WO2018066891A2

WO2018066891A2 - 인터페론 베타 변이체의 안정화 제제

Info

Publication number: WO2018066891A2
Application number: PCT/KR2017/010826
Authority: WO
Inventors: 이희정; 김남아
Original assignee: 에이비온 주식회사
Priority date: 2016-10-06
Filing date: 2017-09-28
Publication date: 2018-04-12
Also published as: PT3524231T; CN110337287A; EP3524231A4; ES2921235T3; KR20180038290A; EP3524231B1; EP3524231A2; WO2018066891A3; DK3524231T3; PL3524231T3; KR101943160B1; US20190247506A1; US11207411B2; CN110337287B; HUE059558T2

Abstract

본 발명은 인간 인터페론 베타 변이체(R27T), 아세트산 완충액, 아르기닌, 트레할로스, 폴록사머 188(Poloxamer 188), 및 메티오닌을 포함하는 R27T의 안정화된 약학 제제에 관한 것이다. 본 발명에 따른 안정화 R27T 약학 제제는, 본 발명자들이 이전에 연구한 만니톨을 포함하는 제제의 조성에서 만니톨을 트레할로스로 대체하여 신규한 조성의 제제를 개발한 것으로서, 상기 제제는 만니톨과 아르기닌 HCl 혼합 첨가에 따른 단백질 응집체 증가의 단점을 보완할 수 있으며, 열역학적/구조적 안정성과 이에 따른 장기보관 시 안정성이 증진됨을 확인하였는바, 상기 제제는 다발성 경화증, 암, 자가면역질환, 바이러스 감염질환, HIV 감염질환, C형 간염, 및 류마티스 관절염 등의 예방, 개선 및 치료에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

인터페론 베타 변이체의 안정화 제제

본 발명은 인간 인터페론 베타 변이체(R27T), 아세트산 완충액, 아르기닌, 트레할로스, 폴록사머 188(Poloxamer 188), 및 메티오닌을 포함하는 R27T의 안정화된 약학 제제에 관한 것이다.

인터페론(IFNs)은 사이토카인의 일종으로서 항-바이러스 활성을 나타내고, 세포 증식을 억제하며 자연 면역 반응을 조절하는 기능을 갖는다. IFN은 세포 기원(백혈구, 섬유모세포, T 세포)에 따라 IFN-α, IFN-β, IFN-γ로 분류된다.

이 중 인터페론-베타(IFN-β)는 5개의 알파-헬릭스(α-helix)를 가지고 있는 구형의 단백질로써 22 kD의 크기이며 당쇄를 제거하면 18 kD이 된다. IFN-β의 임상 적용에 관한 연구는 활발하게 진행 중에 있고, 특히 다발성 경화증(Multiple Sclerosis)에 대한 증상의 완화, 경감 또는 치료제로 각광을 받고 있으며, 또한 다양한 연구들을 통해 항바이러스 활성, 세포 성장 억제, 림프구 세포 독성 증대 활성, 면역 조절 활성, 표적 세포의 분화 유도 또는 억제 활성, 대식세포의 활성화, 사이토카인 생성의 증가 활성, 세포독성 T세포의 효과 증가 활성, 자연 살해 세포(natural killing cell)의 증가 활성 등의 다양한 면역학적 활성으로 암, 자가 면역 장애 및 바이러스 감염, HIV와 관련된 질병, C형 간염, 및 류마티스성 관절염 등의 치료에 효과가 있다는 연구 결과들이 보고된바 있다.

인간 IFN-β 역시 당단백질의 일종으로, 단백질에 연결된 당쇄 부분이 단백질의 활성에 중요한 역할을 하기 때문에 당단백질의 경우 당쇄를 부가시키게 되면 그 활성이 증가하는 경우가 있다. 즉, 단백질 당화는 안정성, 용해도, 세포내 수송 활성(intracellular trafficking activity), 약물 동태 및 항원성과 같은 많은 생화학적 특성에 영향을 미칠 수 있는 것으로 알려져 있다.

이에, 당단백질인 인간 천연형 IFN-β에 당쇄를 도입시켜 그 활성이나 기능이 증가 또는 향상된 인간 IFN-β 변이체를 제조한 예가 보고된 바 있다(한국특허등록 10-0781666). 본 발명에서 이용한 인간 IFN-β 변이체인 R27T는 IFN-β 1a의 25번째 위치에 추가적인 당화를 위하여 27번째 위치의 아르기닌(Arg)을 트레오닌(Thr)으로 대체하여 설계된 재조합 인간 IFN-β 변이체(이하, rhINF-β)로서, 야생형의 INF-β 1a(Rebif)와 비교하였을 때 안정성 증가, 단백질 응집 경향 감소, 및 반감기 증가의 효과를 나타낸다. 즉, R27T는 위치-지정 변이를 통해 추가적인 당화로 생성된 rhINF-β의 바이오베터(biobetter)이다.

