WO1992010515A1 - Derivate des humanen parathormon-fragments (1-37) in der form des amids oder ethylamids als aktiven wirkstoff - Google Patents

Derivate des humanen parathormon-fragments (1-37) in der form des amids oder ethylamids als aktiven wirkstoff Download PDF

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WO1992010515A1
WO1992010515A1 PCT/EP1991/002367 EP9102367W WO9210515A1 WO 1992010515 A1 WO1992010515 A1 WO 1992010515A1 EP 9102367 W EP9102367 W EP 9102367W WO 9210515 A1 WO9210515 A1 WO 9210515A1
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parathyroid hormone
fragment
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PCT/EP1991/002367
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Victor Brantl
Rüdiger Pipkorn
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Pharma Bissendorf Peptide Gmbh
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/635—Parathyroid hormone, i.e. parathormone; Parathyroid hormone-related peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention relates to derivatives of the human parathyroid hormone fragment (1-37) in the form of the amide or alkyl-substituted amide, and to medicaments obtainable therefrom.
  • Human parathyroid hormone (hPTH), the hormone of the parathyroid glands, is an important therapeutic aid, e.g. for the treatment of osteoporosis and hypoparathyroidism.
  • Osteoporosis (reduced bone mass) (Riggs and Melton, N. Engl. J. Med. 314., 1676-1686 (1986)) is a common disease that affects menopausal women and the elderly in particular. Depending on their severity, those affected tend to fractures in the spine, forearms or thighs, pain to complete immobility, loss of ability to work and social contacts as well as a higher risk of mortality. A cure is currently considered hardly possible (Consensus Delepment Conference: Prophylaxis and Treatment of Osteoporosis 1987).
  • PTH deficiency Hypoparathyroidism (PTH deficiency) (Kruse, Weinschr. Kinderheilados 136, 652-666 (1988)) occurs either congenitally or as a result of surgery or radiation in the neck area and leads to a reduced calcium concentration in the blood . Patients are prone to seizures. If the PTH deficiency already exists in childhood, there is a long-term risk of reduced mental development and defective tooth and bone development. Therapy with calcium and / or vitamin D preparations normalizes the calcium concentration in the serum in most patients, but is associated with an increased risk of kidney damage. This risk of drug treatment can be avoided by hormone replacement therapy with PTH.
  • the PTH Both in the treatment of osteoporosis and hypertension and in the hormone substitution in hypoparathyroidism, the PTH must be administered regularly over a long period of time, possibly for life.
  • the PTH used must therefore be free of impurities and not that Cause formation of antibodies. These requirements can be most effectively met by chemically synthesized peptides with the amino acid sequence of human PTH.
  • the secreted PTH molecule consists of 84 amino acids. However, peptides of this size are difficult to access for chemical synthesis.
  • hPTH (1-34) (Reeve et al., Proceedings of the 5th International Congress on Bone Morphometry, Niigata, 24-29.7.1988) could be used as well certain results can also be achieved with hPTH (1-38) (Hesch et al., Calcif. Tissue Int. 4., 176-180 (1989)).
  • PTH fragments available hitherto for clinical use are those that in some patients they produce the formation of antibodies which can cancel out the effect of the exogenously supplied fragments or even the body's own PTH [cf. for example for hPTH (1-34), Audran et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 64.. 937-943 (1987) and for hPTH (1-38) Stögmann et al., Monthly. Children's healing 136. (Issue 8) Abstr. 107 (1988)]. About 20 years ago, Berson and Yalow (J. Clin. Endo-crinol. Metab.
  • PTH natural parathyroid hormone
  • the derivatives of human parathormone (1-37) are proposed according to the formula below, which are present in the form of a substituted or unsubstituted amide as an active ingredient.
  • the derivatives of human parathyroid hormone (1-37) according to the invention are represented by the following formula.
  • R 3 and R4 each independently of one another are hydrogen or a substituted or unsubstituted hydrocarbon.
  • the radicals R 3 or R4 are preferably hydrogen or, in each case independently of one another, an identical or different aliphatic hydrocarbon having 1 to 8 carbon atoms.
  • the residues R 1 and R2 can each
  • the PTH fragments 1-37 according to the invention in the form of the amide or substituted amide have a different biological activity and, at the same time, have an increased stability towards proteases compared to the known PTH fragments.
