EA012205B1 - Гидрогелевые препараты интерферона - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим гидрогелевым препаратам полоксамера, содержащим интерферон. В частности, изобретение относится к гидрогелевым препаратам интерферона-бета пролонгированного действия, способу их получения и применения.

Description

Данное изобретение относится к фармацевтическим гидрогелевым препаратам, содержащим интерферон. В частности, изобретение относится к гидрогелевым препаратам бета-интерферона пролонгированного действия, способу их получения и применения.

Уровень техники

Рекомбинантные белковые фармацевтические средства уже сейчас обеспечивают уникальные способы лечения некоторых ранее неизлечиваемых заболеваний, а в настоящее время разрабатываются многочисленные новые белковые лекарственные средства.

Белки обычно вводят парентерально, что может приводить к быстрой элиминации белка из кровотока. Для поддержания терапевтически эффективных уровней белка в крови, часто необходимо вводить большие или повторные дозы. Неудобство и возможные вредные побочные эффекты упомянутого способа можно обойти, применяя системы, которые обеспечивают непрерывную или контролируемую доставку белка.

С помощью систем пролонгированной доставки можно обеспечивать более постоянные уровни белковых терапевтических средств в крови по сравнению с уровнями, наблюдаемыми при применении болюсных доз, что приводит к улучшенной лекарственной эффективности и меньшему количеству вредных побочных эффектов. Упомянутые системы доставки лекарственных средств включают в себя масла для инъекций, эмульсии, суспензии, липосомы, микрочастицы (микрокапсулы или микросферы), имплантаты или гелевые системы.

Из числа гелевых систем, применяемых для доставки лекарственных средств, полоксамерные гели используют из-за их уникального свойства, такого как термореактивное гелеобразование веществ ίη κίΐιι. Полоксамеры представляют собой блоксополимеры поли(этиленоксида) и поли(пропиленоксида), хорошо известные как неионные поверхностно-активные вещества, которые образуют водные гели, претерпевающие превращения от состояния низкой вязкости до состояния высокой вязкости в результате повышения температуры, называемые «термическое гелеобразование».

Кроме того, полоксамеры обладают хорошими смачивающими, антипенообразующими и солюбилизирующими свойствами, и их обычно применяют для фармацевтических и медицинских целей в качестве носителей для доставки лекарственных средств (Снхтап е! а1., 1Щегпа1юпа1 1оитпа1 оГ Рйаттасеийск, 80, 119-127; Сапдег е! а1., 1986, Эгид Όον. апй 1пйик!. Рйаттасу, 12 (11-13), 1613-1623).

Полоксамеры, упоминаемые под торговым названием плуроники®, представляют собой блоксополимеры из трех компонентов, характеризующиеся следующей формулой (I):

(I) в которой (а) и (с) являются статистически равными, (Ь) равно или больше 15, а (а+с) формируют от 20 до 90 мас.% молекулы.

Две цепи полиэтиленоксида (РЕО) являются гидрофильными, тогда как цепь полипропиленоксида (РРО) является гидрофобной, что придает блоксополимерам РЕО-РРО-РЕО амфифильные свойства, которые можно модулировать, изменяя количество элементов (а) и (Ь).

Вследствие их амфифильной природы, блоксополимеры РЕО-РРО-РЕО способны самоагрегироваться с образованием целого ряда ассоциированных структур, таких как мицеллы и жидкие кристаллические фазы, а также микроэмульсии.

Из числа плуроников®, полоксамер 407 (Еи1то1® Е127 или плуроник® Е127), полоксамер формулы (I), в которой (а)=(с)=99 и (Ь)=65, и полоксамер 338 (Еи1то1® Е108 или плуроник® Е108), полоксамер формулы (I), в которой (а)=(с)=16, а (Ь)=4 6, известны благодаря их термическим гелеобразующим свойствам их водных растворов при концентрации 20-35% (Снхтап е! а1., 1992, выше). В частности, 22-25% (мас./мас.) раствор полимера полоксамера 407 является жидким при относительно низких температурах, то есть 4-10°С, но быстро образует твердый гель с высокой вязкостью при нагревании выше характерной температуры перехода, то есть 18-20°С. Описанные гели используют, например, для жидких гидрогелевых препаратов для подкожных инъекций, местных применений, аэрозолей с тем, чтобы получить гель, когда они нагреваются до температуры тела (Снхтап е! а1., 1992, выше).

Установлено, что гели полоксамера 407 повышают стабильность белков, введенных в гелевый матрикс (8!та!!оп е! а1., 1997, 1оитпа1 οί Рйаттасеи!1са1 каепсек, 86, 9, 1006-1010) и их используют в различных препаратах, включая лидокаин (С.’11еп-С.’1ю\\· е! а1., 1981, 1п!етпа!юпа1 1оитпа1 оГ РйаттасеиБск, 8, 8999), индометацин (М|уахак| е! а1., 1986, СНет. РНагт. Ви11. 34(4), 1801-1808) и 1Ь-2 (1ойпк!оп е! а1., 1992, Рйаттасеи!1са1 Рекеагск 9(3), 425-434).

Интерфероны представляют собой цитокины, то есть растворимые белки, которые передают сигналы между клетками и играют решающую роль в иммунной системе, помогая уничтожать микроорганизмы, которые вызывают инфекции, и восстанавливая любое возникшее повреждение. Интерфероны естественно секретируются инфицированными клетками и впервые были идентифицированы в 1957 году.

- 1 012205

Свое название интерфероны получили вследствие того факта, что они влияют на вирусную репликацию и продукцию.

Интерфероны проявляют как противовирусную, так и антипролиферативную активность. На основании биохимических и иммунологических свойств природные интерфероны человека классифицируют в три основные класса: альфа-интерферон (лейкоцитарный), бета-интерферон (вырабатывается фибробластами) и гамма-интерферон (иммунный). В настоящее время в Соединенных Штатах и других странах альфа-интерферон апробируют для лечения злокачественного ретикулоэндотелиоза, остроконечных бородавок, саркомы Капоши (рак, обычно поражающий пациентов, страдающих синдромом приобретенного иммунного дефицита (АШ8; СПИД)) и хронического гепатита ни А, ни В.

Кроме того, интерфероны (ΙΡΝκ) являются гликопротеинами, продуцируемыми организмом в ответ на вирусную инфекцию. Они ингибируют размножение вирусов в защитных клетках. Состоящие из низкомолекулярных белков ΙΡΝκ являются в высшей степени неспецифическими по действию, то есть ΙΡΝ, индуцированный одним вирусом, оказывается эффективным против большого разнообразия других вирусов. Они, однако, характеризуются видовой специфичностью, то есть ΙΡΝ, продуцируемый одним видом, будет стимулировать противовирусную активность только в клетках того же самого или близко родственного вида. ΙΡΝκ оказались первой группой цитокинов, которые используют из-за их возможной противоопухолевой и противовирусной активностей.

Три основные вида ΙΡΝ называют ΙΡΝ-α, ΙΡΝ-β и ΙΡΝ-γ. Упомянутые основные виды ΙΡΝκ первоначально классифицировали по их клеточному источнику (лейкоцит, фибробласт или Т-клетка). Однако стало ясно, что несколько типов могут продуцироваться одной клеткой. Следовательно, лейкоцитарный ΙΡΝ в настоящее время называют ΙΡΝ-α, ΙΡΝ фибробластов представляет собой ΙΡΝ-β и ΙΡΝ Т-клеток представляет собой ΙΡΝ-γ. Также существует четвертый тип ΙΡΝ, лимфобластоидный ΙΡΝ, продуцируемый в линии клеток ΝαιηαΡνα (получена из лимфомы Беркитта), которая, как оказалось, продуцирует смесь лейкоцитарного и фибробластного ΙΡΝ.

Единица интерферона или международная единица интерферона (ЕД или МЕД для международной единицы) описана как мера активности ΙΡΝ, определенная как количество, необходимое, чтобы защитить 50% клеток от вирусного поражения. Исследование, которое можно использовать для определения биоактивности, представляет собой исследование ингибирования цитопатического действия, которое описывают (КиЬшйеш, е! а1., 1981, 1. νίτοί., 37, 755-758; ГатШет е! а1., 1981, Ме!йойк ίη Еи7уто1оду, 78, Рейка Ей., Асайет1с ргекк, №\ν Уогк, 387-394). В упомянутом исследовании противовирусной активности интерферона, приблизительно 1 единица/мл интерферона составляет количество, необходимое, чтобы вызвать 50% цитопатическое действие. Единицы устанавливают относительно международного контрольного стандарта для ΗΗ-ΙΡΝ-бета, предоставляемого Национальным институтом здоровья (Рейка, 1986, Ме!койк ίη Еи7уто1оду, 78, Рейка Ей., Асайетк ргекк, №\ν Уотк 119, 14-23).

Каждый класс ΙΡΝ содержит несколько разных типов. ΙΡΝ-β и ΙΡΝ-γ, каждый, представляют собой продукт одного гена.

Белки, классифицируемые как ΙΡΝκ-α, являются наиболее разнообразной группой, содержащей приблизительно 15 типов. Существует кластер генов ΙΡΝκ-α на хромосоме 9, содержащий по крайней мере 23 представителя, 15 из которых являются активными и транскрибируемыми. Зрелые ΙΡΝκ-α не гликозилированы.

ΙΡΝκ-α и ΙΡΝ-β, все, имеют одинаковую длину (165 или 166 аминокислот) и подобные биологические активности. ΙΡΝκ-γ содержат 146 аминокислот по длине и меньше напоминают классы α и β. Только ΙΡΝκ-γ могут активировать макрофаги или индуцировать созревание Т-клеток-киллеров. Эти новые типы терапевтических средств иногда можно называть модификаторами биологического ответа (ВКМк), так как они оказывают влияние на ответ организма на опухоль, воздействуя на распознавание через иммуномодулирование.

Интерферон фибробластов человека ΙΡΝ-β проявляет противовирусную активность и может также стимулировать природные киллерные клетки против опухолевых клеток. Интерферон представляет собой полипептид, с массой приблизительно 20000 Да, индуцируемый вирусами и двухцепочечными РНК. Из нуклеотидной последовательности гена интерферона фибробластов, клонированной по технологии рекомбинантных ДНК (Оетуик е! а1., 1980, №!ите, 285, 542-547), выведена полная аминокислотная последовательность белка. Последовательность содержит по длине 166 аминокислот.

Бйератй е! а1., 1981, №!ите, 294, 563-565 описывает мутацию в основании 842 (Сук Туг в положении 141), которая устраняет его противовирусную активность, и вариантный клон с делецией нуклеотидов 1119-1121. Магк е! а1., 1984, Ргос. №!1., Асай. 8с1. И.8.А., 81(18), 5662-5666, внесли искусственную мутацию замещением основания 469 (Т) на (А), вызывая изменение аминокислот Сук^Бет в положении 17. Сообщают, что полученный ΙΡΝ-γ является настолько активным, насколько активен «нативный» ΙΡΝβ и стабилен во время длительного хранения (-70°С).

РеЫГ® (рекомбинантный интерферон-β от 8етоио), самая последняя разработка в терапии интерфероном рассеянного склероза (М8) представляет собой интерферон (ШН)-бета-1а, продуцируемый линиями клеток млекопитающих. Его рекомендуемым международным непатентованным названием (ΙΝΝ)

- 2 012205 является «Интерферон-бета-1а».

В последние десятилетия были разработаны различные препараты ΙΡ№ с сополимерами. Среди них описаны препараты ΙΡΝ-альфа для инъекции, содержащие полиоксиэтилен-полиоксипропиленгликоль (1Р 2003 342193), комбинированные препараты цикларадин-ШЛ-альфа (ЕР 0177153), наборы полоксамеровых гелей интерферона-альфа комнатной температуры для местного применения (И8 4469228), препараты микрочастиц ΙΡΝβ (νθ 01/58474), композиции, содержащие гликопротеины, химически связанные с сополимером полиоксиэтилен-полиоксипропилена, (ЕР 0098110) и препараты ΙΡΝβ для доставки через слизистые, особенно для интраназальной доставки (νθ 2004/002404).

Как в случае всех фармацевтических препаратов на белковой основе, одним основным стимулом для применения интерферона как терапевтического средства является поддержание терапевтически эффективной дозы в крови в течение определенного времени без увеличения вводимой дозы и возможных ассоциированных побочных эффектов. Следовательно, существует потребность в фармацевтических композициях ΙΡΝ, которые поддерживают уровни ΙΡΝ в плазме в течение более длительного периода времени, чем жидкие препараты, и/или которые обеспечивают большую плазменную экспозицию ΙΡΝ, тем самым, поддерживая или улучшая биологическую активность ΙΡΝ.

Краткое изложение изобретения

Данное изобретение направлено на фармацевтические гидрогелевые композиции полоксамера или композиции полоксамера, образующие гель ίη νίνο, которые содержат интерферон (ΙΡΝ), в частности рекомбинантный й-ΙΡΝβ 1а, и способы их получения. Названные фармацевтические композиции представляют собой гидрогели, приготовленные с полоксамерами, особенно с полоксамером 407. Такие фармацевтические композиции в описании называют «гидрогели» ΙΡΝ, и они содержат интерферон (ΙΡΝ) или его изоформу, мутеин, слитый белок, функциональное производное, активную фракцию.

