KR20070012464A - 하이드로겔 인터페론 제제 - Google Patents

하이드로겔 인터페론 제제 Download PDF

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KR20070012464A
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마리아 돌리 델 쿠르토
일라리아 잠발디
실비아 폼필리
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아레스 트레이딩 에스.아.
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Abstract

본 발명은 인터페론을 함유하는 제약학적 Poloxamer 하이드로겔 제제에 관계한다. 특히, 본 발명은 인터페론-베타의 서방 하이드로겔 제제, 이의 제조 방법 및 용도에 관계한다.
인터페론-베타의 서방 하이드로겔 제제

Description

하이드로겔 인터페론 제제{HYDROGEL INTERFERON FORMULATIONS}
본 발명은 인터페론을 함유하는 제약학적 하이드로겔 제제에 관계한다. 특히, 본 발명은 인터페론-베타의 서방 하이드로겔 제제, 이의 제조 방법 및 용도에 관계한다.
재조합 단백질 제약학은 기존에 치료되지 않았던 여러 질병에 대한 독특한 치료법을 이미 제공하고 있으며, 다수의 새로운 단백질 약물이 개발되고 있다.
단백질은 일반적으로, 비경구 투여되는데, 이는 순환계로부터 단백질의 급속한 소실을 유발할 수 있다. 치료 효과적 혈액 수준을 유지하기 위하여, 다량 또는 빈번한 투약이 종종 필요하다. 이런 방식의 불편함과 잠재적인 부작용은 단백질의 지속된 또는 조절된 전달을 제공하는 시스템을 이용함으로써 우회될 수도 있다.
지속 전달 시스템은 괴형 투여(bolus dose)로 획득된 수준보다 훨씬 일정한 혈액 수준으로 단백질 치료제를 제공하고, 향상된 약물 효능과 더욱 적은 부작용을 유도할 수 있다. 이런 약물 전달 시스템에는 주입가능 오일, 에멀젼, 현탁액, 리포좀, 미세미립자(마이크로캡슐 또는 마이크로스피어(microsphere)), 이식물 또는 겔 시스템 등이 포함된다.
약물 전달에 이용되는 겔 시스템 중에서, 폴록사머(poloxamer) 겔이 in situ 에서 열경화성 겔-형성 재료로서 독특한 특성으로 인하여 사용되고 있다. 폴록사머는 온도 증가의 결과로서 낮은 점성 상태에서 높은 점성 상태로의 전이, 다시 말하면, “열성 겔화(thermal gelation)”가 진행되는 수성 겔을 형성하는 비-이온성 계면활성제로서 널리 공지된 폴리(에틸렌 옥사이드)와 폴리(프로필렌 옥사이드)의 블록 공중합체이다.
이에 더하여, 폴록사머는 우수한 습윤(wetting), 소포(anti-foaming), 용해 특성을 보유하고, 약물 전달 수단으로서 제약학적, 의학적 목적에 통상적으로 이용된다(Guzmet al., 1992, International Journal of Pharmaceutics, 80, 119-127; Gander et al., 1986, Drug Dev. and Indust. Pharmacy, 12 (11-13), 1613-1623).
폴록사머(상품명: Pluronic®)는 아래의 화학식(I)을 보유하는 삼중-블록 공중합체이다:
Figure 112006081965425-PCT00001
여기서 (a)와 (c)는 통계학적으로 동등하고, (b)는 15 이상이고, (a+c)는 분자 질량의 20 내지 90 %이다.
2개의 폴리에틸렌 옥사이드 사슬(PEO)은 친수성인 반면, 폴리프로필렌 사슬(PPO)은 소수성이기 때문에, 단위 (a)와 (b)의 총수를 변화시킴으로써 조절될 수 있는 PEO-PPO-PEO 블록 공중합체 양친화성 특성을 유도한다.
이들 PEO-PPO-PEO 블록 공중합체는 양친화성 특성으로 인하여, 자가-응집하 여 마이크로에멀젼(microemulsion) 뿐만 아니라 미셀(micell)과 액정상(liquid crystalline phase)과 같은 다양한 연합된 구조를 형성할 수 있다.
Pluronic®중에서, Poloxamer 407(Lutrol®F127 또는 Pluronic®F127), 화학식(I)의 폴록사머[(a)=(c)=99; (b)=65] 및 Poloxamer 338(Lutrol®F108 또는 Pluronic®F108), 화학식(I)의 폴록사머[(a)=(c)=16; (b)=46]은 20-35% 농도에서 이들의 수용액의 열성 겔화 특성으로 널리 알려져 있다(Guzmet al., 1992, above). 특히, 22-25%(w/w) Poloxamer 407 중합체 용액은 상대적으로 낮은 온도, 다시 말하면, 4 - 10℃에서 액체이지만 특징적인 전이 온도(transition temperature), 다시 말하면, 18 - 20℃ 이상으로 가열되면 고점성의 단단한 겔을 급속하게 형성한다. 이들 겔은 예로써, 체온으로 데워지면 겔을 형성하는 피하 주입, 국소 도포, 에어로졸용 액체 하이드로겔 제제에 이용된다(Guzmet al., 1992, above).
Poloxamer 407 겔은 겔 매트릭스로 적하된 단백질의 안정성을 강화시키는 것으로 밝혀졌으며(Stratton et al., 1997, Journal of Pharmaceutical sciences, 86, 9, 1006-1010), 리도카인(Lidocaine)(Chen-Chow et al., 1981, International Journal of Pharmaceutics, 8, 89-99), 인도메타신(Indomethacin)(Miyazaki et al., 1986, Chem. Pharm. Bull.34(4), 1801-1808), IL-2(Johnston et al., 1992, Pharmaceutical Research, 9(3), 425-434)를 함유하는 다양한 제제에 이용되고 있다.
인터페론은 사이토킨, 다시 말하면, 세포 사이에 메시지를 전달하고, 감염을 유발하는 미생물의 파괴를 보조하고 이에 따른 손상을 회복시킴으로써 면역계에서 핵심적인 역할을 수행하는 가용성 단백질이다. 인터페론은 감염된 세포에 의해 자연적으로 분비되며, 1957년에 처음 확인되었다. 이들의 명칭은 이들이 바이러스 복제와 생산을 “간섭”한다는 사실로부터 유래된다.
인터페론은 항바이러스와 항증식 활성을 보인다. 생화학적 특성과 면역학적 특성에 기초하여, 이들 자연-발생 인간 인터페론은 3가지 종류로 분류된다: 인터페론-알파(백혈구), 인터페론-베타(섬유아세포), 인터페론-감마(면역체). 현재, 알파-인터페론은 미국 및 다른 국가에서 모상 세포 백혈병(hairy cell leukemia), 성기 사마귀(venereal warts), 카포시 육종(Kaposi's Sarcoma)(후천성 면역 결핍증(AIDS) 환자에서 통상적으로 발생하는 암), 만성 비-A형, 비-B형 간염의 치료제로서 승인되었다.
더 나아가, 인터페론(IFN)은 바이러스 감염에 반응하여 체내에서 생성되는 당단백질이다. 이들은 보호된 세포에서 바이러스 복제를 저해한다. 저분자량 단백질로 구성되는 IFN는 상당히 비-특이적으로 작용한다, 다시 말하면, 한 바이러스에 의해 유도된 IFN은 넓은 범위의 다른 바이러스에 폭넓게 유효하다. 하지만, 이들은 종-특이적이다, 다시 말하면, 한 종에 의해 생성된 IFN은 동일하거나 밀접하게 관련된 종의 세포에서만 항바이러스 활성을 촉진한다. IFN은 잠재적인 항-종양과 항바이러스 활성이 개발된 첫 번째 사이토킨이다.