  • the peptides according to the invention can be supplied to the body as pharmaceuticals in various galenical preparation forms, such as, for example, by means of suitable nasal sprays together with stabilizers or absorption promoters, e.g. Lauryl ether or glycocholate or as an agent for parenteral administration together with conventional carriers and auxiliaries.
  • suitable nasal sprays together with stabilizers or absorption promoters, e.g. Lauryl ether or glycocholate or as an agent for parenteral administration together with conventional carriers and auxiliaries.
  • a lyophilisate ampoule for s.c. or i.m. Application contain 40 ⁇ g PTH (1-37) amide or ethyl amide together with 2 mg mannitol.
  • R 1 methionine or norleucine
  • R2 methionine or norleucine
  • N-substituted or unsubstituted amide derivatives of hPTH- (1-37) according to the invention are particularly suitable as long-term therapeutic agents for hypoparathyroidism and osteoporosis, since they have excellent biological effectiveness and are very well tolerated.
  • the preparation according to the invention is also suitable as a blood pressure stabilizing agent and is particularly suitable for long-term or long-term treatment for hypertension.
  • NovaSyn PA 500 was functionalized with p- [(R, S) - ⁇ - [l- (9H-fluoren-9-yl) methoxyformamido] -2,4-dimethoxybenzyl] phenoxyacetic acid and loaded with 0.34 mM / g used.
  • the peptide was cleaved from the support with a mixture of 95% trifluoroacetic acid and 5% ethanedithiol over a period of 1 hour at room temperature. The peptide was then purified with HPCL and characterized by amino acid analysis, analytical HPLC and amino acid sequence analysis.
  • Val-His-Asn-Phe-Val-Ala-Leu-NHC 2H o .. was under. "Constructed using the following angege ⁇ in Table 1 surrounded derivatives by solid phase synthesis on 'polystyrene in a batch process.
  • the support was Fmoc-Leu-marri field-resin with in an amount of 0.4 g (0.22 mM) a loading of 0.53 mM / g, the excess of activated amino acid was 4 equivalents, the time for the coupling 30 minutes and that for the deprotection 10 minutes.
  • the peptide was cleaved from the support with ethylamine over a period of 3 days and this cleavage resulted in the formation of the ethyl amide.
  • the protective groups were removed with a mixture of 95% trifluoroacetic acid and 5% ethanedithiol over a period of 1 hour at room temperature.
  • the peptide was purified by HPLC and then characterized by amino acid analysis, analytical HPLC and amino acid sequence analysis.
  • Osteosarcoma cells e.g. ROS 17.28 and human osteoblast-like cells (osteoblast-like - cells) were used.
  • Bones from patients of both sexes were used to cultivate human bone cells. The bones were removed during orthopedic surgery.
  • the cleaned pieces of bone were used either directly or after further treatment with collagenase for cell growth.
  • the methods used to cultivate human bone cells correspond to the methods described in the literature (2-4).
  • the bone cells were grown from the bone particles in Eagle's Minimum Essential Medium (EMM), to which 20% fetal calf serum was added, in Primaria petri dishes.
  • EMM Eagle's Minimum Essential Medium
  • the cultivated cells were "osteoblast-like cells", which among other things. are characterized in that they contain alkaline phosphatase and form osteocalcin when stimulated with 1,25-dihydroxycholecalciferol.
  • the medium was aspirated 24 hours before the start of the stimulation experiment, the cells were washed and replaced with new serum-free medium. On the day of the experiment, the medium was suctioned off again, the cells were again washed and preincubated with isobutylmethylxanthine (IBMX). The cells were then incubated with the PTH analogs according to the invention, which were added to the nutrient medium (EMM, which contains 1 mM IBMX and 0.5% bovine serum albumin) in increasing concentrations (10-9-10-6M) become. After the cAMP has been extracted, it is radioimmunologically determined in samples and controls using the "RIANEN cAMP kit". The peptides according to the invention had a stimulating effect on the above-mentioned bone cell cultures, ie they stimulated the cAMP.
