CN102481330A - C型利钠肽变体 - Google Patents

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Abstract

本申请公开文本提供一种C型利钠肽(CNP)的变体、包含CNP变体的医药组合物，及制造CNP变体的方法。这些CNP变体适用于治疗CNP反应性疾病的治疗剂，这些疾病包括(但不限于)骨相关病症，诸如骨骼发育不良(例如软骨发育不全)，及血管平滑肌病症(例如再狭窄及动脉硬化)。

Description

C型利钠肽变体
相关申请案的交叉引用
本申请案主张2009年10月23日申请的美国临时申请案第61/254,563号及2009年5月20日申请的美国临时申请案第61/180,112号的优先权及权益，这些临时申请案各自的揭示内容以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
本文的领域大体而言涉及C型利钠肽(CNP)的变体、包含CNP变体的组合物、制造CNP变体的方法，及使用CNP变体来治疗CNP反应性病症的方法，这些病症包括(但不限于)骨相关病症，诸如骨骼发育不良(例如软骨发育不全)，及血管平滑肌病症。
背景技术
利钠肽家族系由三种结构上相关的肽组成：心房利钠肽(ANP)(Genbank登录号NP_006163，针对ANP前驱蛋白质NPPA)、脑利钠肽(BNP)(Genbank登录号NP_002512，针对BNP前驱蛋白质NPPB)，及C型利钠肽(CNP)(Biochem.Biophys.Res.Commun.(生物化学生物物理研究通讯)，168：863-870(1990)(GenBank登录号NP_077720，针对CNP前体蛋白质NPPC)(J.Hypertens.(高血压杂志)，10：907-912(1992))。此等小型单链肽(ANP、BNP、CNP)具有一个17个氨基酸的环结构(Levin等人，N.Engl.J.Med.(新英格兰医学杂志)，339：863-870(1998))且在多个生物过程中具有重要作用。ANP及BNP结合并活化利钠肽受体A(NPR-A)(亦称为鸟苷酸环化酶A(GC-A))，导致细胞内环单磷酸鸟苷(cGMP)含量升高。同样，CNP与NPR-B(GC-B)相互作用刺激cGMP的产生(J.Hypertens.(高血压杂志)，10：1111-1114(1992))。第三类型的受体NPR-C以高亲和力结合各利钠肽且主要用以捕捉来自细胞外代谢区的肽且使这些肽沉积于溶酶体中，这些肽在此处被降解(Science(科学)，238：675-678(1987))。ANP及BNP主要在心肌细胞内产生，且据信其在心血管内稳定中具有重要作用(Science(科学)，252：120-123(1991))。CNP表达更广泛，包括表达于中枢神经系统、生殖道、骨及血管内皮中(Hypertension(高血压)，49：419-426(2007))。
在人类中，CNP最初自呈126个氨基酸单链前原多肽形式的利钠肽前体C(NPPC)基因产生(Biochem.Biophys.Res.Commun.，(生物化学生物物理研究通讯)168：863-870(1990))。移除信号肽得到原CNP，且通过内切蛋白酶弗林蛋白酶(furin)的进一步切割产生53个氨基酸的活性肽(CNP-53)，其经分泌且经未知酶再次切割产生22个氨基酸的成熟肽(CNP-22)(Wu，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)278：25847-852(2003))。CNP-53及CNP-22在其分布方面不同，其中CNP-53在组织中居主导，而CNP-22主要见于血浆及脑脊髓液中(J.Alfonzo，Recept.Signal.Transduct.Res.(受体信号转导研究)，26：269-297(2006))。软骨中的主要CNP形式尚未知。CNP-53与CNP-22类似地结合于NPR-B。此外，其均以剂量依赖性方式及类似方式诱导cGMP产生(VT Yeung，Peptides(肽)，17：101-106(1996))。
先前已描述天然CNP基因及多肽。美国专利第5,352,770号揭示来自猪脑的在序列方面与人类CNP相同的经分离及纯化的CNP-22，及其在治疗心血管适应症中的用途。美国专利第6,034,231号揭示原CNP(126个氨基酸)的人类基因及多肽，及人类CNP-53基因及多肽。
细胞外间隙的CNP清除通过迅速降解CNP的膜结合中性内肽酶(NEP)的作用(Biochem.J.(生物化学杂志)，291(第一部分)：83-88(1993))，及经由结合于CNP且使CNP沉积于溶酶体(CNP在此处降解)中的NPR-C。已显示CNP在正常人类中具有2.6分钟的活体内半衰期(J.Clin.Endocrinol.Metab.(临床内分泌代谢杂志)，78：1428-35(1994))。CNP的低血浆浓度(J.Bone Moner.Res.，(骨矿物质研究杂志)19(增刊1)S20(2004))及其与NPR-B在许多组织中共表达表明CNP主要经由自分泌/旁分泌机制起作用。
如上所述，CNP结合并活化利钠肽受体B(NPR-B)(亦称为鸟苷酸环化酶B(GC-B))，导致细胞内环单磷酸鸟苷(cGMP)含量升高。由cGMP产生所介导的下游信号传导会影响一系列不同生物过程，包括软骨内骨化。因此，提高或抑制此路径中任何组分的含量皆可能会引起骨生长异常。举例而言，在小鼠模型中敲除CNP或NPR-B产生长骨及椎骨较短的矮化表型的动物。已鉴别出人类NPR-B中阻断适当CNP信号传导的突变且其导致侏儒症(Olney等人，J.Clin.Endocrinol.Metab.(临床内分泌代谢杂志)91(4)：1229-1232(2006)；Bartels等人，Am.J.Hum.Genet.(美国人类遗传学杂志)75：27-34(2004))。相反，工程改造成产生较高含量的CNP的小鼠呈现延长的长骨及椎骨。
软骨发育不全是由成纤维细胞生长因子受体3(FGFR-3)基因的常染色体显性突变(导致软骨形成异常)引起。FGFR-3通常对软骨细胞生长及因此骨生长具有负调节作用。在软骨发育不全中，FGFR-3的突变形式具有组成型活性，其引起骨严重缩短。软骨细胞增殖与分化似乎均受到干扰，导致生长板软骨显著较短(P.Krejci等人，J.Cell Sci.(细胞科学杂志)118：5089-5100(2005))。软骨内骨化为控制长骨纵向生长的过程。生长板存在四个区域：静止区、增殖区、肥大区及钙化区。在生长板中，NPR-B由增殖细胞表达，而NPR-C由肥大细胞表达(Yamashite等人，J.Biochem.(生物化学杂志)127：177-179(2000))。在正常软骨内骨生长中，软骨细胞组织成柱状形式且在生长板增殖区中增殖。在软骨发育不全患者中，此等柱变得紊乱。另外，在肥大区中，细胞变大且最终凋亡(裂解)，导致骨细胞侵入及矿化。软骨发育不全患者中肥大软骨细胞及该区的总体大小比正常患者小得多。CNP为软骨细胞及骨生长的正调节剂NPR-B的促效剂。CNP/NPR-B的下游信号传导在有丝分裂原活化蛋白激酶(MAP K)层面上抑制FGFR-3路径。在MAP K处的抑制可促进生长板的增殖区及肥大区中软骨细胞的增殖及分化，使得骨生长。
在人类中，FGFR-3的活化突变为遗传性侏儒症的主要原因。具有已活化FGFR-3的小鼠充当软骨发育不全(骨骼发育不良的最常见形式)的模型，且CNP的过度表达拯救此等动物避免矮小。因此，CNP及CNP的功能变体为治疗各种骨骼发育不良的潜在治疗剂。
CNP的治疗用途目前受限于其短血浆半衰期，该半衰期在人类中活体内显示为2.6分钟(J Clin.Endocrinol.Metab.(临床内分泌代谢杂志)，78：1428-35(1994))。为提高CNP浓度高于人类血浆中通常所见的固有含量(约5pM)，在使用全身性给予的CNP的所有人类及动物研究中，必需连续输注。相较于野生型CNP，具有较长活体内血清半衰期且显示类似或改良的活性的CNP变体对于可持续治疗策略为重要的。人类血浆中缩短CNP半衰期的两种机制为中性内肽酶(NEP)造成的降解及利钠肽受体C(NPR-C)造成的清除(Growth Horm.&IGF Res.(生长激素和IGF研究)，16：S6-S14(2006))。据报导，对肽进行修饰可增强对内肽酶及外肽酶裂解的抗性(AminoAcids(氨基酸)，30：351-367(2006)；Curr.Opin.Biotech(生物技术目前观点).，17：638-642(2006))。
已评估CNP的多种类似物及衍生物的生物活性。据报导，通过以S-甲基Cys取代Cys6与Cys22，肽经由Cys6-Cys22二硫键的环化显示对CNP刺激cGMP形成的活性重要(Biochem.Biophys.Res.Comm.(生物化学生物物理研究通讯)，183：964-969(1992)，亦使用丙氨酸扫描以鉴别对CNP功能性重要的氨基酸)。据报导，活性的额外显著增强是氨基酸Leu9、Lys10及Leu11的组合存在引起的。美国专利第5,434,133号描述包含在氨基酸位置6、7、9、11或22具有取代的CNP-22的CNP类似物，其中该氨基酸选自位置6的Cys或Pmp(五环巯基丙酸)，位置7的Phe、4-氯-Phe、4-氟-Phe、4-硝基-Phe或Cha(3-环己基-Ala)，位置9的Gly、Val、Aib或tLeu，位置11的Leu或Ile，及位置22的Cys或Pmp。
美国专利公开案第2004/0138134号(现为美国专利7,276,481)描述包含CNP-22的氨基酸Cys6至Cys22的CNP变体(“CNP-17”)，其包括位置9、10、11、16、17、19或20的另一天然氨基酸的至少一个取代；具有插入及缺失的CNP变体，诸如在Cys6与Phe7之间NEP裂解的所报导主要位点添加His残基；及使用此等变体来增大异常骨中骨生长板的尺寸及延长异常骨的方法。然而，如根据cGMP产生所量测，此等变体的活性未得到显著增强，且如在基于活体外细胞的方法(实施例7)中所观测，几乎所有变体的活性均减弱。未提供其它支持性数据，诸如提供活体外稳定性或活体内测定改良的药物动力学(PK)来证实CNP类似物的所声称NEP抗性及NPR-C抗性。美国专利第6,743,425号揭示治疗软骨发育不全的物质，其活化NPR-B/GC-B且为肽或低分子量化合物，包括C型利钠肽CNP-22及CNP-53。PCT公开案第WO 94/20534号揭示命名为血管钠肽(vasonatrinpeptide/VNP)的CNP-22与ANP的5氨基酸C端的嵌合体，亦即有限数目的氨基酸取代及藉由形成二硫键或双键产生的环状嵌合肽。
改良其它利钠肽家族成员的半衰期的方法包括降低ANP对NPR-C的亲和力(美国专利第5,846,932号)、利用NPR-C的五肽拮抗剂(WO 00/6163)及共给予NEP抑制剂，诸如塞奥芬(thiorphan)与坎沙曲(candoxatril)(Clin.Exp.Pharma.Physiol.，25：986-991(1997)，Hyperten.，30：184-190(1997))。WO 2004/047871描述BNP及BNP变体与聚烷二醇部分、糖部分、聚山梨醇酯部分、聚阳离子部分及其它亲水性聚合物部分的偶联物，其据报导显示获改良的循环半衰期且据报导适用于治疗急性充血性心脏衰竭。
然而，尚无关于制造具有NEP抗性同时保留CNP功能性的CNP的成功策略的公开报导。
发明内容
本文涉及C型利钠肽(CNP)的变体，其适用于治疗骨相关病症(例如软骨发育不全)及血管平滑肌病症。本公开包含血清半衰期增加(例如由于结合于中性内肽酶(NEP)的能力降低、对NEP的蛋白水解作用的抗性较高及/或对清除利钠肽受体C(NPR-C)的亲和力降低)同时保留CNP功能性的CNP变体。
下文阐述人类CNP-22的野生型序列(在本文中称为”hCNP22”、”wtCNP22”或”CNP22”)：
(N端)Gly1-Leu2-Ser3-Lys4-Gly5-Cys6-Phe7-Gly8-Leu9-Lys10-Leu11-Asp12-Arg13-Ile14-Gly15-Ser16-Met17-Ser18-Gly19-Leu20-Gly21-Cys22(SEQ ID NO：1)。
CNP22的位置6至22藉助于Cys6与Cys22之间的二硫键形成环状域。已显示17个氨基酸的环状结构对CNP结合于NPR-B重要(Schiller，Biochem.Biophys.Res.Commun.，(生物化学生物物理研究通讯)138：880-886(1986))。CNP22的位置6至22的氨基酸序列在本文中称作”CNP17”(SEQ ID NO：2)。
CNP在许多位点易于被NEP裂解：Cys6-Phe7、Gly8-Leu9、Lys10-Leu11、Arg13-Ile14、Ser16-Met17及Gly19-Leu20。在一实施例中，本公开包括一种CNP变体，其(1)经修饰以使其总体大小或分子量增至例如以下范围：约2.6kDa或2.8kDa至约4kDa、4.2kDa、4.4kDa、4.6kDa、4.8kDa、5kDa、5.2kDa、5.4kDa、5.6kDa、5.8kDa、6kDa、6.2kDa、6.4kDa或至约7kDa、7.2kDa或约8.2kDa，及/或(2)在某些氨基酸位置经修饰以降低其在1、2、3、4、5或所有6个上列位点对NEP裂解的敏感性。CNP变体的大小或分子量可藉由多种方式增大，例如藉由将其它氨基酸及/或其它种类的化学(例如天然或合成聚合)基团偶联至肽序列的例如N端、C端及/或侧链，及/或藉由使用天然氨基酸、非天然氨基酸及/或具有较庞大侧链的肽模拟物。视情况进一步使CNP变体偶联偶联至其它功能或结构部分。视情况与本文所述的任何实施例组合，可将突变(例如取代、添加及/或缺失)引入CNP22的某一(某些)位置以降低CNP变体对NPR-C的亲和力。在不影响NEP抗性或CNP活性的情况下，可进行其它修饰，例如保守性取代，或在此项技术中已知的其它修饰。
在一实施例中，CNP变体由以下通式表示：(x)-Gly1-Leu2-Ser3-Lys4-Gly5-Cys6-Phe7-Gly8-Leu9-Lys10-Leu11-Asp12-Arg13-Ile14-Gly15-Ser16-Met17-Ser18-Gly19-Leu20-Gly21-Cys22-(z)(SEQ ID NO：5)，其中：
在对应于一或多个以下CNP残基的位置：Gly1、Lys4、Gly5、Cys6、Phe7、Gly8、Leu9、Lys10、Leu11、Ile14、Gly15、Ser16、Met17、Gly19、Leu20及Gly21，CNP变体包含一或多个经修饰的氨基酸，其可产生经修饰的肽键(例如经由使用肽键等构物)；及
(x)及(z)独立地可不存在或可为来源于利钠多肽(例如NPPC、ANP、BNP)或非利钠多肽(例如人类血清白蛋白(HSA)、IgG等)的氨基酸序列。
在一实施例中，CNP变体包括：(1)在对应于CNP22的位置6、7或8(Cys6、Phe7或Gly8)的一的氨基酸位置处的修饰；(2)在位置1-5(Gly1、Leu2、Ser3、Lys4及Gly5)的任何或所有氨基酸的视情况存在的缺失、添加及/或取代；及(3)视情况至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个在对应于位置6-22的位置处的其它修饰(缺失、添加及/或取代)，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个修饰可为保守性取代或本文所述或在此项技术中已知的其它取代。
应了解，以编号提及特定氨基酸位置(例如CNP22的位置7)指任何CNP变体中对应的氨基酸位置，即使该CNP变体中的位置编号因前述插入或缺失而发生变化亦如此。举例而言，对于前五个氨基酸已缺失的CNP变体，提及”位置7”或”Phe7”将指相应位置2。类似地，对于一个氨基酸已添加至N端的CNP变体，提及”位置7”指对应位置8。
在本文所述的任何实施例中，CNP变体可通过对应于CNP22的6与22位之间的共价键环化。考虑使用此项技术中已知的任何方法形成共价键。在另一实施例中，CNP变体可经由位于肽的N端或靠近N端的氨基酸与C端或靠近C端的氨基酸(出于此目的称为”末端”氨基酸)之间所形成的共价键来环化。在一实施例中，在两个末端氨基酸的侧链之间或对应于CNP22的6与22的位置的氨基酸之间形成共价键。在另一实施例中，在一个末端氨基酸的侧链与另一末端氨基酸的末端基团之间，或在各末端氨基酸的末端基团之间形成共价键。举例而言，末端氨基酸之间或对应于CNP22的6与22的位置的氨基酸之间所形成的共价键可能为头至尾键、侧链至侧链键、侧链至头键或侧链至尾键。
在一实施例中，本文提供一种对NEP的亲和力降低，及/或对NEP裂解的抗性较大及/或活体内血清半衰期增加，同时保留CNP的功能性(例如刺激cGMP产生)的CNP变体。NEP由于其活性位点腔隙的尺寸有限而较佳识别小于约3kDa的底物(Oefner，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，296：341-349(2000))。在一实施例中，例如藉由添加约0.6kDa至约5kDa的氨基酸、亲水性或水溶性聚合物、疏水性酸(包括脂肪酸)及/或碳水化合物来修饰CNP变体，以使其总分子量增至约2.6kDa或2.8kDa至约4、4.6、5、5.2、5.8、6、6.4或7kDa的范围。在特定例示性实施例中，CNP变体的分子量在约2.6kDa与约7kDa之间，或在约2.8kDa与6kDa之间，或在约2.8kDa与约5.8kDa之间。在某些实施例中，添加至少约0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.6或1.8kDa，或至多2、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.2、4.4、4.6、4.8或5kDa，以使CNP变体的总分子量增至例如约2.6或2.8kDa至约4kDa、4.2kDa、4.4kDa、4.6kDa、4.8kDa、5kDa、5.2kDa、5.4kDa、5.6kDa、5.8kDa、6kDa、6.2kDa、7.2kDa、8.2kDa或更高的范围。在一些实施例中，此等CNP变体包含与CNP22的氨基酸6-22至少约70％、75％、80％、85％、90％或95％相同或同源的氨基酸序列。在其它实施例中，此等CNP变体包含另一天然或非天然氨基酸或肽模拟物的1、2、3、4、5、6或7个氨基酸的取代、插入或缺失。尽管预想保守性取代与非保守性取代或插入均可在任何位置进行，但可例如藉由保守性取代开始将修饰引入此项技术中已鉴定为与CNP活性或NPR-B结合有关的区域中，而非保守性取代可在先前已显示容许修饰的那些区域中进行。
在另一实施例中，CNP变体包含在Cys6与Cys22之间具有完整环化部分，且具有含有约1-40、1-20、5-40、5-35、10-35、15-35、5-31、10-31或15-31个氨基酸且为来源于CNP多肽及/或非CNP多肽的片段的N端尾及/或C端尾的CNP。在一实施例中，此等CNP变体的分子量在约2.8kDa至约4、4.6、5、5.2、5.8、6、6.4或7kDa的范围内。此等CNP变体的非限制性实施例包括野生型CNP22；或具有一或多个氨基酸取代(例如K4R取代)的CNP22，其具有来源于以下的N端及/或C端延伸：人类或其它物种的利钠肽前体序列(例如ANP、BNP或CNP)；具有氨基酸取代、添加及/或缺失的利钠肽前体C(NPPC)变体(例如这些CNP变体可为CNP-53的截短形式，其产生分子量在约2.8kDa与5.8kDa之间的肽)；或其它非CNP多肽，诸如血清白蛋白或IgG蛋白(例如这些CNP变体可为含有人类或其它物种的血清白蛋白或IgG的片段的CNP嵌合体)。
在一实施例中，总质量特征在于本文一般描述的范围(例如约2.6kDa或2.8kDa至约6kDa或7kDa)、经设计以便增强对NEP降解的抗性的CNP变体由以下通式表示：
(x)-Gly1-Leu2-Ser3-(b)4-Gly5-Cys6-Phe7-Gly8-Leu9-(h)10-Leu11-Asp12-Arg13-Ile14-Gly15-Ser16-Met17-Ser18-Gly19-Leu20-Gly21-Cys22-(z)(SEQ ID NO：6)，其中：
(x)为合成或天然聚合基团，或其组合，其中合成聚合基团的非限制性实例为聚乙二醇(PEG，亦称为聚环氧乙烷(PEO))，且天然聚合基团的非限制性实例为含有1至35个氨基酸且来源于以下的氨基酸序列：NPPC或其具有取代及/或缺失的变体、ANP、BNP，或其它非CNP多肽或肽，诸如血清白蛋白、IgG、富含组氨酸的糖蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白原、含锌指多肽、骨织素(osteocrin)或成纤维细胞生长因子2(FGF2)；
(z)可不存在或可为合成或天然聚合基团，或其组合，其中合成聚合基团的非限制性实例为PEG，且天然聚合基团的非限制性实例为来源于利钠多肽(例如NPPC、CNP、ANP或BNP)或非利钠多肽(例如血清白蛋白或IgG)的氨基酸序列；且
(b)及(h)可各自独立地在该位置是野生型Lys，或可经保守性氨基酸取代或经侧链上不具有反应性伯胺的任何天然或非天然氨基酸或肽模拟物(包括(但不限于)Arg、Gly、6-羟基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gln、Glu或Ser)置换。在一实施例中，(b)为Arg。在另一实施例中，为了改良NEP抗性，(b)不为Gly。在又一实施例中，(h)不为Arg。
来源于NPPC或其变体的氨基酸序列的非限制性实例包括：
Arg；
Glu-Arg；
Gly-Ala-Asn-Lys-Lys(SEQ ID NO：7)；
Gly-Ala-Asn-Arg-Arg(SEQ ID NO：8)；
Gly-Ala-Asn-Pro-Arg(SEQ ID NO：9)；
Gly-Ala-Asn-Gln-Gln(SEQ ID NO：10)；
Gly-Ala-Asn-Ser-Ser(SEQ ID NO：11)；
Gly-Ala-Asn-Arg-Gln(SEQ ID NO：12)；
Gly-Ala-Asn-Arg-Met(SEQ ID NO：13)；
Gly-Ala-Asn-Arg-Thr(SEQ ID NO：14)；
Gly-Ala-Asn-Arg-Ser(SEQ ID NO：15)；
Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala(SEQ ID NO：16)；
Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg(SEQ ID NO：17)；
Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg(SEQ ID NO：18)；
Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys(SEQ ID NO：19)；
Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Arg-Arg(SEQ ID NO：20)；
Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys(SEQ ID NO：21)；及
Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Arg-Arg(SEQ ID NO：22)。
来源于非CNP多肽(诸如ANP、BNP、血清白蛋白及IgG)的氨基酸序列的非限制性实例包括：
Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser(SEQ ID NO：23)；
Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr(SEQ ID NO：24)；
Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO：25)；
Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO：26)；
Lys-Val-Leu-Arg-Arg-Tyr(SEQ ID NO：27)；
Lys-Val-Leu-Arg-Arg-His(SEQ ID NO：28)；
Gly-Gln-His-Lys-Asp-Asp-Asn-Pro-Asn-Leu-Pro-Arg(SEQ ID NO：29)；
Gly-Val-Pro-Gln-Val-Ser-Thr-Ser-Thr(SEQ ID NO：30)；
Gly-Glu-Arg-Ala-Phe-Lys-Ala-Trp-Ala-Val-Ala-Arg-Leu-Ser-Gln(SEQ ID NO：31)；及
Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO：32)。
在一实施例中，CNP22或其变体的N端及/或C端可独立地偶联偶联于含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个氨基酸的氨基酸延伸。在一实施例中，氨基酸延伸来源于NPPC、CNP53、ANP或BNP。在一特定实施例中，氨基酸延伸为Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys(SEQ ID NO：33)。在一相关实施例中，将此15个氨基酸的延伸添加至N端以提供下式的CNP变体：Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys-Gly1-Leu2-Ser3-(b)4-Gly5-Cys6-Phe7-Gly8-Leu9-(h)10-Leu11-Asp12-Arg13-Ile14-Gly15-Ser16-Met17-Ser18-Gly19-Leu20-Gly21-Cys22-(z)(SEQ ID NO：34)。
在一实施例中，CNP变体包含N端及/或C端偶联与亲水性聚合物(例如PEG)偶联以使其总体分子大小增至约2.6kDa或2.8kDa至约4、5、6或7kDa的范围的wtCNP22或其变体(例如具有添加、缺失及/或取代(诸如K4R取代)的变体)(SEQID NO：35)。此等CNP变体视情况在N端及/或C端进一步偶联偶联于包含例如氨基酸、碳水化合物、疏水性酸及/或磷脂的聚合基团，该聚合基团的一非限制性实例为含有1至35个、或5至31个氨基酸的N端氨基酸延伸。在一实施例中，将至少约0.4、0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.6或1.8kDa或至多2、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.2、4.4、4.6、4.8或5kDa的亲水性聚合(例如PEG)部分添加至wtCNP22或其变体的N端及/或C端。
如本文中所示，约0.6kDa或更高的亲水性或水溶性PEG(或PEO)聚合物偶联偶联于CNP22或其变体一般会显著增强对NEP裂解的抗性。然而，将PEG(即使小至0.6kDa)添加至wtCNP22可能会降低CNP功能性(例如刺激cGMP信号传导)，且将大于约2kDa或3kDa的PEG添加至CNP22或其变体可能会以尺寸依赖性方式降低CNP功能活性。但当使约0.6kDa至约1.2kDa或可能达约2kDa的PEG(或PEO)聚合物偶联与具有N端氨基酸延伸的CNP变体偶联时，CNP功能性得以保留(至少与wtCNP22的功能性相当)，其中至少一个在生理条件下可能带正电荷的相对较大氨基酸(例如精氨酸)紧接于对应于CNP22的Gly1的位置之前，诸如GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)、GANPR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：37)、ER-CNP22(SEQ ID NO：38)、ER-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：39)、R-CNP22(SEQ ID NO：40)及R-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：41)。
因此，在一实施例中，聚乙二醇化CNP变体在CNP22或其变体(例如具有K4R取代的变体)的N端包含含有至少1、2、3、4或5个氨基酸的氨基酸延伸，其中使PEG聚合物偶联与经氨基酸延伸的CNP变体的N端偶联以产生特征在于本文一般描述的范围(例如约2.6kDa或2.8kDa至约6kDa或7kDa)以便增强对NEP裂解的抗性的总质量。在一实施例中，为增强CNP的功能性，此等聚乙二醇化且经氨基酸延伸的CNP变体含有至少一个紧接于对应于CNP22的Gly1的位置之前的在生理条件下可能带正电荷的相对较大的天然或非天然氨基酸。在一特定实施例中，聚乙二醇化且经氨基酸延伸的CNP变体含有至少一个紧接于对应于CNP22的Gly1位之间的精氨酸残基。
除在N端及/或C端偶联偶联亲水性或水溶性聚合物(诸如PEG(或PEO))的CNP变体外，本发明亦包括在内部位点与这种偶联聚合物偶联的CNP变体。本文中为简明起见，将使用PEG(或PEO)作为亲水性或水溶性聚合物的代表性实例。CNP变体可能在各种位点聚乙二醇化，包括(但不限于)：(1)仅在N端聚乙二醇化；(2)仅在C端聚乙二醇化；(3)仅在内部位点(例如Lys4)聚乙二醇化；(4)在N端与C端皆聚乙二醇化；(5)在N端及内部位点聚乙二醇化；及(6)在C端及内部位点聚乙二醇化。为增强对NEP降解的抗性及保留CNP功能性，在某些实施例中，聚乙二醇化CNP变体的总质量的特征在于本文一般描述的范围，例如在约2.6kDa或2.8kDa至约4、5、6或7kDa的范围内。在一特定实施例中，CNP17、CNP22、CNP37(下文定义)或其变体(包括具有氨基酸添加、取代及/或缺失的变体)仅在N端聚乙二醇化。在另一实施例中，CNP变体仅在内部位点(例如Lys4)聚乙二醇化。在另一实施例中，CNP变体在N端及内部位点(例如Lys4)聚乙二醇化。在又一实施例中，为得到更佳功能性，CNP变体不在环状域(对应于CNP22的Cys6至Cys22)内的位点(例如Lys10)聚乙二醇化。为防止在内部位点聚乙二醇化，可用在侧链上不含反应性伯氨基的天然或非天然氨基酸或肽模拟物(诸如Gly、Ser、Arg、Asn、Gln、Asp、Glu或瓜氨酸(Cit))取代Lys4及/或Lys10。在一特定实施例中，Lys4及/或Lys10经Arg置换。在另一实施例中，Lys10不经Arg置换。
本文包括使用可在以下方面不同的亲水性或水溶性聚合物(例如PEG分子)：类型(例如均聚物或共聚物；无规共聚物、交替共聚物或嵌段共聚物；线性或分支；单分散或多分散)、键联(例如可水解键或稳定键联，诸如酰胺、亚胺、胺、伸烷基或酯键)、偶联位点(例如在N端及/或C端，较佳不在CNP的环化区(对应于CNP22的残基6-22)中的任何残基处)，及长度(例如约0.2、0.4或0.6kDa至约2、3、4或5kDa)。亲水性或水溶性聚合物可藉助于此项技术中已知的基于N-羟基丁二酰亚胺(NHS)或基于醛的化学或其它化学偶联至CNP肽。此等CNP变体可使用以下产生：例如wtCNP-22(2.2kDa)、仅保留wtCNP22的环化区(残基6-22)的CNP-17、在CNP22的N端及/或C端具有氨基酸延伸的CNP变体，或具有氨基酸取代、添加及/或缺失的变体，例如GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)、GANPR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：37)、R-CNP22(SEQ ID NO：40)、R-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：41)、ER-CNP22(SEQ ID NO：38)及ER-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：39)。在一实施例中，总质量的特征在于本文一般描述的范围(例如约2.6kDa或2.8kDa至约6或7kDa)的PEG-CNP变体含有经由基于NHS或基于醛的化学偶联偶联于N端及/或C端的单分散性线性PEG(或PEO)基团，或经由基于NHS的化学偶联于N端及/或C端的两臂或三臂分支PEG基团。本文进一步包括经设计以降低肾清除率的带负电PEG-CNP变体，包括(但不限于)羧酸化、硫酸化及磷酸化化合物。
在一相关实施例中，本文包括PEG-CNP偶联物，其包含基于NHS或基于醛的式(CH2CH2O)n的PEG，其中n为12至50的整数，且PEG聚合物的分子量为至多约2.5kDa。在一特定实施例中，n为12或24。在一实施例中，PEG聚合物的末端羟基经非反应性基团封端。在一特定实施例中，封端基团为烷基，例如低级烷基，诸如甲基。
在另一实施例中，PEG聚合物或其衍生物具有约0.4kDa至约2.5kDa或约0.6kDa至约1.5kDa范围内的聚合物数目平均分子量。
在另一实施例中，使wtCNP或CNP变体肽偶联至包括例如二磷酸盐、碳水化合物、疏水性酸(包括脂肪酸)或氨基酸序列的部分。此等氨基酸序列包括例如适用于靶向骨/软骨的聚Asp或聚Glu，或可来源于具有已阐明骨靶向域的骨蛋白或其衍生物，诸如骨桥蛋白(osteopontin)、骨钙化素(osteocalcin)、涎蛋白(sialoprotein)等的融合蛋白或肽序列。在本文所述的CNP22或其变体连接至骨或软骨靶向部分的实施例中，这种部分设计成促进经修饰的CNP肽到达骨生长板的软骨细胞，该肽可在此处结合并活化软骨细胞上的NPR-B。
在另一实施例中，本文提供具有不太易于被肽酶(包括NEP)切割的肽键的CNP变体。本文包括在内肽酶裂解位点包含至少一个经修饰残基的CNP变体。在一实施例中，CNP中NEP裂解位点处的Cys6-Phe7肽键(-C(＝O)-NH-)可经任一以下肽键等构物置换：
-CH2-NH-，
-C(＝O)-N(R)-，其中酰氨基经任何以下R基团烷基化：甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基，
-C(＝O)-NH-CH2-，
-CH2-S-，
-CH2-S(O)n-，其中n为1或2，
-CH2-CH2-，
-CH＝CH-，
-C(＝O)-CH2-，
-CH(CN)-NH-，
-CH(OH)-CH2-，
-O-C(＝O)-NH-，及
-NHC(＝O)NH-。
在另一实施例中，Phe7经其对映异构体D-Phe取代。在另一实施例中，将D-对映异构体引入wtCNP-22内的一或多个(至多所有22个)位点。在另一实施例中，用β氨基酸(诸如3-氨基-2-苯基丙酸)取代Phe7，这在减小侧链长度的同时增加主链长度。在另一实施例中，本文包括Cys6位置的Cys类似物，包括(但不限于)高半胱氨酸、青霉胺、2-巯基丙酸及3-巯基丙酸。
即使在Cys6与Phe7之间存在NEP抗性键，其它肽键(包括Gly8-Leu9、Lys10-Leu11、Arg13-Ile14、Ser16-Met17及Gly19-Leu20)亦可能会被NEP水解。因此，本文包括在CNP类似物主链中多个位置处含有肽键等构物的CNP类似物。在一实施例中，CNP类似物或变体在一个以上肽酶裂解位点处包含修饰。在另一实施例中，此变体包含在结合于NEP活性位点中重要的氨基酸残基处具有取代从而增强对NEP降解的抗性的CNP。一或多个NEP结合残基(包括(但不限于)Gly8、Gly15、Ser18、Gly19及/或Gly21)经较大尺寸的天然或非天然氨基酸残基置换以降低对NEP活性位点的亲和力。在另一实施例中，NEP识别所必需的一或多个疏水性残基(包括(但不限于)Phe7、Leu9、Leu11、Ile14、Met17及Leu20)被降低NEP结合的天然或非天然氨基酸及/或肽模拟物取代。在另一实施例中，CNP的前五个氨基酸中的一至五个可缺失或经任何其它天然氨基酸或非天然氨基酸或肽模拟物取代，或可将一或多个天然或非天然氨基酸或肽模拟物添加至CNP的前五个位置中的任一位置或所有位置。
在另一实施例中，CNP变体具有特征在于本文一般描述的范围(例如约2.6kDa或2.8kDa至约6kDa或7kDa)的总质量，且由下式表示：
(x)-Gly1-Leu2-Ser3-(a)4-Gly5-(b)6-(c)7-(d)8-(e)9-(f)10-(g)11-Asp12-Arg13-(h)14-Gly15-Ser16-(i)17-Ser18-Gly19-(j)20-Gly21-Cys22-(z)(SEQ ID NO：46)，其中：
(x)可不存在，或可选自由以下组成的群：合成骨靶向化合物，诸如二磷酸盐；适用于靶向骨或软骨的氨基酸序列，诸如聚Asp及聚Glu；来源于具有已阐明骨靶向域的骨蛋白(诸如骨桥蛋白、骨钙化素、涎蛋白等的融合蛋白或肽序列)的氨基酸序列；降低肾清除率的聚合或非聚合分子，诸如带电PEG分子；及延伸，包含例如聚合物(例如PEG)、碳水化合物、疏水性酸(包括脂肪酸)及/或氨基酸，且其中此等氨基酸延伸可含有例如1至31个，或1至35个，或5至35个，或10至35个，或15至35个氨基酸残基，且可来源于NPPC、ANP、BNP、其它非CNP多肽或肽(诸如血清白蛋白或IgG)，或具有取代、添加及/或缺失的上述多肽的变体，或其组合；
(z)可不存在，或可选自由以下组成的群：适用于靶向骨或软骨的氨基酸序列，诸如聚Asp及聚Glu；来自骨蛋白(诸如骨桥蛋白、骨钙化素及涎蛋白)的骨靶向域的氨基酸序列；及来源于非CNP多肽或肽(诸如ANP或BNP)的氨基酸序列；
(a)可为该位置的野生型Lys，或可经保守性氨基酸取代或在侧链上不具有反应性伯胺的天然或非天然氨基酸或肽模拟物(包括(但不限于)Arg、Gly、6-羟基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gln、Ser或Glu)置换，其中在一实施例中，(a)为Arg；
(b)选自由Cys、及Cys6与Phe7之间的Cys和肽键等构物(诸如Cys-CH2-NH)组成的群；
(c)选自：L-Phe；D-Phe；3-氨基-2-苯基丙酸；Phe的N-烷基化衍生物，其中N-烷基为甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基；及Phe类似物，其中Phe类似物的苯环的一或多个邻位、间位及/或对位经一或多个选自由以下组成的群的取代基取代：卤素、羟基、氰基、直链或支链C1-6烷基、直链或支链C1-6烷氧基、直链或支链卤基-C1-6烷基、C3-10环烷基、杂环基、C6-14芳基及杂芳基(实例包括(但不限于)酪氨酸、3-氯苯丙氨酸、2，3-氯-苯丙氨酸、3-氯-5-氟-苯丙氨酸、2-氯-6-氟-3-甲基-苯丙氨酸)，或其中Phe类似物的苯环可经另一芳基(非限制性实例包括1-萘基丙氨酸及2-萘基丙氨酸)或杂芳基(非限制性实例包括吡啶基丙氨酸、噻吩基丙氨酸及呋喃基丙氨酸)置换；
(d)选自：Gly、叔丁基-Gly(tBu-Gly)、Thr、Ser、Val及Asn；
(e)选自：Leu、Ser、Thr及肽键等构物，诸如N-Me-Leu；
(f)可为该位置的野生型Lys，或可经保守性氨基酸取代或在侧链上不具有反应性伯胺的天然或非天然氨基酸或肽模拟物(包括(但不限于)Arg、Gly、6-羟基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gln、Ser或Glu)置换，其中在一实施例中，(f)不为Arg；
(g)选自：Leu及肽键等构物，诸如N-Me-Leu；
(h)选自：Ile、tBu-Gly、及肽键等构物，诸如N-Me-Ile；
(i)选自：Met、Val、Asn、β-Cl-Ala、2-氨基丁酸(Abu)及2-氨基-异丁酸(Aib)；且
(j)选自：Leu、正亮氨酸(Nle)、高亮氨酸(homoleucine)(Hleu)、Val、叔丁基-Ala(tBu-Ala)、Ser、Thr、Arg、及肽键等构物，诸如N-Me-Leu。
在一实施例中，CNP变体在位置6、7、8、9、10、11、13、14、16、17、19及/或20中一或多个位置处包含修饰，且可视情况在本文所揭示的任何其它位置处具有修饰。
在本文所述的CNP22或其变体可连接至疏水性酸的实施例中，CNP肽可连接至一或多个疏水性酸。疏水性酸的非限制性实例包括直链或支链、饱和或不饱和C5-C12羧酸(例如戊酸、庚酸等)及天然脂肪酸。疏水性酸可连接至一或多个氨基酸残基的N端、C端及/或侧链。在一实施例中，疏水性酸偶联至N端。在一实施例中，CNP22或其变体与疏水性酸的偶联经过特别设计，以促进经修饰CNP肽与血清白蛋白之间的非特异性相互作用，藉此增大CNP肽的尺寸并保护其避免被蛋白酶(诸如NEP)切割。与疏水性酸偶联的CNP肽与白蛋白之间的相互作用的设计不能太强，以使经修饰CNP肽可扩散穿过软骨，到达骨生长板的软骨细胞，且结合及活化NPR-B。
在另一实施例中，本文提供CNP变体，其在活体外或活体内刺激产生cGMP，其产量为相同浓度wtCNP22(例如1μM)下的cGMP产量的至少约50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％或150％，在位置(b)6、(c)7及/或(d)8包含至少一个经修饰氨基酸，且由以下通式表示：
(x)-Gly1-Leu2-Ser3-(a)4-Gly5-(b)6-(c)7-(d)8-(e)9-(f)10-(g)11-Asp12-Arg13-(h)14-Gly15-Ser16-(i)17-Ser18-Gly19-(j)20-Gly21-Cys22-(z)(SEQ ID NO：47)，其中：
(x)可不存在，或可为含有1至5个氨基酸且来源于如本文所述的利钠多肽(例如NPPC、CNP、ANP或BNP)或非利钠多肽(例如HSA、IgG、骨靶向蛋白等)的肽序列；
(z)可不存在，或可选自由以下组成的群：合成骨靶向化合物，诸如二磷酸盐；适用于靶向骨/软骨的氨基酸序列，诸如聚Asp及聚Glu；具有骨靶向域的骨蛋白及其衍生物，诸如骨桥蛋白、骨钙化素及涎蛋白的融合蛋白或肽序列；降低肾清除率的分子，诸如带电PEG；及如本文所述增强CNP对NEP介导降解的抗性的分子；
(a)可为该位置的野生型Lys，或可经保守性氨基酸取代或在侧链上不具有反应性伯胺的天然或非天然氨基酸或肽模拟物(包括(但不限于)Arg、Gly、6-羟基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gln、Ser或Glu)置换，其中在一实施例中，(a)为Arg；
(b)可为Cys或去羧基半胱氨酸，或(b)6-(c)7肽键(-C(＝O)-NH-)可经任一以下肽键等构物置换：
-CH2-NH-，
-C(＝O)-N(R)-，其中酰氨基经任何以下R基团烷基化：甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基，
-C(＝O)-NH-CH2-，
-CH2-S-，
-CH2-S(O)n-，其中n为1或2，
-CH2-CH2-，
-CH＝CH-，
-C(＝O)-CH2-，
-CH(CN)-NH-，
-CH(OH)-CH2-，
-O-C(＝O)-NH-，或
-NHC(＝O)NH-；
(c)选自：L-Phe；D-Phe；3-氨基-2-苯基丙酸；Phe的肽键等构物，诸如Phe的N-烷基化衍生物，其中N-烷基系选自由甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、异丁基、仲丁基及叔丁基组成的群；及Phe类似物，其中Phe类似物的苯环的一或多个邻位、间位及/或对位经一或多个选自由以下组成的群的取代基取代：卤素、羟基、氰基、直链或支链C1-6烷基、直链或支链C1-6烷氧基、直链或支链卤基-C1-6烷基、C3-10环烷基、C6-14芳基、杂环基及杂芳基(实例包括(但不限于)酪氨酸、3-氯苯丙氨酸、2，3-氯-苯丙氨酸、3-氯-5-氟-苯丙氨酸、2-氯-6-氟-3-甲基-苯丙氨酸)，或其中Phe类似物的苯环可经另一芳基(非限制性实例包括1-萘基丙氨酸及2-萘基丙氨酸)或杂芳基(非限制性实例包括吡啶基丙氨酸、噻吩基丙氨酸及呋喃基丙氨酸)置换；
(d)选自：Gly、叔丁基-Gly(tBu-Gly)、Val、Ser、Thr及Asn；
(e)选自：Leu、Ser、Thr、及肽键等构物，诸如N-Me-Leu；
(f)为侧链上不具有反应性伯氨基的任何天然或非天然氨基酸或肽模拟物，包括(但不限于)Arg、Gly、6-羟基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gln、Ser或Glu，其中在一实施例中，(f)不为Arg；
(g)选自：Leu及肽键等构物，诸如N-Me-Leu；
(h)选自：Ile、tBu-Gly及肽键等构物，诸如N-Me-Ile；
(i)选自：Met、Val、Asn、β-Cl-Ala、2-氨基丁酸(Abu)及2-氨基-异丁酸(Aib)；且
(j)选自：Leu、正亮氨酸(Nle)、高亮氨酸(Hleu)、Val、叔丁基-Ala(tBu-Ala)、Ser、Thr、Arg、及肽键等构物，诸如N-Me-Leu。
在另一实施例中，本文包括CNP变体，其在活体外或活体内刺激产生在相同浓度wtCNP22(例如1μM)下所产生的cGMP量的至少约50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％或150％，具有特征在于本文一般描述的范围(例如约2.6kDa或2.8kDa至约6kDa或7kDa)的总质量以增强对NEP降解的抗性，且由以下通式表示：
(x)-(y)-Cys6-Phe7-Gly8-Leu9-(h)10-Leu11-Asp12-Arg13-Ile14-Gly15-Ser16-Met17-Ser18-Gly19-Leu20-Gly21-Cys22-(z)(SEQ ID NO：48)，其中：
(x)为合成或天然聚合基团，或其组合，其中合成聚合基团的非限制性实例为聚乙二醇(PEG)，且天然聚合基团的非限制性实例为含有1至35个氨基酸且来源于以下的氨基酸序列：NPPC或其具有取代及/或缺失的变体、ANP、BNP，或其它非CNP多肽或肽，诸如血清白蛋白、IgG、富含组氨酸的糖蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白原、含锌指多肽、骨织素或FGF2；
(y)可不存在，或可为一或多个来自Gly1-Leu2-Ser3-Lys4-Gly5(对应于CNP22的位置1至5)(SEQ ID NO：1)的氨基酸及/或在一或多个这些位置使用天然或非天然氨基酸的取代(例如K4R取代)；
(h)可为该位置的野生型Lys，或可经保守性氨基酸取代或在侧链上不具有反应性伯胺的天然或非天然氨基酸或肽模拟物(包括(但不限于)Arg、Gly、6-羟基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gln、Ser或Glu)置换，其中在一实施例中，(h)不为Arg；且
(z)可不存在，或可为合成或天然聚合基团，或其组合，其中合成聚合基团的非限制性实例为PEG，且天然聚合基团的非限制性实例为来源于利钠多肽(例如NPPC、CNP、ANP或BNP)或非利钠多肽(例如血清白蛋白或IgG)的氨基酸序列。
在一实施例中，(x)、(y)与(z)总共含有约10至约40个，或约15至约35个氨基酸。在另一实施例中，(x)为包含1至40个氨基酸或1至20个氨基酸的氨基酸序列。
还包括在活体外或活体内刺激产生在相同浓度wtCNP22(例如1μM)下所产生的cGMP量的至少约50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％或150％且包含以下序列的CNP变体：
(y)-Cys6-Phe7-Gly8-Leu9-Lys10-Leu11-Asp12-Arg13-Ile14-Gly15-Ser16-Met17-Ser18-Gly19-Leu20-Gly21-Cys22(SEQ ID NO：138)，其中：
(y)包含一或多个选自Gly1-Leu2-Ser3-Lys4-Gly5(SEQ ID NO：1)的氨基酸及/或在一或多个该位置使用天然或非天然氨基酸的取代(例如K4R取代)，且进一步包含分子量为约0.6kDa至约5kDa的亲水性或水溶性聚合物。在一实施例中，亲水性或水溶性聚合物偶联至此经氨基酸延伸的CNP变体的N端。在另一实施例中，亲水性或水溶性聚合物为PEG(或PEO)。
在另一实施例中，本文提供在活体外或活体内刺激产生在相同浓度wtCNP22(例如1μM)下所产生的cGMP量的至少约50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％或150％的CNP变体，其中这些CNP变体包含含有1至15个氨基酸的N端及/或C端肽延伸，且偶联至亲水性或水溶性聚合物。在一实施例中，肽延伸含有5至10个氨基酸。在一特定实施例中，肽延伸含有5个氨基酸。在另一特定实施例中，亲水性或水溶性聚合物为PEG(或PEO)。
在另一实施例中，本文的CNP变体在活体外或活体内外刺激产生在相同浓度wtCNP22(例如1μM)下所产生的cGMP量的至少约50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％或150％，且包含至少一个来源于利钠肽前体C(NPPC)的15个氨基酸的片段，其中该片段与含有相同数目氨基酸残基的野生型NPPC的序列至少70％同源。
在又一实施例中，CNP变体具有特征在于本文一般描述的范围(例如约2.6kDa或2.8kDa至约6kDa或7kDa)的总质量以便增强NEP抗性，且由下式表示：
(x)-(b)6-(c)7-(d)8-(e)9-(f)10-(g)11-Asp12-Arg13-(h)14-Gly15-Ser16-(i)17-Ser18-Gly19-(j)20-Gly21-Cys22-(z)(SEQ ID NO：49)，其中：
(x)可不存在(亦即，以-NH2基团为N末端)，或可选自由以下组成的群：来自肽Gly1-Leu2-Ser3-Lys4-Gly5(SEQ ID NO：1)的1、2、3、4或5个氨基酸的序列；适用于靶向骨/软骨的氨基酸序列，诸如聚Asp或聚Glu；来自骨蛋白(诸如骨桥蛋白、骨钙化素或涎蛋白)的骨靶向域；降低肾清除率的分子，诸如亲水性或水溶性聚合物，包括(但不限于)带电PEG分子；及包含PEG、碳水化合物、疏水性酸、氨基酸或其组合的部分，其中此等部分可为氨基酸延伸，包括(但不限于)来源于NPPC或非CNP多肽或肽(诸如BNP、ANP、血清白蛋白或IgG)的氨基酸序列；
(z)可不存在，或可选自由以下组成的群：适用于靶向骨/软骨的氨基酸序列，诸如聚Asp或聚Glu；来源于骨靶向蛋白(诸如骨桥蛋白、骨钙化素或涎蛋白)的氨基酸序列；及来源于如本文所述的NPPC或非CNP多肽或肽的氨基酸序列；
(b)选自：Cys、及Cys6与Phe7之间的肽键等构物，诸如Cys-CH2-NH；
(c)选自：L-Phe；D-Phe；3-氨基-2-苯基丙酸；Phe的N-烷基化衍生物，其中N-烷基为甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基；及Phe类似物，其中Phe类似物的苯环的一或多个邻位、间位及/或对位经一或多个选自由以下组成的群的取代基取代：卤素、羟基、氰基、直链或支链C1-6烷基、直链或支链C1-6烷氧基、直链或支链卤基-C1-6烷基、C3-10环烷基、C6-14芳基、杂环基及杂芳基(实例包括(但不限于)酪氨酸、3-氯苯丙氨酸、2，3-氯-苯丙氨酸、3-氯-5-氟-苯丙氨酸、2-氯-6-氟-3-甲基-苯丙氨酸)，或其中Phe类似物的苯环可经另一芳基(非限制性实例包括1-萘基丙氨酸及2-萘基丙氨酸)或杂芳基(非限制性实例包括吡啶基丙氨酸、噻吩基丙氨酸及呋喃基丙氨酸)置换；
(d)选自：Gly、叔丁基-Gly(tBu-Gly)、Val、Ser、Thr及Asn；
(e)选自：Leu、Ser、Thr、及肽键等构物，诸如N-Me-Leu；
(f)可为该位置的野生型Lys，或可经保守性氨基酸取代或在侧链上不具有反应性伯胺的天然或非天然氨基酸或肽模拟物(包括(但不限于)Arg、Gly、6-羟基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gln、Ser或Glu)置换，其中在一实施例中，(f)不为Arg；
(g)选自：Leu及肽键等构物，诸如N-Me-Leu；
(h)选自：Ile、tBu-Gly及肽键等构物，诸如N-Me-Ile；
(i)选自：Met、Val、Asn、β-Cl-Ala、2-氨基丁酸(Abu)及2-氨基-异丁酸(Aib)；且
(j)选自：Leu、正亮氨酸(Nle)、高亮氨酸(Hleu)、Val、叔丁基-Ala(tBu-Ala)、Ser、Thr、Arg、及肽键等构物，诸如N-Me-Leu。
在另一实施例中，CNP变体具有特征在于本文一般描述的范围(例如约2.6kDa或2.8kDa至约6kDa或7kDa)的总质量以便增强NEP抗性，且其由下式表示；
(x)-Gly1-Leu2-Ser3-(a)4-Gly5-(b)6-(c)7-(d)8-(e)9-(f)10-(g)11-Asp12-Arg13-(h)14-(i)15-Ser16-(j)17-Ser18-Gly19-(k)20-Gly21-Cys22-(z)(SEQ IDNO：50)，其中：
(x)及(z)独立地可不存在，或可选自由以下组成的群：合成骨靶向化合物，诸如二磷酸盐；适用于靶向骨/软骨的氨基酸序列，诸如聚Asp或聚Glu；来源于骨蛋白及其衍生物(诸如骨桥蛋白、骨钙化素、涎蛋白等的融合蛋白或肽序列)的骨靶向域的氨基酸序列；降低肾清除率的部分，包括(但不限于)亲水性或水溶性聚合物，诸如带电PEG分子；及包含例如亲水性聚合物(例如PEG)、碳水化合物、疏水性酸及/或氨基酸的部分；
(a)可为该位置的野生型Lys，或可经保守性氨基酸取代或在侧链上不具有反应性伯胺的天然或非天然氨基酸或肽模拟物(包括(但不限于)Arg、Gly、6-羟基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gln、Ser或Glu)置换，其中在一实施例中，(a)为Arg；
(b)选自：Cys、及Cys6与Phe7之间的肽键等构物，诸如Cys-CH2-NH；
(c)选自：L-Phe；D-Phe；3-氨基-2-苯基丙酸；Phe的N-烷基化衍生物，其中N-烷基为甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基；及Phe类似物，其中Phe类似物的苯环的一或多个邻位、间位及/或对位经一或多个选自由以下组成的群的取代基取代：卤素、羟基、氰基、直链或支链C1-6烷基、直链或支链C1-6烷氧基、直链或支链卤基-C1-6烷基、C3-10环烷基、C6-14芳基、杂环基及杂芳基(实例包括(但不限于)酪氨酸、3-氯苯丙氨酸、2，3-氯-苯丙氨酸、3-氯-5-氟-苯丙氨酸、2-氯-6-氟-3-甲基-苯丙氨酸)，或其中Phe类似物的苯环可经另一芳基(非限制性实例包括1-萘基丙氨酸及2-萘基丙氨酸)或杂芳基(非限制性实例包括吡啶基丙氨酸、噻吩基丙氨酸及呋喃基丙氨酸)置换；
(d)选自：Gly、叔丁基-Gly、Thr、Ser、Val及Asn；
(e)选自：Leu、Ser、Thr及肽键等构物，诸如N-Me-Leu；
(f)可为该位置的野生型Lys，或可经保守性氨基酸取代或在侧链上不具有反应性伯胺的天然或非天然氨基酸或肽模拟物(包括(但不限于)Arg、Gly、6-羟基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gln、Ser或Glu)置换，其中在一实施例中，(f)不为Arg；
(g)选自：Leu、Asn及肽键等构物，诸如N-Me-Leu；
(h)选自：Ile、叔丁基-Gly(tBu-Gly)、Asn及肽键等构物，诸如N-Me-Ile；
(i)选自：Gly、Arg、Ser及Asn；
(j)选自：Met、Val、Asn、β-Cl-Ala、2-氨基丁酸(Abu)及2-氨基-异丁酸(Aib)；且
(k)选自：Leu、正亮氨酸(Nle)、高亮氨酸(Hleu)、Val、叔丁基-Ala(tBu-Ala)、Arg、Thr、Ser及肽键等构物，诸如N-Me-Leu。
在另一实施例中，CNP变体可在CNP22的位置1至22中任何一或多个位置具有氨基酸取代。在一实施例中，Gly1经Arg或Glu取代。在另一实施例中，Lys4经Arg置换。在又一实施例中，Gly5经Arg、Gln或Ser取代。在另一实施例中，Gly15经Ser、Asn、Arg或Cit取代。在另一实施例中，Gly19经Ser、Arg或Asn取代。在另一实施例中，Gly21经Ser、Thr或Arg取代。
在一实施例中，CNP变体选自：GLSKGC(CH2NH)FGLKLDRIGSMSGLGC(使用去羧基-Cys形成)(SEQ ID NO：56)、GLSKGC-(N-Me-Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO：57)、GLSKGC-(D-Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO：136)、GLSKGCF-(tBuG)-LKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO：58)、GLSKGC-(3-Cl-Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO：137)及GLSKGC-[NHCH2CH(Ph)CO]-GLKLDRIGSMSGLGC(使用3-氨基-2-苯基丙酸形成)(SEQ ID NO：59)。在另一实施例中，在本文所述任何CNP变体中Cys6、Cys6位置处的去羧基-Cys或另一含巯基半胱氨酸类似物与Cys22之间存在二硫键。
