ES2897480T3 - Compuestos de péptido tirosina tirosina cíclicos acoplados a anticuerpos como moduladores de receptores de neuropéptidos - Google Patents

Compuestos de péptido tirosina tirosina cíclicos acoplados a anticuerpos como moduladores de receptores de neuropéptidos Download PDF

Info

Publication number
ES2897480T3
ES2897480T3 ES17864112T ES17864112T ES2897480T3 ES 2897480 T3 ES2897480 T3 ES 2897480T3 ES 17864112 T ES17864112 T ES 17864112T ES 17864112 T ES17864112 T ES 17864112T ES 2897480 T3 ES2897480 T3 ES 2897480T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
peptide
acid
antibody
synthesis
fmoc
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES17864112T
Other languages
English (en)
Inventor
Mark Macielag
Raymond J Patch
Rui Zhang
Martin A Case
Shamina M Rangwala
James N Leonard
Raul Camacho
Michael J Hunter
Katharine E D'aquino
Wilson Edwards
Ronald V Swanson
Wenying Jian
Yue-Mei Zhang
Mark Wall
Ellen Chi
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Janssen Pharmaceutica NV
Original Assignee
Janssen Pharmaceutica NV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Janssen Pharmaceutica NV filed Critical Janssen Pharmaceutica NV
Application granted granted Critical
Publication of ES2897480T3 publication Critical patent/ES2897480T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/26—Glucagons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6845—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a cytokine, e.g. growth factors, VEGF, TNF, a lymphokine or an interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6883—Polymer-drug antibody conjugates, e.g. mitomycin-dextran-Ab; DNA-polylysine-antibody complex or conjugate used for therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A61K49/0032—Methine dyes, e.g. cyanine dyes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0052—Small organic molecules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0056—Peptides, proteins, polyamino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
    • C07K1/061—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using protecting groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/12—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by hydrolysis, i.e. solvolysis in general
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/57545—Neuropeptide Y
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
    • C07K5/0205—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing the structure -NH-(X)3-C(=0)-, e.g. statine or derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Un conjugado que comprende un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo acoplado a un péptido PYY cíclico, en donde el péptido PYY cíclico está representado por la Fórmula I o un derivado o sal farmacéuticamente aceptable del mismo: **(Ver fórmula)** en donde p es 0 o 1; m es 0, 1, 2, 3, 4 o 5; n es 1, 2, 3 o 4; q es 0 o 1; siempre que q sea 1 solo cuando 30 esté ausente; PUENTE es -Ph-CH2-S-, -triazolilo-, -NHC(O)CH2S-, -SCH2C(O)NH-, -(OCH2CH2)2NHC(O)CH2S, -NHC(O)- o -CH2S-; Z4 es K, A, E, S o R; Z7 es A o K; Z9 es G o K; Z11 es D o K; Z22 es A o K; Z23 es S o K; Z26 es A o H; Z30 es L, W, ausente o K; siempre que Z30 esté ausente sólo cuando q sea 1; Z34 es **(Ver fórmula)** Z35 es **(Ver fórmula)** en donde el derivado es el compuesto de Fórmula I que se modifica mediante uno o más procesos seleccionados del grupo que consiste de amidación, glicosilación, carbamilación, sulfatación, fosforilación, ciclación, lipidación y pegilación

Description

DESCRIPCIÓN
Compuestos de péptido tirosina tirosina cíclicos acoplados a anticuerpos como moduladores de receptores de neuropéptidos
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se dirige de manera general a nuevos conjugados de péptido tirosina tirosina (PYY) cíclico acoplado a anticuerpos, que son moduladores del receptor del neuropéptido Y2. La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas y métodos de uso de las mismas. Los nuevos compuestos acoplados a anticuerpos son útiles para prevenir, tratar o mejorar enfermedades y trastornos, como obesidad, diabetes tipo 2, síndrome metabólico, resistencia a la insulina y dislipidemia, entre otros.
REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS
Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N° 62/413.613, presentada el 27 de octubre de 2016, y de la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N° 62/413.586 presentada el 27 de octubre de 2016.
REFERENCIA A LISTADO DE SECUENCIAS PRESENTADO POR VÍA ELECTRÓNICA
Esta solicitud contiene un listado de secuencias, que se presenta electrónicamente a través de EFS-Web como una lista de secuencias con formato ASCII con un nombre de archivo "PRD3436 Sequence Listing" y una fecha de creación del 23 de octubre de 2017, y tiene un tamaño de 135 kb. El listado de secuencias presentado a través de EFS-Web es parte de la memoria descriptiva y se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. En el caso de cualquier inconsistencia con respecto a las estructuras para las SEQ ID NO: 1-156 entre la información descrita en la presente y el Listado de Secuencias enviado electrónicamente a través de EFS-Web con un nombre de archivo "PRD3436 Sequence Listing", prevalecerá la información contenida en la presente.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los receptores del neuropéptido Y (NPY) son activados por un grupo estrechamente relacionado de agonistas peptídicos denominados "familia NPY" que tienen diferentes afinidades para cada subtipo de receptor. NPY, péptido tirosina-tirosina (PYY) y polipéptido pancreático (PP), todos de 36 aminoácidos de longitud, son agonistas de la familia de receptores n Py . n Py es un neurotransmisor, sintetizado, coalmacenado y liberado con norepinefrina y epinefrina. NPY es uno de los péptidos más abundantes y ampliamente distribuidos en el sistema nervioso central (SNC) de humanos y roedores y se expresa en áreas del cerebro relacionadas con la alimentación y el estrés. En el sistema nervioso periférico, las neuronas que contienen NPY son predominantemente simpáticas. PYY se sintetiza y libera predominantemente por células endocrinas intestinales. La escisión de NPY y PYY por la serinaproteasa endotelial, di-peptidil peptidasa IV (DPP-IV), genera NPY3.36 y PYY3-36 que son ligandos selectivos para los subtipos Y2 e Y5 de la familia de receptores NPY. El PP se encuentra principalmente en las células de los islotes pancreáticos distintas de las que almacenan insulina, glucagón o somatostatina.
Hasta la fecha se han identificado cinco receptores de NPY distintos, cuatro de los cuales se consideran relevantes para la fisiología humana. Los receptores Y1, Y2 e Y5 se unen preferentemente a NPY y PYY, mientras que el receptor Y4 se une preferentemente a PP. Los receptores Y2 e Y5 también son activados de manera potente por NPY3-36 y PYY3-36. En general, la familia de ligandos de NPY posee selectividad variable para cada una de las isoformas del receptor de NPY, y se ha informado con anterioridad que PYY3-36 tiene selectividad de modesta a robusta para la isoforma Y2. Cada uno de estos receptores está acoplado a la inhibición de la adenilato ciclasa a través de Gai sensible a la toxina pertussis.
PYY se secreta de las células L endocrinas en respuesta a los alimentos y, en particular, después de la ingestión de grasas. PYY1-36 predomina en el estado de ayuno, siendo PYY3-36 la forma principal que se encuentra posprandialmente en humanos, con concentraciones EN plasma correlacionadas negativamente con el número de calorías consumidas. Se ha demostrado que PYY3-36 reduce la ingesta de alimentos en humanos, monos, ratas, conejos y ratones (Batterham RL et al. Nature 8 de agosto de 2002; 418(6898):650-4; Batterham RL et al. N Engl J Med, 4 de septiembre de 2003; 349(10):941-8; Challis BG et al., Biochem Biophys Res Commun, 28 de noviembre de 2003; 311(4):915-9). Se cree que los efectos anorexigénicos de PYY3-36 están mediados por Y2, basándose en la unión preferencial a este receptor y la pérdida de la eficacia de la alimentación en ratones deficientes en Y2 (Batterham RL, et al. Nature, 8 de agosto de 2002; 418(6898) 650-4). La inyección intraarcuata de PYY3-36 reduce la ingesta de alimentos en ratas y ratones (Batterham et al. Nature, 8 de agosto de 2002; 418(6898):650-4), lo que sugiere que la participación de los receptores Y2 hipotalámicos puede mediar estos efectos. También se ha demostrado que los efectos agudos en la alimentación se traducen en efectos dependientes de la dosis sobre el peso corporal en ratones ob/ob, ratones DIO y ratones Zucker fa/fa (Pittner RA et al. IntJObes relat Metab Disord agosto de 2004; 28(8):963 -71). Además, también se ha demostrado que PYY3-36 mejora la eliminación de glucosa mediada por insulina y la sensibilidad a la insulina en roedores DIO (Vrang N et al., Am JPhysiol RegulIntegr Comp Physiol Agosto; 291(2):R367-75). La cirugía bariátrica da como resultado un aumento de la inmunorreactividad de PYY circulante (le Roux CW et al., Ann Surg enero 2006; 243(1); 108-14), que parece desempeñar un papel en la pérdida de peso posoperatoria.
Dado su papel en el control del apetito y la ingesta de alimentos, así como sus efectos antisecretores y proabsorbentes en el tracto gastrointestinal de los mamíferos, PYY3.36 puede ser eficaz en el tratamiento de la obesidad y afecciones asociadas, así como en una serie de trastornos gastrointestinales. Sin embargo, la utilidad terapéutica del propio PYY3-36 como agente de tratamiento está limitada por su rápido metabolismo y la corta vida media circulante resultante (Torang et al., Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 310:R866-R874 (2016)). La WO2015/197735 divulga complejos de PYY-anticuerpo y una vida media aumentada del péptido.
Por tanto, es deseable obtener un análogo de PYY o un derivado del mismo con una estabilidad metabólica y un perfil farmacocinético mejorados con respecto a PYY3-36. Tales derivados, con una vida media prolongada in vivo, proporcionarían modulación del receptor Y2 con mayor duración de acción, haciéndolos adecuados como agentes terapéuticos para sujetos con necesidad de dicha modulación.
El análisis anterior se presenta únicamente para proporcionar una mejor comprensión de la naturaleza de los problemas a los que se enfrenta la técnica y no debe interpretarse de ninguna manera como una admisión del estado de la técnica ni la cita de cualquier referencia en la presente debe interpretarse como una admisión de que tal referencia constituye "estado de la técnica" a la presente solicitud.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
En un aspecto general, la invención se refiere a nuevos compuestos de péptido tirosina tirosina cíclicos (PYY) acoplados a anticuerpos, que son moduladores del receptor del neuropéptido Y2.
En la presente se proporcionan conjugados que comprenden un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo acoplado a un péptido pYy cíclico, en donde el péptido PYY cíclico está representado por la Fórmula I o un derivado o sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
Figure imgf000003_0001
p es 0 o 1;
m es 0, 1, 2, 3, 4 o 5;
n es 1, 2, 3 o 4;
q es 0 o 1; siempre que q sea 1 solo cuando 30 esté ausente;
PUENTE es -Ph-CH2-S-, -triazolilo-, -NHC(O)CH2S-, -SCH2C(O)NH-,
-(OCH2CH2)2NHC(O)CH2S, -NHC(O)- o -CH2S-;
Z4 es K, A, E, S o R;
Z7 es A o K;
Z9 es G o K;
Z11 es D o K;
Z22 es A o K;
Z23 es S o K;
Z26 es A o H;
Z30 es L, W, ausente o K;
siempre que Z30 esté ausente sólo cuando q sea 1;
Z34 es
Figure imgf000004_0001
Z35 es
Figure imgf000004_0002
en donde el derivado es el compuesto de Fórmula I que se modifica mediante uno o más procesos seleccionados del grupo que consiste de amidación, glicosilación, carbamilación, sulfatación, fosforilación, ciclación, lipidación y pegilación. En ciertas realizaciones, el péptido PYY cíclico es un compuesto de Fórmula I o un derivado del péptido PYY cíclico de Fórmula I que se modifica mediante uno o más procesos seleccionados del grupo que consiste de amidación, lipidación y pegilación, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En ciertas realizaciones, el péptido PYY cíclico está representado por la Fórmula I o el derivado o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde:
p es 0 o 1;
m es 0, 1, 2, 3, 4 o 5;
n es 1, 2, 3 o 4;
q es 0 o 1; siempre que q sea 1 solo cuando Z30 esté ausente;
PUENTE es -Ph-CH2-S-, -triazolilo-, -NHC(O)CH2S-, -SCH2C(O)NH2-,
-(OCH2CH2)2NHC(O)CH2S, -NHC(O)- o -CH2S-;
Z4 es K, A, E, S o R;
Z7 es A o K, en donde la cadena lateral amino de dicho K está opcionalmente sustituida con
Figure imgf000004_0003
en donde i es un número entero de 0 a 24, y X = Br, I o Cl, -C(O)CH2Br, -C(O)CH2I, o -C(O)CH2Cl;
Z9 es G o K, en donde la cadena lateral amino de dicho K está opcionalmente sustituida con
en donde i es un número entero
Figure imgf000004_0004
Z11 es D o K, en donde la cadena lateral amino de dicho K está opcionalmente sustituida con
Figure imgf000005_0001
en donde i es un número entero de 0 a 24, y X = Br, I o Cl, -C(O)CH2Br, -C(O)CH2l, o -C(O)CH2Cl; Z22 es A o K, en donde la cadena lateral amino de dicho K está opcionalmente sustituida con
Figure imgf000005_0002
en donde i es un número entero de 0 a 24, y X = Br, I o Cl, -C(O)CH2Br, -C(O)CH2I, o -C(O)CH2Cl; Z23 es S o K, en donde la cadena lateral amino de dicho K está opcionalmente sustituida con
Figure imgf000005_0003
en donde i es un número entero de 0 a 24, y X = Br, I o Cl, -C(O)CH2Br, -C(O)CH2I, o -C(O)CH2Cl; Z26 es A o H;
Z30 es L o K, en donde la cadena lateral amino de dicho K está sustituida con
Figure imgf000005_0004
Z34 es
Figure imgf000005_0005
y
Z35 es
En ciertas realizaciones, el péptido PYY cíclico está representado por la Fórmula I o el derivado o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde:
p es 0 o 1;
mes 0, 1,2, 3o5;
n es 1, 2 o 4;
q es 0 o 1; siempre que q pueda ser 1 solo cuando Z30 esté ausente;
PUENTE es -Ph-CH2-S-, -triazolilo-, -NHC(O)CH2S-, -(OCH2CH2)2NHC(O)CH2S, -NHC(O)-, o -CH2S-;
Z4 es K, A, E, S o R;
Z7 es A o K, en donde la cadena lateral amino de dicho K está sustituida con
Figure imgf000006_0001
Z9 es G o K,
Z11 es D o K, en donde la cadena lateral amino de dicho K está sustituida con
Figure imgf000006_0002
-C(O)CH2Br, Z22 es A o K, en donde la cadena lateral amino de dicho K está sustituida con
Figure imgf000006_0003
Z23 es S o K, en donde la cadena lateral amino de dicho K está sustituida con
Figure imgf000006_0004
Z26 es A o H,
Z30 es L o K, en donde la cadena lateral amino de dicho K está sustituida con
Figure imgf000006_0005
Figure imgf000007_0001
Z35 es
Figure imgf000007_0002
En ciertas realizaciones, el péptido PYY cíclico se selecciona del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 1, 73-100 y 147-156, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo monoclonal o el fragmento de unión a antígeno del mismo está covalentemente enlazado al péptido PYY cíclico en un residuo de lisina del péptido PYY cíclico mediante un conector. El conector puede comprender, por ejemplo, un conector seleccionado del grupo que consiste de polietilenglicol (PEG)8-triazolil-CH2CH2CO-PEG4, una cadena de PEG de 2-24 unidades de PeG, una cadena de alquilo que contiene 2-10 átomos de carbono, (Gly4Ser)j donde j = 1-4, (AlaPro)u donde u = 1-10, y un enlace.
En ciertas realizaciones, solo uno de Z7, Z9, Z11 , Z22 y Z23 en la Fórmula I es lisina, y la lisina está enlazada covalentemente a un residuo de cisteína manipulado del anticuerpo monoclonal o el fragmento de unión a antígeno del mismo a través del conector.
También se proporcionan conjugados que comprenden un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo acoplado a un péptido PYY cíclico, en donde el conjugado comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 102-127 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde mAb representa el anticuerpo monoclonal o el fragmento de unión al antígeno del mismo, y ]2 representa que 1 o 2 del péptido PYY cíclico están covalentemente conjugados con el mAb.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo monoclonal o el fragmento de unión al antígeno del mismo comprende una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (HCDR1), HCDR2, HCDR3, y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (LCDR1), LCDR2 y LCDR3, que tiene las secuencias polipeptídicas de la SEQ ID NO: 141, 142, 143, 144, 145 y 146, respectivamente. En ciertas realizaciones, el anticuerpo monoclonal aislado comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) que tiene la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 137, y un dominio variable de cadena ligera (VL) que tiene la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 139. En ciertas realizaciones, el anticuerpo monoclonal aislado comprende además una porción Fc. En ciertas realizaciones, el anticuerpo monoclonal aislado comprende una cadena pesada (HC) que tiene la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 138 y una cadena ligera que tiene la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 140.
También se proporcionan conjugados que comprenden un anticuerpo monoclonal o el fragmento de unión a antígeno del mismo acoplado a un péptido PYY cíclico, en donde el anticuerpo monoclonal o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (HCDR1), HCDR2, HCDR3, y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (LCDR1), LCDR2 y LCDR3, que tiene las secuencias polipeptídicas de la SEQ ID NO: 141, 142, 143, 144, 145, y 146, respectivamente, preferiblemente el anticuerpo monoclonal o el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) que tiene la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 137, y un dominio variable de cadena ligera (VL) que tiene la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 138 y una cadena ligera (LC) que tiene la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 140; el péptido PYY cíclico comprende una secuencia polipeptídica seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 1, 73-100 y 147-156, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo se conjuga con el péptido PYY cíclico en el residuo 7, 9, 11, 22 o 23 del péptido PYY cíclico, preferiblemente en el residuo de lisina 11 del péptido PYY cíclico, directamente o mediante un conector.
También se proporcionan métodos para producir los conjugados de la invención. Los métodos comprenden hacer reaccionar un electrófilo, preferiblemente bromoacetamida o maleimida, introducido en una cadena lateral del péptido PYY cíclico, preferiblemente la cadena lateral de un residuo lisina del péptido PYY cíclico, con el grupo sulfhidrilo del residuo de cisteína de la SEQ ID NO: 143 del anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo, creando de este modo un enlace covalente entre el péptido PYY cíclico y el anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo.
También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden los conjugados de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable.
También se proporcionan métodos para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno en un sujeto con necesidad de ello, en donde dicha enfermedad o trastorno se selecciona del grupo que consiste de obesidad, diabetes tipo I o tipo II, síndrome metabólico, resistencia a la insulina, tolerancia a la glucosa alterada, hiperglucemia, hiperinsulinemia, hipertrigliceridemia, hipoglucemia debida a hiperinsulinismo congénito (CHI), dislipidemia, aterosclerosis, nefropatía diabética y otros factores de riesgo cardiovascular como hipertensión y factores de riesgo cardiovasculares relacionados con niveles no controlados de colesterol y/o lípidos, osteoporosis, inflamación, enfermedad del hígado graso alcohólico (NAFLD), esteatohepatitis no alcohólica (NASH), enfermedad renal y eccema. Los métodos comprenden administrar al sujeto con necesidad de ello una cantidad eficaz de las composiciones farmacéuticas de la invención.
También se proporcionan métodos para reducir la ingesta de alimentos en un sujeto con necesidad de ello. Los métodos comprenden administrar al sujeto con necesidad de ello una cantidad eficaz de la composición farmacéutica de la invención.
También se proporcionan métodos para modular la actividad del receptor Y2 en un sujeto con necesidad de ello. Los métodos comprenden administrar al sujeto con necesidad de ello una cantidad eficaz de la composición farmacéutica de la invención.
En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica se administra mediante una inyección. En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica se administra en combinación con por lo menos un agente antidiabético. El agente antidiabético puede ser, por ejemplo, un modulador del receptor del péptido 1 similar al glucagón. En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica se administra en combinación con liraglutida.
También se proporcionan kits que comprenden los conjugados de la invención, preferiblemente que comprenden además una liraglutida y un dispositivo para inyección.
También se proporcionan métodos para producir las composiciones farmacéuticas de la invención. Los métodos comprenden combinar el conjugado con un portador farmacéuticamente aceptable para obtener la composición farmacéutica.
Los aspectos, características y ventajas adicionales de la presente invención se apreciarán mejor tras la lectura de la siguiente descripción detallada de la invención y las reivindicaciones.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
El resumen anterior, así como la siguiente descripción detallada de las realizaciones preferidas de la presente solicitud, se entenderán mejor cuando se lean junto con los dibujos adjuntos. Debe entenderse, sin embargo, que la solicitud no se limita a las realizaciones precisas mostradas en los dibujos.
Fig. 1 : Muestra una estrategia general de conjugación de péptido-mAb de acuerdo con una realización de la invención. X representa un electrófilo introducido en una cadena lateral de un péptido terapéutico, como bromoacetamida o maleimida, que reacciona en el sitio específicamente con el grupo sulfhidrilo del residuo Cys manipulado en una CDR de un mAb que extiende la vida media, creando un enlace covalente entre el péptido y mAb.
Fig. 2 : Resumen de residuos de CDR seleccionados para sustitución en PH9H5_VH (SEQ ID NO: 129) y en PH9L3_VL (SEQ ID NO: 128). Los residuos sustituidos con Cys están en negrita y subrayados.
Fig. 3: Farmacocinética del compuesto 1 en ratones obesos inducidos por dieta (DIO).
Fig. 4: Farmacocinética del compuesto 1 en monos cynomolgus.
Fig. 5: Ingesta de alimento en ratones DIO tratados con el compuesto 1: dosificación aguda.
Fig. 6: Pérdida de peso en ratones DIO tratados con el compuesto 1: dosificación aguda.
Fig. 7: Ingesta de alimentos en ratones DIO tratados con el compuesto 1: dosificación crónica.
Fig. 8: Pérdida de peso en ratones DIO tratados con el compuesto 1: dosificación crónica.
Fig. 9 : Pérdida de peso en ratones DIO tratados con el compuesto 1 en combinación con liraglutida: dosificación crónica.
Fig. 10: Muestra un gráfico que muestra la ingesta de alimentos semanal media durante 3 semanas antes de comenzar con liraglutida, 1 semana de tratamiento con liraglutida y 2 semanas después de la administración de liraglutida. Está indicada la reducción porcentual de la ingesta semanal media de alimentos del tratamiento frente a la media de referencia de 3 semanas.
Figs. 11A-11D: Muestra gráficos que demuestran el efecto del compuesto 1 con la adición de liraglutida sobre la glucosa, la insulina y los triglicéridos en macacos rhesus obesos. La Fig. 11A muestra un gráfico que demuestra el efecto de la monoterapia del compuesto 1 (PYY) y la terapia combinada con liraglutida (PYY+Lira) sobre los niveles de glucosa. La Fig. 11B muestra un gráfico que demuestra el efecto de la monoterapia del compuesto 1 (PYY) y la terapia combinada con liraglutida (PYY+Lira) sobre los niveles de insulina. La Fig. 11C muestra un gráfico que demuestra el efecto de la monoterapia del compuesto 1 (PYY) y la terapia combinada con liraglutida (PYY+Lira) sobre HOMA-IR. La Fig. 11D muestra un gráfico que demuestra el efecto de la monoterapia del compuesto 1 (PYY) y la terapia combinada con liraglutida (PYY+Lira) sobre los niveles de triglicéridos.
Figs. 12A-12D: Muestra gráficos del efecto del compuesto 1 con la adición de liraglutida sobre el colesterol y las enzimas hepáticas en macacos rhesus obesos. La Fig. 12A muestra un gráfico que demuestra el efecto de la monoterapia del compuesto 1 (PYY) y la terapia combinada con liraglutida (PYY+Lira) sobre los niveles de colesterol. la Fig. 12B muestra un gráfico que demuestra el efecto de la monoterapia del compuesto 1 (PYY) y la terapia combinada con liraglutida (PYY+Lira) sobre los niveles de HDL. La Fig. 12C muestra un gráfico que demuestra el efecto de la monoterapia del compuesto 1 (PYY) y la terapia combinada con liraglutida (PYY+Lira) sobre los niveles de ALT. La Fig. 12D muestra un gráfico que demuestra el efecto de la monoterapia del compuesto 1 (PYY) y la terapia combinada con liraglutida (PYY+Lira) sobre los niveles de AST.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La invención está definida por las reivindicaciones. Cualquier materia que quede fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona solamente con propósitos informativos. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Por otro lado, ciertos términos usados en la presente tienen los significados que se establecen en la memoria descriptiva.
Debe tenerse en cuenta que, como se usa en la presente y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen la referencia en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
A menos que se indique lo contrario, cualquier valor numérico, como una concentración o un intervalo de concentración descrito en la presente, debe entenderse como modificado en todos los casos por el término "aproximadamente". Por tanto, un valor numérico incluye típicamente el ±10% del valor indicado. Por ejemplo, una concentración de 1 mg/ml incluye de 0,9 mg/ml a 1,1 mg/ml. De igual manera, un intervalo de concentración del 1% al 10% (p/v) incluye del 0,9% (p/v) al 11% (p/v). Como se usa en la presente, el uso de un intervalo numérico incluye expresamente todos los subintervalos posibles, todos los valores numéricos individuales dentro de ese intervalo, incluyendo los números enteros dentro de tales intervalos y fracciones de los valores a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
A menos que se indique lo contrario, debe entenderse que el término "por lo menos" que precede a una serie de elementos se refiere a todos los elementos en la serie. Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de determinar, usando únicamente experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la invención descritas en la presente. Se pretende que tales equivalentes estén incluidos en la invención.
Como se usa en la presente, se entenderá que los términos "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye", "tiene", "que tiene", "contiene" o "que contiene", o cualquier otra variación de los mismos, implica la inclusión de un número entero o grupo de números enteros indicados, pero no la exclusión de ningún otro número entero o grupo de números enteros y se pretende que no sean exclusivos o estén abiertos. Por ejemplo, una composición, una mezcla, un proceso, un método, un artículo o un aparato que comprende una lista de elementos no se limita necesariamente solo a esos elementos, sino que puede incluir otros elementos no enumerados expresamente o inherentes a dicha composición, mezcla, proceso, método, artículo o aparato. Además, a menos que se indique expresamente lo contrario, "o" se refiere a un o inclusivo y no a un o exclusivo. Por ejemplo, una condición A o B se satisface por cualquiera de los siguientes: A es cierto (o está presente) y b es falso (o no está presente), A es falso (o no está presente) y B es cierto (o está presente), y tanto A como B son ciertos (o están presentes).
También debe entenderse que los términos "alrededor de", "aproximadamente", "generalmente", "sustancialmente" y términos similares, usados en la presente cuando se refieren a una dimensión o característica de un componente de la invención preferida, indican que la dimensión/característica descrita no es un límite o parámetro estricto y no excluye variaciones menores de los mismos que sean funcionalmente iguales o similares, como entendería un experto en la técnica. Como mínimo, tales referencias que incluyen un parámetro numérico incluirían variaciones que, usando principios matemáticos e industriales aceptados en la técnica (por ejemplo, redondeo, medición u otros errores sistemáticos, tolerancias de fabricación, etc.), no variarían el dígito menos significativo.
Los términos "idéntico" o "porcentaje de identidad", en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos (por ejemplo, secuencias de polipéptidos PYY3-36 cíclicos, secuencias de cadenas ligeras o pesadas de anticuerpos), se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje específico de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales, cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima, según se miden usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o mediante inspección visual usando métodos conocidos en la técnica en vista de la presente divulgación.
Para la comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se introducen en un ordenador, se designan coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencia. Luego, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencia para la secuencia o secuencias de prueba con respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa designados.
El alineación óptimo de secuencias para comparación puede realizarse, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Apl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineación por homología de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante inspección visual (ver generalmente, Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Eds., Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (Suplemento de 1995) (Ausubel)).
Los ejemplos de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol.
215: 403-410 y Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, respectivamente. El software para realizar análisis BLAST está disponible públicamente a través del National Center for Biotechnology Information.
Una indicación adicional de que dos secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos son sustancialmente idénticos es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico es inmunológicamente reactivo cruzado con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, como se describe a continuación. Por tanto, un polipéptido es típicamente sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren solo por sustituciones conservadoras. Otra indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas hibridan entre sí en condiciones rigurosas, como se describe a continuación.
Como se usa en la presente, "sujeto" significa cualquier animal, preferiblemente un mamífero, lo más preferible un humano. El término "mamífero", como se usa en la presente, abarca cualquier mamífero. Los ejemplos de mamíferos incluyen, pero no se limitan a, vacas, caballos, ovejas, cerdos, gatos, perros, ratones, ratas, conejos, cobayas, monos, seres humanos, etc., más preferiblemente un humano.
El término "administrar" con respecto a los métodos de la invención, significa un método para prevenir, tratar o mejorar terapéutica o profilácticamente un síndrome, trastorno o enfermedad como se describe en la presente mediante el uso de un conjugado de la invención o una forma, composición o medicamento del mismo. Tales métodos incluyen administrar una cantidad eficaz de dicho conjugado, una forma, composición o medicamento del mismo en diferentes momentos durante el curso de una terapia o concurrentemente en una forma de combinación. Debe entenderse que los métodos de la invención abarcan todos los regímenes de tratamiento terapéutico conocidos.
El término "cantidad eficaz" significa la cantidad de conjugado activo o agente farmacéutico que provoca la respuesta biológica o medicinal en un sistema tisular, animal o humano, que está buscando un investigador, veterinario, doctor médico u otro practicante clínico, que incluye prevenir, tratar o mejorar un síndrome, trastorno o enfermedad que se está tratando, o los síntomas de un síndrome, trastorno o enfermedad que se está tratando.
Como se usa en la presente, se pretende que el término "composición" abarque un producto que comprende los ingredientes especificados en las cantidades especificadas, así como cualquier producto que resulte, directa o indirectamente, de combinaciones de los ingredientes especificados en las cantidades especificadas.
Como se usa en la presente, el término "acoplado" se refiere a la unión o conexión de dos o más objetos entre sí. Cuando se hace referencia a compuestos químicos o biológicos, acoplado puede referirse a una conexión covalente entre dos o más compuestos químicos o biológicos. A modo de ejemplo no limitativo, un anticuerpo de la invención puede acoplarse con un péptido de interés para formar un péptido acoplado a anticuerpo. Puede formarse un péptido acoplado a un anticuerpo mediante reacciones químicas específicas diseñadas para conjugar el anticuerpo con el péptido. En ciertas realizaciones, un anticuerpo de la invención puede acoplarse covalentemente con un péptido de la invención a través de un conector. El conector puede, por ejemplo, conectarse primero covalentemente al anticuerpo o al péptido, luego conectarse covalentemente al péptido o al anticuerpo.
Como se usa en la presente, el término "conector" se refiere a un módulo químico que comprende una cadena covalente o atómica que une covalentemente un anticuerpo con el péptido. El conector puede incluir, por ejemplo, pero no se limita a, un conector peptídico, un conector de hidrocarburo, un conector de polietilenglicol (PEG), un conector de polipropilenglicol (PPG), un conector de polisacárido, un conector de poliéster, un conector híbrido que consiste de PEG y un heterociclo incrustado, y una cadena de hidrocarburo.
Como se usa en la presente, el término "conjugado" se refiere a un anticuerpo o un fragmento del mismo acoplado covalentemente a una fracción farmacéuticamente activa. El término "conjugado con" se refiere a un anticuerpo o un fragmento del mismo de la invención enlazado covalentemente o conectado covalentemente a una fracción farmacéuticamente activa, preferiblemente un péptido terapéutico, directa o indirectamente a través de un conector. A modo de ejemplo no limitativo, el anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal de la invención y la fracción farmacéuticamente activa puede ser un péptido terapéutico, como un péptido PYY cíclico de interés.
Las secuencias de péptidos descritas en la presente se escriben de acuerdo con la convención habitual en la que la región N-terminal del péptido está a la izquierda y la región C-terminal está a la derecha. Aunque se conocen formas isoméricas de los aminoácidos, es la forma L del aminoácido la que se representa a menos que se indique expresamente lo contrario.
Anticuerpos
En un aspecto general, la invención se refiere a un nuevo anticuerpo, que ha sido manipulado para no ser dirigido y contener un residuo de cisteína capaz de usarse para conjugar químicamente (es decir, acoplar) una fracción farmacéuticamente activa, como un péptido terapéutico (por ejemplo, un péptido PYY cíclico), de una manera específica de sitio, de tal manera que el péptido acoplado al anticuerpo tenga una vida media extendida/aumentada en comparación con el péptido solo. Como se usa en la presente, el término "no dirigido" en el contexto de un anticuerpo se refiere a un anticuerpo que no se une específicamente a ningún objetivo in vivo. Como se usa en la presente, un anticuerpo que "se une específicamente a un objetivo" se refiere a un anticuerpo que se une a un antígeno objetivo, con una KD de 1 x 10'8 M o menos, preferiblemente 5 x 10-9 M o menos,1 x 10'9 M o menos, 5 x 10'10 M o menos, o 1 x10'10 M o menos. El término "KD" se refiere a la constante de disociación, que se obtiene a partir de la proporción de Kd a Ka (es decir, Kd/Ka) y se expresa como una concentración molar (M). Los valores de KD para anticuerpos pueden determinarse usando métodos en la técnica a la vista de la presente divulgación. Por ejemplo, la k D de un anticuerpo puede determinarse usando resonancia de plasmones superficiales, como usando un sistema biosensor, por ejemplo, un sistema Biacore®, o usando tecnología de interferometría de biocapa, como un sistema Octet RED96. Cuanto menor sea el valor de la KD de un anticuerpo, mayor será la afinidad de que el anticuerpo se una a un antígeno objetivo.
Los anticuerpos monoclonales, completos o un fragmento de los mismos, pueden usarse como una fracción que prolonga la vida media. Los anticuerpos monoclonales son proteínas bien estudiadas que se han utilizado y caracterizado para usos in vivo y, como tales, los mecanismos que permiten su vida media prolongada in vivo y los mecanismos para su eliminación in vivo son bien entendidos. Además, la separación espacial y la presentación de los dos "brazos" del anticuerpo monoclonal pueden ser ventajosas para la presentación bivalente eficaz de una fracción terapéutica (es decir, un péptido terapéutico). Se han desarrollado agentes terapéuticos en los que las toxinas u otros fármacos de molécula pequeña se enlazan químicamente con un anticuerpo monoclonal, pero típicamente utilizan un anticuerpo monoclonal que se une a un antígeno específico y dirige el conjugado anticuerpofármaco a un tejido/célula de interés, que expresa preferentemente el antígeno, y típicamente el fármaco/molécula pequeña se une al anticuerpo de una manera que no afecta a la unión del antígeno del anticuerpo.
Para conjugados de péptido-mAb terapéuticos, no se desea la unión específica del antígeno por el anticuerpo monoclonal que prolonga la vida media. Debido a esto, se usa un par de dominios variables (V) de cadena pesada (HC) y cadena ligera (LC) que no se espera que se una específicamente a ningún objetivo para preparar el anticuerpo monoclonal no dirigido, habilitado para el acoplamiento de la invención. Para obtener un anticuerpo monoclonal no dirigido, habilitado para el acoplamiento, se manipula un residuo de cisteína en una de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de un anticuerpo no dirigido seleccionado. La fracción farmacéuticamente activa (por ejemplo, péptido/compuesto terapéutico) puede contener la fracción química apropiada para permitir la conjugación de la fracción farmacéuticamente activa con la fracción de cisteína manipulada del anticuerpo monoclonal no dirigido. En la Figura 1 se muestra una estrategia de conjugación general de péptido-anticuerpo monoclonal de acuerdo con una realización de la invención.
El término "anticuerpos" como se usa en la presente se entiende en un sentido amplio e incluye anticuerpos monoclonales no humanos (por ejemplo, murina, rata), humanos, adaptados a humanos, humanizados y quiméricos, fragmentos de anticuerpos, anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos, anticuerpos diméricos, tetraméricos o multiméricos y anticuerpos de cadena sencilla.
Las cadenas ligeras de anticuerpos de cualquier especie de vertebrado pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, concretamente, kappa (k) y lambda (A), en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Por consiguiente, los anticuerpos de la invención pueden contener un dominio constante de cadena ligera kappa o lambda. De acuerdo con realizaciones particulares, los anticuerpos de la invención incluyen regiones constantes de cadena pesada y/o ligera de anticuerpos humanos o de ratón. Además de los dominios constantes pesados y ligeros, los anticuerpos contienen una región de unión a antígeno que está compuesta por una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada, cada una de las cuales contiene tres dominios (es decir, regiones determinantes de la complementariedad 1-3; (CDR1, CDR2 y CDR3)). A los dominios de la región variable de la cadena ligera se hace referencia alternativamente como LCDR1, LCDR2 y LCRD3, y a los dominios de región variable de cadena pesada se hace referencia alternativamente como HCDR1, HCRD2, y HCDR3.
Las inmunoglobulinas pueden asignarse a cinco clases principales, concretamente, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de la cadena pesada. La IgG es el más estable de los cinco tipos de inmunoglobulinas y tiene una vida media en suero en humanos de aproximadamente 23 días. IgA e IgG se subclasifican además como los isotipos IgAi, IgA2, IgGi , IgG2, IgG3 e IgG4. Cada una de las cuatro subclases de IgG tiene diferentes funciones biológicas conocidas como funciones efectoras. Estas funciones efectoras generalmente están mediadas por la interacción con el receptor Fc (FcyR) o por la unión de Ciq y la fijación del complemento. La unión a FcyR puede llevar a una citólisis mediada por células dependiente de anticuerpos, mientras que la unión a factores del complemento puede llevar a una lisis celular mediada por el complemento. Un anticuerpo de la invención utilizado por su capacidad para prolongar la vida media de un péptido terapéutico tiene una función efectora mínima o nula, pero conserva su capacidad para unirse a FcRn, cuya unión puede ser un medio principal por el cual los anticuerpos tienen una vida media prolongada in vivo.
En una realización, la invención se refiere a un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una región variable de la cadena ligera que tiene secuencias del gen V de la línea germinal de Ig completamente humanas, y una región variable de la cadena pesada que tiene secuencias del gen V de la línea germinal de Ig completamente humanas, excepto HCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 143, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo no se une específicamente a ningún antígeno humano in vivo. En ciertas realizaciones, la invención se refiere a un conjugado que comprende un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una región variable de cadena ligera que tiene secuencias del gen V de la línea germinal de Ig completamente humanas, y una región variable de la cadena pesada que tiene secuencias del gen V de la línea germinal de Ig completamente humana, excepto HCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 143 y una fracción farmacéuticamente activa (por ejemplo, un péptido PYY cíclico de la invención) conjugado a la misma, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo no se une específicamente a ningún antígeno humano in vivo. En la presente divulgación, con respecto a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una realización de la invención, la frase "un conjugado que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo y una fracción farmacéuticamente activa conjugada con el mismo" se usa indistintamente con la frase "un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con una fracción farmacéuticamente activa".
Como se usa en la presente, el término "fragmento de unión a antígeno" se refiere a un fragmento de anticuerpo como, por ejemplo, un diacuerpo, un Fab, un Fab', un F(ab')2, un fragmento Fv, un fragmento Fv estabilizado con disulfuro (dsFv), un (dsFv)2, un dsFv biespecífico (dsFv-dsFv'), un diacuerpo estabilizado con disulfuro (diacuerpo ds), una molécula de anticuerpo de cadena sencilla (scFv), un anticuerpo de dominio único (sdab) un dímero scFv (diacuerpo bivalente), un anticuerpo multiespecífico formado a partir de una porción de un anticuerpo que comprende una o más CDR, un anticuerpo de dominio único camelizado, un nanocuerpo, un anticuerpo de dominio, un anticuerpo de dominio bivalente o cualquier otro fragmento de anticuerpo que se une a un antígeno pero no comprende una estructura de anticuerpo completa. Un fragmento de unión a antígeno es capaz de unirse al mismo antígeno al que se une el anticuerpo original o un fragmento de anticuerpo original. De acuerdo con realizaciones particulares, el fragmento de unión a antígeno comprende una región variable de cadena ligera, una región constante de cadena ligera y un segmento Fd (es decir, parte de la cadena pesada que está incluida en el fragmento Fab). De acuerdo con otras realizaciones particulares, el fragmento de unión a antígeno comprende Fab y F(ab').
Como se usa en la presente, el término "anticuerpo de cadena sencilla" se refiere a un anticuerpo de cadena sencilla convencional en el campo, que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera conectada por un péptido corto de aproximadamente 15 a aproximadamente 20 aminoácidos.. Como se usa en la presente, el término "anticuerpo de dominio único" se refiere a un anticuerpo de dominio único convencional en el campo, que comprende una región variable de cadena pesada y una región constante de cadena pesada o que comprende solo una región variable de cadena pesada.
La frase "anticuerpo aislado o fragmento de anticuerpo" se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a un antígeno objetivo está sustancialmente libre de anticuerpos que no se unen específicamente al antígeno objetivo). Además, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o productos químicos.
Una región variable de anticuerpo consiste de una región "marco" interrumpida por tres "sitios de unión a antígeno". Los sitios de unión a antígeno se definen usando varios términos: (i) Regiones determinantes de la complementariedad (CDR), tres en el VH (HCDR1, HCDR2, HCDR3) y tres en el VL (LCDR1, LCDR2, LCDR3), se basan en la variabilidad de secuencia. (Wu y Kabat J Exp Med 132:211-50, 1970; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991) (ii) "Regiones hipervariables", "HVR" o "HV", tres en el VH (HI, H2, H3) y tres en el VL (L1, L2, L3), se refieren a las regiones de los dominios variables de un anticuerpo. que son hipervariables en estructura según se define por Chothia y Lesk (Chothia y Lesk Mol Biol 196:901-17, 1987). Otros términos incluyen "IMGT-CDR" (Lefranc et al., Dev Comparat Immunol 27:55-77, 2003) y "Specificity Determining Residue Usage" (SDRU) (Almagro Mol Recognit 17:132-43, 2004). La base de datos International ImMunoGeneTics (IMGT) (http://www_mgt_org) proporciona una numeración y una definición estandarizadas de los sitios de unión a antígeno. La correspondencia entre las delineaciones de CDR, HV e IMGT se describe en Lefranc et al., Dev Comparat Immunol 27:55-77, 2003.
El "marco" o "secuencias del marco" son las secuencias restantes de una región variable distintas de las definidas como sitios de unión a antígeno. Como los sitios de unión a antígeno pueden definirse mediante varios términos como se ha descrito anteriormente, la secuencia exacta de aminoácidos de un marco depende de cómo se definió el sitio de unión al antígeno.
En una realización de la invención, un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena ligera que tiene la LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145 y SEQ ID NO: 146, respectivamente, y una región variable de cadena pesada que tiene la HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142 y SEQ ID NO: 143, respectivamente.
En otra realización, el anticuerpo aislado comprende además una región Fc derivada de la región Fc de IgG4 humana. La región Fc de IgG4 humana tiene una capacidad reducida para unirse a FcyR y factores del complemento en comparación con otros subtipos de IgG. Preferiblemente, la región Fc contiene la región Fc de IgG4 humana que tiene sustituciones que eliminan la función efectora. Por tanto, un anticuerpo aislado comprende además una región Fc que tiene una región Fc de IgG4 humana modificada que contiene una o más de las siguientes sustituciones: sustitución de prolina por glutamato en el residuo 233, alanina o valina por fenilalanina en el residuo 234 y alanina o glutamato por leucina en el residuo 235 (numeración de EU, Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. U.S. Dept. of Health and Human Services, Bethesda, Md., N° de publicación NIH 91-3242). La eliminación del sitio de glicosilación N-enlazado en la región Fc de IgG4 sustituyendo Asn por Ala en el residuo 297 (numeración EU) es otra manera de garantizar que se elimine la actividad efectora residual.
Preferiblemente, un anticuerpo de la invención existe como dímeros unidos entre sí por enlaces disulfuro y varias interacciones no covalentes. Por tanto, la porción Fc útil para el anticuerpo de la invención puede ser la región Fc de IgG4 humana que contiene una sustitución, como serina por prolina en la posición 228 (numeración EU), que estabiliza la formación de dímeros de cadena pesada y previene la formación de medias cadenas de Fc de IgG4.
En otra realización, se elimina el residuo de Lys C-terminal en la cadena pesada, como se ve comúnmente en los anticuerpos monoclonales producidos recombinantemente.
"Anticuerpo humano" se refiere a un anticuerpo que tiene regiones variables de cadena ligera y pesada en las que tanto el marco como los sitios de unión al antígeno se derivan de secuencias de origen humano. Si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también se deriva de secuencias de origen humano.
El anticuerpo humano comprende regiones variables de cadena pesada o ligera que se "derivan de" secuencias de origen humano si las regiones variables del anticuerpo se obtienen de un sistema que usa inmunoglobulina de línea germinal humana o genes de inmunoglobulina reorganizados. Tales sistemas incluyen bibliotecas de genes de inmunoglobulina humana presentadas en fagos, y animales transgénicos no humanos como ratones que portan loci de inmunoglobulina humana como se describe en la presente. El "anticuerpo humano" puede contener diferencias de aminoácidos cuando se compara con la línea germinal humana o secuencias de inmunoglobulina reorganizadas debido, por ejemplo, a mutaciones somáticas de origen natural o la introducción intencionada de sustituciones en el marco o sitios de unión al antígeno. Típicamente, "anticuerpo humano" es por lo menos aproximadamente un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntico en la secuencia de aminoácidos a una secuencia de aminoácidos codificada por una línea germinal humana o gen de inmunoglobulina reordenado. En algunos casos, el "anticuerpo humano" puede contener secuencias de marco de consenso derivadas de análisis de secuencias de marco humano, por ejemplo, como se describe en Knappik et al., J Mol Biol 296:57-86, 2000), o HCDR3 sintética incorporada en bibliotecas de genes de inmunoglobulina humana presentadas en fagos, por ejemplo, como se describe en Shi et al., J Mol Biol 397:385-96, 2010 y la Publicación de Patente Internacional N° WO2009/085462). Los anticuerpos en los que los sitios de unión al antígeno se derivan de una especie no humana no se incluyen en la definición de "anticuerpo humano".
Los anticuerpos humanizados aislados pueden ser sintéticos. Los anticuerpos humanos, aunque se derivan de secuencias de inmunoglobulinas humanas, pueden generarse usando sistemas como la presentación en fagos que incorporan CDR sintéticas y/o marcos sintéticos, o pueden someterse a mutagénesis in vitro para mejorar las propiedades de los anticuerpos, lo que da como resultado anticuerpos que no existen de forma natural dentro el repertorio de la línea germinal de anticuerpos humano in vivo.
El término "anticuerpo recombinante" como se usa en la presente, incluye todos los anticuerpos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, como anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómico para genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado a partir del mismo, anticuerpos aislados de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo, anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos combinatoria recombinante y anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el corte y empalme de secuencias de genes de inmunoglobulina humana con otras secuencias de ADN, o anticuerpos que se generan in vitro usando intercambio de brazos Fab.
El término "anticuerpo monoclonal", como se usa en la presente, se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpos de una composición molecular individual. Los anticuerpos monoclonales de la invención pueden elaborarse mediante el método de hibridoma, tecnología de presentación en fagos, tecnología de clonación de genes de linfocitos individuales, o mediante métodos de ADN recombinante. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden producirse mediante un hibridoma que incluye una célula B obtenida de un animal transgénico no humano, como un ratón o rata transgénicos, que tiene un genoma que comprende un transgén de cadena pesada y un transgén de cadena ligera humanos.