Преимущество полоксамеровых гидрогелевых препаратов ΙΡΝ изобретения заключается в том, что они ίη νίνο образуют гель, который легко можно регулировать и который проявляет пролонгированное действие и/или более высокую биодоступность по сравнению с большей частью препаратов ΙΡΝ.

Согласно одному осуществлению данного изобретения, гидрогели дополнительно содержат по крайней мере одно стабилизирующее средство.

Согласно другому осуществлению изобретения, гидрогели дополнительно содержат по крайней мере один модификатор температурного перехода раствора в гель в качестве наполнителя.

В первом аспекте, изобретение предоставляет фармацевтическую композицию, содержащую интерферон (ΙΡΝ) или его изоформу, мутеин, слитый белок, функциональное производное или активную фракцию, при этом названный препарат представляет собой гидрогель полоксамера.

Во втором аспекте, изобретение предоставляет способ приготовления гидрогелевого препарата ΙΡΝ согласно изобретению, при этом упомянутый способ включает в себя добавление рассчитанного количества полоксамера к забуференному раствору при температуре, при которой образуется гомогенный раствор полимера, а затем добавление интерферона или его изоформы, мутеина, слитого белка, функционального производного или активной фракции.

В третьем аспекте, изобретение предоставляет применение гидрогелевого препарата ΙΡΝ-бета согласно изобретению для получения фармацевтического средства для лечения рассеянного склероза.

В четвертом аспекте, изобретение предоставляет способ лечения рассеянного склероза, включающий в себя введение препарата ΙΡΝ-бета пролонгированного действия согласно изобретению пациенту в случае необходимости.

Подробное описание изобретения

В следующих параграфах дают определения различным химическим фрагментам, которые составляют соединения согласно изобретению, и которые предназначают для применения постоянно по всему описанию и в формуле изобретения, если не указано специально, что представленное определение обеспечивает более широкое значение.

Используемый термин «интерферон» или «ΙΡΝ» предназначают, чтобы охватить любую молекулу, определенную как таковую в литературе, включающий в себя, например, любые типы ΙΡ№. упомянутые в вышеприведенном разделе «Уровень техники». В частности, вышеприведенное определение включает в себя ΙΡΝ-α, ΙΡΝ-β и ΙΡΝ-γ. ΙΡΝ-β является предпочтительным ΙΡΝ в соответствии с данным изобретением. ΙΡΝ-β, подходящий согласно данному изобретению, поставляется коммерчески, например, как РсЫГ® (8егопо), Ауопсх® (Вюдеп) или Ве1аРегоп® (8сйетшд).

Используемый термин «интерферон-бета (ΙΡΝ-бета или ΙΡΝ-β)» предназначают для включения интерферона фибробластов, в частности человека, который получают выделением из биологических жидкостей или методами рекомбинантных ДНК из клеток прокариотического или эукариотического хозяина, а также его солей, функциональных производных, вариатов, аналогов и активных фрагментов. Предпочтительно ΙΡΝ-бета означает рекомбинантный интерферон-бета-1а.

ΙΡΝ-β, подходящий согласно данному изобретению, поставляется коммерчески, например, как РеЫГ® (8етопо), Ауопсх® (Вюдеп) или Ве1аГетоп® (8сйетшд). Применение интерферонов человека также является предпочтительным согласно данному изобретению. Используемый в описании термин интер

- 3 012205 ферон предназначают, чтобы охватить его соли, функциональные производные, варианты, аналоги и активные фрагменты.

КеЬ1Г® (рекомбинантный интерферон-β) является самой последней разработкой в терапии интерфероном рассеянного склероза (М8) и представляет значительный прогресс в лечении данного заболевания. КеЫГ® представляет собой интерферон (ШЫ)-бета-1а, продуцируемый клеточными линиями млекопитающих. Установлено, что интерферон-бета-1а, вводимый подкожно три раза в неделю, эффективен при лечении рецидивирующего-ремиссирующего рассеянного склероза (К.К.М8). Интерферон-бета-1а может оказывать положительное действие при длительном течении М8 посредством снижения числа и тяжести рецидивов и уменьшения тяжести заболевания и интенсивности заболевания, оцениваемых с помощью ΜΚΙ.

Дозирование ΙΕΝ-β при лечении рецидивирующего-ремиссирующего М8 согласно изобретению зависит от типа используемого ΙΕΝ-β.

В соответствии с данным изобретением, когда ΙΕΝ представляет собой рекомбинантный ΙΕΝ-β 1Ь, продуцируемый в Е. Сой, коммерчески поставляемый под торговым названием Ве!акетои®, предпочтительно ΙΕΝ можно вводить подкожно через день в дозе приблизительно от 250 до 300 мкг или от 3 ММЕД (миллион международных единиц) до 9,6 ММЕД на субъекта.

В соответствии с данным изобретением, если ΙΕΝ представляет собой рекомбинантный ΙΕΝ-β 1а, продуцируемый в клетках яичников китайских хомяков (клетках СНО), коммерчески поставляемый под торговым названием Луоиех®, предпочтительно ΙΕΝ можно вводить внутримышечно один раз в неделю в дозе приблизительно от 30 до 33 мкг или от 6 до 6,6 ММЕД на субъекта.

В соответствии с данным изобретением, если ΙΕΝ представляет собой рекомбинантный ΙΕΝ-β 1а, продуцируемый в клетках яичников китайских хомяков (клетках СНО), коммерчески поставляемый под торговым названием К.еЫГ®. ΙΕΝ предпочтительно можно вводить подкожно три раза в неделю (ΤΙν) в дозе от 22 до 44 мкг или от 6 до 12 ММЕД на субъекта.

Используемый термин «мутеины» относится к аналогам ΙΕΝ, в которых один или более аминокислотных остатков природного ΙΕΝ замещают различными аминокислотными остатками или удаляют, или один или более аминокислотных остатков добавляют к природной последовательности ΙΕΝ, не изменяя значительно активность полученных продуктов по сравнению с диким типом ΙΕΝ. Описанные мутеины получают по известным способам синтеза и/или методами сайт-направленного мутагенеза, или любым другим известным способом, подходящим для этого. Предпочтительные мутеины включают в себя, например, мутеины, описанные 8йератб е! а1., 1981, выше или Магк е! а1., 1984, выше.

Любой такой мутеин предпочтительно имеет последовательность аминокислот, достаточно дуплицированных из последовательности ΙΕΝ, например, чтобы иметь по существу подобную или даже лучшую активность относительно ΙΕΝ. Биологическая функция интерферона хорошо известна специалистам в данной области, а биологические стандарты учреждены и могут быть получены, например, в Национальном институте биологических стандартов и контроля (ййр://1ттиио1оду.огд/1шкк/№В8С).

Биоисследование для определения активности ΙΕΝ описано. Исследование ΙΕΝ, например, можно проводить, как описывают К.иЬшк1еш е! а1., 1981, выше. Таким образом, стандартным экспериментированием можно установить, имеет ли любой данный мутеин по существу подобную или даже лучшую активность, чем ΙΕΝ. Мутеины ΙΕΝ, которые можно использовать согласно данному изобретению, или, следовательно, кодирующая нуклеиновая кислота включают в себя ограниченный набор, по существу, соответствующих последовательностей, как замещенные пептиды или полинуклеотиды, которые обычно могут быть получены любым из специалистов в данной области без чрезмерного экспериментирования по способам и руководству, представленному в описании.

Предпочтительными изменениями для мутеинов в соответствии с данным изобретением являются изменения, известные как «консервативные» замещения. Консервативные аминокислотные замещения полипептидов или белков изобретения могут включать в себя синонимические аминокислоты в пределах группы, которые имеют достаточно похожие физико-химические свойства с тем, чтобы замещение представителями группы, сохраняло бы биологическую функцию молекулы. Ясно, что инсерции и делеции аминокислот также можно производить в описанных выше последовательностях без изменения их функции, особенно, если инсерции или делеции включают только несколько аминокислот, например меньше тридцати и предпочтительно меньше десяти, и не удаляют или не замещают аминокислоты, которые являются существенными для функциональной конформации, например, остатки цистеина. Белки и мутеины, полученные с помощью таких делеций и/или инсерций, попадают в сферу действия данного изобретения.

Предпочтительно, группами синонимических аминокислот являются группы, представленные в табл. Ι. Более предпочтительно, группами синонимических аминокислот являются группы, представленные в таблице ΙΙ; и наиболее предпочтительно, группами синонимических аминокислот являются группы, представленные в табл. ΙΙΙ.

- 4 012205

Таблица I. Предпочтительные группы синонимических аминокислот

Аминокислота Синонимическая группа

5ег	Зег,	ТЬг,	С1у,	Азп
Агд	Агд,	<31. П {	Ьуз,	С1и,	ΗΪΞ
Ьеи	Не,	РЬе,	Туг,	Ме!,	Уа1, Ьеи
Рго	31у,	А1а,	ТЬг,	Рго
ТЬг	Рго,	5ег,	А1а,	С1у,	Нгз, С1п, ТЬг
А1а	С1 у {	ТЬг,	Рго,	А1а
Уа1	Мес,	Туг,	РЬе,	Не,	Ьеи, Уа1
С1у	А1а,	ТЬг,	Рго,	Зег,	С1у
Не	Ме!,	Туг,	РЬе,	УаТ,	Ьеи, 11е
РЬе	Тгр,	Ме!,	Туг,	Не,	Уа1, Ьеи, РЬе
Туг	Тгр,	Ме!,	РЬе,	Не,	Уа1, Ьеи, Туг
Суз	Зег,	ТЬг,	Суз
ΗΪ3	С1и,	Ьуз,	С1п,	ТЬг,	Агд, Низ
61п	С1и,	Ьуз,	Азп,	Н1з,	ТЬг, Агд, С1п
Азп	С1п,	Азр,	Зег,	Азп
Ьуз	С1и	, όΐη	, ΗΪ3, Агд, Ьуз
Азр	С1и	, Азп	, Азр
С1и	Азр	, Ьуз	, Азп, С1п, Ηίε, Агд, С1и
Тгр	Тгр

Таблица II. Более предпочтительные группы синонимических аминокислот Аминокислота Синонимическая группа

Зег	5ег
Агд	Н1з, Ьуз, Агд
Беи	Ьеи, Не, РЬе, МеЬ
Рго	А1а, Рго
ТЬг	ТЬг
А1а	Рго, А1а
Уа1	Уа1, МеЬ, Не
С1у	С1у
Не	Не, Мет, РЬе, Уа1, Ьеи
РЬе	Мер, Туг, Не, Ьеи, РЬе
Туг	РЬе, Туг
Суз	Суз, 5ег
Н13	ΗΪ3, С1п, Агд
б1п	С1и, С1п, Нтз
Азп	Азр, Азп
Ьуз	Ьуз, Агд
Азр	Азр, Азп
С1и	С1и, С1п
Ме!	МеЬ, РЬе, Не, Уа1, Ьеи
Тгр	Тгр.

Таблица III. Наиболее предпочтительные группы синонимических аминокислот

Аминокислота Синонимическая группа

Зег Зег

Агд Агд

Меи

Τίρ МеТ.

Примеры производства аминокислотных замещений в белках, которые можно использовать для получения мутеинов ΙΤΝ, для применения в данном изобретении, включают в себя любые стадии известных способов, такие как представлены в патентах США Магк е! а1. 4959314, 4588585 и 473746; Ко1кк е! а1. 5116943; Nатеη е! а1. 4965195; С1юпд е! а1., 4879111; и Ьее е! а1. 5017691; и лизин-замещенные белки, описанные в патенте США 4904584 от 81ιη\ν е! а1. Специальные мутеины ΙΤΝ-бета описывают, например, Магк е! а1., 1984, выше.

Термин «слитый белок» относится к полипептиду, содержащему ΙΤΝ или его мутеин, слитый с другим белком, который, например, характеризуется длительным периодом пребывания в биологических жидкостях. Таким образом, ΙΡΝ можно сливать с другим белком, полипептидом или тому подобным, например с иммуноглобулином или его фрагментом.

Используемое в описании выражение «функциональные производные» охватывает производные ΙΡΝ и их мутеины и слитые белки, которые можно получать с помощью функциональных групп, находящихся на боковых цепях остатков или Ν- или С-концевых группах, по способам, известным в данной области, и которые включены в изобретение, поскольку они сохраняют фармацевтическую приемлемость, то есть, они не уничтожают активность белка, которая в основном подобна активности ΙΤΝ, и не придают токсические свойства композициям, содержащим их. Такие производные могут, например, включать в себя боковые цепи полиэтиленгликоля, которые могут маскировать антигенные участки и увеличивать пребывание ΙΡΝ в биологических жидкостях. Другие производные включают в себя сложные алифатические эфиры карбоксильных групп, амиды карбоксильных групп в результате взаимодействия с аммиаком или с первичными или вторичными аминами, Ν-ацил-производные свободных аминогрупп аминокислотных остатков, образованные с ацил-фрагментом (например, группами алканоила или карбоциклического ароила), или О-ацил-производные свободных гидроксильных групп (например, групп остатков серила или треонила), образованные ацил-фрагментами.