  • EMM nutrient medium
  • bovine serum albumin bovine serum albumin

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Abstract

Die Erfindung betrifft Derivate des humanen Parathormonfragments (1-37) der nachstehend wiedergegebenen Formel: Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-R1-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-R2-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-Val-Ala-Leu-NR3R4, wobei R1, R2 Met und/oder Norleucin ist und R?3 und R4¿ jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff oder einen substituierten oder unsubstituierten Kohlenwasserstoff bedeuten. Die erfindungsgemäßen Derivate sind als Arzneimittel einsetzbar zur Behandlung von Hypoparathyreoidismus, Osteoporose und Hypertonus.

Description

Derivate des humanen Parathormon-Fracπnents (1-37) in der Form des Amids oder Ethylamids als aktiven Wirkstoff
Die Erfindung betrifft Derivate des humanen Parathormon-Frag¬ ments (1-37) in Form des Amids oder alkylsubstituierten Amids, sowie daraus erhältliche Arzneimittel.
Humanes Parathormon (hPTH) , das Hormon der Nebenschilddrüsen, stellt ein wichtiges therapeutisches Hilfsmittel, z.B. für die Behandlung der Osteoporose und des Hypoparathyreoidismus, dar.
Die Osteoporose (verminderte Knochenmasse) (Riggs und Melton, N. Engl. J. Med. 314., 1676-1686 (1986)) ist eine häufige Krankheit, von der vor allem Frauen in der Menopause und ältere Menschen betroffen sind. Die Betroffenen neigen je nach Ausprägung zu Frakturen im Bereich der Wirbelsäule, der Unterarme oder Oberschenkel, Schmerzen bis zur völligen Unbe- weglichkeit, bei Verlust der Arbeitsfähigkeit und sozialer Kontakte sowie einem höheren Sterblichkeitsrisiko. Eine Heilung gilt derzeit als kaum möglich (Consensus Delepment Conference: Prophylaxis and Treatment of Osteoporosis 1987) .
Tierexperimentelle Untersuchungen (Selye, Endocrinology, 16, 547- 558 (1932); Kalu et al., Lancet 1363-1366 (1970); Hefti et al., Clin. Science £2,, -389-396 (1982); Tarn et al., Endo¬ crinology lio, 506-512 (1982); Podbesek et al., Endocrinology 112. 1000-1006 (1983); Gunness-Hey und Hock, Metab. Bone Dis. & Res. 5, 177-181 (1984)) sowie neuere histomorphome- trische Befunde beim primären Hyperparathyreoidismus (Delling et al., Klin. Wochenschr. £5, 643-653 (1987)) legen die Ver¬ mutung nahe, daß durch eine Behandlung mit PTH eine Zunahme der Knochenmasse erzielt werden kann. Reeve et al. (Br. Med. J., 1340-1344 (1980)) erreichten bei Patienten mit Osteo¬ porose durch täglich verabreichte kleine Dosen von PTH tat- sächlich eine Verbesserung der trabekulären Knochenstruktur bei jedoch leicht abnehmender corticaler Knochenmasse.
Neuere Befunde sprechen dafür, daß PTH bei zusätzlicher Ver¬ abreichung von knochenaktiven Substanzen, wie z.B. 1,25- Vitamin-D3 (Slovik et al.. Miner. Res. 1, 377-381 (1986)), Calcitonin (Hesch et al., Calcif. Tissue Int. 44., 176-180 (1989)) oder östrogen (Reeve et al., Proceedings of the 5th International Congress on Bone Morphometry Niigata, 24.-29.7.1988), die Knochenmasse der Spongiosa ohne Corti- calis-Verlust erhöht.
Der Hypoparathyreoidismus (PTH-Mangel) (Kruse, Monatsschr. Kinderheilkunde 136, 652-666 (1988)) tritt entweder congeni- tal oder als Folge einer Operation oder von Bestrahlungen im Halsbereich auf und führt zu einer erniedrigten Calcium-Kon- zentration im Blut. Die Patienten neigen zu Krampfanfällen. Besteht der PTH-Mangel bereits im Kindesalter, drohen lang¬ fristig verminderte geistige Entwicklung und eine defekte Zahn- und Knochenentwicklung. Eine Therapie mit Calcium- und/oder Vitamin- D-Präparaten normalisiert zwar bei den meisten Patienten die Calcium-Konzentration im Serum, - ist jedoch mit einem erhöhten Risiko von Nierenschädigungen ver¬ bunden. Dieses Risiko einer medikamentösen Behandlung kann durch eine Hormonsubstitutionstherapie mit PTH vermieden werden.
