DE4039656A1 - Arzneimittel, enthaltend das humane parathormon-fragment (1-37) in der form des amids oder ethylamids als aktiven wirkstoff - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Arzneimittel, welche als aktiven Wirkstoff das aminoterminale Fragment 1-37 des humanen Parathyreoidhormons (hPTH 1-37) in der Form des Amids oder Ethylamids enthalten.

Humanes Parathormon (hPTH), das Hormon der Nebenschilddrüsen, stellt ein wichtiges therapeutisches Hilfsmittel, z. B. für die Behandlung der Osteoporose und des Hypoparathyreoidismus, dar.

Die Osteoporose (verminderte Knochenmasse) (Riggs und Melton, N. Engl. J. Med. 314, 1676-1686 (1986)) ist eine häufige Krankheit, von der vor allem Frauen in der Menopause und ältere Menschen betroffen sind. Die Betroffenen neigen je nach Ausprägung zu Frakturen im Bereich der Wirbelsäule, der Unterarme oder Oberschenkel, Schmerzen bis zur völligen Unbeweglichkeit, bei Verlust der Arbeitsfähigkeit und sozialer Kontakte sowie einem höheren Sterblichkeitsrisiko. Eine Heilung gilt derzeit als kaum möglich (Consensus Delepment Conference: Prophylaxis and Treatment of Osteoporosis 1987).

Tierexperimentelle Untersuchungen (Selye, Endocrinology, 16, 547-558 (1932); Kalu et al., Lancet 1363-1366 (1970); Hefti et al., Clin. Science 62, 389-396 (1982); Tam et al., Endocrinology 110, 506-512 (1982); Podbesek et al., Endocrinology 112, 1000-1006 (1983); Gunness-Hey und Hock, Metab. Bone Dis. & Res. 5, 177-181 (1984)) sowie neuere histomorphometrische Befunde beim primären Hyperparathyreoidismus (Delling et al., Klin. Wochenschr. 65, 643-653 (1987)) legen die Vermutung nahe, daß durch eine Behandlung mit PTH eine Zunahme der Knochenmasse erzielt werden kann. Reeve et al. (Br. Med. J., 1340-1344 (1980)) erreichten bei Patienten mit Osteoporose durch täglich verabreichte kleine Dosen von PTH tatsächlich eine Verbesserung der trabekulären Knochen­ struktur bei jedoch leicht abnehmender corticaler Knochenmasse.

Neuere Befunde sprechen dafür, daß PTH bei zusätzlicher Verabrei­ chung von knochenaktiven Substanzen, wie z. B. 1,25-Vitamin-D₃ (Slovik et al., Miner. Res. 1, 377-381 (1986)), Calcitonin (Hesch et al., Calcif. Tissue Int. 44, 176-180 (1989)) oder Östrogen (Reeve et al., Proceedings of the 5th International Congress on Bone Morphometry Niigata, 24.-29.7.1988), die Knochenmasse der Spongiosa ohne Corticalis-Verlust erhöht.

Der Hypoparathyreoidismus (PTH-Mangel) (Kruse, Monatsschr. Kinderheilkunde 136, 652-666 (1988)) tritt entweder congenital oder als Folge einer Operation oder von Bestrahlungen im Halsbereich auf und führt zu einer erniedrigten Calcium-Kon­ zentration im Blut. Die Patienten neigen zu Krampfanfällen. Besteht der PTH-Mangel bereits im Kindesalter, drohen langfristig verminderte geistige Entwicklung und eine defekte Zahn- und Knochenentwicklung. Eine Therapie mit Calcium- und/oder Vitamin- D-Präparaten normalisiert zwar bei den meisten Patienten die Calcium-Konzentration im Serum, ist jedoch mit einem erhöhten Risiko von Nierenschädigungen verbunden. Dieses Risiko einer medikamentösen Behandlung kann durch eine Hormonsubstitutions­ therapie mit PTH vermieden werden.

Schließlich hat sich in jüngster Zeit gezeigt, daß das Parathy­ reoidhormon Blutdruck senkende Wirksamkeit aufweist (Nickols, Blood vessels 24, 120-124 (1987)).