在另一实施例中，CNP变体在CNP22或CNP17的N端及/或C端含有氨基酸延伸，包括(但不限于)：
DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-53)(SEQ ID NO：4)；
QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37，类似物BL)(SEQ ID NO：60)；
AAWARLLQEHPNAGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CA)(SEQ ID NO：61)；
AAWARLLQEHPNARGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CB)(SEQ IDNO：62)；
DLRVDTKSRAAWARGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CC)(SEQ IDNO：63)；
RGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO：40)；
ERGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO：38)；
GANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO：64)；
GANRRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO：65)；
GANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO：66)；
GANSSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO：67)；
GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO：144)(在实例及图中有时称作”CNP27-HSA”或”HSA-CNP27”)；
SPKMVQGSG-CNP17-KVLRRH(类似物CD)(SEQ ID NO：68)(具有来源于BNP的N端及C端尾的CNP17)。
在另一实施例中，CNP变体在CNP22的位置4处具有K4R取代。CNP(K4R)变体的非限制性实例包括：
GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物AY)(SEQ ID NO：36)；
GANPRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CI)(SEQ ID NO：37)；
RGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物AZ)(SEQ ID NO：41)；
ERGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物BA)(SEQ ID NO：39)；
GANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CH)(SEQ ID NO：69)；及
GANSSGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CG)(SEQ ID NO：70)。
在一实施例中，具有PEG(或PEO)部分及N端氨基酸延伸的CNP变体在紧接于对应于CNP22的Gly1位前的位置含有精氨酸。此等聚乙二醇化CNP变体经设计为增强对NEP降解的抗性、降低与血清白蛋白的结合且增强CNP功能活性(例如活化cGMP信号传导)。聚乙二醇化CNP变体的非限制性实例包括PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)、PEO12-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)、PEO24-GANRR-CNP22(SEQID NO：65)、PEO12-GANRR-CNP22(SEQ ID NO：65)、PEO24-GANPR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：37)、PEO12-GANPR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：37)、PEO24-GANPR-CNP22(SEQID NO：37)、PEO12-GANPR-CNP22(SEQ ID NO：66)、PEO24-GANQQ-CNP22(SEQ ID NO：64)、PEO12-GANQQ-CNP22(SEQ IDNO：64)、PEO24-ER-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：39)、PEO12-ER-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：39)、PEO24-ER-CNP22(SEQ ID NO：38)、PEO12-ER-CNP22(SEQ ID NO：38)、PEO24-R-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：41)、PEO12-R-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：41)、PEO24-R-CNP22(SEQ ID NO：40)及PEO12-R-CNP22(SEQ ID NO：40)，其中PEO24为单分散性1.2kDa PEG聚合物且PEO12为单分散性0.6kDa PEG聚合物。在一实施例中，PEG(或PEO)聚合物连接至CNP变体的N端。
其它CNP变体包括(但不限于)CNP37的衍生物，这些衍生物在弗林蛋白酶裂解位点(加下划线)具有突变，旨在提高对弗林蛋白酶的活体内抗性，及/或在谷氨酰胺之前具有甘氨酸(加下划线)，旨在防止形成焦谷酰胺(pyroglutamine)，这些衍生物包括(但不限于)：
GQEHPNARKYKGANPKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CS)(SEQ ID NO：71)；GQEHPNARKYKGANQKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CT)(SEQ ID NO：72)；GQEHPNARKYKGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CU)(SEQ ID NO：73)；GQEHPNARKYKGANKPGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CW)(SEQ ID NO：74)；GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-CNP37，类似物DB)(SEQ ID NO：75)；PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP37)(SEQID NO：145)。
在另一实施例中，CNP变体为包含CNP22及N端肽片段的嵌合体，其包括(但不限于)：
GHHSHEQHPHGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CQ)(富含组氨酸的糖蛋白(HRGP)片段-CNP22嵌合体)(SEQ ID NO：76)；
GAHHPHEHDTHGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CR)(HRGP片段-CNP22嵌合体)(SEQ ID NO：77)；
GHHSHEQHPHGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CX)(HRGP片段-CNP22嵌合体)(SEQ ID NO：78)；
GQPREPQVYTLPPSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CF)(IgG1(Fc)片段-CNP22嵌合体)(SEQ ID NO：79)；
GQHKDDNPNLPRGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CY)(人类血清白蛋白(HSA)片段-CNP22嵌合体)(SEQ ID NO：80)；
GERAFKAWAVARLSQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CE)(HSA片段-CNP22嵌合体)(SEQ ID NO：81)；
FGIPMDRIGRNPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CZ)(骨织素”NPR C抑制剂”片段-CNP22嵌合体)(SEQ ID NO：82)；及
GKRTGQYKLGSKTGPGPKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物DA)(FGF2”肝素结合域”片段-CNP22嵌合体)(SEQ ID NO：83)。
在另一实施例中，CNP变体为包含N端肽片段及CNP22(其中精氨酸取代CNP22的Lys4(“CNP22(K4R)”))的嵌合体，其包括(但不限于)：
GQPREPQVYTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CK)(IgG1(Fc)片段-CNP22(K4R)嵌合体)(SEQ ID NO：84)；
GVPQVSTSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CL)(HSA片段-CNP22(K4R)嵌合体)(SEQ ID NO：85)；
GQPSSSSQSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CM)(纤连蛋白片段-CNP22(K4R)嵌合体)(SEQ ID NO：86)；
GQTHSSGTQSGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CN)(纤维蛋白原片段-CNP22(K4R)嵌合体)(SEQ ID NO：87)；
GSTGQWHSESGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CO)(纤维蛋白原片段-CNP22(K4R)嵌合体)(SEQ ID NO：88)；及
GSSSSSSSSSGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CP)(锌指片段-CNP22(K4R)嵌合体)(SEQ ID NO：89)。
在另一实施例中，CNP变体为嵌合体或融合蛋白，其包含CNP肽或变体，及可切割肽或蛋白质，或肽标签。例示性可裂解蛋白质或肽包括(但不限于)组氨酸(例如六His)标签；TAF12：人类转录因子TAF12；KSI：酮类固醇异构酶；MBP：麦芽糖结合蛋白；β-Gal：β-半乳糖苷酶；GST：谷胱甘肽-S-转移酶；Trx：硫氧还蛋白(thioredoxin)；CBD：壳多糖结合域；BMPM：BMP-2突变、SUMO、CAT、TrpE、葡萄球菌蛋白A、链球菌蛋白、淀粉结合蛋白、内葡聚糖酶A的纤维素结合域、外葡聚糖酶Cex的纤维素结合域、生物素结合域、recA、Flag、c-Myc、聚(His)、聚(Arg)、聚(Asp)、聚(Gln)、聚(Phe)、聚(Cys)、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、青色荧光蛋白、生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、抗体表位及其片段。
在另一实施例中，CNP变体可为单体或二聚体。在一相关实施例中，二聚CNP变体的单体可经由接头或不经接头使N端连接至N端，经由接头或不经接头使N端连接至C端，或经由接头或不经接头使C端连接至C端。
包含IgG片段及CNP22或其变体的嵌合体设计成尤其增强对NEP降解的抗性且降低与血清白蛋白的结合。包含HSA的表面片段的CNP嵌合体设计成尤其降低免疫原性且降低与血清白蛋白的结合。在N端含有富含组氨酸、无赖氨酸、无精氨酸的阳离子性序列的HRGP-CNP22及HRGP-CNP22(K4R)嵌合体经设计为尤其增强对蛋白酶的稳定性。含有骨织素片段的嵌合体经设计以在骨生长板处在蛋白酶(例如弗林蛋白酶)裂解后释放骨织素片段，其中该片段将抑制清除受体NPR-C。关于包含FGF2肝素结合片段的嵌合体，结合于片段的肝素经设计以保护嵌合体避免降解，藉此提供较长血清半衰期。含有纤连蛋白、纤维蛋白原或锌指片段的嵌合体系设计为降低与血清白蛋白的结合，以及其它有利特征。
不希望受理论束缚，与wtCNP22相比对NEP降解的抗性增强且具有类似或改良的功能性(例如结合于NPR-B及刺激cGMP信号传导)的分子量为约2.6kDa或2.8kDa至约6kDa或7kDa的CNP变体若不紧密结合于血浆蛋白(诸如血清白蛋白)，则可能更有效。不紧密结合于血浆蛋白(例如血清白蛋白)的CNP变体可更有效地扩散穿过软骨，到达骨生长板的软骨细胞，且结合并活化NPR-B以进行cGMP信号传导。在一实施例中，经设计为降低与血浆蛋白(例如血清白蛋白)的结合的CNP变体为包含CNP22或其变体及来自IgG的肽片段的嵌合体。在另一实施例中，经设计为降低与血浆蛋白的结合的CNP变体为包含CNP22或CNP22(K4R)及来自多肽(例如IgG、HSA、纤连蛋白、纤维蛋白原、含锌指多肽等)的片段的嵌合体。在另一实施例中，经设计为降低与血浆蛋白的结合的CNP变体包含CNP22或其变体偶联至亲水性或水溶性聚合物。在一实施例中，亲水性或水溶性聚合物为PEG(或PEO)。在另一实施例中，亲水性或水溶性聚合物(例如PEG)经在生理条件下赋予聚合物负电荷的一或多个官能基(诸如羧基、硫酸根或磷酸根，或其组合)官能化。
在本文所揭示的任何实施例中，CNP变体可具有与野生型CNP22实质上相同或比其更佳的生物活性。举例而言，CNP变体例如就与NPR-B(GC-B)相互作用以刺激产生cGMP而言，可保留野生型CNP22活性的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高，或可具有高于CNP22的活性。或者或另外，CNP变体就调节软骨内骨生长及软骨细胞活性而言，可保留野生型CNP22活性的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高，或可具有高于CNP22的活性，包括(但不限于)软骨细胞增殖、软骨细胞分化、有丝分裂原活化蛋白(MAP)激酶/MEK(Raf-1)激酶信号传导路径的抑制，及促进软骨内骨化。在本文所述的任何实施例中，CNP变体可包含与野生型CNP22的氨基酸6-22或1-22至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高相同或同源的氨基酸序列。
在另一实施例中，本文提供对NPR-C清除受体具有较小亲和力，同时保留结合及活化NPR-B的能力的CNP22变体。本文包括自或可自如实施方式中所述基于同源性的NPR-B/CNP复合物结构模型产生的变体。在另一实施例中，CNP变体在位置1、5、8、15、19及21的一或多个Gly位点处具有取代以降低构型柔性，此可增强其结合于NPR-B超过NPR-C的特异性。对NPR-C的亲和力可能降低的CNP变体包括(但不限于)具有一或多个以下取代的变体：G1R、G1E、G5R、G5Q、G5S、F7Y、G8T、G8S、G8V、G8N、L9S、L9T、K10Cit、K10Q、K10S、I14N、G15R、G15S、G15N、G15Cit、S16Q、M17V、M17N、G19S、G19R、G19N、L20V、L20R、L20T、L20S、G21S、G21T及G21R。
在另一实施例中，CNP变体在位置5、7、8、9、10、14、15、16、17、19、20及21中一或多个位置处具有修饰及/或取代，且视情况可在本文所揭示的任何其它位置具有修饰及/或取代。在另一实施例中，CNP变体可视情况例如在N端及/或C端具有偶联或延伸以有助于靶向骨/软骨、降低肾清除率及/或增强对NEP降解的抗性。此(等)偶联或延伸可包含由以下形成或来源于以下的分子或序列：例如，聚Asp、聚Glu、骨或软骨靶向肽、骨桥蛋白、骨钙化素、涎蛋白、PEG、碳水化合物、疏水性酸、NPPC或非CNP多肽或肽，或其组合。
在又一实施例中，CNP变体是藉由标准固相肽合成法，用适当时经取代及/或添加的天然或非天然氨基酸或肽模拟物来制备。在另一实施例中，CNP变体是通过重组合成方法，例如经由含有标签或载体蛋白的融合蛋白来产生，其中使用标签或载体蛋白有助于例如检测、分离及/或纯化融合蛋白，且使标签或载体蛋白自融合蛋白选择性化学裂解或蛋白水解裂解提供目标CNP变体。在另一实施例中，CNP变体的聚乙二醇化在化学或生物合成之后或作为化学或生物合成的部分进行，其中偶联反应利用基于NHS或基于醛的化学或此项技术中已知的其它化学来进行。在另一实施例中，CNP变体包含二硫键。在一相关实施例中，二硫键形成环状肽。在另一实施例中，在对应于CNP22的位置6与22的位置的半胱氨酸残基之间形成二硫键。
还包括CNP变体可偶联至疏水性聚合或非聚合部分，诸如庚酸、戊酸或脂肪酸。疏水部分可偶联至氨基酸残基(包括(但不限于)赖氨酸、丝氨酸、半胱氨酸或苏氨酸)的侧链，或可连接至CNP变体的N端及/或C端。
在一实施例中，如本文所述的CNP变体具有在约8至约10.5或约8.5至约10范围内的pI值。
在另一实施例中，本文提供一种医药组合物，其包含CNP变体、视情况选用的另一生物活性剂，及视情况选用的医药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。在一些实施例中，这些组合物为适于非经肠注射的无菌医药组合物。在一些实施例中，组合物包含实质上纯(例如至少约90％或95％纯)的CNP变体。在一些实施例中，这些组合物含有少于约5％、4％、3％、2％、1％或0.5％的污染物，诸如其它人类蛋白质、猪蛋白质，或CNP53或其片段(除所需CNP变体的外)。在某些实施例中，给予个体该无菌组合物以供治疗或预防本文所揭示的任何CNP反应性病状或病症。
本文的CNP变体宜保留CNP活性且显示增加的血清半衰期。保留CNP活性可显示为：例如保留所需活体内生物作用，或保留在相同浓度(例如1μm CNP肽或高于ED80)下CNP22的cGMP刺激活性的至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或至少约100％。在一些实施例中，CNP变体显示相较于CNP22血清半衰期增至至少约1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍或40倍。
在一相关实施例中，本文所述的CNP变体与野生型CNP22相比具有增强的NEP抗性且显示增加的半衰期。在一实施例中，与野生型CNP22相比，CNP变体的半衰期增加约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％。
在某些实施例中，本文所述的CNP变体增加活体外cGMP产生、增加活体内cGMP产生、活体内增加一或多种与软骨或骨形成或生长相关的生物标记的含量、增强对活体外NEP裂解的抗性、增加血浆或血清活体内半衰期、增强活体内生物可用性，或增加活体内特定骨的长度，或实现此等增加(增强)的组合，与野生型CNP22相比，增至约1.5倍、约2倍、约2.5倍、约3倍、约3.5倍、约4倍、约4.5倍或约5倍或更多倍。
在另一实施例中，本文提供治疗CNP反应性病状或病症的方法，其包含给予有需要的个体治疗有效量的CNP变体或包含其的组合物。在一实施例中，CNP反应性病症为骨生长病症，包括(但不限于)骨骼发育不良及遗传性骨骼畸形，诸如与成纤维细胞生长因子受体3(FGFR-3)突变相关的病症。在一特定实施例中，与FGFR-3突变相关的病症为软骨发育不全。在另一实施例中，CNP反应性病症为与血管平滑肌细胞及组织相关的病症。在另一实施例中，CNP变体适用于增大骨(例如肢骨)的生长板的尺寸。在另一实施例中，CNP变体适用于使骨延长或增强长骨生长。在又一实施例中，CNP变体适用于增强软骨细胞的基质产生、增殖及分化。
在某些实施例中，以约5nmol/kg或10nmol/kg至约300nmol/kg，或约20nmol/kg至约200nmol/kg范围内的剂量给予本文所述的CNP变体。在一些实施例中，以约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、350、400、450、500、750、1000、1250、1500、1750或2000nmol/kg的剂量或治疗医师认为适当的其它剂量给予CNP变体。在其它实施例中，以约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750或800μg/kg，或约1mg/kg、1.25mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg的剂量或治疗医师认为适当的其它剂量给予CNP变体。本文所述的CNP变体的剂量可根据本文所述的给药频率/给药频率来给予，这些频率包括(但不限于)每日、每周2或3次、每周、每2周、每3周、每月等。
在另一实施例中，以单次治疗或多次剂量形式给予CNP变体。多次剂量可在疗程内每日给予，或分多次剂量给予。在某些实施例中，包括以如下频率给予CNP变体：单次剂量或多次剂量、每日、每隔一日、每3日、每周2次、每周3次、每周、每两周、每3周、每月、每6周、每2个月、每3个月，或治疗医师认为适当的频率。
在某些实施例中，调节CNP变体的给予以留出生长期(例如软骨生成)，接着为恢复期(例如骨生成)。举例而言，可皮下、静脉内，或藉由另一模式每日或每周多次给予CNP变体持续一段时间，接着为无治疗时期，接着重复该循环。在一些实施例中，初始治疗期(例如每日或每周多次给予CNP变体)持续3日、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周或12周。在一相关实施例中，无治疗时期持续3日、1周、2周、3周或4周。在某些实施例中，CNP变体的给药疗程为每日给药持续3日，接着3日不给药；或每日或每周多次给药持续1周，接着3日或1周不给药；或每日或每周多次给药持续2周，接着1或2周不给药；或每日或每周多次给药持续3周，接着1、2或3周不给药；或每日或每周多次给药持续4、5、6、7、8、9、10、11或12周，接着1、2、3或4周不给药。
在其它实施例中，本文提供一种治疗CNP反应性病状或病症的方法，其包含给予个体CNP肽或变体，及监测个体中(例如来自个体的生物样品中)至少一种骨或软骨相关生物标记的含量，其中骨或软骨相关生物标记的含量增加或降低表明CNP肽或变体对该个体具有治疗作用。在一些实施例中，当生物标记含量与骨或软骨形成或生长相关而增加时，该生物标记含量的增加表明CNP肽或变体对该个体具有治疗作用。在其它实施例中，当生物标记含量与骨或软骨形成或生长相关而降低时，该生物标记含量的降低表明CNP肽或变体对该个体具有治疗作用。
在其它实施例中，治疗方法进一步包含调节给予CNP肽或变体的量(或剂量)或频率，其中：
(i)在生物标记含量与骨或软骨形成或生长相关而增加的情况下，若至少一种骨或软骨相关生物标记的含量低于目标含量，则增加给予CNP肽或变体的量(或剂量)或频率；或
(ii)在生物标记含量与骨或软骨形成或生长相关而增加的情况下，若至少一种骨或软骨相关生物标记的含量高于目标含量，则降低给予CNP肽或变体的量(或剂量)或频率；或
(iii)在生物标记含量与骨或软骨形成或生长相关而降低的情况下，若至少一种骨或软骨相关生物标记的含量高于目标含量，则增加给予CNP肽或变体的量(或剂量)或频率；或
(iv)在生物标记含量与骨或软骨形成或生长相关而降低的情况下，若至少一种骨或软骨相关生物标记的含量低于目标含量，则降低给予CNP肽或变体的量(或剂量)或频率。
预期生物标记的目标含量指与个体中治疗作用及/或在缓解或改善病症或病状的症状方面的有益作用相关的生物标记的含量或含量范围。在某些实施例中，高于或低于目标含量的生物标记含量可能对个体有害。
在其它实施例中，本文包括一种评估给予CNP肽或变体对骨或软骨形成或生长的影响的方法。在一实施例中，该方法提供分析或量测已给予CNP肽或变体的个体中至少一种骨或软骨相关生物标记的含量以评估CNP肽或变体在活体内对骨及软骨形成及生长的影响。在一相关实施例中，至少一种骨或软骨相关生物标记的含量增加可表明给予CNP肽或变体对骨或软骨形成或生长具有积极影响且为适用于与CNP活性降低相关的骨骼发育不良及其它骨或软骨相关疾病或病症的治疗。例示性骨或软骨相关生物标记包括(但不限于)CNP(例如内源性含量的CNP-22或CNP-53)、cGMP、骨钙化素、增殖细胞核抗原(PCNA)、I型原胶原的前肽(PINP)及其片段、I型胶原蛋白及其片段、II型胶原蛋白的前肽及其片段、II型胶原蛋白及其片段、聚集蛋白聚糖硫酸软骨素(aggrecan chondroitin sulfate)及碱性磷酸酶。
在其它实施例中，本文包括一种评估CNP肽或变体对个体中至少一种骨或软骨相关生物标记的含量的影响的方法，其包含分析或量测来自已给予CNP肽或变体的个体的生物样品中骨或软骨相关生物标记的含量。在一些实施例中，该方法进一步包含给予个体CNP肽或变体，随后分析或量测骨或软骨相关生物标记的含量。
在某些实施例中，至少一种骨或软骨相关生物标记选自：CNP(例如内源性含量的CNP-22或CNP-53)、cGMP、II型胶原蛋白的前肽及其片段、II型胶原蛋白及其片段、骨钙化素、增殖细胞核抗原(PCNA)、I型原胶原的前肽(PINP)及其片段、I型胶原蛋白及其片段、聚集蛋白聚糖硫酸软骨素及碱性磷酸酶。
在与骨或软骨相关生物标记有关的方法(例如治疗方法、诊断方法及分析方法)的一些实施例中，CNP肽或变体为CNP-22、CNP-53，或本文所述的任何CNP肽及变体。在此等方法的某些实施例中，CNP肽或变体不是CNP-22或CNP-53。
在其它实施例中，本文提供一种重组产生CNP变体的方法，其包含将包含编码CNP变体肽的多核苷酸连接至编码可切割肽或蛋白质的多核苷酸的宿主细胞在培养基中在使得由这些多核苷酸编码的融合多肽得以表达的条件下培养。在一相关实施例中，宿主细胞经包含编码CNP变体肽的多核苷酸连接至编码可切割肽或蛋白质的多核苷酸的表达载体转化。
在一实施例中，载体为质粒。在又一实施例中，质粒选自：pET-21a、pJexpress、pET-31b、pET-15b、pET-32a、pET-41a、pMAL、pQE-30、pET-SUMO、pET-22b及pTYB11。
在某些实施例中，可切割肽或蛋白质包含选自由以下组成的群的多肽：组氨酸标签、人类转录因子TAF12、酮类固醇异构酶、麦芽糖结合蛋白、β-半乳糖苷酶、谷胱甘肽-S-转移酶、硫氧还蛋白、壳多糖结合域，及BMP-2突变，或其片段。
在一相关实施例中，可切割肽或蛋白质由切割剂切割。在一些实施例中，切割剂选自：甲酸、溴化氰(CNBr)、羟胺、蛋白质自切割(protein self cleavage)、因子Xa、肠激酶、ProTEV及SUMO蛋白酶。其它例示性切割剂包括(但不限于)钯、梭菌蛋白酶(clostripain)、凝血酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶、羧肽酶、肠肽酶、Kex 2蛋白酶、Omp T蛋白酶、枯草杆菌蛋白(subtilisin)、V8蛋白酶、HIV蛋白酶、鼻病毒蛋白酶、变种枯草杆菌蛋白酶(furilisin)、IgA蛋白酶、人类Pace蛋白酶、胶原酶、Nia蛋白酶、脊髓灰白质炎病毒2Apro蛋白酶、脊髓灰白质炎病毒3C蛋白酶、genenase、弗林蛋白酶、弹性蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、皱胃酶(rennin)(凝乳酶(chymosin))、微生物天冬氨酸蛋白酶、木瓜酶、钙蛋白酶(calpain)、木瓜凝乳酶(chymopapain)、无花果酶(ficin)(无花果蛋白酶(ficain))、菠萝酶(bromelain)(菠萝蛋白酶(bromelase))、组织蛋白酶B(cathepisin B)、卡斯蛋白酶(caspase)、嗜热菌蛋白酶(thermolysin)、内切蛋白酶Arg-C、内切蛋白酶Glu-C、内切蛋白酶Lys-C、胰舒血管素(kallikrein)及纤维蛋白溶酶。
在某些实施例中，融合多肽表达为可溶蛋白质或包涵体。在一相关实施例中，本文包括自宿主细胞或培养基分离所表达的融合多肽。在另一实施例中，使经分离的融合多肽与如本文所述的切割剂接触。
在一实施例中，本文提供一种包含表达载体的细菌宿主细胞，该载体包含编码CNP变体肽的多核苷酸连接至编码可切割肽或蛋白质的多核苷酸。在一些实施例中，可切割肽或蛋白质选自：组氨酸标签、人类转录因子TAF12、酮类固醇异构酶、麦芽糖结合蛋白、β-半乳糖苷酶、谷胱甘肽-S-转移酶、硫氧还蛋白、壳多糖结合域，及BMP-2突变，或其片段。
在另一实施例中，宿主细胞为细菌，诸如大肠杆菌(E.coli)。在一相关实施例中，大肠杆菌细胞选自：BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pGro7、ArcticExpress(DE3)、C41[亦称作C41(DE3)]、C43[亦称作C43(DE3)]、OrigamiB(DE3)、Origami B(DE3)pLysS、KRX及Tuner(DE3)。在另一实施例中，宿主细胞包含如上所述的载体。在一些实施例中，宿主细胞在细胞培养的前经载体转化。
在某些实施例中，包括在培养基中在适于表达由多核苷酸编码的融合多肽的条件下培养宿主细胞。在一实施例中，融合多肽表达为可溶蛋白质或包涵体。在一相关实施例中，自宿主细胞或培养基分离所表达的融合多肽。在又一实施例中，使经分离的融合多肽与如本文所述的切割剂接触。
附图说明
图1展示大肠杆菌中CNP融合蛋白的表达(图1A：考马斯蓝染色，图1B：蛋白质印迹分析)。M：蛋白质标记；T：总细胞溶胞物；S：可溶上清液；P：2μg CNP22；KSI：KSI-CNP(M/N)融合蛋白表达(不可溶)；N：未诱导的KSI-CNP融合蛋白总溶胞物；KSI’：KSI-P-CNP融合蛋白表达(不可溶)；Trx：Trx-P-CNP融合蛋白表达(可溶)；MBP：MBP-P-CNP融合蛋白表达(可溶)；TAF：TAF-P-CNP融合蛋白表达(不可溶)(BL21)；TAF’：TAF-P-CNP融合蛋白表达(不可溶)BL21(DE3)，其中CNP为Gly-CNP37；
图2展示TAF-CNP包涵体的甲酸裂解。M：蛋白质标记；1：Gly-CNP37阳性对照；2：未裂解的TAF-CNP包涵体；3：2％甲酸裂解的TAF-CNP包涵体，其中CNP为Gly-CNP37；
图3A-E描绘大肠杆菌中CNP融合蛋白的表达。M：蛋白质标记；Tu：未经诱导的总细胞溶胞物；Su：未经诱导的可溶上清液；T：诱导的总细胞溶胞物；S：可溶上清液；C1：CNP22；C：Gly-wtCNP37(“CNP38”)；P：不可溶沉淀。A：KSI：KSI-CNP38(M/N)融合蛋白表达(不可溶)；KSI’：KSI-Pro-CNP38(Pro-Gly-wtCNP37指定为”Pro-CNP38”)融合蛋白表达(不可溶)；Trx：Trx-Pro-CNP38融合体表达(可溶)；MBP：MBP-Pro-CNP38融合蛋白表达(可溶)；TAF：来自BL21细胞的TAF-Pro-CNP38融合蛋白表达(不可溶)；TAF’：来自BL21(DE3)细胞的TAF-Pro-CNP38融合蛋白表达(不可溶)。B：TAF-Pro-CNP37及BMP-Pro-CNP37融合蛋白表达。C：BMP-Pro-CNP38融合蛋白及BMP蛋白质表达。D：TAF-Pro-HSA-CNP(“Pro-GHKSEVAHRFK-wtCNP27(SEQ ID NO：188)指定为”Pro-HSA-CNP”)融合蛋白表达。E：TAF-Pro-CNP38融合蛋白及TAF蛋白质表达；
图4A-C描绘TAF-Pro-CNP38包涵体的甲酸切割。A：TAF-Pro-CNP38包涵体的50％甲酸切割。M：蛋白质标记；U：未切割的TAF-Pro-CNP38包涵体；25℃、37℃、42℃、55℃：TAF-Pro-CNP38包涵体在50％甲酸中在25℃、37℃、42℃或55℃下切割24小时。37℃-S及55℃-S：来自37℃及55℃下的切割反应、以10N NaOH中和且在14,000rpm下离心15分钟的可溶上清液。B：TAF-Pro-CNP38包涵体的10％及2％甲酸切割。M：蛋白质标记；U：未切割的TAF-Pro-CNP38包涵体；C：甲酸切割的TAF-Pro-CNP38；S：无中和下在14,000rpm下离心5分钟后的可溶上清液；P：无中和下在14,000rpm下离心5分钟后的不可溶沉淀；C：来自TAF-Pro-CNP38包涵体的2％及10％甲酸切割产物的LC/MS分析；
图5A-C描绘在不同温度及甲酸切割时间下TAF-Pro-CNP38包涵体的甲酸切割。M：蛋白质标记；C：Gly-wtCNP37(“CNP38”)阳性对照；U：未切割的TAF-Pro-CNP38包涵体。A：在42℃、55℃或70℃下以2％甲酸切割6、24或48小时的TAF-Pro-CNP38。B：在55℃、60℃、65℃或70℃下以2％甲酸切割17或24小时的TAF-Pro-CNP38。C：来自TAF-Pro-CNP38包涵体的2％甲酸切割产物的LC/MS分析；
图6为TAF-CNP34融合蛋白表达的SDS-PAGE(考马斯蓝染色)。M：蛋白质标记；C：对照[Gly-CNP37(“CNP38”)]；T：总细胞溶胞物；S：上清液；TI：经诱导的总细胞溶胞物；SI：经诱导上清液；
图7为融合蛋白TAF-NL-(C/A及6D/6E)-Pro-CNP38、TAF(C/A及10D/10E)-Pro-CNP38及TAF-Pro-CNP53表达的SDS-PAGE(考马斯蓝染色)，其中”Pro-CNP38”表示Pro-Gly-CNP37。M：蛋白质标记；C：对照[Gly-CNP37(“CNP38”)]；T：总细胞溶胞物；TI：经诱导的总细胞溶胞物；S：上清液；SI：经诱导上清液；
图8为融合蛋白TAF-CNP34及TAF-Pro-CNP53的甲酸切割产物的SDS-PAGE(考马斯蓝染色)。M：蛋白质标记；P：阳性对照[Gly-CNP37(“CNP38”)]；U：未切割；C：切割；CS：切割的上清液；CP：切割的沉淀；
图9为展示TAF-CNP3甲酸切割后CNP-34的峰的LC/MS层析图；
图10为展示TAF-Pro-CNP53甲酸切割后Pro-CNP53的峰的LC/MS层析图；
图11为融合蛋白TAF(C/A及4D/4E)-Pro-CNP38及TAF(4D/4E)-Pro-CNP38表达的SDS-PAGE(考马斯蓝染色)，其中”Pro-CNP38”表示Pro-Gly-CNP37。M：蛋白质标记；C：对照[Gly-CNP37(“CNP38”)]；T：总细胞溶胞物；TI：经诱导的总细胞溶胞物；S：上清液；SI：经诱导上清液；
图12为融合蛋白TAF(4D/4E)-Pro-CNP38及TAF(C/A及4D/4E)-Pro-CNP38的甲酸切割产物的SDS-PAGE(考马斯蓝染色)，其中”Pro-CNP38”表示Pro-Gly-CNP37。M：蛋白质标记；P：阳性对照[Gly-CNP37(“CNP38”)]；U：未切割；C：切割；CS：切割的上清液；CP：切割的沉淀；
图13为融合蛋白TAF-NL-(C/A及6D/6E)-Pro-CNP38及TAF(C/A及10D/10E)-Pro-CNP38的甲酸切割产物的SDS-PAGE(考马斯蓝染色)，其中”Pro-CNP38”表示Pro-Gly-CNP37。M：蛋白质标记；P：阳性对照[Gly-CNP37(“CNP38”)]；U：未切割；C：切割；CS：切割的上清液；CP：切割的沉淀；
图14为在BL21(DE3)细胞的10L发酵物中产生的TAF-Pro-CNP38融合蛋白的使用抗CNP抗体的蛋白质印迹分析，其中在OD600＝64时及第17小时诱导这些细胞且”Pro-CNP38”表示Pro-Gly-CNP37；
图15为来自较粗Pro-Gly-CNP37(“Pro-CNP38”)产物的SP-琼脂糖阳离子交换管柱层析的洗脱级分的SDS-PAGE(考马斯蓝染色)。A：水中的TAF-Pro-CNP38包涵体(IB)；B：甲酸盐中的IB；C：甲酸盐中的IB，经中和；D：中和的沉淀；E：中和的上清液；F：TMAE Hi-CAP负载；G：流经的TMAE Hi-CAP/SP-琼脂糖负载；H：流经的SP-琼脂糖；SP-琼脂糖洗脱级分1-47：10微升/泳道；
图16展示N端聚乙二醇化CNP22偶联物在活体外对中性内肽酶(NEP)的抗性程度；
图17描绘在N端具有氨基酸延伸的CNP变体[“CNP27”为GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)]的NEP抗性程度；
图18说明N端聚乙二醇化CNP17及GANRR-CNP22(K4R)(“CNP27”)(SEQ IDNO：36)的NEP抗性程度；
图19说明wtCNP22及CNP变体Gly-CNP37、GHKSEVAHRFK-wtCNP27(图中的”CNP27-HSA”)(SEQ ID NO：144)及PEO12-GANRR-CNP22(K4R)(图中的”CNP27-PEO12”)(SEQ ID NO：36)的NEP抗性程度；
图20展示具有N端氨基酸延伸的CNP变体在NIH3T3细胞中活体外刺激cGMP产生的能力。这些结果是相对于在1μM CNP22存在下产生的cGMP含量。”CNP27”为GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)；
图21展示N端聚乙二醇化CNP17及GANRR-CNP22(K4R)(“CNP27”)(SEQ ID NO：36)在NIH3T3细胞中刺激cGMP产生的能力；
图22说明CNP22的N端聚乙二醇化对cGMP产生的影响；
图23说明NIH3T3细胞中由wtCNP22及CNP变体Gly-CNP37、GHKSEVAHRFK-wtCNP27(“CNP27-HSA”)(SEQ ID NO：144)、wtCNP29及PEO12-GANRR-CNP22(K4R)(“CNP27-PEO12”)(SEQ ID NO：36)诱导的cGMP产生；
图24A及B展示在活体外信号传导竞争分析法中，CNP-22及Pro-Gly-CNP37(“Pro-CNP38”)经由NPR-B、以类似剂量-反应曲线、且以比经由NPR-A高得多的程度刺激cGMP产生，且显示NPR-B相对于NPR-C选择性的类似概况；
图25显示每日一次1小时或每日一次2小时将大鼠软骨肉瘤细胞暴露于CNP22在逆转FGF2诱导的软骨细胞生长停滞方面与连续暴露于CNP22具有实质上类似的有效性；
图26A及B展示来自对CNP22对FGF2停滞的大鼠软骨肉瘤(RCS)细胞的影响进行的剂量反应研究的结果；
图27A-D展示将CNP22添加至藉由FGF2停滞的RCS细胞中增加基质合成且部分抑制FGF2，如由35S-硫酸盐及3H-Pro并入基质中或在基质中减少所评估。A及C图，合成；B及D图，降解；A及B图，35S量测；C及D图，3H量测。统计学上显著的差异经突出显示(ANOVA；*p＜0.05，**p＜0.01)；
图28A-C展示以FGF2及CNP22培养的RCS细胞中聚集蛋白聚糖及纤连蛋白产生的程度(mRNA，图A及C，及蛋白质，图B)；
图29展示CNP37及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(图中的”CNP27-PEO24”)(SEQ IDNO：36)在离体小鼠器官模型中刺激野生型股骨的纵向生长的功效；
图30展示每两日以CNP22、CNP37或PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)处理的2-3日龄野生型小鼠胫骨的纵向骨生长。相对于处理前(第0日)的量测值校正结果。数据以平均值±SEM(n＝8)的形式表示；
图31展示每两日以CNP22、CNP37或PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)处理的2-3日龄软骨发育不全FGFR3ach小鼠胫骨的纵向骨生长。相对于处理前(第0日)的量测值校正结果。数据以平均值±SEM(n＝7-8)的形式表示；
图32展示每两日以CNP22、CNP37或PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)处理的2-3日龄野生型小鼠股骨的纵向骨生长。相对于处理前(第0日)的量测值校正结果。数据以平均值±SEM(n＝8)的形式表示；
图33展示每两日以CNP22、CNP37或PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)处理的2-3日龄FGFR3ach小鼠股骨的纵向骨生长。相对于处理前(第0日)的量测值校正结果。数据以平均值±SEM(n＝3-7)的形式表示；
图34A-I描绘每两日离体处理的FGFR3ach小鼠股骨中的CNP37生物分布。图A-C说明股骨远端中的分布，图D-F说明关节软骨细胞中的分布且图G-I说明肥大软骨细胞中的分布；
图35A-C描绘在每两日以CNP22或CNP37处理野生型及FGFR3ach小鼠股骨持续8日之后生长板中增殖柱的细胞结构。(A)无处理，(B)处理后每柱的细胞数，(C)处理后的形态学研究。图35C(i)至C(vi)中的图对应于图35B中所述的样品顺序。数据以平均值±SEM(n＝4-8)的形式表示；
图36A-C描绘在每两日以CNP22或CNP37离体处理野生型及FGFR3ach小鼠股骨持续8日之后的软骨细胞肥大。(A)无处理，(B)处理后的细胞尺寸，(C)处理后的形态学研究。图36C(i)至C(vi)中的图对应于图36B中所述的样品顺序。数据以平均值±SEM(n＝4-9)的形式表示；
图37A-I描绘经活体内处理的FGFR3ach小鼠胫骨中的CNP37生物分布。图A-C展示股骨远端中的分布，图D-F说明关节软骨细胞中的分布且图G-I说明肥大软骨细胞中的分布；
图38A-C说明CNP37对FGFR3ach小鼠胫骨生长板的活体内作用：(A)总生长板厚度，(B)增殖区厚度，及(C)肥大区厚度。数据以平均值±SEM(n＝7-15)的形式表示；
图39展示来自以CNP22、CNP37或PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(“CNP27-PEO24”)(SEQ ID NO：36)离体处理的野生型小鼠股骨的条件培养基中的cGMP含量(p＜0.01)；
图40展示来自以CNP22、CNP37或PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)离体处理的FGFR3ach小鼠股骨的条件培养基中的cGMP含量(p＜0.01)；
图41描绘来自以CNP22、CNP37或PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)离体处理的野生型小鼠胫骨的条件培养基中的cGMP含量(p＜0.01)；
图42展示来自以CNP22、CNP37或PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)离体处理的FGFR3ach小鼠胫骨的条件培养基中的cGMP含量(p＜0.01)；
图43显示使野生型及FGFR3ach小鼠股骨离体暴露于CNP22、CNP37或PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)使条件培养基中切割的第II型胶原蛋白的含量增加(p＜0.05)；
图44描绘自野生型小鼠及FGFR3Y367C小鼠(严重软骨发育不全的小鼠模型)分离且以载体或1μM Pro-Gly-CNP37(“ProCNP38”)离体处理6日的股骨肥大区，表明Pro-Gly-CNP37处理使得生长板中的骨生长及扩展增强；
图45展示静脉内(i.v.)给予大鼠的CNP37及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQID NO：36)在血浆中具有比CNP22长得多的半衰期及高得多的生物可用性；
图46说明皮下(s.c.)给予大鼠的PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)在血浆中亦具有比CNP22长得多的半衰期及高得多的生物可用性；
图47显示静脉内给予的CNP37及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)在大鼠中刺激比CNP22高得多的cGMP产生量；
图48展示皮下给予的PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)及(以较低程度)CNP37实质上比CNP22更有效地在大鼠中刺激cGMP产生；
图49展示以Gly-CNP37或PEO12-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)处理的野生型小鼠的体重量测值；
图50展示以Gly-CNP37或PEO12-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)处理的野生型小鼠的尾长量测值；
图51说明以CNP22、CNP37或PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)处理FGFR3ach小鼠对身长的影响(p＝0.02，单尾t-检验，不等变异)；
图52展示CNP22、CNP37及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)对FGFR3ach小鼠尾长的影响；
图53A及B展示CNP22、CNP37及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)对FGFR3ach小鼠的远程长骨(A，尺骨；B，胫骨)长度的影响(p＜0.01，单尾t-检验，不等变异)；
图54A及B展示CNP22、CNP37及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)对FGFR3ach小鼠的近端骨(A，肱骨；B，股骨)长度的影响(p＜0.01，单尾t-检验，不等变异)；
图55说明给予CNP37矫正近端肢骨短小(近端肢长不成比例)，如由在FGFR3ach小鼠中观察到的股骨∶胫骨比率所评估(p＜0.01，单尾t-检验，不等变异)；
图56展示CNP22、CNP37及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)对FGFR3ach小鼠头长的影响(p＜0.01，单尾t-检验，不等变异)；
图57展示以CNP37处理FGFR3ach小鼠使外耳道(EAM)尺寸增加(P＝0.03，单尾t-检验，不等变异)；
图58展示CNP22、CNP37及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)对软骨发育不全小鼠的脊椎长度的影响，其表达为椎骨体(例如腰椎5)延伸；
图59展示以CNP37或PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)处理FGFR3ach小鼠使得给药后15分钟cGMP血浆含量增加；
图60说明以CNP22、CNP37或PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)处理5周的FGFR3ach小鼠中切割的第II型胶原蛋白的血清含量；
图61展示以CNP22、CNP37或PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)处理5周的FGFR3ach小鼠中骨钙化素的血清含量；
图62展示来自以Gly-CNP37或PEO12-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)处理的野生型小鼠的给药后15分钟的cGMP血浆含量(p＜0.05)；
图63展示以Gly-CNP37或PEO12-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)处理5周的野生型小鼠中切割的第II型胶原蛋白的血清含量；
图64-66展示在给予野生型小鼠载体或20nmol/kg或70nmol/kgPro-Gly-CNP37(“Pro-CNP38”)之后cGMP、切割的第II型胶原蛋白及碱性磷酸酶的含量；
图67及68描绘在依据不同给药疗程给予载体或Pro-Gly-CNP37(“Pro-CNP38”)之后，切割的第II型胶原蛋白及总碱性磷酸酶含量；
图69说明在两个个别研究(S1及S2)中在第37日相对于第1日，经Pro-Gly-CNP37(“Pro-CNP38”)及载体处理的动物的身长的相对增加；
图70A及B展示在给予Pro-Gly-CNP37(“Pro-CNP38”)之后骨密度(A)及骨矿质含量(B)的变化；
图71展示第36日在最后一次皮下给予CNP变体之后15分钟的血浆cGMP含量，其中在图71-73中，Gly-wtCNP37为”CNP38”，Pro-Gly-wtCNP37为”Pro-CNP38”，且GHKSEVAHRFK-wtCNP27(SEQ ID NO：144)为”HSA-CNP27”；
图72展示以Gly-CNP37、Pro-Gly-CNP37或GHKSEVAHRFK-CNP27(SEQ ID NO：144)处理的小鼠的切割的第II型胶原蛋白的血清含量；
图73展示以Gly-CNP37、Pro-Gly-CNP37或GHKSEVAHRFK-CNP27(SEQ ID NO：144)处理的小鼠的碱性磷酸酶的血清含量；
图74A及B描绘在以1μM Gly-CNP37短期(A)或长期(B)处理后cGMP反应的脱敏；
图75A显示以200nmol/kg Pro-Gly-CNP37(“Pro-CNP38”)每日处理野生型小鼠持续8日不使cGMP反应脱敏。图75B展示一日一次以200nmol/kgPro-Gly-CNP37处理小鼠持续连续两日增强cGMP反应；
图76A-D展示以200nmol/kg Gly-CNP37处理野生型小鼠刺激股骨远端(软骨及骨)(A)、股骨皮层(骨)(B)、耳翼(软骨)(C)及肾脏(D)中的cGMP分泌。图76E-H展示肝(E)、心脏(F)、肺(G)及脑(H)组织在所研究时点相对于载体对照并未显示响应于Gly-CNP37的显著cGMP分泌；
图77-82展示来自在经每日皮下注射载体或10μg/kg或36μg/kgPro-Gly-CNP37的正常幼年猕猴中正进行的研究的结果。两种剂量的Pro-Gly-CNP37均具有增加的生长板宽度(图77)、增加的左胫骨及右胫骨长度(图78A及B)、增加的腿长(图79)、增加的臂长(图80)、增加的身长(图81)，及增加的碱性磷酸酶血清含量(图82)；及
图83描绘Gly-CNP37制剂的降解速率常数(Kobs)在pH 3-8及5℃、25℃及40℃下随pH值变化的观察曲线图。
具体实施方式
本发明涉及CNP的新颖变体，其对NEP及/或NPR-C具有降低的亲和力，且对NEP的切割作用及/或NPR-C的清除作用具有降低的敏感性；包含此等CNP变体的医药组合物；及使用此等CNP变体来治疗CNP反应性病症的方法，这些病症包括(但不限于)骨相关病症(诸如软骨发育不全)及与血管平滑肌细胞及组织相关的病症。
A.定义
除非另作说明，否则本申请案(包括说明书及申请专利范围)中所用的以下术语具有下文给出的定义。
除非上下文另有明确规定，否则如说明书及随附申请专利范围中所用，不定冠词”一”及定冠词”该/这些”包括复数个以及单数个所指物。
术语”约”或”大约”指如一般技术者所测定的特定值具有可接受的误差，其部分视量测或测定该值的方式而定。在某些实施例中，术语”约”或”大约”指在1、2、3或4个标准偏差内。在某些实施例中，术语”约”或”大约”指在指定值或范围的30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.05％以内。每当术语”约”或”大约”置于一系列两个或两个以上数值中的第一个数值之前时，应了解术语”约”或”大约”适用于该系列中的每个数值。
术语”环境温度”及”室温”在本文中可互换使用且指周围环境(例如进行反应或储存组合物的空间)的温度。在某些实施例中，环境温度或室温为约15℃至约28℃，或约15℃至约25℃，或约20℃至约28℃，或约20℃至约25℃，或约22℃至约28℃，或约22℃至约25℃的范围。在其它实施例中，环境温度或室温为约15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃或28℃。
标准化学术语的定义可见于参考著作中，包括Carey及Sundberg，AdvancedOrganic Chemistry(高等有机化学)第3版，A及B卷(Plenum Press，纽约1992)。除非另有规定，否则本发明的实施可采用在此项技术的技能内的合成有机化学、质谱分析、制备型及分析型层析、蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术及药理学的某些习知方法。例如参看T.E.Creighton，Proteins：Structures andMolecular Properties(蛋白质：结构和分子特性)(W.H.Freeman和公司，1993)；A.L.Lehninger，Biochemistry(生物化学)(Worth出版公司，第4版，2004)；Sambrook等人，Molecular Cloning：A LaboratoryManual(分子克隆：实验手册)(第2版，1989)；Methods In Enzymology(酶学方法)(S.Colowick及N.Kaplan编，Academic Press，Inc.)；Remington’s Pharmaceutical Sciences(Remington药典)第18版(Easton，Pennsylvania：Mack Publishing Company，1990)。
本文中(无论上文或下文)所引用的所有公开案、专利及专利申请案均以全文引用的方式并入本文中。
本文通篇使用以下氨基酸缩写：
丙氨酸：Ala(A)精氨酸：Arg(R)
天冬酰胺：Asn(N)天冬氨酸：Asp(D)
半胱氨酸：Cys(C)谷氨酰胺：Gln(Q)
谷氨酸：Glu(E)甘氨酸：Gly(G)
组氨酸：His(H)异亮氨酸：Ile(I)
亮氨酸：Leu(L)赖氨酸：Lys(K)
甲硫氨酸：Met(M)苯丙氨酸：Phe(F)
脯氨酸：Pro(P)丝氨酸：Ser(S)
苏氨酸：Thr(T)色氨酸：Trp(W)
酪氨酸：Tyr(Y)缬氨酸：Val(V)
“多肽”及”蛋白质”指由经由肽键或肽键等构物连接的氨基酸残基、其天然存在的相关结构变体及非天然存在的合成类似物构成的聚合物。合成多肽可例如使用自动化多肽合成器来合成。术语”多肽”及”蛋白质”不限于产物的最小长度。术语”蛋白质”通常指较大多肽。术语”肽”通常指较短多肽。因此，肽、寡肽、二聚体、多聚体及其类似物均包括于该定义内。该定义包括全长蛋白质与其片段。术语”多肽”及”蛋白质”亦包括多肽或蛋白质的表达后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化及其类似修饰。此外，出于本文的目的，”多肽”可包括对原生序列的”修饰”，诸如缺失、添加、取代(其性质上可具有保守性，或可包括用以下取代：人类蛋白质中通常存在的20种氨基酸中的任一者，或任何其它天然或非天然存在的氨基酸或非典型氨基酸)及化学修饰(例如添加肽模拟物或以肽模拟物取代)。此等修饰可为有意的，如经由定点突变诱发，或经由氨基酸的化学修饰以移除或连接化学部分，或可为意外的，诸如经由产生蛋白质的宿主引起的突变，或经由因PCR扩增所致的错误。
在本文中使用习知符号来描绘多肽序列：多肽序列的左手端为氨基端；多肽序列的右手端为羧基端。
“保守性取代”系指多肽中的氨基酸经功能上、结构上或化学上类似的天然或非天然氨基酸取代。在一实施例中，以下群组各自含有彼此可保守性取代的天然氨基酸：
(1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
(2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
(3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
(4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
(5)亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；及
(6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
在另一实施例中，以下群组各自含有彼此可保守性取代的天然氨基酸：
(1)甘氨酸(G)、丙氨酸(A)；
(2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
(3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