Schließlich hat sich in jüngster Zeit gezeigt, daß das Parat- hyreoidhormon Blutdruck senkende Wirksamkeit aufweist (Nickols, Blood vessels 24., 120-124 (1987)).
Sowohl bei der Behandlung von Osteoporose und Hypertonus als auch bei der Hormonsubstitution bei Hypoparathyreoidismus muß das PTH regelmäßig über einen langen Zeitraum, gegebenen¬ falls lebenslang, verabreicht werden. Das verwendete PTH muß deshalb frei von Verunreinigungen sein und darf nicht die Bildung von Antikörpern hervorrufen. Diesen Anforderungen kann am wirksamsten durch chemisch synthetisierte Peptide mit der Aminosäuresequenz des menschlichen PTH entsprochen werden. Das sezernierte PTH-Molekül besteht aus 84 Amino¬ säuren. Peptide dieser Größenordnung sind einer chemischen Synthese jedoch nur schwer zugänglich.
Bisher sind zwei verschiedene Peptide mit den aminoterminalen Teilsequenzen des humanen PTH - das hPTH (1-34) und das hPTH (1- 38)-synthetisiert worden. Bei der klinischen Erprobung im Rahmen einer Einmalinjektion für eine diagnostische An¬ wendung zeigten sich sowohl bei hPTH (1-34) (Mallette et al., J. Clin. Endocrin. Metab. 61_, 964-972 (1988)) als auch bei hPTH (1-38) (Kruse und Kracht, Eur. J. Pediatr 146, 373-377 (1987)) die aufgrund früherer Erfahrungen mit extraktiv gewonnenem Rinder-PTH erwarteten kurzfristigen Effekte, d.h. vorübergehende Stimulation der Ausscheidung von Phosphat und cyclischen Adenosinmonophosphat (cAMP) im Urin und vorübergehende Erhöhung der cAMP-Konzentration im Plasma.
Bei der therapeutischen Erprobung dieser Peptide bei einer kleinen Anzahl von Osteoporose-Patienten konnten sowohl mit hPTH (1-34) (Reeve et al., Proceedings of the 5th Internatio¬ nal Congress on Bone Morphometry, Niigata, 24-29.7.1988) als auch mit hPTH (1-38) (Hesch et al., Calcif. Tissue Int. 4., 176-180 (1989)) gewisse Erfolge erzielt werden.
Nachteilig an den bisher für die klinische Anwendung verfüg¬ baren PTH-Fragmenten ist jedoch, daß sie in einigen Patienten die Bildung von Antikörpern hervorrufen, welche die Wirkung der exogen zugeführten Fragmente oder sogar des körpereigenen PTH aufheben können [vgl. beispielsweise für hPTH (1-34), Audran et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 64.. 937-943 (1987) und für hPTH (1-38) Stögmann et al., Monatsschr. Kinderheilk. 136. (Heft 8) Abstr. 107 (1988)]. Vor etwa 20 Jahren wiesen Berson und Yalow (J. Clin. Endo- crinol. Metab. 2_8, 1037-1047 (1968)) nach, daß verschiedene PTH-Fragmente im menschlichen Plasma vorkommen, die entweder durch raschen peripheren Abbau des Gesamtmoleküls oder aber durch Sekretion von PTH-Fragmenten entstanden sein konnten. Es zeigte sich, daß die in der Zirkulation mengenmäßig über¬ wiegenden Produkte des peripheren PTH-Metabolis us große carboxylterminale PTH-Fragmente ohne biologische Aktivität sind, die in der Leber gebildet werden (beispielsweise D'Amour und Huet, Am. J. Physiol. 246. E249-255 (1984)). Aufgrund der vorliegenden Untersuchungsergebnisse wurde ange¬ nommen, daß bei intakter Nierenfunktion das hPTH (1-84) die dominierende biologisch aktive PTH-Form ist. Bei einge¬ schränkter Nierenfunktion trat hingegen in fraktioniertem Plasma der jeweiligen Patienten in der Elutionsposition des hPTH (1-34) ein deutlicher Gipfel in Erscheinung (vgl. Grunbaum et al. , Am. J. Physiolol. 247. E442-448 (1984)).
