JP2020510606A - 神経ペプチドｙ受容体の調節因子としての抗体結合環状ペプチドチロシンチロシン化合物 - Google Patents

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Abstract

本発明は、環状ＰＹＹペプチドに複合されたモノクローナル抗体を含む複合体を含む。本発明はまた、医薬組成物及びその使用方法に関する。新規複合体は、本明細書に開示される疾患及び障害を予防する、治療する、又は寛解させるのに有用である。

Description

（発明の分野）
本発明は、概ね、神経ペプチドＹ２受容体の調節因子である新規抗体結合環状ペプチドチロシンチロシン（ＰＹＹ）複合体を目的とする。本発明はまた、医薬組成物及びその使用方法に関する。新規抗体結合化合物は、とりわけ、肥満、２型糖尿病、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、及び脂質異常症などの疾患及び障害を予防する、治療する、又は寛解させるのに有用である。
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１６年１０月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／４１３，６１３号、及び２０１６年１０月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／４１３，５８６号に基づく優先権を主張するものである。各開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
（電子的に提出された配列表の参照）
本出願は、ファイル名「ＰＲＤ３４３６配列表」及び２０１７年１０月２３日の作成日で、ＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出され、１３５ｋｂのサイズを有する配列表を含む。ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される情報と、ファイル名「ＰＲＤ３４３６配列表」でＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出された配列表との間の配列番号１〜１５６の構造に関して一貫性がない場合、本明細書の情報を優先するものとする。
神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）受容体は、各受容体サブタイプに対して異なる親和性を有する「ＮＰＹファミリー」と呼ばれる、密接に関連するペプチドアゴニスト群によって活性化される。ＮＰＹ、ペプチドチロシン−チロシン（ＰＹＹ）、及び膵臓ポリペプチド（ＰＰ）の、長さ３６個全てのアミノ酸は、ＮＰＹ受容体ファミリーのアゴニストである。ＮＰＹは、神経伝達物質であり、合成され、共貯蔵（co-stored）され、ノルエピネフリン及びエピネフリンと共に放出される。ＮＰＹは、ヒト及びげっ歯類の中枢神経系（ＣＮＳ）中の最も豊富かつ広範に分布したペプチドのうちの１つであり、供給及びストレスに関連する脳の領域で発現される。末梢神経系では、ＮＰＹ含有ニューロンは主に交感神経性である。ＰＹＹは、腸内分泌細胞によって主に合成され、放出される。内皮セリン−プロテアーゼ、ジ−ペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）によるＮＰＹ及びＰＹＹの切断は、ＮＰＹ受容体ファミリーのＹ２及びＹ５サブタイプの選択的リガンドであるＮＰＹ３−３６及びＰＹＹ３−３６を生成する。ＰＰは、主に、インスリン、グルカゴン、又はソマトスタチンを貯蔵するものとは異なる膵島細胞に見られる。
５つの異なるＮＰＹ受容体がこれまでに特定されており、そのうちの４つは、ヒトの生理学に関連するものとして理解される。受容体Ｙ１、Ｙ２、及びＹ５は、ＮＰＹ及びＰＹＹに優先的に結合するが、Ｙ４受容体はＰＰに優先的に結合する。Ｙ２及びＹ５受容体はまた、ＮＰＹ３−３６及びＰＹＹ３−３６によって強力に活性化される。一般に、ＮＰＹファミリーのリガンドは、ＮＰＹ受容体イソ型のそれぞれに対して可変選択性を有し、ＰＹＹ３−３６は、Ｙ２イソ型に対して中程度から強固な選択性を有することが以前に報告されている。これらの受容体のそれぞれは、百日咳毒素感受性Ｇαｉを介してアデニル酸シクラーゼの阻害に結合される。
ＰＹＹは、食物に応じて内分泌腺Ｌ−細胞から分泌され、特に脂肪摂取後に分泌される。ＰＹＹ１−３６は空腹状態で優勢であり、ＰＹＹ３−３６は、ヒトにおいて食後に見られる主要形態であり、血漿濃度は消費されるカロリー数と負の相関関係にある。ＰＹＹ３−３６は、ヒト、サル、ラット、ウサギ、及びマウスにおける食物摂取を低減することが実証されている（Ｂａｔｔｅｒｈａｍ ＲＬ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２００２ Ａｕｇ ８；４１８（６８９８）：６５０〜４、Ｂａｔｔｅｒｈａｍ ＲＬ ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００３ Ｓｅｐ ４；３４９（１０）：９４１〜８、Ｃｈａｌｌｉｓ ＢＧ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２００３ Ｎｏｖ ２８；３１１（４）：９１５〜９）。ＰＹＹ３−３６の食欲減退効果は、この受容体における優先的結合、及びＹ２欠損マウスにおける供給有効性の喪失に基づいて、Ｙ２媒介であると考えられる（Ｂａｔｔｅｒｈａｍ ＲＬ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２００２ Ａｕｇ ８；４１８（６８９８）：６５０〜４）。ＰＹＹ３−３６の弓状内注射は、ラット及びマウスにおける食物摂取を低減し（Ｂａｔｔｅｒｈａｍ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２００２ Ａｕｇ ８；４１８（６８９８）：６５０〜４）、視床下部Ｙ２受容体の係合がこれらの効果を媒介し得ることを示唆している。供給に対する急性効果は、ｏｂ／ｏｂマウス、ＤＩＯマウス、及びＺｕｃｋｅｒ ｆａ／ｆａマウスの体重に対する用量依存的効果に変換されることも示されている（Ｐｉｔｔｎｅｒ ＲＡ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｏｂｅｓ ｒｅｌａｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｏｒｄ ２００４ Ａｕｇ；２８（８）：９６３〜７１）。加えて、ＰＹＹ３−３６は、ＤＩＯげっ歯類におけるインスリン媒介グルコース処理及びインスリン感受性を改善することも示されている（Ｖｒａｎｇ Ｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｇｕｌ Ｉｎｔｅｇｒ Ｃｏｍｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ａｕｇ；２９１（２）：Ｒ３６７〜７５）。肥満外科手術は、循環ＰＹＹ免疫反応性の増加をもたらし（ｌｅ Ｒｏｕｘ ＣＷ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｓｕｒｇ ２００６ Ｊａｎ；２４３（１）；１０８〜１４）、術後の体重減少において役割を果たすように思える。
食欲及び食物摂取の制御におけるその役割、並びに哺乳動物の胃腸管におけるその抗分泌及び吸収促進効果を考慮すると、ＰＹＹ３−３６は、肥満及び関連状態、並びにいくつかの胃腸障害の治療に有効であり得る。しかしながら、治療剤としてのＰＹＹ３−３６自体の治療的有用性は、その迅速な代謝及び結果として生じる短い循環半減期によって制限される（Ｔｏｒａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｇｕｌ．Ｉｎｔｅｇｒ．Ｃｏｍｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３１０：Ｒ８６６〜Ｒ８７４（２０１６））。
したがって、ＰＹＹ３−３６に対して、改善された代謝安定性及び薬物動態プロファイルを有するＰＹＹ類似体又はその誘導体を得ることが望ましい。インビボでの半減期の遅延性を有するこのような誘導体は、より長い作用持続時間を有するＹ２受容体の調節を提供し、そのような調節を必要とする対象の治療薬として好適であろう。
前述の議論は、単に当該技術分野に直面する問題の性質のより良い理解を提供するために提示されており、先行技術の容認として決して解釈されるべきではなく、また本明細書における任意の参考文献の引用は、そのような参照が本出願の「先行技術」を構成することを容認するものとして解釈されるべきではない。
１つの一般的な態様では、本発明は、神経ペプチドＹ２受容体の調節因子である新規抗体結合環状ペプチドチロシンチロシン（ＰＹＹ）化合物に関する。
本明細書において、環状ＰＹＹペプチドに結合されたモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含む複合体が提供され、この環状ＰＹＹペプチドは、式Ｉ：
Figure 2020510606
 （式中、
ｐは、０又は１であり、
ｍは、０、１、２、３、４、又は５であり、
ｎは、１、２、３、又は４であり、
ｑは、０又は１であり（但し、ｑは、Ｚ３０が不在の場合にのみ１である。）、
ＢＲＩＤＧＥは、−Ｐｈ−ＣＨ２−Ｓ−、−トリアゾリル−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｓ−、−ＳＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、
−（ＯＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｓ、−ＮＨＣ（Ｏ）−、又は−ＣＨ２Ｓ−であり、
Ｚ４は、Ｋ、Ａ、Ｅ、Ｓ、又はＲであり、
Ｚ７は、Ａ又はＫであり、
Ｚ９は、Ｇ又はＫであり、
Ｚ１１は、Ｄ又はＫであり、
Ｚ２２は、Ａ又はＫであり、
Ｚ２３は、Ｓ又はＫであり、
Ｚ２６は、Ａ又はＨであり、
Ｚ３０は、Ｌ、Ｗ、不在、又はＫであり
（但し、Ｚ３０は、ｑが１である場合にのみ不在である。）、
Ｚ３４は、
Figure 2020510606
 であり、
Ｚ３５は、
Figure 2020510606
 である。）
によって表されるか、又はその誘導体若しくは薬学的に許容される塩であり、この誘導体は、アミド化、グリコシル化、カルバミル化、硫酸化、リン酸化、環化、脂質化、及びＰＥＧ化からなる群から選択される１つ又は２つ以上のプロセスによって修飾されている、式Ｉの化合物である。ある特定の実施形態では、環状ＰＹＹペプチドは、式Ｉの化合物、又はアミド化、脂質化、及びＰＥＧ化からなる群から選択される１つ又は２つ以上のプロセスによって修飾されている式Ｉの環状ＰＹＹペプチドの誘導体、又はその薬学的に許容される塩である。
ある特定の実施形態では、環状ＰＹＹペプチドは、式Ｉによって表されるか、又はその誘導体若しくは薬学的に許容される塩であり、式中、
ｐは、０又は１であり、
ｍは、０、１、２、３、４、又は５であり、
ｎは、１、２、３、又は４であり、
ｑは、０又は１であり（但し、ｑは、Ｚ３０が不在の場合にのみ１である。）、
ＢＲＩＤＧＥは、−Ｐｈ−ＣＨ２−Ｓ−、−トリアゾリル−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｓ−、−ＳＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２−、
−（ＯＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｓ、−ＮＨＣ（Ｏ）−、又は−ＣＨ２Ｓ−であり、
Ｚ４は、Ｋ、Ａ、Ｅ、Ｓ、又はＲであり、
Ｚ７は、Ａ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、任意に、
Figure 2020510606
 （式中、ｉは、０〜２４の整数であり、Ｘ＝Ｂｒ、Ｉ、又はＣｌである。）、
−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｂｒ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｉ、又は−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃｌで置換され、
Ｚ９は、Ｇ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、任意に、
Figure 2020510606
 （式中、ｉは、０〜２４の整数であり、Ｘ＝Ｂｒ、Ｉ、又はＣｌである。）、
−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｂｒ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｉ、又は−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃｌで置換され、
Ｚ１１は、Ｄ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、任意に、
Figure 2020510606
 （式中、ｉは、０〜２４の整数であり、Ｘ＝Ｂｒ、Ｉ、又はＣｌである。）、
−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｂｒ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｉ、又は−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃｌで置換され、
Ｚ２２は、Ａ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、任意に、
Figure 2020510606
 （式中、ｉは、０〜２４の整数であり、Ｘ＝Ｂｒ、Ｉ、又はＣｌである。）、
−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｂｒ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｉ、又は−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃｌで置換され、
Ｚ２３は、Ｓ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、任意に、
Figure 2020510606
 （式中、ｉは、０〜２４の整数であり、Ｘ＝Ｂｒ、Ｉ、又はＣｌである。）、
−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｂｒ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｉ、又は−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃｌで置換され、
Ｚ２６は、Ａ又はＨであり、
Ｚ３０は、Ｌ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、
Figure 2020510606
 で置換され、
Ｚ３４は、
Figure 2020510606
 であり、
Ｚ３５は、
Figure 2020510606
 である。
ある特定の実施形態では、環状ＰＹＹペプチドは、式Ｉによって表されるか、又はその誘導体若しくは薬学的に許容される塩であり、式中、
ｐは、０又は１であり、
ｍは、０、１、２、３、又は５であり、
ｎは、１、２、又は４であり、
ｑは、０又は１であり（但し、ｑは、Ｚ３０が不在の場合にのみ１であり得る。）、
ＢＲＩＤＧＥは、−Ｐｈ−ＣＨ２−Ｓ−、−トリアゾリル−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｓ−、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｓ、−ＮＨＣ（Ｏ）−、又は−ＣＨ２Ｓ−であり、
Ｚ４は、Ｋ、Ａ、Ｅ、Ｓ、又はＲであり、
Ｚ７は、Ａ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、
Figure 2020510606
 で置換され、
Ｚ９は、Ｇ又はＫであり、
Ｚ１１は、Ｄ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、
Figure 2020510606
 −Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｂｒで置換され、
Ｚ２２は、Ａ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、
Figure 2020510606
 で置換され、
Ｚ２３は、Ｓ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、
Figure 2020510606
 で置換され、
Ｚ２６は、Ａ又はＨであり、
Ｚ３０は、Ｌ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、
Figure 2020510606
 で置換され、
Ｚ３４は、
Figure 2020510606
 であり、
Ｚ３５は、
Figure 2020510606
 である。
ある特定の実施形態では、環状ＰＹＹペプチドは、配列番号１、７３〜１００、及び１４７〜１５６からなる群から選択されるか、又はその薬学的に許容される塩である。
ある特定の実施形態では、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、リンカーを介して、環状ＰＹＹペプチドのリジン残基において、環状ＰＹＹペプチドに共有結合している。例えば、リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）８−トリアゾリル−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−ＰＥＧ４、２〜２４ＰＥＧ単位のＰＥＧ鎖、２〜１０個の炭素原子を含有するアルキル鎖、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｊ（式中、ｊ＝１〜４）、（ＡｌａＰｒｏ）ｕ（式中、ｕ＝１〜１０）、及び結合からなる群から選択されるリンカーを含み得る。
ある特定の実施形態では、式Ｉ中のＺ７、Ｚ９、Ｚ１１、Ｚ２２、及びＺ２３のうちの１つのみがリジンであり、リジンは、リンカーを介して、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片の改変システイン残基に共有結合している。
また、環状ＰＹＹペプチドに結合されたモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含む複合体も提供され、この複合体は、配列番号１０２〜１２７からなる群から選択される配列、又はその薬学的に許容される塩を含み、ｍＡｂは、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片を表し、］２は、１つ又は２つの環状ＰＹＹペプチドがｍＡｂに共有結合により複合されていることを表す。
ある特定の実施形態では、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、及び１４６のポリペプチド配列をそれぞれ有する重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、並びに軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。ある特定の実施形態では、単離されたモノクローナル抗体は、配列番号１３７のポリペプチド配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号１３９のポリペプチド配列を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む。ある特定の実施形態では、単離されたモノクローナル抗体は、Ｆｃ部分を更に含む。ある特定の実施形態では、単離されたモノクローナル抗体は、配列番号１３８のポリペプチド配列を有する重鎖（ＨＣ）と、配列番号１４０のポリペプチド配列を有する軽鎖（ＬＣ）とを含む。
また、環状ＰＹＹペプチドに結合されたモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含む複合体も提供され、このモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、及び１４６のポリペプチド配列をそれぞれ有する重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、並びに軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、好ましくは、このモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１３７のポリペプチド配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号１３９のポリペプチド配列を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含み、より好ましくは、このモノクローナル抗体は、配列番号１３８のポリペプチド配列を有する重鎖（ＨＣ）と、配列番号１４０のポリペプチド配列を有する軽鎖（ＬＣ）とを含み、この環状ＰＹＹペプチドは、配列番号１、７３〜１００、及び１４７〜１５６、からなる群から選択されるポリペプチド配列、又はその薬学的に許容される塩を含み、このモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、環状ＰＹＹペプチドの残基７、９、１１、２２、又は２３、好ましくは環状ＰＹＹペプチドのリジン残基１１において、直接又はリンカーを介して環状ＰＹＹペプチドに複合される。
また、本発明の複合体の生成方法も提供される。本方法は、環状ＰＹＹペプチドの側鎖、好ましくは環状ＰＹＹペプチドのリジン残基の側鎖上に導入される求電子物質、好ましくはブロモアセトアミド又はマレイミドを、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片の配列番号１４３のシステイン残基のスルフヒドリル基と反応させ、それにより、環状ＰＹＹペプチドとモノクローナル抗体又はその抗原結合断片との間に共有結合を創出することを含む。
本発明は、本発明の複合体と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物も提供する。
疾患又は障害の治療又は予防をそれを必要とする対象に行う方法も提供され、当該疾患又は障害は、肥満、Ｉ型又はＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、耐糖能異常、高血糖症、高インスリン血症、高トリグリセリド血症、先天性高インスリン症（ＣＨＩ）による低血糖、脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性腎症、並びに管理されていないコレステロール及び／若しくは脂質レベルに関連する高血圧及び心血管危険因子などの他の心血管危険因子、骨粗鬆症、炎症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、腎疾患、並びに湿疹からなる群から選択される。本方法は、有効量の本発明の医薬組成物の投与をそれを必要とする対象に行うことを含む。
また、食物摂取の低減をそれを必要とする対象に行う方法も提供される。本方法は、有効量の本発明の医薬組成物の投与をそれを必要とする対象に行うことを含む。
また、Ｙ２受容体活性の調節をそれを必要とする対象に行う方法も提供される。本方法は、有効量の本発明の医薬組成物の投与をそれを必要とする対象に行うことを含む。
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、注射により投与される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１つの抗糖尿病薬と組み合わせて投与される。抗糖尿病薬は、例えば、グルカゴン様ペプチド−１受容体調節因子であり得る。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、リラグルチドと組み合わせて投与される。
本発明の複合体を含み、好ましくは、リラグルチド及び注射用デバイスを更に含むキットも提供される。
また、本発明の医薬組成物の生成方法も提供される。本方法は、複合体を薬学的に許容される担体と組み合わせて医薬組成物を得ることを含む。
本発明の更なる態様、特徴、及び利点は、「発明の詳細な説明」及び「特許請求の範囲」を読むことにより、より良く理解されるであろう。
上記の概要、及び本出願の好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことでより良く理解されるであろう。しかしながら、本出願は、図面に示される実施形態そのものに限定されないことを理解するべきである。
本発明の実施形態による一般的なペプチド−ｍＡｂ複合戦略を示す。Ｘは、半減期延長ｍＡｂのＣＤＲ内に改変されたＣｙｓ残基のスルフヒドリル基と部位特異的に反応する、ブロモアセトアミド又はマレイミドなどの治療用ペプチドの側鎖上に導入され、ペプチドとｍＡｂとの間に共有結合を創出する求電子物質を表す。 ＰＨ９Ｈ５＿ＶＨ（配列番号１２９）及びＰＨ９Ｌ３＿ＶＬ（配列番号１２８）における置換のために選択されるＣＤＲ残基の要約。Ｃｙｓで置換された残基は、太字であり、下線が引いてある。 食事誘導性肥満マウス（ＤＩＯ）マウスにおける化合物１の薬物動態。 カニクイザルにおける化合物１の薬物動態。 化合物１で処置したＤＩＯマウスにおける食物摂取量：急性投与。 化合物１で処置したＤＩＯマウスにおける体重減少：急性投与。 化合物１で処置したＤＩＯマウスにおける食物摂取量：慢性投与。 化合物１で処置したＤＩＯマウスにおける体重減少：慢性投与。 リラグルチドと組み合わせて化合物１で処置したＤＩＯマウスにおける体重減少：慢性投与。 リラグルチドを開始する３週間前、リラグルチドによる１週間の処置、及びリラグルチド投与２週間後の平均週間食物摂取量を示すグラフを示す。処置の平均週間食物摂取量対３週間のベースライン平均の減少率を示す。 肥満アカゲザルにおけるグルコース、インスリン、及びトリグリセリドに対する、リラグルチドを追加した化合物１の効果を示すグラフを示す。グルコースレベルに対する化合物１の単剤療法（ＰＹＹ）及びリラグルチド併用療法（ＰＹＹ＋Ｌｉｒａ）の効果を示すグラフを示す。 肥満アカゲザルにおけるグルコース、インスリン、及びトリグリセリドに対する、リラグルチドを追加した化合物１の効果を示すグラフを示す。インスリンレベルに対する化合物１の単剤療法（ＰＹＹ）及びリラグルチド併用療法（ＰＹＹ＋Ｌｉｒａ）の効果を示すグラフを示す。 肥満アカゲザルにおけるグルコース、インスリン、及びトリグリセリドに対する、リラグルチドを追加した化合物１の効果を示すグラフを示す。ＨＯＭＡ−ＩＲに対する化合物１の単剤療法（ＰＹＹ）及びリラグルチド併用療法（ＰＹＹ＋Ｌｉｒａ）の効果を示すグラフを示す。 肥満アカゲザルにおけるグルコース、インスリン、及びトリグリセリドに対する、リラグルチドを追加した化合物１の効果を示すグラフを示す。トリグリセリドレベルに対する化合物１の単剤療法（ＰＹＹ）及びリラグルチド併用療法（ＰＹＹ＋Ｌｉｒａ）の効果を示すグラフを示す。 肥満アカゲザルにおけるコレステロール及び肝酵素に対する、リラグルチドを追加した化合物１の効果を示すグラフを示す。コレステロールレベルに対する化合物１の単剤療法（ＰＹＹ）及びリラグルチド併用療法（ＰＹＹ＋Ｌｉｒａ）の効果を示すグラフを示す。 肥満アカゲザルにおけるコレステロール及び肝酵素に対する、リラグルチドを追加した化合物１の効果を示すグラフを示す。ＨＤＬレベルに対する化合物１の単剤療法（ＰＹＹ）及びリラグルチド併用療法（ＰＹＹ＋Ｌｉｒａ）の効果を示すグラフを示す。 肥満アカゲザルにおけるコレステロール及び肝酵素に対する、リラグルチドを追加した化合物１の効果を示すグラフを示す。ＡＬＴレベルに対する化合物１の単剤療法（ＰＹＹ）及びリラグルチド併用療法（ＰＹＹ＋Ｌｉｒａ）の効果を示すグラフを示す。 肥満アカゲザルにおけるコレステロール及び肝酵素に対する、リラグルチドを追加した化合物１の効果を示すグラフを示す。ＡＳＴレベルに対する化合物１の単剤療法（ＰＹＹ）及びリラグルチド併用療法（ＰＹＹ＋Ｌｉｒａ）の効果を示すグラフを示す。
発明の背景において、また、本明細書全体を通じて各種刊行物、論文及び特許を引用又は記載する。これら参照文献のそれぞれはその全体が参照により本明細書に援用される。本明細書に含まれる文書、操作、材料、デバイス、物品などの考察は、本発明のコンテキストを与えるためのものである。かかる考察は、これらの事物のいずれか又は全てが、開示又は特許請求されるいかなる発明に対しても先行技術の一部を構成することを容認するものではない。
特に規定のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。そうでない場合、本明細書で使用される特定の用語は、本明細書に記載される意味を有するものである。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に文脈上明らかでない限り、複数の指示対象物を含むことに留意しなければならない。
特に明記しない限り、本明細書に記載される濃度又は濃度範囲などのあらゆる数値は、全ての場合において、「約」という用語によって修飾されているものとして理解されるべきである。したがって、数値は一般的に、記載される値の±１０％を含む。例えば、１ｍｇ／ｍＬの濃度は０．９ｍｇ／ｍＬ〜１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、１％〜１０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲は０．９％（ｗ／ｖ）〜１１％（ｗ／ｖ）を含む。本明細書で使用する場合、数値範囲の使用は、文脈上そうでない旨が明確に示されない限り、その範囲内の整数及び値の分数を含む、全ての可能な部分範囲、その範囲内の全ての個々の数値を明示的に含む。
別途記載のない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、直列の全ての要素を指すと理解されるべきである。当業者であれば、単なる通常の実験手順を使用するだけで、本明細書に記載した特定の手順に対して非常に多くの同等物を認識するか、又は確認することができよう。このような等価物は、本発明によって包含されることが意図される。
本明細書で使用する場合、用語「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「含む（includes）」、「含む（including）」、「有する（has）」、「有する（having）」、「含有する（contains）」、若しくは「含有する（containing）」、又はそれらの任意の他の変形形態は、明記される整数又は整数群を含むが、任意の他の整数又は整数群を除外することを示唆しないと理解され、非独占又は無制限であることが意図される。例えば、一連の要素を含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されるものではなく、明示的に列挙されない、又はそのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置に本来存在しない他の要素を含んでもよい。更に、明示的に反対に明記されない限り、「又は」は包括的な又はを指すものであり、排他的な又はを指すものではない。例えば、条件Ａ又はＢは、Ａが真であり（又は存在する）かつＢが偽である（又は存在しない）場合、Ａが偽であり（又は存在しない）かつＢが真である（又は存在する）場合、並びにＡ及びＢの両方が真である（又は存在する）場合、のいずれか１つによって充足される。
好ましい発明の構成要素の寸法又は特徴を指すときに本明細書で使用される用語「約」、「およそ」、「概ね」、「実質的に」などの用語は、当業者には理解されるように、記載の寸法／特徴が厳密な境界又はパラメータではなく、また機能的に同じ又は類似する、それらからのわずかな相違を除外しないことを示すことも理解されたい。最小値では、数値パラメータを含むこのような参照は、当該技術分野において受け入れられている数学的及び工業的原理（例えば、四捨五入、測定、又は他の系統的誤差、製造公差など）を使用すると、最小有効数字は変化しない変形形態を含むであろう。
「同一の」又は「同一性」パーセントという用語は、２つ以上の核酸又はポリペプチド配列（例えば、環状ＰＹＹ３−３６ポリペプチド配列、抗体の軽鎖又は重鎖配列）との関連において、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して、又は本開示を考慮して当該技術分野において既知の方法を使用した目視検査によって測定されるとき、最大一致について比較され、整列される場合、同一であるか、又は同一であるアミノ酸残基若しくはヌクレオチドの指定された割合を有する２つ以上の配列又はサブ配列を指す。
配列比較のために、典型的には、１つの配列は、試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じて、サブシーケンス座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列（複数可）の配列同一性パーセントを計算する。
比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、又は目視検査（一般的に、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９５ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照されたい）によって行うことができる。
配列同一性パーセント及び配列類似性を決定するのに好適なアルゴリズムの例は、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２に記載されているＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を行うソフトウェアは、国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）を通じて公的に入手可能である。
２つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であることの更なる指標は、以下に記載されるように、第１の核酸によりコードされるポリペプチドが、第２の核酸によりコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。したがって、ポリペプチドは、典型的には、例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一である別の指標は、以下に記載されるように、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。
本明細書で使用される場合、「対象」は、任意の動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを意味する。本明細書で使用するところの「哺乳動物」なる用語は、あらゆる哺乳動物を包含する。哺乳動物の例としては、これらに限定されるものではないが、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、ヒトなど、より好ましくはヒトが挙げられる。
本発明の方法に関して用語「投与」は、本発明の複合体、又はその形成物、組成物、若しくは薬剤を使用することにより、本明細書に記載の症候群、障害、又は疾患を、治療学的又は予防学的に、予防する、治療する、又は寛解させる方法を意味する。このような方法は、有効量の当該複合体、その形成物、組成物、若しくは薬剤を、治療過程中の異なる時点で、又は併用形式で同時に、投与することを含む。本発明の方法は、既知の治療的処置レジメンを全て包含するものとして理解されるものである。
「有効量」という用語は、研究者、獣医、医師、又は他の臨床医が探求している、組織系、動物、又はヒトにおいて生物学的又は医学的反応（治療される症候群、障害、若しくは疾患、又は治療される症候群、障害、若しくは疾患の症状を予防する、治療する、又は寛解させることを含む）を引き出す活性複合体又は医薬用薬剤の量を意味する。
本明細書で使用するとき、用語「組成物」は、特定の成分を特定の量で含む生成物、並びに、直接的又は間接的に特定の成分の特定の量の組み合わせから生じる任意の生成物を包含するものとする。
本明細書で使用するとき、用語「結合された」は、２つ以上の物体を一緒に接合又は接続することを指す。化学化合物又は生物学的化合物を指す場合、結合されたとは、２つ以上の化学化合物又は生物学的化合物間の共有結合による接続を指し得る。非限定的な例として、本発明の抗体は、目的のペプチドと結合されて抗体結合ペプチドを形成することができる。抗体結合ペプチドは、抗体をペプチドに複合するように設計された特定の化学反応によって形成することができる。ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、リンカーにより本発明のペプチドと共有結合され得る。リンカーは、例えば、最初に抗体又はペプチドに共有結合により接続され、次いでペプチド又は抗体に共有結合により接続され得る。
本明細書で使用するとき、用語「リンカー」は、抗体をペプチドに共有結合により結合する共有結合体又は原子鎖を含む化学モジュールを指す。リンカーとしては、例えば、ペプチドリンカー、炭化水素リンカー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカー、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）リンカー、多糖類リンカー、ポリエステルリンカー、ＰＥＧ及び埋め込まれた複素環からなるハイブリッドリンカー、並びに炭化水素鎖を挙げることができるが、これらに限定されない。
本明細書で使用するとき、用語「複合体」は、薬学的に活性な部分に共有結合した抗体又はその断片を指す。用語「複合された」は、リンカーを介して直接的又は間接的に、薬学的に活性な部分、好ましくは治療用ペプチドに共有結合により連結された、又は共有結合により接続された本発明の抗体又はその断片を指す。非限定的な例として、抗体は、本発明のモノクローナル抗体であってもよく、薬学的に活性な部分は、目的の環状ＰＹＹペプチドなどの治療用ペプチドであり得る。
本明細書に記載のペプチド配列は、通常の慣習に従って記載され、ペプチドのＮ末端領域は左側にあり、Ｃ末端領域は右側にある。アミノ酸の異性体形態は既知であるが、別途明示的に示されない限り、示されるのはアミノ酸のＬ型である。
抗体
１つの一般的な態様では、本発明は、抗体結合ペプチドがペプチド単独と比較して延長／増加した半減期を有するように部位特異的様式で、非標的化され、治療用ペプチド（例えば、環状ＰＹＹペプチド）などの薬学的に活性な部分を化学的に複合する（すなわち、結合する）ように使用することができるシステイン残基を含有するよう改変された新規抗体に関する。本明細書で使用するとき、抗体との関連において、用語「非標的化」は、インビボで任意の標的に特異的に結合しない抗体を指す。本明細書で使用するとき、「標的に特異的に結合する」抗体は、１×１０−８Ｍ以下、好ましくは５×１０−９Ｍ以下、１×１０−９Ｍ以下、５×１０−１０Ｍ以下、又は１×１０−１０Ｍ以下のＫＤで標的抗原に結合する抗体を指す。用語「ＫＤ」は、Ｋｄ対Ｋａ（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）の比から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される解離定数を指す。抗体のＫＤ値は、本開示を考慮して当該技術分野における方法を用いて決定することができる。例えば、抗体のＫＤは、バイオセンサーシステム、例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムを使用することによって、又はＯｃｔｅｔ ＲＥＤ９６システムなどのバイオレイヤー干渉法技術を使用することによってなど、表面プラズモン共鳴を使用することによって決定することができる。抗体のＫＤの値が小さいほど、抗体が標的抗原に結合する親和性が高い。
モノクローナル抗体（完全又はその断片）は、半減期延長部分として使用することができる。モノクローナル抗体は、インビボでの使用に利用され、特徴付けられている、十分に研究されているタンパク質であり、したがって、インビボでのそれらの半減期の延長を可能にする機構及びインビボでのそれらの除去のための機構は十分に理解されている。加えて、モノクローナル抗体の２つの「アーム」の空間的分離及び提示は、治療部分（すなわち、治療用ペプチド）の有効な二価提示に有利であり得る。毒素又は他の小分子薬物がモノクローナル抗体に化学的に連結されている治療薬が開発されているが、典型的には、特定の抗原に結合し、かつ抗原を優先的に発現した抗体−薬物複合体を目的の組織／細胞に標的化するモノクローナル抗体を利用し、典型的には、薬物／小分子は、抗体の抗原結合に影響を及ぼさない様式で抗体に結合される。
治療用ペプチド−ｍＡｂ複合体について、半減期延長モノクローナル抗体による抗原特異的結合は所望されない。このため、任意の標的に特異的に結合することが予想されない重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）可変（Ｖ）ドメイン対が、本発明の結合可能な非標的化モノクローナル抗体を調製するために使用される。結合可能な非標的化モノクローナル抗体を得るために、システイン残基を、選択された非標的抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちの１つに改変する。薬学的に活性な部分（例えば、治療用ペプチド／化合物）は、非標的化モノクローナル抗体の改変システイン残基への薬学的に活性な部分の複合を可能にする適切な化学的部分を含有することができる。本発明の実施形態によるペプチド−モノクローナル抗体の一般的な複合戦略を図１に示す。
本明細書で使用されるとき、用語「抗体」は、広義の意味を有し、非ヒト（例えば、マウス、ラット）、ヒト、ヒト適合化、ヒト化、及びキメラモノクローナル抗体、抗体断片、二重特異性又は多重特異性抗体、二量体、四量体、又は多量体抗体、並びに単鎖抗体を含む。
いずれの脊椎動物種の抗体軽鎖も、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて２つの明確に異なるタイプ、すなわちカッパ（κ）及びラムダ（λ）のうちの一方に割り当てることができる。したがって、本発明の抗体は、カッパ又はラムダ軽鎖定常ドメインを含有することができる。特定の実施形態によると、本発明の抗体は、マウス又はヒト抗体からの重鎖及び／又は軽鎖定常領域を含む。重及び軽定常ドメインに加えて、抗体は、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域からなる抗原結合領域を含有し、これらのそれぞれは３つのドメイン（すなわち相補性決定領域１〜３；（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３））を含有する。軽鎖可変領域ドメインは、あるいはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＲＤ３と称され、重鎖可変領域ドメインは、あるいはＨＣＤＲ１、ＨＣＲＤ２、及びＨＣＤＲ３と称される。
免疫グロブリンは、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて５つの主なクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭに割り当てることができる。ＩｇＧは、ヒトにおいて約２３日間の血清半減期を有する５種類の免疫グロブリンの中で最も安定している。ＩｇＡ及びＩｇＧは、アイソタイプＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４に更に下位分類される。４つのＩｇＧサブクラスのそれぞれは、エフェクター機能として既知の異なる生物学的機能を有する。これらのエフェクター機能は、一般に、Ｆｃ受容体（ＦｃγＲ）との相互作用によって、又はＣ１ｑの結合及び補体の固定によって媒介される。ＦｃγＲへの結合は、抗体依存性細胞媒介性細胞溶解をもたらし得るが、補体因子への結合は、補体媒介性細胞溶解をもたらし得る。治療用ペプチドの半減期を延長する能力に利用される本発明の抗体は、エフェクター機能を有さない又は最小限のエフェクター機能を有するが、ＦｃＲｎに結合する能力を保持し、その結合は、抗体がインビボ半減期の延長を有する主要な手段であり得る。
一実施形態では、本発明は、完全ヒトＩｇ生殖系列Ｖ遺伝子配列を有する軽鎖可変領域、及び配列番号１４３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を除く完全ヒトＩｇ生殖系列Ｖ遺伝子配列を有する重鎖可変領域を含む、単離された抗体又はその抗原結合断片に関し、この抗体又はその抗原結合断片は、インビボで任意のヒト抗原に特異的に結合しない。ある特定の実施形態では、本発明は、完全ヒトＩｇ生殖系列Ｖ遺伝子配列を有する軽鎖可変領域、及び配列番号１４３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を除く完全ヒトＩｇ生殖系列Ｖ遺伝子配列を有する重鎖可変領域を含む、単離された抗体又はその抗原結合断片、並びにそれに複合された薬学的に活性な部分（例えば本発明の環状ＰＹＹペプチド）を含む複合体に関し、この抗体又はその抗原結合断片は、インビボで任意のヒト抗原に特異的に結合しない。本開示において、本発明の実施形態による抗体又はその抗原結合断片に関して、語句「抗体又はその抗原結合断片及びそれに複合された薬学的に活性な部分を含む複合体」は、「薬学的に活性な部分に複合された抗体又はその抗原結合断片」と互換的に使用される。
本明細書で使用するとき、用語「抗原結合断片」は、例えば、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ダイアボディ（ｄｓダイアボディ）、単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄａｂ）ｓｃＦｖ二量体（二価ダイアボディ）、１つ又は２つ以上のＣＤＲを含む抗体の一部から形成される多重特異性抗体、ラクダ化単一ドメイン抗体、ナノボディ、ドメイン抗体、二価ドメイン抗体、又は抗原に結合するが完全な抗体構造を含まない任意の他の抗体断片などの抗体断片を指す。抗原結合断片は、親抗体又は親抗体断片が結合する同じ抗原に結合することができる。特定の実施形態によると、抗原結合断片は、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域、及びＦｄセグメント（すなわち、Ｆａｂ断片に含まれる重鎖の部分）を含む。他の特定の実施形態によると、抗原結合断片は、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）を含む。
本明細書で使用するとき、用語「単鎖抗体」は、約１５〜約２０個のアミノ酸の短いペプチドによって接続される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、この分野における従来の単鎖抗体を指す。本明細書で使用するとき、用語「単一ドメイン抗体」は、重鎖可変領域及び重鎖定常領域を含むか、又は重鎖可変領域のみを含む、この分野における従来の単一ドメイン抗体を指す。
語句「単離された抗体又は抗体断片」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体又は抗体断片を指す（例えば、標的抗原に特異的に結合する単離された抗体は、標的抗原に特異的に結合しない抗体を実質的に含まない）。更に、単離された抗体又は抗体断片は、他の細胞材料及び／又は化学物質を実質的に含まない場合がある。
抗体可変領域は、３つの「抗原結合部位」によって中断された「フレームワーク」領域からなる。抗原結合部位は、様々な用語を用いて定義される：（ｉ）相補性決定領域（ＣＤＲ）、これは、配列特異性に基づいてＶＨ内に３つ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）及びＶＬ内に３つ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）が存在する（Ｗｕ ａｎｄ Ｋａｂａｔ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １３２：２１１〜５０，１９７０、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）。（ｉｉ）「超可変領域」、「ＨＶＲ」、又は「ＨＶ」、ＶＨ内の３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬ内の３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）は、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６：９０１〜１７，１９８７）により定義される構造において超可変性である、抗体可変ドメインの領域を指す。他の用語には、「ＩＭＧＴ−ＣＤＲ」（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ Ｃｏｍｐａｒａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：５５〜７７，２００３）及び「Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｓｉｄｕｅ Ｕｓａｇｅ」（ＳＤＲＵ）（Ａｌｍａｇｒｏ Ｍｏｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔ １７：１３２〜４３，２００４）が含まれる。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ＿ｍｇｔ＿ｏｒｇ）は、抗原結合部位の標準的番号付け及び定義を提供する。ＣＤＲ、ＨＶ、及びＩＭＧＴ概要説明の対応が、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ Ｃｏｍｐａｒａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：５５〜７７，２００３に記載されている。
「フレームワーク」又は「フレームワーク配列」は、抗原結合部位として定義されたものを除く、可変領域の残りの配列である。抗原結合部位は上述のような様々な用語によって定義され得るため、フレームワークの正確なアミノ酸配列は抗原結合部位がどのように定義されたかによる。
本発明の一実施形態では、単離された抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１４４、配列番号１４５、及び配列番号１４６のアミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３をそれぞれ有する軽鎖可変領域、並びに配列番号１４１、配列番号１４２、及び配列番号１４３のアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３をそれぞれ有する重鎖可変領域を含む。
別の実施形態では、単離された抗体は、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域を更に含む。ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域は、他のＩｇＧサブタイプと比較して、ＦｃγＲ及び補体因子に結合する能力が低減されている。好ましくは、Ｆｃ領域は、エフェクター機能を排除する置換を有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含有する。したがって、単離された抗体は、次の置換のうちの１つ又は２つ以上を含有する修飾されたヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域を有するＦｃ領域を更に含む：残基２３３におけるグルタミン酸の代わりにプロリンを使用、残基２３４におけるフェニルアラニンの代わりにアラニン又はバリンを使用、及び残基２３５におけるロイシンの代わりにアラニン又はグルタメートを使用（ＥＵ番号付け、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ．９１〜３２４２）。残基２９７（ＥＵ番号付け）においてＡｓｎの代わりにＡｌａを使用することによって、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域におけるＮ連結グリコシル化部位を除去することは、残留エフェクター活性が排除されることを確実にする別の方法である。
