WO2021010638A1 - 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 방법 - Google Patents

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WO2021010638A1
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beta
chromatography
protein
beta protein
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PCT/KR2020/008847
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최준영
김나영
홍성현
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에이비온 주식회사
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    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C07K16/065—Purification, fragmentation

Definitions

  • the present invention relates to a method for purifying a diglycosylated interferon-beta protein, and more particularly, comprising the steps of: (a) obtaining a culture medium containing interferon-beta expressed in host cells; (b) performing affinity chromatography on the culture solution obtained in step (a); (c) inactivating the solution obtained in step (b) at low pH; (d) performing hydrophobic interaction chromatography on the solution obtained in step (c); (e) performing anion exchange chromatography on the solution obtained in step (d); And (f) a method of purifying diglycosylated interferon-beta protein comprising the step of performing cation exchange chromatography using the solution obtained in step (e), and the diglycosylated interferon-beta protein separated by the method.
  • a method for purifying a diglycosylated interferon-beta protein comprising the step of performing cation exchange chromatography using the solution obtained in step (e), and the diglycosylated inter
  • Type 1 interferons include alpha-, beta-, kappa-, delta-, epsilon-, tau- and omega-interferons, and 2 There is a gamma-interferon in the type interferon.
  • Interferons inhibit viral replication, thereby exhibiting antiviral activity, inhibiting cell proliferation, and regulating immune responses.
  • interferon beta is a cytokine produced in response to a viral infection, and is particularly used as a treatment for multiple sclerosis (MS), and may also be used as a cancer treatment due to its anticancer activity.
  • interferon beta 1a is produced from Chinese hamster ovary (CHO) containing human interferon beta gene, and consists of 166 amino acid residues. It is a glycosylated protein with a size of 25 kD.
  • interferon beta 1b is a protein composed of 165 amino acid residues produced from E. coli, lacks sugar, lacks amino acid 1 methionine residue, and 17 cysteine residue is serine. Is substituted with.
  • commercially available interferon beta 1a includes Rebif and Avonex, and interferon beta 1b includes Betaseron and Extavia.
  • glycoprotein is a protein containing an oligosaccharide chain covalently attached to a polypeptide side chain.
  • Glycoproteins have a wide variety of physiological functions including structure, protection, transport, hormone or enzyme functions, and it is generally known that sugar chains attached to their physiological functions play an important role. Glycoproteins can currently be produced recombinantly, but this requires extensive purification procedures to extract targeted glycoproteins from cell culture harvests, and the elimination and modification of sugar chains during manufacturing/expression and purification processes are physiologically Since the function is affected, it is important to configure each process so that it is formed correctly in the manufacturing/expression process or so that the sugar chain is not eliminated/modified during the purification process.
  • Interferon is also a type of glycoprotein, and in the case of wild-type interferon-beta, a sugar chain is attached to the 80th amino acid.
  • an interferon-beta mutant protein that causes mutations in the glycosylation of interferon was developed, and research to use it as a therapeutic is in progress.
  • interferon beta In order to use interferon beta as a therapeutic agent, it has a sufficient amount of protein and high purity, and must be purified in a form suitable for long-term storage.
  • interferon beta has poor stability, decomposition reactions such as cleavage of peptide bonds, deamidation, oxidation of methionine to methionine sulfide, and disulfide exchange in the purification process are common (US2012/0177603). Consideration is essential.
  • a general purification procedure requires testing multiple combinations in order to find a suitable purification method because many different chromatographic methods are available. In these combinations, different sequences, even different numbers of chromatography methods may be used in combination, but depending on these combinations, the purification effect may not be sufficient, or damage to the purified protein may occur, which is suitable for purifying the glycosylated protein. How to determine the sequence of chromatographic steps is an always required task in the art.
  • the conventional techniques use organic solvents during the purification process, and thus require special equipment during large-scale production, or require high cost due to the complex purification process. Therefore, there is a need to develop a method for purifying diglycosylated interferon beta protein, which is easy to purify in a large amount without using an organic solvent, is simple, economical, and has a high yield.
  • the present inventors studied to develop a method for purifying diglycosylated interferon-beta protein. As a result, when purifying using affinity chromatography, hydrophobic interaction chromatography and ion exchange chromatography, sufficient protein amount and high purity were obtained. The present invention was completed by confirming that it is a new purification method that has less risk of modification of glycosylation or other interferon-beta modification.
  • an object of the present invention is to (a) obtain a culture medium containing interferon-beta expressed in host cells; (b) performing affinity chromatography on the culture solution obtained in step (a); (c) inactivating the solution obtained in step (b) at low pH; (d) performing hydrophobic interaction chromatography on the solution obtained in step (c); (e) performing anion exchange chromatography on the solution obtained in step (d); And (f) subjecting the solution obtained in step (e) to cation exchange chromatography to provide a method for purifying diglycosylated interferon-beta protein.
  • Another object of the present invention is to provide a diglycosylated interferon-beta protein obtained by the purification method of the present invention.
  • the present invention (a) obtaining a culture medium containing interferon-beta expressed in host cells; (b) performing affinity chromatography on the culture solution obtained in step (a); (c) inactivating the solution obtained in step (b) at low pH; (d) performing hydrophobic interaction chromatography on the solution obtained in step (c); (e) performing anion exchange chromatography on the solution obtained in step (d); And (f) it provides a method for purifying diglycosylated interferon-beta protein comprising the step of performing cation exchange chromatography on the solution obtained in step (e).
  • the present invention provides a diglycosylated interferon-beta protein obtained by the purification method of the present invention.
  • chromatographic material refers to a solid material, such as hydroxylapatite or an affinity chromatography material, which can be used as a chromatography material without further modification, and a chromatographic functional group is preferably covalent. It refers to a material comprising a bulk core material attached by bonding.
  • the bulk core material indicates that the chromatographic process, that is, the interaction between the polypeptide to be separated and the chromatographic functional groups of the chromatographic material is not substantially achieved.
  • the chromatographic material simply serves to provide a three-dimensional framework that ensures that the chromatographic functional groups are attached and the solution containing the material to be separated has access to the chromatographic functional groups.
  • the bulk core material is solid.
  • the "chromatographic material” is a solid phase to which chromatographic functional groups are preferably attached by covalent bonds.
  • the "chromatographic functional group” is an ionizable hydrophobic group or a hydrophobic group, or a complex group in which different chromatographic functional groups are combined to bind only some types of polypeptide, or a charged group covalently bonded.
  • polypeptide and protein are used according to their conventional (conventional) meaning, that is, they mean a polymer of amino acid residues.
  • the polypeptide is not limited to a specific length, but may generally refer to a fragment of a full length protein in the context of the present invention.
  • the polypeptide or protein may include post-translational modifications, such as glycosylation, acetylation, phosphorylation, etc., and other modifications known in the art (naturally occurring and non-naturally occurring modifications).
  • Polypeptides and proteins of the present invention can be prepared using any of a variety of known recombinant and/or synthetic techniques.
  • binding mode and “elution mode” refer to a solution containing a desired substance (eg diglycosylated interferon beta) in contact with a stationary phase, preferably a solid phase, wherein the desired substance is Refers to how the chromatographic method works by binding to the chromatographic material of.
  • the desired substance is attached to the solid phase, while the undesired substance is removed along with the flow of the solvent or with the supernatant.
  • the desired material is then eluted from the solid phase and thereby recovered from the solid phase together with the elution solution. This does not necessarily mean that all of the undesired substances are removed, but at least 50%, preferably at least 75%, more preferably at least 85%, and most preferably at least 95% of the undesired substances are removed.
  • the terms “continuous elution” and “continuous elution method” mean that the concentration of a substance that causes elution, ie separation of the bound substance from the chromatographic substance, is continuously raised or decreased. That is, the concentration is changed by a series of small steps in which each step changes the concentration of the substance causing the elution to be no more than 2%, preferably no more than 1%.
  • this "continuous elution” one or more conditions of the chromatography method, such as pH, ionic strength, salt concentration, and/or flow rate, vary linearly or change exponentially. Preferably, the change is one that changes linearly.
  • step elution and “step elution method” refer to, for example, elution, ie, the concentration of the substance that causes the separation of the combined substance from the chromatographic substance at a time, ie, one value/level to the next value. / Refers to a chromatographic method that rises or decreases to a level.
  • elution one or more conditions of the chromatography method, such as pH, ionic strength, salt concentration, and/or flow rate, are determined by a first value, such as a second value, such as a final value, from a starting value. Changes at once.
  • Step elution changes incrementally, ie step by step, as opposed to linear change.
  • step elution method a new fraction is collected after each increment. After each increase, the condition is maintained until the next step in the dissolution method.
  • isolated protein and "isolated polypeptide” are polypeptides that are substantially free of contaminating cellular components such as hydrocarbons, lipids, or other protein impurities associated with the polypeptide in nature.
  • the preparation of an isolated protein contains the polypeptide in a highly purified state, i.e., at least about 80% pure, at least about 90% pure, at least about 95% pure, at least 95% pure, or at least 99% pure.
  • a way to show that a particular protein preparation contains an isolated polypeptide is, for example, by electrophoresis of the protein preparation and staining the gel with Coomassie Brilliant Blue, followed by the appearance of a single band.
  • the term “isolated” does not exclude the presence of the same polypeptide in other physical forms, such as dimers, derivatized forms, not correctly folded forms, incorrectly disulfide crosslinked forms or scrambled forms.
  • polynucleotide and “nucleic acid” refer to deoxyribonucleotides (DNA) or ribonucleotides (RNA) in the form of single-stranded or double-stranded. Unless otherwise limited, also include known analogs of natural nucleotides that hybridize to nucleic acids in a manner similar to those of naturally occurring nucleotides.
  • the term "activity of human interferon-beta” is defined as one or more of the activities known to have human interferon-beta sufficient to identify any polypeptide as human interferon-beta. Such activities include alleviation, amelioration or therapeutic activity for multiple sclerosis, antiviral activity, cell growth inhibitory activity, anti-growth activity, anti-proliferative activity, lymphocyte cytotoxicity enhancing activity, immunomodulatory activity, differentiation of target cells as described above.
  • Inducing or inhibiting activity increasing activity of cytokine production, increasing activity of cytotoxic T cells, increasing activity of macrophages, increasing activity of natural killing cells, preventing or treating cancer, preventing autoimmune disorders Or therapeutic activity, viral infection prophylaxis or therapeutic activity, prophylactic or therapeutic activity of HIV-related diseases, hepatitis C prophylactic or therapeutic activity, rheumatoid arthritis prophylactic or therapeutic activity, and the like can be exemplified.
  • expression refers to the production of a protein or nucleic acid in a cell.