(4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
(5)亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)；
(6)丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；及
(7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)。
在另一实施例中，氨基酸可如下所述来分组。
(1)疏水性：Met、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响主链取向的残基：Gly、Pro；及
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe、His。
在一实施例中，本文所述的肽或多肽系使用编码CNP变体的多核苷酸经由重组方式产生。因此，本文包括编码本文所述的任何CNP变体的多核苷酸，包含此等多核苷酸视情况连接至表达控制序列的宿主细胞或载体，及使用此等多核苷酸、载体或宿主细胞来产生本文的CNP变体的方法。由此等多核苷酸表达的CNP变体可藉由包括以下的方法产生：在适于表达编码CNP变体的多核苷酸的条件下，使宿主细胞在培养基中生长，及自宿主细胞或培养基分离表达产物。实际表达产物可视任何转译后加工而与所编码的蛋白质产物略微不同。
“多核苷酸”系指由核苷酸单元构成的聚合物。多核苷酸包括天然存在的核酸，诸如脱氧核糖核酸(“DNA”)及核糖核酸(“RNA”)以及核酸类似物。术语”核酸”通常系指较大多核苷酸。术语”寡核苷酸”通常系指一般不超过约50个核苷酸的较短多核苷酸。应了解，当将核苷酸序列以DNA序列(亦即A、T、G、C)表示时，核苷酸序列亦包括”U”置换”T”的RNA序列(亦即A、U、G、C)。”cDNA”系指与mRNA互补或相同的呈单股或双股形式的DNA。
“表达控制序列”指调控其所可操作地连接的核苷酸序列的表达的核苷酸序列。”可操作地连接”系指两个部分之间的功能关系，其中一部分的活性(例如调控转录的能力)引起对另一部分的作用(例如序列的转录)。表达控制序列可包括(例如且不限于)启动子(例如诱导性或组成性启动子)、强化子、转录终止子、起始密码子(亦即ATG)、内含子的拼接信号及终止密码子的序列。
“重组多核苷酸”指具有在天然状态下并不联接在一起的序列的多核苷酸。经扩增或组装的重组多核苷酸可包括于适合载体中，且该载体可用于转化适合宿主细胞。将包含重组多核苷酸的宿主细胞称作”重组宿主细胞”。接着于重组宿主细胞中表达基因以产生例如”重组多肽”。重组多核苷酸亦可提供非编码功能(例如启动子、复制起点、核糖体结合位点等)。
如本文中所用，”嵌合体”指包含至少两个异源多核苷酸或多肽序列(亦即，来源于不同来源或彼此无关的天然存在的序列)的多核苷酸或多肽，这些异源多核苷酸或多肽序列系使用此项技术中通常已知的技术(例如重组表达或化学交联)直接或间接连接在一起。在一实施例中，异源序列可包含蛋白质或肽直接或间接连接至CNP肽或变体，包括可自CNP肽或变体切割的蛋白质或肽。在一相关实施例中，CNP变体为如本文所述的嵌合体。
在某些实施例中，嵌合体包括包含可切割载体蛋白或肽标签的CNP融合蛋白。术语”可切割载体蛋白”或”切割可切割肽标签”指可直接或经由接头间接融合至异源多肽序列，且可使用使切割可切割肽或多肽自异源多肽或蛋白质切割或分离的试剂自异源序列移除的肽或多肽序列。在一些实施例中，可切割载体蛋白或肽标签改良融合蛋白或异源多肽的产生、纯化及/或侦测。例示性可切割载体蛋白及肽标签包括(但不限于)人类转录因子TAF12(TAF12)、酮类固醇异构酶(KSI)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、β-半乳糖苷酶(β-Gal)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、硫氧还蛋白(Trx)、壳多糖结合域(CBD)、BMP-2突变(BMPM)、SUMO、CAT、TrpE、葡萄球菌蛋白A、链球菌蛋白、淀粉结合蛋白、内葡聚糖酶A的纤维素结合域、外葡聚糖酶Cex的纤维素结合域、生物素结合域、recA、Flag、c-Myc、聚(His)、聚(Arg)、聚(Asp)、聚(Gln)、聚(Phe)、聚(Cys)、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、青色荧光蛋白、生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、抗体表位及其片段。
“切割剂”为适用于自异源多肽或蛋白质切割或分离例如可切割肽或多肽的试剂。例示性切割剂包括(但不限于)钯、溴化氰(CNBr)、甲酸、羟胺、梭菌蛋白酶、凝血酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶、羧肽酶、肠激酶(肠肽酶)、Kex 2蛋白酶、Omp T蛋白酶、因子Xa蛋白酶、枯草杆菌蛋白、proTEV、SUMO蛋白酶、V8蛋白酶、HIV蛋白酶、鼻病毒蛋白酶、变种枯草杆菌蛋白酶、IgA蛋白酶、人类Pace蛋白酶、胶原酶、Nia蛋白酶、脊髓灰白质炎病毒2Apro蛋白酶、脊髓灰白质炎病毒3C蛋白酶、genenase、弗林蛋白酶、弹性蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、皱胃酶(凝乳酶)、微生物天冬氨酸蛋白酶、木瓜酶、钙蛋白酶、木瓜凝乳酶、无花果酶(无花果蛋白酶)、菠萝酶(菠萝蛋白酶)、组织蛋白酶B、卡斯蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、内切蛋白酶Arg-C、内切蛋白酶Glu-C、内切蛋白酶Lys-C、胰舒血管素及纤维蛋白溶酶。
在两个或两个以上多核苷酸或多肽序列的情形中，术语”相同”或”相同性”百分比系指当比较及对准以获得最大对应性时，如使用一种以下序列比较算法或藉由目测来量测，两个或两个以上序列或子序列相同或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基。
在两个核酸或多肽的情形中，词组”实质上同源”或”实质上相同”一般指当比较及对准以获得最大对应性时，如使用一种以下序列比较算法或藉由目测所量测，两个或两个以上序列或子序列具有至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％核苷酸或氨基酸残基相同性。在某些实施例中，实质同源性或相同性存在于长度为至少约25、50、100或150个残基的序列的区域上。在另一实施例中，这些序列在比较生物聚合物中任一者或两者的整个长度上实质上同源或相同。
对于序列比较，通常以一个序列充当参考序列，用于与测试序列相比较。当使用序列比较算法时，将测试序列及参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，且指定序列算法的程序参数。接着由序列比较算法依据所指定的程序参数，计算测试序列相对于参考序列的序列相同性百分比。
供比较的序列的最佳对准可由以下来进行：例如Smith及Waterman，Adv.Appl.Math.(高等应用数学)，2：482(1981)的局部同源性算法、Needleman及Wunsch，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，48：443(1970)的同源性对准算法、Pearson及Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：2444(1988)的相似性搜寻法、此等算法的计算机化实施(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA，Genetics Computer Group(遗传学计算机组)，575 Science Dr.，Madison，WI)，或目测。适用算法的一实例为PILEUP，其使用Feng及Doolittle，J.Mol.Evol.(分子进化学杂志)，35：351-360(1987)的渐进式对准法的简化形式且类似于Higgins及Sharp，CABIOS，5：151-153(1989)所描述的方法。适用于产生序列多重对准的另一算法为Clustal W(Thompson等人，Nucleic AcidsResearch(核酸研究)，22：4673-4680(1994))。适用于测定序列相同性及序列相似性百分比的算法实例为BLAST算法(Altschul等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，215：403-410(1990)；Henikoff及Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：10915(1989)；Karlin及Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：5873-5787(1993))。执行BLAST分析的软件可经由国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。
如下所述，两个核酸序列或多肽实质上同源或相同的另一指标为：第一核酸所编码的多肽可与第二核酸所编码的多肽发生免疫交叉反应。因此，例如当一多肽与第二多肽不同的处仅在于保守性取代时，该两种多肽通常实质上相同。如本文所述，两个核酸序列实质上相同的另一指标为：两个分子在严格条件下彼此杂交。
“实质上纯”或”经分离”指目标物质为主要存在物质(亦即以摩尔浓度计，比组合物中任何其它个别大分子物质的丰度高)，且实质上纯化的部分为目标物质占所存在的所有大分子物质的至少约50％(以摩尔浓度计)的组合物。在一实施例中，实质上纯的组合物指，以摩尔浓度或重量计，相关物质占组合物中所存在大分子物质的至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或更高。若组合物基本上由单一大分子物质组成，则目标物质经纯化至基本均质(藉由习知侦测方法在组合物中不可侦测到污染物质)。出于此定义的目的，溶剂物质、小分子(＜500道尔顿)、稳定剂(例如BSA)及元素离子物质不被视为大分子物质。在一实施例中，本文的化合物为实质上纯或经分离。在另一实施例中，本文的化合物相对于其制造中所用的大分子起始物质为实质上纯或经分离。在另一实施例中，本文的医药组合物包含实质上纯或经分离的CNP变体与一或多种医药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂及视情况与另一生物活性剂混合。
如应用于目标的”天然存在”指该目标可见于自然界的事实。举例而言，存在于生物体(包括病毒)中且未经人类在实验室中有意修饰的多肽或多核苷酸序列为天然存在的。在一实施例中，”天然存在的”物质具有人类来源。
“野生型”(wt)为提及物种的多核苷酸、多肽或蛋白质的天然形式(包括序列)的术语。野生型形式有别于自遗传突变产生的多核苷酸、多肽或蛋白质的突变形式。
在一实施例中，作为第二多肽的”类似物”或”变体”或”衍生物”的第一多肽为与该第二多肽具有至少约50％、60％或70％序列同源性但小于100％序列同源性的多肽。此等类似物、变体或衍生物可包含非天然存在的氨基酸残基(包括(但不限于)高精氨酸、鸟氨酸、青霉胺及正缬氨酸)以及天然存在的氨基酸残基。此等类似物、变体或衍生物亦可由一个或复数个D-氨基酸残基构成，且亦可含有肽模拟物或肽键等构物，诸如两个或两个以上氨基酸或肽模拟物残基之间的非肽键。在另一实施例中，若第一多肽不为第二多肽的已知切割产物或不为第二多肽的已知前体，则即使第一多肽与第二多肽具有100％序列同源性或其具有野生型序列，第一多肽仍为该第二多肽的”类似物”、”变体”或”衍生物”。
在一实施例中，如本文中所用，术语”来源于”系指多肽或肽序列系基于野生型或天然存在的多肽或肽序列且可具有天然氨基酸、非天然氨基酸或肽模拟物的一或多个缺失、添加及/或取代。在一实施例中，衍生序列与野生型或天然存在的序列共享至少约40％、50％、60％或70％但小于100％的序列相似性。在另一实施例中，衍生物可为多肽的片段，其中该片段与野生型多肽在至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸的长度上实质上同源(例如至少约70％、75％、80％、85％、90％或95％同源)。在又一实施例中，若多肽具有野生型多肽上所不存在的部分(例如聚合物，诸如PEG)与其直接或间接连接，则即使该两种多肽的氨基酸序列共享100％同源性，该多肽仍”来源于”该野生型多肽。
如本文中所用，”NPPC来源的”多肽系指来源于利钠肽前体C(NPPC)多肽的多肽，其为126个氨基酸的单链前原多肽且在切割后最终产生wtCNP22。将信号肽自NPPC移除得到原CNP，且以内切蛋白酶弗林蛋白酶进一步切割产生53个氨基酸的活性肽(CNP-53)，其经分泌且经未知酶再切割，产生22个氨基酸的成熟肽(CNP或CNP-22)。因此，CNP22本身因来源于NPPC而为”NPPC来源的”多肽。在一实施例中，NPPC来源的多肽与野生型NPPC在相同数目的氨基酸残基上至少约40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％同源。进一步预期，NPPC来源的肽可包含NPPC多肽的约1至约53个，或1至37个，或1至35个，或1至31个，或1至27个，或1至22个，或10至35个，或约15至约37个残基。在一实施例中，NPPC来源的肽可包含具有来源于NPPC多肽的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52或53个氨基酸的序列。
术语”有效量”指足以对个体的健康状况、病理学或疾病产生所需结果或用于诊断目的的剂量。所需结果可包含剂量接受者的主观或客观改良。”治疗有效量”指对健康有效产生预定有利作用的药剂量。任何个别情况下的适当”有效”量均可由一般技术者使用常规实验来决定。应了解，用于任何特定患者的特定剂量浓度及给药频率均可改变且将视多种因素而定，包括所用特定化合物的活性；该化合物的生物可用性、代谢稳定性、排泄速率及作用时长；化合物的给予模式及时间；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别及膳食；及特定病状的严重度。
“治疗”指预防性治疗或治疗性治疗或诊断性治疗。在某些实施例中，”治疗”指出于治疗、预防或诊断目的给予个体化合物或组合物。
“预防性”治疗为出于降低产生病变的风险的目的给予未显示疾病征兆或仅显示疾病早期征兆的个体的治疗。可以预防性治疗的形式给予本文的化合物或组合物以降低产生病变的可能性或若已产生则将病变的严重度降至最小。
“治疗性”治疗为给予显示病变征兆或症状的个体以用于减弱或消除彼等征兆或症状的目的的治疗。这些征兆或症状可为生化、细胞、组织、功能或身体、主观或客观征兆或症状。本文的化合物亦可以治疗性治疗的形式给予或给予用于诊断。
“诊断”指鉴别病理学病状的存在、程度及/或性质。诊断方法在其特异性及选择性方面不同。尽管特定诊断方法可能不提供病状的确诊，但该方法若能提供有助于诊断的正面指示则已足够。
“骨或软骨相关生物标记”或”骨或软骨相关标记”指生长因子、酶、蛋白质或其它可侦测生物物质或部分，其含量与例如软骨更新(cartilage turnover)、软骨形成、软骨生长、骨吸收、骨形成、骨生长或其组合相关而增加或降低。此等生物标记可在给予如本文所述的CNP变体之前、期间及/或之后量测。例示性骨或软骨相关生物标记包括(但不限于)：CNP、cGMP、第II型胶原蛋白的前肽及其片段、II型胶原蛋白及其片段、I型胶原蛋白的前肽及其片段、I型胶原蛋白及其片段、骨钙化素、增殖细胞核抗原(PCNA)、聚集蛋白聚糖硫酸软骨素及碱性磷酸酶。可在任何适当生物样品(包括(但不限于)组织、血液、血清、血浆、脑脊髓液、滑液及尿)中量测软骨及骨相关生物标记。在一些实施例中，在来自经历功效/药效学活体内研究的动物及/或来自离体研究的条件培养基的血液、血浆或血清中量测生物标记。
在某些实施例中，量测至少一种骨或软骨相关生物标记的含量，且可根据所量测生物标记含量来调节给予个体的CNP变体的给予量或频率。在一些实施例中，生物标记的含量”低于目标含量”或”高于目标含量”。生物标记的目标含量为在接受CNP变体的个体中观察到治疗作用时生物标记的含量或含量范围。在某些实施例中，患有CNP反应性病症或病状的个体的生物标记目标含量为在未受影响的正常个体中观察到的生物标记的含量或含量范围。在其它实施例中，为指示治疗作用，生物标记的目标含量不需要与在正常个体中观察到的生物标记的含量或含量范围相等，但可在未受影响的个体中观察到的生物标记的”正常”含量或含量范围的例如100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或5％以内。
举例而言，若生物标记含量与骨或软骨形成或生长相关而增加，则指示治疗作用的生物标记的目标含量可高于未经给予CNP变体的患CNP反应性病症的患者中生物标记的含量，且可视情况低于未患该病症的个体中生物标记的”正常”含量、大致等于该生物标记的”正常”含量，或高于该生物标记的”正常”含量。在一实施例中，若生物标记的含量低于目标含量，则表明治疗作用不足，可能需要增加所给予CNP变体的给予量或频率。在一相关实施例中，若生物标记高于目标含量，则表明已给予多于必要量的CNP变体，可能需要降低所给予CNP变体的给予量或频率。
再举一实例，若生物标记的含量与骨或软骨形成或生长相关而降低，则指示治疗作用的生物标记的目标含量可低于未经给予CNP变体的患CNP反应性病症的患者中生物标记的含量，且可视情况高于未患该病症的个体中生物标记的”正常”含量、大致等该生物标记的”正常”含量，或低于该生物标记的”正常”含量。在该种情况下，可能适用上述调节CNP变体给予量及频率的相反情况。
“医药组合物”指在个体动物(包括人类及哺乳动物)中适用于医药用途的组合物。医药组合物包含治疗有效量的CNP变体、视情况选用的另一生物活性剂，及视情况选用的医药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。在一实施例中，医药组合物包含包含以下的组合物：活性成分，及构成载体的惰性成分，以及经由任何两种或两种以上成分的组合、复合或聚集，或经由一或多种成分的解离，或经由一或多种成分的其它类型的反应或相互作用直接或间接产生的任何产物。因此，本文的医药组合物包括混合本文的化合物与医药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂所制得的任何组合物。
“医药学上可接受的载体”指任何标准医药载体、缓冲剂及其类似物，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、5％葡聚糖水溶液，及乳液(例如油/水或水/油乳液)。赋形剂的非限制性实例包括佐剂、黏合剂、填充剂、稀释剂、崩解剂、乳化剂、湿润剂、润滑剂、助流剂、甜味剂、调味剂及着色剂。适合医药载体、赋形剂及稀释剂描述于Remington药典(Remington药典)第19版(Mack Publishing Co.，Easton，1995)中。较佳医药载体视活性剂的预定给予模式而定。典型给予模式包括经肠(例如经口)或非经肠(例如皮下、肌肉内、静脉内或腹膜内注射；或表面、经皮或经黏膜给予)。
“医药学上可接受的盐”为可调配为医药用化合物的盐，包括(但不限于)金属盐(例如钠、钾、镁、钙等)及氨或有机胺的盐。
“医药学上可接受”或”药理学上可接受”指并非在生物学上或其它方面不合需要的物质，亦即该物质可给予个体而不会引起任何不合需要的生物作用，或不会以有害方式与含其的组合物中的任何组分或与个体的身体上或体内所存在的任何组分相互作用。
术语”单位剂型”系指适于以单一剂量形式用于人类及动物个体的实体不连续单元，各单元以足以产生所需作用的量计算含有预定量的本文的化合物，视情况与医药学上可接受的赋形剂、稀释剂、载体或载体结合。本文的新颖单位剂型的规格视以下而定：所用特定化合物及欲达成的效果，及宿主中与各化合物相关的药效学。
“生理状况”指动物(例如人类)体内的状况。生理状况包括(但不限于)体温，及生理性离子强度的水性环境、pH值及酶。生理状况亦包括特定个体体内不同于大多数个体中存在的”正常”状况的状况，例如这些状况不同于约37℃的正常人类体温或不同于约7.4的正常人类血液pH值。
“生理pH值”或”生理学范围内的pH值”指在包括约7.0至8.0在内的范围内、较通常在包括约7.2至7.6在内的范围内的pH值。
如本文中所使用，术语”个体”包括哺乳动物及非哺乳动物。哺乳动物的实例包括(但不限于)哺乳动物纲的任何成员：人类、非人类灵长类动物(诸如黑猩猩)，及其它猿及猴物种；农畜，诸如牛、马、绵羊、山羊、猪；家畜，诸如兔、犬及猫；实验动物，包括啮齿动物，诸如大鼠、小鼠及天竺鼠，及其类似动物。非哺乳动物的实例包括(但不限于)鸟类、鱼及其类似动物。该术语不指定特定年龄或性别。
除非另有指示，否则术语”聚乙二醇”、”PEG”、”聚环氧乙烷”及”PEO”在本文中可互换使用。经由氨基偶联至与数值n相关的”PEOn”聚合物的CNP肽(CNP22或其变体)一般具有式：CH3-[-O-CH2CH2-]n-C(＝O)-NHR，其中n为环氧乙烷单元的数目且R表示肽的剩余部分。”PEOn”聚合物可视情况在羰基碳与重复的环氧乙烷单元之间具有伸烷基(CH2)m，其中m为1至5的整数。该种”PEOn”(例如PEO12或PEO24)聚合物具有单分散性，亦即，其为具有特定分子量的单一不连续聚合物。类似地，经由氨基偶联至与数值nK相关的”PEGnK”聚合物的CNP肽一般具有式：CH3-[-O-CH2CH2-]p-C(＝O)-NHR，其中p为大于1的整数。”PEGnK”聚合物亦可视情况在羰基碳与重复的环氧乙烷单元之间具有伸烷基(CH2)m，其中m为1至5的整数。然而，该种”PEGnK”(例如PEG1K、PEG2K、PEG5K或PEG20K)聚合物具有多分散性，亦即含有具有分子量分布的聚合物的混合物，其中数值nK表示聚合物的数目平均分子量(Mn)(以千道尔顿为单位)。举例而言，偶联至CNP肽的”PEG2K”表示具有数目平均分子量为约2kDa的聚合物的多分散性PEG聚合物。
除非另作明确指示，否则当指定聚合物(例如PEG)的质量范围(例如以kDa为单位)时，该范围指聚合物数目平均分子量的范围，而非多分散性混合物中多种聚合物的分子量的范围。
术语”卤素”、”卤化物”或”卤基”系指氟、氯、溴及/或碘。
术语”烷基”指直链或支链饱和单价烃基，其中烷基可视情况经一或多个如本文所述的取代基Q取代。在某些实施例中，烷基为具有1至20个(C1-20)、1至15个(C1-15)、1至12个(C1-12)、1至10个(C1-10)或1至6(C1-6)个碳原子的直链饱和单价烃基，或具有3至20个(C3-20)、3至15个(C3-15)、3至12个(C3-12)、3至10个(C3-10)或3至6(C3-6)个碳原子的支链饱和单价烃基。如本文中所使用，直链C1-6及支链C3-6烷基亦称为”低碳烷基”。烷基的实例包括(但不限于)甲基、乙基、丙基(包括所有异构形式，包括正丙基及异丙基)、丁基(包括所有异构形式，包括正丁基、异丁基、仲丁基及叔丁基)、戊基(包括所有异构形式)及己基(包括所有异构形式)。举例而言，C1-6烷基指具有1至6个碳原子的直链饱和单价烃基或具有3至6个碳原子的支链饱和单价烃基。
术语”烷氧基”指-O-烷基。在某些实施例中，烷氧基可视情况经一或多个如本文所述的取代基Q取代。
术语”卤代烷基”指经一或多个卤原子取代的烷基。在某些实施例中，卤代烷基系经一、二、三、四、五或六个卤原子取代。在某些实施例中，卤代烷基可视情况经一或多个如本文所述的其它取代基Q取代。
术语”环烷基”指可视情况经一或多个如本文所述的取代基Q取代的环状饱和桥联及/或非桥联单价烃基。在某些实施例中，环烷基具有3至20(C3-20)、3至15(C3-15)、3至12(C3-12)、3至10(C3-10)或3至7(C3-7)个碳原子。环烷基的实例包括(但不限于)环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、十氢萘基及金刚烷基。
术语”杂环基”或”杂环”指单环非芳族环系统或含有至少一个非芳族环的多环系统，其中一或多个非芳族环原子为独立地选自O、S或N的杂原子，且其余非芳族环原子为碳原子。在某些实施例中，杂环基或杂环基团具有3至20个、3至15个、3至10个、3至8个、4至7个或5至6个环原子。在某些实施例中，杂环基为单环、双环、三环或四环系统，其可包括稠合或桥联的环系统，且其中氮或硫原子可视情况经氧化，氮原子可视情况经季铵化，且一些环可为部分或完全饱和，或为芳族。杂环基可于使得产生稳定化合物的任何杂原子或碳原子处连接至主结构。杂环基团的实例包括(但不限于)吖啶基、氮杂
Figure BPA00001469544100481
基、苯并咪唑基、苯并吲哚基、苯并异
Figure BPA00001469544100482
唑基、苯并异嗪基、苯并二
Figure BPA00001469544100484
烷基、苯并间二氧杂环戊烯基、苯并呋喃酮基、苯并呋喃基、苯并萘并呋喃基(benzonaphthofuranyl)、苯并吡喃酮基、苯并吡喃基、苯并四氢呋喃基、苯并四氢噻吩基、苯并噻二唑基、苯并噻唑基、苯并苯硫基、苯并三唑基、苯并硫代吡喃基、苯并嗪基、苯并
Figure BPA00001469544100486
唑基、苯并噻唑基、β-咔啉基、咔唑基、色满基、色酮基、噌啉基、香豆素基、十氢异喹啉基、二苯并呋喃基、二氢苯并异噻嗪基、二氢苯并异
Figure BPA00001469544100487
嗪基、二氢呋喃基、二氢吡喃基、二氧戊环基、二氢吡嗪基、二氢吡啶基、二氢吡唑基、二氢嘧啶基、二氢吡咯基、二氧戊环基、1，4-二噻烷基、呋喃酮基、呋喃基、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、咪唑并吡啶基、咪唑并噻唑基、吲唑基、吲哚啉基、吲嗪基、吲哚基、异苯并四氢呋喃基、异苯并四氢噻吩基、异苯并噻吩基、异色满基、异香豆素基、异吲哚啉基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑烷基、异噻唑基、异唑烷基、异唑基、吗啉基、萘啶基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、
Figure BPA000014695441004810
二唑基、
Figure BPA000014695441004811
唑烷酮基、
Figure BPA000014695441004812
唑烷基、
Figure BPA000014695441004813
唑并吡啶基、
Figure BPA00001469544100491
唑基、环氧乙烷基(oxiranyl)、萘嵌二氮苯基、菲啶基、菲咯啉基(phenathrolinyl)、吩吡嗪基、吩嗪基、吩噻嗪基基、吩
Figure BPA00001469544100492
嗪基、酞嗪基、哌嗪基、哌啶基、4-哌啶酮基、喋啶基、嘌呤基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑基、哒嗪基、吡啶基、吡啶并吡啶基、嘧啶基、吡咯烷基、吡咯啉基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、喹喔啉基、奎宁环基、四氢呋喃基(tetrahydrofuryl)、四氢呋喃基(tetrahydrofuranyl)、四氢异喹啉基、四氢吡喃基、四氢噻吩基、四唑基、噻二唑并嘧啶基、噻二唑基、噻吗啉基、噻唑烷基、噻唑基、噻吩基、三嗪基、三唑基及1，3，5-三噻烷基。在某些实施例中，杂环基团可视情况经一或多个如本文所述的取代基Q取代。
术语”芳基”指含有至少一个芳族烃环的单环芳族基团或多环单价芳族基团。在某些实施例中，芳基具有6至20个(C6-20)、6至15个(C6-15)或6至10(C6-10)个环原子。芳基的实例包括(但不限于)苯基、萘基、茀基、薁基、蒽基、菲基、芘基、联苯及三联苯。芳基亦指至少一个环为芳族且其它环可为饱和、部分不饱和或芳族的双环或三环碳环，例如二氢萘基、茚基、二氢茚基及四氢萘基(萘满基)。在某些实施例中，芳基可视情况经一或多个如本文所述的取代基Q取代。
术语”杂芳基”指含有至少一个芳族环的单环芳族基团或多环芳族基团，其中至少一个芳族环含有一或多个独立地选自O、S及N的杂原子。杂芳基的各环可含有一或两个O原子、一或两个S原子及/或一至四个N原子，限制条件为各环中杂原子的总数为四或四以下且各环含有至少一个碳原子。杂芳基可于使得产生稳定化合物的任何杂原子或碳原子处连接至主结构。在某些实施例中，杂芳基具有5至20个、5至15个或5至10个环原子。单环杂芳基的实例包括(但不限于)吡咯基、吡唑基、吡唑啉基、咪唑基、
Figure BPA00001469544100493
唑基、异
Figure BPA00001469544100494
唑基、噻唑基、噻二唑基、异噻唑基、呋喃基、噻吩基、
Figure BPA00001469544100495
二唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基及三嗪基。双环杂芳基的实例包括(但不限于)吲哚基、苯并噻唑基、苯并
Figure BPA00001469544100496
唑基、苯并噻吩基、喹啉基、四氢异喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并吡喃基、吲嗪基、苯并呋喃基、异苯并呋喃基、色原酮基、香豆素基、噌啉基、喹喔啉基、吲唑基、嘌呤基、吡咯并吡啶基、呋喃并吡啶基、噻吩并吡啶基、二氢异吲哚基及四氢喹啉基。三环杂芳基的实例包括(但不限于)咔唑基、苯并吲哚基、菲咯啉基、吖啶基、菲啶基及呫吨基。在某些实施例中，杂芳基可视情况经一或多个如本文所述的取代基Q取代。
术语”视情况经取代”意欲指基团(包括烷基、烷氧基、卤代烷基、环烷基、杂环基、芳基及杂芳基)可经一或多个取代基Q(在一实施例中，一、二、三或四个取代基Q)取代，其中各Q独立地选自由以下组成的群：氰基、卤基、氧、硝基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤基-C1-6烷基、C3-7环烷基、杂环基、C6-14芳基、杂芳基、-C(O)Re、-C(O)ORe、-C(O)NRfRg、-C(NRe)NRfRg、-ORe、-OC(O)Re、-OC(O)ORe、-OC(O)NRfRg、-OC(＝NRe)NRfRg、-OS(O)Re、-OS(O)2Re、-OS(O)NRfRg、-OS(O)2NRfRg、-NRfRg、-NReC(O)Rf、-NReC(O)ORf、-NReC(O)NRfRg、-NReC(＝NRh)NRfRg、-NReS(O)Rf、-NReS(O)2Rf、-NReS(O)NRfRg、-NReS(O)2NRfRg、-SRe、-S(O)Re、-S(O)2Re及-S(O)2NRfRg，其中各Re、Rf、Rg及Rh独立地为氢、C1-6烷基、C3-7环烷基、杂环基、C6-14芳基或杂芳基；或Rf及Rg连同其所连接的N原子一起形成杂环基。
B.GNP变体
CNP22作为治疗剂的用途受限于其在血浆中的短半衰期(J.Clin.Endocrinol.Metab.(临床内分泌代谢杂志)，78：1428-35(1994))。在人类血浆中，CNP22的浓度通常小于5皮摩尔。在人体中，CNP22由NEP及NPR-C降解且自循环中清除(Growth Hormone&IGF Res.，16：S6-S14)。在使用全身性给予的CNP22的所有人类及动物研究中，均已使用连续输注来增加个体体内的CNP22浓度。具有较长半衰期及至少类似程度功能性的CNP肽将有益于基于CNP的治疗策略。CNP变体亦揭示于相关国际申请案第PCT/US08/84270号(以引用的方式明确并入本文中)中。
本文提供对NEP及/或NPR-C具有降低的亲和力，且对NEP的切割及NPR-C的清除作用具有降低的敏感性，但具有与野生型CNP22相比实质上类似或更佳的功能性的CNP变体。CNP变体对NEP的切割及/或NPR-C的清除作用的敏感性降低将使变体的血浆或血清半衰期增加，藉此增加变体分布至目标组织及部位且实现所需药理学作用的机会。在某些实施例中，与wtCNP22相比，本文所述的CNP变体对NEP的切割及/或NPR-C的清除作用的活体外或活体内敏感性至少降至约1/1.5、1/2、1/2.5、1/3、1/3.5、1/4、1/4.5或1/5，且与wtCNP22相比，活体内血浆或血清半衰期至少增至约1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍或5倍，同时保留wtCNP22功能性的至少约50％、60％、70％、80％、90％或100％，或具有wtCNP22功能性至少约1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍或5倍大的功能性。可在活体外或活体内研究中就一或多种与软骨或骨形成或生长相关的生物标记(例如cGMP)的含量、在离体或活体内研究中就特定骨的长度等来评估CNP功能性。
NEP的天然底物较小且利钠肽(约2.2kDa至约3.2kDa)为最大的天然底物。根据X射线结晶学分析，NEP活性位点深埋于中央腔隙内部，从而有效限制底物分子大小不超过约3kDa(Oefner等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，296：341-349(2000))。基于NPR-B信号传导研究，CNP-22的变体(诸如CNP-17(仅保留CNP22的环状域Cys6-Cys22)及CNP-53(在N端具有31个氨基酸的延伸的CNP-22))仍可类似于2.2kDa wtCNP-22结合并活化NPR-B。因此，本文包括在CNP22或其变体的N端及/或C端偶联至天然聚合物(例如肽)及/或合成聚合物(例如PEG)的CNP变体，其显示NEP抗性增强，但保留结合及活化NPR-B信号传导受体的能力。
在一实施例中，本文包括由以下通式表示的CNP变体：
(x)-Cys6-Phe7-Gly8-Leu9-Lys10-Leu11-Asp12-Arg13-Ile14-Gly15-Ser16-Met17-Ser18-Gly19-Leu20-Gly21-Cys22-(z)(SEQ ID NO：139)，或
(x)-Gly1-Leu2-Ser3-Lys4-Gly5-Cys6-Phe7-Gly8-Leu9-Lys10-Leu11-Asp12-Arg13-Ile14-Gly15-Ser16-Met17-Ser18-Gly19-Leu20-Gly21-Cys22-(z)(SEQ ID NO：140)，其中：
(x)及(z)各自独立地为本文所述的天然聚合物(例如含有至少一个氨基酸的肽序列)及/或合成聚合物(例如PEG)，使得CNP变体的总质量的特征在于本文一般描述的范围，例如在约2.6kDa或2.8kDa至约6kDa或7kDa的范围内。在一实施例中，Cys6至Cys22的残基形成环状部分。在一实施例中，(x)及/或(z)包含来源于NPPC或非CNP多肽(例如ANP、BNP、IgG等)的氨基酸延伸，其中该延伸含有1至40个、1至35个、1至31个、5至35个、5至31个或5至15个氨基酸。在另一实施例中，CNP变体在CNP22的一或多个以下位置包含一或多个另一天然氨基酸、非天然氨基酸、肽模拟物及/或肽键等构物的修饰及/或取代：Gly1、Lys4、Gly5、Cys6、Phe7、Gly8、Leu9、Lys10、Leu11、Ile14、Gly15、Ser16、Met17、Gly19、Leu20及Gly21。
在另一实施例中，总质量特征在于本文一般描述的范围(例如约2.6kDa或2.8kDa至约6kDa或7kDa)，经设计为增强对NEP降解的抗性的CNP变体系由以下通式表示：
(x)-Cys6-Phe7-Gly8-Leu9-(h)10-Leu11-Asp12-Arg13-Ile14-Gly15-Ser16-Met17-Ser18-Gly19-Leu20-Gly21-Cys22-(z)(SEQ ID NO：141)，或
(x)-Gly1-Leu2-Ser3-(b)4-Gly5-Cys6-Phe7-Gly8-Leu9-(h)10-Leu11-Asp12-Arg13-Ile14-Gly15-Ser16-Met17-Ser18-Gly19-Leu20-Gly21-Cys22-(z)(SEQ IDNO：6)，其中：
(x)为合成或天然聚合基团，或其组合，其中合成聚合基团的非限制性实例为PEG(PEO)，且天然聚合基团的非限制性实例为含有1至35个氨基酸且来源于以下的氨基酸序列：NPPC或其具有取代及/或缺失的变体、ANP、BNP，或其它非CNP多肽或肽，诸如血清白蛋白、IgG、富含组氨酸的糖蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白原、含锌指多肽、骨织素或成纤维细胞生长因子2(FGF2)；
(z)可不存在或可为合成或天然聚合基团，或其组合，其中合成聚合基团的非限制性实例为PEG，且天然聚合基团的非限制性实例为来源于利钠多肽(例如NPPC、CNP、ANP或BNP)或非利钠多肽(例如血清白蛋白或IgG)的氨基酸序列；且
(b)及(h)可独立地为该位置的野生型Lys，或可经由保守性氨基酸取代或经侧链上不具有反应性伯胺的任何天然或非天然氨基酸或肽模拟物(包括(但不限于)Arg、Gly、6-羟基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gln、Glu或Ser)置换。在一实施例中，(b)为Arg。在另一实施例中，为提高NEP抗性，(b)不为Gly。在另一实施例中，(h)不为Arg。
来源于NPPC或其变体的氨基酸序列的非限制性实例包括：
Arg，
Glu-Arg，
Gly-Ala-Asn-Lys-Lys(SEQ ID NO：7)，
Gly-Ala-Asn-Arg-Arg(SEQ ID NO：8)，
Gly-Ala-Asn-Pro-Arg(SEQ ID NO：9)，
Gly-Ala-Asn-Gln-Gln(SEQ ID NO：10)，
Gly-Ala-Asn-Ser-Ser(SEQ ID NO：11)，
Gly-Ala-Asn-Arg-Gln(SEQ ID NO：12)，
Gly-Ala-Asn-Arg-Met(SEQ ID NO：13)，
Gly-Ala-Asn-Arg-Thr(SEQ ID NO：14)，
Gly-Ala-Asn-Arg-Ser(SEQ ID NO：15)，
Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala(SEQ ID NO：16)，
Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg(SEQ ID NO：17)，
Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg(SEQ ID NO：18)，
Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys(SEQ IDNO：19)，
Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Arg-Arg(SEQ IDNO：20)，
Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys(SEQ ID NO：21)，及
Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Arg-Arg(SEQ ID NO：22)。
来源于非CNP多肽(诸如ANP、BNP、血清白蛋白及IgG)的氨基酸序列的非限制性实例包括：
Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser(SEQ ID NO：23)；
Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr(SEQ ID NO：24)；
Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO：25)；
Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly(SEQ ID NO：26)；
Lys-Val-Leu-Arg-Arg-Tyr(SEQ ID NO：27)；
Lys-Val-Leu-Arg-Arg-His(SEQ ID NO：28)；
Gly-Gln-His-Lys-Asp-Asp-Asn-Pro-Asn-Leu-Pro-Arg(SEQ ID NO：29)；
Gly-Val-Pro-Gln-Val-Ser-Thr-Ser-Thr(SEQ ID NO：30)；
Gly-Glu-Arg-Ala-Phe-Lys-Ala-Trp-Ala-Val-Ala-Arg-Leu-Ser-Gln(SEQ IDNO：31)；
Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser(SEQ ID NO：32)。
在一实施例中，如本文所述，具有(x)及/或(z)基团的任何CNP变体的N端(x)基团及/或C端(z)基团独立地包含含有少量(若存在)天然或非天然酸性氨基酸(例如Asp或Glu)的氨基酸序列。在另一实施例中，(x)及/或(z)富含天然或非天然碱性氨基酸(例如Lys、Arg或His)，以维持类似CNP22的pI值(pI 8.9)的碱性pI值。在一实施例中，CNP变体的pI值在约8至约10.5的范围内，旨在使得CNP变体可更容易扩散穿过包围骨生长板的软骨细胞的细胞外基质。在较窄的实施例中，CNP变体的pI值为约8.5至约10.5，或约8.5至约10，或约9至约10。
在另一实施例中，(x)及/或(z)富含天然或非天然极性氨基酸，旨在增强水溶性。在又一实施例中，(x)及/或(z)含有少量(若存在)天然或非天然疏水性氨基酸(例如Ala、Val、Leu、Ile或Met)。
在另一实施例中，CNP变体的N端以至少一个甘氨酸残基终止，其设计在于增加血清半衰期。在相关实施例中，为防止形成焦谷氨酰胺，CNP变体的N端以甘氨酸残基终止，或者以谷氨酰胺终止。在一实施例中，(x)基团含有延伸的氨基酸，其N端以至少一个甘氨酸残基终止。在另一实施例中，(x)及/或(z)不含两个相邻天然或非天然碱性氨基酸(例如Lys-Lys或Arg-Arg)，旨在降低对弗林蛋白酶切割的敏感性。在一实施例中，(x)不含紧接于对应于CNP22的Gly1的位置之前的两个相邻碱性氨基酸。
在又一实施例中，CNP变体的(x)基团及/或(z)基团包含来源于NPPC(例如来源于CNP53)的氨基酸序列。在一实施例中，(x)包含来源于ANP或BNP的N端尾的氨基酸序列。在另一实施例中，(z)包含来源于ANP或BNP的C端尾的氨基酸序列。在另一实施例中，(x)及/或(z)包含来源于非利钠多肽的氨基酸序列，诸如，例如：IgG、人类血清白蛋白(HSA)、富含组氨酸的糖蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白原、含锌指多肽、FGF-2及骨靶向蛋白(例如骨织素、骨桥蛋白、骨钙化素及涎蛋白)。
在本文所述的CNP22或其变体可具有N端(x)基团及/或C端(z)基团的任何实施例中，(x)及/或(z)可独立地含有来源于骨形态发生蛋白(BMP)的功能域的氨基酸序列。藉由增加CNP变体的总质量以使其特征在于本文一般描述的范围(例如约2.6kDa或2.8kDa至约6或7kDa的范围)，来源于BMP的功能域的N端及/或C端氨基酸延伸可增强NEP抗性，且因此增加CNP变体的血清半衰期。另外，因为某些BMP为诱导骨及软骨形成的生长因子及细胞因子，所以来源于BMP的功能域的片段可通过不同于以CNP22或其变体的环状域活化NPR-B的鸟苷酸环化酶功能的机制促进软骨细胞、软骨或骨生长。促进骨形成及发育、软骨形成及发育及/或成骨细胞分化的BMP的非限制性实例包括BMP1、BMP2、BMP3、BMP5、BMP7及BMP8a。在一实施例中，CNP22或其变体的N端及/或C端独立地偶联至来源于BMP1、BMP2、BMP3、BMP5、BMP7或BMP8a的C端部分中最后140个氨基酸的氨基酸序列。
在一实施例中，CNP变体在CNP22或CNP17的N端及/或C端含有氨基酸延伸，包括(但不限于)：
DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-53)(SEQID NO：4)；
QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37，类似物BL)(SEQ ID NO：60)；
AAWARLLQEHPNAGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CA)(SEQ IDNO：61)；
AAWARLLQEHPNARGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CB)(SEQ ID NO：62)；
DLRVDTKSRAAWARGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CC)(SEQ ID NO：63)；
RGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO：40)；
ERGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO：38)；
GANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO：64)；
GANRRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO：65)；
GANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO：66)；
GANSSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO：67)；
GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO：144)；及
SPKMVQGSG-CNP17-KVLRRH(类似物CD)(具有来源于BNP的N端及C端尾的CNP17)(SEQ ID NO：68)。
在另一实施例中，CNP变体在CNP22的位置4具有K4R取代。CNP(K4R)变体的非限制性实例包括：
GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物AY)(SEQ ID NO：36)；
GANPRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CI)(SEQ ID NO：37)；
RGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物AZ)(SEQ ID NO：41)；
ERGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物BA)(SEQ ID NO：39)；
GANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CH)(SEQ ID NO：69)；及
GANSSGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CG)(SEQ ID NO：70)。
在其它实施例中，CNP变体为包含CNP22或其具有氨基酸添加、缺失及/或取代的变体，及位于CNP肽N端的来源于除CNP外的多肽或蛋白质的肽片段，或完整非CNP多肽或蛋白质的嵌合体，其中CNP22或其变体可视情况具有一或多个氨基酸残基的N端氨基酸延伸。在某些实施例中，CNP嵌合体包含CNP22或其具有一或多个氨基酸残基的N端氨基酸延伸的变体。在某些实施例中，CNP嵌合体在紧接于CNP22或其变体的第一位置(在CNP22的情况下为Gly)之前含有赖氨酸-赖氨酸(KK)残基或GANKK残基。在其它实施例中，CNP嵌合体在紧接于CNP22或其变体的第一位置之前含有一或两个不同于赖氨酸-赖氨酸的残基。可紧接于CNP22或其变体的第一位置之前的残基的非限制性实例包括KP、PK、PR、PQ、QK、QQ、RR、SS、GANKP(SEQ ID NO：200)、GANPK(SEQ ID NO：201)、GANPR(SEQ ID NO：9)、GANPQ(SEQ ID NO：202)、GANQK(SEQ ID NO：203)、GANQQ(SEQ ID NO：10)、GANRR(SEQ ID NO：8)及GANSS(SEQ ID NO：11)。
在另一实施例中，CNP变体为包含CNP22及N端肽片段的嵌合体，包括(但不限于)：
GHHSHEQHPHGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CQ)(富含组氨酸的糖蛋白(HRGP)片段-CNP22嵌合体)(SEQ ID NO：76)；
GAHHPHEHDTHGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CR)(HRGP片段-CNP22嵌合体)(SEQ ID NO：77)；
GHHSHEQHPHGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CX)(HRGP片段-CNP22嵌合体)(SEQ ID NO：78)；
GQPREPQVYTLPPSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CF)(IgG1(Fc)片段-CNP22嵌合体)(SEQ ID NO：79)；
GQHKDDNPNLPRGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CY)(人类血清白蛋白(HSA)片段-CNP22嵌合体)(SEQ ID NO：80)；
GERAFKAWAVARLSQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CE)(HSA片段-CNP22嵌合体)(SEQ ID NO：81)；
FGIPMDRIGRNPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CZ)(骨织素”NPR C抑制剂”片段-CNP22嵌合体)(SEQ ID NO：82)；及
GKRTGQYKLGSKTGPGPKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物DA)(FGF2”肝素结合域”片段-CNP22嵌合体)(SEQ ID NO：83)。
在另一实施例中，CNP变体为包含N端肽片段及CNP22(其中精氨酸取代CNP22的Lys4(“CNP22(K4R)”))的嵌合体，包括(但不限于)：
GQPREPQVYTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CK)(IgG1(Fc)片段-CNP22(K4R)嵌合体)(SEQ ID NO：84)；
GVPQVSTSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CL)(HSA片段-CNP22(K4R)嵌合体)(SEQ ID NO：85)；
GQPSSSSQSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CM)(纤连蛋白片段-CNP22(K4R)嵌合体)(SEQ ID NO：86)；
GQTHSSGTQSGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CN)(纤维蛋白原片段-CNP22(K4R)嵌合体)(SEQ ID NO：87)；
GSTGQWHSESGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CO)(纤维蛋白原片段-CNP22(K4R)嵌合体)(SEQ ID NO：88)；及
GSSSSSSSSSGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CP)(锌指片段-CNP22(K4R)嵌合体)(SEQ ID NO：89)。
包含IgG及CNP22或其变体的嵌合体经设计为尤其增强对NEP降解的抗性且减少与血清白蛋白的结合。包含HSA的表面片段的CNP嵌合体经设计为尤其降低免疫原性且减少与血清白蛋白的结合。在N端含有富含组氨酸、无赖氨酸、无精氨酸的阳离子性序列的HRGP-CNP22及HRGP-CNP22(K4R)嵌合体经设计为尤其增强对蛋白酶的稳定性。含有骨织素片段的嵌合体经设计以在骨生长板处在蛋白酶(例如弗林蛋白酶)切割后释放骨织素片段，其中该片段将抑制清除受体NPR-C。关于包含FGF2肝素结合片段的嵌合体，结合于片段的肝素经设计以保护嵌合体避免降解，从而提供较长血清半衰期。含有纤连蛋白、纤维蛋白原或锌指片段的嵌合体经设计为减少与血清白蛋白的结合，以及其它特征。
不希望受理论束缚，如与wtCNP22相比，对NEP降解的抗性增强且具有类似或改良的功能性(例如结合于NPR-B及刺激cGMP信号传导)的分子量为约2.6kDa或2.8kDa至约6kDa或7kDa的CNP变体若不紧密结合于血浆蛋白(诸如血清白蛋白)，则可能更有效。不紧密结合于血浆蛋白(例如血清白蛋白)的CNP变体可更有效地扩散穿过软骨，到达骨生长板的软骨细胞，且结合并活化NPR-B以进行cGMP信号传导。在一实施例中，经设计为减少与血浆蛋白(例如血清白蛋白)的结合的CNP变体为包含CNP22或其变体及来自IgG的肽片段的嵌合体。在另一实施例中，经设计为减少与血浆蛋白的结合的CNP变体为包含CNP22或CNP22(K4R)及来自多肽(例如IgG、HSA、纤连蛋白、纤维蛋白原、含锌指多肽等)的片段的嵌合体。在另一实施例中，经设计为减少与血浆蛋白的结合的CNP变体包含CNP22或其变体偶联至亲水性或水溶性聚合物。在一实施例中，亲水性或水溶性聚合物为PEG(或PEO)。在另一实施例中，亲水性或水溶性聚合物(例如PEG)经一或多个在生理条件下赋予聚合物负电荷的官能基(诸如羧基、硫酸根或磷酸根，或其组合)官能化。
在另一实施例中，本文的CNP变体包括介于人类CNP-17(hCNP-17)至人类CNP-53(hCNP-53)的范围内，且具有来源于hCNP-53的野生型氨基酸序列的截短CNP肽。此等截短CNP肽包括：
DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-53)(SEQID NO：4)；
LRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-52)(SEQ IDNO：146)；
RVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-51)(SEQ IDNO：147)；
VDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-50)(SEQ IDNO：148)；
DTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-49)(SEQ ID NO：149)；
TKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-48)(SEQ ID NO：150)；
KSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-47)(SEQ ID NO：151)；
SRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-46)(SEQ ID NO：152)；
RAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-45)(SEQ ID NO：153)；
AAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-44)(SEQ ID NO：154)；
AWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-43)(SEQ ID NO：155)；
WARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-42)(SEQ ID NO：156)；
ARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-41)(SEQ ID NO：157)；
RLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-40)(SEQ ID NO：158)；
LLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-39)(SEQ ID NO：159)；
LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-38)(SEQ ID NO：160)；
QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(SEQ ID NO：60)；
EHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-36)(SEQ ID NO：161)；
HPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-35)(SEQ ID NO：162)；
PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-34)(SEQ ID NO：163)；
NARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-33)(SEQ ID NO：164)；
ARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-32)(SEQ ID NO：165)；
RKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-31)(SEQ ID NO：166)；
KYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-30)(SEQ ID NO：167)；
YKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-29)(SEQ ID NO：168)；
KGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-28)(SEQ ID NO：169)；
GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-27)(SEQ ID NO：170)；
ANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-26)(SEQ ID NO：171)；
NKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-25)(SEQ ID NO：172)；
KKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-24)(SEQ ID NO：173)；
KGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-23)(SEQ ID NO：174)；
GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-22)(SEQ ID NO：1)；
LSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-21)(SEQ ID NO：175)；
SKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-20)(SEQ ID NO：176)；
KGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-19)(SEQ ID NO：177)；
GCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-18)(SEQ ID NO：178)；及
CFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-17)(SEQ ID NO：2)。
在某些实施例中，CNP变体不包括CNP-17、CNP-22或CNP-53。
在另一实施例中，介于hCNP-17至hCNP-53范围内的截短CNP肽可在特定截短CNP肽的任一或多个氨基酸位置含有如本文所述天然或非天然氨基酸或肽模拟物(例如肽键等构物)的氨基酸添加、缺失及/或取代。在另一实施例中，具有野生型序列或氨基酸添加、缺失及/或取代的截短CNP肽可在N端、C端及/或内部位点偶联至本文所述的任何部分，包括(但不限于)靶向骨或软骨的部分(例如二磷酸盐、靶向骨或软骨的肽序列(例如聚Asp、聚Glu)、来源于骨蛋白(例如骨桥蛋白、骨钙化素、涎蛋白)的骨靶向域的肽序列)、来源于骨形态发生蛋白(例如BMP2、BMP3、BMP5、BMP7、BMP8a)的功能域的肽序列、来源于利钠多肽(例如NPPC、ANP、BNP)的肽序列、来源于非利钠来源多肽(例如血清白蛋白、IgG、富含组氨酸的糖蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白原、含锌指多肽、FGF-2、骨织素)的肽序列、降低肾清除率的部分(例如带负电PEG部分)、亲水性聚合物(例如PEG)、碳水化合物(例如由骨生长板的细胞表面上的受体识别的碳水化合物)、疏水性酸(例如C5-C12羧酸、天然脂肪酸)、磷脂及其组合。在一实施例中，具有野生型序列或氨基酸添加、缺失及/或取代且视情况在N端、C端及/或内部位点偶联至一或多个部分的截短CNP肽具有特征在于本文一般描述的范围(例如约2.6kDa或2.8kDa至约6kDa或7kDa)的总质量。
在另一实施例中，CNP变体为CNP37的衍生物，该CNP37为QEHPNARKYKGANKK-CNP22(SEQ ID NO：60)。CNP37变体可在CNP37的37个位置中任一或多处含有天然或非天然氨基酸或肽模拟物(例如肽键等构物)的氨基酸添加、缺失及/或取代。依据CNP22的编号，CNP37中可进行的取代的非限制性实例包括K4R、G5S、G5R、G8S、K10R、G15S、S16Q、M17N、G19R及其组合。在一实施例中，CNP37衍生物含有天然氨基酸(例如天冬酰胺)或非天然氨基酸或肽模拟物对Met17的取代，旨在部分避免甲硫氨酸的硫原子被氧化。在另一实施例中，CNP37变体含有天然或非天然非碱性氨基酸或肽模拟物对Lys8、Lys10、Lys14及/或Lys15(依据始于CNP37的N端的编号)的取代，旨在部分减少白蛋白结合。
除氨基酸添加、缺失及/或取代的外或替代氨基酸添加、缺失及/或取代，CNP37衍生物可在N端、C端及/或内部位点偶联至本文所述的任何部分，这些部分包括(但不限于)靶向骨/软骨的部分(例如骨靶向肽域)、降低肾清除率的部分(例如带负电PEG部分)、亲水性聚合物(例如PEG)、包含一或多个氨基酸的氨基酸序列(例如骨织素”NPR-C抑制剂”片段)、碳水化合物(例如由骨生长板的细胞表面上的受体识别的碳水化合物)、疏水性酸(例如C5-C12羧酸及天然脂肪酸)，及其组合。
在一实施例中，CNP变体为经修饰的CNP37肽，其在弗林蛋白酶切割位点具有突变/取代(加下划线)，旨在提高对弗林蛋白酶的活体内抗性，及/或在N端含有甘氨酸(加下划线)，旨在提高血浆稳定性及防止形成焦谷氨酰胺。此等CNP37变体包括(但不限于)：
GQEHPNARKYKGANPKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CS)(SEQ ID NO：71)；
GQEHPNARKYKGANQKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CT)(SEQ ID NO：72)；
GQEHPNARKYKGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CU)(SEQ ID NO：73)；
GQEHPNARKYKGANKPGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(类似物CW)(SEQ ID NO：74)；
GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-CNP37，类似物DB)(SEQ IDNO：75)；及
PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP37)(SEQ ID NO：145)。
在另一实施例中，本文的CNP变体包括可通过本文所述的融合蛋白方法产生的CNP肽及其变体。可用本文所述的融合蛋白方法使用化学或蛋白水解切割或切割蛋白质自切割产生的CNP变体的非限制性实例包括：
GDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-wtCNP53)(SEQ ID NO：179)；
GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-wtCNP37)(SEQ ID NO：75)；
QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(wtCNP37)(SEQ ID NO：60)；
GHKSEVAHRFK-GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(HSA片段-wtCNP27)(SEQ ID NO：144)；
GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO：36)；
DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP53(M48N)](SEQ ID NO：180)；
GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[Gly-CNP37(M32N)](SEQ ID NO：181)；
QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP37(M32N)](SEQ ID NO：182)；
GHKSEVAHRFK-GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[HSA-CNP27(M22N)](SEQ ID NO：183)；
GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP27(K4，5，9R，M22N)](SEQ ID NO：184)；
PDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-wtCNP53)(SEQ ID NO：185)；
PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-wtCNP37)(SEQ ID NO：145)；
PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-wtCNP37)(SEQ ID NO：186)；
PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(wtCNP34)(SEQ ID NO：187)；
P-GHKSEVAHRFK-GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-HSA-wtCNP27)(SEQ ID NO：188)；
PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Pro-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO：189)；
MDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-wtCNP53)(SEQ ID NO：190)；
MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-Gly-wtCNP37)(SEQ ID NO：191)；
MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-wtCNP37)(SEQ ID NO：192)；
M-GHKSEVAHRFK-GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-HSA-wtCNP27)(SEQ ID NO：193)；
MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Met-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO：194)。
其它CNP变体(包括介于hCNP-17至hCNP-53范围内且具有野生型序列或氨基酸添加、缺失及/或取代的截短CNP肽)亦可通过本文所述的融合蛋白方法产生，只要融合蛋白的化学或蛋白水解切割的预定位点不存在于目标CNP变体本身的氨基酸序列内。作为一非限制性实例，可采用本文所述的融合蛋白方法使用甲酸切割来产生截短wtCNP34。
在其它实施例中，对于具有天冬酰胺(Asn/N)残基及/或谷氨酰胺(Gln/Q)残基的本文所述的任何CNP肽及CNP变体，无论其是否具有野生型序列或非天然氨基酸序列，任何Asn残基及/或任何Gln残基均可独立地经任何其它天然或非天然氨基酸取代，包括保守性取代，诸如Asn经取代为Gln。此等取代系部分地旨在最小化或避免天冬酰胺及/或谷氨酰胺发生任何可能脱酰胺作用。任何Asn残基及/或任何Gln残基均可独立地经任何其它天然或非天然氨基酸取代(包括保守性取代，诸如Asn经取代为Gln)的CNP肽及变体的非限制性实例包括wtCNP34、wtCNP37、Gly-wtCNP37、Pro-wtCNP37、Pro-Gly-wtCNP37、GHKSEVAHRFK-wtCNP27(SEQ ID NO：144)、Pro-GHKSEVAHRFK-wtCNP27(SEQ ID NO：188)、PEO12-GANRR-CNP22(K4R)(SEQID NO：36)及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)。在某些实施例中，本文所述的CNP肽及CNP变体的天冬酰胺残基未经谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸取代。在某些实施例中，本文所述的CNP肽及CNP变体的谷氨酰胺残基未经天冬酰胺、天冬氨酸或谷氨酸取代。作为一非限制性实例，Pro-Gly-wtCNP37(PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC)(SEQ ID NO：145)的天冬酰胺残基7及/或15可独立地经任何其它天然或非天然氨基酸(包括谷氨酰胺)取代以避免天冬酰胺残基脱酰胺为天冬氨酸或异天冬氨酸的任何可能性。在某些实施例中，Pro-Gly-wtCNP37的天冬酰胺残基7及/或15未经谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸取代。
然而应了解，本文包括如下CNP变体：其中任一或多个(至多所有)易于发生脱酰胺或类脱酰胺反应(例如异构化)的残基均可经由脱酰胺或类脱酰胺反应以任何程度(依据转化的残基，至多转化100％)转化为其它残基。在某些实施例中，本文包括CNP变体，其中：
(1)任一或多个(至多所有)天冬酰胺(Asn/N)残基可经由脱酰胺作用转化为天冬氨酸或天冬氨酸盐，及/或转化为异天冬氨酸或异天冬氨酸盐，依据转化的残基，至多转化约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％；或
(2)任一或多个(至多所有)谷氨酰胺(Gln/Q)残基可经由脱酰胺作用转化为谷氨酸或谷氨酸盐，及/或转化为异谷氨酸或异谷氨酸盐，依据转化的残基，至多转化约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％；或
(3)任一或多个(至多所有)天冬氨酸或天冬氨酸盐(Asp/D)残基可经由类脱酰胺反应(亦称为异构化)转化为异天冬氨酸或异天冬氨酸盐，依据转化的残基，至多转化约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％；或
(4)任一或多个(至多所有)谷氨酸或谷氨酸盐(Glu/E)残基可经由类脱酰胺反应(亦称为异构化)转化为异谷氨酸或异谷氨酸盐，依据转化的残基，至多转化约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％；或
(5)上述各项的组合。
作为一非限制性实例，本文包括CNP变体，其中Pro-Gly-wtCNP37[PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC](SEQ ID NO：145)的任一或多个(至多所有)天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸及/或谷氨酸残基可经由脱酰胺或类脱酰胺反应分别转化为(1)天冬氨酸/天冬氨酸盐及/或异天冬氨酸/异天冬氨酸盐、(2)谷氨酸/谷氨酸盐及/或异谷氨酸/异谷氨酸盐、(3)异天冬氨酸/异天冬氨酸盐，及/或(4)异谷氨酸/异谷氨酸盐，如上所述，依据转化的残基，至多转化约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
作为另一实例，本文包括CNP变体，其中Pro-Gly-(SEQ ID NO：145)的任一或多个(至多所有)天冬酰胺及/或wtCNP37[PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC]天冬氨酸残基可经由脱酰胺或类脱酰胺反应分别转化为(1)天冬氨酸/天冬氨酸盐及/或异天冬氨酸/异天冬氨酸盐、及/或(2)异天冬氨酸/异天冬氨酸盐，依据转化的残基，至多转化约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
作为另一实例，本文包括CNP变体，其中Gly-wtCNP37[GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO：75)]的任一或多个(至多所有)天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸及/或谷氨酸残基可经由脱酰胺或类脱酰胺反应分别转化为(1)天冬氨酸/天冬氨酸盐及/或异天冬氨酸/异天冬氨酸盐、(2)谷氨酸/谷氨酸盐及/或异谷氨酸/异谷氨酸盐、(3)异天冬氨酸/异天冬氨酸盐，及/或(4)异谷氨酸/异谷氨酸盐，依据转化的残基，至多转化约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
作为又一实例，本文包括CNP变体，其中wtCNP37[QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO：60)]的任一或多个(至多所有)天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸及/或谷氨酸残基可经由脱酰胺或类脱酰胺反应分别转化为(1)天冬氨酸/天冬氨酸盐及/或异天冬氨酸/异天冬氨酸盐、(2)谷氨酸/谷氨酸盐及/或异谷氨酸/异谷氨酸盐、(3)异天冬氨酸/异天冬氨酸盐，及/或(4)异谷氨酸/异谷氨酸盐，依据转化的残基，至多转化约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
作为另一实例，本文包括CNP变体，其中HSA-wtCNP27嵌合体GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO：144)的任一或多个(至多所有)天冬酰胺、天冬氨酸及/或谷氨酸残基可经由脱酰胺或类脱酰胺反应分别转化为(1)天冬氨酸/天冬氨酸盐及/或异天冬氨酸/异天冬氨酸盐、(2)异天冬氨酸/异天冬氨酸盐，及/或(3)异谷氨酸/异谷氨酸盐，依据转化的残基，至多转化约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
作为又一实例，本文包括CNP变体，其中Pro-HSA-wtCNP27嵌合体PGHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO：188)的任一或多个(至多所有)天冬酰胺、天冬氨酸及/或谷氨酸残基可经由脱酰胺或类脱酰胺反应分别转化为(1)天冬氨酸/天冬氨酸盐及/或异天冬氨酸/异天冬氨酸盐、(2)异天冬氨酸/异天冬氨酸盐，及/或(3)异谷氨酸/异谷氨酸盐，依据转化的残基，至多转化约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
另外，本文包括CNP变体，其中任一或多个(至多所有)甲硫氨酸(Met/M)残基可氧化为任何化学上可行的氧化形式(例如亚砜及/或砜)，依据氧化的残基，至多转化约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
在另一实施例中，CNP变体包含CNP22或其变体在N端及/或C端偶联至有助于变体移位穿过细胞膜或细胞障壁的部分。在一实施例中，CNP变体在N端及/或C端偶联至有助于输送变体穿过细胞膜或细胞障壁(包括经由活性肽转运体)的肽序列。
在另一实施例中，使CNP22或其变体的N端及/或C端偶联至化学部分，诸如天然及/或合成聚合物，以将经修饰的CNP肽的总质量增加至本文一般描述的范围，例如约2.6kDa或2.8kDa至约6kDa或7kDa的范围。在一实施例中，化学部分为生物兼容性亲水性或水溶性天然(例如肽、碳水化合物)或合成(例如PEG(或PEO))聚合物。
在另一实施例中，使CNP22或其变体的N端及/或C端偶联至PEG(或PEO)聚合物以产生特征在于本文一般描述的范围(例如约2.6kDa或2.8kDa至约6kDa或7kDa)的总质量。CNP22或其变体的聚乙二醇化旨在尤其降低免疫原性及藉由降低肾清除率及增强蛋白酶抗性来提高半衰期。PEG部分可连接至本文所述的CNP22或任何变体的N端及/或C端，该变体包括(但不限于)CNP-17(CNP22的Cys6-Cys22环化部分)、CNP37，及CNP17、CNP22或CNP37的具有N端及/或C端氨基酸延伸、氨基酸取代及/或氨基酸缺失的变体。在一实施例中，CNP17、CNP22或CNP37或其变体的Lys4及/或Lys10残基经侧链上不含反应性伯胺的天然或非天然氨基酸(例如Arg、Gly、Ser、Gln、Glu或Cit)或肽模拟物取代，以排除此等赖氨酸残基的任何可能的聚乙二醇化。在一实施例中，CNP肽的Lys4及/或Lys10残基经Arg取代。在另一实施例中，Lys10残基未经Arg取代。
在另一实施例中，具有PEG(或PEO)部分及位于N端的氨基酸延伸的CNP变体(包括CNP22及其变体)在紧接于对应于CNP22的Gly1的位置之前的位置含有精氨酸。此等聚乙二醇化CNP变体经设计为增强对NEP降解的抗性、减少与血清白蛋白的结合及增强CNP功能活性(例如活化cGMP信号传导)。聚乙二醇化CNP变体的非限制性实例包括PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)、PEO12-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)、PEO24-GANRR-CNP22(SEQ ID NO：36)、PEO12-GANRR-CNP22(SEQ ID NO：36)、PEO24-GANPR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：37)、PEO12-GANPR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：37)、PEO24-GANPR-CNP22(SEQ ID NO：37)、PEO12-GANPR-CNP22(SEQ ID NO：37)、PEO24-GANQQ-CNP22(SEQ ID NO：64)、PEO12-GANQQ-CNP22(SEQ ID NO：64)、PEO24-ER-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：39)、PEO12-ER-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：39)、PEO24-ER-CNP22(SEQ ID NO：39)、PEO12-ER-CNP22(SEQ ID NO：39)、PEO24-R-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：41)、PEO12-R-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：41)、PEO24-R-CNP22(SEQ ID NO：41)及PEO12-R-CNP22(SEQ ID NO：41)，其中PEO24为单分散性1.2kDa PEG聚合物且PEO12为单分散性0.6kDa PEG聚合物。在一实施例中，PEG(或PEO)聚合物系偶联至CNP变体的N端。
本文包括使用以下方面可不同的亲水性或水溶性聚合物(例如PEG)：类型(例如同聚物或共聚物；随机共聚物、交替共聚物或嵌段共聚物；线性或分支；单分散或多分散)、键联(例如可水解键联或稳定键联，诸如酰胺、亚胺、胺、亚烷基或酯键)、偶联位点(例如在N端及/或C端，较佳不在CNP的环化区(对应于CNP22的残基6-22)中任何残基处)，及长度(例如约0.2、0.4或0.6kDa至约2、3、4或5kDa)。亲水性或水溶性聚合物可藉助于此项技术中已知的基于N-羟基丁二酰亚胺(NHS)或基于醛的化学或其它化学偶联至CNP肽。此等CNP变体可使用以下产生：例如wtCNP22(2.2kDa)、仅保留wtCNP22的环化区(残基6-22)的CNP17、在CNP22或CNP17的N端及/或C端具有氨基酸延伸的CNP变体，或具有氨基酸取代、添加及/或缺失的变体，诸如GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)、GANPR-CNP22(K4R)(SEQID NO：37)、R-CNP22(SEQ ID NO：40)、R-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：41)、ER-CNP22(SEQID NO：38)及ER-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：39)。在一实施例中，总质量的特征在于本文一般描述的范围(例如约2.6kDa或2.8kDa至约6或7kDa)的PEG-CNP变体含有经由基于NHS或基于醛的化学偶联于N端及/或C端的单分散性线性PEG(或PEO)部分，经由基于NHS的化学偶联于N端及/或C端的两臂或三臂分支PEG部分。本文亦包括经设计以降低肾清除率的带负电PEG-CNP变体，包括(但不限于)羧酸化、硫酸化及磷酸化化合物(Caliceti，Adv.Drug Deliv.Rev.(高等药物传递综述)，55：1261-77(2003)；Perlman，J.Clin.Endo.Metab.(临床内分泌代谢杂志)，88：3227-35(2003)；Pitkin，Antimicrob.Ag.Chemo.，29：440-444(1986)；Vehaskari，Kidney Int’l(国际肾脏)，22：127-135(1982))。在一实施例中，PEG(或PEO)部分含有羧基、硫酸根及/或磷酸根。
在另一实施例中，本文所述的偶联至CNP变体的N端、C端及/或内部位点的PEG(或PEO)部分含有一或多个在生理条件下带正电荷的官能基。此等PEG部分尤其旨在改良此等聚乙二醇化CNP变体于软骨组织的分布。在一实施例中，此等PEG部分含有一或多个一级、二级或三级氨基、季铵基及/或其它含胺(例如脲)基团。
在一实施例中，本文包括经由基于NHS或基于醛的化学偶联至式(CH2CH2O)n的PEG(或PEO)的CNP22或其变体，其中n为约6至约100的整数，且PEG聚合物为约0.3kDa至约5kDa。在另一实施例中，n为约12至约50的整数，且PEG聚合物为约0.6kDa至约2.5kDa。在另一实施例中，n为约12至约24，且PEG聚合物为约0.6kDa至约1.2kDa。在又一实施例中，PEG聚合物的末端羟基经非反应性基团封端。在一特定实施例中，封端基团为烷基，例如低级烷基，诸如甲基。
在另一实施例中，本文提供具有一或多个对肽酶(包括中性内肽酶(NEP))切割的敏感性降低的肽键或肽键等构物的CNP变体。NEP为切割较大疏水性残基的氨基端的底物肽键的膜结合锌依赖性内肽酶。因此，将NEP的切割位点处的肽键修饰为非天然肽键或非肽键可排除NEP切割或降低NEP切割的效率。
对于ANP及CNP，报导NEP切割首先发生于环化区内的Cys6-Phe7键，接着发生于遍及结构的其余部分的其它处。对于BNP，报导切割首先发生于肽N端，接着发生于环状结构内。尽管报导CNP上的主要NEP切割位点为Cys6-Phe7键，但当将wtCNP22于活体外暴露于NEP消化维持2.5分钟时，所有可能位点均意外水解，其中Cys6-Phe7及Gly8-Leu9肽键略微最不稳定，如实例2中所述。
NEP的底物特异性主要由两个底物结合子位点S1’及S2’决定(Oefner等人，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)296：341-349(2000))。S1’位点接受N端肽键经受水解的较大疏水性P1’残基(例如Phe、Leu、Ile及Met)。S2’位点一般优选称为P2’的较小残基(例如Gly或Ser)。在CNP的情况下，报导Phe7为NEP S1’位点的较佳P1’残基，而Gly8为S2’位点的较佳P2’残基。由于此两个子位点一起仅可容纳特定总侧链尺寸，因此CNP的P1’-P2’残基的总尺寸的任何增大可能会潜在地破坏NEP结合。举例而言，将氯原子添加于P1’Phe7芳族环的3位(亦即3-Cl-Phe7)可潜在地修饰CNP与NEP切割位点(例如在S1’子位点)之间的相互作用(例如使这些相互作用不稳定)。将叔丁基添加至较小P2’残基Gly8(亦即tBu-Gly8)可潜在地破坏CNP与S2’子位点之间的相互作用。
因此，在一实施例中，本文的CNP变体包括P1’-P2’残基(诸如Phe7-Gly8)尺寸增大以干扰活性位点处的底物识别，从而降低对NEP切割的敏感性的CNP。天然氨基酸、非天然氨基酸及/或肽模拟物部分可取代一或多个较大P1’疏水性残基(包括(但不限于)Phe7、Leu9、Leu11、Ile14、Met17及Leu20)及/或一或多个较小P2’残基(包括(但不限于)Cys6、Gly8、Gly15、Ser16及Gly19)。
本文包括在至少一个牵涉于底物识别及/或NEP切割的残基处包含至少一个经修饰氨基酸及/或至少一个经修饰肽键的CNP变体，其中这些经修饰氨基酸及经修饰肽键可为天然氨基酸、非天然氨基酸、肽模拟物及/或肽键等构物。在一实施例中，CNP上在Cys6与Phe7之间的NEP切割位点经修饰。在一相关实施例中，Cys6与Phe7之间的肽键(-C(＝O)-NH-)经一个以下肽键等构物置换：
-CH2-NH-，
-C(＝O)-N(R)-，其中酰氨基系经任何以下R基团烷基化：甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基，
-C(＝O)-NH-CH2-，
-CH2-S-，
-CH2-S(O)n-，其中n为1或2，
-CH2-CH2-，
-CH＝CH-，
-C(＝O)-CH2-，
-CH(CN)-NH-，
-CH(OH)-CH2-，
-O-C(＝O)-NH-，或
-NHC(＝O)NH-。
在另一实施例中，CNP变体系由下式表示：
(x)-Gly1-Leu2-Ser3-Lys4-Gly5-(b)6-(c)7-(d)8-Leu9-Lys10-Leu11-Asp12-Arg13-Ile14-Gly15-Ser16-Met17-Ser18-Gly19-Leu20-Gly21-Cys22-(z)(SEQ ID NO：90)，其中：
(x)及(z)独立地可不存在或可选自由以下组成的群：合成骨靶向化合物，诸如二磷酸盐；适用于靶向骨或软骨的氨基酸序列，例如聚Asp及聚Glu；来源于骨蛋白(诸如骨桥蛋白、骨钙化素及涎蛋白)的骨靶向域的氨基酸序列(Wang等人，Adv.Drug Delivery Rev.，57：1049-76(2005))；降低肾清除率的聚合分子及非聚合分子，诸如带负电PEG；及藉由使CNP变体的总质量增至本文一般描述的范围(例如约2.6kDa或2.8kDa至约6kDa或7kDa)来增强CNP变体对NEP降解的抗性的天然聚合物(例如含有氨基酸、脂肪酸及/或碳水化合物的天然聚合物)及合成聚合物(例如PEG)；
(b)及(c)可为野生型Cys6及Phe7、另一天然氨基酸或非天然氨基酸，或可含有如本文所述的肽键等构物以增强对NEP切割的抗性；且
(d)可为野生型Gly8，或可为较大天然或非天然(例如t-Bu-Gly)氨基酸或肽模拟物以减少与NEP的结合。
在一实施例中，此等CNP变体在(b)、(c)及/或(d)处含有至少一个经修饰氨基酸。
即使CNP22或其变体在Cys6-Phe7具有抗NEP的肽键或肽键等构物，但CNP内的其它肽键(包括Gly8-Leu9、Lys10-Leu11、Arg13-Ile14、Ser16-Met17及Gly19-Leu20键)亦可能会被切割。因此，本文包括除Cys6-Phe7键外亦在一或多个其它NEP切割位点具有肽键等构物的CNP变体，其中这些肽键等构物包括本文所述者。
在另一实施例中，本文包括在Cys6及/或Cys22具有半胱氨酸类似物(包括(但不限于)高半胱氨酸、青霉胺、2-巯基丙酸及3-巯基丙酸)的CNP变体。在一实施例中，此等CNP变体具有由野生型Cys6或类似物与Cys22或类似物之间的二硫键所形成的环状域。
在另一实施例中，CNP22或其变体的一或多个残基(至多所有残基)经D-氨基酸取代。以D-氨基酸取代L-氨基酸基本上将侧链自其原始位置移动约120度，藉此可能破坏CNP肽与NEP的结合。在一特定实施例中，Phe7处的L-Phe经其D-对映异构体D-Phe取代。
在又一实施例中，β氨基酸(诸如3-氨基-2-苯基丙酸(或2-苯基-β-丙氨酸))置换野生型α-氨基酸Phe7。使用β-氨基酸将肽主链长度有效增加一个亚甲基单元。蛋白酶抗性可因底物构型的变化或氨基酸侧链之间的距离增加而引起。
具有非天然α-氨基酸、β-氨基酸或肽键等构物的CNP22变体的非限制性实例包括：
GLSKGC(CH2NH)FGLKLDRIGSMSGLGC(类似物A)(SEQ ID NO：56)、
GLSKGC-(N-Me-Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC(类似物B)(SEQ ID NO：57)、
GLSKGC-(D-Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC(类似物E)(SEQ ID NO：136)、
GLSKGCF-(tBu-Gly)-LKLDRIGSMSGLGC(类似物F)(SEQ ID NO：58)、
GLSKGC-(3-Cl-Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC(类似物G)(SEQ ID NO：137)，及
GLSKGC-[NHCH2CH(Ph)CO]-GLKLDRIGSMSGLGC(类似物H，使用3-氨基-2-苯基丙酸形成)(SEQ ID NO：59)。
在另一实施例中，CNP变体具有特征在于本文一般描述的范围(例如约2.6kDa或2.8kDa至约6kDa或7kDa)的总质量，旨在增强对NEP降解的抗性，且这些变体由下式表示：
(x)-Gly1-Leu2-Ser3-(a)4-Gly5-(b)6-(c)7-(d)8-(e)9-(f)10-(g)11-Asp12-Arg13-(h)14-Gly15-Ser16-(i)17-Ser18-Gly19-(j)20-Gly21-Cys22-(z)(SEQ ID NO：46)，其中：
(x)及(z)独立地可不存在或可选自由以下组成的群：合成骨靶向化合物，诸如二磷酸盐；适用于靶向骨或软骨的氨基酸序列，诸如聚Asp及聚Glu；来源于骨蛋白(诸如骨桥蛋白、骨钙化素及涎蛋白)的骨靶向域的氨基酸序列；降低肾清除率的聚合及非聚合部分，诸如带负电PEG；含有例如氨基酸、疏水性酸及/或碳水化合物的聚合物；及合成亲水性聚合物，诸如PEG；
(a)可为该位置的野生型Lys，或可经保守性氨基酸取代或在侧链上不具有反应性伯胺的天然或非天然氨基酸或肽模拟物(包括(但不限于)Arg、Gly、6-羟基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gln、Ser或Glu)置换，其中在一实施例中，(a)为Arg；
(b)选自：Cys、及Cys6与Phe7之间的肽键等构物，诸如Cys-CH2-NH；
(c)选自：L-Phe；D-Phe；3-氨基-2-苯基丙酸；Phe的N-烷基化衍生物，其中N-烷基为甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基；及Phe类似物，其中Phe类似物的苯环的一或多个邻位、间位及/或对位系经一或多个选自由以下组成的群的取代基取代：卤素、羟基、氰基、直链或支链C1-6烷基、直链或支链C1-6烷氧基、直链或支链卤基-C1-6烷基、C3-10环烷基、杂环基、C6-14芳基及杂芳基(实例包括(但不限于)酪氨酸、3-氯苯丙氨酸、2，3-氯-苯丙氨酸、3-氯-5-氟-苯丙氨酸、2-氯-6-氟-3-甲基-苯丙氨酸)，或其中Phe类似物的苯环可经另一芳基(非限制性实例包括1-萘基丙氨酸及2-萘基丙氨酸)或杂芳基(非限制性实例包括吡啶基丙氨酸、噻吩基丙氨酸及呋喃基丙氨酸)置换；
(d)选自：Gly、叔丁基-Gly(tBu-Gly)、Thr、Ser、Val及Asn；
(e)选自：Leu、Ser、Thr及肽键等构物，诸如N-Me-Leu；
(f)可为该位置的野生型Lys，或可经保守性氨基酸取代或在侧链上不具有反应性伯胺的天然或非天然氨基酸或肽模拟物(包括(但不限于)Arg、Gly、6-羟基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gln、Ser或Glu)置换，其中在一实施例中，(f)不为Arg；
(g)选自：Leu及肽键等构物，诸如N-Me-Leu；
(h)选自：Ile、tBu-Gly、及肽键等构物，诸如N-Me-Ile；
(i)选自：Met、Val、Asn、β-Cl-Ala、2-氨基丁酸(Abu)及2-氨基-异丁酸(Aib)；且
(j)选自：Leu、正亮氨酸(Nle)、高亮氨酸(Hleu)、Val、叔丁基-Ala(tBu-Ala)、Ser、Thr、Arg、及肽键等构物，诸如N-Me-Leu。
在另一实施例中，CNP变体具有特征在于本文一般描述的范围(例如约2.6kDa或2.8kDa至约6kDa或7kDa)的总质量，旨在增强对NEP切割的抗性，且高等变体由下式表示：
(x)-Gly1-Leu2-Ser3-(a)4-Gly5-(b)6-(c)7-(d)8-(e)9-(f)10-(g)11-Asp12-Arg13-(h)14-(i)15-Ser16-(j)17-Ser18-Gly19-(k)20-Gly21-Cys22-(z)(SEQID NO：143)，其中：
(x)及(z)独立地可不存在或可选自由以下组成的群：合成骨靶向化合物，诸如二磷酸盐；适用于靶向骨或软骨的氨基酸序列，诸如聚Asp及聚Glu；来源于骨蛋白及其衍生物(诸如骨桥蛋白、骨钙化素、涎蛋白等的融合蛋白或肽序列)的骨靶向域的氨基酸序列；降低肾清除率的部分，包括(但不限于)亲水性或水溶性聚合物，诸如带电PEG分子；及包含例如PEG、氨基酸、碳水化合物及/或疏水性酸的部分；
(a)可为该位置的野生型Lys，或可经保守性氨基酸取代或在侧链上不具有反应性伯胺的天然或非天然氨基酸或肽模拟物(包括(但不限于)Arg、Gly、6-羟基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gln、Ser或Glu)置换，其中在一实施例中，(a)为Arg；
(b)选自：Cys、及Cys6与Phe7之间的肽键等构物，诸如Cys-CH2-NH；
(c)选自：L-Phe；D-Phe；3-氨基-2-苯基丙酸；Phe的N-烷基化衍生物，其中N-烷基为甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基；及Phe类似物，其中Phe类似物的苯环的一或多个邻位、间位及/或对位系经一或多个选自由以下组成的群的取代基取代：卤素、羟基、氰基、直链或支链C1-6烷基、直链或支链C1-6烷氧基、直链或支链卤基-C1-6烷基、C3-10环烷基、C6-14芳基、杂环基及杂芳基(实例包括(但不限于)酪氨酸、3-氯苯丙氨酸、2，3-氯-苯丙氨酸、3-氯-5-氟-苯丙氨酸、2-氯-6-氟-3-甲基-苯丙氨酸)，或其中Phe类似物的苯环可经另一芳基(非限制性实例包括1-萘基丙氨酸及2-萘基丙氨酸)或杂芳基(非限制性实例包括吡啶基丙氨酸、噻吩基丙氨酸及呋喃基丙氨酸)置换；
(d)选自：Gly、叔丁基-Gly、Thr、Ser、Val及Asn；
(e)选自：Leu、Ser、Thr及肽键等构物，诸如N-Me-Leu；
(f)选自：Lys、Arg、Gly、6-羟基-正亮氨酸、瓜氨酸(Cit)、Gln及Ser；
(g)选自：Leu、Asn及肽键等构物，诸如N-Me-Leu；
(h)选自：Ile、叔丁基-Gly(tBu-Gly)、Asn及肽键等构物，诸如N-Me-Ile；
(i)选自：Gly、Arg、Ser及Asn；
(j)选自：Met、Val、Asn、β-Cl-Ala、2-氨基丁酸(Abu)及2-氨基-异丁酸(Aib)；且
(k)选自：Leu、正亮氨酸(Nle)、高亮氨酸(Hleu)、Val、叔丁基-Ala(tBu-Ala)、Arg、Thr、Ser及肽键等构物，诸如N-Me-Leu。
为改良CNP变体传递至骨相关病症(例如骨骼发育不良)的目标部位，可将CNP变体连接(例如在N端及/或C端)至靶向骨/软骨的部分。靶向骨/软骨的部分的非限制性实例包括二磷酸盐；羟基磷灰石；葡糖胺；胶原蛋白(例如X型胶原蛋白)；聚Asp；聚Glu；及来源于骨蛋白(诸如骨织素、骨桥蛋白、骨钙化素及涎蛋白)的骨靶向域的氨基酸序列。
除较不易为NEP切割的外，CNP变体亦可能具有降低的对NPR-C清除受体的亲和力，同时保留CNP功能性。除NEP介导的降解外，CNP22的半衰期亦受清除受体NPR-C影响，该NPR-C与NPR-B的细胞外肽结合域共享58％的序列同源性。CNP22不仅紧密结合于NPR-B(7-30pM亲和力)，而且亦紧密结合于NPR-C(11-140pM)(Bennett，B.D.等人，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)，266：23060-67(1991)；Koller K.J.及Goeddel，D.V.，Circulation(循环)，86：1081-88(1992)；Suga，S.等人，Endocrinology(内分泌学)，130：229-39(1992))。尽管NPR-B晶体结构尚有待报导，但NPR-C与NPR-A晶体结构之间的序列同源性以及相似性(He，X.-L.等人，Science(科学)，293(5535)：1657-62(2001)；Ogawa，H.等人，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)，279(27)：28625-31(2004)；He，X.-L.，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，361(4)：698-714(2006))表明NPR-B可能呈现类似的总体结构折迭。
因此，依据基于结构的序列比对及以下相关系统的结晶结构来建立NPR-B同源性模型：结合于NPR-C的CNP、结合于NPR-A的ANP，及结合于NPR-C的ANP(He，X.-L.等人，Science(科学)，293(5535)：1657-62(2001)；Ogawa，H.等人，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)，279(27)：28625-31(2004)；He，X.-L.，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，361(4)：698-714(2006))。依据受体似乎决定所结合肽的构型，且就一级结构及功能特性而言NPR-B最接近类似于NPR-A的观察结果，以NPR-A/ANP晶体结构作为模型来建立NPR-B/CNP同源性模型。使用公开的CNP变体的信号传导数据(美国专利第5,434,133号及美国专利申请公开案第2004/0138134A1号)及不再结合于NPR-C的功能性ANP变体的信号传导数据(Cunningham，EMBO13(11)2508-15，1994)来改进及解释NPR-B/CNP模型。
本文包括依据NPR-B/CNP复合物的基于同源性的结构模型，经设计以改良NPR-B选择性的CNP变体。组合结合于各种受体的利钠肽的实验及计算结构数据与公开的功能性数据，产生仍旧结合于NPR-B但可潜在地降低对NPR-C清除受体的亲和力的CNP变体。举例而言，NPR-C在环结构中于肽结合位点中具有独特插入，从而使得与NPR-A及NPR-B中的各别环残基相比，该NPR-C的环残基处于更靠近诸如CNP Gly8(或ANP Gly9)的肽残基的位置。早期研究表明，ANP中的G9T突变有助于降低对NPR-C的亲和力，藉此改良NPR-A选择性(Cunningham，EMBO J.，13(11)：2508-15(1994))。因此，产生CNP变体以用较大残基(Ser、Val、Thr或Asn)置换相应Gly8残基，以在不影响CNP与NPR-B的结合的情况下，破坏其与NPR-C的结合。此外，依据对受体/肽复合物的详细结构分析，将一或多个突变引入预期与受体特异性残基相互作用的CNP的C端(包括Gly15至Gly21)。举例而言，CNP22中的G19R突变不会引起NPR-B信号传导活性的显著损失。然而，不能在不改变邻近残基的构型的情况下，于NPR-C/CNP的可用晶体结构中模拟此突变。此等观察结果表明，G19R突变可能会选择性破坏CNP与特定受体(诸如NPR-C)的结合。
在一实施例中，CNP变体在位置1、5、8、15、19及21的一或多个Gly位点具有取代，以降低构型柔性且藉此增强受体特异性。对结合于NPR-C及NPR-A的ANP的晶体结构的比较分析(Ogawa，H.等人，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)，279：28625-31(2004)；He，X.-L.，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，361：698-714(2006))表明ANP的构型柔性可在决定受体选择性方面起到重要作用。
在一实施例中，对NPR-C的亲和力可能降低的功能性CNP变体具有一或多个以下氨基酸取代：G1R、G1E、G5R、G5Q、G5S、F7Y、G8T、G8S、G8V、G8N、L9S、L9T、K10Cit、K10Q、K10S、I14N、G15R、G15S、G15N、G15Cit、S16Q、M17V、M17N、G19S、G19R、G19N、L20V、L20R、L20T、L20S、G21S、G21T及G21R。在一实施例中，CNP变体在位置1、5、7、8、9、10、14、15、16、17、19、20及/或21具有多点取代，且可视情况在变体的肽序列的任何其它位置具有修饰。
在另一实施例中，可将本文所述的CNP变体在N端、C端及/或内部位点偶联至部分，直至总质量的特征在于本文一般描述的范围(例如约2.6kDa或2.8kDa至约6kDa或7kDa)，以有助于靶向骨/软骨、降低NPR-C及肾清除率、增强对NEP降解的抗性，及/或改良CNP功能性。在一实施例中，CNP变体未在环状区域(对应于CNP22的Cys6至Cys22)内的位点偶联至聚合部分。可偶联至CNP变体的聚合或非聚合部分的非限制性实例包括合成骨靶向化合物，诸如二磷酸盐；骨/软骨靶向肽序列，诸如聚Asp及聚Glu；来源于骨蛋白(诸如骨桥蛋白、骨钙化素及涎蛋白)的骨靶向域的肽序列；来源于骨形态发生蛋白(诸如BMP2、BMP3、BMP5、BMP7及BMP8a)的功能域的肽序列；来源于利钠来源的多肽(例如NPPC、ANP及BNP)的肽序列；其它天然聚合或非聚合部分，诸如碳水化合物、脂肪酸及磷脂；生物兼容性合成亲水性聚合物，诸如PEG(或PEO)；疏水性聚合或非聚合部分，诸如庚酸及戊酸；及其组合。
例如就刺激cGMP产生及信号传导而言，本文所述的CNP变体可具有与CNP22相比实质上类似或更佳的功能活性。在一实施例中，CNP变体于活体外或活体内刺激产生在相同浓度wtCNP22(例如1μM)下所产生的cGMP量的至少约50％。在某些实施例中，CNP变体保留野生型CNP22活体外或活体内的cGMP刺激活性的至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％。在另一实施例中，与CNP22相比，CNP变体具有改良的cGMP刺激活性。在某些实施例中，CNP变体于活体外或活体内刺激产生在相同浓度wtCNP22(例如1μm)下所产生的cGMP量的至少约110％、120％、130％、140％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％或更高。
本文中视情况排除本文中所参考的任何先前公开案中特定揭示的任何利钠(例如CNP)肽、片段及变体，及实际产生的任何利钠(例如CNP)肽、片段及变体，这些先前公开案包括(但不限于)：U.S.5,434,133、U.S.6,034,231、U.S.6,020,168、U.S.6,743,425、U.S.7,276,481、WO 94/20534、WO 02/047871、WO 2005/098490、WO 2004/047871、EP 0497368、EP 0466174，及Furuya等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.(生物化学生物物理通讯)183：964-969(1992))。所有此等文献均以全文引用的方式并入本文中。
在一实施例中，本文视情况排除所有已知野生型CNP-53、野生型CNP-22、野生型CNP-17、野生型BNP及人类来源及非人类来源的野生型ANP。举例而言，在一实施例中，本文视情况排除人类CNP-17、人类CNP-22、鸡CNP-22(对应于hCNP-22(Leu9Val))、鳟鱼及鳗鱼CNP-22(对应于hCNP-22(Leu2Trp、Ser3Asn、Lys4Arg))、蛙CNP22-I(对应于hCNP-22(Leu2Tyr、Lys4Arg、Leu9Val、Ser16Ala、Met17Phe))、蛙CNP22-II(对应于hCNP-22(Leu2Thr、Ser16Ala))、人类CNP-53，及猪及大鼠CNP-53(对应于hCNP-53(Gln17His、Ala28Gly))。在另一实施例中，本文视情况排除藉由在人类及非人类动物中活体内蛋白水解切割产生的NPPC、原CNP及CNP-53的片段。在另一实施例中，本文视情况排除野生型人类CNP-53的以下截短片段：CNP-50、CNP-46、CNP-44、CNP-39、CNP-30、CNP-29、CNP-28、CNP-27及CNP-26。
在另一实施例中，本文视情况排除自鲨鱼物种皱唇鲨(Triakis scyllia)及小点猫鲨(Scyliorhinus canicula)分离或搜寻到的CNP肽及其片段(例如参看M.Takano等人，Zool.Sci.，11：451-454(1994))，其包括：
RLLKDLSNNPLRFRGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC(CNP-41)(SEQ ID NO：204)；
LKDLSNNPLRFRGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC(CNP-39)(SEQ ID NO：205)；
KDLSNNPLRFRGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC(CNP-38)(SEQ ID NO：206)；及
GPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC(CNP-22)(SEQ ID NO：207)。
在另一实施例中，本文视情况排除自鲨鱼物种鼠鲨(Lamna ditropis)分离或搜寻到的CNP肽及其片段(例如参看M.Takano等人，Zool.Sci.，11：451-454(1994))，其包括：
RLLKDLSNNPLRFKGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC(CNP-41)(SEQ ID NO：208)；
LKDLSNNPLRFKGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC(CNP-39)(SEQ ID NO：209)；
KDLSNNPLRFKGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC(CNP-38)(SEQ ID NO：210)；
FKGRSKKGPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC(CNP-29)(SEQ ID NO：211)；及
GPSRGCFGVKLDRIGAMSGLGC(CNP-22)(SEQ ID NO：212)。
在又一实施例中，本文视情况排除自鲨鱼物种白斑角鲨(Squalus acanthias)分离的CNP肽及其片段(例如参看M.Takano等人，Zool.Sci.，11：451-454(1994))，其包括：
RLLQDLSNNPLRFKGRSKKGPSRSCFGLKLDRIGAMSGLGC(CNP-41)(SEQ ID NO：213)；及GPSRSCFGLKLDRIGAMSGLGC(CNP-22)(SEQ ID NO：214)。
在另一实施例中，本文视情况排除自青鳉(medaka)及河豚(puffer fish)分离的CNP肽，其在K.Inoue等人，Proc.Nat.Acad.Sci.，100(17)：10079-10084(2003)中命名为”CNP-1”、”CNP-2”、”CNP-3”及”CNP-4”：
GWNRGCFGLKLDRIGSMSGLGC(青鳉及河豚CNP-1)(SEQ ID NO：215)；
PMVAGGGCFGMKMDRIGSISGLGC(青鳉CNP-2)(SEQ ID NO：216)；
GRSSMVGGRGCFGMKIDRIGSISGLGC(河豚CNP-2)(SEQ ID NO：217)；
GGMRSCFGVRLERIGSFSGLGC(青鳉CNP-3)(SEQ ID NO：218)；
GGLRSCFGVRLARIGSFSGLGC(河豚CNP-3)(SEQ ID NO：219)；
GGSTSRSGCFGHKMDRIGTISGMGC(青鳉CNP-4)(SEQ ID NO：220)；及
GGSSRSGCFGHKMDRIGTISGMGC(河豚CNP-4)(SEQ ID NO：221)。
在另一实施例中，本文视情况排除自鸭嘴兽(platypus)毒液分离的CNP-39及其CNP-22片段，其在G.de Plater等人，Toxicon.，36(6)：847-857(1998)中命名为”ovCNP-39”及”ovCNP-39(18-39)”：
LLHDHPNPRKYKPANKKGLSKGCFGLKLDRIGSTSGLGC(ovCNP-39)(SEQ ID NO：222)；及
GLSKGCFGLKLDRIGSTSGLGC(ovCNP-39(18-39)(SEQ ID NO：223)。
在另一实施例中，本文视情况排除以下如US 2007/0197434中特定揭示的肽：
Gly-Leu-Ser-Lys-Gly-Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Met-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys(SEQ ID NO：224)；
Gly-Leu-Ser-Lys-Gly-Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys(SEQ ID NO：225)；
Gly-Leu-Ser-Lys-Gly-Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Ala-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys(SEQ ID NO：226)；
Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Met-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys(SEQ ID NO：227)；
Gly-Leu-Ser-Lys-Gly-Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Met-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr(SEQ IDNO：228)；及
Cys-Phe-Gly-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr(SEQ ID NO：229)。
