접합체 (화합물 8)
구조:
Figure 112019053646884-pct00321
서열 번호 110
명칭: [사이클로-(βA2-COCH2-hC31), R4, K(PEG12)11, W30, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 mAb 동종이량체 접합체 (화합물 9)
구조:
Figure 112019053646884-pct00322
서열 번호 111
명칭: [사이클로-(3I-COCH2CH2CH2NHCOCH2-C31), R4, K(PEG12)11, W30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 mAb 동종이량체 접합체 (화합물 10)
구조:
Figure 112019053646884-pct00323
서열 번호 112
명칭: [사이클로-(K4-OEG-COCH2-C31), K(PEG12)11, psi-(R35,Y36)]-PYY4-36 mAb 동종이량체 접합체 (화합물 11)
구조:
Figure 112019053646884-pct00324
서열 번호 113
명칭: [사이클로-(I3-COCH2CH2트라이아졸릴Nle31), K(PEG12)11, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 mAb 동종이량체 접합체 (화합물 12)
구조
Figure 112019053646884-pct00325
서열 번호 114
명칭: [사이클로-(I3-m-CO-벤질-hC31), K(PEG8-트라이아졸릴-CH2CH2CO-PEG4)11, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 mAb 동종이량체 접합체 (화합물 13)
구조:
Figure 112019053646884-pct00326
서열 번호 115
명칭: [사이클로-(βA2-COCH2-hC31), K(PEG12)23, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 mAb 동종이량체 접합체 (화합물 14)
구조:
Figure 112019053646884-pct00327
서열 번호 116
명칭: [사이클로-(βA2-COCH2-hC31), K(PEG12)22, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 mAb 동종이량체 접합체 (화합물 15)
구조:
Figure 112019053646884-pct00328
서열 번호 117
명칭: [사이클로-(βA2-COCH2-hC31), K(PEG12)7, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 mAb 동종이량체 접합체 (화합물 16)
구조:
Figure 112019053646884-pct00329
서열 번호 118
명칭: [사이클로-(G2-COCH2-C30), K(PEG12)11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 mAb 동종이량체 접합체 (화합물 17)
구조:
Figure 112019053646884-pct00330
서열 번호 119
명칭: [사이클로-(G2-COCH2-C30), K(PEG12)11, N-Me-R35]-PYY2-36 mAb 동종이량체 접합체 (화합물 18)
구조:
Figure 112019053646884-pct00331
서열 번호 120
명칭: [사이클로-(βA2-COCH2-C30), K(PEG12)11, N-Me-R35]-PYY2-36 mAb 동종이량체 접합체 (화합물 19)
구조:
Figure 112019053646884-pct00332
서열 번호 121
명칭: [사이클로-(G2-COCH2-hC30), K(PEG12)11, N-Me-R35]-PYY2-36 mAb 동종이량체 접합체 (화합물 20)
구조:
Figure 112019053646884-pct00333
서열 번호 122
명칭: [사이클로-(βA2-COCH2-hC31), K(PEG12)11, N-Me-R35]PYY2-36 mAb 동종이량체 접합체 (화합물 21)
구조:
Figure 112019053646884-pct00334
서열 번호 123
명칭: [사이클로-(G2-COCH2-hC30), K(PEG12)11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 mAb 동종이량체 접합체 (화합물 22)
구조:
Figure 112019053646884-pct00335
서열 번호 124
명칭: [사이클로-(βA2-COCH2-C30), K(PEG12)11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 mAb 동종이량체 접합체 (화합물 23)
구조:
Figure 112019053646884-pct00336
서열 번호 125
명칭: [사이클로-(G2-E30), S4, K11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 동종이량체 접합체 (화합물 24)
구조:
Figure 112019053646884-pct00337
서열 번호 126
명칭: [사이클로-(βA2-COCH2-hC31), K(PEG24)11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36 mAb 동종이량체 접합체 (화합물 25)
Figure 112019053646884-pct00338
서열 번호 127
명칭: [사이클로-(G2-Ac-hC31), K(PEG12)11, psi-(R35-Y36)]-PYY2-36 mAb 동종이량체 접합체 (화합물 26)
구조:
Figure 112019053646884-pct00339
서열 번호 147
명칭: [사이클로-(βA2-COCH2-hC31), psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00340
서열 번호 148
명칭: [사이클로-(βA2-COCH2-hC31), K11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00341
서열 번호 149
명칭: [사이클로-(G2-E30), S4, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00342
서열 번호 150
명칭: [사이클로-(G2-E30), S4,K11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00343
서열 번호 151
명칭: [사이클로-(G2-COCH2-C30), N-Me-R35]-PYY2-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00344
서열 번호 152
명칭: [사이클로-(G2-COCH2-C30), K11, N-Me-R35]-PYY2-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00345
서열 번호 153
명칭: [사이클로-(βA2-COCH2-C30), N-Me-R35]-PYY2-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00346
서열 번호 154
명칭: [사이클로-(βA2-COCH2-C30), K11, N-Me-R35]-PYY2-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00347
서열 번호 155
명칭: [사이클로-(βA2-COCH2-C30), psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00348
서열 번호 156
명칭: [사이클로-(βA2-COCH2-C30), K11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
구조:
Figure 112019053646884-pct00349
SEQUENCE LISTING <110> Janssen Pharmaceutica NV <120> Antibody-Coupled Cyclic Peptide Tyrosine Tyrosine Compounds as Modulators of Neuropeptide Y Receptors <130> PRD3436 <150> US62/413,613 <151> 2016-10-27 <150> US62/413,586 <151> 2016-10-27 <160> 156 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ala <222> (1)..(1) <223> Ala with chemical modification as described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with chemical modification as described in the specification <220> <221> Cys <222> (30)..(30) <223> Cys, wherein Cys is a homocysteine with chemical modification as described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with chemical modification as described in the specification <400> 1 Ala Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 2 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with chemical modification as described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cyse, wherein Cys is homocysteine with chemical modification as described in the specification <400> 2 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 3 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Leu <222> (29)..(29) <223> Leu, wherien Leu is a norleucine with the chemical modification as described in the specification <400> 3 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Leu Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 4 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Lys <222> (9)..(9) <223> Lys with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein cys is a homocysteine with the chemical modification as described in the specification <400> 4 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 5 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Lys <222> (9)..(9) <223> Lys with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein cys is homocysteine with the chemical modification as described in the specification <400> 5 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 6 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Lys <222> (9)..(9) <223> Lys with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Leu <222> (29)..(29) <223> Leu, wherein the leu is norleucine with the chemical modification as described in the specification <400> 6 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Leu Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 7 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Lys <222> (7)..(7) <223> Lys with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein cys is homocysteine with the chemical modification as described in the specification <400> 7 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Lys Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 8 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Lys <222> (28)..(28) <223> Lys with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein cys is homocysteine with the chemical modification as described in the specification <400> 8 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Lys Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 9 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein cys is a homocysteine with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification as described in the specification <400> 9 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 10 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Lys <222> (28)..(28) <223> Lys with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein cys is homocysteine with the chemical modification as described in the specification <400> 10 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Lys Cys Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 11 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Lys <222> (28)..(28) <223> Lys with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein cys is homocysteine with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification as described in the specification <400> 11 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Lys Cys Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 12 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein the cys is homocysteine with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification as described in the specification <400> 12 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 13 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Lys <222> (28)..