Die Existenz eines biologisch aktiven, im menschlichen Plasma gesunder Patienten zirkulierenden PTH-Fragments konnte bisher nicht nachgewiesen werden.
Es ist daher verschiedentlich versucht worden, den endogenen Abbau des PTH durch in vitro Untersuchungen zu simulieren, um auf diese Weise Rückschlüsse auf primäre Spaltstellen in dem Gesamtmolekül zu ziehen. In diesem Zusammenhang wurde nahezu jede Position zwischen den Aminosäuren Nr. 5 und Nr. 43 des aminoterminaleri Endes in Betracht gezogen (vgl. bei¬ spielsweise Barling et al. , Int. J. Biochem. , .16., 815-821 (1984)). Unter anderem führten Zull und Chuang (J. Biol. Chem. 260, 1608-1613 (1985)) Untersuchungen mit bovinem PTH und Cathepsin D durch. Sie konnten nachweisen, daß bei der enzymatischen Spaltung von Rinder-PTH mit dem aus Rindermilz stammenden Enzym die carboxylterminalen Fragmente 35-84 und 38-84 sowie die komplementären aminoterminalen Fragmente 1-34 und 1-37 gebildet werden. Die letztgenannten Fragmente erwiesen sich bei in vitro Untersuchungen mit Nierenmembranen aus Ratte und Rind als biologisch aktiv, wobei jedoch das Fragment 1-37 nur in sehr geringen Mengen nachweisbar war und schnell zu 1-34 hydrolysiert wurde. Die Autoren schlössen daraus, daß das Endprodukt des enzymatischen Abbaus von PTH durch Cathepsin D beim Rind das Fragment 1-34 ist. Demgegen¬ über bezweifelten andere Autoren, daß in vivo überhaupt amino- terminale PTH-Fragmente im Plasma erscheinen (vgl. beispiels¬ weise Goltzman et al., J. Clin. Invest. 65, 1309-1317 (1980)). So konnten bei normalen Ratten keine durch peri¬ pheren Abbau gebildeten, biologisch aktiven, aminoterminalen PTH-Fragmente nachgewiesen werden; Brunkhurst et al. (Am. J. Physiol. 255. E886-E893) und MacGregor (J. Biol. Chem. 261, 1929-1934 (1986)) fanden, daß bovine Nebenschilddrüsen in Kultur keine biologisch aktiven, aminoterminalen PTH-Frag¬ mente sezernieren.
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein gut zugäng¬ liches Derivat des humanen Parathormons (1-37) mit der bio¬ logischen und therapeutischen Aktivität von natürlichem Parathormon (PTH) zu schaffen, welches als Arzneimittel zur Behandlung z.B. von Osteoporose einsetzbar ist, und welches gegenüber den bekannten PTH-Fragmenten (1-34) und (1-38) eine modifizierte pharmazeutische Wirksamkeit aufweist, und zusätzlich deren Nachteile, insbesondere die Induktion der Antikörperbildung weitgehend vermeidet.
Zur Lösung der Aufgabe werden die Derivate des humanen Parat¬ hormons (1-37) gemäß der nachstehenden Formel vorgeschlagen, welche in der Form eines substituierten oder nicht substitu¬ ierten Amids als aktiven Wirkstoff vorliegen. Die erfindungs¬ gemäßen Derivate des humanen Parathormons (1-37) werden durch die nachstehende Formel wiedergegeben.
Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-R -His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu- Asn-Ser-R2-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp- Val-His-Asn-Phe-Val-Ala-Leu-NR3R4, wobei R 1, ' Met und/oder Norleuci .n ist und
R 3 und R4 jeweils unabhängi.g vonei.nander Wasserstoff oder einen substituierten oder unsubstituierten Kohlenwasserstoff bedeuten.
Vorzugsweise sind die Reste R 3 oder R4 Wasserstoff oder je¬ weils unabhängig voneinander ein gleicher oder verschiedener aliphatischer Kohlenwasserstoff mit 1 bis 8 Kohlenstoff¬ atomen. Besonders bevorzugt ist ein humanes PTH (1-37) Deri¬ vat, wobei R = R = Wasserstoff oder R Wasserstoff und R eine Ethylgruppe ist. Die Reste R 1 und R2 können j.eweils
Methionin und/oder Norleucin sein.
Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß die erfindungs¬ gemäßen PTH-Fragmente 1-37 in der Form des Amids oder sub¬ stituierten Amids eine andersartige biologische Wirksamkeit aufweisen und gleichzeitig im Vergleich zu den bekannten PTH-Fragmenten eine erhöhte Stabilität gegenüber Proteasen besitzen.
Als Beispiel werden die Verbindungen mit R 1 und R2 = Met und
R 3 = R4 = Wasserstoff sowie als weiteres Deri.vat R3 = Wasser- εtoff und R 4 = Ethylgruppe syntheti.si.ert (vgl. Bei.spiele 1 und 2) und als Arzneimittel zubereitet. In diesem Zusammen¬ hang können die erfindungsgemäßen Peptide als Arzneimittel in verschiedener galenischer Zubereitungsform dem Körper zugeführt werden, wie beispielsweise mittels geeigneter Nasensprays zusammen mit Stabilisatoren bzw. Resorptions- för erern, z.B. Laurylether oder Glykocholat oder als Mittel für die parenterale Applikation zusammen mit üblichen Träger¬ und Hilfsstoffen. Beispielsweise kann eine Lyophilisat-Am¬ pulle zur s.c. oder i.m. Applikation 40 μg PTH (1-37) Amid oder Ethylamid zusammen mit.2 mg Mannit enthalten.
Dabei ist das nicht substituierte Amid der Formel 1, wobei
R 1 = Methionin oder Norleucin, R2 = Methionin oder Norleucin, R3 = R4 = Wasserstoff i.st, interessanterwei.se mi.t ei.ner zum humanen Parathormon antagonistischen Wirkung verbunden, während die N- oder N,N-di-substituierten Verbindungen ago- nistische Wirkungen zeigen.
Die erfindungsgemäßen N-substituierten oder nicht substitu¬ ierten Amid-Derivate des hPTH-(l-37) eignen sich in besonde¬ rer Weise als Langzeittherapeutikum bei Hypoparathyreoidismus und Osteoporose, da sie über ausgezeichnete biologische Wirk¬ samkeit verfügen und sehr gut verträglich sind. Das erfin¬ dungsgemäße Präparat ist ferner als Blutdruck stabilisieren¬ des Mittel und insbesondere zur Langzeit- bzw. Dauerbehand¬ lung bei Hypertonus geeignet.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen er¬ läutert.
Beispiel 1
Synthese von hPTH-d-37)-amid
Das Peptid mit der Formel
Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu- Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp- Val-His-Asn-Phe-Val-Ala-Leu-NH2
wurde unter Verwendung der nachfolgend in Tabelle 1 angege¬ benen Derivate im Durchflußverfahren (Atherton und Sheppard, Solid phase synthesis. IRL Press (1989)) auf 580 mg (0,2 mM) Träger aufgebaut. Tabelle I
Fmoc-Ala-OH Fmoc-Asp(OBut)-OH Fmoc-Met-OH Fmoc-Glu(OBut)-OH Fmoc-His(Trt)-OH Fmoc-Leu-OH Fmoc-Arg(Pmc)-OH Fmoc-Trp-OH Fmoc-Lys(BOC)-OH Fmoc-Ile-OH Fmoc-Phe-OH Fmoc-Gly-OH Fmoc.-Asn(Trt)-OH Fmoc-Gln(Trt)-OH Fmoc-Val-OH Fmoc-Ser(But)-OH
Als Träger wurde NovaSyn PA 500 mit p-[ (R,S)-α-[l-(9H- Fluoren-9-yl)-methoxyformamido]-2,4-dimethoxybenzyl]-phenoxy- acetylεäure funktionalisiert und mit einer Beladung von 0,34 mM/g eingesetzt.
(Die Verwendung des vorgenannten Amid-Linkers führt bei der Abspaltung vom Harz zur Bildung einer C-terminalen Amid- gruppe) . Der Überschuß an -aktivierter Aminosäure betrug 3 Äquivalente, die Zeit für die Kupplung 40 Minuten und die der Deprotektion 10 Minuten.