3가지 주요 IFN은 IFN-α, IFN-β, IFN-γ이다. 초기에, 이들 IFN은 기원된 세포(백혈구, 섬유아세포 또는 T 세포)에 따라 분류되었다. 하지만, 한 세포에서 여러 유형이 생성될 수 있음이 확인되었다. 이후, 백혈구 IFN은 IFN-α, 섬유아세 포 IFN는 IFN-β, T 세포 IFN는 IFN-γ로 불린다. 또한, “Namalwa”세포주(버킷림프종(Burkitt's lymphoma)으로부터 유래됨)에서 생성되는 네 번째 유형의 IFN, 림포양성(lymphoblastoid) IFN이 존재하는데, 이는 백혈구와 섬유아세포 IFN의 혼합물로 보인다.
인터페론 단위 또는 인터페론 국제 단위(U 또는 IU)는 바이러스 손상으로부터 세포의 50%를 보호하는데 필요한 양으로 정의되는 IFN 활성의 척도이다. 생활성을 측정하는데 이용되는 검사법은 세포변성 효과 저해법이다(Rubinstein, et al. 1981, J. Virol., 37, 755-758; Familletti et al., 1981, Methods in Enzymology, 78, Pestka Ed., Academic press, New York, 387-394). 인터페론에 대한 이런 항바이러스 검사에서 50%의 세포변성 효과를 유도하는데 대략 1 unit/㎖의 인터페론이 필요하다. 이들 단위는 국립보건원(National Institutes of Health)에 의해 제공된 Hu-IFN-베타에 대한 국제 참고 표준에 기초하여 결정된다(Pestka, 1986, Methods in Enzymology, 78, Pestka Ed., Academic press, New York 119, 14-23).
모든 종류의 IFN은 여러 상이한 유형을 포함한다. IFN-β와 IFN-γ는 각각 단일 유전자의 산물이다.
IFN-α로 분류된 단백질은 가장 다양한 군이며, 대략 15가지 유형을 포함한다. 크로모좀 9에 적어도 23개의 구성원을 포함하는 IFN-α 유전자의 클러스터가 존재하는데, 이들 중에서 15개가 활성화되고 전사된다. 성숙 IFN-α는 당화되지 않는다.
IFN-α와 IFN-β는 동일한 길이(165개 또는 166개 아미노산) 및 유사한 생물 학적 활성을 보유한다. IFN-γ는 146개 아미노산 길이를 보유하며, α와 β 종류와 다소 상이하다. IFN-γ만 대식세포를 활성화시키거나 킬러 T 세포의 성숙을 유도할 수 있다. 이들 새로운 유형의 치료제는 생물학적 반응 조절제(BRM)라고 하는데, 그 이유는 이들 치료제가 종양에 대한 생물체의 반응에 영향을 주고, 따라서 면역조절을 통한 인식에 영향을 주기 때문이다.
인간 섬유아세포 인터페론(IFN-β)은 항바이러스 활성을 보유하며, 종양 세포에 대항하는 자연 킬러 세포를 자극할 수 있다. 이는 바이러스와 이중-가닥 RNA에 의해 유도되는 대략 20,000 Da의 폴리펩티드이다. 재조합 DNA 기술에 의해 클론된 섬유아세포 인터페론 유전자의 뉴클레오티드 서열로부터, Derynk 등(Derynk et al., Nature, 285, 542-547)은 상기 단백질의 완전 아미노산 서열을 추론하였다. 이는 166개 ®아미노산 길이를 보유한다.
Shepard et al., 1981, Nature, 294, 563-565에서는 항-바이러스 활성이 소멸된 염기 842 돌연변이(141번 위치에서 Cys → Tyr) 및 뉴클레오티드 1119-1121이 결실된 변이 클론을 기술하였다.
Mark et al., 1984, Proc. Natl., Acad. Sci. U.S.A., 81(18), 5662-5666에서는 염기 469(T)를 (A)로 치환시켜 17번 위치에서 Cys → Ser 아미노산 전환을 유도하는 인공 돌연변이를 삽입하였다. 생성된 IFN-β는 장기 보관(-70℃)동안 ‘고유’IFN-β 만큼 유효하고 안정한 것으로 보고되었다.
Rebif®(Serono-재조합 인간 인터페론-β)는 다발성 경화증(MS)에 대한 가장 최신의 인터페론 치료제이며, 포유동물 세포주로부터 생산된 인터페론(IFN)-베타- 1a이다. 이의 권장된 국제 일반명(INN)은 “인터페론 베타-1a”이다.
IFN와 공중합체의 다양한 제제가 지난 세기동안 개발되었다. 이들 중에서, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 글리콜을 함유하는 IFN 알파 주사 제제(JP 2003 342193), 시클라라딘(cyclaradine)-IFN 알파 복합 제제(EP 0177153), 국소 투여를 위한 인터페론 알파 실온 Poloxamer 겔용 키트(US 4,469,228), IFNβ의 미세입자 제제(WO 01/58474), 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체와 화학적으로 결합된 당단백질을 함유하는 조성물(EP 0098110), 점막, 특히 비강내(intra-nasal) 전달용 IFNβ 제제(WO 2004/002404)가 기술되었다.
모든 단백질-기초된 의약품에서처럼, 치료제로서 인터페론의 이용에서 한가지 주요한 과제는 주입된 용량과 잠재적 관련 부작용을 증가시키지 않으면서 특정 기간 동안 치료 효과량을 혈액 수준에서 유지시키는 것이다. 결과적으로, 액체 제제에서보다 더욱 긴 기간 동안 IFN 혈장 수준을 유지하고 및/또는 IFN의 더욱 높은 혈장 노출을 제공하여 IFN 생물활성을 유지하거나 개선하는 IFN 제약학적 조성물이 필요하다.
본 발명의 요약
본 발명은 인터페론(IFN), 특히 재조합 h-IFNβ1a를 함유하는 Poloxamer 하이드로겔 또는 in-vivo 형성 Poloxamer 겔 제약학적 조성물 및 이들의 제조 방법에 관계한다. 이들 제약학적 조성물은 Poloxamer, 특히 Poloxamer 407로 제조된 하이드로겔이다. 이들 제약학적 조성물은 이후 IFN “하이드로겔(hydrogel)”이라 하는데, 이들은 인터페론(IFN), 또는 이의 동등형(isofom), 뮤테인(mutein), 융합 단백 질(fused protein), 기능성 유도체(functional derivative), 활성 분획물(active fraction)을 함유한다.
본 발명의 poloxamer 하이드로겔 IFN 제제는 쉽게 처리될 수 있고, 서방 프로필(sustained release profile) 및 대부분의 IFN 제제에 비하여 높은 생체이용효율(bioavailability)을 보이는 생체내 형성 겔이라는 이점을 갖는다.
본 발명의 한 구체예에서, 하이드로겔은 적어도 하나의 안정화제(stabilizing agent)를 함유한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 하이드로겔은 부형제로서 적어도 하나의 용액-겔 온도 전이 조절제(solution-to-gel temperature transition modifier)를 함유한다.