(28) <223> Lys with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein the cys is homocysteine with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification as described in the specification <400> 13 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Lys Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 14 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Lys <222> (28)..(28) <223> Lys with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein the cys is homocysteine with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification as described in the specification <400> 14 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Lys Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 15 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Lys <222> (1)..(1) <223> Lys with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Lys <222> (27)..(27) <223> Lys with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Cys <222> (28)..(28) <223> Cys, wherein cys is homocysteine with the chemical modification as described in the specification <400> 15 Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn Arg 1 5 10 15 Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Lys Cys Thr Arg Gln Arg 20 25 30 Tyr <210> 16 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Lys <222> (1)..(1) <223> Lys with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Lys <222> (27)..(27) <223> Lys with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Cys <222> (28)..(28) <223> Cys, wherein the cys is homocysteine with the chemical modification as described in the specification <400> 16 Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn Arg 1 5 10 15 Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Lys Cys Thr Arg Gln Arg 20 25 30 Tyr <210> 17 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Lys <222> (28)..(28) <223> Lys with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification as described in the specification <400> 17 Ile Ala Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Lys Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 18 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Lys <222> (28)..(28) <223> Lys with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein cys is homocysteine with the chemical modification as described in the specification <400> 18 Ile Glu Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Lys Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 19 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Lys <222> (28)..(28) <223> Lys with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification as described in the specification <400> 19 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Lys Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 20 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Lys <222> (28)..(28) <223> Lys with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification as described in the specification <400> 20 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Lys Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 21 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Lys <222> (28)..(28) <223> Lys with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein cys is a homocysteine with the chemical modification as described in the specification <400> 21 Ile Ala Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg Ala Tyr Leu Asn Lys Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 22 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Lys <222> (28)..(28) <223> Lys with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification as described in the specification <400> 22 Ile Glu Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg Ala Tyr Leu Asn Lys Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 23 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Lys <222> (28)..(28) <223> Lys with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein cys is a homocysteine with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification as described in the specification <400> 23 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Lys Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 24 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Lys <222> (28)..(28) <223> Lys with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein cys is homocysteine with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification as described in the specification <400> 24 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Lys Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 25 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Lys <222> (28)..(28) <223> Lys with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein cys is a homocysteine with the chemical modification as described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification as described in the specification <400> 25 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Lys Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 26 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the application <220> <221> Lys <222> (28)..(28) <223> Lys with the chemical modification described in the application <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the application <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification described in the application <400> 26 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Lys Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 27 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (28)..(28) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein the cys is homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 27 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Lys Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 28 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Lys <222> (1)..(1) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (27)..(27) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (28)..(28) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (32)..(32) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 28 Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn Arg 1 5 10 15 Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Lys Cys Thr Arg Gln Arg 20 25 30 Tyr <210> 29 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Lys <222> (1)..(1) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (27)..(27) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (28)..(28) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (32)..(32) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 29 Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn Arg 1 5 10 15 Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Lys Cys Thr Arg Gln Arg 20 25 30 Tyr <210> 30 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Lys <222> (1)..(1) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (27)..(27) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (28)..(28) <223> Cys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (32)..(32) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 30 Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn Arg 1 5 10 15 Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Lys Cys Thr Arg Gln Arg 20 25 30 Tyr <210> 31 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (28)..(28) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 31 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Lys Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 32 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (28)..