Sowohl bei der Behandlung von Osteoporose und Hypertonus als auch bei der Hormonsubstitution bei Hypoparathyreoidismus muß das PTH regelmäßig über einen langen Zeitraum, gegebenenfalls lebenslang, verabreicht werden. Das verwendete PTH muß deshalb frei von Verunreinigungen sein und darf nicht die Bildung von Antikörpern hervorrufen. Diesen Anforderungen kann am wirksamsten durch chemisch synthetisierte Peptide mit der Aminosäuresequenz des menschlichen PTH entsprochen werden. Das sezernierte PTH-Molekül besteht aus 84 Aminosäuren. Peptide dieser Größenordnung sind einer chemischen Synthese jedoch nur schwer zugänglich.

Bisher sind zwei verschiedene Peptide mit den aminoterminalen Teilsequenzen des humanen PTH - das hPTH (1-34) und das hPTH (1-38)- synthetisiert worden. Bei der klinischen Erprobung im Rahmen einer Einmalinjektion für eine diagnostische Anwendung zeigten sich sowohl bei hPTH (1-34) (Mallette et al., J. Clin. Endocrin. Metab. 67, 964-972 (1988)) als auch bei hPTH (1-38) (Kruse und Kracht, Eur. J. Pediatr 146, 373-377 (1987)) die aufgrund früherer Erfahrungen mit extraktiv gewonnenem Rinder-PTH erwarteten kurzfristigen Effekte, d. h. vorübergehende Stimulation der Ausscheidung von Phosphat und cyclischen Adenosinmonophosphat (cAMP) im Urin und vorübergehende Erhöhung der cAMP-Konzentration im Plasma.

Bei der therapeutischen Erprobung dieser Peptide bei einer kleinen Anzahl von Osteoporose-Patienten konnten sowohl mit hPTH (1-34) (Reeve et al., Proceedings of the 5th International Congress on Bone Morphometry, Niigata, 24-29.7.1988) als auch mit hPTH (1-38) (Hesch et al., Calcif. Tissue Int. 44, 176-180 (1989)) gewisse Erfolge erzielt werden.

Nachteilig an den bisher für die klinische Anwendung verfügbaren PTH-Fragmenten ist jedoch, daß sie in einigen Patienten die Bildung von Antikörpern hervorrufen, welche die Wirkung der exogen zugeführten Fragmente oder sogar des körpereigenen PTH aufheben können (vgl. beispielsweise für hPTH (1-34), Audran et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 64, 937-943 (1987) und für hPTH (1-38) Stögmann et al., Monatsschr. Kinderheilk. 136, (Heft 8) Abstr. 107 (1988)).

Vor etwa 20 Jahren wiesen Berson und Yalow (J. Clin. Endocrinol. Metab. 28, 1037-1047 (1968)) nach, daß verschiedene PTH-Fragmente im menschlichen Plasma vorkommen, die entweder durch raschen peripheren Abbau des Gesamtmoleküls oder aber durch Sekretion von PTH-Fragmenten entstanden sein konnten. Es zeigte sich, daß die in der Zirkulation mengenmäßig überwiegenden Produkte des peripheren PTH-Metabolismus große carboxylterminale PTH-Fragmente ohne biologische Aktivität sind, die in der Leber gebildet werden (beispielsweise D′Amour und Huet, Am. J. Physiol. 246, E249-255 (1984)). Aufgrund der vorliegenden Untersuchungsergebnisse wurde angenommen, daß bei intakter Nierenfunktion das hPTH (1-84) die dominierende biologisch aktive PTH-Form ist. Bei eingeschränkter Nierenfunktion trat hingegen in fraktioniertem Plasma der jeweiligen Patienten in der Elutionsposition des hPTH (1-34) ein deutlicher Gipfel in Erscheinung (vgl. Grunbaum et al., Am. J. physiolol. 247, E442-448 (1984)).

Die Existenz eines biologisch aktiven, im menschlichen Plasma gesunder Patienten zirkulierenden PTH-Fragments konnte bisher nicht nachgewiesen werden.