En ciertas realizaciones, el término "mAb" se refiere a un anticuerpo monoclonal que tiene una secuencia de cadena pesada variable (VH) que comprende la SEQ ID NO: 137 y una secuencia de cadena ligera variable (VL) que comprende la SEQ ID NO: 139. En ciertas realizaciones, el mAb es un anticuerpo monoclonal completamente humano que tiene una secuencia de cadena pesada (HC) que comprende la SEQ iD NO: 138 y una secuencia de cadena ligera (LC) que comprende laSEQ ID NO: 140. En ciertas realizaciones, el residuo de lisina en la posición 446 de la SEQ ID nO: 138 está opcionalmente ausente.
Como se usa en la presente, el término "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que la secuencia de aminoácidos de la molécula de inmunoglobulina se deriva de dos o más especies. La región variable de las cadenas ligera y pesada a menudo corresponde a la región variable de un anticuerpo derivado de una especie de mamífero (por ejemplo, ratón, rata, conejo, etc.) que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas, mientras que las regiones constantes corresponden a las secuencias de un anticuerpo derivado de otra especie de mamífero (por ejemplo, humano) para evitar provocar una respuesta inmune en esa especie.
Como se usa en la presente, el término "anticuerpo multiespecífico" se refiere a un anticuerpo que comprende una pluralidad de secuencias de dominio variable de inmunoglobulina, en donde una primera secuencia de dominio variable de inmunoglobulina de la pluralidad tiene especificidad de unión para un primer epítopo o comprende secuencias de línea germinal que carecen de cualquier especificidad de unión conocida y una segunda secuencia de dominio variable de inmunoglobulina de la pluralidad tiene especificidad de unión para un segundo epítopo o comprende secuencias de línea germinal que carecen de cualquier especificidad de unión conocida, y en donde el primer y/o el segundo dominio variable de inmunoglobulina incluye opcionalmente una fracción farmacéuticamente activa conjugada (por ejemplo, un péptido terapéutico). En una realización, el primer y el segundo epítopos están en el mismo antígeno, por ejemplo, la misma proteína (o subunidad de una proteína multimérica). En una realización, el primer y el segundo epítopos se superponen o se superponen sustancialmente. En una realización, el primer y el segundo epítopos no se superponen o no se superponen sustancialmente. En una realización, el primer y el segundo epítopos están en diferentes antígenos, por ejemplo, las diferentes proteínas (o diferentes subunidades de una proteína multimérica). En una realización, el primer y el segundo dominios variables de inmunoglobulina incluyen la misma fracción farmacéuticamente activa conjugada. En una realización, el primer y el segundo dominios variables de inmunoglobulina incluyen diferentes fracciones farmacéuticamente activas. En una realización, solo el primer dominio variable de inmunoglobulina incluye una fracción farmacéuticamente activa conjugada. En una realización, solo el segundo dominio variable de inmunoglobulina incluye una fracción farmacéuticamente activa conjugada. En una realización, un anticuerpo multiespecífico comprende un tercer, cuarto o quinto dominio variable de inmunoglobulina. En una realización, un anticuerpo multiespecífico es una molécula de anticuerpo biespecífico, un anticuerpo inespecífico o una molécula de anticuerpo tetraespecífico.
Como se usa en la presente, el término "anticuerpo biespecífico" se refiere a un anticuerpo multiespecífico que se une a no más de dos epítopos o dos antígenos y/o comprende dos fraccione farmacéuticamente activas conjugadas (por ejemplo, la misma fracción farmacéuticamente activa o una diferente). Un anticuerpo biespecífico se caracteriza por una primera secuencia de dominio variable de inmunoglobulina que tiene especificidad de unión para un primer epítopo o comprende secuencias de línea germinal que carecen de cualquier especificidad de unión conocida y una segunda secuencia de dominio variable de inmunoglobulina que tiene especificidad de unión para un segundo epítopo o comprende secuencias de línea germinal que carecen de cualquier especificidad de unión conocida, y en donde el primer y/o el segundo dominio variable de inmunoglobulina incluyen opcionalmente una fracción farmacéuticamente activa conjugada. En una realización, el primer y el segundo epítopos están en el mismo antígeno, por ejemplo, la misma proteína (o subunidad de una proteína multimérica). En una realización, el primer y el segundo epítopos se superponen o se superponen sustancialmente. En una realización, el primer y el segundo epítopos se encuentran en diferentes antígenos, por ejemplo, las diferentes proteínas (o diferentes subunidades de una proteína multimérica). En una realización, el primer y el segundo dominios variables de inmunoglobulina incluyen la misma fracción farmacéuticamente activa conjugada. En una realización, el primer y el segundo dominios variables de inmunoglobulina incluyen diferentes fracciones farmacéuticamente activas. En una realización, solo los primeros dominios variables de inmunoglobulina incluyen una fracción farmacéuticamente activa conjugada. En una realización, solo el segundo dominio variable de inmunoglobulina incluye una fracción farmacéuticamente activa conjugada. En una realización, un anticuerpo biespecífico comprende una primera secuencia de dominio variable de cadena pesada y una secuencia de dominio variable de cadena ligera que tienen especificidad de unión para un primer epítopo o comprenden secuencias de línea germinal que carecen de cualquier especificidad de unión conocida y una segunda secuencia de dominio variable de cadena pesada y secuencia de dominio variable de cadena ligera que tiene especificidad de unión para un segundo epítopo o comprenden secuencias de la línea germinal que carecen de cualquier especificidad de unión conocida, y en donde el primer y/o el segundo dominio variable de cadena pesada incluye opcionalmente una fracción farmacéuticamente activa conjugada. En una realización, el primer y el segundo dominios variables de cadena pesada incluyen la misma fracción farmacéuticamente activa conjugada. En una realización, el primer y el segundo dominios variables de cadena pesada incluyen diferentes fracciones farmacéuticamente activas conjugadas. En una realización, solo el primer dominio variable de cadena pesada incluye una fracción farmacéuticamente activa conjugada. En una realización, solo el segundo dominio variable de cadena pesada incluye una fracción farmacéuticamente activa conjugada.
"Anticuerpo de longitud completa", como se usa en la presente, se refiere a un anticuerpo que tiene dos cadenas pesadas de anticuerpo de longitud completa y dos cadenas ligeras de anticuerpo de longitud completa. Una cadena pesada (HC) de anticuerpo de longitud completa consiste de dominios variables y constantes de cadena pesada bien conocidos VH, CHI, CH2 y CH3. Una cadena ligera (LC) de anticuerpo de longitud completa consiste de dominios variables y constantes de cadena ligera bien conocidos VL y CL. El anticuerpo de longitud completa puede carecer de lisina C-terminal (K) en una o ambas cadenas pesadas.
El término "brazo Fab" o "media molécula" se refiere a una pareja de cadena pesada-cadena ligera que se une específicamente a un antígeno.
Pueden generarse anticuerpos biespecíficos de longitud completa, por ejemplo, usando intercambio de brazos Fab (o intercambio de mitad de molécula) entre dos anticuerpos bivalentes monoespecíficos mediante la introducción de sustituciones en la interfaz de CH3 de la cadena pesada en cada mitad de molécula para favorecer la formación de heterodímeros de dos medias moléculas de anticuerpo que tienen una especificidad distinta o in vitro en un entorno libre de células o usando coexpresión. La reacción de intercambio de brazos Fab es el resultado de una reacción de isomerización de enlaces disulfuro y de una disociación-asociación de dominios de CH3. Se reducen los enlaces disulfuro de cadena pesada en las regiones bisagra de los anticuerpos monoespecíficos originales. Las cisteínas libres resultantes de uno de los anticuerpos monoespecíficos originales forman un enlace disulfuro entre cadenas pesadas con residuos de cisteína de una segunda molécula de anticuerpo monoespecífico original y simultáneamente los dominios de CH3 de los anticuerpos originales se liberan y reforman mediante disociación-asociación. Los dominios de CH3 de los brazos Fab pueden manipularse para favorecer la heterodimerización sobre la homodimerización. El producto resultante es un anticuerpo biespecífico que tiene dos brazos Fab o medias moléculas, cada una de las cuales puede unirse a un epítopo distinto.
"Homodimerización", como se usa en la presente, con respecto a los anticuerpos, se refiere a una interacción de dos cadenas pesadas que tienen secuencias de aminoácidos de CH3 idénticas. "Homodímero", como se usa en la presente, con respecto a los anticuerpos, se refiere a un anticuerpo que tiene dos cadenas pesadas con secuencias de aminoácidos de CH3 idénticas.
"Heterodimerización", como se usa en la presente, con respecto a los anticuerpos, se refiere a una interacción de dos cadenas pesadas que tienen secuencias de aminoácidos de CH3 no idénticas. "Heterodímero", como se usa en la presente, con respecto a los anticuerpos, se refiere a un anticuerpo que tiene dos cadenas pesadas con secuencias de aminoácidos de CH3 no idénticas.
Puede usarse la estrategia "botón en agujero" (ver, por ejemplo, Publicación Internacional de PCT N° WO 2006/028936) para generar anticuerpos biespecíficos de longitud completa. Brevemente, los aminoácidos seleccionados que forman la interfaz de los dominios de CH3 en IgG humana se pueden mutar en posiciones que afectan a las interacciones del dominio de CH3 para promover la formación de heterodímeros. Un aminoácido con una cadena lateral pequeña (agujero) se introduce en una cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a un primer antígeno y un aminoácido con una cadena lateral grande (botón) se introduce en una cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a un segundo antígeno. Después de la coexpresión de los dos anticuerpos, se forma un heterodímero como resultado de la interacción preferencial de la cadena pesada con un "agujero" con la cadena pesada con un "botón". Las parejas de sustituciones de CH3 ejemplares forman un botón y un agujero son (expresadas como posición modificada en el primer dominio de CH3 de la primera cadena pesada/posición modificada en el segundo dominio de CH3 de la segunda cadena pesada): T366Y/F405A, T366W/F405W, F405W/Y407A, T394W/Y407T, T394S/Y407A, T366W/T394S, F405W/T394S y T366W/T366S_L368A_Y407V.
Pueden usarse otras estrategias como promover la heterodimerización de la cadena pesada usando interacciones electrostáticas mediante la sustitución de residuos cargados positivamente en una superficie de CH3 y residuos cargados negativamente en una segunda superficie de CH3, como se describe en la patente de la Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2010/0015133; Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2009/0182127; Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2010/028637 o la Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2011/0123532. En otras estrategias, puede promoverse la heterodimerización mediante las siguientes sustituciones (expresadas como posición modificada en el primer dominio de CH3 de la primera cadena pesada/posición modificada en el segundo dominio de CH3 de la segunda cadena pesada): L351Y_F405A_Y407V/T394W, T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V, T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V, L351Y_Y407A/T366A_K409F, L351Y_Y407A/T366V_K409F, Y407A/T366A_K409F, o T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W como se describe en la Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2012/0149876 o la Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2013/0195849.
Además de los métodos descritos anteriormente, los anticuerpos biespecíficos pueden generarse in vitro en un entorno libre de células introduciendo mutaciones asimétricas en las regiones de CH3 de dos anticuerpos homodiméricos monoespecíficos y formando el anticuerpo heterodimérico biespecífico a partir de dos anticuerpos homodiméricos monoespecíficos originales en condiciones reductoras para permitir isomerización del enlace disulfuro de acuerdo con los métodos descritos en la Publicación de Patente Internacional N° WO2011/131746. En los métodos, el primer anticuerpo bivalente monoespecífico y el segundo anticuerpo bivalente monoespecífico se manipula para que tengan ciertas sustituciones en el dominio de CH3 que promueven la estabilidad del heterodímero; los anticuerpos se incuban juntos en condiciones reductoras suficientes para permitir que las cisteínas de la región bisagra experimenten la isomerización de los enlaces disulfuro; generando de este modo el anticuerpo biespecífico mediante intercambio de brazos Fab. Las condiciones de incubación pueden restaurarse óptimamente a no reductoras. Ejemplos de agentes reductores que pueden usarse son 2-mercaptoetilamina (2-MEA), ditiotreitol (DTT), ditioeritritol (DTE), glutatión, tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), L-cisteína y beta-mercaptoetanol, preferiblemente un agente reductor seleccionado del grupo que consiste de: 2-mercaptoetilamina, ditiotreitol y tris(2-carboxietil)fosfina. Por ejemplo, puede usarse incubación durante por lo menos 90 min a una temperatura de por lo menos 20° C en presencia de por lo menos 2-MEA 25 mM o en presencia de por lo menos ditiotreitol 0,5 mM a un pH de 5-8, por ejemplo un pH de 7,0 7,4.
La numeración de los residuos de aminoácidos en la región constante del anticuerpo a lo largo de la memoria descriptiva se realiza de acuerdo con el índice EU como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), a menos que se indique explícitamente lo contrario.
Conjugados
En otro aspecto general, la invención se refiere a un conjugado que comprende un anticuerpo de la invención conjugado covalentemente con una fracción farmacéuticamente activa, como un péptido terapéutico sintético (por ejemplo, un péptido PYY cíclico), de una manera específica de sitio, de tal manera que el péptido acoplado al anticuerpo tiene una vida media prolongada/aumentada en comparación con el péptido solo. La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas y métodos de uso de los mismos. Los conjugados son útiles para prevenir, tratar o mejorar enfermedades o trastornos, como obesidad, diabetes tipo 2, síndrome metabólico (es decir, síndrome X), resistencia a la insulina, tolerancia a la glucosa alterada (por ejemplo, intolerancia a la glucosa), hiperglucemia, hiperinsulinemia, hipertrigliceridemia., hipoglucemia debida a hiperinsulinismo congénito (CHI), dislipidemia, aterosclerosis, nefropatía diabética, y otros factores de riesgo cardiovascular como hipertensión y factores de riesgo cardiovasculares relacionados con niveles no controlados de colesterol y/o lípidos, osteoporosis, inflamación, enfermedad del hígado graso alcohólico (NAFLD), esteatohepatitis no alcohólica (NASH), enfermedad renal y eccema, entre otros.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo de la invención se modifica para comprender por lo menos una sustitución de residuos de cisteína que es capaz de conjugarse con la fracción farmacéuticamente activa para prolongar/aumentar la vida media de la fracción farmacéuticamente activa. En ciertas realizaciones, la por lo menos una sustitución de residuos de cisteína está comprendida en una región determinante de la complementariedad del anticuerpo. En ciertas realizaciones, la por lo menos una sustitución de residuos de cisteína está en una región determinante de la complementariedad de cadena pesada (HCDR). En ciertas realizaciones, la por lo menos una sustitución de residuos de cisteína está en una HCDR3, en donde la HCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 143. En ciertas realizaciones, el anticuerpo que comprende una HCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 143 tienen por lo menos una sustitución de cisteína adicional que es capaz de conjugarse con una fracción farmacéuticamente activa.
En ciertas realizaciones, la fracción farmacéuticamente activa puede comprender un conector. El conector puede modificarse químicamente para permitir la conjugación del anticuerpo con la fracción farmacéuticamente activa. El conector puede incluir, por ejemplo, pero no se limita a, un conector peptídico, un conector de hidrocarburo, un conector de polietilenglicol (PEG), un conector de polipropilenglicol (PPG), un conector de polisacárido, un conector de poliéster, un conector híbrido que consiste de PEG y un heterociclo incrustado, o una cadena de hidrocarburos. Los conectores de PEG pueden comprender, por ejemplo, 2-24 unidades de PEG.
En ciertas realizaciones, un anticuerpo monoclonal de la invención se conjuga con uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis fracciones farmacéuticamente activas (por ejemplo, péptidos terapéuticos) de interés. En realizaciones preferidas, el anticuerpo monoclonal no dirigido se conjuga con dos fracciones farmacéuticamente activas de interés. En ciertas realizaciones en las que el anticuerpo monoclonal se conjuga con por lo menos dos fracciones farmacéuticamente activas de interés, las fracciones farmacéuticamente activas de interés pueden ser la misma fracción farmacéuticamente activa o pueden ser diferentes fracciones farmacéuticamente activas.
Los métodos para conjugar anticuerpos de la invención con las fracciones farmacéuticamente activas de la invención son conocidos en la técnica. Brevemente, los anticuerpos de la invención pueden reducirse con un agente reductor (por ejemplo, TCEP (tris(2-carboxietil)fosfina), purificar (por ejemplo, mediante adsorción de proteína A o filtración en gel) y conjugarse con la fracción farmacéuticamente activa (por ejemplo, proporcionando un péptido liofilizado al anticuerpo reducido en condiciones que permitan la conjugación). Después de la reacción de conjugación, el conjugado puede purificarse mediante cromatografía de intercambio iónico o cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) con un paso de purificación final de adsorción de proteína A. En ciertas realizaciones, los anticuerpos de la invención pueden purificarse antes de reducirlos usando métodos de HIC. Para una descripción más detallada de los métodos de conjugación, ver, Dennler et al., Antibodies 4:197-224 (2015).
En la presente se proporcionan conjugados que comprenden un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo acoplado a un péptido PYY cíclico, en donde el péptido PYY cíclico está representado por la Fórmula I o un derivado o sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
Figure imgf000017_0001
p es 0 o 1;
m es 0, 1, 2, 3, 4 o 5;
n es 1, 2, 3 o 4;
q es 0 o 1; siempre que q sea 1 solo cuando 30 esté ausente;
PUENTE es -Ph-CH2-S-, -triazolil-, -NHC(O)CH2S-, -SCH2C(O)NH-, -(OCH2CH2)2NHC(O)CH2S, -NHC(O)- o -CH2S-;
Z4 es K, A, E, S o R;
Z7 es A o K;
Z9 es G o K;
Z11 es D o K;
Z22 es A o K;
Z23 es S o K;
Z26 es A o H;
Z30 es L, W, ausente o K;
siempre que Z30 esté ausente sólo cuando q sea 1;
Z34 es
Figure imgf000018_0001
Z35 es
Figure imgf000018_0002
en donde el derivado es el compuesto de Fórmula I que se modifica mediante uno o más procesos seleccionados del grupo que consiste de amidación, glicosilación, carbamilación, sulfatación, fosforilación, ciclación, lipidación y pegilación
En ciertas realizaciones, el péptido PYY cíclico es un derivado del péptido PYY cíclico de Fórmula I que se modifica mediante uno o más procesos seleccionados del grupo que consiste de amidación, lipidación y pegilación, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En ciertas realizaciones, el péptido PYY cíclico está representado por la Fórmula I o el derivado o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde:
p es 0 o 1;
m es 0, 1, 2, 3, 4 o 5;
n es 1, 2, 3 o 4;
q es 0 o 1; siempre que q sea 1 solo cuando Z30 esté ausente;
PUENTE es -Ph-CH2-S-, -triazolil-, -NHC(O)CH2S-, -SCH2C(O)NH-, -(OCH2CH2)2NHC(O)CH2S, -NHC(O)-, o -CH2S-;
Z4 es K, A, E, S o R;
Z7 es A o K, en donde la cadena lateral amino de dicho K está opcionalmente sustituida con
Figure imgf000018_0003
Figure imgf000019_0001
o
en donde i es un número entero de
Figure imgf000019_0002
donde la cadena lateral amino de dicho K está opcionalmente sustituida con
Figure imgf000019_0003
en donde t es 0, 1 o 2;
u es 0 o 1; y
v es 14, 16 o 18;
Figure imgf000019_0004
Figure imgf000020_0001
en d
Figure imgf000020_0002
Z11 es D o K, en donde la cadena lateral amino de dicho K está opcionalmente sustituida con
Figure imgf000020_0003
en donde w es 0, 1, 2 o 4;'
x es 0 o 1; y
y es 14, 16 o 18;
Figure imgf000020_0004
Figure imgf000021_0001
en donde i es un número entero de 0 a 24, y X = Br, I o Cl,
Figure imgf000021_0002
-C(O)CH2l, -C(O)CH2Cl o -C(O)CH2Br;
Z22 es A o K, en donde la cadena lateral amino de dicho K está opcionalmente sustituida con
Figure imgf000021_0003
Figure imgf000022_0003
en donde i es un número entero de 0 a 24, y X = Br, I o Cl, -C(O)CH2Br, -C(O)CH2l, o -C(O)CH2Cl;
Z23 es S o K; en donde la cadena lateral amino de dicho K está opcionalmente sustituida con
Figure imgf000022_0001
o
en donde i es un número entero de
Figure imgf000022_0002
Z26 es A o H;
Z30 es L, W, ausente o K, siempre que Z30 esté ausente solo cuando q sea 1, en donde la cadena lateral amino de dicho K está opcionalmente sustituida con
Figure imgf000023_0001
en donde r es 0, 1 o 2;
s es 0 o 1; y
q es 14, 16 o 18; o
Figure imgf000023_0002
Figure imgf000024_0002
Z34 es
Figure imgf000024_0001
Z35 es
Figure imgf000025_0001
En ciertas realizaciones, el péptido PYY cíclico está representado por la Fórmula I o el derivado o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde:
p es 0 o 1;
mes 0, 1,2, 3o5;
n es 1, 2 o 4;
q es 0 o 1; siempre que q sea 1 solo cuando Z30 esté ausente;
PUENTE es -Ph-CH2-S-, -triazolil-, -NHC(O)CH2S-, -SCH2C(O)NH-, -(OCH2CH2)2NHC(O)CH2S, -NHC(O)-, o -CH2S-;
Z4 es K, A, E, S o R;
Z7 es A o K, en donde la cadena lateral amino de dicho K está sustituida con
Figure imgf000025_0003
Z9 es G o K, en donde la cadena lateral amino de dicho K está sustituida con
Figure imgf000025_0002
en donde t es 0;
u es 1; y
v es 14;
Z11 es D o K, en donde la cadena lateral amino de dicho K está opcionalmente sustituida con
Figure imgf000026_0001
en donde w es 0 o 4;
x es 1; y
y es 14;
Figure imgf000026_0002
-C(O)CH2Br,
Figure imgf000026_0003
Figure imgf000027_0001
Z22 es A o K, en donde la cadena lateral amino de dicho K está sustituida con
Figure imgf000027_0002
Z23 es S o K, en donde la cadena lateral amino de dicho K está sustituida con
Figure imgf000027_0004
Z26 es A o H;
Z30 es L o K, en donde la cadena lateral amino de dicho K está sustituida con
Figure imgf000027_0003
Figure imgf000028_0001
en donde r es 0 o 2;
s es 1; y
es 14, 16 o 18; o
Figure imgf000028_0002
Figure imgf000029_0001
Z35 es
Figure imgf000029_0002
En ciertas realizaciones, un conjugado comprende un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo conjugado con un péptido PYY cíclico, en donde el péptido PYY cíclico se selecciona del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 1-100 y las SEQ ID NO: 147-156. En una realización preferida, el conjugado comprende un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo conjugado con un péptido PYY cíclico, en donde el péptido PYY cíclico se selecciona del grupo que consiste de la SeQ ID NO: 1, las SeQ ID NO: 73-100 y las SEQ NO: ID: 147-156.
En ciertas realizaciones, un anticuerpo monoclonal o el fragmento de unión a antígeno del mismo está enlazado covalentemente al péptido PYY cíclico en un residuo de lisina del péptido PYY cíclico mediante un conector. El conector puede comprender, por ejemplo, un conector seleccionado del grupo que consiste de polietilenglicol (PEG)8-triazolil-CH2CH2CO-PEG4, una cadena de PEG de 2-24 unidades de PeG, una cadena de alquilo que contiene 2-10 átomos de carbono, (Gly4Ser)j en donde j = 1-4, (AlaPro)u en donde u = 1-10, o un enlace.
Un anticuerpo monoclonal o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una realización de la invención puede conjugarse con un péptido PYY cíclico en una o más posiciones de aminoácidos del PYY cíclico, como el residuo de aminoácido 4, 7, 9, 10, 11., 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 30 o 31 del PYY usando métodos conocidos en la técnica. La numeración de los residuos de aminoácidos sigue a la de hPYY3-36. En ciertas realizaciones, solo uno de Z7, Z9, Z11 , Z22 y Z23 en la Fórmula I es lisina, y la lisina está enlazada covalentemente a un residuo de cisteína manipulado del anticuerpo monoclonal o el fragmento de unión a antígeno del mismo a través del conector. En una realización preferida, un anticuerpo monoclonal o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una realización de la invención se conjuga con un péptido PYY cíclico en el residuo 11 del PYY cíclico. En otra realización preferida, se introduce un electrófilo, como bromoacetamida o maleimida, en una cadena lateral de un PYY cíclico, como la cadena lateral amino de una lisina en el residuo 11 del PYY cíclico, y el electrófilo reacciona en el sitio específicamente con el grupo sulfhidrilo del residuo Cys manipulado en una CDR, preferiblemente HCDR3, del anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo, creando de este modo un enlace covalente entre el péptido PYY cíclico y el anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo. Más preferiblemente, el péptido PYY cíclico se selecciona del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 1, las SEQ ID NO: 73-100 y las SEQ ID NO: 147-156. En una realización, el electrófilo se introduce directamente en la cadena lateral de un PYY cíclico. En otra realización, el electrófilo se introduce en la cadena lateral de un PYY cíclico indirectamente a través de un conector.
También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden los conjugados de la invención y que comprenden además un portador farmacéuticamente aceptable.
También se proporcionan conjugados que comprenden un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo acoplado a un péptido PYY cíclico, en donde los conjugados están representados por la Fórmula IIIa-b, IVa-b, Va-by/o VIa-b, respectivamente.
Figure imgf000030_0001
Figure imgf000031_0001
Figure imgf000032_0001
En las fórmulas IlIa-b, IVa-b, Va-b y Vla-b,
x puede ser, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o 6, preferiblemente 2.
el enlace 1 puede ser, por ejemplo, G, pA, -COCH2OCH2CH2OCH2CH2NH-, Y-aminobutanoilo, GG, -CO(CH2)mSCH2-(siempre que cuando el enlace 2 =-NH-, m=1, 2) o un enlace;
el enlace 2 puede ser, por ejemplo, -CH2-, bencilo, etiltriazolilo, -NH- o un enlace;
n puede ser, por ejemplo, 1, 2 o 3;
X puede ser, por ejemplo, -S- o -CH2-;
Z3 puede ser, por ejemplo, I o un enlace;
Z4 puede ser, por ejemplo, K, S, o R;
Z30 puede ser, por ejemplo, L, W, K (mPEG16) o K (mPEG12);
Z34 puede ser, por ejemplo, Q, en donde dicho Q está opcionalmente N-metilado en el nitrógeno de alfa-amida; Z35 puede ser, por ejemplo, R, en donde dicho R está opcionalmente N-metilado en el nitrógeno de alfa-amida, o R está descarbonilado dando como resultado un enlace psi-(Z35Z36) amida, o R está tanto N-metilado en el nitrógeno de alfa-amida y descarbonilado dando como resultado un enlace ps/-(Z35Z36) amida;
Z36 puede ser, por ejemplo, Y (Tyr), Cha (p-ciclohexilalanina), Aic (ácido 2-aminoindano-2-carboxílico) o F (Phe), en donde dicho F está opcionalmente para-sustituido con fluoro (4-F-Phe), cloro (4-Cl-Phe), Bromo (4-Br-Phe), yodo (4-I-Phe), amino (4-NH2-Phe); y
el enlace 3 puede comprender, por ejemplo, cualquiera de las siguientes amidaciones de la cadena lateral de lisina: (PEG)8-triazolil-CH2CH2cO-PEG4 (incluyendo
Figure imgf000032_0002
), una cadena PEG de 2-24 unidades de PEG (incluyendo
Figure imgf000032_0003
), una cadena de alquilo que contiene 2-10 átomos de carbono (incluyendo
Figure imgf000032_0004
alquilo C(Mp -
), (Gly4Ser)j en donde j = 1-4, (AlaPro)u donde u = 1-10, o-NH-Enlace 3- puede ser reemplazado por un enlace.
También se proporciona un conjugado que comprende un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo (mAb) acoplado a un péptido PYY cíclico (cPYY) mediante un conector (L): cPYY-L]2-mAb, en donde el conjugado comprende una secuencia PYY cíclica seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 102-127 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, el mAb representa un anticuerpo monoclonal o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una realización de la invención, y ]2 representa que 1 o 2 del péptido PYY cíclico se conjuga covalentemente con el mAb.
También se proporcionan en la presente análogos cíclicos N-terminales a la cadena lateral de PYY que muestran por lo menos un 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 95% o 99% de identidad de secuencia con PYY3 -36 humano (hPYY3 -36 ). Como ejemplo de un método para la determinación de la identidad de secuencia entre dos análogos, los dos péptidos
Figure imgf000033_0001
están alineados. La identidad de secuencia del análogo con respecto a hPYY(3 -36) viene dada por el número total de residuos alineados menos el número de residuos diferentes (es decir, el número de residuos idénticos alineados) dividido por el número total de residuos en hPYY3 -36. En este ejemplo, los diferentes residuos son D11 que se ha intercambiado por un K11 sustituido, seguido de V31 que se ha intercambiado por hC31, y finalmente R35 se ha descarbonilado. Por consiguiente, en dicho ejemplo la identidad de secuencia es (34-3)/34 X 100.
Péptidos PYY cíclicos
PYY3 -36 es una hormona endógena secretada por las células L en el intestino distal que actúa como agonista del receptor Y2 para inhibir la ingesta de alimentos. Dado su papel en el control del apetito y la ingesta de alimentos, así como sus efectos antisecretores y proabsorbentes en el tracto gastrointestinal de los mamíferos, PYY3 -36 puede ser eficaz en el tratamiento de la obesidad y afecciones asociadas, así como en una serie de trastornos gastrointestinales. Sin embargo, la utilidad terapéutica del propio PYY3 -36 como agente de tratamiento está limitada por su rápido metabolismo y su corta vida media circulante. Por tanto, la presente invención se dirige generalmente a conjugados de PYY3 -36 modificados, que prolongan la vida media del péptido PYY3 -36 y reduce el metabolismo del péptido in vivo.
En ciertas realizaciones de la invención, los péptidos PYY3 -36 modificados son péptidos PYY cíclicos. Los términos "péptido PYY cíclico", "análogo de PYY3 -36 cíclico" y "análogo de péptido PYY3 -36 cíclico" pueden usarse de manera intercambiable. Ejemplos de péptidos PYY cíclicos que pueden usarse en los conjugados se describen en la Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 62/413.613, presentada el 27 de octubre de 2016 y la Solicitud de Patente de Estados Unidos titulada "Cyclic peptide tyrosine tyrosine compounds as modulators of neuropeptide receptors", presentada el mismo día que esta solicitud con el número de expediente del representante PRD3411.
Como se usa en la presente, se pretende que el término "NTSC-PYY" describa análogos cíclicos N-terminales a la cadena lateral de PYY.
Las secuencias de péptidos descritas en la presente se escriben de acuerdo con la convención habitual en la que la región N-terminal del péptido está a la izquierda y la región C-terminal está a la derecha. Aunque se conocen formas isoméricas de los aminoácidos, es la forma L del aminoácido la que se representa a menos que se indique expresamente lo contrario. Por conveniencia al describir las moléculas de esta invención, se usan abreviaturas convencionales y no convencionales para varios aminoácidos (códigos tanto de una sola como de tres letras) y fracciones funcionales. Estas abreviaturas son familiares para los expertos en la técnica, pero para mayor claridad se enumeran a continuación: A = Ala = alanina; R = Arg = arginina; N = Asn = asparagina; D = Asp = ácido aspártico; pA = pAla = beta-alanina; C = Cys = cisteína; hC = hCys = homocisteína; E = Glu = ácido glutámico; Q = Gln = glutamina; G = Gly = glicina; H = His = histidina; I = Ile = isoleucina; L = Leu = leucina; K = Lys = lisina; Nle = norleucina; F = Phe = fenilalanina; P = Pro = prolina; S = Ser = serina; T = Thr = treonina; W = Trp = triptófano; Y = Tyr = tirosina y V = Val = valina.
Por conveniencia, la convención de numeración de residuos de aminoácidos usada para nombrar los péptidos NTSC-PYY de la presente invención sigue la de hPYY3 -36. Los reemplazos de aminoácidos específicos que se han introducido en los péptidos NTSC-PYY, con respecto a los residuos nativos en las posiciones correspondientes en hPYY3 -36 , se indican mediante el código de aminoácidos apropiado, seguido de la posición de la sustitución. Por tanto, "S4" en el péptido NTSC-PYY se refiere a un péptido en el que la serina ha reemplazado al residuo de lys4 nativo correspondiente de hPYY3 -36. De manera similar, "hC31" en el péptido NTSC-PYY se refiere a un péptido en el que la homocisteína ha reemplazado al residuo val31 nativo correspondiente de hPYY3 -36. Los reemplazos de aminoácidos adicionales que se producen dentro de los péptidos NTSC-PYY se describen de acuerdo con esta convención y serán reconocidos como tales por un experto en la técnica.
También por conveniencia, la convención de nomenclatura usada para los péptidos NTSC-PYY de la presente invención incorpora los residuos amino implicadoss en el ciclo junto con el grupo o grupos de enlace entre ellos en una dirección de izquierda a derecha, comenzando desde el residuo N-terminal implicado en el ciclo. En todos los casos, el residuo de aminoácido N-terminal del ciclo se une mediante su funcionalidad a-amino al grupo de enlace, que a su vez se conecta con el residuo de la cadena lateral del aminoácido en la posición 31 del péptido NTSC-pYy . Por lo tanto, "ciclo-(I3-m-COPhCH2-hC31)" se usa para describir el ciclo de un péptido NTSC-PYY en el que la funcionalidad a-amino de Ile3 se acila con un residuo de ácido meta-toluico, cuyo grupo metilo está enlazado adicionalmente por medio de un enlace tioéter a la cadena lateral de un residuo hCys31. De manera similar, "ciclo-(K4-CO(CH2)2NHCOCH2-hC31)" se usa para describir el ciclo de un péptido NTSC-PYY, en el que se ha eliminado el residuo Ile3 nativo y cuya funcionalidad a-amino (ahora N-terminal) de lys4 está acilada por un grupo 3-acetamidopropanoilo, cuyo carbono acetamido metileno está conectado a la cadena lateral de un residuo hCys31 por medio de un enlace tioéter.
Pueden incorporarse residuos de lisina en varias posiciones de la secuencia de hPYY3 -36 para proporcionar un asa funcional conveniente para una derivatización adicional. Los residuos de lisina pueden modificarse para acoplarse al anticuerpo monoclonal ya sea directa o indirectamente. En un acoplamiento indirecto al anticuerpo monoclonal, el residuo de lisina puede modificarse para que comprenda un conector que permitirá que el péptido PYY cíclico se acople al anticuerpo monoclonal. Un experto en la técnica reconocerá que los ortólogos relacionados también podrían emplearse eficazmente como tales y se contemplan en la presente.
El término "K(y-Glu)", que aparece en la secuencia del péptido, representa un residuo de lisinilo cuyo grupo £-amino de la cadena lateral ha sido acilado por el grupo Y-carboxilo del ácido glutámico.
El término "K(y-Glu-Pal (palmitoilo))" representa un residuo de lisinilo cuyo grupo £-amino de la cadena lateral ha sido acilado por el grupo Y-carboxilo del ácido N-hexadecan-1-oilglutámico.
El término "K (y-Glu-Stear (estearoilo))" representa un residuo de lisinilo cuyo grupo £-amino de la cadena lateral ha sido acilado por el grupo Y-carboxilo del ácido N-octadecan-1-oilglutámico.
El término "K (y-Glu-Arach (araquidoilo))" representa un residuo de lisinilo cuyo grupo £-amino de la cadena lateral ha sido acilado por el grupo Y-carboxilo del ácido N-dodecan-1-oilglutámico.
El término "K (OEG) (8-amino-3,6-dioxaoctanoilo)" representa un residuo de lisinilo cuyo grupo £-amino de la cadena lateral ha sido acilado por ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico.
El término "(OEG)/ representa dos unidades de OEG enlazadas entre sí en sucesión mediante un enlace amida (es decir, ácido 17-amino-10-oxo-3,6,12,15-tetraoxa-9-azaheptadecanoico).
El término "K(OEG)2" representa un residuo de lisinilo cuyo grupo £-amino de la cadena lateral ha sido acilado por ácido 17-amino-10-oxo-3,6,12,15-tetraoxa-9-azaheptadecanoico.
El término "K((OEG)2-Y-Glu" representa un residuo de lisinilo cuyo grupo £-amino de la cadena lateral ha sido acilado por ácido (22S)-22-amino-10,19-dioxo-3,6,12,15-tetraoxa-9,18-diazatricosanodioico a través de su funcionalidad de ácido 1-carboxílico.
El término, "K((OEG)2-Y-Glu-Stear)" representa un residuo de lisinilo cuyo grupo £-amino de la cadena lateral ha sido acilado por ácido (22S)-10,19-dioxo-22-estearamido-3,6,12,15-tetraoxa-9,18-diazatricosanodioico a través de su funcionalidad de ácido 1-carboxílico.
El término, "K((OEG)2-Y-Glu-COCi 6 CO2 H)" representa un residuo de lisinilo cuyo grupo £-amino de la cadena lateral ha sido acilado por ácido (21S)-9,18,23-trioxo-2,5,11,14-tetraoxa-8,17,22-triazanonatriacontano-1,21,39-tricarboxílico a través de su funcionalidad de ácido 1-carboxílico.
De manera similar, el término "K((OEG)2-Y-Glu-COC1s CO2 H)" representa un residuo de lisinilo cuyo grupo £-amino de la cadena lateral ha sido acilado por ácido (21S)-9,18,23-trioxo-2,5,11,14-tetraoxa-8,17,22-triazahentetracontano-1,21,41-tricarboxílico a través de su funcionalidad de ácido 1-carboxílico.
El término, "K((OEG)2-COC16CO2 H)" representa un residuo de lisinilo cuyo grupo £-amino de la cadena lateral ha sido acilado por ácido 10,19-dioxo-3,6,12,15-tetraoxa-9,18-diazahexatriacontanodioico a través de su funcionalidad de ácido 1-carboxílico.
El término "K(PEG24-AcBr)" representa un residuo de lisinilo cuyo grupo £-amino de la cadena lateral ha sido acilado por ácido N-bromoacetil-75-amino-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61,64,67,70,73-tetracosaoxapentaheptacontanoico a través de su funcionalidad de ácido 1-carboxílico.
El término "K(PEG12-AcBr)" representa un residuo de lisinilo cuyo grupo £-amino de la cadena lateral ha sido acilado por ácido N-bromoacetil-39-amino-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-dodecaoxanonatriacontanoico a través de su funcionalidad de ácido 1-carboxílico.
El término "K(PEG6-AcBr)" representa un residuo de lisinilo cuyo grupo £-amino de la cadena lateral ha sido acilado por ácido N-bromoacetil-3-[(17-amino-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadec-1-il)oxi]-propanoico a través de su funcionalidad de ácido 1-carboxílico.
El término "K(PEG8-triazolil-CH2CH2CO-PEG4-AcBr)" representa un residuo de lisinilo cuyo grupo £-amino de la cadena lateral ha sido acilado por ácido 27-[4-[2-[3-[2-[2-[3-(N-bromoacetilamino)propoxi]etoxi]etoxi]propilaminocarbonil]etil]tetrazol-1-il]-4,7,10,13,16,19,22,25-octaoxaheptacosanoico a través de su funcionalidad de ácido 1-carboxílico.
El término "K(mPEG16) representa un residuo de lisinilo cuyo grupo £-amino de la cadena lateral ha sido acilado por ácido 4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49-hexadecaoxapentacontanoico a través de su funcionalidad de ácido 1-carboxílico.
El término "K(mPEG12)" representa un residuo de lisinilo cuyo grupo £-amino de la cadena lateral ha sido acilado por ácido 4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-dodecaoxaoctatriacontanoico a través de su funcionalidad de ácido 1-carboxílico.
El término "VitE" representa una unidad de a-tocoferolilo en la molécula.
El término "AcVitE" representa una unidad de a-tocoferolilo cuyo grupo fenólico lleva una funcionalidad metilenilcarboxi enlazada a éter.
El término K-Y-Glu-AcVitE "representa un residuo de lisinilo cuyo grupo £-amino de la cadena lateral ha sido acilado por ácido (2-(((2R)-2,5,7,8-tetrametil-2-((4R,8R)-4,8,12-trimetiltridecil)croman-6-il)oxi)acetil)-L-glutámico a través de su funcionalidad de ácido Y-carboxílico.
Muchos de los compuestos/conjugados de la presente invención incorporan un enlace amida reducido entre el residuo C-terminal de la secuencia, Y36, y su residuo adyacente, R35. Este enlace amida reducido está representado por el término 'ps/-(R35, Y36)".
Varios residuos de aminoácidos que comprenden ciertas secuencias de la presente invención contienen grupos a-amino que han sido metilados. Por tanto, los términos "N-Me-Q34" o "N-Me-R35" representan glutamina a-N-metilada en la posición 34 de una secuencia, y arginina a-N-metilada en la posición 35 de una secuencia, respectivamente.
El término "N-Me-Q34, ps/-(R35, Y36)" en una descripción de secuencia se refiere a una secuencia que contiene tanto un residuo de a-metilglutamina en la posición 34 como un enlace amida reducido entre los residuos R35 e Y36.
De manera similar, el término "N-Me-R35, ps/-(R35, Y36)" en una descripción de secuencia se refiere a una secuencia que contiene un residuo de a-metil arginina en la posición 35, así como un enlace amida reducido entre este residuo e Y36.
Fracciones que prolongan la vida media
Además del anticuerpo de la presente invención o un fragmento de unión a antígeno del mismo, los conjugados de la invención pueden incorporar una o más fracciones para extender la vida media de la fracción farmacéuticamente activa (por ejemplo, el péptido PYY cíclico), por ejemplo mediante interacción covalente. Otras fracciones ejemplares que prolongan la vida media incluyen, pero no se limitan a, albúmina, variantes de albúmina, proteínas y/o dominios de unión a albúmina, transferrina y fragmentos y análogos de los mismos. Las fracciones adicionales que prolongan la vida media que pueden incorporarse en los conjugados de la invención incluyen, por ejemplo, moléculas de polietilenglicol (PEG), como PEG5000 o PEG20.000, ácidos grasos y ésteres de ácidos grasos de diferentes longitudes de cadena, por ejemplo, laurato, miristato, estearato, araquidato, behenato, oleato, araquidonato, ácido octanodioico, ácido tetradecanodioico, ácido octadecanodioico, ácido docosanedioico y similares, polilisina, octano, carbohidratos (dextrano, celulosa, oligo- o polisacáridos) para las propiedades deseadas. Estas fracciones pueden ser fusiones directas con las secuencias codificantes del andamiaje proteico y pueden generarse mediante técnicas estándar de clonación y expresión. Alternativamente, pueden usarse métodos de acoplamiento químico bien conocidos para unir las fracciones a conjugados de la invención producidos químicamente y recombinantemente.
Puede añadirse una fracción pegilo, por ejemplo, a las moléculas peptídicas de la invención incorporando un residuo de cisteína al extremo C-terminal de la molécula y uniendo un grupo pegilo a la cisteína usando métodos bien conocidos.
Las moléculas de péptidos de la invención que incorporan fracciones adicionales pueden compararse en cuanto a funcionalidad mediante varios ensayos bien conocidos. Por ejemplo, las actividades biológicas o farmacocinéticas de un péptido terapéutico de interés, solo o en un conjugado de acuerdo con la invención, pueden probarse usando ensayos in vitro o in vivo conocidos y compararse.
Composiciones farmacéuticas
En otro aspecto general, la invención se refiere a una composición farmacéutica, que comprende los conjugados y compuestos de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. El término "composición farmacéutica" como se usa en la presente significa un producto que comprende un conjugado de la invención junto con un portador farmacéuticamente aceptable. Los conjugados y compuestos de la invención y las composiciones que los comprenden también son útiles en la fabricación de un medicamento para aplicaciones terapéuticas mencionadas en la presente.
Como se usa en la presente, el término "portador' se refiere a cualquier excipiente, diluyente, carga, sal, tampón, estabilizante, solubilizante, aceite, lípido, vesícula que contiene lípidos, microesferas, encapsulación liposomal u otro material bien conocido en la técnica para su uso en formulaciones farmacéuticas. Se entenderá que las características del portador, excipiente o diluyente dependerán de la vía de administración para una aplicación particular. Como se usa en la presente, el término "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un material no tóxico que no interfiere con la eficacia de una composición de acuerdo con la invención o la actividad biológica de una composición de acuerdo con la invención. De acuerdo con realizaciones particulares, a la vista de la presente divulgación, en la invención puede usarse cualquier portador farmacéuticamente aceptable para su uso en una composición farmacéutica de anticuerpos.
Las sales ácidas/aniónicas farmacéuticamente aceptables para su uso en la invención incluyen, y no se limitan a, acetato, bencenosulfonato, benzoato, bicarbonato, bitartrato, bromuro, edetato de calcio, camsilato, carbonato, cloruro, citrato, diclorhidrato, edetato, edisilato, estolato, esilato, fumarato, gliceptato, gluconato, glutamato, glicolilarsanilato, hexilresorcinato, hidrabamina, bromhidrato, clorhidrato, hidroxinaftoato, yoduro, isetionato, lactato, lactobionato, malato, maleato, mandelato, mesilato, metilbromuro, metilnitrato, metilsulfato, mucato, napsilato, nitrato, pamoato, pantotenato, fosfato/difosfato, poligalacturonato, salicilato, estearato, subacetato, succinato, sulfato, tanato, tartrato, teoclato, tosilato y trietioduro. Los ácidos orgánicos o inorgánicos también incluyen, pero no se limitan a, ácido yodhídrico, perclórico, sulfúrico, fosfórico, propiónico, glicólico, metanosulfónico, hidroxietanosulfónico, óxalico, 2-naftalenosulfónico, p-toluenosulfónico, ciclohexanosulfámico, sacarínico o trifluoroacético.
Las sales básicas/catiónicas farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, aluminio, 2-amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol (también conocido como tris(hidroximetil)aminometano, trometano o "TRIS"), amoniaco, benzatina, t-butilamina, calcio, cloroprocaína, colina, ciclohexilamina, dietanolamina, etilendiamina, litio, L-lisina, magnesio, meglumina, N-metil-D-glucamina, piperidina, potasio, procaína, quinina, sodio, trietanolamina o zinc.
En algunas realizaciones de la invención, se proporcionan formulaciones farmacéuticas que comprenden los conjugados de la invención en una cantidad de aproximadamente 0,001 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml, de aproximadamente 0,01 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml o de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml. La formulación farmacéutica puede tener un pH de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 10, por ejemplo de aproximadamente 3 a aproximadamente 7, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 9. La formulación puede comprender además por lo menos un ingrediente seleccionado del grupo que consiste de un sistema tampón, conservantes, agentes de tonicidad, agentes quelantes, estabilizantes y surfactantes.
La formulación de ingredientes farmacéuticamente activos con portadores farmacéuticamente aceptables es conocida en la técnica, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (por ejemplo, 21a edición (2005) y cualquier edición posterior). Los ejemplos no limitativos de ingredientes adicionales incluyen: tampones, diluyentes, solventes, agentes reguladores de la tonicidad, conservantes, estabilizantes y agentes quelantes. Pueden usarse uno o más portadores farmacéuticamente aceptables para formular las composiciones farmacéuticas de la invención.
En una realización de la invención, la composición farmacéutica es una formulación líquida. Un ejemplo preferido de una formulación líquida es una formulación acuosa, es decir, una formulación que comprende agua. La formulación líquida puede comprender una solución, una suspensión, una emulsión, una microemulsión, un gel y similares. Una formulación acuosa comprende típicamente por lo menos un 50% p/p de agua, o por lo menos un 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o por lo menos un 95% p/p de agua.
En una realización, la composición farmacéutica puede formularse como un inyectable que puede inyectarse, por ejemplo, mediante un dispositivo de inyección (por ejemplo, una jeringuilla o una bomba de infusión). La inyección puede administrarse por vía subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa, por ejemplo.