好ましくは、本発明の抗体は、ジスルフィド結合及び様々な非共有結合相互作用によって一緒に接合された二量体として存在する。したがって、本発明の抗体に有用なＦｃ部分は、重鎖二量体形成を安定させ、半ＩｇＧ４ Ｆｃ鎖の形成を防止する、２２８（ＥＵ番号付け）における位置でのプロリンに対するセリンなどの置換を含有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり得る。
別の実施形態では、重鎖のＣ末端Ｌｙｓ残基は、組換えにより生成されたモノクローナル抗体に一般的に見られるように除去される。
「ヒト抗体」とは、フレームワーク及び抗原結合部位の両方がヒト起源の配列に由来する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有する抗体を指す。抗体が定常領域を含有する場合、定常領域もヒト起源の配列に由来する。
ヒト抗体は、抗体の可変領域がヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られた場合のヒト起源の配列に「由来する」重鎖可変領域又は軽鎖可変領域を含む。そのような系は、ファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリ、及び本明細書に記載されるヒト免疫グロブリン遺伝子座を保有するマウスなど、トランスジェニックの非ヒト動物を含む。「ヒト抗体」は、例えばフレームワーク又は抗原結合部位内に天然に存在する体細胞突然変異、又は意図的な置換の導入によりヒト生殖系列又は再編成された免疫グロブリン配列と比較した場合に、アミノ酸の相違を含有し得る。典型的には、ヒト抗体は、アミノ酸配列において、ヒト生殖系列又は再編成された免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である。一部の場合では、「ヒト抗体」は、例えばＫｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９６：５７〜８６，２０００）に記載されるヒトフレームワーク配列分析から得られたコンセンサスフレームワーク配列、又は例えばＳｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９７：３８５〜９６，２０１０及び国際特許出願公開第２００９／０８５４６２号）に記載される、ファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリに組み込まれた合成ＨＣＤＲ３を含有し得る。抗原結合部位が非ヒト種に由来する抗体は、「ヒト抗体」の定義には含まれない。
単離されたヒト化抗体は合成であり得る。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来するものであるが、合成ＣＤＲ及び／若しくは合成フレームワークを組み込んだファージディスプレイなどの系を用いて生成され得るか、又はインビトロ突然変異誘発を行って抗体の特性を改善することができ、インビボのヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然に存在しない抗体を得ることができる。
本明細書で使用されるとき、用語「組換え抗体」は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニック若しくは染色体導入動物（例えばマウス）又はそれから調製されたハイブリドーマから単離された抗体、抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から単離された抗体、組換えコンビナトリアル抗体ライブラリから単離された抗体、並びにヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライスすることを伴う任意の他の手段により調製、発現、創出、又は単離された抗体、あるいはＦａｂアーム交換を用いてインビトロで生成される抗体などの組換え手段により調製、発現、創出、又は単離される全ての抗体を含む。
本明細書で使用されるとき、用語「モノクローナル抗体」は、単一分子組成物の抗体分子の調製物を指す。本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、ファージディスプレイ技術、単一リンパ球遺伝子クローニング技術、又は組換えＤＮＡ法によって作製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、トランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウス又はラットから得られるＢ細胞を含むハイブリドーマによって生成され得、ヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する。
ある特定の実施形態では、用語「ｍＡｂ」は、配列番号１３７を含む可変重鎖（ＶＨ）配列と、配列番号１３９を含む可変軽鎖（ＶＬ）配列とを有するモノクローナル抗体を指す。ある特定の実施形態では、ｍＡｂは、配列番号１３８を含む重鎖（ＨＣ）配列と、配列番号１４０を含む軽鎖（ＬＣ）配列とを有する完全ヒトモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態では、配列番号１３８の４４６位のリジン残基は、任意に欠落している。
本明細書で使用するとき、用語「キメラ抗体」は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が２つ以上の種に由来する抗体を指す。軽鎖及び重鎖の両方の可変領域は、多くの場合、所望の特異性、親和性、及び能力を有する１つの種の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）に由来する抗体の可変領域に対応し、一方で定常領域は、その種における免疫応答の誘発を回避するために、別の種の哺乳動物（例えば、ヒト）に由来する抗体の配列に対応する。
本明細書で使用するとき、用語「多重特異性抗体」は、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む抗体を指し、複数の第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第１のエピトープに対して結合特異性を有するか、又は任意の既知の結合特異性を欠く生殖系列配列を含み、複数の第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第２のエピトープに対して結合特異性を有するか、又は任意の既知の結合特異性を欠く生殖系列配列を含み、この第１及び／又は第２の免疫グロブリン可変ドメインは、任意に、複合された薬学的に活性な部分（例えば、治療用ペプチド）を含む。ある実施形態では、第１及び第２のエピトープは、同じ抗原、例えば、同じタンパク質（又は多量体タンパク質のサブユニット）上にある。ある実施形態では、第１及び第２のエピトープは、重複するか、又は実質的に重複する。ある実施形態では、第１及び第２のエピトープは、重複しないか、又は実質的に重複しない。ある実施形態では、第１及び第２のエピトープは、異なる抗原、例えば、異なるタンパク質（又は異なる多量体タンパク質のサブユニット）上にある。ある実施形態では、第１及び第２の免疫グロブリン可変ドメインは、同一の複合された薬学的に活性な部分を含む。ある実施形態では、第１及び第２の免疫グロブリン可変ドメインは、異なる薬学的に活性な部分を含む。ある実施形態では、第１の免疫グロブリン可変ドメインのみが、複合された薬学的に活性な部分を含む。ある実施形態では、第２の免疫グロブリン可変ドメインのみが、複合された薬学的に活性な部分を含む。ある実施形態では、多重特異性抗体は、第３、第４、又は第５の免疫グロブリン可変ドメインを含む。ある実施形態では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体分子、三重特異性抗体、又は四重特異性抗体分子である。
本明細書で使用するとき、用語「二重特異性抗体」は、２つ以下のエピトープ又は２つの抗原に結合し、かつ／又は２つの複合された薬学的に活性な部分（例えば、同じ又は異なる薬学的に活性な部分）を含む、多重特異性抗体を指す。二重特異性抗体は、第１のエピトープに対して結合特異性を有するか、又は任意の既知の結合特異性を欠く生殖系列配列を含む第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列、及び第２のエピトープに対して結合特異性を有するか、又は任意の既知の結合特異性を欠く生殖系列配列を含む第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列を特徴とし、この第１及び／又は第２の免疫グロブリン可変ドメインは、任意に、複合された薬学的に活性な部分を含む。ある実施形態では、第１及び第２のエピトープは、同じ抗原、例えば、同じタンパク質（又は多量体タンパク質のサブユニット）上にある。ある実施形態では、第１及び第２のエピトープは、重複するか、又は実質的に重複する。ある実施形態では、第１及び第２のエピトープは、異なる抗原、例えば、異なるタンパク質（又は異なる多量体タンパク質のサブユニット）上にある。ある実施形態では、第１及び第２の免疫グロブリン可変ドメインは、同一の複合された薬学的に活性な部分を含む。ある実施形態では、第１及び第２の免疫グロブリン可変ドメインは、異なる薬学的に活性な部分を含む。ある実施形態では、第１の免疫グロブリン可変ドメインのみが、複合された薬学的に活性な部分を含む。ある実施形態では、第２の免疫グロブリン可変ドメインのみが、複合された薬学的に活性な部分を含む。ある実施形態では、二重特異性抗体は、第１のエピトープに対して結合特異性を有するか、又は任意の既知の結合特異性を欠く生殖系列配列を含む第１の重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列、及び第２のエピトープに対して結合特異性を有するか、又は任意の既知の結合特異性を欠く生殖系列配列を含む第２の重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列を含み、この第１及び／又は第２の重鎖可変ドメインは、任意に、複合された薬学的に活性な部分を含む。ある実施形態では、第１及び第２の重鎖可変ドメインは、同一の複合された薬学的に活性な部分を含む。ある実施形態では、第１及び第２の重鎖可変ドメインは、異なる薬学的に活性な部分を含む。ある実施形態では、第１の重鎖可変ドメインのみが、複合された薬学的に活性な部分を含む。ある実施形態では、第２の重鎖可変ドメインのみが、複合された薬学的に活性な部分を含む。
本明細書で使用されるとき、「完全長抗体」は、２つの完全長抗体重鎖と２つの完全長抗体軽鎖とを有する抗体を意味する。完全長抗体重鎖（ＨＣ）は、周知の重鎖可変ドメイン及び定常ドメインＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３からなる。完全長抗体軽鎖（ＬＣ）は、周知の軽鎖可変ドメイン及び定常ドメインＶＬ及びＣＬからなる。完全長抗体は、一方又は両方の重鎖のいずれかにおいて、Ｃ末端リジン（Ｋ）を欠いていてもよい。
用語「Ｆａｂアーム」又は「半分子」は、抗原に特異的に結合する一対の重鎖−軽鎖を意味する。
完全長二重特異性抗体は、例えば、インビトロでの無細胞環境において又は共発現を使用してかのいずれかで、異なる特異性を有する２つの抗体半分子のヘテロ二量体形成を好むように各半分子における重鎖ＣＨ３界面に置換を導入することによって、２つの単一特異性二価抗体間でのＦａｂアーム交換（又は半分子交換）を使用して生成され得る。Ｆａｂアーム交換反応は、ジスルフィド結合異性化反応及びＣＨ３ドメインの解離−会合の結果である。親単一特異性抗体のヒンジ領域における重鎖ジスルフィド結合は減少する。親単一特異性抗体のうち１つの得られた遊離システインは、第２の親単一特異性抗体分子のシステイン残基と重鎖内ジスルフィド結合を形成し、同時に、親抗体のＣＨ３ドメインは、解離−会合により解放及び再形成する。ＦａｂアームのＣＨ３ドメインは、ホモ二量体形成よりヘテロ二量体形成を好むように改変されてもよい。得られた生成物は、それぞれ異なるエピトープに結合することができる、２つのＦａｂアーム又は半分子を有する二重特異性抗体である。
抗体に関して本明細書で使用されるとき、「ホモ二量体形成」は、同一のＣＨ３アミノ酸配列を有する２つの重鎖の相互作用を指す。抗体に関して本明細書で使用されるとき、「ホモ二量体」は、同一のＣＨ３アミノ酸配列を有する２つの重鎖を有する抗体を指す。
抗体に関して本明細書で使用されるとき、「ヘテロ二量体形成」は、同一でないＣＨ３アミノ酸配列を有する２つの重鎖の相互作用を指す。抗体に関して本明細書で使用されるとき、「ヘテロ二量体」は、同一でないＣＨ３アミノ酸配列を有する２つの重鎖を有する抗体を指す。
「ノブインホール（knob-in-hole）」戦略（例えば、国際公開第２００６／０２８９３６号を参照のこと）を使用して、完全長二重特異性抗体を生成することができる。簡潔に、ヒトＩｇＧにおけるＣＨ３ドメインの界面を形成する選択されたアミノ酸は、ヘテロ二量体形成を促進するために、ＣＨ３ドメイン相互作用に影響を及ぼす位置において変異され得る。小さな側鎖を有するアミノ酸（ホール）が、第１の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖内に導入され、大きな側鎖を有するアミノ酸（ノブ）が、第２の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖内に導入される。２つの抗体の共発現後に、ヘテロ二量体が、「ホール」を有する重鎖と「ノブ」を有する重鎖との優先的な相互作用の結果として形成される。ノブ及びホールを形成する例示的なＣＨ３置換の対は、Ｔ３６６Ｙ／Ｆ４０５Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ｗ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ｔ、Ｔ３９４Ｓ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、Ｆ４０５Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、及びＴ３６６Ｗ／Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖである（第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメインにおける修飾された位置／第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインにおける修飾された位置として表す）。
他の戦略、例えば、１つのＣＨ３表面における正に荷電した残基及び第２のＣＨ３表面における負に荷電した残基を置換することによる静電的相互作用を使用する重鎖ヘテロ二量体形成の促進が、米国特許出願公開第２０１０／００１５１３３号、米国特許出願公開第２００９／０１８２１２７号、米国特許出願公開第２０１０／０２８６３７号、又は米国特許出願公開第２０１１／０１２３５３２号に記載されるように使用されてもよい。他の戦略では、ヘテロ二量体形成は、米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号又は米国特許出願公開第２０１３／０１９５８４９号に記載されるように、次の置換：Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｉ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、又はＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ（第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメインにおける修飾された位置／第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインにおける修飾された位置として表す）により促進することができる。
上述された方法に加えて、二重特異性抗体は、国際特許出願公開第２０１１／１３１７４６号に記載される方法に従って、インビトロでの無細胞環境において、２つの単一特異的ホモ二量体抗体のＣＨ３領域中に非対称な突然変異を導入し、ジスルフィド結合を異性化させる還元条件下において、２つの親単一特異性ホモ二量体抗体から二重特異性ヘテロ二量体抗体を形成することにより生成され得る。この方法において、第１の単一特異性二価抗体及び第２の単一特異性二価抗体は、ヘテロ二量体の安定性を促進するＣＨ３ドメインにおいてある特定の置換を有するように改変されるが、これらの抗体は、ヒンジ領域におけるシステインがジスルフィド結合を異性化させるのに十分な還元条件下において共にインキュベートされ、それにより、Ｆａｂアーム交換により二重特異性抗体が生成される。インキュベート条件は、最適には、非還元条件に戻され得る。使用され得る例示的な還元剤は、２−メルカプトエチルアミン（２−ＭＥＡ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、グルタチオン、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、Ｌ−システイン、及びベータ−メルカプトエタノールであり、好ましくは、２−メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、及びトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンからなる群から選択される還元剤である。例えば、少なくとも２０℃の温度において、少なくとも２５ｍＭの２−ＭＥＡの存在下又は少なくとも０．５ｍＭのジチオスレイトールの存在下で、ｐＨ５〜８、例えば、ｐＨ７．０又はｐＨ７．４において、少なくとも９０分のインキュベートが使用されてもよい。
本明細書全体を通して、抗体の定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、特に明示的に指定しない限り、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）に記載されるＥＵインデックスに従って行われる。
複合体
別の一般的な態様では、本発明は、ペプチドに結合された抗体がペプチド単独と比較して延長／増加した半減期を有するように部位特異的様式で、合成の治療用ペプチド（例えば、環状ＰＹＹペプチド）などの薬学的に活性な部分に共有結合により複合された、本発明の抗体を含む複合体に関する。本発明はまた、医薬組成物及びその使用方法に関する。この複合体は、とりわけ、肥満、２型糖尿病、メタボリックシンドローム（すなわち、シンドロームＸ）、インスリン抵抗性、耐糖能異常（例えば、耐糖能）、高血糖症、高インスリン血症、高トリグリセリド血症、先天性高インスリン症（ＣＨＩ）による低血糖、脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性腎症、並びに管理されていないコレステロール及び／若しくは脂質レベルに関連する高血圧及び心血管危険因子などの他の心血管危険因子、骨粗鬆症、炎症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、腎疾患、並びに湿疹などの疾患又は障害を予防する、治療する又は緩解させるのに有用である。
ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、薬学的に活性な部分に複合されて、薬学的に活性な部分の半減期を延長／増加させることができる少なくとも１つのシステイン残基置換を含むように修飾される。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのシステイン残基置換は、抗体の相補性決定領域に含まれる。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのシステイン残基置換は、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）にある。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのシステイン残基置換はＨＣＤＲ３にあり、ＨＣＤＲ３は、配列番号１４３のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、配列番号１４３のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む抗体は、薬学的に活性な部分に複合することができる、少なくとも１つの追加のシステイン置換を有する。
ある特定の実施形態では、薬学的に活性な部分は、リンカーを含み得る。リンカーは、薬学的に活性な部分への抗体の複合を可能にするように化学的に修飾され得る。リンカーとしては、例えば、ペプチドリンカー、炭化水素リンカー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカー、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）リンカー、多糖類リンカー、ポリエステルリンカー、ＰＥＧ及び埋め込まれた複素環からなるハイブリッドリンカー、又は炭化水素鎖を挙げることができるが、これらに限定されない。ＰＥＧリンカーは、例えば、２〜２４のＰＥＧ単位を含み得る。
ある特定の実施形態では、本発明のモノクローナル抗体は、目的の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つの薬学的に活性な部分（例えば、治療用ペプチド（複数可））に複合される。好ましい実施形態では、非標的化モノクローナル抗体は、目的の２つの薬学的に活性な部分に複合される。モノクローナル抗体が目的の少なくとも２つの薬学的に活性な部分に複合されるある特定の実施形態では、目的の薬学的に活性な部分は、同じ薬学的に活性な部分であり得るか、又は異なる薬学的に活性な部分であり得る。
本発明の抗体を本発明の薬学的に活性な部分と複合させる方法は、当該技術分野において既知である。簡潔に、本発明の抗体は、還元剤（例えば、ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）を用いて還元され、精製され（例えば、タンパク質Ａ吸着又はゲル濾過によって）、薬学的に活性な部分と複合され得る（例えば、複合を可能にする条件下で凍結乾燥ペプチドを還元抗体に提供することによって）。複合反応後、複合体は、イオン交換クロマトグラフィ又は疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）によって、タンパク質Ａ吸着の最終精製工程により精製することができる。ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、ＨＩＣ方法を利用して還元される前に精製することができる。複合方法のより詳細な説明については、例えば、実施例１０３及びＤｅｎｎｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ４：１９７〜２２４（２０１５）を参照されたい。
本明細書において、環状ＰＹＹペプチドに結合されたモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含む複合体が提供され、この環状ＰＹＹペプチドは、式Ｉ：
Figure 2020510606
 （式中、
ｐは、０又は１であり、
ｍは、０、１、２、３、４、又は５であり、
ｎは、１、２、３、又は４であり、
ｑは、０又は１であり（但し、ｑは、Ｚ３０が不在の場合にのみ１である。）、
ＢＲＩＤＧＥは、−Ｐｈ−ＣＨ２−Ｓ−、−トリアゾリル−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｓ−、−ＳＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、
−（ＯＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｓ、−ＮＨＣ（Ｏ）−、又は−ＣＨ２Ｓ−であり、
Ｚ４は、Ｋ、Ａ、Ｅ、Ｓ、又はＲであり、
Ｚ７は、Ａ又はＫであり、
Ｚ９は、Ｇ又はＫであり、
Ｚ１１は、Ｄ又はＫであり、
Ｚ２２は、Ａ又はＫであり、
Ｚ２３は、Ｓ又はＫであり、
Ｚ２６は、Ａ又はＨであり、
Ｚ３０は、Ｌ、Ｗ、不在、又はＫであり
（但し、Ｚ３０は、ｑが１である場合にのみ不在である。）、
Ｚ３４は、
Figure 2020510606
 であり、
Ｚ３５は、
Figure 2020510606
 である。）
によって表されるか、又はその誘導体若しくは薬学的に許容される塩であり、この誘導体は、アミド化、グリコシル化、カルバミル化、硫酸化、リン酸化、環化、脂質化、及びＰＥＧ化からなる群から選択される１つ又は２つ以上のプロセスによって修飾されている、式Ｉの化合物である。
ある特定の実施形態では、環状ＰＹＹペプチドは、アミド化、脂質化、及びＰＥＧ化からなる群から選択される１つ又は２つ以上のプロセスによって修飾されている式Ｉの環状ＰＹＹペプチドの誘導体、又はその薬学的に許容される塩である。
ある特定の実施形態では、環状ＰＹＹペプチドは、式Ｉによって表されるか、又はその誘導体若しくは薬学的に許容される塩であり、式中、
ｐは、０又は１であり、
ｍは、０、１、２、３、４、又は５であり、
ｎは、１、２、３、又は４であり、
ｑは、０又は１であり（但し、ｑは、Ｚ３０が不在の場合にのみ１である。）、
ＢＲＩＤＧＥは、−Ｐｈ−ＣＨ２−Ｓ−、−トリアゾリル−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｓ−、−ＳＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、
−（ＯＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｓ、−ＮＨＣ（Ｏ）−、又は−ＣＨ２Ｓ−であり、
Ｚ４は、Ｋ、Ａ、Ｅ、Ｓ、又はＲであり、
Ｚ７は、Ａ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、任意に、
Figure 2020510606
 （式中、ｉは、０〜２４の整数であり、Ｘ＝Ｂｒ、Ｉ、又はＣｌである。）、
−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｂｒ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｉ、又は−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃｌで置換され、Ｚ９は、Ｇ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、任意に、
Figure 2020510606
 （式中、ｔは、０、１、又は２であり、
ｕは、０又は１であり、
ｖは、１４、１６、又は１８である。）、
Figure 2020510606
 （式中、ｉは、０〜２４の整数であり、Ｘ＝Ｂｒ、Ｉ、又はＣｌである。）、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｂｒ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｉ、又は−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃｌで置換され、
Ｚ１１は、Ｄ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、任意に、
Figure 2020510606
 （式中、ｗは、０、１、２、又は４であり、
ｘは、０又は１であり、
ｙは、１４、１６、又は１８である。）、
Figure 2020510606
 （式中、ｉは、０〜２４の整数であり、Ｘ＝Ｂｒ、Ｉ、又はＣｌである。）、
Figure 2020510606
 −Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｉ、
−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃｌ、又は−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｂｒで置換され、
Ｚ２２は、Ａ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、任意に、
Figure 2020510606
 （式中、ｉは、０〜２４の整数であり、Ｘ＝Ｂｒ、Ｉ、又はＣｌである。）、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｂｒ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｉ、又は−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃｌで置換され、
Ｚ２３は、Ｓ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、任意に、
Figure 2020510606
 （式中、ｉは、０〜２４の整数であり、Ｘ＝Ｂｒ、Ｉ、又はＣｌである。）、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｂｒ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｉ、又は−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃｌで置換され、
Ｚ２６は、Ａ又はＨであり、
Ｚ３０は、Ｌ、Ｗ、不在、又はＫであり（但し、Ｚ３０は、ｑが１である場合にのみ不在である。）、当該Ｋのアミノ側鎖は、任意に、
Figure 2020510606
 （式中、ｒは、０、１、又は２であり、
ｓは、０又は１であり、
ｑは、１４、１６、又は１８である。）、又は
Figure 2020510606
 で置換され、
Ｚ３４は、
Figure 2020510606
 であり、
Ｚ３５は、
Figure 2020510606
 である。
ある特定の実施形態では、環状ＰＹＹペプチドは、式Ｉによって表されるか、又はその誘導体若しくは薬学的に許容される塩であり、式中、
ｐは、０又は１であり、
ｍは、０、１、２、３、又は５であり、
ｎは、１、２、又は４であり、
ｑは、０又は１であり（但し、ｑは、Ｚ３０が不在の場合にのみ１である。）、
ＢＲＩＤＧＥは、−Ｐｈ−ＣＨ２−Ｓ−、−トリアゾリル−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｓ−、−ＳＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、
−（ＯＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｓ、−ＮＨＣ（Ｏ）−、又は−ＣＨ２Ｓ−であり、
Ｚ４は、Ｋ、Ａ、Ｅ、Ｓ、又はＲであり、
Ｚ７は、Ａ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、
Figure 2020510606
 で置換され、
Ｚ９は、Ｇ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、
Figure 2020510606
 （式中、ｔは０であり、
ｕは１であり、
ｖは１４である。）で置換され、
Ｚ１１は、Ｄ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、任意に、
Figure 2020510606
 （式中、ｗは、０又は４であり、
ｘは１であり、
ｙは１４である。）、
Figure 2020510606
 で置換されるか、あるいは
Ｚ２２は、Ａ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、
Figure 2020510606
 で置換され、
Ｚ２３は、Ｓ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、
Figure 2020510606
 で置換され、
Ｚ２６は、Ａ又はＨであり、
Ｚ３０は、Ｌ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、
Figure 2020510606
 （式中、ｒは、０又は２であり、
ｓは１であり、
ｑは、１４、１６、又は１８である。）、又は
Figure 2020510606
 で置換され、
Ｚ３４は、
Figure 2020510606
 であり、
Ｚ３５は、
Figure 2020510606
 である。
ある特定の実施形態では、複合体は、環状ＰＹＹペプチドに複合されたモノクローナル抗体又はその断片を含み、この環状ＰＹＹペプチドは、配列番号１〜１００及び配列番号１４７〜１５６からなる群から選択される。好ましい実施形態では、複合体は、環状ＰＹＹペプチドに複合されたモノクローナル抗体又はその断片を含み、この環状ＰＹＹペプチドは、配列番号１、配列番号７３〜１００、及び配列番号１４７〜１５６からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、リンカーを介して、環状ＰＹＹペプチドのリジン残基において、環状ＰＹＹペプチドに共有結合している。例えば、リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）８−トリアゾリル−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−ＰＥＧ４、２〜２４ＰＥＧ単位のＰＥＧ鎖、２〜１０個の炭素原子を含有するアルキル鎖、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｊ（式中、ｊ＝１〜４）、（ＡｌａＰｒｏ）ｕ（式中、ｕ＝１〜１０）、又は結合からなる群から選択されるリンカーを含み得る。
本発明の実施形態によるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、当該技術分野において既知の方法を使用して、ＰＹＹのアミノ酸残基４、７、９、１０、１１、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、３０、又は３１などの、環状ＰＹＹの１つ又は２つ以上のアミノ酸位置で環状ＰＹＹペプチドに複合され得る。アミノ酸残基の番号付けは、ｈＰＹＹ３−３６のものに従う。ある特定の実施形態では、式Ｉ中のＺ７、Ｚ９、Ｚ１１、Ｚ２２、及びＺ２３のうちの１つのみがリジンであり、リジンは、リンカーを介して、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片の改変システイン残基に共有結合している。好ましい実施形態では、本発明の実施形態によるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片は、環状ＰＹＹの残基１１において環状ＰＹＹペチドに複合される。別の好ましい実施形態では、ブロモアセトアミド又はマレイミドなどの求電子物質は、環状ＰＹＹの残基１１におけるリジンのアミノ側鎖などの環状ＰＹＹの側鎖上に導入され、求電子物質は、モノクローナル抗体又はその断片のＣＤＲ、好ましくはＨＣＤＲ３に改変されたＣｙｓ残基のスルフヒドリル基と部位特異的に反応し、それにより、環状ＰＹＹペプチドとモノクローナル抗体又はその断片との間に共有結合による連結を創出する。より好ましくは、環状ＰＹＹペプチドは、配列番号１、配列番号７３〜１００、及び配列番号１４７〜１５６からなる群から選択される。一実施形態では、求電子物質は、環状ＰＹＹの側鎖上に直接導入される。別の実施形態では、求電子物質は、リンカーを介して環状ＰＹＹの側鎖上に導入される。
また、本発明の複合体を含み、薬学的に許容される担体を更に含む医薬組成物も提供される。
また、環状ＰＹＹペプチドに結合されたモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含む複合体も提供され、この複合体は、式ＩＩＩａ−ｂ、ＩＶａ−ｂ、Ｖａ−ｂ、及び／又はＶＩａ−ｂによってそれぞれ表される。
Figure 2020510606
Figure 2020510606
式ＩＩＩａ−ｂ、ＩＶａ−ｂ、Ｖａ−ｂ、及びＶＩａ−ｂにおいて、
ｘは、例えば、１、２、３、４、５、又は６、好ましくは２であり得る。
ｌｉｎｋ１は、例えば、Ｇ、βＡ、−ＣＯＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、γ−アミノブタノイル、ＧＧ、−ＣＯ（ＣＨ２）ｍＳＣＨ２−（但し、Ｌｉｎｋ２＝−ＮＨ−の場合、ｍ＝１、２である。）、又は結合であってもよく、
ｌｉｎｋ２は、例えば、−ＣＨ２−、ベンジル、エチルトリアゾリル、−ＮＨ−、又は結合であってもよく、
ｎは、例えば、１、２、又は３であってもよく、
Ｘは、例えば、−Ｓ−又は−ＣＨ２−であってもよく、
Ｚ３は、例えば、Ｉ又は結合であってもよく、
Ｚ４は、例えば、Ｋ、Ｓ、又はＲであってもよく、
Ｚ３０は、例えば、Ｌ、Ｗ、Ｋ（ｍＰＥＧ１６）、又はＫ（ｍＰＥＧ１２）であってもよく、
Ｚ３４は、例えば、Ｑであってもよく、当該Ｑは、任意に、アルファ−アミド窒素上でＮ−メチル化され、
Ｚ３５は、例えば、Ｒであってもよく、式中、当該Ｒは、任意に、アルファ−アミド窒素上でＮ−メチル化されるか、又はＲは脱カルボニル化されて、ｐｓｉ−（Ｚ３５Ｚ３６）アミド結合をもたらすか、又はＲは、アルファ−アミド窒素上でＮ−メチル化され、脱カルボニルされて、ｐｓｉ−（Ｚ３５Ｚ３６）アミド結合をもたらす両方であり、
Ｚ３６は、例えば、Ｙ（Ｔｙｒ）、Ｃｈａ（β−シクロヘキシルアラニン）、Ａｉｃ（２−アミノインダン−２−カルボン酸）、又はＦ（Ｐｈｅ）であってもよく、当該Ｆは、任意に、フルオロ（４−Ｆ−Ｐｈｅ）、クロロ（４−Ｃｌ−Ｐｈｅ）、ブロモ（４−Ｂｒ−Ｐｈｅ）、ヨード（４−Ｉ−Ｐｈｅ）、アミノ（４−ＮＨ２−Ｐｈｅ）であってもよく、かつ
Ｌｉｎｋ３は、例えば、リジン側鎖への以下のアミド化：（ＰＥＧ）８−トリアゾリル−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−ＰＥＧ４（
Figure 2020510606
 を含む）、２〜２４ＰＥＧ単位のＰＥＧ鎖（
Figure 2020510606
 を含む）、２〜１０個の炭素原子を含有するアルキル鎖（
Figure 2020510606
 を含む）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｊ（式中、Ｊ＝１〜４）、（ＡｌａＰｒｏ）ｕ（式中、ｕ＝１〜１０）のうちのいずれかを含み得るか、又は−ＮＨ−リンク３−は結合によって置換され得る。
また、リンカー（Ｌ）を介して環状ＰＹＹペプチド（ｃＰＹＹ）に結合されたモノクローナル抗体又はその抗原結合断片（ｍＡｂ）（ｃＰＹＹ−Ｌ］２−ｍＡｂ）を含む複合体も提供され、この複合体は、配列番号１０２〜１２７からなる群から選択される環状ＰＹＹ配列、又はその薬学的に許容される塩を含み、ｍＡｂは、本発明の実施形態によるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を表し、］２は、１つ又は２つの環状ＰＹＹペプチドがｍＡｂに共有結合により複合されていることを表す。
本明細書において、ヒトＰＹＹ３−３６（ｈＰＹＹ３−３６）に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を示す、Ｎ末端〜ＰＹＹの側鎖環状類似体も提供する。２つの類似体間の配列同一性を決定する方法の一例として、２つのペプチド
Figure 2020510606
 （配列番号１）とｈＰＹＹ３−３６
Figure 2020510606
 （配列番号１０１）を整列させる。ｈＰＹＹ（３−３６）に対する類似体の配列同一性は、整列させた残基の総数から異なる残基の数（すなわち、整列させた同一残基の数）を、ｈＰＹＹ３−３６の残基の総数で除算したものである。この例では、異なる残基は、置換Ｋ１１と交換されたＤ１１であり、その後ｈＣ３１と交換されたＶ３１、そして最後に脱カルボニル化されたＲ３５が続く。したがって、この例では、配列同一性は、（３４−３）／３４×１００である。
環状ＰＹＹペプチド
ＰＹＹ３−３６は、食物摂取を阻害するためにＹ２受容体のアゴニストとして作用する、遠位腸内のＬ細胞によって分泌される内因性ホルモンである。食欲及び食物摂取の制御におけるその役割、並びに哺乳動物の胃腸管におけるその抗分泌及び吸収促進効果を考慮すると、ＰＹＹ３−３６は、肥満及び関連状態、並びにいくつかの胃腸障害の治療に有効であり得る。しかしながら、治療剤としてのＰＹＹ３−３６自体の治療的有用性は、その迅速な代謝及び短い循環半減期によって制限される。したがって、本発明は、広義には、ＰＹＹ３−３６ペプチドの半減期を延長し、インビボでのペプチドの代謝を低減する修飾されたＰＹＹ３−３６複合体に関する。
本発明のある特定の実施形態では、修飾されたＰＹＹ３−３６ペプチドは、環状ＰＹＹペプチドである。「環状ＰＹＹペプチド」、「環状ＰＹＹ３−３６類似体」、及び「環状ＰＹＹ３−３６ペプチド類似体」という用語は、互換的に使用され得る。複合体に使用することができる環状ＰＹＹペプチドの例は、２０１６年１０月２７日に出願された米国特許出願第６２／４１３，６１３号、及び代理人整理番号ＰＲＤ３４１１で本出願と同日に出願された「Ｃｙｃｌｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ａｓ ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」と題した米国特許出願第＿＿＿＿＿＿号に記載されており、両出願の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「ＮＴＳＣ−ＰＹＹ」という用語は、ＰＹＹのＮ末端〜側鎖環状類似体を説明することを意図している。
本明細書に記載のペプチド配列は、通常の慣習に従って記載され、ペプチドのＮ末端領域は左側にあり、Ｃ末端領域は右側にある。アミノ酸の異性体形態は既知であるが、別途明示的に示されない限り、示されるのはアミノ酸のＬ型である。本発明の分子を説明する際の便宜上、様々なアミノ酸の従来の及び非従来の略語（単一及び３文字コードの両方）及び機能部分が使用される。これらの略語は当業者にはよく知られているが、明確にするために、以下に列記する：Ａ＝Ａｌａ＝アラニン；Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン；Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン；Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸；βＡ＝βＡｌａ＝ベータ−アラニン；Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン；ｈＣ＝ｈＣｙｓ＝ホモシステイン；Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸；Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン；Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン；Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン；Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン；Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン；Ｋ＝Ｌｙｓ＝リジン；Ｎｌｅ＝ノルロイシン；Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン；Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン；Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン；Ｔ＝Ｔｈｒ＝スレオニン；Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン；Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン、及びＶ＝Ｖａｌ＝バリン。
便宜上、本発明のＮＴＳＣ−ＰＹＹペプチドを命名する際に使用されるアミノ酸残基の番号付け規則は、ｈＰＹＹ３−３６のものに従う。ｈＰＹＹ３−３６の対応する位置における天然残基に対して、ＮＴＳＣ−ＰＹＹペプチドに導入された特定のアミノ酸置換は、適切なアミノ酸コード、続いて置換の位置によって示される。したがって、ＮＴＳＣ−ＰＹＹペプチド中の「Ｓ４」は、ｈＰＹＹ３−３６の対応する天然のｌｙｓ４残基がセリンに置換されたペプチドを指す。同様に、ＮＴＳＣ−ＰＹＹペプチド中の「ｈＣ３１」は、ｈＰＹＹ３−３６の対応する天然のｖａｌ３１残基がホモシステインに置換されたペプチドを指す。ＮＴＳＣ−ＰＹＹペプチド内で生じる更なるアミノ酸置換は、この規則に従って記載され、当業者によってこのようなものとして認識されるであろう。
また便宜上、本発明のＮＴＳＣ−ＰＹＹペプチドに使用される命名規則は、サイクルに関与するＮ末端残基から出発して左から右方向に、それらの間に連結基（複数可）と共にサイクルに関与するアミノ残基を組み込む。全ての場合において、サイクルのＮ末端アミノ酸残基は、そのα−アミノ官能基を介して連結基に連結し、これは次に、ＮＴＳＣ−ＰＹＹペプチドの３１位のアミノ酸の側鎖残基に接続する。したがって、「シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１）」は、Ｉｌｅ３のα−アミノ官能基がメタ−トルイル酸残基でアシル化されるＮＴＳＣ−ＰＹＹペプチドのサイクルを記載するために使用され、そのメチル基は、チオエーテル結合によってｈＣｙｓ３１残基の側鎖に更に連結される。同様に、「シクロ−（Ｋ４−ＣＯ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯＣＨ２−ｈＣ３１）」は、天然のＩｌｅ３残基が欠失しており、ｌｙｓ４のその（ここでＮ末端）α−アミノ官能基が３−アセトアミドプロパノイル基によりアシル化され、そのアセトアミドメチレン炭素は、チオエーテル結合によってｈＣｙｓ３１残基の側鎖に接続される、ＮＴＳＣ−ＰＹＹペプチドのサイクルを説明するために使用される。
リジン残基は、更なる誘導体化のために便利な機能性ハンドルを提供するために、ｈＰＹＹ３−３６配列の様々な位置に組み込まれ得る。リジン残基は、直接的又は間接的のいずれかでモノクローナル抗体に結合されるように修飾され得る。モノクローナル抗体への間接的結合において、リジン残基は、環状ＰＹＹペプチドがモノクローナル抗体に結合されることを可能にするリンカーを含むように修飾され得る。当業者であれば、関連するオルソロガスもそのように効果的に使用することができ、本明細書において企図されることを認識するであろう。
ペプチド配列に現れる「Ｋ（γ−Ｇｌｕ）」という用語は、その側鎖ε−アミノ基がグルタミン酸のγ−カルボキシル基によってアシル化されているリシニル残基を表す。
「Ｋ（γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ（パルミトイル））」という用語は、その側鎖ε−アミノ基がＮ−ヘキサデカン−１−オイルグルタミン酸のγ−カルボキシル基によってアシル化されているリシニル残基を表す。
「Ｋ（γ−Ｇｌｕ−Ｓｔｅａｒ（ステアロイル））」という用語は、その側鎖ε−アミノ基がＮ−オクタデカン−１−オイルグルタミン酸のγ−カルボキシル基によってアシル化されているリシニル残基を表す。
「Ｋ（γ−Ｇｌｕ−Ａｒａｃｈ（アラキドイル））」という用語は、その側鎖ε−アミノ基がＮ−ドデカン−１−オイルグルタミン酸のγ−カルボキシル基によってアシル化されているリシニル残基を表す。
「Ｋ（ＯＥＧ）（８−アミノ−３，６−ジオキサオクタノイル）」という用語は、その側鎖ε−アミノ基が８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸によってアシル化されているリシニル残基を表す。
「（ＯＥＧ）２」という用語は、アミド連結（すなわち、１７−アミノ−１０−オキソ−３，６，１２，１５−テトラオキサ−９−アザヘプタデカン酸）を介して連続して一緒に連結された２つのＯＥＧ単位を表す。
「Ｋ（ＯＥＧ）２」という用語は、その側鎖ε−アミノ基が１７−アミノ−１０−オキソ−３，６，１２，１５−テトラオキサ−９−アザヘプタデカン酸によってアシル化されているリシニル残基を表す。
「Ｋ（（ＯＥＧ）２−γ−Ｇｌｕ」という用語は、その側鎖ε−アミノ基がその１−カルボン酸官能基を介して（２２Ｓ）−２２−アミノ−１０，１９−ジオキソ−３，６，１２，１５−テトラオキサ−９，１８−ジアザトリコサン二酸によってアシル化されているリシニル残基を表す。
「Ｋ（（ＯＥＧ）２−γ−Ｇｌｕ−Ｓｔｅａｒ）」という用語は、その側鎖ε−アミノ基がその１−カルボン酸官能基を介して（２２Ｓ）−１０，１９−ジオキソ−２２−ステアルアミド−３，６，１２，１５−テトラオキサ−９，１８−ジアザトリコサン二酸によってアシル化されているリシニル残基を表す。
「Ｋ（（ＯＥＧ）２−γ−Ｇｌｕ−ＣＯＣ１６ＣＯ２Ｈ）」という用語は、その側鎖ε−アミノ基がその１−カルボン酸官能基を介して（２１Ｓ）−９，１８，２３−トリオキソ−２，５，１１，１４−テトラオキサ−８，１７，２２−トリアザノナトリアコンタン−１，２１，３９−トリカルボン酸によってアシル化されているリシニル残基を表す。
同様に、「Ｋ（（ＯＥＧ）２−γ−Ｇｌｕ−ＣＯＣ１８ＣＯ２Ｈ）」という用語は、その側鎖ε−アミノ基がその１−カルボン酸官能基を介して（２１Ｓ）−９，１８，２３−トリオキソ−２，５，１１，１４−テトラオキサ−８，１７，２２−トリアザヘンテトラコンタン−１，２１，４１−トリカルボン酸によってアシル化されているリシニル残基を表す。
「Ｋ（（ＯＥＧ）２−ＣＯＣ１６ＣＯ２Ｈ）」という用語は、その側鎖ε−アミノ基がその１−カルボン酸官能基を介して１０，１９−ジオキソ−３，６，１２，１５−テトラオキサ−９，１８−ジアザヘキサトリアコタン二酸によってアシル化されているリシニル残基を表す。
「Ｋ（ＰＥＧ２４−ＡｃＢｒ）」という用語は、その側鎖ε−アミノ基がその１−カルボン酸官能基を介して、Ｎ−ブロモアセチル−７５−アミノ−４，７，１０，１３，１６，１９，２２，２５，２８，３１，３４，３７，４０，４３，４６，４９，５２，５５，５８，６１，６４，６７，７０，７３−テトラコサオキサペンタヘプタコンタン酸によってアシル化されている。
「Ｋ（ＰＥＧ１２−ＡｃＢｒ）」という用語は、その側鎖ε−アミノ基がその１−カルボン酸官能基を介して、Ｎ−ブロモアセチル−３９−アミノ−４，７，１０，１３，１６，１９，２２，２５，２８，３１，３４，３７−ドデカオキサノナトリアコンタン酸によってアシル化されているリシニル残基を表す。
「Ｋ（ＰＥＧ６−ＡｃＢｒ）」という用語は、その側鎖ε−アミノ基がその１−カルボン酸官能基を介してＮ−ブロモアセチル−３−［（１７−アミノ−３，６，９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカ−１−イル）オキシ］−プロパン酸によってアシル化されているリシニル残基を表す。
「Ｋ（ＰＥＧ８−トリアゾリル−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−ＰＥＧ４−ＡｃＢｒ）」という用語は、その側鎖ε−アミノ基がその１−カルボン酸官能基を介して２７−［４−［２−［３−［２−［２−［３−（Ｎ−ブロモアセチルアミノ）プロポキシ］エトキシ］エトキシ］プロピルアミノカルボニル］エチル］テトラゾール−１−イル］−４，７，１０，１３，１６，１９，２２，２５−オクタオキサヘプタコサン酸によってアシル化されているリシニル残基を表す。