  • One letter (three letters) of amino acids used herein means the following amino acids according to the standard abbreviation regulations in the field of biochemistry: A(Ala): alanine; C(Cys): cysteine; D(Asp): aspartic acid; E(Glu): glutamic acid; F(Phe): phenylalanine; G(Gly): glycine; H(His): histidine; I(IIe): isoleucine; K(Lys): lysine; L(Leu): leucine; M(Met): methionine; N(Asn): asparagine; O(Ply)pyrrolysine; P(Pro): proline; Q(Gin): glutamine; R(Arg): arginine; S(Ser): serine; T(Thr): threonine; U(Sec): selenocysteine, V(Val): valine; W(Trp
  • the present invention is a.
  • step (b) performing affinity chromatography on the culture solution obtained in step (a);
  • step (c) inactivating the solution obtained in step (b) at low pH
  • step (d) performing hydrophobic interaction chromatography on the solution obtained in step (c);
  • step (e) performing anion exchange chromatography on the solution obtained in step (d);
  • step (f) it provides a method of purifying diglycosylated interferon-beta protein comprising the step of performing cation exchange chromatography on the solution obtained in step (e).
  • the interferon-beta (interferon-beta polypeptide or interferon-beta protein) of the present invention may be a wild-type interferon beta in which the arginine at position 27 (R27) is mutated to threonine (R27T).
  • R27 arginine at position 27
  • R27T threonine
  • it may be a polypeptide consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the interferon-beta of the present invention is to be understood as a polypeptide having interferon-beta activity as a sugar chain is bound to two positions of the 25th amino acid and the 80th amino acid of SEQ ID NO: 1.
  • interferon-beta of the present invention represents human interferon-beta.
  • the interferon-beta of the present invention can be expressed from a host cell transformed so that the corresponding gene is expressed and expressed in an intracellular or extracellular location.
  • the host cell may choose to regulate the expression of the inserted sequence or to proceed with the gene product in a specific manner desired.
  • Different host cells have characteristic and specific mechanisms for the translation and post-translational processing and modification of proteins. Suitable cell lines or host systems can be selected to provide the desired modification and processing of the expressed heterologous protein.
  • Expression in yeast can produce biologically active products. Expression in eukaryotic cells can increase the likelihood of natural folding.
  • any host cell known in the art may be used as a host cell capable of stably and continuously expressing interferon-beta, but a prokaryotic host cell may be used for expression of diglycosylated interferon-beta.
  • the host cells of the present invention may be, for example, yeast (Saccharomyces cerevisiae), insect cells, animal cells, and human cells, preferably CHO cell line (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2 , 3T3, RIN and MDCK cell lines may be used, and most preferably, the host cell in the present invention may be a CHO cell line.
  • the cultivation is carried out under appropriate conditions allowing the expression of the target protein, interferon-beta, and such conditions can be carried out according to known methods.
  • Transformed host cells can be cultured in large quantities by conventional culture methods.
  • a culture medium a medium composed of a carbon source, a nitrogen source, vitamins and minerals may be used, for example, a medium such as SFM4CHO, optiCHO SFM, etc. may be used, and 200mM L-Glutamine may be used as an additive.
  • the host cells can be cultured under normal host cell culture conditions, for example, in a temperature range of 15°C to 45°C for 10 to 40 hours. Centrifugation or filtration may be performed to remove the culture medium in the culture medium and recover only the concentrated cells, and this step may be performed by a person skilled in the art as needed.
  • step (b) step: performing affinity chromatography on the culture solution obtained in step (a)
  • affinity chromatography refers to a chromatography method using an affinity chromatography material.
  • affinity chromatography polypeptides are separated on the basis of their biological activity or chemical structure following electrostatic interaction with chromatographic functional groups, hydrophobic bonds and/or hydrogen bond formation.
  • a competitor ligand is added or chromatographic conditions such as pH value, polarity or ionic strength of the buffer are changed.
  • An affinity chromatography material is a chromatography material comprising complex chromatographic functional groups in which single different chromatographic functional groups are combined to bind only a certain type of polypeptide. This chromatography material specifically binds some types of polypeptides, depending on the specificity of the chromatographic functional groups.
  • the affinity chromatography material may be interferon, preferably dye affinity chromatography having affinity for interferon-beta, and blue sepharose may be used as a resin.
  • Dye affinity chromatography may be a matrix to which Blue Dextran Sepharose R or Cibacron R Blue is immobilized, for example.
  • Blue Dextran Sepharose R or Cibacron R Blue is immobilized, for example.
  • Amicon's Matrex Gel Blue A, Merck's Fraktogel 45 TSK AF-Blue, or GE Healthcare's Blue-Sepharose R 6FF (fastflow) may be used.
  • the diglycosylated interferon-beta protein is separated by affinity chromatography using Blue-Sepharose R 6FF, and in particular, the glycosylation state is maintained and interferon-beta protein is isolated. I did. Therefore, in the present invention, Blue-Sepharose R 6FF may be preferably used as an affinity chromatography material.
  • Interferon-beta binds strongly to Blue-Sepharose R 6FF, and the bound proteins can be washed off with various buffers prior to elution.
  • This step is suitable as the first chromatographic step of the purification process according to the present invention because interferon-beta binds well to Blue-Sepharose R 6FF even at a low concentration under normal conditions.
  • a reagent used for elution of IFN-beta a chaotropic agent or salt may be used, and an aqueous solution containing a reducing agent such as ethylene glycol or propylene glycol may be used.
  • an aqueous propylene glycol solution may be used for elution in this step, and an aqueous propylene glycol solution of 20% to 40% may be used.
  • low pH inactivation refers to inactivating the viral external influent under acidic conditions of pH 4.0 or lower by adding an acid for the purpose of inactivating the enveloped virus.
  • the low pH inactivation is treated to a pH of 2.0 to pH 4.0, more preferably pH 3.0 to pH 4.0 or pH 3.5 to pH 4.0 by adding an acid.
  • Treatment time and temperature may be 30 minutes to 4 hours at 10 to 30 °C or 15 to 25 °C.
  • the acid to be added may be an inorganic acid, such as phosphoric acid, hydrochloric acid, sulfuric acid, or an organic acid, such as acetic acid or oxalic acid, and preferably an aqueous phosphoric acid solution.
  • an inorganic acid such as phosphoric acid, hydrochloric acid, sulfuric acid, or an organic acid, such as acetic acid or oxalic acid, and preferably an aqueous phosphoric acid solution.
  • a 10-fold diluted aqueous phosphoric acid solution of pH 3.5 was added to the eluate of step (b) to lower the pH to 4 or less, and treated at 15 to 25°C for 1 hour to prevent low pH. Activation was performed and then neutralized again using 2M Trizma base.
  • hydrophobic interaction chromatography refers to a chromatography method in which a hydrophobic interaction chromatography material is used.
  • the hydrophobic interaction chromatography material is a chromatography material in which a hydrophobic group such as butyl-, octyl- or phenyl group is bound as a chromatographic functional group.
  • the polypeptide can be separated by interacting with a hydrophobic group of a hydrophobic interaction chromatography material by the nature of the hydrophobic site exposed on its surface. The interaction between the polypeptide and the chromatography material can be affected by the temperature, the solvent and the ionic strength of the solvent.
  • Hydrophobic interaction chromatography material is butyl sepharose, phenyl sepharose, octyl sepharose as resin, for example phenyl sepharose CL-4B, 6FF, HP, phenyl superrose, octyl sepharose CL-4B, 4 FF And butyl sepharose 4FF, preferably butyl sepharose, more preferably butyl sepharose 4FF as a resin.
  • anion exchange chromatography refers to a chromatography method using an anion exchange chromatography material.
  • the anion exchange chromatography material is a solid polymer material having a cationally charged group as a chromatographic functional group, and refers to a material in which anion is exchanged.
  • counter ions are associated with an anion exchange chromatography material, and the anion exchange chromatography material can exchange similarly charged anions in the surrounding solution for counter ions.
  • anion exchange chromatography may be, for example, chromatography using a commercial anion exchange chromatography material, and an anion exchange chromatography material provided by manufacturers such as Biorad Laboratories, Cyphergen, GE Healthcare, etc. Can be used.
  • Anion exchange chromatography may be performed using quaternary ammonium as an anion exchange resin, preferably using Q resin as a resin, more preferably Capto Q ImpRes to perform anion exchange chromatography. I can.
  • anion exchange chromatography is carried out first in ion exchange chromatography. This is a necessary step to more effectively remove the basic variant, virus, HCP (host cell protein), HCD (host cell DNA), and endotoxin, which are impurities in the interferon beta purification process.
  • cation exchange chromatography refers to a chromatography method using a cation exchange chromatography material.
  • the cation exchange chromatography material is a solid polymer material having an anionally charged group as a chromatographic functional group, and refers to a material in which cations are exchanged.
  • counter ions are associated with a cation exchange chromatography material, and the cation exchange chromatography material can exchange similarly charged cations in the surrounding solution for counter ions.
  • the cation exchange chromatography material may have, for example, a sulfonic acid group (SP) or a carboxymethyl group (CM).
  • SP sulfonic acid group
  • CM carboxymethyl group
  • it may be further classified as a strong or weak cation exchange chromatography material depending on the strength of the charged substituent.
  • strong cation exchange chromatography materials have sulfonic acid groups as chromatographic functional groups
  • weak cation exchange chromatography materials have carboxylic acid groups as chromatographic functional groups.
  • cation exchange chromatography may be, for example, chromatography using a commercial cation exchange chromatography material, and a cation exchange chromatography material provided by manufacturers such as Biorad Laboratories, Cyphergen, GE Healthcare, etc. Although it may be used, preferably, it may be performed using SP Sepharose as a resin, and more preferably, cation exchange chromatography may be performed using sephadex SFF.
  • Interferon-beta isolated through the purification of the present invention has the activity of human interferon-beta, has the biological and/or immunological characteristics of interferon-beta, GMP (manufacturing management and quality control rules for pharmaceuticals and quasi-drugs) In terms of ), it is applicable to routine treatment, and preferably, regulatory acceptance requirements (validation, reproducibility) and interferon-beta have certain biochemical properties (hydrophobicity, etc.).
  • the specific activity of the isolated diglycosylated interferon-beta should be at least 2 ⁇ 10 8 IU/mg, preferably at least 3 ⁇ 10 8 IU/mg, more preferably at least 4 ⁇ 10 8 IU/mg.
  • Two essential biological activities of IFN-beta that can be measured are their antiviral and antiproliferative effects. Each of these biological activities can be measured by a standard method through inhibition of the cytopathic effect of viruses.
  • the measurement of the activity of interferon beta can use a method known in the art.
  • the method for purifying diglycosylated interferon-beta of the present invention preferably does not include reverse phase chromatography, ultrafiltration or dialysis, or size exclusion chromatography.