В качестве «активных фракций» ΙΡΝ, или мутеинов и слитых белков, данное изобретение охватывает любой фрагмент или предшественники полипептидной цепи белковой молекулы отдельно или вместе с ассоциированными молекулами или остатками, связанными еще, например, с сахаром или фосфатным остатком, или агрегаты белковой молекулы или сами остатки Сахаров при условии, что названная фракция не имеет никакой значительно сниженной активности по сравнению с соответствующим ΙΡΝ.

В соответствии с данным изобретением, кроме того, применение рекомбинантного ΙΡΝ-бетаПа и соединений изобретения особенно предпочтительно.

Недавно описан особый вид варианта интерферона. Так называемые «консенсусные интерфероны» являются неприродными вариантами ΙΡΝ (И8 6013253). В соответствии с предпочтительным осуществлением изобретения соединения изобретения применяют в комбинации с консенсусным интерфероном.

Используемый в описании термин консенсус интерферона (ΙΡΝ-соп) человека будет означать неприродный полипептид, который преимущественно включает в себя те аминокислотные остатки, которые обычно в субпопуляции ΙΡΝ-альфа являются характерными для большинства из последовательностей подтипа природных человеческих лейкоцитарных интерферонов, и который включают в себя в од

- 6 012205 ном или более тех положений, где нет никаких аминокислот общих со всеми подтипами, аминокислоту, которая преимущественно встречается в таком положении, и ни в коем случае не включает остаток любой аминокислоты, который не присутствует в таком положении по крайней мере у одного природного подтипа. ΙΡΝ-соп, не ограничиваясь, охватывает аминокислотные последовательности, обозначенные ΙΡΝ-οοηΙ, ΙΡΝ<οη2 и ΙΡΝ-сопЗ, которые описывают в патентах США №№4695623, 4897471 и 5541293. Последовательности ДНК, кодирующие ΙΡΝ-соп, можно получать, как описывают в вышеупомянутых патентах, или другими стандартными способами.

В следующем предпочтительном осуществлении, слитый белок включает слияние Ιμ. Слияние может быть прямым или через короткий линкерный пептид, который может содержать до от 1 до 3 аминокислотных остатков по длине, или быть больше, например, 13 аминокислотных остатков по длине. Названный линкер может быть трипептидом с последовательностью Ε-Ρ-Μ (С1и-Рйе-Ме1), например, или иметь линкерную последовательность из 13 аминокислотных остатков, содержащую С1и-Рйе-С1у-А1аС1у-Ьеи-Уа1-Ееи-С1у-С1у-С1п-Рйе-Ме1, введенную между последовательностью ΙΡΝ и последовательностью иммуноглобулина. Полученный слитый белок может иметь улучшенные свойства, такие как продолжительное время пребывания в биологических жидкостях (период полувыведения), увеличенную специфическую активность, повышенный уровень экспрессии, или облегчается очистка слитого белка.

В другом предпочтительном осуществлении, ΙΡΝ сливают с константной областью молекулы Ιμ. Предпочтительно, ΙΡΝ сливают с областями тяжелой цепи, например, подобными доменам СН2 и СН3 Ι§0| человека. Другие изоформы молекул Ιμ также подходят для образования слитых белков согласно данному изобретению, такие как изоформы Ι§0₂, ΙβΟ₃ или Ι§0₄ или другие классы Ι§, например, подобные ΙμΜ или ЦА. Слитые белки могут быть мономерными, мультимерными, гетеро- или гомомультимерными.

В следующем предпочтительном осуществлении, функциональное производное содержит по крайней мере один фрагмент, присоединенный к одной или более функциональных групп, которые присутствуют на одной или более боковых цепях на аминокислотных остатках. Предпочтительно, фрагмент представляет собой полиэтиленовый (РЕС; ПЭГ) фрагмент. Пегилирование можно осуществлять по известным способам, таким как способы, описанные, например, в \УО 99/55377.

Дозы, вводимые индивидууму, будут очень зависеть от целого ряда факторов, включая фармакокинетические свойства, способ введения, состояния и характерных особенностей (пола, возраста, веса тела, здоровья и размера) пациента, степени симптомов, сопутствующего лечения, частоты курсов лечения и желаемого действия.

Стандартные дозы ΙΡΝ-бетаНа человека колеблются от 80000 МЕД/кг до 200000 МЕД/кг в день или 6 ММЕД (миллион международных единиц) до 12 ММЕД на субъекта в день или от 22 до 44 мкг (микрограмм) на субъекта. В соответствии с данным изобретением, ΙΡΝ-бетаНа предпочтительно можно вводить в дозе приблизительно от 1 до 500 мкг, более предпочтительно приблизительно от 10 до 308 мкг или приблизительно от 10 до 260 мкг на субъекта один раз в неделю или меньше.

Введение активных ингредиентов в соответствии с данным изобретением можно производить внутримышечным или подкожным способом. Предпочтительным способом введения ΙΡΝ является подкожный способ.

ΙΡΝ также можно вводить через день или реже. Предпочтительно, ΙΡΝ вводят один раз, дважды или три раза в неделю.

Предпочтительным способом введения является подкожное введение, осуществляемое, например, один раз в неделю или реже.

Предпочтительно, концентрация ΙΡΝ-бетаНа в препарате составляет от 10 мкг/мл, или приблизительно от 10 до 800 мкг/мл, или приблизительно до 800 мкг/мл, более предпочтительно от 20 мкг/мл, или приблизительно от 20 до 500 мкг/мл, или приблизительно до 500 мкг/мл, еще более предпочтительно от 30, или приблизительно от 30 до 300 мкг/мл, или приблизительно до 300 мкг/мл, наиболее предпочтительно 44, 88 или 264 мкг/мл, или приблизительно 44, 88 или 264 мкг/мл.

Термин «гидрогель» относится к поперечно сшитой сетке гидрофильных полимеров, которые обладают способностью самопревращаться в трехмерную структуру, содержащую большие количества воды. Полоксамеры представляют собой полимеры, которые характеризуются свойством образовывать мицеллы в водном растворе. При более высоких концентрациях и/или повышенной температуре, полоксамеры претерпевают «гелеобразование» (переход раствор-в-гель) посредством ассоциации мицелл с образованием жидкой кристаллической фазы (геля) вследствие увеличивающихся межмицеллярных взаимодействий. Затем, при еще более высоких температурах гель снова плавится (ВготЬегд е1 а1., 1998, Айуапсей Эгид ЭеНуегу Ве\зе\\ъ 31, 197-221).

Температуры фазового перехода зависят от концентрации полоксамера в воде. Обычно переход раствор-в-гель происходит при температурах от 5 до 30°С, а превращение гель-в-раствор происходит при 35-50°С в диапазоне концентрации полимера от 20 до 30 мас.% Поэтому, термин «полоксамеровый гидрогель» согласно изобретению относится к раствору полоксамера, который обладает свойством проявлять гелеобразование (переход раствор-в-гель) при температуре тела человека. Например, гидрогели полоксамера изобретения содержат от 20 до 30 мас.% полоксамера, обычно от 20 до 25 мас.% Поэтому,

- 7 012205 термин «гидрогель» также относится к образованию геля ίη νίνο.

Выражение «модификатор температурного перехода раствор-в-гель (или 8о1-де1)» относится к наполнителю, который способен смещать, предпочтительно повышать температурный переход раствор-вгель ΙΡΝ-бета-содержащего гидрогеля. Примерами таких модификаторов являются сахара, такие как трегалоза, полиэтиленгликоль, глицерин, такой как глицерин 30°, и циклодекстрины, предпочтительно гидроксипропил-в-циклодекстрин. Модификатор температурного перехода раствор-гель можно использовать, например, для повышения температурного превращения гидрогеля примерно комнатной температуры, для увеличения способности прохождения через шприц и/или температуры хранения. Гидрогель согласно изобретению может содержать, например, приблизительно от 1 до 3% мас./мас. модификатера температуоного перехода раствор-гель, предпочтительно приблизительно 2,6% мас./мас.

Термин «поверхностно-активное вещество» относится к растворимому соединению, которое снижает поверхностное натяжение жидкостей или снижает межфазное натяжение между двумя жидкостями или жидкостью и твердым веществом, поверхностное натяжение, являющееся силой, действующей на поверхность жидкости, имеющей тенденцию минимизировать область поверхности. Поверхностноактивные вещества иногда используют в фармацевтических препаратах, включая доставку низкомолекулярных лекарственных средств и полипептидов для того, чтобы модифицировать поглощение лекарственного средства или его доставку в ткани-мишени. Хорошо известные поверхностно-активные вещества включают в себя полисорбаты (производные полиоксиэтилена; твин), а также плуроники.

В соответствии с одним осуществлением изобретения, плуроники представляют собой поверхностно-активные вещества, которые предпочтительно присутствуют в жидком препарате стабилизированного ΙΡΝ, используемого для приготовления гидрогелей изобретения.

В соответствии с другим осуществлением изобретения, плуроники, выбранные из плуроника® Ρ77 (полоксамер 217), плуроника® Ρ87 (полоксамер 237), плуроника® Ρ88 (полоксамер 238) и плуроника® Ρ68 (полоксамер 188), в особенности предпочтительно плуроника® Ρ68 (ΒΑ8Ρ), присутствуют в стабилизированном жидком препарате ΙΡΝ, используемого для приготовления гидрогелей изобретения.

Плуроники предпочтительно присутствуют в жидком препарате стабилизированного ΙΡΝ в концентрации, которая является достаточной для поддержания стабильности интерферона в течение требуемого периода хранения (например, от 12 до 24 месяцев), а также в концентрации, которая является достаточной для предотвращения потери белка вследствие абсорбции на поверхностях, таких как флакон, ампула или картридж или шприц.

Обычно используют лутрол Ρ68: между 25- и 200-кратным молярным избытком (относительно ΙΡΝ), предпочтительно 50-кратный молярный избыток (приблизительно 3 мг/мл, если дозировка ΙΡΝ составляет приблизительно 150 мкг/мл).

Предпочтительно, концентрация плуроников, особенно плуроника® Ρ68, в жидких стабилизированных препаратах ΙΡΝ составляет от 0,01 мг/мл или приблизительно 0,01 мг/мл до 10 мг/мл или приблизительно 10 мг/мл, более предпочтительно от 0,05 мг/мл или приблизительно 0,05 мг/мл до 5 мг/мл или приблизительно 5 мг/мл, особо более предпочтительно от 0,1 мг/мл или приблизительно 0,1 мг/мл до 2 мг/мл или приблизительно 2 мг/мл, наиболее предпочтительно составляет 1 мг/мл или приблизительно 1 мг/мл.

Термин «антиоксидант» относится к соединению, которое предотвращает взаимодействие кислорода или свободных радикалов с другими поверхностно-активными веществами. Антиоксиданты относятся к числу целого ряда наполнителей, обычно добавляемых в фармацевтические системы, чтобы повысить физическую и химическую стабильность. Антиоксиданты добавляют, чтобы минимизировать или замедлить окислительные процессы, которые происходят с некоторыми лекарственными средствами или наполнителями при экспозиции с кислородом или в присутствии свободных радикалов. Упомянутые процессы часто могут катализироваться на свету, температурой, концентрацией водорода, в присутствии следовых количеств металлов или перекисей. Сульфиты, бисульфиты, тиомочевину, метионин, соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ΕΌΤΑ), бутилированный гидрокситолуол (ВНТ) и бутилированный гидроксианизол (ВНА) часто применяют в качестве антиоксидантов в лекарственных средствах. Установлено, что натрий-ΕΌΤΑ повышает активность антиоксидантов образованием хелатных комплексов с ионами металлов, которые иным образом катализируют реакцию окисления. Наиболее предпочтительным антиоксидантом является метионин.

Предпочтительно антиоксиданты и особенно метионин являются стабилизаторами, которые присутствуют в жидком препарате стабилизированного ΙΡΝ, используемом для приготовления гидрогелей по изобретению. Обычно метионин можно использовать в концентрации с 100-800-кратным молярным избытком (относительно ΙΡΝ), предпочтительно с 400-кратным молярным избытком (приблизительно 0,4 мг/мл, если дозировка ΙΡΝ составляет приблизительно 150 мкг/мл).

Метионин может присутствовать или в его свободной основной форме или в его солевой форме. Любой стериоизомер (то есть, изомер Ь, Ό или ΌΌ) метионина можно использовать в данном способе или препарате по изобретению, пока метионин присутствует в его свободной основной форме или его солевой форме. Предпочтительно используют Ь-стериоизомер. Аналоги метионина также можно исполь

- 8 012205 зовать в данном препарате по изобретению. Термин «аналог метионина» относится к производному природного метионина. Аналоги метионина также можно использовать в данном препарате или в их свободной основной форме или их солевой форме.

Повышенная и/или сохраненная стабильность при добавлении антиоксидантов (например, метионина) зависит от концентрации. То есть, увеличивающиеся концентрации антиоксидантов приводят к повышению и/или поддержанию стабильности препарата, содержащего интерферон-бета данного изобретения, если в таком препарате, содержащем интерферон-бета, обычно происходит окисление или образование агрегата/олигомера в отсутствие антиоксиданта. Определение количества оксиданта (например, метионина), который используют в данном препарате по изобретению, чтобы уменьшить окисление или образование олигомера/агрегата, можно легко осуществить без чрезмерного экспериментирования, используя способы, в основном известные любому из специалистов в данной области.