「Ｋ（ｍＰＥＧ１６）という用語は、その側鎖ε−アミノ基がその１−カルボン酸官能基を介して４，７，１０，１３，１６，１９，２２，２５，２８，３１，３４，３７，４０，４３，４６，４９−ヘキサデカオキサペンタコンタン酸によってアシル化されているリシニル残基を表す。
「Ｋ（ｍＰＥＧ１２）」という用語は、その側鎖ε−アミノ基がその１−カルボン酸官能基を介して、４，７，１０，１３，１６，１９，２２，２５，２８，３１，３４，３７−ドデカオキサオクタトリアコンタン酸によってアシル化されているリシニル残基を表す。
「ＶｉｔＥ」という用語は、分子中のα−トコフェロリル単位を表す。
「ＡｃＶｉｔＥ」という用語は、そのフェノール基がエーテル連結されたメチレンカルボキシ官能基を有するα−トコフェロリル単位を表す。
用語「Ｋ−γ−Ｇｌｕ−ＡｃＶｉｔＥ」は、その側鎖ε−アミノ基がそのγ−カルボン酸官能基を介して（２−（（（２Ｒ）−２，５，７，８−テトラメチル−２−（（４Ｒ，８Ｒ）−４，８，１２−トリメチルトリデシル）クロマン−６−イル）オキシ）アセチル）−Ｌ−グルタミン酸によってアシル化されているリシニル残基を表す。
本発明の化合物／複合体の多くは、配列のＣ末端残基と、Ｙ３６と、その隣接する残基Ｒ３５との間に還元アミド結合を組み込む。この還元アミド連結は、「ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）」という用語により表される。
本発明のある特定の配列を含む様々なアミノ酸残基は、メチル化されているα−アミノ基を含む。したがって、「Ｎ−Ｍｅ−Ｑ３４」又は「Ｎ−Ｍｅ−Ｒ３５」という用語は、それぞれ、配列の３４位におけるα−Ｎ−メチル化グルタミン、及び配列の３５位におけるα−Ｎ−メチル化アルギニンを表す。
配列の説明において「Ｎ−Ｍｅ−Ｑ３４、ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）」という用語は、３４位においてα−メチルグルタミン残基、並びに残基Ｒ３５とＹ３６との間に還元アミド結合の両方を含む配列を指す。
同様に、配列の説明において「Ｎ−Ｍｅ−Ｒ３５、ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）」という用語は、３５位においてα−メチルアルギニン残基、並びにこの残基とＹ３６との間に還元アミド結合の両方を含む配列を指す。
半減期延長部分
本発明の抗体又はその抗原結合断片に加えて、本発明の複合体は、例えば共有結合の相互作用を介して、薬学的に活性な部分（例えば、環状ＰＹＹペプチド）の半減期を延長するための１つ又は２つ以上の他の部分を組み込むことができる。例示的な他の半減期延長部分としては、アルブミン、アルブミン変異体、アルブミン結合タンパク質、及び／又はドメイン、トランスフェリン、並びにそれらの断片及び類似体が挙げられるが、これらに限定されない。所望の特性のために、本発明の複合体に組み込むことができる追加の半減期延長部分としては、例えば、ＰＥＧ５０００又はＰＥＧ２０，０００などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、脂肪酸及び異なる鎖長の脂肪酸エステル、例えば、ラウリン酸エステル、ミリスチン酸エステル、ステアリン酸エステル、アラキジン酸エステル、ベヘン酸エステル、オレイン酸エステル、アラキドン酸エステル、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸など、ポリリジン、オクタン、炭水化物（デキストラン、セルロース、オリゴ糖又は多糖類）を挙げることができる。これらの部分は、タンパク質足場コード配列との直接融合体であってもよく、標準的なクローニング及び発現技術によって生成されてもよい。あるいは、周知の化学結合方法を用いて、組換えにより及び化学的に生成された本発明の複合体にその部分を結合させることができる。
周知の方法を用いて、システイン残基を分子のＣ−末端に組み込み、ＰＥＧ化した基をシステインに結合させることによって、ＰＥＧ化部分を、例えば、本発明のペプチド分子に付加してもよい。
更なる部分を組み込んだ本発明のペプチド分子を、いくつかの周知のアッセイによって、官能性について比較することができる。例えば、目的の治療用ペプチドの生物学的又は薬物動態学的活性は、単独で、又は本発明による複合体において、既知のインビトロ又はインビボアッセイを使用してアッセイし、比較することができる。
医薬組成物
別の一般的な態様では、本発明は、本発明の複合体及び化合物、並びに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、薬学的に許容される担体と一緒に本発明の複合体を含む生成物を意味する。本発明の複合体及び化合物、並びにそれらを含む組成物は、本明細書で言及される治療用途のための薬剤の製造にも有用である。
本明細書で使用するところの「担体」なる用語は、あらゆる賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、バッファー、安定剤、可溶化剤、油、脂質、脂質含有小胞、ミクロスフェア、リポソーム封入体、又は医薬製剤で使用するための当該技術分野では周知の他の材料を指す。担体、賦形剤又は希釈剤の特性は、特定の用途の投与経路によって決る点は理解されよう。本明細書で使用するころの「薬学的に許容される担体」なる用語は、本発明に基づく組成物の効果又は本発明に基づく組成物の生物活性を妨げない無毒性材料を指す。特定の実施形態によると、本開示を考慮して、抗体の医薬組成物での使用に好適ないずれの薬学的に許容される担体が本発明において使用することができる。
本発明において使用するための薬学的に許容される酸性／アニオン性の塩としては、酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、酒石酸水素塩、臭化物、エデト酸カルシウム、カンシル酸塩、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、二塩酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストル酸塩、エシル酸塩、フマル酸塩、グリセプト酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニル酸塩、ヘキシルレソルシン酸塩、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メチル臭化物、メチル硝酸塩、メチル硫酸塩、ムコ酸塩、ナプシル酸塩、硝酸塩、パモ酸塩、パントテン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシル酸塩、及びトリエチオジドが挙げられるが、これらに限定されない。また、有機酸又は無機酸としては、ヨウ化水素酸、過塩素酸、硫酸、リン酸、プロピオン酸、グリコール酸、メタンスルホン酸、ヒドロキシエタンスルホン酸、シュウ酸、２−ナフタレンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シクロヘキサンスルファミン酸、サッカリン酸又はトリフルオロ酢酸が挙げられるが、これらに限定されない。
薬学的に許容され得る塩基性／カチオン性の塩としては、アルミニウム、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トロメタン、又は「ＴＲＩＳ」としても知られる）、アンモニア、ベンザチン、ｔ−ブチルアミン、カルシウム、クロロプロカイン、コリン、シクロへキシルアミン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、リチウム、Ｌ−リジン、マグネシウム、メグルミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、ピペリジン、カリウム、プロカイン、キニーネ、ナトリウム、トリエタノールアミン、又は亜鉛が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のいくつかの実施形態では、約０．００１ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、又は約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２５ｍｇ／ｍＬの量で本発明の複合体を含む医薬製剤が提供される。医薬製剤は、約３．０〜約１０、例えば、約３〜約７、又は約５〜約９のｐＨを有してもよい。製剤は更に、緩衝系、防腐剤（複数可）、等張化剤（複数可）、キレート剤（複数可）、安定化剤、及び界面活性剤（複数可）からなる群から選択される、少なくとも１つの成分を含み得る。
薬学的に許容される担体を有する薬学的に活性な成分の製剤は、当該技術分野において既知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（例えば、２１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ（２００５）、及び任意の後編）である。追加成分の非限定的な例としては、緩衝剤、希釈剤、溶媒、張度調節剤、防腐剤、安定剤、及びキレート剤が挙げられる。１つ又は２つ以上の薬学的に許容される担体は、本発明の医薬組成物を製剤化する際に使用され得る。
本発明の一実施形態では、医薬組成物は液体製剤である。液体製剤の好ましい例は、水性製剤、すなわち、水を含む製剤である。液体製剤は、溶液、懸濁液、エマルション、マイクロエマルション、ゲルなどを含んでもよい。水性製剤は、典型的には、少なくとも５０％ ｗ／ｗの水、又は少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は少なくとも９５％ ｗ／ｗの水を含む。
一実施形態では、医薬組成物は、例えば注射デバイス（例えば注射器又は注入ポンプ）を介して注射することができる注射剤として製剤化され得る。注射は、例えば、皮下、筋肉内、腹腔内、又は静脈内に送達され得る。
別の実施形態では、医薬組成物は、固体製剤、例えば、そのまま使用することができるか、又は医師若しくは患者が使用前に溶媒及び／又は希釈剤を添加する、凍結乾燥又は噴霧乾燥組成物である。固体剤形としては、圧縮錠剤などの錠剤、及び／又はコーティングされた錠剤、並びにカプセル（例えば、硬又は軟ゼラチンカプセル）を挙げることができる。医薬組成物はまた、例えば、サッシェ、糖衣錠、粉末、顆粒、トローチ剤、又は再構成用の粉末の形態であってもよい。
剤形は即時放出であってもよく、その場合、それらは水溶性若しくは分散性担体を含んでもよく、又は剤形は遅延放出、持続放出、又は変性放出であってもよく、その場合、それらは、胃腸管における剤形の溶解速度を調節する非水溶性ポリマーを含んでもよい。
他の実施形態では、医薬組成物は、鼻腔内、口内、又は舌下に送達され得る。
水性製剤のｐＨは、ｐＨ３〜ｐＨ１０であり得る。本発明の一実施形態では、製剤のｐＨは約７．０〜約９．５である。本発明の別の実施形態では、製剤のｐＨは約３．０〜約７．０である。
本発明の別の実施形態では、医薬組成物は緩衝剤を含む。緩衝剤の非限定的な例としては、アルギニン、アスパラギン酸、ビシン、シトレート、リン酸一水素二ナトリウム、フマル酸、グリシン、グリシルグリシン、ヒスチジン、リジン、マレイン酸、リンゴ酸、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、コハク酸塩、酒石酸、トリシン、及びトリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、及びこれらの混合物が挙げられる。緩衝液は、個々に又は集合体中に、約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在してもよい。これらの具体的な緩衝剤の各１つを含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。
本発明の別の実施形態では、医薬組成物は防腐剤を含む。緩衝剤の非限定的な例としては、塩化ベンゼトニウム、安息香酸、ベンジルアルコール、ブロノポール、ブチル４−ヒドロキシベンゾエート、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロヘキシジン、クロルフェネシン、ｏ−クレゾール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、エチル４−ヒドロキシベンゾエート、イミド尿素、メチル４−ヒドロキシベンゾエート、フェノール、２−フェノキシエタノール、２−フェニルエタノール、プロピル４−ヒドロキシベンゾエート、デヒドロ酢酸ナトリウム、チオメロサール、及びこれらの混合物が挙げられる。防腐剤は、個々に又は集合体中に、約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在してもよい。これらの具体的な防腐剤の各１つを含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。
本発明の別の実施形態では、医薬組成物は、等張剤を含む。本実施形態の非限定的な例としては、塩（塩化ナトリウムなど）、アミノ酸（グリシン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、及びスレオニンなど）、アルジトール（グリセロール、１，２−プロパンジオールプロピレングリコールなど）、１，３−プロパンジオール、及び１，３−ブタンジオールなど）、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ４００）、並びにこれらの混合物が挙げられる。等張剤の別の例としては、糖が挙げられる。糖の非限定的な例は、例えば、フルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、アルファ及びベータ−ＨＰＣＤ、可溶性澱粉、ヒドロキシエチル澱粉、及びカルボキシメチルセルロースナトリウムを含む、単糖類、二糖類、又は多糖類であり得る。等張剤の別の例は糖アルコールであり、「糖アルコール」という用語は、少なくとも１つの−ＯＨ基を有するＣ（４−８）炭化水素として定義される。糖アルコールの非限定的な例としては、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、ズルシトール、キシリトール、及びアラビトールが挙げられる。本段落に列記される各等張剤を含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。等張剤は、個々に又は集合体中に、約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在してもよい。これらの具体的な等張剤の各１つを含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。
本発明の別の実施形態では、医薬組成物はキレート剤を含む。キレート剤の非限定的な例としては、クエン酸、アスパラギン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の塩、及びこれらの混合物が挙げられる。キレート剤は、個々に又は集合体中に、約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在してもよい。これらの具体的なキレート剤の各１つを含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。
本発明の別の実施形態では、医薬組成物は安定剤を含む。安定剤の非限定的な例としては、１つ又は２つ以上の凝集阻害剤、１つ又は２つ以上の酸化阻害剤、１つ又は２つ以上の界面活性剤、及び／あるいは１つ又は２つ以上のプロテアーゼ阻害剤が挙げられる。
本発明の別の実施形態では、医薬組成物は安定剤を含み、当該安定剤は、カルボキシ−／ヒドロキシセルロース及びそれらの誘導体（ＨＰＣ、ＨＰＣ−ＳＬ、ＨＰＣ−Ｌ、及びＨＰＭＣなど）、シクロデキストリン、２−メチルチオエタノール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ ３３５０など）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、塩（塩化ナトリウムなど）、硫黄含有物質、例えばモノチオグリセロール）、又はチオグリコール酸である。安定剤は、個々に又は集合体中に、約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在してもよい。これらの具体的な安定剤の各１つを含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。
本発明の更なる実施形態では、医薬組成物は、１つ又は２つ以上の界面活性剤、好ましくは界面活性剤、少なくとも１つの界面活性剤、又は２つの異なる界面活性剤を含む。「界面活性剤」という用語は、水溶性（親水性）部分及び脂溶性（親油性）部分からなる任意の分子又はイオンを指す。界面活性剤は、例えば、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、及び／又は双極性界面活性剤からなる群から選択され得る。界面活性剤は、個々に又は集合体中に、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在してもよい。これらの具体的な界面活性剤の各１つを含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。
本発明の更なる実施形態では、医薬組成物は、１つ又は２つ以上のプロテアーゼ阻害剤、例えば、ＥＤＴＡ、及び／又はベンズアミジン塩酸（ＨＣｌ）を含む。プロテアーゼ阻害剤は、個々に又は集合体中に、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在してもよい。これらの具体的なプロテアーゼ阻害剤の各１つを含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。
本発明の医薬組成物は、組成物の保管中にポリペプチド凝集体形成を減少させるのに十分な量のアミノ酸塩基を含み得る。「アミノ酸塩基」という用語は、１つ又は２つ以上のアミノ酸（メチオニン、ヒスチジン、イミダゾール、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニンなど）、又はこれらの類似体を指す。任意のアミノ酸は、その遊離塩基形態又はその塩形態のいずれかで存在し得る。アミノ酸塩基の任意の立体異性体（すなわち、Ｌ、Ｄ、又はこれらの混合物）が存在し得る。アミノ酸塩基は、個々に又は他のアミノ酸塩基と組み合わせて、約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在してもよい。これらの具体的なアミノ酸塩基の各１つを含む医薬組成物は、本発明の代替実施形態を構成する。
また、本発明の複合体又はその医薬組成物の治療的有効量が、所望の効果に応じて変動することも当業者には明らかである。したがって、最適投与量は、当業者によって容易に決定されることができ、使用される具体的な複合体、投与方法、調製物の強度、及び病状の進行と共に変動するだろう。加えて、対象の年齢、体重、食事、及び投与時間を含む、治療される具体的な対象に関連する要因は、投与量を適切な治療的濃度に調節する必要性を生じさせるものである。
全ての適応症に関して、本発明の複合体は、好ましくは、単一又は分割用量で（例えば、単一用量を２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の部分用量（subdose）に分割することができる）、１日当たり約１μｇ〜約５ｍｇの用量で、又は１用量当たり約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５００μｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．０５μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇ、最も好ましくは約５０μｇ／ｋｇ未満で末梢的に投与される。これらの範囲内の投与量は、当然ながら各アゴニストの効力によって変化し、当業者によって容易に決定される。したがって、上記の投与量は平均的な場合の例である。当然ながら、これよりも多いか又は少ない投与量範囲が有効である個々の例もあり得、かかる例も本発明の範囲内である。
ある特定の実施形態では、本発明の複合体は、約１μｇ〜約５ｍｇの用量で、又は約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５００μｇ／ｋｇの用量で、より好ましくは約０．０５μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇの用量で、最も好ましくは約５０μｇ／ｋｇ未満の用量で、第２の治療薬（例えば、リラグルチド）の用量と共に、約１μｇ〜約５ｍｇの用量で、又は約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５００μｇ／ｋｇの用量で、より好ましくは約０．０５μｇ／ｋｇ〜約２５０μｇ／ｋｇの用量で、最も好ましくは、約５０μｇ／ｋｇ未満の用量で投与される。
本発明の複合体の薬学的に許容される塩としては、無機又は有機の酸又は塩基から形成される、従来の非毒性の塩又は第四級アンモニウム塩が挙げられる。かかる酸付加塩の例としては、酢酸塩、アジピン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、クエン酸塩、樟脳酸塩、ドデシル硫酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩及び酒石酸塩が挙げられる。塩基性塩としては、アンモニウム塩、ナトリウム塩及びカリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、ジシクロヘキシルアミノ塩などの有機塩基との塩、並びにアルギニンなどのアミノ酸との塩が挙げられる。更に、塩基性の窒素含有基は、例えばハロゲン化アルキルによって四級化されてもよい。
本発明の医薬組成物は、その使用目的を実現する任意の手段によって投与することができる。例としては、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮的、口内又は眼内投与が挙げられる。経口経路により投与してもよい。非経口投与に適する製剤としては、例えば、水溶性の塩、酸性溶液、アルカリ性溶液、デキストロース水溶液、等張炭水化物溶液、及びシクロデキストリン包接錯体などの水溶性形態の活性複合体の水溶液が挙げられる。
本発明はまた、薬学的に許容される担体を本発明の複合体のいずれかと混合することを含む、医薬組成物の作製方法も包含する。加えて、本発明は、１つ又は２つ以上の薬学的に許容される担体を本発明の複合体のいずれかと混合することによって作製される医薬組成物を含む。
更に、本発明の複合体は、１つ又は２つ以上の結晶多形又は非晶質結晶形を有してもよく、したがって、これらも本発明の範囲に含まれることが意図される。加えて、複合体は、例えば水（すなわち水和物）又は一般的な有機溶媒と溶媒和物を形成してもよい。本明細書で使用されるとき、用語「溶媒和物」は、本発明の複合体と１つ又は２つ以上の溶媒分子との物理的会合を意味する。この物理的会合は、水素結合など、イオン結合及び共有結合の度合いの変化を伴う。特定の場合において、例えば１つ又は２つ以上の溶媒分子が結晶質固体の結晶格子に組み込まれているとき、この溶媒和物は分離することができるようになる。用語「溶媒和物」は、溶液相溶媒和物と、分離可能な溶媒和物の両方を包含するものとする。適切な溶媒和物の非限定的な例としては、エタノラート、メタノラートなどが挙げられる。
本発明は、本発明の複合体の多形体及び溶媒和物をその範囲内に包含することを意図する。ゆえに、本発明の治療方法における「投与」という用語には、本発明の複合体、あるいは具体的に開示されていなくとも、明らかに本発明の範囲内に含まれるであろう多形体又はその溶媒和物を用いて、本明細書に記載の症候群、障害、又は疾患を治療する、寛解させる、又は予防する手段が含まれる。
別の実施形態では、本発明は、薬剤として使用するための本発明の複合体に関する。
本発明の範囲内には、本発明の複合体のプロドラッグが含まれる。一般的には、そのようなプロドラッグは、インビボで必要な複合体に容易に変換可能な、複合体の機能的誘導体である。したがって、本発明の治療方法において、用語「投与」は、具体的に開示される複合体を用いた、又は具体的に開示されなくてもよいが、患者への投与後にインビボで特定の複合体に転換する複合体を用いた、記載される様々な障害の治療を包含するものとする。好適なプロドラッグ誘導体の選択及び調製に関する従来の手順は、例えば、「Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ」（Ｅｄ．Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８５）に記載されている。
更に、本発明の範囲内で、任意の元素が、特に本発明の複合体に関して言及される場合、天然に存在するか又は合成により生成されたかのいずれか、また自然存在比であるか又は同位体濃縮形態のいずれかで、当該元素の全ての同位体及び同位体の混合物を含むものとすることが意図される。例えば、水素への言及には、その範囲内に１Ｈ、２Ｈ（Ｄ）、及び３Ｈ（Ｔ）が含まれる。同様に、炭素及び酸素への言及には、それらの範囲内に１２Ｃ、１３Ｃ及び１４Ｃ、並びに１６Ｏ及び１８Ｏがそれぞれ含まれる。かかる同位体は、放射性同位体であってもよく、又は非放射性同位体であってもよい。本発明の放射性標識複合体は、３Ｈ、１１Ｃ、１８Ｆ、１２２Ｉ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、及び８２Ｂｒからなる群から選択される放射性同位体を含んでもよい。好ましくは、放射性同位元素は、３Ｈ、１１Ｃ、及び１８Ｆからなる群から選択される。
本発明のいくつかの複合体は、アトロプ異性体として存在してもよい。アトロプ異性体は、一重結合周りの回転が障害されることにより生じる立体異性体であり、回転に対する立体歪みによる干渉が、配座異性体の単離を可能にする程度に十分高いものである。かかる配座異性体及びその混合物は全て、本発明の範囲内に包含されると理解される。
本発明による複合体が少なくとも１つの立体中心を有する場合、結果としてそれらはエナンチオマー又はジアステレオマーとして存在し得る。かかる異性体及びその混合物は全て、本発明の範囲内に包含されると理解される。
本発明による複合体の調製プロセスにより立体異性体混合物が生じる場合、これらの異性体は、分取クロマトグラフィなどの従来法により分離することができる。複合体はラセミ体として調製され得るか、又は個々のエナンチオマーをエナンチオ選択的合成、又は分解のいずれかにより調製することができる。複合体は、例えば（−）−ジ−ｐ−トルオイル−Ｄ−酒石酸及び／又は（＋）−ジ−ｐ−トルオイル−Ｌ−酒石酸のような光学的に活性な酸と共に塩を形成することによりジアステレオマー対を形成した後、分別結晶化及び遊離塩基の再生などの標準的な方法により、その成分であるエナンチオマーに分解することができる。複合体はまた、ジアステレオマーのエステル又はアミドを形成した後、クロマトグラフィ分離を行い、キラル補助基を除去することにより、分解することもできる。あるいは、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）又はＳＦＣを介したキラルカラムを使用して、複合体を分解してもよい。場合によっては、１Ｈ ＮＭＲスペクトルにおいて、複雑な多重線及びピーク積分をもたらす１Ｈ ＮＭＲにより観察可能な、複合体の回転異性体が存在し得る。
本発明の複合体を調製するためのプロセスのいずれかの間、関連する分子のいずれかにおける感受性基又は反応性基を保護することが必要及び／又は望ましい場合がある。これは、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｅｄ．Ｊ．Ｆ．Ｗ．ＭｃＯｍｉｅ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９７３、及びＴ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ＆ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９１（それらのそれぞれは、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。）に記載されるものなど、従来の保護基の手段によって達成され得る。保護基は、その後の便利な段階において、当該技術分野で既知の方法を用いて除去することができる。
使用方法
本発明は、Ｙ２受容体媒介症候群、障害、又は疾患を予防する、治療する、又は寛解させることを、それを必要とする対象に行う方法に関し、本方法は、それを必要とする対象に、有効量の本発明の複合体、化合物、又は医薬組成物を投与することを含む。
本発明は、障害、疾患、若しくは状態、又は当該障害、疾患、若しくは状態の任意の１つ又は２つ以上の症状を予防する、治療する、その発症を遅延させる、又は寛解させることを、それを必要とする対象に行う方法も提供し、本方法は、それを必要とする対象に、有効量の本発明の複合体、化合物、又は医薬組成物を投与することを含む。
特定の実施形態によると、疾患障害、又は状態は、肥満、Ｉ型又はＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム（すなわち、シンドロームＸ）、インスリン抵抗性、耐糖能異常（例えば、耐糖能）、高血糖症、高インスリン血症、高トリグリセリド血症、先天性高インスリン症（ＣＨＩ）による低血糖、脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性腎症、並びに管理されていないコレステロール及び／若しくは脂質レベルに関連する高血圧及び心血管危険因子などの他の心血管危険因子、骨粗鬆症、炎症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、腎疾患、並びに／又は湿疹からなる群から選択される。
特定の実施形態によれば、治療有効量は、以下の効果のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上を実現するのに十分である治療量を指す：（ｉ）治療される疾患、障害、若しくは状態、又はそれに関連する症状の重症度を低減する、又は寛解させること、（ｉｉ）治療される疾患、障害若しくは病態、又はそれに関連する症状の期間を短縮すること、（ｉｉｉ）治療される疾患、障害若しくは病態、又はそれに関連する症状の進行を防止すること、（ｉｖ）治療される疾患、障害若しくは状態、又はそれに関連する症状の退縮を生じること、（ｖ）治療される疾患、障害又は病態、又はそれに関連する症状の進展又は発症を予防すること、（ｖｉ）治療される疾患、障害又は病態、又はそれに関連する症状の再発を防止すること、（ｖｉｉ）治療される疾患、障害、若しくは状態、又はそれに関連する症状を有する対象の入院を減少させること、（ｖｉｉｉ）治療される疾患、障害若しくは状態、又はそれに関連する症状を有する対象の入院期間を短縮させること、（ｉｘ）治療される疾患、障害又は病態、又はそれに関連する症状を有する対象の生存率を高めること、（ｘｉ）治療される対象の疾患、障害若しくは状態、又はそれに関連する症状を阻害又は軽減すること、及び／又は（ｘｉｉ）別の治療の予防又は治療効果を強化又は改善すること。
治療有効量又は用量は、治療される疾患、障害又は病態、投与手段、標的部位、対象の生理学的状態（例えば、年齢、体重、健康状態を含む）、対象がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬剤、及び、治療が予防的なものであるか治療的なものであるか、などの様々な因子によって異なり得る。治療用量は、安全性及び有効性を最適化するために最適に滴定される。
本明細書で使用される場合、「治療する（treat）」、「治療する（treating）」、及び「治療（treatment）」という用語は全て、疾患、障害、又は状態に関連する少なくとも１つの測定可能な物理的パラメータの改善又は逆転を指すものであり、これは対象において必ずしも認識されるとは限らないが、対象において認識可能な場合もある。「治療する（treat）」、「治療する（treating）」、及び「治療（treatment）」なる用語はまた、疾患、障害、又は病態の退縮を生じる、その進行を防止する、又は少なくともその進行を遅らせることを指す場合もある。特定の実施形態では、「治療する（treat）」、「治療する（treating）」、及び「治療（treatment）」は、疾患、障害、若しくは状態に関連する１つ又は２つ以上の症状の緩和、進展若しくは発症の予防、又はその期間の短縮を指す。特定の実施形態では、「治療する」、「治療する」、及び「治療」は、疾患、障害、又は病態の再発の防止を指す。特定の実施形態では、「治療する」、「治療する」、及び「治療」は、疾患、障害、又は病態を有する対象の生存率の向上を指す。特定の実施形態では、「治療する」、「治療する」、及び「治療」は、対象における疾患、障害、又は病態の消失を指す。
一実施形態では、本発明は、肥満、又は肥満の任意の１つ又は２つ以上の症状を予防する、治療する、その発症を遅延させる、又は寛解させることを、それを必要とする対象に行う方法を提供し、本方法は、それを必要とする対象に、有効量の本発明の複合体、化合物、又は医薬組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象の体重は、本明細書に記載の本発明の複合体、化合物、医薬組成物、形態、若しくは薬剤のいずれかの投与前の対象の体重に対して、又は本明細書に記載の本発明の複合体、組成物、形態、薬剤、若しくは組み合わせのいずれも受けていない対照対象と比較して、例えば、約０．０１％〜約０．１％、約０．１％〜約０．５％、約０．５％〜約１％、約１％〜約５％、約２％〜約３％、約５％〜約１０％、約１０％〜約１５％、約１５％〜約２０％、約２０％〜約２５％、約２５％〜約３０％、約３０％〜約３５％、約３５％〜約４０％、約４０％〜約４５％、又は約４５％〜約５０％低減される。
いくつかの実施形態では、体重の低減は、約１週間、約２週間、約３週間、約１ヶ月間、約２ヶ月間、約３ヶ月間、約４ヶ月間、約５ヶ月間、約６ヶ月間、約７ヶ月間、約８ヶ月間、約９ヶ月間、約１０ヶ月間、約１１ヶ月間、約１年間、約１．５年間、約２年間、約２．５年間、約３年間、約３．５年間、約４年間、約４．５年間、約５年間、約６年間、約７年間、約８年間、約９年間、約１０年間、約１５年間、又は約２０年間維持される。
本発明は、症候群、障害、若しくは疾患、又は当該症候群、障害、若しくは疾患のうちのいずれか１つ又は２つ以上の症状を予防する、治療する、その発症を遅延させる、又は寛解させることを、それを必要とする対象に行う方法であって、当該症候群、障害、又は疾患が、肥満、Ｉ型若しくはＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム（すなわち、シンドロームＸ）、インスリン抵抗性、耐糖能異常（例えば、耐糖能）、高血糖症、高インスリン血症、高トリグリセリド血症、先天性高インスリン症（ＣＨＩ）による低血糖、脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性腎症、並びに管理されていないコレステロール及び／又は脂質レベルに関連する高血圧及び心血管危険因子などの他の心血管危険因子、骨粗鬆症、炎症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、腎疾患、並びに湿疹からなる群から選択される、方法を提供し、本方法は、それを必要とする対象に、有効量の本発明の複合体、化合物、又は医薬組成物を投与することを含む。
本明細書で使用される場合、メタボリックシンドロームは、高血糖（例えば、高空腹時血糖）、高血圧、異常コレステロールレベル（例えば、低ＨＤＬレベル）、異常トリグリセリドレベル（例えば、高トリグリセリド）、大腰線（すなわち、腰部周囲）、腹部領域の脂肪の増加、インスリン抵抗性、耐糖能、高いＣ反応性タンパク質レベル（すなわち、前炎症状態）、及び血漿プラスミノゲン活性化因子阻害剤−１及びフィブリノーゲンレベル（すなわち、血栓状態）の任意の１つ又は２つ以上を有する対象を指す。
本発明は、食物摂取の低減をそれを必要とする対象に行う方法を提供し、本方法は、それを必要とする対象に、有効量の本発明の複合体、化合物、又は医薬組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象の食物摂取は、本明細書に記載の本発明の複合体、化合物、組成物、形態、薬剤、若しくは組み合わせのいずれかの投与前の対象の食物摂取に対して、又は本明細書に記載の本発明の複合体、化合物、組成物、形態、薬剤、若しくは組み合わせのいずれも受けていない対照対象と比較して、例えば、約０．０１％〜約０．１％、約０．１％〜約０．５％、約０．５％〜約１％、約１％〜約５％、約２％〜約３％、約５％〜約１０％、約１０％〜約１５％、約１５％〜約２０％、約２０％〜約２５％、約２５％〜約３０％、約３０％〜約３５％、約３５％〜約４０％、約４０％〜約４５％、又は約４５％〜約５０％低減される。
いくつかの実施形態では、食物摂取の低減は、約１週間、約２週間、約３週間、約１ヶ月間、約２ヶ月間、約３ヶ月間、約４ヶ月間、約５ヶ月間、約６ヶ月間、約７ヶ月間、約８ヶ月間、約９ヶ月間、約１０ヶ月間、約１１ヶ月間、約１年間、約１．５年間、約２年間、約２．５年間、約３年間、約３．５年間、約４年間、約４．５年間、約５年間、約６年間、約７年間、約８年間、約９年間、約１０年間、約１５年間、又は約２０年間維持される。
本発明は、糖化ヘモグロビン（Ａ１Ｃ）を低減することを、それを必要とする対象に行う方法を提供し、本方法は、それを必要とする対象に、有効量の本発明の複合体、化合物、又は医薬組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象のＡ１Ｃは、本明細書に記載の本発明の複合体、化合物、組成物、形態、薬剤、若しくは組み合わせのいずれかの投与前の対象のＡ１Ｃに対して、又は本明細書に記載の本発明の複合体、化合物、組成物、形態、薬剤、若しくは組み合わせのいずれも受けていない対照対象と比較して、例えば、約０．００１％〜約０．０１％、約０．０１％〜約０．１％、約０．１％〜約０．２％、約０．２％〜約０．３％、約０．３％〜約０．４％、約０．４％〜約０．５％、約０．５％〜約１％、約１％〜約１．５％、約１．５％〜約２％、約２％〜約２．５％、約２．５％〜約３％、約３％〜約４％、約４％〜約５％、約５％〜約６％、約６％〜約７％、約７％〜約８％、約８％〜約９％、又は約９％〜約１０％低減される。
他の実施形態では、空腹時血糖レベルを低減することを、それを必要とする対象に行う方法を提供し、本方法は、それを必要とする対象に、有効量の本発明の複合体、化合物、又は医薬組成物を投与することを含む。空腹時血糖レベルは、本明細書に記載の本発明の複合体、化合物、組成物、形態、薬剤、若しくは組み合わせのいずれかの投与前の対象の空腹時血糖レベルに対して、又は本明細書に記載の本発明の複合体、化合物、組成物、形態、薬剤、若しくは組み合わせのいずれかを受けていない対照対象と比較して、約１４０〜約１５０ｍｇ／ｄＬ未満、約１４０〜約１３０ｍｇ／ｄＬ未満、約１３０〜約１２０ｍｇ／ｄＬ未満、約１２０〜約１１０ｍｇ／ｄＬ未満、約１１０〜約１００ｍｇ／ｄＬ未満、約１００〜約９０ｍｇ／ｄＬ未満、又は約９０〜約８０ｍｇ／ｄＬ未満まで低減され得る。
本発明は、Ｙ２受容体活性の調節をそれを必要とする対象に行う方法を提供し、本方法は、それを必要とする対象に、有効量の本発明の複合体、化合物、又は医薬組成物を投与することを含む。本明細書で使用される場合、「調節する」とは、受容体活性を増加又は減少させることを指す。
いくつかの実施形態では、有効量の本発明の複合体若しくは化合物、又はその形態、組成物、若しくは薬剤は、それを必要とする対象に、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回、１日７回、又は１日８回投与される。他の実施形態では、有効量の本発明の複合体若しくは化合物、又はその形態、組成物、若しくは薬剤は、それを必要とする対象に、２日に１回、週に１回、週に２回、週に３回、週に４回、週に５回、週に６回、１ヶ月に２回、１ヶ月に３回、又は１ヶ月に４回投与される。
本発明の別の実施形態は、疾患、障害、若しくは症候群、又は当該疾患、障害、若しくは症候群のいずれかの１つ又は２つ以上の症状を予防する、治療する、その発症を遅延させる、又は寛解させることを、それを必要とする対象に行う方法を提供し、本方法は、それを必要とする対象に、併用療法で、有効量の本発明の複合体、化合物、又は医薬組成物を投与することを含む。ある特定の実施形態では、併用療法は、第２の治療薬である。ある特定の実施形態では、併用療法は、外科療法である。
本明細書で使用するところの「併用される」なる用語は、対象への２種以上の治療薬の投与との関連において、複数の治療の使用を指す。
本明細書で使用されるとき、併用療法は、それを必要とする対象に、有効量の本発明の複合体若しくは化合物、又はその形態、組成物、若しくは薬剤と同時に、１つ若しくは２つ以上の追加の治療薬、又は１つ若しくは２つ以上の外科療法を施すことを指す。いくつかの実施形態では、１つ若しくは２つ以上の追加の治療薬又は外科療法は、有効量の本発明の複合体と同日に投与され得、他の実施形態では、１つ若しくは２つ以上の追加の治療薬又は外科療法は、有効量の本発明の複合体又は化合物と同じ週又は同じ月に投与され得る。
ある特定の実施形態では、疾患又は障害は、肥満、ＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、及び脂質異常症からなる群から選択され、第２の治療薬は抗糖尿病薬であり得る。ある特定の実施形態では、抗糖尿病薬は、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）受容体調節因子であり得る。
本発明はまた、併用療法を用いて、本明細書に記載の疾患、障害、症候群、又は症状のいずれかを予防する、治療する、その発症を遅延させる、又は寛解させることを、それを必要とする対象に行うことも企図し、併用療法は、それを必要とする対象に、有効量の本発明の複合体、化合物、又は医薬組成物を、以下の治療薬のうちの任意の１つ又は２つ以上と組み合わせて投与することを含む：ジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ−４）阻害剤（例えば、シタグリプチン、サクサグリプチン、リナグリプチン、アログリプチンなど）；ＧＬＰ−１受容体アゴニスト（例えば、エキセナチド及びリキシセナチドなどの、短時間作用型ＧＬＰ−１受容体アゴニスト；中間作用型ＧＬＰ−１受容体アゴニスト（例えば、リラグルチド）；長期放出型エクセナチド、アルビグルチド、デュラグルチドなどの長時間作用型ＧＬＰ−１受容体アゴニスト；ナトリウム−グルコース共輸送体−２（ＳＧＬＴ−２）阻害剤（例えば、カナグリフォジン、ダパグリフォジン、エンパグリフォジンなど）；胆汁酸封鎖剤（例えば、コレセベラムなど）；ドーパミン受容体アゴニスト（例えば、ブロモクリプチン急速放出）；ビグアニド（例えば、メトホルミンなど）；インスリン；オキシントモジュリン；スルホニル尿素（例えば、クロルプロパミド、グリメピリド、グリピジド、グリブリド、グリベンクラミド、グリボルヌリド、グリソキセピド、グリクロピラミド、トラザミド、トルブタミド、アセトヘキサミド、カブタミドなど）；及びチアゾリジンジオン（例えば、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、ロベグリタゾン、シグリタゾン、ダルグリタゾン、エングリタゾン、ネトグリタゾン、リボグリタゾン、トログリタゾンなど）。いくつかの実施形態では、追加の治療薬（複数可）の用量は、本発明の複合体又は化合物と組み合わせて与えられる場合に低減される。いくつかの実施形態では、本発明の複合体又は化合物と組み合わせて使用される場合、追加の治療薬（複数可）は、それぞれが単独で使用される場合よりも低い用量で使用され得る。
疾患又は障害が、肥満、Ｉ型又はＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム（すなわち、シンドロームＸ）、インスリン抵抗性、耐糖能異常（例えば、耐糖能）、高血糖症、高インスリン血症、高トリグリセリド血症、先天性高インスリン症（ＣＨＩ）による低血糖、脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性腎症、並びに管理されていないコレステロール及び／若しくは脂質レベルに関連する高血圧及び心血管危険因子などの他の心血管危険因子、骨粗鬆症、炎症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、腎疾患、並びに湿疹からなる群から選択される、ある特定の実施形態では、第２の治療薬はリラグルチドであり得る。
本発明は、併用療法を用いて、本明細書に記載の疾患、障害、症候群、又は症状のいずれかを予防する、治療する、その発症を遅延させる、又は寛解させることを、それを必要とする対象に行うことを企図し、併用療法は、それを必要とする対象に、有効量の本発明の複合体、化合物、又は医薬組成物を、外科療法と組み合わせて投与することを含む。ある特定の実施形態では、外科治療は、肥満手術（例えば、Ｒｏｕｘ−ｅｎ−Ｙ胃バイパス手術などの胃バイパス手術；スリーブ胃切除術；調節可能な胃バンド手術；十二指腸スイッチを伴う胆すい消化回避術；胃内バルーン；胃縫縮術、及びこれらの組み合わせ）であり得る。
１つ若しくは２つ以上の追加の治療薬又は外科療法が、有効量の本発明の複合体又は化合物と同日に投与される実施形態では、本発明の複合体又は化合物は、追加の治療薬又は外科療法の前、後、又は同時に投与され得る。「併用される」なる用語の使用は、治療が対象に投与される順序を限定しない。例えば、第１の治療（例えば、本明細書に記載される組成物）を、対象への第２の治療の投与の前（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間前）、同時に、又はその後（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間後）に投与することができる。
実施形態
本発明は以下の非限定的な実施形態も提供する。
実施形態１は、環状ＰＹＹペプチドに結合されたモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含む複合体であって、環状ＰＹＹペプチドが、式Ｉ：
Figure 2020510606
 （式中、
ｐは、０又は１であり、
ｍは、０、１、２、３、４、又は５であり、
ｎは、１、２、３、又は４であり、
ｑは、０又は１であり（但し、ｑは、Ｚ３０が不在の場合にのみ１である。）、
ＢＲＩＤＧＥは、−Ｐｈ−ＣＨ２−Ｓ−、−トリアゾリル−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｓ−、−ＳＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、
−（ＯＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｓ、−ＮＨＣ（Ｏ）−、又は−ＣＨ２Ｓ−であり、
Ｚ４は、Ｋ、Ａ、Ｅ、Ｓ、又はＲであり、
Ｚ７は、Ａ又はＫであり、
Ｚ９は、Ｇ又はＫであり、
Ｚ１１は、Ｄ又はＫであり、
Ｚ２２は、Ａ又はＫであり、
Ｚ２３は、Ｓ又はＫであり、
Ｚ２６は、Ａ又はＨであり、
Ｚ３０は、Ｌ、Ｗ、不在、又はＫであり
（但し、Ｚ３０は、ｑが１である場合にのみ不在である。）、
Ｚ３４は、
Figure 2020510606
 であり、
Ｚ３５は、
Figure 2020510606
 である。）
によって表されるか、又はその誘導体若しくは薬学的に許容される塩であり、誘導体が、アミド化、グリコシル化、カルバミル化、硫酸化、リン酸化、環化、脂質化、及びＰＥＧ化からなる群から選択される１つ又は２つ以上のプロセスによって修飾されている、式Ｉの化合物である、複合体である。
実施形態２は、環状ＰＹＹペプチドが、アミド化、脂質化、及びＰＥＧ化からなる群から選択される１つ又は２つ以上のプロセスによって修飾されている式Ｉの環状ＰＹＹペプチドの誘導体、又はその薬学的に許容される塩である、実施形態１に記載の複合体である。
実施形態３は、環状ＰＹＹペプチドが、式Ｉによって表されるか、又はその誘導体若しくは薬学的に許容される塩であり、式中、
ｐは、０又は１であり、
ｍは、０、１、２、３、４、又は５であり、
ｎは、１、２、３、又は４であり、
ｑは、０又は１であり（但し、ｑは、Ｚ３０が不在の場合にのみ１である。）、
ＢＲＩＤＧＥは、−Ｐｈ−ＣＨ２−Ｓ−、−トリアゾリル−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｓ−、−ＳＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２−、
−（ＯＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｓ、−ＮＨＣ（Ｏ）−、又は−ＣＨ２Ｓ−であり、
Ｚ４は、Ｋ、Ａ、Ｅ、Ｓ、又はＲであり、
Ｚ７は、Ａ又はＫであり、
Ｚ９は、Ｇ又はＫであり、
Ｚ１１は、Ｄ又はＫであり、
Ｚ２２は、Ａ又はＫであり、
Ｚ２３は、Ｓ又はＫであり、
Ｚ２６は、Ａ又はＨであり、
Ｚ３０は、Ｌ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、
Figure 2020510606
 で置換され、
Ｚ３４は、
Figure 2020510606
 であり、
Ｚ３５は、
Figure 2020510606
 である、実施形態１に記載の複合体である。
実施形態４は、環状ＰＹＹペプチドが、式Ｉによって表されるか、又はその誘導体若しくは薬学的に許容される塩であり、式中、
ｐは、０又は１であり、
ｍは、０、１、２、３、又は５であり、
ｎは、１、２、又は４であり、
ｑは、０又は１であり（但し、ｑは、Ｚ３０が不在の場合にのみ１であり得る。）、
ＢＲＩＤＧＥは、−Ｐｈ−ＣＨ２−Ｓ−、−トリアゾリル−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｓ−、−ＳＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２−、
−（ＯＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｓ、−ＮＨＣ（Ｏ）−、又は−ＣＨ２Ｓ−であり、
Ｚ４は、Ｋ、Ａ、Ｅ、Ｓ、又はＲであり、
Ｚ７は、Ａ又はＫであり、
Ｚ９は、Ｇ又はＫであり、
Ｚ１１は、Ｄ又はＫであり、
Ｚ２２は、Ａ又はＫであり、
Ｚ２３は、Ｓ又はＫであり、
Ｚ２６は、Ａ又はＨであり、
Ｚ３０は、Ｌ又はＫであり、当該Ｋのアミノ側鎖は、
Figure 2020510606
 で置換され、
Ｚ３４は、
Figure 2020510606
 であり、
Ｚ３５は、
Figure 2020510606
 である、実施形態１に記載の複合体である。
実施形態５は、環状ＰＹＹペプチドに結合されたモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含む複合体であって、式ＩＩＩａ−ｂ、ＩＶａ−ｂ、Ｖａ−ｂ、及び／又がＶＩａ−ｂによって表され、式ＩＩＩａ−ｂ、ＩＶａ−ｂ、Ｖａ−ｂ、及びＶＩａ−ｂにおいて、式中、
ｘは、例えば、１、２、３、４、５、又は６、好ましくは２であり得る。
Ｌｉｎｋ１は、例えば、Ｇ、βＡ、−ＣＯＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、γ−アミノブタノイル、ＧＧ、−ＣＯ（ＣＨ２）ｍＳＣＨ２−（但し、リンク２＝−ＮＨ−の場合、ｍ＝１、２である。）、又は結合であってもよく、
Ｌｉｎｋ２は、例えば、−ＣＨ２−、ベンジル、エチルトリアゾリル、−ＮＨ−、又は結合であってもよく、
ｎは、例えば、１、２、又は３であってもよく、
Ｘは、例えば、−Ｓ−又は−ＣＨ２−であってもよく、
Ｚ３は、例えば、Ｉ又は結合であってもよく、
Ｚ４は、例えば、Ｋ、Ｓ、又はＲであってもよく、
Ｚ３０は、例えば、Ｌ、Ｗ、Ｋ（ｍＰＥＧ１６）、又はＫ（ｍＰＥＧ１２）であってもよく、
Ｚ３４は、例えば、Ｑであってもよく、当該Ｑは、任意に、アルファ−アミド窒素上でＮ−メチル化され、
Ｚ３５は、例えば、Ｒであってもよく、式中、当該Ｒは、任意に、アルファ−アミド窒素上でＮ−メチル化されるか、又はＲは脱カルボニル化されて、ｐｓｉ−（Ｚ３５Ｚ３６）アミド結合をもたらすか、又はＲは、アルファ−アミド窒素上でＮ−メチル化され、脱カルボニルされて、ｐｓｉ−（Ｚ３５Ｚ３６）アミド結合をもたらす両方であり、