(28) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 32 Ile Ala Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg Ala Tyr Leu Asn Lys Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 33 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (28)..(28) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Gln <222> (32)..(32) <223> Gln with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 33 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Lys Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 34 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Lys <222> (1)..(1) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (27)..(27) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (28)..(28) <223> Cys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (32)..(32) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 34 Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn Arg 1 5 10 15 Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Lys Cys Thr Arg Gln Arg 20 25 30 Tyr <210> 35 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (28)..(28) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 35 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Lys Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 36 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Lys <222> (1)..(1) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (27)..(27) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (28)..(28) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (32)..(32) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 36 Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn Arg 1 5 10 15 Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Lys Cys Thr Arg Gln Arg 20 25 30 Tyr <210> 37 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (28)..(28) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 37 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Lys Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 38 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (28)..(28) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 38 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Lys Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 39 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (28)..(28) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 39 Ile Ser Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Lys Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 40 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (28)..(28) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Leu <222> (29)..(29) <223> Leu, wherein the leu is a norleucine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 40 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Lys Leu Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 41 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (28)..(28) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Leu <222> (29)..(29) <223> Leu, wherein the leu is a norleucine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 41 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Lys Leu Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 42 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (28)..(28) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Leu <222> (29)..(29) <223> Leu, wherein the leu is a norleucine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 42 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Lys Leu Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 43 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (28)..(28) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 43 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Lys Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 44 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (9)..(9) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 44 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 45 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (9)..(9) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 45 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 46 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (28)..(28) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 46 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Lys Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 47 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (5)..(5) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 47 Ile Lys Pro Glu Lys Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 48 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (20)..(20) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 48 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Lys Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 49 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (28)..(28) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 49 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Lys Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 50 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (21)..(21) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 50 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Lys Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 51 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (28)..(28) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 51 Ile Ser Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Lys Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 52 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (9)..(9) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <400> 52 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 53 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (9)..(9) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 53 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 54 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (9)..(9) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 54 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 55 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (21)..(21) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 55 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Lys Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 56 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (28)..(28) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <400> 56 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Lys Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 57 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (28)..(28) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <400> 57 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Lys Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 58 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (28)..(28) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 58 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Lys Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 59 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (20)..(20) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 59 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Lys Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 60 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (5)..(5) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 60 Ile Lys Pro Glu Lys Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 61 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (28)..(28) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 61 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Lys Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 62 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (28)..(28) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 62 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Lys Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 63 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (28)..(28) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 63 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Lys Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 64 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (28)..