  • Reversed-phase chromatography has a disadvantage in that acetonitrile, which is a commonly used buffer, is an organic solvent, and therefore requires additional facilities such as explosion-proof facilities for mass culture and purification, and ultrafiltration and dialysis are suitable for mass culture and purification. It is not appropriate and has a disadvantage that a large number of waste fluids may be generated.
  • size-exclusion chromatography is not suitable for mass culture and purification.
  • the present invention provides a diglycosylated interferon-beta protein obtained by the purification method of the present invention.
  • the interferon beta protein of the present invention has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and has sugar chains at the 25th and 80th amino acids.
  • sugar chains of the interferon beta protein are labeled according to the oxford notation method A2G2, FA2G2, FA2G2S1, FA2G2S2, FA2G2S*2, FA3G3S1, FA3G3S3, FA3G3S*3, FA4G4S1, FA4G4S3, FA4G4G4S3, FA4G4G4S4, It may be a sugar chain having a structure of FA4G4Lac1S*3, FA4G4Lac1S4, FA4G4Lac2S3, or FA4G4Lac1S*3, and preferably has a sugar chain structure of any two of the sugar chains.
  • Gx number (x) of galactose linked beta 1-4 to antenna
  • sialic acid is in an alpha 2-3 unless indicated by a * that alpha 2-6 linkages are also present;
  • Lacx number (x) of lactosamine (Gal-GlcNAc) extensions.
  • the diglycosylated interferon-beta purification method of the present invention After culturing at a 5 liter scale to express interferon-beta, it was purified using the diglycosylated interferon-beta purification method of the present invention. Purification of diglycosylated interferon-beta was performed by affinity chromatography using blue sepharose 6 fast flow resin, low pH inactivation by acid addition, and hydrophobic interaction using butyl sepharose (Butyl 4 fast flow) resin, respectively. Action chromatography, anion exchange chromatography using Capto Q ImpRes resin, and cation exchange chromatography using an SP sepharose fast flow column were performed in order.
  • interferon-beta prepared by the same culture expression was used in affinity chromatography using a blue sepharose 6 fast flow column according to the conventional interferon-beta protein purification method, CM Sepharose (CM Sepharose fast flow) cation exchange chromatography using resin, reverse phase chromatography using (VYDAC C4), ultrafiltration ⁇ concentration, and size exclusion chromatography (Sephacryl 100HR) were performed in order.
  • CM Sepharose CM Sepharose fast flow
  • VYDAC C4 reverse phase chromatography using
  • Sephacryl 100HR size exclusion chromatography
  • the method of the present invention is a comparative example method. Compared to the total content, yield, and methionine deletion form were all excellent.In the case of inactivity, the comparative method was higher than the method of the present invention, but the present invention also in the overall activity considering the total purification amount. The method was found to be remarkably superior. Therefore, in the case of the method of the present invention, it was found that the diglycosylated interferon beta can be separated/purified to have excellent quality and yield, and to have higher activity.
  • the impurities of interferon-beta isolated and purified according to each purification method were confirmed in terms of cell-derived protein (CHO-HCP) content, endotoxin content, and patterns in IEF of CHO cells.
  • CHO-HCP cell-derived protein
  • endotoxin content CHO-derived protein
  • patterns in IEF of CHO cells both met the standard values, but it was confirmed that the method of the present invention detects less impurities.
  • the method of the present invention does not have a basic variant, so that the purification method is a little more pure than the method of Comparative Example 1.
  • the interferon-beta protein purification method provided by the present invention has remarkably excellent purification yield of diglycosylated interferon-beta protein, easy manufacturing control and quality control in mass culture, and regulation in use as pharmaceuticals.
  • a diglycosylated interferon-beta protein of good quality suitable for can be purified.
  • Example One In host cells Disaccharide Expression and acquisition of interferon-beta
  • the production CHO cell line containing the diglycosylated interferon-beta gene was cultured at a 5-liter scale using a medium based on Hyclone's optiCHO SFM to express interferon-beta.
  • the initial temperature was 34.0°C, pH 7.0, and the amount of dissolved oxygen was 50%, and the cultivation was proceeded with slow agitation. After incubation for 9 days, the culture solution recovered from the incubator was centrifuged at 4500 rpm and 4°C for 30 minutes. Proceeded. After centrifugation, 0.22 ⁇ m filtration of the supernatant aseptically was performed, and then purification was performed.
  • Example 1 The interferon-beta obtained in Example 1 was introduced into a purification process using affinity chromatography.
  • the harvested interferon-beta fraction was combined with a blue sepharose 6 fast flow (GE) column previously equilibrated with a solution of 10 mM Sodium phosphate, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, pH 7.4, and a 700 mM sodium thiocyanate solution. Washed thoroughly. Then, this fraction was harvested by eluting with a solution of 20mM Sodium phosphate, 1.4M NaCl, 35% Propylene Glycol, 250mM L-Arginine, pH 7.4.
  • GE blue sepharose 6 fast flow
  • the purity was 94% to 96%, and as a result of detection of residual HCP, the first purification was completed with an amount of 6300 to 9500 ppm.
  • pH 3.5 was added to adjust the pH to 3.0 by adding Phosphoric acid (99%, diluted 10 times using distilled water). Then, it was treated at 22° C. for 1 hour and then neutralized with 2M Trizma base to obtain a sample.
  • an anion exchange chromatography filled with a Capto Q (Capto Q ImpRes; GE) resin was performed using a 20 mM Tris, pH 8.0 solution.
  • the solution from which the solvent was eluted was 20mM Tris, 140mM NaCl, pH 8.0.
  • the fraction previously eluted from the anion exchange resin was added to a SP sepharose fast flow (GE) column equilibrated with 50mM sodium acetate, pH 5.0, and cation exchanged by the difference in salt concentration from 150mM to 500mM. Chromatography was carried out.
  • GE SP sepharose fast flow
  • the interferon-beta material finally obtained with a yield of 32% showed a purity of 95% or more, and the HCP recorded 100 ppm, which is less than the reference value, and the final product with no specifics was obtained as a result of IEF and SDS-PAGE gel analysis.
  • Comparative example 1 Purification according to the existing interferon-beta protein purification method
  • the interferon-beta fraction obtained from the culture was bound to a blue sepharose 6 fast flow (GE) column previously equilibrated with a solution of 10 mM Sodium phosphate, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, pH 7.4, and a 700 mM sodium thiocyanate solution Washed thoroughly with. Then, this fraction was harvested by eluting with a solution of 20mM Sodium phosphate, 1.4M NaCl, 35% Propylene Glycol, pH 7.0.
  • GE blue sepharose 6 fast flow
  • the fraction obtained by the above process was diluted 5 times with a solution of 20 mM sodium phosphate, pH 2.7, and introduced into the second process, cation exchange chromatography, using CM sepharose fast flow (GE) resin.
  • the elution solvent used at this time was 50mM NaPi, 0.145M NaCl, 10% PG, pH 7.0.
  • the eluted interferon-beta sample was eluted through an HPLC reverse phase chromatography column (VYDAC C4; Agilent) using 30% of Acetonitrile and 0.1% of Trifluoracetic acid as an organic solvent as a buffer solution.
  • VYDAC C4 HPLC reverse phase chromatography column
  • Trifluoracetic acid 30% of Acetonitrile and 0.1% of Trifluoracetic acid as an organic solvent as a buffer solution.
  • 20mM sodium phosphate monobasic pH 2.9 was put in the collection container of the eluted sample in advance so that the sample was eluted and diluted at the same time to obtain interferon-beta.
  • Example 2 The purification methods of Example 2 and Comparative Example 1 were evaluated in terms of yield, protein modification, specific activity, content, and total activity.
  • Protein quantification was performed using a UV measurement method. A solution containing 0.5M NaOH and a size-exclusion chromatography elution solvent at a ratio of 1:1 was zeroed, and a mixture of the target product obtained by size-exclusion chromatography and 0.5M NaOH at 1:1 was measured at a UV wavelength of 290 nm. The measurement was based on three times, and it was quantified by the following calculation formula.
  • the yield was based on the eluate passed through Blue Sepharose (100%), and the relative content thereof was measured by enzyme immunoassay (ELISA) using a primary antibody specific for interferon beta, and the enzyme immunoassay method used at this time. Is as follows. After dispensing the enzyme-conjugated antibody solution according to the concentration on the measurement plate, the standard solution and the test solution to be measured were added in duplicate at a dilution concentration of at least 8. After the reaction for a certain period of time, after a washing process, a substrate solution causing a color development reaction was added to induce the reaction. After the reaction was stopped, absorbance was measured at 450 nm.
  • Protein modification was measured by performing peptide mapping using HPLC equipment. An analysis sample was injected using a chromatography system and a measuring device, and protein structure and amino acid denaturation corresponding to retention and integral values were confirmed for the values measured at a wavelength of 214 nm.
  • CPE cytopathic effect
  • Each purified sample was diluted with MEM culture medium so that the expected activity was 50IU/ml (volume was 1500ul or more), and the samples for measurement were prepared by sequentially dilution from 50 to 0.390625IU/ml.
  • Each sample and standard material for measurement were divided into 96-well culture plates, and A549 cells were added to the wells at 3 ⁇ 10 4 cells/well, followed by incubation for 22 hours at 37° C. and 5% CO 2 . After removing the medium from the plate, a virus solution (1000 TCID50/ml) was divided into each well and incubated for 22 hours at 37°C and 5% CO 2 . After removing the solution from the plate, dyeing at room temperature with Crystal Violet Solution, destaining with 2-Methoxyethanol, and measuring the absorbance at 570 nm to calculate specific activity.
  • the total content was 26.4 mg, the yield was around 20%, the form in which methionine was deleted was 2.8%, and the total activity was high at 6520MIU.
  • the diglycosylated interferon beta can be separated/purified to have excellent quality and yield, and to have higher activity.
  • Enzyme immunoassay was used to measure the protein content derived from CHO cells to be isolated from the target protein, interferon-beta.
  • a diluted solution was prepared and dispensed on a plate, and the sample for analysis was diluted to the final half.
  • the standard solution was transferred to a plate included in the analysis kit and dispensed (at this time, the enzyme-conjugated antibody was coated on the plate attached to the kit), and a substrate solution showing a color reaction was added to induce the reaction. After that, the plate was analyzed for the amount of protein derived from CHO cells compared to the standard calibration curve by measuring the absorbance at a wavelength of 450 nm.
  • LAL Lipotoxin Assay
  • a standard calibration curve was prepared at the desired concentration in a test tube for analysis. Then, the prepared standard sample, zero point solution, and analysis sample were dispensed into the plate in equal amounts. After the LAL reagent was well dissolved in distilled water for analysis, it was evenly dispensed into the plate prepared above to induce a reaction. After the reaction, the absorbance was measured at a wavelength of 405 nm to measure the level of endotoxin present in the target material.