첫 번째 측면에서, 본 발명은 인터페론(IFN), 또는 이의 동등형, 뮤테인, 융합 단백질, 기능성 유도체 또는 활성 분획물을 함유하는 제약학적 조성물을 제시하는데, 상기 조성물은 Poloxamer 하이드로겔이다.
두 번째 측면에서, 본 발명은 상기한 IFN 하이드로겔 조성물을 제조하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 균질성 중합체 용액이 형성되는 온도에서, 계산된 양의 Poloxamer를 완충액에 첨가하고, 이후 인터페론, 또는 이의 동등형, 뮤테인, 융합 단백질, 기능성 유도체 또는 활성 분획물을 첨가하는 단계를 포함한다.
세 번째 측면에서, 본 발명은 다발성 경화증의 치료를 위한 제약학적 조성물의 제조에서 상기한 IFN-베타 하이드로겔 조성물의 용도를 제시한다.
네 번째 측면에서, 본 발명은 상기한 서방 IFN-베타 하이드로겔 조성물을 다 발성 경화증 환자에 투여하여 다발성 경화증을 치료하는 방법을 제시한다.
아래의 단락에서는 본 발명에 따른 화합물을 구성하는 다양한 화학적 부분의 정의를 제공하며, 더욱 광의의 정의로서 달리 명시되지 않는 경우에 명세서와 특허청구범위 전체에서 균일하게 적용된다.
본 명세서에서 “인터페론” 또는 “IFN”은 예로써 상기 “본 발명의 배경기술”에 언급된 임의 유형의 IFN을 포함하는 임의의 분자를 포괄한다. 특히, IFN-α, IFN-β, IFN-γ가 상기 정의에 포함된다. IFN-β는 본 발명에서 선호되는 IFN이다. 본 발명에 적합한 IFN-β는 예로써 Rebif®(Serono), Avonex®(Biogen) 또는 Betaferon®(Schering)이며, 상업적으로 구입가능하다.
본 명세서에서 “인터페론-베타(IFN-베타 또는 IFN-β)”는 생물학적 유체로부터 분리로 수득되거나, 또는 진핵이나 원핵 숙주 세포로부터 DNA 재조합 기술로 수득될 수 있는 섬유아세포 인터페론, 특히 인간 기원의 섬유아세포 인터페론 및 이의 염, 기능성 유도체, 변이체, 유사체, 활성 단편을 포괄한다. 적절하게는, INF-베타는 재조합 인터페론 베타-1a를 의미한다.
본 발명에 적합한 IFN-β는 예로써 Rebif®(Serono), Avonex®(Biogen) 또는 Betaferon®(Schering)이며, 상업적으로 구입가능하다. 인간 기원의 인터페론 역시 본 발명에 사용하기 적합하다. 본 명세서에서 인터페론은 이의 염, 기능성 유도체, 변이체, 유사체, 활성 단편을 포괄한다.
Rebif®(재조합 인간 인터페론-β)는 다발성 경화증(MS)에 대한 가장 최신의 인터페론 치료제이며, 치료에서 현저한 진전을 대표한다. Rebif®은 포유동물 세포주로부터 생성된 인터페론(IFN)-베타 1a이다. 인터페론 베타-1a의 주 3회 피하 투여는 재발-이장성 다발성 경화증(RRMS)에 유효한 것으로 확인되었다. 인터페론 베타-1a는 재발의 횟수와 심각도를 감소시키고, MRI에 의한 측정에서 질병 부담과 질병 활성을 감소시킴으로써 MS의 장기 과정에 긍정적인 영향을 줄 수 있다.
본 발명에서 재발-이장성 다발성 경화증의 치료에서 IFN-β의 용량은 이용된 IFN-β의 유형에 좌우된다.
본 발명에서, IFN이 대장균(E. coli)에서 생산되고 상품명 Betaseron로 상업적으로 구입가능한 재조합 IFN-β1b인 경우에, 이는 가급적, 1인당 대략 250 내지 300 ㎍ 또는 8 MIU 내지 9.6 MIU의 용량으로 격일로 피하 투여된다.
본 발명에서, IFN이 중국 햄스터 난 세포(CHO 세포)에서 생산되고 상품명 Avonex로 상업적으로 구입가능한 재조합 IFN-β1a인 경우에, 이는 가급적, 1인당 대략 30 내지 33 ㎍ 또는 6 MIU 내지 6.6 MIU의 용량으로 주 1회 근육내 투여된다.
본 발명에서, IFN이 중국 햄스터 난 세포(CHO 세포)에서 생산되고 상품명 Rebif®로 상업적으로 구입가능한 재조합 IFN-β1a인 경우에, 이는 가급적, 1인당 대략 22 내지 44 ㎍ 또는 6 MIU 내지 12 MIU의 용량으로 주 3회(TIW) 피하 투여된다.
본 명세서에서 “뮤테인”은 IFN 유사체를 의미하는데, 여기서 고유 IFN의 아미노산 잔기중 적어도 하나가 상이한 아미노산 잔기로 치환되거나 결실되고, 대안으로 하나이상의 아미노산 잔기가 IFN의 고유 서열에 부가되는데, 이때 야생형 IFN과 비교하여 생성된 산물의 능력에는 큰 변화가 없어야 한다. 이들 뮤테인은 공지된 합성 방법이나 특정부위-돌연변이유발 기술, 또는 임의의 적합한 다른 공지된 기술에 의해 제조된다. 바람직한 뮤테인에는 예로써 Shepard et al.(1981) 또는 Mark et al.(1984)에 의해 기술된 뮤테인이 포함된다.
임의의 이런 뮤테인은 IFN의 서열과 충분히 중복되는 아미노산 서열을 가지기 때문에, IFN와 실제로 유사한 또는 IFN보다 우수한 활성을 가진다. 인터페론의 생물학적 기능은 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 생물학적 표준은 확립되어 있고 National Institute for Biological Standards and Control(http://immunology.org/links/NIBSC)로부터 입수가능하다.
IFN 활성의 결정을 위한 생물검정법이 보고되었다. IFN 검정은 예로써 Rubinstein et al., 1981에 의해 기술된 바와 같이 수행될 수 있다. 따라서, 통상적인 실험 방법으로 일정한 뮤테인이 IFN와 실질적으로 동일하거나 IFN보다 우수한 활성을 가지는 지를 결정할 수 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 IFN의 뮤테인, 또는 이들을 코딩하는 핵산에는 본 명세서에 제시된 교시와 보도에 기초하여 과도한 실험없이 당업자가 용이하게 수득할 수 있는 치환 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 같은 일단의 실질적으로 상응하는 서열이 포함된다.
본 발명에 따른 뮤테인에 대한 바람직한 변화는“보존성”치환이다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 단백질의 보존성 아미노산 치환에는 분자의 생물학적 기능을 보존하면서 충분히 유사한 물리화학적 성질을 가지는 일군의 동질성 아미노산간 치환이 포함된다. 기능의 변화없는 아미노산의 부가 또는 결실이 상기 정의된 서열에서 실시될 수 있는데, 특히, 30개 이하, 바람하게는 10개 이하의 아미노산이 부가 또는 결실되고 기능적 구조에 중요한 아미노산(가령, 시스테인 잔기)이 결실 또는 치환되지 않는 경우에 기능의 변화없는 아미노산의 부가 또는 결실이 가능하다. 이런 결실 및/또는 부가에 의해 만들어지는 단백질과 뮤테인은 본 발명의 목적에 포함된다.