在另一实施例中，本文视情况排除US 2007/0197434中一般性揭示的SEQ IDNO：10的肽，其中此等肽为在位置4、5、6、11、12、14及/或15具有特定天然氨基酸取代的CNP-17变体。在又一实施例中，本文视情况排除对应于以下的肽：hCNP-53(Ser47Ala)、hCNP-53(Met48Gln)、hCNP-53(Met48Ala)及hCNP-53(C端)-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr。
在一实施例中，本文视情况排除如US 7,276,481中特定揭示的SEQ ID NO：1-4及6-71的肽。在另一实施例中，本文视情况排除US 7,276,481中一般性揭示的SEQ ID NO：5的肽，其中此等肽为在Leu9、Lys10、Leu11、Ser16、Met17、Gly19及/或Leu20具有至少一个天然氨基酸取代的CNP17变体。在又一实施例中，视情况排除CNP17或其变体含有N-Me-Phe7或N-Me-Phe7及N-Me-Leu11的CNP17变体。在另一实施例中，本文视情况排除融合或偶联至生长激素(GH)、类胰岛素生长因子1(IGF-1)或甲状腺激素(TH)的如US 7,276,481中揭示的SEQ ID NO：5的CNP17变体。在另一实施例中，视情况排除CNP22融合至GH、IGF-1或TH或经由接头(例如肽接头)连接至GH、IGF-1或TH的CNP22变体。在又一实施例中，视情况排除CNP17或其变体在N端或C端偶联至生物素或荧光素的CNP17变体。
在另一实施例中，本文视情况排除如US 5,434,133中特定揭示的化合物第1-27号及SEQ ID NO：1-17、22-24、30、31及40-42的肽。在另一实施例中，本文视情况排除US 5,434,133中一般性揭示的SEQ ID NO：18-21及25-29的肽。在又一实施例中，本文视情况排除如WO 94/20534中特定揭示的SEQ ID NO：1-4及9的肽。
然而，在一些实施例中，本文仍包括本文中视情况排除的利钠(例如CNP)肽、片段及变体的使用方法，以及包含此等利钠(例如CNP)肽、片段及变体的医药组合物(包括无菌医药组合物)。
C.CNP变体的合成及纯化
在一些实施例中，本文所述的CNP变体藉由重组表达，使用此项技术中已知的某些技术(在某些实施例中)来产生。例如参看Sambrook，Fritsch及Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验手册)，第2版。冷泉湾实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)(Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))；DNA Cloning：A Practical Approach(DNA克隆：实验方法)，第I及第II卷，D.N.Glover编(1985)；及Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学目前方法)，John Wiley&Sons，Inc.(1994)。
在某些实施例中，藉由重组方法产生本文所述的CNP变体，该重组方法包含将包含编码CNP变体多肽的第一多核苷酸连接至编码切割可切割肽或蛋白质的第二多核苷酸的宿主细胞在培养基中在使得由这些多核苷酸编码的融合多肽得以表达的条件下培养，其中该融合多肽包含CNP变体多肽直接连接至切割可切割肽或蛋白质或经由接头与其间接连接。在一些实施例中，用包含编码CNP变体多肽的多核苷酸连接至编码切割可切割肽或蛋白质的多核苷酸的表达载体来转化宿主细胞。在某些实施例中，融合多肽表达为可溶蛋白质或包涵体。可自宿主细胞或培养基分离所表达的融合多肽，且可使经分离的融合多肽与切割切割剂接触以释放CNP变体。
用以产生CNP变体的宿主细胞可为细菌、酵母、昆虫、非哺乳动物脊椎动物或哺乳动物细胞。细菌细胞包括(但不限于)大肠杆菌(E.coli)细胞株及菌株。大肠杆菌细胞株及菌株的非限制性实例包括BL21、BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pGro7、ArcticExpress(DE3)、C41[亦称作C41(DE3)]、C43[亦称作C43(DE3)]、Origami B(DE3)、Origami B(DE3)pLysS、KRX及Tuner(DE3)。在一实施例中，使用BL21(DE3)细胞来产生CNP变体及CNP融合蛋白。哺乳动物细胞包括(但不限于)仓鼠、猴、黑猩猩、犬、猫、牛、猪、小鼠、大鼠、兔、绵羊及人类细胞。宿主细胞可为永生化细胞(细胞株)或非永生化(原生或次生)细胞，且可为多种细胞类型中的任一种，诸如(但不限于)成纤维细胞、角质细胞、上皮细胞(例如乳腺上皮细胞、肠上皮细胞)、卵巢细胞(例如中国仓鼠卵巢或CHO细胞)、内皮细胞、神经胶质细胞、神经细胞、血液的形成成分(例如淋巴细胞、骨髓细胞)、软骨细胞及其它骨源性细胞，及此等体细胞类型的前体。在适于细胞生长、表达DNA或RNA及鉴别/选择表达CNP变体的细胞的条件下培养含有CNP变体DNA或RNA的宿主细胞。
在一些实施例中，使宿主细胞在约10℃至约40℃，或约20℃至约40℃，或约30℃至约40℃的温度下生长或培养一段时间。在某些实施例中，使宿主细胞在约20℃、22℃、25℃、28℃、30℃、35℃或37℃下生长或培养一段时间。在某些实施例中，使宿主细胞在约35℃或37℃下生长或培养一段时间。
使编码CNP变体多肽(包括CNP融合蛋白)的重组多核苷酸于包含含有表达控制序列可操作地连接至待表达核苷酸序列的重组多核苷酸的表达载体中表达。表达载体包含足够用于表现的顺式作用组件；其它用于表达的组件可由宿主细胞或活体外表达系统供应。表达载体包括此项技术中已知的所有表达载体，包括(但不限于)黏质体、质体(例如裸质体或含于脂质体中的质体)及并有重组多核苷酸的病毒。经由转化或转染将表达载体插入适当宿主细胞中以便表达编码多肽的多核苷酸(例如参看Sambrook等人(同上文))。
预期用于产生CNP变体(包括可切割CNP融合蛋白)的表达载体的非限制性实例包括pJexpress、pJexpress401、pJexpress404、pET-15b、pET-21a、pET-22b、pET-31b、pET-32a、pET-41a、pMAL、pMAL-c2X、pQE-30、pET-SUMO及pTYB11。特定构建体的表达可产生呈包涵体形式的可溶CNP变体(包括CNP融合蛋白)或不可溶CNP变体(包括CNP融合蛋白)。
在一些实施例中，使用异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导性载体来增强编码CNP变体或CNP融合蛋白的多核苷酸的表达。在一些实施例中，使宿主细胞在IPTG存在下，在约10℃至约40℃，或约20℃至约40℃，或约30℃至约40℃的温度下生长或培养一段时间。在某些实施例中，使宿主细胞在IPTG存在下，在约20℃、22℃、25℃、28℃、30℃、35℃或37℃下生长或培养一段时间。在某些实施例中，使宿主细胞，在1mM IPTG存在下，在约35℃或37℃下生长或培养一段时间。
在其它实施例中，使宿主细胞与浓度为约0.4mM至约2mM，或约0.4mM至约1.5mM，或约0.4mM至约1mM的IPTG一起培养。在某些实施例中，IPTG浓度为约0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2mM。在一实施例中，IPTG浓度为约1mM。
在某些实施例中，本文所述的CNP变体重组表达为包含CNP变体多肽及可切割载体蛋白或可切割标签(例如肽标签)的融合蛋白，其中该融合蛋白包含CNP变体多肽直接连接至可切割载体蛋白或标签或经由接头与其间接连接。使用载体蛋白或标签有助于例如检测、分离及/或纯化融合蛋白。可切割载体蛋白及标签包括(但不限于)组氨酸(例如六His)标签；人类转录因子TAF12(TAF12)、TAF12片段、TAF12组蛋白折叠域、TAF12的突变体及其片段、TAF12(C/A)、TAF12(D/E)、TAF12(4D/4E)、TAF12(6D/6E)、TAF12(10D/10E)、TAF12(C/A及D/E)、TAF12(C/A及4D/4E)、TAF12(C/A及6D/6E)、TAF12(C/A及10D/10E)；酮类固醇异构酶(KSI)；麦芽糖结合蛋白(MBP)；β-半乳糖苷酶(β-Gal)；谷胱甘肽-S-转移酶(GST)；硫氧还蛋白(Trx)；壳多糖结合域(CBD)；BMP-2、BMP-2突变体、BMP-2(C/A)；SUMO；及其突变体及片段。
表达构建体可表达包含CNP变体及载体蛋白或标签的融合蛋白。标签可为赋予融合蛋白适用特性的氨基酸序列。在一实施例中，标签为配位体结合域，其可用以藉由将融合蛋白施加至含有该配位体的分离介质来纯化融合蛋白。举例而言，可将包含谷胱甘肽-S-转移酶(GST)域的融合蛋白施加至含有连接有谷胱甘肽的分离介质的层析管柱。作为另一实例，可将包含麦芽糖结合蛋白(MBP)作为标签的融合蛋白施加至含有麦芽糖的分离介质。作为另一实例，可将包含聚组氨酸标签的融合蛋白施加至镍柱，藉此聚组氨酸标签螯合于镍柱有助于纯化融合蛋白。在另一实施例中，标签为配位体。举例而言，融合蛋白可包含谷胱甘肽作为标签且施加至含有连接有谷胱甘肽-S-转移酶的分离介质的层析管柱。适用于融合蛋白的载体蛋白及标签的非限制性实例包括(但不限于)人类转录因子TAF12(TAF12)、酮类固醇异构酶(KSI)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、β-半乳糖苷酶(β-Gal)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、硫氧还蛋白(Trx)、壳多糖结合域(CBD)、BMP-2突变体(BMPM)、SUMO、CAT、TrpE、葡萄球菌蛋白A、链球菌蛋白、淀粉结合蛋白、内葡聚糖酶A的纤维素结合域、外葡聚糖酶Cex的纤维素结合域、生物素结合域、recA、Flag、聚(His)、聚(Arg)、聚(Asp)、聚(Gln)、聚(Phe)、聚(Cys)、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、青色荧光蛋白、生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、抗体表位，及其突变体及片段。
为产生目标CNP变体，载体蛋白或标签可藉助于化学切割、蛋白酶切割或切割蛋白质自切割自融合蛋白切割。例示性化学及蛋白水解切割切割剂(切割位点在括号中)包括(但不限于)甲酸(Asp-Pro)、溴化氰(CNBr)(Met-X)、羟胺(Asn-Gly)、因子Xa(IEGR-X)(SEQ ID NO：230)、肠激酶(DDDDK-X)(SEQ ID NO：231)、ProTEV(EXXYXQ-G)(SEQ ID NO：232)，及SUMO蛋白酶。由于特定种类化学切割的性质，因此使用甲酸来进行切割可产生Pro-CNP，CNBr可产生Met经取代为Asn的CNP，且羟胺可产生Gly-CNP。或者，藉由使用不表达为融合蛋白的CNP变体的特定构建体(例如pET-21a-CNP)，可避免化学或蛋白酶切割。pET-21a-CNP的表达可产生Met-CNP。或某些融合蛋白(例如含有内含肽CBD的融合蛋白)可经历自切割来产生CNP。
在其它实施例中，融合蛋白在CNP变体与载体蛋白或标签(例如肽标签)之间包含切割可切割肽接头。在某些实施例中，切割可切割肽接头选自：Asp-Pro、Asn-Gly、Met-X、Val-Asp-Asp-Arg(SEQ ID NO：233)、Gly-Ser-Asp-Arg(SEQID NO：234)、Ile-Thr-Asp-Arg(SEQ ID NO：235)、Pro-Gly-Asp-Arg(SEQ IDNO：236)、Ile-Glu-Gly-Arg-X(SEQ ID NO：230)、Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-X(SEQ ID NO：231)、Glu-X-X-Tyr-X-Gln-Gly(SEQ IDNO：232)、Ala-Phe-Leu-Gly-Pro-Gly-Asp-Arg(SEQ ID NO：237)，及MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHTGDDDDKHMD(pET-15b接头)(SEQ ID NO：95)，其中X表示氨基酸。在一些实施例中，切割可切割肽接头系藉由选自由以下组成的群的切割切割剂切割：钯、溴化氰(CNBr)、甲酸、羟胺、梭菌蛋白酶、凝血酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶、羧肽酶、肠激酶(肠肽酶)、Kex 2蛋白酶、Omp T蛋白酶、因子Xa蛋白酶、枯草杆菌蛋白、proTEV、SUMO蛋白酶、V8蛋白酶、HIV蛋白酶、鼻病毒蛋白酶、变种枯草杆菌蛋白酶、IgA蛋白酶、人类Pace蛋白酶、胶原酶、Nia蛋白酶、脊髓灰白质炎病毒2Apro蛋白酶、脊髓灰白质炎病毒3C蛋白酶、genenase、弗林蛋白酶、弹性蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、皱胃酶(凝乳酶)、微生物天冬氨酸蛋白酶、木瓜酶、钙蛋白酶、木瓜凝乳酶、无花果酶(无花果蛋白酶)、菠萝酶(菠萝蛋白酶)、组织蛋白酶B、卡斯蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、内切蛋白酶Arg-C、内切蛋白酶Glu-C、内切蛋白酶Lys-C、胰舒血管素及纤维蛋白溶酶。
在某些实施例中，可切割载体蛋白、标签(例如肽标签)或肽接头系使用甲酸来切割以自融合蛋白释放CNP变体。在一些实施例中，甲酸浓度为约1％至约20％，或约1％至约15％，或约2％至约15％，或约1％至约10％，或约2％至约10％，或约1％至约5％，或约2％至约5％。在某些实施例中，甲酸浓度为约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％。在某些实施例中，甲酸浓度为约2％、5％或10％。
在其它实施例中，在甲酸存在下，在约20℃至约80℃，或约30℃至约75℃，或约40℃至约75℃，或约50℃至约75℃，或约50℃至约70℃，或约55℃至约70℃，或约50℃至约60℃的温度下进行CNP融合蛋白切割。在一些实施例中，在甲酸存在下，在约20℃、22℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、42℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃下进行切割。在某些实施例中，在甲酸存在下，在约50℃、55℃、60℃、65℃或70℃下进行切割。在某些实施例中，在甲酸存在下，在约55℃或70℃下进行切割。
在其它实施例中，甲酸存在下CNP融合蛋白的切割进行约3小时至约48小时，或约5小时至约48小时，或约5小时至约36小时，或约5小时至约24小时，或约5小时至约18小时，或约20小时至约24小时，或约6小时至约10小时的时段。在某些实施例中，甲酸存在下的切割进行约5小时、6小时、12小时、15小时、18小时、20小时或24小时。
在一些实施例中，CNP融合蛋白的切割在约2％、5％或10％甲酸存在下，在约55℃下进行约20小时至约36小时，或在约60℃下进行约15小时至约24小时，或在约65℃下进行约10小时至约21小时，或在约70℃下进行约6小时至约18小时。在某些实施例中，CNP融合蛋白的切割在约2％甲酸存在下，在约55℃下进行约20小时至约24或36小时，或在约60℃下进行约15小时至约24小时，或在约65℃下进行约10小时至约18小时，或在约70℃下进行约6小时至约10小时。
本文提供使用甲酸来切割CNP融合蛋白以得到高CNP变体产率的温和条件。本文所述使用甲酸来切割融合蛋白的条件亦适用于切割包含除CNP外的多肽或蛋白质的融合蛋白，其中这些融合蛋白含有Asp-Pro肽键。
在其它实施例中，在CNP融合蛋白的化学切割(例如使用甲酸)或蛋白水解切割之前，先以缓冲液及/或去污剂处理可溶性CNP融合蛋白或CNP融合蛋白包涵体。缓冲液的非限制性实例包括B-PER II；经稀释B-PER II(例如1/20稀释度)；B-PER；B-PER磷酸盐缓冲液；含有Tris的缓冲液(例如25mM Tris，pH 7.5)；含有Tris及NaCl的缓冲液(例如25mM Tris、150mM NaCl，pH 7.9)；及PBS。在一实施例中，缓冲液为B-PER II。去污剂的非限制性实例包括辛基蔗糖、Triton X-100、Tween-20、NP-40及CA-630。去污剂可位于缓冲液中(例如，含1％去污剂的25mM Tris缓冲液(pH 7.5))。在某些实施例中，去污剂为Triton X-100或CA-630。
应了解，上述任何方法及条件可与上述任何其它方法及条件组合使用来产生本文所揭示的CNP变体。
在其它实施例中，本文所述的CNP变体系使用肽合成器合成且根据此项技术中已知的方法，例如根据Atherton及Sheppard，Solid Phase PeptideSynthesis：a Practical Approach(固相肽合成：实验方法)，IRLPress(Oxford，England(1989))的方法进行纯化。
肽可基于例如CNP的以下肽序列来合成：G1LS(K或R)GC6F7G8L(K或R或Nle或6-OH-Nle)LDRIGSMSGLGC22。
例示性CNP变体包括(但不限于)：
类似物A(GLSKGC(CH2NH)FGLKLDRIGSMSGLGC)(SEQ ID NO：56)通过将C6的主链”-C＝O”基团转化为”-CH2”基团来制得；
类似物B(GLSKGC(N-Me-Phe)GLKLDRIGSMSGLGC)(SEQ ID NO：57通过将F7的主链”-NH”基团转化为”-N-CH3”基团来制得；
类似物E(GLSKGC(D-Phe)GLKLDRIGSMSGLGC)(SEQ ID NO：136)通过在F7使用D-Phe来制得；
类似物F(GLSKGCF(tBu-Gly)LKLDRIGSMSGLGC)(SEQ ID NO：58)通过在G8使用叔丁基-Gly来制得；
类似物G(GLSKGC(3-Cl-Phe)GLKLDRIGSMSGLGC)(SEQ ID NO：137)通过将氯原子添加至F7的苯环的间位来制得(类似变体可通过以Cl、F、Br、OH及/或CH3对Phe7的苯环进行邻位、间位及/或对位取代来产生)；且
类似物H(GLSKGC[NHCH2CH(Ph)CO]GLKLDRIGSMSGLGC)(SEQ ID NO：59)通过在F7使用(±)-3-(氨基)-2-苯基丙酸来制得。
具有例如氨基酸延伸、天然或非天然氨基酸或肽键等构物的取代，及/或与聚合物或疏水部分的偶联的CNP变体的实例包括(但不限于)：
类似物J C6-CH2-NH、N-Me-L9、N-Me-L20(SEQ ID NO：91)
类似物K N-Me-L9、N-Me-L20(SEQ ID NO：92)
类似物L N-Me-L9、N-Me-L11、N-Me-L20(SEQ ID NO：93)
类似物M N-Me-L9、N-Me-L11(SEQ ID NO：94)
类似物Z K4R、F7Y(SEQ ID NO：95)
类似物AAK4R、G8V(SEQ ID NO：96)
类似物ABK4R、G8S(SEQ ID NO：97)
类似物ACK4R、G8T(SEQ ID NO：98)
类似物ADK4R、L9T(SEQ ID NO：99)
类似物AEK4R、G15R(SEQ ID NO：100)
类似物AFK4R、G15Cit(SEQ ID NO：101)
类似物AGK4R、M17V(SEQ ID NO：102)
类似物AHK4R(SEQ ID NO：35)
类似物AJK4R、L20V(SEQ ID NO：103)
类似物AKK4R、L20t-Bu-Ala(SEQ ID NO：104)
类似物ATG1E、K4E(SEQ ID NO：105)
类似物AVG1E、K4E-戊酸(连接于N端)(SEQ ID NO：106)
类似物AWG1E、K4E-庚酸(连接于N端)(SEQ ID NO：107)
类似物AXCNP17(ΔN端)(SEQ ID NO：2)
类似物AYGANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)
类似物AZR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：41)
类似物BBG1E-庚酸(连接于N端)(SEQ ID NO：108)
类似物BCG1E-戊酸(连接于N端)(SEQ ID NO：109)
类似物BFK4R、K10Cit(SEQ ID NO：110)
类似物BGK4R、K10Q(SEQ ID NO：111)
类似物BHK4R、K10R(SEQ ID NO：112)
类似物BJK4R、G15N(SEQ ID NO：113)
类似物BKK4R、G15S(SEQ ID NO：114)
类似物BLCNP-37(SEQ ID NO：60)
CNP-53(SEQ ID NO：4)
类似物CAAAWARLLQEHPNA-CNP22(SEQ ID NO：61)
类似物CBAAWARLLQEHPNAR-CNP22(SEQ ID NO：62)
类似物CCDLRVDTKSRAAWAR-CNP22(SEQ ID NO：63)
类似物CDSPKMVQGSG-CNP17-KVLRRH(N端及C端BNP尾)(SEQ ID NO：68)
类似物CEGERAFKAWAVARLSQ-CNP22(HSA-CNP22)(SEQ ID NO：81)
类似物CFGQPREPQVYTLPPS-CNP22(SEQ ID NO：79)
PEG(24K)-CNP22
PEG(20K)-CNP22
PEG(5K)-CNP22
PEG(2K)-CNP22
PEG(2K)-CNP17
PEG(1K)-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)
PEG(1K)-CNP22
PEO4-(PEO12)3(分支)-CNP22
PEO12-CNP22
PEO12-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)
PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)；及
SEQ ID NO：1至6及34至144，及其包含至多1、2、3、4或5个其它修饰的变体。
在一实施例中，CNP变体经由在Cys6与Cys22之间形成二硫键来环化。Cys6可为半胱氨酸类似物，诸如高半胱氨酸或青霉胺。在另一实施例中，CNP变体可通过头至尾、侧链至侧链、侧链至头或侧链至尾形成的共价键来环化。在一实施例中，在位于或靠近肽的N端的氨基酸与位于或靠近肽的C端的氨基酸(在此上下文中称作”末端”氨基酸)之间形成共价键。在另一实施例中，在两个末端氨基酸的侧链之间形成共价键。在另一实施例中，在一个末端氨基酸的侧链与另一末端氨基酸的末端基团之间，或在两个末端氨基酸的末端基团之间形成共价键。
末端胺与末端羧基的头至尾环化可使用多种方法来进行，例如使用对硝基苯酯、2，4，5-三氯苯酯、五氟苯酯、叠氮化物法、混合酸酐法、HATU、碳二亚胺(例如DIC、EDC或DCC)及催化剂(诸如HOBt、HONSu或HoAt)，或树脂上环化(on-resincyclization)。
另外，环状结构可经由涉及CNP变体的氨基酸残基的侧链及/或末端氨基酸残基的桥联基团形成。桥联基团为允许肽的两个部分环化的化学部分。桥联基团的非限制性实例包括酰胺、硫醚、硫酯、二硫化物、脲、氨基甲酸酯、磺酰胺及其类似物。此项技术中已知并入具有此等桥联基团的单元的多种方法。举例而言，可在N端氨基或侧链氨基与C端羧酸或侧链(例如赖氨酸或鸟氨酸的侧链，及谷氨酸或天冬氨酸的侧链)羧基之间形成内酰胺桥(亦即环状酰胺)。可在C端羧基或侧链羧基与半胱氨酸或半胱氨酸类似物的侧链硫醇基之间形成硫酯。
或者，可藉由掺入羊毛硫氨酸(硫代二丙氨酸)残基以连接藉由硫醚键共价键合在一起的丙氨酸残基来形成交联。在另一方法中，诸如二羧酸(例如辛二酸(suberic acid/octanedioic acid))的交联剂可连接氨基酸侧链的官能基(诸如游离氨基、羟基及硫醇基)。
亦可使用酶催化环化。举例而言，已报导可使用短杆菌酪肽(tyrocidine)合成酶的硫酯酶域来环化硫酯前体，可使用枯草杆菌蛋白突变体来环化肽羟乙酸苯丙氨酰基酰胺酯，且可使用抗体连接酶16G3来环化对硝基苯基酯。关于肽环化的回顾，请参看Davies，J.Peptide Sci.(肽科学杂志)，9：471-501(2003)，其以全文引用的方式并入本文中。
在某些实施例中，最终环化产物具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或至少约99％的纯度。
D.经化学修饰的CNP变体
CNP22或其变体的化学修饰可可能赋予经修饰CNP肽以有利特性，诸如稳定性及半衰期增加及免疫原性降低(有关对治疗蛋白的化学修饰的一般论述，请参看Pharmazie(药物)，57(1)：5-29(2002))。举例而言，使天然或合成的聚合或非聚合部分(例如PEG)连接至CNP肽以将CNP肽的总质量增至本文一般描述的范围(例如约2.6kDa或2.8kDa至约6kDa或7kDa的范围)可降低经修饰肽对外肽酶及/或内肽酶(例如NEP)活体内切割的敏感性。除聚乙二醇化、糖基化及其它化学衍生化程序(例如藉由磷酸化、酰胺化、羧基化、乙酰化、甲基化及产生酸加成盐来进行修饰)外，酰胺、酯及N-酰基衍生物亦可潜在地遮蔽免疫原性区域及/或蛋白水解敏感区域(Science(科学)，303：480-482(2004))。
化学修饰的实例包括(但不限于)用于改良稳定性及蛋白酶抗性且降低免疫原性的Bednarsaki的聚合物添加法及Altus Corporation的交联法。Bednarsaki显示聚合物添加可改良蛋白质的温度稳定性(J.Am.Chem.Soc.(美国化学学报)，114(1)：378-380(1992))，且Altus Corporation发现戊二醛交联可改良酶稳定性。
多肽的化学修饰可以非特异性方式(产生衍生物质的混合物)，或以位点特异性方式(例如基于野生型大分子反应性引导的衍生化，及/或使用定点突变诱发与化学修饰的组合的位点选择性修饰)，或者使用所表达蛋白质连接法来进行(Curr.Opin.Biotechnol.(生物技术目前观点)，13(4)：297-303(2002))。
聚乙二醇化CNP变体
在一实施例中，为增强稳定性(例如对NEP降解的抗性)，使CNP22或其变体(包括具有氨基酸添加、取代及/或缺失的变体)偶联至亲水性天然或合成聚合物，以将经修饰CNP肽的总质量增至约2.6kDa或2.8kDa至约4、5、6、7kDa或7kDa以上的范围。在某些实施例中，所添加的亲水性聚合物具有约0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.2、4.4、4.6、4.8kDa或约5kDa的总质量。
在一实施例中，亲水性聚合物具有水溶性，以便与其偶联的CNP肽在水性(例如生理)环境下不会沉淀出来。此外，亲水性聚合物具有生物兼容性，亦即不会在活体内引起损伤、毒性或免疫反应。
亲水性聚合物可为分支或未分支聚合物。在一实施例中，亲水性聚合物未分支。
CNP22或其变体可能与亲水性聚合物在各种位点偶联，包括(但不限于)：(1)仅在N端；(2)仅在C端；(3)仅在内部位点(例如Lys4)；(4)在N端与C端；(5)在N端及内部位点；及(6)在C端及内部位点。在一实施例中，CNP22或其变体仅在N端偶联至亲水性聚合物。在另一实施例中，仅在内部位点(例如Lys4)偶联。在另一实施例中，在N端及内部位点(例如Lys4)偶联。在又一实施例中，为达成更佳功能性，CNP肽不在环状域(对应于CNP22的Cys6至Cys22)内的位点(例如Lys10)偶联至亲水性聚合物。若与亲水性聚合物的偶联系基于与CNP肽上的反应性伯氨基形成键，则可藉由以侧链上不含反应性伯氨基的天然或非天然氨基酸或肽模拟物(诸如Gly、Ser、Arg、Asn、Gln、Asp、Glu或瓜氨酸(Cit))取代Lys4及/或Lys10来防止在内部位点(例如Lys4及/或Lys10)偶联。在一特定实施例中，Lys4及/或Lys10经Arg置换。在另一实施例中，Lys10未经Arg置换。
亲水性聚合物的非限制性实例包括自带有羧酸的单体(例如甲基丙烯酸(MA)及丙烯酸(AA))形成的聚合物；聚乙烯醇；自带有羟基的单体(例如甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)、甲基丙烯酸羟丙酯(HPMA)、羟丙基甲基丙烯酰胺，及甲基丙烯酸3-三甲基硅烷基丙酯(TMSPMA))形成的聚合物；聚环氧烷；聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)；聚(乙二醇)(PEG)；聚(丙二醇)；单C1-C10烷氧基-PEG(例如单甲氧基-PEG)；三氟乙磺酰基单甲氧基-PEG；芳氧基-PEG；PEG丙烯酸酯(PEGA)；PEG甲基丙烯酸酯；PEG丙醛；双丁二酰亚氨基碳酸酯PEG；2-甲基丙烯酰氧基乙基-磷酸胆碱(MPC)与N-乙烯基吡咯啶酮(VP)的共聚物；羟基官能性聚(N-乙烯基吡咯啶酮)(PVP)；SIS-PEG(SIS为聚苯乙烯-聚异丁烯-聚苯乙烯嵌段共聚物)；聚苯乙烯-PEG；聚异丁烯-PEG；PCL-PEG(PCL为聚己内酯)；PLA-PEG(PLA为聚乳酸)；PMMA-PEG(PMMA为聚(甲基丙烯酸甲酯))；PDMS-PEG(PDMS为聚二甲基氧环己酮(polydimethyloxanone))；PVDF-PEG(PVDF为聚偏二氟乙烯)；PLURONICTM界面活性剂(聚环氧丙烷-共-聚乙二醇)；聚(伸丁二醇)；聚(L-赖氨酸-g-乙二醇)(PLL-g-PEG)；聚(L-赖氨酸-g-透明质酸)(PLL-g-HA)；聚(L-赖氨酸-g-磷酰胆碱)(PLL-g-PC)；聚(L-赖氨酸-g-乙烯基吡咯啶酮)(PLL-g-PVP)；聚(乙亚胺-g-乙二醇)(PEI-g-PEG)；聚(乙亚胺-g-透明质酸)(PEI-g-HA)；聚(乙亚胺-g-磷酰胆碱)(PEI-g-PC)；聚(乙亚胺-g-乙烯基吡咯啶酮)(PEI-g-PVP)；PLL-共-HA、PLL-共-PC、PLL-共-PVP、PEI-共-PEG、PEI-共-HA、PEI-共-PC、PEI-共-PVP、纤维素及其衍生物(例如羟乙基纤维素)；聚葡萄糖；糊精；透明质酸及其衍生物(例如透明质酸钠)；弹性蛋白；壳聚糖；丙烯酸硫酸酯；丙烯酸磺酸酯；丙烯酸氨基苯磺酸酯；甲基丙烯酸硫酸酯；甲基丙烯酸磺酸酯；甲基丙烯酸氨基苯磺酸酯；其聚合物及共聚物；及其组合的聚合物及共聚物。
在一特定实施例中，亲水性聚合物为聚(乙二醇)(PEG)，亦称聚(环氧乙烷)(PEO)。如本文中所用，术语”PEG”或”PEO”包括可用于衍生多肽的PEG的所有形式(分支及未分支)，包括(但不限于)单(C1-C10)烷氧基-PEG及芳氧基-PEG。
在一实施例中，PEG-CNP偶联物包含式(CH2CH2O)n的PEG(或PEO)聚合物，其中n为约6至约100的整数，且PEG聚合物为约0.3kDa至约5kDa。在另一实施例中，n为约12至约50的整数，且PEG聚合物为约0.6kDa至约2.5kDa。在另一实施例中，n为约12至约24，且PEG聚合物为约0.6kDa至约1.2kDa。在另一实施例中，PEG聚合物的末端羟基经非反应性基团封端。在一特定实施例中，封端基团为烷基，例如低级烷基，诸如甲基，以使PEG聚合物以烷氧基终止。在一实施例中，PEG聚合物未分支。在另一实施例中，CNP22或其变体仅在N端偶联至PEG聚合物。
PEG及PEO视其制备方式而可能包括具有分子量分布的分子，亦即，其可能具有多分散性。聚合制剂的大小/质量分布在统计学上可由其重量平均分子量(Mw)及其数目平均分子量(Mn)表征，其比率系称作多分散性指数(Mw/Mn)。Mw及Mn可藉由质谱法量测。偶联至大于1.5kDa的PEG部分的PEG-CNP变体可因母体PEG分子的多分散性质而显示分子量范围。举例而言，在mPEG2K(Sunbright ME-020HS，NOF Co.)的情况下，PEG分子的分子量分布于约1.5kDa至约3kDa的范围内，多分散性指数为1.036。相反，使用皮尔斯生物技术(Pierce Biotechnology)(洛克福德，伊利诺斯州)的MS(PEG)n试剂(n＝4、8、12或24，表示为例如”PEO12”或”PEO24”)偶联至CNP22或其变体的PEG具有单分散性，具有不连续链长及规定分子量。
用于产生包含PEG部分的多肽的方法为此项技术中所已知(例如参看美国专利5,824,784)。制备聚乙二醇化CNP肽的方法一般包含以下步骤：(a)使CNP22或其变体与聚乙二醇化试剂在适于将PEG连接至CNP肽(例如在N端)的条件下反应，及(b)获得反应产物。因为对CNP肽进行聚乙二醇化可显著改变其与NPR-B的结合，所以可视PEG部分的大小及聚乙二醇化的位置而定，探索不同种类的PEG及聚乙二醇化反应条件。可用于对CNP肽进行聚乙二醇化的化学包括使用甲氧基-PEG(O-[(N-丁二酰亚氨基氧基羰基)-甲基]-O’-甲基聚乙二醇)的NHS酯对肽的反应性伯胺进行酰化。以甲氧基-PEG-NHS或甲氧基-PEG-SPA进行酰化产生消除初始伯胺的任何电荷的酰胺键。以符号”PEO12”或”PEO24”表示的PEG-CNP肽，以及以符号”PEG1K”、”PEG2K”、”PEG5K”或”PEG20K”表示的肽系经由肽上的伯氨基与经NHS酯活化、甲氧基封端的PEG试剂反应来进行聚乙二醇化。PEG-CNP变体亦可藉由其它方法，例如经由涉及肽上的伯氨基及PEG醛(诸如PEG-丙醛)或其单C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物的还原性胺化来制备(参看美国专利5,252,714)。
不同于核糖体蛋白质合成，合成肽的合成系自C端进行至N端。因此，Boc-PEG(含有第三丁氧羰基(Boc))为一种将PEG连接至肽的C端的方法(R.B.Merrifield，J.Am.Chem.Soc.(美国化学学报)，85(14)：2149-2154(1963))。或者可采用Fmoc(茀基甲氧羰基)化学(E.Atherton及R.C.Sheppard，Solid Phase Peptide Synthesis：a PracticalApproach(固相肽合成：实验方法)，IRL Press(Oxford，England(1989))。
制备PEG-CNP变体的本发明方法提供聚合物-蛋白质偶联物的实质上均质混合物。纯化之后，不连续PEG-CNP制剂对于生物特性的活体外及活体内测试足够纯。如本文中所表明，某些PEG-CNP变体显示对NEP切割的敏感性降低及实质上类似或更佳的功能性(例如刺激cGMP产生)。
如本文所述，使用适当聚乙二醇化试剂/CNP肽比率及反应条件进行的CNP22或其变体的聚乙二醇化反应提供PEG-CNP衍生物。聚乙二醇化的性质及程度可使用例如PAGE及HPLC分析来测定。在某些实施例中，至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的CNP22或其变体在N端经单聚乙二醇化。为优化聚乙二醇化对CNP肽的生物特性的有利影响，可改变聚合物长度、构型(例如分支或线性)，及/或PEG部分的官能化(例如添加带负电基团)。针对NEP抗性、药物动力学及生物活性(例如结合NPR-B及刺激cGMP产生的能力)对聚乙二醇化CNP变体进行测试。可例如于活体外在基于大鼠软骨肉瘤细胞的软骨发育不全模型中，及于活体内在鼠类软骨发育不全动物模型中进一步测试显示获改良NEP抗性及CNP22的cGMP刺激活性的至少约50％的聚乙二醇化CNP变体。
E.使用CNP变体的方法、CNP变体的医药组合物，及给药途径
使用CNP变体的方法
骨相关病症
成纤维细胞生长因子(FGF)在骨形成方面起重要作用，且FGF受体基因(FGFR1、2及3)的突变导致多种遗传性骨骼畸形(Curr.Biol.(目前生物学)，5：500-507(1995))。特别是，FGFR-3的活化突变造成长骨病症，包括软骨发育不全(人类遗传性侏儒症的最常见形式)(Nature(自然)，371：252-254(1994)；Cell(细胞)，78：335-342(1994))，较轻度病症软骨发育低下(Ann.N.Y.Acad.Sci.(纽约科学年报)，785：182-187(1996))，及较严重及新生儿致死性第I型及第II型侏儒症性发育不全(TD)(Hum.Mol.Genet.(人分子遗传学)，5：509-512(1996)；Nat.Genet.(自然遗传学)，9：321-328(1995))。过度表达FGF-2且从而活化FGFR-3的小鼠模型显示长骨缩短及巨头畸形(Mol.Biol.Cell(分子生物学，细胞)，6：1861-73(1995))。与此模型相符，缺乏FGFR-3的小鼠显示显著的骨骼过度生长与较宽生长板(Nature Genet.(自然遗传学)，12：390-397(1996))。
使用CNP、NPR-B及NPR-C的互补实验表明肽配位体、相应受体与骨生长之间的联系。在转殖基因小鼠中藉由提高血浆浓度的CNP来活化NPR-B引起骨骼过度生长(Nat.Med.(自然医学)，10：80-86(2004))，此在组织学上类似于FGFR-3基因敲除小鼠的生长板软骨的情形(Nat.Genet.，4：390-397(1996))。在NPR-C基因敲除小鼠中，应消除NPR-C介导的CNP清除；与此预测相符，基因敲除动物显示延长的长骨及延长的椎骨与脊柱隆凸(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：7403-08(1999))。相反，CNP基因敲除的小鼠因长骨及椎骨较短而矮化(表型在组织学上类似于软骨发育不全)，且因咬合异常及肺受小胸腔限制而致使死亡率增加(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98：4016-4021(2001))。与所提出的CNP作为NPR-B的活化剂的作用相符，NPR-B基因敲除小鼠与CNP基因敲除小鼠具有相同矮化骨骼表型及增加的死亡率(Proc.Natl.Acad.Sci USA，101：17300-05(2004))。此外，在软骨中具有活化FGFR-3的软骨发育不全的小鼠模型中，软骨细胞中CNP的靶向过度表达对抗侏儒症(Yasoda等人，Nat.Med.(自然医学)，10：80-86(2004))。另外，已显示CNP在调节软骨内骨生长及软骨细胞活性方面起作用，包括(但不限于)软骨细胞增殖及分化、抑制有丝分裂原活化蛋白(MAP)激酶/MEK(Raf-1)激酶信号传导路径及促进软骨内骨化(Yasoda等人，Nat.Med.(自然医学)，10：80-86(2004))。此等结果表明CNP/NPR-B系统的活化为治疗人类软骨发育不全的潜在治疗策略。
本文的CNP变体藉由刺激基质产生、使软骨细胞增殖及分化及增强长骨生长而适用于治疗患骨相关病症(诸如骨骼发育不良)的哺乳动物，包括人类。CNP反应性骨相关病症及骨骼发育不良的非限制性实例包括软骨发育不全、软骨发育低下、身材矮小、侏儒症、骨软骨发育不全、致死性软骨发育不全、成骨不全、软骨成长不全、斑点状软骨发育异常、同型合子软骨发育不全、斑点状软骨发育异常、屈肢骨发育不良、先天性致死性低磷酸酯酶症、周产期致死型成骨不全、短肋骨综合征多指综合征、软骨发育低下、肢根型斑点状软骨发育异常、詹森型干骺端发育不良(Jansen-type metaphyseal dysplasia)、先天性椎体骨骺结构不良(spondyloepiphyseal dysplasia congenita)、骨发育不全症(atelosteogenesis)、骨畸形性发育不良(diastrophic dysplasia)、先天性短股骨、朗格型肢中部发育不良(Langer-type mesomelic dysplasia)、尼弗哥特型肢中部发育不良(Nievergelt-type mesomelic dysplasia)、综合征罗比挠综合征(Robinow syndrome)、综合征莱茵哈特综合征(Reinhardt syndrome)、肢端发育不全(acrodysostosis)、周围性骨发育不全、克尼斯特发育不良(Kniest dysplasia)、纤维软骨发生(fibrochondrogenesis)、综合征罗伯茨综合征(Robertssyndrome)、肢端肢中发育不全、短肢畸形、莫基奥综合征(Morquio syndrome)、克尼斯特综合征(Kniest syndrome)、后生营养性发育不良(metatrophic dysplasia)及脊椎干骺端发育不良(spondyloepimetaphyseal dysplasia)。此外，CNP变体适用于生长激素的辅助物或替代物以便治疗特发性身材矮小及其它骨骼发育不良。
另外，CNP变体适用于治疗其它骨相关病状及病症，诸如佝偻病、低磷酸盐血症性佝偻病[包括X染色体连锁低磷酸盐血症性佝偻病(亦称为抗维生素D佝偻病)及常染色体显性低磷酸盐血症性佝偻病]，及软骨病[包括肿瘤诱发的软骨病(亦称为致癌软骨病或致癌低磷酸盐血性软骨病)]。
本文的CNP变体亦可用以治疗骨关节炎。骨关节炎为关节软骨的退化性疾病且通常发生于老年人中。骨关节炎涉及软骨破坏及由关节组件退化所致的骨与软骨的增生性变化，其中该变化导致继发性关节炎(例如滑膜炎)。在骨关节炎中，作为软骨的功能性实体的细胞外基质蛋白质减少，且软骨细胞数目减少(Arth.Rheum.46(8)：1986-1996(2002))。藉由促进基质产生、软骨细胞生长及分化，CNP变体适用于在患关节炎(包括骨关节炎)的个体中抗衡FGF-2的不当作用及增加基质合成，藉此治疗关节炎，包括骨关节炎。
血管平滑肌病症
CNP及其它血管活性肽(包括ANP、BNP及尿舒血管素(urodilatin))具有血管扩张及利尿特性且在心血管内稳定中起重要作用(J.Cardiovasc.Pharmacol.(心血管药物学杂志)，117：1600-06(1998)；Kidney Int.(国际肾脏)，49：1732-37(1996)；Am.J.Physiol.(美国生理学杂志)，275：H1826-1833(1998))。CNP广泛分布于心血管系统中，尤其以高浓度分布于血管内皮细胞中(J.Cardiovasc.Pharmacol.(心血管药物学杂志)，117：1600-06(1998))。CNP为血管平滑肌(尤其在冠状循环中)的有效松弛剂(Biochem.Biophys.Res.Commun.，(生物化学生物物理研究通讯)205：765-771(1994))，且为平滑肌细胞增殖的抑制剂(Biochem.Biophys.Res.Commun.，(生物化学生物物理研究通讯)177：927-931(1991))。尽管CNP的血管扩张作用的效力不如ANP强(约1∶100)(Hypertens.Res.(高血压研究)，21：7-13(1998)；Am.J.Physiol.(美国生理学杂志)，275：L645-L652(1998))，但在发炎性心血管病理学中，CNP mRNA回应于剪切应力而增加(FEBSLett.(FEBS通信)，373：108-110(1995))，且CNP的血浆含量升高(Biochem.Biophys.Res.Commun.，(生物化学生物物理研究通讯)198：1177-1182(1994))。已显示CNP经由抑制巨噬细胞浸润于兔的受损颈动脉中来抑制发炎(Circ.Res.(循环研究)，91：1063-1069(2002))，且经由NPR-B/cGMP依赖性路径直接抑制心脏成纤维细胞增殖(Endocrinology(内分泌学)，144：2279-2284(2003))。
CNP的心血管作用系经由NPR亚型NPR-B及NPR-C的活化来介导(Endocrinology(内分泌学)，130：229-239(1992))，NPR-C占活体内表达的NPR的95％(Science(科学)，293：1657-1662(2001))。CNP/NPR-B路径在心血管系统中引起cGMP(公认第二信使)升高。NPR-C的C端的37个氨基酸部分具有与异源三聚G蛋白Gi相互作用的共同序列(J.Biol.Chem.(生物化学杂志)，274：17587-17592(1999))，已显示该异源三聚G蛋白Gi调节腺苷酸环化酶及磷脂酶C活性(J.Biol.Chem.(生物化学杂志)，276：22064-70(2001)；Am.J.Physiol.(美国生理学杂志)，278：G974-980(2000)；J.Biol.Chem.(生物化学杂志)，271：19324-19329(1996))。CNP经由NPR-C的活化及G蛋白调节的内向性整流K+通道的开启来介导平滑肌超极化及松弛(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，100：1426-1431(2003))。同样，CNP在心脏成纤维细胞中具有重要抗增殖作用，且经由与NPR-C相互作用使平滑肌细胞超极化来调节局部血液流动及全身血压(R.Rose及W.Giles，J.Physiol.(生理学杂志)586：353-366(2008))。
CNP22通过结合于血管平滑肌细胞上的NPR-B来刺激cGMP的产生，cGMP充当细胞内第二信使以最终使得血管松弛。基于CNP的降血压作用，本文的CNP变体适用于治疗高血压、充血性心脏衰竭、心原性水肿、肾水肿、肝原性水肿、急性及慢性肾功能不全等。另外，cGMP信号传导的活化抑制血管平滑肌细胞的生长。因此，本文的CNP变体可用以治疗由血管平滑肌细胞的异常生长所致的病状或疾病，包括(但不限于)再狭窄及动脉硬化。
上述研究表明，CNP可为用于血管平滑肌松弛及重塑的潜在治疗候选物。CNP对于某些病症的药理作用部分地归因于血管保护作用而非血管扩张活性(Am.J.Respir.Crit.Care Med.(美国呼吸道重症监护医学杂志)，170：1204-1211(2004))。因此，本文的CNP变体适用于治疗CNP可具有血管保护作用的病状，例如血管平滑肌病症，该血管保护作用包括(但不限于)诱导平滑肌松弛及抑制巨噬细胞浸润于心脏组织中。在一实施例中，使用CNP变体来治疗心脏衰竭，包括(但不限于)急性代偿失调性心脏衰竭及急性充血性心脏衰竭。在另一实施例中，使用CNP变体来治疗哮喘、心肌症及冠状动脉再狭窄(藉由增强平滑肌细胞松弛及减少平滑肌细胞增殖)。
CNP变体的医药组合物
在其它实施例中，本文提供医药组合物，其包含CNP变体及一或多种医药学上可接受的赋形剂、载体及/或稀释剂。在某些实施例中，这些组合物进一步包含一或多种其它生物活性剂(例如蛋白酶、受体酪氨酸激酶及/或清除受体NPR-C的抑制剂)。
在一些实施例中，组合物包含纯度为至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的所需CNP变体。在某些实施例中，组合物含有少于约10％、5％、4％、3％、2％、1％或0.5％大分子污染物，诸如其它哺乳动物(例如人类)蛋白质及其它CNP变体。
赋形剂、载体及稀释剂的非限制性实例包括载体、液体、缓冲剂、等张剂、添加剂、稳定剂、防腐剂、增溶剂、界面活性剂、乳化剂、湿润剂、佐剂等。组合物可含有液体(例如水、乙醇)；各种缓冲剂内容物(例如Tris-HCl、磷酸盐、乙酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂)、pH值及离子强度的稀释剂；去污剂及增溶剂(例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)；抗氧化剂(例如甲硫氨酸、抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠)；防腐剂(例如硫柳汞(Thimerosol)、苯甲醇、间甲酚)；及增积物质(bulkingsubstance)(例如乳糖、甘露糖醇、蔗糖)。在此项技术中已知在医药组合物的制剂中使用赋形剂、稀释剂及载体；例如参看Remington’s PharmaceuticalSciences(Remington药典)，第18版，第1435-1712页，Mack PublishingCo.(Easton，Pennsylvania(1990))，其系以其全文引用的方式并入本文中。
举例而言，载体包括(但不限于)稀释剂、载体及佐剂，以及植入运载体，及不与活性成分反应的惰性无毒固体或液体填充剂及囊封材料。载体的非限制性实例包括磷酸盐缓冲盐水、生理盐水、水及乳液(例如油/水乳液)。载体可为含有例如乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇及其类似物)、植物油及其混合物的溶剂或分散介质。
在一些实施例中，组合物为液体制剂。在某些实施例中，制剂包含浓度范围为约0.1mg/ml至约20mg/ml，或约0.5mg/ml至约20mg/ml，或约1mg/ml至约20mg/ml，或约0.1mg/ml至约10mg/ml，或约0.5mg/ml至约10mg/ml，或约1mg/ml至约10mg/ml的CNP变体。
在其它实施例中，组合物包含缓冲溶液或缓冲剂以维持含CNP的溶液或悬浮液的pH值在所需范围内。缓冲溶液的非限制性实例包括磷酸盐缓冲盐水、Tris缓冲盐水及亨克氏缓冲盐水(Hank’s buffered saline)。缓冲剂包括(但不限于)乙酸钠、磷酸钠及柠檬酸钠。亦可使用缓冲剂的混合物。在某些实施例中，缓冲剂为乙酸/乙酸盐或柠檬酸/柠檬酸盐。适用于组合物中的缓冲剂的量部分视所用特定缓冲剂及溶液或悬浮液的所需pH值而定。举例而言，乙酸盐为在pH 5下比在pH 6下更有效的pH值缓冲剂，因此在pH 5的溶液中可使用比pH 6的溶液中所用较少的乙酸盐。在一些实施例中，缓冲剂具有约10mM±5mM的浓度。在某些实施例中，组合物的pH值为约pH 3至约pH 7.5，或约pH 3.5至约pH 7，或约pH 3.5至约pH 6.5，或约pH 4至约pH 6，或约pH 4至约pH 5，或为约pH 5.0±1.0。
在其它实施例中，组合物含有等张调节剂以使得溶液或悬浮液等张且更兼容以便注射。等张剂的非限制性实例包括NaCl、葡聚糖、葡萄糖、丙三醇、山梨糖醇、木糖醇及乙醇。在某些实施例中，等张剂为NaCl。在某些实施例中，NaCl浓度为约160±20mM，或约140mM±20mM，或约120±20mM，或约100mM±20mM，或约80mM±20mM，或约60mM±20mM。
在其它实施例中，组合物包含防腐剂。防腐剂包括(但不限于)间甲酚及苯甲醇。在某些实施例中，防腐剂浓度为约0.4％±0.2％，或约1％±0.5％，或约1.5％±0.5％，或约2.0％±0.5％。
在其它实施例中，组合物含有抗吸附剂(例如以减轻CNP变体吸附至玻璃或塑料)。抗吸附剂包括(但不限于)苯甲醇、聚山梨醇酯20及聚山梨醇酯80。在某些实施例中，抗吸附剂浓度为约0.001％至约0.5％，或约0.01％至约0.5％，或约0.1％至约1％，或约0.5％至约1％，或约0.5％至约1.5％，或约0.5％至约2％，或约1％至约2％。
在其它实施例中，组合物包含稳定剂。稳定剂的非限制性实例包括丙三醇、甘油、硫甘油、甲硫氨酸及抗坏血酸及其盐。在一些实施例中，当稳定剂为硫甘油或抗坏血酸或其盐时，稳定剂浓度为约0.1％至约1％。在其它实施例中，当稳定剂为甲硫氨酸时，稳定剂浓度为约0.01％至约0.5％，或约0.01％至约0.2％。在其它实施例中，当稳定剂为丙三醇时，稳定剂浓度为约5％至约100％(纯)。
在其它实施例中，组合物含有抗氧化剂。例示性抗氧化剂包括(但不限于)甲硫氨酸及抗坏血酸。在某些实施例中，抗氧化剂与CNP变体的摩尔比为约0.1∶1至约15∶1，或约1∶1至约15∶1，或约0.5∶1至约10∶1，或约1∶1至约10∶1，或约3∶1至约10∶1。
组合物中可使用医药学上可接受的盐，包括(但不限于)无机酸盐(例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐)、有机酸盐(例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、甲苯磺酸盐)，及胺盐(例如异丙胺、三甲胺、二环己胺、二乙醇胺)。医药学上可接受的盐的全面讨论可见于Remington’s PharmaceuticalSciences(Remington药典)，第18版，Mack Publishing Company，(Easton，Pennsylvania(1990))中。
医药组合物可以各种形式给予，诸如锭剂、胶囊、颗粒剂、粉末、溶液、悬浮液、乳液、软膏及经皮贴片。组合物的剂型可据组合物的所需给予模式来调整。对于经口给予，组合物可采用例如锭剂或胶囊(包括软凝胶胶囊)的形式，或可为例如水性或非水性溶液、悬浮液或糖浆。供经口给予的锭剂及胶囊可包括一或多种常用赋形剂、稀释剂及载体，诸如甘露糖醇、乳糖、葡萄糖、蔗糖、淀粉、玉米淀粉、糖精钠、滑石、纤维素、碳酸镁及润滑剂(例如硬脂酸镁、硬脂酰反丁烯二酸钠)。必要时，可将调味剂、着色剂及/或甜味剂添加至固体及液体制剂中。用于经口制剂的其它可选成分包括(但不限于)防腐剂、悬浮剂及增稠剂。经口制剂亦可具有肠溶衣以保护CNP变体不受胃部的酸性环境影响。制备固体及液体剂型的方法为已知，或本领域技术人员将显而易见(例如参看上文所参考的Remington药典(Remington药典))。
供非经肠给予的制剂可制备为例如液体溶液或悬浮液，制备为适于在注射之前溶解或悬浮于液体介质中的固体形式，或制备为乳液。举例而言，可根据此项技术中已知的技术，使用适合稀释剂、载体、溶剂(例如缓冲水溶液、林葛尔氏溶液(Ringer’s solution)、等张氯化钠溶液)、分散剂、湿润剂、乳化剂、悬浮剂及其类似物来调配无菌可注射溶液及悬浮液。另外，可使用无菌不挥发性油、脂肪酸酯、多元醇及/或其它非活性成分。作为其它实例，供非经肠给予的制剂包括无菌可注射水溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂，及使制剂与预定接受者的血液等张的溶质；及水性及非水性无菌悬浮液，其可含有悬浮剂及增稠剂。
包含CNP变体的组合物亦可为冻干制剂。在某些实施例中，冻干制剂包含缓冲剂及膨胀剂，及视情况选用的抗氧化剂。例示性缓冲剂包括(但不限于)乙酸盐缓冲剂及柠檬酸盐缓冲剂。例示性膨胀剂包括(但不限于)甘露糖醇、蔗糖、聚葡萄糖、乳糖、海藻糖及聚维酮(PVP K24)。在某些实施例中，甘露糖醇的量为约3％至约10％，或约4％至约8％，或约4％至约6％。在某些实施例中，蔗糖的量为约6％至约20％，或约6％至约15％，或约8％至约12％。例示性抗氧化剂包括(但不限于)甲硫氨酸及抗坏血酸。
本文亦提供试剂盒，其含有例如包含液体(例如无菌可注射液体)制剂或固体(例如冻干固体)制剂的瓶、小瓶、安瓿、管、药筒及/或针筒。这些试剂盒亦可含有医药学上可接受的载体或运载体(例如溶剂、溶液及/或缓冲液)以便将固体(例如冻干固体)制剂复原成溶液或悬浮液以便给予(例如通过注射)，包括(但不限于)在针筒中复原冻干制剂以便注射或将浓缩物稀释至较低浓度。此外，可自例如包含含有CNP的组合物的无菌散剂、颗粒剂或锭剂制备临时注射溶液及悬浮液。试剂盒亦可包括分配装置，诸如喷雾器，或注射分配装置、笔式注射器、自动注射器、无针注射器、针筒及/或针。
作为一非限制性实例，试剂盒可包括具有单腔室或双腔室的针筒。对于单腔室针筒，单腔室可含有备用于注射的液体CNP制剂，或固体(例如冻干固体)CNP制剂或CNP变体于相对较小量的适合溶剂系统(例如丙三醇)中的液体制剂，其可复原成溶液或悬浮液以便注射。对于双腔室针筒，一个腔室可含有医药学上可接受的载体或运载体(例如溶剂系统、溶液或缓冲液)，且另一腔室可含有固体(例如冻干固体)CNP制剂或CNP变体于相对较小量的适合溶剂系统(例如丙三醇)中的液体制剂，其可使用来自第一腔室的载体或运载体复原成溶液或悬浮液以便注射。
作为另一实例，试剂盒可包括一或多个笔式注射器或自动注射器装置，及双腔室药筒。药筒的一个腔室可含有医药学上可接受的载体或运载体(例如溶剂系统、溶液或缓冲液)，且另一腔室可含有固体(例如冻干固体)CNP制剂或CNP变体于相对较小量的适合溶剂系统(例如丙三醇)中的液体制剂，其可使用来自第一腔室的载体或运载体复原成溶液或悬浮液以便注射。药筒可包含足以历经所需时段(例如1日、2日、3日、1周、2周、3周、4周等)给药的量的CNP变体。可调节笔式注射器或自动注射器以自药筒给予所需量的CNP制剂。
另外，可将包含CNP变体的医药组合物调配为缓慢释放、控制释放或持续释放系统以便历经所需时段(诸如1周、2周、3周、1个月、2个月或3个月)维持相对恒定的剂量浓度。如在此项技术中所已知，缓慢释放、控制释放及持续释放制剂可使用例如生物可降解的聚合系统{其可包含例如亲水性聚合物[例如聚丙交酯、聚乙交酯、聚(丙交酯-乙交酯)]}来制备，且可采用例如微粒、微球体或脂质体的形式。
给药剂量及频率
如本文中所用，术语活性剂(例如CNP变体)的”治疗有效量”指向患者提供治疗益处的量。该量可在个体之间不同及可视许多因素(包括患者的总体身体状况)而定。熟习此项技术者使用公开可得的材料及程序可容易地确定CNP变体的治疗有效量。举例而言，基于患有软骨发育不全的0-17岁儿童(214名女性及189名男性)的生长图表(其列出年龄别身高(height for age)、头围及体节生长(segmentalgrowth))，用于疗法的CNP变体的量应得到可接受的生长速率(Horton WA等人，Standard growth curves for achondroplasia(软骨发育不全的标准生长曲线)，J.Pediatr.(儿科杂志)，93：435-8(1978))。CDC图表可用以评估年龄别体重及身高别体重或年龄别BMI。亦可量测使用实质上较长疗程获得的次要结果。