  • Positive and negative buffers to be used for IEF gel analysis were prepared, calculated so that the amount of the analysis sample and the standard sample were the same, and mixed with the IEF analysis buffer (pH 3-10), respectively, to prepare a developed sample for analysis.
  • the positive electrode buffer was filled in the development container, and the negative electrode buffer was filled in the outer space, and the prepared samples were injected into the gel.
  • the finished gel was separated to perform Coomassie staining and bleaching, and the isoelectric point of the protein was determined through a chemiluminescence analyzer.
  • the protein of CHO cells was 65 ppm in the case of Comparative Example 1, but was found to be 42 ppm according to the method of the present invention. It was found to be less than 100 ppm, which is a typical reference value, but in the present invention, it was confirmed that it appeared a little lower by performing anion exchange chromatography followed by cation exchange chromatography.
  • the purification method of interferon-beta protein provided by the present invention has remarkably excellent purification yield of diglycosylated interferon-beta protein, easy manufacturing control and quality control in mass culture, and used as a pharmaceutical. It is possible to isolate diglycosylated interferon-beta protein of excellent quality suitable for the regulation of debris and has great industrial applicability.

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Abstract

본 발명은 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 숙주세포에서 발현된 인터페론-베타를 포함하는 배양액을 수득하여 친화성 크로마토그래피, low pH 불활성화, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 방법 및 상기 방법에 의해서 분리된 2당화된 인터페론-베타 단백질에 관한 것이다.

Description

2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 방법
본 출원은 2019년 7월 18일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2019-0087244호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
본 발명은 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 (a) 숙주세포에서 발현된 인터페론-베타를 포함하는 배양액을 수득하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 배양액을 친화성 크로마토그래피를 수행하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 수득한 용액을 low pH 불활성화하는 단계; (d) 상기 (c) 단계에서 수득한 용액을 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하는 단계; (e) 상기 (d) 단계에서 수득한 용액을 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계; 및 (f) 상기 (e) 단계에서 수득한 용액을 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 방법 및 상기 방법에 의해서 분리된 2당화된 인터페론-베타 단백질에 관한 것이다.
인간의 인터페론(Interferon, IFN)은 현재 8 종류로 알려져 있으며, 이들은 물리화학적 및 기능적 특징에 따라 1형과 2형의 두 가지로 분류된다. 1형 인터페론은 알파(alpha)-, 베타(beta)-, 카파(kappa)-, 델타(delta)-, 입실론(epsilon)-, 타우(tau)- 및 오메가(omega)-인터페론이 있고, 2형 인터페론에는 감마(gamma)-인터페론이 있다.
인터페론(IFNs)은 바이러스의 복제를 억제함으로써, 항 바이러스 활성을 나 타내고, 세포 증식을 억제하며, 면역 반응을 조절한다. 이중 인터페론 베타는 바이러스 감염 등에 의한 반응시 생산되는 사이토카인(cytokine)으로, 특히 다발성경화증(multiple sclerosis, MS) 치료제 등으로 사용되며, 항암활성도 나타내어 암치료제로 사용될 가능성도 있다.
현재, 치료용으로 사용되는 인터페론 베타는 2 종류가 존재하는데, 첫째로 인터페론 베타 1a는 인간 인터페론 베타 유전자를 포함하는 중국 햄스터 난소(chinese hamster ovary, CHO)로부터 생산되고, 166개 아미노산 잔기로 구성되어 있으며, 크기가 25 kD인 당화된(glycosylated) 단백질이다. 둘째로 인터페론 베타 1b는 대장균으로부터 생산되는 165개 아미노산 잔기로 구성된 단백질인데, 당이 결여되어 있고, 아미노산 1번 메티오닌(methionine) 잔기가 결여되어 있으며, 17번 시스테인(cysteine) 잔기가 세린(serine)으로 치환되어 있다. 현재 시판되고 있는 인터페론 베타 1a는 레비프(Rebif)와 아보넥스(Avonex)가 있으며, 인터페론 베타 1b는 베타세론(Betaseron), 엑타비아 (Extavia)이 있다.
한편, 당단백질은 폴리펩티드 측쇄에 공유적으로 부착된 올리고당류 사슬을 함유하는 단백질이다. 당단백질은 구조, 보호, 운반, 호르몬 또는 효소 기능을 포함하는 매우 다양한 여러 생리학적 기능을 가지고 있으며, 이들의 생리학적 기능에 부착된 당쇄가 중요하게 작용하는 점이 일반적으로 알려져있다. 당단백질은 현재 재조합적으로 생성될 수 있으나, 이는 세포 배양 수거물로부터 표적화된 당단백질을 추출하기 위해 광범위한 정제 절차를 필요로하며, 제조/발현 및 정제 과정 중 당쇄의 탈락, 변형 등은 생리학적 기능에 영향을 미치게 되므로 제조/발현 과정에서 올바르게 형성되도록 하거나 정제 과정에 당쇄의 탈락/변형이 되지 않도록 각 과정을 구성하는 것이 중요하다.
인터페론도 당단백질의 일종이며, 야생형 인터페론-베타의 경우 80 번째 아미노산에 당쇄가 부착되어 있다. 특히, 2004년 인터페론의 당화에 변이를 초래하는 인터페론-베타 돌연변이 단백질을 개발되어 이를 치료제로 활용하고자 하는 연구가 진행중에 있다. 인터페론 베타를 치료제로 사용하기 위해서는 충분한 단백질 양과 높은 순도를 가지며, 장기 보존에 적합한 형태로 정제되어야 한다. 인터페론 베타는 안정성이 떨어지기 때문에, 정제과정에서 펩타이드 결합의 절단, 탈 아미드화, 메티오닌의 메티오닌 설파이드로의 산화, 디설파이드 교환과 같은 분해 반응이 흔히 일어나는데 (US2012/0177603), 정제 과정에서 이들에 대한 고려가 반드시 필요하다.
아울러, 일반적인 정제과정은 다수의 상이한 크로마토그래피 방법이 이용가능하기 때문에 적합한 정제 방법을 찾기 위해서는 다수의 조합을 시험해야만 한다. 이들 조합에서 서로 다른 순서, 심지어는 다른 수의 크로마토그래피 방법이 조합되어 사용될 수 있으나, 이들 조합에 따라서 정제 효과가 충분하지 않거나, 정제된 단백질에 손상이 발생할 수 있어 당화된 단백질을 정제하기 위해 적합한 순서의 크로마토그래피 단계를 결정하는 방법은 당업계에 항상 요구되는 과제이다.
특히, 종래의 기술들은 정제 과정 중 유기용매를 사용하기 때문에 대규모의 생산시 특별한 설비를 필요로 한다던지, 정제 과정이 복잡하여 고비용이 소요되는 단점이 있다. 따라서 유기용매를 사용하지 않아 대량의 정제가 용이하고, 간단하고 경제적이며 수율이 높은 2당화된 인터페론 베타 단백질의 정제 방법의 개발이 필요하다.
이에 본 발명자들은 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 방법을 개발하기 위하여 연구한 결과, 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 정제를 하는 경우 충분한 단백질 양과 높은 순도를 가지며, 당화의 변형이나 기타의 인터페론-베타의 변형의 우려가 적은 새로운 정제 방법인 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 (a) 숙주세포에서 발현된 인터페론-베타를 포함하는 배양액을 수득하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 배양액을 친화성 크로마토그래피를 수행하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 수득한 용액을 low pH 불활성화하는 단계; (d) 상기 (c) 단계에서 수득한 용액을 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하는 단계; (e) 상기 (d) 단계에서 수득한 용액을 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계; 및 (f) 상기 (e) 단계에서 수득한 용액을 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 정제 방법에 의해서 수득된 2당화된 인터페론-베타 단백질을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 숙주세포에서 발현된 인터페론-베타를 포함하는 배양액을 수득하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 배양액을 친화성 크로마토그래피를 수행하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 수득한 용액을 low pH 불활성화하는 단계; (d) 상기 (c) 단계에서 수득한 용액을 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하는 단계; (e) 상기 (d) 단계에서 수득한 용액을 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계; 및 (f) 상기 (e) 단계에서 수득한 용액을 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명의 정제 방법에 의해서 수득된 2당화된 인터페론-베타 단백질을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
일반적인 크로마토그래피 방법 및 그들의 용도는 당 분야의 숙련자들에게 공지되어 있다.
본 명세서에서 용어 "크로마토그래피 물질"은 크로마토그래피 물질로서 추가의 개질없이 이용될 수 있는 고형 물질, 예를 들면 하이드록실아파타이트 또는 친화성 크로마토그래피 물질을 의미하고, 또한 크로마토그래피 작용기가 바람직하게는 공유 결합에 의해 부착되는 벌크 코어 물질을 포함하는 물질을 의미한다. 벌크 코어 물질은 크로마토그래피 과정, 즉, 분리되고자 하는 폴리펩타이드와 크로마토그래피 물질의 크로마토그래피 작용기 사이의 상호작용이 실질적으로 이루어지지 않는 것을 나타낸다. 크로마토그래피 물질은 단순히 크로마토그래피 작용기가 부착되고, 분리될 물질을 함유하는 용액이 크로마토그래피 작용기에 접근할 수 있도록 보장하는 3차원 골격을 제공하는 역할을 한다. 바람직하게는 상기 벌크 코어 물질은 고형상이다. 따라서, 바람직하게는 상기 "크로마토그래피 물질"은 크로마토그래피 작용기가 바람직하게는 공유 결합에 의해 부착된 고형상이다. 바람직하게는 상기 "크로마토그래피 작용기"는 이온화가능한 소수성 기 또는 소수성 기이거나, 또는 서로 다른 크로마토그래피 작용기가 일부 유형의 폴리펩타이드만 결합하도록 조합되어 있는 복합기이거나, 공유 결합된 하전된 기이다.
본 명세서에서 용어 “폴리펩타이드” 및 “단백질”은 통상(종래)의 의미에 따라 사용되는 것으로, 즉 아미노산 잔기의 중합체를 의미한다. 폴리펩타이드는 특정의 길이로 한정되지 않지만, 본 발명의 문맥에서는 일반적으로 전장(full length) 단백질의 단편을 지칭하는 것일 수 있다. 상기 폴리펩타이드 또는 단백질은 번역후의 수식, 예를 들면 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등 및 해당 분야에 공지된 다른 수식(자연적으로 발생하는 수식 및 비자연적 발생의 수식)을 포함할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드 및 단백질은 임의의 다양한 공지의 재조합 및/또는 합성의 기술을 이용하여 제조될 수 있다.