Ｚ３６は、例えば、Ｙ（Ｔｙｒ）、Ｃｈａ（β−シクロヘキシルアラニン）、Ａｉｃ（２−アミノインダン−２−カルボン酸）又はＦ（Ｐｈｅ）であってもよく、当該Ｆは、任意に、フルオロ（４−Ｆ−Ｐｈｅ）、クロロ（４−Ｃｌ−Ｐｈｅ）、ブロモ（４−ＢＢｒ−Ｐｈｅ）、ヨード（４−Ｉ−Ｐｈｅ）、アミノ（４−ＮＨ２−Ｐｈｅ）であってもよく、かつ
Ｌｉｎｋ３は、例えば、リジン側鎖への以下のアミド化：（ＰＥＧ）８−トリアゾリル−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−ＰＥＧ４（
Figure 2020510606
 を含む）、２〜２４ＰＥＧ単位のＰＥＧ鎖（
Figure 2020510606
 を含む）、２〜１０個の炭素原子を含有するアルキル鎖（
Figure 2020510606
 を含む）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｊ（式中、Ｊ＝１〜４）、（ＡｌａＰｒｏ）ｕ（式中、ｕ＝１〜１０）のうちのいずれかを含み得るか、又は−ＮＨ−リンク３−は結合によって置換され得る、複合体である。
実施形態６は、環状ＰＹＹペプチドが、配列番号１〜１００からなる群から選択される、実施形態１に記載の複合体である。
実施形態７は、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片が、リンカーを介して、環状ＰＹＹペプチドのリジン残基において、環状ＰＹＹペプチドに共有結合している、実施形態１〜６のいずれか１つに記載の複合体である。
実施例８は、リンカーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）８−トリアゾリル−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−ＰＥＧ４、２〜２４ＰＥＧ単位のＰＥＧ鎖、２〜１０個の炭素原子を含有するアルキル鎖、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｊ（式中、ｊ＝１〜４）、（ＡｌａＰｒｏ）ｕ（式中、ｕ＝１〜１０）、及び結合からなる群から選択される１つを含む、実施例７に記載の複合体である。
実施形態９は、式Ｉ中のＺ７、Ｚ９、Ｚ１１、Ｚ２２、及びＺ２３のうちの１つのみがリジンであり、このリジンは、リンカーを介して、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片の改変システイン残基に共有結合している、実施形態８に記載の複合体である。
実施形態１０は、環状ＰＹＹペプチドに結合されたモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含む複合体であって、配列番号１０２〜１２７からなる群から選択される構造又はその薬学的に許容される塩を含み、
ｍＡｂが、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片を表し、］２が、１つ又は２つの環状ＰＹＹペプチドがｍＡｂに共有結合により複合されていることを表す、複合体である。
実施形態１１は、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片が、配列番号１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、及び１４６のポリペプチド配列をそれぞれ有する重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、並びに軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の複合体である。
実施形態１２は、単離されたモノクローナル抗体が、配列番号１３７のポリペプチド配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号１３９のポリペプチド配列を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む、実施形態１１に記載の複合体である。
実施形態１３は、Ｆｃ部分を更に含む、実施形態１２に記載の複合体である。
実施形態１４は、配列番号１３８のポリペプチド配列を有する重鎖（ＨＣ）と、配列番号１４０のポリペプチド配列を有する軽鎖（ＬＣ）とを含む、実施形態１３に記載の複合体である。
実施形態１５は、環状ＰＹＹペプチドの側鎖、好ましくは環状ＰＹＹペプチドのリジン残基のアミノ側鎖上に導入される求電子物質、好ましくはブロモアセトアミド又はマレイミドを、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片の配列番号１４３のシステイン残基のスルフヒドリル基と反応させ、それにより、環状ＰＹＹペプチドとモノクローナル抗体又はその抗原結合断片との間に共有結合による連結を創出することを含む、実施形態１〜１４のいずれか１つに記載の複合体の生成方法である。
実施形態１６は、実施形態１〜１４のいずれか１つに記載の複合体と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物である。
実施形態１７は、肥満を治療又は予防をそれを必要とする対象に行う方法であって、有効量の実施形態１６に記載の医薬組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む方法である。
実施形態１８は、有効量の薬学的組成物の投与をそれを必要とする対象に行うことが、医薬組成物の投与前の対象の体重と比較して、約５％〜約１０％、約１０％〜約１５％、約１５％〜約２０％、又は約２０％〜約２５％の体重減少をもたらす、実施形態１７に記載の方法である。
実施例１９は、疾患又は障害の治療又は予防をそれを必要とする対象に行う方法であって、当該疾患又は障害が、肥満、Ｉ型又はＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、耐糖能異常、高血糖症、高インスリン血症、高トリグリセリド血症、先天性高インスリン症（ＣＨＩ）による低血糖、脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性腎症、並びに管理されていないコレステロール及び／若しくは脂質レベルに関連する高血圧及び心血管危険因子などの他の心血管危険因子、骨粗鬆症、炎症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、腎疾患、並びに湿疹からなる群から選択され、治療又は予防を必要とする対象に有効量の実施形態１６に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法である。
実施形態２０は、当該疾患又は障害が肥満である、実施形態１９に記載の方法である。
実施形態２１は、当該疾患又は障害がＩ型糖尿病である、実施形態１９に記載の方法である。
実施形態２２は、当該疾患又は障害がＩＩ型糖尿病である、実施形態１９に記載の方法である。
実施形態２３は、当該疾患又は障害がメタボリックシンドロームである、実施形態１９に記載の方法である。
実施形態２４は、当該疾患又は障害が腎疾患である、実施形態１９に記載の方法である。
実施形態２５は、当該疾患又は障害が非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である、実施形態１９に記載の方法である。
実施形態２６は、当該疾患又は障害が非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）である、実施形態１９に記載の方法である。
実施形態２７は、食物摂取の低減をそれを必要とする対象に行う方法であって、それを必要とする対象に有効量の実施形態１６に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法である。
実施形態２８は、有効量の医薬組成物の投与をそれを必要とする対象に行うことが、医薬組成物の投与前の対象の食物摂取と比較して、約５％〜約１０％、約１０％〜約１５％、約１５％〜約２０％、約２０％〜約２５％、約２５％〜約３０％、約３０％〜約３５％、約３５％〜約４０％、約４０％〜約４５％、又は約４５％〜約５０％の食物摂取の低減をもたらす、実施形態２７に記載の方法である。
実施形態２９は、Ｙ２受容体活性の調節をそれを必要とする対象に行う方法であって、それを必要とする対象に有効量の実施形態１６に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法である。
実施形態３０は、医薬組成物が、注射により投与される、実施形態１７〜２９のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３１は、注射剤が、皮下、筋肉内、腹腔内、又は静脈内に送達される、実施形態３０に記載の方法である。
実施形態３２は、医薬組成物が、第２の治療薬と組み合わせて投与される、実施形態１７〜３１のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３３は、疾患又は障害が、肥満、２型糖尿病、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、及び脂質異常症からなる群から選択され、第２の治療薬が少なくとも１つの抗糖尿病薬である、実施形態３２に記載の方法である。
実施形態３４は、当該抗糖尿病薬が、グルカゴン様ペプチド−１受容体調節因子である、実施形態３３に記載の方法である。
実施形態３５は、第２の治療薬がリラグルチドである、実施形態３２に記載の方法である。
実施形態３６は、医薬組成物が、それを必要とする対象に毎日、毎週、又は毎月投与される、実施形態１７〜３５のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態３７は、医薬組成物が、１日に１回、２回、３回、４回、５回、又は６回投与される、実施形態３６に記載の方法である。
実施形態３８は、医薬組成物が、週に１回、２回、３回、４回、５回、又は６回投与される、実施形態３６に記載の方法である。
実施形態３９は、医薬組成物が、月に１回、２回、３回、又は４回投与される、実施形態３６に記載の方法である。
実施形態４０は、実施形態１〜１４のいずれか１つに記載の複合体又は実施形態１６の医薬組成物を含むキットであり、好ましくはキットは、有効量の第２の治療薬を更に含み、より好ましくは、キットは、有効量のリラグルチドを更に含む。
実施形態４１は、キットが注入デバイスを更に含む、実施形態４０に記載のキットである。
実施形態４２は、実施形態１〜１４のいずれか１つに記載の複合体を含む医薬組成物の生成方法であって、複合体を薬学的に許容される担体と組み合わせて医薬組成物を得ることを含む、方法である。
合成
本発明の化合物又は複合体は、当業者に知られる一般的な合成法に従って合成することができる。以下の合成の説明は、例示目的のためのものであり、決して本発明の限定を意図するものではない。
本発明のＮＴＳＣ環状ＰＹＹ（ＮＴＳＣ−ＰＹＹ）類似体又は誘導体は、アミノ酸間の連続するペプチド連結を形成するための様々な既知の従来の手順によって合成することができ、自動化されたペプチド合成装置、従来のベンチ合成、又は両方のアプローチの組み合わせを使用して、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９６３，８５，２１４９〜２１５４）により一般的に記載されるように、優先的に固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により行われる。ペプチド合成のための従来の手順は、１つのアミノ酸残基の遊離アミノ基（その他の反応性官能基は好適に保護されている）と別のアミノ酸の遊離カルボキシル基（その反応性官能基も好適に保護されている）との間の縮合を伴う。ペプチド結合形成に典型的に利用される縮合剤の例としては、１−ヒドロキシベンズトリアゾール（ＨＯＢＴ）又はエチルシアノ（ヒドロキシイミノ）アセテート（Ｏｘｙｍａ Ｐｕｒｅ）を有する又は有しないジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、２−（１Ｈ−７−アザベンズトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、２−（６−クロロ−１Ｈ−ベンズトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）、１−シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチリデンアミノオキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＯｘｉｍ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアミニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）ブロモ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｒｏＰ）などが挙げられる。
自動化されたペプチド合成方法論は、Ｙｕ（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，５７，４７８１〜４７８４）により説明され、Ｐａｌａｓｅｋ（Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．，２００７，１３，１４３〜１４８）により近年改良されるように、好ましくはマイクロ波加熱を適用することにより、室温又は高温で行われ得る。
本発明の化合物（Ｃ末端アミド）は、好適な保護されたＮ−α−ＦＭＯＣ保護されたアミノ酸のカルボキシ末端が、好適な結合剤を使用して従来の固相樹脂上に結合される、Ｎ−α−ＦＭＯＣ（９−フルオロエニルメチルオキシカルボニル）保護されたアミノ酸方法論を用いて、便宜上調製することができる。好適な従来の市販の固相樹脂としては、ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂、ＲｉｎｋアミドＡＭ樹脂、Ｔｅｎｔａｇｅｌ Ｓ ＲＡＭ Ｒｅｓｉｎ、ＦＭＯＣ−ＰＡＬ−ＰＥＧ ＰＳ樹脂、ＳｐｈｅｒｉＴｉｄｅ Ｒｉｎｋアミド樹脂、ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ Ｒｉｎｋ樹脂、Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂、ＴＧ Ｓｉｅｂｅｒ樹脂などが挙げられる。次いで、樹脂結合されたＦＭＯＣ−アミノ酸は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）又は１−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）のいずれか中の２０％ピペリジンへの曝露によって脱保護されてもよく、その処理は、ＦＭＯＣ保護基を選択的に除去する役割を果たす。次いで、追加のＦＭＯＣ保護されたアミノ酸は、続いて順次結合及び脱保護され、それによって所望の樹脂結合された、保護されたペプチドを生成する。ある特定の場合では、ＦＭＯＣ脱保護条件に耐えるであろうペプチド配列中の別のアミンに対して直交反応性保護基を利用することが必要であり得る。４−メチルトリチル（Ｍｔｔ）又は４−メトキシトリチル（Ｍｍｔ）のような保護基は、いずれも１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／ジクロロメタン（ＤＣＭ）処理によって除去可能であるか、又は好ましくはアリルオキシカルボニル（ａｌｌｏｃ；Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０））／ＰｈＳｉＨ３（フェニルシラン）処理により除去可能）、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロへクス−１−イリデン）エチル（Ｄｄｅ；２〜３％ヒドラジン／ＤＭＦで処理することによって除去可能）、及び１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロへクス−１−イリデン）−３−メチルブチル（ｉｖＤｄｅ；２〜３％ヒドラジン／ＤＭＦで処理することによって除去可能）が、そのような場合に効果的に使用され得る。
従来のペプチド合成方法論では、アルファアミノ酸の反応性側鎖は、一般的に、結合及び脱保護プロトコルに対してそれらを不活性にするために、好適な保護基で合成を通して保護される。アミノ酸側鎖のための複数の保護基が当該技術分野において既知であるが、本明細書では、以下の保護基が最も好ましい：セリン、スレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、及びチロシンにはｔｅｒｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）；アスパラギン、グルタミン、システイン、ホモシステイン、及びヒスチジンにはトリチル（Ｔｒｔ）；トリプトファン及びリジンのε−アミノ基にはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）；並びにアルギニンには２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（Ｐｂｆ）。これらの保護基は、高濃度のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）などの強酸処理により除去される。
ＳＰＰＳが完了すると、樹脂結合された側鎖保護されたペプチドは、脱保護され、トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）、水、フェノール、及びアニソールなどの様々な組み合わせのカルボカチオン掃去剤と共に、主に（ＴＦＡ）からなる切断カクテルを使用して、樹脂から同時に切断される。次いで、ペプチド／カクテル濾液を冷エーテルで沈殿させることにより、粗固体ペプチドを単離する。Ｓｉｅｂｅｒ樹脂結合された保護されたペプチドの特別な場合では、樹脂からの保護されたペプチドの切断は、側鎖脱保護を引き起こすことなく、ＤＣＭ中１〜２％ ＴＦＡで繰り返し処理すると有利にもたらされ得る。単離されたら、保護されたペプチドの更なる操作は、溶液相反応において行われてもよい。最後に、保護されたペプチドは、切断カクテルを用いた別個の処理を使用して、全体的に脱保護され、上記のように沈殿されてもよい。次いで、このようにして得られた粗ペプチドを、アセトニトリル又はエタノールなどの有機共溶媒を含有する主に水性溶媒系中に低濃度（約＜４ｍｇ／ｍＬ）で溶解する。溶液のｐＨを＞５に上昇させると、次にペプチドは分子内環化反応を経て、本発明の対応する粗ＮＴＳＣ ＰＹＹ類似体を形成する。このように形成されたＮＴＳＣ ＰＹＹ類似体は、当該技術分野において一般的に既知の精製技術を使用して精製することができる。本明細書で使用されるペプチド精製の好ましい方法は、逆相高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）である。次いで、精製されたペプチドは、液体クロマトグラフィ／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）によって特徴付けられる。
本明細書に記載の以下の実施例及び実施形態は例示の目的のみであって、それらを考慮した様々な修正又は変更が当業者に提示され、本出願の趣旨及び範囲、並びに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが理解される。本明細書で引用される全ての発行物、特許、及び特許出願は、全ての目的においてそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一般的スキーム
Ｃ末端アミドＮＴＳＣ−ＰＹＹペプチドの合成のための一般的な合成手順は、２０１６年１０月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／４１３，６１３号、及び代理人整理番号ＰＲＤ３４１１で本出願と同日に出願された「Ｃｙｃｌｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ａｓ ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」と題した米国特許出願第＿＿＿＿＿＿号に記載されている。両出願の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
実施例１：環状ＰＹＹ類似体配列番号１の合成
Figure 2020510606
スキーム１４．Ｆｍｏｃ−ｐｓｉ−［Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−（Ｎ−Ｂｏｃ）Ｔｙｒ（ｔＢｕ）］−ＯＨの合成
１．Ｆｍｏｃ−ｐｓｉ−［Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−（Ｎ−Ｂｏｃ）Ｔｙｒ（ｔＢｕ）］−ＯＨの合成
Ａ．Ｈ２Ｎ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＡｌｌの合成
氷冷したＤＭＦ（５００ｍＬ）中のＦｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｏ（６９ｇ、１５０．１５ｍｍｏｌ）及びＫ２ＣＯ３（６２ｇ、４４５．３６ｍｍｏｌ）の溶液に、臭化アリル（７２ｇ、５９５．１６ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を３時間混合した。次いで、氷／水（１Ｌ）を添加し、混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下で濃縮して、黄色の油状物としてＦｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＡｌｌを得た。氷冷したＤＭＦ（６００ｍＬ）中のＦｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＡｌｌ（７０ｇ、１４０．１ｍｍｏｌ）の溶液に、ピペリジン（１５０ｍＬ）を２０分かけて滴下して添加した。３時間後、反応溶液を水／氷（１Ｌ）に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（２×２Ｌ）で抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下で濃縮した。このようにして得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィにより精製し、ＥｔＯＡｃ／石油エーテル（１０：１）で溶出して、黄色の油状物として３４ｇのＨ２Ｎ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＡｌｌを得た。
Ｂ．Ｆｍｏｃ Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｎ（Ｍｅ）ＯＭｅ（２）のＦ合成の合成
氷冷したＤＣＭ（５００ｍＬ）中のＦｍｏｃ Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ（１）（６４．８ｇ、９９．８８ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩（２０ｇ、２０６．２ｍｍｏｌ）、及びＨＡＴＵ（５７ｇ、１４９．９１ｍｍｏｌ）の混合物に、ＤＩＥＡ（５２ｇ、４０２．２ｍｍｏｌ）を１０分かけて滴下して添加し、得られた混合物を室温で一晩撹拌した。次いで、反応物を水／氷（１Ｌ）に注ぎ、ＤＣＭ（１Ｌ）で抽出した。有機抽出物を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下で濃縮して、黄色の固体として７０ｇの粗Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｎ（Ｍｅ）ＯＭｅ（２）を得て、これを更に精製することなく使用した。
Ｃ．Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＣＨＯ（３）の合成
窒素の不活性雰囲気下で、冷却した（−７８℃）ＴＨＦ（１Ｍ、１０７ｍＬ、０．１０７ｍｍｏｌ）中のＬＡＨの溶液に、カニューレを通して、冷却した（−５０℃）ＴＨＦ（１００ｍＬ）中のＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｎ（Ｍｅ）ＯＭｅ（２）（５０ｇ、７２．３ｍｍｏｌ）の溶液を１時間かけて滴下して添加した。−７８℃で５時間撹拌した後、混合物を１Ｎ ＨＣｌ溶液（３００ｍＬ）に注ぎ、必要に応じて追加の１Ｎ ＨＣｌを添加してｐＨを４に調整し、次いでＥｔＯＡｃ（２×２Ｌ）で抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下で濃縮して、黄色の固体として４５ｇの粗Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＣＨＯ（３）を得て、これを更に精製することなく使用した。
Ｄ．Ｆｍｏｃ−ｐｓｉ−［Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）］−ＯＡｌｌ（４）の合成
氷冷したＴＨＦ（２００ｍＬ）中の工程ＣのＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＣＨＯ（３）（４５ｇ、７１．１２ｍｍｏｌ）及び工程ＡのＨ２Ｎ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＡｌｌ（３２ｇ、１１５．３７ｍｍｏｌ）、ＭｅＯＨ（２００ｍＬ）、並びにＨＯＡｃ（１５ｍＬ）の溶液に、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（１８．０ｇ、２８６．４ｍｍｏｌ）を３０分かけて少しずつ添加し、得られた溶液を室温で一晩撹拌した。飽和水性ＮａＨＣＯ３（５００ｍＬ）溶液を添加して反応をクエンチし、混合物をＥｔＯＡｃ（２×２Ｌ）で抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下で濃縮した。残渣を、ＥｔＯＡｃ／石油エーテル（１０：１）で溶出させるシリカゲルクロマトグラフィにより精製して、黄色の固体として４０ｇのＦｍｏｃ−ｐｓｉ−［Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）］−ＯＡｌｌ（４）を得た。
Ｅ．Ｆｍｏｃ−ｐｓｉ−［Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｎ（Ｂｏｃ）Ｔｙｒ（ｔＢｕ）］−ＯＡｌｌ（５）の合成
ＭｅＣＮ（２４０ｍＬ）中のＦｍｏｃ−ｐｓｉ−［Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＡｌｌ］（４）（５３ｇ、５９．２８ｍｍｏｌ）の溶液に、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボナート（２０ｇ、９１．３ｍｍｏｌ）を添加し、得られた溶液を５０℃で一晩撹拌した。次いで、混合物を減圧下で濃縮し、残渣を、ＥｔＯＡｃ／石油エーテル（１：１）で溶出させるシリカゲルクロマトグラフィにより精製して、黄色の固体として３２ｇのＦｍｏｃ ｐｓｉ−［Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｎ（Ｂｏｃ）Ｔｙｒ（ｔＢｕ）］−ＯＡｌｌ（５）を得た。
Ｆ．Ｆｍｏｃ−ｐｓｉ−［Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｎ（Ｂｏｃ）Ｔｙｒ（ｔＢｕ）］−ＯＨ（６）の合成
窒素の不活性雰囲気下で、冷却した（−３０℃）ＤＣＭ（６００ｍＬ）中のＦｍｏｃ−ｐｓｉ−［Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｎ（Ｂｏｃ）Ｔｙｒ（ｔＢｕ）］−ＯＡｌｌ（５）（３２ｇ、３２ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（３．０ｇ、４．３３ｍｍｏｌ）を添加して、続いてＮ−メチルアニリン（１０ｇ、９３ｍｍｏｌ）を３０分かけて滴下して添加した。得られた混合物を室温で２時間撹拌した後、減圧下で濃縮した。残渣を、ＥｔＯＡｃ／石油エーテル（１：１）で溶出させるシリカゲルクロマトグラフィにより精製して、黄色がかった固体として２６．８ｇのＦｍｏｃ−ｐｓｉ−［Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｎ（Ｂｏｃ）Ｔｙｒ（ｔＢｕ）］−ＯＨ（６）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ７．７５〜７．７７（２Ｈ，ｍ），７．５９〜７．６０（２Ｈ，ｍ），７．３２〜７．３３（４Ｈ，ｍ），７．０９〜７．１１（２Ｈ，ｍ），６．８７〜７．００（２Ｈ，ｍ），４．２７〜４．５０（３Ｈ，ｍ），３．３０〜３．５０（４Ｈ，ｍ），３．０２〜３．２３（３Ｈ，ｍ），２．７５〜２．９８（３Ｈ，ｍ），２．５７（３Ｈ，ｓ），２．４８（３Ｈ，ｓ），２．００（３Ｈ，ｓ），１．３１〜１．４１（２８Ｈ，ｍ）。ＬＣ／ＭＳ（ＥＳ，ｍ／ｚ）：Ｃ５２Ｈ６７Ｎ５Ｏ１０Ｓの質量計算値：９５３．４６、実測値：９５４．５５［Ｍ＋Ｈ］＋。
２．ジペプチドＦｍｏｃ−ｐｓｉ−（Ｒ３５−Ｎ（Ｂｏｃ）−Ｙ３６）のＳｉｅｂｅｒ樹脂上への充填
フリット化されたマイクロ波反応槽（ＣＥＭ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより供給される）中で、ＮｏｖａＳｙｎ ＴＧ Ｓｉｅｂｅｒ樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍにより供給される）（０．２ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１０ｍＬ）中２０％ピペリジンで処理し、ＣＥＭマイクロ波反応器中で５０℃で２．５分間加熱した。反応物を排出し、樹脂をＤＭＦで洗浄し、ＣＥＭマイクロ波反応器中で、５０℃で５分間、ＤＭＦ中２０％ピペリジンで再度処理した。排出し、ＤＭＦで洗浄した後、脱保護処理をもう１回繰り返した。次いで、樹脂を、ＤＭＦ（４ｍＬ）中の上記から得たＦｍｏｃ−ｐｓｉ−［Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−（Ｎ−Ｂｏｃ）Ｔｙｒ（ｔＢｕ）］−ＯＨ（３〜５当量）、ＨＡＴＵ（２．７５〜４．８当量）、及びＤＩＥＡ（６〜１０当量）の溶液で処理し、室温で６〜２４時間混合した。混合物を排出し、樹脂をＤＭＦで十分に洗浄した後、５０℃で５分間、マイクロ波条件下で、ＤＭＦ（５ｍＬ）中２０％ Ａｃ２Ｏで処理することにより末端保護した。反応物を排出し、樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄した。
３．Ｆｍｏｃ−βＡ−ＩＫＰＥＡＰＧＥＫ（Ａｌｌｏｃ）ＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬ（ｈＣ）ＴＲＱ（ｐｓｉ−Ｒ３５Ｙ３６）−Ｓｉｅｂｅｒ樹脂の合成
事前充填された（ｐｓｉ−Ｒ３５，Ｙ３６）−Ｓｉｅｂｅｒ樹脂（０．２ｍｍｏｌ）上のアミノ酸延長をＣＥＭ Ｌｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅ Ｍｉｃｒｏｗａｖｅペプチド合成装置で実行した。標準的なα−Ｆｍｏｃ保護されたアミノ酸は、結合剤としてＨＢＴＵ／ＤＩＥＡを使用して、５０℃で１５分間、初期樹脂充填に対して３．８倍過剰で二重結合された。Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨを、室温で２５分、続いて５０℃で１５分の２段階プロトコルを用いて二重結合し、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨを、室温で４分、続いて５０℃で８分間の２段階プロトコルを用いて二重結合した。
４．Ｆｍｏｃ−βＡ−ＩＫＰＥＡＰＧＥＫ（ＮＨ２）ＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬ（ｈＣ）ＴＲＱ（ｐｓｉ−Ｒ３５Ｙ３６）−Ｓｉｅｂｅｒ樹脂の合成：Ａｌｌｏｃ脱保護
上記から得られた樹脂を、脱酸素化ＤＣＭ（１０ｍＬ）中のフェニルシラン（２５当量）の溶液で処理した。約２分間撹拌した後、ＤＣＭ（１０ｍＬ）中のＰｄ（ＰＰｈ３）４（０．５当量）の溶液を添加し、樹脂混合物をアルゴン下で３０分間撹拌した。反応物を排出し、樹脂を脱酸素化ＤＣＭで洗浄した。脱保護を新しい試薬で繰り返し、その後、反応物を排出し、樹脂をＤＣＭ及びＤＭＦで十分に洗浄した。
５．Ｆｍｏｃ−βＡ−ＩＫＰＥＡＰＧＥＫ（ＮＨ−ｄＰＥＧ１２−ＮＨＦｍｏｃ）ＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹ ＡＳＬＲＨＹＬＮＬ（ｈＣ）ＴＲＱ（ｐｓｉ−Ｒ３５Ｙ３６）−Ｓｉｅｂｅｒ樹脂の合成：Ｎ−Ｆｍｏｃ ｄＰＥＧ１２カルボン酸の１１Ｋへの結合
上記のＡｌｌｏｃ脱保護されたペプチド−Ｓｉｅｂｅｒ樹脂を、ＣＥＭマイクロ波条件下で、５０℃で１５分間、ＤＭＦ（７ｍＬ）中のＮ−Ｆｍｏｃ−ｄＰＥＧ１２−カルボン酸（５当量）、ＨＢＴＵ（４．８当量）、及びＤＩＥＡ（１０当量）の溶液で処理し、その時点までに、反応は負のＫａｉｓｅｒ試験を示した。反応物を排出し、樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄した。
６．ＢｒＣＨ２ＣＯＨＮ−βＡ−ＩＫＰＥＡＰＧＥＫ（ＮＨ−ｄＰＥＧ１２−ＮＨＣＯＣＨ２Ｂｒ）ＡＳＰＥＥＬ ＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬ（ｈＣ）ＴＲＱ（ｐｓｉ−Ｒ３５Ｙ３６）−Ｓｉｅｂｅｒ樹脂の合成：βＡ及びｄＰＥＧ１２におけるビス−ブロモアセチル化
上記の樹脂を、ＣＥＭマイクロ波反応器中で、５０℃で５分間、ＤＭＦ中の新しい２０％ピペリジンを使用して、Ｆｍｏｃ脱保護を行った。脱保護を２回繰り返した。このようにして得られたＦｍｏｃ脱保護されたペプチド樹脂を、ＣＥＭマイクロ波反応器中で、５０℃で１０分間、ＤＭＦ（５ｍＬ）中のブロモ酢酸無水物（２０当量）の溶液で処理し、その時点までに、反応は負のＫａｉｓｅｒ試験を示した。反応物を排出し、樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄した後、乾燥させた。
７．ＢｒＣＨ２ＣＯＨＮ−βＡ−ＩＫＰＥＡＰＧＥＫ（ＮＨ−ｄＰＥＧ１２−ＮＨＣＯＣＨ２Ｂｒ）ＡＳＰＥＥＬ ＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬ（ｈＣ）ＴＲＱ（ｐｓｉ−Ｒ３５Ｙ３６）−ＣＯＮＨ２の合成：樹脂からの切断及び全体的な脱保護
乾燥させた樹脂を、ＤＣＭ（１０ｍＬ）中１．５％ ＴＦＡの溶液で処理し、５〜１０分間混合した後、濾過した。各処理に新しいカクテルを使用して、この処理を更に９回繰り返した。次いで、合わせた濾液を合わせ、濃縮して、黄色の発泡体として保護された粗ペプチドを得た。この発泡体を、室温で２．５時間、２０ｍＬの切断カクテル（ＴＦＡ／フェノール／Ｈ２Ｏ／ＴＩＰＳ＝８８／５／５／２）で処理し、次いで窒素流下で約２．５ｍＬの体積に濃縮し、次いで、冷エーテル（４０ｍＬ）を添加してペプチドを沈殿させた。混合物を遠心分離し（５分間、５０００ｒｐｍ）、デカントした。このプロセスを更に２回繰り返して、オフホワイト色の粉末として粗ペプチドを得た。
あるいは、樹脂を、ＤＣＭ中１〜２％ ＴＦＡで前処理することなく、切断カクテルで処理して、完全に脱保護されたペプチドを得た。
８．環状ＰＹＹ類似体配列番号１：環化手順Ａ及び精製
上記の粗ペプチドを脱酸素化５０％ ＭｅＣＮ／水（５〜１０ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、ＥＤＴＡ（１ｍＭ）を任意に添加した。次いで、７．５ｗ／ｖ％ ＮａＨＣＯ３溶液を添加して、反応溶液のｐＨを約８に上昇させた。得られた溶液を室温で０．５〜２．５時間撹拌した後、ＴＦＡを添加することによってｐＨ＜１に酸性化した。次いで、室温の減圧下で、溶液を元の体積の約半分（約２４ｍＬ）に濃縮した。得られた溶液を逆相分取ＨＰＬＣにより精製した。Ｖａｒｉａｎ Ｐｕｒｓｕｉｔ ＸＲ Ｃ１８カラム（３０×２５０ｍｍ、１００Å、５μｍ）を使用して、Ｇｉｌｓｏｎ ＨＰＬＣ ２０２０ Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍで精製した。移動相は、緩衝液Ａ（水中０．１％ ＴＦＡ）、及び３６分かけて初期濃度２０％Ｂから最終濃度５０％Ｂの範囲の緩衝液Ｂ（ＭｅＣＮ中０．１％ ＴＦＡ）の勾配溶出からなった。ＵＶ検出は、２２０及び２５４ｎｍで監視された。生成物含有画分は、上記と同じカラムタイプ（４．６×２５０ｍｍ、５μｍ）を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣシステムで分析ＨＰＬＣによって分析された。純粋な画分を合わせ、次いで凍結乾燥させて、綿様の固体として生成物を得た。１２．２７分（ＬＣ：Ａｔｌａｎｔｉｓ Ｔ３ Ｃ１８カラム、５ｕｍ、４．６×２５０ｍｍ、１．０ｍＬ／分、１５〜６０％勾配）での生成物のピークに関してＬＣＭＳ：１２２５．５（Ｍ＋４Ｈ）／４，１６３３．４（Ｍ＋３Ｈ）／３及び２４５０．０（Ｍ＋２Ｈ）／２。
実施例２：環状ＰＹＹ類似体配列番号２の合成
１．Ｈ２Ｎ−ＩＫＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬ（ｈＣ）ＴＲＱＲＹ−ＰＡＬ−ＰＥＧ樹脂の合成
保護されたペプチジル樹脂は、スキーム１に示されるように、上述のＦｍｏｃ戦略を使用して、０．１ｍｍｏｌスケールで、低充填Ｒｉｎｋアミド樹脂、好ましくはＦｍｏｃ−ＰＡＬ−ＰＥＧ ＰＳ樹脂（約０．１６〜０．２ｍｅｑ／ｇ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより供給される）を使用して、ＣＥＭ Ｌｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅ Ｍｉｃｒｏｗａｖｅペプチド合成装置で合成された。標準的なＦｍｏｃ保護されたアミノ酸は、結合剤としてＤＩＣ／Ｏｘｙｍａ及び４分間９０℃の反応温度を使用して、樹脂充填に対して５倍過剰で結合された。Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨを、それぞれ９０℃で４分間二重結合し、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨを、室温で４分間、続いて５０℃で８分間の２段階プロトコルを用いて結合した。１回のＦｍｏｃ脱保護を、ＤＭＦ中の２０％ピペリジン（脱保護溶液）を使用して、９０℃で１．５分間行った。
２．ｍ−ＢｒＣＨ２ＰｈＣＯＨＮ−ＩＫＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬ（ｈＣ）ＴＲＱＲＹ−ＰＡＬ−ＰＥＧ樹脂の合成
上記のＦｍｏｃ脱保護されたペプチド−樹脂（０．１ｍｍｏｌ）を、マイクロ波反応器中で、７５℃で１５分間、ＤＭＦ（４ｍＬ）中のｍ−ブロモメチル安息香酸（２０当量）及びＤＩＣ（１０当量）の溶液で処理し、その時点までに、Ｋａｉｓｅｒニンヒドリン試験により完了であると決定された（Ｋａｉｓｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９７０，３４，５９５〜５９８）。結合が不完全であると決定された場合結合は新しい試薬で繰り返された。反応物を排出し、樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄した。
３．ｍ−ＢｒＣＨ２ＰｈＣＯＨＮ−ＩＫＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬ（ｈＣ）ＴＲＱＲＹ−ＣＯＮＨ２の合成：脱保護及び樹脂からの切断
次いで、上記の樹脂を、ＴＦＡ／水／フェノール／ＴＩＰＳ（８８：５：５：２）からなる切断カクテル（１０ｍＬ／０．１ｍｍｏｌスケール）で処理し、マイクロ波反応器中で３８℃で４０分間加熱した後、濾過した。樹脂をＴＦＡで洗浄し、合わせた濾液を窒素流下で約２．５ｍＬの体積に濃縮し、ペプチドを、冷ジエチルエーテル（４０ｍＬ）を添加することにより沈殿させた。ペプチド／エーテル懸濁液を遠心分離し、エーテル層をデカントした。ペプチドペレットをエーテルに再懸濁し、遠心分離し、デカントし、このプロセスを３回繰り返した。このようにして得られた粗ペプチドを穏やかな窒素流下で乾燥させた。
４．環状ＰＹＹ類似体配列番号２：環化手順Ａ及び精製
上記の粗ペプチドを、≦４ｍｇ／ｍＬの濃度で脱酸素化ＭｅＣＮ／水（６０％ ＭｅＣＮ）に溶解した。次いで、ペプチド溶液のｐＨを、水性ＮＨ４ＯＡｃ（２００ｍＭ、ｐＨ８．４）を添加することにより約７〜９に上昇させ、得られた溶液を、ＬＣＭＳにより環化が完了するまで（典型的には３〜４時間）、室温で撹拌した。環化反応混合物を、ＴＦＡを添加することによりｐＨ１．５〜３に酸性化し、溶液を濃縮して、有機共溶媒の大部分をわずかな濁りが生じる点まで除去した。混合物を均質にするために必要に応じて最小限の量のＭｅＣＮを添加し戻し、次いで、得られた溶液を、Ｃ１８ Ｖａｒｉａｎ Ｐｕｒｓｕｉｔ ＸＲ Ｃ１８（２１×２５０ｍｍ、１００Å、５μｍ）カラムを使用して、複数回の注入で分取ＨＰＬＣによって直接精製した。移動相は、緩衝液Ａ（水中０．１％ ＴＦＡ）、及び４５分かけて初期濃度２０％Ｂから最終濃度４０％Ｂの範囲の緩衝液Ｂ（ＭｅＣＮ中０．１％ ＴＦＡ）の勾配溶出からなった。ＵＶ検出は、２２０及び２５４ｎｍで監視された。生成物含有画分は、適切なカラムを使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ＨＰＬＣシステムで分析ＨＰＬＣによって分析された。純粋な画分を合わせ、濃縮して有機相の大部分を除去した後、凍結乾燥させた。
実施例３：環状ＰＹＹ類似体配列番号３の合成
１．（Ｈ２Ｎ）−ＩＫＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬ−（アジド−ｎｏｒＬｅｕ）−ＴＲＱＲＹＰＡＬ−ＰＥＧ樹脂の合成
３１位のＦｍｏｃ−ｈＣｙｓ（ｔｒｔ）−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−アジドｎｏｒＬｅｕ−ＯＨを使用して、実施例２、工程１に記載の方法に従って、樹脂結合されたペプチドを０．１ｍｍｏｌスケールで調製した。
２．（ＨＣＣＨ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ）−ＩＫＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬ−（アジド−ｎｏｒＬｅｕ）−ＴＲＱＲＹＰＡＬ−ＰＥＧ樹脂の合成
ＤＩＣ／ＨＯＢＴプロトコル（７５℃、１０分間）を用いて、マイクロ波条件下で、４−ペンチン酸を上記の樹脂上に結合した。反応物を排出し、樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄した。
３．（ＨＣＣＨ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ）−ＩＫＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬ−（アジド−ｎｏｒＬｅｕ）−ＴＲＱＲＹＰＡＬ−ＣＯＮＨ２の合成
上記の樹脂を、マイクロ波条件下（３８℃、４０分間）下で、ＴＦＡ／ＤＯＤＴ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ（９２．５：２．５：２．５：２．５）からなる１０ｍＬの切断カクテルで処理した。反応物を排出し、樹脂をＴＦＡ（１０ｍＬ）で洗浄した。次いで、合わせた濾液を窒素流下で約２．５ｍＬの体積に濃縮した。次いで、冷エーテル（４０ｍＬ）を添加してペプチドを沈殿させ、混合物を遠心分離し（５分間、５０００ｒｐｍ）、デカントした。このプロセスを更に２回繰り返して、オフホワイト色の粉末として粗ペプチドを得た。
４．環状ＰＹＹアナログ配列番号３
２ｍＬの脱酸素化Ｈ２Ｏ中に７ｍｇのＣｕＳＯ４を調製する。５．４ｍＬのＥｔＯＨ及び０．６ｍＬのＭｅＣＮ中に３０ｍｇのＴＢＴＡを調製する。０．９４ｍＬのＣｕＳＯ４溶液及び４．８ｍＬのＴＢＴＡ溶液を予備混合する。３ｍＬの脱酸素化Ｈ２Ｏ中に３０ｍｇのアスコルビン酸Ｎａを調製する。
２０ｍＬの脱酸素化水中の工程３の粗アジド含有ペプチド（１００ｍｇ）の溶液に、予備混合したＣｕＳＯ４／ＴＢＴＡ溶液を添加し、続いて２．４ｍＬのアスコルビン酸Ｎａ溶液を添加した（溶液が直ちに乳白色になった）。混合物を４０℃に加温し、１．５時間撹拌し、この時点で、ＬＣＭＳ分析は完全な反応を示した。混合物を水（０．１％ ＴＦＡ）で約４０ｍＬに希釈し、混合物を遠心分離し、上清を逆相分取ＨＰＬＣにより精製した。精製は、Ｖａｒｉａｎ Ｐｕｒｓｕｉｔ ＸＲ Ｃ１８カラム（２１×２５０ｍｍ、１００Å、５μｍ）を使用して、３５℃で行った。移動相は、緩衝液Ａ（水中０．１％ ＴＦＡ）、及び初期濃度１０％Ｂから中間濃度１８％Ｂ（２１ｍｐｍ）、そして３５分かけて最終濃度３３％Ｂ（１０．５ｍｐｍ）の範囲の緩衝液Ｂ（ＭｅＣＮ中０．１％ ＴＦＡ）の勾配溶出からなった。ＵＶ検出は、２２０及び２５４ｎｍで監視された。生成物含有画分は、上記と同じカラムタイプ（４．６×２５０ｍｍ、５μｍ）を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣシステムで分析ＨＰＬＣによって分析された。純粋な画分を合わせ、次いで凍結乾燥させて、綿様の固体として生成物を得た。
実施例４：環状ＰＹＹ類似体配列番号４の合成
１．（Ｄｄｅ）Ｋ（ＮＨ２）ＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬ（ｈＣ）ＴＲＱＲＹ−ＰＡＬ−ＰＥＧ樹脂の合成
実施例２、工程１に記載の方法を用い、樹脂結合されたペプチドを調製した。
２．（Ｄｄｅ）Ｋ（ＮＨ−Ｇｌｕ−（ＯｔＢｕ）ＮＨ２）ＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬ（ｈＣ）ＴＲＱＲＹ−ＰＡＬ−ＰＥＧ樹脂の合成
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ（５当量）を、マイクロ波条件下で、ＤＩＣ／Ｏｘｙｍａ結合方法（９０℃、６分間、ｄｃ）を用いて上記の樹脂上に結合させた。樹脂を排出し、ＤＭＦで洗浄した。次いで、Ｆｍｏｃ脱保護を、３段階プロトコル（７５℃で０．５分間、７５℃で３分間、７５℃で３分間）を用いて（各段階でＤＭＦ洗浄を行う）、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを使用して行った。
３．（Ｄｄｅ）Ｋ（ＮＨ−Ｇｌｕ−（ＯｔＢｕ）ＮＨ−Ｐａｌ）ＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬ（ｈＣ）ＴＲＱＲＹ−ＰＡＬ−ＰＥＧ樹脂の合成
パルミチン酸（５当量）を、マイクロ波条件下で、ＤＩＣ／Ｏｘｙｍａ結合方法（９０℃、５分）を用いて上記の樹脂上に結合させた。樹脂を排出し、ＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄した。
４．（Ｈ２Ｎ）Ｋ（ＮＨ−Ｇｌｕ−（ＯｔＢｕ）ＮＨ−Ｐａｌ）ＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬ（ｈＣ）ＴＲＱＲＹ−ＰＡＬ−ＰＥＧ樹脂の合成
上記の樹脂をＤＭＦで洗浄した後、室温で５分間、ＤＭＦ中２％ヒドラジンの溶液（６ｍＬ／０．１ｍｍｏｌ樹脂）で処理し、次いで排出し、ＤＭＦで洗浄した。処理を更に５回繰り返した。
５．（Ｈ２Ｎ）ＩＫＰＥＡＰＧＥＫ（ＮＨ−Ｇｌｕ−（ＯｔＢｕ）ＮＨ−Ｐａｌ）ＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬ（ｈＣ）ＴＲＱＲＹ−ＰＡＬ−ＰＥＧ樹脂の合成
残りのアミノ酸結合は、実施例２、工程１に記載の方法を用いて行われた。
６．環状ＰＹＹ類似体配列番号４
実施例２、工程２〜４に記載の方法を用いて、残りの合成を行った。生成物の精製は、Ｖａｒｉａｎ Ｐｕｒｓｕｉｔ ＸＲＳ Ｃ１８カラム（２１×２５０ｍｍ、１００Å、５μｍ）を使用して、室温で行った。移動相は、緩衝液Ａ（水中０．１％ ＴＦＡ）、及び５分かけて２３％Ｂから中間濃度３３％Ｂ（２１ｍｐｍ）、そして５５分かけて最終濃度４８％Ｂ（１０．５ｍｐｍ）の範囲の緩衝液Ｂ（ＭｅＣＮ中０．１％ ＴＦＡ）の勾配溶出からなった。
実施例５：環状ＰＹＹ類似体配列番号５の合成
工程３においてパルミチン酸の代わりにα−トコフェリルオキシ酢酸（ＡｃＶｉｔＥ）（８）を使用して、実施例４に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。生成物の精製は、Ａｇｉｌｅｎｔ ３００ＳＢ Ｃ８カラム（２１×２５０ｍｍ、１００Å、５μｍ）を使用して、室温で行った。移動相は、緩衝液Ａ（水中０．１％ ＴＦＡ）、及び５分かけて初期濃度３５％Ｂから中間濃度４５％Ｂ（２１ｍｐｍ）、そして６０分かけて最終濃度６０％Ｂ（１０．５ｍｐｍ）の範囲の緩衝液Ｂ（ＭｅＣＮ中０．１％ ＴＦＡ）の勾配溶出からなった。
実施例６：環状ＰＹＹ類似体配列番号６の合成
１．（ＨＣＣＨ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ）−ＩＫＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＫ（Ｄｄｅ）−（アジド−ｎｏｒＬｅｕ）−ＴＲＱＲＹ−ＰＡＬ−ＰＥＧ樹脂の合成
樹脂結合されたペプチドは、実施例３、工程１に記載されるように、３０位のＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨを使用し、この工程において、３位のＦｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨの後に、２位に４−ペンチン酸（二重結合される）を組み込み、調製された。
２．（ＨＣＣＨ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ）−ＩＫＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＫ（ＮＨ２）−（アジド−ｎｏｒＬｅｕ）−ＴＲＱＲＹ−ＰＡＬ−ＰＥＧ樹脂の合成
上記の樹脂を、室温で５分間、ＤＭＦ中３％ヒドラジン（８ｍＬ／０．１ｍｍｏｌスケール）で処理し、次いで混合物を排出し、ＤＭＦで洗浄した。この手順を約５回繰り返し、その後、樹脂をＤＭＦで、次いでＤＣＭで十分に洗浄した。
３．（ＨＣＣＨ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ）−ＩＫＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＫ（ＮＨ−γ−Ｇｌｕ−ＡｃＶｉｔＥ）−（アジド−ｎｏｒＬｅｕ）−ＴＲＱＲＹ−ＰＡＬ−ＰＥＧ樹脂の合成
実施例２、工程１に記載の結合手順を用いて、５分間の結合時間で、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕを上記の樹脂上に結合した。樹脂を、３段階マイクロ波プロトコル（７５℃、０．５分間；７５℃、３分間；７５℃、３分間）を用いて、ＤＭＦ中２０％ピペリジンで処理することにより脱保護し、その後、樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄した。次いで、α−トコフェリルオキシ酢酸（ＡｃＶｉｔＥ）（８）を、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕの結合に使用した同じ手順を用いて、樹脂上に結合した。
４．（ＨＣＣＨ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ）−ＩＫＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＫ（ＮＨ−γ−Ｇｌｕ−ＡｃＶｉｔＥ）−（アジド−ｎｏｒＬｅｕ）−ＴＲＱＲＹ−ＣＯＮＨ２の合成
上記の樹脂からのペプチドの切断及び沈殿は、実施例３、工程３に記載の手順を用いて行った。
５．環状ＰＹＹ類似体配列番号６
実施例３、工程４に記載の手順を用いて、表題化合物を調製した。生成物の精製は、Ｖａｒｉａｎ Ｐｕｒｓｕｉｔ ＸＲ Ｃ８カラム（２１×２５０ｍｍ、１００Å、５μｍ）で、３５℃で行った。移動相は、緩衝液Ａ（水中０．１％ ＴＦＡ）、及び５分かけて初期濃度３５％Ｂから中間濃度４８％Ｂ（２１ｍｐｍ）、そして４０分かけて最終濃度６３％Ｂ（１０．５ｍｐｍ）の範囲の緩衝液Ｂ（ＭｅＣＮ中０．１％ ＴＦＡ）の勾配溶出からなった。