(28) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 64 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Lys Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 65 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (28)..(28) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 65 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Lys Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 66 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (28)..(28) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 66 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Lys Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 67 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (28)..(28) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 67 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Lys Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 68 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (9)..(9) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (28)..(28) <223> Cys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 68 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Cys Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 69 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Gly <222> (1)..(1) <223> Gly with the chemical modification described in the specification <220> <221> Glu <222> (30)..(30) <223> Glu with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 69 Gly Ile Ser Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Glu Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 70 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Gly <222> (1)..(1) <223> Gly with the chemical modification described in the specification <220> <221> Glu <222> (29)..(29) <223> Glu with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 70 Gly Ile Ser Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Glu Val Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 71 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Gly <222> (1)..(1) <223> Gly with the chemical modification described in the specification <220> <221> Glu <222> (29)..(29) <223> Glu with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 71 Gly Ile Ser Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Glu Val Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 72 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Gly <222> (1)..(1) <223> Gly with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Glu <222> (29)..(29) <223> Glu with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 72 Gly Ile Ser Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Glu Val Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 73 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ala <222> (1)..(1) <223> Ala with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (30)..(30) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 73 Ala Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 74 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ala <222> (1)..(1) <223> Ala with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (30)..(30) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 74 Ala Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 75 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (9)..(9) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 75 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 76 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ala <222> (1)..(1) <223> Ala with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (29)..(29) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (30)..(30) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 76 Ala Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Lys Cys Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 77 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ala <222> (1)..(1) <223> Ala with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (19)..(19) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (30)..(30) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 77 Ala Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Lys Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 78 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ala <222> (1)..(1) <223> Ala with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (30)..(30) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Gln <222> (33)..(33) <223> Gln with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 78 Ala Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 79 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ala <222> (1)..(1) <223> Ala with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (30)..(30) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 79 Ala Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 80 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ala <222> (1)..(1) <223> Ala with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (30)..(30) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 80 Ala Ile Arg Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Trp Cys Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 81 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (9)..(9) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 81 Ile Arg Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Trp Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 82 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Lys <222> (1)..(1) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (8)..(8) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (28)..(28) <223> Cys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (32)..(32) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 82 Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn Arg 1 5 10 15 Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Thr Arg Gln Arg 20 25 30 Tyr <210> 83 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (9)..(9) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Leu <222> (29)..(29) <223> Leu, wherein the leu is a norleucine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 83 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Leu Val Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 84 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (9)..(9) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 84 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Val Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 85 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ala <222> (1)..(1) <223> Ala with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (22)..(22) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (30)..(30) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 85 Ala Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Lys Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Val Thr 20 25 30 Arg Gln Arg Tyr 35 <210> 86 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ala <222> (1)..(1) <223> Ala with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (21)..(21) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (30)..(30) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 86 Ala Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Lys Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Val Thr 20 25 30 Arg Gln Arg Tyr 35 <210> 87 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ala <222> (1)..(1) <223> Ala with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (6)..(6) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (30)..(30) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 87 Ala Ile Lys Pro Glu Lys Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Val Thr 20 25 30 Arg Gln Arg Tyr 35 <210> 88 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Gly <222> (1)..