본 명세서에서 용어 “결합 모드” 및 “용출 모드”는 원하는 물질 (예를 들어, 2당화된 인터페론 베타)을 함유하는 용액이 정지상, 바람직하게는 고형상과 접촉하고, 여기서, 원하는 물질은 고형상의 크로마토그래피 물질에 결합하는 크로마토그래피 방법의 작동 방식을 의미한다. 그 결과, 원하는 물질이 고형상에 부착되어 있는 반면, 원하지 않는 물질은 용매의 흐름을 따라서 또는 상층액과 함께 제거된다. 이후에 원하는 물질은 고형상으로부터 용출되고 이에 의해 용출 용액과 함께 고형상으로부터 회수된다. 이는 원하지 않는 물질 모두가 제거되는 것을 반드시 의미하는 것은 아니지만, 원하지 않는 물질의 50% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 더 바람직하게는 85% 이상, 가장 바람직하게는 95%이상이 제거된다.
본 명세서에서 용어 “연속 용출” 및 “연속 용출 방법”은 예를 들면 용출, 즉 결합된 물질의 크로마토그래피 물질로부터의 분리를 야기하는 물질의 농도가 연속적으로 상승되거나 감소됨을 의미한다. 즉, 각각의 단계가 용출을 야기하는 물질의 농도를 2% 보다 크지 않게, 바람직하게는 1% 보다 크지 않게 변화시키는 일련의 작은 단계에 의해 농도가 변화된다. 이러한 “연속 용출”에서, 크로마토그래피 방법의 하나 이상의 조건, 예를 들면 pH, 이온 강도, 염의 농도, 및/또는 유속은 선형으로 변화되거나, 기하급수적으로 변화된다. 바람직하게는, 변화는 선형으로 변화되는 것이다.
본 명세서에서 용어 “단계 용출” 및 “단계 용출 방법”은 예를 들면 용출, 즉, 결합된 물질의 크로마토그래피 물질로부터의 분리를 야기하는 물질의 농도가 한번에, 즉, 한 값/수준에서 다음 값/수준으로 상승되거나 감소되는 크로마토그래피 방법을 의미한다. 이러한 "단계 용출"에서, 크로마토그래피 방법의 하나 이상의 조건, 예를 들면 pH, 이온 강도, 염의 농도, 및/또는 유속은 제1값, 예를 들면 출발값에서 제2값, 예를 들면 최종 값으로 한번에 변화된다. 단계에서의 변화는 용출을 야기하는 물질의 농도를 5% 보다 크게, 바람직하게는 10% 보다 크게 변화시킨다. “단계 용출”은 선형 변화와는 대조적으로 증분적으로, 즉, 단계별로 변화된다. “단계 용출 방법”에서는 각각의 증가 후에 새로운 분획이 수집된다. 각각의 증가후, 용출방법에서의 다음 단계까지 조건이 유지된다.
본 명세서에서 용어 “분리된 단백질” 및 “분리된 폴리펩타이드”는 탄화수소, 지질 또는 자연에서 폴리펩타이드와 관련된 다른 단백질 불순물과 같은 오염 세포 성분이 실질적으로 없는 폴리펩타이드이다. 전형적으로, 분리된 단백질의 제조는 매우 정제된 상태, 즉, 약 80% 이상 순수한, 약 90% 이상 순수한, 약 95% 이상 순수한, 95% 이상 순수한, 또는 99% 이상 순수한 폴리펩타이드를 함유한다. 특정한 단백질 제제가 분리된 폴리펩타이드를 함유하고 있음을 보여주는 방법은 예를 들어, 단백질 제제를 전기영동시키고 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue)로 염색시킨 후 단일 밴드가 나타나는 것이다. 그러나, 용어 “분리된”은 이량체, 유도체화된 형태, 정확하게 절첩되지 않은 형태, 정확하지 않게 다이설파이드 가교된 형태 또는 스크램블된 형태와 같은 다른 물리적 형태의 동일한 폴리펩타이드의 존재를 배제하지는 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어 ‘폴리뉴클레오티드’, ‘핵산’은 단일-가닥 또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드(DNA) 또는 리보뉴클레오티드(RNA)를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다.
본 명세서에서 사용된 용어 “인간 인터페론-베타의 활성”이란 인간 인터페론-베타가 지닌다고 알려진 활성 중에서 어떠한 폴리펩티드가 인간 인터페론-베타로 동정되기에 충분한 하나 이상의 활성으로 정의된다. 그러한 활성으로서는 이미 전술한 바의 다발성경화증에 대한 경감, 완화 또는 치료 활성, 항바이러스 활성, 세포 성장 억제 활성, 항 성장활성, 항 증식 활성, 림프구세포독성 증대 활성, 면역 조절 활성, 표적 세포의 분화 유도 또는 억제 활성, 사이토카인 생성의 증가 활성, 세포독성 T 세포의 효과 증가 활성, 대식세포의 효과 증가 활성, 자연 살해 세포(natural killing cell)의 증가 활성, 암 예방 또는 치료 활성, 자가 면역 장애 예방 또는 치료 활성, 바이러스 감염 예방 또는 치료 활성, HIV와 관련된 질병의 예방 또는 치료 활성, C형 간염 예방 또는 치료 활성, 류마티스성 관절염 예방 또는 치료 활성 등을 예시할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “발현(expression)”이라 함은 세포에서 단백질 또는 핵산의 생성을 의미한다.
본 명세서에 사용된 아미노산의 일문자(삼문자)는 생화학 분야에서의 표준 약어 규정에 따라 다음의 아미노산을 의미한다: A(Ala): 알라닌; C(Cys): 시스테인; D(Asp):아스파르트산; E(Glu): 글루탐산; F(Phe): 페닐알라닌; G(Gly): 글라이신; H(His): 히스티딘; I(IIe): 이소류신; K(Lys): 라이신; L(Leu): 류신; M(Met): 메티오닌; N(Asn): 아스파라긴; O(Ply)피롤라이신; P(Pro): 프롤린; Q(Gln): 글루타민; R(Arg): 아르기닌; S(Ser): 세린; T(Thr): 트레오닌; U(Sec):셀레노시스테인, V(Val): 발린; W(Trp): 트립토판; Y(Tyr): 티로신.
본 발명은
(a) 숙주세포에서 발현된 인터페론-베타를 포함하는 배양액을 수득하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 수득한 배양액을 친화성 크로마토그래피를 수행하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 수득한 용액을 low pH 불활성화하는 단계;
(d) 상기 (c) 단계에서 수득한 용액을 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하는 단계;
(e) 상기 (d) 단계에서 수득한 용액을 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계; 및
(f) 상기 (e) 단계에서 수득한 용액을 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 방법을 제공한다.
본 발명의 정제 방법 (또는 분리 방법)에 각 단계에 대해서는 다음과 같다.
(a) 단계 : 숙주세포에서 발현된 인터페론-베타를 포함하는 배양액을 수득하는 단계
본 발명의 인터페론-베타 (인터페론-베타 폴리펩티드 또는 인터페론-베타 단백질)은 야생형의 인터페론 베타의 27번 아르기닌(R27)부위가 트레오닌으로 변이(R27T)된 것일 수 있다. 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드일 수 있다. 본 발명의 인터페론-베타는 서열번호 1의 25번째 아미노산 및 80번째 아미노산의 2곳에 당쇄가 결합된 것으로 인터페론-베타 활성을 지니는 폴리펩티드로서 이해되어야 한다. 바람직하게는 본 발명의 인터페론-베타는 인간 인터페론-베타를 나타낸다.
본 발명의 인터페론-베타는 해당 유전자가 발현되도록 형질전환된 숙주세포로부터 발현되어 세포내 또는 세포외 위치로 발현될 수 있다. 본 발명에서 숙주 세포는 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 또는 바람직한 특정 방식으로 유전자 생성물을 진행시키는 것을 선택할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질의 해독 및 해독 후 프로세싱과 변형에 대한 특징적이고 특이적인 기작을 갖고 있다. 적합한 세포주 또는 숙주 시스템으로는 발현된 이종 단백질의 바람직한 변형 및 프로세싱을 제공하는 것을 선택할 수 있다. 효모에서의 발현은 생물학적 활성 생성물을 생산할 수 있다. 진핵 세포에서의 발현은 천연 폴딩의 가능성을 증가시킬 수 있다.
본 발명에서 인터페론-베타를 안정되면서 연속적으로 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으나, 2당화된 인터페론-베타의 발현을 위해서는 원핵생물인 숙주세포는 사용될 수 없다. 본 발명의 숙주세포는 예를 들어, 이스트(Saccharomyces cerevisiae), 곤충 세포, 동물 세포 및 사람 세포일 수 있으며, 바람직하게는 CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주가 이용될 수 있으며, 가장 바람직하게는 본 발명에서 숙주세포는 CHO 세포주일 수 있다.
본 발명에서 배양은 목적 단백질인 인터페론-베타의 발현을 가능하게 하는 적절한 조건하에서 수행하며, 이러한 조건은 공지된 방법에 따라 수행할 수 있다. 형질전환 숙주세포는 통상적인 배양방법에 의해 대량으로 배양할 수 있다. 배양배지로는 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄로 구성된 배지를 사용할 수 있으며, 예를 들어, SFM4CHO, optiCHO SFM 등의 배지를 사용하고, 첨가물로써 200mM L-Glutamine 등을 사용할 수 있다. 숙주세포의 배양은 통상의 숙주세포 배양 조건상에서 가능하며 예를 들어, 온도범위 15℃ 내지 45℃에서 10시간 내지 40시간 동안 배양할 수 있다. 배양액 중의 배양배지를 제거하고 농축된 균체만을 회수하기 위해 원심분리(centrifugation) 또는 여과 (filtration)과정을 거칠 수 있으며 이러한 단계는 당업자가 필요에 따라 수행할 수 있다.
(b) 단계 : 상기 (a) 단계에서 수득한 배양액을 친화성 크로마토그래피를 수행하는 단계
본 명세서에서 용어 “친화성 크로마토그래피”는 친화성 크로마토그래피 물질을 이용하는 크로마토그래피 방법을 의미한다. 친화성 크로마토그래피에서, 폴리펩타이드는 크로마토그래피 작용기에 대한 정전기적 상호작용, 소수성 결합 및/또는 수소 결합 형성에 따른 이들의 생물학적 활성 또는 화학적 구조에 근거하여 분리된다. 특이적으로 결합된 폴리펩타이드를 친화성 크로마토그래피 물질로부터 회수하기 위해서, 경쟁자 리간드가 첨가되거나, 또는 pH 값, 극성 또는 완충제의 이온 강도와 같은 크로마토그래피 조건을 변화시킨다. 친화성 크로마토그래피 물질은 일정한 유형의 폴리펩타이드에만 결합하도록 서로 다른 단일한 크로마토그래피 작용기가 조합되는 복합 크로마토그래피 작용기를 포함하는 크로마토그래피 물질이다. 이 크로마토그래피 물질은 크로마토그래피 작용기의 특이성에 따라 일부 유형의 폴리펩타이드에 특이적으로 결합한다.