한편, 단백질 의약품 개발에 있어서 주요 과제 중 하나는 충분한 화학적, 물리적, 생물학적 안정성을 부여하여 24개월 이상 장기간의 유통기한을 가지는 제품을 생산하는 것이다. 그러나 단백질 분해 경로에서 다양한 고유의 민감성(intrinsic susceptibility), 단백질의 거대분자, 2차, 3차, 4차 구조와 같은 다양한 level을 가진 단백질 구조의 복잡성 때문에 높은 안정성을 달성하는 것은 여전히 어려운 문제이다.

최초의 재조합 펩타이드 호르몬으로서 인슐린이 1982년에 처음으로 승인되어 성공적으로 생산된 지 30년 이상 된 현재, 이를 이어서 수많은 재조합 단백질/펩타이드 의약품의 성공 사례들이 보고되고 있다. 그러나 바이오 의약품의 개발 과정, 특히 제제화에 있어서, 단백질 응집, 물리화학적 불안정성, 낮은 반감기, 저용해성, 약물 동태학적 특성(pharmacokinetic properties) 등 여러 가지 요인 때문에 여전히 난관에 직면하고 있다.

특히, 단백질 응집은 거의 모든 바이오의약품 공정에서 쉽게 발생하는 주요 문제들 중 하나인데, 보관하는 동안 치료용 단백질이 용액에서 구조적/열역학적으로 불안정하기 때문이다. 치료용 단백질은 정제, 가공, 보관 시 다양한 요인으로 인한 구조적 변화에 민감하기 때문에 단백질들이 고온, 최고/최저 pH, 전단 변형률(shear strain) 및 표면흡착에 노출되면 상기와 같은 문제들이 악화될 수 있다. 또한, 단백질 기반 바이오 의약품들은 풀림(unfolding), 응집, 비정상적인(non-native) 응집으로 인한 불용성 입자화와 같은 물리적 변성(degradation)의 가능성이 있기 때문에 단백질 응집이나 물리적 변성을 피하고 안정성을 최대화하기 위해서 안정적인 pH 범위, 적절한 완충액 시스템, 및 부형제의 개발 등 제제 시스템 최적화가 요구된다.

이에, 본 발명자들은 상기 인간 IFN-β 변이체의 보관 및 열역학적/구조적 안정성이 증진된 안정화된 약학 제제를 개발하고자 하였다.

본 발명자들은 종래의 문제점을 해결하기 위하여, 인간 인터페론 베타 변이체인 R27T의 안정성을 증진시킬 수 있는 약학 제제를 개발하기 위하여 예의 연구한 결과, 기존의 제제와 비교하여 보관 및 열역학적/구조적 안정성 증진과 더불어 R27T 단백질의 응집체 형성이 감소된 신규한 조성의 안정화 R27T 제제를 개발하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 신규한 조성의 인간 인터페론 베타 변이체(R27T)의 안정화된 약학 제제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기를 포함하는, 인간 인터페론 베타 변이체(R27T)의 안정화된 약학 제제를 제공한다.

(a) 인간 인터페론 베타 변이체(R27T),

(b) 5 내지 100 mM 농도의 아세트산 완충액,

(c) 10 내지 150 mM 농도의 아르기닌(Arginine),

(d) 50 내지 300 mM 농도의 트레할로스(Trehalose),

(e) 0.1 내지 10 mg/mL 농도의 폴록사머 188(Poloxamer 188), 및

(f) 0.5 내지 5 mM 농도의 메티오닌(Methionine).

본 발명의 일구현예로, 상기 인간 인터페론 베타 변이체(R27T)는 인간 인터페론 베타의 27번째 아미노산인 아르기닌이 트레오닌으로 치환되어 25번째 아미노산인 아스파라진 잔기에 N-연결형 당쇄를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 아세트산 완충액은 10 내지 30 mM의 농도로 포함되어 있는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 아세트산 완충액은 pH가 3.6 내지 4.4의 범위인 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 아르기닌은 50 내지 100 mM의 농도로 포함될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 트레할로스는 150 내지 250 mM의 농도로 포함될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 폴록사머 188은 0.1 내지 1 ㎎/mL의 농도로 포함될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 메티오닌은 0.5 내지 2 mM의 농도로 포함될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 안정화된 약학 제제는 수소 이온 농도 지수(pH)가 3.6 내지 4.4의 범위인 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 안정화된 약학 제제는 다발성 경화증, 암, 자가면역질환, 바이러스 감염질환, HIV 감염질환, C형 간염, 및 류마티스성 관절염으로 이루어진 군에서 선택되는 질환의 예방 또는 치료용일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 안정화된 약학 제제는 경구 또는 비경구 투여용일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 안정화된 약학 제제는 액상 또는 동결건조 제형인 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 안정화 제제를 약제학적 유효량으로 포함하는 다발성 경화증, 암, 자가면역질환, 바이러스 감염질환, HIV 감염질환, C형 간염, 및 류마티스성 관절염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 안정화 제제를 약제학적 유효량으로 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 다발성 경화증, 암, 자가면역질환, 바이러스 감염질환, HIV 감염질환, C형 간염, 및 류마티스성 관절염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 안정화 제제의 다발성 경화증, 암, 자가면역질환, 바이러스 감염질환, HIV 감염질환, C형 간염, 및 류마티스성 관절염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