血清半衰期长于野生型CNP22的CNP变体可潜在地以低于CNP22的频率给予。特定个体的给药频率可视多种因素(包括所治疗的病症，及个体的状况及对疗法的反应)而变。在某些实施例中，约每日一次、每两日一次、每三日一次或每周一次给予个体含有CNP变体的医药组合物。在一实施例中，为治疗骨相关病症(例如骨骼发育不良，包括软骨发育不全)，给予患者每日或每周剂量的CNP变体直至成人为止及/或贯穿成人期。
本文所述的CNP变体可以治疗有效剂量给予患者以治疗、改善或预防骨相关病症(例如骨骼发育不良，包括软骨发育不全)及CNP可提供血管保护作用的病状(例如血管平滑肌病症)。可于细胞培养物或实验动物中藉由标准药理学程序，诸如藉由测定LD50(对50％群体致死的剂量)及ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)来测定CNP变体的安全性及治疗功效。毒性作用与治疗作用之间的剂量比率为治疗指数且其可以比率LD50/ED50形式表示。显示大治疗指数的活性剂通常较佳。
获自细胞培养分析法及动物研究的数据可用以调配供人类使用的剂量范围。该剂量通常处于循环浓度(包括ED50)的范围内，其中毒性极小或最小。该剂量可视所用剂型及所用给药途径而在此范围内变化。治疗有效剂量可由细胞培养分析法及动物研究测定。
在某些实施例中，本文所述的CNP变体系以约5或10nmol/kg至约300nmol/kg，或约20nmol/kg至约200nmol/kg范围内的剂量给予。在一些实施例中，以约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、125、130、140、150、160、170、175、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、350、400、450、500、750、1000、1250、1500、1750或2000nmol/kg的剂量或治疗医师认为适当的其它剂量给予CNP变体。在其它实施例中，以约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000μg/kg或约1、1.25、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg/kg的剂量，或治疗医师认为适当的其它剂量给予CNP变体。本文所述的CNP变体的剂量可根据本文所述的给药频率/给药频率来给予，这些频率包括(但不限于)每日、每周2或3次、每周、每2周、每3周、每月等。
对于特定个体，给予/给予CNP变体的频率可视包括以下的多种因素而变化：所治疗的病症、及个体的状况、及对疗法的反应。可以单次剂量或以每次给药多次剂量的形式给予CNP变体。在某些实施例中，以如下频率给予CNP变体：单次剂量或多次剂量、每日、每隔一日、每3日、每周2次、每周3次、每周、每两周、每3周、每月、每6周、每2个月、每3个月，或治疗医师认为适当的频率。
在一些实施例中，给予CNP变体以便留出生长期(例如软骨生成)，接着为恢复期(例如骨生成)。举例而言，可静脉内、皮下，或藉由另一模式每日或每周多次给予CNP变体持续一段时间，接着为无治疗时期，接着重复该循环。在一些实施例中，初始治疗期(例如每日或每周多次给予CNP变体)持续3日、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周或12周。在一相关实施例中，无治疗时期持续3日、1周、2周、3周或4周。在某些实施例中，CNP变体的给药疗程为每日给药持续3日，接着3日不给药；或每日或每周多次给药持续1周，接着3日或1周不给药；或每日或每周多次给药持续2周，接着1或2周不给药；或每日或每周多次给药持续3周，接着1、2或3周不给药；或每日或每周多次给药持续4、5、6、7、8、9、10、11或12周，接着1、2、3或4周不给药。
给药模式
可以多种方式(诸如通过皮下、静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮内或鞘内注射)来给予个体CNP变体或包含其的医药组合物。在一实施例中，藉由一日一次单次皮下、静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮内或鞘内注射来给予CNP变体。
亦可通过在疾病部位或其附近直接注射来给予CNP变体。此外，可通过在目标作用部位(例如异常骨或发育不全骨)植入储积器来给予CNP变体。或者，可于舌下方经舌下(例如舌下锭剂)或通过吸入肺中(例如吸入剂或气雾剂喷雾)、通过传递至鼻腔中(例如鼻内喷雾)、通过传递至眼内(例如滴眼剂)或通过经皮传递(例如藉助于皮肤贴片)来给予CNP变体。CNP变体亦可以微球体、微囊、脂质体(不带电或带电(例如阳离子型))、聚合微粒(例如聚酰胺、聚丙交酯、聚乙交酯、聚(丙交酯-乙交酯))、微乳液及其类似物的形式经口给予。
另一给药方法通过渗透泵(例如Alzet泵)或微型泵(例如Alzet微型渗透泵)来给予，这些泵允许控制、连续及/或缓释传递CNP变体或医药组合物持续预定时期。渗透泵或微型泵可植入目标部位(例如肢干的长骨、骨骺等)或目标部位附近的皮下。
如上所说明，CNP变体可用以治疗由血管平滑肌细胞异常生长引起的病状或疾病，包括(但不限于)再狭窄及动脉硬化。为将CNP变体局部传递至患病身体血管(例如血管)，可借助植入于患病部位的医学装置(例如血管内支架)来传递CNP变体。在一实施例中，将CNP变体浸渍于安置于血管内支架上的聚合基质或聚合涂层内。在另一实施例中，CNP变体包含在形成于血管内支架内且由CNP变体可扩散穿过的多孔聚合膜或聚合层覆盖的储集器或通道内。如在此项技术中所已知，聚合基质、涂层、膜或层可包含至少一种生物可降解(例如亲水性)聚合物。在另一实施例中，CNP变体可含于血管内支架体中的微孔内。可自血管内支架通过爆发式释放、脉冲释放、控制释放或持续释放或其组合来传递CNP变体。举例而言，血管内支架可依次以爆发式释放及持续释放的方式将CNP变体局部传递至患病部位。持续释放可持续多达约2周、1个月、2个月、3个月、6个月或1年的时期。
本领域技术人员将明白，CNP变体或其组合物亦可通过其它模式给予。CNP变体或其组合物的最有效给药模式的决定在本领域技术人员的技能范围内。
CNP变体可以医药制剂形式给予，这些医药制剂适用于例如经口(包括颊内及舌下)、经直肠、经鼻、表面、经肺、经阴道或非经肠(包括肌肉内、动脉内、鞘内、皮下及静脉内)给予，或呈适于通过吸入或吹入给予的形式。视预定给药模式而定，医药制剂可呈固体、半固体或液体剂型，诸如锭剂、栓剂、丸剂、胶囊、散剂、液体、悬浮液、乳液、乳膏、软膏、洗剂及其类似物。可以适于单次给予精确剂量的单位剂型提供制剂。这些制剂包含有效量的CNP变体，及一或多种医药学上可接受的赋形剂、载体及/或稀释剂，及视情况选用的一或多种其它生物活性剂。
组合疗法
在一实施例中，CNP变体可与一或多种适用于治疗、改善或预防CNP反应性病状或病症(诸如骨相关病症(例如骨骼发育不良)及血管平滑肌病症)的其它活性剂组合使用。其它活性剂可增强CNP变体的作用及/或除CNP变体的作用外亦发挥其它药理学作用。可与本文所述的CNP变体组合使用的活性剂的非限制性实例为其它利钠肽(例如BNP)，及肽酶及蛋白酶(例如NEP及弗林蛋白酶)、NPR-C及酪氨酸激酶(例如FGFR-3)的抑制剂(例如拮抗剂)。NEP抑制剂可通过防止CNP变体的NEP切割来延长变体的半衰期。NEP抑制剂的实例包括(但不限于)塞奥芬及坎沙曲。共同使用NPR-C抑制剂亦可经由抑制NPR-C对变体的清除来延长CNP变体的半衰期。NPR-C抑制剂的非限制性实例为片段FGIPMDRIGRNPR(SEQ ID NO：82)，其将在目标部位(例如骨生长板)于FGIPMDRIGRNPR-CNP22嵌合体(类似物CZ)(SEQ ID NO：82)或包含CNP22的变体(例如相对于CNP22含有氨基酸取代、添加及/或缺失的变体)的类似嵌合体的蛋白水解切割后释放。共同使用酪氨酸激酶抑制剂可通过抑制酪氨酸激酶受体FGFR-3(一种软骨细胞及骨生长的负调节剂)来增强CNP的效果。酪氨酸激酶抑制剂的非限制性实例包括U.S.6,329,375及6,344,459中所揭示者。
为在组合疗法中达成适当治疗结果，一般将给予个体有效产生所需治疗结果(例如恢复骨生长)的组合量的CNP组合物与其它治疗剂。此方法可涉及同时给予CNP组合物与其它治疗剂。同时给予可藉由给予包括CNP变体与其它治疗剂的单一组合物或药理学蛋白质制剂来达成。或者，其它治疗剂可与CNP变体的药理学制剂(例如锭剂、注射液或饮剂)大致在同时分别服用。亦可将CNP变体调配于适于摄取的食物(诸如核仁巧克力蛋糕(brownies)、薄饼或蛋糕)中。
在其它替代疗程中，给予CNP变体可在给予其它治疗剂之前或之后，间隔数分钟至数小时范围内的时间进行。在分别给予其它治疗剂及CNP组合物的实施例中，一般将确保CNP变体及其它治疗剂在彼此适当的时间内给予，以使CNP变体及其它治疗剂可对患者发挥协同或加成的有利作用。举例而言，可在其它治疗剂的约0.5-6小时内(之前或之后)给予CNP组合物。在一实施例中，CNP组合物在其它治疗剂的约1小时内(之前或之后)给予。
鉴别及监测患者群体
可建立鉴别适于CNP疗法的个体及确定指定患者对CNP疗法是否有反应的疗程。举例而言，对于治疗骨相关病症，可量测生长指标，诸如子宫内(in utero)及新生儿的长骨生长量测值，及骨生长生物标记(诸如CNP、cGMP、胶原蛋白II、骨钙化素及增殖细胞核抗原(PCNA))的量测值。
一种CNP信号传导标记为cGMP(鸟苷3’，5’环状单磷酸)。在CNP结合并活化其同源受体NPR-B之后，此细胞内信号传导分子的含量增加。可自CNP暴露后的细胞培养抽提物(活体外)、自CNP暴露后的骨外植体研究(离体)的条件培养基，及皮下、静脉内或经由此项技术中已知的其它给药途径给予CNP的数分钟内的血浆(活体内)量测提高的cGMP含量。
亦可量测软骨及骨特异性分析物(或软骨及骨相关标记)来评估CNP功效。举例而言，切割的第II型胶原蛋白的片段为软骨更新的软骨特异性标记。第II型胶原蛋白为软骨的主要有机组分且在软骨更新之后，第II型胶原蛋白的片段(切割的胶原蛋白)释放于循环中，且随后分泌于尿中。软骨更新之后形成新骨。
可量测的骨形成的骨特异性生物标记为第I型原胶原的N端前肽(PINP)。因为第I型胶原蛋白为骨基质中的主要有机组分，所以第I型胶原蛋白的合成为骨形成中的重要步骤。在胶原蛋白合成期间，前肽自原胶原分子释放且可在血清中检测到。另外，可量测第I型胶原蛋白的片段作为骨吸收标记。
软骨及骨形成及生长的其它可能生物标记包括聚集蛋白聚糖硫酸软骨素(软骨更新的软骨特异性标记)、第II型胶原蛋白的前肽(软骨形成的软骨特异性标记)、碱性磷酸酶(骨特异性)及骨钙化素(骨形成的骨特异性标记)。可使用市售试剂盒，例如在来自功效/药效学活体内研究及来自离体研究的条件培养基的血清中量测软骨及骨相关生物标记。
在一实施例中，在已给予CNP变体的个体中分析或量测至少一种骨或软骨相关生物标记的含量以监测CNP变体在活体内对骨及软骨形成及生长的作用。举例而言，至少一种骨或软骨相关生物标记的含量增加可表明给予CNP变体对骨生长具有积极作用且为适用于与CNP活性降低相关的骨骼发育不良及其它骨或软骨相关疾病或病症的治疗。例示性骨或软骨相关生物标记包括(但不限于)：CNP(例如内源性含量的CNP)、cGMP、第II型胶原蛋白的前肽及其片段、第II型胶原蛋白及其片段、骨钙化素、增殖细胞核抗原(PCNA)、第I型原胶原的前肽(PINP)及其片段、第I型胶原蛋白及其片段、聚集蛋白聚糖硫酸软骨素及碱性磷酸酶。
在一实施例中，通过自将给予、正给予或已给予CNP变体的个体获得生物样品来量测生物标记。可使用此项技术中已知的技术来量测生物标记，这些技术包括(但不限于)蛋白质印迹分析(Western Blot)、酶联免疫吸附分析法(ELISA)及酶活性分析法。生物样品可为血液、血清、尿液或其它生物流体。
本文的其它态样及细节将自以下实例显而易见，这些实例意欲说明而不具限制性。
实施例
实例1
CNP变体的合成
使用本文所述的方法制备CNP变体。在CNP22的野生型序列的各别氨基酸残基处，以天然或非天然氨基酸或肽模拟物进行取代，如表1-3(展示于实施例3中)中所示。在某些变体中，将额外氨基酸添加至完整野生型CNP22序列或野生型CNP22序列的一部分的N末端及/或C末端(参看表3)。
亦制备PEG(或PEO)部分偶联至CNP22或其变体的N端的CNP变体(参看实施例3中所示的表4)。聚乙二醇化试剂可获自表5中所示的商业来源。
表5
Figure BPA00001469544101001
Figure BPA00001469544101011
购自皮尔斯生物科技(Pierce Biotechnology，洛克福德，伊利诺斯州)的PEG(亦称PEO)聚合物具有单分散性，亦即其含有具有特定分子量的单一不连续聚合物。相反，购自NOF(Nippon Oil and Fat)的PEG聚合物具有多分散性，亦即其含有具有分子量分布的聚合物混合物。
为将CNP22或其变体聚乙二醇化，针对各PEG-CNP偶联物优化反应及纯化条件。根据一般聚乙二醇化程序，反应混合物含有约1mM CNP22或其变体及含约1至5mM NHS活化的PEG的磷酸钾缓冲液(pH值在约5.0与6.5之间)。为在肽N端选择性单聚乙二醇化且将内部位点(例如CNP22的Lys4)的聚乙二醇化降至最少，可在更酸性条件下(例如在约5.5与6.5之间的pH值下)进行聚乙二醇化反应以将赖氨酸侧链上的更具碱性的伯氨基选择性质子化且因此使其去活化。在室温下保温约1至3小时之后，通过添加水性甘氨酸缓冲液来淬灭聚乙二醇化反应。接着通过逆相HPLC(针对各PEG-CNP偶联物优化)分离反应产物。将分级分离样品真空离心浓缩(speedvacced)至干燥，且于1mM HCl中复原/调配。通过液相层析-质谱分析(LC/MS)鉴别各PEG-CNP产物且测定各PEG-CNP产物的纯度。
实施例2A
重组产生CNP变体
可使用重组技术产生CNP变体。在某些实施例中，CNP变体系以包含切割可切割肽、载体蛋白或标签的融合蛋白的形式产生。下文揭示重组产生CNP融合蛋白的例示性方法。
材料及方法
将CNP融合蛋白选殖于表达载体中
使用聚合酶链反应(PCR)扩增CNP DNA片段，且以Nde I及BamHI消化扩增的PCR片段，且选殖于pET21a载体(Novagen，Gibbstown，New Jersey)中。通过DNA2.0合成CNP融合蛋白DNA且将其选殖于不同表达载体(表6)中。
表6
Figure BPA00001469544101021
CNP：GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Gly-CNP37(SEQ ID NO：75)；TAF：人类转录因子TAF12；KSI：酮类固醇异构酶；MBP：麦芽糖结合蛋白；Trx：硫氧还蛋白
在大肠杆菌中表达CNP融合蛋白
将CNP融合蛋白表达质体转化至大肠杆菌BL21或BL21(DE3)中。将转化的细胞涂铺于含有100μg/ml卡本西林(carbeniciline)或50μg/ml康霉素(kanamycin)的LB培养盘上且在37℃下培育隔夜。挑选一个单一菌落且在37℃下在震荡下于4ml含有100μg/ml卡本西林或50μg/ml康霉素的LB培养基中培养。当细菌培养物的OD600达到0.6时，将1mM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)添加至细胞培养基中，且在37℃下在震荡下培育培养基3小时。为进行细胞收集，在4000rpm下离心细菌细胞10分钟且将细胞沉淀储存于-80℃下。在室温下以B-PER II细菌抽提试剂(B-PER II Bacterial Extraction Reagent)(PIERCE，每4ml细菌培养物使用0.4ml)及Benzonase核酸酶(Benzonase Nuclease)(Novagen，0.025U/ml)溶解细胞沉淀10分钟。保存细菌粗抽提物且加以离心以获得上清液。通过SDS-PAGE及蛋白质印迹分析分析上清液及粗抽提物的CNP融合蛋白表达及溶解度。
以SDS-PAGE及蛋白质印迹分析检测CNP融合蛋白表达
在十二烷基硫酸钠-聚丙烯基酰亚胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(英杰公司，卡尔斯伯德，加利福尼亚，NuPAGE 4-12％Bis-tris凝胶，MES SDS缓冲液)上对10μL细胞溶胞物或可溶上清液进行电泳。在室温下使用20ml Imperial蛋白质染料(ThermoFisher(TF公司)，洛克福德，伊利诺斯州)将凝胶染色1小时且以水去染色。为进行蛋白质印迹分析，将蛋白质用凝胶印迹(Gel blot)(英杰公司)转移至膜。在室温下在含5％乳汁的TBS缓冲液中阻断该膜1小时。将兔抗CNP22抗体(1∶2500稀释液)(Bachem，Torrance，California)添加至膜，接着在室温下在震荡下保温该膜2小时，且接着以TBS缓冲液洗涤该膜3次。
将碱性磷酸盐(AP)偶联的抗兔IgG(1∶5000稀释液)添加至膜，接着在室温下在震荡下保温该膜1小时，且接着以TBS缓冲液洗涤该膜3次。将10ml WESTERNBLUE
Figure BPA00001469544101031
稳定化底物(普洛麦格，麦迪逊，威斯康星)添加至膜，接着在室温下震荡保温该膜1至5分钟，且接着以TBS缓冲液洗涤该膜以移除过量染料。
在大肠杆菌BL21中表达TAF-CNP融合蛋白
自储存在-80℃下的甘油储备物获得表达TAF-CNP融合蛋白的细胞(大肠杆菌菌株BL21)且使其在37℃下在震荡下(250rpm)于4ml含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中生长隔夜。将4ml隔夜生长的细胞培养物转移至200ml含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中且37℃震荡(250rpm)培养。当OD600达到0.6时，则添加IPTG至1mM的最终浓度以在37℃震荡(250rpm)诱导蛋白质表达3小时。接着在3000rpm向下旋转细胞10分钟且在-80℃下冷冻所得细胞沉淀。
纯化TAF-CNP包涵体及甲酸切割
将细胞沉淀(自200ml培养物)再悬浮于25ml B-PER II缓冲液(PIERCE)中，在冰上将沉淀音波处理10分钟(50％，1秒，暂停2秒)，在12000rpm下在4℃下离心20分钟，且接着将沉淀再悬浮于25ml稀释20倍的B-PER II缓冲液中。重复此操作直至上清液变得澄清(3-5次)。将1mL再悬浮的TAF-CNP包涵体转移至1.5ml管中且在14000rpm下离心15分钟。弃去上清液且以10μl 88％甲酸溶解沉淀，且接着立即添加490μl微孔过滤的水。通过涡旋充分混合该沉淀，且在55℃下保温20至24小时(70℃/6小时为替代条件)。通过SDS-PAGE及LC/MS(C4RP)分析甲酸切割产物。
LC/MS样品制备
自约8mL培养物(约1.5OD)分离包涵体且将沉淀溶解于10μL纯甲酸盐中。立即将再溶解的沉淀稀释至2％或10％最终甲酸盐浓度(0.5mL)，且在55℃下保温21小时(pH 2)(次日，在2％甲酸盐样品中可见较明显混浊)。在15000rpm下离心两个样品2分钟。将20μL上清液注入LC/MS(C4RP)装置中。
结果
在大肠杆菌中表达CNP融合蛋白
在37℃下，以1mM IPTG诱导3小时使所有CNP融合蛋白均在大肠杆菌中表达(图1)。构建体pJexpress-TAF-CNP、pJexpress-KSI-CNP(M/N)及pET-31b-KSI-CNP以包涵体形式表达，而构建体pET-32a-Trx-CNP及pMAL-CNP以可溶融合蛋白形式表达。使用抗CNP22抗体的蛋白质印迹分析证实CNP融合蛋白的表达(图1)。
通过甲酸切割自TAF-CNP包涵体产生CNP
将TAF-CNP包涵体部分纯化且在55℃下以2％甲酸处理20至24小时(70℃/6小时为替代条件)。大部分TAF-CNP切割且在SDS-PAGE上出现具有与Gly-CNP37肽类似大小的一个额外条带(图2)。通过LC/MS(C4RP)进一步分析切割样品。LC/MS结果显示CNP在甲酸切割之后以可溶形式自TAF-CNP包涵体释放。LC/MS分析表明CNP融合蛋白的甲酸切割使得形成环化Pro-Gly-CNP37(MW＝4102)。基于分析对蛋白质的量进行计算表明自8mL极低OD培养物制得约60μg甲酸产生的CNP。自小规模(例如约8mL)低OD(例如1.2OD)细胞培养物产生大约8μg/mlCNP，而较大规模(例如约8L)较高OD(例如38OD)细胞培养物的发酵可产生约1mg/ml CNP。
结论
产生五个表达构建体以表达CNP融合蛋白。所有五个构建体的表达均产生可溶(Trx及MBP)或不可溶(TAF及KSI)CNP融合蛋白。通过简单甲酸切割程序，可自TAF-CNP包涵体产生约1mg/ml可溶CNP。
实施例2B
在大肠杆菌中产生其它CNP变体
CNP变体的重组产生可如实施例2A中所述进行。在此实施例中，用QuikChange II XL定点突变诱发试剂盒(Stratagene)来产生或利用DNA2.0来合成其它CNP构建体。其它CNP构建体及表达载体列于表7中。
表7
Figure BPA00001469544101041
Figure BPA00001469544101051
Figure BPA00001469544101061
CNP38：GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Gly-CNP37(SEQ ID NO：75)]；
Pro-CNP38：PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Pro-Gly-CNP37](SEQ ID NO：145)；
CNP37：QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO：60)；
HSA-CNP：GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC[HSA-CNP27(SEQ ID NO：144)]；
Pro-CNP53：PDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIG-SMSGLGC(SEQ ID NO：185)；
CNP34：PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO：163)；
TAF-Pro-CNP38：MVLTKKKLQDLVREVCPNEQLDEDVEEMLLQIADDFIESVVTAA-CQLARHRKSSTLEVKDVQLHLERQWNMWIMGSSHHHHHHSSGLVPRGSHT-GDDDDKHMDPGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(SEQ ID NO：196)；
TAF：人类转录因子TAF12组蛋白折叠域(HFD)及来自PET-15b载体的接头；
TAF-NL：无接头的TAF12HFD；
TAF12HFD：VLTKKKLQDLVREVCPNEQLDEDVEEMLLQIADDFIESVVTAACQLA-RHRKSSTLEVKDVQLHLERQWNMWI(SEQ ID NO：197)；
pET-15b接头：MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHTGDDDDKHMD(SEQ ID NO：195)；
TAF(C/A)：TAF中的半胱氨酸变为丙氨酸；
TAF(D/E)：TAF中的天冬氨酸变为谷氨酸(编号指示改变哪个氨基酸残基)；
TAF(C/A及D/E)：TAF中的半胱氨酸及天冬氨酸分别变为丙氨酸及谷氨酸；
BMP：含七个C/A(半胱氨酸变为丙氨酸)突变的骨形态发生蛋白2；
KSI：酮类固醇异构酶；MBP：麦芽糖结合蛋白；TRX：硫氧还蛋白
结果
在37℃下，以1mM IPTG诱导3小时使所有CNP融合蛋白均在大肠杆菌中表达。构建体pJexpress-BMP-Pro-CNP38、pJexpress-TAF-Pro-CNP37、pJexpress-BMP-Pro-CNP37、pJexpress-Pro-HSA-CNP、pJexpress-TAF及pJexpress-BMP以包涵体形式表达。使用利用抗CNP抗体的蛋白质印迹分析来证实该表达(图3)。
通过甲酸切割自TAF-Pro-CNP38包涵体产生Pro-Gly-CNP37(“Pro-CNP38”)
使用甲酸作为包涵体蛋白质的变性剂且可在优化条件下特异性切割Asp与Pro之间的肽键。将TAF-Pro-CNP包涵体如上所述部分纯化且在25℃、37℃、42℃及55℃下以50％甲酸处理24小时。大部分TAF-Pro-CNP38切割，且自37℃、42℃及55℃切割的SDS-PAGE上展示具有与Gly-CNP37(“CNP38”)肽类似的大小的一个额外条带(图4A)。以10M NaOH中和37℃及55℃下的切割反应且在14,000rpm下离心15分钟。未切割TAF-Pro-CNP38、TAF及其它包涵体沉淀于沉淀中。上清液含有可溶Pro-CNP38且通过LC/MS进一步分析。LC/MS结果展示上清液含有由过量酸性水解产生的非特异性切割肽的混合物。
当在55℃下以2％及10％甲酸处理TAF-Pro-CNP包涵体20小时时，大部分TAF-Pro-CNP38切割，且在SDS-PAGE上观察到具有与Gly-CNP37类似的大小的一个额外条带(图4B)。通过LC/MS进一步分析切割样品。LC/MS分析展示正确的Pro-CNP38在甲酸切割之后以可溶形式自TAF-Pro-CNP38包涵体释放。Pro-CNP38自2％及10％甲酸切割的产率类似(图4C)。
用于Pro-Gly-CNP37(“Pro-CNP38”)产生及纯化的甲酸切割及中和
甲酸可溶解及切割TAF-Pro-CNP38、BMP-Pro-CNP38及其它包涵体。pH值中和使得不可溶的污染蛋白质/肽(未切割的TAF-Pro-CNP38及BMP-Pro-CNP38、TAF、BMP及其它)沉淀。在离心之后，可溶Pro-CNP38保留于上清液中。TAF-Pro-CNP38及BMP-Pro-CNP38在55℃或70℃下在2％甲酸中切割24小时。以1∶1比率的0.5M Tris缓冲液中和切割反应且在14,000rpm下离心15分钟。结果显示上清液含有几乎纯的肽且在中和后不存在可观察到的Pro-CNP38的回收损失。此为Pro-CNP38纯化的简单且有效的步骤。
用于Pro-Gly-CNP37(“Pro-CNP38”)产生的TAF-Pro-CNP38包涵体甲酸切割的不同条件的分析
甲酸可在优化条件下特异性切割Asp与Pro之间的肽键。若甲酸切割条件未经优化，则可能在Asp与任何其它氨基酸之间发生肽键的非特异性切割，或甚至发生任何肽键的非特异性切割。TAF-Pro-CNP38包涵体以2％甲酸在42℃、55℃或70℃下切割6、24或48小时。图5A展示TAF-Pro-CNP38在70℃下24小时或在55℃下48小时完全切割。70℃切割可在17小时内完成(图5B)。尽管70℃/24小时切割得到最高产率，但非特异性切割产物(例如分子量为3142，自Pro-CNP38通过Asp与Arg之间肽键的切割所产生的肽)显著增加(图5C)。
当TAF-Pro-CNP38包涵体在甲酸切割之前经纯化或以B-PER II缓冲液处理时，Pro-CNP38产生的产率及纯度获得改良。因为B-PER II缓冲液含有去污剂辛基硫糖苷且相对昂贵，所以测试其它常用去污剂或缓冲剂以便大规模产生Pro-CNP38。将TAF-Pro-CNP38包涵体再悬浮于不同去污剂(辛基蔗糖；Tritonx-100；Tween-20；NP-40；CA-630)或缓冲液(B-PER II；B-PER II 1/20稀释液；B-PER；B-PER磷酸盐缓冲液；25mM tris；150mM NaCl(pH 7.9)；25mM tris(pH 7.5)；过滤水；PBS)中且在室温(RT)下保温24小时。所有去污剂均以1％存在于25mM tris缓冲液(pH 7.5)中。在去污剂或缓冲液中保温之后，在55℃下通过2％甲酸来切割TAF-Pro-CNP38包涵体22小时。结果显示BPER II仍显示良好产率，且使用CA630及Triton X-100亦获得积极结果。
Pro-Gly-CNP37(“Pro-CNP38”)蛋白水解切割产物
在Pro-CNP38纯化期间，一种未鉴别的蛋白酶(可能为膜相关蛋白酶)将Pro-CNP38肽(自BL21菌株产生，MW 4102)切割为两种肽，产生肽PGQEHPNAR(MW 1004)(SEQ ID NO：198)及KYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(MW 3115)(SEQ ID NO：199)。不受理论束缚，去污剂可改善Pro-CNP38的产率及纯度的一种可能原因为去污剂可移除大多数，但可能并非全部该未鉴别的蛋白酶。测试高温、碱性pH值及EDTA以鉴别此等试剂是否可抑制蛋白酶切割。在室温或120℃下保温TAF-Pro-CNP38包涵体2小时且在14000rpm下离心15分钟。将沉淀再悬浮于2％甲酸中且在55℃或70℃下保温18小时。添加1∶1比率的0.5M Tris以中和切割。在14000rpm下离心中和的样品5分钟，且在有或无10mM EDTA(pH 10)存在下将上清液在室温下留置6小时或22小时。通过LC/MS分析蛋白水解切割(表8)。
表8.Pro-CNP38蛋白水解切割的LC/MS结果
Figure BPA00001469544101091
所有在70℃下切割的样品(8-12)均显示有限蛋白水解切割(Pro-CNP38切割少于4％)。当在55℃下进行切割时，几乎40％Pro-CNP38被蛋白酶切割(样品7)。碱性pH值及EDTA不影响非特异性蛋白水解切割。高温(120℃，2小时)非特异性切割Pro-CNP38。
应注意来自Stratagene的BL21(DE3)菌株不具有该未鉴别的蛋白酶。
自不同构建体产生Pro-Gly-CNP37(“Pro-CNP38”)及其它CNP变体：
可藉助于TAF-Pro-CNP38融合蛋白以包涵体形式过表达，接着以甲酸切割融合蛋白，在大肠杆菌中大规模产生Pro-CNP38。按照本文所述的方法，其它TAF-CNP融合蛋白(TAF-CNP34及TAF-Pro-CNP53)可以包涵体形式表达，且接着以甲酸切割，以产生CNP变体CNP34及Pro-CNP53。图6描绘TAF-CNP34的表达，图7描绘TAF-Pro-CNP53的表达，图8描绘TAF-CNP34及TAF-Pro-CNP53的甲酸切割产物，图9描绘LC/MS层析图中CNP-34的峰，且图10描绘LC/MS层析图中Pro-CNP53的峰。
使用甲酸可引起在除所靶向Asp-Pro键外的肽键处非特异性切割。为改良所需甲酸切割产物的纯度及总体滴度，将TAF12或其片段中的不同天冬氨酸残基变为谷氨酸。此外，将TAF12或其片段中的一或多个半胱氨酸残基变为丙氨酸以防止形成非特异性二硫键。所有在TAF12中具有此等突变的TAF-Pro-CNP38融合蛋白均以包涵体形式表达且以甲酸切割以产生Pro-CNP38。图7展示TAF-NL-(C/A及6D/6E)-Pro-CNP38及TAF(C/A及10D/10E)-Pro-CNP38的表达，图11展示TAF(C/A及4D/4E)-Pro-CNP38及TAF(4D/4E)-Pro-CNP38的表达，图12展示TAF(4D/4E)-Pro-CNP38及TAF(C/A及4D/4E)-Pro-CNP38的甲酸切割产物，且图13展示TAF-NL-(C/A及6D/6E)-Pro-CNP38及TAF(C/A及10D/10E)-Pro-CNP38的甲酸切割产物。表9概括获自各种TAF-Pro-CNP38构建体的Pro-CNP38的纯度(在纯化之前)及滴度。
表9
Figure BPA00001469544101101
*具有pJexpress-TAF(C/A及10D/10E)-Pro-CNP38的细胞生长较缓慢且最终细胞密度(OD600)相比于其它TAF-Pro-CNP38构建体较低。
通过发酵及甲酸切割大规模产生Pro-Gly-CNP37(“Pro-CNP38”)
使包含pJexpress-TAF-CNP构建体的BL21(DE3)细胞在10公升发酵罐中于37℃下生长约16-17小时直至OD600达到64。接着在1mM IPTG存在下在约35-37℃下生长/培养细胞，以诱导TAF-Pro-CNP38融合蛋白表达，持续约7-8小时直至OD600达到160。发酵产生9g/L TAF-Pro-CNP38的滴度。图14显示发酵中产生的TAF-Pro-CNP38融合蛋白的蛋白质印迹。
将自750mL细胞培养物(来自10L发酵发酵物)回收的细胞沉淀再悬浮于pH7.4磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，且通过三次穿过压力匀浆机(10,000巴)溶解。在6,500g下离心所得溶胞物10分钟且弃去上清液。以定子旋转机(rotostator)将含有不可溶TAF-Pro-CNP38融合蛋白包涵体的沉淀部分再悬浮于500mL PBS中。在6,500g下离心悬浮液10分钟且弃去上清液。以定子旋转机将所得包涵体沉淀再悬浮于500mL中且在55℃下保温30分钟。将250mL 6％甲酸添加至温热的包涵体悬浮液中达2％甲酸的最终浓度，且在55℃下保温20-24小时。在20-24小时之后添加50mL400mM Na2HPO4以开始中和甲酸切割反应，且以50％w/v NaOH滴定所得混合物至pH 6.9-7.4且在室温下留置30分钟。在中和之后，形成重沉淀物且通过在6,500g下离心10分钟来移除。保留上清液且其每公升培养物含有平均1.3g 80％纯Pro-CNP38。大部分大肠杆菌及TAF相关蛋白质及肽保留于沉淀中。
自甲酸切割及中和上清液产生的可溶Pro-CNP38为80％纯且含有线性及环化Pro-CNP38肽连同其它产物相关杂质的混合物。无菌过滤含有Pro-CNP38的pH值中性上清液。在pH 7-7.4下通过使用Fractogel TMAE Hi-CAP管柱(EMD Biosciences)进行阴离子交换层析来进一步纯化以移除应结合于该管柱的DNA、内毒素及肽污染物。流穿的级分含有部分环化的Pro-CNP38。将硫酸铜添加至流穿级分中达10μM的最终浓度且在室温下保温1小时。在中性pH值下添加Cu++催化肽上游离半胱氨酸硫氢基的氧化以形成分子内二硫键，产生100％环化Pro-CNP38且无可检测的线性肽。藉由添加水将溶液电导率调节至小于15mS/cm。接着使用SP-琼脂糖管柱(GE Healthcare)及磷酸钠缓冲液(pH 7)进行阳离子交换层析以移除流经物中任何剩余DNA及内毒素，且进一步纯化Pro-CNP38至约95-96％的纯度，其中非产物相关杂质少于0.5％。图15为来自SP-琼脂糖管柱的洗脱级分的SDS-PAGE；Pro-CNP38的最高浓度见于级分22至30。未汇集的级分24的逆相HPLC/MS分析表明存在90％Pro-CNP38、5％含氧化甲硫氨酸残基的Pro-CNP38、3％在Gly-Cys键处切割从而形成CNP-17的Pro-CNP38，及1.6％在环状域中Asp-Arg键处切割的Pro-CNP38。最终纯化后纯Pro-CNP38肽的产率为每公升细胞培养物获得0.9g(36％总回收率)。
汇集自五次个别纯化收集的Pro-CNP38以供调配。汇集产物含有93.5％Pro-CNP38、3.3％含氧化甲硫氨酸残基的Pro-CNP38、1.3％脱酰胺Pro-CNP38，及1％在Gly-Cys键处切割从而形成CNP-17的Pro-CNP38。将样品以50mM磷酸钠(pH 7)稀释至10mS/cm的电导率且将其加载于CM-琼脂糖管柱(GE-Healthcare)上以供浓缩及缓冲液交换。CM-琼脂糖树脂的弱阳离子交换特性允许利用弱酸溶液而非典型盐梯度使肽自管柱解离。使Pro-CNP38自CM-琼脂糖管柱解离所需的酸浓度视管柱负载量而定。在每毫升树脂负载50mg Pro-CNP38时，10mM HCl足以使Pro-CNP38洗脱。在每毫升树脂负载9mg Pro-CNP38时，洗脱需要50mM HCl。当负载量为每毫升树脂9mg Pro-CNP38时，Pro-CNP38洗脱于小于一个管柱体积中，其使肽显著浓缩。洗脱级分含有20.3mg/mL 95％纯Pro-CNP38，以及3％含氧化甲硫氨酸残基的Pro-CNP38、1％脱酰胺Pro-CNP38，及少于1％在Gly-Cys键处切割从而形成CNP-17的Pro-CNP38。Pro-CNP38于弱酸中的浓溶液适用于稀释于适当缓冲液中以用于液体或冻干制剂。
实施例3
活体外利用中性内肽酶对CNP变体进行切割
为测定氨基酸取代、氨基酸延伸、主链修饰、侧链修饰及聚乙二醇化对CNP变体对中性内肽酶(NEP)切割的敏感性的影响，使用监测未切割CNP变体消失的活体外分析法来分析肽切割。
将重组人类NEP(1μg/mL最终浓度)添加至100μM稀释于0.1M Tris(pH 7)中的CNP变体中。在37℃下保温反应混合物持续各种时段，且以EDTA(最终10mM)淬灭反应，接着进行热变性。缩减反应混合物且接着使用HPLC及质谱来分析反应产物。基于完整CNP变体随时间而消失来计算CNP变体的半衰期。将经消化CNP变体的结果与平行wtCNP22消化相比较且相对于由1mg/ml NEP消化的100μM CNP22的结果(t1/2＝80分钟)来校正。
表1列出具有主链或侧链修饰的各种CNP变体的半衰期(依据活体外NEP切割分析法)。然而，移除类似物L中六个NEP切割位点中的三个产生实质上更短的半衰期。在所测试的CNP变体中，类似物N(含有CNP22的所有22个氨基酸的D-对映异构体)及类似物M(在Leu9与Leu11均具有N-甲基化酰胺键)显示最大的NEP切割抗性。然而，类似物N与类似物M均不能刺激cGMP产生(参看下文)。
将类似物A、B、E、F、G及H的半衰期互相比较，类似物E及G的半衰期经测定相比于类似物A、B、F及H的半衰期为约1.5倍至约2.5倍长。所有此六种类似物均在Cys6-Phe7键处显示切割抗性或相对于wtCNP22获改良的切割抗性(数据未图标)。依据半衰期，类似物对1μg/ml NEP的抗性的等级次序为类似物G(3-Cl-Phe)≥类似物E(D-Phe)＞类似物H(“β-2Phe”)、类似物B(N-Me-Phe)及类似物F(t-Bu-Gly)＝wtCNP22＞类似物A(Cys-CH2-NH)。类似物E及G相比于wtCNP22具有约1.5倍长的半衰期。除对Cys6-Phe7键切割的抗性外，类似物B、E、F、G及H亦显示对1μg/mL NEP存在下Gly8-Leu9键切割的抗性(数据未图标)。此等结果表明在Cys6与Gly8之间具有主链或侧链修饰的CNP变体可对NEP切割Cys6-Phe7键及/或Gly8-Leu9键具有抗性，但未必具有改良的对NEP的总体抗性或比CNP22长的半衰期。这些结果似乎与文献中关于NEP首先切割CNP22的Cys6-Phe7键且接着在其它处切割的报导相反。
表1
Figure BPA00001469544101131
Figure BPA00001469544101141
1通过利钠肽刺激NIH3T3细胞中的cGMP产生(相对于1μM CNP22存在下的cGMP产生)
2CNP22的NEP抗性t1/2平均为80分钟。由于实验之间NEP的催化活性存在变化，因此将所有CNP22 t1/2消化均相对于80分钟来校正，且在各实验中使用差分系数来计算类似物t1/2以获得经调整的t1/2。
ND＝未测定
表2列出具有天然及/或非天然氨基酸的取代的各种CNP变体的半衰期(依据活体外NEP切割分析法)。在所测试的变体中，具有K4R及G15S取代的类似物BK及具有K4R及G15N取代的类似物BJ显示最大NEP切割抗性。
表2
Figure BPA00001469544101142
Figure BPA00001469544101161
1通过利钠肽刺激NIH3T3细胞中的cGMP产生(相对于1μM CNP22存在下的cGMP产生)
2CNP22的NEP抗性t1/2平均为80分钟。由于实验之间存在NEP催化活性的变化，因此将所有CNP22 t1/2消化均相对于80分钟来校正，且在各实验中使用差分系数来计算类似物t1/2以获得经调整的t1/2。
ND＝未测定
表3列出具有N端及/或C端修饰(包括氨基酸延伸)的CNP变体的半衰期(依据活体外NEP切割分析法)。在所测试的类似物中，类似物AZ、CC、CF、BL、CS、CK及CL、Pro-Gly-CNP37及HSA-CNP27对NEP降解最具抗性。
表3
Figure BPA00001469544101162
Figure BPA00001469544101171
Figure BPA00001469544101181
Figure BPA00001469544101191
1通过利钠肽刺激NIH3T3细胞中的cGMP产生(相对于1μM CNP22存在下的cGMP产生)
2CNP22的NEP抗性t1/2平均为80分钟。由于实验之间存在NEP催化活性的变化，因此将所有CNP22 t1/2消化均相对于80分钟来校正，且在各实验中使用差分系数来计算类似物t1/2以获得经调整的t1/2。
ND＝未测定
表4列出在N端偶联至PEG(或PEO)聚合物的CNP变体的半衰期(依据活体外NEP切割分析法)。除与wtCNP22具有相同半衰期的PEO12-GANPR-CNP22(K4R)外，表4中所测试及展示的所有聚乙二醇化CNP变体均显示NEP切割抗性或增强的NEP切割抗性。具有K4G取代的CNP22的N端聚乙二醇化似乎并不使NEP抗性实质上提高。举例而言，PEG2K-CNP22(K4G)的NEP切割抗性仅略强于CNP22(数据未图标)，而PEG2K-CNP22具有比CNP22长得多的活体外半衰期。
表4
Figure BPA00001469544101201
1通过利钠肽刺激NIH3T3细胞中的cGMP产生(相对于1μM CNP22存在下的cGMP产生)
2CNP22的NEP抗性t1/2平均为80分钟。由于实验之间存在NEP催化活性的变化，因此将所有CNP22 t1/2消化均相对于80分钟来校正，且在各实验中使用差分系数来计算类似物t1/2以获得经调整的t1/2。
ND＝未测定
图16展示CNP22的五种N端聚乙二醇化偶联物的NEP抗性概况。CNP22肽偶联至具有递增质量的PEG(或PEO)聚合物显示对NEP降解的抗性增强。特别是，PEO24-CNP22、PEG2K-CNP22及PEG5K-CNP22历经160分钟的分析时期对NEP降解具有抗性。
图17展示具有N端氨基酸延伸的CNP变体CNP37(类似物BL)、CNP53及GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)的NEP抗性概况。清楚可见，在此活体外分析法中，CNP37与CNP53均对NEP降解具有抗性，而GANRR-CNP22(K4R)(SEQID NO：36)对NEP水解具有与CNP22具有相同的不稳定性。
图18描绘在N端偶联至PEG(或PEO)部分的CNP17及GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)的NEP抗性概况。GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)的聚乙二醇化极大地改良此CNP变体的NEP抗性，其中PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)历经160分钟的分析时期对NEP切割完全具有抗性。将PEO部分的质量自约0.6kDa(PEO12)增至约1.2kDa(PEO24)改良聚乙二醇化GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)的NEP抗性。以单分散性PEO24部分而非多分散性PEG1K部分对GANRR-CNP22(K4R)(SEQ IDNO：36)进行聚乙二醇化亦改良NEP抗性。最后，尽管PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)与PEG2K-CNP17具有类似的总质量(注意PEG2K为多分散性)，但前者显示实质上更佳的NEP抗性。
亦对wtCNP22及CNP变体G-CNP37、GHKSEVAHRFK-wtCNP27(“CNP27-HSA”，SEQ ID NO：144)及PEO12-GANRR-CNP22(K4R)(“CNP27-PEO12”)(SEQ ID NO：36)进行NEP抗性分析法。图19展示G-CNP37及CNP27-HSA对NEP切割完全具有抗性，且CNP27-PEO12显示对NEP降解的稳定性比wtCNP22大得多。
实施例4
CNP变体刺激NIH3T3细胞中的cGMP产生
为测定CNP变体的功能活性，量测暴露于CNP变体的NIH3T3细胞中GMP的产生。鼠类NIH3T3细胞内源性表达CNP信号传导受体NPR-B，该NPR-B与人类NPR-B共享98％蛋白质序列相同性。在37℃与5％CO2下于补充有10％胎牛血清及抗生素的Dulbecco改良Eagle高葡萄糖培养基(high glucose Dulbecco′sModified Eagle Medium)中培养NIH3T3细胞。在信号传导之前24至48小时，在分析时将细胞以2-5×105个细胞/孔的密度于12孔培养盘中继代。将CNP变体再悬浮于1mM HCl中达1mg/mL(对于wtCNP22为455μM)的储备物浓度，且随后以磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释成30μM的工作储备溶液。在磷酸盐缓冲盐水中制备十倍连续稀释液。培养基自细胞移除且用0.4mL含有0.75mM异丁基甲基黄嘌呤的PBS/杜贝可改良伊格尔培养基(50/50，v/v)替换。将培养盘在37℃、5％CO2下培育15分钟，随后添加0.2mL含CNP变体的PBS且在37℃下继续培育15分钟。通过添加0.2mL由CatchPoint cGMP分析试剂盒(Molecular Devices)供应的溶解缓冲液来停止反应，且用CatchPoint cGMP分析法(Molecular Devices)测定cGMP产量。所有刺激实验均一式两份地进行。
表1-4概括分别具有主链或侧链修饰、氨基酸取代、N端氨基酸延伸及/或N端聚乙二醇化的CNP变体刺激NIH3T3细胞中cGMP产生的能力。在所有四个表中，均将暴露于10nM或1μM CNP变体的NIH3T3细胞中cGMP产量的值相对于细胞数及1μM wtCNP22存在下的cGMP产量进行校正。
关于表1中的结果，仅位置7具有3-Cl-Phe的类似物G在1μm下显示与wtCNP22实质上相同的NPR-B刺激活性。关于表2，具有氨基酸取代的各种CNP变体(包括类似物AH、BO、AB、BH、BZ、BX及BR)显示与wtCNP22实质上类似的NPR-B刺激活性。
考虑表3中的结果，具有N端及/或C端修饰(包括氨基酸延伸)的许多CNP变体显示与wtCNP22相当的NPR-B刺激活性。功能性CNP变体包括类似物BB(其为在N端连接至庚酸的CNP22(G1E))及类似物CD(其为偶联至BNP的N端及C端”尾”的CNP22的环状域(保留Cys6至Cys22序列的”CNP17”))。图20说明在活体外分析法中，GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)、CNP37(类似物BL)及CNP53所有均具有与wtCNP22类似的NPR-B刺激活性。
表3中值得注意的是，在针对CNP功能性与NEP抗性所分析的CNP变体中，类似物AZ(R-CNP22(K4R))、类似物CC、类似物CF、类似物BL(CNP37)、类似物DB(Gly-CNP37)及GHKSEVAHRFK-CNP27(HSA-CNP27)(SEQ ID NO：144)所有均具有与CNP22实质上类似的NPR-B刺激活性，同时具有实质上强于CNP22的NEP切割抗性。
关于表4中的结果，九种N端聚乙二醇化CNP变体在1μM下刺激cGMP产生至用wtCNP22所达成的量的至少约70％。若干值得关注的态样呈现于表4中。首先，将GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)在N端用单分散性PEO聚合物(PEO12为约0.6kDa，PEO24为约1.2kDa)聚乙二醇化产生比用多分散性PEG聚合物(PEG1K具有约1kDa的聚合物数目平均分子量(Mn)，PEG2K为约2kDa)聚乙二醇化更佳的NPR-B功能性(亦参看图21)。第二，将wtCNP22在N端用具有递增Mn的多分散性PEG聚合物(PEG1K、PEG2K、PEG5K及PEG20K)聚乙二醇化或用质量较大的单分散性PEO聚合物(PEO12及PEO24)聚乙二醇化相应地降低CNP变体的NPR-B活化能力(亦参看图22)。第三，具有N端GANRR(SEQ ID NO：8)延伸的PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ  ID NO：36)比PEO24-CNP22及PEO24-CNP22(K4R)刺激更多cGMP产生。亦值得注意的是，在针对CNP功能性与NEP抗性所分析的N端聚乙二醇化CNP变体中，PPEO12-R-CNP22(K4R)、PEO12-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQID NO：36)所有均具有与CNP22实质上类似的NPR-B刺激活性，同时对NEP降解的抗性比CNP22大得多。
在表1-4中所列且针对CNP功能性与NEP抗性所分析的CNP变体中，类似物G、BK、AZ、CC、CF、BL及DB、Pro-Gly-CNP37、HSA-CNP27(GHKSEVAHRFK-CNP27)(SEQ ID NO：144)、PEG1K-CNP22、(PEO12)-生物素-CNP22、PEO12-R-CNP22(K4R)、PEO12-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)所有均具有与wtCNP22实质上类似的NPR-B刺激活性，同时对NEP降解的抗性实质上大于wtCNP22。
亦对wtCNP22及CNP变体G-CNP37、GHKSEVAHRFK-wtCNP27(“CNP27-HSA”，SEQ ID NO：144)、wtCNP29及PEO12-GANRR-CNP22(K4R)(“CNP27-PEO12”)(SEQ ID NO：36)分析cGMP产量。图23展示CNP22及所有所分析的CNP变体在低剂量或高剂量CNP下均诱导产生类似含量的cGMP。
实施例5
对NPR-A、NPR-B及NPR-C的结合特异性
信号传导竞争分析法
为测定CNP变体对清除受体NPR-C的结合特异性，进行信号传导竞争分析法。瞬时转染人类NPR-B或NPR-C的表达质体(各自购自OriGene)且使受体表达于HEK293T细胞中。在转染后四十小时，收集NPR-B、NPR-C及原生HEK293T细胞，计数且以1∶1的比率(NPR-B细胞∶竞争细胞(NPR-C或原生HEK293T细胞))涂铺于12孔或96孔培养盘中。在涂铺二十小时之后，处理细胞以进行实施例4中所述的NPR-B/cGMP刺激分析法。利钠清除受体NPR-C若存在则预期结合及内化CNP，藉此降低可用于经由NPR-B信号传导的总体CNP浓度，使得cGMP产生减少及剂量-反应曲线向右偏移。已证实wtCNP22的剂量-反应曲线向右偏移。对NPR-C的亲和力降低的CNP变体预期不诱导剂量-反应曲线向右偏移，或预期其诱导剂量-反应曲线向右较小偏移。此信号传导竞争分析法类似于Cunningham(美国专利5,846,932；B.Cunningham，EMBO J.13(11)：2508-2515(1994)；H.Jin等人，J.Clin.Invest.(临床调查杂志)98(4)：969-976(1996))先前所述的分析法。
在信号传导竞争分析法中评估wtCNP-22、Pro-Gly-wtCNP37及ANP经由NPR-B及NPR-A的cGMP刺激活性，及其对于NPR-B相对于NPR-C及对于NPR-A相对于NPR-C的选择性。将NPR-A、NPR-B及NPR-C个别地瞬时转染于HEK293T细胞中。在转染之后三十小时，将细胞涂铺于96孔培养盘中：(A)20,000个NPR-B细胞+20,000个模拟物转染细胞；(B)20,000个NPR-B细胞+20,000个NPR-C细胞；(C)20,000个NPR-A细胞+20,000个模拟物转染细胞；及(D)20,000个NPR-A细胞+20,000个NPR-C细胞。在涂铺后二十小时，移除培养基且以无血清培养基∶PBS(1∶1)+0.75μM IBMX替换历时15分钟。对于经由NPR-B的cGMP信号传导，添加一系列剂量的ANP、CNP-22及Pro-Gly-CNP37且在37℃下培育12分钟，随后通过细胞溶解停止分析。对于经由NPR-A的cGMP信号传导，在37℃下培育一系列剂量的CNP-22及Pro-Gly-CNP37持续12分钟，而在37℃下培育一系列剂量的ANP持续6分钟(因为NPR-A似乎为“快于”NPR-B的鸟苷酸环化酶，所以缩短ANP的培育时间以便在用ANP进行信号传导时不会过早达到最大程度(耗尽所有细胞GTP))。图24A及B展示在信号传导竞争分析法中CNP-22及Pro-Gly-CNP37(“Pro-CNP38”)经由NPR-B以类似剂量-反应曲线，且以比经由NPR-A高得多的程度刺激cGMP产生，且显示类似的NPR-B相对于NPR-C选择性的概况。
测定对NPR-A、NPR-B及NPR-C的结合亲和力(Ki)
在异源竞争结合分析法中测定CNP变体对NPR-A、NPR-B及NPR-C的结合亲和力(Ki)(美国专利5,846,932；B.Cunningham，EMBO J.13(11)：2508-2515(1994)；H.Jin等人，J.Clin.Invest.98(4)：969-976(1996))。制备来自表达人类NPR-A、NPR-B或NPR-C的HEK293细胞或另一可适当转染细胞株(例如海拉细胞(HeLa cell))的膜以便进行放射性标记配位体结合分析法。将膜制剂稀释于适当缓冲液中且添加不同浓度的wtCNP22或CNP变体(竞争剂)与经I125标记的wtCNP22(Bachem)。在室温下保温样品以使配位体/受体平衡，且通过经PVDF滤膜过滤将结合的肽与游离肽分离。洗涤滤膜，随后添加闪烁体且通过闪烁计数器计数。一式两份量测各浓度竞争剂肽的结合。通过非线性回归分析及/或程-普鲁索夫方程(Cheng-Prusoff equation)计算CNP变体的亲和力(Ki，平衡解离常数)及Bmax(受体数)。
显示对NPR-C的亲和力降低的CNP变体预期对NPR-C所致的清除具有降低的敏感性且因此具有较长血浆或血清半衰期。CNP变体在循环中的半衰期增加将增强变体用于治疗活性的可用性。
实施例6
CNP变体对大鼠软骨肉瘤(RCS)细胞生长及RCS细胞中cGMP产生的影响
为评估CNP变体刺激骨生长的能力，在细胞培养物中通过以成纤维细胞生长因子2(FGF-2)处理大鼠软骨肉瘤(RCS)细胞来模拟骨骼发育不良，该成纤维细胞生长因子2活化成纤维细胞生长因子受体3(FGFR-3)且诱导生长停滞(Krejci等人，J.Cell Sci.(细胞科学杂志)，118(21)：5089-5100(2005))。
最佳CNP治疗参数可通过改变CNP浓度(0.05、0.1、0.2及0.5μM)，及治疗持续时间及间隔(连续；2.5分钟、10分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时及8小时，一日一次；2.5分钟、10分钟、30分钟、1小时、2小时及4小时，一日两次)来确定。72小时之后，使用自动化细胞计数器对细胞进行计数，且使用阿辛蓝(alcian blue)染色估算细胞外基质的量。
接着使用由使用wtCNP22的生长实验所确定的最佳条件，以CNP变体处理RCS细胞。通过竞争性ELISA量测未经处理的RCS细胞、经CNP处理的RCS细胞及经CNP变体处理的RCS细胞的cGMP浓度。亦监测由用CNP变体处理所引起的细胞生长及基质合成且将其与由CNP处理所引起的细胞生长及基质合成相比较。
为评估CNP变体在人类细胞培养系统中的作用，以wtCNP22及CNP变体处理海藻酸盐珠中的原代再分化人类软骨细胞，且通过竞争性ELISA测定cGMP浓度作为有效CNP信号传导的量度。
本文所述的方法可用以评估CNP变体活体外刺激大鼠软骨肉瘤细胞中cGMP产生及大鼠软骨肉瘤细胞生长的能力。
实施例7
大鼠软骨肉瘤细胞中的剂量反应研究
酪氨酸激酶受体成纤维细胞生长因子受体3(FGFR-3)(一种软骨细胞生长的负调节剂)在软骨发育不全个体中具有组成型活性。以FGF-2刺激FGFR-3受体通过长久活化Erk MAPK导致生长停滞，且使得基质合成减少及损失基质，以及细胞形状变化。使大鼠软骨肉瘤(RCS)细胞连续暴露于成纤维细胞生长因子2(FGF-2)可通过活化FGFR-3及诱导生长停滞来在细胞培养物中模拟软骨发育不全(Krejci等人，J.Cell Sci.(细胞科学杂志)，118(21)：5089-5100(2005))。为测定刺激骨细胞充分生长的CNP变体的剂量及给药频率，使用如实施例6中所述的RCS细胞分析法进行剂量反应研究。
将RCS细胞以10×103个细胞/孔接种于24孔培养盘中，生长24小时，处理72小时，且接着计数。使RCS细胞连续暴露于FGF-2(5ng/mL)以模拟诱导细胞生长停滞的组成性活性FGFR-3(参看图25中的第5号柱)。连续(72小时)、每日1小时或每日2小时培养野生型CNP22(0.2μM)。每日更换所有刺激剂。与在无CNP22存在下每孔约100×103个细胞(图25中的第5号柱)相比，在5.0ng/mL FGF-2存在下使RCS细胞连续暴露于0.2μM CNP22部分逆转FGF2诱导的生长停滞，使得每孔生长约200×103个细胞(图25中的第6号柱)。