(1) <223> Gly with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 88 Gly Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Cys Val Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 89 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Gly <222> (1)..(1) <223> Gly with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 89 Gly Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Cys Val Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 90 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ala <222> (1)..(1) <223> Ala with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 90 Ala Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Cys Val Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 91 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Gly <222> (1)..(1) <223> Gly with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 91 Gly Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Cys Val Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 92 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ala <222> (1)..(1) <223> Ala with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (30)..(30) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 92 Ala Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 93 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Gly <222> (1)..(1) <223> Gly with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 93 Gly Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Cys Val Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 94 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ala <222> (1)..(1) <223> Ala with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 94 Ala Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Cys Val Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 95 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Gly <222> (1)..(1) <223> Gly with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Glu <222> (29)..(29) <223> Glu with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 95 Gly Ile Ser Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Glu Val Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 96 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ala <222> (1)..(1) <223> Ala with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (30)..(30) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 96 Ala Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 97 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Gly <222> (1)..(1) <223> Gly with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (30)..(30) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 97 Gly Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 98 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Gly <222> (1)..(1) <223> Gly with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 98 Gly Ile Ser Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Cys Val Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 99 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ala <222> (1)..(1) <223> Ala with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 99 Ala Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Cys Val Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 100 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ala <222> (1)..(1) <223> Ala with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 100 Ala Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Cys Val Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 101 <211> 34 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 101 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 102 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conjugate 1 <220> <221> Ala <222> (1)..(1) <223> Ala with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 102 Ala Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 103 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conjugate 2 <220> <221> Ala <222> (1)..(1) <223> Ala with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (30)..(30) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 103 Ala Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 104 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conjugate 3 <220> <221> Ala <222> (1)..(1) <223> Ala with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (30)..(30) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 104 Ala Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 105 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conjugate 4 <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (9)..(9) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 105 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 106 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conjugate 5 <220> <221> Ala <222> (1)..(1) <223> Ala with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (29)..(29) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (30)..(30) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 106 Ala Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Lys Cys Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 107 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conjugate 6 <220> <221> Ala <222> (1)..(1) <223> Ala with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (19)..(19) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (30)..(30) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 107 Ala Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Lys Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 108 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conjugate 7 <220> <221> Ala <222> (1)..(1) <223> Ala with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (30)..(30) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Gln <222> (33)..(33) <223> Gln with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 108 Ala Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 109 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conjugate 8 <220> <221> Ala <222> (1)..(1) <223> Ala with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (30)..(30) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 109 Ala Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 110 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conjugate 9 <220> <221> Ala <222> (1)..(1) <223> Ala with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (30)..(30) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 110 Ala Ile Arg Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Trp Cys Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 111 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conjugate 10 <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (9)..(9) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 111 Ile Arg Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Trp Cys Thr Arg Gln 20 25 30 Arg Tyr <210> 112 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conjugate 11 <220> <221> Lys <222> (1)..(1) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (8)..(8) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (28)..(28) <223> Cys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (32)..(32) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 112 Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn Arg 1 5 10 15 Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Thr Arg Gln Arg 20 25 30 Tyr <210> 113 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conjugate 12 <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (9)..(9) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Leu <222> (29)..(29) <223> Leu, wherein the leu is a norleucine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (33)..(33) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 113 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Leu Val Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 114 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conjugate 13 <220> <221> Ile <222> (1)..(1) <223> Ile with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (30)..