Es wurden 880 mg Träger-gebundenes, voll geschütztes Peptid erhalte .
Das Peptid wurde mit einer Mischung aus 95% Trifluoressig- säure und 5% Ethandithiol im Verlauf von 1 Stunde bei Raum¬ temperatur vom Träger gespalten. Das Peptid wurde anschließend mit HPCL gereinigt und durch Aminosäureanalyse, analytische HPLC und Aminosäuresequenz¬ analyse charakterisiert.
Es wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:
Molekulargewicht: 4399 D (bestimmt durch FAB-MS)
Peptidgehalt: 77,5% (±2%)
Peptidreinheit: > 98%
Menge: 20,5 mg
Aussehen: weißes Pulver
Aminosäureanalvse. gefundene Werte (theoretische Werte) :
Ala 0,95 (1,00) Gly 1,00 (1,00) Met 1,99 (2,00) Trp* 0,82 (1,00)
Arg 2,05 (2,00) Hi≤ 3,02 (3,00) Phe 0,97 (1,00) Tyr -
Asx 3,97 (4,00) He 0,99 (1,00) Pro - Val 4,03 (4,00)
Cys - . Leu 5,94 (6,00) Ser* 2,59 (3,00)
Glx 4,95 (5,00) Lys 2,96 (3,00) Thr -
Während der Hydrolyse teilweise zerstört
Beispiel 2
Synthese von hPTH-.1-37, -ethylamid Das Peptid mit der Formel
Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-
Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-
Val-His-Asn-Phe-Val-Ala-Leu-NHC 2H o.. wurde unter. Verwendung, der nachfolgend in Tabelle 1 angege¬ benen Derivate" durch Festphasensynthese auf ' Polystyrol im Batch- Verfahren aufgebaut. Als Träger wurde Fmoc-Leu-Marri- field-Resin in einer Menge von 0,4 g (0,22 mM) mit einer Beladung von 0,53 mM/g eingesetzt. Der Überschuß an aktivierter Aminosäure betrug 4 Äquivalente, die Zeit für die Kupplung 30 Minuten und die der Deprotektion 10 Minuten.
Es wurden 680 mg Träger-gebundenes, voll geschütztes Peptid erhalten.
Das Peptid wurde mit Ethylamin über einen Zeitraum von 3 Tagen vom Träger gespalten und diese Spaltung führte zur Bildung des Ethylamids.
Die Schutzgruppen wurden mit einer Mischung aus 95% Trifluor- essigsäure und 5% Ethandithiol über einen Zeitraum von 1 Stunde bei Raumtemperatur abgespalten.
Das Peptid wurde mit HPLC gereinigt und anschließend durch Aminosäureanalyse, analytische HPLC und Aminosäuresequenzana- lyse charakterisiert.
Es wurden die nachfolgend angegebene Daten erhalten:
Molekulargewicht: 4427.4 D
Peptidgehalt: 83,2% (±2%)
Peptidreinheit: 70%
Menge: 1,5 mg
Aussehen: weißes Pulver A ionsäureanalyse, gefundene Werte (theoretischer Wert) :
Ala 1,06 (1,00) Gly 1,00 (1,00) Met 2,04 (2,00) Trp* 0,95 (1,00)
Arg 1,95 (2,00) His 2,97 (3,00) Phe 1,02 (1,00) Tyr -
ASX 3,95 (4,00) He 0,94 (1,00) Pro - Val 3,94 (4,900)
Cys - Leu 6,09 (6,00) Ser* 2,79 (3,00)
Glx 4,99 (5,00) Lys 3,05 (3,00) Thr -
Während der Hydrolyse teilweise zerstört.
Beispiel 3
Biologische Wirksamkeit von PTH-Analoga
Methodik
1. Zellinien
Es wurden Osteosarkomzellen, z.B. ROS 17.28 und menschliche Osteoblasten - ähnliche Zellen (osteoblast-like - cells) verwendet.
2. Humane Knochenzellen
Zur Kultivierung von menschlichen Knochenzellen wurden Knochen von Patienten beiderlei Geschlechts verwendet. Die Knochen wurden bei orthopädischen Operationen entnommen.