Es ist daher verschiedentlich versucht worden, den endogenen Abbau des PTH durch in vitro Untersuchungen zu simulieren, um auf diese Weise Rückschlüsse auf primäre Spaltstellen in dem Gesamtmolekül zu ziehen. In diesem Zusammenhang wurde nahezu jede Position zwischen den Aminosäuren Nr. 5 und Nr. 43 des aminoter­ minalen Endes in Betracht gezogen (vgl. beispielsweise Barling et al. Int. J. Biochem. 16 815-821 (1984)). Unter anderem führten Zull und Chuang (J. Biol. Chem. 260, 1608-1613 (1985)) Untersuchungen mit bovinem PTH und Cathepsin D durch. Sie konnten nachweisen, daß bei der enzymatischen Spaltung von Rinder-PTH mit dem aus Rindermilz stammenden Enzym die carboxylterminalen Fragmente 35-84 und 38-84 sowie die komplementären aminoter­ minalen Fragmente 1-34 und 1-37 gebildet werden. Die letztgenann­ ten Fragmente erwiesen sich bei in vitro Untersuchungen mit Nierenmembranen aus Ratte und Rind als biologisch aktiv, wobei jedoch das Fragment 1-37 nur in sehr geringen Mengen nachweisbar war und schnell zu 1-34 hydrolysiert wurde. Die Autoren schlossen daraus, daß das Endsprodukt des enzymatischen Abbaus von PTH durch Cathepsin D beim Rind das Fragment 1-34 ist. Demgegenüber bezweifelten andere Autoren, daß in vivo überhaupt aminoterminale PTH-Fragmente im Plasma erscheinen (vgl. beispielsweise Goltzman et al., J. Clin. Invest. 65, 1309-1317 (1980)). So konnten bei normalen Ratten keine durch peripheren Abbau gebildeten, biologisch aktiven, aminoterminalen PTH-Fragmente nachgewiesen werden; Brunkhurst et al.(Am. J. Physiol. 255, E886-E893) und MacGregor (J. Biol. Chem. 261, 1929-1934 (1986)) fanden, daß bovine Nebenschilddrüsen in Kultur keine biologisch aktiven, aminoterminalen PTH-Fragmente sezernieren.

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein gut zugängliches Arzneimittel mit der biologischen und therapeutischen Aktivität von natürlichem Parathormon (PTH) zu schaffen, welches gegenüber den bekannten PTH-Fragmenten (1-34) und (1-38) höhere pharmazeu­ tische Wirksamkeit aufweist, und zusätzlich deren Nachteile, insbesondere die Induktion der Antikörperbildung weitgehend ver­ meidet.

Zur Lösung der Aufgabe wird das Arzneimittel gemäß Anspruch 1 vorgeschlagen, welches das aminoterminale PTH-Fragment 1-37 in der Form des Amids oder des Ethylamids als aktiven Wirkstoff enthält.

Erfindungsgemäß hat es sich überraschenderweise gezeigt, daß das PTH-Fragment 1-37 in der Form des Amids oder Ethylamids eine starke biologische Wirksamkeit aufweist und gleichzeitig im Vergleich zu den bekannten PTH-Fragementen eine erhöhte Stabili­ tät gegenüber Proteasen besitzt.

Die jeweiligen Verbindungen wurden synthetisiert (vgl. Beispiele 1 und 2) und als Arzneimittel zubereitet. In diesem Zusammenhang können die erfindungsgemäßen Peptide als Arzneimittel in verschiedener galenischer Zubereitungsform dem Körper zugeführt werden, wie beispielsweise mittels geeigneter Nasensprays zusammen mit Stabilisatoren bzw. Resorptionsförderern, z. B. Laurylether oder Glykocholat oder als Mittel für die parenterale Applikation zusammen mit üblichen Träger- und Hilfsstoffen. Beispielsweise kann eine Lyophilisat-Ampulle zur s.c. oder i.m. Applikation 40 µg PTH (1-37) Amid oder Ethylamid zusammen mit 2 mg Mannit enthalten.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen hPTH-(1-37)-amid und -ethyl­ amid eignen sich in besonderer Weise als Langzeittherapeutikum bei Hypoparathyreoidismus und Osteoporose, da sie über ausge­ zeichnete biologische Wirksamkeit verfügen und sehr gut ver­ träglich sind. Das erfindungsgemäße Präparat ist ferner als Blutdruck stabilisierendes Mittel und insbesondere zur Langzeit­ bzw. Dauerbehandlung bei Hypertonus geeignet.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen erläutert.