En otra realización, la composición farmacéutica es una formulación sólida, por ejemplo, una composición liofilizada o secada por pulverización, que puede usarse tal cual, o cuando el médico o el paciente añaden solventes y/o diluyentes antes de su uso. Las formas de dosificación sólidas pueden incluir comprimidos, como comprimidos y/o comprimidos recubiertos y cápsulas (por ejemplo, cápsulas de gelatina duras o blandas). La composición farmacéutica también puede estar en forma de bolsitas, grageas, polvos, gránulos, comprimidos oblongos o polvos para reconstitución, por ejemplo.
Las formas de dosificación pueden ser de liberación inmediata, en cuyo caso pueden comprender un portador soluble o dispersable en agua, o pueden ser de liberación retardada, liberación sostenida o liberación modificada, en cuyo caso pueden comprender polímeros insolubles en agua que regulan la tasa de disolución de la forma de dosificación en el tracto gastrointestinal.
En otras realizaciones, la composición farmacéutica puede administrarse por vía intranasal, intrabucal o sublingual.
El pH en una formulación acuosa puede estar entre pH 3 y pH 10. En una realización de la invención, el pH de la formulación es de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 9,5. En otra realización de la invención, el pH de la formulación es de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 7,0.
En otra realización de la invención, la composición farmacéutica comprende un tampón. Los ejemplos no limitativos de tampones incluyen: arginina, ácido aspártico, bicina, citrato, hidrogenofosfato disódico, ácido fumárico, glicina, glicilglicina, histidina, lisina, ácido maleico, ácido málico, acetato de sodio, carbonato de sodio, dihidrogenofosfato de sodio, fosfato de sodio, succinato, ácido tartárico, tricina y tris(hidroximetil)-aminometano y mezclas de los mismos. El tampón puede estar presente individualmente o en el agregado, en una concentración de aproximadamente 0,01 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, por ejemplo, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml. Las composiciones farmacéuticas que comprenden cada uno de estos tampones específicos constituyen realizaciones alternativas de la invención.
En otra realización de la invención, la composición farmacéutica comprende un conservante. Los ejemplos no limitativos de tampones incluyen: cloruro de bencetonio, ácido benzoico, alcohol bencílico, bronopol, 4-hidroxibenzoato de butilo, clorobutanol, clorocresol, clorohexidina, clorfenesina, o-cresol, m-cresol, p-cresol, 4-hidroxibenzoato de etilo, imidurea, 4-hidroxibenzoato de metilo, fenol, 2-fenoxietanol, 2-feniletanol, 4-hidroxibenzoato de propilo, deshidroacetato de sodio, tiomerosal y mezclas de los mismos. El conservante puede estar presente individualmente o en el agregado, en una concentración de aproximadamente 0,01 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, por ejemplo, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml. Las composiciones farmacéuticas que comprenden cada uno de estos conservantes específicos constituyen realizaciones alternativas de la invención.
En otra realización de la invención, la composición farmacéutica comprende un agente isotónico. Los ejemplos no limitativos de la realización incluyen una sal (como cloruro de sodio), un aminoácido (como glicina, histidina, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptófano y treonina), un alditol (como glicerol, 1,2-propanodiol propilenglicol), 1,3-propanodiol y 1,3-butanodiol), polietilenglicol (por ejemplo, PEG400) y mezclas de los mismos. Otro ejemplo de un agente isotónico incluye un azúcar. Los ejemplos no limitativos de azúcares pueden ser mono-, di- o polisacáridos, o glucanos solubles en agua que incluyen, por ejemplo, fructosa, glucosa, mañosa, sorbosa, xilosa, maltosa, lactosa, sacarosa, trehalosa, dextrano, pululano, dextrina, ciclodextrina, alfa y beta-HPCD, almidón soluble, almidón de hidroxietilo y carboximetilcelulosa de sodio. Otro ejemplo de un agente isotónico es un alcohol de azúcar, en el que el término "alcohol de azúcar" se define como un hidrocarburo C(4-8) que tiene por lo menos un grupo -OH. Los ejemplos no limitativos de alcoholes de azúcar incluyen manitol, sorbitol, inositol, galactitol, dulcitol, xilitol y arabitol. Las composiciones farmacéuticas que comprenden cada agente isotónico enumerado en este párrafo constituyen realizaciones alternativas de la invención. El agente isotónico puede estar presente individualmente o en el agregado, en una concentración de aproximadamente 0,01 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, por ejemplo de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml. Las composiciones farmacéuticas que comprenden cada uno de estos agentes isotónicos específicos constituyen realizaciones alternativas de la invención.
En otra realización de la invención, la composición farmacéutica comprende un agente quelante. Los ejemplos no limitativos de agentes quelantes incluyen ácido cítrico, ácido aspártico, sales de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y mezclas de los mismos. El agente quelante puede estar presente individualmente o en el agregado, en una concentración de aproximadamente 0,01 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, por ejemplo, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml. Las composiciones farmacéuticas que comprenden cada uno de estos agentes quelantes específicos constituyen realizaciones alternativas de la invención.
En otra realización de la invención, la composición farmacéutica comprende un estabilizante. Los ejemplos no limitativos de estabilizantes incluyen uno o más inhibidores de agregación, uno o más inhibidores de oxidación, uno o más surfactantes y/o uno o más inhibidores de proteasa.
En otra realización de la invención, la composición farmacéutica comprende un estabilizante, en donde dicho estabilizante es carboxi-/hidroxicelulosa y derivados de la misma (como HPC, HPC-SL, HPC-L y HPMC), ciclodextrinas, 2-metiltioetanol, polietilenglicol (como PEG 3350), alcohol polivinílico (PVA), polivinilpirrolidona, sales (como cloruro de sodio), sustancias que contienen azufre como monotioglicerol) o ácido tioglicólico. El estabilizante puede estar presente individualmente o en el agregado, en una concentración de aproximadamente 0,01 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, por ejemplo, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml. Las composiciones farmacéuticas que comprenden cada uno de estos estabilizantes específicos constituyen realizaciones alternativas de la invención.
En realizaciones adicionales de la invención, la composición farmacéutica comprende uno o más surfactantes, preferiblemente un surfactante, por lo menos un surfactante o dos surfactantes diferentes. El término "surfactante" se refiere a cualquier molécula o ion que se componga de una parte soluble en agua (hidrófila) y una parte soluble en grasa (lipófila). El surfactante puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo que consiste de surfactantes aniónicos, surfactantes catiónicos, surfactantes no iónicos y/o surfactantes zwiterónicos. El surfactante puede estar presente individualmente o en el agregado, en una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml. Las composiciones farmacéuticas que comprenden cada uno de estos surfactantes específicos constituyen realizaciones alternativas de la invención.
En una realización adicional de la invención, la composición farmacéutica comprende uno o más inhibidores de proteasas, como, por ejemplo, EDTA y/o ácido clorhídrico (HCl) de benzamidina. El inhibidor de proteasas puede estar presente individualmente o en el agregado, en una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml. Las composiciones farmacéuticas que comprenden cada uno de estos inhibidores de proteasas específicos constituyen realizaciones alternativas de la invención.
La composición farmacéutica de la invención puede comprender una cantidad de una base de aminoácidos suficiente para disminuir la formación de agregados del polipéptido durante el almacenamiento de la composición. El término "base de aminoácidos" se refiere a uno o más aminoácidos (como metionina, histidina, imidazol, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptófano, treonina) o análogos de los mismos. Cualquier aminoácido puede estar presente en su forma de base libre o en su forma de sal. Puede estar presente cualquier estereoisómero (es decir, L, D o una mezcla de los mismos) de la base de aminoácidos. La base de aminoácidos puede estar presente individualmente o en combinación con otras bases de aminoácidos, en una concentración de aproximadamente 0,01 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, por ejemplo de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml. Las composiciones farmacéuticas que comprenden cada uno de estas bases de aminoácidos específicas constituyen realizaciones alternativas de la invención.
También es evidente para un experto en la técnica que la dosis terapéuticamente eficaz para los conjugados de la presente invención o una composición farmacéutica de los mismos variará dependiendo del efecto deseado. Por lo tanto, un experto en la técnica puede determinar fácilmente las dosificaciones óptimas a administrar y variarán con el conjugado particular usado, el modo de administración, la concentración de la preparación y el avance del estado patológico. Además, los factores asociados con el sujeto particular que se está tratando, incluyendo la edad, el peso, la dieta del sujeto y el momento de administración, darán como resultado la necesidad de ajustar la dosis a un nivel terapéutico apropiado.
Para todas las indicaciones, los conjugados de la invención se administran preferiblemente de manera periférica a una dosis de aproximadamente 1 |jg a aproximadamente 5 mg por día en dosis individuales o divididas (por ejemplo, una dosis individual puede dividirse en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o l0 subdosis), o de aproximadamente 0,01 jg/kg a aproximadamente 500 jg/kg por dosis, más preferiblemente de aproximadamente 0,05 jg/kg a aproximadamente 250 jg/kg, lo más preferible por debajo de aproximadamente 50 jg/kg. Las dosificaciones en estos intervalos variarán con la potencia de cada agonista, por supuesto, y un experto en la técnica las determinará fácilmente. Las dosificaciones anteriores son, por tanto, ejemplares del caso medio. Por supuesto, puede haber casos individuales en los que se ameriten intervalos de dosificación más altos o más bajos, y estos están dentro del alcance de esta invención.
En ciertas realizaciones, los conjugados de la invención se administran a una dosis de aproximadamente 1 jg a aproximadamente 5 mg, o a una dosis de aproximadamente 0,01 jg/kg a aproximadamente 500 jg/kg, más preferiblemente a una dosis de aproximadamente 0,05 jg/kg a aproximadamente 250 jg/kg, lo más preferible a una dosis inferior a aproximadamente 50 jg/kg con una dosis de un segundo agente terapéutico (por ejemplo, liraglutida) a una dosis de aproximadamente 1 jg a aproximadamente 5 mg, o a una dosis de aproximadamente 0,01 jg/kg a aproximadamente 500 jg/kg, más preferiblemente a una dosis de aproximadamente 0,05 jg/kg a aproximadamente 250 jg/kg, lo más preferible a una dosis inferior a aproximadamente 50 jg/kg.
Las sales farmacéuticamente aceptables de los conjugados de la invención incluyen las sales no tóxicas convencionales o las sales de amonio cuaternario que se forman a partir de ácidos o bases inorgánicos u orgánicos. Ejemplos de tales sales de adición de ácido incluyen acetato, adipato, benzoato, bencenosulfonato, citrato, canforato, dodecilsulfato, clorhidrato, bromhidrato, lactato, maleato, metanosulfonato, nitrato, oxalato, pivalato, propionato, succinato, sulfato y tartrato. Las sales básicas incluyen sales de amonio, sales de metales alcalinos como sales de sodio y potasio, sales de metales alcalinotérreos como sales de calcio y magnesio, sales con bases orgánicas como sales de diciclohexilamino y sales con aminoácidos como arginina. Además, los grupos que contienen nitrógeno básico pueden cuaternizarse con, por ejemplo, haluros de alquilo.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse por cualquier medio que logre su propósito pretendido. Los ejemplos incluyen la administración por vía parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica, bucal u ocular. La administración puede ser por vía oral. Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los conjugados activos en forma soluble en agua, por ejemplo, sales solubles en agua, soluciones ácidas, soluciones alcalinas, soluciones de dextrosa-agua, soluciones de carbohidratos isotónicas y complejos de inclusión de ciclodextrina.
La presente invención también abarca un método para elaborar una composición farmacéutica que comprende mezclar un portador farmacéuticamente aceptable con cualquiera de los conjugados de la presente invención. Además, la presente invención incluye composiciones farmacéuticas elaboradas mezclando uno o más portadores farmacéuticamente aceptables con cualquiera de los conjugados de la presente invención.
Además, los conjugados de la presente invención pueden tener una o más formas cristalinas polimorfas o amorfas y, como tales, se pretende que estén incluidos en el alcance de la invención. Además, los conjugados pueden formar solvatos, por ejemplo con agua (es decir, hidratos) o solventes orgánicos comunes. Como se usa en la presente, el término "solvato" significa una asociación física de los conjugados de la presente invención con una o más moléculas de solvente. Esta asociación física implica grados variables de enlaces iónicos y covalentes, incluyendo enlaces de hidrógeno. En ciertos casos, el solvato podrá aislarse, por ejemplo, cuando se incorporen una o más moléculas de solvente en la red cristalina del sólido cristalino. Se pretende que el término "solvato" abarque tanto solvatos en fase de solución como solvatos aislables. Los ejemplos no limitativos de solvatos adecuados incluyen etanolatos, metanolatos y similares.
Se pretende que la presente invención incluya dentro de su alcance polimorfos y solvatos de los conjugados de la presente invención. Por tanto, en los métodos de tratamiento, el término "administrar" abarcará los medios para tratar, mejorar o prevenir un síndrome, trastorno o enfermedad descritos en la presente con los conjugados de la presente invención o un polimorfo o solvato de los mismos.
En otra realización, la invención se refiere a los conjugados de la invención para su uso como un medicamento.
En general, los profármacos serán derivados funcionales de los conjugados que pueden convertirse fácilmente in vivo en el conjugado requerido. Por tanto, en los métodos de tratamiento, el término "administrar" abarcará el tratamiento de los varios trastornos descritos con el conjugado divulgado específicamente o con un conjugado que puede no ser divulgado específicamente, pero que se convierte en el conjugado especificado in vivo después de la administración al paciente. Los procedimientos convencionales para la selección y preparación de derivados de profármacos adecuados se describen, por ejemplo, en "Design of Prodrugs", Ed. H. Bundgaard, Elsevier, 1985.
A d e m á s , s e p r e t e n d e q u e d e n t r o d e l a l c a n c e d e la p r e s e n t e i n v e n c i ó n , c u a l q u i e r e l e m e n t o , e n p a r t i c u l a r c u a n d o s e m e n c i o n a e n r e l a c i ó n c o n l o s c o n j u g a d o s d e la i n v e n c i ó n , c o m p r e n d e r á t o d o s l o s i s ó t o p o s y m e z c l a s i s o t ó p i c a s d e d i c h o e l e m e n t o , y a s e a n d e o r i g e n n a t u r a l o s i n t é t i c o , y a s e a c o n a b u n d a n c i a n a t u r a l o e n f o r m a i s o t ó p i c a m e n t e e n r i q u e c i d a . P o r e j e m p l o , u n a r e f e r e n c i a a l h i d r ó g e n o i n c l u y e d e n t r o d e s u a l c a n c e 1 H, 2H ( D ) y 3H ( T ) . D e m a n e r a s i m i l a r , l a s r e f e r e n c i a s a l c a r b o n o y a l o x í g e n o i n c l u y e n d e n t r o d e s u a l c a n c e r e s p e c t i v a m e n t e 12 C , 13C y 14C y 16O y 18O . L o s i s ó t o p o s p u e d e n s e r r a d i a c t i v o s o n o r a d i a c t i v o s . L o s c o n j u g a d o s r a d i o m a r c a d o s d e la i n v e n c i ó n p u e d e n c o m p r e n d e r u n i s ó t o p o r a d i a c t i v o s e l e c c i o n a d o d e l g r u p o d e 3H, 11 C , 18F, 122I, 123I, 125I, 131I, 75Br, 76Br , 77B r y 82Br. P r e f e r i b l e m e n t e , e l i s ó t o p o r a d i a c t i v o s e s e l e c c i o n a d e l g r u p o d e 3H, 11 C y 18F.
A l g u n o s c o n j u g a d o s d e la p r e s e n t e i n v e n c i ó n p u e d e n e x i s t i r c o m o a t r o p i s ó m e r o s . L o s a t r o p i s ó m e r o s s o n e s t e r e o i s ó m e r o s r e s u l t a n t e s d e la r o t a c i ó n i m p e d i d a a l r e d e d o r d e e n l a c e s s i m p l e s d o n d e la b a r r e r a d e d e f o r m a c i ó n e s t é r i c a a la r o t a c i ó n e s lo s u f i c i e n t e m e n t e a l t a c o m o p a r a p e r m i t i r e l a i s l a m i e n t o d e l o s c o n f ó r m e r o s . D e b e e n t e n d e r s e q u e t o d o s e s t o s c o n f ó r m e r o s y m e z c l a s d e l o s m i s m o s e s t á n i n c l u i d o s d e n t r o d e l a l c a n c e d e la p r e s e n t e i n v e n c i ó n .
C u a n d o l o s c o n j u g a d o s d e a c u e r d o c o n e s t a i n v e n c i ó n t i e n e n p o r lo m e n o s u n e s t e r e o c e n t r o , p u e d e n e x i s t i r p o r c o n s i g u i e n t e c o m o e n a n t i ó m e r o s o d i a s t e r e ó m e r o s . D e b e e n t e n d e r s e q u e t o d o s e s t o s i s ó m e r o s y m e z c l a s d e l o s m i s m o s e s t á n i n c l u i d o s d e n t r o d e l a l c a n c e d e la p r e s e n t e i n v e n c i ó n .
C u a n d o l o s p r o c e s o s p a r a la p r e p a r a c i ó n d e l o s c o n j u g a d o s d e a c u e r d o c o n la i n v e n c i ó n d a n l u g a r a m e z c l a s d e e s t e r e o i s ó m e r o s , e s t o s i s ó m e r o s p u e d e n s e p a r a r s e m e d i a n t e t é c n i c a s c o n v e n c i o n a l e s c o m o c r o m a t o g r a f í a p r e p a r a t i v a . L o s c o n j u g a d o s p u e d e n p r e p a r a r s e e n f o r m a r a c é m i c a , o l o s e n a n t i ó m e r o s i n d i v i d u a l e s p u e d e n p r e p a r a r s e o m e d i a n t e s í n t e s i s e n a n t i o e s p e c í f i c a o m e d i a n t e r e s o l u c i ó n . L o s c o n j u g a d o s p u e d e n , p o r e j e m p l o , r e s o l v e r s e e n s u s c o m p o n e n t e s e n a n t i ó m e r o s m e d i a n t e t é c n i c a s e s t á n d a r , c o m o la f o r m a c i ó n d e p a r e j a s d i a s t e r e o m é r i c a s m e d i a n t e la f o r m a c i ó n d e s a l e s c o n u n á c i d o ó p t i c a m e n t e a c t i v o , c o m o e l á c i d o ( - ) - d i - p - t o l u o i l - D -t a r t á r i c o y / o á c i d o ( ) - d i - p - t o l u o i l - L - t a r t á r i c o s e g u i d o d e c r i s t a l i z a c i ó n f r a c c i o n a d a y r e g e n e r a c i ó n d e la b a s e l ib re . L o s c o n j u g a d o s t a m b i é n p u e d e n r e s o l v e r s e m e d i a n t e la f o r m a c i ó n d e é s t e r e s o a m i d a s d i a s t e r e o m é r i c a s , s e g u i d o d e s e p a r a c i ó n c r o m a t o g r á f i c a y e l i m i n a c i ó n d e l a u x i l i a r q u i r a l . A l t e r n a t i v a m e n t e , l o s c o n j u g a d o s p u e d e n r e s o l v e r s e u s a n d o u n a c o l u m n a q u i r a l m e d i a n t e c r o m a t o g r a f í a l í q u i d a d e a l t o r e n d i m i e n t o ( H P L C ) o S F C . E n a l g u n o s c a s o s , p u e d e n e x i s t i r r o t á m e r o s d e c o n j u g a d o s q u e s o n o b s e r v a b l e s p o r 1 H R M N q u e l l e v a n a m u l t i p l e t e s c o m p l e j o s e i n t e g r a c i ó n d e p i c o s e n e l e s p e c t r o d e 1 H R M N .
D u r a n t e c u a l q u i e r a d e l o s p r o c e s o s p a r a la p r e p a r a c i ó n d e l o s c o n j u g a d o s d e la p r e s e n t e i n v e n c i ó n , p u e d e s e r n e c e s a r i o y / o d e s e a b l e p r o t e g e r g r u p o s s e n s i b l e s o r e a c t i v o s e n c u a l q u i e r a d e l a s m o l é c u l a s e n c u e s t i ó n . E s t o p u e d e l o g r a r s e p o r m e d i o d e g r u p o s p r o t e c t o r e s c o n v e n c i o n a l e s , c o m o l o s d e s c r i t o s e n P r o t e c t i v e G r o u p s in O r g a n i c C h e m i s t r y , e d . J . F . W . M c O m i e , P l e n u m P r e s s , 1973 ; y T . W . G r e e n e & P G M W u t s , P r o t e c t i v e G r o u p s in O r g a n i c S y n t h e s i s , J o h n W i l e y & S o n s , 1991. L o s g r u p o s p r o t e c t o r e s p u e d e n e l i m i n a r s e e n u n a e t a p a p o s t e r i o r c o n v e n i e n t e u s a n d o m é t o d o s c o n o c i d o s e n la t é c n i c a .
Métodos de uso
L a p r e s e n t e i n v e n c i ó n e s t á d i r i g i d a a u n m é t o d o p a r a p r e v e n i r , t r a t a r o m e j o r a r u n s í n d r o m e , t r a s t o r n o o e n f e r m e d a d m e d i a d o p o r e l r e c e p t o r Y 2 e n u n s u j e t o c o n n e c e s i d a d d e e l l o , q u e c o m p r e n d e a d m i n i s t r a r a l s u j e t o c o n n e c e s i d a d d e e l l o u n a c a n t i d a d e f i c a z d e u n c o n j u g a d o , c o m p u e s t o o c o m p o s i c i ó n f a r m a c é u t i c a d e la i n v e n c i ó n .
L a p r e s e n t e i n v e n c i ó n t a m b i é n p r o p o r c i o n a u n m é t o d o p a r a p r e v e n i r , t r a t a r , r e t r a s a r la a p a r i c i ó n o m e j o r a r u n t r a s t o r n o , e n f e r m e d a d o a f e c c i ó n o u n o o m á s s í n t o m a s d e d i c h o t r a s t o r n o , e n f e r m e d a d o a f e c c i ó n e n u n s u j e t o c o n n e c e s i d a d d e e l l o , q u e c o m p r e n d e a d m i n i s t r a r a l s u j e t o c o n n e c e s i d a d d e e l l o u n a c a n t i d a d e f i c a z d e un c o n j u g a d o , c o m p u e s t o o c o m p o s i c i ó n f a r m a c é u t i c a d e la i n v e n c i ó n .
D e a c u e r d o c o n r e a l i z a c i o n e s p a r t i c u l a r e s , la e n f e r m e d a d , t r a s t o r n o o a f e c c i ó n s e s e l e c c i o n a d e l g r u p o q u e c o n s i s t e d e o b e s i d a d , d i a b e t e s d e t i p o I o II, s í n d r o m e m e t a b ó l i c o ( e s d e c i r , s í n d r o m e X ) , r e s i s t e n c i a a la i n s u l i n a , t o l e r a n c i a a l t e r a d a a la g l u c o s a ( p o r e j e m p l o , i n t o l e r a n c i a a la g l u c o s a ) , h i p e r g l u c e m i a , h i p e r i n s u l i n e m i a , h i p e r t r i g l i c e r i d e m i a , h i p o g l u c e m i a d e b i d a a h i p e r i n s u l i n i s m o c o n g é n i t o ( C H I ) , d i s l i p i d e m i a , a t e r o s c l e r o s i s , n e f r o p a t í a d i a b é t i c a y o t r o s f a c t o r e s d e r i e s g o c a r d i o v a s c u l a r c o m o h i p e r t e n s i ó n y f a c t o r e s d e r i e s g o c a r d i o v a s c u l a r r e l a c i o n a d o s c o n n i v e l e s d e c o l e s t e r o l y / o l í p i d o s n o c o n t r o l a d o s , o s t e o p o r o s i s , i n f l a m a c i ó n , e n f e r m e d a d d e h í g a d o g r a s o n o a l c o h ó l i c a ( N A F L D ) , e s t e a t o h e p a t i t i s n o a l c o h ó l i c a ( N A S H ) , e n f e r m e d a d r e n a l y / o e c c e m a .
D e a c u e r d o c o n r e a l i z a c i o n e s p a r t i c u l a r e s , u n a c a n t i d a d t e r a p é u t i c a m e n t e e f i c a z s e r e f i e r e a la c a n t i d a d d e t e r a p i a q u e e s s u f i c i e n t e p a r a l o g r a r u n o , d o s , t r e s , c u a t r o o m á s d e l o s s i g u i e n t e s e f e c t o s : (i) r e d u c i r o m e j o r a r la g r a v e d a d d e la e n f e r m e d a d , t r a s t o r n o o c o n d i c i ó n a t r a t a r o u n s í n t o m a a s o c i a d o c o n e l m i s m o ; (ii) r e d u c i r la d u r a c i ó n d e la e n f e r m e d a d , t r a s t o r n o o a f e c c i ó n a t r a t a r , o u n s í n t o m a a s o c i a d o c o n e l m i s m o ; (iii) p r e v e n i r la p r o g r e s i ó n d e la e n f e r m e d a d , t r a s t o r n o o a f e c c i ó n a t r a t a r , o u n s í n t o m a a s o c i a d o c o n e l m i s m o ; ( iv ) p r o v o c a r la r e g r e s i ó n d e la e n f e r m e d a d , t r a s t o r n o o a f e c c i ó n a t r a t a r , o u n s í n t o m a a s o c i a d o c o n e l m i s m o ; ( v ) p r e v e n i r e l desarrollo o la aparición de la enfermedad, trastorno o afección a tratar, o un síntoma asociado con el mismo; (vi) prevenir la reaparición de la enfermedad, trastorno o afección a tratar, o un síntoma asociado con el mismo; (vii) reducir la hospitalización de un sujeto que tiene la enfermedad, trastorno o afección a tratar, o un síntoma asociado con el mismo; (viii) reducir la duración de la hospitalización de un sujeto que tiene la enfermedad, trastorno o afección a tratar, o un síntoma asociado con el mismo; (ix) aumentar la supervivencia de un sujeto con la enfermedad, trastorno o afección a tratar, o un síntoma asociado con el mismo; (xi) inhibir o reducir la enfermedad, trastorno o afección a tratar, o un síntoma asociado con el mismo en un sujeto; y/o (xii) potenciar o mejorar los efectos profilácticos o terapéuticos de otra terapia.
La cantidad o dosificación terapéuticamente eficaz puede variar de acuerdo con varios factores, como la enfermedad, trastorno o afección a tratar, los medios de administración, el sitio objetivo, el estado fisiológico del sujeto (incluyendo, por ejemplo, edad, peso corporal, salud), si el sujeto es un humano o un animal, otros medicamentos administrados y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Las dosificaciones de tratamiento se titulan óptimamente para optimizar la seguridad y la eficacia.
Como se usa en la presente, se pretende que los términos "tratar", "tratando" y "tratamiento" se refieran todos a una mejora o reversión de por lo menos un parámetro físico medible relacionado con la enfermedad, trastorno o afección, que no es necesariamente discernible en el sujeto, pero puede ser discernible en el sujeto. Los términos "tratar", "tratando" y "tratamiento" también pueden referirse a provocar la regresión, prevenir la progresión o por lo menos ralentizar la progresión de la enfermedad, trastorno o afección. En una realización particular, "tratar", "tratando" y "tratamiento" se refieren a un alivio, prevención del desarrollo o aparición, o reducción en la duración de uno o más síntomas asociados con la enfermedad, trastorno o afección. En una realización particular, "tratar", "tratando" y "tratamiento" se refieren a la prevención de la recurrencia de la enfermedad, trastorno o afección, En una realización particular, "tratar", "tratando" y "tratamiento" se refieren a un aumento en la supervivencia de un sujeto que tiene la enfermedad, trastorno o afección. En una realización particular, "tratar", "tratando" y "tratamiento" se refieren a la eliminación de la enfermedad, trastorno o afección en el sujeto.
En una realización, la invención proporciona un método para prevenir, tratar, retrasar la aparición o mejorar la obesidad, o uno o más síntomas de obesidad en un sujeto con necesidad de ello, el método comprendiendo administrar al sujeto con necesidad de ello un cantidad de un conjugado, compuesto o composición farmacéutica de la invención. En algunas realizaciones, el peso corporal de un sujeto se reduce, por ejemplo, entre aproximadamente un 0,01% y aproximadamente un 0,1%, entre aproximadamente un 0,1% y aproximadamente un 0,5%, entre aproximadamente un 0,5% y aproximadamente un 1%, entre aproximadamente un 1% y aproximadamente un 5%, entre aproximadamente un 2% y aproximadamente un 3%, entre aproximadamente un 5% y aproximadamente un 10%, entre aproximadamente un 10% y aproximadamente un 15%, entre aproximadamente un 15% y aproximadamente un 20%, entre aproximadamente un 20% y aproximadamente un 25%, entre aproximadamente un 25% y aproximadamente un 30%, entre aproximadamente un 30% y aproximadamente un 35%, entre aproximadamente un 35% y aproximadamente un 40%, entre aproximadamente un 40% y aproximadamente un 45%, o entre aproximadamente un 45% y aproximadamente un 50%, con respecto al peso corporal de un sujeto antes de la administración de cualquiera de los conjugados, compuestos, composiciones farmacéuticas, formas o medicamentos de la invención descrita en la presente, o en comparación con los sujetos de control que no reciben cualquiera de los conjugados, compuestos, composiciones, formas, medicamentos o combinaciones de la invención descrita en la presente.
En algunas realizaciones, la reducción en el peso corporal se mantiene durante aproximadamente 1 semana, durante aproximadamente 2 semanas, durante aproximadamente 3 semanas, durante aproximadamente 1 mes, durante aproximadamente 2 meses, durante aproximadamente 3 meses, durante aproximadamente 4 meses, durante aproximadamente 5 meses, durante aproximadamente 6 meses, durante aproximadamente 7 meses, durante aproximadamente 8 meses, durante aproximadamente 9 meses, durante aproximadamente 10 meses, durante aproximadamente 11 meses, durante aproximadamente 1 año, durante aproximadamente 1,5 años, durante aproximadamente 2 años, durante aproximadamente 2,5 años, durante aproximadamente 3 años, durante aproximadamente 3,5 años, durante aproximadamente 4 años, durante aproximadamente 4,5 años, durante aproximadamente 5 años, durante aproximadamente 6 años, durante aproximadamente 7 años, durante aproximadamente 8 años, durante aproximadamente 9 años, durante aproximadamente 10 años, durante aproximadamente 15 años, o durante aproximadamente 20 años, por ejemplo.
La presente invención proporciona un método para prevenir, tratar, retrasar la aparición o mejorar un síndrome, trastorno o enfermedad, o uno o más síntomas de dicho síndrome, trastorno o enfermedad en un sujeto con necesidad de ello, en donde dicho síndrome, trastorno o enfermedad se selecciona del grupo que consiste de obesidad, diabetes tipo I o tipo II, síndrome metabólico (es decir, síndrome X), resistencia a la insulina, tolerancia alterada a la glucosa (por ejemplo, intolerancia a la glucosa), hiperglucemia, hiperinsulinemia, hipertrigliceridemia, hipoglucemia debida a hiperinsulinismo congénito (CHI), dislipidemia, aterosclerosis, nefropatía diabética y otros factores de riesgo cardiovascular como hipertensión y factores de riesgo cardiovascular relacionados con niveles no controlados de colesterol y/o lípidos, osteoporosis, inflamación, enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD),esteatohepatitis no alcohólica (NASH), enfermedad renal y eccema, que comprende administrar al sujeto con necesidad de ello una cantidad eficaz de un conjugado, compuesto o composición farmacéutica de la invención.
Como se usa en la presente, síndrome metabólico se refiere a un sujeto que tiene uno o más de los siguientes: azúcar en sangre alta (por ejemplo, azúcar en sangre alta en ayunas), presión arterial alta, niveles anormales de colesterol (por ejemplo, niveles bajos de HDL), niveles anormales de triglicéridos (por ejemplo, triglicéridos altos), cintura grande (es decir, circunferencia de la cintura), aumento de grasa en el área abdominal, resistencia a la insulina, intolerancia a la glucosa, niveles elevados de proteína C reactiva (es decir, un estado proinflamatorio) e inhibidor 1 del activador del plasminógeno en plasma y niveles de fibrinógeno aumentados (es decir, un estado protrombótico).
La presente invención proporciona un método para reducir la ingesta de alimentos en un sujeto con necesidad de ello, el método comprendiendo administrar al sujeto con necesidad de ello una cantidad eficaz de un conjugado, compuesto o composición farmacéutica de la invención. En algunas realizaciones, la ingesta de alimentos de un sujeto se reduce, por ejemplo, entre aproximadamente un 0,01% y aproximadamente un 0,1%, entre aproximadamente un 0,1% y aproximadamente un 0,5%, entre aproximadamente un 0,5% y aproximadamente un 1%, entre aproximadamente un 1% y aproximadamente un 5%, entre aproximadamente un 2% y aproximadamente un 3%, entre aproximadamente un 5% y aproximadamente un 10%, entre aproximadamente un 10% y aproximadamente un 15%, entre aproximadamente un 15% y aproximadamente un 20%, entre aproximadamente un 20% y aproximadamente un 25%, entre aproximadamente un 25% y aproximadamente un 30%, entre aproximadamente un 30% y aproximadamente un 35%, entre aproximadamente un 35% y aproximadamente un 40%, entre aproximadamente un 40% y aproximadamente un 45%, o entre aproximadamente un 45% y aproximadamente un 50%, con respecto a la ingesta de alimentos de un sujeto antes de la administración de cualquiera de los conjugados, compuestos, composiciones, formas, medicamentos o combinaciones de la invención descrita en la presente, o en comparación con los sujetos de control que no reciben cualquiera de los conjugados, compuestos, composiciones, formas, medicamentos o combinaciones de la invención descrita en la presente.
En algunas realizaciones, la reducción en la ingesta de alimentos se mantiene durante aproximadamente 1 semana, durante aproximadamente 2 semanas, durante aproximadamente 3 semanas, durante aproximadamente 1 mes, durante aproximadamente 2 meses, durante aproximadamente 3 meses, durante aproximadamente 4 meses, durante aproximadamente 5 meses, durante aproximadamente 6 meses, durante aproximadamente 7 meses, durante aproximadamente 8 meses, durante aproximadamente 9 meses, durante aproximadamente 10 meses, durante aproximadamente 11 meses, durante aproximadamente 1 año, durante aproximadamente 1,5 años, durante aproximadamente 2 años, durante aproximadamente 2,5 años, durante aproximadamente 3 años, durante aproximadamente 3,5 años, durante aproximadamente 4 años, durante aproximadamente 4,5 años, durante aproximadamente 5 años, durante aproximadamente 6 años, durante aproximadamente 7 años, durante aproximadamente 8 años, durante aproximadamente 9 años, durante aproximadamente 10 años, durante aproximadamente 15 años, o durante aproximadamente 20 años, por ejemplo.
La presente invención proporciona un método para reducir la hemoglobina glucosilada (A1C) en un sujeto con necesidad de ello, el método comprendiendo administrar al sujeto con necesidad de ello una cantidad eficaz de un conjugado, compuesto o composición farmacéutica de la invención. En algunas realizaciones, la A1C de un sujeto se reduce, por ejemplo, entre aproximadamente un 0,001% y aproximadamente un 0,01%, entre aproximadamente un 0,01% y aproximadamente un 0,1%, entre aproximadamente un 0,1% y aproximadamente un 0,2%, entre aproximadamente un 0,2% y aproximadamente un 0,3%, entre aproximadamente un 0,3% y aproximadamente un 0,4%, entre aproximadamente un 0,4% y aproximadamente un 0,5%, entre aproximadamente un 0,5% y aproximadamente un 1%, entre aproximadamente un 1% y aproximadamente un 1,5%, entre aproximadamente un 1,5% y aproximadamente un 2%, entre aproximadamente un 2% y aproximadamente un 2,5%, entre aproximadamente un 2,5% y aproximadamente un 3%, entre aproximadamente un 3% y aproximadamente un 4%, entre aproximadamente un 4% y aproximadamente un 5%, entre aproximadamente un 5% y aproximadamente un 6%, entre aproximadamente un 6% y aproximadamente un 7%, entre aproximadamente un 7% y aproximadamente un 8%, entre aproximadamente un 8% y aproximadamente un 9%, o entre aproximadamente un 9% y aproximadamente un 10%, con respecto a la A1C de un sujeto antes de la administración de cualquiera de los conjugados, compuestos, composiciones, formas, medicamentos o combinaciones de la invención descrita en la presente, o en comparación con los sujetos de control que no reciben cualquiera de los conjugados, compuestos, composiciones, formas, medicamentos o combinaciones de la invención descrita en la presente.
En otras realizaciones, se proporcionan métodos para reducir los niveles de glucosa en sangre en ayunas en un sujeto con necesidad de ello, los métodos comprendiendo administrar al sujeto con necesidad de ello una cantidad eficaz de un conjugado, compuesto o composición farmacéutica de la invención. Los niveles de glucosa en sangre en ayunas pueden reducirse a menos de aproximadamente 140 a aproximadamente 150 mg/dl, menos de aproximadamente 140 a aproximadamente 130 mg/dl, menos de aproximadamente 130 a aproximadamente 120 mg/dl, menos de aproximadamente 120 a aproximadamente 110 mg/dl, menos de aproximadamente 110 a aproximadamente 100 mg/dl, menos de aproximadamente 100 a aproximadamente 90 mg/dl, o menos de aproximadamente 90 a aproximadamente 80 mg/dl, con respecto a los niveles de glucosa en sangre en ayunas de un sujeto antes de la administración de cualquiera de los conjugados, compuestos, composiciones, formas, medicamentos o combinaciones de la invención descrita en la presente, o en comparación con los sujetos de control que no reciben cualquiera de los conjugados, compuestos, composiciones, formas, medicamentos o combinaciones de la invención descrita en la presente.
La presente invención proporciona un método para modular la actividad del receptor Y2 en un sujeto con necesidad de ello, el método comprendiendo administrar al sujeto con necesidad de ello una cantidad eficaz de un conjugado, compuesto o composición farmacéutica de la invención. Como se usa en la presente, "modular" se refiere a aumentar o disminuir la actividad del receptor.
En algunas realizaciones, una cantidad eficaz de un conjugado o compuesto de la invención o una forma, composición o medicamento del mismo se administra a un sujeto con necesidad de ello una vez al día, dos veces al día, tres veces al día, cuatro veces al día, cinco veces al día, seis veces al día, siete veces al día u ocho veces al día. En otras realizaciones, una cantidad eficaz de un conjugado o compuesto de la invención o una forma, composición o medicamento del mismo se administra a un sujeto con necesidad de ello una vez cada dos días, una vez a la semana, dos veces a la semana, tres veces a la semana, cuatro veces a la semana, cinco veces a la semana, seis veces a la semana, dos veces al mes, tres veces al mes o cuatro veces al mes.
Otra realización de la invención comprende un método para prevenir, tratar, retrasar la aparición o mejorar una enfermedad, trastorno o síndrome, o uno o más síntomas de cualquiera de dichas enfermedades, trastornos o síndromes en un sujeto con necesidad de ello, el método comprendiendo administrar al sujeto con necesidad de ello una cantidad eficaz de un conjugado, compuesto o composición farmacéutica de la invención en una terapia de combinación. En ciertas realizaciones, la terapia de combinación es un segundo agente terapéutico. En ciertas realizaciones, la terapia de combinación es una terapia quirúrgica.
Como se usa en la presente, el término "en combinación", en el contexto de la administración de dos o más terapias a un sujeto, se refiere al uso de más de una terapia.
Como se usa en la presente, terapia de combinación se refiere a administrar a un sujeto con necesidad de ello uno o más agentes terapéuticos adicionales, o una o más terapias quirúrgicas, concurrentemente con una cantidad eficaz de un conjugado o compuesto de la invención o una forma, composición o medicamento del mismo. En algunas realizaciones, el uno o más agentes terapéuticos o terapias quirúrgicas adicionales pueden administrarse el mismo día que una cantidad eficaz de un conjugado de la invención, y en otras realizaciones, el uno o más agentes terapéuticos o terapias quirúrgicas adicionales pueden administrarse en la misma semana o el mismo mes que una cantidad eficaz de un conjugado o compuesto de la invención.
En ciertas realizaciones, en donde la enfermedad o trastorno se selecciona del grupo que consiste de obesidad, diabetes tipo II, síndrome metabólico, resistencia alterada a la insulina y dislipidemia, el segundo agente terapéutico puede ser un agente antidiabético. En ciertas realizaciones, el agente antidiabético puede ser un modulador del receptor del péptido 1 similar al glucagón (GLP-1).
La presente invención también contempla prevenir, tratar, retrasar la aparición o mejorar cualquiera de las enfermedades, trastornos, síndromes o síntomas descritos en la presente en un sujeto con necesidad de ello con una terapia de combinación que comprende administrar al sujeto con necesidad de ello una cantidad eficaz de un conjugado, compuesto o composición farmacéutica de la invención, en combinación con uno o más de los siguientes agentes terapéuticos: un inhibidor de la dipeptidil peptidasa-4 (DPP-4) (por ejemplo, sitagliptina, saxagliptina, linagliptina, alogliptina, etc.); un agonista del receptor de GLP-1 (por ejemplo, agonistas del receptor de GLP-1 de acción corta como exenatida y lixisenatida; agonistas del receptor de GLP-1 de acción intermedia como liraglutida; agonistas del receptor de GLP-1 de acción prolongada como exenatida de liberación prolongada, albiglutida, dulaglutida); inhibidores del cotransportador-2 de sodio-glucosa (SGLT-2) (por ejemplo, canaglifozin, dapaglifozin, empaglifozin, etc.); secuestrantes de ácidos biliares (por ejemplo, colesevelam, etc.); agonistas del receptor de dopamina (por ejemplo, bromocriptina de liberación rápida); biguanidas (por ejemplo, metformina, etc.); insulina; oxintomodulina; sulfonilureas (por ejemplo, clorpropamida, glimepirida, glipizida, gliburida, glibenclamida, glibornurida, glisoxepida, gliclopiramida, tolazamida, tolbutamida, acetohexamida, carbutamida, etc.); y tiazolidinedionas (por ejemplo, pioglitazona, rosiglitazona, lobeglitazona, ciglitazona, darglitazona, englitazona, netoglitazona, rivoglitazona, troglitazona, etc.). En algunas realizaciones, la dosis del agente o agentes terapéuticos adicionales se reduce cuando se administra en combinación con un conjugado o compuesto de la invención. En algunas realizaciones, cunado se usa en combinación con un conjugado o compuesto de la invención el agente o agentes terapéuticos adicionales pueden usarse en dosis más bajas que cuando se usa cada uno por sí solo.
En ciertas realizaciones, en las que la enfermedad o trastorno se selecciona del grupo que consiste de obesidad, diabetes tipo I o tipo II, síndrome metabólico (es decir, síndrome X), resistencia a la insulina, tolerancia alterada a la glucosa (por ejemplo, Intolerancia a la glucosa), hiperglucemia, hiperinsulinemia., hipertrigliceridemia, hipoglucemia debida a hiperinsulinismo congénito (CHI), dislipidemia, aterosclerosis, nefropatía diabética y otros factores de riesgo cardiovascular como hipertensión y factores de riesgo cardiovascular relacionados con niveles no controlados de colesterol y/o lípidos, osteoporosis, inflamación, enfermedad de hígado graso no alcohólico (NAFLD), esteatohepatitis no alcohólica (NASH), enfermedad renal y eccema, el segundo agente terapéutico puede ser liraglutida.
La presente invención contempla prevenir, tratar, retrasar la aparición o mejorar cualquiera de las enfermedades, trastornos, síndromes o síntomas descritos en la presente en un sujeto con necesidad de ello, con una terapia de combinación que comprende administrar al sujeto con necesidad de ello una cantidad eficaz de un conjugado, compuesto o composición farmacéutica de la invención en combinación con una terapia quirúrgica. En ciertas realizaciones, la terapia quirúrgica puede ser cirugía bariátrica (por ejemplo, cirugía de bypass gástrico, como cirugía de bypass gástrico Roux-en-Y; gastrectomía de manguito; cirugía de banda gástrica ajustable; derivación biliopancreática con cruce duodenal; balón intragástrico; plicatura gástrica; y combinaciones de los mismos).
En realizaciones en las que uno o más agentes terapéuticos o terapias quirúrgicas adicionales se administran el mismo día que una cantidad eficaz de un conjugado o compuesto de la invención, el conjugado o compuesto de la invención puede administrarse antes, después o simultáneamente con el agente terapéutico o la terapia quirúrgica adicionales. El uso del término "en combinación" no restringe el orden en el que se administran las terapias a un sujeto. Por ejemplo, puede administrarse una primera terapia (por ejemplo, una composición descrita en la presente) antes de (por ejemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 16 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas antes), concomitantemente con o después de (por ejemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 16 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas después) de la administración de una segunda terapia a un sujeto.
EJEMPLOS SÍNTESIS
Los compuestos o conjugados de la presente invención pueden sintetizarse de acuerdo con los métodos sintéticos generales conocidos por los expertos en la técnica. La siguiente descripción de la síntesis es con propósitos ejemplares y de ninguna manera se pretende que sea un límite de la invención.
Los análogos o derivados de PYY cíclico de NTSC (NTSC-PYY) de esta invención pueden sintetizarse mediante una variedad de procedimientos convencionales conocidos para la formación de enlaces peptídicos sucesivos entre aminoácidos, y se llevan a cabo preferentemente mediante síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS), como se describe de manera general por Merrifield (J. Am. Chem. Soc., 1963, 85, 2149-2154), usando un sintetizador de péptidos automatizado, síntesis de banco tradicional o una combinación de ambos enfoques. Los procedimientos convencionales para la síntesis de péptidos implican la condensación entre el grupo amino libre de un residuo de aminoácido, cuyas otras funcionalidades reactivas se han protegido adecuadamente, y el grupo carboxilo libre de otro aminoácido, cuyas funcionalidades reactivas también se han protegido adecuadamente. Ejemplos de agentes de condensación que se utilizan típicamente para la formación de enlaces peptídicos incluyen diisopropilcarbodiimida (DIC) con o sin 1-hidroxibenztriazol (HOBT) o ciano(hidroxiimino)acetato de etilo (Oxyma Pure), hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilaminio (HbTU), hexafluorofosfato de 2-(1H-7-azabenztriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrame, tilaminio (Ha Tu ), hexafluorofosfato de 2-(6-cloro-1H-benztriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilaminio (HCTU), hexafluorofosfato de 1-ciano-2-etoxi-2-oxoetilideneaminooxi-tris-pirrolidino-fosfonio (PyOxim), tetrafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol-1iyl)-1,1,3,3-tetrametilaminio (TBTU), hexafluorofosfato de bromotris-pirrolidino-fosfonio (Py-BroP), y similares.
La metodología de síntesis de péptidos automatizada puede llevarse a cabo a temperatura ambiente (ta), o a temperaturas elevadas, preferiblemente mediante la aplicación de calentamiento por microondas, como se describe por Yu (J. Org. Chem., 1992, 57, 4781-4784) y como lo refinó más recientemente Palasek (J. Pept. Sci., 2007, 13, 143-148).