実施例７：環状ＰＹＹ類似体配列番号７の合成
１１位の代わりに９位に配置されたＫ（ＮＨ−γＧｌｕ−Ｐａｌ）残基を用いて、実施例４に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。生成物の精製は、Ａｇｉｌｅｎｔ ３００ＳＢ Ｃ８カラム（２１×２５０ｍｍ、１００Å、５μｍ）を使用して、室温で行った。移動相は、緩衝液Ａ（水中０．１％ ＴＦＡ）、及び初期濃度２３％Ｂから中間濃度４３％Ｂ（２１ｍｐｍ）、そして４０分かけて最終濃度４３％Ｂ（１０．５ｍｐｍ）の範囲の緩衝液Ｂ（ＭｅＣＮ中０．１％ ＴＦＡ）の勾配溶出からなった。不純な生成物含有画分を、初期濃度２５％Ｂから中間濃度３５％Ｂ（２１ｍｐｍ）、そして８０分かけて最終濃度４５％Ｂ（１０．５ｍｐｍ）の勾配を使用して、室温で、Ｗａｔｅｒｓ Ｔ３ Ｃ１８カラム（２５０×１９ｍｍ、１００Å、５μｍ）上で再精製した。
実施例８：環状ＰＹＹ類似体配列番号８の合成
１１位の代わりに３０位に配置されたＫ（ＮＨ−γＧｌｕ−Ｐａｌ）残基を用いて、実施例４に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。生成物の精製は、Ａｇｉｌｅｎｔ ３００ＳＢ Ｃ８カラム（２１×２５０ｍｍ、１００Å、５μｍ）を使用して、３５℃で行った。移動相は、緩衝液Ａ（水中０．１％ ＴＦＡ）、及び初期濃度２１％Ｂから中間濃度３１％Ｂ（２１ｍｐｍ）、そして４０分かけて最終濃度４１％Ｂ（１０．５ｍｐｍ）の範囲の緩衝液Ｂ（ＭｅＣＮ中０．１％ ＴＦＡ）の勾配溶出からなった。不純な生成物含有画分を、初期濃度２１％Ｂから中間濃度３１％Ｂ（２１ｍｐｍ）、そして８０分かけて最終濃度４０％Ｂ（１０．５ｍｐｍ）の勾配を使用して、室温で、Ｗａｔｅｒｓ Ｔ３ Ｃ１８カラム（２５０×１９ｍｍ、１００Å、５μｍ）上で再精製した。
実施例９：環状ＰＹＹ類似体配列番号９の合成
１．Ｈ２Ｎ−ＩＫＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬ（ｈＣ）ＴＲＱ（ｐｓｉ−Ｒ３５Ｙ３６）−Ｓｉｅｂｅｒ樹脂の合成
実施例１、工程２からの事前充填された（ｐｓｉ−Ｒ３５，Ｙ３６）−Ｓｉｅｂｅｒ樹脂（０．１ｍｍｏｌ）上へのアミノ酸延長は、保護されたアミノ酸の５倍過剰を使用する修正を加えて、実施例１、工程３に記載されるように行われた。
２．ｍ−ＢｒＣＨ２ＰｈＣＯＨＮ−ＩＫＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬ（ｈＣ）ＴＲＱ（ｐｓｉ−Ｒ３５Ｙ３６）−Ｓｉｅｂｅｒ樹脂の合成
結合を７５℃の代わりに５０℃で行う修正を加えて、実施例１、工程に記載の手順に従って、ｍ−ブロモメチル安息香酸を上記の樹脂上に結合した。
３．環状ＰＹＹ類似体配列番号９
実施例１、工程７及び８に記載の手順に従って、上記の樹脂から表題化合物を調製した。生成物の精製は、Ｖａｒｉａｎ Ｐｕｒｓｕｉｔ ＸＲ Ｃ１８カラム（２１×２５０ｍｍ、１００Å、５μｍ）を使用して、３５℃で行った。移動相は、緩衝液Ａ（水中０．１％ ＴＦＡ）、及び１０分かけて初期濃度１０％Ｂから中間濃度１８％Ｂ（２１ｍｐｍ）、そして３５分かけて最終濃度３３％Ｂ（１０．５ｍｐｍ）の範囲の緩衝液Ｂ（ＭｅＣＮ中０．１％ ＴＦＡ）の勾配溶出からなった。
実施例１０：環状ＰＹＹ類似体配列番号１０の合成
３０位のＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨの代わりにＤｄｅ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨを使用し、工程３においてパルミチン酸の代わりにα−トコフェリルオキシ酢酸（ＡｃＶｉｔＥ）（８）を使用して、実施例４に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。生成物の精製は、Ａｇｉｌｅｎｔ ３００ＳＢ Ｃ８カラム（２１×２５０ｍｍ、１００Å、５μｍ）を使用して、室温で行った。移動相は、緩衝液Ａ（水中０．１％ ＴＦＡ）、及び１０分かけて初期濃度３０％Ｂから中間濃度４０％Ｂ（２１ｍｐｍ）、そして３５分かけて最終濃度５５％Ｂ（２１ｍｐｍ）の範囲の緩衝液Ｂ（ＭｅＣＮ中０．１％ ＴＦＡ）の勾配溶出からなった。不純な生成物含有画分を、５分かけて初期濃度３５％Ｂから中間濃度４３％Ｂ（２１ｍｐｍ）、そして４０分かけて最終濃度５８％Ｂ（１０．５ｍｐｍ）の修正した勾配を使用して再精製した。
実施例１１：環状ＰＹＹ類似体配列番号１１の合成
１．（Ａｌｌｏｃ）Ｋ（ＮＨ２）−（ｈＣ）−ＴＲＱ（ｐｓｉ−Ｒ３５Ｙ３６）−Ｓｉｅｂｅｒ樹脂の合成
３０位のＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨの代わりにＡｌｌｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨを使用して、実施例９、工程１に記載の手順に従って、上記の樹脂を調製した。
２．（Ａｌｌｏｃ）Ｋ（ＮＨ−γ−Ｇｌｕ−ＡｃＶｉｔＥ）−（ｈＣ）−ＴＲＱ（ｐｓｉ−Ｒ３５Ｙ３６）−Ｓｉｅｂｅｒ樹脂の合成
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ及びα−トコフェリルオキシ酢酸（ＡｃＶｉｔＥ）（８）（それぞれ５当量）を、５０℃で１５〜２０分間、マイクロ波条件下で、ＨＢＴＵ／ＤＩＥＡ媒介結合を使用して上記の樹脂上に順次結合した。
３．Ｈ２Ｎ−Ｋ（ＮＨ−γ−Ｇｌｕ−ＡｃＶｉｔＥ）−（ｈＣ）−ＴＲＱ（ｐｓｉ−Ｒ３５Ｙ３６）−Ｓｉｅｂｅｒ樹脂の合成
実施例１、工程４に記載の手順に従って、ａｌｌｏｃ保護基を除去した。
４．環状ＰＹＹ類似体配列番号１１
ＮＨ４ＯＡｃ緩衝液の代わりに１Ｍ ＴＲＩＳ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を使用して環化を引き起こす修正を加えて、実施例９、工程１〜３に記載の手順に従って、上記の樹脂から表題化合物を調製した。生成物の精製は、Ｖａｒｉａｎ Ｐｕｒｓｕｉｔ ＸＲ Ｃ１８カラム（２１×２５０ｍｍ、１００Å、５μｍ）を使用して、３５℃で行った。移動相は、緩衝液Ａ（水中０．１％ ＴＦＡ）、及び１０分かけて初期濃度１０％Ｂから中間濃度１８％Ｂ（２１ｍｐｍ）、そして３５分かけて最終濃度３３％Ｂ（１０．５ｍｐｍ）の範囲の緩衝液Ｂ（ＭｅＣＮ中０．１％ ＴＦＡ）の勾配溶出からなった。
実施例１２：環状ＰＹＹ類似体配列番号１２の合成
工程１において３５位のＦｍｏｃ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ｎ−Ｍｅ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＯＨを使用し、ＮＨ４ＯＡｃ緩衝液の代わりに１Ｍ ＮａＨＣＯ３緩衝液を使用して環化を引き起こす修正を加えて、実施例２に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。生成物の精製は、Ｖａｒｉａｎ Ｐｕｒｓｕｉｔ ＸＲ Ｃ１８カラム（３０×２５０ｍｍ、１００Å、５μｍ）を使用して、室温で行った。移動相は、緩衝液Ａ（水中０．１％ ＴＦＡ）、及び３６分かけて１０〜６０％Ｂ（３０ｍｐｍ）の範囲の緩衝液Ｂ（ＭｅＣＮ中０．１％ ＴＦＡ）の勾配溶出からなった。
実施例１３：環状ＰＹＹ類似体配列番号１３の合成
工程２においてα−トコフェリルオキシ酢酸（ＡｃＶｉｔＥ）（８）の代わりにパルミチン酸を使用し、６０％ ＥｔＯＨ／Ｈ２ＯをＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏの代わりに溶媒として使用し、飽和水性ＮａＨＣＯ３を、ＮＨ４ＯＡｃ緩衝液の代わりに使用して環化を引き起こす修正を加えて、実施例１１に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。生成物の精製は、Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８ ＯＢＤカラム（５０×２５０ｍｍ、５μｍ）を使用して、室温で行った。移動相は、緩衝液Ａ（水中１０ｍＭ ＮＨ４ＯＨ、ｐＨ約９）、及び５分かけて初期濃度１５％Ｂから中間濃度２０％Ｂ（１００ｍｐｍ）、そして４０分かけて最終濃度３５％Ｂ（１００ｍｐｍ）の範囲の緩衝液Ｂ（ＭｅＣＮ）の勾配溶出からなった。
実施例１４：環状ＰＹＹ類似体配列番号１４の合成
工程１において、１１位の代わりに３０位に配置されたＬｙｓ（ＮＨ−γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）残基を用い、工程１において３５位のＦｍｏｃ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ｎ−Ｍｅ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＯＨを用い、工程６においてＮＨ４ＯＡｃ緩衝液の代わりに１Ｍ ＮａＨＣＯ３緩衝液を使用して環化を引き起こす修正を加えて、実施例４に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。生成物の精製は、Ｖａｒｉａｎ Ｐｕｒｓｕｉｔ ＸＲ Ｃ１８カラム（３０×２５０ｍｍ、１００Å、５μｍ）を使用して、室温で行った。移動相は、緩衝液Ａ（水中０．１％ ＴＦＡ）、及び３６分かけて２０〜７０％Ｂ（３０ｍｐｍ）の範囲の緩衝液Ｂ（ＭｅＣＮ中０．１％ ＴＦＡ）の勾配溶出からなった。不純な画分を、２５分かけて３０〜５０％Ｂ（３０ｍｐｍ）の勾配を使用して、室温で、Ｖａｒｉａｎ Ｐｕｒｓｕｉｔ ＸＲジフェニルカラム（３０×１００ｍｍ、１００Å、５μｍ）上で再精製した。
実施例１５：環状ＰＹＹ類似体配列番号１５の合成
１１位の代わりに３０位に配置されたＬｙｓ（ＮＨ−γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）残基を用い、３位のＦｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ結合の代わりにＦｍｏｃ−βＡｌａ−ＯＨを使用し、ＮＨ４ＯＡｃ緩衝液の代わりに１Ｍ ＮａＨＣＯ３緩衝液を使用して環化を引き起こし、ブロモ酢酸無水物との結合は、以下の手順を用いて、工程６（実施例２の工程２）において、ｍ−ブロモメチル安息香酸の代わりに使用される修正を加えて、実施例４に記載の手順に従って、表題化合物を調製した：Ｆｍｏｃ脱保護されたペプチド樹脂（０．１ミリモル）を、５０℃で５〜１０分間、マイクロ波反応器中で、ＤＭＦ（５ｍＬ）中のブロモ酢酸無水物（１０当量）の溶液で処理する（この時点までに、反応は、一般的に、Ｋａｉｓｅｒニンヒドリン試験により完全であると決定された）。結合が不完全であると決定された場合結合は新しい試薬で繰り返された。生成物の精製は、Ｖａｒｉａｎ Ｐｕｒｓｕｉｔ ＸＲ Ｃ１８カラム（３０×２５０ｍｍ、１００Å、５μｍ）を使用して、室温で行った。移動相は、緩衝液Ａ（水中０．１％ ＴＦＡ）、及び３６分かけて２０〜６０％Ｂ（３０ｍｐｍ）の範囲の緩衝液Ｂ（ＭｅＣＮ中０．１％ ＴＦＡ）の勾配溶出からなった。不純な画分を、２５分かけて３０〜５０％Ｂ（３０ｍｐｍ）の勾配を使用して、室温で、Ｖａｒｉａｎ Ｐｕｒｓｕｉｔ ＸＲジフェニルカラム（３０×１００ｍｍ、１００Å、５μｍ）上で再精製した。
実施例１６：環状ＰＹＹ類似体配列番号１６の合成
１１位の代わりに３０位に配置されたＬｙｓ（ＮＨ−γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）残基を用い、３位のＦｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ結合を省略し、工程６において（実施例２の工程２）、ｍ−ブロモメチル安息香酸の代わりにｐ−ブロモメチル安息香酸を使用して、実施例４に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。加えて、１ＭＮａＨＣＯ３緩衝液を、ＮＨ４ＯＡｃ緩衝液の代わりに使用して環化を引き起こした。生成物の精製は、Ｖａｒｉａｎ Ｐｕｒｓｕｉｔ ＸＲ Ｃ１８カラム（３０×２５０ｍｍ、１００Å、５μｍ）を使用して、室温で行った。移動相は、緩衝液Ａ（水中０．１％ ＴＦＡ）、及び３６分かけて２０〜７０％Ｂ（３０ｍｐｍ）の範囲の緩衝液Ｂ（ＭｅＣＮ中０．１％ ＴＦＡ）の勾配溶出からなった。不純な画分を、２５分かけて３０〜５０％Ｂ（３０ｍｐｍ）の勾配を使用して、室温で、Ｖａｒｉａｎ Ｐｕｒｓｕｉｔ ＸＲジフェニルカラム（３０×１００ｍｍ、１００Å、５μｍ）上で再精製した。
実施例１７：環状ＰＹＹ類似体配列番号１７の合成
１１位の代わりに３０位に配置されたＬｙｓ（ＮＨ−γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）残基を用い、工程１において４位のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨを使用して、実施例４に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。工程６において、ＴＲＩＳ／ＨＣｌ緩衝液（１Ｍ、ｐＨ７．５）を、ＮＨ４ＯＡｃ緩衝液の代わりに使用して環化を引き起こした。生成物の精製は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｏｌａｒｉｓ Ｃ１８−Ａカラム（３０×２５０ｍｍ、１００Å、５μｍ）を使用して、室温で行った。移動相は、緩衝液Ａ（水中０．１％ ＴＦＡ）、及び５分かけて初期濃度２０％Ｂから中間濃度３５％Ｂ（４０ｍｐｍ）、そして４０分かけて最終濃度４５％Ｂ（４０ｍｐｍ）の範囲の緩衝液Ｂ（ＭｅＣＮ中０．１％ ＴＦＡ）の勾配溶出からなった。
実施例１８：環状ＰＹＹ類似体配列番号１８の合成
１１位の代わりに３０位に配置されたＬｙｓ（ＮＨ−γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）残基を用い、工程１において４位のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨを使用して、実施例４に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。工程６において、ＴＲＩＳ／ＨＣｌ緩衝液（１Ｍ、ｐＨ７．５）を、ＮＨ４ＯＡｃ緩衝液の代わりに使用して環化を引き起こした。生成物の精製は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｏｌａｒｉｓ Ｃ１８−Ａカラム（３０×２５０ｍｍ、１００Å、５μｍ）を使用して、室温で行った。移動相は、緩衝液Ａ（水中０．１％ ＴＦＡ）、及び５分かけて初期濃度２０％Ｂから中間濃度３５％Ｂ（４０ｍｐｍ）、そして４０分かけて最終濃度４５％Ｂ（４０ｍｐｍ）の範囲の緩衝液Ｂ（ＭｅＣＮ中０．１％ ＴＦＡ）の勾配溶出からなった。
実施例１９：環状ＰＹＹ類似体配列番号１９の合成
１１位の代わりに３０位に配置されたＬｙｓ（ＮＨ−γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）残基、工程１において、３５位のＦｍｏｃ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ｎ−Ｍｅ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ｈＣｙｓ（ｔｒｔ）−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（ｔｒｔ）−ＯＨを用い、工程６において（実施例２の工程２）、ｍ−ブロモメチル安息香酸の代わりにｐ−ブロモメチル安息香酸を使用して、実施例４に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。
以下の修正は、工程６（実施例２、工程３及び４）に対して行われた：環化前に得た粗ペプチドを、Ｖａｒｉａｎ Ｐｕｒｓｕｉｔ ＸＲ Ｃ１８カラム（３０×２５０ｍｍ、１００Å、５μｍ）を使用して、室温で精製した。移動相は、緩衝液Ａ（水中０．１％ ＴＦＡ）、及び３６分かけて２０〜７０％Ｂ（３０ｍｐｍ）の範囲の緩衝液Ｂ（ＭｅＣＮ中０．１％ ＴＦＡ）の勾配溶出からなった。生成物含有画分を合わせ、固体ＮａＨＣＯ３で処理して、ｐＨを約７〜８に上昇させた。得られた溶液を室温で４時間撹拌した後、ＴＦＡでｐＨ４に酸性化した。溶液を５〜１０ｍＬの体積に濃縮し、ＭｅＣＮを添加して、任意の沈殿物を溶解させた。生成物の精製は、３６分かけて２０〜６０％Ｂ（３０ｍｐｍ）の勾配で、上記のように行った。
実施例２０：環状ＰＹＹ類似体配列番号２０の合成
１１位の代わりに３０位に配置されたＬｙｓ（ＮＨ−γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）残基、工程１において３５位のＦｍｏｃ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ｎ−Ｍｅ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＯＨ、及びＦｍｏｃ−ｈＣｙｓ（ｔｒｔ）−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（ｔｒｔ）−ＯＨを用いて、実施例４に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。粗直鎖状ペプチドを、実施例１９に記載の修正に従って精製及び環化した。最終生成物の精製は、３６分かけて２０〜６０％Ｂ（３０ｍｐｍ）の勾配を使用して行った。
実施例２１：環状ＰＹＹ類似体配列番号２１の合成
１１位の代わりに３０位に配置されたＬｙｓ（ＮＨ−γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）残基を用い、２６位のＦｍｏｃ−Ｈｉｓ（ｔｒｔ）−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨを使用し、工程１において４位のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨを使用して、実施例４に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。工程６において、ＴＲＩＳ／ＨＣｌ緩衝液（１Ｍ、ｐＨ７．５）を、ＮＨ４ＯＡｃ緩衝液の代わりに使用して環化を引き起こした。生成物の精製は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｏｌａｒｉｓ Ｃ１８−Ａカラム（３０×２５０ｍｍ、１００Å、５μｍ）を使用して、室温で行った。移動相は、緩衝液Ａ（水中０．１％ ＴＦＡ）、及び５分かけて初期濃度２０％Ｂから中間濃度３５％Ｂ（４０ｍｐｍ）、そして４０分かけて最終濃度４５％Ｂ（４０ｍｐｍ）の範囲の緩衝液Ｂ（ＭｅＣＮ中０．１％ ＴＦＡ）の勾配溶出からなった。
実施例２２：環状ＰＹＹ類似体配列番号２２の合成
１１位の代わりに３０位に配置されたＬｙｓ（ＮＨ−γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）残基を用い、２６位のＦｍｏｃ−Ｈｉｓ（ｔｒｔ）−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨを使用し、工程１において４位のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨを使用して、実施例４に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。工程６において、ＴＲＩＳ／ＨＣｌ緩衝液（１Ｍ、ｐＨ７．５）を、ＮＨ４ＯＡｃ緩衝液の代わりに使用して環化を引き起こした。生成物の精製は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｏｌａｒｉｓ Ｃ１８−Ａカラム（３０×２５０ｍｍ、１００Å、５μｍ）を使用して、室温で行った。移動相は、緩衝液Ａ（水中０．１％ ＴＦＡ）、及び５分かけて初期濃度２０％Ｂから中間濃度３３％Ｂ（４０ｍｐｍ）、そして４０分かけて最終濃度４３％Ｂ（４０ｍｐｍ）の範囲の緩衝液Ｂ（ＭｅＣＮ中０．１％ ＴＦＡ）の勾配溶出からなった。
実施例２３：環状ＰＹＹ類似体配列番号２３の合成
α−トコフェリルオキシ酢酸（ＡｃＶｉｔＥ）（８）の代わりにオクタデカン二酸モノ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（ＡｓｔａＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．から入手可能）を使用し、工程２において５０℃で３０分間のＨＡＴＵ／ＤＩＥＡ及びＤＭＦの代わりにＮＭＰを溶媒として用いた結合プロトコルを使用し、工程２において、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕを結合する前に直列にＦｍｏｃ−ＯＥＧ−ＯＨの２つの単位を結合する、実施例１１に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。粗直鎖状ペプチドを、２０〜６０％Ｂの勾配を使用して、実施例１９に記載の修正に従って精製及び環化した。最終生成物の精製は、３６分かけて２０〜７０％Ｂ（３０ｍｐｍ）の勾配を使用して行った。
実施例２４：環状ＰＹＹ類似体配列番号２４の合成
オクタデカン二酸モノ−ｔｅｒｔ−ブチルエステルの代わりに２０−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）−２０オキソイコサン酸（Ｋｅｙ Ｏｒｇａｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．から入手可能）を使用して、実施例２３に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。粗直鎖状ペプチドを、２０〜６０％Ｂの勾配を使用して、実施例１９に記載の修正に従って精製及び環化した。最終生成物の精製は、３６分かけて２０〜６０％Ｂ（３０ｍｐｍ）の勾配を使用して行った。
実施例２５：環状ＰＹＹ類似体配列番号２５の合成
α−トコフェリルオキシ酢酸（ＡｃＶｉｔＥ）（８）の代わりにステアリン酸を使用し、工程２において５０℃で３０分間のＨＡＴＵ／ＤＩＥＡ及びＤＭＦの代わりにＮＭＰを溶媒として用いた結合プロトコルを用いて、実施例１１に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。粗直鎖状ペプチドを、２０〜８０％Ｂの勾配を使用して、実施例１９に記載の修正に従って精製及び環化した。最終生成物の精製は、３６分かけて２０〜８０％Ｂ（３０ｍｐｍ）の勾配を使用して行った。
実施例２６：環状ＰＹＹ類似体配列番号２６の合成
α−トコフェリルオキシ酢酸（ＡｃＶｉｔＥ）（８）の代わりにアラキジン酸を使用し、工程２において５０℃で３０分間のＨＡＴＵ／ＤＩＥＡ及びＤＭＦの代わりにＮＭＰを溶媒として用いた結合プロトコルを用いて、実施例１１に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。粗直鎖状ペプチドを、２０〜９０％Ｂの勾配を使用して、実施例１９に記載の修正に従って精製及び環化した。最終生成物の精製は、３６分かけて２０〜９０％Ｂ（３０ｍｐｍ）の勾配を使用して行った。
実施例２７：環状ＰＹＹ類似体配列番号２７の合成
実施例２３に記載の手順に従うが、直列Ｆｍｏｃ−ＯＥＧ−ＯＨ結合後のＦｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕの結合を省略して、表題化合物を調製した。粗直鎖状ペプチドを、２０〜６０％Ｂの勾配を使用して、実施例１９に記載の修正に従って精製及び環化した。最終生成物の精製は、３６分かけて２０〜６０％Ｂ（３０ｍｐｍ）の勾配を使用して行った。
実施例２８：環状ＰＹＹ類似体配列番号２８の合成
α−トコフェリルオキシ酢酸（ＡｃＶｉｔＥ）（８）の代わりにパルミチン酸を使用し、３位におけるＦｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨの結合を省略し、工程４（実施例９、工程２）においてｍ−ブロモメチル安息香酸の代わりにｐ−ブロモメチル安息香酸を使用して、実施例１１に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。粗直鎖状ペプチドを、２０〜６０％Ｂの勾配を使用して、実施例１９に記載の修正に従って精製及び環化した。最終生成物の精製は、３６分かけて２０〜６０％Ｂ（３０ｍｐｍ）の勾配を使用して行った。
実施例２９：環状ＰＹＹ類似体配列番号２９の合成
α−トコフェリルオキシ酢酸（ＡｃＶｉｔＥ）（８）の代わりにパルミチン酸を使用し、３位のＦｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−βＡｌａ−ＯＨを使用し、実施例１５に記載の修正を使用して、工程４（実施例９、工程２）においてｍ−ブロモメチル安息香酸の代わりにブロモ酢酸無水物を結合して、実施例１１に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。粗直鎖状ペプチドを、２０〜６０％Ｂの勾配を使用して、実施例１９に記載の修正に従って精製及び環化した。最終生成物の精製は、３６分かけて２０〜６０％Ｂ（３０ｍｐｍ）の勾配を使用して行った。
実施例３０：環状ＰＹＹ類似体配列番号３０の合成
α−トコフェリルオキシ酢酸（ＡｃＶｉｔＥ）（８）の代わりにパルミチン酸を使用し、３位のＦｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−β−ＯＨを使用し、実施例１５に記載の修正を使用して、工程４（実施例９、工程２）においてｍ−ブロモメチル安息香酸の代わりにブロモ酢酸無水物を結合して、実施例１１に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。粗直鎖状ペプチドを、２０〜６０％Ｂの勾配を使用して、実施例１９に記載の修正に従って精製及び環化した。最終生成物の精製は、３６分かけて２０〜６０％Ｂ（３０ｍｐｍ）の勾配を使用して行った。
実施例３１：環状ＰＹＹ類似体配列番号３１の合成
オクタデカン二酸モノ−ｔｅｒｔ−ブチルエステルの代わりにステアリン酸を使用して、実施例２３に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。粗直鎖状ペプチドを、２０〜６０％Ｂの勾配を使用して、実施例１９に記載の修正に従って精製及び環化した。最終生成物の精製は、３６分かけて２０〜６０％Ｂ（３０ｍｐｍ）の勾配を使用して行った。
実施例３２：環状ＰＹＹ類似体配列番号３２の合成
工程２においてα−トコフェリルオキシ酢酸（ＡｃＶｉｔＥ）（８）の代わりにパルミチン酸を使用し、２６位のＦｍｏｃ−Ｈｉｓ（ｔｒｔ）−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨを使用し、工程４（実施例９、工程１）において、４位のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨを使用して、実施例１１に記載の手順に従って表題化合物を調製した。工程６において、ＴＲＩＳ／ＨＣｌ緩衝液（１Ｍ、ｐＨ７．５）を、ＮＨ４ＯＡｃ緩衝液の代わりに使用して環化を引き起こした。生成物の精製は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｏｌａｒｉｓ Ｃ１８−Ａカラム（３０×２５０ｍｍ、１００Å、５μｍ）を使用して、室温で行った。移動相は、緩衝液Ａ（水中０．１％ ＴＦＡ）、及び５分かけて初期濃度２０％Ｂから中間濃度３５％Ｂ（４０ｍｐｍ）、そして４０分かけて最終濃度４５％Ｂ（４０ｍｐｍ）の範囲の緩衝液Ｂ（ＭｅＣＮ中０．１％ ＴＦＡ）の勾配溶出からなった。
実施例３３：環状ＰＹＹ類似体配列番号３３の合成
工程２においてα−トコフェリルオキシ酢酸（ＡｃＶｉｔＥ）（８）の代わりにパルミチン酸を使用し、工程４（実施例９、工程１）において、３４位のＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（ｔｒｔ）−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ｎ（Ｍｅ）−Ｇｌｎ（ｔｒｔ）−ＯＨを使用して、実施例１１に記載の手順に従って表題化合物を調製した。この場合、結合は、ＮＭＰを溶媒として、及びＨＡＴＵ／ＤＩＥＡプロトコル（１時間、単一結合）を使用して、室温で行った。Ｆｍｏｃ−Ｎ（Ｍｅ）−Ｇｌｎ（ｔｒｔ）−ＯＨ及びＦｍｏｃ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＯＨを二重結合した。２段階Ｆｍｏｃ脱保護プロトコルを全体にわたって使用した（ＤＭＦ中２０％ピペリジン；室温；１０分、１５分）。粗直鎖状ペプチドを、２０〜７０％Ｂの勾配を使用して、実施例１９に記載の修正に従って精製及び環化した。最終生成物の精製は、３６分かけて２０〜７０％Ｂ（３０ｍｐｍ）の勾配を使用して行った。
実施例３４：環状ＰＹＹ類似体配列番号３４の合成
α−トコフェリルオキシ酢酸（ＡｃＶｉｔＥ）（８）の代わりにパルミチン酸を使用し、３１位のＦｍｏｃ−ｈＣｙｓ（ｔｒｔ）−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（ｔｒｔ）−ＯＨを使用し、３位のＦｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨの代わりに６−Ｆｍｏｃ−アミノヘキサン酸を使用し、実施例１５に記載の修正を使用し、工程４（実施例９の工程２）においてｍ−ブロモメチル安息香酸の代わりにブロモ酢酸無水物を欠号して、実施例１１に記載の手順に従って表題化合物を調製した。水性ＮａＨＣＯ３（２Ｎ）を、ＮＨ４ＯＡｃ緩衝液の代わりに使用して環化を引き起こした。生成物の精製は、Ｖａｒｉａｎ Ｐｕｒｓｕｉｔ ＸＲ Ｃ１８カラム（３０×２５０ｍｍ、１００Å、５μｍ）を使用して、室温で行った。移動相は、緩衝液Ａ（水中０．１％ ＴＦＡ）、及び３６分かけて２０〜７０％Ｂ（３０ｍｐｍ）の範囲の緩衝液Ｂ（ＭｅＣＮ中０．１％ ＴＦＡ）の勾配溶出からなった。
実施例３５：環状ＰＹＹ類似体配列番号３５の合成
以下の修正を加えて、実施例９に記載の手順に従って、表題化合物を調製した：本明細書で使用される充填されたＳｉｅｂｅｒ樹脂を調製するために、実施例１、工程１に記載の手順に従って、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ｎ−Ｍｅ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＯＨから調製したＦｍｏｃ−ｐｓｉ−［Ｎ−Ｍｅ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｎ（Ｂｏｃ）Ｔｙｒ（ｔＢｕ）］−ＯＨが、Ｆｍｏｃ−ｐｓｉ−［Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｎ（Ｂｏｃ）Ｔｙｒ（ｔＢｕ）］−ＯＨ（６）の代わりに使用され、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｐａｌ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ）−ＯＨ（Ａｃｔｉｖｅ Ｐｅｐｔｉｄｅから）が、３０位のＬｅｕの代わりに使用され、ｍ−クロロメチル安息香酸が、工程２において、ｍ−ブロモメチル安息香酸の代わりに使用され、ＮＭＰを溶媒として使用して、結合が室温で行われ、ＨＡＴＵ／ＤＩＥＡプロトコル（１時間、単一結合）が使用され、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＯＨが二重結合された。２段階Ｆｍｏｃ脱保護プロトコルを全体にわたって使用した（ＤＭＦ中２０％ピペリジン；室温；１０分、１５分）。粗直鎖状ペプチドを、２０〜７０％Ｂの勾配を使用して、実施例１９に記載の修正に従って精製及び環化した。最終生成物の精製は、３６分かけて２０〜７０％Ｂ（３０ｍｐｍ）の勾配を使用して行った。
実施例３６：環状ＰＹＹ類似体配列番号３６の合成
３位のＦｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−βＡｌａ−ＯＨを使用し、実施例１５に記載の修正を使用して、工程４（実施例９、工程２）においてｍ−ブロモメチル安息香酸の代わりにブロモ酢酸無水物を結合して、実施例３５に記載の手順に従って表題化合物を調製した。実施例１９の修正されたワークアップは省略した。Ｆｍｏｃ−βＡｌａ−ＯＨをマイクロ波条件下で５０℃で２０分間結合した。飽和水性ＮａＨＣＯ３を、ＮＨ４ＯＡｃ緩衝液の代わりに使用して環化を引き起こした。生成物の精製は、Ｖａｒｉａｎ Ｐｕｒｓｕｉｔ ＸＲ Ｃ１８カラム（３０×２５０ｍｍ、１００Å、５μｍ）を使用して、室温で行った。移動相は、緩衝液Ａ（水中０．１％ ＴＦＡ）、及び３６分かけて２０〜７０％Ｂ（３０ｍｐｍ）の範囲の緩衝液Ｂ（ＭｅＣＮ中０．１％ ＴＦＡ）の勾配溶出からなった。
実施例３７：環状ＰＹＹ類似体配列番号３７の合成
３１位のＦｍｏｃ−ｈＣｙｓ（ｔｒｔ）−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（ｔｒｔ）−ＯＨを使用し、３０位のＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｐａｌ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ）−ＯＨ（Ａｃｔｉｖｅ Ｐｅｐｔｉｄｅから）を使用して、実施例９に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。加えて、Ｆｍｏｃ−Ａｂｕ−ＯＨが、工程１において２位の配列上に付加され、ブロモ酢酸無水物との結合が、実施例１５に記載の修正を使用して、工程２においてｍ−ブロモメチル安息香酸の代わりに使用された。飽和水性ＮａＨＣＯ３を、工程３においてＮＨ４ＯＡｃ緩衝液の代わりに使用して環化を引き起こした。生成物の精製は、Ｖａｒｉａｎ Ｐｕｒｓｕｉｔ ＸＲ Ｃ１８カラム（３０×２５０ｍｍ、１００Å、５μｍ）を使用して、室温で行った。移動相は、緩衝液Ａ（水中０．１％ ＴＦＡ）、及び３６分かけて２０〜７０％Ｂ（３０ｍｐｍ）の範囲の緩衝液Ｂ（ＭｅＣＮ中０．１％ ＴＦＡ）の勾配溶出からなった。
実施例３８：環状ＰＹＹ類似体配列番号３８の合成
以下の修正を加えて、実施例３５に記載の手順に従って、表題化合物を調製した：Ｆｍｏｃ−βＡｌａ−ＯＨが、５０℃で２０分間、マイクロ波条件を使用して工程１に従い２位の配列上に付加され、実施例１５に記載の修正を使用して、工程２においてブロモ酢酸無水物との結合がｍ−ブロモメチル安息香酸の代わりに使用された。飽和水性ＮａＨＣＯ３を、ＮＨ４ＯＡｃ緩衝液の代わりに使用して環化を引き起こした。生成物の精製は、Ｖａｒｉａｎ Ｐｕｒｓｕｉｔ ＸＲ Ｃ１８カラム（３０×２５０ｍｍ、１００Å、５μｍ）を使用して、室温で行った。移動相は、緩衝液Ａ（水中０．１％ ＴＦＡ）、及び３６分かけて２０〜８０％Ｂ（３０ｍｐｍ）の範囲の緩衝液Ｂ（ＭｅＣＮ中０．１％ ＴＦＡ）の勾配溶出からなった。
実施例３９：環状ＰＹＹ類似体配列番号３９の合成
工程２において、α−トコフェリルオキシ酢酸（ＡｃＶｉｔＥ）（８）の代わりにアラキジン酸を使用して、実施例１１に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨが、工程４（実施例９、工程１）において、４位のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨの代わりに使用され、ｍ−クロロメチル安息香酸が、工程４（実施例９、工程２）において、ｍ−ブロモメチル安息香酸の代わりに使用された。６０％ ＥｔＯＨ／Ｈ２ＯをＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏの代わりに溶媒として使用し、飽和水性ＮａＨＣＯ３を、工程４においてＮＨ４ＯＡｃ緩衝液の代わりに使用して環化を引き起こした。生成物の精製は、Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８ ＯＢＤカラム（５０×２５０ｍｍ、５μｍ）を使用して、室温で行った。移動相は、緩衝液Ａ（水中１０ｍＭ ＮＨ４ＯＨ、ｐＨ約９）、及び５分かけて初期濃度２０％Ｂから中間濃度２５％Ｂ（１００ｍｐｍ）、そして４０分かけて最終濃度４０％Ｂ（１００ｍｐｍ）の範囲の緩衝液Ｂ（ＭｅＣＮ）の勾配溶出からなった。
実施例４０：環状ＰＹＹ類似体配列番号４０の合成
１．（ＨＣＣＨ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ）−ＩＫＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＫ（Ｄｄｅ）−（アジド−ｎｏｒＬｅｕ）−ＴＲＱ（ｐｓｉ−Ｒ３５Ｙ３６）−Ｓｉｅｂｅｒ樹脂の合成
実施例１、工程２からの事前充填された（ｐｓｉ−Ｒ３５，Ｙ３６）−Ｓｉｅｂｅｒ樹脂（０．１ｍｍｏｌ）上へのアミノ酸延長は、溶媒としてＮＭＰ、５倍過剰の保護されたアミノ酸、及びＨＡＴＵ／ＤＩＥＡプロトコル（１時間、単一結合）を使用して、室温で行われた。Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＯＨ及びＦｍｏｃ−Ｈｉｓ（ｔｒｔ）−ＯＨを二重結合した。２段階Ｆｍｏｃ脱保護プロトコルを全体にわたって使用した（ＤＭＦ中２０％ピペリジン；室温；１０分、１５分）。
２．（ＨＣＣＨ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ）−ＩＫＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＫ（ＮＨ２）−（アジド−ｎｏｒＬｅｕ）−ＴＲＱ（ｐｓｉ−Ｒ３５Ｙ３６）−Ｓｉｅｂｅｒ樹脂の合成
上記の樹脂を、室温で２分間、ＤＭＦ中２％ヒドラジン（１２ｍＬ／０．２ｍｍｏｌスケール）で処理し、次いで混合物を排出した。この手順を約４回繰り返し、その後、樹脂をＤＭＦで、次いでＤＣＭで十分に洗浄した。
３．（ＨＣＣＨ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ）−ＩＫＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＫ（（ＯＥＧ）２−γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）−（アジド−ｎｏｒＬｅｕ）−ＴＲＱ（ｐｓｉ−Ｒ３５Ｙ３６）−Ｓｉｅｂｅｒ樹脂の合成
室温で１．５時間、ＨＢＴＵ／ＤＩＥＡプロトコルを使用して、上記樹脂を、（Ｓ）−１０，１９−ジオキソ−２２−パルミトアミド−３，６，１２，１５−テトラオキサ−９，１８−ジアザトリコサン二酸（５当量）と結合させた［工程Ｇにおいて１８−ｔｅｒｔ−ブトキシ−１８−オキソオクタデカン酸の代わりにパルミチン酸を使用することにより、中間体３の合成について記載した手順に従って調製された］。樹脂を排出し、ＤＭＦ及びＤＣＭで十分に洗浄した。
４．（ＨＣＣＨ（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ）−ＩＫＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＫ（（ＯＥＧ）２−γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）−（アジド−ｎｏｒＬｅｕ）−ＴＲＱ（ｐｓｉ−Ｒ３５Ｙ３６）−ＣＯＮＨ２の合成
乾燥させた樹脂を、ＤＣＭ（２０ｍＬ）中２％ ＴＦＡの溶液で処理し、２０分間混合した後、濾過した。各処理に新しいカクテルを使用して、この処理を更に２回繰り返した。次いで、合わせた濾液を合わせ、濃縮して、黄色の発泡体として粗保護ペプチドを得た。この発泡体を、室温で２．５時間、２０ｍＬの切断カクテル（ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＰＳ＝９５／２．５／２．５）で処理し、次いで窒素流下で約２．５ｍＬの体積に濃縮した。次いで、冷エーテル（４０ｍＬ）を添加してペプチドを沈殿させ、混合物を遠心分離し（５分間、５０００ｒｐｍ）、デカントした。このプロセスを更に２回繰り返して、オフホワイト色の粉末として粗ペプチドを得た。
あるいは、樹脂を、ＤＣＭ中１〜２％ ＴＦＡで前処理することなく、切断カクテルで処理して、完全に脱保護されたペプチドを直接得た。粗ペプチドを、Ｖａｒｉａｎ Ｐｕｒｓｕｉｔ ＸＲ Ｃ１８カラム（３０×２５０ｍｍ、１００Å、５μｍ）を使用して逆相分取ＨＰＬＣにより精製した。移動相は、緩衝液Ａ（水中０．１％ ＴＦＡ）、及び３６分かけて２０〜７０％Ｂの範囲の緩衝液Ｂ（ＭｅＣＮ中０．１％ ＴＦＡ）の勾配溶出からなった。ＵＶ検出は、２２０及び２５４ｎｍで監視された。生成物含有画分は、上記と同じカラムタイプ（４．６×２５０ｍｍ、５μｍ）を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣシステムで分析ＨＰＬＣによって分析された。純粋な画分を合わせ、次いで凍結乾燥させて、綿様の固体として生成物を得た。１６．８７分（ＬＣ：Ａｔｌａｎｔｉｓ Ｔ３ Ｃ１８カラム、５μｍ、４．６×２５０ｍｍ、１．０ｍＬ／分、３０〜６０％勾配）での生成物のピークに関してＬＣＭＳ：１２１１．８（Ｍ＋４Ｈ）／４，１６１５．４（Ｍ＋３Ｈ）／３及び２４２２．９（Ｍ＋２Ｈ）／２。
５．環状ＰＹＹ類似体配列番号４０
１ｍＬのＨ２Ｏ中に５．１ｍｇのＣｕＳＯ４を調製する。３ｍＬのＥｔＯＨ中に１０．４ｍｇのＴＢＴＡを調製する。４００μＬのＣｕＳＯ４溶液及び３ｍＬのＴＢＴＡ溶液を予備混合する。２ｍＬのＨ２Ｏ中に１３ｍｇのアスコルビン酸Ｎａを調製する。
４ｍＬのＨＥＰＥＳ（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）中の工程４の精製されたアジド含有ペプチド（３７ｍｇ）の溶液に、１．７ｍＬの予備混合したＣｕＳＯ４／ＴＢＴＡ溶液を添加し、続いて１ｍＬのアスコルビン酸Ｎａ溶液を添加した。反応溶液が透明になるまでＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ比を調整する。混合物を３時間撹拌し、ＨＰＬＣによって監視した。３０分後、反応は完了した。混合物をｐＨ４に調整し、逆相分取ＨＰＬＣにより精製した。精製は、Ｖａｒｉａｎ Ｐｕｒｓｕｉｔ ＸＲ Ｃ１８カラム（３０×２５０ｍｍ、１００Å、５μｍ）を使用して行った。移動相は、緩衝液Ａ（水中０．１％ ＴＦＡ）、及び３６分かけて２０〜６０％Ｂの範囲の緩衝液Ｂ（ＭｅＣＮ中０．１％ ＴＦＡ）の勾配溶出からなった。ＵＶ検出は、２２０及び２５４ｎｍで監視された。生成物含有画分は、上記と同じカラムタイプ（４．６×２５０ｍｍ、５μｍ）を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣシステムで分析ＨＰＬＣによって分析された。純粋な画分を合わせ、次いで凍結乾燥させて、綿様の固体として生成物を得た。
実施例４１：環状ＰＹＹ類似体配列番号４１の合成
工程３において、（Ｓ）−１０，１９−ジオキソ−２２−パルミトアミド−３，６，１２，１５−テトラオキサ−９，１８−ジアザトリコサン二酸の代わりに、Ｌ−グルタミン酸、Ｎ−（１−オキソヘキサデシル）−、１−（１，１−ジメチルエチル）エステルを使用して、実施例４０に記載の手順法に従って、表題化合物を調製した。
実施例４２：環状ＰＹＹ類似体配列番号４２の合成
工程３において、（Ｓ）−１０，１９−ジオキソ−２２−パルミトアミド−３，６，１２，１５−テトラオキサ−９，１８−ジアザトリコサン二酸の代わりに、（Ｓ）−２２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４３，４３−ジメチル−１０，１９，２４，４１−テトラオキソ−３，６，１２，１５，４２−ペンタオキサ−９，１８，２３−トリアザテトラテトラコンタン−１−酸（１６）（中間体２）を使用して、実施例４０に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。
実施例４３：環状ＰＹＹ類似体配列番号４３の合成
１．（Ａｌｌｏｃ）Ｌｙｓ（（ＯＥＧ）２−γ−Ｇｌｕ−ＮＨ２）−（ｈＣ）−ＴＲＱ（ｐｓｉ−Ｒ３５Ｙ３６）−Ｓｉｅｂｅｒ樹脂の合成
実施例１、工程２からの事前充填された（ｐｓｉ−Ｒ３５，Ｙ３６）−Ｓｉｅｂｅｒ樹脂（０．１ｍｍｏｌ）上へのアミノ酸延長は、溶媒としてＮＭＰ、５倍過剰の保護されたアミノ酸、及びＨＡＴＵ／ＤＩＥＡプロトコル（１時間、単一結合）を使用して、室温で行われた。Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）−ＯＨが二重結合された。２段階Ｆｍｏｃ脱保護プロトコルを全体にわたって使用した（ＤＭＦ中２０％ピペリジン；室温；１０分、１５分）。
２．（Ａｌｌｏｃ）Ｌｙｓ（（ＯＥＧ）２−γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）−（ｈＣ）−ＴＲＱ（ｐｓｉ−Ｒ３５Ｙ３６）−Ｓｉｅｂｅｒ樹脂の合成
５０℃で２０〜３０分間、ＨＡＴＵ／ＤＩＥＡ及びＮＭＰを溶媒として用いるマイクロ波条件を使用して、工程１からの樹脂上にパルミチン酸を結合させた。
３．（Ｈ２Ｎ）Ｌｙｓ（（ＯＥＧ）２−−γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）−（ｈＣ）−ＴＲＱ（ｐｓｉ−Ｒ３５Ｙ３６）−Ｓｉｅｂｅｒ樹脂の合成
実施例１、工程４に記載の手順に従って、上記樹脂のａｌｌｏｃ保護基を除去した。
４．環状ＰＹＹ類似体配列番号４３
工程２においてｍ−ブロモメチル安息香酸の代わりにｍ−クロロメチル安息香酸を使用して、実施例９、工程１〜３に記載の手順に従って、上記の樹脂から表題化合物を調製した。粗直鎖状ペプチドを、２０〜６０％Ｂの勾配を使用して、実施例１９に記載の修正に従って精製及び環化した。最終生成物の精製は、３６分かけて２０〜６０％Ｂ（３０ｍｐｍ）の勾配を使用して行った。
実施例４４：環状ＰＹＹ類似体配列番号４４の合成
直列Ｆｍｏｃ−ＯＥＧ−ＯＨ単位及びＦｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ単位が工程１の代わりに工程２において組み込まれるように修正された、実施例４３に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。オクタデカン二酸モノ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（ＡｓｔａＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．）を、工程２においてパルミチン酸の代わりに使用し、リンカー脂質配列を３０位の代わりに１１位に配置した。粗直鎖状ペプチドを、２０〜７０％Ｂの勾配を使用して、実施例１９に記載の修正に従って精製及び環化した。最終生成物の精製は、３６分かけて２０〜７０％Ｂ（３０ｍｐｍ）の勾配を使用して行った。
実施例４５：環状ＰＹＹ類似体配列番号４５の合成
Ｆｍｏｃ−ｄＰＥＧ２４−カルボン酸を、直列Ｆｍｏｃ−ＯＥＧ−ＯＨ単位の代わりに使用し、パルミチン酸と共に工程２に組み込まれるように修正された、実施例４３に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。リンカー−脂質配列を３０位の代わりに１１位に配置した。粗直鎖状ペプチドを、２０〜９０％Ｂの勾配を使用して、実施例１９に記載の修正に従って精製及び環化した。最終生成物の精製は、３６分かけて２０〜９０％Ｂ（３０ｍｐｍ）の勾配を使用して行った。
実施例４６：環状ＰＹＹ類似体配列番号４６の合成
３０位のＬｅｕの代わりにＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｐａｌ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ）−ＯＨ（Ａｃｔｉｖｅ Ｐｅｐｔｉｄｅから）を使用して、実施例９に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。加えて、Ｆｍｏｃ−βＡｌａ−ＯＨが、５０℃で２０分間、マイクロ波条件を使用して工程１に従い、２位の配列上に付加され、ブロモ酢酸無水物との結合が、実施例１５に記載の修正を使用して、工程２においてｍ−ブロモメチル安息香酸の代わりに使用された。個体粗直鎖状ペプチドを、２０〜７０％Ｂの勾配を使用して、実施例１９に記載の修正に従って精製及び環化した。最終生成物の精製は、３６分かけて２０〜７０％Ｂ（３０ｍｐｍ）の勾配を使用して行った。
実施例４７：環状ＰＹＹ類似体配列番号４７の合成
１１位の代わりに７位にリンカー−脂質配列を配置して、実施例４４に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。生成物の精製は、Ｖａｒｉａｎ Ｐｕｒｓｕｉｔ ＸＲ Ｃ１８カラム（３０×２５０ｍｍ、１００Å、５μｍ）を使用して、室温で行った。粗直鎖状ペプチドを、２０〜６０％Ｂの勾配を使用して、実施例１９に記載の修正に従って精製及び環化した。最終生成物の精製は、３６分かけて２０〜６０％Ｂ（３０ｍｐｍ）の勾配を使用して行った。
実施例４８：環状ＰＹＹ類似体配列番号４８の合成
工程２（３０分の結合時間）においてパルミチン酸の代わりにオクタデカン二酸モノ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（ＡｓｔａＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．）を使用し、３０位の代わりに２２位にリンカー−脂質配列を配置して、実施例４３に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。粗直鎖状ペプチドを、２０〜７０％Ｂの勾配を使用して、実施例１９に記載の修正に従って精製及び環化した。最終生成物の精製は、３６分かけて２０〜７０％Ｂ（３０ｍｐｍ）の勾配を使用して行った。
実施例４９：環状ＰＹＹ類似体配列番号４９の合成
工程２においてα−トコフェリルオキシ酢酸（ＡｃＶｉｔＥ）（８）の代わりに１６−テトラヒドロピラン−２−イルオキシパルミチン酸を使用し、工程４（実施例９、工程２）においてｍ−ブロモメチル安息香酸の代わりにｍ−クロロメチル安息香酸を使用して、実施例１１に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。６０％ ＥｔＯＨ／Ｈ２ＯをＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏの代わりに溶媒として使用し、飽和水性ＮａＨＣＯ３を、工程４においてＮＨ４ＯＡｃ緩衝液の代わりに使用して環化を引き起こした。生成物の精製は、Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８ ＯＢＤカラム（５０×２５０ｍｍ、５μｍ）を使用して、室温で行った。移動相は、緩衝液Ａ（水中１０ｍＭ ＮＨ４ＯＨ、ｐＨ約９）、及び５分かけて初期濃度２０％Ｂから中間濃度１０％Ｂ（１００ｍｐｍ）、そして４０分かけて最終濃度３０％Ｂ（１００ｍｐｍ）の範囲の緩衝液Ｂ（ＭｅＣＮ）の勾配溶出からなった。
実施例５０：環状ＰＹＹ類似体配列番号５０の合成
実施例４８に記載の手順に従い、３０位の代わりに２３位にリンカー−脂質配列を配置して、表題化合物を調製した。
実施例５１：環状ＰＹＹ類似体配列番号５１の合成
３０位のＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｐａｌ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ）−ＯＨ（Ａｃｔｉｖｅ Ｐｅｐｔｉｄｅから）を使用し、工程１において４位のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨを使用して、実施例９に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。６０％ ＥｔＯＨ／Ｈ２ＯをＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏの代わりに溶媒として使用し、飽和水性ＮａＨＣＯ３を、工程４においてＮＨ４ＯＡｃ緩衝液の代わりに使用して環化を引き起こした。生成物の精製は、Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８ ＯＢＤカラム（５０×２５０ｍｍ、５μｍ）を使用して、室温で行った。移動相は、緩衝液Ａ（水中１０ｍＭ ＮＨ４ＯＨ、ｐＨ約９）、及び５分かけて初期濃度１０％Ｂから中間濃度２０％Ｂ（１００ｍｐｍ）、そして４０分かけて最終濃度３０％Ｂ（１００ｍｐｍ）の範囲の緩衝液Ｂ（ＭｅＣＮ）の勾配溶出からなった。不純な画分を、５分かけて初期濃度１０％Ｂから中間濃度２０％Ｂ（１００ｍｐｍ）、そして６０分かけて最終濃度３０％Ｂ（１００ｍｐｍ）で構成される勾配を使用して再クロマトグラフした。