바람직한 동질성 아미노산 군은 표 I에 제시한다. 더욱 바람직한 동질성 아미노산 군은 표 II에 제시한다; 가장 바람직한 동질성 아미노산 군은 표 III에 제시한다.
표 I
바람직한 동질성 아미노산 군
아미노산 동질성 군
Ser Ser, Thr, Gly, Asn
Arg Arg, Gln, Lys, Glu, His
Leu Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu
Pro Gly, Ala, Thr, Pro
Thr Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr
Ala Gly, Thr, Pro, Ala
Val Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val
Gly Ala, Thr, Pro, Ser, Gly
Ile Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile
Phe Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe
Tyr Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr
Cys Ser, Thr, Cys
His Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His
Gln Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln
Asn Gln, Asp, Ser, Asn
Lys Glu, Gln, His, Arg, Lys
Asp Glu, Asn, Asp
Glu Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu
Met Phe, Ile, Val, Leu, Met
Trp Trp
표 II
더욱 바람직한 동질성 아미노산 군
아미노산 동질성 군
Ser Ser
Arg His, Lys, Arg
Leu Leu, Ile, Phe, Met
Pro Ala, Pro
Thr Thr
Ala Pro, Ala
Val Val, Met, Ile
Gly Gly
Ile Ile, Met, Phe, Val, Leu
Phe Met, Tyr, Ile, Leu, Phe
Tyr Phe, Tyr
Cys Cys, Ser
His His, Gln, Arg
Gln Glu, Gln, His
Asn Asp, Asn
Lys Lys, Arg
Asp Asp, Asn
Glu Glu, Gln
Met Met, Phe, Ile, Val, Leu
Trp Trp
표 III
가장 바람직한 동질성 아미노산 군
아미노산 동질성 군
Ser Ser
Arg Arg
Leu Leu, Ile, Met
Pro Pro
Thr Thr
Ala Ala
Val Val
Gly Gly
Ile Ile, Met, Leu
Phe Phe
Tyr Tyr
Cys Cys, Ser
His His
Gln Gln
Asn Asn
Lys Lys
Asp Asp
Glu Glu
Met Met, Ile, Leu
Trp Met
본 발명에 사용될 수 있는 IFN의 뮤테인을 수득하는데 이용될 수 있는 단백질에서 아미노산 치환체의 생산 방법의 예에는 임의의 공지된 방법이 포함되는데, 이들 방법은 예로써 미국 특허 4,959,314, 4,588,585, 4,737,462(Mark et al); 5,116,943(Koths et al.,); 4,965,195(Namen et al.,); 4,879,111(Chong et al.,); 5,017,691(Lee et al.,); 4,904,584(Shaw et al.,)(리신 치환된 단백질의 경우)에서 제시한다. IFN-베타의 특정 뮤테인은 예로써 Mark et al.,(1984)에서 보고되었다.
“융합단백질”은 예로써 체액에서 연장된 체류 시간을 갖고 다른 단백질과 융합된 IFN, 또는 이들의 뮤테인으로 구성되는 폴리펩티드를 의미한다. 따라서, IFN은 다른 단백질, 폴리펩티드 등, 예를 들면, 면역글로불린이나 이의 단편과 융합될 수 있다.
본 명세서에서 “기능성 유도체”에는 IFN의 유도체, 이들의 뮤테인, 융합 단백질이 포함되고, 이들은 당분야에 공지된 수단으로 잔기 또는 N-이나 C-말단 기에 측쇄로서 생성되는 작용기로부터 만들 수 있는데, 이들이 제약학적으로 수용가능하면, 다시 말하면, IFN의 활성과 실질적으로 유사한 단백질의 활성을 파괴하지 않고 이를 함유하는 조성물에 독성을 공여하지 않는다면 본 발명에 포함된다. 가령, 이들 유도체에는 폴리에틸렌글리콜 측쇄가 포함되는데, 이는 항원성 부위를 감추고 체액에서 IFN의 체류를 연장시킬 수 있다. 다른 유도체에는 카르복실기의 지방족 에스테르; 암모니아, 또는 일차 또는 이차 아민과의 반응에 의한 카르복실기의 아마이드; 아실 부분(가령, 알카노일 또는 카르보사이클릭 아로일 기)으로 형성된 아미노산 잔기의 유리 아미노기의 N-아실 유도체; 또는 아실 부분으로 형성된 유리 하이드록실기(가령, 세릴 또는 테레오닐 잔기)의 O-아실 유도체 등이 포함된다.
본 발명에서 IFN, 뮤테인, 융합단백질의 “활성 분획물”에는 단독으로, 또는 관련된 분자나 여기에 결합된 잔기(가령, 당이나 인산염 잔기) 또는 단백질 분자나 당 잔기의 자체적인 응집체와 공동으로, 단백질 분자의 폴리펩티드 사슬의 임의 단편이나 전구물질이 포함되지만, 이런 분획물은 상응하는 IFN와 실질적으로 유사한 활성을 보유해야 한다.
본 발명에 따라, 재조합 IFN-베타 1a와 본 발명의 화합물의 병용이 더욱 바람직하다.
독특한 인터페론 변이체가 최근에 보고되었다. 소위 “컨센서스 인터페론(consensus interferon)”은 IFN의 비-자연 발생 변이체이다(US 6,013,253). 본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 화합물은 컨센서스 인터페론과 병용된다.
본 명세서에서, 인간 인터페론 컨센서스(IFN-con)는 비-자연 발생 폴리펩티드를 의미하는데, 상기 폴리펩티드는 자연-발생 인간 백혈구 인터페론 아형 서열을 대표하는 IFN-알파 부분집합에 공통적인 아미노산 잔기를 보유하고, 모든 아형에 공통적인 아미노산이 존재하지 않는 하나이상의 위치에서 상기 위치에 우세하게 나타나는 아미노산을 보유하며, 적어도 하나의 자연-발생 아형에서 상기 위치에 존재하지 않는 아미노산 잔기를 전혀 보유하지 않는다. IFN-con에는 U.S. 4,695,623, 4,897,471, 5,541,293에 기술된 IFN-con1, IFN-con2, IFN-con3으로 명명된 아미노산 서열이 포함되지만, 이들에 국한되지 않는다. IFN-con을 인코딩하는 DNA 서열은 상기 특허에 기술된 방법, 또는 다른 표준 방법으로 생산될 수 있다.
다른 바람직한 구체예에서, 융합 단백질은 Ig 융합을 포함한다. 융합은 직접적으로, 또는 짧게는 1 내지 3개 아미노산 잔기 혹은 이보다 더욱 긴, 예를 들면, 13개 아미노산 잔기 길이의 짧은 링커 펩티드를 통하여 달성될 수 있다. 상기 링커는 예로써 트리펩티드 서열 E-F-M(Glu-Phe-Met), 또는 IFN 서열과 면역글로불린 서열 사이에 도입된 Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met을 포함하는 13개 아미노산 링커 서열이다. 생성된 융합단백질은 체액에서 연장된 체류 시간(반감기), 증가된 특이적 활성, 증가된 발현 수준, 융합 단백질의 용이한 정제와 같은 향상된 특성을 보유한다.