Beispiel 1 Synthese von hPTH-(1-37)-amid

Das Peptid mit der Formel

wurde unter Verwendung der nachfolgend in Tabelle 1 angege­ benen Derivate im Durchflußverfahren (Atherton und Sheppard, Solid phase synthesis. IRL Press (1989)) auf 580 mg (0,2 mM) Träger aufgebaut.

Tabelle I

Fmoc-Ala-OH
Fmoc-Asp(OBut)-OH
Fmoc-Met-OH
Fmoc-Glu(OBut)-OH
Fmoc-His(Trt)-OH
Fmoc-Leu-OH
Fmoc-Arg(Pmc)-OH
Fmoc-Trp-OH
Fmoc-Lys(BOC)-OH
Fmoc-Ile-OH
Fmoc-Phe-OH
Fmoc-Gly-OH
Fmoc-Asn(Trt)-OH
Fmoc-Gln(Trt)-OH
Fmoc-Val-OH
Fmoc-Ser(But)-OH

Als Träger wurde NovaSyn PA 500 mit p-[(R,s)-α-[1-(9H-Fluoren-9- yl)-methoxyformamido]-2,4-dimethoxybenzyl]-phenoxyacetylsäure funktionalisiert und mit einer Beladung von 0,34 mM/g eingesetzt.

(Die Verwendung des vorgenannten Amid-Linkers führt bei der Abspaltung vom Harz zur Bildung einer C-terminalen Amidgruppe). Der Überschuß an aktivierter Aminosäure betrug 3 Äquivalente, die Zeit für die Kupplung 40 Minuten und die der Deprotektion 10 Minuten.

Es wurden 880 mg Träger-gebundenes, voll geschütztes Peptid erhalten.

Das Peptid wurde mit einer Mischung aus 95% Trifluoressigsäure und 5% Ethandithiol im Verlauf von 1 Stunde bei Raumtemperatur vom Träger gespalten.

Das Peptid wurde anschließend mit HPCL gereinigt und durch Aminosäureanalyse, analytische HPLC und Aminosäuresequenzanalyse charakterisiert.

Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

Molekulargewicht:
4399 D (bestimmt durch FAB-MS)
Peptidgehalt:	77,5% (±2%)
Peptidreinheit:	<98%
Menge:	20,5 mg
Aussehen:	weißes Pulver

Aminosäureanalyse, gefundende Werte (theoretische Werte)

Beispiel 2 Synthese von hPTH-(1-37)-ethylamid

Das Peptid mit der Formel

wurde unter Verwendung der nachfolgend in Tabelle 1 angegebenen Derivate durch Festphasensynthese auf Polystyrol im Batch- Verfahren aufgebaut. Als Träger wurde Fmoc-Leu-Marrifield-Resin in einer Menge von 0,4 g (0,22 mM) mit einer Beladung von 0,53 mM/g eingesetzt. Der Überschuß an aktivierter Aminosäure betrug 4 Äquivalente, die Zeit für die Kupplung 30 Minuten und die der Deprotektion 10 Minuten.

Es wurden 680 mg Träger-gebundenes, voll geschütztes Peptid erhalten.

Das Peptid wurde mit Ethylamin über einen Zeitraum von 3 Tagen vom Träger gespalten und diese Spaltung führte zur Bildung des Ethylamids.

Die Schutzgruppen wurden mit einer Mischung aus 95% Trifluor­ essigsäure und 5% Ethandithiol über einen Zeitraum von 1 Stunde bei Raumtemperatur abgespalten.