본 발명에 따른 안정화 R27T 약학 제제는, 본 발명자들이 이전에 연구한 만니톨을 포함하는 제제의 조성에서 만니톨을 트레할로스로 대체하여 신규한 조성의 제제를 개발한 것으로서, 상기 제제는 만니톨과 아르기닌 HCl 혼합 첨가에 따른 단백질 응집체 증가의 단점을 보완할 수 있으며, 열역학적/구조적 안정성과 이에 따른 장기보관 시 안정성이 증진됨을 확인하였는바, 상기 제제는 다발성 경화증, 암, 자가면역질환, 바이러스 감염질환, HIV 감염질환, C형 간염, 및 류마티스 관절염 등의 예방, 개선 및 치료에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 인간 인터페론 베타 변이체(R27T)의 유전자 및 단백질 서열을 나타낸 것이다.

도 2는 만니톨을 첨가하여 제조한 R27T 제제(Mannitol 250 mM, Arginine HCl 50 mM, Poloxamer 188 0.5 ㎎/mL, 및 Methionine 1 mM의 부형제 첨가 제제) 및 만니톨 대신 트레할로스, 수크로오스, 또는 자일리톨을 각각 150, 200, 및 250 mM의 농도로 첨가하여 제조한 총 10종의 제제를 0.1 ㎎/mL의 농도로 4℃에서 0, 1주, 2주, 3주, 및 3개월 동안 냉장보관한 후 크기-배제 크로마토그래피(SEC)를 통해 잔여 단량체량을 측정함으로써 제제의 보관 안정성을 평가한 결과이다.

도 3은 도 2와 동일한 만니톨을 첨가하여 제조한 R27T 제제 및 만니톨 대신 트레할로스 또는 자일리톨을 각각 200 또는 250 mM의 농도로 첨가하여 제조한 총 5종의 제제를 고온인 37℃에서 0, 14, 21, 및 28일 동안 보관한 후 SEC를 수행하여 잔여 단량체량을 측정함으로써 제제의 보관 안정성을 평가한 결과이다.

도 4는 도 2 및 도 3과 동일한 만니톨 또는 트레할로스를 포함하는 조성의 제제에서 아르기닌 HCl의 첨가 유무에 따른 R27T의 안정성을 검증하기 위한 것으로, 각 제제를 저농도(0.1 ㎎/mL) 또는 고농도(0.64 ㎎/mL)로 37℃의 고온에서 1, 7, 14, 및 28일 동안 보관한 후 SEC 분석을 통해 단백질 응집 정도를 측정한 결과이다.

이하, 본 발명을 자세히 설명한다.

본 발명자들은 인간 인터페론 베타 변이체인 R27T에 대한 안정화된 약학 제제를 개발하기 위한 이전의 연구를 통해, R27T를 위한 최적화된 기초 완충액 시스템으로 pH 3.8 ± 0.2의 20 mM 아세트산 완충액을 선정하였으며, R27T의 안정성을 증진시키기 위한 다양한 부형제를 첨가한 실험들을 통해 만니톨(Mannitol), 아르기닌 HCl(Arginine HCl), 폴록사머 188(Poloxamer 188), 및 메티오닌(Methionine)을 첨가하여 제조한 제제가 기존의 제제와 비교하여 R27T의 안정성을 증진시킬 수 있는 조성임을 확인한바 있다. 그러나 상기 만니톨과 아르기닌 HCl의 혼합 조성은 고농도 및 고온 보관의 경우 기존 제제에 비하여 안정성이 감소하는 단점이 존재하였는바, 이러한 단점을 극복하기 위해 본 발명자들은 만니톨을 대체할 수 있는 부형제를 스크리닝함으로써 R27T의 안정성을 증진시킬 수 있는 새로운 조성의 R27T의 안정화된 약학 제제를 개발하였다.

이에, 본 발명은 인간 인터페론 베타 변이체(R27T) 및 5 내지 100 mM 농도의 아세트산 완충액, 10 내지 150 mM 농도의 아르기닌(Arginine), 50 내지 300 mM 농도의 트레할로스(Trehalose), 0.1 내지 10 mg/mL 농도의 폴록사머 188(Poloxamer 188), 및 0.5 내지 5 mM 농도의 메티오닌(Methionine)을 포함하는, 인간 인터페론 베타 변이체(R27T)의 안정화된 약학 제제를 제공한다.