다른 바람직한 구체예에서, IFN은 Ig 분자의 불변 영역에 융합된다. 적절하게는, 이는 예로써 인간 IgG1의 CH2와 CH3 도메인과 같은 중쇄 영역에 융합된다. Ig 분자의 다른 동등형(isoform), 예를 들면, 동등형 IgG2, IgG3 혹은 IgG4, 또는 다른 Ig 종류(가령, IgM 또는 IgA) 역시 본 발명에 따른 융합 단백질의 생산에 적합하다. 가령, 융합 단백질은 단량체 또는 다량체이고, 헤테로- 또는 동종이다.
다른 바람직한 구체예에서, 상기 기능성 유도체는 아미노산 잔기의 하나이상의 측쇄로서 존재하는 한가지이상의 기능기에 부착된 적어도 하나의 부분을 포함한다. 적절하게는, 상기 부분은 폴리에틸렌(PEG) 부분이다. PEG화(PEGlaytion)는 WO 99/55377에 기술된 바와 같은 공지된 방법으로 수행될 수 있다.
개체에 투여된 용량은 약동학적 특성, 투여 경로, 환자 상태와 특성(성별, 연령, 체중, 건강, 크기), 증상의 정도, 병행 치료법, 치료 빈도, 소요 효과를 비롯한 다양한 인자에 따라 달라진다.
인간 IFN-베타 1a의 표준 용량은 일일 80,000 IU/㎏ 내지 200,000 IU/㎏, 또는 일일 1인당 6 MIU(백만 국제 단위) 내지 12 MIU, 또는 1인당 22 내지 44 ㎍이다. 본 발명에 따라, IFN-베타 1a는 주 1회 이하의 빈도로, 1인당 대략 1 내지 500 ㎍, 더욱 바람직하게는 대략 10 내지 308 ㎍, 또는 대략 10 내지 260 ㎍의 용량으로 투여된다.
본 발명에 따른 활성 성분의 투여는 근육내 또는 피하 경로로 달성된다. IFN에 적합한 투여 경로는 피하 투여이다.
IFN은 격일 이하의 빈도로 투여될 수도 있다. 적절하게는, IFN은 주 1회, 2회 또는 3회 투여된다.
적절한 투여 경로는 주 1회 이하의 빈도로, 피하 투여이다.
적절하게는, 제제에서 IFN-베타 1a는 대략 10 ㎍/㎖ 내지 800 ㎍/㎖, 더욱 바람직하게는 대략 20 ㎍/㎖ 내지 500 ㎍/㎖, 이보다 더욱 바람직하게는 대략 30 ㎍/㎖ 내지 300 ㎍/㎖, 가장 바람직하게는 대략 44, 88 또는 264 ㎍/㎖이다.
“하이드로겔”은 다량의 물을 보유하는 3차원 구조에서 스스로를 조직화할 수 있는 능력을 갖는 친수성 중합체의 가교-결합된 네트워크를 의미한다. Poloxamer는 수용액에서 미셀을 형성하는 특이성(particularity)을 갖는 중합체이다. 더욱 높은 농도 및/또는 상승된 온도에서, Poloxamer는 미셀의 연합에 의한 “겔화(gelation)”(용액-겔 전이)가 진행되고, 증가된 미셀간 상호작용으로 인하여 액정상(겔)을 형성한다. 이후, 더욱 높은 농도에서 겔은 다시 용융된다(Bromberg et al., 1998, Advanced Drug Delivery Reviews 31, 197-221).
상 전이(phase transition) 온도는 물에서 Poloxamer 농도에 좌우된다. 전형적으로, 20 내지 30 wt%의 중합체 농도 범위에서, 용액-겔 전이(solution-to-gel transition)는 5 내지 30℃ 온도에서 진행되고, 겔-용액 전이(gel-to-solution transition)는 35 내지 50℃에서 진행된다. 이런 이유로, 본 발명에 따른 “Poloxamer 하이드로겔”은 인간 체온에서 겔화(용액-겔 전이) 특성을 갖는 Poloxamer 용액을 의미한다. 가령, 본 발명의 Poloxamer 하이드로겔은 20 내지 30 wt %, 전형적으로, 20 내지 25 wt % Poloxamer를 함유한다. 이런 이유로, “하이드로겔”은 in-vivo 형성 겔을 또한 의미한다.
“용액-겔 온도 전이 조절제(“sol-gel”temperature transition modifier)”는 IFN 베타 함유 하이드로겔의 용액-겔 전이 온도를 변화시킬 수 있는, 바람직하게는 증가시킬 수 있는 부형제를 의미한다. 이런 조절제의 실례는 트레할로스와 같은 당, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세롤 30°과 같은 글리세린, 사이클로덱스트린, 바람직하게는 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린이다. sol-gel 온도 전이 조절제는 예로써 주사가능성(seringeability) 및/또는 보관 온도를 증가시키기 위하여, 하이드로겔의 전이 온도를 실온 정도로 증가시키는데 이용될 수 있다. 본 발명에 따른 하이드로겔은 대략 1 내지 3% w/w, 바람직하게는 대략 2.6% w/w의 sol-gel 온도 전이 조절제를 함유할 수 있다.
“계면활성제”는 액체의 표면 장력(surface tension)을 감소시키거나, 또는 두 액체 또는 액체와 고체간 경계면 장력(interfacial tension)을 감소시키는 화합물을 의미하는데, 표면 장력은 액체의 표면에 작용하여 표면 영역을 감소시키는데 기여하는 힘이다. 계면활성제는 때때로, 약물의 흡수 또는 약물의 표적 조직으로의 전달을 변화시키기 위하여, 저분자량 약물과 폴리펩티드의 전달을 비롯한 제약학적 제제에 이용된다. 널리 공지된 계면활성제는 폴리소르베이트(폴리옥시에틸렌 유도체; Tween) 및 Pluronic이다.
본 발명의 한 구체예에서, Pluronic은 가급적, 본 발명의 하이드로겔의 제조에 이용되는 안정화된 IFN 액체 제제에 존재하는 계면활성제이다.
본 발명의 다른 구체예에서, Pluronic®F77(Poloxamer 217), Pluronic®F87(Poloxamer 237), Pluronic®F88(Poloxamer 238), Pluronic®F68(Poloxamer 188)에서 선택되는 Pluronic, 특히 바람직하게는 Pluronic®F68(Pluronic®F68, BASF)이 본 발명의 하이드로겔의 제조에 이용되는 안정화된 IFN 액체 제제에 존재한다.
적절하게는, Pluronic은 원하는 보관 기관(가령, 12 내지 24개월) 동안 인터페론 안정성을 유지하고, 또한 표면, 예를 들면, 바이알, 앰플이나 카트리지 또는 주사기에 흡착으로 인한 단백질 손실을 예방할 만큼 충분한 농도로, 안정화된 IFN 액체 제제에 존재한다. 전형적으로, Lutrol®F68: 25 내지 200배 몰 과잉(molar excess)(IFN에 비하여), 바람직하게는 50배 몰 과잉(IFN 하중(loading)이 대략 150 ㎍/㎖인 경우에 대략 3 ㎎/㎖).
적절하게는, 안정화된 IFN 액체 제제에서 Pluronic, 특히 Pluronic®F68의 농도는 대략 0.01 ㎎/㎖ 내지 대략 10 ㎎/㎖, 더욱 바람직하게는 대략 0.05 ㎎/㎖ 내지 대략 5 ㎎/㎖, 이보다 더욱 바람직하게는 대략 0.1 ㎎/㎖ 내지 대략 2 ㎎/㎖, 가장 바람직하게는 대략 1 ㎎/㎖이다.