본 발명에서 친화성 크로마토그래피 물질은 인터페론, 바람직하게는 인테페론-베타에 친화성이 있는 염료 친화성 크로마토그래피 (dye affinity chromatography)일 수 있으며, 블루 세파로스를 레진(resin)으로 이용할 수 있다. 염료 친화성 크로마토그래피는 예를 들어 블루 덱스트란 세파로스 R (Blue Dextran Sepharose R) 또는 시바크론 R 블루 (Cibacron R Blue)가 고정된 매트릭스일 수 있다. 예를 들어, Amicon 사의 Matrex Gel Blue A, Merck 사의 Fraktogel 45 TSK AF-Blue 또는 GE Healthcare의 Blue-Sepharose R 6FF (fastflow)를 사용할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서 2당화된 인터페론-베타 단백질은 Blue-Sepharose R 6FF를 이용한 친화성 크로마토그래피에 의해서 인터페론-베타 단백질이 분리, 특히 당화 상태가 유지되며 인터페론-베타 단백질이 분리되는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명에서는 바람직하게는 친화성 크로마토그래피 물질로 Blue-Sepharose R 6FF를 사용할 수 있다.
Blue-Sepharose R 6FF를 이용한 염료 친화성 크로마토그래피에 의한 인터페론-베타의 분리, 정제는 당해 기술 분야에 여러 기술문헌으로 공지되어 있으며, 해당 기술 문헌에서의 크로마토그래피 수행 방법은 본 명세서에 참고로 포함된다.
인터페론-베타는 Blue-Sepharose R 6FF에 강하게 결합하며, 결합된 단백질들은 용출 전에 다양한 완충액에 의해 씻어 낼 수 있다. 통상적인 조건 하에서 인터페론-베타는 저농도라고 하더라도 Blue-Sepharose R 6FF에 잘 결합하기 때문에 이 단계는 본 발명에 따른 정제 공정의 첫 번째 크로마토그래피 단계로서 적합하다. IFN-beta의 용출을 위해 사용되는 시약으로는 Chaotropic agent 나 salt 등이 사용될 수 있으며, 에틸렌글리콜 (ethylene glycol) 또는 프로필렌글리콜 (propylene glycol) 등의 환원제를 포함하는 수용액을 사용할 수 있다. 바람직하게는 본 단계에서의 용출을 위해서는 프로필렌 글리콜 수용액이 사용될 수 있으며, 20% 내지 40%의 프로필렌 글리콜 수용액이 사용될 수 있다.
(c) 단계 : 상기 (b) 단계에서 수득한 용액을 low pH 불활성화하는 단계
본 명세서에서 용어 “low pH 불활성화”는 외피성 바이러스의 불활성화의 목적으로써 산을 첨가하여 pH 4.0 또는 그 이하의 pH의 산성 조건에서 바이러스성 외부 유입물을 불활성화하는 것을 나타낸다.
바람직하게는 low pH 불활성화는 산을 첨가하여 pH 2.0 내지 pH 4.0, 더 바람직하게는 pH 3.0 내지 pH 4.0 또는 pH 3.5 내지 pH 4.0이 되도록 처리한다. 처리 시간 및 온도는 10 내지 30℃ 또는 15 내지 25℃에서 30분 내지 4시간일 수 있다. 처리 후 필요에 따라서 염기성 용액을 이용하여 pH 6 내지 7.5, 바람직하게는 pH 6.5 내지 7.5로 중화하여 이후의 단계를 진행한다.
첨가되는 산은 무기산, 예를 들어, 인산, 염산, 황산 또는 유기산, 예를 들어 아세트산, 옥살산일 수 있으며, 바람직하게는 인산 수용액 (phosphoric acid)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 상기 (b) 단계의 용출물에 10배 희석된 pH 3.5의 인산 수용액을 첨가하여 pH를 4 또는 그 이하로 낮추고, 15 내지 25℃에서 1시간 동안 처리하여 low pH 불활성화를 수행하였고 이후 2M Trizma base를 이용하여 다시 중화하였다.
(d) 단계 : 상기 (c) 단계에서 수득한 용액을 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하는 단계
본 명세서에서 용어 “소수성 상호작용 크로마토그래피”는 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질이 이용되는 크로마토그래피 방법을 의미한다. 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질은 소수성 기, 예를 들면 부틸-, 옥틸- 또는 페닐 기가 크로마토그래피 작용기로서 결합되어 있는 크로마토그래피 물질이다. 폴리펩타이드는 그 표면에 노출된 소수성 부위의 성질에 의해서 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질의 소수성 기와 상호작용하여 분리될 수 있다. 폴리펩타이드와 크로마토그래피 물질 사이의 상호작용은 온도, 용매 및 용매의 이온 강도의 영향을 받을 수 있다. 아미노산 측쇄의 움직임이 증가하고 더 낮은 온도에서는 폴리펩타이드 내부에 파묻힌 소수성 아미노산 측쇄가 접근가능해지므로, 온도 증가는 예를 들면 폴리펩타이드와 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질 사이의 상호작용을 더 크게한다. 또한 소수성 상호작용은 코스모트로픽 염에 의해 촉진되고 카오트로픽 염에 의해 감소된다.
소수성 상호작용 크로마토그래피 물질은 부틸 세파로스, 페닐 세파로스, 옥틸 세파로스를 레진으로 하는, 예를 들면 페닐세파로스 CL-4B, 6FF, HP, 페닐 슈퍼로스, 옥틸세파로스 CL-4B, 4 FF 및 부틸세파로스 4FF일 수 있으며, 바람직하게는 부틸 세파로스, 더 바람직하게는 부틸세파로스 4FF를 레진으로 이용하여 수행되는 것일 수 있다.
(e) 단계 : 상기 (d) 단계에서 수득한 용액을 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계
본 명세서에서 용어 “음이온 교환 크로마토그래피”는 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 이용한 크로마토그래피 방법을 의미한다. 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 크로마토그래피 작용기로서 양이온으로 하전된 기를 가지는 고형상의 고분자물질이며, 음이온이 교환되는 물질을 의미한다. 보통 카운터 이온이 음이온 교환 크로마토그래피 물질과 결합되어 있으며, 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 주위 용액에 있는 유사하게 하전된 음이온을 카운터 이온과 교환할 수 있다.
예를 들면, 음이온 교환 크로마토그래피는 예를 들면, 상용의 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 이용한 크로마토그래피일 수 있으며, Biorad Laboratories사, Cyphergen사, GE Healthcare 등의 제조사에 의해서 제공되는 음이온 교환 크로마토그래피 물질을 이용할 수 있다.
음이온 교환 크로마토그래피는 4가 암모늄을 음이온 교환 수지로 이용하는, 바람직하게는 Q 레진을 레진(resin)으로 이용하여 수행될 수 있으며, 더 바람직하게는 Capto Q ImpRes를 이용하여 음이온 교환 크로마토그래피를 수행할 수 있다.
바람직하게는 이온 교환 크로마토그래피에서 음이온 교환 크로마토그래피가 먼저 수행된다. 이는 인터페론 베타 정제과정에서 불순물에 해당하는 basic variant와 virus, HCP (host cell protein), HCD (host cell DNA) 및 내독소 (endotoxin)를 보다 효과적으로 제거하기 위하여 필요한 단계이다.
(f) 단계 : 상기 (e) 단계에서 수득한 용액을 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계
본 명세서에서 용어 “양이온 교환 크로마토그래피”는 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 이용한 크로마토그래피 방법을 의미한다. 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 크로마토그래피 작용기로서 음이온으로 하전된 기를 가지는 고형상의 고분자물질이며, 양이온이 교환되는 물질을 의미한다. 보통 카운터 이온이 양이온 교환 크로마토그래피 물질과 결합되어 있으며, 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 주위 용액에 있는 유사하게 하전된 양이온을 카운터 이온과 교환할 수 있다.
하전된 기의 성질에 따라, 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 예를 들어, 설폰산 기(SP) 또는 카복시메틸 기(CM)을 가질 수 있다. 또한, 하전된 기의 성질에 따라, 하전된 치환기의 강도에 따라 강하거나 약한 양이온 교환 크로마토그래피 물질로서 추가로 분류될 수 있다. 예를 들면 강한 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 크로마토그래피 작용기로서 설폰산 기를 갖고, 약한 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 크로마토그래피 작용기로서 카복실산 기를 갖는다.
예를 들면, 양이온 교환 크로마토그래피는 예를 들면, 상용의 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 이용한 크로마토그래피일 수 있으며, Biorad Laboratories사, Cyphergen사, GE Healthcare 등의 제조사에 의해서 제공되는 양이온 교환 크로마토그래피 물질을 이용할 수 있으나, 바람직하게는 SP 세파로스를 레진(resin)으로 이용하여 수행될 수 있으며, 더 바람직하게는 sephadex S.F.F.를 이용하여 양이온 교환 크로마토그래피를 수행할 수 있다.
본 발명의 정제를 통해 분리되는 인터페론-베타는 인간 인터페론-베타의 활성을 가지고 있으며, 인터페론-베타의 생물학적 및/또는 면역학적 특징을 가지면서, GMP (의약품 및 의약부외품의 제조 관리 및 품질관리 규칙)의 관점에서 일상적인 처리에 있어서 적용가능해서, 바람직하게는 규제에 의한 용인 요건 (밸리데이션, 재현성) 및 인터페론-베타가 특정한 생화학적인 특질 (소수성 등)을 가지고 있다.
분리된 2당화된 인터페론-베타의 비활성은, 적어도 2×10 8IU/mg이어야 하며, 바람직하게는 적어도 3×10 8IU/mg, 더 바람직하게는 적어도 4×10 8IU/mg의 비활성을 가질 수 있다. 측정할 수 있는 IFN-beta의 2개가 필수적인 생물학적 활성은, 그 항바이러스 효과 및 항증식 효과다. 이 생물학적 활성을, 각각, 바이러스의 세포 변성 효과 저해를 통하는 표준적인 방법에 의해 측정할 수 있다. 인터페론 베타의 활성의 측정은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 2당화된 인터페론-베타의 정제방법은 바람직하게는 역상 크로마토그래피, 한외여과 또는 투석, 크기배제 크로마토그래피는 포함하지 않는다. 역상 크로마토그래피는 일반적으로 사용하는 버퍼인 아세토니트릴 (acetonitrile)이 유기용매이기 때문에, 대량 배양 및 정제를 위해서는 방폭 시설 등의 추가적인 설비가 필요하다는 단점이 있으며, 한외여과, 투석은 대량 배양 및 정제에 적절하지 않고, 폐액이 다수 발생할 수 있다는 단점이 있다. 아울러, 크기배제크로마토그래피는 대량 배양 및 정제시에 적절하지 않다는 단점이 있다.