Термин «бактериостатическое средство» относится к соединению или композициям, добавленным в препарат, которые действуют как противобактериальное средство. Примеры бактериостатических средств включают в себя фенол, м-крезол, п-крезол, о-крезол, хлоркрезол, бензиловый спирт, алкилпарабен (метил-, этил-, пропил-, бутил- и тому подобные), бензалконий хлорид, бензетоний хлорид, дегидроацетат натрия и тимерозал. Предпочтительным бактериостатическим средством является бензиловый спирт.

Гидрогелевые препараты согласно изобретению могут быть в форме однократной дозы или многократных доз (мультидозовые). Описанные жидкие препараты интерферона по изобретению, которые предназначены для применения в виде многократных доз, предпочтительно содержат бактериостатическое средство, такое как фенол, м-крезол, п-крезол, о-крезол, хлоркрезол, бензиловый спирт, алкилпарабен (метил-, этил-, пропил-, бутил- и тому подобные), бензалкония хлорид, бензетония хлорид, дегидроацетат натрия и тимерозал. Особо предпочтительным является фенол, бензиловый спирт и м-крезол, более предпочтительным является бензиловый спирт. Бактериостатическое средство используют в количестве, которое будет обеспечивать концентрацию, которая эффективна для сохранения препарата по существу без бактерий (приемлемо для инъекции) в течение периода многократного введения дозы, который может составлять от 12 или 24 ч или приблизительно от 12 или 24 ч до 12 дней или приблизительно 12 дней, предпочтительно от 6 или приблизительно 6 до 12 дней или приблизительно 12 дней. Бактериостатическое средство предпочтительно присутствует в концентрации от 0,1% или приблизительно 0,1% (масса бактериостатического средства/масса растворителя) до 2,0% или приблизительно 2,0%, более предпочтительно от 0,2% или приблизительно 0,2% до 1,0%, или приблизительно 1,0%. В случае бензилового спирта особенно предпочтительными являются концентрации 0,2 или 0,3%.

Однако применение консервантов, например бензилового спирта, не ограничивают мультидозовыми препаратами, их также можно добавлять в препараты в форме однократной дозы. Одно осуществление данного изобретения относится к препаратам в форме однократной дозы, содержащим бензиловый спирт.

Предпочтительно, препараты данного изобретения имеют рН приблизительно между 3,0 и 5,0, более предпочтительно рН 3,8-4,0 или приблизительно 3,8-4,0. Предпочтительным буфером является ацетатный буфер с предпочтительными противоионами, являющимися ионами натрия или калия. Ацетатные солевые буферные растворы хорошо известны в данной области. Концентрации буфера в общем растворе могут колебаться между или приблизительно 5 мМ, 9,5 мМ, 10 мМ, 50 мМ, 100 мМ, 150 мМ, 200 мМ, 250 мМ и 500 мМ. Предпочтительно концентрация буфера составляет 10 мМ или приблизительно 10 мМ. Особо предпочтительным является буфер 50 мМ по ацетатным ионам с рН 3,8.

«Циклодекстринами», предназначенными для применения в изобретении, являются гидроксипропил-, гидроксиэтил-, глюкозил-, мальтозил- и мальтотриозил-производные бета-циклодекстрина и соответствующие производные гамма-циклодекстрина. Группы гидроксиалкила могут содержать одну или более гидроксильных групп, например гидроксипропил (2-гидроксипропил, 3-гидроксипропил), дигидроксипропил и тому подобные. Производные глюкозила, мальтозила и мальтотриозила могут содержать один или более остатков сахара, например глюкозил или диглюкозил, мальтозил или димальтозил. Различные смеси производных циклодекстрина также можно использовать, например смесь производных мальтозила и димальтозила. Специальные производные циклодекстрина для применения в изобретении включают в себя гидроксипропил-бета-циклодекстрин (НРСЭ и НРВСЭ). гидроксиэтил-бета-циклодекстрин (НЕВСО), гидроксипропил-гамма-циклодекстрин (ПРОСО), гидроксиэтил-гамма-циклодекстрин (НЕОСЭ), дигидроксипропил-бета-циклодекстрин (2НРВСО), глюкозил-бета-циклодекстрин Щ-бета-СЭ или ОЩСО), диглюкозил-бета-циклодекстрин (20 Ц-бета-СЭ или 2 ОЩСО), мальтозилбета-циклодекстрин (О₂-бета-СО или О₂ВСО), мальтозил-гамма-циклодекстрин (О₂-гамма-СО или О₂ОСО), мальтотриозил-бета-циклодекстрин (Сз-бета-СО или О₃ВСЭ), мальтотриозил-гамма-циклодекстрин (С₃-гамма-СЭ или С₃,ССЭ) и димальтозил-бета-циклодекстрин (2 С₂-бета-СО или 2 С₂ВСЭ) и их смеси, такие как мальтозил-бета-циклодекстрин/димальтозил-бета-циклодекстрин.

Гидроксипропил-бета-циклодекстрин для применения в композициях данного изобретения поставляется коммерчески и является предпочтительным циклодекстрином согласно изобретению.

Диапазон количества интерферона в препаратах по изобретению включает в себя концентрации

- 9 012205 приблизительно от 1,0 мкг/мл до 50 мг/мл, хотя более низкие и более высокие концентрации также используют и выбор концентрации зависит от носителя для предполагаемой доставки или способа введения, например препараты раствора будут отличаться от гелей, вводимых через слизистые (например, гелевые композиции ΙΡΝ для трансбуккального или назального способа введения). Концентрация интерферона предпочтительно составляет от 5,0 мкг/мл или приблизительно от 5,0 мкг/мл до 2 мг/мл или приблизительно 2 мг/мл, более предпочтительно от 10 мкг/мл или приблизительно от 10 мкг/мл до 1 мг/мл или приблизительно 1 мг/мл, наиболее предпочтительно от 30 мкг/мл или приблизительно от 30 мкг/мл до 100 мкг/мл или приблизительно 100 мкг/мл.

Предпочтительно препараты по изобретению сохраняют по крайней мере 60% или приблизительно 60%, более предпочтительно по крайней мере 70% или приблизительно 70%, наиболее предпочтительно по крайней мере 80% или приблизительно 80% активности интерферона за время нахождения в упаковке в течение периода 24 месяцев.

Препараты пролонгированного действия данного изобретения можно получать по способу, который включает в себя добавление рассчитанных количеств раствора интерферона к гомогенному раствору полоксамера. Раствор интерферона предпочтительно представляет собой стабилизированный раствор интерферона, например раствор интерферона, содержащий эксципиенты, такие как стабилизаторы, подобные Ь-метионину, поверхностно-активные вещества, такие как полоксамеры, такие как полоксамер 188, или их комбинация.

В соответствии с одним осуществлением изобретения препараты данного изобретения еще можно подвергнуть стадии фильтрации в стерильных условиях, например стерилизующую фильтрацию с использованием мембраны 0,22 мкм проводят при температуре, при которой вязкость полоксамерового гидрогеля поддерживают низкой, например при 4°С.

Для улучшения способности прохождения через шприц препаратов данного изобретения при комнатной температуре, можно добавлять эксципиенты, которые модифицируют температуру превращения раствор-в-гель полоксамерового гидрогеля, предпочтительно к буферному раствору до образования раствора жидкого гидрогеля, то есть, до добавления полоксамера. Примерами эксципиентов, которые модифицируют температуру перехода раствор-гель полоксамерового гидрогеля, являются полиэтиленгликоль, глицерин, такой как глицерин 30° (по Боме), сахара, такие как трегалоза, и циклодекстрины, такие как гидроксипропил-(3 -циклодекстрин).

В соответствии с одним осуществлением изобретения, гидрогелевый препарат имеет вязкость при 4°С между вязкостью воды и областью 200 мПа.с, предпочтительно в диапазоне между 100-150 мПа-с, препарат может быть заключен в специальное приспособление, такое как автоинжектор или предварительно заполненные шприцы, и может образовывать ίη 8Йи гель после подкожного введения.

Полученный раствор потом помещают во флаконы, ампулы, картриджи или предварительно заполненные шприцы.

Вариации описанного способа будут осознаны любым из специалистов в данной области. Например, порядок добавления компонентов, необходимость использования дополнительных добавок, температура и рН, при которых готовят препарат, все являются факторами, которые могут быть оптимизированы для используемых концентраций и способов введения.

Стабилизированные препараты можно давать пациентам в виде прозрачных растворов, хранение которых предпочтительно осуществляют при температуре перехода раствор-гель гидрогеля.

Интерферон в гидрогелевых препаратах, описываемых в изобретении, можно вводить пациенту согласно данному изобретению с помощью целого ряда способов доставки, включая подкожную инъекцию, через слизистые, с помощью имплантата или другими способами, рассматриваемыми специалистами, как хорошо известные в данной области.

Термин «флакон» относится вообще к резервуару, подходящему для сохранения препарата интерферона пролонгированного действия согласно изобретению в твердой или жидкой форме в поддерживаемом стерильном состоянии. Примеры флаконов, которые используют в изобретении, включают в себя ампулы, картриджи, блистер-упаковки или другие такие резервуары, подходящие для доставки интерферона пациенту с помощью шприца или трансмукозального спрея.

Препараты согласно изобретению также можно продавать в виде предварительно заполненных шприцев.

Препараты изобретения можно вводить, используя признанные инъекционные приспособления. Примеры, включающие в себя такие одноразовые флаконные системы, охватывают автоинжекторные или карандаш-инжекторные приспособления для доставки раствора, такого как Всу(|сс1®.

Иглы для инъекционного устройства выбирают с тем, чтобы они соответствовали плотности гидрогеля изобретения. Например, гидрогель изобретения можно вводить инъекционным устройством, имеющим различные калибры игл, такие как 18/23 (внутренний диаметр эквивалентен калибру иглы 18 и минимальный внешний диаметр калибра иглы 21) или 21/26 (внутренний диаметр эквивалентен калибру иглы 21 и минимальный внешний диаметр калибра иглы 26).

Предпочтительно, препараты изобретения можно вводить, используя признанные приспособления

- 10 012205 для гидрогелей. Например, способ инъекции с использованием Перо! Опе №е61е (1трп1 РЬаттасеийсак) можно использовать для введения гидрогелей изобретения.

Термин «лечение» в контексте изобретения относится к любому благоприятному воздействию на прогрессирование заболевания, включая ослабление, снижение, уменьшение или устранение патологического развития после начала заболевания.

Фармацевтические композиции изобретения, содержащие ΙΡΝ или изоформу, мутеин, слитый белок, функциональное производное, активную фракцию или соль, используют для диагностики, предупреждения и лечения (локально или системно) клинических симптомов, чувствительных к терапии упомянутым полипептидом.

Такие клинические показания включают в себя, например, нарушения или заболевания центральной нервной системы (ЦНС), мозга и/или спинного мозга, включая рассеянный склероз; аутоиммунные заболевания, включая ревматоидный артрит, псориаз, болезнь Крона; и злокачественные новообразования, включая рак молочной железы, простаты, мочевого пузыря, почки и толстой кишки.

Все ссылки, цитируемые в изобретении, включающие в себя журнальные статьи или рефераты, опубликованные или неопубликованные патентные заявки США и иностранные заявки, вышедшие в США, и иностранные патенты или любые другие ссылки, включены в описание цитированием в их полном объеме, включая все данные, таблицы, фигуры и текст, представленные в цитируемых ссылках. Кроме того, полное содержание цитируемых рекомендаций в ссылках, приводимых в описании, также включены цитированием в их полном объеме.

Упоминание известных стадий способа, общепринятых стадий способов, известных способов или общепринятых способов не является никоим образом признанием, что любой аспект, описание или осуществление данного изобретения установлены, изложены или были предложены в соответствующей области.

Предшествующее описание специальных воплощений, таким образом, будет полностью раскрывать главную сущность изобретения, которую другие специалисты, применяя знания в данной области (включая содержания ссылок, цитируемых в описании) могут модифицировать и/или адаптировать для различных применений таких специальных воплощений без чрезмерного экспериментирования, не отступая от основной идеи данного изобретения. Поэтому полагают, что такие адаптации и модификации соответствуют ряду эквивалентов описываемых осуществлений, основанных на изложении и руководстве, представленных в описании. Понятно, что фразеология и терминология соответствует цели описания, а не ограничения так, что терминология и фразеология данного описания должны быть интерпретированы специалистами в свете изложений и руководства, представленных в изобретении, в сочетании со знаниями любого специалиста в данной области.

В соответствии с одним осуществлением, изобретение предоставляет фармацевтическую композицию, в которой указанный препарат представляет собой полоксамеровый гидрогель, содержащий интерферон-бета.

В следующем осуществлении, изобретение предоставляет фармацевтическую композицию, где указанная композиция представляет собой полоксамеровый гидрогель, содержащий рекомбинантный интерферон-бета, такой как рекомбинантный интерферон-бета-1а.

В другом осуществлении, изобретение предоставляет фармацевтическую композицию согласно изобретению, где указанная композиция дополнительно содержит буфер и антиоксидант.

В следующем осуществлении, изобретение предоставляет фармацевтическую композицию согласно изобретению, где указанная композиция дополнительно содержит буфер и поверхностно-активное вещество.

В соответствии с другим осуществлением, изобретение предоставляет фармацевтическую композицию согласно изобретению, где указанная композиция дополнительно содержит модификатор температурного перехода раствор-гель.