“항산화제”는 산소 또는 산소-유래된 유리 라디칼이 다른 물질과 반응하는 것을 예방하는 화합물을 의미한다. 항산화제는 물리적, 화학적 안정성을 강화하기 위하여 제약학적 시스템에 통상적으로 첨가되는 다양한 부형제에 속한다. 항산화제는 산소에 노출이후 또는 유리 라디칼의 존재하에, 일부 약물 또는 부형제와의 사이에서 발생하는 산화 과정을 최소화 또는 지체시키기 위하여 첨가된다. 이들 과정은 광, 온도, 농축 수소, 미량 금속의 존재 또는 과산화물에 의해 빈번하게 기폭될 수 있다. 아황산염(Sulfite), 중아황산염(bisufite), 티오요소(thiourea), 메티오닌, 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid)(EDTA)의 염, 부틸화된 하이드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene)(BHT), 부틸화된 하이드록시 아니솔(butylated hydroxy anisole)(BHA)이 약물에서 항산화제로서 주로 이용된다. 나트륨 EDTA는 산화 반응을 기폭하는 금속 이온을 킬레이트화시킴으로써 항산화제의 활성을 강화시키는 것으로 알려져 있다.
적절하게는, 항산화제, 특히 메티오닌은 본 발명의 하이드로겔의 제조에 이용되는 안정화된 IFN 액체 제제에 존재하는 안정화제이다. 전형적으로, 메티오닌은 100 내지 800배 몰 과잉(IFN에 비하여), 바람직하게는 400배 몰 과잉(IFN 하중이 대략 150 ㎍/㎖인 경우에 대략 0.4 ㎎/㎖)으로 사용될 수 있다. 메티오닌은 유리 염기 형태 또는 염 형태로 존재할 수 있다. 메티오닌이 유리 염기 형태 또는 염 형태로 존재한다면, 메티오닌의 임의 입체이성질체(즉, L, D, 또는 DL 이성체)가 본 발명의 방법이나 제제에 사용될 수 있다. 적절하게는, L-입체이성질체가 사용된다. 메티오닌의 유사체 역시 본 발명의 제제에 사용될 수 있다. “메티오닌 유사체”는 자연 발생 메티오닌의 유도체를 의미한다. 메티오닌 유사체는 유리 염기 형태 또는 염 형태로 본 발명의 제제에 사용될 수도 있다.
항산화제(가령, 메티오닌)의 첨가로 증가된 및/또는 유지된 안정성은 농도 의존성 방식으로 나타난다. 다시 말하면, 인터페론-베타를 함유하는 제제가 항산화제의 부재에서 산화 또는 집합체/올리고머 형성을 통상적으로 보이는 반면, 항산화제의 농도를 증가시키면 본 발명의 인터페론-베타 함유 제제의 안정성이 증가 및/또는 유지된다. 산화 또는 올리고머/집합체 형성을 감소시키기 위하여 본 발명의 제제에 사용되는 항산화제(가령, 메티오닌)의 양은 당업자에게 널리 공지된 방법을 이용하여 과도한 실험 없이 용이하게 결정될 수 있다.
“정균제(bacteriostatic)”는 제제에 첨가되어 항-박테리아제로서 기능하는 화합물이나 조성물을 의미한다. 정균제의 실례는 페놀, m-크레졸(cresol), p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알코올, 알킬파라벤(메틸, 에틸, 프로필, 부틸 등), 벤잘코늄 클로라이드(benzalkonium chloride), 벤제토늄 클로라이드(benzethonium chloride), 나트륨 디하이드로아세테이트, 티메로살(thimerosal)이다. 적절하게는, 정균제는 벤질 알코올이다.
본 발명에 따른 하이드로겔 제제는 단회 투약(mono-dose) 또는 다중 투약(multi-dose)될 수 있다. 다중 투약에 의도되는 본 발명의 이들 액체 인터페론 제제는 가급적, 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알코올, 알킬파라벤(메틸, 에틸, 프로필, 부틸 등), 벤잘코늄 클로라이드(benzalkonium chloride), 벤제토늄 클로라이드(benzethonium chloride), 나트륨 디하이드로아세테이트, 티메로살(thimerosal)과 같은 정균제를 함유한다. 적절하게는, 정균제는 페놀, 벤질 알코올, m-크레졸, 바람직하게는 벤질 알코올이다. 정균제는 대략 12 또는 24시간, 또는 대략 12일, 바람직하게는 대략 6 내지 12일의 다중 투약 기간 동안 제제를 본질적으로 무균(주사에 적합)으로 유지시킬 만큼 유효한 농도를 산출하는 양으로 사용된다. 적절하게는, 정균제는 대략 0.1%(정균제 중량/용매 중량) 내지 대략 2.0%, 바람직하게는 대략 0.2% 내지 대략 1.0%의 농도로 존재한다. 벤질 알코올의 경우에, 0.2 또는 0.3%의 농도가 특히 선호된다.
하지만, 보존제, 예를 들면, 벤질 알코올은 다중 투약 제제에 한정되지 않고 단회 투약 제제에도 첨가될 수 있다. 본 발명의 한 구체예는 벤질 알코올을 함유하는 단회 투약 제제이다.
적절하게는, 본 발명의 제제는 대략 3.0 내지 대략 5.0, 바람직하게는 대략 3.8-4.0의 pH를 보유한다. 선호되는 완충제는 아세테이트이고, 선호되는 반대-이온(counter-ion)은 나트륨 또는 칼륨 이온이다. 아세테이트 염수 완충제는 당분야에 널리 공지되어 있다. 전체 용액에서 완충제 농도는 대략 5 mM, 9.5 mM, 10 mM, 50 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, 500 mM에서 변화될 수 있다. 적절하게는, 완충제 농도는 대략 10 mM이다. 특히 적절하게는, 완충제는 아세테이트 이온에서 50 mM 농도 및 pH 3.8을 보유한다.
본 발명에 사용될 수 있는 “사이클로덱스트린”은 베타-사이클로덱스트린의 하이드록시프로필, 하이드록시에틸, 글루코실(glucosyl), 말토실(maltosyl), 말토트리오실 유도체 및 감마-사이클로덱스트린의 상응하는 유도체이다. 하이드록시알킬 집단은 하나이상의 하이드록실 기, 예를 들면, 하이드록시프로필(2-하이드록시프로필, 3-하이드록시프로필), 디하이드록시프로필 등을 보유할 수 있다. 글루코실, 말토실, 말토트리오실 유도체는 하나이상의 당 잔기, 예를 들면, 글루코실이나 디글루코실, 말토실이나 디말토실을 보유할 수 있다. 사이클로덱스트린 유도체의 다양한 혼합물, 예를 들면, 말토실과 디말토실 유도체의 혼합물 역시 사용될 수 있다. 본 발명에 이용되는 특정 사이클로덱스트린 유도체는 하이드록시프로필-베타-사이클로덱스트린(HPCD 또는 HPBCD), 하이드록시에틸-베타-사이클로덱스트린(HEBCD), 하이드록시프로필-감마-사이클로덱스트린(HPGCD), 하이드록시에틸-감마-사이클로덱스트린(HEGCD), 디하이드록시프로필-베타-사이클로덱스트린(2HPBCD), 글루코실-베타-사이클로덱스트린(G1-베타-CD 또는 G1BCD), 디글루코실-베타-사이클로덱스트린(2G G1-베타-CD 또는 2 G1BCD), 말토실-베타-사이클로덱스트린(G2-베타-CD 또는 G2BCD), 말토실-감마-사이클로덱스트린(G2-감마-CD 또는 G2GCD), 말토트리오실-베타-사이클로덱스트린(G3-베타-CD 또는 G3BCD), 말토트리오실-감마-사이클로덱스트린(G3-감마-CD 또는 G3GCD), 디말토실-베타-사이클로덱스트린(2 G2-베타-CD 또는 2 G2BCD), 이들의 혼합물, 예를 들면, 말토실-베타-사이클로덱스트린/디말토실-베타-사이클로덱스트린이다.