Das Peptid wurde mit HPLC gereinigt und anschließend durch Aminosäureanalyse, analytische HPLC und Aminosäuresequenzanalyse charakterisiert.

Es wurden die nachfolgend angegebenen Daten erhalten:

Molekulargewicht:|4427,4 D
Peptidgehalt:	83,2% (±2%)
Peptidreinheit:	70%
Menge:	1,5 mg
Aussehen:	weißes Pulver

Aminosäureanalyse, gefundende Werte (theoretische Werte)

Beispiel 3 Biologische Wirksamkeit von PTH-Analoga Methodik 1. Zellinien

Es wurden Osteosarkomzellen, z. B. ROS 17.28 und menschliche Osteoblasten - ähnliche Zellen (osteoblast-like - cells) verwendet.

2. Humane Knochenzellen

Zur Kultivierung von menschlichen Knochenzellen wurden Knochen von Patienten beiderlei Geschlechts verwendet. Die Knochen wurden bei orthopädischen Operationen entnommen.

2.1 Aufarbeitung des Knochengewebes

Unter feuchter Konservierung mit isotoner Kochsalzlösung wurde die Spongiosa aus dem Knochen gebrochen, zerkleinert und von Blutzellen, Fett und Bindegewebe befreit. Die Schritte der Zerkleinerung und Spülung wurden so lange wiederholt, bis elfenbeinartiges Spongiosamaterial übrig blieb (1).

2.2 Knochenpellprimärkulturen

Die gereinigten Knochenstückchen wurden entweder direkt oder nach weiterer Behandlung mit Kollagenase zur Zellzucht verwendet. Die eingesetzten Methoden zur Kultivierung menschlicher Knochenzellen stimmen mit den in der Literatur beschriebenen Verfahren überein (2-4). Die Knochenzellen wurden aus den Knochenpartikelchen in Eagle′s Minimum Essential Medium (EMM), dem 20% fötales Kälberserum bei­ gegeben war, in Primaria-Petrischalen gezüchtet.

Sobald die Schalen das Stadium der Konfluenz erreicht hatten, wurden sie trypsinisiert und in neue Kulturschalen umgesetzt (Passage 1).

Für die Stimulierung des cAMP durch PTH-Analoga wurden ausschließlich Knochenzellen der 1. Passage verwendet. Bei den kultivierten Zellen handelte es sich um "osteoblast­ like-cells", welche u. a. dadurch charakterisiert sind, daß sie alkalische Phosphatase enthalten und unter Stimulation mit 1,25-Dihydroxycholecalciferol Osteocalcin bilden.

2.3 Inkubation von Zellen mit PTH-Analoga und Bestimmung der cAMP Bildung

24 Stunden vor Beginn des Stimulationsversuches wurde das Medium abgesaugt, die Zellen wurden gewaschen und durch neues serumfreies Medium ersetzt. An Versuchstag wurde das Medium erneut abgesaugt, die Zellen wurden wiederum gewa­ schen und mit Isobutylmethylxanthin (IBMX) vorinkubiert. Danach erfolgte die Inkubation der Zellen mit den erfin­ dungsgemäßen PTH-Analoga, die in ansteigenden Konzentratio­ nen (10^-9 -10^-6M) dem Nährmedium (EMM, das 1 mM IBMX sowie 0,5% bovines Serum Albumin enthält) zugegeben werden. Nach Extraktion des cAMP wird dieses in Proben und Kontrollen mit dem "RIANEN cAMP-Kit" radioimmunologisch bestimmt.

Die erfindungsgemäßen Peptide zeigten stimulierende Wirkung auf die oben angegebenen Knochenzellkulturen, d. h., sie führten zu einer Stimulation des cAMP.

Claims (4)

1. Arzneimittel, enthaltend das humane, aminoterminale Parathy­ reoidhormon-Fragment (1-37) in Form des Amids oder Ethyla­ mids als aktiven Wirkstoff.

2. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 1 zur Behandlung von Hypoparathyreoidismus.

3. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 1 zur Behandlung von Osteoporose.

4. Verwendung des Arzneimittels nach Anspruch 1 zur Behandlung des Hypertonus.