実施例５２：環状ＰＹＹ類似体配列番号５２の合成
Ｆｍｏｃ−ｄＰＥＧ１２−カルボン酸を、直列Ｆｍｏｃ−ＯＥＧ−ＯＨ単位の代わりに使用し、それを、工程２においてＦｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ及びパルミチン酸と共に組み込んで、実施例４３に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。リンカー−脂質配列を３０位の代わりに１１位に配置した。粗直鎖状ペプチドを、２０〜７０％Ｂの勾配を使用して、実施例１９に記載の修正に従って精製及び環化した。最終生成物の精製は、３６分かけて２０〜７０％Ｂ（３０ｍｐｍ）の勾配を使用して行った。
実施例５３：環状ＰＹＹ類似体配列番号５３の合成
Ｆｍｏｃ−ｄＰＥＧ１２−カルボン酸の代わりに直列の４単位のＦｍｏｃ−ＯＥＧ−ＯＨを使用して、実施例５２に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。
実施例５４：環状ＰＹＹ類似体配列番号５４の合成
２つの代わりに直列の２単位のＦｍｏｃ−ＯＥＧ−ＯＨを配置して、実施例５３に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。
実施例５５：環状ＰＹＹ類似体配列番号５５の合成
３０位の代わりに２３位にリンカー−脂質配列を配置して、実施例４３に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。粗直鎖状ペプチドを、２０〜７０％Ｂの勾配を使用して、実施例１９に記載の修正に従って精製及び環化した。最終生成物の精製は、３６分かけて２０〜７０％Ｂ（３０ｍｐｍ）の勾配を使用して行った。
実施例５６：環状ＰＹＹ類似体配列番号５６の合成
工程２においてα−トコフェリルオキシ酢酸（ＡｃＶｉｔＥ）（８）の代わりに（４’−クロロビフェニル−４−ｙｌ）酢酸を使用し、工程４（実施例９、工程２）においてｍ−ブロモメチル安息香酸の代わりにｍ−クロロメチル安息香酸を使用して、実施例１１に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。６０％ ＥｔＯＨ／Ｈ２ＯをＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏの代わりに溶媒として使用し、飽和水性ＮａＨＣＯ３を、工程４においてＮＨ４ＯＡｃ緩衝液の代わりに使用して環化を引き起こした。生成物の精製は、Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８ ＯＢＤカラム（５０×２５０ｍｍ、５μｍ）を使用して、室温で行った。移動相は、緩衝液Ａ（水中１０ｍＭ ＮＨ４ＯＨ、ｐＨ約９）、及び４０分かけて１０〜２８％Ｂ（１００ｍｐｍ）の範囲の緩衝剤Ｂ（ＭｅＣＮ）の勾配溶出からなった。
実施例５７：環状ＰＹＹ類似体配列番号５７の合成
工程２においてα−トコフェリルオキシ酢酸（ＡｃＶｉｔＥ）（８）の代わりに３−［（２，４−ジクロロフェノキシ）フェン−４−イル］プロピオン酸を使用し、工程４（実施例９、工程２）においてｍ−ブロモメチル安息香酸の代わりにｍ−クロロメチル安息香酸を使用して、実施例１１に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。６０％ ＥｔＯＨ／Ｈ２ＯをＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏの代わりに溶媒として使用し、飽和水性ＮａＨＣＯ３を、工程４においてＮＨ４ＯＡｃ緩衝液の代わりに使用して環化を引き起こした。生成物の精製は、Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８ ＯＢＤカラム（５０×２５０ｍｍ、５μｍ）を使用して、室温で行った。移動相は、緩衝液Ａ（水中１０ｍＭ ＮＨ４ＯＨ、ｐＨ約９）、及び４０分かけて１０〜３０％Ｂ（８０ｍｐｍ）の範囲の緩衝剤Ｂ（ＭｅＣＮ）の勾配溶出からなった。生成物含有画分を合わせ、ＴＦＡで酸性化し、濃縮し、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｏｌａｒｉｓ Ｃ１８−Ａカラム（３０×２５０ｍｍ、１００Å、５μｍ）上で、室温で再クロマトグラフした。移動相は、緩衝液Ａ（水中０．１％ ＴＦＡ）、及び４５分かけて初期濃度２０％Ｂから中間濃度１５％Ｂ（４０ｍｐｍ）、そして最終濃度４５％Ｂ（４０ｍｐｍ）の範囲の緩衝液Ｂ（ＭｅＣＮ中０．１％ ＴＦＡ）の勾配溶出からなった。
実施例５８：環状ＰＹＹ類似体配列番号５８の合成
工程２においてα−トコフェリルオキシ酢酸（ＡｃＶｉｔＥ）（８）の代わりに１１−（４−フルオロフェニル｝ウンデカン酸を使用し、工程４（実施例９、工程２）においてｍ−ブロモメチル安息香酸の代わりにｍ−クロロメチル安息香酸を使用して、実施例１１に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。６０％ ＥｔＯＨ／Ｈ２ＯをＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏの代わりに溶媒として使用し、飽和水性ＮａＨＣＯ３を、工程４においてＮＨ４ＯＡｃ緩衝液の代わりに使用して環化を引き起こした。生成物の精製は、Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８ ＯＢＤカラム（５０×２５０ｍｍ、５μｍ）を使用して、室温で行った。移動相は、緩衝液Ａ（水中１０ｍＭ ＮＨ４ＯＨ、ｐＨ約９）、及び４０分かけて１５〜３５％Ｂ（１００ｍｐｍ）の範囲の緩衝剤Ｂ（ＭｅＣＮ）の勾配溶出からなった。
実施例５９：環状ＰＹＹ類似体配列番号５９の合成
工程２を省略し、工程１にパルミチン酸結合を組み込んで、実施例４３に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。リンカー−脂質配列を１１位の代わりに２２位に配置した。粗直鎖状ペプチドを、２０〜７０％Ｂの勾配を使用して、実施例１９に記載の修正に従って精製及び環化した。最終生成物の精製は、３６分かけて２０〜７０％Ｂ（３０ｍｐｍ）の勾配を使用して行った。
実施例６０：環状ＰＹＹ類似体配列番号６０の合成
４つの代わりに直列の２つのＦＭＯＣ−ＯＥＧ−ＯＨ単位を組み込み、１１位の代わりに７位にリンカー−脂質配列を配置して、実施例５３に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。粗直鎖状ペプチドを、２０〜８０％Ｂの勾配を使用して、実施例１９に記載の修正に従って精製及び環化した。最終生成物の精製は、３６分かけて２０〜８０％Ｂ（３０ｍｐｍ）の勾配を使用して行った。
実施例６１：環状ＰＹＹ類似体配列番号６１の合成
工程２においてα−トコフェリルオキシ酢酸（ＡｃＶｉｔＥ）（８）の代わりに１１−［（４−トリフルオロメチル）フェニル｝ウンデカン酸を使用し、工程４（実施例９、工程２）においてｍ−ブロモメチル安息香酸の代わりにｍ−クロロメチル安息香酸を使用して、実施例１１に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。６０％ ＥｔＯＨ／Ｈ２ＯをＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏの代わりに溶媒として使用し、飽和水性ＮａＨＣＯ３を、工程４においてＮＨ４ＯＡｃ緩衝液の代わりに使用して環化を引き起こした。生成物の精製は、Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８ ＯＢＤカラム（５０×２５０ｍｍ、５μｍ）を使用して、室温で行った。移動相は、緩衝液Ａ（水中１０ｍＭ ＮＨ４ＯＨ、ｐＨ約９）、及び４０分かけて１５〜３５％Ｂ（１００ｍｐｍ）の範囲の緩衝剤Ｂ（ＭｅＣＮ）の勾配溶出からなった。
実施例６２：環状ＰＹＹ類似体配列番号６２の合成
工程２においてα−トコフェリルオキシ酢酸（ＡｃＶｉｔＥ）（８）の代わりに１１，１１，１１−トリフルオロウンデカン酸を使用し、工程４（実施例９、工程２）においてｍ−ブロモメチル安息香酸の代わりにｍ−クロロメチル安息香酸を使用して、実施例１１に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。６０％ ＥｔＯＨ／Ｈ２ＯをＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏの代わりに溶媒として使用し、飽和水性ＮａＨＣＯ３を、工程４においてＮＨ４ＯＡｃ緩衝液の代わりに使用して環化を引き起こした。生成物の精製は、Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８ ＯＢＤカラム（５０×２５０ｍｍ、５μｍ）を使用して、室温で行った。移動相は、緩衝液Ａ（水中１０ｍＭ ＮＨ４ＯＨ、ｐＨ約９）、及び４０分かけて１０〜２８％Ｂ（１００ｍｐｍ）の範囲の緩衝剤Ｂ（ＭｅＣＮ）の勾配溶出からなった。
実施例６３：環状ＰＹＹ類似体配列番号６３の合成
工程２においてα−トコフェリルオキシ酢酸（ＡｃＶｉｔＥ）（８）の代わりに１５，１５，１５−トリフルオロペンタウンデカン酸を使用し、工程４（実施例９、工程２）においてｍ−ブロモメチル安息香酸の代わりにｍ−クロロメチル安息香酸を使用して、実施例１１に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。６０％ ＥｔＯＨ／Ｈ２ＯをＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏの代わりに溶媒として使用し、飽和水性ＮａＨＣＯ３を、工程４においてＮＨ４ＯＡｃ緩衝液の代わりに使用して環化を引き起こした。生成物の精製は、Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８ ＯＢＤカラム（５０×２５０ｍｍ、５μｍ）を使用して、室温で行った。移動相は、緩衝液Ａ（水中１０ｍＭ ＮＨ４ＯＨ、ｐＨ約９）、及び４０分かけて１５〜３０％Ｂ（１００ｍｐｍ）の範囲の緩衝剤Ｂ（ＭｅＣＮ）の勾配溶出からなった。
実施例６４：環状ＰＹＹ類似体配列番号６４の合成
工程２においてα−トコフェリルオキシ酢酸（ＡｃＶｉｔＥ）（８）の代わりに１６−エトキシパルミチン酸を使用し、工程４（実施例９、工程２）においてｍ−ブロモメチル安息香酸の代わりにｍ−クロロメチル安息香酸を使用して、実施例１１に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。６０％ ＥｔＯＨ／Ｈ２ＯをＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏの代わりに溶媒として使用し、飽和水性ＮａＨＣＯ３を、工程４においてＮＨ４ＯＡｃ緩衝液の代わりに使用して環化を引き起こした。生成物の精製は、Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８ ＯＢＤカラム（５０×２５０ｍｍ、５μｍ）を使用して、室温で行った。移動相は、緩衝液Ａ（水中１０ｍＭ ＮＨ４ＯＨ、ｐＨ約９）、及び４０分かけて１５〜３０％Ｂ（１００ｍｐｍ）の範囲の緩衝剤Ｂ（ＭｅＣＮ）の勾配溶出からなった。
実施例６５：環状ＰＹＹ類似体配列番号６５の合成
工程２においてα−トコフェリルオキシ酢酸（ＡｃＶｉｔＥ）（８）の代わりに１３，１３，１４，１４，１５，１５，１６，１６，１６−Ｄ９−パルミチン酸（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅｓ）を使用し、工程４（実施例９、工程２）においてｍ−ブロモメチル安息香酸の代わりにｍ−クロロメチル安息香酸を使用して、実施例１１に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。６０％ ＥｔＯＨ／Ｈ２ＯをＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏの代わりに溶媒として使用し、飽和水性ＮａＨＣＯ３を、工程４においてＮＨ４ＯＡｃ緩衝液の代わりに使用して環化を引き起こした。生成物の精製は、Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８ ＯＢＤカラム（５０×２５０ｍｍ、５μｍ）を使用して、室温で行った。移動相は、緩衝液Ａ（水中１０ｍＭ ＮＨ４ＯＨ、ｐＨ約９）、及び５分かけて１５〜２０％Ｂ（１００ｍｐｍ）から、そして４０分かけて３５％Ｂ（１００ｍｐｍ）の範囲の緩衝剤Ｂ（ＭｅＣＮ）の勾配溶出からなった。
実施例６６：環状ＰＹＹ類似体配列番号６６の合成
工程２においてα−トコフェリルオキシ酢酸（ＡｃＶｉｔＥ）（８）の代わりに１１−［（２，４−ビス（トリフルオロメチル）フェニル］ウンデカン酸を使用し、工程４（実施例９、工程２）においてｍ−ブロモメチル安息香酸の代わりにｍ−クロロメチル安息香酸を使用して、実施例１１に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。６０％ ＥｔＯＨ／Ｈ２ＯをＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏの代わりに溶媒として使用し、飽和水性ＮａＨＣＯ３を、工程４においてＮＨ４ＯＡｃ緩衝液の代わりに使用して環化を引き起こした。生成物の精製は、Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８ ＯＢＤカラム（５０×２５０ｍｍ、５μｍ）を使用して、室温で行った。移動相は、緩衝液Ａ（水中１０ｍＭ ＮＨ４ＯＨ、ｐＨ約９）、及び４０分かけて１５〜３５％Ｂ（１００ｍｐｍ）の範囲の緩衝剤Ｂ（ＭｅＣＮ）の勾配溶出からなった。
実施例６７：環状ＰＹＹ類似体配列番号６７の合成
工程２においてα−トコフェリルオキシ酢酸（ＡｃＶｉｔＥ）（８）の代わりに１１−［（３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル］ウンデカン酸を使用し、工程４（実施例９、工程２）においてｍ−ブロモメチル安息香酸の代わりにｍ−クロロメチル安息香酸を使用して、実施例１１に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。６０％ ＥｔＯＨ／Ｈ２ＯをＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏの代わりに溶媒として使用し、飽和水性ＮａＨＣＯ３を、工程４においてＮＨ４ＯＡｃ緩衝液の代わりに使用して環化を引き起こした。生成物の精製は、Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８ ＯＢＤカラム（５０×２５０ｍｍ、５μｍ）を使用して、室温で行った。移動相は、緩衝液Ａ（水中１０ｍＭ ＮＨ４ＯＨ、ｐＨ約９）、及び４０分かけて１５〜３５％Ｂ（１００ｍｐｍ）の範囲の緩衝剤Ｂ（ＭｅＣＮ）の勾配溶出からなった。
実施例６８：環状ＰＹＹ類似体配列番号６８の合成
１．（Ｆｍｏｃ）−βＡ−ＩＫＰＥＡＰＧＥＫ（Ａｌｌｏｃ）ＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＣＶＴＲＱ（ｐｓｉ−Ｒ３５Ｙ３６）−Ｓｉｅｂｅｒ樹脂の合成
実施例１、工程２からの事前充填された（ｐｓｉ−Ｒ３５，Ｙ３６）−Ｓｉｅｂｅｒ樹脂（０．１ｍｍｏｌ）上へのアミノ酸延長は、溶媒としてＤＭＦ、６倍過剰の保護されたアミノ酸、及びＨＡＴＵ／ＤＩＥＡプロトコル（１０分間、二重結合）を使用して、室温で行われた。２段階Ｆｍｏｃ脱保護プロトコルを全体にわたって使用した（ＤＭＦ中２０％ピペリジン；室温；１０分、１５分）。
２．（Ｆｍｏｃ）−βＡ−ＩＫＰＥＡＰＧＥＫ（（ＯＥＧ）２−γ−Ｇｌｕ−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）１６ＣＯ２ｔＢｕ）−ＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＣＶＴＲＱ（ｐｓｉ−Ｒ３５Ｙ３６）−Ｓｉｅｂｅｒ樹脂の合成
各処理について１０分間の修正した反応時間を使用して、実施例１、工程４に記載の方法に従って、上記の樹脂の脱保護を行った。次いで、ＤＭＦ中でＨＡＴＵ／ＤＩＥＡプロトコル（１時間、室温）を使用して、樹脂を中間体２（１５）（５当量）と結合させた。
３．（ＢｒＡｃ）−βＡ−ＩＫＰＥＡＰＧＥＫ（（ＯＥＧ）２−γ−Ｇｌｕ−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）１６ＣＯ２ｔＢｕ）−ＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＣＶＴＲＱ（ｐｓｉ−Ｒ３５Ｙ３６）−Ｓｉｅｂｅｒ樹脂の合成
Ｆｍｏｃ脱保護（２０％ピペリジン／ＤＭＦ）後、上記の樹脂をブロモ酢酸無水物（１０当量、室温、３０分間））で処理してブロモアセチル化樹脂を得た。
４．（ＢｒＡｃ）−βＡ−ＩＫＰＥＡＰＧＥＫ（（ＯＥＧ）２−γ−Ｇｌｕ−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）１６ＣＯ２ｔＢｕ）−ＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＣＶＴＲＱ（ｐｓｉ−Ｒ３５Ｙ３６）−ＣＯＮＨ２の合成
上記の樹脂を、室温で１．５時間、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＰＳ（９５：２．５：２．５）からなる切断カクテルで処理した。実施例１、工程７に記載の手順に従って、粗ペプチドをエーテルで沈殿させた。
５．環状ＰＹＹ類似体配列番号６８
上記で得られた粗ペプチドを、１０％ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ中１０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、ＴＥＡを添加して溶液ｐＨを８〜９に上昇させた。室温で約２０分間撹拌した後、ＴＦＡを添加してｐＨを２に下げ、溶液を、Ｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｃ１８ Ｅｖｏカラム（３０×１００ｍｍ、１００Å、５μｍ）上で分取ＨＰＬＣにより直接精製した。移動相は、緩衝液Ａ（水中０．１％ ＴＦＡ）、及び２２分かけて２０〜６０％Ｂの範囲の緩衝液Ｂ（ＭｅＣＮ中０．１％ ＴＦＡ）の勾配溶出からなった。ＵＶ検出は、２２０及び２５４ｎｍで監視された。純粋な画分を合わせ、次いで凍結乾燥させて、綿様の固体として生成物を得た。
実施例６９：環状ＰＹＹ類似体配列番号６９の合成
１．（Ｂｏｃ）−Ｇ−ＩＳＰＥＡＰＧＥＫ（ｄｄｅ）ＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬＥ（ＯＡｌｌｙｌ）ＴＲＱ（ｐｓｉ−Ｒ３５Ｙ３６）−Ｓｉｅｂｅｒ樹脂の合成
実施例１、工程２からの事前充填された（ｐｓｉ−Ｒ３５，Ｙ３６）−Ｓｉｅｂｅｒ樹脂（０．１ｍｍｏｌ）上へのアミノ酸延長は、溶媒としてＤＭＦ、６倍過剰の保護されたアミノ酸、及びＨＡＴＵ／ＮＭＭプロトコル（１０分間、二重結合）を使用して、室温で行われた。２段階Ｆｍｏｃ脱保護プロトコルを全体にわたって使用した（ＤＭＦ中２０％ピペリジン；室温；１０分、１５分）。
２．（Ｂｏｃ）−Ｇ−ＩＳＰＥＡＰＧＥＫ（ｄｄｅ）ＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬＥ（ＮＨＳ）ＴＲＱ（ｐｓｉ−Ｒ３５Ｙ３６）−Ｓｉｅｂｅｒ樹脂の合成
各処理について１０分間の修正した反応時間を使用して、実施例１、工程４に記載の方法に従って、上記の樹脂のＡｌｌｏｃ脱保護を行った。次いで、ＤＭＦ中でＨＡＴＵ／ＤＩＥＡプロトコル（１時間、室温、二重結合）を使用して、樹脂をＮＨＳ（１０当量）と結合させた。
３．（ＮＨ２）−Ｇ−ＩＳＰＥＡＰＧＥＫ（ｄｄｅ）ＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬＥ（ＮＨＳ）ＴＲＱ（ｐｓｉ−Ｒ３５Ｙ３６）の合成
上記の樹脂を、室温で１．５時間、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＰＳ（９５：２．５：２．５）からなる切断カクテルで処理した。実施例１、工程７に記載の手順に従って、粗ペプチドをエーテルで沈殿させた。
４．環状ＰＹＹ類似体配列番号６９
上記で得られた粗ペプチドを、ＤＭＳＯ中８０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、ＴＥＡ（２５当量）を添加して、ラクタム化を引き起こした。室温で約３０分間撹拌した後、反応物を１０％ＭｅＣＮ／水で１０倍希釈し、ｐＨを２に調整し、粗ペプチドを、Ｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｃ１８ Ｅｖｏカラム（３０×１００ｍｍ、１００Å、５μｍ）上で分取ＨＰＬＣにより直接精製した。移動相は、緩衝液Ａ（水中０．１％ ＴＦＡ）、及び２２分かけて１０〜６０％Ｂの範囲の緩衝液Ｂ（ＭｅＣＮ中０．１％ ＴＦＡ）の勾配からなった。ＵＶ検出は、２２０及び２５４ｎｍで監視された。純粋な画分を合わせ、次いで凍結乾燥させて、Ｋ（Ｄｄｅ）保護されたペプチドを得た。室温で３０分間、２％ヒドラジン／ＤＭＦ（１０ｍｇペプチド／ｍＬ）を使用して、Ｄｄｅ保護基を除去した。反応物を１０％ＭｅＣＮ／水で１０倍希釈し、ｐＨをＴＦＡで２に調整し、粗ペプチド溶液を上記のように精製して、綿様固体として生成物を得た。
実施例７０：環状ＰＹＹ類似体配列番号７０の合成
３０位のＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ｅ（ＯＡｌｌ）−ＯＨを使用し、３１位のＦｍｏｃ−Ｅ（ＯＡｌｌ）−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨを使用して、実施例６９の手順に従って、表題化合物を調製した。
実施例７１：環状ＰＹＹ類似体配列番号７１の合成
１．（Ｂｏｃ）−Ｇ−ＩＳＰＥＡＰＧＥＫ（ｄｄｅ）ＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮ Ｅ（ＯＡｌｌｙｌ）ＶＴＲＱ（Ｎ−Ｍｅ−Ｒ）Ｙ−ＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＲ樹脂の合成
実施例６９、工程１に記載の手順を使用して、ＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＲ樹脂（０．１ｍｍｏｌ）上へのアミノ酸延長を行った。
２．環状ＰＹＹ類似体配列番号７１
実施例６９、工程２〜４に記載の手順に従って、上記の樹脂から表題化合物を調製した。
実施例７２：環状ＰＹＹ類似体配列番号７２の合成
１．（Ｓ）−２２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４３，４３−ジメチル−１０，１９，２４，４１−テトラオキソ−３，６，１２，１５，４２−ペンタオキサ−９，１８，２３−トリアザテトラテトラコンタン−１−ｏｉｃＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの合成
１．０ｍＬのＤＭＦ中の（Ｓ）−２２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４３，４３−ジメチル−１０，１９，２４，４１−テトラオキソ−３，６，１２，１５，４２−ペンタオキサ−９，１８，２３−トリアザテトラテトラコンタン−１−酸（中間体２（１６））（５４．０ｍｇ、０．０６３ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１４．６ｍｇ、０．１２７ｍｍｏｌ）、及びＨＡＴＵ（２４．１ｍｇ、０．０６３ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＥＡ（０．０２２ｍＬ、０．１２７ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で３０分間撹拌し、更に精製することなく次の工程で直接使用した。
２．環状ＰＹＹ類似体配列番号７２の合成
ＤＭＦ（０．２ｍＬ）中の［シクロ−（Ｇ２−Ｅ３０），Ｓ４，Ｋ１１，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ２−３６（実施例７０で調製された）（４ｍｇ、０．９６μｍｏｌ）の溶液に、２４μＬのＮ−ヒドロキシエステル溶液（工程１で調製）及びＴＥＡ（０．６６μＬ；５当量）を添加し、混合物を室温で一晩撹拌した。反応物を１０％ＭｅＣＮ／水で１０倍希釈し、ｐＨをＴＦＡで２に調整し、粗ペプチドを、Ｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｃ１８ Ｅｖｏカラム（３０×１００ｍｍ、１００Å、５μｍ）上で分取ＨＰＬＣにより直接精製した。移動相は、緩衝液Ａ（水中０．１％ ＴＦＡ）、及び２２分かけて１０〜６０％Ｂの範囲の緩衝液Ｂ（ＭｅＣＮ中０．１％ ＴＦＡ）の勾配溶出からなった。ＵＶ検出は、２２０及び２５４ｎｍで監視された。純粋な画分を合わせ、次いで凍結乾燥させて、ｔ−ブチルエステル保護されたペプチドを得た。ｔ−ブチルエステル保護基を、室温で１．５時間、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＰＳ（９５：２．５：２．５）の混合物を使用して除去した。混合物を濃縮し、ペプチドを上記のとおり精製して、綿様固体として生成物を得た。
実施例７３：環状ＰＹＹ類似体配列番号７３の合成
工程５においてＮ−Ｆｍｏｃ−ｄＰＥＧ１２−カルボン酸の代わりにＮ−Ｆｍｏｃ−ｄＰＥＧ６−カルボン酸を使用して、実施例１に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。
実施例７４：環状ＰＹＹ類似体配列番号７４の合成
実施例１に記載の手順に従うが、ＰＥＧリンカー結合工程５を省略して、表題化合物を調製した。
実施例７５：環状ＰＹＹ類似体配列番号７５の合成
３１位のＦｍｏｃ−ｈＣ（ｔｒｔ）−ＯＨに代わりＦｍｏｃ−Ｃ（ｔｒｔ）−ＯＨを使用し、工程３においてＦｍｏｃ−βＡ−ＯＨ結合工程を省略して、実施例１に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。
実施例７６：環状ＰＹＹ類似体配列番号７６の合成
工程３及び工程４に修正を加えて、実施例１に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。工程Ａにおいて、Ｆｍｏｃ−Ｋ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨ及びＦｍｏｃ−Ｋ（ｄｄｅ）−ＯＨを、それぞれ３０位及び１１位に使用した。３０位のＡｌｌｏｃをＰｄ（ＰＰｈ３）４−フェニルシランで脱保護した後、ｍＰＥＧ１６−カルボン酸をＨＡＴＵ ＤＩＰＥＡと結合させた。工程４において、ＤＭＦ中２％ヒドラジンを用いて、１１位のｄｄｅを除去した。
実施例７７：環状ＰＹＹ類似体配列番号７７の合成
工程ＡにおいてｍＰＥＧ１６−カルボン酸の代わりにｍＰＥＧ１２−カルボン酸を使用し、工程５においてＦｍｏｃ−ｄＰＥＧ１２−カルボン酸結合工程を省略して、実施例７６に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。
実施例７８：環状ＰＹＹ類似体配列番号７８の合成
工程３においてＦｍｏｃ−Ｑ（ｔｒｔ）−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ｎ−Ｍｅ−Ｑ（ｔｒｔ）−ＯＨを使用して、実施例１に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。
実施例７９：環状ＰＹＹ類似体配列番号７９の合成
工程１ＢにおいてＦｍｏｃ−Ｒ（ｐｂｆ）−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ｎ−Ｍｅ−Ｒ（ｐｂｆ）−ＯＨを使用して、実施例１に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。
実施例８０：環状ＰＹＹ類似体配列番号８０の合成
４位のＦｍｏｃ−Ｋ（Ｂｏｃ）−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ｒ（ｐｂｆ）−ＯＨを使用し、工程３において３０位のＦｍｏｃ−Ｌ−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ｗ（Ｂｏｃ）−ＯＨを使用して、実施例７９に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。
実施例８１：環状ＰＹＹ類似体配列番号８１の合成
３１位のＦｍｏｃ−ｈＣ（ｔｒｔ）−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ｃ（ｔｒｔ）−ＯＨを使用し、工程３においてＦｍｏｃ−βＡ−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−γ−アミノブタン酸を使用して、実施例８０に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。
実施例８２：環状ＰＹＹ類似体配列番号８２の合成
Ｆｍｏｃ−βＡ−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−ＰＥＧ２−カルボン酸を使用し、３１位のＦｍｏｃ−ｈＣ（ｔｒｔ）−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ｃ（ｔｒｔ）−ＯＨを使用し、工程３においてＦｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨの結合を省略して、実施例１に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。
実施例８３：環状ＰＹＹ類似体配列番号８３の合成
３１位のＦｍｏｃ−ｈＣ（ｔｒｔ）−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ｋ（Ｎ３）−ＯＨを使用し、工程３においてＦｍｏｃ−βＡ−ＯＨの代わりにペンタ−４−イン酸を使用し、以下の環化手順Ｂに従う、実施例１に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。
環化手順Ｂ：２ｍＬのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中の１１位に配置されたＰＥＧ１２−ＡｃＢｒ（３８ｍｇ、０．００６７ｍｍｏｌ）で完全に脱保護されたペプチドの溶液に、１．７ｍＬの予備混合されたＣｕＳＯ４／ＴＢＴＡ溶液を添加し（溶液は、水（０．４ｍＬ）中２．２ｍｇのＣｕＳＯ４の溶液と、ＥｔＯＨ中１１ｍｇの溶液とを混合することによって調製された）、続いて水（１ｍＬ）中７ｍｇのアスコルビン酸ナトリウムを添加した。透明な反応溶液を室温で混合し、ＨＰＬＣにより監視した。３０分後、反応は完了し、ＴＦＡを用いて反応混合物をｐＨ４に調整し、ＨＰＬＣ精製（Ｐｕｒｓｕｉｔ ＸＲＳ ５ ２５０×３０ｍｍ Ｃ１８カラム、３０ｍｐｍ流量で実行し、２１４ ｎＭ波長を監視し、３６分かけて２０〜６０％ ＡＣＮ−水／水（両方とも０．１％ ＴＦＡを有する）の範囲の勾配を用いた）を行った。所望の画分を回収し、凍結乾燥した。
実施例８４：環状ＰＹＹ類似体配列番号８４の合成
Ｆｍｏｃ−βＡ−ＯＨ結合工程を省略し、工程５においてＦｍｏｃ−ｄＰＥＧ１２−カルボン酸の代わりにＮ３−ＰＥＧ８カルボン酸を使用し、工程３においてブロモ酢酸無水物アシル化の代わりにＤＩＣと結合する３−（ブロモメチル）安息香酸を使用し、以下の環化手順Ｃに従う、実施例１に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。
環化手順Ｃ：５ｍＬの脱気水中の完全に脱保護されたペプチド（２０ｍｇ、０．００３５ｍｍｏｌ）の溶液に、水性ＮａＨＣＯ３溶液を添加して、反応混合物をｐＨ６．４以上に調整した。２０分後、ＬＣＭＳは反応が完了したことを示し、ＴＦＡを用いて反応混合物をｐＨ４に調整し、ＨＰＬＣ精製（Ｐｕｒｓｕｉｔ ＸＲＳ ５ ２５０×３０ｍｍ Ｃ１８カラム、３０ｍｐｍ流量で実行し、２１４ ｎＭ波長を監視し、３６分かけて１０〜６０％ ＡＣＮ−水／水（両方とも０．１％ ＴＦＡを有する）の範囲の勾配を用いた）を行った。所望の画分を回収し、凍結乾燥した。
環化後、環化中間体は、Ｎ−（１−ブロモ−２−オキソ−７，１０，１３−トリオキサ−３−アザヘキサデカン−１６−イル）ペンタ−４−インアミドを用いた環化手順Ｂに従って、クリックケミストリーによってリンカー延長を受け、これは、ＨＡＴＵ−ＤＩＰＥＡを使用して、Ｎ−Ｂｏｃ−ＰＥＧ４−ＮＨ２をペンタ−４−イン酸と結合させ、続いてＴＦＡでＢｏｃを脱保護し、ＴＥＡの存在下でブロモ酢酸無水物でアシル化することによって調製した。
実施例８５：環状ＰＹＹ類似体配列番号８５の合成
１１位の代わりに２３位に配置されたＰＥＧ１２−ＡｃＢｒリンカーを用いて、実施例１に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。
実施例８６：環状ＰＹＹ類似体配列番号８６の合成
１１位の代わりに２２位に配置されたＰＥＧ１２−ＡｃＢｒリンカーを用いて、実施例１に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。
実施例８７：環状ＰＹＹ類似体配列番号８７の合成
１１位の代わりに７位に配置されたＰＥＧ１２−ＡｃＢｒリンカーを用いて、実施例１に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。
実施例８８：環状ＰＹＹ類似体配列番号８８の合成
３１位のＦｍｏｃ−ｈＣ（ｔｒｔ）−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ｖ−ＯＨを使用し、３０位のＦｍｏｃ−Ｌ−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ｃ（ｔｒｔ）−ＯＨを使用し、工程３においてＦｍｏｃ−βＡ−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ｇ−ＯＨを使用して、実施例１に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。
実施例８９：環状ＰＹＹ類似体配列番号８９の合成
工程１を省略して還元ジペプチドを作製し、工程２においてＦｍｏｃ−ｐｓｉ−（Ｒ３５−Ｎ（Ｂｏｃ）−Ｙ３６）−ＯＨ充填の代わりにＦｍｏｃ−（Ｎ−Ｍｅ）Ｒ−ＯＨとの結合が続くＦｍｏｃ−Ｙ（ｔＢｕ）−ＯＨ充填を使用して、実施例８８に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。
実施例９０：環状ＰＹＹ類似体配列番号９０の合成
工程３においてＦｍｏｃ−Ｇ−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−βＡ−ＯＨを使用して、実施例８９に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。
実施例９１：環状ＰＹＹ類似体配列番号９１の合成
工程３において３０位のＦｍｏｃ−Ｃ（ｔｒｔ）−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−ｈＣ（ｔｒｔ）−ＯＨを使用して、実施例８９に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。
実施例９２：環状ＰＹＹ類似体配列番号９２の合成
３１位のＦｍｏｃ−Ｖ−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−ｈＣ（ｔｒｔ）−ＯＨを使用し、工程３において３０位のＦｍｏｃ−Ｃ（ｔｒｔ）−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ｌ−ＯＨを使用して、実施例９０に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。
実施例９３：環状ＰＹＹ類似体配列番号９３の合成
３１位のＦｍｏｃ−ｈＣ（ｔｒｔ）−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ｖ−ＯＨを使用し、３０位のＦｍｏｃ−Ｌ−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ｃ（ｔｒｔ）−ＯＨを使用し、工程３においてＮ末端のＦｍｏｃ−βＡ−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ｇ−ＯＨを使用して、実施例１に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。
実施例９４：環状ＰＹＹ類似体配列番号９４の合成
３１位のＦｍｏｃ−ｈＣ（ｔｒｔ）−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ｖ−ＯＨを使用し、工程３において３０位のＦｍｏｃ−Ｌ−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ｃ（ｔｒｔ）−ＯＨを使用して、実施例１に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。
実施例９５：環状ＰＹＹ類似体配列番号９５の合成
３１位のＦｍｏｃ−ｈＣ（ｔｒｔ）−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ｖ−ＯＨを使用し、３０位のＦｍｏｃ−Ｌ−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＡｌｌｏｃ）−ＯＨを使用し、１１位のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（ｄｄｅ）−ＯＨを使用し、４位のＦｍｏｃ−Ｋ（Ｂｏｃ）−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨを使用し、工程３においてＮ末端のＦｍｏｃ−βＡ−ＯＨの代わりにＢｏｃ−Ｇ−ＯＨを使用して、実施例１に記載の手順に従って、表題化合物を調製した（０．０５ｍｍｏｌスケール）。
上記から得られた樹脂に、脱酸素化ＤＣＭ（１０ｍＬ）、フェニルシラン（１０当量）、及びＤＣＭ（１ｍＬ）中のＰｄ（ＰＰｈ３）４（０．２当量）の溶液を添加し、混合物を１０分間撹拌した。反応物を排出し、樹脂を脱酸素化ＤＣＭで洗浄し、脱保護を１回繰り返した。
上記から得られた樹脂に、ＤＭＦ（１０ｍｌ）、ＨＡＴＵ（５当量）、及びＤＩＥＡ（１０当量）を添加し、混合物を５分間撹拌した後、ＤＭＦ中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１０当量）の溶液を添加し、更に２０分間撹拌した。樹脂を濾過し、手順を１回繰り返した。
上記の樹脂を、ＴＦＡ／ＴＩＰＳ／水（９５／２．５／２．５）（１０ｍｌ）中、室温で２時間脱保護した。切断カクテルを約１ｍＬに濃縮した後、４０ｍＬのエーテルに添加した。得られた沈殿物を遠心分離により回収し、Ｎ２下で乾燥させた。
上記から得られた材料を、１０当量のＴＥＡを添加した９ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、反応を室温で３時間進行させた。得られた溶液を水で３０ｍｌに希釈し、ｐＨを２に調整し、３０分で水（０．１％ ＴＦＡ）中２０〜４０％ ＡＣＮの直線勾配で溶出させる、３０ｍｍ×２５０ｍｍ Ｃ１８カラム上でＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥させた。
次いで、上記から得られた材料を１〜２％ヒドラジン／ＤＭＦ（１ｍＬ）で処理して、リジンからＤｄｅを除去した。得られた混合物を水で１０ｍＬに希釈し、ｐＨを２に調整した後、上記のようにＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。
次いで、得られた生成物を１０％ ＡＣＮ／水に溶解し、ｐＨを１０に調整し、ブロモ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（３当量の０．１Ｍ／ＤＭＦ溶液）の溶液を添加し、反応を室温で１０分間進行させた。得られた混合物を水で１０ｍＬに希釈し、ｐＨを２に調整した後、上記のようにＲＰ−ＨＰＬＣにより精製して表題生成物を得た。
実施例９６：環状ＰＹＹ類似体配列番号９６の合成
工程５においてＮ−Ｆｍｏｃ−ｄＰＥＧ１２−カルボン酸の代わりにＮ−Ｆｍｏｃ−ｄＰＥＧ２４−カルボン酸を使用して、実施例１に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。
実施例９７：環状ＰＹＹ類似体配列番号９７の合成
工程３においてＦｍｏｃ−βＡ−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−Ｇ−ＯＨを使用して、実施例１に記載の手順に従って、表題化合物を調製した。
実施例９８：環状ＰＹＹ類似体配列番号９８の合成
実施例８９に記載の手順に従うが、工程５においてＦｍｏｃ−ｄＰＥＧ１２−カルボン酸結合工程を省略して、表題化合物を調製した。
実施例９９：環状ＰＹＹ類似体配列番号９９の合成
実施例９０に記載の手順に従うが、工程５においてＦｍｏｃ−ｄＰＥＧ１２−カルボン酸結合工程を省略して、表題化合物を調製した。
実施例１００：環状ＰＹＹ類似体配列番号１００の合成
実施例９４に記載の手順に従うが、工程５においてＦｍｏｃ−ｄＰＥＧ１２−カルボン酸結合工程を省略して、表題化合物を調製した。
実施例１０１：ｍＡｂ ＭＳＣＢ９７の特定及び生成
改変のための開始Ｖ領域としてのＰＨ９Ｌ３ ＶＬ及びＰＨ９Ｈ５ ＶＨの選択
ＰＨ９Ｌ３と指定された抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）（配列番号１２８）（Ｔｅｐｌｙａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｖａｒｉｅｔｙ ｉｎ ａ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｌｉｂｒａｒｙ，」ｍＡｂｓ Ａｕｇ−Ｓｅｐ ８（６）：１０４５〜６３（２０１６））及びＰＨ９Ｈ５と指定された抗体重鎖可変領域（ＶＨ）（配列番号１２９）（Ｔｅｐｌｙａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ａ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｌｉｂｒａｒｙ，」ｍＡｂｓ Ａｕｇ−Ｓｅｐ ８（６）：１０４５〜６３（２０１６））は、ペプチドの複合を可能にするｍＡｂを改変する出発可変領域として選択された。ＰＨ９Ｌ３は、完全にヒトＩｇ生殖系列Ｖ遺伝子配列で構成され、そのため、高い親和性、抗原特異的結合をもたらすであろうインビボ親和性成熟プロセスからの任意の配列突然変異を含有しない。ＰＨ９Ｈ５のＣＤＲ３は、そのＶＨにおいてヒト生殖系列Ｖ遺伝子配列で構成されない唯一のセグメントである。ＰＨ９Ｈ５のＣＤＲ３は、抗ヒトＣＣＬ２抗体、ＣＮＴＯ８８８由来であり、配列番号１３０によって提供される。ＰＨ９Ｈ５／ＰＨ９Ｌ３ ＶＨ／ＶＬ対を含有するＦａｂを生成した。
これらが最も類似しているＰＨ９Ｌ３、ＰＨ９Ｈ５、並びにヒトＩｇ生殖系列Ｖ領域及びＪ領域配列を整列させて、生殖系列配列に対する配列同一性又は類似性を決定した。ＰＨ９Ｈ５を、ヒトＩｇ生殖系列遺伝子ＩＧＨＶ３−２３＊０１（ＰｕｂＭｅｄ ＩＤ：Ｍ９９６６０）（配列番号１３２）及びヒトＩＧＨＪ１＊０１（ＰｕｂＭｅｄ ＩＤ：Ｊ００２５６）（配列番号１３３）の連結体（配列番号１３１）に整列させ、ＰＨ９Ｈ５アミノ酸配列と連結したヒトＩＧＨＶ３−２３＊０１−ＩＧＨＪ１＊０１配列との間の唯一の差異は、ＰＨ９Ｈ５の配列番号１３０であるＶＨ ＣＤＲ３にある。
ＰＨ９Ｌ３を、ヒトＩｇ生殖系列遺伝子ＩＧＫＶ３−１１＊０１（ＰｕｂＭｅｄ ＩＤ：Ｘ０１６６８）（配列番号１３５）及びＩＧＫＪ１＊０１（ＰｕｂＭｅｄ ＩＤ：Ｊ００２４２）（配列番号１３６）の連結体（配列番号１３４）に整列させ、唯一の差異は、Ｖ遺伝子／Ｊ遺伝子の接合点における１つの偏差である。
ＰＨ９Ｈ５及びＰＨ９Ｌ３のＣｙｓ置換変異体の設計及び生成
Ｖ領域の３つ全てのＣＤＲにわたって選択ＣＤＲ残基に単一のＣｙｓ置換を含有するＰＨ９Ｈ５ ＶＨの変異体を設計し、生成し、ヒトＩｇＧ１定常領域を有する完全な重鎖として哺乳類宿主発現ベクターにクローニングした。複合のためによりアクセス可能と思われる置換のためのＣＤＲ残基の選択を補助するために、ＰＨ９Ｈ５／ＰＨ９Ｌ３ Ｆａｂ構造を利用し、変異体のいくつかにおいて、追加のグリシン（Ｇｌｙ）残基を、導入されたＣｙｓ残基のいずれかの側に挿入して、複合のためのＣｙｓのアクセス可能性を潜在的に増加させた。これらがヒトカッパ定常領域を有する完全軽鎖として発現ベクターにクローニングされたことを除いて、ＰＨ９Ｌ３ ＶＬの同様の変異体を設計し、生成した。合計２４のＰＨ９Ｈ５の単一Ｃｙｓ変異体の発現構築物、及び２２のＰＨ９Ｌ３の単一Ｃｙｓ変異体の発現構築物を生成した。ＰＨ９Ｈ５＿ＶＨ（配列番号１２９）内及びＰＨ９Ｌ３＿ＶＬ（配列番号１２８）内の置換のために選択された残基を図２に要約する。
生成された発現構築物を使用して、各ＰＨ９Ｈ５ベースのＨＣ Ｃｙｓ変異体構築物を野生型ＰＨ９Ｌ３ ＬＣ構築物と一過性に共トランスフェクトすることにより、又は各ＰＨ９Ｌ３ベースのＬＣ Ｃｙｓ変異体構築物を野生型ＰＨ９Ｈ５ＨＣ構築物と共トランスフェクトすることにより、Ｃｙｓ変異体を発現させた。初期試験トランスフェクションは、ＨＥＫ由来のＥｘｐｉ２９３を発現宿主として使用し、２０ｍＬスケールであった。ＨＣ及びＬＣ Ｃｙｓの両方の変異体の大部分は、培養上清からの変異体タンパク質定量化に基づいて良好に発現した。
５つの初期ＨＣ Ｃｙｓ変異体ＭＳＣＢ３３−ＭＳＣＢ３７を、７５０ｍＬスケールでＥｘｐｉ２９３において発現させ、変異体タンパク質を精製した。精製変異体の精製収率及び品質特性は、ほぼ同じであり、初期ペプチド複合反応において精製タンパク質を使用するのに十分であった。
ＰＨ９Ｈ５ベースのＨＣ Ｃｙｓ変異体へのペプチド複合の評価
ＭＳＣＢ３３タンパク質及び他の変異体タンパク質の分析質量決定は、ｍＡｂ当たり２つの複合のために改変されたＣｙｓにおけるシステイン付加物の存在、並びにＨＣ Ｃ末端Ｌｙｓ残基の除去を示し、これは組換えにより生成されたｍＡｂで一般的に見られる。複合のための変異体ｍＡｂを調製するために、ｍＡｂ内の天然ジスルフィド結合を維持するために開発された還元プロセスによって付加物を除去した（実施例１０３を参照されたい）。ヒトオキシントモジュリン（ＯＸＭ）ペプチド類似体（ＧＣＧ Ａｉｂ２、Ｇｌｕ１６，２４、Ａｒｇ２０、Ｌｅｕ２７、Ｌｙｓ３０−ε（ＰＥＧ１２）−ＮＨ２）との初期試験複合は、５つ全てのＨＣ Ｃｙｓ変異体ｍＡｂ上でマレイミド化学を用いて行った。複合効率はｍＡｂ変異体間で異なり、これは複合反応生成物及びそれぞれの相対的割合により定性的に推定された。最大効率は、ホモ二量体生成物の最大割合によって測定した場合、隣接Ｇｌｙ残基を含有する他のＩ１０２Ｃ変異体と比較して、ＭＳＣＢ３３で観察され、Ｙ１０３Ｃ変異体ＭＳＣＢ３５又はＭＳＣＢ３７では、複合はほとんど又は全く観察されなかった。
様々なＣＤＲ（ＰＨ９Ｈ５＿ＶＨ（配列番号１２９）におけるＴ２８Ｃ、Ｓ３０Ｃ、及びＳ５４Ｃ置換、並びにＰＨｐＬ３＿ＶＬ（配列番号１２８）におけるＳ３０Ｃ及びＳ９２Ｃ置換）における改変システイン置換を有する、いくつかの他のＨＣ及びＬＣ Ｃｙｓ変異体を、Ｅｘｐｉ２９３において大規模で発現させた。還元によるこれらの精製タンパク質からのＣｙｓ付加物の除去は困難であり、これらの変異体は更に追求されなかった。Ｃｙｓ変異体の大部分で観察された課題及びＩ１０２Ｃ ＰＨ９Ｈ５変異体ｍＡｂ、ＭＳＣＢ３３で観察された初期の良好な複合効率により、プロセス開発及び更なる改変の試みはこの特定の変異体に重点を置いた。
ＭＳＣＢ３３のＦｃ改変
ＭＳＣＢ３３は、インビボでＦｃ機能を低減するために、サイレントヒトＩｇＧ４＿ＰＡＡ Ｆｃを含有するように再度改変された。ヒトＩｇＧ４＿ＰＡＡは、ヒトＩｇＧ４アロタイプｎＧ４ｍ（ａ）上に突然変異Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａを有する（ＩＭＧＴに定義されるＩＧＨＧ４＊０１対立遺伝子に基づく）。ＩｇＧ４＿ＰＡＡ Ｆｃに融合したＭＳＣＢ３３のＶＨを有する発現構築物を生成し、ＭＳＣＢ３３発現に使用した同じＬＣ発現構築物と共に使用して、ＭＳＣＢ９７と指定されるＭＳＣＢ３３のＩｇＧ４＿ＰＡＡ変異体を生成した。ＭＳＣＢ９７ ＶＨ、ＨＣ、ＶＬ、及びＬＣのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１３７、１３８、１３９、及び１４０により提供される。
ＭＳＣＢ９７の試験発現は、Ｅｘｐｉ２９３細胞において２０ｍＬスケールで一過性に行われ、このｍＡｂ変異体は良好に発現した。ＭＳＣＢ９７を大規模なＥｘｐｉ２９３発現実行から精製した。ＭＳＣＢ９７の精製収率は２６４．５３ｍｇ／Ｌであり、品質は８５％単量体種で決定された。その後の大規模発現の実行及び精製は、収率及び品質が同様であるか、又は良好であり、このｍＡｂが生成され得る一貫性を示した。
ＭＳＣＢ９７へのペプチド複合及び複合反応のスケーラビリティの評価
ＬＣ−ＨＣジスルフィド接続性はＩｇＧ１とＩｇＧ４のアイソタイプとの間で異なるため、上述のＯＸＭ−マレイミド試験ペプチドのＴＣＥＰ還元及び複合を使用して、還元及びマレイミド複合を試験し、ＩｇＧ１ ｍＡｂ ＭＳＣＢ３３からＩｇＧ４＿ＰＡＡ ｍＡｂ ＭＳＣＢ９７へ移動可能であることが確認された。マレイミド複合から生じる連結は、潜在的に可逆性であることが知られているため、より安定した連結をもたらすブロモアセトアミド複合化学を採用し、開始ＭＳＣＢ９７に基づく１０ｍｇスケールで成功裏に実施された。
ブロモアセトアミド化学により生成されたＯＸＭ類似体ＧＣＧ Ａｉｂ２、Ｇｌｕ１６，２４、Ａｒｇ２０、Ｌｅｕ２７、Ｌｙｓ３０−ε（ＰＥＧ１２）−ＮＨ２（ＭＳＣＢ９７−ＯＸＭ１）のＭＳＣＢ９７複合体をアッセイして、インビトロＧＬＰ−１Ｒ及びＧＣＧＲの効力を決定した。参照ペプチド及び参照非構造化ポリペプチド複合体に対する効力は、妥当であり、ＭＳＣＢ３３（ＩｇＧ１）と同じペプチドで生成された複合体のものと類似していた。これは、アイソタイプであるＭＳＣＢ９７（ＩｇＧ４＿ＰＡＡ）とＭＳＣＢ３３（ＩｇＧ１）との間の単一の差が、同じペプチドを含有する複合体の効力に影響を与えなかったことを示した。加えて、これらのデータは、望ましいインビトロ効力がインビボで安定である連結をもたらすブロモアセトアミド化学により生成されたペプチド−ｍＡｂ複合体において保持され得ることを示した。他のＯＸＭ類似体もＭＳＣＢ９７に複合し、これらの複合体のインビトロ効力をアッセイした。これらの複合体は、ＭＳＣＢ９７−ＯＸＭ１に対して同様のＧＬＰ−１Ｒ及びＧＣＧＲ効力を有し、ペプチド効力を保持しながら、様々なペプチドをＭＳＣＢ９７に複合する能力を強調した。
ヒトＣＣＬ２に結合するペプチド−ＭＳＣＢ９７複合体の評価
ＭＳＣＢ９７は、特定の抗原結合の欠如のために選択及び改変されたが、このｍＡｂが結合する可能性が最も高い抗原は、ある場合、ＶＨ ＣＤＲ３の起源に基づいてヒトＣＣＬ２である。ＯＸＭペプチド類似体又はＰＹＹペプチド類似体を有する２つのペプチド−ＭＳＣＢ９７複合体を使用して、ＭＳＣＢ９７が任意の特定のＣＣＬ２結合を示すかどうかを評価した。
潜在的なＣＣＬ２結合は、複合体が抗Ｆｃ捕捉法を用いて表面固定化された表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって直接測定された。市販の抗ＣＣＬ２マウスｍＡｂは陽性対照として機能し、２つの非特異的ヒト抗体、ＣＮＴＯ ９４１２及びＨＨ３Ｂ３３は陰性対照として機能した。全ての対照を同様に表面固定化し、最大４００ｎＭの濃度で組換えヒトＣＣＬ２を固定化複合体及び対照上に流した。事前確立されたアッセイ基準に基づいて、特定の抗原結合を示すＣＣＬ２蓄積は、陽性対照では見られたが、陰性対照でも、いずれのペプチド−ＭＳＣＢ９７複合体でも見られなかった。これにより、ペプチド−ｍＡｂ複合体の関連する治療形態において、ＭＳＣＢ９７がヒトＣＣＬ２結合を欠くことが確認された。
実施例１０２：ｍＡｂの発現及び精製