본 발명의 조성물에 사용되는 하이드록시프로필-베타-사이클로덱스트린은 상업적으로 구입가능하며, 본 발명에서 선호되는 사이클로덱스트린이다.
본 발명의 제제에서 인터페론의 농도 범위는 대략 1.0 ㎍/㎖ 내지 대략 50 ㎎/㎖이지만, 더욱 낮은 농도와 더욱 높은 농도 역시 이용가능하고 의도된 전달 운반체 또는 투여 경로에 좌우된다, 예를 들면, 용액 제제는 경점막 겔(가령, 협측 또는 비강 경로용 IFN 겔 조성물)과 구별된다. 적절하게는, 인터페론 농도는 대략 5.0 ㎍/㎖ 내지 2 ㎎/㎖, 바람직하게는 대략 10 ㎍/㎖ 내지 1 ㎎/㎖, 가장 바람직하게는 대략 30 ㎍/㎖ 내지 100 ㎍/㎖이다.
적절하게는, 본 발명의 제제는 24개월 기간 동안, 포장 시점에서 인터페론 활성의 적어도 대략 60%, 바람직하게는 적어도 대략 70%, 가장 바람직하게는 적어도 80%를 유지한다.
본 발명의 서방 제제는 계산된 양의 인터페론 용액을 poloxamer 균질성 용액에 첨가하는 단계를 포함하는 공정으로 제조될 수 있다. 적절하게는, 인터페론 용액은 인터페론 안정화된 용액, 예를 들면, L-메티오닌과 같은 안정화제, 폴록사머, 예를 들면, Poloxamer 188과 같은 계면활성제, 또는 이들의 조합을 함유하는 인터페론 용액이다.
본 발명의 한 구체예에서, 본 발명의 제제는 무균 조건하에 여과 단계, 예를 들면, 폴록사머 하이드로겔의 점도가 낮게 유지되는 온도(가령, 4℃)에서 0.22 ㎛ 막을 이용한 멸균 여과가 추가로 수행될 수 있다.
실온에서 본 발명의 제제의 주사가능성을 개선하기 위하여, 폴록사머 하이드로겔의 용액-겔 전이 온도를 변화시키는 부형제를 가급적, 액체 하이드로겔 용액의 형성이전, 다시 말하면, 폴록사머의 첨가이전에 완충액에 첨가할 수 있다. 폴록사머 하이드로겔의 sol-gel 전이 온도를 변화시키는 부형제의 실례는 폴리에틸렌 글리콜, 글리세롤 30°과 같은 글리세린, 트레할로스와 같은 당, 사이클로덱스트린, 예를 들면, 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린이다.
본 발명의 한 구체예에서, 하이드로겔 제제는 4℃에서, 물의 점도 내지 200 mPas 범위, 바람직하게는 자동혈관주입기(auto-injector) 또는 프리필드(pre-filled) 주사기와 같은 특별한 장치에 포함될 수 있고 피하 주사이후 “in situ” 겔을 형성할 수 있는 100 내지 150 mPas 범위의 점도를 보유한다.
이후, 생성된 용액은 바이알, 앰플, 카트리지 또는 프리필드 주사기에 집어넣는다. 이런 과정의 변경은 당업자에 의해 인식될 것이다. 가령, 이들 성분이 첨가되는 순서, 부가적인 첨가제가 사용되는 지의 여부, 제제가 제조되는 온도와 pH 모두 이용된 농도와 투여 수단에 맞게 최적화될 수 있는 인자이다.
보존된 제제는 투명 용액으로 환자에게 제공되는데, 그 이유는 하이드로겔이 sol-gel 전이 온도 이하에서 보관되기 때문이다.
본 발명의 하이드로겔 제제에 담긴 인터페론은 피하 주입, 경점막, 임플란트, 또는 당분야에 널리 공지되고 당업자에 의해 인정된 다른 수단을 비롯한 다양한 전달 방법을 통하여 환자에 투여될 수 있다.
“바이알”은 광의에서, 본 발명의 서방 인터페론 제제를 억제된 무균 상태에서 고체 또는 액체 형태로 유지하는데 적합한 저장소를 의미한다. 본 발명에 이용되는 바이알의 실례는 앰플, 카트리지, 블리스터 패키지(blister package), 또는 주사기 또는 경점막 스프레이를 통한 인터페론의 환자로의 전달에 적합한 다른 저장소이다.
본 발명에 따른 제제는 프리필드 주사기로 판매될 수도 있다.
본 발명의 제제는 인정된 주입 장치를 이용하여 투여될 수 있다. 이들 단일 바이알 시스템을 포함하는 실례는 Rebiject®과 같은 용액의 전달을 위한 자동혈관주입기 또는 펜-주입기(pen-injector) 장치이다.
주입 장치용 바늘은 본 발명의 하이드로겔의 두께와 적합하도록 선택된다. 가령, 본 발명의 하이드로겔은 18/23(18 게이지 바늘에 상당하는 내부 직경(internal diameter) 및 21 게이지 바늘의 최소 외부 직경(minimum external diameter)) 또는 21/26(21 게이지 바늘에 상당하는 내부 직경 및 26 게이지 바늘의 최소 외부 직경)과 같은 상이한 바늘 게이지를 보유하는 주입 장치로 도입될 수 있다.
적절하게는, 본 발명의 제제는 인정된 하이드로겔용 장치를 이용하여 투여될 수 있다. 가령, 본 발명의 하이드로겔을 주입하기 위하여 Depot One Needle 주입 기술(Imprint Pharmaceuticals)이 이용될 수 있다.
본 명세서에서, “치료”는 발병이후 병리학적 진행의 약화, 감소 또는 소멸을 비롯한 병의 진행에 대한 임의의 유익한 효과를 의미한다.
IFN, 또는 이의 동등형, 뮤테인, 융합 단백질, 기능성 유도체, 활성 분획물 또는 염을 함유하는 본 발명의 제약학적 조성물은 상기 폴리펩티드를 이용한 치료에 반응하는 임상적 징후의 진단, 예방, 치료(국소 또는 전신)에 유용하다. 이런 임상 징후에는 예로써, 다발성 경화증을 비롯한 중추 신경계(CNS), 뇌 및/또는 척수의 질병이나 질환; 류머티스 관절염, 건선, 크론병을 비롯한 자가면역질환; 유방암, 전립선암, 방광암, 신장암, 결장암을 비롯한 암이 포함된다.