(30) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 114 Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn 1 5 10 15 Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Val Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 115 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conjugate 14 <220> <221> Ala <222> (1)..(1) <223> Ala with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (22)..(22) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (30)..(30) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 115 Ala Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Lys Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Val Thr 20 25 30 Arg Gln Arg Tyr 35 <210> 116 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conjugate 15 <220> <221> Ala <222> (1)..(1) <223> Ala with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (21)..(21) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (30)..(30) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 116 Ala Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Lys Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Val Thr 20 25 30 Arg Gln Arg Tyr 35 <210> 117 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conjugate 16 <220> <221> Ala <222> (1)..(1) <223> Ala with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (6)..(6) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (30)..(30) <223> Cys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 117 Ala Ile Lys Pro Glu Lys Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Val Thr 20 25 30 Arg Gln Arg Tyr 35 <210> 118 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conjugate 17 <220> <221> Gly <222> (1)..(1) <223> Gly with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 118 Gly Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Cys Val Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 119 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conjugate 18 <220> <221> Gly <222> (1)..(1) <223> Gly with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 119 Gly Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Cys Val Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 120 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conjugate 19 <220> <221> Ala <222> (1)..(1) <223> Ala with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 120 Ala Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Cys Val Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 121 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conjugate 20 <220> <221> Gly <222> (1)..(1) <223> Gly with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 121 Gly Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Cys Val Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 122 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conjugate 21 <220> <221> Ala <222> (1)..(1) <223> Ala with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (30)..(30) <223> Cys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 122 Ala Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 123 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conjugate 22 <220> <221> Gly <222> (1)..(1) <223> Gly with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 123 Gly Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Cys Val Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 124 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conjugate 23 <220> <221> Ala <222> (1)..(1) <223> Ala with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 124 Ala Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Cys Val Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 125 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conjugate 24 <220> <221> Gly <222> (1)..(1) <223> Gly with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Glu <222> (29)..(29) <223> Glu with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 125 Gly Ile Ser Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Glu Val Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 126 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conjugate 25 <220> <221> Ala <222> (1)..(1) <223> Ala with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (30)..(30) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 126 Ala Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 127 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conjugate 26 <220> <221> Gly <222> (1)..(1) <223> Gly with the chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with the chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (30)..(30) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with the chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with the chemical modification described in the specification <400> 127 Gly Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 128 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 128 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 129 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 129 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Asp Gly Ile Tyr Gly Glu Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 130 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 130 Tyr Asp Gly Ile Tyr Gly Glu Leu Asp Phe 1 5 10 <210> 131 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> concatenation of IGHV3-23*01 and IGHJ1*01 <400> 131 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ala Glu Tyr Phe Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 132 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 132 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys <210> 133 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 133 Ala Glu Tyr Phe Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 1 5 10 15 Ser <210> 134 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> concatenation of IGKV3-11*01 and IGKJ1*01 <400> 134 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 135 <211> 95 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 135 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro 85 90 95 <210> 136 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 136 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 137 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MSCB97 VH <400> 137 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Asp Gly Cys Tyr Gly Glu Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 138 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MSCB97 HC <400> 138 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Asp Gly Cys Tyr Gly Glu Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 139 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MSCB97 VL <400> 139 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 140 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MSCB97 LC <400> 140 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 141 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MSCB97 HCDR1 <400> 141 Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 142 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MSCB97 HCDR2 <400> 142 Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 143 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MSCB97 HCDR3 <400> 143 Tyr Asp Gly Cys Tyr Gly Glu Leu Asp Phe 1 5 10 <210> 144 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MSCB97 LCDR1 <400> 144 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 145 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MSCB97 LCDR2 <400> 145 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 146 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MSCB97 LCDR3 <400> 146 Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu Thr 1 5 <210> 147 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ala <222> (1)..(1) <223> Ala with chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (30)..(30) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with chemical modification described in the specification <400> 147 Ala Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 148 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ala <222> (1)..