본 발명의 일실시예에서는, 상기 만니톨을 첨가하여 제조한 R27T 제제와 비교하여 R27T의 보관 안정성을 증진시킬 수 있는 만니톨 대체제를 찾기 위해 트레할로스, 수크로오스, 및 자일리톨을 이용하여 동일한 조성으로 R27T 제제를 제조한 후 각 제제를 저농도에서 보관한 후 안정성을 측정하였다. 그 결과, 트레할로스를 이용한 경우 보관 안정성 및 가역성이 크게 증가함을 확인하였으며, 수크로오스 및 자일리톨을 이용한 경우에도 비교적 제제의 가역성이 증가하는 것을 확인하였다(실시예 2 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, 실시예 2의 결과를 바탕으로 만니톨을 대신하여 트레할로스 또는 자일리톨을 부형제로 첨가한 R27T 제제의 안정성 및 항바이러스 활성을 측정한 결과, 고온 보관 시 트레할로스를 첨가하여 제조한 제제의 경우 열에 대한 안정성 및 농도 증가에 따른 안정성이 가장 큰 것을 확인하였고, 만니톨을 이용한 제제와 비교하여 유사한 정도의 열역학/구조적 안정성 및 항바이러스 활성을 나타내는 것을 확인하였다(실시예 3 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 만니톨 또는 트레할로스가 아르기닌과 혼합된 조성에서 단백질 응집체 변화를 통해 제제의 안정성을 분석한 결과, 만니톨은 아르기닌이 없는 경우에 비해 아르기닌과 혼합하였을 때 단백질 응집이 증가하는 반면, 트레할로스의 경우 아르기닌과의 혼합 조성에서 단백질 응집이 오히려 감소함을 확인하였다(실시예 4 참조).

상기 본 발명의 실시예 결과들을 통하여 트레할로스를 부형제로 사용한 본 발명의 신규한 R27T 안정화 약학 제제는 만니톨을 이용한 기존의 R27T 제제에 비하여 안정성이 우수함을 확인하였는바, 인터페론 베타를 이용한 다양한 질환의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "인터페론-베타(IFN-β)"는 생물학적 유동액으로부터 분리하여 얻어지거나 진핵 또는 원핵 숙주 세포로부터 DNA 재조합 기술로 얻어진 인간 기원의 섬유모세포 인터페론뿐만 아니라, 그의 염, 기능성 유도체, 변이체(variants), 유사물 및 활성 분획물을 포함하는 것을 의미한다. 바람직하게는 IFN-β는 인터페론 베타-1a를 의미하고자 한다.

본 발명에서 만니톨의 대체체로써 사용된 트레할로스(Trehalose)는 2분자의 D-글루코오스가 1→1결합한 비환원성 이당류를 의미하며, 화학적으로 α,α형, α,β형, β,β형의 3가지 형이 있고 천연적으로 얻을 수 있는 것은 α,α형이다. 맥각에서 최초로 발견되었고, 균이나 효모에 다량 존재하고 곤충의 체액과 난(egg)에서도 관찰되었으며, 곤충류의 에너지원이나 저장탄수화물로서 중요한 역할을 담당하고 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "안정화 제제"는, 그 안에 포함된 단백질의 분해, 변성, 응집, 생물학적 활성의 손실의 정도가 허용 가능할 정도로 제어되며 시간에 따라 허용불가능하게 증가하지 않는 것이다. 바람직하게 상기 제제는 24개월까지는 R27T 활성의 적어도 약 60%, 바람직하게는 적어도 약 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 80%를 유지하는 것이다.

본 발명에서 사용된 용어 "완충액"은 제제에 바람직한 pH 범위에 속하도록 제제의 pH를 조절 또는 유지하는 효과를 갖는 화합물의 용액을 의미하는 것이다. 본 발명에 있어서 pH를 조절하기에 적합한 완충액에 제한은 없지만, 상기 완충액은 인산, 아세트산, 구연산, 히스티딘과 같은 화합물을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 5 내지 100 mM의 농도 아세트산 완충액이며, 바람직하게 10 내지 30 mM의 농도, 더욱 바람직하게는 20 mM의 농도로 포함될 수 있다.

본 발명에 있어서, R27T의 안정화된 약학적 제제는 인간 인터페론 변이체인 R27T를 포함하는 용액을 5 내지 100 mM 농도의 아세트산 완충액 및 부형제를 포함하는 용액을 이용하여 투석하는 단계; 상기 투석액을 여과하는 단계를 포함하여 제조할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 부형제는 10 내지 150 mM 농도의 아르기닌, 50 내지 300 mM 농도의 트레할로스, 0.1 내지 10 ㎎/mL 농도의 폴록사머 188, 및 0.5 내지 5 mM 농도의 메티오닌을 첨가할 수 있고, 보다 바람직하게는 50 내지 100 mM 농도의 아르기닌, 150 내지 250 mM 농도의 트레할로스, 0.1 내지 1 ㎎/mL 농도의 폴록사머 188, 및 0.5 내지 2 mM 농도의 메티오닌을 첨가할 수 있다.