2.1 Aufarbeitung des Knochengewebes
Unter feuchter Konservierung mit isotoner Kochsalzlösung wurde die Spongiosa aus dem Knochen gebrochen, zerkleinert und von Blutzellen, Fett und Bindegewebe befreit. Die Schritte der Zerkleinerung und Spülung wurden so lange wiederholt, bis elfenbeinartiges Spongiosamaterial übrig blieb (1) . 2.2 Knochenzellprimärkulturen-
Die gereinigten Knochenstückchen wurden entweder direkt oder nach weiterer Behandlung mit Kollagenase zur Zellzucht verwendet. Die eingesetzten Methoden zur Kultivierung menschlicher Knochenzellen stimmen mit den in der Literatur beschriebenen Verfahren überein (2-4) . Die Knochenzellen wurden aus den Knochenpartikelchen in Eagle's Minimum Essential Medium (EMM) , dem 20% fötales Kälberserum bei¬ gegeben war, in Primaria-Petrischalen gezüchtet.
Sobald die Schalen das Stadium der Konfluenz erreicht hatten, wurden sie trypsinisiert und in neue Kulturschalen umgesetzt (Passage 1) .
Für die Stimulierung des cAMP durch PTH-Analoga wurden ausschließlich Knochenzellen der 1. Passage verwendet. Bei den kultivierten Zellen handelte es sich um "osteoblast- like-cells", welche u.a. dadurch charakterisiert sind, daß sie alkalische Phosphatase enthalten und unter Stimulation mit 1,25-Dihydroxycholecalciferol Osteocalcin bilden.
2.3 Inkubation von Zellen mit PTH-Analoga und Bestimmung der cAMP Bildung
24 Stunden vor Beginn des Stimulationsversuches wurde das Medium abgesaugt, die Zellen wurden gewaschen und durch neues serumfreies Medium ersetzt. Am Versuchstag wurde das Medium erneut abgesaugt, die Zellen wurden wiederum gewa¬ schen und mit Isobutylmethylxanthin (IBMX) vorinkubiert. Danach erfolgte die Inkubation der Zellen mit den erfin¬ dungsgemäßen PTH-Analoga, die in ansteigenden Konzen- trationen (10 —9-10—6M) dem Nährmedium (EMM, das 1 mM IBMX sowie 0,5% bovines Serum Albumin enthält) zugegeben werden. Nach Extraktion des cAMP wird dieses in Proben und Kontrollen mit dem "RIANEN cAMP-Kit" radioimmunologisch -bestimmt. Die erfindungsgemäßen Peptide zeigten stimulierende Wirkung auf die oben angegebenen Knochenzellkulturen, d. h. sie führten zu einer Stimulation des cAMP.
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Claims

Patentansprüche
1. Derivate des humanen Parathormons (1-37) gemäß der nach¬ stehenden Formel
Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-R -His-Asn-Leu-Gly-Lyε-Hiε-Leu-
2 Asn-Ser-R -Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Aεp-
Val-His-Asn-Phe-Val-Ala-Leu-NR3R4,
wobei R 1, R2 Met und/oder Norleuci.n ist und R 3 und R4 jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff oder einen substituierten oder unsubstituierten Kohlenwasser¬ stoff bedeuten.
2. Derivate des humanen Parathormons (1-37) nach Anspruch l, wobei R 3 und/oder R4 Wasserstoff oder j.eweils unabhängig voneinander eine gleiche oder verschiedene aliphatische
Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffato en bedeuten.
3. Derivate des humanen Parathormons (1-37) gemäß Anspruch 1,
T A wwoobbeeii RR == RR = Wasserεtoff oder R - Waεεerstoff und R = Ethylreεt ist.
4. Arzneimittel, enthaltend ein Derivat des humanen Parat¬ hormonfragments (1-37) nach mindestenε einem der Anεprüche 1 bis 3.
5. Arzneimittel nach Anspruch 4, enthaltend das humane, aminoter inale Parathyreoidhormon-Fragment (1-37) in Form des Amids oder Ethylamids als aktiven Wirkstoff.
6. Verwendung eines humanen Parathormonfragments (1-37) nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung von Hypoparathyreoidismus.
7. Verwendung eines humanen Parathormonfragments (1-37) nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung von Osteoporose.
8. Verwendung des Arzneimittels eines humanen Parathormon¬ fragments (1-37) nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung des Hyper- tonus.
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