Los compuestos de la presente invención (amidas C-terminales) pueden prepararse convenientemente usando la metodología de aminoácidos protegidos con N-a-FMOC (9-fluroenilmetiloxicarbonilo), mediante la cual se acopla el extremo terminal carboxi de un aminoácido protegido con N-a-FMOC adecuadamente protegido sobre una resina en fase sólida convencional que usa un agente de acoplamiento adecuado. Las resinas en fase sólida convencionales adecuadas comercialmente disponibles incluyen resina Rink amide MBHA, resina Rink amide AM, resina Tentagel S RAM, resina FMOC-PAL-PEG PS, resina de amida SpheriTide Rink, resina ChemMatrix Rink, resina de amida Sieber, resina TG Sieber y similares. El aminoácido FMOC unido a resina puede desprotegerse mediante exposición a piperidina al 20% en N,N-dimetilformamida (DMF) o 1 -metil-2-pirrolidona (NMP), cuyo tratamiento sirve para eliminar selectivamente el grupo protector FMOC. Luego, se acoplan y desprotegen secuencialmente aminoácidos protegidos con FMOC adicionales, generando de este modo el péptido protegido unido a resina deseado. En ciertos casos, puede ser necesario utilizar un grupo protector ortogonalmente reactivo para otra amina en la secuencia del péptido que resistiría las condiciones de desprotección de FMOC. En tales casos pueden usarse eficazmente grupos protectores como 4-metiltritil (Mtt) o 4-metoxitritil (Mmt), ambos pudiéndose eliminar mediante tratamientos de ácido trifluoroacético (TFA)/diclorometano (DCM) al 1%, o preferiblemente aliloxicarbonilo (aloc; que puede eliminarse mediante tratamiento con Pd(PPh3 )4 (tetraquis(trifenilfosfina)paladio(0))/PhSiH3 (fenilsilano)), 1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex-1-iliden)etilo (Dde; que puede eliminarse mediante tratamiento con 2-3% de hidrazina/DMF) y 1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex-1-iliden)-3-metilbutilo (ivDde; que puede eliminarse mediante tratamiento con 2-3% de hidrazina/DMF).
En las metodologías sintéticas de péptidos convencionales, las cadenas laterales reactivas de los alfaaminoácidos se protegen generalmente a lo largo de la síntesis con grupos protectores adecuados para hacerlas inertes a los protocolos de acoplamiento y desprotección. Aunque en la técnica se conocen múltiples grupos protectores para las cadenas laterales de aminoácidos, en la presente los siguientes grupos protectores son los más preferidos: terc-butilo (t-Bu) para serina, treonina, ácido glutámico, ácido aspártico y tirosina; tritilo (Trt) para asparagina, glutamina, cisteína, homocisteína e histidina; terc-butiloxicarbonilo (Boc) para triptófano y el grupo £-amino de lisina; y 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonilo (Pbf) para arginina. Estos grupos protectores se eliminan mediante un tratamiento con ácido fuerte, como con altas concentraciones de ácido trifluoroacético (TFA).
Una vez completado el SPPS, el péptido protegido de cadena lateral unido a resina se desprotege y se escinde concomitantemente de la resina usando un cóctel de escisión que consiste predominantemente de (TFA) junto con varias combinaciones de captadores de carbocatión, como triisopropilsilano (TIPS), agua, fenol y anisol. El péptido sólido bruto se aísla luego mediante precipitación del filtrado de péptido/cóctel con éter frío. En el caso especial de péptidos protegidos unidos a resina de Sieber, la escisión del péptido protegido de la resina puede efectuarse ventajosamente tras un tratamiento repetido con TFA al 1-2% en dCm sin provocar desprotecciones de la cadena lateral. Una vez aislado, pueden realizarse manipulaciones adicionales del péptido protegido en reacciones en fase de solución. Finalmente, el péptido protegido puede desprotegerse globalmente usando un tratamiento separado con el cóctel de escisión y precipitarse como se ha descrito con anterioridad. El péptido bruto obtenido de este modo se disuelve luego a baja concentración (aproximadamente, <4 mg/ml) en un sistema solvente en gran parte acuoso (ac) que contiene un cosolvente orgánico como acetonitrilo o etanol. Tras elevar el pH de la solución a >5, el péptido experimenta entonces una reacción de ciclación intramolecular para formar el correspondiente análogo bruto de NTSC PYY de la presente invención. Los análogos de NTSC PYY formados de este modo pueden purificarse usando técnicas de purificación generalmente conocidas en la técnica. Un método preferido de purificación de péptidos usado en la presente es la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) en fase inversa. Luego, los péptidos purificados se caracterizan mediante cromatografía líquida/espectrometría de masas (LC/MS).
Se entiende que los siguientes ejemplos y realizaciones descritos en la presente son solo con propósitos ilustrativos y que varias modificaciones o cambios a la luz de los mismos serán sugestivos para los expertos en la técnica y deben incluirse dentro del espíritu y alcance de esta solicitud y el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en la presente se incorporan aquí como referencia en su totalidad para todos los propósitos.
ESQUEMAS GENERALES
Un procedimiento sintético general para la síntesis de péptidos NTSC-PYY de amida C-terminal se describe en la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N° 62/413.613, presentada el 27 de octubre de 2016 y la Solicitud de Patente de Estados Unidos N°_______, titulada “Cyclic peptide tyrosine tyrosine compounds as modulators of neuropeptide receptors”, presentada el mismo día que esta solicitud con el expediente de representante N° PRD3411. El contenido de ambas aplicaciones se incorpora aquí como referencia en su totalidad.
Ejemplo 1: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 1
Figure imgf000046_0001
A. Síntesis de H2 N-Tyr(tBu)-OAll
A una solución enfriada con hielo de Fmoc-Tyr(tBu)-O (69 g, 150,15 mmol) y K2 CO3 (62 g, 445,36 mmol) en DMF (500 ml) se le añadió bromuro de alilo (72 g, 595,16 mmol) y la mezcla resultante se agitó durante 3 h. Luego se añadió hielo/agua (1 l) y la mezcla se extrajo con EtOAc. Los extractos orgánicos combinados se secaron (Na 2 SO 4 ) y se concentraron a presión reducida para proporcionar Fmoc-Tyr(tBu)-OAll como un aceite amarillo. A una solución enfriada con hielo de Fmoc-Tyr(tBu)-OAll (70 g, 140,1 mmol) en DMF (600 ml) se le añadió piperidina (150 ml) gota a gota durante un período de 20 min. Después de 3 h, la solución de la reacción se vertió en agua/hielo (1 l) y se extrajo con EtOAc (2 x 2l). Los extractos orgánicos combinados se secaron (Na 2 SO 4 ) y se concentraron a presión reducida. El residuo obtenido de este modo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice, eluyendo con EtOAc/éter de petróleo (10:1) para proporcionar 34 g de H 2 N-Tyr(tBu)-OAll como un aceite amarillo.
B. Síntesis de F Síntesis de Fmoc-Arg(Pbf)-N(Me)OMe (2)
A una mezcla enfriada con hielo de Fmoc-Arg(Pbf)-OH (1) (64,8 g, 99,88 mmol), clorhidrato de N,O-dimetilhidroxilamina (20 g, 206,2 mmol) y HATU (57 g, 149,91 mmol) en DCM (500 ml) se le añadió DIEA (52 g, 402,2 mmol) gota a gota durante un período de 10 min, y la mezcla resultante se dejó agitar a temperatura ambiente durante la noche. Luego, la reacción se vertió en agua/hielo (1 l) y se extrajo con DCM (1 l). Los extractos orgánicos se secaron (Na 2 SO 4 ) y se concentraron a presión reducida para proporcionar 70 g de Fmoc-Arg(Pbf)-N(Me)OMe (2) crudo como un sólido amarillo, que se usó sin purificación adicional.
C. Síntesis de Fmoc-Arg(Pbf)-CHO (3)
A una solución enfriada (-78° C) de LAH en THF (1M, 107 ml, 0,107 mmol) bajo una atmósfera inerte de nitrógeno, se le añadió a través de una cánula una solución enfriada (-50° C) de Fmoc-Arg(Pbf)-N(Me)OMe (2) (50 g, 72,3 mmol) en THF (100 ml) gota a gota durante un período de 1 h. Después de agitar a -78° C durante 5 h, la mezcla se vertió en una solución de HCl 1N (300 ml) y se añadió HCl 1N adicional según fue necesario para ajustar el pH a 4 y luego se extrajo con EtOAc ( 2 x 2 l). Los extractos orgánicos combinados se secaron (Na 2 SO 4 ) y se concentraron a presión reducida para proporcionar 45 g de Fmoc-Arg(Pbf)-CHO (3) bruto como un sólido amarillo, que se usó sin purificación adicional.
D. Síntesis de Fmoc-ps/-[Arg(Pbf)-Tyr(tBu)]-OAll (4)
A una solución enfriada con hielo de Fmoc-Arg(Pbf)-CHO (3) del paso C (45 g, 71,12 mmol) y H 2 N-Tyr(tBu)-OAll del paso A (32 g, 115,37 mmol) en THF (200 ml), MeoH (200 ml) y HOAc (15 ml) se le añadió cianoborohidruro de sodio (18,0 g, 286,4 mmol) en porciones durante un período de 30 min, y la solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La reacción se inactivó mediante la adición de solución de NaHCO 3 acuosa saturada (500 ml) y la mezcla se extrajo con EtOAc ( 2 x 2 l). Los extractos orgánicos combinados se secaron (Na 2 SO 4 ) y se concentraron a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice eluyendo con EtOAc/éter de petróleo (10:1) para proporcionar 40 g de Fmoc-ps/-[Arg(Pbf)-Tyr(tBu)]-OAll (4) como un sólido amarillo.
E. Síntesis de Fmoc-ps/-[Arg(Pbf)-N(Boc)Tyr(tBu)]-OAll (5)
A una solución de Fmoc-ps/-[Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-OAll] (4) (53 g, 59,28 mmol) en MeCN (240 ml) se le añadió dicarbonato de di-ferc-butilo (20 g, 91,3 mmol) y la solución resultante se agitó a 50° C durante la noche. Después, la mezcla se concentró a presión reducida y el residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice eluyendo con EtOAc/éter de petróleo (1:1) para proporcionar 32 g de Fmoc-ps/-[Arg(Pbf)-N(Boc)Tyr(tBu)]-OAll (5) como un sólido amarillo.
F. Síntesis de Fmoc-ps/-[Arg(Pbf)-N(Boc)Tyr(tBu)]-OH (6)
A una solución enfriada (-30° C) de Fmoc-ps/-[Arg(Pbf)-N(Boc)Tyr(tBu)]-OAll (5) (32 g, 32 mmol) en DCM (600 ml) bajo una atmósfera inerte de nitrógeno se le añadió Pd(PPh a ) 4 (3,0 g, 4,33 mmol), seguido de la adición gota a gota de N-metilanilina (10 g, 93 mmol) durante un período de 30 min. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y luego se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice eluyendo con EtOAc/éter de petróleo (1:1) para proporcionar 26,8 g de Fmoc-ps/-[Arg(Pbf)-N(Boc)Tyr(tBu)]-OH (6) como un sólido amarillento. 1 H NMR (300 MHz, CD 3 OD) 67.75-7.77 (2H, m), 7.59­ 7.60 (2H, m), 7.32-7.33 (4H, m), 7.09-7.11 (2H, m), 6.87-7.00 (2H, m), 4.27-4.50 (3H, m),3.30-3.50 (4H, m), 3.02­ 3.23 (3H, m), 2.75- 2.98 (3H, m), 2.57 (3H, s), 2.48 (3H, s), 2.00 (3H,s), 1.31-1.41 (28H, m). LC/MS (ES, m/z): mass calcd. for C 52 H 67 N 5 O 10 S: 953.46, found: 954.55 [M+H] + .
2. Carga del dipéptido Fmoc-ps/-(R35-N(Boc)-Y36) sobre resina Sieber
En un recipiente de reacción de microondas fritado (suministrado por CEM Corporation), se trató resina NovaSyn TG Sieber (suministrada por Novabiochem) (0,2 mmol) con piperidina al 20% en DMF (10 ml) y se calentó a 50° C durante 2,5 min en un reactor de microondas CEM. Se drenó la reacción y se lavó la resina con DMF y se trató de nuevo con piperidina al 20% en DMF a 50° C durante 5 min en un reactor de microondas CEM. Después de drenar y lavar la resina con DMF, se repitió una vez más el tratamiento de desprotección. Luego, la resina se trató con una solución de Fmoc-ps/'-[Arg(Pbf)-(N-Boc)Tyr(tBu)]-OH obtenida anteriormente (3-5 eq.), HATU (2,75-4,8 eq.) y DIEA (6-10 eq.) en DMF (4 ml) y se mezclaron a ta durante 6 a 24 h. La mezcla se drenó y la resina se lavó extensamente con DMF y luego se tapó mediante tratamiento con Ac 2 O al 20% en DMF (5 ml) en condiciones de microondas a 50° C durante 5 min. La reacción se drenó y la resina se lavó extensamente con DMF y DCM.
3. Síntesis de Fmoc-pA-IKPEAPGEK(Alloc)ASPEELNRYYASLRHYLNL(hC)TRQ(ps/-R35Y36)-Resina Sieber Se realizaron extensiones de aminoácidos sobre la resina Sieber (ps/'-R35, Y36) precargada (0,2 mmol) en un sintetizador de péptidos de microondas CEM Liberty Blue. Los aminoácidos estándar protegidos con a-Fmoc se acoplaron doblemente en un exceso de 3,8 veces con respecto a la carga de resina inicial a 50° C durante 15 min usando HBTU/DIEA como agentes de acoplamiento. Se acopló doblemente Fmoc-Arg(Pbf)-OH usando un protocolo de dos etapas: 25 min a ta seguido de 15 min a 50° C, y se acopló doblemente Fmoc-His(Trt)-OH usando un protocolo de dos etapas: 4 min a ta seguido de 8 min a 50° C.
4. Síntesis de Fmoc-pA-IKPEAPGEK(NH 2 )ASPEELNRYYASLRHYLNL(hC) TRQ(ps/-R35Y36)-Resina Sieber: desprotección Al-loc
La resina resultante anterior se trató con una solución de fenilsilano (25 eq.) en DCM desoxigenado (10 ml). Después de agitar durante ~2 min, se añadió una solución de Pd(PPh 3 ) 4 (0,5 eq.) en DCM (10 ml) y la mezcla de resina se agitó durante 30 min bajo argón. Se drenó la reacción y se lavó la resina con DCM desoxigenado. La desprotección se repitió con reactivos nuevos, después de lo cual se drenó la reacción y la resina se lavó extensamente con DCM y DMF.
5. Síntesis de Fmoc-pA-IKPEAPGEK(NH-dPEGi 2 -NHFmoc)ASPEELNRYY ASL-RHYLNL(hC)TRQ(ps/-R35Y36) -Resina Sieber: acoplamiento de ácidos N-Fmoc dPEGi 2 carboxílicos en 11K
El péptido-resina Sieber desprotegido con Alloc anterior se trató con una solución del ácido N-FmocdPEG12-carboxílico (5 eq), HBTU (4,8 eq.) Y DIEA (10 eq.) en DMF (7 ml) en un reactor de microondas CEM a 50° C durante 15 min, momento en el que la reacción mostró una prueba de Kaiser negativa. La reacción se drenó y la resina se lavó extensamente con DMF y DCM.
6. Síntesis de BrCH 2 COHN-pA-IKPEAPGEK(NH-dPEGi 2 -NHCOCH 2 Br)ASPEEL NRYYASL-RHYLNL(hC)TRQ(psi-R35Y36)- Resina Sieber: bis-bromoacetilación en pA y dPEGi 2
La resina anterior se sometió a desprotección con Fmoc usando piperidina al 20% nueva en DMF a 50° C durante 5 min en un reactor de microondas CEM. La desprotección se repitió dos veces. El péptido-resina desprotegido con Fmoc obtenido de este modo se trató con una solución de anhídrido bromoacético (20 eq.) en DMF (5 ml) en un reactor de microondas CEM a 50° C durante 10 min, momento en el cual la reacción mostró una prueba Kaiser negativa. La reacción se drenó y la resina se lavó extensamente con DMF y DCM y luego se secó.
7. Síntesis de BrCH 2 COHN-pA-IKPEAPGEK(NH-dPEGi 2 -NHCOCH 2 Br)ASPEEL NRYYASL-RHYLNL(hC)TRQ(ps/ -R35Y36)-CONH2: escisión de la resina y desprotección global
La resina seca se trató con una solución de TFA al 1,5% en DCM (10 ml) y se mezcló durante 5 a 10 min, luego se filtró. Este tratamiento se repitió nueve veces adicionales usando un cóctel nuevo para cada tratamiento. Luego, los filtrados combinados se combinaron y se concentraron para proporcionar el péptido protegido bruto como una espuma amarilla. Esta espuma se trató con 20 ml de cóctel de escisión (TFA/fenol/H 2 O/TIPS = 88/5/5/2) a temperatura ambiente durante 2,5 h y luego se concentró bajo una corriente de nitrógeno hasta un volumen de ~2,5 ml., luego se añadió éter frío (40 ml) para precipitar el péptido. La mezcla se centrifugó (5 min; 5000 rpm) y se decantó. Este proceso se repitió 2 veces más para dar el péptido crudo como un polvo blanquecino.
Alternativamente, la resina se trató con un cóctel de escisión sin tratamiento previo con TFA al 1-2% en DCM para proporcionar el péptido completamente desprotegido.
8. Análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: i: procedimiento de ciclación A y purificación
El péptido bruto anterior se disolvió en MeCN/agua al 50% desoxigenado (5-10 mg/ml), se añadió opcionalmente EDTA (1 mM). Luego, se elevó el pH de la solución de la reacción a aproximadamente 8 mediante la adición de solución de NaHCO 3 al 7,5% p/v. La solución resultante se agitó a ta durante de 0,5 a 2,5 h, y luego se acidificó a pH <1 mediante la adición de TFA. Luego, la solución se concentró a presión reducida a ta hasta aproximadamente la mitad del volumen original (~24 ml). La solución resultante se purificó mediante HPLC preparativa de fase inversa. Las purificaciones se realizaron en un sistema de purificación personal Gilson HPLC 2020 usando una columna Varian Pursuit XRs C18 (30 x 250 mm, 100Á, 5 pm). La fase móvil consistía de un gradiente de elución de Tampón A (TFA al 0,1% en agua) y Tampón B (TFA al 0,1% en MeCN) que variaba desde una concentración inicial de B al 20% hasta una concentración final de B al 50% durante 36 min. La detección de UV s e m o n i t o r i z ó a 220 y 254 n m . L a s f r a c c i o n e s q u e c o n t e n í a n e l p r o d u c t o s e a n a l i z a r o n m e d i a n t e H P L C a n a l í t i c a e n u n s i s t e m a d e H P L C A g i l e n t 1100 u s a n d o e l m i s m o t i p o d e c o l u m n a a n t e r i o r ( 4 , 6 x 250 m m , 5 p m ) . L a s f r a c c i o n e s p u r a s s e c o m b i n a r o n y l u e g o s e l i o f i l i z a r o n p a r a d a r e l p r o d u c t o c o m o u n s ó l i d o s i m i l a r a l a l g o d ó n . C M S : 1225.5 ( M 4 H ) / 4 , 1633.4 ( M 3 H ) / 3 y 2450.0 ( M 2 H ) / 2 p a r a e l p i c o d e l p r o d u c t o a 12.27 m i n ( L C : c o l u m n a A t l a n t i s T 3 C 18 , 5 u m , 4 .6 x 25 0 m m , 1, 0 m l/ m in , g r a d i e n t e d e l 15 - 60 % )
Ejemplo 2: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 2
1. Síntesis de H 2 N-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNL(hC) TRQRY-PAL-Resina PEG
L a r e s i n a d e p e p t i d i l o p r o t e g i d a s e s i n t e t i z ó u s a n d o la e s t r a t e g i a F m o c c o m o s e h a d e s c r i t o a n t e r i o r m e n t e e n u n s i n t e t i z a d o r d e p é p t i d o s d e m i c r o o n d a s C E M L i b e r t y B l u e u s a n d o r e s i n a s d e a m i d a R i n k d e b a j a c a r g a , p r e f e r i b l e m e n t e , r e s i n a F m o c - P A L - P E G P S ( c a . , 0 , 16 - 0 , 2 m e q / g , s u m i n i s t r a d a p o r A p p l i e d B i o s y s t e m s ) e n u n a e s c a l a d e 0 , 1 m m o l , c o m o s e m u e s t r a e n e l E s q u e m a 1. S e a c o p l a r o n a m i n o á c i d o s e s t á n d a r p r o t e g i d o s c o n F m o c e n u n e x c e s o d e 5 v e c e s c o n r e s p e c t o a la c a r g a d e r e s i n a u s a n d o D I C / O x y m a c o m o a g e n t e s d e a c o p l a m i e n t o y u n a t e m p e r a t u r a d e r e a c c i ó n d e a p r o x i m a d a m e n t e 90 ° C d u r a n t e 4 m in . F m o c - A r g ( P b f ) - O H s e a c o p l ó d o b l e m e n t e a 90 ° C d u r a n t e 4 m i n c a d a u n o y F m o c - H i s ( T r t ) - O H s e a c o p l ó u s a n d o u n p r o t o c o l o d e d o s e t a p a s : 4 m i n a t a s e g u i d o d e 8 m i n a 50 ° C . S e l l e v a r o n a c a b o d e s p r o t e c c i o n e s d e F m o c i n d i v i d u a l e s u s a n d o p i p e r i d i n a a l 20 % e n D M F ( s o l u c i ó n d e d e s p r o t e c c i ó n ) a 90 ° C d u r a n t e 1, 5 m in .
2. Síntesis de m-BrCH 2 PhCOHN-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNL(hC) TRQRY-PAL-Resina PEG
Figure imgf000049_0001
4. Análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 2: procedimiento de ciclación A y purificación
E l p é p t i d o b r u t o a n t e r i o r s e d i s o l v i ó e n M e C N / a g u a d e s o x i g e n a d o ( M e C N a l 60 % ) a u n a c o n c e n t r a c i ó n d e < 4 m g / m l . L u e g o , s e e l e v ó e l p H d e la s o l u c i ó n d e p é p t i d o a a p r o x . 7 - 9 m e d i a n t e la a d i c i ó n d e N H 4A c a c u o s o ( 200 m M , p H 8 , 4 ) y la s o l u c i ó n r e s u l t a n t e s e a g i t ó a t a h a s t a q u e s e h u b o c o m p l e t a d o la c i c l a c i ó n , s e g ú n L C M S ( t í p i c a m e n t e , 3 - 4 h). L a m e z c l a d e la r e a c c i ó n d e c i c l a c i ó n s e a c i d i f i c ó a p H 1, 5 - 3 m e d i a n t e la a d i c i ó n d e T F A , y la s o l u c i ó n s e c o n c e n t r ó p a r a e l i m i n a r la m a y o r p a r t e d e l c o s o l v e n t e o r g á n i c o h a s t a u n p u n t o e n e l q u e s e p r o d u j o u n l i g e r o e n t u r b i a m i e n t o . S e v o l v i ó a a ñ a d i r u n a c a n t i d a d m í n i m a d e M e C N s e g ú n f u e r a n e c e s a r i o p a r a h a c e r la m e z c l a h o m o g é n e a y la s o l u c i ó n r e s u l t a n t e s e p u r i f i c ó l u e g o d i r e c t a m e n t e m e d i a n t e H P L C p r e p a r a t i v a e n m ú l t i p l e s i n y e c c i o n e s u s a n d o u n a c o l u m n a C 18 V a r i a n P u r s u i t X R s C 18 ( 21 x 250 m m , 100 Á , 5 p m ) . L a f a s e m ó v i l c o n s i s t í a d e e l u c i o n e s e n g r a d i e n t e d e t a m p ó n A ( T F A a l 0 , 1 % e n a g u a ) y T a m p ó n B ( T F A a l 0 , 1 % e n M e C N ) q u e v a r i a b a d e s d e u n a c o n c e n t r a c i ó n in ic ia l d e B a l 20 % h a s t a u n a c o n c e n t r a c i ó n f i n a l d e B a l 40 % d u r a n t e 45 m in . L a d e t e c c i ó n d e U V s e m o n i t o r i z ó a 220 y 254 n m . L a s f r a c c i o n e s q u e c o n t e n í a n e l p r o d u c t o s e a n a l i z a r o n m e d i a n t e H P L C a n a l í t i c a e n u n s i s t e m a d e H P L C A g i l e n t 1100 u s a n d o u n a c o l u m n a a p r o p i a d a . L a s f r a c c i o n e s p u r a s s e c o m b i n a r o n , s e c o n c e n t r a r o n p a r a e l i m i n a r la m a y o r p a r t e d e la f a s e o r g á n i c a y l u e g o s e l i o f i l i z a r o n .
Ejemplo 3: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 3
1. Síntesis de (H 2 N)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNL-(azido-norLeu)-TRQRYPAL-Resina PEG
E l p é p t i d o u n i d o a r e s i n a s e p r e p a r ó a u n a e s c a l a d e 0 , 1 m m o l s e g ú n e l m é t o d o d e s c r i t o e n e l Ejemplo 2, p a s o 1, s u s t i t u y e n d o F m o c - a z i d o n o r L e u - O H e n l u g a r d e F m o c - h C y s ( t r t ) - O H e n la p o s i c i ó n 31.
2. Síntesis de (HCCH(CH 2 ) 2 CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNL-(azido-norLeu)-TRQRYPAL-Resina PEG
Se acopló ácido 4-pentinoico sobre la resina anterior en condiciones de microondas usando un protocolo DIC/HOBT (75° C, 10 min). La reacción se drenó y la resina se lavó extensamente con DMF y DCM.
3. Síntesisde(HCCH(CH 2 ) 2 CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNL-(azido-norLeu)-TRQRYPAL-CONH 2 La resina anterior se trató con 10 ml de cóctel de escisión que consistía de TFA/Dodt/H2 O/TIS (92,5:2,5:2,5:2,5) en condiciones de microondas (38° C, 40 min). Se drenó la reacción y se lavó la resina con TFA (10 ml). El filtrado combinado se concentró luego bajo una corriente de nitrógeno hasta un volumen de ~2,5 ml. Luego se añadió éter frío (40 ml) para precipitar el péptido y la mezcla se centrifugó (5 min; 5000 rpm) y se decantó. Este proceso se repitió 2 veces más para dar el péptido bruto como un polvo blanquecino.
4. Análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 3
Preparar 7 mg de CuSO4 en 2 ml de H2O desoxigenada. Preparar 30 mg de TBTA en 5,4 ml de EtOH y 0,6 ml de MeCN. Premezclar 0,94 ml de solución de CuSO4 y 4,8 ml de solución de TBTA. Preparar 30 mg de ascorbato de Na en 3 ml de H2O desoxigenada.
A una solución del péptido bruto que contenía azido del paso 3 (100 mg) en 20 ml de agua desoxigenada se le añadió la solución de CuSO^TBTA premezclada seguido de 2,4 ml de solución de ascorbato de Na (la solución se volvió inmediatamente lechosa). La mezcla se calentó a 40°C y se agitó durante 1,5 h, momento en el que el análisis LCMS indicó una reacción completa. La mezcla se diluyó hasta ~40 ml con agua (TFA al 0,1%); la mezcla se centrifugó y el sobrenadante se purificó mediante HPLC preparativa de fase inversa. Las purificaciones se realizaron usando una columna Varian Pursuit XRs C18 (21 x 250 mm, 100Á, 5 pm) a 35° C. La fase móvil consistía de una elución en gradiente de Tampón A (TFA al 0,1% en agua) y Tampón B (TFA al 0,1% en MeCN) que variaba desde una concentración inicial de 10% de B hasta una concentración intermedia de 18% de B (21 mpm) y luego a una concentración final del 33% de B (10,5 mpm) durante 35 min. La detección de UV se monitorizó a 220 y 254 nm. Las fracciones que contenían el producto se analizaron mediante HPLC analítica en un sistema de HPLC Agilent 1100 usando el mismo tipo de columna anterior (4,6 x 250 mm, 5 pm). Las fracciones puras se combinaron y luego se liofilizaron para dar el producto como un sólido similar al algodón.
Ejemplo 4: Síntesis del análogo de PYY cíclico
SEQ ID NO: 41. Síntesis de (Dde)K(NH 2 )ASPEELNRYYASLRHYLNL(hC) TRQRY-PAL-Resina PEG
El péptido unido a resina se preparó usando el método descrito en el Ejemplo 2, paso 1.
2. Síntesis de (Dde)K(NH-Glu-(OtBu)NH 2 )ASPEELNRYYASLRHYLNL(hC) TRQRY-PAL-Resina PEG
Se acopló Fmoc-Glu-OtBu (5 eq.) sobre la resina anterior en condiciones de microondas usando métodos de acoplamiento de DIC/Oxyma (90° C, 6 min; dc). La resina se drenó y se lavó con DMF. Luego se llevó a cabo la desprotección de Fmoc usando piperidina al 20% en DMF usando un protocolo de 3 etapas (75° C durante 0,5 min; 75° C durante 3 min; 75° C durante 3 min) con lavados de DMF en cada etapa.
3. Síntesis de (Dde)K(NH-Glu-(OtBu)NH-Pal)ASPEELNRYYASLRHYLNL(hC) TRQRY-PAL-Resina PEG
Se acopló ácido palmítico (5 eq.) sobre la resina anterior en condiciones de microondas usando métodos de acoplamiento de DIC/Oxyma (90°C, 5 min). La resina se drenó y se lavó abundantemente con DMF y DCM.
4. Síntesis de (H 2 N)K(NH-Glu-(OtBu)NH-Pal)ASPEELNRYYASLRHYLNL(hC) TRQRY-PAL-Resina PEG Después de lavar la resina anterior con DMF, se trató con una solución de hidrazina al 2% en DMF (6 ml/0,1 mmol de resina) a ta durante 5 min, luego se drenó y se lavó con DMF. El tratamiento se repitió 5 veces más.
5. Síntesis de (H 2 N)IKPEAPGEK(NH-Glu-(OtBu)NH-Pal)ASPEELNRYYASLRHYLNL(hC) TRQRY-PAL-Resina PEG
Los acoplamientos de aminoácidos restantes se llevaron a cabo usando el método descrito en el Ejemplo 2, paso 1.
6. Análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 4
El resto de la síntesis se llevó a cabo usando los métodos descritos en el Ejemplo 2, pasos 2-4. La purificación del producto se realizó usando una columna Varian Pursuit XRS C18 (21 x 250 mm, 100Á, 5 pm) a ta. La fase móvil consistía de una elución en gradiente de Tampón A (TFA al 0,1% en agua) y Tampón B (TFA al 0,1% en MeCN) que variaba desde el 23% de B hasta una concentración intermedia del 33% de B (21 mpm) durante 5 min, y luego a una concentración final del 48% de B (10,5 mpm) durante 55 min.
Ejemplo 5: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 5
El compuesto del título se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 4 sustituyendo ácido a-tocoferiloxiacético (AcVitE) (8) en lugar de ácido palmítico en el paso 3. La purificación del producto se realizó usando una columna Agilent 300SB C8 (21 x 250 mm, 100Á, 5 |jm) a ta. La fase móvil consistía de una elución en gradiente de Tampón A (TFA al 0,1% en agua) y Tampón B (TFA al 0,1% en MeCN) que variaba desde una concentración inicial del 35% de B hasta una concentración intermedia del 45% de B (21 mpm) durante 5 min, y luego a una concentración final del 60% de B (10,5 mpm) durante 60 min.
Ejemplo 6: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 6
1. Síntesis de (HCCH(CH 2 ) 2 CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNK(Dde)-(azido-norLeu)-TRQRY-PAL-Resina PEG
El péptido unido a resina se preparó como se describe en el Ejemplo 3, paso 1, sustituyendo Fmoc-Lys (Dde)-OH en lugar de Fmoc-Leu-OH en la posición 30 e incorporando el ácido 4-pentinoico (acoplado doble) en este paso en la posición 2, siguiendo a Fmoc-Ile-OH en la posición 3.
2. Síntesis de (HCCH(CH 2 ) 2 CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNK(NH 2 )-(azido-norLeu)- TRQRY-PAL-Resina PEG
La resina anterior se trató con hidrazina al 3% en DMF (8 ml/escala de 0,1 mmol) durante 5 min a ta y luego la mezcla se drenó y se lavó con DMF. Este procedimiento se repitió aproximadamente 5x, después de lo cual la resina se lavó extensamente con DMF y luego con DCM.
3. Síntesis de (HCCH(CH 2 ) 2 CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNK(NH-Y-Glu-AcVitE)-(azido-norLeu)-TRQRY-PAL-Resina PEG
Se acopló Fmoc-Glu-OtBu sobre la resina anterior usando el protocolo de acoplamiento descrito en el Ejemplo 2, paso 1 con un tiempo de acoplamiento de 5 min. La resina se desprotegió mediante tratamiento con piperidina al 20% en DMF usando un protocolo de microondas de 3 etapas (75° C, 0,5 min; 75° C, 3 min; 75° C, 3 min), después de lo cual la resina se lavó extensamente con d Mf y DCM. Luego, se acopló ácido atocoferiloxiacético (AcVitE) (8) a la resina usando el mismo procedimiento usado para acoplar Fmoc-Glu-OtBu.
4. Síntesis de (HCCH(CH 2 ) 2 CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNK(NH-Y-Glu-AcVitE)-(azido-norLeu)-TRQRY-CONH 2
La escisión y precipitación del péptido de la resina anterior se llevó a cabo usando el procedimiento descrito en el Ejemplo 3, paso 3.
5. Análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 6
El compuesto del título se preparó usando el procedimiento descrito en el Ejemplo 3, paso 4. La purificación del producto se realizó en una columna Varian Pursuit XRs C8 (21 x 250 mm, 100Á, 5 jm ) a 35° C. La fase móvil consistía de una elución en gradiente de Tampón A (TFA al 0,1% en agua) y Tampón B (TFA al 0,1% en MeCN) que variaba desde una concentración inicial del 35% de B hasta una concentración intermedia del 48% de B (21 mpm) durante 5 min, y luego a una concentración final * del 63% de B (10,5 mpm) durante 40 min.
Ejemplo 7: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 7
El compuesto del título se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 4 con el residuo de K(NH-Y-Glu-Pal) instalado en la posición 9 en lugar de la posición 11. La purificación del producto se realizó usando una columna Agilent 300SB C8 (21 x 250 mm, 100Á, 5 jm ) a ta. La fase móvil consistía de una elución en gradiente de Tampón A (TFA al 0,1% en agua) y Tampón B (TFA al 0,1% en MeCN) que variaba desde una concentración inicial del 23% de B hasta una concentración intermedia del 43% de B (21 mpm) y luego a una concentración final del 43% de B (10,5 mpm) durante 40 min. Las fracciones que contenían productos impuros se volvieron a purificar en una columna Waters T3 C18 (250 x 19 mm, 100Á, 5 jm ) a ta usando un gradiente desde una concentración inicial del 25% de B hasta una concentración intermedia del 35% de B (21 mpm) y luego a una concentración final del 45% de B (10,5 mpm) durante 80 min.
Ejemplo 8: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 8
El compuesto del título se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 4 con el residuo de K(NH-Y-Glu-Pal) instalado en la posición 30 en lugar de la posición 11. La purificación del producto se realizó usando una columna Agilent 300SB C8 (21 x 250 mm, 100Á, 5 |jm) a 35° C. La fase móvil consistía de una elución en gradiente de Tampón A (TFA al 0,1% en agua) y Tampón B (TFA al 0,1% en MeCN) que variaba desde una concentración inicial del 21% de B hasta una concentración intermedia del 31% de B (21 mpm) y luego a una concentración final del 41% de B (10,5 mpm) durante 40 min. Las fracciones que contenían productos impuros se volvieron a purificar en una columna Waters T3 C18 (250 x 19 mm, 100Á, 5 jm) a ta usando un gradiente desde una concentración inicial del 21% de B a una concentración intermedia del 31% de B (21 mpm) y luego a una concentración final del 40% de B (10,5 mpm) durante 80 min.
Ejemplo 9: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO 9
1. Síntesis de H 2 N-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNL(hC) TRQ (psi-R35Y36)-Resina Sieber
Se realizaron extensiones de aminoácidos sobre (ps/'-R35, Y36)-Resina Sieber precargado del Ejemplo 1, paso 2 (0,1 mmol) como se describe en el Ejemplo 1, paso 3 con la modificación de usar un exceso de 5 veces de aminoácidos protegidos.
2. Síntesis de m-BrCH 2 PhCOHN-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNL(hC) TRQ (psi -R35Y36)-Resina Sieber
Se acopló ácido m-bromometilbenzoico sobre la resina anterior de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 1, paso, con la modificación de que el acoplamiento se llevó a cabo a 50° C en lugar de 75° C.
3. Análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 9
El compuesto del título se preparó a partir de la resina anterior siguiendo los procedimientos descritos en el Ejemplo 1, pasos 7 y 8. La purificación del producto se realizó usando una columna Varian Pursuit XRs C18 (21 x 250 mm, 100Á, 5 jm) a 35° C. La fase móvil consistía de una elución en gradiente de Tampón A (TFA al 0,1% en agua) y Tampón B (TFA al 0,1% en MeCN) que variaba desde una concentración inicial del 10% de B hasta una concentración intermedia del 18% de B (21 mpm) durante 10 min, y luego a una concentración final del 33% de B (10,5 mpm) durante 35 min.
Ejemplo 10: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO 10
El compuesto del título se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 4 sustituyendo Dde-Lys(Fmoc) -OH en lugar de Fmoc-Leu-OH en la posición 30 y ácido a-tocoferiloxiacético (AcVitE) (8) en lugar de ácido palmítico en el paso 3. La purificación del producto se realizó usando una columna Agilent 300SB C8 (21 x 250 mm, 100Á, 5 jm) a ta. La fase móvil consistía de una elución en gradiente de Tampón A (TFA al 0,1% en agua) y Tampón B (TFA al 0,1% en MeCN) que variaba desde una concentración inicial del 30% de B hasta una concentración intermedia del 40% de B (21 mpm) durante 10 min, y luego a una concentración final del 55% de B (21 mpm) durante 35 min. Las fracciones que contenían productos impuros se volvieron a purificar usando un gradiente modificado desde una concentración inicial del 35% de B hasta una concentración intermedia del 43% de B (21 mpm) durante 5 min, y luego hasta una concentración final del 58% de B (10,5 mpm) durante 40 min.
Ejemplo 11: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 11
1. Síntesis de (Alloc)K(NH2)-(hC)-TRQ(psi-R35Y36)-Resina Sieber
La resina anterior se preparó siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 9, paso 1 usando Alloc-Lys(Fmoc)-OH en lugar de Fmoc-Leu-OH en la posición 30.
2. Síntesis de (Alloc)K(NH-Y-Glu-AcVitE)-(hC)-TRQ(psi-R35Y36)-Resina Sieber
Se acoplaron secuencialmente Fmoc-Glu-OtBu y ácido a-tocoferiloxiacético (AcVitE) (8) (5 eq. cada uno) sobre la resina anterior usando acoplamientos mediados por HBTU/DIEA en condiciones de microondas a 50° C durante 15-20 min.
3. Síntesis de H2N-K(NH-Y-Glu-AcVitE)-(hC)-TRQ(psi-R35Y36)-Resina Sieber
El grupo protector aloc se eliminó siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 1, paso 4.
4. Análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 11
El compuesto del título se preparó a partir de la resina anterior siguiendo los procedimientos descritos en el Ejemplo 9, pasos 1-3, con la modificación de que se usó un tampón TRIS/HCl 1M, pH 7,5 en lugar del tampón de NH4 OAC para efectuar la ciclación. La purificación del producto se realizó usando una columna Varían Pursuit XRs C18 (21 x 250 mm, 100Á, 5 |jm) a 35° C. La fase móvil consistía de una elución en gradiente de Tampón A (TFA al 0,1% en agua) y Tampón B (TFA al 0,1% en MeCN) que variaba desde una concentración inicial del l0% de B hasta una concentración intermedia del 18% de B (21 mpm) durante 10 min, y luego a una concentración final del 33% de B (10,5 mpm) durante 35 min.
Ejemplo 12: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 12
El compuesto del título se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 2 sustituyendo Fmoc-N-Me-Arg(pbf)-OH en lugar de Fmoc-Arg(pbf)-OH en la posición 35 en el paso 1 y con la modificación de que se usó un tampón de NaHCO3 1M en lugar de tampón de NH4 OAc a efecto de ciclación. La purificación del producto se realizó usando una columna Varian Pursuit XRs C18 (30 x 250 mm, 100Á, 5 jm ) a ta. La fase móvil consistía de una elución en gradiente de Tampón A (TFA al 0,1% en agua) y Tampón B (TFA al 0,1% en MeCN) en el intervalo del 10-60% de B (30 mpm) durante 36 min.
Ejemplo 13: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 13
El compuesto del título se preparó de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 11, usando ácido palmítico en lugar de ácido a-Tocoferiloxiacético (AcVitE) (8) en el paso 2, y con las modificaciones de que se usó el 60% de EtOH/H2O como solvente en lugar de MeCN/H2 O y se usó NaHCO3 saturado acuoso en lugar del tampón de NH4OAc para efectuar la ciclación. La purificación del producto se realizó usando una columna Waters XBridge C18 OBD (50 x 250 mm, 5 jm ) a ta. La fase móvil consistía de una elución en gradiente de Tampón A (NH4 OH 10 mM en agua, pH ~9) y Tampón B (MeCN) que variaba desde una concentración inicial del 15% de B hasta una concentración intermedia del 20% de B (100 mpm) durante 5 min, y luego a una concentración final del 35% de B (100 mpm) durante 40 min.
Ejemplo 14: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 14
El compuesto del título se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 4 con el residuo Lys(NH-Y-Glu-Pal) instalado en la posición 30 en lugar de la posición 11 y con Fmoc-N-Me-Arg(pbf)-OH en lugar de Fmoc-Arg(pbf)-OH en la posición 35 en el paso 1 y con la modificación de que se usó un tampón de NaHCO3 1M en lugar del tampón de NH4OAc en el paso 6, para efectuar la ciclación. La purificación del producto se realizó usando una columna Varian Pursuit XRs C18 (30 x 250 mm, 100Á, 5 jm ) a ta. La fase móvil consistía de una elución en gradiente de Tampón A (TFA al 0,1% en agua) y Tampón B (TfA al 0,1% en MeCN) en el intervalo del 20-70% B (30 mpm) durante 36 min. Las fracciones impuras se volvieron a purificar en una columna de difenilo Varian Pursuit XRs (30 x 100 mm, 100Á, 5 pm) a ta usando un gradiente del 30-50% de B (30 mpm) durante 25 min.
Ejemplo 15: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 15
El compuesto del título se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 4 con el residuo Lys(NH-Y-Glu-Pal) instalado en la posición 30 en lugar de la posición 11, sustituyendo Fmoc-pAla-OH en lugar del acoplamiento de Fmoc-Ile-OH en la posición 3, y con las modificaciones de que se usó un tampón de NaHCO3 1M en lugar del tampón de NH4 OAc para efectuar la ciclación, y se usó acoplamiento con anhídrido bromoacético en lugar de ácido m-bromometilbenzoico en el paso 6 (paso 2 de Ejemplo 2) usando el siguiente procedimiento: el péptido-resina desprotegido con Fmoc (0,1 mmol) se trató con una solución de anhídrido bromoacético (10 eq.) en DMF (5 ml) en un reactor de microondas a 50° C durante 5-10 min, en cuyo momento se determinó generalmente que la reacción se había completado según una prueba de ninhidrina de Kaiser. En los casos en los que se determinó que el acoplamiento era incompleto, se repitió el acoplamiento con reactivos nuevos. La purificación del producto se realizó usando una columna Varian Pursuit XRs C18 (30 x 250 mm, 100Á, 5 jm ) a ta. La fase móvil consistía de una elución en gradiente de Tampón A (TFA al 0,1% en agua) y Tampón B (TFA al 0,1% en MeCN) en el intervalo del 20-60% de B (30 mpm) durante 36 min. Las fracciones impuras se volvieron a purificar en una columna de difenilo Varian Pursuit XRs (30 x 100 mm, 100Á, 5 pm) a ta usando un gradiente del 30-50% de B (30 mpm) durante 25 min.
Ejemplo 16: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 16
El compuesto del título se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 4 con el residuo de Lys(NH-Y-Glu-Pal) instalado en la posición 30 en lugar de la posición 11, omitiendo el acoplamiento de Fmoc-Ile-OH en la posición 3, y usando ácido p-bromometilbenzoico en lugar de ácido m-bromometilbenzoico en el paso 6 (paso 2 del Ejemplo 2). Además, se usó un tampón de NaHCO3 1 M en lugar del tampón de NH4 OAc, para efectuar la ciclación. La purificación del producto se realizó usando una columna Varian Pursuit XRs C18 (30 x 250 mm, 100Á, 5 jm ) a ta. La fase móvil consistía de una elución en gradiente de Tampón A (TFA al 0,1% en agua) y Tampón B (TFA al 0,1% en MeCN) en el intervalo de 20-70% B (30 mpm) durante 36 min. Las fracciones impuras se volvieron a purificar en una columna de difenilo Varian Pursuit XRs (30 x 100 mm, 100 Á, 5 jm ) a ta usando un g r a d i e n t e d e l 30 - 50 % d e B ( 30 m p m ) d u r a n t e 25 m in .
Ejemplo 17: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 17
Figure imgf000054_0001
Ejemplo 18: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 18
E l c o m p u e s t o d e l t í t u l o s e p r e p a r ó d e a c u e r d o c o n e l p r o c e d i m i e n t o d e s c r i t o e n e l Ejemplo 4 c o n e l r e s i d u o d e L y s ( N H - Y - G l u - P a l ) i n s t a l a d o e n la p o s i c i ó n 30 e n l u g a r d e la p o s i c i ó n 11 y u s a n d o F m o c - G l u ( O t B u ) - O H e n l u g a r d e F m o c - L y s ( B o c ) - O H e n la p o s i c i ó n 4 e n e l p a s o 1. E n e l p a s o 6 s e u s ó t a m p ó n T R I S / H C l (1 M, p H 7 , 5 ) e n l u g a r d e l t a m p ó n d e N H 4 O A c p a r a e f e c t u a r la c i c l a c i ó n . L a p u r i f i c a c i ó n d e l p r o d u c t o s e r e a l i z ó u s a n d o u n a c o l u m n a A g i l e n t P o l a r i s C 18 - A ( 30 x 250 m m , 100 Á , 5 j m ) a t a . L a f a s e m ó v i l c o n s i s t í a d e u n a e l u c i ó n e n g r a d i e n t e d e T a m p ó n A ( T F A al 0 , 1 % e n a g u a ) y T a m p ó n B ( T F A a l 0 , 1 % e n M e C N ) q u e v a r i a b a d e s d e u n a c o n c e n t r a c i ó n in ic ia l d e l 20 % d e B h a s t a u n a c o n c e n t r a c i ó n i n t e r m e d i a d e l 35 % d e B ( 40 m p m ) d u r a n t e 5 m in , y l u e g o a u n a c o n c e n t r a c i ó n f i n a l d e l 4 5 % d e B ( 40 m p m ) d u r a n t e 40 m in .
Ejemplo 19: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 19
E l c o m p u e s t o d e l t í t u l o s e p r e p a r ó d e a c u e r d o c o n e l p r o c e d i m i e n t o d e s c r i t o e n e l Ejemplo 4 c o n e l r e s i d u o d e L y s ( N H - Y - G l u - P a l ) i n s t a l a d o e n la p o s i c i ó n 30 e n l u g a r d e la p o s i c i ó n 11 , F m o c - N - M e - A r g ( p b f ) - O H e n l u g a r d e F m o c - A r g ( p b f ) - O H e n la p o s i c i ó n 35 e n e l p a s o 1 , F m o c - C y s ( t r t ) - O H e n l u g a r d e F m o c - h C y s ( t r t ) - O H , y u s a n d o ác ido p - b r o m o m e t i l b e n z o i c o e n l u g a r d e á c i d o m - b r o m o m e t i l b e n z o i c o e n p a s o 6 ( p a s o 2 d e l Ejemplo 2 ).