一日一次暴露于CNP22(0.2μM)1小时与一日一次暴露于CNP22(0.2μM)2小时均获得连续CNP22(0.2μM)暴露对软骨细胞生长的作用的约84％(图25中的第7号及第8号柱)。此等结果表明细胞生长停滞的逆转无需将生长停滞的软骨细胞连续暴露于CNP22。另外，剂量反应研究表明较低剂量的CNP22亦能够逆转生长停滞(图26A)。
此外，细胞外基质的组织及细胞形态分析显示CNP22处理拮抗FGF2介导的软骨肉瘤细胞外基质损失且增加基质合成。如由35S-硫酸盐及3H-Pro并入基质中或在基质中减少所评估，暴露于FGF-2减少基质合成且增加降解，而将CNP22添加至FGF-2细胞培养物中增加基质合成且部分抑制FGF-2(图27A-D)。对与FGF-2及CNP22一起培养的RCS细胞中聚集蛋白聚糖及纤连蛋白产生(mRNA及蛋白质)的分析显示FGF-2降低聚集蛋白聚糖含量且增加纤连蛋白含量，这些含量可通过添加CNP22来抑制(图28A-C)。FGF-2主要经由Erk来诱导及活化基质加工分子，且添加CNP22显示对此活化具有一定程度的影响。
量测生长停滞的其它高产量分析法(诸如结晶紫染色)适用于量测CNP22及其变体对RCS细胞的作用。
可用本文所述的CNP变体进行类似剂量反应研究以测定其逆转FGF2诱导的RCS细胞生长停滞的有效剂量。
实施例8A
离体刺激患有轻度软骨发育不全的小鼠的胫骨及股骨生长
已使用小鼠胫骨器官培养物模型来证明野生型CNP22刺激纵向骨生长的功效。用10-8、10-7或10-6M的CNP22处理野生型胫骨6日分别使纵向生长增加31％、40％及42％。组织学评估亦显示肥大区扩展，例如生长板中肥大软骨细胞的数目及尺寸增加(Agoston等人，BMC Dev.Biol.7：18(2007))。在自FGFR3Ach小鼠分离的胫骨中观察到类似结果(Yasoda等人，Nat.Med.(自然医学)10：80-86(2004))。
为测定CNP变体刺激纵向骨生长的功效，在野生型小鼠及在人类FGFR-3基因(FGFR3wt/Ach异型接合子)中具有G380R突变的转殖基因小鼠(代表轻度软骨发育不全的小鼠模型)中的软骨内骨生长的小鼠器官培养物模型中测试CNP变体。简而言之，比较野生型CNP22及CNP变体在自野生型及FGFR3wt/Ach同窝出生小鼠分离的小鼠胚胎胫骨或新生小鼠胫骨的器官培养物模型中的药理学活性。评估总体骨生长及生长板内的组织学变化。亦针对细胞内信号传导的生物标记(cGMP)、软骨代谢的生物标记(第II型胶原蛋白、其它胶原蛋白、聚集蛋白聚糖硫酸软骨素)、骨代谢的生物标记(骨碱性磷酸酶、骨钙化素、第I型胶原蛋白[C端肽、N端肽])及炎症的生物标记(介白素-1、介白素-6、介白素-11)对条件培养基进行评估。
有效CNP变体可通过其例如刺激cGMP产生及骨生长(如通过纵向骨长度增加及生长板肥大区中的细胞扩展所量测)的能力来鉴别。
量测骨生长
在小鼠器官培养物模型中评估wtCNP22、CNP37及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)刺激纵向股骨生长的功效。对于此等实验，自2-3日龄野生型小鼠分离股骨且在载体、CNP22或CNP变体存在下于补充有0.2％BSA、0.5mM L-谷氨酰胺、40单位青霉素(penicillin)/毫升及40微克链霉素(streptomycin)/毫升的alphaMEM中培养8日。该处理在第0日开始且此后每两日加以重复，同时更换培养基。处理之前及处理之后每两日使用配备1cm目镜网线(eye-piece reticule)的解剖显微镜量测骨。使用条件培养基进行生物标记分析。在第8日，将骨于4％三聚甲醛中固定24小时，于5％甲酸中脱钙24小时，脱水且包埋于石蜡中。将骨切成5μm(微米)切片，接着脱石蜡、复水，且用阿辛蓝(pH 2.5；MasterTech)染色30分钟。阿辛蓝将软骨染成蓝色。观测经染色的切片且通过明视野显微镜术拍摄。由影像分析测定生长板软骨的肥大区的厚度。
图29说明wtCNP22、CNP37及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)对每两日经CNP肽处理的3日龄野生型小鼠的股骨的纵向生长的作用。将结果相对于处理前(第0日)的量测值校正。一式三份(载体)或一式四份(CNP肽)进行研究。如图29中所示，CNP37及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)以及CNP22有效刺激纵向股骨生长，其中N端聚乙二醇化的CNP变体最有效。
亦评估野生型及FGFR3ach小鼠股骨及胫骨回应于CNP22、CNP37及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(“CNP27-PEO24”)(SEQ ID NO：36)的生长。野生型或软骨发育不全(FGFR3ach)小鼠胫骨的培养物显示CNP37及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)与载体或CNP22相比均增加胫骨纵向生长(图30及31)。CNP22、CNP37及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)亦刺激野生型小鼠股骨生长(图32)。此外，CNP22、PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)及CNP37与载体相比各自增加FGFR3ach小鼠股骨的纵向生长(图33)。
此外，评估FGFR3ach小鼠胫骨的生长板中CNP37的离体分布。如上所述制备骨样品。切下石蜡切片且在60℃下热休克1小时。在37℃下以1％透明质酸酶进行抗原修复(30分钟)，接着进行1小时血清封闭(10％正常山羊血清(Normal GoatSerum))。在4℃下涂覆CNP22抗体(1∶500稀释液；Peninsula Laboratories Inc.半岛实验室公司，圣卡洛斯，加利福尼亚)隔夜。对于免疫检测，根据制造商建议使用Vectastain ELITE ABC试剂盒(Vector，伯灵根，加利福尼亚)。通过与DAB底物试剂盒(Vector)一起培育来观测特异性结合的过氧化酶且使反应进行3分钟。接着使载片脱水且安置且使用明视野显微镜拍摄。对FGFR3ach小鼠胫骨的生长板中的CNP进行染色显示在关节及肥大软骨细胞的区域中CNP免疫反应性增强(图34)，表明CNP37已传递至软骨细胞。
除骨生长板中CNP变体的分布外，亦评估CNP37、CNP22及载体对FGFR3ach及野生型生长板中的细胞(例如增殖区的肥大细胞尺寸及细胞结构(cellularity))的离体影响。如上所述制备骨样品，包括阿辛蓝染色。以4倍放大倍数拍摄整个近端生长板的影像。自软骨的骨骺侧开始，生长板分为三个区：静止区(个别小软骨细胞)、增殖区(平行于骨长轴的堆栈软骨细胞柱)及肥大区(大软骨细胞及软骨细胞之间的薄隔膜)。在此等区域中，通过ImageJ软件进行量测，包括每个柱中增殖软骨细胞的数目及肥大软骨细胞的密度。使用肥大区的五个不同区域的测试方块(4×4mm2)来测定肥大软骨细胞的密度。通过1/所测定细胞密度计算肥大软骨细胞的细胞尺寸。在野生型与FGFR3ach小鼠中，CNP37及CNP22均增加增殖柱的细胞结构(图35B及C)。由于与CNP22或CNP37一起培养，因此FGFR3ach小鼠中的软骨细胞肥大亦增加(图36B及C)。
小鼠骨培养物的离体研究表明CNP37已传递至生长板且能够增加软骨细胞细胞结构及肥大，其与生长板扩展及纵向骨生长相关。为评估骨生长板中CNP37的活体内生物分布及CNP37对生长板的活体内作用(包括总生长板厚度、肥大区厚度及增殖区的细胞结构)，自如上所述以载体或CNP37处理的FGFR3ach小鼠获得骨样品。对于生物分布及活体内作用研究，将胫骨固定且储存于70％乙醇中。对于免疫组织化学，使样品在5％甲酸中脱钙2日，脱水且包埋于石蜡中。将骨切成5μm(微米)切片，接着脱石蜡、复水，且用于如上所述的CNP免疫组织化学。对于细胞影像分析，将骨切成5μm(微米)切片，且接着脱石蜡、复水，且以阿辛蓝染色30分钟(pH 2.5；MasterTech)且以苏木精(Hematoxylin)及伊红(Eosin)染色30秒。观测经染色的切片且通过明视野显微镜术拍摄。使用ImageJ软件量测生长板厚度及增殖及肥大区。
活体内生物分布研究表明，类似于离体研究，在以CNP37处理的FGFR3ach小鼠的胫骨生长板中的关节及肥大软骨细胞的区域中，CNP免疫反应性增强，表明CNP37活体内传递至FGFR3ach小鼠胫骨的生长板(图37)。此外，CNP37处理活体内显著增加FGFR3ach小鼠胫骨的总生长板厚度、增殖区厚度及肥大区厚度(图38A-C)。
此等结果表明，在经处理的野生型及软骨发育不全动物中，本文的CNP变体渗入野生型及软骨发育不全动物的生长板中，增加软骨细胞的数目及尺寸，增加生长板的增殖区及肥大区的厚度，且增加纵向骨生长。因此，CNP变体适用于在软骨发育不全个体中刺激骨生长。
量测生物标记
除量测回应于CNP变体的骨生长的外，回应于CNP变体而诱导的软骨及骨形成及生长的生物标记的含量的分析法亦适用于评估CNP变体对骨生长的作用。
自如上所述的野生型及FGFR3ach小鼠分离股骨及胫骨。与CNP22或其变体一起培养骨八日，其中每两日置换培养基。在第八日，收集培养基且分析生物标记cGMP(环状鸟苷3′，5′环状单磷酸)及切割的第II型胶原蛋白的片段(软骨更新的软骨特异性标记)。按照制造商方案，使用用于分析cGMP(凯曼化学公司，安阿伯，密西根)及切割的II型胶原蛋白(Cartilaps)(Immunodiagnostic Systems免疫诊断系统，泉水山，亚利桑那)的市售酶联免疫吸附分析法(ELISA)来量测两种标记。
自暴露于CNP22、CNP37或PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(“CNP27-PEO24”)(SEQ ID NO：36)后的细胞培养物抽提物量测cGMP及第II型胶原蛋白片段的含量。图39-42显示外植野生型及FGFR3ach小鼠股骨及胫骨暴露于CNP22、CNP37或PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)之后，培养基中cGMP的含量的大增(p＜0.01)。另外，野生型及FGFR3ach小鼠股骨暴露于CNP22、CNP37或PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)使切割的第II型胶原蛋白的含量增加，其中经处理的FGFR3ach小鼠股骨显示第II型胶原蛋白片段的含量显著增加(p＜0.05)(图43)。第II型胶原蛋白片段的含量升高表明软骨基质更新，且在正生长的骨中软骨更新之后通常为新骨形成。
实施例8B
离体刺激患有严重软骨发育不全的小鼠的股骨生长
离体评估CNP变体对患有严重软骨发育不全的小鼠的骨生长的影响。研究中使用表达具有Y367C突变的人类FGFR-3基因(FGFR3Y367C)的转殖基因小鼠[S.Pannier等人，Biochim.Biophys.Acta，1792(2)：140-147(2009)]，其代表严重软骨发育不全的小鼠模型。在胚胎第16.5日分离股骨且在1μM Pro-Gly-CNP37存在下培养6日。在第1日及第7日量测骨长度。这些骨接着以石蜡包埋，切成切片且以苏木精及伊红染色以评估组织学变化及细胞形态学。以Pro-Gly-CNP37(“ProCNP38”)处理自FGFR3Y367C小鼠分离的骨外植体使得生长板中的骨生长及扩展增加(图44)。与经载体处理的野生型股骨相比，来自经载体处理6日的FGFR3Y367C小鼠的股骨显示纵向生长(growth length-wise)缺乏18％。以1μMPro-Gly-CNP37处理FGFR3Y367C小鼠的股骨6日使生长缺乏降至仅11％，亦即将生长缺陷降低约40％。
实施例9
CNP变体的活体外血清/血浆稳定性
在药物动力学(PK)研究的准备期间，评估CNP变体于血清及/或血浆中的稳定性。
简而言之，通过2％三氯乙酸沉淀或1∶3血清∶乙腈沉淀移除血清或血浆蛋白来分离分析物。将沉淀混合物以14,000rpm涡旋五分钟，且移除上清液的一部分且以水稀释，随后转移至硅烷化自动取样器小瓶中以供分析。接着通过逆相高效液相层析(RP-HPLC)及电喷雾电离质谱(ESI-MS)分析血清抽提物。出于定量目的监测显示对CNP变体具特异性的单一质量(m/z)。
首先，测定分析物稳定性及回收率。经由分析基质标准物(沉淀后经分析物强化的血清抽提物)优化分析(RP-HPLC及ESI-MS)参数。优化之后，通过添加(spike)已知浓度的血清样品且将分析物反应与在类似浓度下制备的基质标准物的反应相比较来测定分析物回收率。亦测定血清抽提物中的分析物稳定性以确保血清沉淀之后及实际分析之前未发生显著损失。为测试冷冻对血清稳定性的影响，亦进行双循环冷冻/解冻研究。在此研究中，将CNP变体添加至血清样品中且加以分析，随后在-20℃下冷冻隔夜。接着在室温下解冻样品且再分析。重复此过程以进行第二次冷冻/解冻循环。
通过将10μg/mL浓度的CNP变体添加至血清/血浆样品中来测定CNP变体的血清稳定性。将样品在37℃水浴中置放三小时的时期。以30分钟间隔移除血清的双份等分试样且加以分析。若分析物明显快速减少(30分钟内＞50％)，则可以10分钟时点重复研究。
在用于测定CNP变体在鼠类血浆中的稳定性的例示性方法中，将CNP变体(10μL约2.5-5.0mg/ml的储备溶液)、肝素化鼠类血浆(50μL，Bioreclamation，CD-1 LithHep 62231)与5M NaCl(10μL)的混合物在37℃及5％CO2下保温0-5小时，且接着用10×蛋白酶抑制剂混合物(15μL，Sigma P2714)淬灭。抽提时，将150μL的MeOH/0.1％FA添加至85μL反应混合物中，且将所得混合物涡旋1分钟且接着在15℃下离心15分钟。将75μL上清液添加至300μL 0.1％FA水溶液中。对所得混合物的一小部分进行LC/MS分析。
实施例10
大鼠及小鼠体内的药物动力学及cGMP产生
在正常大鼠中进行研究以评估单次静脉内(i.v.)或皮下(s.c.)给予CNP肽之后CNP22及某些CNP变体的药物动力学(PK)概况，及血浆cGMP浓度的时程。通过使用利用抗CNP兔多株抗体的竞争性放射免疫分析法(RIA)来测定血浆CNP免疫反应性。通过使用市售试剂盒(YAMASA环状GMP分析试剂盒，YAMASACorporation)的RIA测定血浆cGMP浓度。
使用7-8周龄的正常雄性大鼠。评估重组野生型CNP22、CNP37及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)。将20nmol/kg剂量的各CNP肽以于5％甘露醇中的溶液形式一次性经静脉内注入尾部，或将50nmol/kg剂量的各CNP肽以于0.03mol/L乙酸缓冲溶液(pH 4.0，含有1％(w/v)苯甲醇及10％(w/v)蔗糖)中的溶液形式一次性皮下注入背部。
通过使用抗CNP兔多株抗体的竞争性RIA测定血浆CNP免疫反应性。制备标准样品及QC样品。将50μL标准样品、QC样品及分析样品分别添加至含有50μL RIA缓冲液的试管中。将经稀释的抗CNP兔多株抗体(100μL)添加至这些管中。所有管4℃保温过夜。添加125I-[Tyr0]-CNP22溶液(100μL)及兔IgG溶液(100μL)且在约4℃下放置过夜。添加1毫升含有10％聚乙二醇的抗兔IgG山羊血清，涡旋且在约4℃下放置至少1小时，且接着通过离心使不可溶部分沉淀。吸出上清液之后，通过γ计数器量测沈降物中的辐射量(γ线)。一式两份地量测各样品，且采用平均值作为测定值。
通过使用抗cGMP单株抗体的竞争性RIA测定静脉内给药之后5、30、60及90分钟时，或皮下给药之后5、30、60、120及180分钟时样品中的血浆cGMP浓度。制备标准样品。将100μL分析样品(用于校准曲线的标准溶液或用于cGMP测定的经稀释血浆样品)转移至试管中。接着将100μL抗cGMP单株抗体溶液及100μL经125I标记的丁二酰基cGMP酪氨酸甲酯溶液分别添加至管中。所有管均4℃下放置过夜。添加500μL聚葡萄糖炭溶液之后，涡旋管且接着在冰上置放10分钟。离心反应混合物且将500μL上清液自各样品转移至新试管中。通过γ计数器量测上清液中的辐射量(γ线)。一式两份地量测各样品，且采用平均值作为测定值。
对于药物动力学(PK)分析，采用血浆CNP免疫反应性。使用WINNONLIN
Figure BPA00001469544101321
Professional(Pharsight Corporation)来进行PK分析。使用PK参数计算CNP22、CNP37及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)在静脉内给予后的PK概况，这些PK参数诸如为在0小时的浓度(C0：外推，pmol/mL)、总身体清除率(CLtot：mL/min/kg)、稳态下的分布容积(Vdss：mL/kg)、血浆浓度-时间曲线下的面积(AUC：pmol·min/mL)、平均滞留时间(MRT：分钟)及半衰期(T1/2：分钟)。使用PK参数计算CNP肽在皮下给予后的PK概况，这些PK参数诸如为最大血浆浓度(Cmax：pmol/mL)、达到Cmax的时间(Tmax：min)、血浆浓度-时间曲线下的面积(AUC：pmol·min/mL)、平均滞留时间(MRT：分钟)及半衰期(T1/2：分钟)。
在血浆添加回收率实验中，RIA以类似方式检测CNP22、CNP37及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)(数据未图标)。
采用类似于上述程序的程序研究小鼠中CNP22及其变体的PK概况及其刺激cGMP产生的能力。
图45中说明CNP22、CNP37及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ IDNO：36)在静脉内给予三只大鼠中后的PK概况。如图45所示，CNP37及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)具有比CNP22长得多的半衰期及大得多的生物可用性。CNP22的半衰期T1/2(分钟)为1.42(±0.45)，PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)的半衰期为22.3(±1.5)，且CNP37的半衰期为49.5(±28.0)。CNP22的曲线下面积AUC(pmol.min/mL)为320(±54)，CNP37的曲线下面积为1559(±568)，且PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQID NO：36)的曲线下面积为2084(±424)。
该三种CNP肽在皮下给予三只大鼠中后的PK概况描绘于图46中。与CNP22相比，PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)具有长得多的半衰期(78.1分钟(±16.4)相对于10.0(±5.0))及大得多的生物可用性(60％(±6％)相对于19％(±9％))。
图47中展示将三种CNP肽静脉内给予三只大鼠中之后，血浆cGMP浓度的时程。图47明确说明静脉内给予CNP37及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ IDNO：36)在30、60及90分钟时产生比静脉内给予CNP22高得多的cGMP血浆含量。
图48中展示在将三种CNP肽皮下给予三只大鼠中之后，血浆cGMP浓度的时间概况。皮下给予PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)及CNP37产生的cGMP血浆浓度亦实质上高于皮下给予CNP22，且PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)相对于CNP22的差异随时间增大，而CNP37相对于CNP22的差异随时间减小。
大鼠研究表明，与wtCNP22相比，CNP变体CNP37及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)具有实质上较长的活体内半衰期，具有实质上较高的活体内生物可用性，且刺激活体内产生实质上较高含量的cGMP持续较长时期。CNP37及PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)对NEP降解的抗性与较长的活体内血浆半衰期相关，而该较长活体内血浆半衰期又与活体内较长NPR-B/cGMP信号传导相关。此等结果表明，与CNP22相比，通过静脉内或皮下注射(例如每日一次)给予的本文的CNP变体可更有效地治疗CNP反应性病状或病症，诸如骨相关病症及血管平滑肌病症。
实施例11
小鼠体内的药物动力学研究
为确定CNP变体具有增强的NEP抗性以供在FGFR3ach小鼠中进行功效研究(参看实施例13)，进行药物动力学(PK)研究，该研究比较CNP变体的药物动力学特性与野生型CNP22的药物动力学特性。FGFR3ach小鼠为在FVB小鼠背景上含有单一转殖基因的轻度软骨发育不全的突变体小鼠模型。
将野生型CNP22或其变体以单次静脉内(i.v.)剂量形式给予6周龄野生型FVB小鼠。使用wtCNP22进行例示性PK研究。将wtCNP22以100nmol/kg的单次剂量形式静脉内给予六周龄FVB/N小鼠。计算CNP22的平均血浆含量，且CNP22的估算半衰期经测定为0.76分钟至1.03分钟。
预期对NEP降解显示较高抗性的CNP变体在活体内显示随时间增加的血清浓度及较长半衰期。
实施例12
CNP变体于野生型小鼠中的功效
在野生型小鼠中评估CNP变体对骨生长的活体内作用。三周龄FVB野生型雄性小鼠每日接受皮下(s.c.)注射的载体、G-CNP37(200nmol/kg)或PEO12-GANRR-CNP22(K4R)(“CNP27-PEO12”)(SEQ ID NO：36)(200nmol/kg)持续5周。至少每周一次量测体重。使用数字测径规读数每周至少一次量测尾长，且在处理之后5周使用测径规量测身长(鼻-肛门长度)、骨长(胫骨、股骨、尺骨及肱骨)、颅骨长(后颅段(posterior cranial segment)的前部)及腰椎5(LV5)长度。在基线时及在处理5周后采用X射线。
以G-CNP37处理野生型小鼠五周使得体重显著增加，其中自第9日开始观察到体重增加(p＜0.05)(图49)。以G-CNP37处理自处理后第二周开始亦使得尾长显著增加(p＜0.01)(图50)。
表10展示相对于仅以载体处理的野生型小鼠的100％值，在经每日一次皮下注射200nmol/kg G-CNP37或PEO12-GANRR-CNP22(K4R)(“CNP27-PEO12”)(SEQID NO：36)持续5周的野生型小鼠中，尾长、身(鼻-肛门)长、颅骨(后颅段的前部)长度、骨(股骨、胫骨、肱骨及尺骨)长度及腰椎5(LV5)长度的变化百分比。
表10
**p＜0.01，*p＜0.05
与以载体处理相比，以G-CNP37处理使得尾长、身(鼻-肛门)长、颅骨长度、近端骨(股骨及肱骨)长度、远程骨(胫骨)长度及椎骨(腰椎5)长度显著增加。
与载体相比，每日皮下给予较低剂量的Pro-Gly-CNP37(5nmol/kg、20nmol/kg或70nmol/kg)持续五周使得尾长、身(鼻-肛门)长及骨长以剂量依赖性方式增加。表11展示相对于仅以载体处理的野生型小鼠的100％值，在每日一次皮下注射5nmol/kg、20nmol/kg或70nmol/kg Pro-Gly-CNP37持续5周的野生型小鼠中，尾长、身(鼻-肛门)长及骨(股骨、胫骨、肱骨及尺骨)长的变化百分比。
表11
  尾   鼻-肛门   股骨   胫骨   肱骨   尺骨
  5nmol/kg   107.6％**   102.7％**   103.3％**   101.7％**   101.1％   100.9％*
  20nmol/kg   107.8％**   107.6％**   107.1％**   103.4％**   102.3％**   102.5％**
  70nmol/kg   113.6％**   112.5％**   109.3％**   105.9％**   103.6％**   104.1％**
**p＜0.01，*p＜0.05
在另一研究中，给予Pro-Gly-CNP37的各种给药疗程持续九周，接着恢复一周。对野生型FVB小鼠皮下给予以下：
(1)载体，每日，持续九周，接着恢复一周；
(2)20nmol/kg Pro-Gly-CNP37，每日，持续一周，接着每周三剂，持续八周，及恢复一周；
(3)20nmol/kg Pro-Gly-CNP37，各周交替；或
(4)5nmol/kg Pro-Gly-CNP37，每日，持续九周，接着恢复一周。
在研究结束时在所有处理组(第2、3及4组)中均观察到尾长、身长及骨长的生长增加。表12展示相对于仅以载体处理的野生型小鼠的100％值，在上述给药疗程下经给予Pro-Gly-CNP37(“Pro-CNP38”)的野生型小鼠中，尾长、身(鼻-肛门)长及骨(股骨、胫骨、肱骨及尺骨)长的变化百分比。
表12
Figure BPA00001469544101361
**p＜0.01，*p＜0.05
尽管Pro-Gly-CNP37的所有给药疗程均使所量测的轴向及附肢生长参数增大，但与给药频率较低的疗程(第2组及第3组)相比，以较低总剂量(第4组)每日给于Pro-Gly-CNP37促进附肢生长(股骨、胫骨、肱骨及尺骨)。
实施例13
轻度软骨发育不全的小鼠模型中的功效
在轻度软骨发育不全的小鼠模型中，使用表达具有G380R突变的人类FGFR-3基因(FGFR3ach)的转殖基因小鼠品系来测试CNP变体增强生长及矫正软骨发育不全的功效(Wang等人，Proc.Natl Acad.Sci.U S A，96(8)：4455-4460(1999)；Naski等人，Development USA(美国发育)125：4977-4988(1998)；美国专利第6,265,632号及第6,136,040号)。
将FGFR3ach小鼠及其野生型同窝出生小鼠在3周龄时麻醉，以通过Faxitron拍摄横向全身X射线影像，且依据体重随机分成以下处理组(n＝8只/组)：(1)野生型/载体、(2)FGFR3ach/载体、(3)FGFR3ach/CNP37，及(4)FGFR3ach/PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)。小鼠每日一次接受指定测试物品(载体或200nmol/kg CNP变体)的皮下(s.c.)给予持续5周。使用卫星组(Satellitegroup)(n＝3)以证实各测试物品在第1日单次皮下给予后的暴露。将每日皮下接受载体注射持续5周的野生型雄性FVB小鼠用作正常生长的对照。
在基线及在研究结束时进行X射线量测以测定头长、颅骨面积及外耳道(EAM，自外耳通至中耳的耳道)的变化。每周至少一次量测体重及尾长，其中使用数字测径规来量测尾长，且在处理5周后量测身(鼻-肛门)长。在尸体剖检时使用数字测径规量测骨(胫骨、股骨、尺骨及肱骨)长。
在第37日，通过终端麻醉处死所有小鼠且通过Faxitron拍摄完整动物相片及X射线影像。收集左及右胫骨、股骨、肱骨及尺骨且使用数字测径规量测。处理各骨的左边部分以用于组织学，且将右边部分速冻以便归档。使用获自骨的样品来评估CNP变体对软骨内骨生长的影响。
通过每日一次皮下注射，以CNP37处理FGFR3ach小鼠持续5周使得身长(图51)、尾长(图52)、远程骨(尺骨及胫骨)长度(图53A及B)及近端骨(肱骨及股骨)长度(图54A及B)显著增加。此外，以CNP37处理使头长(图56)、外耳道面积(图57)及脊柱长度(图58)(经由延长椎骨体)增加。另外，以CNP37处理矫正FGFR3ach小鼠的近端肢骨短小(近端肢长度不成比例)，亦即恢复近端骨的成比例生长，如由股骨∶胫骨比率所评估(图55)。表13概括相对于仅以载体处理的FGFR3ach小鼠的100％值，在每日一次皮下注射200nmol/kg CNP37或PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(“CNP27-PEO24”)(SEQ ID NO：36)持续5周的FGFR3ach小鼠中，尾长、体(鼻-肛门)长及骨(股骨、胫骨、肱骨及尺骨)长的变化百分比。
表13
Figure BPA00001469544101371
**p＜0.01，*p＜0.05
此等研究的结果显示CNP37可刺激脊椎及长骨生长，通过相对于胫骨优先增加股骨长度来帮助矫正近端肢骨短小，且有助于恢复FGFR3ach小鼠中的颅面比例。此等结果表明CNP37及可能其它CNP变体可有效矫正软骨发育不全症状及治疗患有骨生长缺陷或需要增加骨生长的个体。
实施例14
在野生型及软骨发育不全小鼠中量测生物标记及评估免疫原性
在CNP给予之后量测生物标记
在野生型及软骨发育不全(FGFR3ach)小鼠中量测骨生长生物标记的含量。
如上所述通过皮下注射载体(30mM乙酸/乙酸盐缓冲液、1％苯甲醇、10％蔗糖，pH 4.0)、CNP22、CNP37或PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(“CNP27-PEO24”)(SEQID NO：36)(各CNP化合物为200nmol/kg)来每日处理转殖基因FVB FGFR3ach小鼠(轻度软骨发育不全的小鼠模型)持续5周。在研究期间收集血浆及血清。收集的血浆在-80℃下在10×蛋白酶抑制剂存在下储存直至分析为止。在第36日，在注射后15分钟自K2-ETDA血浆收集管量测cGMP含量。在研究结束时(第37日)自最终放血血清量测切割的第II型胶原蛋白的片段(软骨相关生物标记)、骨钙化素(骨相关生物标记)及IgG(与免疫原性有关)。使用市售ELISA试剂盒(凯曼化学公司目录号581021.1)量测cGMP，使用来自免疫诊断系统(Immunodiagnostic Systems)的市售试剂盒(目录号3CAL4000)量测切割的第II型胶原蛋白(Cartilaps)，且使用来自生物医学技术公司(Biomedical Technologies Inc.)(斯道顿，马赛诸塞州)的市售试剂盒量测骨钙化素。
图59展示与载体相比，以CNP37或PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)处理的FGFR3ach小鼠中的cGMP血浆含量的增加。图60及61展示给予CNP37使得切割的第II型胶原蛋白及骨钙化素的血清含量升高最多。此等结果表明给予FGFR3ach小鼠CNP肽(特别是CNP37)使得骨生长标记含量增加，表明在以CNP肽处理的FGFR3ach小鼠中骨形成及生长增加。
为评估野生型小鼠中的生物标记，通过皮下注射载体(30mM乙酸/乙酸盐缓冲液、1％苯甲醇、10％蔗糖，pH 4.0)、200nmol/kg G-CNP37、200nmol/kgPEO12-GANRR-CNP22(K4R)(“CNP27-PEO12”)(SEQ ID NO：36)或20nmol/kg或70nmol/kgPro-Gly-CNP37来每日处理野生型FVB小鼠持续5周。在研究期间收集血浆及血清。收集的血浆在-80℃下在10×蛋白酶抑制剂存在下储存直至分析为止。在第36日，在注射后15分钟自K2-ETDA血浆收集管量测cGMP含量。在研究结束时(第37日)自最终放血血清量测切割的第II型胶原蛋白、骨特异性碱性磷酸酶及IgG(与免疫原性有关)的含量。如上所述量测cGMP及切割的第II型胶原蛋白(Cartilaps)。使用市售试剂盒(Cusabio，目录号CSB-E11914m)量测骨特异性碱性磷酸酶。
与载体相比，在野生型小鼠中，给予G-CNP37显著增加(p＜0.05)cGMP含量(图62)及特别是切割的II型胶原蛋白的片段的含量(图63)。给予G-CNP37引起的II型胶原蛋白片段的显著较高含量指示软骨基质更新，表明G-CNP37在野生型小鼠中在正生长的骨中刺激新骨形成。
与以载体处理的野生型小鼠相比，20nmol/kg及70nmol/kg剂量的Pro-Gly-CNP37(“Pro-CNP38”)在给予后15分钟均显著增加(p＜0.05)血浆cGMP含量(图64)。与以载体处理的小鼠相比，给予较高剂量(70nmol/kg)的Pro-Gly-CNP37亦显著增加(p＜0.05)切割的第II型胶原蛋白的含量(图65)，表明在野生型小鼠中较高剂量的Pro-Gly-CNP37在新骨形成之前刺激软骨基质更新。此外，与以载体处理的小鼠相比，给予较高剂量(70nmol/kg)的Pro-Gly-CNP37增加(p＜0.05)骨特异性碱性磷酸酶的含量(图66)，表明在野生型小鼠中较高剂量的Pro-Gly-CNP37增强骨重塑。
评估CNP变体的免疫原性
因为CNP变体为肽衍生物，所以给予肽有可能在活体内导致免疫原性反应。为评估在连续给予CNP变体之后是否发生免疫反应，量测血清抗体含量。
进行IgG分析法以评估使软骨发育不全FGFR3ach小鼠暴露于CNP22、CNP37或PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(“CNP27-PEO24”)(SEQ ID NO：36)5周是否触发IgG免疫反应。IgG为小鼠及人类血清中的最主要免疫球蛋白，且作为对抗原的二次免疫反应的部分而产生。如下测定对给予CNP肽的IgG反应。对96孔板涂布含100ng/mL CNP22、CNP37或PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)的BupHPBS缓冲液(Pierce/Thermo，目录号28372，洛克福德，伊利诺斯州)。在培育隔夜之后，在室温下在300rpm震荡下以酪蛋白-PBS阻断缓冲液(Pierce/Thermo，目录号37528)阻断板两小时。在以洗涤缓冲液(含0.05％Tween的1×PBS)洗涤之后，将来自最终放血的经稀释血清样品(以1∶25稀释)添加至板中。亦将阳性对照及阴性对照加载板中。阳性对照为以1∶25稀释的血清(自6只个别FVB小鼠汇集)与以1∶1000稀释度添加的抗CNP22抗体(Bachem兔抗CNP22IgG，目录号T-4222)。阴性对照为经稀释的汇集血清。在培育两小时之后，洗涤板且将稀释于阻断缓冲液中的二次抗体添加至孔中。对于小鼠血清样品，以1∶10,000稀释度添加抗小鼠IgG Fcγ(过氧化酶偶联的亲和力纯化山羊抗小鼠IgG，Fcγ片段，目录号115-035-071，杰克逊免疫研究，西林，宾西法尼亚)。对于阳性对照及阴性对照，将抗兔IgG-HRP(圣克鲁斯生物技术，目录号SC-2004，圣克鲁斯，加利福尼亚)添加至阻断缓冲液中。在室温下在300rpm震荡下培育两小时之后，以洗涤缓冲液洗涤板。将100μLTMB(One-step TMB，Pierce/Thermo，目录号34022)添加至所有孔中。在室温下在300rpm震荡下培育板15分钟。通过添加100μL 2N H2SO4来停止比色反应。在450nm下(Spectramax，分子设备，桑尼威尔，加利福尼亚)读取板且使用SoftMaxPro软件(Molecular Devices)分析数据。
来自以CNP22或PEO24-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)处理的FGFR3ach小鼠的血清样品表明任何小鼠中均无阳性IgG免疫反应。九只经CNP37处理的FGFR3ach小鼠中仅一只展示弱阳性IgG反应。
亦通过检验如上所述的最终放血血清样品来评估经给予G-CNP37、PEO12-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)或Pro-Gly-CNP37的野生型小鼠的免疫原性反应(如通过血清IgG含量增加所量测)。以PEO12-GANRR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：36)或Pro-Gly-CNP37(20或70nmol/kg)处理的野生型小鼠中无一者显示阳性IgG免疫反应，且六只经给予G-CNP37的野生型小鼠中仅一只显示弱阳性IgG反应。
在不同CNP给药疗程下量测生物标记
在不同给药疗程下通过皮下(s.c.)注射载体(30mM乙酸/乙酸盐缓冲液、1％苯甲醇、10％蔗糖，pH 4.0)或Pro-Gly-CNP37(“Pro-CNP38”)来每日处理野生型FVB小鼠持续9周。第1组包括经每日皮下注射持续9周接着1周不处理的载体处理小鼠。第2组包括每日一次以Pro-Gly-CNP37(20nmol/kg)处理持续1周，接着每周三剂持续8周，接着1周不处理的小鼠。第3组含有隔周(1、3、5、7及9周)每日一次以Pro-Gly-CNP37(20nmol/kg)处理，各周的处理后1周不处理的小鼠。第4组含有每日一次以Pro-Gly-CNP37(5nmol/kg)处理持续9周接着1周不处理的小鼠。最终，第5组包括每日一次以Pro-Gly-CNP37(5nmol/kg)处理持续5周而无任何无处理周的小鼠。自小鼠收集最终放血血清，且由此量测切割的第II型胶原蛋白、总碱性磷酸酶及总抗体含量。如上所述量测切割的第II型胶原蛋白含量。藉助于兽医用诊断实验室测试设备(Antech)来量测主要来自肝脏及骨的总碱性磷酸酶含量。
开发总抗体分析法以评估可能的免疫反应。用于总抗体分析法的平台为电致化学发光分析法(ECLA)。ECLA平台利用经生物素标记的药物(在本文中为生物素-Pro-Gly-CNP37)及经钌标记的药物(在本文中为Ru-Pro-Gly-CNP37)。经生物素标记的药物结合于含有电极的经抗生蛋白链菌素涂布的板，且因为钌可经电化学刺激，所以使用经钌标记的药物作为分析法的检测组分。药物特异性抗体(在本文中为CNP特异性抗体)结合于经生物素标记的药物及经钌标记的药物且“桥联”两种经标记的药物。在ECLA平台的优势中，可检测抗体的任何同型(IgG、IgM等)，且ECLA分析法与物种无关。
如下进行总抗体分析法。用生物素以4∶1攻击比率标记Pro-Gly-CNP37，且用钌以10∶1攻击比率亦单独标记Pro-Gly-CNP37。通过添加甘氨酸来淬灭两个单独标记反应，且将来自两个反应的样品均缓冲液交换为PBS。通过使用以低浓度及高浓度添加至5％稀释FVB小鼠血清中的市售抗CNP22抗体(Bachem兔抗CNP22IgG，目录号T-4222)来制备低及高QC。使用分析稀释剂(含5％BSA的PBS，MSD目录号R93AA-1)将小鼠血清样品稀释至5％。通过将经生物素标记的Pro-Gly-CNP37添加至分析稀释剂中，接着将经钌标记的Pro-Gly-CNP37添加至分析稀释剂中且接着将两种溶液组合在一起来制备工作溶液。将25μL低及高QC载入板上作为对照。接着将25μL样品添加至非结合96孔板中，接着向所有孔中均添加50μL工作溶液。在室温下在350rpm震荡下将样品及QC与工作溶液一起保温2小时。同时，在室温下在350rpm震荡下以阻断缓冲液(MSD目录号R93AA-1)阻断MSD抗生蛋白链菌素板(MSD目录号L13SA-1)2小时。在两小时保温结束时，洗涤MSD抗生蛋白链菌素板，且接着将50μL样品或QC转移至MSD板中。接着在室温下在350rpm震荡下保温板1小时。在1小时保温结束时，洗涤MSD板且将150μL 2×读取缓冲液(MSD目录号R92TC-2)添加至板中。使用MSD PR400机读取板。
所有五组小鼠均显示实质上相当的切割的II型胶原蛋白含量(图67)。每日一次以5nmol/kg Pro-Gly-CNP37处理第5组的小鼠持续5周显著增加(p＜0.001)总碱性磷酸酶含量(图68)，其指示骨重塑。来自四组以Pro-Gly-CNP37处理的小鼠中每一者的血清样品在总抗体分析法中不显示阳性抗体反应。
不受任何理论束缚，关于以下现象存在可能的解释：为何四组经CNP处理的小鼠与载体处理的小鼠相比不显示统计学上显著的切割的第II型胶原蛋白含量的差异，及为何仅第5组中以CNP处理的小鼠与载体处理的小鼠相比显示统计学上显著的总碱性磷酸酶含量增加。可能因为在研究中以载体处理的小鼠亦在生长，因此切割的第II型胶原蛋白及碱性磷酸酶(其为生长的生物标记)亦在以载体处理的小鼠中产生。另外，对于第1至第4组的各组中的小鼠存在一周无处理时期，此可能弱化第1-3组中以CNP处理的小鼠与以载体处理的小鼠之间切割的第II型胶原蛋白及总碱性磷酸酶含量的任何变化。对于第5组中以CNP处理的小鼠不存在无处理时期，且彼等小鼠与以载体处理的小鼠相比显示显著(p＜0.001)较高的总碱性磷酸酶含量。
实施例15
CNP变体在小鼠中的剂量反应
在野生型FVB小鼠中评估不同剂量的CNP变体的作用。
对于剂量研究，在两个单独研究(S1及S2)中，每日一次皮下给予10只小鼠的组20及70nmol/kg Pro-Gly-wtCNP37(“Pro-CNP38”)持续36次注射。在整个疗程中量测尾长及体重。在实验结束时处死动物且评估骨长。
以载体处理的动物的尾长在第36日为约8cm，而以20nmol/kg Pro-CNP38处理的动物显示约8.75cm的尾长且以70nmol/kg Pro-CNP38处理的动物显示尾长增至约9.5cm。与以对照处理的动物相比，以任一剂量给予Pro-CNP38均诱导总身长显著(p＜.05)相对增加，表明在20nmol/kg Pro-CNP38下生长速度增加约130％且在70nmol/kg Pro-CNP38下生长速度增加约160％(图69)。
以Pro-CNP 38处理亦显著增加大多数所评估长骨的骨长以及动物的总鼻-肛门(身长)。表14表示经处理的动物与以载体处理的动物相比骨长的相对增加％。
表14
  Pro-CNP38   尾   鼻-肛门   LV4-6   股骨   胫骨   肱骨   尺骨
  20nmol/kg   8％*   7％*   10％*   7％*   4％*   3％*   3％*
  70nmol/kg   16％*   13％*   13*   10％*   7％*   4％*   5％*
相对增加％，相对于载体*p＜0.05ANNOVA(杜奈特(Dunnett))
亦在给予不同剂量Pro-CNP38之后评估骨矿质密度(BMD)及骨矿质含量(BMC)。结果(图70)显示给予70nmol/kg的Pro-CNP38显著降低骨矿质密度(图70A)且增加骨矿质含量(图70B)，表明在经处理的动物中存在骨矿化延迟，但矿化过程本身不受CNP处理不利影响。
在经Pro-CNP38或载体处理的动物之间器官重量不存在显著变化。
小鼠中剂量反应的生物分析研究
进行生物分析研究以量测活体内给予不同剂量的Pro-CNP38后CNP活性的标记。分析活体内样品中的血浆cGMP含量、第II型胶原蛋白的血清含量及碱性磷酸酶的血清含量。每日一次皮下给予野生型小鼠20及70nmol/kgGly-wtCNP37(“CNP38”)，20及70nmol/kg Pro-Gly-wtCNP37(“Pro-CNP38”)及70及200nmol/kg GHKSEVAHRFK-wtCNP27(“HSA-CNP27”)(SEQ ID NO：144)持续36日。在第36日在最后注射之后15分钟收集血浆且24小时后处死小鼠。在处死时，收集最终放血血清且用于如先前所述的生物标记分析。
图71显示20nmol/kg CNP38及70nmol/kg HSA-CNP27显著增加血浆cGMP(p＜0.01)，使血浆cGMP含量分别升至约300pmol及400pmol。给予70nmol/kgCNP38使cGMP增至约500pmol(p＜0.01)，而给予70nmol/kg Pro-CNP38使cGMP增至约575pmol(p＜0.001)。给予200nmol/kg HSA-CNP27使cGMP增至约675pmol(p＜0.001)。
CNP变体亦使切割的第II型胶原蛋白的血清含量显著增加(图72)。20nmol/kgCNP38使胶原蛋白增至约9pg/ml(p＜0.05)，70nmol/kg CNP38使胶原蛋白增至约8pg/ml(p＜0.05)，20nmol/kg Pro-CNP38使胶原蛋白增至约12pg/ml(p＜0.05)，70nmol/kg Pro-CNP38使胶原蛋白增至约16pg/ml(p＜0.05)，70nmol/kg HSA-CNP27使胶原蛋白增至约10pg/ml，且200nmol/kg HSA-CNP27使胶原蛋白增至约10pg/ml(p＜0.05)。
在给予CNP变体之后，血清碱性磷酸酶(AP)含量亦增加(图73)。20nmol/kgCNP38使AP增至约130IU/L，70nmol/kg CNP38使AP增至约160IU/L(p＜0.001)，20nmol/kg Pro-CNP38使AP增至约155IU/L(p＜0.001)，70nmol/kg Pro-CNP38使AP增至约180IU/L(p＜0.001)，70nmol/kg HSA-CNP27使AP增至约120IU/L，且200nmol/kg HSA-CNP27使AP增至约140IU/L(p＜0.01)。表15说明总骨特异性AP的百分比。
表15
Figure BPA00001469544101431
抗CNP抗体的分析显示仅HSA-CNP27在小鼠中引发IgG抗体反应。
上述结果说明给予CNP变体使血清中第II型胶原蛋白及碱性磷酸酶的浓度增加，表明CNP使与骨生长增加相关的因子增加，且表明给予剂量低至20nmol/kg的CNP变体在活体内亦有效增强骨生长。
不同给药疗程后的cGMP反应
亦在对8-10周龄野生型CD-1小鼠(每个处理组n＝3)给予Pro-Gly-wtCNP37(“Pro-CNP38”)之后的不同时间评估生物分析。以200nmol/kg的单次皮下剂量给予Pro-CNP38，且在注射后15分钟、3小时、1日、2日及3日量测血浆、骨骺、皮层骨(已移除骨髓)、肺及脑中的cGMP含量。在K2EDTA上收集血液。收集胫骨及股骨骺及皮层骨、耳翼(ear pinna)、脑、肾脏及肺，置于沸水中5分钟，接着冷冻至-70℃。分析血浆与组织的cGMP(凯曼化学环状GMP ELISA试剂盒)。
结果显示，在注射后15分钟，在血浆(约1300pmol/ml)及骨骺(约2.5pmol/ml/mg)中的cGMP含量增加。到3小时时，血浆含量已大致降低至对照含量，而骨骺中的含量为注射后15分钟cGMP含量的约1/3，但高于对照含量。皮层骨的含量在15分钟时增至约0.5pmol/ml/mg且保持在此含量下3小时。到注射后1日，在所有时点，cGMP的含量均回至对照含量。在肺或脑中，在任何时点均检测到极少至无cGMP。
亦在经给予Pro-CNP38的多次注射的小鼠中量测cGMP含量。如下给予各组小鼠(n＝3)Pro-CNP38：20nmol/kg单次剂量，皮下；200nmol/kg单次剂量，皮下；20nmol/kg皮下，第0日及第1日；200nmol/kg皮下，第0日及第1日；20nmol/kg皮下，第0日及第3日；200nmol/kg皮下，第0日及第3日。在最终剂量的Pro-CNP38后15分钟处死小鼠且分析cGMP的血浆含量。由于给药疗程不同，因此似乎不存在血浆cGMP信号的调节。亦研究软骨中的cGMP反应。
NPR-B受体脱敏潜力的评估法
组织学分析显示当每日给予200nmol/kg的CNP时，会累积于动物生长板中(依据所增强的CNP免疫反应性)。生长板中此累积或CNP受体的每日刺激有可能脱敏CNP受体。
为测定在活体外多次给药是否脱敏NPR-B受体，由正常人类关节软骨细胞与Pro-Gly-wtCNP37(“Pro-CNP38”)一起培养持续不同时间，且量测cGMP的分泌。
根据供货商(龙扎)推荐，培养自关节软骨分离的原代正常人类软骨细胞。在60-80％汇合度时，以1μM Pro-CNP38处理软骨细胞两次，其中在处理之间逐渐拉长时间(第一次处理在0时间点，接着在初次处理后15分钟、30分钟、60分钟、2小时、3小时、4小时、6小时)。在以下实验中，这些处理施用两次，其中在处理之间逐渐拉长时间(第一次处理在0时间点，接着在初次处理后6、16、24、48小时)，或仅施用一次，与第二次处理平行进行(仅在初次反应的6、16、24及48小时时)。处理仅施加15分钟(短期处理)，或持续实验的持续时间(长期处理，此时CNP保留于培养基中)。收集细胞溶胞物及条件培养基且分析其总cGMP分泌(Molecular Devices ELISA)。
在短期实验中，以1μM Gly-wtCNP37(“CNP38”)刺激细胞两次持续15分钟(短期处理)，或在整个培养中以CNP38刺激两次(长期处理)。两次处理之间的时间为15分钟、30分钟、60分钟、2小时、3小时、4小时、6小时。在实验的最后时间点，通过仅处理细胞一次获得cGMP刺激作用的峰值(6小时；在短期实验中＞0.1皮摩尔/孔，且在长期实验中为0.2皮摩尔/孔)。在短期实验中，当处理细胞两次时，若在0时间点且接着又在15分钟时处理细胞，则反应降至0.1皮摩尔/孔。在短期实验中，当处理细胞两次时，若在0时间点且又在30分钟、60分钟、2小时、3小时及4小时时处理细胞，则反应降至约0.5皮摩尔/孔。在长期实验中，当处理细胞两次时，若在0时间点及在15分钟时处理细胞，则反应降至约0.16皮摩尔/孔。在长期实验中，当处理细胞两次时，若在0时间点且又在30分钟、60分钟、2小时处理细胞，则反应降至约0.6皮摩尔/孔。在长期实验中，当处理细胞两次时，若在0时间点且又在2、4或6小时处理细胞，则反应降至＜0.5皮摩尔/孔。
亦进行长期研究。对于短期处理，将1μM CNP38添加至如上所述的细胞培养物中。对于长期处理，在整个如上所述的实验持续时间中，将1μM CNP38添加至细胞培养物中。结果显示，NPR-B受体会在重复每日活体外给予CNP之后脱敏，且若在第一剂之后移除CNP，则剂量之间48小时足以恢复对CNP38的最大NPR-B反应的60％，且若在整个实验中培育CNP则恢复至＜40％(图74)。
为评估在活体内以CNP变体处理是否使NPR-B受体脱敏，用野生型小鼠进行实验。在适当的日以载体对照或Pro-Gly-wtCNP37(“Pro-CNP38”)以200nmol/kg皮下注射8-10周龄的CD-1雄性小鼠。向小鼠每日注射Pro-CNP38持续至多8日，或在研究的第一日、第一及第二日，或第一及第三日向其注射Pro-CNP38。在最终注射之后十五分钟，使小鼠(每处理组n＝3)深度麻醉且经由开胸术及主动脉套管插入法来放血。经由主动脉套管以PBS自身体冲洗循环血液。收集肾脏及右胫骨、右股骨及左股骨，在水中煮沸5分钟及/或速冻于液氮中，且储存于干冰上或于-70℃冷冻器中直至分析cGMP为止。为评估软骨中的cGMP产生，解剖股骨远端及/或近端胫骨，称重且使用Covaris Cryoprep CP02粉碎。使用Covaris E210音波器在5％过氯酸中均质化粉末样品，且在60％KOH中中和。接着在4℃下在10,000rpm下将样品离心5分钟，且将上清液用于cGMP分析法(环状GMP酶免疫分析试剂盒，凯曼，密西根)。另外，收集左胫骨，固定于10％正常缓冲福尔马林(formalin)中，且加以储存以供进一步免疫组织化学分析。
图75A展示以200nmol/kg Pro-CNP38重复每日处理野生型小鼠持续1、4、6、7及8日并不使得cGMP反应脱敏。相反，在4日的每日处理后观察到cGMP反应增强。进一步每日处理产生cGMP反应的平稳状态(至多8日)。结果表明以200nmol/kgPro-CNP38每日处理野生型小鼠至多8日不使cGMP反应脱敏。
亦研究以Pro-CNP38处理野生型小鼠之后，股骨远端软骨中cGMP反应的动力学。与对单次处理的cGMP反应相比，一日一次处理小鼠持续两日增强对Pro-CNP38的cGMP反应(图75B)。当在第一及第三日，而非在第一及第二日处理小鼠时，第二次处理(在第三日)后的cGMP反应实质上类似于在第一日单次处理之后观察到的cGMP反应(图75B)。在此小鼠研究中，结果表明连续数日给药有利于增强对Pro-CNP38的cGMP反应。
不同组织中的NPR-B活化
为评估CNP变体对不同组织中NPR-B的可能活化，向野生型雄性CD-1小鼠注射200nmol/kg Gly-CNP37，且在不同时点在某些组织中量测cGMP反应。各处理组使用两只小鼠。各小鼠接受一次Gly-CNP37或载体对照的皮下注射。在注射后15、30或60分钟或3小时，使小鼠深度麻醉且经由开胸术及主动脉套管插入法来放血。通过用主动脉套管进行PBS冲洗来移除循环血液。收集心脏、肝、肺、肾、耳翼、主动脉及脑。所有组织均在水中煮沸5分钟，精细解剖(包括用PBS自股骨皮层冲洗骨髓)、称重、在液氮中冷却，且在生物磨粉机(BioPulverizer)中粉碎。用Polytron，在6％预冷却的过氯酸中均质化所得粉末状样品，且以60％KOH中和。接着在10,000rpm及4℃下离心样品5分钟，且将上清液用于cGMP分析法(环状GMP酶免疫分析试剂盒，凯曼化学公司，安阿伯，密西根)。对于组织重量校正结果。
在股骨远端(软骨及骨)、股骨皮层(骨)、耳翼(软骨)及肾脏中可检测回应于Gly-CNP37(图76中的”CNP”)处理的cGMP分泌(图76A-D)。在处理之后15分钟观察到彼等组织中的最大cGMP反应。在研究时点，相对于载体对照，肝、心脏、肺及脑组织未显示响应于Gly-CNP37的显著cGMP分泌(图76E-H)。结果表明以200nmol/kg Gly-CNP37处理在软骨、骨及肾组织中刺激cGMP分泌。
实施例16
CNP变体在猴中的剂量反应
在猕猴中评估CNP变体Pro-Gly-CNP37对骨生长及骨生长相关生物标记的含量的影响。以每日10或36μg/kg Pro-Gly-CNP37每日皮下注射八只正常幼年猕猴(在正在进行的研究开始时约2.5岁)(每剂量组n＝4)。给予四只此等猴载体作为对照。处理总长为6个月。通过数字X射线及磁共振成像，且通过外部量测肢干及身长来获得生长板扩展及骨生长的多种量度。定期收集血液及尿样品以用于临床病理学及量测Pro-Gly-CNP37及生物标记的含量。在终止研究之后，进行总体病理学研究，且在组织学方式评估组织样品以评估功效及安全性。
正在进行的研究中迄今所得的数据显示两种剂量的Pro-Gly-CNP37均使生长板宽度增加(通过数字X射线)(图77)、使左胫骨及右胫骨长度增加(通过数字X射线)(图78A及B)、使腿长增加(通过外部量测)(图79)、使臂长增加(通过外部量测)(图80)、使身长增加(通过外部量测)(图81)，且使碱性磷酸酶(骨形成的生物标记)的血清含量增加(图82)。数据表明明Pro-Gly-CNP37在血液动力学可接受的剂量下可在正常幼年猕猴中刺激骨生长。
实施例17
CNP变体在小鼠中对心血管系统的影响
已报导诸如CNP的利钠肽影响心血管系统。Wang等人，(Eur J Heart Fail.(欧洲心脏衰竭杂志)9：548-57.2007)描述CNP显示在大鼠中预防心肌局部缺血/再灌注损伤及改良心肌梗塞后心脏重塑中具有心脏保护作用。Wang显示过度表达CNP的小鼠的由心肌梗塞所致的心脏肥大的发生率降低。另外，CNP已显示引起与内皮无关的血管扩张(M.Honing等人，Hypertension(高血压)，37：1179-1183(2001))及因此可在活体内短暂降低血压。
为评估CNP变体对心血管系统的影响，在皮下注射变体之后研究经麻醉的野生型FVB小鼠中的血压及心跳速率。
在定义心血管活性的广泛剂量范围的试验性研究之后，进行剂量-反应研究以检验三种不同剂量浓度的各CNP变体的作用。三只8周龄的雄性FVB小鼠构成各处理组。将剂量皮下给予经麻醉的小鼠，且经由植入的动脉内压力转导器监测收缩压、舒张压及平均动脉压(MAP)，以及心跳速率。
实施例18
CNP变体的制剂
进行CNP预调配研究以评估CNP变体Gly-wtCNP37(“CNP38”)在不同pH值(pH3、4、5、6、7及8)及温度(5℃、25℃及40℃)下随时间的稳定性。在这些研究中，CNP38显示在pH 4-6下的稳定性大于其它pH值下的稳定性。CNP38在5℃下在pH 4-6下稳定，在15周后≥约95％的CNP38得以保留。当温度升高至25℃时，在pH 4下，在15周后约85％的CNP38得以保留，在pH 5下，在15周后约85％得以保留，且在pH 6下，在15周后约80％得以保留。当温度升高至40℃时，在pH 4下，在15周后约55-60％的CNP38得以保留，在pH 5下，在15周后约65％得以保留，且在pH 6下，在15周后约40％得以保留。图83说明伪一级降解速率常数(Kobs)相对于pH 3至8的pH值及在5℃、25℃及40℃下的观察图。预调配研究中CNP38的稳定性数据表明CNP制剂的pH值在约4至约6的范围内。酸性pH值(例如pH≤约6)可通过以下来促进CNP变体稳定：例如最小化或避免天冬酰胺及/或谷氨酰胺残基的脱酰胺、天冬氨酸残基的异构化，或CNP变体通过其它路径降解。
可将CNP变体调配于医药载体中以便给予受例如骨生长病状影响的个体。在一些实施例中，根据表16中的成分及其量或浓度的任何组合调配CNP变体的液体制剂。
表16
Figure BPA00001469544101481
1丙三醇系用以最小化或防止CNP变体的水推动水解、脱酰胺、异构化或切割。对于冻干制剂，4-6％或6-20％甘露糖醇或蔗糖可取代NaCl。
在某些实施例中，自根据表17中的成分及其量或浓度的任何组合调配的制剂，制备CNP变体的冻干制剂。
表17
Figure BPA00001469544101482
Figure BPA00001469544101491
1丙三醇系用以最小化或防止CNP变体的水推动水解、脱酰胺、异构化或切割。
在某些实施例中，包含CNP变体的制剂的pH值为约3-7，或约3-6，或约3.5-6.5，或约4-6，或约4-5，或约4.5-5.5。在一些实施例中，对于pH 4-5.5，适合缓冲剂为乙酸/乙酸盐(例如乙酸钠)，且对于pH 5.5-6，适合缓冲剂为柠檬酸/柠檬酸盐。柠檬酸/柠檬酸盐(例如柠檬酸钠)亦为在pH 3-6或pH 4-6范围内的适合缓冲剂。在某些实施例中，缓冲剂在制剂中的浓度为约2-50mM，或约2-40mM，或约2-30mM，或约5-30mM，或约2-20mM，或约5-20mM，或约5-15mM。