본 발명의 R27T의 안정화된 약학적 제제가 "액상 제형"으로 제조되는 경우, 바람직한 용매는 물 또는 멸균 주사용수이며, 단일용량제제(monodose) 또는 다용량제제(multidose)일 수 있다. 본 발명의 다용량제제용 액상 R27T 제제는 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질알콜, 알킬파라벤(메틸, 에틸, 프로필, 부틸등), 벤즈알코늄클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 소듐 데히드로아세테이트 및 티메로살과 같은 정균제를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 정균제는 다용량제제의 주사기간, 약 12 또는 24시간에서 약 12일, 바람직하게는 약 6 내지 12일 동안에 걸쳐 반드시 무균인 제제(주사에 적당한)를 유지시키기에 효과적인 농도를 줄 수 있는 함량으로 사용된다. 상기 정균제는 약 0.1% 내지 약 2.0%(정균제의 질량/용매의 질량)의 농도로 존재하는 것이 바람직하다.

본 발명의 제제는 추가로 희석제, 부형제 및 담체뿐만 아니라 생리학상/제약상 허용되는 첨가제, 예컨대 자유-유동화제, 유화제, 안정화제, 방부제, 착색제, 소포제 및 고결 방지제를 임의로 포함할 수 있다.

약제학적으로 허용 가능한 담체에 특별한 제한은 없으나, 생리식염수, 폴리에틸렌글리콜, 에탄올, 식물성 오일, 및 이소프로필미리스테이트 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 안정화 제제를 약제학적 유효량으로 개체에 투여하여 다발성 경화증, 암, 자가면역질환, 바이러스 감염질환, HIV 감염질환, C형 간염, 류마티스성 관절염 등의 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간, 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.

"약제학적 유효량"은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하게 조절될 수 있음은 당업자에게 명백하다.

본 발명의 제제의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로, 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직하게는, 1일 0.001 내지 100 mg/체중kg으로, 보다 바람직하게는 0.01 내지 30 mg/체중kg으로 투여한다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 여러번 나누어 투여할 수 있다.

본 발명의 제제는 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여방법에는 제한이 없으며, 예를 들면, 경구, 직장, 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막, 또는 뇌혈관(intra cerbroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험방법

1-1. 크기-배제 크로마토그래피(Size Exclusion Chromatography; SEC)

R27T 시료는 TSK-GEL G3000SWXL SEC 컬럼(TOSOH Bioscience, PA, USA)과 다이오드 검출기(DAD)가 장착된 Agilent 고성능 액체 크로마토그래피 시스템(Agilent HPLC 1260, Santa Clara, CA, USA)을 사용하여 분석하였다. 수용성 R27T 입자를 분리하기 위하여, 이동상 A(0.1% TFA(Trifluoroacetic acid) 수용액, 100 mM NaCl)와 이동상 B(0.1% TFA 아세토니트릴, 100mM NaCl)를 4:6의 비율로 0.5 mL/min의 유속으로 흘려주었다. 시료에서 다량체의 피크로 분석된 영역은 수용성 응집체의 영역과 함께 계산되었다. 최초 측정과 이후 측정된 R27T 시료의 총 면적(크로마토그램 결과에서의 모든 피크 영역 넓이의 합)의 차이는 측정 시의 불용성 응집체의 형성으로 인하여 생겼다고 정의하였다. 각각의 종류 (불용성 응집체, 단량체, 단백질 조각)의 남아있는 비율은 초기 시간과 비교한 피크 넓이로 계산되었고, 보관 기간을 X축으로 하여 그래프화 하였다. 이때 남아있는 비율을 계산하는 식은 다음과 같다.

남은 량 (%) = (a_t ÷ A₀) × 100

상기 식에서, a_t는 각각의 시간에서 단백질 피크의 넓이를 의미하며, A₀는 각각의 단백질 피크의 최초의 넓이를 의미한다. 오차막대는 3회의 측정 동안의 표준 편차(Standard deviation; SD)를 의미한다.

1-2. 시차 주사 열량계(Differential Scanning Calorimetry; DSC)

R27T 시료의 열역학적 안정성 평가를 실시하기 위하여, VP-DSC Microcalorimeter(Microcal, Northampton, MA, USA)를 이용하였다. 실험은 15℃에서 120℃까지 분당 1℃의 가열 속도로 진행되었으며, 총 3회 반복하였다. DSC 실험결과는 최종적으로 측정된 완충액을 이용하여 측정된 기준선을 차감하고, 시료에 존재하는 단백질의 농도를 계산함으로써 표준화하였다.