完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、哺乳類発現宿主において組換えにより発現され、当該技術分野において既知の標準的な方法を用いて細胞培養上清から精製することができる。例えば、それぞれが分泌を可能にする適切なシグナルペプチドを含む、ｍＡｂの軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）をコードするｃＤＮＡ配列を、標準的な分子生物学的方法を使用して別個の哺乳類発現ベクター又は単一の発現ベクターにクローニングすることができる。使用される発現ベクターは、ｐＥＥ１２．４、ｐｃＤＮＡ（商標）３．１（＋）、又はｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３などの市販のもの、又は類似の機能性を有する任意のカスタム発現ベクターであり得る。そのようなベクターでは、ｍＡｂの重鎖及び軽鎖の転写はそれぞれ、ｈＣＭＶ−ＭＩＥプロモーターなどの既知の有効なプロモーターのいずれかによって駆動される。トランスフェクショングレードのプラスミドＤＮＡは、ＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔなどの標準的な方法を用いて、別個のＬＣ及びＨＣ発現構築物又はＬＣ及びＨＣの両方を発現する単一の構築物のために調製される。
精製プラスミドＤＮＡは、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）Ｍａｘトランスフェクション試薬などの脂質をベースとするトランスフェクション試薬（製造業者の指示に従う）でトランスフェクションするために調製され、次いで、ＣＨＯ−Ｓ又はＨＥＫ２９３−Ｆなどの標準的な哺乳類発現宿主細胞株にトランスフェクトされる。ｍＡｂ ＬＣ及びＨＣが別個の発現構築物によってコードされる場合、２つの構築物は同時にトランスフェクトされる。トランスフェクションの前及び後に、哺乳類細胞を、維持するために、又は標準的な細胞培養法に従ってｍＡｂ発現のために培養され、それにより、細胞密度は、使用する培養培地を維持するための範囲であり、その後の他の細胞培養条件は、利用される特定の哺乳類宿主細胞株によって決定される。これらのパラメータは、典型的には、細胞株が得られたベンダー、又は科学文献に記載されている。例えば、ＣＨＯ−Ｓ細胞を懸濁液中ＣＨＯ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）培地に維持し、３７℃及び８％ ＣＯ２に設定された加湿インキュベータ内で１２５ ＲＰＭで振盪し、細胞濃度が１．５〜２．０×１０６細胞／ｍＬであるときに分割する。
ｍＡｂを発現する一過性にトランスフェクトされた哺乳類細胞からの細胞培養上清を、トランスフェクションの数日後に採取し、遠心分離により清澄化し、濾過する。ＣＨＯ−Ｓ細胞の発現持続時間は、典型的には４日間であるが、調節することができ、異なる哺乳類宿主細胞株に関して異なり得る。大規模トランスフェクション（＞１０リットル）は、Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅなどの濃縮装置を使用して１０倍濃縮される。タンパク質Ａ樹脂にｍＡｂを結合させ、樹脂を洗浄し、低ｐＨ緩衝液を使用してタンパク質を溶出させる標準的な方法を利用して、ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅなどのタンパク質Ａ親和性カラムを使用して、ｍＡｂを清澄化された上清から精製する。ＰＨ７の緩衝液を含有するチューブへの溶出によって直ちにタンパク質画分を中和し、ピーク画分をプールし、濾過し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２に対して一晩、４℃で透析する。透析後、ｍＡｂを再度濾過し（０．２μフィルター）、タンパク質濃度を２８０ｎｍでの吸光度によって決定する。精製ｍＡｂタンパク質の品質は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及び分析サイズ排除ＨＰＬＣによって評価され、内毒素レベルは、ｌｉｍｕｌｕｓ ａｍｅｂｏｃｙｔｅ溶解物（ＬＡＬ）アッセイを使用して測定される。精製ｍＡｂを４℃で貯蔵する。
一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞からのＭＳＣＢ９７の発現及び精製
ＭＳＣＢ９７を、製造者の推奨に従ってＭＳＣＢ９７発現構築物の精製プラスミドＤＮＡを用いて、細胞を一過性にトランスフェクトすることにより、ＥｘｐｉＣＨＯ−Ｓ（商標）細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；カタログ番号Ａ２９１２７）において発現させた。簡潔に、ＥｘｐｉＣＨＯ−Ｓ（商標）細胞を、３７℃、８％ ＣＯ２及び１２５ＲＰＭに設定された振盪インキュベータ内で、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ２９１００）中の懸濁液中に維持した。トランスフェクションの日に、１ｍＬ当たり６．０×１０６細胞に希釈することができるように細胞を継代し、細胞生存率を９８％以上に維持する。一過性トランスフェクションは、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯトランスフェクションキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号Ａ２９１３１）を使用して行った。トランスフェクトされる希釈細胞の１ｍｌごとに、１マイクログラムのプラスミドＤＮＡを使用し、ＯｐｔｉＰＲＯ（商標）ＳＦＭ複合体形成培地に希釈する。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ試薬を、１：３比（ｖ／ｖ、ＤＮＡ：試薬）で使用し、ＯｐｔｉＰＲＯ（商標）にも希釈する。希釈したＤＮＡ及びトランスフェクション試薬を１分間組み合わせ、ＤＮＡ／脂質複合体を形成させ、次いで細胞に添加した。一晩インキュベートした後、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）フィード及びＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯエンハンサを細胞に添加した。培養上清を採取する前に、細胞を３２℃で５日間振盪しながら培養した。
一過性にトランスフェクトされたＥｘｐｉＣＨＯ−Ｓ（商標）細胞からの培養上清を、遠心分離（３０分、６０００ｒｐｍ）を通して清澄化した後、濾過した（０．２μＰＥＳ膜、Ｃｏｒｎｉｎｇ）。最初に、Ｐａｌｌ Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎシステムを使用して、大規模トランスフェクション（５〜２０リットル）を１０倍濃縮した。１０×ＤＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水）、ｐＨ７．２を、ＡＫＴＡ ＦＰＬＣクロマトグラフィシステムを使用して、樹脂１ｍＬ当たり約２０ｍｇのタンパク質の相対濃度で、平衡化した（ＤＰＢＳ、ｐＨ７．２）ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）上に充填する前に、１×最終濃度まで上清に添加した。充填後、カラムを１０カラム体積のＤＰＢＳ、ｐＨ７．２で洗浄した。タンパク質を０．１ＭのＮａ−酢酸（ｐＨ３．５）１０カラム体積で溶出させた。タンパク質画分は、溶出画分体積の２０％の２．０Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７）を入れたチューブに溶出することによって直ちに中和した。ピーク画分をプールし、必要に応じて、追加のＴｒｉｓを用いてｐＨを約５．５に調整した。精製タンパク質を濾過し（０．２μ）、濃度を、ＢｉｏＴｅｋ ＳｙｎｅｒｇｙＨＴ（商標）分光光度計で２８０ｎｍでの吸光度により決定した。精製タンパク質の量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び分析サイズ排除ＨＰＬＣ（Ｄｉｏｎｅｘ ＨＰＬＣシステム）により評価した。内毒素レベルをＬＡＬアッセイ（Ｐｙｒｏｔｅｌｌ（登録商標）−Ｔ、Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｏｆ Ｃａｐｅ Ｃｏｄ社）を用いて測定した。
実施例１０３：ｍＡｂ及び環状ＰＹＹ類似体の複合
方法Ａ：ＴＣＥＰによるｍＡｂの部分還元
Ｔｒｉｓ−酢酸緩衝液（２０ｍＬ、ＥＤＴＡ中１ｍＭ）中の１０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ溶液を、３当量のＴＣＥＰで処理した。溶液をｐＨ６に調整し、質量分析計（ＬＣＭＳ）を用いた室温での高圧液体クロマトグラフィの１時間後に、Ｃ１０２位のジスルフィド付加物が完全に還元されたことを示した。還元ｍＡｂを、タンパク質Ａ吸着及び溶出（４ＣＶ １００ｍＭ酢酸）により精製し、１８０ｍｇの還元ｍＡｂを得た。
還元ｍＡｂ及び環状ＰＹＹ類似体の複合
凍結乾燥したペプチド（５当量対ｍＡｂ）を上述の還元ｍＡｂに添加した。ＥＤＴＡを１ｍＭの最終濃度に添加し、ｐＨを７に調整した。濃度を８ｍｇ／ｍＬに調整し、穏やかに撹拌しながら室温で１６時間反応を進行させた。ＴＣＥＰ（０．５当量対ｍＡｂ）を添加し、穏やかに撹拌しながら室温で４時間反応を更に進行させ、その後、高分子量（ＭＷ）種を３％未満に低減させた。
反応混合物をｐＨ５．５に調整し、２０ＣＶで勾配１００％Ａ（１００ｍＭ ＴＲＩＳ−アセテート、ｐＨ５．５）から１００％Ｂ（１００ｍＭ ＴＲＩＳ−アセテート、ｐＨ５．５；０．５Ｍ ＮａＣｌ）を使用して、ＣａｐｔｏＳＰ樹脂上のイオン交換クロマトグラフィにより精製した。所望の複合体を含有する画分をプールし、１４０ｍｇの複合体を回収し、少量の未反応ペプチドと共溶出した。タンパク質Ａ吸着及び溶出（４ＣＶ １００ｍＭ酢酸）により最終精製を行った。生成物のｐＨを６に調整して、＜３％高ＭＷ種の＞９０％純度で１２０ｍｇの複合体（収率６０％）を得た。
方法Ｂ：
ｍＡｂの疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）精製
Ｔｒｉｓ−酢酸緩衝液中の２０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ溶液を、疎水性相互作用カラム（ＴＯＳＯＨ ＴＳＫｇｅｌフェニル７．５×２１ｃｍ）上に充填し、直線勾配（０〜７０％Ｂ／Ａ、溶媒Ａ：５％ ｉＰｒＯＨ、１Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．０；溶媒Ｂ：２０％ ｉＰｒＯＨ、１００ｍＭリン酸緩衝液）で溶出した。ｍＡｂ単量体ピークをプールし、濃縮し（５〜１０ｍｇ／ｍＬ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ５．５）に対して透析した。
ＴＣＥＰによる部分還元及び還元ｍＡｂの環状ＰＹＹ類似体との複合
精製ｍＡｂ（２７ｍＬ、９．２８ｍｇ／ｍＬ）に４当量のＴＣＥＰ、続いてＥＤＴＡ（１ｍＭ）を添加した。室温で２時間後、ＬＣＭＳは、Ｃ１０２位のジスルフィド付加物が完全に還元されたことを示した。還元ｍＡｂを、Ｚｅｂｒａ脱塩スピンカラム（７×１０ｍＬ、７Ｋ ＭＷＣＯ、ＭＯＰＳ １００ｍＭ、ｐＨ５．５との予備平衡）で処理し、遊離システイン／ＧＳＨを除去した。還元ｍＡｂ（２８ｍＬ）の組み合わせた画分に、Ｍｉｌｌｉ Ｑグレードの水（６．５当量対ｍＡｂ、１５〜２０ｍｇ／ｍＬ）中のＰＹＹペプチドの溶液、続いてＥＤＴＡ（１ｍＭ）を添加した。１Ｎ ＮａＯＨを滴下して添加することにより、反応物のｐＨを７．２〜７．４に調整した。穏やかに撹拌しながら室温で１８時間反応を進行させた。反応過程中に形成されたｍＡｂ−ｍＡｂ二量体を低減し、所望のｍＡｂホモ二量体への変換を可能にするために、更なる０．５当量のＴＣＥＰを添加した後、更に１２時間反応を継続した。２Ｍ酢酸を添加することにより、反応物のｐＨをｐＨ５．５に下げ、粗複合体を、疎水性相互作用クロマトグラフィにより精製し、直線勾配（０〜１００％Ｂ／Ａ、溶媒Ａ：５％ ｉＰｒＯＨ、１Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．０；溶媒Ｂ：２０％ ｉＰｒＯＨ、１００ｍＭリン酸緩衝液）で溶出した。タンパク質Ａ吸着（ＰＢＳ）及び溶出（ＮａＯＡｃ、ｐＨ３．５）により最終精製を行った。生成物のｐＨを６に調整し、ＰＢＳに対して透析して最終試料（５６％）を得た。
あるいは、ｍＡｂをＧＳＨ及び／又はＣｙｓで還元した。Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ（ＴＦＦ）による還元剤の除去後、任意に０．２〜０．５当量のＴＣＥＰの存在下で、過剰なペプチドを還元ｍＡｂに添加した。
実施例１０４：ｍＡｂ複合体の特性評価
ＰＹＹ−ｍＡｂ複合体の分析特性評価は、（ｉ）疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）、（ｉｉ）ＬＣ−ＥＳＩＭＳによる無傷質量測定、（ｉｉｉ）サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を使用して実施した。ＰＹＹ−ｍＡｂ複合体及び複合方法の分析特性評価の結果を表１に示す。
Figure 2020510606
実施例１０５：インビトロアッセイ
化合物１は、ヒト、ラット、マウス、及びアカゲザルＹ２受容体、並びにヒトＹ１、Ｙ４、及びＹ５受容体を発現するクローン細胞（ＨＥＫ又はＣＨＯ）において、インビトロでＮＰＹ受容体を活性化する能力について評価された。ＰＹＹ３−３６、ＮＰＹ、及びＰＰは、研究対照としてこれらのアッセイに含まれた。
細胞株
ｃＡＭＰアッセイで使用するために、ＮＰＹ受容体を発現する安定なトランスフェクトされたクローン細胞株を開発した。簡潔に、そのプロトコルに従いＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＨＥＫ２９３細胞株を、ヒトＹ２受容体（寄託番号：ＮＭ＿０００９１０．２）、ヒトＹ５受容体（寄託番号：ＮＭ＿００６１７４．２）、マウスＹ２受容体（寄託番号：ＮＭ＿００８７３１）、及びアカゲザルＹ２受容体（寄託番号：ＮＭ＿００１０３２８３２）のコード配列を保有する発現プラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を選択培地（１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、５０Ｉ．Ｕ．ペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、及び６００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８を有するＤＭＥＭ高グルコース）で再度平板培養した。細胞を選択培地に２週間保持した後、限定希釈法を用いて単一のクローンを採取した。続いて、トランスフェクトした細胞を、１０％ウシ胎児血清、１％ Ｌ−グルタミン、１％ピルビン酸ナトリウム、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、及び６００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８で補足したＤＭＥＭ高グルコース培地（Ｃｅｌｌｇｒｏ）で培養することによって維持した。
加えて、ＣＨＯ−Ｋ１細胞株は、ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから得、ヒトＹ１受容体（カタログ番号９３−０３９７Ｃ２）及びヒトＹ４受容体（カタログ番号９５−００８７Ｃ２）を発現する。ＤｉｓｃｏｖｅｒｙＸ細胞を、１０％ ＦＢＳで補足したＦ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）中、及びＧ４１８選択下（８００μｇ／ｍＬ）で培養した。ラットＹ２受容体は、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから得たＧｌｏ−Ｓｅｎｓｏｒ ＣＨＯ−Ｋ１株において発現された。これらの細胞を、発光ベースのｃＡＭＰアッセイのためにｐＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（商標）−２３Ｆ ｃＡＭＰプラスミドでトランスフェクトしたが、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＬＡＮＣＥ ｃＡＭＰアッセイでの使用のために試験及び検証した。ラットＹ２細胞を、１０％ ＦＢＳ及び８００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８で補足したＦ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）中で成長させた。
全ての細胞株をバイアル（４×１０６細胞／バイアル）にバンクし、使用するまで液体窒素中に貯蔵した。アッセイの前日に、バイアルを解凍し、１５ｍｌの適切な培地に添加した。細胞を４５０×ｇで５分間遠心分離し、上清を吸引し、細胞を０．２×１０６細胞／ｍＬの密度でＧ４１８を含まない培地に再懸濁した。細胞を、Ｂｉｏｃｏａｔコラーゲンコーティングされた白色３８４ウェルプレートに、５０００細胞／ウェルの最終密度に分配した（２５μｌ／ウェル）。細胞プレートを、５％ ＣＯ２／９０％ Ｏ２雰囲気下で３７℃の加湿組織培養インキュベータ内で一晩インキュベートした。
実験プロトコル
ｃＡＭＰアッセイは、様々な受容体アッセイと同じであった。ＬＡＮＣＥ ｃＡＭＰキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を全ての実験で使用して、細胞内ｃＡＭＰレベルを定量化した。アッセイの日に、細胞培地を細胞からデカントし、６μｌのペプチド（２倍濃度）をウェルに添加した。ペプチドは、刺激緩衝液中の１１ポイント用量反応（段階１：３希釈を用いて１００ｎＭ又は１０μＭから開始）としてペプチドを作製した。刺激緩衝液は、ＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩溶液）中５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、５００μＭ ＩＢＭＸ、及び０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）からなる。次に、フォルスコリン（２×、５μＭ最終濃度）及びＬＡＮＣＥ ｃＡＭＰ抗体（１：１００）を含有する６μｌの刺激緩衝液を細胞に添加した。室温で２５分間インキュベートした後、１２μｌのアッセイ検出ミックスを各ウェルに添加した。検出ミックスは、ＬＡＮＣＥ ｃＡＭＰキットで提供されるように、ビオチン−ｃＡＭＰ（１：７５０）及びユウロピウム−Ｗ８０４４（１：２２５０）を検出緩衝液中に希釈することによって調製した。プレートを室温で２時間インキュベートした後、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（励起３２０ｎｍ、発光６１５ｎｍ及び６６５ｎｍ）でＴＲ−ＦＲＥＴアッセイとして読み取った。チャネル１蛍光（６１５ｎｍでの相対蛍光単位）及びチャネル２蛍光（６６５ｎｍでの相対蛍光単位）を、それらの比と共にＥｘｃｅｌファイルにエクスポートした。
データ解析
Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーからのデータは、（６１５ｎｍ／６６５ｎｍ）×１０，０００として計算された相対蛍光単位（ＲＦＵ）として表した。全ての試料は３つ組で測定された。Ｅｕｄｅａｎ Ｓｈａｗによって設計されたＣｒｕｃｉｂｌｅ社内データ分析ソフトウェアを使用して、データを分析した。各ウェル内の未知のｃＡＭＰ濃度は、各プレート内に含まれる既知のｃＡＭＰ濃度の参照標準から補間された。ＥＣ５０、Ｌｏｇ（ＥＣ５０）、ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ（ｎＨ）、頂部、及び底部などのパラメータは、Ｎｏｎ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ＆ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ａｔ Ｊａｎｓｓｅｎ Ｒ＆Ｄにより実施された、Ｒ環境内の非線形加重最小二乗法適用を使用して、４−Ｐモデルを適合させたｌｏｇ化合物濃度に対してｃＡＭＰ濃度値をプロットすることによって得られた（オープンソースｈｔｔｐ：／／ｃｒａｎ．ｕｓ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）。
Figure 2020510606
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実施例１０６：インビボマウス安定性アッセイ
雄のＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス（９〜１２週齢）をＴａｃｏｎｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得た。１２時間の光／暗サイクルの温度制御された部屋の、ＡｌｐｈａＤｒｉ床敷を有する各ケージに１匹のマウスを収容した。マウスには水を自由に摂取させ、飼料（５００１、Ｌａｂ Ｄｉｅｔ）で維持した。
マウスに、１ｍｇ／ｋｇ化合物を皮下投与した。３匹の動物から約１００μＬの血液を、尾部切除によりｔ＝４、２４、及び４８時間で収集した。時点当たり２〜３匹の動物からの血液（約６００μＬ）も、心臓穿刺によりｔ＝４、２４、及び４８時間で収集した。４％比の完全プロテアーゼ阻害剤溶液及び１％比のＤＰＰＩＶ阻害剤を含有するＫ３Ｅ（ＥＤＴＡ）チューブに血液試料を収集した。血液試料を湿潤氷上に設置した後、各時点で収集した後３０分以内に細胞除去のために冷蔵条件下（約５℃）で１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、利用可能な全ての血漿を９６ウェルプレートに移した。ウェルプレートを−８０℃の冷凍庫に貯蔵した。化合物のレベルは、以下に記載のＬＣＭＳ法を用いて測定した。データを表４に示す。
無傷複合体の残存％の決定のための質量スペクトルアッセイ
抗ヒトＦｃ抗体を使用して免疫親和性捕捉によって血漿試料を処理した後、三重ＴＯＦ（飛行時間型）質量分析計で逆相ＬＣ高分解能フルスキャンＭＳ分析を行った。生ＭＳスペクトルをデコンボリューションして、注入試料中の成分の分子量を解明した。無傷複合体の分子イオンのピークを、未変化の無傷複合体の定量化に使用した。別個のアッセイにおいて、抗ヒトＦｃ抗体を使用して免疫親和性捕捉によって血漿試料を処理した後、トリプシン消化及びトリプル四重極質量分析計で逆相ＬＣ−ＭＳＭＳ分析を行った。ｍＡｂのＦｃ上に位置するペプチドを、全ｍＡｂの定量化について監視した。両方のアッセイに関して、標準曲線及び品質管理試料は、血漿中の参照標準をスパイクすることによって調製され、発生した試料と同時に同じ手順を使用して処理された。無傷複合体の濃度と全ｍＡｂの濃度との比を、残存％であると計算した。
Figure 2020510606
実施例１０７：薬物動態（ＰＫ）
ＤＩＯマウスＰＫ
雄のＤＩＯ Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（２０週齢、高脂肪食餌で１４週間）をＴａｃｏｎｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得た。１２時間の光／暗サイクルの温度制御された部屋の、ＡｌｐｈａＤｒｉ床敷を有する各ケージに１匹のマウスを収容した。マウスには水を自由に摂取させ、高脂肪食餌（Ｄ１２４９２，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔ）で維持した。
マウスに、１ｍｇ／ｋｇの化合物１で皮下（ｓ．ｃ．）投与し、３匹の動物を各時点で屠殺し、ｔ＝４、８、２４、４８、７２、１２０、及び１６８時間で血液を収集した。３匹のナイーブ動物からの血液も収集した。各動物から約３００μＬの血液を、７０％ ＣＯ２及び３０％ Ｏ２混合物により誘導されたガス麻酔下で、断頭後に頸静脈を介して収集した。１２μｌ（４％比）の完全プロテアーゼ阻害剤溶液及び３μＬ（１％比）のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を含有するＫ３Ｅ（ＥＤＴＡ）コーティングＳａｒｓｔｅｄｔ Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ（登録商標）チューブに血液試料（約３００μＬ）を収集した。血液試料を湿潤氷上に設置した後、各時点で収集した後３０分以内に細胞除去のために冷蔵条件下（約５℃）で１０，０００ｒｐｍで約４分間遠心分離し、利用可能な全ての血漿を９６ウェルプレートに移した。ウェルプレートを、−８０℃の冷凍庫に入れるまでドライアイス上で貯蔵した。データを表５及び図３に示す。
ラットＰＫ
化合物１を、ＰＢＳ（ｐＨ７．０〜７．６）中１．０ｍｇ／ｋｇの用量レベルで、雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）に皮下及び静脈内投与した。約５００μＬの血液を、伏在静脈（投与後ｔ＝１、４、２４、４８、７２、９６、１６８、及び２４０時間）を介して、時間点当たり３匹の動物から約５００μＬの血液を収集した。投与後３３６時間の血液試料を、７０％ ＣＯ２及び３０％ Ｏ２混合物により誘導されたガス麻酔下で、断頭後に頸静脈を介して収集した。２０μｌ（４％比）の完全プロテアーゼ阻害剤溶液及び５μＬ（１％比）のＤＰＰＩＶ阻害剤を含有するＫ３Ｅ（ＥＤＴＡ）コーティングＳａｒｓｔｅｄｔ Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ（登録商標）チューブに血液試料を収集した。血液試料を湿潤氷上に設置した後、各時点で収集した後６０分以内に細胞除去のために冷蔵条件下（約５℃）で１０，０００ｒｐｍで約４分間遠心分離し、利用可能な全ての血漿を９６ウェルプレートに移した。化合物１のレベルは、以下に記載のＬＣＭＳ法を用いて測定した。データを表６に示す。
カニクイザル（Ｃｙｎｏ）ＰＫ
全ての動物を、投与前少なくとも８時間、及び血液試料収集の最初の４時間絶食させた。３匹の動物が１ｍｇ／ｋｇの化合物１の単回ＩＶ投与を受け、３匹の動物が１ｍｇ／ｋｇの化合物１の単一ＳＣ投与を受けた。投与前、並びに投与後１、６、１０、２４、３６、４８、７２、１２０、１６８、２４０、３３６、４３２、及び５０４時間後に血液を収集した。ＩＶ群に関して、追加の試料を投与０．５時間後に収集した。４％比の完全プロテアーゼ阻害剤溶液及び１％比のＤＰＰＩＶ阻害剤を含有するＫ３Ｅ（ＥＤＴＡ）コーティングＳａｒｓｔｅｄｔ Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ（登録商標）チューブに、各動物から約１ｍＬの血液を収集した。血液試料を湿潤氷上に設置した後、各時点で収集した後３０分以内に遠心分離し、得られた血漿を３つに分割し、三つ組９６ウェルプレートに移した。ウェルプレートを、−８０℃の冷凍庫に入れるまでドライアイス上で貯蔵した。データを表７及び図４に示す。
血漿レベル決定のための無傷質量スペクトルアッセイ
抗ヒトＦｃ抗体を使用して免疫親和性捕捉によって血漿試料を処理した後、三重ＴＯＦ（飛行時間型）質量分析計で逆相ＬＣ高分解能フルスキャンＭＳ分析を行った。生ＭＳスペクトルをデコンボリューションして、注入試料中の成分の分子量を解明した。無傷複合体の分子イオンのピークを定量化に使用した。標準曲線及び品質管理試料は、血漿中の参照標準をスパイクすることによって調製され、発生した試料と同時に同じ手順を使用して処理された。ＤＩＯマウス、ラット、及びカニクイザルのＰＫデータを、それぞれ、表５、表６、及び表７に示す。ＤＩＯマウス及びカニクイザルのＰＫデータも、図３及び４にそれぞれ示される。
Figure 2020510606
Figure 2020510606
Figure 2020510606
実施例１０８：インビボでの有効性研究
食餌誘導型肥満（ＤＩＯ）マウスにおける体重減少：急性投与
化合物１を、単回投与後に雄のＤＩＯ Ｃ５７Ｂ１／６マウスの足摂取量及び体重を低減させる能力について評価した。雄のＤＩＯ Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（２０週齢、高脂肪食餌で１４週間）をＴａｃｏｎｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得た。１２時間の光／暗サイクルの温度制御された部屋の、ＡｌｐｈａＤｒｉ床敷を有する各ケージに１匹のマウスを収容した。マウスには水を自由に摂取させ、高脂肪食餌（Ｄ１２４９２，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔ）で維持した。実験開始の少なくとも１週間前に、動物を施設に馴化させた。
投与前日、マウスを、個々の体重に基づいて８匹の動物のコホートに分けた。翌日の３：００〜４：００ｐｍに、動物を量り、ビヒクル、０．１、０．３、１．０、３．０、若しくは７．５ｎｍｏｌ／ｋｇの用量の化合物１、又は皮下（ｓ．ｃ．）投与を介して０．３ｎｍｏｌ／ｋｇのデュラグルチドで処置した。体重及び食物摂取量を、投与２４時間後、４８時間後、及び７２時間後に測定し、体重減少率及び食物摂取の低減率を計算した。ＰｒｉｓｍにおけるＴｕｋｅｙの事後検定を用いて、二元配置反復測定ＡＮＯＶＡを使用して統計分析を行った。全てのデータは平均±ＳＥＭとして表される（図５及び図６）。
食餌誘導型肥満マウスにおける体重減少：慢性投与
化合物１を、８日間にわたって雄のＤＩＯ Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおいて反復投与して、食物摂取量及び体重を低減させ、グルコースホメオスタシスを改善する能力について評価した。雄のＤＩＯ Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（２０週齢、高脂肪食餌で１４週間）をＴａｃｏｎｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得た。１２時間の光／暗サイクルの温度制御された部屋の、ＡｌｐｈａＤｒｉ床敷を有する各ケージに１匹のマウスを収容した。マウスには水を自由に摂取させ、高脂肪食餌（Ｄ１２４９２，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔ）で維持した。実験開始の少なくとも１週間前に、動物を施設に馴化させた。
投与前日、マウスを、個々の体重に基づいて分けた。次の８日間のそれぞれの３：００〜４：００ｐｍに、動物及び食物摂取量を量った。動物を、毎日皮下投与を介して０．３ｎｍｏｌ／ｋｇのビヒクル（ｄＰＢＳ、ｐＨ７．２）若しくはデュラグルチド、又は３日毎に皮下投与を介して０．１、０．３、１．０、３．０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量の化合物１で処置した。８日後、マウスを５時間絶食させ、次いで、２ｇ／ｋｇのグルコースのボーラスをｔ＝０で経口投与する。グルコース接種後、ｔ＝０、３０、６０、９０、及び１２０分に血糖値を測定し、血漿インスリンを測定するために、ｔ＝０、３０、及び９０分に血液を採取する。ＰｒｉｓｍにおけるＴｕｋｅｙの事後検定を用いて、一元配置ＡＮＯＶＡ又は二元配置反復測定ＡＮＯＶＡを使用して統計分析を行った。全てのデータは平均±ＳＥＭとして表される（図７、図８、及び表８〜１１）。
Figure 2020510606
 値は、８匹の動物からのデータについて時間当たり、群当たりの平均±ＳＥＭを表す。
＊溶媒に対してｐ＜０．０５二元配置ＡＮＯＶＡ ＲＭ：Ｔｕｋｅｙの多重比較検定
Figure 2020510606
 値は、８匹の動物からのデータについて時間当たり、群当たりの平均±ＳＥＭを表す。
＊溶媒に対してｐ＜０．０５血糖値については、二元配置ＡＮＯＶＡ ＲＭ、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定；ＡＵＣについては、一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定
Figure 2020510606
 値は、８匹の動物からのデータについて時間当たり、群当たりの平均±ＳＥＭを表す。
＊溶媒に対してｐ＜０．０５血糖値については、二元配置ＡＮＯＶＡ ＲＭ、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定；ＡＵＣについては、一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定
Figure 2020510606
 値は、８匹の動物からのデータについて時間当たり、群当たりの平均±ＳＥＭを表す。
＊溶媒に対してｐ＜０．０５一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定
リラグルチドと組み合わせた食餌誘導型肥満マウスにおける体重減少：慢性投与
化合物１を、９日間にわたって雄のＤＩＯ Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおいて反復投与して、長期作用型ＧＬＰ−１アゴニストのリラグルチドと組み合わせた、食物摂取量及び体重を低減させ、グルコースホメオスタシスを改善する能力について評価した。
雄のＤＩＯ Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（２０週齢、高脂肪食餌で１４週間）をＴａｃｏｎｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得た。１２時間の光／暗サイクルの温度制御された部屋の、ＡｌｐｈａＤｒｉ床敷を有する各ケージに１匹のマウスを収容した。マウスには水を自由に摂取させ、高脂肪食餌（Ｄ１２４９２，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔ）で維持した。実験開始の少なくとも１週間前に、動物を施設に馴化させた。
投与前日、ＭＲＩにより身体組成を測定し、マウスを、個々の体重に基づいて分けた。０日目の３：００〜４：００ｐｍに、動物及び食物摂取量を量った。単一処置群の動物を、毎日皮下投与を介して１０ｎｍｏｌ／ｋｇのビヒクル（ｄＰＢＳ、ｐＨ７．２）若しくはリラグルチド、又は３日毎に皮下投与を介して、０．１若しくは１．０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量の化合物１で処置した。組み合わせ群の動物は、リラグルチド（１０ｎｍｏｌ／ｋｇ）を１日１回、及び０．１又は１．０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で３日毎に化合物１を受けた。８日目に、ＭＲＩにより身体組成を測定した。９日目に、マウスを５時間絶食させ、空腹時血糖及びインスリンを測定した。ＰｒｉｓｍにおけるＴｕｋｅｙの事後検定を用いて、一元配置ＡＮＯＶＡ又は二元配置反復測定ＡＮＯＶＡを使用して統計分析を行った。全てのデータは平均±ＳＥＭとして表される（図９及び表１２〜１７）。
Figure 2020510606
 値は、ｎ＝＝７の場合（＾により示される）を除き、８匹の動物からのデータについて時間当たり、群当たりの平均±ＳＥＭを表した。
＊溶媒に対してｐ＜０．０５二元配置ＡＮＯＶＡ ＲＭ：Ｔｕｋｅｙの多重比較検定
Figure 2020510606
 値は、８匹の動物からのデータについて時間当たり、群当たりの平均±ＳＥＭを表す。
＊溶媒に対してｐ＜０．０５二元配置ＡＮＯＶＡ ＲＭ：Ｔｕｋｅｙの多重比較検定
Figure 2020510606
 値は、８匹の動物からのデータについて時間当たり、群当たりの平均±ＳＥＭを表す。
＊ｐ＜０．０５、化合物１及びリラグルチドの合計対共投与；一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定
Figure 2020510606
 値は、８匹の動物からのデータについて時間当たり、群当たりの平均±ＳＥＭを表す。
＊溶媒に対してｐ＜０．０５一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定
Figure 2020510606
 値は、８匹の動物からのデータについて時間当たり、群当たりの平均±ＳＥＭを表す。
＊溶媒に対してｐ＜０．０５一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定
Figure 2020510606
 値は、８匹の動物からのデータについて時間当たり、群当たりの平均±ＳＥＭを表す。
＊溶媒に対してｐ＜０．０５一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定
実施例１０９：Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおける食物摂取量及び体重に対する化合物１の単回投与の効果
化合物１を、単回投与後にＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙの食物摂取量及び体重を低減させる能力について評価した。動物は、体重２００〜２２５ｇのものをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）より得、配送の１週間以内に使用した。動物は、１２時間の明暗サイクルを行った調温室内で、Ａｌｐｈａドライ床材及び濃縮用プラスチックチューブの入ったケージに１匹ずつ収容した。ラットには自由に水を摂取させ、実験用のげっ歯類食餌；Ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ ＰｉｃｏＬａｂ（登録商標）Ｒｏｄｅｎｔ Ｄｉｅｔ ２０，５Ｋ７５＊（Ｐｕｒｉｎａ Ｍｉｌｌｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ ｖｉａ ＡＳＡＰ Ｑｕａｋｅｒｔｏｗｎ，ＰＡから供給された）を与えた。投与に先立って各ラットについて動物の体重を測定し、記録した。
投与前日、ラットを、個々の体重に基づいて８匹の動物のコホートに分けた。翌日、動物を量り、皮下（ｓ．ｃ．）投与を介してビヒクル（ｄＰＢＳ、ｐＨ７．２）、０．１、０．３、１．０、若しくは３．０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量の化合物１、又は０．３ｎｍｏｌ／ｋｇのデュラグルチドで処置した。体重及び食物摂取量を、投与１日後、２日後、及び３日後に測定し、体重減少率及び食物摂取の低減率を計算した。ＰｒｉｓｍにおけるＴｕｋｅｙの事後検定を用いて、二元配置反復測定ＡＮＯＶＡを使用して統計分析を行った。全てのデータは平均±ＳＥＭとして表される（表１８〜２０）。
Figure 2020510606
 値は、８匹の動物からのデータについて時間当たり、群当たりの平均±ＳＥＭを表す。
＊溶媒に対してｐ＜０．０５総食物消費量については、一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定；毎日の食物消費量については、二元配置ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定
Figure 2020510606
 値は、８匹の動物からのデータについて時間当たり、群当たりの平均±ＳＥＭを表す。
＊溶媒に対してｐ＜０．０５二元配置ＡＮＯＶＡ，Ｔｕｋｅｙの多重比較検定
Figure 2020510606
 値は、８匹の動物からのデータについて時間当たり、群当たりの平均±ＳＥＭを表す。
＊溶媒に対してｐ＜０．０５３日目の体重の正味変化については、一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定；体重の毎日の変化については、二元配置ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定
実施例１１０：肥満アカゲザルにおける単独又はリラグルチドとの組み合わせでの化合物１の効果
化合物１は、肥満アカゲザルにおける足摂取量を低減させる能力について評価した。リラグルチドが有効用量の化合物１と共投与される場合に観察される追加の有効性も評価した。最初に、略された用量範囲の研究を実施して、共投与中に使用されるリラグルチドの用量を決定した。６匹の動物は、生理食塩水の１日１回のｓｃ投与を３週間受けた。食物摂取量を毎日測定し、ベースライン摂取量を、３週間にわたるビヒクル処置の平均日摂取量として設定した。次いで、６匹の動物を２つの群；０．０１ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝３）及び０．０２ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝３）に分けた。それぞれ、ベースラインに対して食物摂取量に対する影響を決定し、最大許容用量を特定するために、１週間、リラグルチドの皮下日用量を受けた。また、リラグルチド処置を中止した後、２週間にわたって食物摂取量も測定した。全てのデータは平均週間食物摂取量±ＳＥＭとして表される（図１０）。
１０匹の肥満アカゲザルを使用して、化合物１の有効性を評価した。２週間のベースライン期間後、化合物１を毎日４週間ｓ．ｃ．投与した。動物に、０．０１ｍｇ／ｋｇで７日間、次いで０．０３ｍｇ／ｋｇで７日間、次いで０．０１５ｍｇ／ｋｇで９日間投与し、最終的に０．０１ｍｇ／ｋｇのリグルチドと組み合わせて０．０１５ｍｇ／ｋｇの化合物１を５日間共投与した。食物摂取量を毎日監視し、体重を毎週測定した。化合物１の処置後及び併用処置後に、グルコース、インスリン、総コレステロール、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＡＬＴ、及びＡＳＴレベルをベースラインで評価した。全てのデータは平均±ＳＥＭとして表される（表２１〜２２、並びに図１１及び図１２）。
Figure 2020510606
Figure 2020510606
 値は、８匹の動物からのデータについて群当たりの平均±ＳＥＭを表す。
＊溶媒に対してｐ＜０．０５
一元配置ＡＮＯＶＡ ＲＭ、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定
当業者は、広い発明概念から逸脱することなく前述の実施形態に変更を行うことができることを理解されたい。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に制限されず、本説明によって定義されるように本発明の趣旨及び範囲内の修正を包含することを意図するものと理解される。
引用した全ての文献は、参照により本明細書に援用される。
本発明の例示的な環状ＰＹＹ配列又はその複合体は、以下を含む：
配列番号１
名称：［シクロ−（βＡ２−ＣＯＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（ＰＥＧ１２−ＡｃＢｒ）１１，ｐｓｉ−（３５Ｒ，３６Ｙ）］−ＰＹＹ２−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号２
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号３
名称：［シクロ−（Ｉ３−ＣＯ（ＣＨ２）２トリアゾリル−Ｎｌｅ３１）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号４
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）１１］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号５
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（γ−Ｇｌｕ−ＡｃＶｉｔＥ）１１］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号６
名称：［シクロ−（Ｉ３−ＣＯ（ＣＨ２）２トリアゾリル−Ｎｌｅ３１），Ｋ（γ−Ｇｌｕ−ＡｃＶｉｔＥ）１１］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号７
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）９］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号８
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）３０］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号９
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），ｐｓｉ−（Ｒ３５Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号１０
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（γ−Ｇｌｕ−ＡｃＶｉｔＥ）３０］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号１１
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（γ−Ｇｌｕ−ＡｃＶｉｔＥ）３０，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号１２
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），（Ｎ−Ｍｅ−Ｒ３５）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号１３
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）３０，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号１４
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）３０，（Ｎ−Ｍｅ−Ｒ３５）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号１５
名称：［シクロ−（Ｋ４−ＣＯ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）３０］−ＰＹＹ４−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号１６
名称：［シクロ−（Ｋ４−ｐ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）３０］−ＰＹＹ４−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号１７
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ａ４，Ｋ（γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）３０］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号１８
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ｅ４，Ｋ（γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）３０］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号１９
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｐ−ＣＯＰｈＣＨ２−Ｃ３１），Ｋ（γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）３０，（Ｎ−Ｍｅ−Ｒ３５）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号２０
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−Ｃ３１），Ｋ（γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）３０，（Ｎ−Ｍｅ−Ｒ３５）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号２１
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ａ４，Ａ２６，Ｋ（γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）３０］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号２２
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ｅ４，Ａ２６，Ｋ（γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）３０］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号２３
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（（ＯＥＧ）２−γ−Ｇｌｕ−ＣＯＣ１６ＣＯ２Ｈ）３０，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号２４
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（（ＯＥＧ）２−γ−Ｇｌｕ−ＣＯＣ１８ＣＯ２Ｈ）３０，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号２５
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（γ−Ｇｌｕ−Ｓｔｅａｒ）３０，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号２６
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（γ−Ｇｌｕ−Ａｒａｃｈ）３０，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号２７
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（（ＯＥＧ）２−ＣＯＣ１６ＣＯ２Ｈ）３０，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号２８
名称：［シクロ−（Ｋ４−ｐ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）３０，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ４−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号２９
名称：［シクロ−（Ｋ４−ＣＯ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）３０，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ４−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号３０
名称：［シクロ−（Ｋ４−ＣＯ（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＣＨ２−Ｃ３１），Ｋ（γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）３０，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ４−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号３１
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（（ＯＥＧ）２−γ−Ｇｌｕ−Ｓｔｅａｒ）３０，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号３２
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ａ４，Ａ２６，Ｋ（γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）３０，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号３３