S e r e a l i z ó la s i g u i e n t e m o d i f i c a c i ó n e n e l p a s o 6 ( p a s o s 3 y 4 d e l Ejemplo 2 ): E l p é p t i d o b r u t o o b t e n i d o a n t e s d e la c i c l a c i ó n s e p u r i f i c ó u s a n d o u n a c o l u m n a V a r i a n P u r s u i t X R s C 18 ( 30 x 250 m m , 100 Á , 5 j m ) a t a . L a f a s e m ó v i l c o n s i s t í a d e u n a e l u c i ó n e n g r a d i e n t e d e T a m p ó n A ( T F A a l 0 , 1 % e n a g u a ) y T a m p ó n B ( T F A a l 0 , 1 % e n M e C N ) e n e l i n t e r v a l o d e l 20 - 70 % d e B ( 30 m p m ) d u r a n t e 36 m in . L a s f r a c c i o n e s q u e c o n t e n í a n e l p r o d u c t o s e c o m b i n a r o n y s e t r a t a r o n c o n N a H C O 3 s ó l i d o p a r a e l e v a r e l p H a ~ 7 - 8 ; la s o l u c i ó n r e s u l t a n t e s e a g i t ó a t a d u r a n t e 4 h, l u e g o s e a c i d i f i c ó a p H 4 c o n T F A . L a s o l u c i ó n s e c o n c e n t r ó h a s t a u n v o l u m e n d e 5 - 10 m l y s e a ñ a d i ó M e C N p a r a s o l u b i l i z a r c u a l q u i e r p r e c i p i t a d o . L a p u r i f i c a c i ó n d e l p r o d u c t o s e r e a l i z ó c o m o a n t e s , c o n u n g r a d i e n t e d e l 20 - 60 % d e B ( 30 m p m ) d u r a n t e 36 m in .
Ejemplo 20: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 20
E l c o m p u e s t o d e l t í t u l o s e p r e p a r ó d e a c u e r d o c o n e l p r o c e d i m i e n t o d e s c r i t o e n e l Ejemplo 4 c o n e l r e s i d u o d e L y s ( N H - Y - G l u - P a l ) i n s t a l a d o e n la p o s i c i ó n 30 e n l u g a r d e la p o s i c i ó n 11 , F m o c - N - M e - A r g ( p b f ) - O H e n l u g a r d e F m o c - A r g ( p b f ) - O H e n la p o s i c i ó n 35 e n e l p a s o 1 y F m o c - C y s ( t r t ) - O H e n l u g a r d e F m o c - h C y s ( t r t ) - O H . E l p é p t i d o l i n e a l b r u t o s e p u r i f i c ó y c i c l ó d e a c u e r d o c o n la m o d i f i c a c i ó n d e s c r i t a e n e l Ejemplo 19. L a p u r i f i c a c i ó n d e l p r o d u c t o f i n a l s e r e a l i z ó u s a n d o u n g r a d i e n t e d e l 20 - 60 % B ( 30 m p m ) d u r a n t e 36 m in .
Ejemplo 21: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 21
E l c o m p u e s t o d e l t í t u l o s e p r e p a r ó d e a c u e r d o c o n e l p r o c e d i m i e n t o d e s c r i t o e n e l Ejemplo 4 c o n e l r e s i d u o d e L y s ( N H - Y - G l u - P a l ) i n s t a l a d o e n la p o s i c i ó n 30 e n l u g a r d e la p o s i c i ó n 11 , s e u s ó F m o c - A l a - O H e n l u g a r d e F m o c -H i s ( t r t ) - O H e n la p o s i c i ó n 26 y F m o c - A l a - O H u s a d o e n l u g a r d e F m o c - L y s ( B o c ) - O H e n la p o s i c i ó n 4 e n e l p a s o 1. S e u s ó t a m p ó n T R l S / H C l , ( 1 M , p H 7.5 ) e n l u g a r d e l t a m p ó n d e N H 4 O A c e n e l p a s o 6 p a r a e f e c t u a r la c i c l a c i ó n . L a p u r i f i c a c i ó n d e l p r o d u c t o s e r e a l i z ó u s a n d o u n a c o l u m n a A g i l e n t P o l a r i s C 18 - A ( 30 x 250 m m , 100 Á , 5 j m ) a t a . L a f a s e m ó v i l c o n s i s t í a d e u n a e l u c i ó n e n g r a d i e n t e d e T a m p ó n A ( T F A a l 0 , 1 % e n a g u a ) y T a m p ó n B ( T F A a l 0 , 1 % e n M e C N ) q u e v a r i a b a d e s d e u n a c o n c e n t r a c i ó n in ic ia l d e l 20 % d e B h a s t a u n a c o n c e n t r a c i ó n i n t e r m e d i a d e l 35 % d e B ( 40 m p m ) d u r a n t e 5 m in , y l u e g o a u n a c o n c e n t r a c i ó n f i n a l d e l 45 % d e B ( 40 m p m ) d u r a n t e 40 m in .
Ejemplo 22: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 22
E l c o m p u e s t o d e l t í t u l o s e p r e p a r ó d e a c u e r d o c o n e l p r o c e d i m i e n t o d e s c r i t o e n e l Ejemplo 4 c o n e l r e s i d u o d e L y s ( N H - Y - G l u - P a l ) i n s t a l a d o e n la p o s i c i ó n 30 e n l u g a r d e la p o s i c i ó n 11 , s e u s ó F m o c - A l a - O H e n l u g a r d e F m o c -H i s ( t r t ) - O H e n la p o s i c i ó n 26 y s e u s ó F m o c - G l u ( O t B u ) - O H e n l u g a r d e F m o c - L y s ( B o c ) - O H e n la p o s i c i ó n 4 e n e l p a s o 1. S e u s ó t a m p ó n T R I S / H C l , ( 1 M , p H 7.5 ) e n l u g a r d e t a m p ó n d e N H 4 O A c e n e l p a s o 6 p a r a e f e c t u a r la ciclación. La purificación del producto se realizó usando una columna Agilent Polaris C18-A (30 x 250 mm, 100Á, 5 |jm) a ta. La fase móvil consistía de una elución en gradiente de Tampón A (TFA al 0,1% en agua) y Tampón B (TFA al 0,1% en MeCN) que variaba desde una concentración inicial del 20% de B hasta una concentración intermedia del 33% de B (40 mpm) durante 5 min, y luego a una concentración final del 43% de B (40 mpm) durante 40 min.
Ejemplo 23: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 23
El compuesto del título se preparó de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 11, usando ácido octadecanodioico, éster mono-terc-butílico (disponible de AstaTech, Inc.) en lugar de ácido atocoferiloxiacético (AcVitE) (8), un protocolo de acoplamiento que emplea HATU/DIEA a 50° C durante 30 min y NMP como solvente en lugar de d Mf en el paso 2, y acoplando dos unidades de Fmoc-OEG-OH en tándem antes de acoplar Fmoc-Glu-OtBu, en el paso 2. El péptido lineal bruto se purificó y cicló de acuerdo con la modificación descrita en el Ejemplo 19, usando un gradiente del 20-60% B. La purificación del producto final se realizó usando un gradiente del 20-70% de B (30 mpm) durante 36 min.
Ejemplo 24: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 24
El compuesto del título se preparó de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 23, usando ácido 20-(terc-butoxi)-20-oxoicosanoico (disponible de Key Organics, Inc.) en lugar de ácido octadecanodioico, mono-terc-butil éster. El péptido lineal bruto se purificó y cicló de acuerdo con la modificación descrita en el Ejemplo 19, usando un gradiente del 20-60% B. La purificación del producto final se realizó usando un gradiente del 20-60% de B (30 mpm) durante 36 min.
Ejemplo 25: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 25
El compuesto del título se preparó de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 11, usando ácido esteárico en lugar de ácido a-tocoferiloxiacético (AcVitE) (8), un protocolo de acoplamiento que emplea HATU/DIEA a 50° C durante 30 min y NMP como solvente en lugar de DMF en el paso 2. El péptido lineal bruto se purificó y cicló de acuerdo con la modificación descrita en el Ejemplo 19, usando un gradiente del 20-80% de B. La purificación del producto final se realizó usando un gradiente del 20-80% de B (30 mpm) durante 36 min.
Ejemplo 26: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 26
El compuesto del título se preparó de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 11, usando ácido araquídico en lugar de ácido a-tocoferiloxiacético (AcVitE) (8), un protocolo de acoplamiento que emplea HATU/DIEA a 50° C durante 30 min y NMP como solvente en lugar de DMF en el paso 2. El péptido lineal bruto se purificó y cicló de acuerdo con la modificación descrita en el Ejemplo 19, usando un gradiente del 20-90% de B. La purificación del producto final se realizó usando un gradiente del 20-90% de B (30 mpm) durante 36 min.
Ejemplo 27: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 27
El compuesto del título se preparó de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 23, pero omitiendo el acoplamiento de Fmoc-Glu-OtBu después de los acoplamientos en tándem de Fmoc-OEG-OH. El péptido lineal bruto se purificó y cicló de acuerdo con la modificación descrita en el Ejemplo 19, usando un gradiente del 20-60% de B. La purificación del producto final se realizó usando un gradiente del 20-60% de B (30 mpm) durante 36 min.
Ejemplo 28: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 28
El compuesto del título se preparó de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 11, usando ácido palmítico en lugar de ácido a-tocoferiloxiacético (AcVitE) (8), omitiendo el acoplamiento de Fmoc-Ile-OH en la posición 3 y usando ácido p-bromometilbenzoico. en lugar de ácido m-bromometilbenzoico en el paso 4 (Ejemplo 9, paso 2). El péptido lineal bruto se purificó y cicló de acuerdo con la modificación descrita en el Ejemplo 19, usando un gradiente del 20-60% de B. La purificación del producto final se realizó usando un gradiente del 20-60% de B (30 mpm) durante 36 min.
Ejemplo 29: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 29
El compuesto del título se preparó de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 11, usando ácido palmítico en lugar de ácido a-tocoferiloxiacético (AcVitE) (8), sustituyendo Fmoc-pAla-OH en lugar de Fmoc-Ile-OH en la posición 3, y acoplando anhídrido bromoacético en lugar de ácido m-bromometilbenzoico en el paso 4 (Ejemplo 9, paso 2), usando la modificación descrita en el Ejemplo 15. El péptido lineal bruto se purificó y cicló de acuerdo con la modificación descrita en el Ejemplo 19, usando un gradiente del 20-60% de B. La purificación del producto final se realizó usando un gradiente del 20-60% de B (30 mpm) durante 36 min.
Ejemplo 30: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 30
E l c o m p u e s t o d e l t í t u l o s e p r e p a r ó d e a c u e r d o c o n l o s p r o c e d i m i e n t o s d e s c r i t o s e n e l Ejemplo 11, u s a n d o á c i d o p a l m í t i c o e n l u g a r d e á c i d o a - t o c o f e r i l o x i a c é t i c o ( A c V i t E ) ( 8 ), s u s t i t u y e n d o F m o c - A p u - O H e n l u g a r d e F m o c - I l e -O H e n la p o s i c i ó n 3 , y a c o p l a n d o a n h í d r i d o b r o m o a c é t i c o e n l u g a r d e á c i d o m - b r o m o m e t i l b e n z o i c o e n e l p a s o 4 (Ejemplo 9, p a s o 2 ) , u s a n d o la m o d i f i c a c i ó n d e s c r i t a e n e l Ejemplo 15. E l p é p t i d o l i n e a l b r u t o s e p u r i f i c ó y c i c l ó d e a c u e r d o c o n la m o d i f i c a c i ó n d e s c r i t a e n e l Ejemplo 19, u s a n d o u n g r a d i e n t e d e l 20 - 60 % d e B . L a p u r i f i c a c i ó n d e l p r o d u c t o f i n a l s e r e a l i z ó u s a n d o u n g r a d i e n t e d e l 20 - 60 % d e B ( 30 m p m ) d u r a n t e 36 m in .
Ejemplo 31: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 31
E l c o m p u e s t o d e l t í t u l o s e p r e p a r ó d e a c u e r d o c o n l o s p r o c e d i m i e n t o s d e s c r i t o s e n e l Ejemplo 23, u s a n d o á c i d o e s t e á r i c o e n l u g a r d e á c i d o o c t a d e c a n o d i o i c o , é s t e r m o n o - t e r c - b u t í l i c o . E l p é p t i d o l i n e a l b r u t o s e p u r i f i c ó y c i c l ó d e a c u e r d o c o n la m o d i f i c a c i ó n d e s c r i t a e n e l Ejemplo 19, u s a n d o u n g r a d i e n t e d e l 20 - 60 % d e B. L a p u r i f i c a c i ó n d e l p r o d u c t o f i n a l s e r e a l i z ó u s a n d o u n g r a d i e n t e d e l 20 - 60 % d e B ( 30 m p m ) d u r a n t e 36 m in .
Ejemplo 32: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 32
E l c o m p u e s t o d e l t í t u l o s e p r e p a r ó d e a c u e r d o c o n l o s p r o c e d i m i e n t o s d e s c r i t o s e n e l Ejemplo 11, u s a n d o á c i d o p a l m í t i c o e n l u g a r d e á c i d o a - t o c o f e r i l o x i a c é t i c o ( A c V i t E ) ( 8 ) e n e l p a s o 2, u s a n d o F m o c - A l a - O H e n l u g a r d e F m o c - H i s ( t r t ) - O H e n la p o s i c i ó n 26 y u s a n d o F m o c - A l a - O H e n l u g a r d e F m o c - L y s ( B o c ) - O H e n la p o s i c i ó n 4 e n e l p a s o 4 (Ejemplo 9 , p a s o 1 ) . S e u s ó t a m p ó n T R I S / H C l , ( 1 M, p H 7 , 5 ) e n l u g a r d e l t a m p ó n d e N H 4 O A c e n e l p a s o 6 p a r a e f e c t u a r la c i c l a c i ó n . L a p u r i f i c a c i ó n d e l p r o d u c t o s e r e a l i z ó u s a n d o u n a c o l u m n a A g i l e n t P o l a r i s C 18 - A ( 30 x 250 m m , 100 Á , 5 p m ) a t a . L a f a s e m ó v i l c o n s i s t í a d e u n a e l u c i ó n e n g r a d i e n t e d e l T a m p ó n A ( T F A al 0 , 1 % e n a g u a ) y T a m p ó n B ( T F A al 0 , 1 % e n M e C N ) q u e v a r i a b a d e s d e u n a c o n c e n t r a c i ó n in ic ia l d e l 20 % d e B h a s t a u n a c o n c e n t r a c i ó n i n t e r m e d i a d e l 35 % d e B ( 40 m p m ) d u r a n t e 5 m in , y l u e g o a u n a c o n c e n t r a c i ó n f i n a l d e l 45 % d e B ( 40 m p m ) d u r a n t e 40 m in .
Ejemplo 33: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 33
E l c o m p u e s t o d e l t í t u l o s e p r e p a r ó d e a c u e r d o c o n l o s p r o c e d i m i e n t o s d e s c r i t o s e n e l Ejemplo 11, u s a n d o á c i d o p a l m í t i c o e n l u g a r d e á c i d o a - t o c o f e r i l o x i a c é t i c o ( A c V i t E ) ( 8 ) e n e l p a s o 2 y F m o c - N ( M e ) - G l n ( t r t ) - O H e n l u g a r d e F m o c - G l n ( t r t ) - O H e n la p o s i c i ó n 34 e n e l p a s o 4 ( Ejemplo 9 , p a s o 1 ) . E n e s t e c a s o , l o s a c o p l a m i e n t o s s e r e a l i z a r o n a t a u s a n d o N M P c o m o s o l v e n t e y u n p r o t o c o l o d e H A T U / D I E A (1 h, a c o p l a m i e n t o s i m p l e ) ; F m o c - N ( M e ) -G l n ( t r t ) - O H y F m o c - A r g ( p b f ) - O H s e a c o p l a r o n p o r d u p l i c a d o . S e u s ó u n p r o t o c o l o d e d e s p r o t e c c i ó n d e F m o c d e d o s e t a p a s e n t o d o m o m e n t o ( p i p e r i d i n a a l 20 % e n D M F ; ta ; 10 m in , 15 m in ) . E l p é p t i d o l i n e a l b r u t o s e p u r i f i c ó y c i c l ó d e a c u e r d o c o n la m o d i f i c a c i ó n d e s c r i t a e n e l Ejemplo 19, u s a n d o u n g r a d i e n t e d e l 20 - 70 % d e B . L a p u r i f i c a c i ó n d e l p r o d u c t o f i n a l s e r e a l i z ó u s a n d o u n g r a d i e n t e d e l 20 - 70 % d e B ( 30 m p m ) d u r a n t e 36 m in .
Ejemplo 34: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 34
E l c o m p u e s t o d e l t í t u l o s e p r e p a r ó d e a c u e r d o c o n l o s p r o c e d i m i e n t o s d e s c r i t o s e n e l Ejemplo 11, u s a n d o á c i d o p a l m í t i c o e n l u g a r d e á c i d o a - t o c o f e r i l o x i a c é t i c o ( A c V i t E ) ( 8 ), s u s t i t u y e n d o F m o c - C y s ( t r t ) - O H e n l u g a r d e F m o c - h C y s ( t r t ) - O H e n la p o s i c i ó n 31, á c i d o 6 - F m o c - a m i n o h e x a n o i c o e n l u g a r d e F m o c - I l e - O H e n la p o s i c i ó n 3 , y a n h í d r i d o b r o m o a c é t i c o d e a c o p l a m i e n t o e n l u g a r d e á c i d o m - b r o m o m e t i l b e n z o i c o e n e l p a s o 4 ( Ejemplo 9, p a s o 2) , u s a n d o la m o d i f i c a c i ó n d e s c r i t a e n Ejemplo 15. S e u s ó N a H C O 3 a c u o s o ( 2 N ) e n l u g a r d e l t a m p ó n d e N H 4 O A c p a r a e f e c t u a r la c i c l a c i ó n . L a p u r i f i c a c i ó n d e l p r o d u c t o s e r e a l i z ó u s a n d o u n a c o l u m n a V a r i a n P u r s u i t X R s C 18 ( 30 x 250 m m , 100 Á , 5 p m ) a t a . L a f a s e m ó v i l c o n s i s t í a d e u n a e l u c i ó n e n g r a d i e n t e d e l T a m p ó n A ( T F A a l 0 , 1 % e n a g u a ) y T a m p ó n B (t F a a l 0 , 1 % e n M e C N ) e n e l i n t e r v a l o d e l 20 - 70 % d e B ( 30 m p m ) d u r a n t e 36 m in .
Ejemplo 35: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 35
E l c o m p u e s t o d e l t í t u l o s e p r e p a r ó d e a c u e r d o c o n l o s p r o c e d i m i e n t o s d e s c r i t o s e n e l Ejemplo 9, c o n l a s s i g u i e n t e s m o d i f i c a c i o n e s : s e u s ó F m o c - p s / ' -[ N - M e - A r g ( P b f ) - N ( B o c ) T y r ( t B u ) ] - O H , p r e p a r a d o a p a r t i r d e F m o c - N - M e -A r g ( p b f ) - O H e n l u g a r d e F m o c - A r g ( P b f ) - O H , d e a c u e r d o c o n e l p r o c e d i m i e n t o d e s c r i t o e n e l Ejemplo 1, p a s o 1 , e n l u g a r d e F m o c - p s / ' - [ A r g ( P b f ) - N ( B o c ) T y r ( t B u ) ] - O H ( 6 ) p a r a p r e p a r a r la r e s i n a S i e b e r c a r g a d a u s a d a e n la p r e s e n t e ; s e u s ó F m o c - L y s ( P a l - G l u - O t B u ) - O H ( d e A c t i v e P e p t i d e ) e n l u g a r d e L e u e n la p o s i c i ó n 30 ; s e u s ó á c i d o m -c l o r o m e t i l b e n z o i c o e n l u g a r d e á c i d o m - b r o m o m e t i l b e n z o i c o e n e l p a s o 2; l o s a c o p l a m i e n t o s s e l l e v a r o n a c a b o a t a u s a n d o N M P c o m o s o l v e n t e y s e u s ó u n p r o t o c o l o d e H A T U / D I E A (1 h, a c o p l a m i e n t o ú n i c o ) ; s e a c o p l ó p o r d u p l i c a d o F m o c - A r g ( p b f ) - O H . S e u s ó u n p r o t o c o l o d e d e s p r o t e c c i ó n d e F m o c d e d o s e t a p a s e n t o d o m o m e n t o ( p i p e r i d i n a a l 20 % e n d M F ; ta ; 10 m in , 15 m in ) . E l p é p t i d o l i n e a l b r u t o s e p u r i f i c ó y c i c l ó d e a c u e r d o c o n la m o d i f i c a c i ó n d e s c r i t a e n e l Ejemplo 19, u s a n d o u n g r a d i e n t e d e l 2 0 - 70 % d e B. L a p u r i f i c a c i ó n d e l p r o d u c t o f i n a l s e r e a l i z ó u s a n d o u n g r a d i e n t e d e l 20 - 70 % d e B ( 30 m p m ) d u r a n t e 36 m in .
Ejemplo 36: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 36
El compuesto del título se preparó de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 35, sustituyendo Fmoc-pAla-OH en lugar de Fmoc-Ile-OH en la posición 3, y acoplando anhídrido bromoacético en lugar de ácido m -bromometilbenzoico en el paso 4 (Ejemplo 9, paso 2), usando la modificación descrita en el Ejemplo 15.
Se omitió el tratamiento modificado del Ejemplo 19. Se acopló Fmoc-pAla-OH en condiciones de microondas a 50° C durante 20 min. Para efectuar la ciclación se usó NaHCO3 acuoso saturado en lugar del tampón de NH4OAc. La purificación del producto se realizó usando una columna Varian Pursuit XRs C18 (30 x 250 mm, 100Á, 5 pm) a ta. La fase móvil consistía de una elución en gradiente del Tampón A (TFA al 0,1% en agua) y Tampón B (TFA al 0,1% en MeCN) en el intervalo del 20-70% de B (30 mpm) durante 36 min.
Ejemplo 37: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 37
El compuesto del título se preparó de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 9, sustituyendo Fmoc-Cys(trt)-OH en lugar de Fmoc-hCys(trt)-OH en la posición 31 y Fmoc-Lys(Pal-Glu-OtBu)-OH (del péptido activo) en lugar de Fmoc-Leu-OH en la posición 30. Además, se añadió Fmoc-Abu-OH a la secuencia en la posición 2, en el paso 1, y se usó el acoplamiento con anhídrido bromoacético en lugar de ácido m-bromometilbenzoico en el paso 2, usando la modificación descrita en el Ejemplo 15. Para efectuar la ciclación se usó NaHCO3 saturado acuoso en lugar del tampón de NH4OAc en el paso 3. La purificación del producto se realizó usando una columna Varian Pursuit XRs C18 (30 x 250 mm, 100Á, 5 pm) a ta. La fase móvil consistía de una elución en gradiente del Tampón A (TFA al 0,1% en agua) y Tampón B (TfA al 0,1% en MeCN) en el intervalo del 20-70% de B (30 mpm) durante 36 min.
Ejemplo 38: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 38
El compuesto del título se preparó de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 35, con las siguientes modificaciones: se añadió Fmoc-pAla-OH a la secuencia en la posición 2, después del paso 1 usando condiciones de microondas a 50° C durante 20 min, y se usó acoplamiento con anhídrido bromoacético en lugar de ácido m -bromometilbenzoico en el paso 2, usando la modificación descrita en el Ejemplo 15. Se usó NaHCO3 acuoso saturado en lugar del tampón de NH4OAc para efectuar la ciclación. La purificación del producto se realizó usando una columna Varian Pursuit XRs C18 (30 x 250 mm, 100Á, 5 pm) a ta. La fase móvil consistía de una elución en gradiente del Tampón A (TFA al 0,1% en agua) y Tampón B (TfA al 0,1% en MeCN) en el intervalo del 20-80% de B (30 mpm) durante 36 min.
Ejemplo 39: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 39
El compuesto del título se preparó de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 11, usando ácido araquídico en lugar de ácido a-tocoferiloxiacético (AcVitE) (8) en el paso 2. Se usó Fmoc-Ser(tBu)-OH en lugar de Fmoc-Lys(Boc)-OH en la posición 4 en el paso 4 (Ejemplo 9, paso 1) y se usó ácido m -clorometilbenzoico en lugar de ácido m-bromometilbenzoico en el paso 4 (Ejemplo 9, paso 2). Se usó EtOH/H2O al 60% como solvente en lugar de MeCN/H2O y se usó NaHCO3 satura acuoso en lugar del tampón de NH4OAc en el paso 4 para efectuar la ciclación. La purificación del producto se realizó usando una columna Waters XBridge C18 OBD (50 x 250 mm, 5 pm) a ta. La fase móvil consistía de una elución en gradiente del Tampón A (NH4 OH 10 mM en agua, pH ~9) y Tampón B (MeCN) que variaba desde una concentración inicial del 20% de B hasta una concentración intermedia del 25% de B (100 mpm) durante 5 min, y luego a una concentración final del 40% de B (100 mpm) durante 40 min.
Ejemplo 40: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 40
1. Síntesis de (HCCH(CH 2 ) 2 CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNK(Dde)-(azido-norLeu)-TRQ(ps/-R35Y36)-Resina Sieber
Se llevaron a cabo extensiones de aminoácidos sobre (psi-R35, Y36)-resina Sieber precargada del Ejemplo 1, paso 2 (0,1 mmol) a ta usando NMP como solvente, se acoplaron por duplicado un exceso de 5 veces de aminoácidos protegidos y un protocolo HATU/DIEA (1 h, acoplamiento simple); Fmoc-Arg(pbf)-OH y Fmoc-His(trt)-OH. Se usó un protocolo de desprotección de Fmoc de dos etapas en todo momento (piperidina al 20% en DMF; ta; 10 min, 15 min).
2. Síntesis de (HCCH(CH 2 ) 2 CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNK(NH 2 )-(azido-norLeu)-TRQ(psi-R35Y36)-Resina Sieber
La resina anterior se trató con hidrazina al 2% en DMF (12 ml/escala de 0,2 mmol) durante 2 min a ta y luego se drenó la mezcla. Este procedimiento se repitió aproximadamente 4x, después de lo cual la resina se lavó extensamente con DMF y luego con DCM.
3. Síntesis de (HCCH(CH 2 ) 2 CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNK((OEG) 2 -Y-Glu-Pal)-(azido-norLeu)-TRQ(ps/-R35Y36)-Resina Sieber
L a r e s i n a a n t e r i o r s e a c o p l ó c o n á c i d o ( S ) - 10 , 19 - d i o x o - 22 - p a l m i t a m i d o - 3 , 6 , 12 , 15 - t e t r a o x a - 9 , 18 -d i a z a t r i c o s a n o d i o i c o ( 5 e q , ) [ p r e p a r a d o d e a c u e r d o c o n e l p r o c e d i m i e n t o d e s c r i t o p a r a la s í n t e s i s d e l p r o d u c t o i n t e r m e d i o 3, s u s t i t u y e n d o e l á c i d o p a l m í t i c o e n l u g a r d e l á c i d o 18 - t e r c - b u t o x i - 18 - o x o o c t a d e c a n o i c o e n e l p a s o G ] , u s a n d o u n p r o t o c o l o d e H B T U / D I E A a t a d u r a n t e 1, 5 h. L a r e s i n a s e d r e n ó y s e l a v ó e x t e n s a m e n t e c o n D M F y D C M .
4. Síntesis de (HCCH(CH 2 ) 2 CONH)-IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNK((OEG) 2 -Y-Glu-Pal)-(azido-norLeu)-TRQ(ps/-R35Y36)-CONH2
L a r e s i n a s e c a s e t r a t ó c o n u n a s o l u c i ó n d e T F A a l 2 % e n D C M ( 20 m l) y s e m e z c l ó d u r a n t e 20 m in , l u e g o s e filtró. E s t e t r a t a m i e n t o s e r e p i t i ó 2 v e c e s a d i c i o n a l e s u s a n d o u n c ó c t e l f r e s c o p a r a c a d a t r a t a m i e n t o . L u e g o , l o s f i l t r a d o s c o m b i n a d o s s e c o m b i n a r o n y s e c o n c e n t r a r o n p a r a p r o p o r c i o n a r e l p é p t i d o p r o t e g i d o e n b r u t o c o m o u n a e s p u m a a m a r i l l a . E s t a e s p u m a s e t r a t ó c o n 20 m l d e c ó c t e l d e e s c i s i ó n ( T F A / H 2 O / T I P S = 95 / 2 , 5 / 2 , 5 ) a t a d u r a n t e 2 , 5 h y l u e g o s e c o n c e n t r ó b a j o u n a c o r r i e n t e d e n i t r ó g e n o h a s t a u n v o l u m e n d e a p r o x i m a d a m e n t e 2 , 5 ml. L u e g o s e a ñ a d i ó é t e r f r ío ( 40 m l) p a r a p r e c i p i t a r e l p é p t i d o y la m e z c l a s e c e n t r i f u g ó ( 5 m in ; 5000 r p m ) y s e d e c a n t ó . E s t e p r o c e s o s e r e p i t i ó 2 v e c e s m á s p a r a d a r e l p é p t i d o b r u t o c o m o u n p o l v o b l a n q u e c i n o .
A l t e r n a t i v a m e n t e , la r e s i n a s e t r a t ó c o n u n c ó c t e l d e e s c i s i ó n s i n t r a t a m i e n t o p r e v i o c o n T F A a l 1 - 2 % e n D C M , p a r a p r o p o r c i o n a r e l p é p t i d o c o m p l e t a m e n t e d e s p r o t e g i d o d i r e c t a m e n t e . E l p é p t i d o b r u t o s e p u r i f i c ó m e d i a n t e H P L C p r e p a r a t i v a d e f a s e i n v e r s a u s a n d o u n a c o l u m n a V a r i a n P u r s u i t X R s C 18 ( 30 x 250 m m , 100 Á , 5 p m ) . L a f a s e m ó v i l c o n s i s t í a d e u n g r a d i e n t e d e e l u c i ó n d e l T a m p ó n A ( T F A a l 0 , 1 % e n a g u a ) y T a m p ó n B ( T F A a l 0 , 1 % e n M e C N ) e n e l i n t e r v a l o d e l 20 - 70 % d e B d u r a n t e 36 m in . L a d e t e c c i ó n d e U V s e c o n t r o l ó a 220 y 254 n m . L a s f r a c c i o n e s q u e c o n t e n í a n e l p r o d u c t o s e a n a l i z a r o n m e d i a n t e H P L C a n a l í t i c a e n u n s i s t e m a d e H P L C A g i l e n t 1100 u s a n d o e l m i s m o t i p o d e c o l u m n a a n t e r i o r ( 4 , 6 x 250 m m , 5 p m ) . L a s f r a c c i o n e s p u r a s s e c o m b i n a r o n y l u e g o s e l i o f i l i z a r o n p a r a d a r e l p r o d u c t o c o m o u n s ó l i d o s i m i l a r a l a l g o d ó n . L C M S : 1211.8 ( M 4 H ) / 4 , 1615 .4 ( M 3 H ) / 3 a n d 24 22.9 ( M 2 H ) / 2 p a r a e l p i c o d e l p r o d u c t o a 16 , 87 m i n ( L C : c o l u m n a A t l a n t i s T 3 C 18 , 5 p m , 4.6 x 250 m m , 1.0 m L / m i n , g r a d i e n t e d e l 30 - 60 % ) .
5. Análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 40
P r e p a r a r 5 , 1 m g d e C u S O 4 e n 1 m l d e H 2 O . P r e p a r a r 10 , 4 m g d e T B T A e n 3 m l d e E t O H . M e z c l a r p r e v i a m e n t e 400 pl d e s o l u c i ó n d e C u S O 4 y 3 m l d e s o l u c i ó n d e T B T A . P r e p a r a r 13 m g d e a s c o r b a t o d e N a e n 2 m l d e H 2 O .
A u n a s o l u c i ó n d e l p é p t i d o p u r i f i c a d o q u e c o n t e n í a a z i d o d e l P a s o 4 ( 37 m g ) e n 4 m l d e H E P E S ( 0 , 1 M , p H 7 , 4 ) s e le a ñ a d i e r o n 1, 7 m l d e la s o l u c i ó n p r e m e z c l a d a d e C u S O ^ T B T A s e g u i d o d e 1 m l d e s o l u c i ó n d e a s c o r b a t o d e N a . S e a j u s t ó la p r o p o r c i ó n d e E t O H / H 2 O h a s t a q u e la s o l u c i ó n d e r e a c c i ó n s e v o l v i ó t r a n s p a r e n t e . L a m e z c l a s e a g i t ó a t a y s e m o n i t o r i z ó m e d i a n t e H P L C . D e s p u é s d e 30 m in , s e c o m p l e t ó la r e a c c i ó n . L a m e z c l a s e a j u s t ó a p H 4 y s e p u r i f i c ó m e d i a n t e H P L C p r e p a r a t i v a d e f a s e i n v e r s a . L a s p u r i f i c a c i o n e s s e r e a l i z a r o n u s a n d o u n a c o l u m n a V a r i a n P u r s u i t X R s C 18 ( 30 x 250 m m , 100 Á , 5 p m ) . L a f a s e m ó v i l c o n s i s t í a d e u n g r a d i e n t e d e l e l u c i ó n d e T a m p ó n A ( T F A a l 0 , 1 % e n a g u a ) y T a m p ó n B ( T F A a l 0 , 1 % e n M e C N ) e n e l i n t e r v a l o d e l 20 - 60 % d e B d u r a n t e 36 m in . L a d e t e c c i ó n d e U V s e c o n t r o l ó a 220 y 254 n m . L a s f r a c c i o n e s q u e c o n t e n í a n e l p r o d u c t o s e a n a l i z a r o n m e d i a n t e H P L C a n a l í t i c a e n u n s i s t e m a d e H P L C A g i l e n t 1100 u s a n d o e l m i s m o t i p o d e c o l u m n a a n t e r i o r ( 4 , 6 x 250 m m , 5 p m ) . L a s f r a c c i o n e s p u r a s s e c o m b i n a r o n y l u e g o s e l i o f i l i z a r o n p a r a d a r e l p r o d u c t o c o m o u n s ó l i d o s i m i l a r a l a l g o d ó n .
Ejemplo 41: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 41
E l c o m p u e s t o d e l t í t u l o s e p r e p a r ó d e a c u e r d o c o n e l p r o c e d i m i e n t o d e s c r i t o e n e l E j e m p l o 40 , s u s t i t u y e n d o á c i d o L - g l u t á m i c o , N -( 1 - o x o h e x a d e c i l ) - , é s t e r d e 1 -( 1, 1 - d i m e t i l e t i l ) e n l u g a r d e á c i d o ( S ) - 10 , 19 - d i o x o - 22 - p a l m i t a m i d o -3 .6.12. 15 - t e t r a o x a - 9 , 18 - d i a z a t r i c o s a n o d i o i c o , e n e l p a s o 3.
Ejemplo 42: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 42
E l c o m p u e s t o d e l t í t u l o s e p r e p a r ó d e a c u e r d o c o n e l p r o c e d i m i e n t o d e s c r i t o e n e l E j e m p l o 40 , s u s t i t u y e n d o á c i d o ( S ) - 22 -( t e r c - b u t o x i c a r b o n i l ) - 43 , 43 - d i m e t i l - 10 , 19 , 24 , 41 - t e t r a o x o - 3 , 6 , 12 , 15 , 42 - p e n t a o x a - 9 , 18 , 23 -t r i a z a t e t r a t e t r a c o n t a n - 1 - o i c o ( 16 ) ( p r o d u c t o i n t e r m e d i o 2 ) e n l u g a r d e á c i d o ( S ) - 10 , 19 - d i o x o - 22 - p a l m i t a m i d o -3 .6.12. 15 - t e t r a o x a - 9 , 18 - d i a z a t r i c o s a n o d i o i c o , e n e l p a s o 3.
Ejemplo 43 Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 43
1. Síntesis de (Alloc)Lys((OEG)2-Y-Glu-NH2)-(hC)-TRQ(ps/-R35Y36)-Resina Sieber
S e l l e v a r o n a c a b o e x t e n s i o n e s d e a m i n o á c i d o s s o b r e (ps i-R 35 , Y 36 ) - r e s i n a S i e b e r p r e c a r g a d o d e l Ejemplo 1, p a s o 2 ( 0 , 1 m m o l ) a t a u s a n d o N M P c o m o s o l v e n t e , s e a c o p l ó p o r d u p l i c a d o u n e x c e s o d e 5 v e c e s d e aminoácidos protegidos y un protocolo de HATU/DIEA (1 h, acoplamiento simple); Fmoc-Arg(pbf)-OH. Se usó un protocolo de desprotección de Fmoc de dos etapas en todo momento (piperidina al 20% en DMF; ta; 10 min, 15 min).
2. Síntesis de (Alloc)Lys((OEG)2-Y-Glu-PalHhC)-TRQ(ps/-R35Y36)-Resma Sieber
Se acopló ácido palmítico a la resina del paso 1, usando condiciones de microondas empleando HATU/DIEA a 50° C durante 20-30 min y NMP como solvente.
3. Síntesis de (H2N)Lys((OEG)2-Y-Glu-Pal)-(hC)-TRQ(ps/-R35Y36)-Resina Sieber
El grupo protector aloc de la resina anterior se eliminó siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 1, paso 4.
4. Análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 43
El compuesto del título se preparó a partir de la resina anterior siguiendo los procedimientos descritos en el Ejemplo 9, pasos 1-3, usando ácido m-clorometilbenzoico en lugar de ácido m-bromometilbenzoico en el paso 2. El péptido lineal bruto se purificó y cicló de acuerdo con la modificación descrita en el Ejemplo 19, usando un gradiente del 20-60% de B. La purificación del producto final se realizó usando un gradiente del 20-60% de B (30 mpm) durante 36 min.
Ejemplo 44 Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 44
El compuesto del título se preparó de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 43, modificado de tal manera que las unidades en tándem Fmoc-OEG-OH y la unidad Fmoc-Glu-OtBu se incorporaron en el paso 2 en lugar del paso 1. Se usó ácido octadecanodioico, éster mono-terc-butílico (AstaTech, Inc.) en lugar de ácido palmítico en el paso 2 y la secuencia conector-lípido se instaló en la posición 11 en lugar de la posición 30. El péptido lineal bruto se purificó y cicló de acuerdo con la modificación descrita en el Ejemplo 19, usando un gradiente del 20-70% de B. La purificación del producto final se realizó usando un gradiente del 20-70% de B (30 mpm) durante 36 min.
Ejemplo 45 Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 45
El compuesto del título se preparó de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 43, modificado de tal manera que se usó ácido Fmoc-dPEG24-carboxílico en lugar de las unidades en tándem Fmoc-OEG-OH y se incorporaron, junto con el ácido palmítico, en el paso 2. La secuencia conector-lípido se instaló en la posición 11 en lugar de la posición 30. El péptido lineal bruto se purificó y cicló de acuerdo con la modificación descrita en el Ejemplo 19, usando un gradiente del 20-90% de B. La purificación del producto final se realizó usando un gradiente del 20-90% de B (30 mpm) durante 36 min.
Ejemplo 46 Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 46
El compuesto del título se preparó de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 9, usando Fmoc-Lys(Pal-Glu-OtBu)-OH (de Active Peptide) en lugar de Leu en la posición 30. Además, se añadió Fmoc-pAla-OH en la secuencia en la posición 2, después del paso 1 usando condiciones de microondas a 50° C durante 20 min, y se usó el acoplamiento con anhídrido bromoacético en lugar de ácido m-bromometilbenzoico en el paso 2, usando la modificación descrita en el Ejemplo 15. El péptido lineal bruto sólido se purificó y cicló de acuerdo con la modificación descrita en el Ejemplo 19, usando un gradiente del 20-70% de B. La purificación del producto final se realizó usando un gradiente del 20-70% de B (30 mpm) durante 36 min.
Ejemplo 47 Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 47
El compuesto del título se preparó de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 44, instalando la secuencia conector-lípido en la posición 7 en lugar de la posición 11. La purificación del producto se realizó usando una columna Varian Pursuit XRs C18 (30 x 250 mm, 100Á, 5 pm) a ta. El péptido lineal bruto se purificó y cicló de acuerdo con la modificación descrita en el Ejemplo 19, usando un gradiente del 20-60% de B. La purificación del producto final se realizó usando un gradiente del 20-60% de B (30 mpm) durante 36 min.
Ejemplo 48 Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 48
El compuesto del título se preparó de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 43, usando ácido octadecanodioico, éster mono-terc-butílico (AstaTech, Inc.) en lugar de ácido palmítico en el paso 2 con un tiempo de acoplamiento de 30 min, e instalando la secuencia conector-lípido en la posición 22 en lugar de la posición 30. El péptido lineal bruto se purificó y cicló de acuerdo con la modificación descrita en el Ejemplo 19, usando un gradiente del 20-70% de B. La purificación del producto final se realizó usando un gradiente del 20-70% de B (30 mpm) durante 36 min.
Ejemplo 49 Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 49
El compuesto del título se preparó siguiendo los procedimientos descritos en el Ejemplo 11, sustituyendo ácido 16-tetrahidropiran-2-iloxipalmítico en lugar de ácido a-tocoferiloxiacético (AcVitE) (8) en el paso 2, y usando ácido m-clorometilbenzoico en lugar de ácido m-bromometilbenzoico en el paso 4 (Ejemplo 9, paso 2). Se usó EtOH/H2O al 60% como solvente en lugar de MeCN/H2O y se usó NaHCO3 acuoso saturado en lugar del tampón de NH4 OAc en el paso 4 para efectuar la ciclación. La purificación del producto se realizó usando una columna Waters XBridge C18 OBD (50 x 250 mm, 5 pm) a ta. La fase móvil consistía de una elución en gradiente del Tampón A (NH4 OH 10 mM en agua, pH ~9) y Tampón B (MeCN) que variaba desde una concentración inicial de 20% del B hasta una concentración intermedia del 10% de B (100 mpm) durante 5 min, y luego a una concentración final del 30% de B (100 mpm) durante 40 min.
Ejemplo 50 Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 50
El compuesto del título se preparó de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 48, e instalando la secuencia conector-lípido en la posición 23 en lugar de la posición 30.
Ejemplo 51 Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 51
El compuesto del título se preparó de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 9, usando Fmoc-Lys(Pal-Glu-OtBu)-OH (de Active Peptide) en lugar de Fmoc-Leu-OH en la posición 30 y Fmoc-Ser(tBu)-OH en lugar de Fmoc-Lys(Boc)-OH en la posición 4, en el paso 1. Se usó EtOH/H2O al 60% como solvente en lugar de MeCN/H2O y se usó NaHCO3 acuoso saturado en lugar del tampón de NH4OAc en el paso 4 para efectuar la ciclación. La purificación del producto se realizó usando una columna Waters XBridge C18 OBD (50 x 250 mm, 5 pm) a ta. La fase móvil consistía de una elución en gradiente del Tampón A (NH4 OH 10 mM en agua, pH ~9) y Tampón B (MeCN) que variaba desde una concentración inicial del 10% de B hasta una concentración intermedia del 20% de B (100 mpm) durante 5 min, y luego hasta una concentración final del 30% de B (100 mpm) durante 40 min. Las fracciones impuras se volvieron a cromatografiar usando un gradiente compuesto por una concentración inicial del 10% de B hasta una concentración intermedia del 20% de B (100 mpm) durante 5 min, y luego hasta una concentración final del 30% de B (100 mpm) durante 60 min.
Ejemplo 52 Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 52
El compuesto del título se preparó de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 43, usando ácido Fmoc-dPEG12-carboxílico en lugar de las unidades en tándem de Fmoc-OEG-OH e incorporándolo junto con Fmoc-Glu-OtBu y ácido palmítico en el paso 2. La secuencia conector-lípido se instaló en la posición 11 en lugar de la posición 30. El péptido lineal bruto se purificó y cicló de acuerdo con la modificación descrita en el Ejemplo 19, usando un gradiente del 20-70% de B. La purificación del producto final se realizó usando un gradiente del 20-70% de B (30 mpm) durante 36 min.
Ejemplo 53 Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 53
El compuesto del título se preparó de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 52, usando cuatro unidades de Fmoc-OEG-OH en tándem en lugar de ácido Fmoc-dPEG12-carboxílico.
Ejemplo 54 Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 54
El compuesto del título se preparó de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 53, instalando dos unidades de Fmoc-OEG-OH en tándem en lugar de dos.
Ejemplo 55 Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 55
El compuesto del título se preparó de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 43, instalando la secuencia conector-lípido en la posición 23 en lugar de la posición 30. El péptido lineal bruto se purificó y cicló de acuerdo con la modificación descrita en el Ejemplo 19, usando un gradiente del 20-70% de B. La purificación del producto final se realizó usando un gradiente del 20-70% de B (30 mpm) durante 36 min.
Ejemplo 56: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 56
El compuesto del título se preparó usando los métodos descritos en el Ejemplo 11, sustituyendo ácido (4'-clorobifenil-4-il)-acético en lugar de ácido a-tocoferiloxiacético (AcVitE) (8) en el paso 2, y usando ácido mclorometilbenzoico en lugar de ácido m-bromometilbenzoico en el paso 4 (Ejemplo 9, paso 2). Se usó EtOH/H2O al 60% como solvente en lugar de MeCN/H2O y se usó NaHCO3 acuoso saturado en lugar del tampón de NH4OAC en el paso 4 para efectuar la ciclación. La purificación del producto se realizó usando una columna Waters XBridge C18 o Bd (50 x 250 mm, 5 |jm) a ta. La fase móvil consistía de una elución en gradiente del Tampón A (NH 10 mM4 OH en agua, pH 9) y Tampón B (MeCN) en un intervalo del 10-28% de B (100 mpm) durante 40 min.
Ejemplo 57: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 57
El compuesto del título se preparó siguiendo los procedimientos descritos en el Ejemplo 11, sustituyendo ácido 3-[(2,4-diclorofenoxi)fen-4-il]propiónico en lugar de ácido a-tocoferiloxiacético (AcVitE) (8) en el paso 2, y usando ácido m-clorometilbenzoico en lugar de ácido m-bromometilbenzoico en el paso 4 (Ejemplo 9, paso 2).Se usó EtOH/H2 O al 60% como solvente en lugar de MeCN/H2 O y se usó NaHCO3 acuoso saturado en lugar del tampón de NH4 OAc en el paso 4 para efectuar la ciclación. La purificación del producto se realizó usando una columna Waters XBridge Cl8 OBD (50 x 250 mm, 5 jm ) a ta. La fase móvil consistía de una elución en gradiente del Tampón A (NH4OH 10 mM en agua, pH 9) y Tampón B (MeCN) en un intervalo del 10-30% de B (80 mpm) durante 40 min. Las fracciones que contenían el producto se combinaron, se acidificaron con TFA, se concentraron y se volvieron a cromatografiar en una columna Agilent Polaris C18-A (30 x 250 mm, 100 A, 5 jm ) a ta. La fase móvil consistía de una elución en gradiente del Tampón A (TFA al 0,1% en agua) y Tampón B (TFA al 0,1% en MeCN) que variaba desde una concentración inicial del 20% de B a una concentración intermedia del 15% de B (40 mpm) a una concentración final del 45% de B (40 mpm) durante 45 min.
Ejemplo 58: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 58
El compuesto del título se preparó siguiendo los procedimientos descritos en el Ejemplo 11, sustituyendo ácido 11-(4-fluorofenil}undecanoico en lugar de ácido a-tocoferiloxiacético (AcVitE) (8) en el paso 2, y usando ácido m-clorometilbenzoico en lugar de ácido m-bromometilbenzoico en el paso 4 (Ejemplo 9, paso 2). Se usó EtOH/H2O al 60% como solvente en lugar de MeCN/H2O y se usó NaHCO3 acuoso saturado en lugar del tampón de NH4OAc en el paso 4 para efectuar la ciclación. La purificación del producto se realizó usando una columna Waters XBridge C18 OBD (50 x 250 mm, 5 jm ) a ta. La fase móvil consistía de una elución en gradiente del Tampón A (NH4 OH 10 mM en agua, pH 9) y Tampón B (MeCN) en el intervalo del 15-35% de B (100 mpm) durante 40 min.