R27T 측정결과는 선형 기준선 조절을 통해서 결과의 영점 조절을 위한 기준선을 설정하였다. 이때, 시료의 영점 조절을 위한 기준선을 설정하는 과정은 가열에 의해서 생기는 응집이나 침전 현상에 의해서 방해를 받기 때문에 복잡하게 되는데, 본 발명에서는 선형기준선 옵션을 선택함으로써 반복되는 실험에서 시료의 종류나 사용자의 결정에 관계없이 가장 안정적인 결과를 얻도록 하였다.

최종 열량 기록은 초과 비열(cal/℃mol)을 Y축으로, 온도를 X축(℃)으로 하여 작성되었다. 이러한 결과로부터 단백질 전이온도(Transition temperature; T_m)를 계산하였다.

1-3. CPE(Cytopathic effect) assay

각 R27T 안정화 제제의 항바이러스 효과를 평가하기 위하여, 96 웰 플레이트에 폐암세포주인 A549 세포를 3x10⁵ cells/mL로 분주하고, 상기 세포가 포함된 배지 100 ㎕에 각 제제 100 ㎕를 처리하고 세포를 37℃에서 22시간 동안 배양하였다. 2일차에 상층액을 제거하고, 1000 TCID50/mL의 농도의 EMCV(encephalomyocarditis virus) 100 uL를 세포에 처리하여 37℃에서 22시간 동안 배양한 후 3일차에 상층액을 제거하고 살아있는 세포를 염색하여, 570 nm에서 흡광도를 측정하여 Standard 대비 역가를 계산하였다.

실시예 2. 부형제에 따른 R27T 제제의 안정성 비교분석

2-1. R27T 제제의 제조

본 발명자들은 이전의 연구를 통해, 인터페론 베타 변이체인 R27T에 pH3.8의 아세테이트 완충액(acetate buffer) 20 mM와 함께 만니톨(Mannitol), 아르기닌 HCl(Arginine HCl), 폴록사머 188(Poloxamer 188), 및 메티오닌(Methionine)의 부형제를 첨가함으로써 상기 인터페론 변이체의 안정성을 증진시키기 위한 제제를 제조한 바 있다. 나아가 본 발명에서는 기존의 인터페론 안정화제로써 사용한 만니톨을 대체할 수 있는 부형제를 찾아 만니톨과 아르기닌 HCl을 첨가한 혼합 제제보다 더욱 안정한 제제를 개발하고자 하였다.

이를 위해, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 이전 연구에서 제조한 만니톨을 포함하는 제제의 조성(1(F5))과 함께 다른 부형제의 조성 및 농도는 동일하게 사용하되 만니톨 대신 2분자의 D-글루코오스가 1→1결합한 비환원성 이당류로써 균이나 효모에 다량 존재하고 곤충의 체액과 난(egg)에서도 관찰되는 것으로 알려진 트레할로스(Trehalose)를 다양한 농도(150, 200, 또는 250 mM)로 첨가하거나, 이전 연구에서 만니톨을 대체 가능할 것으로 판단되었던 수크로오스(sucrose) 또는 자일리톨(xylitol)을 다양한 농도(150, 200, 또는 250 mM)로 첨가하여 총 10종류의 R27T 제제를 제조하였으며, 상기 제제의 안정성을 비교분석하기 위한 실험을 진행하였다.

2-2. SEC : 단량체량 분석

상기 실시예 2-1에서 제조한 각 R27T 제제의 보관 안정성을 평가하기 위하여, 상기 10종의 제제를 0.1 ㎎/mL의 농도로 4℃에서 각각 0, 1주, 2주, 3주, 및 3개월 동안 냉장보관한 후 상기 실시예 1-1의 크기-배제 크로마토그래피 방법을 이용하여 잔여 단량체(monomer)의 양을 측정하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 동일한 시작 농도에도 불구하고 각각의 제제(formulation)에 따라 단량체의 함량이 다르게 나타나는 것을 확인하였다. 만니톨 대신 트레할로스를 첨가한 경우 가역성(reversibility)이 크게 증가하였으며, 결과적으로 보관 안정성이 크게 증가한 것을 확인하였다. 또한, 트레할로스의 사용농도가 증가할수록 가역성이 증가하며, 특히 200 및 250 mM의 농도로 첨가한 경우 3개월 동안의 냉장보관 후에도 단량체량의 변화가 매우 적은 것을 알 수 있었다. 한편, 수크로오스 및 자일리톨을 150 또는 200 mM로 첨가한 제제의 경우에도 비교적 제제의 가역성이 증가하는 것을 확인하였다.