В соответствии со следующим осуществлением, изобретение предоставляет фармацевтическую композицию согласно изобретению, где указанная композиция дополнительно содержит модификатор температурного перехода раствор-гель, выбранный из трегалозы и циклодекстрина.

В соответствии с одним осуществлением, изобретение предоставляет фармацевтическую композицию, в которой названный препарат представляет собой гидрогель полоксамера 407.

В следующем осуществлении, изобретение предоставляет фармацевтическую композицию, где указанная композиция представляет собой гидрогель полоксамера 407, который содержит приблизительно от 20 до 25 % мас./мас. полоксамера 407.

В соответствии с одним предпочтительным осуществлением, изобретение предоставляет фармацевтическую композицию, где указанный препарат содержит рекомбинантный интерферон-бета, такой как рекомбинантный интерферон-бета-1а, ацетатный буфер и Ь-метионин как антиоксидант.

В соответствии с другим предпочтительным осуществлением, изобретение предоставляет фармацевтическую композицию, где указанный препарат представляет собой гидрогель полоксамера 407, содержащий рекомбинантный интерферон-бета, такой как рекомбинантный интерферон-бета-1а, ацетатный буфер, Ь-метионин как антиоксидант и полоксамер 188 как поверхностно-активное вещество.

- 11 012205

В соответствии со следующим предпочтительным осуществлением, изобретение предоставляет фармацевтическую композицию, где указанный препарат представляет собой гидрогель полоксамера 407, содержащий рекомбинантный интерферон-бета, такой как рекомбинантный интерферон-бета-1а, ацетатный буфер, Ь-метионин как антиоксидант и полоксамер 188 как поверхностно-активное вещество и трегалозу в качестве модификатора температурного перехода раствор-гель.

В соответствии с еще одним предпочтительным осуществлением, изобретение предоставляет фармацевтическую композицию, где указанный препарат представляет собой гидрогель полоксамера 407, содержащий рекомбинантный интерферон-бета, такой как рекомбинантный интерферон-бета-1а, ацетатный буфер, Ь-метионин как антиоксидант и циклодекстрин в качестве модификатора температурного перехода раствор-гель, предпочтительно гидроксипропил-бета циклодекстрин.

В соответствии с другим предпочтительным осуществлением, изобретение предоставляет фармацевтическую композицию, выбранную из следующей группы:

Полоксамер 407 — 25% мас./мас.

Ацетатный буфер 50 ми/рн 3,8 - 74,7% мас./мас.

г-Ь-1ГЫ-бета-1а - 0,012% мас./мас.

Ь-Метионин - 0,03% мае./мае.

Полоксамер 188 - 0,24% мас./мас;

Полоксамер 407 - 25% мас./мас.

Ацетатный буфер 50 мМ/рН 3,8 - 72,04% мас./мас.

г-Ь-1ГЫ-бета-1а - 0,012% мас./мас.

Ь-Метионин — 0,03% мас./мас.

Полоксамер 188 - 0,24% мас./мас.

Трегалоза - 2,6% мае./мае;

Полоксамер 407 - 20% мас./мас.

Ацетатный буфер 50 мМ/рН 3,8 - 77 34% мас./мас.

г-И-1ГЫ-бета-1а - 0,015% мас./мас.

Ь-Метионин — 0,04% мас./мас.

Гидроксипропил-р-циклодекстрин - 2,6% мас./мас;

Полоксамер 407 - 25% мас./мас.

Ацетатный буфер 50 мМ/рН 3,8 - 72,04% мас./мас.

г-Ъ-1ЕЭД-бета-1а - 0,012% мас./мас.

Ц-Метионин - 0,03% мас./мас.

Полоксамер 188 - 0,24% мас./мас.

Глицерин 30° Ве' - 2,6% мас./мас;

и

Полоксамер 407 - 25% мас./мас.

Ацетатный буфер 50 мМ/рН 3,8 - 72,04% мас./мас.

г-Ъ-1ЕИ~бета-1а - 0,012% мас./мас.

Ь-Метионин - 0,03% мас./мас.

Полоксамер 188 - 0,24% мас./мас.

ПЭГ (Ьи1:го1®Е400) - 2,6% мас./мас;

В другом осуществлении, изобретение предоставляет способ получения гидрогелевой фармацевтической композиции ΙΡΝ согласно изобретению, где указанный способ включает добавление рассчитанного количества полоксамера в буферный раствор при температуре, при которой образуется гомогенный раствор полимера, а затем добавление интерферона или его изоформы, мутеина, слитого белка, функционального производного или активной фракции.

В следующем осуществлении, изобретение предоставляет способ получения фармацевтической гидрогелевой композиции ΙΡΝ согласно изобретению, где буферный раствор содержит модификатор температурного перехода раствор-гель, выбранный из трегалозы и циклодекстрина, предпочтительно гидроксипропил-в-циклодекстрин.

В еще одном осуществлении, изобретение предоставляет способ получения фармацевтической гидрогелевой композиции ΙΡΝ согласно изобретению, где интерферон добавляют из раствора, содержащего стабилизаторы, предпочтительно выбранные из Ь-метионина и полоксамера 188 и их комбинации.

- 12 012205

В следующем осуществлении, изобретение предоставляет применение гидрогеля ΙΡΝ-бета согласно изобретению для получения фармацевтической композиции для лечения рассеянного склероза.

В другом осуществлении, изобретение предоставляет способ лечения рассеянного склероза, включающий введение гидрогеля ΙΡΝ-бета согласно изобретению пациенту в случае необходимости.

Далее изобретение будет описано с помощью следующих примеров, которые не следует истолковывать в любом отношении как ограничение данного изобретения. В примерах будут упомлнаться фигуры, которые анализируют ниже.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 показан процент высвобождения г-ΗΙΡΝβ 1а из полоксамерового гидрогеля г-ΗΙΡΝβ 1а (1) в РВ8 при рН 7,4 при 37°С, определенного с помощью 8Е-ВЭЖХ/флуоресцентного детектора (ромбы) и методом ΕΕΙ8Ά (твердрофазный иммуноферментный анализ) (закрашенные квадраты) в зависимости от времени после введения гидрогеля в РВ8 (пример 1).

На фиг. 2 представлена противовирусная активность г-ΗΙΡΝβ 1а, высвобожденного через 2 ч из полоксамерового гидрогеля τ-ΗΙΡΝβ 1а (1) (светлые ромбы) по сравнению с исходным г-ΗΙΡΝβ 1а (светлые квадраты) и исходным τ-ΗΙΡΝβ 1а, смешанным с полоксамеровым гелем без τ-ΗΙΡΝβ 1а (плацебо) (закрашенные треугольники). Противовирусную активность выражали как гроцент клеток (клетки νΙ8Η), выживших после введения У8У, как функцию концентрации τ-ΗΙΡΝβ 1а (пример 2).

На фиг. 3 представлено изменение концентрации в крови τ-ΗΙΡΝβ 1а в зависимости от времени у наивных обезьян супошо1ди§ после подкожного введения или однократной инъекции 3,6 мкг/кг полоксамерового геля τ-ΗΙΡΝβ 1а (1) (закрашенные квадраты), однократной инъекции 3,6 мкг/кг исходного τΗΙΡΝβ 1а (контроль 1: светлые треугольники) или трех инъекций в течение недели с интервалами 48 ч (!=0, 48 и 96 ч) по 1,223 мкг/кг каждая (контроль 3: светлые ромбы) (пример 3).

На фиг. 4 представлено изменение концентрации г-ΗΙΡΝβ 1а в крови в зависимости от времени у наивных обезьян супошо1ди§ после однократной подкожной инъекции 3,6 мкг/кг липогеля СМ8 г-ΗΙΡΝβ 1а (контроль 2: точки) или трех инъекций в течение недели с 48-часовыми интервалами (!=0, 48 и 96 ч) по 1,223 мкг/кг каждая (контроль 3: светлые ромбы) (пример 3).

На фиг. 5 показаны профили вязкости гидрогелевого препарата лутрола (1), -точки-, по сравнению с гидрогелевым препаратом лутрола, содержащим трегалозу 2,6% мас./мас. (2), -заполненные квадраты-, и гидрогелевым препаратом лутрола, содержащим 2,6% мас./мас. НР-бета СО (3), - закрашенные треугольники.

На фиг. 6 показан процент г-ΗΙΡΝβ 1а, высвобожденного из полоксамерового гидрогеля (3) (полоксамер 407-20% мас./мас; ацетатный буфер 50 мМ/рН 3,8-77,34% мас./мас, г-ΗΙΡΝβ 1а -0,015% мас./мас, Ьметионин - 0,04% мас./мас. и гидроксипропилф-циклодекстрин - 2,6% мас./мас.) в РВ8 при рН 7,4 при 37°С, определенного с помощью 8Е-ВЭЖХ/флуоресцентного детектора.

Примеры

Следующие сокращения относятся соответственно к определениям ниже:

ст (сантиметр, см), срк (сантипаузы), Эа (дальтон, Да), д (грамм, г), цд (микрограмм, мкг), шш (минута, мин), шд (миллиграмм, мг), шЬ (миллилитр, мл), шш (миллиметр, мм), шМ (миллимолярный, мМ), шРак (миллиПаскаль-секунды, мПа'с), грш (оборотов в минуту), пш (нанометер, нм), СНО (яичник китайского хомяка), ΙΡΝ (интерферон), Ιυ (международные единицы, МЕД), ί.ν. (внутривенный), ЕМЕМ (минимальная основная среда Игла с солями Игла), ΡΒ8 (фетальная телячья сыворотка), СМ8 (глицерилмоностеарат) МТТ (Ы-2-гидроксиэтилпиперазин-М'-2-этансульфоновая кислота), М8 (рассеянный склероз), М\У (молекулярный вес), РВ8 (забуференный фосфатом физиологический раствор), РЕ8 (полиэфирсульфон), РР (полипропилен), РУЭН (фторид поливинилидена), τ-ΙΡΝ-бета (рекомбинантный интерферон-бета), г-ΗΙΡΝβ 1а (рекомбинантный интерферон-бета 1а, продуцируемый в клетках СНО), К1Л (радиоиммунный анализ), к.с. (подкожный), ΤΙν (три раза в неделю), υΙ (международная единица, МЕД), У8У (вирус везикулярного стоматита).

Синтез полоксамера описан 8сΗто1ка 1977, 1оитпа1 о£ 111е Лшейсап Θί1 СНешЦРк 8оае!у 54, 110-116, и полоксамер поставляется коммерчески.

Пример 1. Гидрогель полоксамера 407-τ-ΗΙΡΝ-β 1а (1).

Основной способ получения

В полипропиленовый чан (низкая адсорбция белка), помещенный в баню со льдом, взвешенное количество Ьи!го1® Ρ127 медленно добавляли к холодному (2-8°С) ацетатному буферу [50 мМ, рН 3,8] на при перемешивании с магнитом [при 500-800 оборотов в минуту] до полного растворения полимера.

В другой сосуд, небольшое количество ацетатного буфера, содержащего стабилизирующие средства (например, Ьи!го1 ® Ρ68 и Ь-метионин) добавляли к концентрированному исходному раствору г-ΗΙΡΝбета (2 мг/мл). Этот составленный буфер добавляли в раствор полимера, уменьшая перемешивание до 100-200 об./мин, чтобы минимизировать механическое напряжение белка. Конечным препаратом заполняли полипропиленовые шприцы при 2-8°С.

Исходный раствор τ-ΙΡΝ-бета представляет собой раствор ацетатного буфера, сконцентрированный

- 13 012205 от 0,348 до 2 мг/мл ультрафильтрирующим центрифугированием (8айотшк У1уа8рш 20 мл, отсечка ΜΨ 5000 Да, 2500 об./мин). Концентрированный основной раствор всегда исследовали современным методом 8ЕС-ВЭЖХ для анализа и определения чистоты (% мономера), как описано в примере 1, параграф 5, ниже.

2. г-ЫЕЫ-бета.

Использовали исходный КеЫГа® 0,348 мг/мл, а стабилизированный раствор т-ЫЕИ-бета 1а получали в соответствии с общим способом по параграфу 1, приведенным выше, добавлением комбинации стабилизаторов, например Ьи1го1® Г68/Ь-метионина.

3. Эксципиенты.

3.1. Ьи1го1 Е127® (полоксаиер, плуроник, синпероник).

Ьи1го1 Е127 (блоксополимер их трех компонентов полиоксиэтилен-полиоксипропиленполиоксиэтилена) ΒΆ8Ε представляет собой блоксополимер полиэтиленоксида и полипропиленоксида. Включен в список неактивных ингредиентов по критерию ΕΌΆ (Департамента по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств) (внутривенные инъекции, ингаляции, глазные препараты, пероральные порошки, растворы, суспензии и сироп, а также препараты для местного применения). Включен в список медикаментов для не парентерального применения, внесенных в Европейскую фармакопею Объединенного королевства 4, р. 1777; И8Р 24 ΝΡ19 р 2492-2493.

В плуронике® Е127 процент полиоксиэтилена (гидрофильный) составляет 73%, (полоксамер формулы (I), в которой (а)=(с)=67 и (Ь)=98).

Типичные свойства плуроника® Е127 приведены ниже:

Средний молекулярный вес: 12600 г/моль.

Точка плавления: 56°С.

Физическая форма при 20°С: твердое вещество.

Вязкость при 77°С: 3100 срк (сантипауз).