Ejemplo 59: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 59
El compuesto del título se preparó de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 43, omitiendo el paso 2 e incorporando el acoplamiento de ácido palmítico en el paso 1. La secuencia conector-lípido se instaló en la posición 22 en lugar de la posición 11. El péptido lineal bruto se purificó y cicló de acuerdo con la modificación descrita en el Ejemplo 19, usando un gradiente del 20-70% de B. La purificación del producto final se realizó usando un gradiente del 20-70% de B (30 mpm) durante 36 min.
Ejemplo 60: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 60
El compuesto del título se preparó de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 53, incorporando dos unidades de FMOC-OEG-OH en tándem en lugar de cuatro y la instalación de la secuencia conector-lípido estaba en la posición 7 en lugar de en la posición 11. El péptido lineal bruto se purificó y cicló de acuerdo con la modificación descrita en el Ejemplo 19, usando un gradiente del 20-80% de B. La purificación del producto final se realizó usando un gradiente del 20-80% de B (30 mpm) durante 36 min.
Ejemplo 61: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 61
El compuesto del título se preparó siguiendo los procedimientos descritos en el Ejemplo 11, sustituyendo ácido 11-[(4-trifluorometil)fenil]undecanoico en lugar de ácido a-tocoferiloxiacético (AcVitE) (8) en el paso 2, y usando ácido m-clorometilbenzoico en lugar de ácido m-bromometilbenzoico en el paso 4 (Ejemplo 9, paso 2). Se usó EtOH/H2 O al 60% como solvente en lugar de MeCN/H2 O y se usó NaHCO3 saturado acuoso en lugar del tampón de NH4 OAc en el paso 4 para efectuar la ciclación. La purificación del producto se realizó usando una columna Waters XBridge C18 OBD (50 x 250 mm, 5 jm ) a ta. La fase móvil consistía de una elución en gradiente del Tampón A (NH4OH 10 mM en agua, pH 9) y Tampón B (MeCN) en el intervalo del 15-35% de B (100 mpm) durante 40 min.
Ejemplo 62: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 62
El compuesto del título se preparó siguiendo los procedimientos descritos en el Ejemplo 11, sustituyendo ácido 11,11,11-trifluoroundecanoico en lugar de ácido a-tocoferiloxiacético (AcVitE) (8) en el paso 2, y usando ácido m-clorometilbenzoico en lugar de ácido m-bromometilbenzoico en el paso 4 (Ejemplo 9, paso 2). Se usó EtOH/H2O al 60% como solvente en lugar de MeCN/H2O y se usó NaHCO3 saturado acuoso en lugar del tampón de NH4OAc en el paso 4 para efectuar la ciclación. La purificación del producto se realizó usando una columna Waters XBridge C18 OBD (50 x 250 mm, 5 jm ) a ta. La fase móvil consistía de una elución en gradiente del Tampón A (NH4 OH 10 mM en agua, pH 9) y Tampón B (MeCN) en el intervalo del 10-28% de B (100 mpm) durante 40 min.
Ejemplo 63: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 63
El compuesto del título se preparó siguiendo los procedimientos descritos en el Ejemplo 11, sustituyendo ácido 15,15,15-trifluoropentadecanoico en lugar de ácido a-tocoferiloxiacético (AcVitE) (8) en el paso 2, y usando ácido m -clorometilbenzoico en lugar de ácido m -bromometilbenzoico en el paso 4 (Ejemplo 9, paso 2). Se usó EtOH/H2O al 60% como solvente en lugar de MeCN/H2O y se usó NaHCO3 saturado acuoso en lugar del tampón de NH4 OAc en el paso 4 para efectuar la ciclación. La purificación del producto se realizó usando una columna Waters XBridge C18 OBD (50 x 250 mm, 5 pm) a ta. La fase móvil consistía de una elución en gradiente del Tampón A (NH4 OH 10 mM en agua, pH 9) y Tampón B (MeCN) en un intervalo del 15-30% de B (100 mpm) durante 40 min. Ejemplo 64: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 64
El compuesto del título se preparó siguiendo los procedimientos descritos en el Ejemplo 11, sustituyendo ácido 16-etoxipalmítico en lugar de ácido a-tocoferiloxiacético (AcVitE) (8) en el paso 2, y usando ácido m -clorometilbenzoico en lugar de ácido m - bromometilbenzoico en el paso 4 (Ejemplo 9, paso 2). Se usó EtOH/H2O al 60% como solvente en lugar de MeCN/H2O y se usó NaHCO3 saturado acuoso en lugar del tampón de NH4OAc en el paso 4 para efectuar la ciclación. La purificación del producto se realizó usando una columna Waters XBridge C18 o Bd (50 x 250 mm, 5 pm) a ta. La fase móvil consistía de una elución en gradiente del Tampón A (NH 10 mM4 OH en agua, pH 9) y Tampón B (MeCN) en un intervalo del 15-30% de B (100 mpm) durante 40 min.
Ejemplo 65: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 65
El compuesto del título se preparó siguiendo los procedimientos descritos en el Ejemplo 11, sustituyendo ácido 13,13,14,14,15,15,16,16,16-D9-palmítico (Cambridge Isotopes) en lugar de ácido a-tocoferiloxiacético (AcVitE) (8) en el paso 2, y usando ácido m - clorometilbenzoico en lugar de ácido m -bromometilbenzoico en el paso 4 (Ejemplo 9, paso 2). Se usó EtOH/H2O al 60% como solvente en lugar de MeCN/H2O y se usó NaHCO3 saturado acuoso en lugar del tampón de NH4OAc en el paso 4 para efectuar la ciclación. La purificación del producto se realizó usando una columna Waters XBridge C18 OBD (50 x 250 mm, 5 pm) a ta. La fase móvil consistía de una elución en gradiente del Tampón A (NH 4 OH 10 mM en agua, pH ~ 9) y Tampón B (MeCN) en un intervalo del 15-20% de B (100 mpm) durante 5 min, y luego al 35%. B (100 mpm) durante 40 min.
Ejemplo 66: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 66
El compuesto del título se preparó siguiendo los procedimientos descritos en el Ejemplo 11, sustituyendo ácido 11-[(2,4-bis(trifluorometil)fenil]undecanoico en lugar de ácido a-tocoferiloxiacético (AcVitE) (8) en el paso 2, y usando ácido m -clorometilbenzoico en lugar de ácido m -bromometilbenzoico en el paso 4 (Ejemplo 9, etapa 2).Se usó EtOH/H2 O al 60% como solvente en lugar de MeCN/H2 O y se usó NaHCO3 acuoso saturado en lugar del tampón de NH4 OAc en el paso 4 para efectuar la ciclación. La purificación del producto se realizó usando una columna Waters XBridge C18 OBD (50 x 250 mm, 5 pm) a ta. La fase móvil consistía de una elución en gradiente del Tampón A (NH4OH 10 mM en agua, pH 9) y Tampón B (MeCN) en el intervalo del 15-35% de B (100 mpm) durante 40 min.
Ejemplo 67: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 67
El compuesto del título se preparó siguiendo los procedimientos descritos en el Ejemplo 11, sustituyendo ácido 11-[(3,5-bis(trifluorometil)fenil]undecanoico en lugar de ácido a-tocoferiloxiacético (AcVitE) (8) en el paso 2, y usando ácido m-clorometilbenzocio en lugar de ácido m-bromometilbenzoico en el paso 4 (Ejemplo 9, paso 2). Se usó EtOH/H2 O al 60% como solvente en lugar de MeCN/H2 O y se usó NaHCO3 saturado acuoso en lugar del tampón de NH4 OAc en el paso 4 para efectuar la ciclación. La purificación del producto se realizó usando una columna Waters XBridge C18 OBD (50 x 250 mm, 5 pm) a ta. La fase móvil consistía de una elución en gradiente del Tampón A (NH4 OH 10 mM en agua, pH 9) y Tampón B (MeCN) en un intervalo del 15-35% de B (100 mpm) durante 40 min.
Ejemplo 68: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 68
1. Síntesis de (Fmoc)-pA-IKPEAPGEK(Alloc)ASPEELNRYYASLRHYLNCVTRQ(ps/-R35Y36)-Resina Sieber Se llevaron a cabo extensiones de aminoácidos sobre (p s / -R35, Y36)-resina Sieber precargado del Ejemplo 1, paso 2 (0,1 mmol) a ta usando DMF como solvente, un exceso de 6 veces de aminoácidos protegidos y un protocolo de HATU/DIEA (10 min, doble acoplamiento). Se usó un protocolo de desprotección de Fmoc de dos etapas en todo momento (piperidina al 20% en DMF; ta; 10 min, 15 min).
2. Síntesis de (Fmoc)-pA-IKPEAPGEK((OEG) 2 -Y-Glu-NHCO(CH 2 ) 16 CO 2 tBu)- ASPEELNRYYASLRHYLNCVTRQ(ps/-R35Y36)-Resina Sieber
La desprotección de la resina anterior se llevó a cabo siguiendo el método descrito en el Ejemplo 1, paso 4, usando tiempos de reacción modificados de 10 min para cada tratamiento. Luego, la resina se acopló con el producto intermedio 2 (15) (5 eq.), usando un protocolo fr HATU/DIEA en DMF (1h, ta).
3. Síntesis de (BrAc)-pA-IKPEAPGEK((OEG) 2 -Y-Glu-NHCO(CH 2 )isCO 2 tBu)-ASPEELNRYYASLRHYLNCVTRQ(ps/-R35Y36)-Resina Sieber
Después de la desprotección con Fmoc (piperidina/DM al 20%F), la resina anterior se trató con anhídrido bromoacético (10 eq.; ta, 30 min) para proporcionar la resina bromoacetilada.
4. Síntesis de (BrAc)-pA-IKPEAPGEK((OEG) 2 -Y-Glu-NHCO(CH 2 )isCO 2 tBu)-ASPEELNRYYASLRHYLNCVTRQ(ps/-R35Y36)-CONH2
La resina anterior se trató con un cóctel de escisión que consistía de TFA/H2O/TIPS (95:2,5:2,5) durante 1,5 h a ta. El péptido bruto se precipitó con éter siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 1, paso 7.
5. Análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 68
El péptido bruto obtenido anteriormente se disolvió a una concentración de 10 mg/ml en 10% de MeCN/H2O, y se añadió TEA para elevar el pH de la solución a 8-9. Después de agitar a ta durante ~20 min, se añadió TFA para reducir el pH a 2 y la solución se purificó directamente mediante HPLC preparativa en una columna Kinetics C18 Evo (30 x 100 mm, 100Á, 5 pm). La fase móvil consistía de un gradiente del elución de Tampón A (TFA al 0,1% en agua) y Tampón B (TFA al 0,1% en MeCN) en el intervalo del 20-60% de B durante 22 min. La detección de UV se monitorizó a 220 y 254 nm. Las fracciones puras se combinaron y luego se liofilizaron para dar el producto como un sólido similar al algodón.
Ejemplo 69: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 69
1. Síntesis de (Boc)-G-ISPEAPGEK(dde)ASPEELNRYYASLRHYLNLE(OAllyl)TRQ(ps/-R35Y36)-Resina Sieber Se llevaron a cabo extensiones de aminoácidos sobre el (ps/'-R35, Y36)-resina Sieber precargado del Ejemplo 1, paso 2 (0,1 mmol) a ta usando DMF como solvente, un exceso de 6 veces de aminoácidos protegidos y un protocolo HATU/NMM (10 min, acoplamiento doble). Se usó un protocolo de desprotección de Fmoc de dos etapas en todo momento (piperidina al 20% en DMF; ta; 10 min, 15 min).
2. Síntesis de (Boc)-G-ISPEAPGEK(dde)ASPEELNRYYASLRHYLNLE(NHS)TRQ(ps/-R35Y36)-Resina Sieber La desprotección de alloc de la resina anterior se llevó a cabo siguiendo el método descrito en el Ejemplo 1, paso 4, usando tiempos de reacción modificados de 10 min para cada tratamiento. Luego, la resina se acopló con NHS (10 eq.), usando un protocolo HATU/DIEA en DMF (1h, ta, acoplamiento doble).
3. Síntesis de (NH2)-G-ISPEAPGEK(dde)ASPEELNRYYASLRHYLNLE(NHS)TRQ(ps/-R35Y36)
La resina anterior se trató con un cóctel de escisión que consistía de TFA/H2O/TIPS (95:2,5:2,5) durante 1,5 h a ta. El péptido bruto se precipitó con éter siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 1, paso 7.
4. Análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 69
El péptido bruto obtenido anteriormente se disolvió a una concentración de 80 mg/ml en DMSO y se añadió TEA (25 eq.) para efectuar la lactamización. Después de agitar a ta durante ~30 min, la reacción se diluyó 10 veces con MeCN/agua al 10%, el pH se ajustó a 2 y el péptido bruto se purificó directamente mediante HPLC preparativa en una columna Kinetics C18 Evo (30 x 100 mm, 100á , 5 pm). La fase móvil consistía de un gradiente del Tampón A (TFA al 0,1% en agua) y Tampón B (TFA al 0,1% en MecN) en el intervalo del 10-60% de B durante 22 min. La detección de UV se monitorizó a 220 y 254 nm. Las fracciones puras se combinaron y luego se liofilizaron para dar el péptido protegido con K(Dde). El grupo protector Dde se eliminó usando 2% de hidrazina/DMF (10 mg de péptido/ml), 30 minutos a ta. La reacción se diluyó 10 veces con MeCN/agua al 10%, y el pH se ajustó a 2 con TFA y la solución de péptido bruta se purificó como antes para dar el producto como un sólido similar al algodón.
Ejemplo 70: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 70
El compuesto del título se preparó de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 69, sustituyendo Fmoc-E (OAll)-OH por Fmoc-Leu-OH en la posición 30 y sustituyendo Fmoc-E(OAll)-OH por Fmoc-E(OAll)-OH en la posición 31.
Ejemplo 71: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 71
1. Síntesis de (Boc)-G-ISPEAPGEK(dde)ASPEELNRYYASLRHYLNE(OAMyl)VTRQ(N-Me-R)Y-Resina NovaSyn TGR
Se llevaron a cabo extensiones de aminoácidos sobre una resina NovaSyn TGR (0,1 mmol) usando el procedimiento descrito en el Ejemplo 69, paso 1.
2. Análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 71
El compuesto del título se preparó a partir de la resina anterior de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 69, pasos 2-4.
Ejemplo 72: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 72
1. Síntesis de N-hidroxisuccinimid éster (S)-22-(terc-butoxicarbonil)-43,43-dimetil-10,19,24,41-tetraoxo-3,6,12,15,42-pentaoxa-9,18,23-triazatetratetracontan-1-oico
A una solución de ácido (S)-22-(terc-butoxicarbonil)-43,43-dimetil-10,19,24,41-tetraoxo-3,6,12,15,42-pentaoxa-9,18,23-triazatetratetracontan-1-oico (producto intermedio 2 (16)) (54,0 mg, 0,063 mmol), N-hidroxisuccinimida (14,6 mg, 0,127 mmol) y Ha Tu (24,1 mg, 0,063 mmol) en 1,0 ml de DMF se le añadió DIEA (0,022 ml, 0,127 mmol) y la mezcla se agitó durante 30 minutos a TA y se usó directamente en el paso siguiente sin purificación adicional.
2. Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 72
A una solución de [ciclo-(G2-E30), S4, K11, psi- (R35,Y36)]-PYY2-36 (preparado en el Ejemplo 70) (4 mg, 0,96 |jmol) en DMF (0,2 ml) se le añadieron 24 j l de la solución de N-hidroxi éster (preparada en el Paso 1) y TEA (0,66 jl; 5 eq) y la mezcla se agitó durante la noche a ta. La reacción se diluyó 10 veces con MeCN/agua al 10%, el pH se ajustó a 2 con TFA y el péptido bruto se purificó directamente por HPLC preparativa en una columna Kinetics C18 Evo (30 x 100 mm, 100Á, 5 jm). La fase móvil consistía de elución en gradiente del Tampón A (TFA al 0,1% en agua) y Tampón B (TFA al 0,1% en MeCN) en el intervalo del 10-60% de B durante 22 min. La detección de UV se monitorizó a 220 y 254 nm. Las fracciones puras se combinaron y luego se liofilizaron para dar el péptido protegido con t-butil éster. Los grupos protectores de t-butil éster se eliminaron usando una mezcla de TFA/H2O/TIPS (95:2.5:2.5) durante 1,5 h a ta. La mezcla se concentró y el péptido se purificó como antes para dar el producto como un sólido similar al algodón.
Ejemplo 73: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 73
El compuesto del título se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 sustituyendo ácido N-Fmoc-dPEG6-carboxílico por ácido N-Fmoc-dPEG12-carboxílico en el paso 5.
Ejemplo 74: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 74
El compuesto del título se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 pero omitiendo el paso 5 de acoplamiento del conector PEG.
Ejemplo 75: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 75
El compuesto del título se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 1, sustituyendo Fmoc-hC(trt)-OH por Fmoc-hC(trt)-OH en la posición 31 y omitiendo el paso de acoplamiento de Fmoc-pA-OH en el paso 3.
Ejemplo 76: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 76
El compuesto del título se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 con los pasos 3 y 4 modificados. En el paso A, se usaron Fmoc-K(Alloc)-OH y Fmoc-K(dde)-OH para la posición 30 y la posición 11, respectivamente. Después de que se desprotegió Alloc en la posición 30 con Pd(PPh3 )4-fenilsilano, se acopló el ácido mPEG16-carboxílico con HATU-DIPEA. En el paso 4, se eliminó el dde en la posición 11 con hidrazina al 2% en DMF.
Ejemplo 77: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 77
El compuesto del título se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 76 sustituyendo á c i d o m P E G 12 - c a r b o x í l i c o p o r á c i d o m P E G 16 - c a r b o x í l i c o e n e l p a s o A , y o m i t i e n d o e l p a s o d e a c o p l a m i e n t o d e á c i d o F m o c - d P E G 12 - c a r b o x í l i c o e n e l p a s o 5.
Ejemplo 78: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 78
E l c o m p u e s t o d e l t í t u l o s e p r e p a r ó d e a c u e r d o c o n e l p r o c e d i m i e n t o d e s c r i t o e n e l E j e m p l o 1 s u s t i t u y e n d o F m o c - N - M e - Q ( t r t ) - O H p o r F m o c - Q ( t r t ) - O H e n e l p a s o 3.
Ejemplo 79: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 79
E l c o m p u e s t o d e l t í t u l o s e p r e p a r ó d e a c u e r d o c o n e l p r o c e d i m i e n t o d e s c r i t o e n e l E j e m p l o 1 s u s t i t u y e n d o F m o c - N - M e - R ( p b f ) - O H p o r F m o c - R ( p b f ) - O H e n e l p a s o 1 B .
Ejemplo 80: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 80
E l c o m p u e s t o d e l t í t u l o s e p r e p a r ó d e a c u e r d o c o n e l p r o c e d i m i e n t o d e s c r i t o e n e l E j e m p l o 79 s u s t i t u y e n d o F m o c - R ( p b f ) - O H p o r F m o c - K ( B o c ) - O H e n la p o s i c i ó n 4 , y s u s t i t u y e n d o F m o c - W ( B o c ) - O H p o r F m o c - L - O H e n la p o s i c i ó n 30 e n e l p a s o 3.
Ejemplo 81: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 81
E l c o m p u e s t o d e l t í t u l o s e p r e p a r ó d e a c u e r d o c o n e l p r o c e d i m i e n t o d e s c r i t o e n e l E j e m p l o 80 s u s t i t u y e n d o F m o c - C ( t r t ) - O H p o r F m o c - h C ( t r t ) - O H e n la p o s i c i ó n 31 , y s u s t i t u y e n d o e l á c i d o F m o c - Y - a m i n o b u t a n o i c o p o r á c i d o F m o c - p A - O H e n e l p a s o 3.
Ejemplo 82: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 82
Figure imgf000065_0001
Ejemplo 83: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 83
E l c o m p u e s t o d e l t í t u l o s e p r e p a r ó d e a c u e r d o c o n e l p r o c e d i m i e n t o d e s c r i t o e n e l E j e m p l o 1 s u s t i t u y e n d o F m o c - K ( N 3 ) - O H p o r F m o c - h C ( t r t ) - O H e n la p o s i c i ó n 31 , s u s t i t u y e n d o e l á c i d o p e n t - 4 - i n o i c o p o r F m o c - p A - O H e n e l p a s o 3, y s i g u i e n d o e l p r o c e d i m i e n t o d e c i c l a c i ó n B c o m o s e i n d i c a a c o n t i n u a c i ó n .
P r o c e d i m i e n t o d e c i c l a c i ó n B: A u n a s o l u c i ó n d e p é p t i d o c o m p l e t a m e n t e d e s p r o t e g i d o c o n P E G 12 - A c B r i n s t a l a d o e n la p o s i c i ó n 11 ( 38 m g , 0 , 0067 m m o l ) e n 2 m l d e H E P E S ( p H 7 , 4 ) s e le a ñ a d i e r o n 1 , 7 m l d e la s o l u c i ó n p r e m e z c l a d a d e C u S O 4/ T B T A ( l a s o l u c i ó n s e p r e p a r ó m e z c l a n d o u n a s o l u c i ó n d e 2 , 2 m g d e C u S O 4 e n a g u a ( 0 , 4 m l) c o n u n a s o l u c i ó n d e 11 m g d e T B T A e n E t O H ) , s e g u i d o d e la a d i c i ó n d e 7 m g d e a s c o r b a t o d e s o d i o e n a g u a (1 ml). L a s o l u c i ó n d e r e a c c i ó n t r a n s p a r e n t e s e d e j ó m e z c l a n d o a t e m p e r a t u r a a m b i e n t e y s e m o n i t o r i z ó m e d i a n t e H P L C . D e s p u é s d e 30 m in , s e c o m p l e t ó la r e a c c i ó n y la m e z c l a d e la r e a c c i ó n s e a j u s t ó a p H 4 u s a n d o T F A y s e s o m e t i ó a p u r i f i c a c i ó n p o r H P L C ( c o l u m n a P u r s u i t X R S 5 250 x 30 m m C 18 , f u n c i o n a n d o a u n f lu jo d e 30 m p m , m o n i t o r i z a n d o u n a l o n g i t u d d e o n d a d e 214 n M , c o n u n g r a d i e n t e q u e v a r í a d e l 20 - 60 % A C N - a g u a / a g u a a m b o s c o n T F A a l 0 , 1 % d u r a n t e 36 m i n u t o s ) . L a f r a c c i ó n d e s e a d a s e r e c o g i ó y l io fi l iz ó .
Ejemplo 84: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 84
E l c o m p u e s t o d e l t í t u l o s e p r e p a r ó d e a c u e r d o c o n e l p r o c e d i m i e n t o d e s c r i t o e n e l E j e m p l o 1 o m i t i e n d o e l p a s o d e a c o p l a m i e n t o d e F m o c - p A - O H , s u s t i t u y e n d o e l á c i d o N 3 - P E G 8 - c a r b o x í l i c o p o r á c i d o F m o c - d P E G 12 -c a r b o x í l i c o e n e l p a s o 5 y s u s t i t u y e n d o e l a c o p l a m i e n t o d e á c i d o 3 - ( b r o m o m e t i l ) b e n z o i c o c o n D I C p a r a la a c i l a c i ó n d e l a n h í d r i d o b r o m o a c é t i c o e n e l p a s o 3, y s i g u i e n d o e l p r o c e d i m i e n t o d e c i c l a c i ó n C c o m o s e i n d i c a a c o n t i n u a c i ó n .
P r o c e d i m i e n t o d e c i c l a c i ó n C : a u n a s o l u c i ó n d e p é p t i d o c o m p l e t a m e n t e d e s p r o t e g i d o ( 20 m g , 0 , 0035 m m o l ) e n 5 m l d e a g u a d e s g a s i f i c a d a , s e le a ñ a d i ó u n a s o l u c i ó n N a H C O 3 a c u o s a p a r a a j u s t a r la m e z c l a d e la r e a c c i ó n a p H 6 , 4 o m á s . D e s p u é s d e 20 m in , la L C M S i n d i c ó q u e la r e a c c i ó n s e h a b í a c o m p l e t a d o , y la m e z c l a d e la r e a c c i ó n s e a j u s t ó a p H 4 u s a n d o T F A y s e s o m e t i ó a p u r i f i c a c i ó n p o r H P L C ( c o l u m n a C 18 P u r s u i t X R S 5 d e 250 x 30 m m , f u n c i o n a n d o a u n f l u j o d e 30 m p m , m o n i t o r i z a n d o u n a l o n g i t u d d e o n d a d e 214 n M , c o n u n g r a d i e n t e q u e v a r i a b a d e l 10 a l 60 % d e A C N - a g u a / a g u a , a m b o s c o n T F A a l 0 , 1 % d u r a n t e 36 m i n u t o s ) . L a f r a c c i ó n d e s e a d a s e r e c o g i ó y lio fi l izó .
D e s p u é s d e la c i c l a c i ó n , e l p r o d u c t o i n t e r m e d i o c i c l a d o s e s o m e t i ó a e x t e n s i ó n d e l c o n e c t o r m e d i a n t e q u í m i c a d e c l i c s i g u i e n d o e l p r o c e d i m i e n t o d e c i c l a c i ó n B c o n N - ( 1 - b r o m o - 2 - o x o - 7 , 10 , 13 - t r i o x a - 3 - a z a h e x a d e c a n - 16 -i l ) p e n t - 4 - i n a m i d a , q u e s e p r e p a r ó m e d i a n t e a c o p l a m i e n t o d e N - B o c - P E G 4 - N H 2 c o n á c i d o p e n t - 4 - i n o i c o u s a n d o Ejemplo 85: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 85
E l c o m p u e s t o d e l t í t u l o s e p r e p a r ó d e a c u e r d o c o n e l p r o c e d i m i e n t o d e s c r i t o e n e l E j e m p l o 1 c o n e l c o n e c t o r P E G 12 - A c B r i n s t a l a d o e n la p o s i c i ó n 23 e n l u g a r d e la p o s i c i ó n 11.
Ejemplo 86: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 86
E l c o m p u e s t o d e l t í t u l o s e p r e p a r ó d e a c u e r d o c o n e l p r o c e d i m i e n t o d e s c r i t o e n e l E j e m p l o 1 c o n e l c o n e c t o r P E G 12 - A c B r i n s t a l a d o e n la p o s i c i ó n 22 e n l u g a r d e la p o s i c i ó n 11.
Ejemplo 87: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 87
E l c o m p u e s t o d e l t í t u l o s e p r e p a r ó d e a c u e r d o c o n e l p r o c e d i m i e n t o d e s c r i t o e n e l E j e m p l o 1 c o n e l c o n e c t o r P E G 12 - A c B r i n s t a l a d o e n la p o s i c i ó n 7 e n l u g a r d e la p o s i c i ó n 11.
Ejemplo 88: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 88
E l c o m p u e s t o d e l t í t u l o s e p r e p a r ó d e a c u e r d o c o n e l p r o c e d i m i e n t o d e s c r i t o e n e l E j e m p l o 1 s u s t i t u y e n d o F m o c - V - O H p o r F m o c - h C ( t r t ) - O H e n la p o s i c i ó n 31, s u s t i t u y e n d o F m o c - C ( t r t ) - O H p o r F m o c - L - O H e n la p o s i c i ó n 30 , y s u s t i t u y e n d o F m o c - p A - O H p o r F m o c - G - O H e n e l p a s o 3.
Ejemplo 89: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 89
E l c o m p u e s t o d e l t í t u l o s e p r e p a r ó d e a c u e r d o c o n e l p r o c e d i m i e n t o d e s c r i t o e n e l E j e m p l o 88 o m i t i e n d o e l p a s o 1 p a r a p r o p o r c i o n a r e l d i p é p t i d o r e d u c i d o y s u s t i t u y e n d o la c a r g a d e F m o c - Y ( t B u ) - O H s e g u i d o d e a c o p l a m i e n t o c o n F m o c -( N - M e ) R - O H p o r la c a r g a d e F m o c - p s i -( R 35 - N ( B o c ) - Y 36 ) - O H e n e l p a s o 2.
Ejemplo 90: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 90
E l c o m p u e s t o d e l t í t u l o s e p r e p a r ó d e a c u e r d o c o n e l p r o c e d i m i e n t o d e s c r i t o e n e l E j e m p l o 89 s u s t i t u y e n d o F m o c - p A - O H p o r F m o c - G - O H e n e l p a s o 3.
Ejemplo 91: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 91
E l c o m p u e s t o d e l t í t u l o s e p r e p a r ó d e a c u e r d o c o n e l p r o c e d i m i e n t o d e s c r i t o e n e l E j e m p l o 89 s u s t i t u y e n d o F m o c - h C ( t r t ) - O H p o r F m o c - C ( t r t ) - O H e n la p o s i c i ó n 30 e n e l p a s o 3.
Ejemplo 92: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 92
E l c o m p u e s t o d e l t í t u l o s e p r e p a r ó d e a c u e r d o c o n e l p r o c e d i m i e n t o d e s c r i t o e n e l E j e m p l o 90 s u s t i t u y e n d o F m o c - h C ( t r t ) - O H p o r F m o c - V - O H e n la p o s i c i ó n 31, y s u s t i t u y e n d o F m o c - C ( t r t ) - O H p o r F m o c - C ( t r t ) - O H e n la p o s i c i ó n 31 30 e n e l p a s o 3.
Ejemplo 93: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 93
E l c o m p u e s t o d e l t í t u l o s e p r e p a r ó d e a c u e r d o c o n e l p r o c e d i m i e n t o d e s c r i t o e n e l E j e m p l o 1 s u s t i t u y e n d o F m o c - V - O H p o r F m o c - h C ( t r t ) - O H e n la p o s i c i ó n 31, s u s t i t u y e n d o F m o c - C ( t r t ) - O H p o r F m o c - L - O H e n la p o s i c i ó n 30 y s u s t i t u y e n d o F m o c - p A - O H p o r F m o c - G - O H e n e l e x t r e m o N - t e r m i n a l e n e l p a s o 3.
Ejemplo 94: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 94
E l c o m p u e s t o d e l t í t u l o s e p r e p a r ó d e a c u e r d o c o n e l p r o c e d i m i e n t o d e s c r i t o e n e l E j e m p l o 1 s u s t i t u y e n d o F m o c - V - O H p o r F m o c - h C ( t r t ) - O H e n la p o s i c i ó n 31 y s u s t i t u y e n d o F m o c - C ( t r t ) - O H p o r F m o c - L - O H e n la p o s i c i ó n 30 e n e l p a s o 3.
Ejemplo 95: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 95
E l c o m p u e s t o d e l t í t u l o s e p r e p a r ó ( e s c a l a d e 0 , 05 m m o l ) d e a c u e r d o c o n l o s p r o c e d i m i e n t o s d e s c r i t o s e n e l E j e m p l o 1 s u s t i t u y e n d o F m o c - V - O H p o r F m o c - h C ( t r t ) - O H e n la p o s i c i ó n 31, s u s t i t u y e n d o F m o c - G l u ( O A l l o c ) - O H p o r F m o c - L - O H e n la p o s i c i ó n 30 , s u s t i t u y e n d o F m o c - L y s ( d d e ) - O H p o r F m o c - L y s ( A l l o c ) - O H e n la p o s i c i ó n 11, s u s t i t u y e n d o F m o c - S e r ( t B u ) - O H p o r F m o c - K ( B o c ) - O H e n la p o s i c i ó n 4 y s u s t i t u y e n d o B o c - G - O H p o r F m o c - p A - O H e n e l e x t r e m o N - t e r m i n a l e n e l p a s o 3.
A la r e s i n a r e s u l t a n t e a n t e r i o r s e le a ñ a d i ó D C M d e s o x i g e n a d o ( 10 m l) , f e n i l s i l a n o ( 10 e q . ) y u n a s o l u c i ó n d e P d ( P P h 3 ) 4 ( 0 , 2 e q . ) e n D C M (1 m l) y la m e z c l a s e a g i t ó d u r a n t e 10 m i n u t o s . S e d r e n ó la r e a c c i ó n y s e l a v ó la r e s i n a c o n D C M d e s o x i g e n a d o y s e r e p i t i ó la d e s p r o t e c c i ó n u n a v e z .
A la r e s i n a r e s u l t a n t e a n t e r i o r s e le a ñ a d i ó D M F ( 10 m l) , H A T U ( 5 e q ) y D I E A ( 10 e q ) y la m e z c l a s e a g i t ó d u r a n t e 5 m i n u t o s , l u e g o s e a ñ a d i ó u n a s o l u c i ó n d e N - h i d r o x i s u c c i n i m i d a ( 10 e q ) e n D M F y s e a g i t ó d u r a n t e 20 m i n u t o s a d i c i o n a l e s . L a r e s i n a s e fi l tró y e l p r o c e d i m i e n t o s e r e p i t i ó u n a v e z .
L a r e s i n a a n t e r i o r s e d e s p r o t e g i ó d u r a n t e 2 h o r a s a T A e n T F A / T I P S / a g u a ( 95 / 2 , 5 / 2 , 5 ) ( 10 m l) . E l c ó c t e l d e e s c i s i ó n s e c o n c e n t r ó a a p r o x . 1 m l y l u e g o s e a ñ a d e a 40 m l d e é t e r . E l p r e c i p i t a d o r e s u l t a n t e s e r e c o g i ó p o r c e n t r i f u g a c i ó n y s e s e c ó b a j o N 2.
E l m a t e r i a l r e s u l t a n t e a n t e r i o r s e d i s o l v i ó e n 9 m l d e D M S O a l q u e s e le a ñ a d i e r o n 10 e q d e T E A y s e d e j ó q u e la r e a c c i ó n p r o s i g u i e r a d u r a n t e 3 h o r a s a T A . L a s o l u c i ó n r e s u l t a n t e s e d i l u y ó a 30 m l c o n a g u a , e l p H s e a j u s t ó a 2 y s e p u r i f i c ó p o r R P - H P L C e n u n a c o l u m n a C 18 d e 30 m m x 250 m m e l u y e n d o c o n u n g r a d i e n t e l i n e a l d e 20 -40 % d e A C N e n a g u a ( T F A a l 0 , 1 % ) e n 30 m i n u t o s . S e l i o f i l i z a r o n l a s f r a c c i o n e s q u e c o n t e n í a n e l p r o d u c t o .
E l m a t e r i a l r e s u l t a n t e a n t e r i o r s e t r a t ó l u e g o c o n 1 - 2 % d e h i d r a z i n a / D M F (1 m l) p a r a e l i m i n a r e l D d e d e la l i s i n a . L a m e z c l a r e s u l t a n t e s e d i l u y ó a 10 m l c o n a g u a , e l p H s e a j u s t ó a 2 y l u e g o s e p u r i f i c ó m e d i a n t e R P - H P L C c o m o a n t e s .
L u e g o , e l p r o d u c t o r e s u l t a n t e s e d i s o l v i ó e n 10 % d e A C N / a g u a , e l p H s e a j u s t ó a 10 y s e a ñ a d i ó u n a s o l u c i ó n d e é s t e r d e N - h i d r o x i s u c c i n i m i d a b r o m o a c é t i c o ( 3 e q d e s o l u c i ó n 0 , 1 M / D M F ) y s e d e j ó q u e la r e a c c i ó n p r o s i g u i e r a d u r a n t e 10 m i n u t o s a T A . L a m e z c l a r e s u l t a n t e s e d i l u y ó a 10 m l c o n a g u a , e l p H s e a j u s t ó a 2 y l u e g o s e p u r i f i c ó m e d i a n t e R P - H P L C c o m o a n t e s p a r a d a r e l p r o d u c t o d e l t í tu lo .
Ejemplo 96: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 96
E l c o m p u e s t o d e l t í t u l o s e p r e p a r ó d e a c u e r d o c o n e l p r o c e d i m i e n t o d e s c r i t o e n e l E j e m p l o 1 s u s t i t u y e n d o á c i d o N - F m o c - d P E G 24 - c a r b o x í l i c o p o r á c i d o N - F m o c - d P E G 12 - c a r b o x í l i c o e n e l p a s o 5.
Ejemplo 97: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 97
E l c o m p u e s t o d e l t í t u l o s e p r e p a r ó d e a c u e r d o c o n e l p r o c e d i m i e n t o d e s c r i t o e n e l E j e m p l o 1 , s u s t i t u y e n d o F m o c - p A - O H p o r F m o c - p A - O H e n e l p a s o 3.
Ejemplo 98: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 98
E l c o m p u e s t o d e l t í t u l o s e p r e p a r ó d e a c u e r d o c o n e l p r o c e d i m i e n t o d e s c r i t o e n e l E j e m p l o 89 p e r o o m i t i e n d o e l p a s o d e a c o p l a m i e n t o d e á c i d o F m o c - d P E G 12 - c a r b o x í l i c o e n e l p a s o 5.
Ejemplo 99: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 99
E l c o m p u e s t o d e l t í t u l o s e p r e p a r ó d e a c u e r d o c o n e l p r o c e d i m i e n t o d e s c r i t o e n e l E j e m p l o 90 p e r o o m i t i e n d o e l p a s o d e a c o p l a m i e n t o d e á c i d o F m o c - d P E G 12 - c a r b o x í l i c o e n e l p a s o 5.
Ejemplo 100: Síntesis del análogo de PYY cíclico SEQ ID NO: 100
E l c o m p u e s t o d e l t í t u l o s e p r e p a r ó d e a c u e r d o c o n e l p r o c e d i m i e n t o d e s c r i t o e n e l E j e m p l o 94 p e r o o m i t i e n d o e l p a s o d e a c o p l a m i e n t o d e á c i d o F m o c - d P E G 12 - c a r b o x í l i c o e n e l p a s o 5.
Ejemplo 101: Identificación y producción de mAb MSCB97
Selección de PH9L3 VL y PH9H5 VH como regiones V iniciales para manipulación
L a r e g i ó n v a r i a b l e d e la c a d e n a l i g e r a d e l a n t i c u e r p o ( V L ) d e s i g n a d a P H 9 L 3 ( S E Q ID N O : 128 ) ( T e p l y a k o v e t a l . , " S t r u c t u r a l d i v e r s i t y in a h u m a n a n t i b o d y g e r m l i n e l ib r a r y " , m A b s a g o s t o - s e p t i e m b r e 8 ( 6 ) : 1045 - 63 ( 2016 ) ) y la r e g i ó n v a r i a b l e d e la c a d e n a p e s a d a d e a n t i c u e r p o ( V H ) d e s i g n a d a P H 9 H 5 ( S E Q ID N O : 129 ) ( T e p l y a k o v e t a l . , " S t r u c t u r a l d i v e r s i t y in a h u m a n a n t i b o d y g e r m l i n e l i b r a r y ," m A b s A g o - s e p 8 ( 6 ) : 1045 - 1063 ( 2016 ) ) s e s e l e c c i o n a r o n c o m o l a s r e g i o n e s v a r i a b l e s d e p a r t i d a a p a r t i r d e l a s c u a l e s d i s e ñ a r u n m A b h a b i l i t a d o p a r a la c o n j u g a c i ó n d e p é p t i d o s . P H 9 L 3 e s t á c o m p u e s t o c o m p l e t a m e n t e p o r s e c u e n c i a s d e l g e n V d e la l í n e a g e r m i n a l d e Ig h u m a n a y, c o m o ta l , n o c o n t i e n e n i n g u n a s e c u e n c i a d e m u t a c i o n e s d e la s e c u e n c i a d e l p r o c e s o d e m a d u r a c i ó n p o r a f i n i d a d in v i v o q u e d a r í a c o m o r e s u l t a d o u n a u n i ó n e s p e c í f i c a d e a n t í g e n o d e a l t a a f i n i d a d . L a C D R 3 d e P H 9 H 5 e s e l ú n i c o s e g m e n t o q u e n o e s t á c o m p u e s t o p o r s e c u e n c i a s d e l g e n V d e la l í n e a g e r m i n a l h u m a n a e n e s a V H . L a C D R 3 d e P H 9 H 5 e s d e u n a n t i c u e r p o d e C C L 2 a n t i - h u m a n o , C N T O 888 y e s p r o p o r c i o n a d a p o r la S E Q ID N O : 130. S e g e n e r ó u n F a b q u e c o n t e n í a e l p a r P H 9 H 5 / P H 9 L 3 V H / V L .
Figure imgf000068_0001
Diseño y generación de variantes Cys sustituidas de PH9H5 y PH9L3
Figure imgf000068_0002
L o s c o n s t r u c t o s d e e x p r e s i ó n g e n e r a d o s s e u s a r o n p a r a e x p r e s a r l a s v a r i a n t e s d e C y s c o t r a n s f e c t a n d o t r a n s i t o r i a m e n t e c a d a c o n s t r u c t o v a r i a n t e d e C y s d e H C b a s a d o e n P H 9 H 5 c o n e l c o n s t r u c t o d e L C d e P H 9 L 3 d e t i p o s a l v a j e o c o t r a n s f e c t a n d o c a d a c o n s t r u c t o d e v a r i a n t e d e C y s d e L C b a s a d o e n P H 9 L 3 c o n e l c o n s t r u c t o d e H C d e P H 9 H 5 d e t i p o s a l v a j e . L a s t r a n s f e c c i o n e s d e p r u e b a i n i c i a l e s u s a r o n E x p i 293 d e r i v a d o d e H E K c o m o h u é s p e d d e e x p r e s i ó n y e s t a b a n a u n a e s c a l a d e 20 m l. L a m a y o r í a d e l a s v a r i a n t e s d e C y s d e H C y L C s e e x p r e s a r o n b i e n e n b a s e a la c u a n t i f i c a c i ó n d e la p r o t e í n a v a r i a n t e d e l s o b r e n a d a n t e d e l c u l t i v o .
S e e x p r e s a r o n c i n c o v a r i a n t e s i n i c i a l e s d e C y s d e H C , M S C B 33 - M S C B 37 , e n E x p i 293 a u n a e s c a l a d e 750 m l y s e p u r i f i c a r o n l a s p r o t e í n a s v a r i a n t e s . E l r e n d i m i e n t o d e la p u r i f i c a c i ó n y l a s p r o p i e d a d e s d e c a l i d a d d e l a s v a r i a n t e s p u r i f i c a d a s f u e r o n b a s t a n t e s i m i l a r e s y s u f i c i e n t e s p a r a u s a r l a s p r o t e í n a s p u r i f i c a d a s e n l a s r e a c c i o n e s i n i c i a l e s d e c o n j u g a c i ó n d e p é p t i d o s .
Evaluación de la conjugación de péptidos con variantes de Cys de HC basadas en PH9H5
Figure imgf000068_0003
Manipulación de Fc de MSCB33
S e r e d i s e ñ ó M S C B 33 p a r a c o n t e n e r e l I g G 4 _ P A A F c h u m a n o s i l e n c i o s o p a r a r e d u c i r la f u n c i ó n F c in vivo. L a I g G 4 _ P A A h u m a n a t i e n e m u t a c i o n e s S 228 P / F 234 A / L 235 A e n e l a l o t i p o n G 4 m ( a ) d e I g G 4 h u m a n a ( e n b a s e a l a l e l o I G H G 4 * 01 c o m o s e d e f i n e e n I M G T ) . S e g e n e r ó u n c o n s t r u c t o d e e x p r e s i ó n c o n e l V H d e M S C B 33 f u s i o n a d a a l F c d e I g G 4 _ P A A y s e u s ó j u n t o c o n e l m i s m o c o n s t r u c t o d e e x p r e s i ó n d e L C u s a d o p a r a la e x p r e s i ó n d e M S C B 33 p a r a p r o p o r c i o n a r la v a r i a n t e d e I g G 4 _ P A A d e M S C B 33 , q u e s e d e s i g n a M S C B 97. L a s s e c u e n c i a s d e a m i n o á c i d o s d e v H, H C , V L y L C d e M S C B 97 s o n p r o p o r c i o n a d a s p o r la S E Q ID N O : 137 , 138 , 139 y 140 , r e s p e c t i v a m e n t e .
L a e x p r e s i ó n d e p r u e b a d e M S C B 97 s e r e a l i z ó t r a n s i t o r i a m e n t e a u n a e s c a l a d e 20 m l e n c é l u l a s E x p i 293 y e s t a v a r i a n t e d e m A b s e e x p r e s ó b i e n . S e p u r i f i c ó M S C B 97 a p a r t i r d e u n a s e r i e d e e x p r e s i ó n d e E x p i 293 a g r a n e s c a l a . E l r e n d i m i e n t o d e p u r i f i c a c i ó n d e M S C B 97 f u e d e 264 , 53 m g / l y la c a l i d a d s e d e t e r m i n ó e n e l 85 % d e e s p e c i e s d e m o n ó m e r o s . L a s s e r i e s d e e x p r e s i ó n y p u r i f i c a c i o n e s p o s t e r i o r e s a g r a n e s c a l a f u e r o n s i m i l a r e s o m e j o r e s e n r e n d i m i e n t o y c a l i d a d e i n d i c a r o n la c o n s i s t e n c i a c o n la q u e s e p o d r í a p r o p o r c i o n a r e s t e m A b .
Evaluación de la conjugación de péptidos a MSCB97 y escalabilidad de la reacción de conjugación
Figure imgf000069_0001
Evaluación de la unión del conjugado péptido-MSCB97 con CCL2 humana
A u n q u e s e s e l e c c i o n ó y m a n i p u l ó M S C B 97 p o r f a l t a d e u n i ó n d e a n t í g e n o e s p e c í f i c o , e l a n t í g e n o m á s p r o b a b l e a l q u e e s t e m A b p o d r í a u n i r s e , s i lo h u b i e r a , e s C C L 2 h u m a n a e n b a s e a l o r i g e n d e l V H d e C D R 3. S e e v a l u ó s i M S C B 97 d e m u e s t r a a l g u n a u n i ó n d e C C L 2 e s p e c í f i c a u s a n d o d o s c o n j u g a d o s p é p t i d o - M S C B 97 , c o n u n a n á l o g o p e p t í d i c o d e O X M o u n a n á l o g o p e p t í d i c o d e P Y Y .
L a u n i ó n p o t e n c i a l d e C C L 2 s e m i d i ó d i r e c t a m e n t e m e d i a n t e r e s o n a n c i a d e p l a s m o n e s d e s u p e r f i c i e ( S P R ) e n la q u e l o s c o n j u g a d o s s e i n m o v i l i z a r o n e n la s u p e r f i c i e u s a n d o u n m é t o d o d e c a p t u r a a n t i - F c . U n m A b d e r a t ó n a n t i - C C L 2 d i s p o n i b l e c o m e r c i a l m e n t e s i r v i ó c o m o c o n t r o l p o s i t i v o y d o s a n t i c u e r p o s h u m a n o s n o e s p e c í f i c o s , C N T O 94 12 y H H 3 B 33 , s i r v i e r o n c o m o c o n t r o l e s n e g a t i v o s . T o d o s l o s c o n t r o l e s s e i n m o v i l i z a r o n e n la s u p e r f i c i e d e m a n e r a s i m i l a r y s e h i z o f lu ir C C L 2 h u m a n a r e c o m b i n a n t e s o b r e c o n j u g a d o s y c o n t r o l e s i n m o v i l i z a d o s a c o n c e n t r a c i o n e s d e h a s t a 400 n M . E n b a s e a l o s c r i t e r i o s d e e n s a y o p r e e s t a b l e c i d o s , s e o b s e r v ó a c u m u l a c i ó n d e C C L 2 , q u e i n d i c a u n i ó n d e a n t í g e n o e s p e c í f i c o , c o n e l c o n t r o l p o s i t i v o p e r o n o c o n l o s c o n t r o l e s n e g a t i v o s ni c o n e l c o n j u g a d o p é p t i d o -M S C B 97. E s t o c o n f i r m ó q u e M S C B 97 , e n la f o r m a t e r a p é u t i c a r e l e v a n t e d e u n c o n j u g a d o p é p t i d o - m A b , c a r e c e d e u n i ó n a C C L 2 h u m a n a .