바람직하게는 역상 크로마토그래피, 한외여과 또는 투석, 크기배제 크로마토그래피를 배제한 것은 상당한 노동력이 소요되거나, 많은 투자가 소요되는 고가의 설비를 필수적으로 사용하거나, 또한, 인화성 용매, 폭발 방호, 폐액의 처리 등 안전과 환경에 영향을 미치는 여러 제약을 원천적으로 배제할 수 있기 때문이다.
아울러, 본 발명은 상기한 본 발명의 정제 방법에 의해서 수득된 2당화된 인터페론-베타 단백질을 제공한다. 바람직하게는 본 발명의 인터페론 베타 단백질은 서열번호 1의 염기서열을 가지며, 25번째 아미노산 및 80번째 아미노산에 당쇄를 가진다.
상기 인터페론 베타 단백질이 가지는 당쇄는 oxford notation 방법에 따라 표기된 A2G2, FA2G2, FA2G2S1, FA2G2S2, FA2G2S*2, FA3G3S1, FA3G3S3, FA3G3S*3, FA4G4S1, FA4G4S3, FA4G4S4, FA4G4S*3, FA4G4S*4, FA4G4Lac1S3, FA4G4Lac1S*3, FA4G4Lac1S4, FA4G4Lac2S3, FA4G4Lac1S*3 구조의 당쇄일 수 있으며, 바람직하게는 상기 당쇄 중 어느 2개의 당쇄 구조를 가진다.
(F = core fucosylated;
A2, biantennary with both GlcNAcs as beta 1-2 linked;
A3, triantennary with a GlcNAc linked beta1-2 to both mannoses and the third GlcNAc linked beta 1-4 to the alpha 1-3 linked mannose;
A3', triantennary with a GlcNAc linked beta 1-2 to both mannoses and the third GlcNAc linked beta 1-6 to the alpha 1-6 linked mannose;
A4, GlcNAcs linked as A3 with additional GlcNAc beta 1-6 linked to alpha 1-6 mannose;
Gx, number (x) of galactose linked beta 1-4 to antenna;
Sx, number (x) of sialic acids linked to galactose; sialic acid is in an alpha 2-3 unless indicated by a * that alpha 2-6 linkages are also present;
Lacx, number (x) of lactosamine (Gal-GlcNAc) extensions.
The additional possible lactosamine structures are listed in italic)
본 발명의 일실시예에서 5 리터 스케일로 배양하여 인터페론-베타가 발현시킨 후에 본 발명의 2당화 인터페론-베타의 정제 방법을 이용하여 정제하였다. 2당화 인터페론-베타의 정제는 각각 블루 세파로즈(Blue sepharose 6 fast flow) 레진을 이용한 친화성 크로마토그래피, 산 첨가에 의한 low pH 불활성화, 부틸 세파로즈(Butyl 4 fast flow) 레진을 이용한 소수성 상호작용 크로마토그래피, 캡토 Q(Capto Q ImpRes) 레진을 이용한 음이온 교환 크로마토그래피, SP 세파로즈(SP sepharose fast flow) 컬럼을 이용한 양이온 교환 크로마토그래피를 순서에 따라 수행하여 진행하였다.
이에 대한 비교예로, 동일한 배양 발현에 의해 제조된 인터페론-베타를 기존 인터페론-베타 단백질의 정제 방법에 따라 블루 세파로즈(Blue sepharose 6 fast flow) 컬럼을 이용한 친화성 크로마토그래피, CM 세파로즈(CM sepharose fast flow) 레진을 이용한 양이온 교환 크로마토그래피, 를 이용한 역상크로마토그래피(VYDAC C4), 한외여과·농축, 크기배제 크로마토그래피(Sephacryl 100HR)를 순서에 따라 수행하여 진행하였다.
본 발명의 일실시예에서는 각 정제 방법에 따라 분리, 정제된 인터페론-베타를 수율 (yield), 단백질 변형 여부, 비활성, 함량 및 전체 활성의 관점에서 평가한 결과, 본 발명의 방법이 비교예 방법에 비해서 전체 함량, 수율, 메티오닌이 결실된 형태 (Met deletion form) 모두 우수한 것으로 나타났고, 비활성의 경우 비교예 방법이 본 발명의 방법에 비해서 높게 나왔으나, 전체적인 정제량을 고려한 전체적인 활성에서도 본 발명의 방법이 현저히 우수한 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 방법에 의하는 경우 2당화된 인터페론 베타를 우수한 품질 및 수율을 가지며, 더 높은 활성을 가지도록 분리/정제할 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명의 일실시예에서는 각 정제 방법에 따라 분리, 정제된 인터페론-베타의 불순물을 CHO 세포의 세포유래단백질 (CHO-HCP) 함량, 엔도톡신 함량, IEF에서의 패턴의 관점에서 확인한 결과, CHO 세포의 단백질, 엔도톡신의 경우 모두 통상적인 기준치에 부합되었으나, 본 발명의 방법이 불순물의 함량이 더 적게 검출되는 것을 확인할 수 있었다. 아울러, 본 발명의 방법에 의해서는 염기성 변이체 (basic variant)가 존재하지 않아 비교예 1의 방법에 비해서도 좀 더 순도 높은 정제방법임을 알 수 있었다.
상기한 바와 같은 일련의 공정을 통해 각 단계별 정제 수율 및 순도를 하기 표 1에 나타내었다.
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본 발명에서 제공하는 인터페론-베타 단백질의 정제 방법은 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 수율이 현저히 우수하고, 대량 배양에서의 제조 관리 및 품질관리가 용이하며, 의약품으로 사용하는 데에 있어서의 규제에 적합한 우수한 품질의 2당화된 인터페론-베타 단백질을 정제할 수 있다.
도 1은 본 발명의 정제방법을 모식적으로 기재한 것이다.
도 2는 본 발명의 정제방법 (우측패널) 및 비교 정제방법 (좌측패널)에 따라 정제된 정제물을 IEF 실험을 수행한 결과이다. 적색 화살표는 염기성 변이체를 나타낸다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 숙주세포에서의 2당화된 인터페론-베타의 발현 및 수득
배양액은 해당 2당화된 인터페론-베타 유전자를 포함하는 생산 CHO 세포주를 Hyclone사의 optiCHO SFM를 기본으로 하는 배지를 이용하여 5 리터 스케일로 배양하여 인터페론-베타가 발현되도록 하였다.
배양 시 초기온도는 34.0℃, pH 7.0, 용존산소량 50%로 하여 천천히 교반하면서 배양을 진행하였고, 9일동안 배양한 후, 배양기에서 회수된 배양액을 4500 rpm, 4℃ 조건으로 30분 동안 원심분리를 진행하였다. 원심분리 후, 상등액을 무균적으로 0.22 μm filtration을 수행한 뒤, 정제를 진행하였다.
실시예 2: 2당화된 인터페론-베타의 정제
실시예 1에서 수득된 인터페론-베타를 친화성 크로마토그래피를 이용한 정제공정에 투입하였다.
먼저 수확된 인터페론-베타 분획을 10mM Sodium phosphate, 137mM NaCl, 2.7mM KCl, pH 7.4의 용액으로 미리 평형화된 블루 세파로즈(Blue sepharose 6 fast flow; GE사) 컬럼에 결합시키고, 700mM sodium thiocyanate 용액으로 충분히 세척하였다. 그 후 20mM Sodium phosphate, 1.4M NaCl, 35% Propylene Glycol, 250mM L-Arginine, pH 7.4의 용액으로 용출시켜 이 분획을 수확하였다.
HPLC 분석 결과, 94% ~ 96%의 순도를 나타냈으며, 잔존 HCP 검출 결과로는 6300 ~ 9500ppm의 함량으로 첫 번째 정제가 완료되었다.
두 번째 스텝으로, pH 3.5의 Phosphoric acid (99%, 증류수를 이용하여 10배 희석)를 첨가하여 pH를 3.0이 되도록 조절하였다. 그 후 22℃에서 1시간 동안 처리한 다음 2M Trizma base로 중화하여 샘플로 하였다.
세 번째 스텝으로 20mM Tris, 1.4M NaCl, 300mM Arg, pH 7.4 용액으로 미리 평형화된 부틸 세파로즈(Butyl 4 fast flow; GE사) 컬럼에 결합시키고, 그 후 20mM Tris, pH 8.0의 용액으로 용출시켜 이 분획을 수확하였다.
네 번째 스텝으로 수득된 용출 분획물을 이용하여 20mM Tris, pH 8.0 용액을 이용하여, 캡토 Q(Capto Q ImpRes; GE사) 레진이 충진된 음이온 교환 크로마토그래피를 진행하였다. 용매를 용출시킨 용액은 20mM Tris, 140mM NaCl, pH 8.0을 사용하였다.
마지막 스텝으로, 이전에 음이온 교환수지에서 용출된 분획물은 50mM sodium acetate, pH 5.0으로 평형화된 SP 세파로즈(SP sepharose fast flow; GE사) 컬럼에 투입되어 150mM부터 500mM까지 염 농도차에 의한 양이온 교환 크로마토그래피를 진행하였다.
이로써 최종적으로 32%의 수율로써 얻어진 인터페론-베타 물질은 95% 이상의 순도를 나타내며, HCP는 기준치 이하인 100ppm을 기록하였고, IEF 및 SDS-PAGE 겔 분석결과 특이사항이 없는 최종 생산물을 수득하였다.
비교예 1: 기존 인터페론-베타 단백질 정제 방법에 따른 정제
배양에서 수득된 인터페론-베타 분획을 10mM Sodium phosphate, 137mM NaCl, 2.7mM KCl, pH 7.4의 용액으로 미리 평형화된 블루 세파로즈(Blue sepharose 6 fast flow; GE사) 컬럼에 결합시키고, 700mM sodium thiocyanate 용액으로 충분히 세척하였다. 그 후 20mM Sodium phosphate, 1.4M NaCl, 35% Propylene Glycol, pH 7.0의 용액으로 용출시켜 이 분획을 수확하였다.
위 공정으로 얻어진 분획물은 20mM sodium phosphate, pH 2.7의 용액으로 5배 희석하고 CM 세파로즈(CM sepharose fast flow; GE사)레진을 이용하여 두 번째 공정인 양이온 교환 크로마토그래피에 투입하였다. 이때 사용된 용출 용매는 50mM NaPi, 0.145M NaCl, 10% PG, pH 7.0로 하였다.
이후 용출된 인터페론-베타 시료는 유기용매인 Acetonitrile 30%와 Trifluoracetic acid 0.1%를 버퍼용액으로써 사용하고, HPLC 역상크로마토그래피 컬럼(VYDAC C4; Agilent사)을 거쳐 용출시킨다. 이때, 용출되는 시료의 수집용기에는 20mM Sodium phosphate monobasic pH 2.9를 미리 넣어두어 시료가 용출되는 동시에 희석되도록 하며 인터페론-베타를 수득하였다.