Поверхностное натяжение при 25°С 0,1% конц.: 41 дина/см.

Смачивание (Итауек ХУеШпд) (загрузка 3 г, 0,1% конц. при 25°С: > 360 с).

Высота пены (Кокк Мйек, 0,1% водный при 50°С: 40 мм).

Точка помутнения в водном растворе, 1% конц.: >100°С.

НЬВ (гидрофильный-липофильный баланс) в воде при 25°С: 18-23.

Растворимость в воде при 25°С: > 10%.

3.2. Ледяная уксусная кислота, 8фта.

3.3. Ьи1го1® Е68 (полоксамер, плуроник, синпероник).

Ьи1го1 Е68 (блоксополимер полиоксиэтилена и полиокипропилена), ΒΆ8Ε представляет собой блоксополимер полиэтиленоксида и полипропиленоксида. Включен в список неактивных ингредиентов по критерию ΕΌΆ (внутривенные инъекции, ингаляции, глазные препараты, пероральные порошки, растворы, суспензии и сироп, а также препараты для местного применения). Включен в список медикаментов для не парентерального применения, внесенных в Европейскую фармакопею Объединенного королевства 4, р. 1777; И8Р 24 ΝΡ19 р 2492-2493.

В плуронике® Е68 процент полиоксиэтилена (гидрофильный) составляет 80%, а молекулярная масса полиоксипропилена (гидрофобный) составляет приблизительно 1,967 Да (полоксамер формулы (I), в которой (а)=(с)=79 и (Ь)=28).

Типичные свойства плуроника® Е68 приведены ниже:

Средняя молекулярная масса: 8400;

Точка плавления/текучести: 52°С;

Физическая форма при 20°С: твердое вещество;

Вязкость (ВтоокйеИ) сантипауз: 1000 [жидкости при 25°С, пасты при 60°С и твердые вещества при 77°С];

Поверхностное натяжение, дины/см при 25°С;

0,1% конц.: 50,3;

0,01% конц.: 51,2;

0,001% конц.: 53,6.

Межфазное натяжение, дины/см при 2 5°С против растительного масла;

0,1% конц.: 19,8;

0,01% конц.: 24,0;

0,01% конц.: 26,0.

Смачивание (Итауек ХУеШпд). секунды, при 25°С;

1,0% конц.: >360;

0,1% конц.: > 360;

Высота пены:

Кокк Мйек, 0,1%, мм при 50°С: 35;

Кокк Мйек, 0,1%, мм при 26°С: 40;

- 14 012205

Динамическая, 0,1%, мм при 400 мл/мин: >600.

Точка помутнения в водном растворе, °С:

1% конц.: >100:

10% конц.: >100;

НТВ (гидрофильный-липофильный баланс): 29.

3.4. Ь-метионин, 81дта.

Ь-метионин (Ъ-Ме!) включали в препарат в количестве 0,03%, чтобы ограничить окисление и, следовательно, для стабильности раствора ΙΤΝ-бета.

4. Композиция гидрогеля (1).

Гидрогель (1), содержащий 120 мкг/мл Γ-ΙιΙΤΝ-бета 1а получали со следующим составом:

Ьи+го1® ΕΊ27 25,0% мас./мас.

Ацетатный буфер [50 ММ/рН 3,8] 74,7% мас./мас.

г-ЫЕТЯ-бета 1а 0,012% мас./мас.

Ь-Метионин 0,03% мас./мас.

ЬиЬго1® Г68 0,24% мас./мас.

Гидрогель (1) производили в соответствии с общим способом примера 1, параграф 1, и при этом использовали 25 г раствора лутрола Т127 и 3 мг Γ-ΤΙΤΝ-бета 1а.

5. Физико-химические свойства.

Вязкость.

Исследование динамической вязкости проводили, чтобы охарактеризовать такой гидрогель и подтвердить соответствующий стандарт инъецируемости; использовали вращающийся вискозиметр марки У1ксо81аг Ь ТипдйаЬ, получая прямое считывание в тРак (мПа-с (сантипаузах)). Порцию 50 г гидрогеля (1) готовили и вносили в полипропиленовый флакон, содержали в бане со льдом (Т=5±2°С) за время исследования вязкости. Полученные величины вязкости колебались между 100-140 тРак (шпиндель п° 2, скорость вращения шпинделя 100 оборотов в минуту и время уравновешивания 3 минуты).

Высвобождение белка.

Для того чтобы моделировать физиологические подкожные процессы, высвобождение ΙΤΝ-бета из гидрогеля (1) исследовали в РВ8. Тестирование высвобождения лекарственного средства проводили, используя 1 г препарата (1) (распределяли, используя предварительно заполненные шприцы) в 4 мл РВ8 рН 7,4 при 37 ± 2°С (скорость вибратора бани = 100 оборотов в минуту). Образцы отбирали через 5, 15, 30 мин, 1 и 2 ч.

Каждый образец исследовали методом 8Е-ВЭЖХ с флуоресцентным детектором (флуоресценция Тгр) и подтверждали методом ЕЫ8Л (Тогау Κι!). Указанные способы подробно описывают ниже.

Количество ΙΤΝ-бета, определенное в среде, выражали как процент общего высвобожденного белка. Профили высвобождения, полученные двумя методами, указывали на двухфазный характер высвобождения, с быстрой начальной фазой, за которой следовала более медленная скорость высвобождения лекарственного средства (фиг. 1).

Способ экстракции и анализ методом 8Е-ВЭЖХ.

Испытания проводили, чтобы оптимизировать метод экстракции ΙΤΝ-бета, введенного в системы гидрогелей, и оценить выход лекарственного средства.

Процедуру экстракции устанавливали следующим образом на основании смеси вода/органический растворитель, составленной из воды и ацетона:

500 мг гидрогелевого препарата (1) растворяли в 1,0 мл ацетона в центрифужной пробирке и разрушали ультразвуком в течение 2 мин в ультразвуковой бане при менее чем 10°С;

добавляли воду вплоть до 3 мл в виде конечного объема;

образец получали центрифугированием (5 мин при 10000 об./мин, при +4°С);

жидкую фазу собирали и исследовали.

После процедуры экстракции, образцы исследовали 8Е-ВЭЖХ при следующих рабочих условиях.

Колонка ВЭЖХ Т8К С2000 8^_хъ, тип. 08540 (внутренний диаметр 7,8 ммх30 см, 5 мкм).

Объем инжекции 100 мкл.

Температура колонки - комнатная температура.

Температура образца - комнатная температура.

Скорость течения: 0,5 мл/мин, (изократная).

Подвижная фаза: 70% об./об. очищенной воды (М1Ыр-М1Шроге) - 30% об./об. ацетонитрил - 0,2% об./об. ТТА.

Время работы 27 мин.

Время уравновешивания 3 мин.

Длины волн флуоресцентного детектора: возбуждение 280 нм, эмиссия 348 нм.

ЕЬ18А-анализ (твердофазный иммуноферментный анализ).

- 15 012205

Иммуноанализ ЕЫ8Л (Тогау кН) использовали, чтобы оценить концентрацию ΙΡΝ-бета, высвобожденного гидрогелем ΙΡΝ (1). В упомянутом анализе применяют одностадийный сэндвич-метод и используют 96-луночные микропланшеты, покрытые поликлональными антителами к Γ-ΙιΙΕΝ-бета. Связанные с ферментом моноклональные антитела, специфические для Γ-ΙιΙΕΝ-бета добавляли в лунки, а затем в лунки пипеткой добавляли стандарты и образцы; любой присутствующий Γ-ΙιΙΕΝ-бета связывался с иммобилизованным антителом. После промывания, чтобы удалить любой несвязанный реагент антителофермент, в лунки добавляли раствор субстрата, а окраска развивалась соответственно количеству Γ-11ΙΡΝбета, связанного на первоначальной стадии. Развитие окраски останавливали и измеряли интенсивность окрашивания.

Исследование проводили в соответствии с инструкцией с тем различием, что инкубацию образца проводили в течение всей ночи при +4°С.

Покрытый антителом микропланшет промывали 400 мкл промывающего раствора и высушивали на бумаге. Затем 50 мкл/лунку антитела, меченного ферментом, добавляли в микропланшет, предварительно заполненный 100 мкл образца, полученного в экспериментах по высвобождению лекарственного средства из гидрогеля (1), или заполненный исходным Γ-ΜΡΝ-бета в соответствии с кривой изменения концентрации (0-200 МЕД/мл). Микропланшет закрывали и энергично встряхивали во время инкубации в течение 120 мин при комнатной температуре. В конце инкубации образцы удаляли, микропланшет промывали 3 раза и высушивали на бумаге. 100 мкл раствора с развившейся окраской добавляли в каждую лунку; после 30 мин инкубации добавляли 100 мкл стоп-реагента и абсорбцию считывали при двух длинах волн 450 нм и 650 нм (фиг. 1) .

Предварительная стабильность

Стабильность гидрогеля ΙΡΝ (1) оценивали в течение периода времени: ί=0, 24 ч, 1 недели, 1 и 2 месяцам при 4°С. Проводимыми исследованиями были: анализ дозировки лекарственного средства с гомощью визуального осмотра и по вязкости (шпиндель п° 2, 100 оборотов в минуту, Т=6±2°С).

Препарат гидрогеля (1) был стабилен в течение по крайней мере 2 месяцев.

Пример 2. Биоактивность гидрогеля полоксамер 407-г-ЬШЫ-бета 1а (1).

Биологическую активность гидрогеля (1) оценивали по противовирусной активности г-ЫР№бета 1 а, высвобожденного из препарата гидрогеля (1) по сравнению с противовирусной активностью, наблюдаемой с исходным ΙΡΝ-бета.

Вирус везикулярного стоматита (У8У), вирус, который вызывает заболевание копыта и полости рта домашнего скота, был выбран для применения в данном исследовании из-за его чувствительности к интерферонам.

Провидимое противовирусное исследование основано на индуцируемом ΙΡΝ-бета ингибировании цитопатического действия вирусов на линиях клеток \νΙ8Η, помещенных в ЕМЕМ, содержащую 5% ΡΒ8, при 4х10⁴ клеток/лунку (50 мкл/лунку) 96-луночного титрационного микропланшета, предварительно заполненного серийным разведением (разведение 1:1,5) образца гидрогеля г-БШЫ-бета или стандартом (исходным) г-11 ΙΡΝ-бета 1а. Клетки инкубировали в течение 18-22 ч при 37°С и 5% СОг перед добавлением 50 мкл/лунку суспензии вируса везикулярного стоматита (У8У), приготовленной в ЕМЕМ, содержащей 2,5% РЕ88. В контрольные клеточные лунки добавляли только среду и не добавляли никакой суспензии вируса, тогда как в контрольные вирусные лунки добавляли только суспензию У8У. Инфицированные клетки инкубировали в течение еще 20-24 ч при 37°С и 5% СО₂, а затем окрашивали 5% раствором МТТ в течение 2 ч. В конце эксперимента, супернатанты отбрасывали, а соли формазана растворяли добавлением 200 мкл/лунку 96% этанола. Планшеты считывали при 595 нм на планшет-ридере спектрофотометра. Результаты выражали как процент ингибирования цитопатического действия в сравнении с контрольными клетками.

Биологическую активность τ-ΜΡΝ-бета 1а ίη νίίτο, высвобожденную из препарата гидрогеля (1) через 2 ч, оценивали, используя описанное выше ^ΙδΗ-исследование в двух различных сериях экспериментов. Концентрация τ-ΜΡΝ-бета 1а составляла 37,7 мкг/мл. Любую позитивную интерференцию гидрогеля лутрола без τ-ΜΡΝ-бета 1а (пласебо), использованного для приготовления геля также проверяли, по образованию пиков исходного Γ-ίΙΡΝ-бета 1а в плацебо.

Γ-ΗΙΡΝ-бета 1а, высвобожденный через 2 ч из обоих порций, показал, что биоактивность сохранялась и выход был полным по соавнению с исходным τ-ΜΡΝ-бета 1а, вставленным в плацебо (фиг. 2). Поэтому оказалось, что гидрогели полоксамера способны сохранять полную биологическую активность гΙΙΡΝ-бета 1а при высвобождении лекарственного средства.

Пример 3. Фармакокинетический профиль гидрогеля полоксамера 407-г-ЬШЫ-бета 1а (1).

Для оценки характеристик пролонгированного высвобождения полоксамерового гидрогеля ΙΡΝ изобретения, можно сравнивать фармакокинетический профиль гидрогеля с профилем буферных препаратов и других гелевых препаратов.

Фармакокинетический профиль препарата гидрогеля ΙΡΝ-бета (1) изучали на наивных обезьянах сепото1оди8 (2 самца и 2 самки в каждой группе) и сравнивали с фармакокинетическим профилем препарата липогеля ΙΡΝ-бета.

- 16 012205

Образцы обеспечивали в предварительно заполненных шприцах, снабженных иглой 190. Исследование предназначали (таблица ГУ ниже) для сравнения подкожной инъекции один раз в неделю гидрогеля ΙΡΝ-бета (1) с инъекцией один раз в неделю жидкого забуференного (рН 3,8) препарата исходного ΙΡΝ-бета (контроль) или с подкожной инъекцией один раз в неделю липогеля ΙΡΝ-бета (120 мкг/мл) (контроль 2).