Ejemplo 102: Expresión y purificación del mAb
E l a n t i c u e r p o m o n o c l o n a l ( m A b ) c o m p l e t a m e n t e h u m a n o p u e d e e x p r e s a r s e d e m a n e r a r e c o m b i n a n t e e n un h u é s p e d d e e x p r e s i ó n d e m a m í f e r o y p u r i f i c a r s e a p a r t i r d e l s o b r e n a d a n t e d e l c u l t i v o c e l u l a r u s a n d o m é t o d o s e s t á n d a r q u e s e c o n o c e n e n e l á r e a . P o r e j e m p l o , u n a s e c u e n c i a d e A D N c q u e c o d i f i c a l a s c a d e n a s l i g e r a ( L C ) y p e s a d a ( H C ) d e l m A b , c a d a u n a d e l a s c u a l e s i n c l u y e u n p é p t i d o s e ñ a l a p r o p i a d o p a r a p e r m i t i r la s e c r e c i ó n , p u e d e c l o n a r s e e n v e c t o r e s d e e x p r e s i ó n d e m a m í f e r o s s e p a r a d o s o e n u n ú n i c o v e c t o r d e e x p r e s i ó n u s a n d o m é t o d o s d e b i o l o g í a m o l e c u l a r e s t á n d a r . L o s v e c t o r e s d e e x p r e s i ó n u s a d o s p u e d e n s e r c u a l q u i e r a d e l o s d i s p o n i b l e s c o m e r c i a l m e n t e c o m o p E E 12.4 , p c D N A ™ 3.1 ( ) o p I R E S p u r o 3 o c u a l q u i e r v e c t o r d e e x p r e s i ó n p e r s o n a l i z a d o c o n f u n c i o n a l i d a d e s s i m i l a r e s . E n t a l e s v e c t o r e s , la t r a n s c r i p c i ó n d e l a s c a d e n a s p e s a d a y l i g e r a d e l m A b e s t á d i r i g i d a c a d a u n a p o r c u a l q u i e r a d e l o s p r o m o t o r e s e f i c a c e s c o n o c i d o s , c o m o e l p r o m o t o r h C M V - M I E . E l A D N p l a s m í d i c o d e g r a d o t r a n s f e c c i ó n s e p r e p a r a r p a r a s e p a r a r l o s c o n s t r u c t o s d e e x p r e s i ó n d e L C y H C o u n ú n i c o c o n s t r u c t o q u e e x p r e s a t a n t o L C c o m o h S u s a n d o m é t o d o s e s t á n d a r c o m o u n Kit Q I A G E N P l a s m i d Midi.
e q u i v a l e n t e s d e T C E P . L a s o l u c i ó n s e a j u s t ó a p H 6 y d e s p u é s d e 1 h o r a a t a la c r o m a t o g r a f í a l í q u i d a d e a l t a p r e s i ó n c o n e s p e c t r ó m e t r o d e m a s a s ( L C M S ) m o s t r ó q u e l o s a d u c t o s d e d i s u l f u r o e n la p o s i c i ó n C 102 s e h a b í a n r e d u c i d o c o m p l e t a m e n t e . E l m A b r e d u c i d o s e p u r i f i c ó m e d i a n t e a d s o r c i ó n y e l u c i ó n d e p r o t e í n a A ( 4 C V d e á c i d o a c é t i c o 100 m M ) p a r a p r o p o r c i o n a r 180 m g d e m A b r e d u c i d o .
Conjugación de mAb reducido y análogo de PYY cíclico
S e a ñ a d i ó p é p t i d o l i o f i l i z a d o ( 5 e q f r e n t e a m A b ) a l m A b r e d u c i d o d e s c r i t o a n t e r i o r m e n t e . S e a ñ a d i ó E D T A a u n a c o n c e n t r a c i ó n f i n a l d e 1 m M y e l p H s e a j u s t ó a 7. L a c o n c e n t r a c i ó n s e a j u s t ó a 8 m g / m l y s e d e j ó q u e la r e a c c i ó n p r o s i g u i e r a c o n a g i t a c i ó n s u a v e d u r a n t e 16 h a t a . S e a ñ a d i ó T C E P ( 0 , 5 e q f r e n t e a m A b ) y s e d e j ó q u e la r e a c c i ó n p r o s i g u i e r a d u r a n t e 4 h o r a s a t a c o n a g i t a c i ó n s u a v e , d e s p u é s d e lo c u a l l a s e s p e c i e s d e a l t o p e s o m o l e c u l a r ( P M ) s e r e d u j e r o n a m e n o s d e l 3 % .
L a m e z c l a d e la r e a c c i ó n s e a j u s t ó a p H 5 , 5 y s e p u r i f i c ó m e d i a n t e c r o m a t o g r a f í a d e i n t e r c a m b i o i ó n i c o e n r e s i n a C a p t o S P u s a n d o u n g r a d i e n t e d e l 100 % d e A ( T R I S - a c e t a t o 100 m M , p H 5 , 5 ) a l 100 % d e B ( T R I S - a c e t a t o 100 m M , p H 5 , 5 ; N a C l 0 , 5 M ) s o b r e 20 C V . S e a g r u p a r o n l a s f r a c c i o n e s q u e c o n t e n í a n e l c o n j u g a d o d e s e a d o y s e r e c u p e r a r o n 140 m g d e c o n j u g a d o , c o e l u y e n d o c o n u n a p e q u e ñ a c a n t i d a d d e p é p t i d o s i n r e a c c i o n a r . L a p u r i f i c a c i ó n f i n a l s e r e a l i z ó m e d i a n t e a d s o r c i ó n y e l u c i ó n d e p r o t e í n a A ( 4 C V d e á c i d o a c é t i c o 100 m M ) . E l p H d e l p r o d u c t o s e a j u s t ó a 6 p a r a d a r 120 m g d e c o n j u g a d o ( r e n d i m i e n t o d e l 60 % ) c o n u n a p u r e z a > 90 % c o n e s p e c i e s d e P M a l t o < 3 % .
Método B
Purificación de mAb por cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC)
S e c a r g ó u n a s o l u c i ó n d e 20 m g / m l d e m A b e n t a m p ó n d e t r i s - a c e t a t o e n u n a c o l u m n a d e i n t e r a c c i ó n h i d r ó f o b a ( T O S O H T S K g e l f e n i l o 7 , 5 x 21 c m ) y s e e l u y ó c o n u n g r a d i e n t e l i n e a l ( 0 - 70 % d e B/ A, s o l v e n t e A : 5 % d e i P r O H , ( n H 4 )2 S O 4 1 M , t a m p ó n d e f o s f a t o 100 m M , p H 6 ,0 ; s o l v e n t e B: i P r O H a l 20 % , t a m p ó n f o s f a t o 100 m M ) . L o s p i c o s d e m o n ó m e r o d e m A b s e r e u n i e r o n , s e c o n c e n t r a r o n ( 5 - 10 m g / m l ) y s e d i a l i z a r o n c o n t r a t a m p ó n d e á c i d o 3 -( N - m o r f o l i n o ) p r o p a n o s u l f ó n i c o ( M O P S ) ( 100 m M , p H 5 , 5 ) .
Reducción parcial con TCEP y conjugación de mAb reducido con análogo de PYY cíclico
A l m A b p u r i f i c a d o ( 27 m l, 9 , 28 m g / m l ) s e le a ñ a d i e r o n 4 e q . d e T C E P s e g u i d o d e E D T A (1 m M ) . D e s p u é s d e 2 h o r a s a t e m p e r a t u r a a m b i e n t e , la L C M S m o s t r ó q u e l o s a d u c t o s d e d i s u l f u r o e n la p o s i c i ó n C 102 s e h a b í a n r e d u c i d o c o m p l e t a m e n t e . E l m A b r e d u c i d o s e t r a t ó c o n u n a c o l u m n a g i r a t o r i a d e d e s a l a c i ó n Z e b r a ( 7 x 10 m l, M W C O 7 K , p r e e q u i l i b r i o c o n M O P S 100 m M p H 5 , 5 ) p a r a e l i m i n a r l a s c i s t e í n a s / G S H l i b e r a d a s . A l a s f r a c c i o n e s c o m b i n a d a s d e l m A b r e d u c i d o ( 28 m l) s e l e s a ñ a d i ó u n a s o l u c i ó n d e p é p t i d o P Y Y e n a g u a d e c a l i d a d Milli Q ( 6 , 5 e q f r e n t e a m A b , 15 - 20 m g / m l ) s e g u i d o d e E D T A (1 m M ) . E l p H d e la r e a c c i ó n s e a j u s t ó d e 7 , 2 a 7 , 4 m e d i a n t e la a d i c i ó n g o t a a g o t a d e N a O H 1 N . S e d e j ó q u e la r e a c c i ó n p r o s i g u i e r a d u r a n t e 18 h o r a s a t e m p e r a t u r a a m b i e n t e c o n a g i t a c i ó n s u a v e . L a r e a c c i ó n c o n t i n u ó d u r a n t e o t r a s 12 h d e s p u é s d e la a d i c i ó n d e 0 , 5 e q u i v d e T C E P a d i c i o n a l e s p a r a r e d u c i r e l d í m e r o d e m A b - m A b f o r m a d o d u r a n t e e l c u r s o d e la r e a c c i ó n y p e r m i t i r la c o n v e r s i ó n a l h o m o d í m e r o d e m A b d e s e a d o . El p H d e la r e a c c i ó n s e r e d u j o a p H 5 , 5 m e d i a n t e la a d i c i ó n d e á c i d o a c é t i c o 2 M y e l c o n j u g a d o b r u t o s e p u r i f i c ó m e d i a n t e c r o m a t o g r a f í a d e i n t e r a c c i ó n h i d r ó f o b a y s e e l u y ó c o n u n g r a d i e n t e l i n e a l ( 0 - 100 % d e B / A , s o l v e n t e A : 5 % d e i P r O H , ( N H 4 ) 2 S O 4 1 M , t a m p ó n d e f o s f a t o 100 m M , p H 6 , 0 ; s o l v e n t e B: 20 % d e i P r O H , t a m p ó n d e f o s f a t o 100 m M ) . L a p u r i f i c a c i ó n f i n a l s e r e a l i z ó m e d i a n t e a d s o r c i ó n d e p r o t e í n a A ( P B S ) y e l u c i ó n ( N a O A c , p H 3 , 5 ) . E l p H d e l p r o d u c t o s e a j u s t ó a 6 y s e d i a l i z ó f r e n t e a P B S p a r a d a r la m u e s t r a f i n a l ( 56 % ) .
A l t e r n a t i v a m e n t e , e l m A b s e r e d u j o c o n G S H y / o C y s . D e s p u é s d e la e l i m i n a c i ó n d e l a g e n t e r e d u c t o r m e d i a n t e f i l t r a c i ó n d e f l u j o t a n g e n c i a l ( T F F ) , s e a ñ a d i ó u n e x c e s o d e l p é p t i d o a l m A b r e d u c i d o o p c i o n a l m e n t e e n p r e s e n c i a d e 0 , 2 - 0 , 5 e q u i v a l e n t e s d e T C E P .
Ejemplo 104: caracterización del conjugado de mAb
Figure imgf000071_0001
-
Figure imgf000072_0002
Ejemplo 105: Ensayos in vitro
S e e v a l u ó la c a p a c i d a d d e l c o m p u e s t o 1 p a r a a c t i v a r r e c e p t o r e s d e N P Y in v i t r o e n c é l u l a s c l ó n a l e s ( H E K o C H O ) q u e e x p r e s a n r e c e p t o r e s Y 2 d e h u m a n o s , r a t a s , r a t o n e s y m o n o s r h e s u s , y r e c e p t o r e s Y 1 , Y 4 e Y 5 h u m a n o s . P Y Y 3 - 36 , N P Y y P P s e i n c l u y e r o n e n e s t o s e n s a y o s c o m o c o n t r o l e s d e l e s t u d i o .
Líneas celulares
Figure imgf000072_0001
A d e m á s , s e o b t u v i e r o n l í n e a s c e l u l a r e s C H O - K 1 d e D i s c o v e r X C o r p o r a t i o n , q u e e x p r e s a n e l r e c e p t o r Y 1 h u m a n o ( N ° d e c a t á l o g o : 93 - 0397 C 2 ) y e l r e c e p t o r Y 4 h u m a n o ( N ° d e c a t á l o g o : 95 - 0087 C 2 ) . L a s c é l u l a s D i s c o v e r X c u l t i v a d a s e n m e d i o F 12 ( G i b c o ) s u p l e m e n t a d o c o n F B S a l 10 % y b a j o la s e l e c c i ó n d e G 418 ( 800 p g / m l ) . E l r e c e p t o r Y 2 d e r a t a s e e x p r e s ó e n u n a l í n e a G l o - S e n s o r C H O - K 1 o b t e n i d a d e P r o m e g a C o r p o r a t i o n . E s t a s c é l u l a s s e t r a n s f e c t a r o n c o n e l p l á s m i d o p G l o S e n s o r ™ - 23 F c A M P p a r a u n e n s a y o d e c A M P b a s a d o e n l u m i n i s c e n c i a , p e r o s e h a b í a n p r o b a d o y v a l i d a d o p a r a s u u s o c o n e l e n s a y o d e c A M P d e P e r k i n - E l m e r L A N C E . L a s c é l u l a s Y 2 d e r a t a s e c u l t i v a r o n e n m e d i o F 12 ( G i b c o ) s u p l e m e n t a d o c o n F b S a l 10 % y 800 p g / m l d e G 418.
T o d a s l a s l í n e a s c e l u l a r e s s e a l m a c e n a r o n e n v i a l e s ( 4 x 106 c é l u l a s / v i a l ) y s e a l m a c e n a r o n e n n i t r ó g e n o l í q u i d o h a s t a s u u s o . E l d í a a n t e s d e l e n s a y o , l o s v i a l e s s e d e s c o n g e l a r o n y s e a ñ a d i e r o n a 15 m l d e m e d i o a p r o p i a d o . L a s c é l u l a s s e c e n t r i f u g a r o n a 450 x g d u r a n t e 5 m in , l o s s o b r e n a d a n t e s s e a s p i r a r o n y l a s c é l u l a s s e v o l v i e r o n a s u s p e n d e r e n m e d i o s i n G 418 a u n a d e n s i d a d d e 0 , 2 x 106 c é l u l a s / m l . L a s c é l u l a s s e d i s p e n s a r o n ( 25 p l / p o c i l l o ) e n p l a c a s b l a n c a s d e 384 p o c i l l o s r e c u b i e r t a s c o n c o l á g e n o B i o c o a t h a s t a u n a d e n s i d a d f i n a l d e 5000 c é l u l a s / p o c i l l o . L a s p l a c a s d e l a s c é l u l a s s e i n c u b a r o n d u r a n t e la n o c h e e n u n a i n c u b a d o r a d e c u l t i v o d e t e j i d o h u m i d i f i c a d a a 37 ° C b a j o u n a a t m ó s f e r a d e 5 % d e C O 2 / 90 % d e O 2.
Protocolo experimental
E l e n s a y o d e c A M P f u e e l m i s m o p a r a l o s v a r i o s e n s a y o s d e r e c e p t o r e s . S e u s ó e l kit L A N C E c A M P ( P e r k i n E l m e r C o r p o r a t i o n ; W a l t h a m , M A ) e n t o d o s l o s e x p e r i m e n t o s p a r a c u a n t i f i c a r l o s n i v e l e s i n t r a c e l u l a r e s d e c A M P . El d í a d e l e n s a y o , s e d e c a n t ó e l m e d i o c e l u l a r d e l a s c é l u l a s y s e a ñ a d i e r o n a l o s p o c i l l o s 6 pl d e p é p t i d o s ( c o n c e n t r a c i ó n 2 X ) . L o s p é p t i d o s s e p r e p a r a r o n c o m o u n a r e s p u e s t a a la d o s i s d e 11 p u n t o s ( c o m e n z a n d o a l 00 n M o 10 p M c o n d i l u c i o n e s e n s e r i e 1 : 3 ) e n t a m p ó n d e e s t i m u l a c i ó n . E l t a m p ó n d e e s t i m u l a c i ó n c o n s i s t e d e H E P E S 5 m M ( á c i d o 4 -( 2 - h i d r o x i e t i l ) - 1 - p i p e r a z i n e t a n o s u l f ó n i c o ) , I B M X 500 p M y a l b ú m i n a d e s u e r o b o v i n o ( B S A ) a l 0 , 1 % e n H B S S ( s o l u c i ó n s a l i n a e q u i l i b r a d a d e H a n k ) . L u e g o , s e a ñ a d i e r o n a l a s c é l u l a s 6 pl d e t a m p ó n d e e s t i m u l a c i ó n q u e c o n t e n í a f o r s k o l i n a ( 2 X , c o n c e n t r a c i ó n f i n a l 5 p M ) y a n t i c u e r p o L A N C E c A M P ( 1 : 100 ) . D e s p u é s d e la i n c u b a c i ó n d u r a n t e 25 m i n u t o s a t a , s e a ñ a d i e r o n 12 pl d e m e z c l a d e d e t e c c i ó n d e e n s a y o a c a d a p o c i l l o . L a m e z c l a d e d e t e c c i ó n s e p r e p a r ó d i l u y e n d o b i o t i n a - c A M P ( 1 : 750 ) y e u r o p i o - W 8044 ( 1 : 2250 ) e n t a m p ó n d e d e t e c c i ó n c o m o s e p r o p o r c i o n a c o n e l kit L A N C E c A M P . L a p l a c a s e i n c u b ó d u r a n t e 2 h o r a s a t a y l u e g o s e l e y ó c o m o u n e n s a y o T R -F R E T e n e l l e c t o r d e p l a c a s E n v i s i o n ( e x c i t a c i ó n 320 n m , e m i s i ó n 615 n m y 665 n m ) . L a f l u o r e s c e n c i a d e l c a n a l 1 ( u n i d a d e s f l u o r e s c e n t e s r e l a t i v a s a 615 n m ) y la f l u o r e s c e n c i a d e l c a n a l 2 ( u n i d a d e s f l u o r e s c e n t e s r e l a t i v a s a 665 n m ) j u n t o c o n s u r e l a c i ó n s e e x p o r t a r o n a u n a r c h i v o d e E x c e l .
Análisis de los datos
Figure imgf000073_0001
Tabla 2: datos in vitro
Figure imgf000073_0002
Tabla 3: EC5ode isoforma humana in vitro es ecies cruzadas
Figure imgf000073_0003
n i n i n
Figure imgf000074_0001
Ejemplo 106: Ensayo de estabilidad en ratón in vivo
S e o b t u v i e r o n r a t o n e s m a c h o C 57 B L / 6 N ( 9 - 12 s e m a n a s d e e d a d ) d e T a c o n i c L a b o r a t o r y . L o s r a t o n e s s e a l o j a r o n u n r a t ó n p o r j a u l a c o n r o p a d e c a m a A l p h a D r i e n u n a h a b i t a c i ó n c o n t e m p e r a t u r a c o n t r o l a d a c o n u n c i c l o d e l u z / o s c u r i d a d d e 12 h. S e p e r m i t i ó a l o s r a t o n e s a c c e s o a v o l u n t a d a l a g u a y s e m a n t u v i e r o n c o n u n a d i e t a d e p i e n s o ( 5001, L a b D ie t) .
A l o s r a t o n e s s e l e s d o s i f i c ó p o r v í a s u b c u t á n e a 1 m g / k g d e c o m p u e s t o . S e r e c o g i e r o n a p r o x i m a d a m e n t e 100 |jl d e s a n g r e d e 3 a n i m a l e s e n t = 4 , 24 y 48 h o r a s m e d i a n t e u n c o r t e d e c o l a . T a m b i é n s e r e c o g i ó s a n g r e ( a p r o x i m a d a m e n t e 600 j l ) d e 2 - 3 a n i m a l e s p o r p u n t o t e m p o r a l e n t = 4 , 24 y 48 h o r a s m e d i a n t e p u n c i ó n c a r d í a c a . L a s m u e s t r a s d e s a n g r e s e r e c o g i e r o n e n t u b o s K 3 E ( E D T A ) q u e c o n t e n í a n u n a p r o p o r c i ó n d e l 4 % d e s o l u c i ó n i n h i b i d o r a d e p r o t e a s a c o m p l e t a y u n a p r o p o r c i ó n d e l 1 % d e i n h i b i d o r d e D P P I V . L a s m u e s t r a s d e s a n g r e s e c o l o c a r o n e n h i e l o h ú m e d o a n t e s d e c e n t r i f u g a r l a s a 10.000 r p m d u r a n t e 10 m i n u t o s e n c o n d i c i o n e s d e r e f r i g e r a c i ó n ( ~ 5 ° C ) p a r a e l i m i n a r l a s c é l u l a s e n e l p l a z o d e l o s 30 m i n u t o s s i g u i e n t e s a la r e c o g i d a e n c a d a p u n t o t e m p o r a l y t o d o e l p l a s m a d i s p o n i b l e s e t r a n s f i r i ó a u n a p l a c a d e 96 p o c i l l o s . L a p l a c a d e p o c i l l o s s e a l m a c e n ó e n u n c o n g e l a d o r a -80 ° C . L o s n i v e l e s d e c o m p u e s t o s e m i d i e r o n u s a n d o e l m é t o d o L C M S q u e s e d e s c r i b e a c o n t i n u a c i ó n . L o s d a t o s s e m u e s t r a n e n la T a b l a 4.
Ensayos de espectrometría de masas para la determinación del % restante de conjugado intacto
L a s m u e s t r a s d e p l a s m a s e p r o c e s a r o n m e d i a n t e c a p t u r a d e i n m u n o a f i n i d a d u s a n d o u n a n t i c u e r p o F c a n t i h u m a n o , s e g u i d o d e a n á l i s i s d e M s d e b a r r i d o c o m p l e t o d e a l t a r e s o l u c i ó n d e L C d e f a s e i n v e r s a e n u n e s p e c t r ó m e t r o d e m a s a s d e T O F ( t i e m p o d e v u e l o tr ip l e ) . L o s e s p e c t r o s d e M S s i n p r o c e s a r s e d e c o n v o l u c i o n a r o n p a r a d i l u c i d a r l o s p e s o s m o l e c u l a r e s d e l o s c o m p o n e n t e s e n l a s m u e s t r a s i n y e c t a d a s . E l p i c o d e l io n d e la m o l é c u l a d e l c o n j u g a d o i n t a c t o s e u s ó p a r a la c u a n t i f i c a c i ó n d e l c o n j u g a d o i n t a c t o s i n c a m b i o s . E n u n e n s a y o s e p a r a d o , s e p r o c e s a r o n l a s m u e s t r a s d e p l a s m a m e d i a n t e c a p t u r a d e i n m u n o a f i n i d a d u s a n d o u n a n t i c u e r p o a n t i - F c h u m a n o , s e g u i d o d e d i g e s t i ó n c o n t r i p s i n a y a n á l i s i s d e L C - M S M S d e f a s e i n v e r s a e n u n e s p e c t r ó m e t r o d e m a s a s d e t r i p l e c u a d r u p o l o . S e m o n i t o r i z ó u n p é p t i d o l o c a l i z a d o e n F c d e l m A b p a r a la c u a n t i f i c a c i ó n d e l m A b t o t a l . P a r a a m b o s e n s a y o s , l a s m u e s t r a s d e c u r v a e s t á n d a r y d e c o n t r o l d e c a l i d a d s e p r e p a r a r o n a ñ a d i e n d o e l e s t á n d a r d e r e f e r e n c i a e n p l a s m a y s e p r o c e s a r o n u s a n d o e l m i s m o p r o c e d i m i e n t o a l m i s m o t i e m p o q u e l a s m u e s t r a s o b t e n i d a s . S e c a l c u l ó q u e la p r o p o r c i ó n e n t r e la c o n c e n t r a c i ó n d e c o n j u g a d o i n t a c t o y la d e m A b t o t a l e r a e l % r e s t a n t e .
Tabla 4: Datos de estabilidad del ratón in vivo
Figure imgf000074_0002
n i n i n
Figure imgf000075_0002
Ejemplo 107: Farmacocinética (PK)PK del ratón DIO
Figure imgf000075_0001
PK de mono Cynomolgus (Cyno)
T o d o s l o s a n i m a l e s s e m a n t u v i e r o n e n a y u n a s d u r a n t e p o r lo m e n o s o c h o h o r a s a n t e s d e la d o s i f i c a c i ó n y d u r a n t e l a s p r i m e r a s c u a t r o h o r a s d e r e c o g i d a d e m u e s t r a s d e s a n g r e . T r e s a n i m a l e s r e c i b i e r o n u n a ú n i c a d o s i s i V d e 1 m g / k g d e C o m p u e s t o 1 y t r e s a n i m a l e s r e c i b i e r o n u n a ú n i c a d o s i s S C d e 1 m g / k g d e C o m p u e s t o 1. S e e x t r a j o s a n g r e a n t e s d e la d o s i s y a l d e 1, 6 , 10 , 24 , 36 , 48 , 72 , 120 , 168 , 240 , 336 , 432 y 504 h o r a s d e s p u é s d e la d o s i s . S e r e c o g i ó u n a m u e s t r a a d i c i o n a l 0 , 5 h o r a s d e s p u é s d e la d o s i s p a r a e l g r u p o IV. S e r e c o g i ó a p r o x i m a d a m e n t e 1 m l d e s a n g r e d e c a d a a n i m a l e n t u b o s S a r s t e d t M i c r o v e t t e ® r e c u b i e r t o s c o n K 3 E ( E D T A ) q u e c o n t e n í a n u n a p r o p o r c i ó n d e l 4 % d e s o l u c i ó n i n h i b i d o r a d e p r o t e a s a c o m p l e t a y u n a p r o p o r c i ó n d e l 1 % d e i n h i b i d o r d e D P P I V . L a s m u e s t r a s d e s a n g r e s e c o l o c a r o n e n h i e l o h ú m e d o a n t e s d e s e r c e n t r i f u g a d a s e n e l p l a z o d e l o s 30 m i n u t o s p o s t e r i o r e s a la r e c o g i d a e n c a d a p u n t o t e m p o r a l y e l p l a s m a r e s u l t a n t e s e d i v i d i ó e n t e r c i o s y s e t r a n s f i r i ó a u n a p l a c a d e 96 p o c i l l o s p o r t r i p l i c a d o . L a p l a c a d e p o c i l l o s s e a l m a c e n ó e n h i e l o s e c o h a s t a q u e s e c o l o c ó e n u n c o n g e l a d o r a - 80 ° C . L o s d a t o s s e m u e s t r a n e n la T a b l a 7 y la F i g u r a 4.
Ensayo de espectrometría de masas intacta para la determinación de niveles en plasma
L a s m u e s t r a s d e p l a s m a s e p r o c e s a r o n m e d i a n t e c a p t u r a d e i n m u n o a f i n i d a d u s a n d o u n a n t i c u e r p o d e F c a n t i h u m a n o , s e g u i d o d e a n á l i s i s d e M S d e b a r r i d o c o m p l e t o d e a l t a r e s o l u c i ó n d e L C d e f a s e i n v e r s a e n u n e s p e c t r ó m e t r o d e m a s a s d e T O F ( t i e m p o d e v u e l o ) t r ip l e . S e d e c o n v o l u c i o n a r o n l o s e s p e c t r o s d e M S s i n p r o c e s a r p a r a d i l u c i d a r l o s p e s o s m o l e c u l a r e s d e l o s c o m p o n e n t e s e n l a s m u e s t r a s i n y e c t a d a s . P a r a la c u a n t i f i c a c i ó n s e u s ó e l p i c o d e l io n d e la m o l é c u l a d e l c o n j u g a d o i n t a c t o . S e p r e p a r a r o n m u e s t r a s d e c o n t r o l d e c a l i d a d y c u r v a s e s t á n d a r a ñ a d i e n d o e l e s t á n d a r d e r e f e r e n c i a e n p l a s m a y s e p r o c e s a r o n u s a n d o e l m i s m o p r o c e d i m i e n t o a l m i s m o t i e m p o q u e l a s m u e s t r a s o b t e n i d a s . L o s d a t o s d e P K p a r a r a t ó n D I O , r a t a y c y n o s e m u e s t r a n e n la T a b l a 5, la T a b l a 6 y la T a b l a 7 , r e s p e c t i v a m e n t e . L o s d a t o s P K p a r a r a t ó n D I O y C y n o t a m b i é n s e m u e s t r a n e n l a s F i g u r a s 3 y 4 , r e s p e c t i v a m e n t e .
Tabla 5: PK en Ratón DIO
Figure imgf000076_0004
Tabla 6: PK en rata
Figure imgf000076_0003
Tabla 7: PK en C no
Figure imgf000076_0005
Ejemplo 108: Estudios de eficacia in vivo
Pérdida de peso en ratones obesos inducidos por dieta (DIO): dosis aguda
Figure imgf000076_0001
E l d í a a n t e s d e la d o s i f i c a c i ó n , l o s r a t o n e s s e a g r u p a r o n e n c o h o r t e s d e o c h o a n i m a l e s e n b a s e a l o s p e s o s c o r p o r a l e s i n d i v i d u a l e s . A l a s 3 : 00 - 4 : 00 p m d e l d í a s i g u i e n t e , l o s a n i m a l e s f u e r o n p e s a d o s y t r a t a d o s c o n v e h í c u l o ( d P B S , p H 7.2 ) , C o m p u e s t o 1 a u n a d o s i s d e 0 , 1, 0 ,3 , 1, 0 , 3 , 0 o 7 , 5 n m o l / k g , o D u l a g l u t i d a e n 0 , 3 n m o l / k g m e d i a n t e a d m i n i s t r a c i ó n s u b c u t á n e a ( s . c . ) . S e m i d i e r o n l o s p e s o s c o r p o r a l e s y la i n g e s t a d e a l i m e n t o s 24 h, 48 h y 72 h d e s p u é s d e la d o s i f i c a c i ó n y s e c a l c u l a r o n l o s p o r c e n t a j e s d e p é r d i d a d e p e s o y r e d u c c i ó n d e la i n g e s t a d e a l i m e n t o s . L o s a n á l i s i s e s t a d í s t i c o s s e r e a l i z a r o n u s a n d o A N O V A d e m e d i d a s r e p e t i d a s b i d i r e c c i o n a l c o n la p r u e b a p o s t e r i o r d e T u k e y e n P r i s m . T o d o s l o s d a t o s s e p r e s e n t a n c o m o la m e d i a ± S E M ( F i g u r a 5 y F i g u r a 6).
Pérdida de peso en ratones obesos inducidos por dieta: dosis crónica
Figure imgf000076_0002
E l d í a a n t e s d e la d o s i f i c a c i ó n , l o s r a t o n e s s e a g r u p a r o n e n b a s e a l p e s o c o r p o r a l i n d i v i d u a l . A l a s 3 : 00 - 4 : 00 p m d u r a n t e c a d a u n o d e l o s s i g u i e n t e s 8 d í a s , s e p e s a r o n l o s a n i m a l e s y la i n g e s t a d e a l i m e n t o s . L o s a n i m a l e s s e t r a t a r o n c o n v e h í c u l o ( d P B S , p H 7 , 2 ) o d u l a g l u t i d a a 0 , 3 n m o l / k g m e d i a n t e a d m i n i s t r a c i ó n s u b c u t á n e a t o d o s l o s d í a s o C o m p u e s t o 1 a d o s i s d e 0 , 1, 0 ,3 , 1, 0 , 3 , 0 n m o l / k g m e d i a n t e a d m i n i s t r a c i ó n s u b c u t á n e a c a d a t r e s d í a s . D e s p u é s d e 8 d í a s , l o s r a t o n e s s e d e j a n e n a y u n a s d u r a n t e 5 h o r a s y l u e g o s e l e s a d m i n i s t r a u n b o l o d e g l u c o s a d e 2 g / k g p o r v í a o r a l e n t= 0. E n t= 0 , 30 , 60 , 90 y 120 m i n u t o s d e s p u é s d e l d e s a f í o d e g l u c o s a s e m i d e la g l u c o s a e n s a n g r e y e n t = 0 , 30 y 90 m i n u t o s s e e x t r a e s a n g r e p a r a m e d i r la i n s u l i n a e n p l a s m a . L o s a n á l i s i s e s t a d í s t i c o s s e r e a l i z a r o n u s a n d o A N O V A u n i d i r e c c i o n a l o A N O V A d e m e d i d a s r e p e t i d a s b i d i r e c c i o n a l c o n la p r u e b a p o s t e r i o r d e T u k e y e n P r i s m . T o d o s l o s d a t o s s e p r e s e n t a n c o m o la m e d i a ± S E M ( F i g u r a 7 , F i g u r a 8 y T a b l a s 8 - 11 ) .
Figure imgf000077_0001
Figure imgf000078_0001
Tabla 10: Efecto del compuesto 1 sobre los niveles de insulina (ng/ml) durante una OGTT después de 8 días de tratamiento
Figure imgf000079_0002
Tabla 11: Efecto del compuesto 1 sobre los niveles de glucosa en sangre (mg/dl) después de 8 días de tratamiento
Figure imgf000079_0003
Pérdida de peso en ratones obesos inducidos por dieta en combinación con liraglutida: dosis crónica
Figure imgf000079_0001
E l d í a a n t e s d e la d o s i f i c a c i ó n , s e m i d i ó la c o m p o s i c i ó n c o r p o r a l m e d i a n t e M R I y l o s r a t o n e s s e a g r u p a r o n e n b a s e a l p e s o c o r p o r a l i n d i v i d u a l . E l d í a 0 a l a s 3 : 00 - 4 : 00 p m , s e p e s a r o n l o s a n i m a l e s y la i n g e s t a d e a l i m e n t o s . L o s a n i m a l e s e n l o s g r u p o s d e t r a t a m i e n t o ú n i c o s e t r a t a r o n c o n v e h í c u l o ( d P B S , p H 7 , 2 ) o l i r a g l u t i d a a 10 n o m o l / k g m e d i a n t e a d m i n i s t r a c i ó n s u b c u t á n e a t o d o s l o s d í a s o C o m p u e s t o 1 a d o s i s d e 0 , 1 o 1 , 0 n m o l / k g m e d i a n t e a d m i n i s t r a c i ó n s u b c u t á n e a c a d a t r e s d í a s . L o s a n i m a l e s d e l o s g r u p o s d e c o m b i n a c i ó n r e c i b i e r o n l i r a g l u t i d a ( 10 n m o l / k g ) d i a r i a m e n t e y e l c o m p u e s t o 1 a d o s i s d e 0 , 1 o 1 , 0 n m o l / k g c a d a t r e s d í a s . E l d í a 8, s e m i d i ó la c o m p o s i c i ó n c o r p o r a l m e d i a n t e r e s o n a n c i a m a g n é t i c a . E l d í a 9, l o s r a t o n e s s e m a n t u v i e r o n e n a y u n a s d u r a n t e 5 h o r a s y s e m i d i e r o n la g l u c o s a e n s a n g r e y la i n s u l i n a e n a y u n a s . L o s a n á l i s i s e s t a d í s t i c o s s e r e a l i z a r o n u s a n d o A N O V A u n i d i r e c c i o n a l o A N O V A d e m e d i d a s r e p e t i d a s b i d i r e c c i o n a l c o n la p r u e b a p o s t e r i o r d e T u k e y e n P r i s m . T o d o s l o s d a t o s s e p r e s e n t a n c o m o m e d i a ± S E M ( F i g u r a 9 y T a b l a s 12 - 17 ) .
Tabla 12: Efecto del compuesto 1, liraglutida y combinaciones de compuesto 1 y liraglutida sobre la ingesta
Figure imgf000080_0002
Tabla 13: Efecto del compuesto 1, liraglutida y combinaciones de compuesto 1 y liraglutida sobre el peso cor oral durante 9 días de tratamiento.
Figure imgf000080_0003
Tabla 14: Comparación del compuesto 1 codosificado y liraglutida sobre el porcentaje de cambio de peso corporal frente a la suma del porcentaje de cambio de peso corporal del compuesto 1 o liraglutida dosificado solo en el día
9.
Figure imgf000080_0001
p r e s e n t a n c o m o la m e d i a ± S E M ( T a b l a s 18 - 20 ) .
Tabla 18: Efecto de una dosis única del compuesto 1 sobre la ingesta diaria de alimentos y el consumo total de lim n r n r í n r r -D wl .
Figure imgf000082_0001
Tabla 19: Efecto de una dosis única del compuesto 1 sobre el peso corporal absoluto durante tres días en ratas S ra ue-Dawle .
Figure imgf000082_0003
Tabla 20: Efecto de una dosis única del compuesto 1 sobre el cambio de peso corporal durante tres días en ratas S ra ue-Dawle .
Figure imgf000082_0002
Ejemplo 110: Efectos del compuesto 1, solo o en combinación con liraglutida, en macacos rhesus obesos
S e e v a l u ó la c a p a c i d a d d e l c o m p u e s t o 1 p a r a r e d u c i r la i n g e s t a d e a l i m e n t o s e n m a c a c o s r h e s u s o b e s o s . T a m b i é n s e e v a l u ó la e f i c a c i a a d i c i o n a l o b s e r v a d a c u a n d o s e c o a d m i n i s t r a l i r a g l u t i d a c o n u n a d o s i s e f i c a z d e l c o m p u e s t o 1. E n p r i m e r l u g a r , s e r e a l i z ó u n e s t u d i o a b r e v i a d o d e i n t e r v a l o d e d o s i s p a r a d e t e r m i n a r la d o s i s d e l i r a g l u t i d a q u e s e u s a r á d u r a n t e la c o a d m i n i s t r a c i ó n . S e i s a n i m a l e s r e c i b i e r o n u n a ú n i c a a d m i n i s t r a c i ó n s c d i a r i a d e s o l u c i ó n s a l i n a d u r a n t e t r e s s e m a n a s . L a i n g e s t a d e a l i m e n t o s s e m i d i ó d i a r i a m e n t e y la i n g e s t a d e a l i m e n t o s d e r e f e r e n c i a s e e s t a b l e c i ó c o m o la i n g e s t a d i a r i a m e d i a d u r a n t e l a s t r e s s e m a n a s d e t r a t a m i e n t o c o n v e h í c u l o . L u e g o , l o s s e i s a n i m a l e s s e d i v i d i e r o n e n d o s g r u p o s ; 0 , 01 m g / k g ( n = 3 ) y 0 , 02 m g / k g ( n = 3 ) . C a d a u n o r e c i b i ó u n a d o s i s s u b c u t á n e a d i a r i a d e l i r a g l u t i d a d u r a n t e u n a s e m a n a p a r a d e t e r m i n a r l o s e f e c t o s s o b r e la i n g e s t a d e a l i m e n t o s c o n r e s p e c t o a l v a l o r d e r e f e r e n c i a y p a r a i d e n t i f i c a r u n a d o s i s m á x i m a t o l e r a b l e . T a m b i é n s e m i d i ó la i n g e s t a d e a l i m e n t o s d u r a n t e d o s s e m a n a s d e s p u é s d e s u s p e n d e r e l t r a t a m i e n t o c o n l i r a g l u t i d a . T o d o s l o s d a t o s s e p r e s e n t a n c o m o la i n g e s t a m e d i a s e m a n a l d e a l i m e n t o s ± S E M ( F i g u r a 10 ) .
S e u s a r o n d i e z ( 10 ) m a c a c o s r h e s u s o b e s o s p a r a e v a l u a r la e f i c a c i a d e l c o m p u e s t o 1. D e s p u é s d e u n p e r í o d o d e r e f e r e n c i a d e 2 s e m a n a s , e l c o m p u e s t o 1 s e a d m i n i s t r ó s . c . d i a r i a m e n t e d u r a n t e 4 s e m a n a s . S e d o s i f i c ó a l o s a n i m a l e s d u r a n t e 7 d í a s a 0 , 01 m g / k g , l u e g o 7 d í a s a 0 , 03 m g / k g , l u e g o 9 d í a s a 0 , 015 m g / k g y f i n a l m e n t e 5 d í a s d e c o d o s i f i c a c i ó n d e l c o m p u e s t o 1 a 0 , 015 m g / k g e n c o m b i n a c i ó n c o n l i r a g l u t i d a a 0 , 01 m g / k g . L a i n g e s t a d e a l i m e n t o s s e m o n i t o r i z ó d i a r i a m e n t e y e l p e s o c o r p o r a l s e m i d i ó s e m a n a l m e n t e . L o s n i v e l e s d e g l u c o s a , i n s u l i n a , c o l e s t e r o l t o t a l , H D L , L D L , A L T y A S T s e e v a l u a r o n a l in ic io d e l e s t u d i o , d e s p u é s d e l t r a t a m i e n t o c o n e l c o m p u e s t o 1 y d e s p u é s d e l t r a t a m i e n t o c o m b i n a d o . T o d o s l o s d a t o s s e p r e s e n t a n c o m o la m e d i a ± S E M ( T a b l a s 21 - 22 y F i g u r a s 11 y 12 ) .