실시예 3. 트레할로스 첨가에 따른 R27T 제제의 안정성 및 항바이러스 활성 검증

3-1. SEC : 단량체량 분석

상기 실시예 2의 결과를 바탕으로, 만니톨을 이용한 경우에 비해 R27T 제제의 냉장 보관 안정성을 증가시킨 것으로 확인된 트레할로스를 이용한 제제를 중심으로 추가 안정성 분석을 실시하였다. 보다 구체적으로 만니톨 250 mM를 첨가하거나 트레할로스 또는 자일리톨을 200 또는 250 mM의 농도로 첨가하여 R27T 제제를 제조하였으며, 자세한 제제의 조성은 하기 표 2에 나타내었다.

먼저, 상기 각각의 5가지 R27T 제제의 보관 안정성을 평가하기 위하여, 각 제제를 0.64 ㎎/mL 고농도로 37℃의 고온에서 0, 14, 21, 및 28일 동안 보관한 후 상기 실시예 1-1의 방법에 따라 단량체량을 측정하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 다른 제제들에 비하여 2번 제제 즉, 트레할로스 200 mM를 첨가한 경우 열에 대한 안정성이 제일 큰 것으로 나타났다. 또한, 상기 제제가 다른 제제에 비하여 농도 증가에 따른 안정성도 가장 큰 것을 확인하였다.

3-2. DSC : 열역학적 안정성 분석

상기 실시예 3-1의 보관 안정성 분석에 더하여, 상기 5종류의 R27T 제제에 대하여 실시예 1-2의 방법에 따라 DSC 분석을 실시하여 R27T의 열역학적/구조적 안정성을 평가하였다.

그 결과, 하기 표 3에 나타낸 바와 같이, 만니톨 또는 트레할로스가 첨가된 1 내지 3번 제제에서 자일리톨이 첨가된 4 및 5번 제제보다 높은 T_m 값이 나타났으며, 1 내지 3번 제제의 경우 T_m 값이 유사하게 나타나 상기 3종류의 R27T 제제에서 R27T의 열역학적 또는 구조적 안정성이 높은 것을 알 수 있었다.

Formulation	Concentration (㎎/mL)	Highest Tm (℃)
1	0.64	60.60
2	0.64	60.46
3	0.64	60.28
4	0.64	50.77
5	0.64	47.77

3-3. CPE assay : 항바이러스 활성 분석

상기 실시예 3-1 및 3-2의 안정성 분석에 더하여, 상기 각 R27T 제제의 항바이러스 활성을 비교하기 위해 실시예 1-3의 방법에 따라 CPE assay를 실시하였다.

그 결과, 하기 표 4에 나타낸 바와 같이, 트레할로스 200 mM이 첨가된 2번 제제의 경우 만니톨이 첨가된 제제와 유사한 정도의 항바이러스 활성이 나타나는 것을 확인하였다.

상기 실시예 결과들을 통해, 트레할로스 200 mM을 첨가하여 제조한 R27T 제제가 만니톨 250 mM을 첨가하여 제조한 제제와 비교할 때 보관 안정성, 구조적 안정성, 및 항바이러스 활성이 유사하거나 증진된 것을 확인하였는바, 상기 농도의 트레할로스가 만니톨을 대체하기에 충분한 이점을 갖는 것을 알 수 있었다.

실시예 4. 아르기닌 HCl 혼합 유무에 따른 안정성 비교분석

상기 실시예 2 및 3을 통해 만니톨을 대체할 수 있는 부형제로 최종 선정한 트레할로스 200 mM을 이용한 R27T 제제에서 아르기닌 HCl의 유무에 따라 제제의 보관안정성에 차이가 나타나는지 분석하고자 하였다. 이를 위해, 하기 표 5에 나타낸 바와 같이, 대조군으로는 아세테이트 완충액만을 이용한 제제(control-1) 및 아르기닌 HCl을 첨가하지 않고 만니톨 250 mM을 첨가한 R27T 제제(control-2)를 이용하였으며, 실험군으로는 아르기닌 HCl 50 mM과 만니톨 250 mM을 함께 첨가한 제제(3) 및 아르기닌 HCl 50 mM을 첨가하거나 또는 첨가하지 않고 트레할로스 200 mM을 첨가한 제제(4 및 5)를 이용하였다. 상기 각각의 제제를 저농도(0.1 ㎎/mL) 또는 고농도(0.64 ㎎/ mL)로 37℃의 고온에서 1, 7, 14, 및 28일 동안 보관한 후 상기 실시예 1-1의 SEC 분석을 통해 단백질 응집 정도를 측정하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 만니톨을 첨가하여 제조한 제제의 경우 저농도 및 고농도 모두에서 아르기닌 HCl 첨가에 의해 단백질 응집이 증가한 반면(F2 및 F3 비교), 트레할로스를 첨가하여 제조한 제제의 경우에는 아르기닌 HCl이 첨가된 경우 단백질 응집이 감소한 것을 확인하였다(F4 및 F5 비교).