Использовали другую контрольную группу, в которой обезьянам вводили три раза в неделю (ΤΙν) (3 подкожные инъекции с 48-часовыми интервалами: 1=0, 48 ч и 96 ч), имитируя распространенную схему приема К.еЫГ® для лечения М8 (контроль 3).

Раствор ΙΡΝ для контроля 1 (группа 2) состоял из 40 мкг/мл раствора ΙΡΝ в 50 мМ ацетатном буфере.

Липогелевая композиция ΙΡΝ-бета для контроля 2 (группа 3) была следующей:

Моностеарат глицерина (СМ3), 22,37% мас./мас.

(КУЬО™ МС20 РНАКМА,

Оаптасо Οιιΐ+οχ)

РЕС400 63,09% мас./мас.

(ЪиЬго1 Е400, ВАЗЕ)

Уксусная кислота 4,03% мае./мае.

Ацетатный буфер [50 мМ/рН 3,8] 9,94% мас./мас.

г-Ъ1ГК бета 1 а 0,01% мас./мас.

Ь-Метионин (3±дта) 0,03% мас./мас.

Гидроксипропил-β-циклодекстрин 0,03% мас./мас.

(Сауаао1 РГ7НР, Иаскег)

Раствор ΙΡΝ для контроля 3 (группа 4) состоял из 16 мкг/мл раствора ΙΡΝ в 50 мМ ацетатном буфере.

Взятие образцов крови включало пре-дозу и было задумано, чтобы охватить 14 дней после инъекции (336 ч) для группы 1 и 3; 2 дня после инъекции для группы 2. Взятие образцов крови для группы 4 предназначали для того, чтобы учесть характеристики РК после первой и последней инъекции г-ΜΡΝ бета 1 а и полной характеристики неоптерина.

г-ΙιΙΡΝ бета 1а количественно определяли с помощью иммуноанализа, ЕЫ8А (Ги)|геЫо). как описывают выше. Уровни неоптерина оценивали количественно с помощью анализа КГА (ΙΟΝ Вютейюа!).

ТаблицаΙΥ

Группа	Тип препарата	Доза (мкг/кг)	Замечания
1	Гидрогель-1 ΕΝ- бета	3, 67 подкожно	Гидрогель полоксамера, инъекция в 6=0
2	ΙΓΝ-бета (Контроль 1)	3, 67 подкожно	Исходный раствор, инъекция в 6=0
3	липогель ΙΓΝ-бета (Контроль 2)	3, 6Ί подкожно	Липогель глицирил моностеарата в 6=0
4	Исходный ΙΝΓ-бета (Контроль 3)	3x1,223 подкожно	Инъекция исходного раствора в 6=0, 49 часов, 96 час

Высвобождение β-ΙΡΝ.

Результаты доказывают, что после однократной подкожной инъекции полоксамеровый гидрогель (1) (группа 1) высвобождает г-ΜΡΝ бета 1а контролируемым способом, поддерживая уровни в плазме выше 5 ЕД/мл приблизительно в течение недели, и, возможно, больше (фиг. 3).

Биодоступность белка значительно выше (табл. V, ниже) по сравнению с забуференным жидким препаратом (как при подкожной однократной инъекции, так и инъекциях ΤΙν) и препаратом липогеля, использованным в качестве контролей.

Высвобождение г-ΜΡΝ бета 1а полоксамеровом гидрогелем (1) продемонстрировало несомненный выраженный контролируемый характер по сравнению с профилем высвобождения г-ΙιΙΡΝ бета 1а, полученный с липогелем на основе ОМ8 (группа 3), как показано на фиг. 3 и 4. Профиль высвобождения г11ΙΡΝ бета 1а из липогеля (контроль 2) характеризовался более низким «всплеском» и низким, пролонгированным состоянием равновесия.

Полученные результаты показали, что липогелевый препарат, используемый как контроль, не подходит для пролонгированного высвобождения г-ΙιΙΡΝ бета 1а.

- 17 012205

Таблица V

Параметры РК	Гидрогель ΙΓΝ-бета (1)	Липогель IГЫ-бета (Контроль 2)	ΙΓΝ-бета (Контроль 1)	ΙΓΝ-бета (Контроль 3) 1 день	ΙΡΝ-бета (Контроль 3} 5 день
Т макс. (час)	8,0+0,0	1,5+0,5	13+0,5	1,8+0,5	1,4 + 0,5
С макс, (МЁД/мл)	231,31116,4	24,0112,1	96,3+53,4	31,3±0,9	26, 1±1б, 5
г ч (час)	19,4+2,4	45,1+77,6	9,5+3, 8	6,1+2,8	8,0±3,5

Увеличение уровней неоптерина в сыворотке.

Результаты фармакодинамического (ΡΌ) исследования подтвердили биологическую активность г11ΙΡΝ бета 1а, высвобожденного из гелей. Уровни неоптерина повышались со сдвигом 1_тах приблизительно 24 ч для инъекции гидрогеля (1) по сравнению с контролем (контроль 1). Повторное введение доз (ΤΙ4) Γ-ΙΙΡΝ-бета 1а приводило к более низкому, но продолжительному профилю РС (контроль 3). Препарат липогеля давал более низкий фармакодинамический профиль (контроль 2).

Получение контрольного препарата липогеля.

В полипропиленовом чане (низкая адсорбция белка) взвешенные количества СМБ и ПЭГа смешивали в ацетатном буфере [50 мМ, рН 4-5] и содержали в водяной бане (40°С) в течение нескольких минут для того, чтобы получить расплавленный и гомогенный липидный матрикс.

В другой сосуд небольшое количество ацетатного буфера [50 мМ, рН 4-5], содержащего стабилизирующие средства и наполнители (например, циклодекстрин и Ь-метионин), добавляли, чтобы получить исходный раствор Γ-ΙΙΡΝ-бета 1а (2 мг/мл). Описанный приготовленный буфер сначала помещали в водяную баню (40°С) приблизительно на 1,5 мин и добавляли в липидную смесь.

Смесь затем оставляли в водяной бане приблизительно в течение 5-10 мин, а потом охлаждали до комнатной температуры при мягком перемешивании с полипропиленовым стержнем.

Полученные результаты показали, что гидрогель (1) имеет биологическую активность подобную активности контрольных, жидких препаратов Γ-ΙΙΡΝ-бета 1а и делает возможным поддержание уровней Γ-ΙΙΡΝ-бета 1а в плазме в течение по крайней мере одной недели и достижение улучшенной биодоступности.

Пример 4. Стерилизующая фильтрация гидрогеля полоксамера 407-г-ЬШЫ-бета 1а (1).

Монофазный раствор гидрогеля, содержащий ΙΡΝ-бета, можно обрабатывать стерилизующей фильтрацией. ΙΡΝ-Гидрогель (1) получали, как описано в примере 1.

Две разные мембраны (ΡνΌΡ: фторид поливинилидена, и РЕБ: полиэфирсульфон) фирмы РЛЬЬ СогрогаЕоп с диаметром мембран 47 мм и пластиной 2 мм использовали при температуре, при которой вязкость раствора сохранялась низкой, например 4°С.

Вязкость определяли до и после фильтрации в реометре (У18СоБ1аг Ь ЕнпдПаЬ): 50 мл гидрогеля (1) в полипропиленовом флаконе содержали в бане со льдом (Т=5±2°С) , шпиндель п°С, 100 оборотов в минуту. Не наблюдали никаких значительных реологических изменений, обусловленных процессом фильтрации.

Содержание мономера ΙΡΝ и кинетику высвобождения из нагруженного ΙΡΝ гидрогеля (1) до и после фильтрации исследовали с помощью БЕС ВЭЖХ/флуоресцентного детектора (РВБ (рН 7,4), 37°С, 100 об./мин/1 г гидрогеля (1) в 4 мл РВБ). Полученные профили высвобождения после фильтрации оказались очень похожими на профили до фильтрации, следовательно, процесс фильтрации не модифицирует высвобождающие ΙΡΝ свойства гидрогеля.

Пример 5. Гидрогель полоксамера 407-г-ЬШЫ-бета 1а (2).

ΙΡΝ-гидрогель (2) получали, как описывают в примере 1, и трегалозу (Бщша) 2,6% мас./мас. добавляли к раствору буфера до образования раствора гидрогеля полоксамера, то есть, до добавления полоксамера 407.

Композиция гидрогеля (2).

Полоксамер 407 25% мас./мас.

Ацетатный буфер 50 мМ/рН 3,8 72,04; мас./мас.

г-ЫГЦ-бета 1 а 0,012% мас./мас.

Ц-Метионин 0,03% мас./мас.

Полоксамер 188 0,24% мас./мас.

Трегалоза 2,6% мас./мас.

- 18 012205

Вязкость.

Исследование динамической вязкости проводили, чтобы охарактеризовать гидрогель (2) и охарактеризовать свойства его инъецируемости. Использовали вращающийся вискозиметр типа У1ксо8!ат Ь Ει.ιη§ί1ηΚ получая прямое считывание в тРак (сантипаузах). Гидрогель (2) вносили в полипропиленовый флакон и измерения вязкости (8РЬ4, диапазон скорости - 200-300 об./мин) проводили во время изменения температуры и непрерывного считывания значений на дисплее вискозиметра.

Результаты указывают на другое реологическое поведение гидрогеля (2) по сравнению с гидрогелем (1). Применение трегалозы в концентрации 2,6% мас./мас. в гидрогеле (2) изобретения приводит к повышению температуры перехода раствор-гель (фиг. 5), что улучшает условия производства и манипулирования матриксом.

Пример 6. Гидрогель полоксамера 407-г-йШЫ-бета 1а (3).

ΙΕΝ-гидрогель (3) получали, как описано в примере 1, но гидроксипропил-β-циклодекстрин (Сауако1 ν7ΗΡ, Ааскег) 2,6% мас./мас. добавляли в буферный раствор при перемешивании с магнитом (500-700 оборотов в минуту) до добавления полоксамера 407. Затем, полоксамер 407 добавляли к раствору гидроксипропил-β-циклодекстрин, как описано в примере 1, при перемешивании с магнитом.

Композиция гидрогеля (3):

Полоксамер 407 20% мас./мас.

Ацетатный буфер 50 мМ/рН 3,8 77,34; мас./мас.

г-ΗΙΗΝ-бета 1 а 0,015% мас./мас.

Ь-Метионин 0,04% мае./мае.

Сауазо1 Н7НР 2,6% мае./мае.

Вязкость.

Исследование динамической вязкости проводили, чтобы охарактеризовать гидрогель (3) и охарактеризовать свойства его инъецируемости. Использовали вращающийся вискозиметр марки У1ксо8!ат Ь Ειιη§ίΓιΚ получая прямое считывание в тРак (сантипаузах). Гидрогель (3) вносили в полипропиленовый флакон и измерения вязкости (8РЬ4, диапазон скорости - 200-300 об./мин) проводили во время изменения температуры и непрерывного считывания значений на дисплее вискозиметра.

Результаты, представленные на фиг. 5, указывают на другое реологическое поведение гидрогеля (3) по сравнению с гидрогелем (1): температуры перехода раствор-гель гидрогеля (3) повышалась приблизительно от 11 до 23°С.

Поразительно, сдвиг температуры перехода раствор-гель гидрогеля (3) повышался значительно больше по сравнению со сдвигом температуры перехода раствор-гель гидрогеля, содержащего трегалозу, (2) , несмотря на более низкую концентрацию использованного матрикс-образующего полоксамера 407 (20% мас./мас.) (фиг. 5), что улучшает условия производства и обращение с матриксом.

Высвобождение белка.

Для моделирования физиологических подкожных процессов, высвобождение ΙΕΝ-бета из гидрогеля (3) исследовали в РВ8, как описано ранее. Тестирование высвобождения лекарственного средства проводили, используя 1 г препарата (3) (распределяли, используя предварительно заполненные шприцы) в 4 мл РВ8 рН 7,4 при 37±2°С (скорость вибратора бани = 100 об./мин). Образцы отбирали через: 5, 15, 30 мин, 1 и 2 ч.

Каждый образец исследовали методом 8Е-ВЭЖХ с флуоресцентным детектором (флуоресценция Тгр). Характеристики пролонгированного высвобождения (профиль высвобождения ΙΕΝ-бета) циклодекстрин-содержащего гидрогеля (3) были сопоставимыми с характеристиками гидрогеля без модификатора температурного перехода раствор-гель, то есть, гидрогеля (1) несмотря на сдвиг в температуре перехода раствор-гель (фиг. 6). При противовирусном исследовании, которое описано в примере 2, наблюдали, что Γ-11ΙΕΝ 1а, высвобожденный через 2 ч из циклодекстрин-содержащего гидрогеля (3), сохранял биоактивность, а выход был полным по сравнению с исходным г-ΙιΙΕΝ-β 1а, введенным в плацебо. Следовательно, оказалось, что гидрогель, содержащий циклодекстрин, (3) способен сохранять полностью биологическую активность г-ΙιΙΕΝ-β 1а при высвобождении лекарственного средства.

Пример 7. Гидрогель полоксамера 407-г-йШЫ-бета 1а (4).

ΙΕΝ-гидрогель (4) получали, как описано в примере 1 и глицерин 30°Ве' (30 градусов по Боме) (Саг1о ЕгЬа) 2,6% мас./мас. добавляли в буферный раствор до образования раствора гидрогеля полоксамера, то есть, до добавления полоксамера 407. Композиция гидрогеля (4):

Полоксамер 407 25% мас./мас.