이전 공정에서 7배 희석된 인터페론-베타 용출시료는 용량을 줄임과 동시에, 가장 효율적인 방법으로 정제되기 위하여, 한외 여과·농축을 위해 Millipore 사의 TFF 시스템(Pellicon Biomax 10; Millipore사)을 거쳐, 약 7배가량 농축을 진행하였다. 이때 교환하는 용액은 20mM Sodium phosphate pH 2.9로 하였으며, 농축의 농도는 보통 크기배제 크로마토그래피의 레진 특성에 따르는 것을 기본으로 한다.
마지막 공정으로 크기배제 크로마토그래피(Sephacryl 100HR; GE사)를 이용하여 불필요한 물질들을 제거하였으며, 이때 용출시료는 25mL씩 수집하였고 최종적으로 인터페론-베타가 포함된 분획물을 수득하였다.
실시예 3: 정제 방법의 평가
3-1. 활성 및 수율 등의 평가
실시예 2 및 비교예 1의 정제 방법을 수율 (yield), 단백질 변형 여부, 비활성, 함량 및 전체 활성의 관점에서 평가하였다.
단백질 정량은 UV측정방법을 이용하였다. 0.5M NaOH와 크기배제 크로마토그래피 용출용매를 1:1로 넣은 용액으로써 영점을 맞추고, 크기배제 크로마토그래피에서 수득된 목적물과 0.5M NaOH를 1:1로 혼합하여 UV파장 290nm에서 측정하였다. 측정은 3회를 기본으로 하며, 다음과 같은 계산식으로 수치화하였다.
-(3회 측정값의 평균 ÷ 흡광계수) × 희석배수 (mg/mL)
수율은 블루 세파로즈를 통과한 용출물 기준(100%)으로 하여 이에 대한 상대적인 함량을 인터페론 베타에 특이적인 1차 항체를 이용한 효소면역측정법(ELISA)에 의해서 측정하였으며, 이때 사용된 효소면역측정방법은 다음과 같다. 효소접합 항체용액을 측정 플레이트에 농도에 맞게 분주한 뒤, 표준용액과 측정하고자 하는 시험용액을 최소 8개의 희석농도로 2반복이 되도록 첨가하였다. 이후 일정시간 반응 뒤에 세척과정을 거친 뒤, 발색반응을 일으키는 기질용액을 첨가하여 반응을 유도하였다. 이후 반응이 멈춘 후, 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
단백질 변형 여부는 HPLC 장비를 이용한 펩티드 맵핑 (peptide mapping)을 수행하여 측정하였다. 크로마토그래피 시스템과 측정기를 이용하여 분석 시료를 주입하고, 214nm의 파장에서 측정된 수치에 대하여 머무름 값과 적분 값에 해당하는 단백질 구조 및 아미노산 변성을 확인하였다.
비활성의 측정은 세포 변성 효과 분석법(CPE(Cytopathic effect) assay)에 의해서 다음과 같이 측정하였다. 비활성 측정을 위한 표준물질 (standard)는 다음과 같이 준비하였다: NIBSC(National Institute for Biological Standads and Control)에서 구매한 인터페론 베타를 MEM 배양배지에 혼합하여 적정 Activity(standard stock solution (2,000IU/mL))로 만든 다음 STD Activity (IU/㎖)를 200부터 0.390625IU/㎖까지 순차적으로 희석하여 준비하였다.
정제된 각 샘플을 예상 activity가 50IU/㎖이 되도록 MEM 배양 배지를 사용해 희석하였고, (volume은 1500ul 이상), 이를 다시 50부터 0.390625IU/ml까지 순차적으로 희석하여 측정용 샘플을 준비하였다.
측정용 샘플과 표준물질을 각각 96well culture plate에 나누어 담고, A549 cell을 3x10 4 세포/well로 웰에 투입한 다음 37℃, 5% CO 2 조건으로 22시간동안 인큐베이션 (incubation)하였다. 플레이트에서 배지를 제거한 후 바이러스 용액 (virus solution, 1000 TCID50/ml)을 각 well에 나누어 담고, 37℃, 5% CO 2조건으로 22시간동안 인큐베이션 하였다. 플레이트에서 용액을 제거한 다음 Crystal Violet Solution으로 상온에서 염색하고, 2-Methoxyethanol로 탈염색한 다음 570nm에서 흡광도를 측정하여 비활성을 계산하였다.
각각의 분석항목의 결과는 다음 표와 같다.
Figure PCTKR2020008847-appb-img-000002
측정 결과, 비교예 1의 방법에 있어서는 전체 함량은 16.5mg, 수율은 11% 내외, 메티오닌이 결실된 형태 (Met deletion form)가 3.6%를 나타내었다. 비활성의 경우 327MIU/mg으로 본 발명의 방법에 비해서 높게 나왔으나, 정제된 함량이 16.5mg에 지나지 않아 전체적인 활성은 5395MIU에 그쳤다.
이에 비해서 본 발명의 방법에 있어서는 전체 함량은 26.4mg, 수율은 20% 내외, 메티오닌이 결실된 형태는 2.8%이며, 전체 활성은 6520MIU로 높게 나왔다.
따라서, 본 발명의 방법에 의하는 경우 2당화된 인터페론 베타를 우수한 품질 및 수율을 가지며, 더 높은 활성을 가지도록 분리/정제할 수 있음을 알 수 있었다.
3-2. 불순물 평가
비교예 1 및 실시예 2에서의 정제시 불순물을 CHO 세포의 세포유래단백질 (CHO-HCP) 함량, 엔도톡신 함량, IEF에서의 패턴의 관점에서 확인하였다.
목적단백질인 인터페론-베타와 분리되야 하는 CHO 세포 유래의 단백질 함량의 측정은 효소면역측정법 (ELISA)를 이용하였다. 희석용액을 준비하여 플레이트에 분주해두고, 분석용 시료를 최종 절반까지 희석하였다. 희석된 시료와 더불어 표준용액을 분석용 키트에 포함된 플레이트에 옮겨 분주하고(이때 키트 부속 플레이트에는 효소접합 항체가 도포되어 있다), 발색반응을 나타내는 기질용액을 첨가하여 반응을 유도하였다. 이후 플레이트는 450nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 표준검량곡선 대비 CHO 세포 유래 단백량을 분석하였다.
잔존 Endotoxin 수준을 측정하고자 LAL(Limulus Amebocyte Lysate) 분석법을 활용하였다. Endotoxin 표준시료를 LAL분석전용증류수에 잘 섞어 녹인 뒤, 분석용 테스트튜브에 표준검량곡선을 그리고자 하는 농도로 준비하였다. 이후 준비된 농도별 표준시료, 영점용액, 분석시료를 플레이트에 같은양으로 분주하였다. 분석전용증류수에 LAL시약을 잘 녹인뒤, 앞서 준비된 플레이트에 고르게 분주하고 반응을 유도하였다. 반응이 끝난 플레이트는 405nm파장에서 흡광도를 측정하여 목적물질에 존재하는 endotoxin 수준을 측정하였다.
IEF 겔 분석에 쓰일 양·음극 버퍼를 준비하고, 분석시료와, 표준시료의 양이 같도록 계산하여 IEF분석버퍼(pH 3-10)와 각각 혼합하여 분석용 전개샘플을 만들었다. pH 3-10 IEG 겔을 전개용기에 결착시킨 후 전개용기의 안에는 양극버퍼를, 밖의 공간에 음극버퍼를 채우고 준비된 시료들을 겔에 주입하였다. 준비된 전개용기에 200V로 1시간, 500V로 30분 순으로 전개한 뒤, 완료된 겔을 분리하여 쿠마시 염색 및 탈색을 진행하고 화학발광분석기를 통해 단백질의 등전점을 파악하였다.
Figure PCTKR2020008847-appb-img-000003
그 결과, CHO 세포의 단백질은 비교예 1의 경우 65ppm이었으나, 본 발명의 방법에 따르면 42ppm으로 나타났다. 통상적인 기준치인 100ppm이하로 모두 나타났으나, 본 발명에서는 음이온 교환 크로마토그래피에 이어서 양이온 교환 크로마토그래피를 수행함으로써 좀 더 낮게 나타나는 것으로 확인되었다.
엔도톡신의 경우 두 경우 모두 함유되지 않았으며, IEF의 결과를 확인한 결과 (도 1), 비교예 1에서는 약 pH 7.7 근방에 미량의 염기성 변이체 (basic variant)가 확인되는 것에 비해서 (화살표), 본 발명의 방법에서는 염기성 변이체가 확인되지 않아 좀 더 순도 높은 정제방법임을 알 수 있었다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 인터페론-베타 단백질의 정제 방법은 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 수율이 현저히 우수하고, 대량 배양에서의 제조 관리 및 품질관리가 용이하며, 의약품으로 사용하는 데에 있어서의 규제에 적합한 우수한 품질의 2당화된 인터페론-베타 단백질을 분리할 수 있어 산업상 이용가능성이 크다.

Claims (10)

  1. 하기 단계를 포함하는, 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 방법:
    (a) 숙주세포에서 발현된 인터페론-베타를 포함하는 배양액을 수득하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 배양액을 친화성 크로마토그래피를 수행하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계에서 수득한 용액을 low pH 불활성화하는 단계;
    (d) 상기 (c) 단계에서 수득한 용액을 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하는 단계;
    (e) 상기 (d) 단계에서 수득한 용액을 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계; 및
    (f) 상기 (e) 단계에서 수득한 용액을 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인터페론-베타 단백질은 서열번호 1의 펩타이드 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 숙주세포는 CHO (chinese hamster ovary) 세포인 것을 특징으로 하는 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 친화성 크로마토그래피는 블루 세파로스를 레진(resin)으로 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 소수성 상호작용 크로마토그래피는 부틸 세파로스를 레진(resin)으로 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피는 Q 레진을 레진(resin)으로 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피는 SP 세파로스를 레진(resin)으로 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 방법.
  8. 제1항의 정제 방법에 의해서 수득된 2당화된 인터페론-베타 단백질.
  9. 제8항에 있어서, 상기 인터페론 베타 단백질은 서열번호 1의 염기서열을 가지며, 25번째 아미노산 및 80번째 아미노산에 당쇄를 가지는 것을 특징으로 하는 인터페론 베타 단백질.
  10. 제8항에 있어서, 상기 인터페론 베타 단백질은 A2G2, FA2G2, FA2G2S1, FA2G2S2, FA2G2S*2, FA3G3S1, FA3G3S3, FA3G3S*3, FA4G4S1, FA4G4S3, FA4G4S4, FA4G4S*3, FA4G4S*4, FA4G4Lac1S3, FA4G4Lac1S*3, FA4G4Lac1S4, FA4G4Lac2S3, FA4G4Lac1S*3 중 어느 2개의 당쇄 구조를 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 인터페론 베타 단백질.
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