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）３０，（Ｎ−Ｍｅ−Ｑ３４），ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号３４
名称：［シクロ−（Ｋ４−ＣＯ（ＣＨ２）５ＮＨＣＯＣＨ２−Ｃ３１），Ｋ（γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）３０，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ４−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号３５
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）３０，（Ｎ−Ｍｅ−Ｒ３５），ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号３６
名称：［シクロ−（Ｋ４−ＣＯ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）３０，（Ｎ−Ｍｅ−Ｒ３５），ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ４−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号３７
名称：［シクロ−（Ｉ３−ＣＯ（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＣＨ２−Ｃ３１），Ｋ（γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）３０，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号３８
名称：［シクロ−（Ｉ３−ＣＯ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）３０，（Ｎ−Ｍｅ−Ｒ３５），ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号３９
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ｓ４，Ｋ（γ−Ｇｌｕ−Ａｒａｃｈ）３０，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号４０
名称：［シクロ−（Ｉ３−ＣＯ（ＣＨ２）２トリアゾリル−Ｎｌｅ３１），Ｋ（（ＯＥＧ）２−γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）３０，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号４１
名称：［シクロ−（Ｉ３−ＣＯ（ＣＨ２）２トリアゾリル−Ｎｌｅ３１），Ｋ（γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）３０，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号４２
名称：［シクロ−（Ｉ３−ＣＯ（ＣＨ２）２トリアゾリル−Ｎｌｅ３１），Ｋ（（ＯＥＧ）２−γ−Ｇｌｕ−ＣＯＣ１６ＣＯ２Ｈ）３０，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号４３
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（（ＯＥＧ）２−γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）３０，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号４４
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（（ＯＥＧ）２−γ−Ｇｌｕ−ＣＯＣ１６ＣＯ２Ｈ）１１，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号４５
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（ＣＯＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）２４ＮＨ−γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）１１，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号４６
名称：［シクロ−（Ｉ３−ＣＯ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）３０，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号４７
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（（ＯＥＧ）２−γ−Ｇｌｕ−ＣＯＣ１６ＣＯ２Ｈ）７，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号４８
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（（ＯＥＧ）２−γ−Ｇｌｕ−ＣＯＣ１６ＣＯ２Ｈ）２２，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号４９
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（γ−Ｇｌｕ−（Ｐａｌ−１６−ＯＨ））３０，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号５０
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（（ＯＥＧ）２−γ−Ｇｌｕ−ＣＯＣ１６ＣＯ２Ｈ）２３，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号５１
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ｓ４，Ｋ（γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）３０，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号５２
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（ＣＯＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）１２ＮＨ−γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）１１，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号５３
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（（ＯＥＧ）４−γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）１１，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号５４
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（（ＯＥＧ）２−γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）１１，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号５５
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（（ＯＥＧ）２−γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）２３，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号５６
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（γ−Ｇｌｕ−ＣＯＣＨ２Ｐｈ−（４−ＣｌＰｈ）３０，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号５７
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（γ−Ｇｌｕ−ＣＯ（ＣＨ２）２ＰｈＯ−（２，４−Ｃｌ２Ｐｈ）３０，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号５８
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（γ−Ｇｌｕ−ＣＯ（ＣＨ２）１０−（４−Ｆ−Ｐｈ））３０，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号５９
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（（ＯＥＧ）２−γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）２２，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号６０
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（（ＯＥＧ）２−γ−Ｇｌｕ−Ｐａｌ）７，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号６１
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（γ−Ｇｌｕ−ＣＯ（ＣＨ２）１０−（４−Ｆ３Ｃ−Ｐｈ））３０，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号６２
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（γ−Ｇｌｕ−ＣＯ（ＣＨ２）１０−ＣＦ３）３０，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号６３
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（γ−Ｇｌｕ−ＣＯ（ＣＨ２）１３−ＣＦ３）３０，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号６４
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（γ−Ｇｌｕ−（Ｐａｌ−１６−ＯＥｔ））３０，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号６５
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（γ−Ｇｌｕ−ＣＯ（ＣＨ２）１１（ＣＤ２）３ＣＤ３）３０，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号６６
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（γ−Ｇｌｕ−ＣＯ（ＣＨ２）１０−（２，４−（ＣＦ３）２−Ｐｈ））３０，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号６７
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯＰｈＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（γ−Ｇｌｕ−ＣＯ（ＣＨ２）１０−（３，５−（ＣＦ３）２−Ｐｈ））３０，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号６８
名称：［シクロ−（Ｉ３−ＣＯ（ＣＨ２）２ＮＨＣＯＣＨ２−Ｃ３０），Ｋ（（ＯＥＧ）２−γ−Ｇｌｕ−ＣＯＣ１６ＣＯ２Ｈ）１１，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号６９
名称：［シクロ−（Ｇ２−Ｅ３１），Ｓ４，Ｋ１１，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ２−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号７０
名称：［シクロ−（Ｇ２−Ｅ３０），Ｓ４，Ｋ１１，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ２−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号７１
名称：［シクロ−（Ｇ２−Ｅ３０），Ｓ４，Ｋ１１，（Ｎ−Ｍｅ−Ｒ３５）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号７２
名称：［シクロ−（Ｇ２−Ｅ３０），Ｓ４，Ｋ（（ＯＥＧ）２−γ−Ｇｌｕ−ＣＯＣ１６ＣＯ２Ｈ）１１，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ２−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号７３
名称：［シクロ−（βＡ２−ＣＯＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（ＰＥＧ６−ＡｃＢｒ）１１，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ２−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号７４
名称：［シクロ−（βＡ２−ＣＯＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（ＡｃＢｒ）１１，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ２−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号７５
名称：［シクロ−（Ｉ３−ＣＯＣＨ２−Ｃ３１），Ｋ（ＰＥＧ１２−ＡｃＢｒ）１１，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号７６
名称：［シクロ−（βＡ２−ＣＯＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（ＰＥＧ１２−ＡｃＢｒ）１１，Ｋ（ｍＰＥＧ１６）３０，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ２−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号７７
名称：［シクロ−（βＡ２−ＣＯＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（ＡｃＢｒ）１１，Ｋ（ｍＰＥＧ１２）２０，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ２−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号７８
名称：［シクロ−（βＡ２−ＣＯＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（ＰＥＧ１２−ＡｃＢｒ）１１，（Ｎ−Ｍｅ）Ｑ３４，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ２−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号７９
名称：［シクロ−（βＡ２−ＣＯＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（ＰＥＧ１２−ＡｃＢｒ）１１，Ｎ−Ｍｅ−Ｒ３５，ｐｓｉ−（Ｒ３５，３６Ｙ）］−ＰＹＹ２−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号８０
名称：［シクロ−（βＡ２−ＣＯＣＨ２−ｈＣ３１），Ｒ４，Ｋ（ＰＥＧ１２−ＡｃＢｒ）１１，Ｗ３０，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ２−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号８１
名称：［シクロ−（３Ｉ−ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＯＣＨ２−Ｃ３１），Ｒ４，Ｋ（ＰＥＧ１２−ＡｃＢｒ）１１，Ｗ３０，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号８２
名称：［シクロ−（Ｋ４−ＯＥＧ−ＣＯＣＨ２−Ｃ３１），Ｋ（ＰＥＧ１２−ＡｃＢｒ）１１，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ４−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号８３
名称：［シクロ−（Ｉ３−ＣＯＣＨ２ＣＨ２トリアゾリルＮｌｅ３１），Ｋ（ＰＥＧ１２−ＡｃＢｒ）１１，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造
Figure 2020510606
配列番号８４
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯ−ベンジル−ｈＣ３１），Ｋ（ＰＥＧ８−トリアゾリル−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−ＰＥＧ４−ＡｃＢｒ）１１，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号８５
名称：［シクロ−（βＡ２−ＣＯＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（ＰＥＧ１２−ＡｃＢｒ）２３，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ２−３６、構造：
Figure 2020510606
配列番号８６
名称：［シクロ−（βＡ２−ＣＯＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（ＰＥＧ１２−ＡｃＢｒ）２２，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ２−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号８７
名称：［シクロ−（βＡ２−ＣＯＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（ＰＥＧ１２−ＡｃＢｒ）７，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ２−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号８８
名称：［シクロ−（Ｇ２−ＣＯＣＨ２−Ｃ３０），Ｋ（ＰＥＧ１２−ＡｃＢｒ）１１，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ２−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号８９
名称：［シクロ−（Ｇ２−ＣＯＣＨ２−Ｃ３０），Ｋ（ＰＥＧ１２−ＡｃＢｒ）１１，Ｎ−Ｍｅ−Ｒ３５］−ＰＹＹ２−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号９０
名称：［シクロ−（βＡ２−ＣＯＣＨ２−Ｃ３０），Ｋ（ＰＥＧ１２−ＡｃＢｒ）１１，Ｎ−Ｍｅ−Ｒ３５］−ＰＹＹ２−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号９１
名称：［シクロ−（Ｇ２−ＣＯＣＨ２−ｈＣ３０），Ｋ（ＰＥＧ１２−ＡｃＢｒ）１１，Ｎ−Ｍｅ−Ｒ３５］−ＰＹＹ２−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号９２
名称：［シクロ−（βＡ２−ＣＯＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（ＰＥＧ１２−ＡｃＢｒ）１１，Ｎ−Ｍｅ−Ｒ３５］−ＰＹＹ２−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号９３
名称：［シクロ−（Ｇ２−ＣＯＣＨ２−ｈＣ３０），Ｋ（ＰＥＧ１２−ＡｃＢｒ）１１，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ２−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号９４
名称：［シクロ−（βＡ２−ＣＯＣＨ２−Ｃ３０），Ｋ（ＰＥＧ１２−ＡｃＢｒ）１１，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ２−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号９５
名称：［シクロ−（Ｇ２−Ｅ３０），Ｓ４，Ｋ（ＡｃＢｒ）１１，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ２−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号９６
名称：［シクロ−（βＡ２−ＣＯＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（ＰＥＧ２４−ＡｃＢｒ）１１，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ２−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号９７
名称：［シクロ−（Ｇ２−Ａｃ−ｈＣ３１），Ｋ（ＰＥＧ１２−ＡｃＢｒ）１１，ｐｓｉ−（Ｒ３５−Ｙ３６）］−ＰＹＹ２−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号９８
名称：［シクロ−（Ｇ２−ＣＯＣＨ２−Ｃ３０），Ｋ（ＡｃＢｒ）１１，Ｎ−Ｍｅ−Ｒ３５］−ＰＹＹ２−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号９９
名称：［シクロ−（βＡ２−ＣＯＣＨ２−Ｃ３０），Ｋ（ＡｃＢｒ）１１，Ｎ−Ｍｅ−Ｒ３５］−ＰＹＹ２−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号１００
名称：［シクロ−（βＡ２−ＣＯＣＨ２−Ｃ３０），Ｋ（ＡｃＢｒ）１１，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ２−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号１０１
ｈＰＹＹ３−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号１０２
名称：［シクロ−（βＡ２−ＣＯＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（ＰＥＧ１２）１１，ｐｓｉ−（３５Ｒ，３６Ｙ）］−ＰＹＹ２−３６ ｍＡｂホモ二量体複合体（化合物１）
構造：
Figure 2020510606
配列番号１０３
名称：［シクロ−（βＡ２−ＣＯＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（ＰＥＧ６）１１，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ２−３６ ｍＡｂホモ二量体複合体（化合物２）
構造：
Figure 2020510606
配列番号１０４
名称：［シクロ−（βＡ２−ＣＯＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ１１，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ２−３６ ｍＡｂホモ二量体複合体（化合物３）
構造：
Figure 2020510606
配列番号１０５
名称：［シクロ−（Ｉ３−ＣＯＣＨ２−Ｃ３１），Ｋ（ＰＥＧ１２）１１，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６ ｍＡｂホモ二量体複合体（化合物４）
構造：
Figure 2020510606
配列番号１０６
名称：［シクロ−（βＡ２−ＣＯＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（ＰＥＧ１２）１１，Ｋ（ｍＰＥＧ１６）３０，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ２−３６ ｍＡｂホモ二量体複合体（化合物５）
構造：
Figure 2020510606
配列番号１０７
名称：［シクロ−（βＡ２−ＣＯＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ１１，Ｋ（ｍＰＥＧ１２）２０，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ２−３６ ｍＡｂホモ二量体複合体（化合物６）
構造：
Figure 2020510606
配列番号１０８
名称：［シクロ−（βＡ２−ＣＯＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（ＰＥＧ１２）１１，（Ｎ−Ｍｅ）Ｑ３４，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ２−３６ ｍＡｂホモ二量体複合体（化合物７）
構造：
Figure 2020510606
配列番号１０９
名称：［シクロ−（βＡ２−ＣＯＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（ＰＥＧ１２）１１，Ｎ−Ｍｅ−Ｒ３５，ｐｓｉ−（Ｒ３５，３６Ｙ）］−ＰＹＹ２−３６ ｍＡｂホモ二量体複合体（化合物８）
構造：
Figure 2020510606
配列番号１１０
名称：［シクロ−（βＡ２−ＣＯＣＨ２−ｈＣ３１），Ｒ４，Ｋ（ＰＥＧ１２）１１，Ｗ３０，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ２−３６ ｍＡｂホモ二量体複合体（化合物９）
構造：
Figure 2020510606
配列番号１１１
名称：［シクロ−（３Ｉ−ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＯＣＨ２−Ｃ３１），Ｒ４，Ｋ（ＰＥＧ１２）１１，Ｗ３０，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６ ｍＡｂホモ二量体複合体（化合物１０）
構造：
Figure 2020510606
配列番号１１２
名称：［シクロ−（Ｋ４−ＯＥＧ−ＣＯＣＨ２−Ｃ３１），Ｋ（ＰＥＧ１２）１１，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ４−３６ ｍＡｂホモ二量体複合体（化合物１１）
構造：
Figure 2020510606
配列番号１１３
名称：［シクロ−（Ｉ３−ＣＯＣＨ２ＣＨ２トリアゾリルＮｌｅ３１），Ｋ（ＰＥＧ１２）１１，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６ ｍＡｂホモ二量体複合体（化合物１２）
構造
Figure 2020510606
配列番号１１４
名称：［シクロ−（Ｉ３−ｍ−ＣＯ−ベンジル−ｈＣ３１），Ｋ（ＰＥＧ８−トリアゾリル−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−ＰＥＧ４）１１，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ３−３６ ｍＡｂホモ二量体複合体（化合物１３）
構造：
Figure 2020510606
配列番号１１５
名称：［シクロ−（βＡ２−ＣＯＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（ＰＥＧ１２）２３，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ２−３６ ｍＡｂホモ二量体複合体（化合物１４）
構造：
Figure 2020510606
配列番号１１６
名称：［シクロ−（βＡ２−ＣＯＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（ＰＥＧ１２）２２，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ２−３６ ｍＡｂホモ二量体複合体（化合物１５）
構造：
Figure 2020510606
配列番号１１７
名称：［シクロ−（βＡ２−ＣＯＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（ＰＥＧ１２）７，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ２−３６ ｍＡｂホモ二量体複合体（化合物１６）
構造：
Figure 2020510606
配列番号１１８
名称：［シクロ−（Ｇ２−ＣＯＣＨ２−Ｃ３０），Ｋ（ＰＥＧ１２）１１，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ２−３６ ｍＡｂホモ二量体複合体（化合物１７）
構造：
Figure 2020510606
配列番号１１９
名称：［シクロ−（Ｇ２−ＣＯＣＨ２−Ｃ３０），Ｋ（ＰＥＧ１２）１１，Ｎ−Ｍｅ−Ｒ３５］−ＰＹＹ２−３６ ｍＡｂホモ二量体複合体（化合物１８）
構造：
Figure 2020510606
配列番号１２０
名称：［シクロ−（βＡ２−ＣＯＣＨ２−Ｃ３０），Ｋ（ＰＥＧ１２）１１，Ｎ−Ｍｅ−Ｒ３５］−ＰＹＹ２−３６ ｍＡｂホモ二量体複合体（化合物１９）
構造：
Figure 2020510606
配列番号１２１
名称：［シクロ−（Ｇ２−ＣＯＣＨ２−ｈＣ３０），Ｋ（ＰＥＧ１２）１１，Ｎ−Ｍｅ−Ｒ３５］−ＰＹＹ２−３６ ｍＡｂホモ二量体複合体（化合物２０）
構造：
Figure 2020510606
配列番号１２２
名称：［シクロ−（βＡ２−ＣＯＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（ＰＥＧ１２）１１，Ｎ−Ｍｅ−Ｒ３５］−ＰＹＹ２−３６ ｍＡｂホモ二量体複合体（化合物２１）
構造：
Figure 2020510606
配列番号１２３
名称：［シクロ−（Ｇ２−ＣＯＣＨ２−ｈＣ３０），Ｋ（ＰＥＧ１２）１１，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ２−３６ ｍＡｂホモ二量体複合体（化合物２２）
構造：
Figure 2020510606
配列番号１２４
名称：［シクロ−（βＡ２−ＣＯＣＨ２−Ｃ３０），Ｋ（ＰＥＧ１２）１１，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ２−３６ ｍＡｂホモ二量体複合体（化合物２３）
構造：
Figure 2020510606
配列番号１２５
名称：［シクロ−（Ｇ２−Ｅ３０），Ｓ４，Ｋ１１，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ２−３６ホモ二量体複合体（化合物２４）
構造：
Figure 2020510606
配列番号１２６
名称：［シクロ−（βＡ２−ＣＯＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ（ＰＥＧ２４）１１，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ２−３６ ｍＡｂホモ二量体複合体（化合物２５）
Figure 2020510606
配列番号１２７
名称：［シクロ−（Ｇ２−Ａｃ−ｈＣ３１），Ｋ（ＰＥＧ１２）１１，ｐｓｉ−（Ｒ３５−Ｙ３６）］−ＰＹＹ２−３６ ｍＡｂホモ二量体複合体（化合物２６）
構造：
Figure 2020510606
配列番号１４７
名称：［シクロ−（βＡ２−ＣＯＣＨ２−ｈＣ３１），ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ２−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号１４８
名称：［シクロ−（βＡ２−ＣＯＣＨ２−ｈＣ３１），Ｋ１１，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ２−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号１４９
名称：［シクロ−（Ｇ２−Ｅ３０），Ｓ４，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ２−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号１５０
名称：［シクロ−（Ｇ２−Ｅ３０），Ｓ４，Ｋ１１，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ２−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号１５１
名称：［シクロ−（Ｇ２−ＣＯＣＨ２−Ｃ３０），Ｎ−Ｍｅ−Ｒ３５］−ＰＹＹ２−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号１５２
名称：［シクロ−（Ｇ２−ＣＯＣＨ２−Ｃ３０），Ｋ１１，Ｎ−Ｍｅ−Ｒ３５］−ＰＹＹ２−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号１５３
名称：［シクロ−（βＡ２−ＣＯＣＨ２−Ｃ３０），Ｎ−Ｍｅ−Ｒ３５］−ＰＹＹ２−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号１５４
名称：［シクロ−（βＡ２−ＣＯＣＨ２−Ｃ３０），Ｋ１１，Ｎ−Ｍｅ−Ｒ３５］−ＰＹＹ２−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号１５５
名称：［シクロ−（βＡ２−ＣＯＣＨ２−Ｃ３０），ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ２−３６
構造：
Figure 2020510606
配列番号１５６
名称：［シクロ−（βＡ２−ＣＯＣＨ２−Ｃ３０），Ｋ１１，ｐｓｉ−（Ｒ３５，Ｙ３６）］−ＰＹＹ２−３６
構造：
Figure 2020510606

Claims (25)

  1. 環状ＰＹＹペプチドに結合されたモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含む複合体であって、
    前記環状ＰＹＹペプチドが、式Ｉ：
    Figure 2020510606
     （式中、
    ｐは、０又は１であり、
    ｍは、０、１、２、３、４、又は５であり、
    ｎは、１、２、３、又は４であり、
    ｑは、０又は１であり（但し、ｑは、Ｚ３０が不在の場合にのみ１である。）、
    ＢＲＩＤＧＥは、−Ｐｈ−ＣＨ２−Ｓ−、−トリアゾリル−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｓ−、−ＳＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、
    −（ＯＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｓ、−ＮＨＣ（Ｏ）−、又は−ＣＨ２Ｓ−であり、
    Ｚ４は、Ｋ、Ａ、Ｅ、Ｓ、又はＲであり、
    Ｚ７は、Ａ又はＫであり、
    Ｚ９は、Ｇ又はＫであり、
    Ｚ１１は、Ｄ又はＫであり、
    Ｚ２２は、Ａ又はＫであり、
    Ｚ２３は、Ｓ又はＫであり、
    Ｚ２６は、Ａ又はＨであり、
    Ｚ３０は、Ｌ、Ｗ、不在、又はＫであり（但し、Ｚ３０は、ｑが１である場合にのみ不在である。）、
    Ｚ３４は、
    Figure 2020510606
     であり、
    Ｚ３５は、
    Figure 2020510606
     である。）
    によって表されるか、又はその誘導体若しくは薬学的に許容される塩であり、該誘導体が、アミド化、グリコシル化、カルバミル化、硫酸化、リン酸化、環化、脂質化、及びＰＥＧ化からなる群から選択される１つ又は２つ以上のプロセスによって修飾されている、式Ｉの化合物である、
    前記複合体。
  2. 前記環状ＰＹＹペプチドが、式Ｉの化合物、又はアミド化、脂質化、及びＰＥＧ化からなる群から選択される１つ又は２つ以上のプロセスによって修飾されている式Ｉの前記環状ＰＹＹペプチドの誘導体、又はその薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の複合体。
  3. 前記環状ＰＹＹペプチドが、式Ｉによって表されるか、又は前記その誘導体若しくは薬学的に許容される塩であり、式中、
    ｐは、０又は１であり、
    ｍは、０、１、２、３、４、又は５であり、
    ｎは、１、２、３、又は４であり、
    ｑは、０又は１であり（但し、ｑは、Ｚ３０が不在の場合にのみ１である。）、
    ＢＲＩＤＧＥは、−Ｐｈ−ＣＨ２−Ｓ−、−トリアゾリル−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｓ−、−ＳＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２−、
    −（ＯＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｓ、−ＮＨＣ（Ｏ）−、又は−ＣＨ２Ｓ−であり、
    Ｚ４は、Ｋ、Ａ、Ｅ、Ｓ、又はＲであり、
    Ｚ７は、Ａ又はＫであり、前記Ｋのアミノ側鎖は、任意に、
    Figure 2020510606
     （式中、ｉは、０〜２４の整数であり、Ｘ＝Ｂｒ、Ｉ、又はＣｌである。）、
    −Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｂｒ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｉ、又は−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃｌで置換され、
    Ｚ９は、Ｇ又はＫであり、前記Ｋのアミノ側鎖は、任意に、
    Figure 2020510606
     （式中、ｉは、０〜２４の整数であり、Ｘ＝Ｂｒ、Ｉ、又はＣｌである。）、
    −Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｂｒ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｉ、又は−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃｌで置換され、
    Ｚ１１は、Ｄ又はＫであり、前記Ｋのアミノ側鎖は、任意に、
    Figure 2020510606
     （式中、ｉは、０〜２４の整数であり、Ｘ＝Ｂｒ、Ｉ、又はＣｌである。）、
    −Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｂｒ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｉ、又は−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃｌで置換され、
    Ｚ２２は、Ａ又はＫであり、前記Ｋのアミノ側鎖は、任意に、
    Figure 2020510606
     （式中、ｉは、０〜２４の整数であり、Ｘ＝Ｂｒ、Ｉ、又はＣｌである。）、
    −Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｂｒ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｉ、又は−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃｌで置換され、
    Ｚ２３は、Ｓ又はＫであり、前記Ｋのアミノ側鎖は、任意に、
    Figure 2020510606
     （式中、ｉは、０〜２４の整数であり、Ｘ＝Ｂｒ、Ｉ、又はＣｌである。）、
    −Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｂｒ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｉ、又は−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃｌで置換され、
    Ｚ２６は、Ａ又はＨであり、
    Ｚ３０は、Ｌ又はＫであり、前記Ｋのアミノ側鎖は、
    Figure 2020510606
     で置換され、
    Ｚ３４は、
    Figure 2020510606
     であり、
    Ｚ３５は、
    Figure 2020510606
     である、
    請求項１に記載の複合体。
  4. 前記環状ＰＹＹペプチドが、式Ｉによって表されるか、又は前記その誘導体若しくは薬学的に許容される塩であり、式中、
    ｐは、０又は１であり、
    ｍは、０、１、２、３、又は５であり、
    ｎは、１、２、又は４であり、
    ｑは、０又は１であり（但し、ｑは、Ｚ３０が不在の場合にのみ１であり得る。）、
    ＢＲＩＤＧＥは、−Ｐｈ−ＣＨ２−Ｓ−、−トリアゾリル−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｓ−、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｓ、−ＮＨＣ（Ｏ）−、又は−ＣＨ２Ｓ−であり、
    Ｚ４は、Ｋ、Ａ、Ｅ、Ｓ、又はＲであり、
    Ｚ７は、Ａ又はＫであり、前記Ｋのアミノ側鎖は、
    Figure 2020510606
     で置換され、
    Ｚ９は、Ｇ又はＫであり、
    Ｚ１１は、Ｄ又はＫであり、前記Ｋのアミノ側鎖は、
    Figure 2020510606
     −Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｂｒで置換され、
    Ｚ２２は、Ａ又はＫであり、前記Ｋのアミノ側鎖が、
    Figure 2020510606
     で置換され、
    Ｚ２３は、Ｓ又はＫであり、前記Ｋのアミノ側鎖が、
    Figure 2020510606
     で置換され、
    Ｚ２６は、Ａ又はＨであり、
    Ｚ３０は、Ｌ又はＫであり、前記Ｋのアミノ側鎖は、
    Figure 2020510606
     で置換され、
    Ｚ３４は、
    Figure 2020510606
     であり、
    Ｚ３５は、
    Figure 2020510606
     である、
    請求項１に記載の複合体。
  5. 前記環状ＰＹＹペプチドが、配列番号１、７３〜１００、及び１４７〜１５６からなる群から選択されるか、又はその薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の複合体。
  6. 前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片が、リンカーを介して、前記環状ＰＹＹペプチドのリジン残基において、前記環状ＰＹＹペプチドに共有結合している、請求項１〜５のいずれか一項に記載の複合体。
  7. 前記リンカーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）８−トリアゾリル−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ−ＰＥＧ４、２〜２４ＰＥＧ単位のＰＥＧ鎖、２〜１０個の炭素原子を含有するアルキル鎖、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｊ（式中、ｊ＝１〜４）、（ＡｌａＰｒｏ）ｕ（式中、ｕ＝１〜１０）、及び結合からなる群から選択される１つを含む、請求項６に記載の複合体。
  8. 式Ｉ中のＺ７、Ｚ９、Ｚ１１、Ｚ２２、及びＺ２３のうちの１つのみがリジンであり、前記リジンが、前記リンカーを介して、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片の改変システイン残基に共有結合している、請求項７に記載の複合体。
  9. 環状ＰＹＹペプチドに結合されたモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含む複合体であって、前記複合体が、配列番号１０２〜１２７からなる群から選択される配列又はその薬学的に許容される塩を含み、
    ｍＡｂが、前記モノクローナル抗体又は前記その抗原結合断片を表し、］２が、１つ又は２つの前記環状ＰＹＹペプチドが前記ｍＡｂに共有結合により複合されていることを表す、
    前記複合体。
  10. 前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片が、配列番号１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、及び１４６のポリペプチド配列をそれぞれ有する重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、並びに軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の複合体。
  11. 前記単離されたモノクローナル抗体が、配列番号１３７のポリペプチド配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号１３９のポリペプチド配列を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む、請求項１０に記載の複合体。
  12. Ｆｃ部分を更に含む、請求項１１に記載の複合体。
  13. 配列番号１３８のポリペプチド配列を有する重鎖（ＨＣ）と、配列番号１４０のポリペプチド配列を有する軽鎖（ＬＣ）とを含む、請求項１２に記載の複合体。
  14. 環状ＰＹＹペプチドに結合されたモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含む複合体であって、
    前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片が、配列番号１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、及び１４６のポリペプチド配列をそれぞれ有する重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、並びに軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、好ましくは、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片が、配列番号１３７のポリペプチド配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号１３９のポリペプチド配列を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含み、より好ましくは、前記モノクローナル抗体が、配列番号１３８のポリペプチド配列を有する重鎖（ＨＣ）と、配列番号１４０のポリペプチド配列を有する軽鎖（ＬＣ）とを含み、
    前記環状ＰＹＹペプチドが、配列番号１、７３〜１００、及び１４７〜１５６からなる群から選択されるポリペプチド配列又はその薬学的に許容される塩を含み、
    前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片が、前記環状ＰＹＹペプチドの残基７、９、１１、２２、又は２３、好ましくは前記環状ＰＹＹペプチドのリジン残基１１において、直接又はリンカーを介して前記環状ＰＹＹペプチドに複合される、
    前記複合体。
  15. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載の複合体の生成方法であって、前記環状ＰＹＹペプチドの側鎖、好ましくは前記環状ＰＹＹペプチドのリジン残基の前記側鎖上に導入される求電子物質、好ましくはブロモアセトアミド又はマレイミドを、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片の配列番号１４３のシステイン残基のスルフヒドリル基と反応させ、それにより、前記環状ＰＹＹペプチドと前記モノクローナル抗体又はその抗原結合断片との間に共有結合を創出することを含む、前記方法。
  16. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載の複合体と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
  17. 疾患又は障害の治療又は予防をそれを必要とする対象に行う方法であって、前記疾患又は障害が、肥満、Ｉ型又はＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗性、耐糖能異常、高血糖症、高インスリン血症、高トリグリセリド血症、先天性高インスリン症（ＣＨＩ）による低血糖、脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性腎症、並びに管理されていないコレステロール及び／若しくは脂質レベルに関連する高血圧及び心血管危険因子などの他の心血管危険因子、骨粗鬆症、炎症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、腎疾患、並びに湿疹からなる群から選択され、該方法が、治療又は予防を必要とする前記対象に有効量の請求項１６に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
  18. 食物摂取の低減をそれを必要とする対象に行う方法であって、それを必要とする前記対象に有効量の請求項１６に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
  19. Ｙ２受容体活性の調節をそれを必要とする対象に行う方法であって、それを必要とする前記対象に有効量の請求項１６に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
  20. 前記医薬組成物が、注射により投与される、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記医薬組成物が、少なくとも１つの抗糖尿病薬と組み合わせて投与される、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記抗糖尿病薬が、グルカゴン様ペプチド−１受容体調節因子である、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記医薬組成物が、リラグルチドと組み合わせて投与される、請求項２１に記載の方法。
  24. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載の複合体を含むキットであって、好ましくは、リラグルチド及び注射用デバイスを更に含む、前記キット。
  25. 請求項１〜１５のいずれか一項に記載の複合体を含む医薬組成物の生成方法であって、前記複合体を薬学的に許容される担体と組み合わせて前記医薬組成物を得ることを含む、前記方法。
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