Tabla 21: Efecto del compuesto 1 con adición de liraglutida sobre la ingesta de alimentos en macacos rhesus obesos
Figure imgf000083_0002
Tabla 22: Ef l m 1 n i i n lir l i r l r r l n m rh besos
Figure imgf000083_0003
A N O V A u n i d i r e c c i o n a l R M , p r u e b a d e c o m p a r a c i ó n m ú l t i p l e d e D u n n e t t
L o s e j e m p l o s d e s e c u e n c i a s d e P Y Y c í c l i c a s o c o n j u g a d o s d e l a s m i s m a s d e la i n v e n c i ó n i n c l u y e n :
S E Q ID N O : 1
N o m b r e : [ C i c l o -( p A 2 - C O C H 2 - h C 31 ) , K ( P E G 12 - A c B r ) 11, p s / -( 35 R , 36 Y ) ] - P Y Y 2 - 36
E s t r u c t u r a :
Figure imgf000083_0001
Figure imgf000085_0001
E s t r u c t u r a :
Figure imgf000086_0001
Figure imgf000087_0001
SEQ ID NO: 15
Nombre: [ciclo-(K4-CO(CH2)2NHCOCH2-hC31), K(Y-Glu-Pal)30]-PYY4-36
Estructura:
Figure imgf000088_0001
SEQ ID NO: 18
Nombre: [ciclo-(I3-m-COPhCH2-hC31), E4, K(Y-Glu-Pal)30]-PYY3-36
Estructura:
Figure imgf000089_0001
SEQ ID NO: 21
Nombre: [ciclo-(I3-m-COPhCH2-hC31), A4, A26, K(Y-Glu-Pal)30]-PYY3-36
Estructura:
Figure imgf000090_0001
SEQ ID NO: 24
Nombre: [dclo-(I3-m-COPhCH2-hC31), K((OEG)2-Y-Glu-COCi8CO2H)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Estructura:
Figure imgf000091_0001
S E Q ID N O : 27
Figure imgf000092_0002
S E Q ID N O : 29
N o m b r e : [ c i c l o -( K 4 - C O ( C H 2 ) 2 N H C O C H 2 - h C 31 ) , K ( Y - G l u - P a l ) 30 , p s i -( R 35 , Y 36 ) ] - P Y Y 4 - 36 E s t r u c t u r a :
Figure imgf000092_0001
S E Q ID N O : 30
N o m b r e : [ c i d o -( K 4 - C O ( C H 2 ) s N H C O C H 2 - C 31 ) , K ( Y - G l u - P a l ) 30 , p s i -( R 35 , Y 36 ) ] - P Y Y 4 - 36
E s t r u c t u r a :
Figure imgf000093_0001
E s t r u c t u r a :
Figure imgf000094_0001
SEQ ID NO: 36
Nombre: [ciclo-(K4-CO(CH2)2NHCOCH2-hC31), K(Y-Glu-Pal)30, (N-Me-R35), psi-(R35,Y36)]-PYY4-36 Estructura:
Figure imgf000095_0001
SEQ ID NO: 39
Nombre: [cido-(I3-m-COPhCH2-hC31), S4, K(Y-Glu-Arach)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
Estructura:
Figure imgf000096_0001
SEQ ID NO: 42
Nombre: [ciclo-(I3-CO(CH2)2triazolyl-Nle31), K((OEG)2-Y-Glu-COCiaCO2H)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Estructura:
Figure imgf000097_0001
SEQ ID NO: 45
Nombre: [ciclo-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(COCH2CH2(OCH2CH2)24NH-Y-Glu-Pal)11, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Estructura:
Figure imgf000098_0001
SEQ ID NO: 48
Nombre: [ciclo-(I3-m-COPhCH2-hC31), K((OEG)2-Y-Glu-COCi6CO2H)22, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Estructura:
Figure imgf000099_0001
SEQ ID NO: 51
Nombre: [dclo-(I3-m-COPhCH2-hC31), S4, K(Y-Glu-Pal)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
Estructura:
Figure imgf000100_0001
SEQ ID NO: 54
Nombre: [ciclo-(I3-m-COPhCH2-hC31), K((OEG)2-Y-Glu-Pal)11, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36
Estructura:
Figure imgf000101_0001
SEQ ID NO: 57
Nombre: [ciclo-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(Y-Glu-CO(CH2)2PhO-(2,4-Cl2Ph)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Estructura:
Figure imgf000102_0001
Figure imgf000103_0001
SEQ ID NO: 63
Nombre: [ciclo-(I3-m-COPhCH2- hC31), K(Y-Glu-CO(CH2)is-CFs)30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Estructura:
Figure imgf000104_0001
SEQ ID NO: 66
Nombre: [ciclo-(I3-m-COPhCH2-hC31), K(Y-Glu-CO(CH2)io-(2,4-(CFs)2-Ph))30, psi-(R35,Y36)]-PYY3-36 Estructura:
Figure imgf000105_0001
S E Q ID N O : 69
N o m b r e : [ c i c l o -( G 2 - E 31 ) , S 4 , K 11, p s i -( R 35 , Y 36 ) ] - P Y Y 2 - 36
E s t r u c t u r a :
Figure imgf000106_0001
S E Q ID N O : 70
N o m b r e : [ c i c l o -( G 2 - E 30 ) , S 4 , K 11, p s i -( R 35 , Y 36 ) ] - P Y Y 2 - 36
E s t r u c t u r a :
Figure imgf000106_0002
S E Q ID N O : 71
N o m b r e : [ c i c l o -( G 2 - E 30 ) , S 4 , K 11, ( N - M e - R 35 ) ] - P Y Y 3 - 36
E s t r u c t u r a :
Figure imgf000106_0003
SEQ ID NO: 72
Nombre: [ciclo-(G2-E30), S4, K((OEG)2-Y-Glu-COC1aCO2H)11, psi-(R35,Y36)]-PYY2-36
Estructura:
Figure imgf000107_0001
SEQ ID NO: 75
Nombre: [Ciclo-(I3-COCH2-C31), K(PEG12-AcBr)11, ps/-(R35,Y36)]-PYY3-36
Estructura:
Figure imgf000108_0001
S E Q ID N O : 79
N o m b r e : [ C i c l o -( p A 2 - C O C H 2 - h C 31 ) , K ( P E G 12 - A c B r ) 11, N - M e - R 35 , p s / -( R 35 , 36 Y ) ] - P Y Y 2 - 36
E s t r u c t u r a :
Figure imgf000109_0001
SEQ ID NO: 82
Nombre: [Ciclo-(K4-OEG-COCH2-C31), K(PEG12-AcBr)11, ps/-(R35,Y36)]-PYY4-36
Estructura:
Figure imgf000110_0001
SEQ ID NO: 85
Nombre: [Ciclo-(pA2-COCH2-hC31), K(PEG12-AcBr)23, ps/-(R35,Y36)]-PYY2-36,
Estructura:
Figure imgf000111_0001
S E Q ID N O : 89
N o m b r e : [ C i c l o -( G 2 - C O C H 2 - C 30 ) , K ( P E G 12 - A c B r ) 11, N - M e - R 35 ] - P Y Y 2 - 36 E s t r u c t u r a :
Figure imgf000112_0001
S E Q ID N O : 92
N o m b r e : [ C i c l o -( p A 2 - C O C H 2 - h C 31 ) , K ( P E G 12 - A c B r ) 11, N - M e - R 35 ] P Y Y 2 - 36 E s t r u c t u r a :
Figure imgf000113_0001
S E Q ID N O : 93
N o m b r e : [ C i c l o -( G 2 - C O C H 2 - h C 30 ) , K ( P E G 12 - A c B r ) 11, p s / -( R 35 , Y 36 ) ] - P Y Y 2 - 36 E s t r u c t u r a :
Figure imgf000113_0002
S E Q ID N O : 94
N o m b r e : [ C i c l o -( P A 2 - C O C H 2 - C 30 ) , K ( P E G 12 - A c B r ) 11, p s / -( R 35 , Y 36 ) ] - P Y Y 2 - 36 E s t r u c t u r a :
Figure imgf000113_0003
SEQ ID NO: 95
Nombre: [Ciclo-(G2-E30), S4, K(AcBr)11, ps/-(R35,Y36)]-PYY2-36 Estructura:
Figure imgf000114_0001
S E Q ID N O : 96
N o m b r e : [ C i c l o -( p A 2 - C O C H 2 - h C 31 ) , K ( P E G 24 - A c B r ) 11, p s / -( R 35 , Y 36 ) ] - P Y Y 2 - 36 E s t r u c t u r a :
Figure imgf000114_0002
S E Q ID N O : 97
N o m b r e : [ C i c l o -( G 2 - A c - h C 31 ) , K ( P E G 12 - A c B r ) 11, p s / -( R 35 - Y 36 ) ] - P Y Y 2 - 36 E s t r u c t u r a :
Figure imgf000114_0003
S E Q ID N O : 98
N o m b r e : [ C i c l o -( G 2 - C O C H 2 - C 30 ) , K ( A c B r ) 11, N - M e - R 35 ] - P Y Y 2 - 36 E s t r u c t u r a :
Figure imgf000115_0001
S E Q ID N O : 102
N o m b r e : [ C i c l o -( p A 2 - C O C H 2 - h C 31 ) , K ( P E G 12 ) 11, p s / -( 35 R , 36 Y ) ] - P Y Y 2 - 36 m A b h o m o d í m e r o c o n j u g a d o ( C o m p u e s t o 1 )
E s t r u c t u r a :
Figure imgf000116_0001
Figure imgf000117_0001
S E Q ID N O : 106
N o m b r e : [ C i c l o -( p A 2 - C O C H 2 - h C 31 ) , K ( P E G 12 ) 11, K ( m P E G 16 ) 30 , p s / -( R 35 , Y 36 ) ] - P Y Y 2 - 36 m A b h o m o d í m e r o c o n j u g a d o ( C o m p u e s t o 5 )
E s t r u c t u r a :
Figure imgf000117_0002
S E Q ID N O : 107
N o m b r e : [ C i c l o -( p A 2 - C O C H 2 - h C 31 ) , K 11, K ( m P E G I 2 ) 20 , p s / -( R 35 , Y 36 ) ] - P Y Y 2 - 36 m A b h o m o d í m e r o c o n j u g a d o ( C o m p u e s t o 6 )
E s t r u c t u r a :
Figure imgf000117_0003
S E Q ID N O : 108
N o m b r e : [ C i c l o -( p A 2 - C O C H 2 - h C 31 ) , K ( P E G 12 ) 11, ( N - M e ) Q 34 , p s / -( R 35 , Y 36 ) ] - P Y Y 2 - 36 m A b h o m o d í m e r o c o n j u g a d o ( C o m p u e s t o 7 )
E s t r u c t u r a :
Figure imgf000118_0001
Figure imgf000119_0001
Figure imgf000120_0001
S E Q ID N O : 115
N o m b r e : [ C i c l o -( p A 2 - C O C H 2 - h C 31 ) , K ( P E G 12 ) 23 , p s / -( R 35 , Y 36 ) ] - P Y Y 2 - 36 m A b h o m o d í m e r o c o n j u g a d o
( C o m p u e s t o 14 )
E s t r u c t u r a :
Figure imgf000120_0002
S E Q ID N O : 116
N o m b r e : [ C i c l o -( p A 2 - C O C H 2 - h C 31 ) , K ( P E G 12 ) 22 , p s / -( R 35 , Y 36 ) ] - P Y Y 2 - 36 m A b h o m o d í m e r o c o n j u g a d o
( C o m p u e s t o 15 )
E s t r u c t u r a :
Figure imgf000120_0003
S E Q ID N O : 117
N o m b r e : [ C i c l o -( p A 2 - C O C H 2 - h C 31 ) , K ( P E G 12 ) 7 , p s / -( R 35 , Y 36 ) ] - P Y Y 2 - 36 m A b h o m o d í m e r o c o n j u g a d o
( C o m p u e s t o 16 )
E s t r u c t u r a :
Figure imgf000121_0001
S E Q ID N O : 118
N o m b r e : [ C i c l o -( G 2 - C O C H 2 - C 30 ) , K ( P E G 12 ) 11, p s / -( R 35 , Y 36 ) ] - P Y Y 2 - 36 m A b h o m o d í m e r o c o n j u g a d o ( C o m p u e s t o 17 )
E s t r u c t u r a :
Figure imgf000121_0002
S E Q ID N O : 119
N o m b r e : [ C i c l o -( G 2 - C O C H 2 - C 30 ) , K ( P E G 12 ) 11, N - M e - R 35 ] - P Y Y 2 - 36 m A b h o m o d í m e r o c o n j u g a d o ( C o m p u e s t o 18 )
E s t r u c t u r a :
Figure imgf000121_0003
S E Q ID N O : 120
N o m b r e : [ C i c l o -( p A 2 - C O C H 2 - C 30 ) , K ( P E G 12 ) 11, N - M e - R 35 ] - P Y Y 2 - 36 m A b h o m o d í m e r o c o n j u g a d o ( C o m p u e s t o 19 )
E s t r u c t u r a :
Figure imgf000122_0001
S E Q ID N O : 121
N o m b r e : [ C i c l o -( G 2 - C O C H 2 - h C 30 ) , K ( P E G 12 ) 11, N - M e - R 35 ] - P Y Y 2 - 36 m A b h o m o d í m e r o c o n j u g a d o ( C o m p u e s t o 20 )
E s t r u c t u r a :
Figure imgf000122_0002
Figure imgf000123_0001
S E Q ID N O : 124
N o m b r e : [ C i c l o -( P A 2 - C O C H 2 - C 30 ) , K ( P E G 12 ) 11, p s / -( R 35 , Y 36 ) ] - P Y Y 2 - 36 m A b h o m o d í m e r o c o n j u g a d o ( C o m p u e s t o 23 )
E s t r u c t u r a :
Figure imgf000123_0002
S E Q ID N O : 125
N o m b r e : [ C i c l o -( G 2 - E 30 ) , S 4 , K 11, p s / -( R 35 , Y 36 ) ] - P Y Y 2 - 36 h o m o d í m e r o c o n j u g a d o ( C o m p u e s t o 24 ) E s t r u c t u r a :
Figure imgf000123_0003
S E Q ID N O : 126
N o m b r e : [ C i c l o -( p A 2 - C O C H 2 - h C 31 ) , K ( P E G 24 ) 11, p s / -( R 35 , Y 36 ) ] - P Y Y 2 - 36 m A b h o m o d í m e r o c o n j u g a d o ( C o m p u e s t o 25 )
Figure imgf000124_0001
S E Q ID N O : 127
N o m b r e : [ C i c l o -( G 2 - A c - h C 31 ) , K ( P E G 12 ) 11, p s i -( R 35 - Y 36 ) ] - P Y Y 2 - 36 m A b h o m o d í m e r o c o n j u g a d o ( C o m p u e s t o 26 )
E s t r u c t u r a :
Figure imgf000124_0002
S E Q ID N O : 147
N o m b r e : [ C i c l o -( p A 2 - C O C H 2 - h C 31 ) , p s i -( R 35 , Y 36 ) ] - P Y Y 2 - 36
E s t r u c t u r a :
Figure imgf000124_0003
S E Q ID N O : 148
N o m b r e : [ C i c l o -( p A 2 - C O C H 2 - h C 31 ) , K 11, p s i -( R 35 , Y 36 ) ] - P Y Y 2 - 36
E s t r u c t u r a :
Figure imgf000125_0001
S E Q ID N O : 152
N o m b r e : [ C i c l o -( G 2 - C O C H 2 - C 30 ) , K 11, N - M e - R 35 ] - P Y Y 2 - 36
E s t r u c t u r a :
Figure imgf000126_0001
S E Q ID N O : 153
N o m b r e : [ C i c l o -( P A 2 - C O C H 2 - C 30 ) , N - M e - R 35 ] - P Y Y 2 - 36
E s t r u c t u r a :
Figure imgf000126_0002
S E Q ID N O : 154
N o m b r e : [ C i c l o -( P A 2 - C O C H 2 - C 30 ) , K 11, N - M e - R 35 ] - P Y Y 2 - 36
E s t r u c t u r a :
Figure imgf000126_0003
S E Q ID N O : 155
N o m b r e : [ C i c l o -( P A 2 - C O C H 2 - C 30 ) , p s i -( R 35 , Y 36 ) ] - P Y Y 2 - 36
E s t r u c t u r a :

Claims (20)

REIVINDICACIONES
1. U n c o n j u g a d o q u e c o m p r e n d e u n a n t i c u e r p o m o n o c l o n a l o u n f r a g m e n t o d e u n i ó n a a n t í g e n o d e l m i s m o a c o p l a d o a u n p é p t i d o P Y Y c í c l i c o , e n d o n d e e l p é p t i d o P Y Y c í c l i c o e s t á r e p r e s e n t a d o p o r la F ó r m u l a I o u n d e r i v a d o o s a l f a r m a c é u t i c a m e n t e a c e p t a b l e d e l m i s m o :
Figure imgf000227_0001
p e s 0 o 1;
m e s 0, 1, 2 , 3, 4 o 5;
n e s 1, 2 , 3 o 4;
q e s 0 o 1; s i e m p r e q u e q s e a 1 s o l o c u a n d o 30 e s t é a u s e n t e ;
P U E N T E e s - P h - C H 2 - S - , - t r i a z o l i l o - , - N H C ( O ) C H 2 S - , - S C H 2 C ( O ) N H - ,
-( O C H 2 C H 2 )2 N H C ( O ) C H 2 S , - N H C ( O ) - o - C H 2 S - ;
Z 4 e s K, A , E, S o R;
Z 7 e s A o K;
Z 9 e s G o K;
Z 11 e s D o K;
Z 22 e s A o K;
Z 23 e s S o K;
Z 26 e s A o H;
Z 30 e s L, W , a u s e n t e o K;
s i e m p r e q u e Z 30 e s t é a u s e n t e s ó l o c u a n d o q s e a 1;
Z 34 e s
Figure imgf000227_0002
Z 35 e s
Figure imgf000227_0003
en donde el derivado es el compuesto de Fórmula I que se modifica mediante uno o más procesos seleccionados del grupo que consiste de amidación, glicosilación, carbamilación, sulfatación, fosforilación, ciclación, lipidación y pegilación
2. El c o n j u g a d o d e l a r e i v i n d i c a c i ó n 1, e n d o n d e e l p é p t i d o P Y Y c í c l i c o e s u n c o m p u e s t o d e F ó r m u l a I o u n d e r i v a d o d e l p é p t i d o P Y Y c í c l i c o d e F ó r m u l a I q u e s e m o d i f i c a m e d i a n t e u n o o m á s p r o c e s o s s e l e c c i o n a d o s d e l g r u p o q u e c o n s i s t e d e a m i d a c i ó n , l i p i d a c i ó n y p e g i l a c i ó n , o u n s a l f a r m a c é u t i c a m e n t e a c e p t a b l e d e l m i s m o .
3. El c o n j u g a d o d e l a r e i v i n d i c a c i ó n 1, e n d o n d e e l p é p t i d o P Y Y c í c l i c o e s t á r e p r e s e n t a d o p o r l a F ó r m u l a I o e l d e r i v a d o o s a l f a r m a c é u t i c a m e n t e a c e p t a b l e d e l m i s m o , e n d o n d e :
p e s 0 o 1;
m e s 0, 1, 2 , 3, 4 o 5;
n e s 1 , 2 , 3 o 4 ;
q e s 0 o 1; s i e m p r e q u e q s e a 1 s o l o c u a n d o Z 30 e s t é a u s e n t e ;
P U E N T E e s - P h - C H 2 - S - , - t r i a z o l i l o - , - N H C ( O ) C H 2 S - , - S C H 2 C ( O ) N H 2 -,
-( O C H 2 C H 2 )2 N H C ( O ) C H 2 S , - N H C ( O ) - o - C H 2 S - ;
Z 4 e s K , A , E , S o R;
Z 7 e s A o K, e n d o n d e l a c a d e n a l a t e r a l a m i n o d e d i c h o K e s t á o p c i o n a l m e n t e s u s t i t u i d a c o n
Figure imgf000228_0001
e n d o n d e i e s u n n ú m e r o e n t e r o d e 0 a 24 , y X = Br , I o C l , - C ( O ) C H 2 Br, - C ( O ) C H 2 I, o - C ( O ) C H 2 C l;
Z 9 e s G o K , e n d o n d e l a c a d e n a l a t e r a l a m i n o d e d i c h o K e s t á o p c i o n a l m e n t e s u s t i t u i d a c o n
Figure imgf000228_0002
e n d o n d e i e s u n n ú m e r o e n t e r o d e 0 a 24 , y X = Br , I o C l , - C ( O ) C H 2 Br, - C ( O ) C H 2 I, o - C ( O ) C H 2 C l;
Z 11 e s D o K, e n d o n d e l a c a d e n a l a t e r a l a m i n o d e d i c h o K e s t á o p c i o n a l m e n t e s u s t i t u i d a c o n
Figure imgf000228_0003
e n d o n d e i e s u n n ú m e r o e n t e r o d e 0 a 24 , y X = Br , I o C l , - C ( O ) C H 2 Br, - C ( O ) C H 2 I, o - C ( O ) C H 2 C l;
Z 22 e s A o K, e n d o n d e l a c a d e n a l a t e r a l a m i n o d e d i c h o K e s t á o p c i o n a l m e n t e s u s t i t u i d a c o n
Figure imgf000228_0004
e n d o n d e i e s u n n ú m e r o e n t e r o d e 0 a 24 , y X = Br , I o C l , - C ( O ) C H 2 Br, - C ( O ) C H 2 I, o - C ( O ) C H 2 C l;
Z 23 e s S o K, e n d o n d e l a c a d e n a l a t e r a l a m i n o d e d i c h o K e s t á o p c i o n a l m e n t e s u s t i t u i d a c o n
Figure imgf000229_0001
e n d o n d e i e s u n n ú m e r o e n t e r o d e 0 a 24 , y X = Br, I o C l , - C ( O ) C H 2 Br, - C ( O ) C H 2 l, o - C ( O ) C H 2 Cl;
Z 26 e s A o H;
Z 30 e s L o K, e n d o n d e la c a d e n a l a t e r a l a m i n o d e d i c h o K e s t á s u s t i t u i d a c o n
Figure imgf000229_0002
Z 34 e s
Figure imgf000229_0003
y
Z 35 e s
Figure imgf000229_0004
4. E l c o n j u g a d o d e la r e i v i n d i c a c i ó n 1, e n d o n d e e l p é p t i d o P Y Y c í c l i c o e s t á r e p r e s e n t a d o p o r la F ó r m u l a I o e l d e r i v a d o o s a l f a r m a c é u t i c a m e n t e a c e p t a b l e d e l m i s m o , e n d o n d e :
p e s 0 o 1 ;
m e s 0, 1, 2 , 3 o 5 ;
n e s 1, 2 o 4;
q e s 0 o 1 ; s i e m p r e q u e q p u e d a s e r 1 s o l o c u a n d o Z 30 e s t é a u s e n t e ;
P U E N T E e s - P h - C H 2 - S - , - t r i a z o l i l o - , - N H C ( O ) C H 2 S - , -( O C H 2 C H 2 )2 N H C ( O ) C H 2 S , - N H C ( O ) - , o - C H 2 S - ;
Z 4 e s K, A , E, S o R;
Z 7 e s A o K, e n d o n d e la c a d e n a l a t e r a l a m i n o d e d i c h o K e s t á s u s t i t u i d a c o n
Figure imgf000229_0005
Z 9 e s G o K,
Z 11 e s D o K, e n d o n d e la c a d e n a l a t e r a l a m i n o d e d i c h o K e s t á s u s t i t u i d a c o n
Figure imgf000230_0001
Z 23 e s S o K, e n d o n d e la c a d e n a l a t e r a l a m i n o d e d i c h o K e s t á s u s t i t u i d a c o n
Figure imgf000230_0002
Z 26 e s A o H,
Z 30 e s L o K, e n d o n d e la c a d e n a l a t e r a l a m i n o d e d i c h o K e s t á s u s t i t u i d a c o n
Figure imgf000230_0003
Z 34 e s
Figure imgf000230_0004
Z 35 e s
Figure imgf000230_0005
5. E l c o n j u g a d o d e la r e i v i n d i c a c i ó n 1, e n d o n d e e l p é p t i d o P Y Y c í c l i c o s e s e l e c c i o n a d e l g r u p o q u e c o n s i s t e d e l a s S E Q ID N O : 1, 73 - 100 y 147 - 156 , o u n a s a l f a r m a c é u t i c a m e n t e a c e p t a b l e d e l m i s m o .
6. E l c o n j u g a d o d e c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 1 - 5 , e n d o n d e e l a n t i c u e r p o m o n o c l o n a l o e l f r a g m e n t o d e u n i ó n a a n t í g e n o d e l m i s m o e s t á e n l a z a d o c o v a l e n t e m e n t e a l p é p t i d o P Y Y c í c l i c o e n u n r e s i d u o d e l i s i n a d e l p é p t i d o P Y Y c í c l i c o m e d i a n t e u n c o n e c t o r ; o p c i o n a l m e n t e e n d o n d e e l c o n e c t o r c o m p r e n d e u n o s e l e c c i o n a d o d e l g r u p o q u e c o n s i s t e d e p o l i e t i l e n g l i c o l ( P E G ) 8 - t r i a z o l i l - C H 2 C H 2 C O - P E G 4 , u n a c a d e n a d e P E G d e 2 - 24 u n i d a d e s d e P E G , u n a c a d e n a d e a l q u i l o q u e c o n t i e n e 2 - 10 á t o m o s d e c a r b o n o , ( G l y 4 S e r ) j e n d o n d e j = 1 - 4 , ( A l a P r o ) u e n d o n d e u = 1 - 10 , y u n e n l a c e .
7. E l c o n j u g a d o d e la r e i v i n d i c a c i ó n 6, e n d o n d e s o l o u n o d e Z 7 , Zg , Z 11 , Z 22 y Z 23 e n la F ó r m u l a I e s l i s i n a , y la l i s i n a e s t á e n l a z a d a c o v a l e n t e m e n t e a u n r e s i d u o d e c i s t e í n a m a n i p u l a d o d e l a n t i c u e r p o m o n o c l o n a l o e l f r a g m e n t o d e u n i ó n a a n t í g e n o d e l m i s m o a t r a v é s d e l c o n e c t o r .
8. U n c o n j u g a d o q u e c o m p r e n d e u n a m o l é c u l a d e a c u e r d o c o n la s i g u i e n t e f ó r m u l a :
c P Y Y - L ] 2 - m A b
e n d o n d e :
c P Y Y e s u n a s e c u e n c i a d e p é p t i d o P Y Y c í c l i c o s e l e c c i o n a d a d e l g r u p o q u e c o n s i s t e d e l a s S E Q ID N O : 102 - 127 o u n a s a l f a r m a c é u t i c a m e n t e a c e p t a b l e d e la m i s m a ;
L e s u n c o n e c t o r ;
m A b e s u n a n t i c u e r p o m o n o c l o n a l o u n f r a g m e n t o d e u n i ó n a a n t í g e n o d e l m i s m o a c o p l a d o a l p é p t i d o P Y Y c í c l i c o a t r a v é s d e l c o n e c t o r ; y
]2 r e p r e s e n t a q u e 1 o 2 d e l p é p t i d o P Y Y c í c l i c o s e c o n j u g a n c o v a l e n t e m e n t e c o n e l m A b .
9. E l c o n j u g a d o d e c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 1 a 8, e n d o n d e e l a n t i c u e r p o m o n o c l o n a l o e l f r a g m e n t o d e u n i ó n a a n t í g e n o d e l m i s m o c o m p r e n d e u n a r e g i ó n d e t e r m i n a n t e d e c o m p l e m e n t a r i e d a d d e c a d e n a p e s a d a 1 ( H C D R 1 ) , H C D R 2 , H C D R 3 , y u n a r e g i ó n d e t e r m i n a n t e d e c o m p l e m e n t a r i e d a d d e c a d e n a l i g e r a 1 ( L C D R 1 ) , L C D R 2 y L C D R 3 , q u e t i e n e n l a s s e c u e n c i a s p o l i p e p t í d i c a s d e la S E Q ID N O : 141, 142 , 143 , 144 , 145 y 146 , r e s p e c t i v a m e n t e , o p c i o n a l m e n t e e n d o n d e e l a n t i c u e r p o m o n o c l o n a l a i s l a d o c o m p r e n d e u n d o m i n i o v a r i a b l e d e c a d e n a p e s a d a ( V H ) q u e t i e n e la s e c u e n c i a p o l i p e p t í d i c a d e la S E Q ID N O : 137 , y u n d o m i n i o v a r i a b l e d e c a d e n a l i g e r a ( V L ) q u e t i e n e la s e c u e n c i a p o l i p e p t í d i c a d e la S E Q ID N O : 139.
10. E l c o n j u g a d o d e la r e i v i n d i c a c i ó n 9, q u e c o m p r e n d e a d e m á s u n a p o r c i ó n F c , q u e c o m p r e n d e o p c i o n a l m e n t e u n a c a d e n a p e s a d a ( H C ) q u e t i e n e la s e c u e n c i a p o l i p e p t í d i c a d e la S E Q ID N O : 138 y u n a c a d e n a l i g e r a ( L C ) q u e t i e n e la s e c u e n c i a p o l i p e p t í d i c a d e la S E Q ID N O : 140.
11. U n c o n j u g a d o q u e c o m p r e n d e u n a n t i c u e r p o m o n o c l o n a l o u n f r a g m e n t o d e u n i ó n a a n t í g e n o d e l m i s m o a c o p l a d o a u n p é p t i d o P Y Y c í c l i c o , e n d o n d e :
e l a n t i c u e r p o m o n o c l o n a l o e l f r a g m e n t o d e u n i ó n a a n t í g e n o d e l m i s m o c o m p r e n d e u n a r e g i ó n d e t e r m i n a n t e d e la c o m p l e m e n t a r i e d a d d e c a d e n a p e s a d a 1 ( H C D R 1 ) , H C D R 2 , H C D R 3 , y u n a r e g i ó n d e t e r m i n a n t e d e la c o m p l e m e n t a r i e d a d d e c a d e n a l i g e r a 1 ( L C D R 1 ) , L C D R 2 y L C D R 3 , q u e t i e n e l a s s e c u e n c i a s p o l i p e p t í d i c a s d e la S E Q ID N O : 141, 142 , 143 , 144 , 145 y 146 , r e s p e c t i v a m e n t e , p r e f e r i b l e m e n t e e l a n t i c u e r p o m o n o c l o n a l o f r a g m e n t o d e u n i ó n a a n t í g e n o d e l m i s m o c o m p r e n d e u n d o m i n i o v a r i a b l e d e c a d e n a p e s a d a ( V H ) q u e t i e n e la s e c u e n c i a p o l i p e p t í d i c a d e la S E Q ID N O : 137 , y u n d o m i n i o v a r i a b l e d e c a d e n a l i g e r a ( V L ) q u e t i e n e la s e c u e n c i a p o l i p e p t í d i c a d e la S E Q ID N O : 139 , y m á s p r e f e r i b l e m e n t e , e l a n t i c u e r p o m o n o c l o n a l c o m p r e n d e u n a c a d e n a p e s a d a ( H C ) q u e t i e n e la s e c u e n c i a p o l i p e p t í d i c a d e la S E Q ID N O : 138 y u n a c a d e n a l i g e r a ( L C ) q u e t i e n e la s e c u e n c i a p o l i p e p t í d i c a d e la S E Q ID N O : 140 ;
e l p é p t i d o P Y Y c í c l i c o c o m p r e n d e u n a s e c u e n c i a p o l i p e p t í d i c a s e l e c c i o n a d a d e l g r u p o q u e c o n s i s t e d e l a s S E Q ID N O : 1, 73 - 100 y 147 - 156 , o u n a s a l f a r m a c é u t i c a m e n t e a c e p t a b l e d e l m i s m o ; y
e l a n t i c u e r p o m o n o c l o n a l o f r a g m e n t o d e u n i ó n a a n t í g e n o d e l m i s m o s e c o n j u g a c o n e l p é p t i d o P Y Y c í c l i c o e n e l r e s i d u o 7 , 9, 11, 22 o 23 d e l p é p t i d o P Y Y c í c l i c o , p r e f e r i b l e m e n t e e n e l r e s i d u o d e l i s i n a 11 d e l p é p t i d o P Y Y c í c l i c o , d i r e c t a m e n t e o m e d i a n t e u n c o n e c t o r .
12. U n m é t o d o p a r a p r o d u c i r e l c o n j u g a d o d e c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 1 - 11, q u e c o m p r e n d e h a c e r r e a c c i o n a r u n e l e c t r ó f i l o , p r e f e r i b l e m e n t e b r o m o a c e t a m i d a o m a l e i m i d a , i n t r o d u c i d o e n u n a c a d e n a l a t e r a l d e l p é p t i d o P Y Y c í c l i c o , p r e f e r i b l e m e n t e la c a d e n a l a t e r a l d e u n r e s i d u o d e l i s i n a d e l p é p t i d o P Y Y c í c l i c o , c o n e l g r u p o s u l f h i d r i l o d e l r e s i d u o d e c i s t e í n a d e la S E Q ID N O : 143 d e l a n t i c u e r p o m o n o c l o n a l o f r a g m e n t o d e u n i ó n a a n t í g e n o d e l m i s m o , c r e a n d o d e e s t e m o d o u n e n l a c e c o v a l e n t e e n t r e e l p é p t i d o P Y Y c í c l i c o y e l a n t i c u e r p o m o n o c l o n a l o f r a g m e n t o d e u n i ó n a a n t í g e n o d e l m i s m o .
13. U n a c o m p o s i c i ó n f a r m a c é u t i c a q u e c o m p r e n d e e l c o n j u g a d o d e c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 1 - 11 y u n p o r t a d o r f a r m a c é u t i c a m e n t e a c e p t a b l e .
Figure imgf000232_0001
15. L a c o m p o s i c i ó n f a r m a c é u t i c a d e la r e i v i n d i c a c i ó n 13 p a r a s u u s o e n u n m é t o d o p a r a r e d u c i r la i n g e s t a d e a l i m e n t o s e n u n s u j e t o c o n n e c e s i d a d d e e l l o , e l m é t o d o c o m p r e n d i e n d o a d m i n i s t r a r a l s u j e t o c o n n e c e s i d a d d e e l l o u n a c a n t i d a d e f i c a z d e la c o m p o s i c i ó n f a r m a c é u t i c a .
16. L a c o m p o s i c i ó n f a r m a c é u t i c a d e la r e i v i n d i c a c i ó n 13 p a r a s u u s o e n u n m é t o d o d e m o d u l a r la a c t i v i d a d d e l r e c e p t o r Y 2 e n u n s u j e t o c o n n e c e s i d a d d e e l l o , e l m é t o d o c o m p r e n d i e n d o a d m i n i s t r a r a l s u j e t o c o n n e c e s i d a d d e e l l o u n a c a n t i d a d e f i c a z d e la c o m p o s i c i ó n f a r m a c é u t i c a .
17. L a c o m p o s i c i ó n f a r m a c é u t i c a p a r a s u u s o d e a c u e r d o c o n c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 14 - 16 , e n d o n d e la c o m p o s i c i ó n f a r m a c é u t i c a s e a d m i n i s t r a m e d i a n t e u n a i n y e c c i ó n y / o
e n c o m b i n a c i ó n c o n p o r lo m e n o s u n a g e n t e a n t i d i a b é t i c o .
18. L a c o m p o s i c i ó n f a r m a c é u t i c a p a r a s u u s o d e a c u e r d o c o n la r e i v i n d i c a c i ó n 17 , e n d o n d e d i c h o a g e n t e a n t i d i a b é t i c o e s u n m o d u l a d o r d e l r e c e p t o r d e l p é p t i d o 1 s i m i l a r a l g l u c a g ó n o
la c o m p o s i c i ó n f a r m a c é u t i c a s e a d m i n i s t r a e n c o m b i n a c i ó n c o n l i r a g l u t i d a .
19. U n kit q u e c o m p r e n d e e l c o n j u g a d o d e c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 1 - 11, q u e p r e f e r i b l e m e n t e c o m p r e n d e a d e m á s u n a l i r a g l u t i d a y u n d i s p o s i t i v o p a r a i n y e c c i ó n .
20. U n m é t o d o p a r a p r o d u c i r u n a c o m p o s i c i ó n f a r m a c é u t i c a q u e c o m p r e n d e e l c o n j u g a d o d e c u a l q u i e r a d e l a s r e i v i n d i c a c i o n e s 1 - 11, q u e c o m p r e n d e c o m b i n a r e l c o n j u g a d o c o n u n p o r t a d o r f a r m a c é u t i c a m e n t e a c e p t a b l e p a r a o b t e n e r la c o m p o s i c i ó n f a r m a c é u t i c a .
ES17864112T 2016-10-27 2017-10-26 Compuestos de péptido tirosina tirosina cíclicos acoplados a anticuerpos como moduladores de receptores de neuropéptidos Active ES2897480T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662413586P 2016-10-27 2016-10-27
US201662413613P 2016-10-27 2016-10-27
PCT/US2017/058455 WO2018081370A1 (en) 2016-10-27 2017-10-26 Antibody-coupled cyclic peptide tyrosine tyrosine compounds as modulators of neuropeptide y receptors

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2897480T3 true ES2897480T3 (es) 2022-03-01

Family

ID=62020814

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES17864112T Active ES2897480T3 (es) 2016-10-27 2017-10-26 Compuestos de péptido tirosina tirosina cíclicos acoplados a anticuerpos como moduladores de receptores de neuropéptidos

Country Status (37)

Country Link
US (14) US10640544B2 (es)
EP (4) EP3532092A4 (es)
JP (6) JP7387431B2 (es)
KR (6) KR20240046290A (es)
CN (4) CN110036022A (es)
AU (5) AU2017348175B2 (es)
BR (3) BR112019008500A2 (es)
CA (3) CA3041672A1 (es)
CL (3) CL2019001110A1 (es)
CO (3) CO2019003938A2 (es)
CR (3) CR20190210A (es)
CY (1) CY1124732T1 (es)
DK (1) DK3532486T3 (es)
DO (3) DOP2019000107A (es)
EC (3) ECSP19029835A (es)
ES (1) ES2897480T3 (es)
HR (1) HRP20211626T1 (es)
HU (1) HUE056442T2 (es)
IL (4) IL301843A (es)
JO (3) JOP20190097A1 (es)
LT (1) LT3532486T (es)
MA (3) MA46665B1 (es)
MD (1) MD3532486T2 (es)
MX (4) MX2019004955A (es)
NI (2) NI201900044A (es)
PE (3) PE20191079A1 (es)
PH (3) PH12019500723A1 (es)
PL (1) PL3532486T3 (es)
PT (1) PT3532486T (es)
RS (1) RS62677B1 (es)
SA (3) SA519401642B1 (es)
SG (4) SG11201902873RA (es)
SI (1) SI3532486T1 (es)
TW (4) TWI773699B (es)
UY (3) UY37455A (es)
WO (3) WO2018081367A1 (es)
ZA (1) ZA202200648B (es)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3912986B1 (en) 2013-12-18 2023-12-13 President and Fellows of Harvard College Crp capture/detection of bacteria
JOP20190097A1 (ar) * 2016-10-27 2019-04-28 Janssen Pharmaceutica Nv الجلوبولينات المناعية واستخداماتها
TW202014433A (zh) 2018-04-25 2020-04-16 比利時商健生藥品公司 類升糖素肽１（ｇｌｐ－１）融合肽偶合環狀酪酪肽接合物及其用途
US11780900B2 (en) 2018-04-25 2023-10-10 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Glucagon like peptide 1 (GLP-1) fusion peptide coupled cyclic peptide tyrosine tyrosine conjugates and uses thereof
WO2020262590A1 (ja) * 2019-06-28 2020-12-30 味の素株式会社 環状ペプチドの製造方法
JP2023500895A (ja) 2019-11-11 2023-01-11 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング Ｎｐｙ２受容体アゴニスト
CN111494606B (zh) * 2020-04-24 2021-12-14 广州医科大学 神经肽y的新应用
KR20230045088A (ko) 2020-08-07 2023-04-04 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하 가용성 npy2 수용체 작용제
CN115073556A (zh) * 2021-03-12 2022-09-20 上海天慈生命科学发展有限公司 一类阿片/神经肽ff受体多靶点环肽分子及其制备和应用
US20230015478A1 (en) * 2021-06-14 2023-01-19 Resolute Bio, Inc. Glp-1 receptor agonists having improved pharmacological and drug delivery properties
WO2023097363A1 (en) * 2021-11-30 2023-06-08 Garvan Institute Of Medical Research Improved binding proteins and uses thereof
CN115028551B (zh) * 2022-07-15 2024-01-05 成都普康生物科技有限公司 一种叠氮-九甘醇-丙酸的制备方法

Family Cites Families (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2434149A1 (fr) 1978-06-22 1980-03-21 Parcor Nouveaux derives de la l-cysteine
US5393669A (en) * 1993-02-05 1995-02-28 Martek Biosciences Corp. Compositions and methods for protein structural determinations
US7166575B2 (en) 2002-12-17 2007-01-23 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Compositions and methods for enhanced mucosal delivery of peptide YY and methods for treating and preventing obesity
EP1789440A4 (en) 2004-02-11 2008-03-12 Amylin Pharmaceuticals Inc REASONS FOR THE FAMILY OF PANCREATIC POLYPEPTIDES AND POLYPEPTIDES CONTAINING THEM
EP1718671A2 (en) 2004-02-23 2006-11-08 Rheoscience A/S Peptide yy analogues
MXPA06010347A (es) * 2004-03-17 2007-06-19 7Tm Pharma As Agonistas de receptor selectivo de y2 para intervenciones terapeuticas.
CA2577082A1 (en) 2004-09-02 2006-03-16 Genentech, Inc. Heteromultimeric molecules
JP5620626B2 (ja) 2005-03-31 2014-11-05 中外製薬株式会社 会合制御によるポリペプチド製造方法
DE102005028778A1 (de) 2005-06-22 2006-12-28 SUNJÜT Deutschland GmbH Mehrlagige Folie mit einer Barriere- und einer antistatischen Lage
JP5412273B2 (ja) * 2006-03-21 2014-02-12 アミリン・ファーマシューティカルズ，リミテッド・ライアビリティ・カンパニー ペプチド−ぺプチダーゼ阻害剤及びその使用
JP2009541275A (ja) 2006-06-22 2009-11-26 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 二重特異性抗体の生産
EP2068920A2 (en) 2006-10-05 2009-06-17 Centocor Ortho Biotech, Inc. Ccr2 antagonists for treatment of fibrosis
JP2008169195A (ja) * 2007-01-05 2008-07-24 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd キャリア物質を用いたインスリン分泌ペプチド薬物結合体
EP2185592B1 (en) * 2007-09-13 2013-01-23 University Of Zurich Prorektorat Forschung Monoclonal amyloid beta (abeta)-specific antibody and uses thereof
AU2008343589A1 (en) 2007-12-19 2009-07-09 Centocor Ortho Biotech Inc. Design and generation of human de novo pIX phage display libraries via fusion to pIX or pVII, vectors, antibodies and methods
KR20110091720A (ko) 2008-11-04 2011-08-12 얀센 파마슈티카 엔.브이. Ｃｒｈｒ2 펩티드 작용제 및 이의 용도
WO2010052144A2 (en) * 2008-11-05 2010-05-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Neuropeptide-2-receptor (y-2r) agonists and uses thereof
EP2424567B1 (en) 2009-04-27 2018-11-21 OncoMed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
PL2454282T3 (pl) 2009-07-13 2015-08-31 Zealand Pharma As Acylowane analogi glukagonu
EP2477643A1 (en) 2009-09-18 2012-07-25 Novo Nordisk A/S Long-acting y2 receptor agonists
US9150663B2 (en) 2010-04-20 2015-10-06 Genmab A/S Heterodimeric antibody Fc-containing proteins and methods for production thereof
CN103429616B (zh) 2010-09-27 2016-08-10 詹森生物科技公司 结合人胶原ii的抗体
US8906649B2 (en) 2010-09-27 2014-12-09 Janssen Biotech, Inc. Antibodies binding human collagen II
RU2604490C2 (ru) 2010-11-05 2016-12-10 Займворкс Инк. ДИЗАЙН УСТОЙЧИВОГО ГЕТЕРОДИМЕРНОГО АНТИТЕЛА С МУТАЦИЯМИ В Fc ДОМЕНЕ
EP2668212B1 (en) * 2011-01-28 2018-03-21 Sanofi Biotechnology Human antibodies to pcsk9 for use in methods of treating particular groups of subjects
AU2012270366C1 (en) 2011-06-17 2017-07-13 Hanmi Science Co., Ltd. A conjugate comprising oxyntomodulin and an immunoglobulin fragment, and use thereof
KR102052774B1 (ko) 2011-11-04 2019-12-04 자임워크스 인코포레이티드 Ｆｃ 도메인 내의 돌연변이를 갖는 안정한 이종이합체 항체 설계
NZ701040A (en) * 2012-07-04 2017-02-24 Hoffmann La Roche Covalently linked antigen-antibody conjugates
MX2015005698A (es) 2012-11-06 2015-08-20 Hanmi Pharm Co Tld Formulacion liquida del conjugado de proteina que comprende la oxintomodulina y un fragmento de inmunoglobulina.
PE20151603A1 (es) 2012-12-27 2015-11-20 Sanofi Sa Anticuerpos anti-lamp1 y conjugados anticuerpo farmaco, y usos de estos
EP2943512A4 (en) 2013-01-11 2016-06-01 California Inst Biomedical Res FUSION BOVINE ANTIBODIES
ES2732291T3 (es) 2013-05-02 2019-11-21 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Péptidos terapéuticos
LT3129406T (lt) 2014-04-11 2019-04-10 Medimmune, Llc Konjuguoti junginiai, apimantys inžineriniu būdu sukonstruotus cisteino antikūnus
AR100978A1 (es) 2014-06-26 2016-11-16 Hoffmann La Roche LANZADERAS CEREBRALES DE ANTICUERPO HUMANIZADO ANTI-Tau(pS422) Y USOS DE LAS MISMAS
PE20170771A1 (es) 2014-07-30 2017-07-04 Ngm Biopharmaceuticals Inc Composiciones y metodos de uso para tratar trastornos metabolicos
CA3003899A1 (en) 2015-11-02 2017-05-11 Janssen Pharmaceutica Nv Anti-il1rap antibodies, bispecific antigen binding molecules that bind il1rap and cd3, and uses thereof
JOP20190097A1 (ar) 2016-10-27 2019-04-28 Janssen Pharmaceutica Nv الجلوبولينات المناعية واستخداماتها
TW202014433A (zh) * 2018-04-25 2020-04-16 比利時商健生藥品公司 類升糖素肽１（ｇｌｐ－１）融合肽偶合環狀酪酪肽接合物及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
AU2017348172B2 (en) 2021-10-07
CO2019004186A2 (es) 2019-05-10
UY37455A (es) 2018-04-30
IL266202A (en) 2019-06-30
UY37457A (es) 2018-04-30
AU2017348175B2 (en) 2021-08-26
IL266202B1 (en) 2023-05-01
SG10202107777XA (en) 2021-08-30
KR102573684B1 (ko) 2023-09-04
CA3041672A1 (en) 2018-05-03
KR20230129194A (ko) 2023-09-06
US10858413B2 (en) 2020-12-08
SG11201902873RA (en) 2019-05-30
AU2021269420A1 (en) 2021-12-16
TWI773699B (zh) 2022-08-11
JP2019534281A (ja) 2019-11-28
EP3532486B1 (en) 2021-09-22
US10968264B2 (en) 2021-04-06
BR112019008500A2 (pt) 2019-07-09
CA3041674A1 (en) 2018-05-03
JP7387431B2 (ja) 2023-11-28
KR102653376B1 (ko) 2024-04-02
SA519401647B1 (ar) 2022-01-26
US20190298849A1 (en) 2019-10-03
CY1124732T1 (el) 2022-07-22
US10428134B2 (en) 2019-10-01
ECSP19029942A (es) 2019-05-31
UY37456A (es) 2018-04-30
JP2023012467A (ja) 2023-01-25
AU2022200089A1 (en) 2022-02-03
JOP20190096A1 (ar) 2019-04-28
EP3532092A4 (en) 2020-07-01
CR20190208A (es) 2019-05-27
US20210094998A1 (en) 2021-04-01
CO2019003938A2 (es) 2019-04-30
HRP20211626T1 (hr) 2022-02-04
BR112019008417A2 (pt) 2019-09-03
US11732019B2 (en) 2023-08-22
EP3534928A1 (en) 2019-09-11
EP3532486A1 (en) 2019-09-04
PH12019500723A1 (en) 2019-11-11
US20240018208A1 (en) 2024-01-18
KR102653381B1 (ko) 2024-04-02
MX2023005465A (es) 2023-05-22
MA46665B1 (fr) 2021-09-30
DOP2019000107A (es) 2019-09-30
PE20191079A1 (es) 2019-08-20
WO2018081370A1 (en) 2018-05-03
MX2019004952A (es) 2019-06-24
EP3534928A4 (en) 2020-08-12
CR20190210A (es) 2019-05-27
SG11201902879SA (en) 2019-05-30
JP2024020405A (ja) 2024-02-14
TWI794189B (zh) 2023-03-01
RS62677B1 (sr) 2021-12-31
MD3532486T2 (ro) 2022-01-31
CN109890410A (zh) 2019-06-14
US10961293B2 (en) 2021-03-30
US20190367577A1 (en) 2019-12-05
AU2021269420B2 (en) 2023-11-23
US20200385439A1 (en) 2020-12-10
TW201827456A (zh) 2018-08-01
US10787495B2 (en) 2020-09-29
TW201829455A (zh) 2018-08-16
AU2022200089B2 (en) 2023-11-16
EP3532486A4 (en) 2020-06-24
EP3988123A1 (en) 2022-04-27
JP2019534283A (ja) 2019-11-28
IL266202B2 (en) 2023-09-01
PL3532486T3 (pl) 2022-01-31
AU2017348172A1 (en) 2019-04-18
PT3532486T (pt) 2021-11-19
US10640544B2 (en) 2020-05-05
JP2022137031A (ja) 2022-09-21
DOP2019000106A (es) 2019-09-30
US20180127476A1 (en) 2018-05-10
TW201827081A (zh) 2018-08-01
TWI781118B (zh) 2022-10-21
CO2019004203A2 (es) 2019-05-10
NI201900044A (es) 2019-09-09
JP7090077B2 (ja) 2022-06-23
MA46672A (fr) 2019-09-04
CL2019001136A1 (es) 2019-07-05
JOP20190095A1 (ar) 2019-04-28
DOP2019000178A (es) 2020-02-16
KR20240046290A (ko) 2024-04-08
IL266206A (en) 2019-06-30
SA519401646B1 (ar) 2021-12-26
CN110036022A (zh) 2019-07-19
TW202304972A (zh) 2023-02-01
HUE056442T2 (hu) 2022-02-28
US20200283491A1 (en) 2020-09-10
NI201900043A (es) 2019-10-25
EP3532486B8 (en) 2022-01-12
LT3532486T (lt) 2021-11-10
US20190345214A1 (en) 2019-11-14
CN110099692A (zh) 2019-08-06
CN110099692B (zh) 2024-03-12
BR112019008351A2 (pt) 2019-10-01
KR20190073492A (ko) 2019-06-26
SI3532486T1 (sl) 2021-12-31
US20180125998A1 (en) 2018-05-10
JOP20190096B1 (ar) 2023-09-17
US20210163566A1 (en) 2021-06-03
KR20240046621A (ko) 2024-04-09
US20230365644A1 (en) 2023-11-16
WO2018081375A1 (en) 2018-05-03
AU2017348180A1 (en) 2019-04-18
US10968265B2 (en) 2021-04-06
CR20190209A (es) 2019-08-21
PH12019500906A1 (en) 2020-01-20
PE20190917A1 (es) 2019-06-26
US11591379B2 (en) 2023-02-28
CL2019001129A1 (es) 2019-07-05
MA46718A (fr) 2019-09-11
SA519401642B1 (ar) 2022-03-07
PH12019500749A1 (en) 2019-11-11
PE20190916A1 (es) 2019-06-26
IL301843A (en) 2023-06-01
JOP20190097A1 (ar) 2019-04-28
MA46665A (fr) 2019-09-04
KR20190072615A (ko) 2019-06-25
US11767354B2 (en) 2023-09-26
US20180117170A1 (en) 2018-05-03
MX2019004955A (es) 2019-06-24
AU2017348175A1 (en) 2019-04-18
DK3532486T3 (da) 2021-10-18
MX2019004954A (es) 2019-06-24
CN118085061A (zh) 2024-05-28
WO2018081367A1 (en) 2018-05-03
ZA202200648B (en) 2024-02-28
ECSP19029835A (es) 2019-05-31
EP3532092A1 (en) 2019-09-04
ECSP19029995A (es) 2019-05-31
US20210206822A1 (en) 2021-07-08
IL266204A (en) 2019-06-30
JP7231539B2 (ja) 2023-03-01
US20190263879A1 (en) 2019-08-29
CL2019001110A1 (es) 2019-07-05
SG11201902886SA (en) 2019-05-30
CA3041046A1 (en) 2018-05-03
JP2020510606A (ja) 2020-04-09
KR20190072616A (ko) 2019-06-25
US11401315B2 (en) 2022-08-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2897480T3 (es) Compuestos de péptido tirosina tirosina cíclicos acoplados a anticuerpos como moduladores de receptores de neuropéptidos
BR112020021562A2 (pt) conjugados de peptídeo tirosina tirosina cíclico acoplado ao peptídeo de fusão semelhante ao peptídeo glucagon-1 (glp-1) e usos dos mesmos
WO2019207427A2 (en) Thioether cyclic peptide amylin receptor modulators
EA044997B1 (ru) Конъюгат антител, связанный с циклическим пептидом, фармацевтическая композиция и набор, содержащие конъюгат, способы их получения и применения