Ацетатный буфер 50 ММ/рН 3,8 72,04; мас./мас.

г-ЫГЫ-бета 1 а 0,012% мае./мае.

Ь-Метионин 0,03% мае./мае.

Полоксамер 188 0,24% мас./мас.

Глицерин 30°Ве' 2,6% мас./мас.

- 19 012205

Пример 8. Гидрогель полоксамера 407-г-йШЫ-бета 1а (5).

ΙΡΝ-гидрогель (5) получали, как описано в примере 1, и ПЭГ (Ьи1го1®Е400, ВаГ) 2,6% мас./мас. добавляли в буферный раствор до образования раствора гидрогеля полоксамера, то есть, до добавления полоксамера 407.

Композиция гидрогеля (5):

Полоксамер 407 25% мае./мае.

Ацетатный буфер 50 мМ/рН 3,8 72,04; мас./мас.

г-ЫЕЫ-бета 1 а 0,012% мас./мас.

Ь-Метионин 0,03% мас./мас.

Полоксамер 188 0,24% мас./мас.

ПЭГ (ЬиЕго1®Е400) 2,6% мае. /мае.

Пример 9. Исследование введения шприцем.

Для тестирования подкожного введения шприцем полоксамеровых гидрогелей ΙΡΝ, исследование введения шприцем можно осуществлять, используя различные типы игл.

В частности, исследование введения шприцем проводили, используя новую технологию инъекции, названную Эеро1 Опе (Ιιηρπηΐ Рйагтасеибсак).

Выбранные иглы Эеро1 Опе представляют собой следующее:

18/23 (внутренний диаметр эквивалентен калибру иглы 18 и минимальный внешний диаметр соответствует калибру иглы 21);

1/26 (внутренний диаметр эквивалентен калибру иглы 21 и минимальный внешний диаметр соответствует калибру иглы 26).

Пропиленовые шприцы, 3 мл, заполняли 0,5 мл гидрогеля (1) или гидрогеля (3) (хранили при 4°С) и приблизительно через 15 мин при комнатной температуре выдавливали в полистироловый флакон. «Производительность шприца» устанавливали на основании силы, необходимой, чтобы выдавить шприцы.

Исследования введения шприцем при комнатной температуре показало, что гидрогель (3) имеет очень хорошие характеристики введения шприцем при комнатной температуре.

Пример 10. Фармакокинетический профиль гидрогеля полоксамера 407-Γ-1ιΙΡΝ-β 1а (3).

Фармакокинетические характеристики гидрогеля полоксамера 407-г-йШЫ-бета 1а (3) можно оценивать на самцах наивных обезьян супото1ди§ (выращенная в неволе Масаса Га5сюи1ап5) любым предшествующим способом лечения Γ-ΙιΙΡΝ-бета 1а и другим исследуемым лекарственным средством.

Животные.

Диапазон веса тела животных: 2-4 кг в начале исследования.

Диапазон возраста: приблизительно 5 лет.

Количество животных на группу: 4.

Препараты вводили животным, которые голодали в течение ночи (то есть, приблизительно в течение 16 ч) до введения. Пищу можно снова давать через 4 ч после лечения. Воду можно давать ай НЬйит.

Препарат гидрогеля г-ΙιΙΡΝ-β 1а (3) готовили в предварительно заполненные шприцы по 320 мг каждый с иглой 21 С при концентрации 174 мкг г-ΙιΙΡΝ-β 1а на грамм. Вследствие термообратимой природы препарата геля, предварительно заполненные шприцы следует хранить при 4°С и содержать при комнатной температуре только в течение времени, необходимом для введения.

Однократную дозу, которая составляла 44 мкг г-ΙιΙΡΝ-β 1а на животное, вводили под кожу одной из ног. 200-250 мг из одного предварительно заполненного гидрогелевым препаратом Γ-ΙιΙΡΝ-бета 1а (3) шприца вводили каждой обезьяне (один шприц для каждой обезьяны) в группе 1 (от 1 до 4 животных). Стеклянные предварительно заполненные шприцы взвешивали до и после введения, чтобы произвести точную оценку введенной дозы.

Кровь собирали из латеральной подкожной вены в пробирки в соответствии со схемой, подробно представленной в таблице ниже:

- 20 012205

Время взятия образца	Время взятия образца, исследование ΙϊΉ-бета	Время взятия образца, исследование неоптерина	Общее количество собранной крови
Предварительное исследование (день-1)		X	0,5 мл
Предварительное исследование (0 час)	X	X	1,5 мл
3 0 мин	X	-	1,0 мл
1 час	X	-	1,0 мл
2 час	X	-	1,0 мл
4 час	X	-	1, 0 мл
6 час	-	X	0, 5 мл
8 час	X		1,0 мл
24 час	X	X	1, 5 мл
32 час	X	X	1,5 мп
4 8 час	X	X	1, 5 мл
56 час	X	X	1,5 мл
72 час	X	X	1,5 мл
96 час	X	X	1, 5 мл
104 час	X	X	1,5 мл
120 час	X	X	1,5 мл
168 час	X	X	1,5 мл

Образцы крови оставляли для свертывания в течение 60 мин при комнатной температуре. Сгусток отделали центрифугированием при 2500 д (3350 оборотов в минуту) при 4°С в течение 15 мин.

Если собирали 0,5 мл крови, готовили 2 аликвоты сыворотки, 1-ая по крайней мере 0,125 мл сыворотки, 2-ая с оставшейся сывороткой.

Если собирали 1,0 мл крови, готовили 2 аликвоты сыворотки, 1-ая по крайней мере 0,250 мл сыворотки, 2-ая с оставшейся сывороткой.

Если собирали 1,5 мл сыворотки, готовили 3 аликвоты сыворотки, 1-ая и 2-ая по крайней мере по 0,250 мл сыворотки, 3-ая с оставшейся сывороткой.

Образцы сыворотки для исследования Γ-ΙιΙΡΝ-бета 1а хранили при -80°С.

Образцы сыворотки для исследования неоптерина хранили при -20°С.

Следующие фармакокинетические параметры получали из индивидуальных сывороточных концентраций г-ΗΙΡΝβ 1а (как МЕД/мл) в зависимости от времени (часы) после каждого введения.

Непосредственно при наблюдении:

С_тах: наиболее высокая величина концентрации, установленная в сыворотке.

Т_мах: время от введения, при котором установлена величина С_тах.

Τζ: время взятия последнего образца, в которое обнаружена количественно определяемая концентрация.

Сζ: величина концентрации, полученная во время Τζ взятия образца.

При использовании программы \Уй1№п1т®:

Λυί,'ζ: площади области под кривой изменения сывороточной концентрации в зависимости от времени вплоть до времени взятия образца Τζ, рассчитанная по «Ьод-линейному правилу трапеции» (линейная вплоть до Οη^, логарифмическая после С_тах).

Τ1ίη: первая точка, рассматриваемая для определения периода полувыведения.

λζ: константа скорости элиминации, рассчитанная по наклону кривой линейной регрессии, полученной построением естественных логарифмов величин конечной концентрации в зависимости от времени (от Τ1ίη до Τζ).

!1/2: период полувыведения, рассчитанный по уравнению:

Ъ1/2 =(Ιη2)/λζ

АИС: площадь области под кривой изменения сывороточной концентрации в зависимости от вре мени, рассчитанная по следующему уравнению:

Аис=лисг+сг/Хг

- 21 012205 %АИСех1: процент экстраполированного АИС (то есть, полученного экстраполяцией), рассчитанный по следующему уравнению:

% Аисех±.= (лис-лис ζ) /Аис 1 о о

Описанный эксперимент можно проводить с параллельной группой 2 животных, используя коммерческий препарат ΙΡΝ(β в качестве стандарта (такой как К.еЫГ®: раствор препарата, содержащий человеческий сывороточный альбумин (НАБ)), маннит и ацетат натрия в качестве наполнителей, упакованный в предварительно заполненные шприцы с иглой 21 С объемом инъекции 0,5 мл при концентрации 44 мкг г-ΗΙΡΝβ 1а (12 ММЕД). В этом случае, все содержимое (0,5 мл) одного предварительно заполненного шприца КеЬгГ® вводили каждой обезьяне (один шприц на животное) в группе 2 (от 5 до 8 животных).

Анализируемое вещество: интерферон бета (г-ΗΙΡΝβ 1а):

	Т макс. (час)	С макс. [МЕД/мл]	ДОС-последний [час*МЕД/мл]	Τ'- последнее [час]	с- последнее [МЕД/мл]	АОС (0-72) [час*МЕД/мл]
Меап	12	1930	54300	96	9, 64	53900
ЗБ	8,0	992	16000	16	5, 10	15800
СУ%	67	513	29, 4	17	52, 9	29, 3

Полученные результаты показали, что гидрогелевый препарат г-ΗΙΡΝβ 1а (3) характеризуется высокой биодоступностью.

Claims (19)

1. Фармацевтическая композиция, содержащая интерферон-бета (ШЫ-Ье1а), где указанная композиция представляет собой гидрогель полоксамера и дополнительно содержит метионин.

2. Композиция по п.1, в которой интерферон-бета представляет собой рекомбинантный ΙΡΝ-бета.

3. Композиция по любому из предшествующих пунктов, в которой интерферон представляет собой рекомбинантный ΙΡΝ-бета 1а.

4. Композиция по любому из предшествующих пунктов, где композиция дополнительно содержит буфер и антиоксидант.

5. Композиция по любому из предшествующих пунктов, где композиция дополнительно содержит буфер и поверхностно-активное вещество.

6. Композиция по любому из предшествующих пунктов, где композиция дополнительно содержит модификатор температурного перехода раствор-в-гель.

7. Композиция по любому из предшествующих пунктов, где композиция дополнительно содержит модификатор температурного перехода раствор-в-гель, выбранный из трегалозы и циклодекстрина.

8. Композиция по любому из предшествующих пунктов, в которой полоксамер представляет собой полоксамер 407.

9. Композиция по любому из предшествующих пунктов, где композиция содержит от 20 до 25% мас./мас. полоксамера 407.

10. Композиция по п.1, где указанная композиция представляет собой гидрогель полоксамера 407, содержащий рекомбинантный ΙΡΝ-бета 1а, и дополнительно содержит буфер и Ь-метионин.

11. Композиция по п.10, где композиция дополнительно содержит полоксамер 188.

12. Композиция по п.11, где композиция дополнительно содержит трегалозу.

13. Композиция по п.10, где композиция дополнительно содержит гидроксипропил-бетациклодекстрин.

14. Композиция по любому из предшествующих пунктов, где композицию выбирают из группы

- 22 012205

Полоксамер 407 - 25% мас./мас.

Ацетатный буфер 50 мМ/рН 3,8 - 74,7% мас./мас.

г-ЫЕИ-бета 1 а - 0,0X2% мас./мас.

Ь-Метионин - 0,03% мас./мас.

Полоксамер 188 - 0,24% мас./мас.

Полоксамер 407 - 25% мас./мас.

Ацетатный буфер 50 мМ/рН 3,8 - 72,04% мас./мас.

г-ЫГЫ-бета 1 а - 0,012% мас./мас.

Ь-Метионин - 0,03% мас./мас.

Полоксамер 188 - 0,24% мас./мас.

Глицерин 30°Ве' - 2,6% мас./мас.

Полоксамер 407 - 25% мас./мас.

Ацетатный буфер 50 мМ/рН 3,8 - 72,04% мас./мас.

г-ЫЕП-бета 1 а - 0,012% мас./мас.

Ь-Метионин - 0,03% мас./мас.

Полоксамер 188 - 0,24% мас./мас.

ПЭГ(ЬиЪго1®Е400) - 2,6% мас./мас.

Полоксамер 407 - 25% мас./мас.

Ацетатный буфер 50 мМ/рН 3,8 - 72,04% мас./мас.

г-ЫГЫ-бета 1 а - 0,012% мас./мас.

Ь-Метионин - 0,03% мас./мас.

Полоксамер 188 - 0,24% мас./мас.

Трегалоза - 2,6% мае./мае.

и

Полоксамер 407 - 20% мас./мас.

Ацетатный буфер 50 мМ/рН 3,8 - 77,34% мас./мас.

г-ЫГЫ-бета 1 а - 0,015% мас./мас.

Ь-Метионин - 0,04% мас./мас.

Гидроксипропил-р-циклодекстрин - 2,6% мае./мае.

15. Способ получения гидрогелевой композиции ΙΕΝ по пп.1-14, где указанный способ включает добавление рассчитанного количества полоксамера к забуференному раствору при температуре, при которой образуется гомогенный раствор полимера, а затем добавление интерферона.

16. Способ по п.15, где раствор буфера содержит модификатор температурного перехода раствор-вгель.

17. Способ по п.15, где раствор буфера содержит модификатор температурного перехода раствор-вгель, выбранный из трегалозы и циклодекстрина.

18. Способ по пп.15-17, где интерферон добавляют из раствора, содержащего стабилизаторы, выбранные из Ь-метионина и полоксамера 188 и их комбинации.

19. Применение гидрогелевой композиции ΙΕΝ по пп.1-14 для получения фармацевтического препарата для лечения рассеянного склероза.