(1) <223> Ala with chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (30)..(30) <223> Cys, wherein the cys is a homocysteine with chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with chemical modification described in the specification <400> 148 Ala Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Cys Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 149 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Gly <222> (1)..(1) <223> Gly with chemical modification described in the specification <220> <221> Glu <222> (29)..(29) <223> Glu with chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with chemical modification described in the specification <400> 149 Gly Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Glu Val Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 150 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Gly <222> (1)..(1) <223> Gly with chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with chemical modification described in the specification <220> <221> Glu <222> (29)..(29) <223> Glu with chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with chemical modification described in the specification <400> 150 Gly Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Glu Val Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 151 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Gly <222> (1)..(1) <223> Gly with chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys with chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with chemical modification described in the specification <400> 151 Gly Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Cys Val Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 152 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Gly <222> (1)..(1) <223> Gly with chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys with chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with chemical modification described in the specification <400> 152 Gly Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Cys Val Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 153 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ala <222> (1)..(1) <223> Ala with chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys with chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with chemical modification described in the specification <400> 153 Ala Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Cys Val Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 154 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ala <222> (1)..(1) <223> Ala with chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys with chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with chemical modification described in the specification <400> 154 Ala Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Cys Val Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 155 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ala <222> (1)..(1) <223> Ala with chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys with chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with chemical modification described in the specification <400> 155 Ala Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Cys Val Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35 <210> 156 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cyclic PYY Peptide Compound <220> <221> Ala <222> (1)..(1) <223> Ala with chemical modification described in the specification <220> <221> Lys <222> (10)..(10) <223> Lys with chemical modification described in the specification <220> <221> Cys <222> (29)..(29) <223> Cys with chemical modification described in the specification <220> <221> Arg <222> (34)..(34) <223> Arg with chemical modification described in the specification <400> 156 Ala Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Lys Ala Ser Pro Glu Glu Leu 1 5 10 15 Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Cys Val Thr Arg 20 25 30 Gln Arg Tyr 35

Claims (26)

  1. 사이클릭 PYY 펩티드에 커플링된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 접합체로서,
    여기서 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 각각 서열 번호 141, 142, 143, 144, 145, 및 146의 폴리펩티드 서열에 제시된 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR1), HCDR2, HCDR3, 및 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR1), LCDR2, 및 LCDR3을 포함하고,
    상기 사이클릭 PYY 펩티드는 화학식 I 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로 나타내고:
    [화학식 I]

    (상기 식에서,
    p는 0 또는 1이고;
    m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고;
    n은 1, 2, 3, 또는 4이고;
    q는 0 또는 1이되; 단, Z30이 부재하는 경우에만 q가 1이고;
    가교(BRIDGE)는 -Ph-CH2-S-, -트라이아졸릴-, -NHC(O)CH2S-, -SCH2C(O)NH-,
    -(OCH2CH2)2NHC(O)CH2S, -NHC(O)-, 또는 -CH2S-이고;
    Z4는 K, A, E, S, 또는 R이고;
    Z7은 A 또는 K이고;
    Z9는 G 또는 K이고;
    Z11은 D 또는 K이고;
    Z22는 A 또는 K이고;
    Z23은 S 또는 K이고;
    Z26은 A 또는 H이고;
    Z30은 L, W, 부재, 또는 K이되;
    단, q가 1인 경우에만 Z30이 부재하고;
    Z34는 또는 이고;
    Z35는 , , , 또는 임);
    상기 화학식 I의 사이클릭 PYY 펩티드는 적어도 하나의 라이신 잔기 (K)의 측쇄의 아미노 그룹에서 아실화되어, 아실화된 사이클릭 PYY 펩티드를 제공하고,
    추가로 직접 혹은 링커(linker)를 통해 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 HCDR3의 시스테인 모이어티에 커플링되는 것인,
    접합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 사이클릭 PYY 펩티드는
    화학식 I로 나타내어지거나 이의 약제학적으로 허용되는 염이며 여기서,
    p는 0 또는 1이고;
    m은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고;
    n은 1, 2, 3, 또는 4이고;
    q는 0 또는 1이되; 단, Z30이 부재하는 경우에만 q가 1이고;
    가교는 -Ph-CH2-S-, -트라이아졸릴-, -NHC(O)CH2S-, -SCH2C(O)NH2-,
    -(OCH2CH2)2NHC(O)CH2S, -NHC(O)-, 또는 -CH2S-이고;
    Z4는 K, A, E, S, 또는 R이고;
    Z7은 A 또는 K이며, Z7이 K인 경우 상기 K의 아미노 측쇄는
    (여기서, i는 0 내지 24의 정수이고, X는 Br, I 또는 Cl임),
    -C(O)CH2Br, -C(O)CH2I, 또는 -C(O)CH2Cl로 아실화되고;
    Z9는 G 또는 K이며, Z9가 K인 경우 상기 K의 아미노 측쇄는
    (여기서, i는 0 내지 24의 정수이고, X는 Br, I 또는 Cl임),
    -C(O)CH2Br, -C(O)CH2I, 또는 -C(O)CH2Cl로 아실화되고;
    Z11은 D 또는 K이며, Z11이 K인 경우 상기 K의 아미노 측쇄는
    (여기서, i는 0 내지 24의 정수이고, X는 Br, I 또는 Cl임),
    -C(O)CH2Br, -C(O)CH2I, 또는 -C(O)CH2Cl로 아실화되고;
    Z22는 A 또는 K이며, Z22가 K인 경우 상기 K의 아미노 측쇄는
    (여기서, i는 0 내지 24의 정수이고, X는 Br, I 또는 Cl임),
    -C(O)CH2Br, -C(O)CH2I, 또는 -C(O)CH2Cl로 아실화되고;
    Z23은 S 또는 K이며, Z23이 K인 경우 상기 K의 아미노 측쇄는
    (여기서, i는 0 내지 24의 정수이고, X는 Br, I 또는 Cl임),
    -C(O)CH2Br, -C(O)CH2I, 또는 -C(O)CH2Cl로 아실화되고;
    Z26은 A 또는 H이고;
    Z30은 L 또는 K이며, Z30이 K인 경우 상기 K의 아미노 측쇄는
    또는 로 아실화되고;
    Z34는 또는 이고;
    Z35는 , , , 또는 이고,
    여기서 화학식 I의 Z7, Z9, Z11, Z22 및 Z23의 단지 하나만이 라이신인 것인, 접합체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 사이클릭 PYY 펩티드는,
    화학식 I로 나타내어지거나 이의 약제학적으로 허용되는 염이며 여기서,
    p는 0 또는 1이고;
    m은 0, 1, 2, 3, 또는 5이고;
    n은 1, 2, 또는 4이고;
    q는 0 또는 1이되; 단, Z30이 부재하는 경우에만 q가 1일 수 있고;
    가교는 -Ph-CH2-S-, -트라이아졸릴-, -NHC(O)CH2S-, -(OCH2CH2)2NHC(O)CH2S, -NHC(O)-, 또는 -CH2S-이고;
    Z4는 K, A, E, S, 또는 R이고;
    Z7은 A 또는 K이며, Z7이 K일 때 상기 K의 아미노 측쇄는
    로 아실화되고;
    Z9는 G 또는 K이고;
    Z11은 D 또는 K이며, Z11이 K일 때 상기 K의 아미노 측쇄는
    , , , , -C(O)CH2Br로 아실화되고;
    Z22는 A 또는 K이며, Z22이 K일 때 상기 K의 아미노 측쇄는
    로 아실화되고;
    Z23은 S 또는 K이며, Z23이 K일 때 상기 K의 아미노 측쇄는
    로 아실화되고;
    Z26은 A 또는 H이고;
    Z30은 L 또는 K이며, Z30이 K일 때 상기 K의 아미노 측쇄는
    또는 로 아실화되고;
    Z34는 또는 이고;
    Z35는 , , , 또는 인, 접합체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 사이클릭 PYY 펩티드는 서열 번호 1 및 73-100으로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, 접합체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 링커는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)8-트라이아졸릴-CH2CH2CO-PEG4, 2 내지 24개의 PEG 단위의 PEG 사슬, 2 내지 10개의 탄소 원자를 함유하는 알킬 사슬, (Gly4Ser)j(여기서, J는 1 내지 4임), (AlaPro)u(여기서, u는 1 내지 10임), 및 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나를 포함하는, 접합체.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 접합체는 서열 번호 102-127로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하며,
    여기서 mAb는 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 나타내고, ]2는 1개 또는 2개의 상기 사이클릭 PYY 펩티드가 상기 mAb에 공유적으로 접합됨을 나타내는, 접합체.