为最小化或避免CNP变体脱酰胺，可将变体调配于医药学上可接受的有机共溶剂(诸如丙三醇、乙醇及丙二醇)中。因为脱酰胺通过水解发生，所以以有机共溶剂取代水将使CNP变体与水的接触减到最小。若不使用水，则有机-水性溶剂系统中一或多种有机溶剂的浓度可为例如约10％至约99％，或约100％。
亦为最小化或避免CNP变体脱酰胺，可通过冻干自制剂移除水。在一些实施例中，冻干制剂含有以下组分的任何组合：
缓冲剂：乙酸钠及乙酸，或柠檬酸钠及柠檬酸；
等张性/膨胀剂：甘露糖醇(例如3-10％、2-8％或4-6％)；
蔗糖(例如6-20％、5-15％或8-12％)
抗氧化剂：甲硫氨酸及/或抗坏血酸，各抗氧化剂与CNP变体的摩尔比为约0.1∶1至约1∶1，或约0.5∶1至约5∶1，或约1∶1至约15∶1，或约1∶1至约10∶1，或约3∶1至约10∶1。
亦可通过将CNP组合物(例如液体制剂或冻干制剂)储存在较低温度下，诸如在约5℃、0℃、-10℃、-20℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃、-90℃或
-100℃下，以最小化或避免脱酰胺。
为最小化或避免CNP变体中可氧化残基(例如甲硫氨酸)的氧化，可用一或多种抗氧化剂调配变体。例示性抗氧化剂包括(但不限于)甲硫氨酸、抗坏血酸及硫甘油。例如甲硫氨酸残基的氧化亦可通过用氮或氩自液体介质(若为液体制剂)清除氧，及/或用氮或氩自容器或包装清除氧来最小化或防止。
在一些实施例中，为最小化或防止吸附(例如CNP变体吸附至塑料或玻璃)，将聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80或苯甲醇或其组合添加至CNP制剂中。在某些实施例中，各抗吸附剂的浓度为约0.001％至约0.5％，或约0.01％至约0.5％，或约0.1％至约1％，或约0.5％至约1％，或约0.5％至约1.5％，或约0.5％至约2％，或约1％至约2％。制剂中抗吸附剂的例示性范围包括(但不限于)约0.001％至约0.5％聚山梨醇酯20、约0.001％至约0.5％聚山梨醇酯80及/或约0.5％至约1.5％苯甲醇。
在某些实施例中，液体CNP制剂包含以下，或冻干CNP制剂系自包含以下的制剂制备：(1)乙酸/乙酸盐(例如乙酸钠)缓冲液，其具有约30mM±5或10mM缓冲剂的浓度及约4±0.5或1的pH值，及(2)浓度为约1％±0.5％的苯甲醇(例如作为防腐剂及/或抗吸附剂)，及视情况选用的(3)浓度为约10％±5％的蔗糖。
实施例19
CNP变体的临床评估
以下实施例提供关于用于在本文的治疗方法中临床评估包含CNP22或其变体的组合物的参数的指导。如本文所讨论，CNP22或其变体将用于治疗CNP反应性病症，包括骨及血管平滑肌的病症。将进行临床试验，其将提供CNP22或其变体的安全剂量、药物动力学、及替代临床终点与规定临床终点的初始反应的评估。试验将进行最少(但不必限于)24周以便收集关于约100位可评估患者的足够安全性信息。试验的初始剂量将在每周约0.001至约1.0mg/kg间变化，或为任何本文所述的剂量。在此范围中的初始剂量不产生显著直接临床益处的情况下，应在此范围内增加剂量或必要时增加剂量超出此范围，且再维持最少(但不必限于)24周的时期以确定安全性且进一步评估功效。
安全性的量测将包括不良事件、过敏反应、全套临床化学项目(包括肾及肝功能)、尿分析及差示CBC。另外，监测与临床益处有关的其它参数。本发明的实施例亦包括测定CNP22或其变体的药物动力学参数，包括吸收、分布、代谢、排泄，及血液中的半衰期及生物可用性。预期此等分析将将有助于关联剂量与临床反应。
方法
患者将经历基线病史及身体检查，及一套标准临床实验测试(包括CBC、Panel20、CH50及UA)。患者将以每周至门诊就诊方式紧密追踪。治疗期完成之后一周，患者返回门诊以便全面评估。若需要增加剂量，则患者应遵循上述相同时程。将在整个试验中监测安全性。
诊断及纳入准则
患者可为具有潜在CNP反应性病症的诊断病历的男性或女性。潜在CNP反应性骨相关病症的特定实例为软骨发育不全，其可通过遗传测试及FGFR-3突变或功能异常的其它证据来证明。软骨发育不全患者的理想年龄范围为婴儿(＜1岁)至青春期前(＜13岁)。具有以下情形的患者将排除在此研究的外：患者怀孕或正在哺乳；在参加研究之前30日内已接受研究药物；或患有医学病状、严重间发性疾病，或可能会显著降低研究顺应性的其它掩饰情形。
安全性
若在研究过程期间未发生显著急性或慢性药物反应，则使用CNP22或其变体的疗法将确定为安全。若临床检查、临床实验室或其它适当研究中未观察到显著异常，则长时间给予该药物将确定为安全。
已显示，与野生型CNP22相比，本文的某些CNP变体在活体外具有高得多的对NEP降解的抗性，在大鼠中具有长得多的血浆半衰期及生物可用性，在大鼠中刺激高得多的cGMP产生量，及/或在软骨发育不全小鼠中诱导长骨长度及身长显著较大增长。此外，已显示在逆转FGF2诱导的活体外软骨细胞生长停滞方面，用CNP22进行短持续时间剂量疗程处理几乎与连续CNP22处理同样有效。此等结果(尤其本文所述者)表明本文的CNP变体适用于治疗CNP反应性病状或病症(诸如骨相关病症及血管平滑肌病症)。
应了解本文所述的揭示内容的每个实施例均可视情况与本文所述的任一或多个其它实施例组合。本文中所引用的每个专利文献及每个非专利文献均以全文引用的方式并入本文中。
预期本领域技术人员可对如本文所述的实施例及说明性实施例中所述的揭示内容进行多种修改及变化。因此本文应仅受诸如随附申请专利范围中所呈现的限制。
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Claims (57)

1.一种C型利钠肽(CNP)的变体，其系选自由以下组成的群：
GDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-CNP53)(SEQ ID NO：179)；
PDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-CNP53)(SEQ ID NO：185)；
MDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-CNP53)(SEQ ID NO：190)；
DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP-53(M48N)](SEQ ID NO：180)；
LRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-52)(SEQ ID NO：146)；
RVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-51)(SEQ ID NO：147)；
VDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-50)(SEQ ID NO：148)；
DTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-49)(SEQ ID NO：149)；
TKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-48)(SEQ ID NO：150)；
KSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-47)(SEQ ID NO：151)；
SRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-46)(SEQ ID NO：152)；
RAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-45)(SEQ ID NO：153)；
AAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-44)(SEQ ID NO：154)； 
AWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-43)(SEQ ID NO：155)；
WARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-42)(SEQ ID NO：156)；
ARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMS GLGC(CNP-41)(SEQ ID NO：157)；
RLLQEHPNARKYKGANKKGL SKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-40)(SEQ ID NO：158)；
LLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-39)(SEQ ID NO：159)；
LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-38)(SEQ ID NO：160)；
QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(SEQ ID NO：60)；
EHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-36)(SEQ ID NO：161)；
HPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-35)(SEQ ID NO：162)；
PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-34)(SEQ ID NO：163)；
NARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-33)(SEQ ID NO：164)；
ARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-32)(SEQ ID NO：165)；
RKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-31)(SEQ ID NO：166)；
KYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-30)(SEQ ID NO：167)；
YKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-29)(SEQ ID NO：168)；
KGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-28)(SEQ ID NO：169)；
GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-27)(SEQ ID NO：170)； 
ANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-26)(SEQ ID NO：171)；
NKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-25)(SEQ ID NO：172)；
KKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-24)(SEQ ID NO：173)；
KGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-23)(SEQ ID NO：174)；
LSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-21)(SEQ ID NO：175)；
SKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-20)(SEQ ID NO：176)；
KGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-19)(SEQ ID NO：177)；
GCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-18)(SEQ ID NO：178)；
QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP37(M32N)](SEQ ID NO：182)；
PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-CNP37)(SEQ ID NO：186)；
MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-CNP37)(SEQ ID NO：192)；
GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-CNP37)(SEQ ID NO：75)；
GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[Gly-CNP37(M32N)](SEQ ID NO：181)；
PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP37)(SEQ ID NO：145)；
MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-Gly-CNP37)(SEQ ID NO：191)；
GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(HSA-CNP27)(SEQ ID NO：144)；
GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[HSA-CNP27(M22N)](SEQ ID NO：183)]；
PGHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-HSA-CNP27)(SEQ ID NO：188)；
MGHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-HSA-CNP 27)(SEQ ID NO：193)；
GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO：36)；
GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP27(K4，5，9R，M22N)](SEQ ID NO：184)；
PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Pro-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO：189)；
MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Met-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO：194)；
PEG1K-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PEG1K-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO：36)；
PEG1K-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC[PEG1K-CNP27(K4，5，9R，M22N)](SEQ ID NO：184)；
PEG1K-PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PEG1K-Pro-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO：189)；
PEG1K-MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PEG1K-Met-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO：194)；
PEO12-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PEO12-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO：36)；
PEO12-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC[PEO12-CNP27(K4，5，9R，M22N)](SEQ ID NO：184)；
PEO12-PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PEO12-Pro-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO：189)；
PEO12-MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PEO12-Met-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO：194)；
PEO24-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PEO24-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO：36)；
PEO24-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC[PEO24-CNP27(K4，5，9R，M22N)](SEQ ID NO：184)； 
PEO24-PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PEO24-Pro-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO：189)；及
PEO24-MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PEO24-Met-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO：194)。
2.一种医药组合物，其包含CNP变体，及医药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
3.如权利要求2所述的组合物，其为冻干制剂。
4.如权利要求3所述的组合物，其中所述冻干制剂是用包含pH值为约4至约6的缓冲液的制剂制备的。
5.如权利要求4所述的组合物，其中所述缓冲液是柠檬酸/柠檬酸盐缓冲液或乙酸/乙酸盐缓冲液。
6.如权利要求4或5所述的组合物，其中该冻干制剂用进一步包含等张调节剂或膨胀剂的制剂制备。
7.如权利要求6所述的组合物，其中等张调节剂或膨胀剂选自甘露醇、蔗糖、山梨醇及其组合。
8.如权利要求4-7任一所述的组合物，其中该冻干制剂用进一步包含抗氧化剂的制剂制备。
9.如权利要求8所述的组合物，其中所述抗氧化剂选自甲硫氨酸、抗坏血酸、抗坏血酸的盐形式、硫甘油及其组合。
10.如权利要求2-9任一所述的组合物，其中该CNP变体是权利要求1所述的CNP变体。
11.一种如权利要求1所述的CNP变体或如权利要求2-10任一所述的药物组合物，用于治疗选自骨关节炎、低磷酸盐血症性佝偻病、软骨发育不全、软骨发育低下、身材矮小、侏儒症、骨软骨发育不全、致死性软骨发育不全、成骨不全、软骨成长不全、斑点状软骨发育异常、同型合子软骨发育不全、斑点状软骨发育异常、屈肢骨发育不良、先天性致死性低磷酸酯酶症、围产期致死型成骨不全、短肋骨多指综合征、软骨发育低下、肢根型斑点状软骨发育异常、詹森型干骺端发育不良(Jansen-type metaphyseal dysplasia)、先天性椎体骨骺结构不良(spondyloepiphyseal dysplasia congenita)、骨发育不全症(atelosteogenesis)、骨畸形性发育不良(diastrophic  dysplasia)、先天性短股骨、朗格型肢中部发育不良(Langer-type mesomelic dysplasia)、尼弗哥特型肢中部发育不良(Nievergelt-type mesomelic dysplasia)、罗比挠综合征(Robinow syndrome)、莱茵哈特综合征(Reinhardt syndrome)、肢端发育不全(acrodysostosis)、周围性骨发育不全、克尼斯特发育不良(Kniest dysplasia)、纤维软骨发生(fibrochondrogenesis)、罗伯茨综合征(Roberts syndrome)、肢端肢中发育不全(acromesomelic dysplasia)、短肢畸形、莫基奥综合征(Morquio syndrome)、克尼斯特综合征(Kniest syndrome)、后生营养性发育不良(metatrophic dysplasia)及脊椎干骺端发育不良(spondyloepimetaphyseal dysplasia)的骨相关病症或骨骼发育不良。
12.如权利要求11所述的CNP变体或药物组合物，其中该骨相关病症或骨骼发育不良为软骨发育不全。
13.一种如权利要求1所述的CNP变体或如权利要求2-10任一所述的药物组合物，用于治疗选自高血压、再狭窄、动脉硬化、急性代偿失调性心脏衰竭、充血性心脏衰竭、心原性水肿、肾水肿、肝原性水肿、急性肾功能不全及慢性肾功能不全的血管平滑肌病症。
14.一种重组产生CNP变体的方法，其包括使包含编码CNP变体多肽的第一多核苷酸连接至编码可切割肽或蛋白质的第二多核苷酸的宿主细胞，在培养基中，在可以让所述多核苷酸编码的融合多肽表达的条件下培养，其中该融合多肽包含该CNP变体多肽直接连接至该可切割肽或蛋白质或经由接头与其间接连接。
15.如权利要求14的方法，其中该宿主细胞经表达载体转化，该表达载体包含编码该CNP变体多肽的多核苷酸连接至编码该可切割肽或蛋白质的该多核苷酸。
16.如权利要求14或15的方法，其中使用异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)-诱导型载体来增强编码该融合多肽的该多核苷酸的表达。
17.如权利要求16所述的方法，其中在约20℃至约40℃的温度下，在约0.4mM至约1.5mM IPTG存在下培养该宿主细胞一段时间。
18.如权利要求15-17任一所述的方法，其中该载体为质体。
19.如权利要求18的方法，其中该质体选自：pJexpress、pJexpress401、pJexpress404、pET-15b、pET-21a、pET-22b、pET-31b、pET-32a、pET-41a、pMAL、pMAL-c2X、pQE-30、pET-SUMO及pTYB11。 
20.如权利要求14-19任一所述的方法，其中该可切割肽或蛋白质选自：组胺酸标签、人类转录因子TAF12、TAF12片段、TAF12组蛋白折叠域、TAF12的突变体及其片段、TAF12(C/A)、TAF12(D/E)、TAF12(4D/4E)、TAF12(6D/6E)、TAF12(10D/10E)、TAF12(C/A及D/E)、TAF12(C/A及4D/4E)、TAF12(C/A及6D/6E)、TAF12(C/A及10D/10E)、酮类固醇异构酶、麦芽糖结合蛋白、β-半乳糖苷酶、谷胱甘肽-S-转移酶、硫氧还蛋白、壳多糖结合域、BMP-2、BMP-2突变体、BMP-2(C/A)，及其突变体及片段。
21.如权利要求20所述的方法，其中该可切割肽或蛋白质选自：人类转录因子TAF12、TAF12片段、TAF12组蛋白折叠域、TAF12的突变体及其片段、TAF12(C/A)、TAF12(D/E)、TAF12(4D/4E)、TAF12(6D/6E)、TAF12(10D/10E)、TAF12(C/A及D/E)、TAF12(C/A及4D/4E)、TAF12(C/A及6D/6E)及TAF12(C/A及10D/10E)。
22.如权利要求14-21任一所述的方法，其中用切割剂切割所述可切割肽或蛋白。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述切割剂选自：甲酸、溴化氰(CNBr)、羟胺、蛋白质自切割、因子Xa、肠激酶、ProTEV和SUMO蛋白酶。
24.如权利要求14-23任一所述的方法，其特征在于，该宿主细胞为细菌。
25.如权利要求24的方法，其中该细菌宿主细胞为大肠杆菌(E.coli)。
26.如权利要求25所述的方法，其中该大肠杆菌细胞选自：BL21、BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pGro7、ArcticExpress(DE3)、C41(DE3)、C43(DE3)、Origami B(DE3)、Origami B(DE3)pLysS、KRX及Tuner(DE3)。
27.如权利要求26所述的方法，其中该大肠杆菌细胞为BL21(DE3)。
28.如权利要求14-27任一所述的方法，其中该融合多肽表达为可溶蛋白质或包涵体。
29.如权利要求14-28任一所述的方法，其进一步包含自该宿主细胞或培养基分离该所表达的融合多肽。
30.如权利要求29所述的方法，其进一步包含使该经分离的融合多肽与选自由以下组成的群的切割剂接触：甲酸、溴化氰(CNBr)、羟胺、蛋白质自切割、因子Xa、肠激酶、ProTEV及SUMO蛋白酶。 
31.如权利要求30所述的方法，其中该切割剂为甲酸。
32.如权利要求30或31所述的方法，其中在约1％至约10％甲酸存在下，在约50℃至约70℃的温度下，由该经分离的融合多肽与切割剂接触。
33.如权利要求32所述的方法，其中在甲酸存在下，进行该接触约5小时至约36小时。
34.如权利要求14-33任一所述的方法，其产生选自由以下组成的群的CNP变体：
R-CNP22(K4R)(类似物AZ)(SEQ ID NO：41)；
ER-CNP22(K4R)(类似物BA)(SEQ ID NO：39)；
GANPR-CNP22(K4R)(类似物CI)(SEQ ID NO：37)；
GANQQ-CNP22(K4R)(类似物CH)(SEQ ID NO：69)；
AAWARLLQEHPNA-CNP22(类似物CA)(SEQ ID NO：61)；
AAWARLLQEHPNAR-CNP22(类似物CB)(SEQ ID NO：62)；
DLRVDTKSRAAWAR-CNP22(类似物CC)(SEQ ID NO：63)；
GQPREPQVYTLPPS-CNP22(类似物CF)(SEQ ID NO：79)；
GERAFKAWAVARLSQ-CNP22(类似物CE)(SEQ ID NO：81)；
GHHSHEQHPHGANQQ-CNP22(类似物CQ)(SEQ ID NO：76)；
GQEHPNARKYKGANPK-CNP22(类似物CS)(SEQ ID NO：71)；
GQEHPNARKYKGANQK-CNP22(类似物CT)(SEQ ID NO：130)；
GAHHPHEHDTHGANQQ-CNP22(类似物CR)(SEQ ID NO：77)；
GQTHS SGTQSGANQQ-CNP22(K4R)(类似物CN)(SEQ ID NO：87)；
SPKMVQGSG-CNP17-KVLRRH(类似物CD)(SEQ ID NO：68)；
PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-34)；
GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO：36)；
GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP27(K4，5，9R，M22N)](SEQ ID NO：184)；
PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Pro-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO：189)； 
MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Met-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO：194)；
GDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-CNP53)(SEQ ID NO：179)；
PDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-CNP53)(SEQ ID NO：185)；
MDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-CNP53)(SEQ ID NO：190)；
DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP-53(M48N)](SEQ ID NO：180)；
QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(SEQ ID NO：60)；
QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP37(M32N)](SEQ ID NO：182)；
PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-CNP37)(SEQ ID NO：186)；
MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-CNP37)(SEQ ID NO：192)；
GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-CNP37)(SEQ ID NO：75)；
GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[Gly-CNP37(M32N)](SEQ ID NO：181)；
PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP37)(SEQ ID NO：145)；
MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-Gly-CNP37)(SEQ ID NO：191)；
GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(HSA-CNP27)(SEQ ID NO：144)；
GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [HSA-CNP27(M22N)](SEQ ID NO：183)；
PGHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-HSA-CNP27)(SEQ ID NO：188)；及
MGHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-HSA-CNP27)(SEQ ID NO：193)。
35.如权利要求14-34任一所述的方法，其不产生CNP-22或CNP-53。
36.一种根据如权利要求14-33任一所述的方法产生的CNP变体，其中该CNP变体选自：
R-CNP22(K4R)(类似物AZ)(SEQ ID NO：41)；
ER-CNP22(K4R)(类似物BA)(SEQ ID NO：39)；
GANPR-CNP22(K4R)(类似物CI)(SEQ ID NO：37)；
GANQQ-CNP22(K4R)(类似物CH)(SEQ ID NO：69)；
AAWARLLQEHPNA-CNP22(类似物CA)(SEQ ID NO：61)；
AAWARLLQEHPNAR-CNP22(类似物CB)(SEQ ID NO：62)；
DLRVDTKSRAAWAR-CNP22(类似物CC)(SEQ ID NO：63)；
GQPREPQVYTLPPS-CNP22(类似物CF)(SEQ ID NO：79)；
GERAFKAWAVARLSQ-CNP22(类似物CE)(SEQ ID NO：81)；
GHHSHEQHPHGANQQ-CNP22(类似物CQ)(SEQ ID NO：76)；
GQEHPNARKYKGANPK-CNP22(类似物CS)(SEQ ID NO：71)；
GQEHPNARKYKGANQK-CNP22(类似物CT)(SEQ ID NO：130)；
GAHHPHEHDTHGANQQ-CNP22(类似物CR)(SEQ ID NO：77)；
GQTHSSGTQSGANQQ-CNP22(K4R)(类似物CN)(SEQ ID NO：87)；
SPKMVQGSG-CNP17-KVLRRH(类似物CD)(SEQ ID NO：68)；
PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-34)；
GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO：36)；
GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP27(K4，5，9R，M22N)]；
PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Pro-CNP27(K4，5，9R)]；
MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Met-CNP27(K4，5，9R)]；
GDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSM SGLGC(Gly-CNP53)(SEQ ID NO：179)；
PDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-CNP53)(SEQ ID NO：185)；
MDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-CNP53)(SEQ ID NO：190)；
DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP-53(M48N)](SEQ ID NO：180)；
QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(SEQ ID NO：60)；
QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP37(M32N)](SEQ ID NO：182)；
PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-CNP37)(SEQ ID NO：186)；
MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-CNP37)(SEQ ID NO：192)；
GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-CNP37)(SEQ ID NO：75)；
GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[Gly-CNP37(M32N)](SEQ ID NO：181)；
PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP37)(SEQ ID NO：145)；
MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-Gly-CNP37)(SEQ ID NO：191)；
GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(HSA-CNP27)(SEQ ID NO：144)；
GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[HSA-CNP27(M22N)](SEQ ID NO：183)；
PGHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-HSA-CNP27)(SEQ ID NO：188)；及 
MGHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-HSA-CNP27)(SEQ ID NO：193)。
37.一种包含表达载体的宿主细胞，该载体包含编码CNP变体多肽的第一多核苷酸连接至编码可切割肽或蛋白质的第二多核苷酸。
38.如权利要求37的宿主细胞，其中该可切割肽或蛋白质选自：组胺酸标签、人类转录因子TAF12、TAF12片段、TAF12组蛋白折叠域、TAF12的突变体及其片段、TAF12(C/A)、TAF12(D/E)、TAF12(4D/4E)、TAF12(6D/6E)、TAF12(10D/10E)、TAF12(C/A及D/E)、TAF12(C/A及4D/4E)、TAF12(C/A及6D/6E)、TAF12(C/A及10D/10E)、酮类固醇异构酶、麦芽糖结合蛋白、β-半乳糖苷酶、谷胱甘肽-S-转移酶、硫氧还蛋白、壳多糖结合域、BMP-2、BMP-2突变体、BMP-2(C/A)，及其突变体及片段。
39.如权利要求37或38所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌。
40.如权利要求39所述的宿主细胞，其中所述细菌宿主细胞是大肠杆菌。
41.如权利要求40的宿主细胞，其中所述大肠杆菌选自：BL21、BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pGro7、ArcticExpress(DE3)、C41(DE3)、C43(DE3)、Origami B(DE3)、Origami B(DE3)pLysS、KRX及Tuner(DE3)。
42.如权利要求41所述的宿主细胞，其中所述大肠杆菌是BL21(DE3)。
43.如权利要求37-42任一所述的宿主细胞，其中所述载体是质粒。
44.如权利要求43的宿主细胞，其中所述质粒选自：pJexpress、pJexpress401、pJexpress404、pET-15b、pET-21a、pET-22b、pET-31b、pET-32a、pET-41a、pMAL、pMAL-c2X、pQE-30、pET-SUMO及pTYB11。
45.如权利要求37-44任一所述的宿主细胞，其中在细胞培养前用载体转化宿主细胞。
46.如权利要求37-45任一所述的宿主细胞，其中在适于表达由所述多核苷酸编码的融合多肽的条件下，于培养基中培养该宿主细胞，其中该融合多肽包含该CNP变体多肽直接连接至该可切割肽或蛋白质或经由接头与其间接连接。
47.如权利要求46的宿主细胞，其中该融合多肽表达为可溶蛋白质或包涵体。
48.如权利要求46或47所述的方法，其中从该宿主细胞或培养基分离该所 表达的融合多肽。
49.如权利要求48所述的宿主细胞，其中使该经分离的融合多肽与选自由以下组成的群的切割剂接触：甲酸、溴化氰(CNBr)、羟胺、蛋白质自切割、因子Xa、肠激酶、ProTEV及SUMO蛋白酶。
50.如权利要求37-49任一所述的宿主细胞，其中该CNP变体多肽不是CNP-22或CNP-53。
51.一种评估CNP肽或变体对个体中至少一种骨或软骨相关生物标记含量的影响的方法，其包括分析来自已给予CNP肽或变体的个体的生物样品中至少一种骨或软骨相关生物标记的该含量。
52.如权利要求51的方法，其进一步包含对该个体给予该CNP肽或变体，随后分析该至少一种骨或软骨相关生物标记的该含量。
53.一种治疗CNP反应性病状或病症的方法，其包括
对个体给予CNP肽或变体，及
监测该个体中至少一种骨或软骨相关生物标记的含量，
其中该至少一种骨或软骨相关生物标记的该含量增加，表示该CNP肽或变体对该个体或该病状或病症具有治疗作用。
54.如权利要求53所述的方法，其进一步包括调整该CNP肽或变体的给药量或给药频率，其中
i)若所述至少一种骨或软骨相关生物标记的所述含量低于目标含量，则增加该CNP肽或变体的给药量或给药频率；或
ii)若所述至少一种骨或软骨相关生物标记的所述含量高于目标含量，则降低所述CNP肽或变体的给药量或给药频率。
55.如权利要求51-54任一所述的方法，其中所述至少一种骨或软骨相关生物标记选自：CNP、cGMP、II型胶原蛋白的前肽及其片段、II型胶原蛋白及其片段、骨钙化素、增殖细胞核抗原(PCNA)、I型原胶原的前肽(PINP)及其片段、I型胶原蛋白及其片段、聚集蛋白聚糖硫酸软骨素及碱性磷酸酶。
56.如权利要求51-55任一所述的方法，其中所述CNP肽或变体选自：
R-CNP22(K4R)(类似物AZ)(SEQ ID NO：41)；
GANRR-CNP22(K4R)(类似物AY)(SEQ ID NO：36)； 
AAWARLLQEHPNA-CNP22(类似物CA)(SEQ ID NO：61)；
AAWARLLQEHPNAR-CNP22(类似物CB)(SEQ ID NO：62)；
DLRVDTKSRAAWAR-CNP22(类似物CC)(SEQ ID NO：63)；
GQPREPQVYTLPPS-CNP22(类似物CF)(SEQ ID NO：79)；
GERAFKAWAVARLSQ-CNP22(类似物CE)(SEQ ID NO：81)；
GHHSHEQHPHGANQQ-CNP22(类似物CQ)(SEQ ID NO：76)；
GQEHPNARKYKGANPK-CNP22(类似物CS)(SEQ ID NO：71)；
GQEHPNARKYKGANQK-CNP22(类似物CT)(SEQ ID NO：130)；
GAHHPHEHDTHGANQQ-CNP22(类似物CR)(SEQ ID NO：77)；
GQTHSSGTQSGANQQ-CNP22(K4R)(类似物CN)(SEQ ID NO：87)；
SPKMVQGSG-CNP17-KVLRRH(类似物CD)(SEQ ID NO：68)；
GDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-CNP53)(SEQ ID NO：179)；
PDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-CNP53)(SEQ ID NO：185)；
MDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-CNP53)(SEQ ID NO：190)；
DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP-53(M48N)](SEQ ID NO：180)；
DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-53)(SEQ ID NO：4)；
LRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-52)(SEQ ID NO：146)；
RVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-51)(SEQ ID NO：147)；
VDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-50)(SEQ ID NO：148)；
DTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-49)(SEQ ID NO：149)； 
TKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-48)(SEQ ID NO：150)；
KSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-47)(SEQ ID NO：151)；
SRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGL SKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-46)(SEQ ID NO：152)；
RAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-45)(SEQ ID NO：153)；
AAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-44)(SEQ ID NO：154)；
AWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-43)(SEQ ID NO：155)；
WARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-42)(SEQ ID NO：156)；
ARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-41)(SEQ ID NO：157)；
RLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-40)(SEQ ID NO：158)；
LLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-39)(SEQ ID NO：159)；
LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-38)(SEQ ID NO：160)；
QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-37)(SEQ ID NO：60)；
EHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-36)(SEQ ID NO：161)；
HPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC
(CNP-35)(SEQ ID NO：162)；
PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC 
(CNP-34)(SEQ ID NO：163)；
NARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-33)(SEQ ID NO：164)；
ARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-32)(SEQ ID NO：165)；
RKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-31)(SEQ ID NO：166)；
KYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-30)(SEQ ID NO：167)；
YKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-29)(SEQ ID NO：168)；
KGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-28)(SEQ ID NO：169)；
GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-27)(SEQ ID NO：170)；
ANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-26)(SEQ ID NO：171)；
NKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-25)(SEQ ID NO：172)；
KKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-24)(SEQ ID NO：173)；
KGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-23)(SEQ ID NO：174)；
GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-22)(SEQ ID NO：1)；
LSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-21)(SEQ ID NO：175)；
SKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-20)(SEQ ID NO：176)；
KGCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-19)(SEQ ID NO：177)；
GCFGLKLDRIGSMSGLGC(CNP-18)(SEQ ID NO：178)；
QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP37(M32N)](SEQ ID NO：181)；
PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-CNP37)(SEQ ID NO：186)；
MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-CNP37)(SEQ ID NO：191)；
GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Gly-CNP37)(SEQ ID NO：75)；
GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[Gly-CNP37(M32N)](SEQ ID NO：181)； 
PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-Gly-CNP37)(SEQ ID NO：145)；
MGQEHPNARKYKGANKKGL SKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-Gly-CNP37)(SEQ ID NO：191)；
GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(HSA-CNP27)(SEQ ID NO：144)；
GHKSEVAHRFKGANKKGL SKGCFGLKLDRIGSNSGLGC[HSA-CNP27(M22N)](SEQ ID NO：183)；
PGHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Pro-HSA-CNP27)(SEQ ID NO：188)；
MGHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC(Met-HSA-CNP27)(SEQ ID NO：193)；
GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO：36)；
GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC[CNP27(K4，5，9R，M22N)](SEQ ID NO：184)；
PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Pro-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO：189)；
MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[Met-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO：194)；
PEG1K-CNP22(SEQ ID NO：1)；
PEO12-CNP22(SEQ ID NO：1)；
PEO24-CNP22(SEQ ID NO：1)；
PEO12-R-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：41)；
PEO24-R-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：41)；
PEO12-ER-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：39)；
PEO24-ER-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：39)；
PEO12-GANPR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：37)；
PEO24-GANPR-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：37)； 
PEO12-GANQQ-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：69)；
PEO24-GANQQ-CNP22(K4R)(SEQ ID NO：69)；
PEG1K-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PEG1K-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO：36)；
PEG1K-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC[PEG1K-CNP27(K4，5，9R，M22N)](SEQ ID NO：184)；
PEG1K-PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PEG1K-Pro-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO：189)；
PEG1K-MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PEG1K-Met-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO：194)；
PEO12-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PEO12-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO：36)；
PEO12-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC[PEO12-CNP27(K4，5，9R，M22N)](SEQ ID NO：184)；
PEO12-PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PEO12-Pro-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO：189)；
PEO12-MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PEO12-Met-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO：194)；
PEO24-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PEO24-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO：36)；
PEO24-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC[PEO24-CNP27(K4，5，9R，M22N)](SEQ ID NO：184)；
PEO24-PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PEO24-Pro-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO：189)；及
PEO24-MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC[PEO24-Met-CNP27(K4，5，9R)](SEQ ID NO：194)。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述CNP肽或变体不是CNP-22或CNP-53。 
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