상기 결과를 통해 트레할로스와 아르기닌 HCl을 함께 첨가하는 제제가 만니톨 기반 제제보다 안정성이 우수한 것을 알 수 있었다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

본 발명에서 제공하는 안정화 R27T 약학 제제는, 본 발명자들이 이전에 연구한 만니톨을 포함하는 제제의 조성에서 만니톨을 트레할로스로 대체한 신규한 조성의 제제로서, 상기 제제는 만니톨과 아르기닌 HCl 혼합 첨가에 따른 단백질 응집체 증가의 단점을 보완할 수 있고, 열역학적/구조적 안정성과 이에 따른 장기보관 시 안정성이 증진됨을 확인하였는바, 상기 제제는 다발성 경화증, 암, 자가면역질환, 바이러스 감염질환, HIV 감염질환, C형 간염, 및 류마티스 관절염 등의 질환의 치료제 관련 산업 분야에서 유용하게 이용될 수 있다.

<210> 1

<211> 600

<212> DNA

<213> Type R27T IFN-beta DNA sequence

<400> 1

atgaccaaca agtgtctcct ccaaattgct ctcctgttgt gcttctccac tacagctctt 60

tccatgagct acaacttgct tggattccta caaagaagca gcaattttca gtgtcagaag 120

ctcctgtggc aattgaatgg gacgcttgaa tattgcctca aggacaggat gaactttgac 180

atccctgagg agattaagca gctgcagcag ttccagaagg aggacgccgc attgaccatc 240

tatgagatgc tccagaacat ctttgctatt ttcagacaag attcatctag cactggctgg 300

aatgagacta ttgttgagaa cctcctggct aatgtctatc atcagataaa ccatctgaag 360

acagtcctgg aagaaaaact ggagaaagaa gattttacca ggggaaaact catgagcagt 420

ctgcacctga aaagatatta tgggaggatt ctgcattacc tgaaggccaa ggagtacagt 480

cactgtgcct ggaccatagt cagagtggaa atcctaagga acttttactt cattaacaga 540

cttacaggtt acctccgaaa ctgaagatct cctagcctgt ccctctggga ctggacaatt 600

600

<210> 2

<211> 187

<212> PRT

<213> Type R27T IFN-beta Protein sequence

<400> 2

Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu Leu Cys Phe Ser

1 5 10 15

Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg

20 25 30

Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Thr

35 40 45

Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu

50 55 60

Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile

65 70 75 80

Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser

85 90 95

Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val

100 105 110

Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu

115 120 125

Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys

130 135 140

Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser

145 150 155 160

His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr

165 170 175

Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn

180 185

Claims

하기를 포함하는, 인간 인터페론 베타 변이체의 안정화된 약학 제제:

(a) 인간 인터페론 베타 변이체,

(b) 5 내지 100 mM 농도의 아세트산 완충액,

(c) 10 내지 150 mM 농도의 아르기닌(Arginine),

(d) 50 내지 300 mM 농도의 트레할로스(Trehalose),

(e) 0.1 내지 10 mg/mL 농도의 폴록사머 188(Poloxamer 188), 및

(f) 0.5 내지 5 mM 농도의 메티오닌(Methionine).
제1항에 있어서, 상기 인간 인터페론 베타 변이체는 인간 인터페론 베타의 27번째 아미노산인 아르기닌이 트레오닌으로 치환되어 25번째 아미노산인 아스파라진 잔기에 N-연결형 당쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는, 안정화된 약학 제제.
제1항에 있어서, 상기 아세트산 완충액은 10 내지 30 mM의 농도로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는, 안정화된 약학 제제.
제1항에 있어서, 상기 아세트산 완충액은 pH가 3.6 내지 4.4의 범위인 것을 특징으로 하는, 안정화된 약학 제제.
제1항에 있어서, 상기 아르기닌은 50 내지 100 mM의 농도로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는, 안정화된 약학 제제.
제1항에 있어서, 상기 트레할로스는 150 내지 250 mM의 농도로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는, 안정화된 약학 제제.
제1항에 있어서, 상기 폴록사머 188은 0.1 내지 1 mg/mL의 농도로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는, 안정화된 약학 제제.
제1항에 있어서, 상기 메티오닌은 0.5 내지 2 mM의 농도로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는, 안정화된 약학 제제.
제1항에 있어서, 상기 안정화된 약학 제제는 수소 이온 농도 지수(pH)가 3.6 내지 4.4의 범위인 것을 특징으로 하는, 안정화된 약학 제제.
제1항에 있어서, 상기 안정화된 약학 제제는 다발성 경화증, 암, 자가면역질환, 바이러스 감염질환, HIV 감염질환, C형 간염, 및 류마티스성 관절염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 질환의 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 하는, 안정화된 약학 제제.
제1항에 있어서, 상기 안정화된 약학 제제는 경구 또는 비경구 투여용인 것을 특징으로 하는, 안정화된 약학 제제.
제1항에 있어서, 상기 안정화된 약학 제제는 액상 또는 동결건조 제형인 것을 특징으로 하는, 안정화된 약학 제제.