  7. 제1항에 있어서, 단리된 단일클론 항체는 서열 번호 137의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH), 및 서열 번호 139의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는, 접합체.
  8. 제7항에 있어서, 서열 번호 138의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄(HC), 및 서열 번호 140의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄(LC)를 포함하는, 접합체.
  9. 사이클릭 PYY 펩티드에 커플링된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 접합체로서,
    상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 각각 서열 번호 141, 142, 143, 144, 145, 및 146의 폴리펩티드 서열을 갖는, 중쇄 상보성 결정 영역 1(HCDR1), HCDR2, HCDR3, 및 경쇄 상보성 결정 영역 1(LCDR1), LCDR2, 및 LCDR3을 포함하며,
    상기 사이클릭 PYY 펩티드는 서열 번호 1, 73-100, 및 147-156으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 서열, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하고;
    상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 직접적으로 또는 링커를 통해 상기 사이클릭 PYY 펩티드의 잔기 7, 9, 11, 22 또는 23에서 상기 사이클릭 PYY 펩티드에 접합되는, 접합체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호 137의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH), 및 서열 번호 139의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 것인, 접합체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호 138의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄(HC), 및 서열 번호 140의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄(LC)를 포함하는 것인, 접합체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 접합체를 생성하는 방법으로서,
    상기 사이클릭 PYY 펩티드의 라이신 잔기의 측쇄 상에 도입된,
    브로모아세트아미드 또는 말레이미드로부터 선택된 친전자체를
    상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 서열 번호 143의 시스테인 잔기의 설프하이드릴 기와 반응시켜, 상기 사이클릭 PYY 펩티드와 상기 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편 사이에 공유 결합을 생성하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  13. 비만, 제I형 또는 제II형 당뇨병, 대사 증후군, 인슐린 저항성, 내당능 장애, 고혈당증, 고인슐린혈증, 고트라이글리세라이드혈증, 선천성 고인슐린혈증(CHI)으로 인한 저혈당증, 이상지질혈증, 죽상경화증, 당뇨병성 신장병증, 고혈압, 관리되지 않은 콜레스테롤 또는 지질 수준과 관련된 심혈관 위험 인자, 골다공증, 염증, 비알코올성 지방간 질병(NAFLD), 비알코올성 지방성 간염(NASH), 신장 질병, 및 습진으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질병 또는 장애의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 상기 질병 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위한,
    제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 접합체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  14. 비만, 제I형 또는 제II형 당뇨병, 대사 증후군, 인슐린 저항성, 내당능 장애, 고혈당증, 고인슐린혈증, 고트라이글리세라이드혈증, 선천성 고인슐린혈증(CHI)으로 인한 저혈당증, 이상지질혈증, 죽상경화증, 당뇨병성 신장병증, 고혈압, 관리되지 않은 콜레스테롤 또는 지질 수준과 관련된 심혈관 위험 인자, 골다공증, 염증, 비알코올성 지방간 질병(NAFLD), 비알코올성 지방성 간염(NASH), 신장 질병, 및 습진으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질병 또는 장애의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 상기 질병 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위한,
    제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 접합체를 포함하는, 약제.
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 제14항에 있어서, 적어도 하나의 항당뇨병제를 추가로 포함하는, 약제.
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 제17항에 있어서, 상기 항당뇨병제는 글루카곤-유사-펩티드-1 수용체 조절제인 것인, 약제.
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 제17항에 있어서, 상기 항당뇨병제는 리라글루타이드인 것인, 약제.
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 접합체를 포함하며,
    비만, 제I형 또는 제II형 당뇨병, 대사 증후군, 인슐린 저항성, 내당능 장애, 고혈당증, 고인슐린혈증, 고트라이글리세라이드혈증, 선천성 고인슐린혈증(CHI)으로 인한 저혈당증, 이상지질혈증, 죽상경화증, 당뇨병성 신장병증, 고혈압, 관리되지 않은 콜레스테롤 또는 지질 수준과 관련된 심혈관 위험 인자, 골다공증, 염증, 비알코올성 지방간 질병(NAFLD), 비알코올성 지방성 간염(NASH), 신장 질병, 및 습진으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질병 또는 장애의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 상기 질병 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위한, 키트.
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