논문이나 초록, 공개되거나 공개되지 않은 특허 출원, 특허 혹은 외국 특허, 또는 임의 다른 자료를 비롯한 본원에 언급된 모든 자료, 예를 들면 모든 데이터, 표, 도면 및 이들 언급된 자료에 기재된 참고문헌은 여기에 순전히 참조로 한다. 이에 덧붙여, 본원에 언급된 참고문헌의 전체 내용은 순전히 참조로 한다.
공지된 방법 단계, 통상적인 방법 단계, 공지된 방법 또는 통상적인 방법에 대한 참고문헌은 본 발명의 임의 측면, 설명 또는 구체예가 선행 기술에 개시, 교시 또는 제안되었음을 인정하는 것이 아니다.
특정 구체예의 전술한 설명에서는 본 발명의 전반적인 특성을 제시하는데, 당업자는 통상적인 지식을 활용하여 과도한 실험없이 본 발명의 기술적 사상과 범주를 벗어나지 않는 범위에서 이런 특정 구체예를 용이하게 개변할 수 있다. 따라서, 이런 개변은 본원에 제시된 내용에 기초하여 개시된 구체예의 균등물 범위에 속한다. 본원에 이용된 용어는 설명을 목적으로 하고, 본 발명을 제한하지 않으며, 본원에 개시된 내용에 비추어 당업자가 통상적인 지식으로 이해할 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명은 제약학적 조성물을 제시하는데, 상기 조성물은 인터페론(IFN)을 함유하는 Poloxamer 하이드로겔이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 제약학적 조성물을 제시하는데, 상기 조성물은 재조합 인터페론-베타 1a와 같은 재조합 인터페론-베타를 함유하는 Poloxamer 하이드로겔이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 제약학적 조성물을 제시하는데, 상기 조성물은 완충제와 항산화제를 추가로 함유한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 제약학적 조성물을 제시하는데, 상기 조성물은 완충제와 계면활성제를 추가로 함유한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 제약학적 조성물을 제시하는데, 상기 조성물은 용액-겔 온도 전이 조절제(sol-gel temperature transition modifier)를 추가로 함유한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 제약학적 조성물을 제시하는데, 상기 조성물은 트레할로스와 사이클로덱스트린에서 선택되는 용액-겔 온도 전이 조절제를 추가로 함유한다.
한 구체예에서, 본 발명은 제약학적 조성물을 제시하는데, 상기 조성물은 Poloxamer 407 하이드로겔이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 제약학적 조성물을 제시하는데, 상기 조성물은 20 내지 25% w/w의 Poloxamer 407을 함유하는 Poloxamer 407 하이드로겔이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 제약학적 조성물을 제시하는데, 상기 조성물은 재조합 인터페론-베타 1a와 같은 재조합 인터페론-베타, 아세테이트 완충제, 항산화제로서 L-메티오닌을 함유한다.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 제약학적 조성물을 제시하는데, 상기 조성물은 재조합 인터페론-베타 1a와 같은 재조합 인터페론-베타, 아세테이트 완충제, 항산화제로서 L-메티오닌, 계면활성제로서 Poloxamer 188을 함유하는 Poloxamer 407 하이드로겔이다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 제약학적 조성물을 제시하는데, 상기 조성물은 재조합 인터페론-베타 1a와 같은 재조합 인터페론-베타, 아세테이트 완충제, 항산화제로서 L-메티오닌, 계면활성제로서 Poloxamer 188, 용액-겔 온도 전이 조절제로서 트레할로스를 함유하는 Poloxamer 407 하이드로겔이다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 제약학적 조성물을 제시하는데, 상기 조성물은 재조합 인터페론-베타 1a와 같은 재조합 인터페론-베타, 아세테이트 완충제, 항산화제로서 L-메티오닌, 용액-겔 온도 전이 조절제로서 사이클로덱스트린, 바람직하게는 하이드록시프로필 베타 사이클로덱스트린을 함유하는 Poloxamer 407 하이드로겔이다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 아래에서 선택되는 제약학적 조성물을 제시한다:
Poloxamer 407 - 25% w/w
아세테이트 완충제 50 mM/pH 3.8 - 74.7% w/w
r-hIFN베타 1a - 0.012% w/w
L-메티오닌 - 0.03% w/w
Poloxamer 188 - 0.24% w/w;
Poloxamer 407 - 25% w/w
아세테이트 완충제 50 mM/pH 3.8 - 72.04% w/w
r-hIFN베타 1a - 0.012% w/w
L-메티오닌 - 0.03% w/w
Poloxamer 188 - 0.24% w/w
글리세롤 30°B- 2.6% w/w;
Poloxamer 407 - 20% w/w
아세테이트 완충제 50 mM/pH 3.8 - 77.34% w/w
r-h-IFN베타 1a - 0.015% w/w
L-메티오닌 - 0.04% w/w
하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린 - 2.6% w/w;
Poloxamer 407 - 25% w/w
아세테이트 완충제 50 mM/pH 3.8 - 72.04% w/w
r-h-IFN베타 1a - 0.012% w/w
L-메티오닌 - 0.03% w/w
Poloxamer 188 - 0.24% w/w
트레할로스 - 2.6% w/w;
Poloxamer 407 - 25% w/w
아세테이트 완충제 50 mM/pH 3.8 - 72.04% w/w
r-hIFN베타 1a - 0.012% w/w
L-메티오닌 - 0.03% w/w
Poloxamer 188 - 0.24% w/w
PEG(Lutrol®E400) - 2.6% w/w.
다른 구체예에서, 본 발명은 상기한 IFN 하이드로겔 제약학적 조성물을 제조하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 균질성 중합체 용액이 형성되는 온도에서, 계산된 양의 Poloxamer를 완충액에 첨가하고, 이후 인터페론, 또는 이의 동등형, 뮤테인, 융합 단백질, 기능성 유도체 또는 활성 분획물을 첨가하는 단계를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 상기한 IFN 하이드로겔 제약학적 조성물을 제조하는 방법을 제시하는데, 여기서 완충액은 트레할로스와 사이클로덱스트린에서 선택되는 용액-겔 온도 전이 조절제(solution-to-gel temperature transition modifier), 바람직하게는 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린을 함유한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 상기한 IFN 하이드로겔 제약학적 조성물을 제조하는 방법을 제시하는데, 여기서 인터페론은 가급적 L-메티오닌, Poloxamer 188, 이들의 조합에서 선택되는 안정화제를 함유하는 용액으로부터 첨가된다.
다른 구체예에서, 본 발명은 다발성 경화증의 치료를 위한 제약학적 조성물의 제조에서 상기한 IFN-베타 하이드로겔의 용도를 제시한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 상기한 IFN-베타 하이드로겔을 다발성 경화증 환자에 투여하여 다발성 경화증을 치료하는 방법을 제시한다.
본 발명은 아래의 실시예에 의해 기술되지만, 이들 실시예는 본 발명을 결코 제한하지 않는다. 이들 실시예는 아래에 특정된 도면을 인용한다.
도 1에서는 PBS에 하이드로겔 주입이후 37℃에서 PBS(pH 7.4)에서 SE-HPLC/형광 탐지기(마름모꼴)와 ELISA 검사법(닫힌 사각형)으로 측정된 r-hIFNβ1a Poloxamer 하이드로겔(1)로부터 r-hIFNβ1a 방출 비율 vs. 시간을 보여준다(실시예 1).
도 2에서는 r-hIFNβ1a 벌크(bulk)(열린 사각형) 및 r-hIFNβ1a가 없는 Poloxamer 겔(플라시보)과 공동-혼합된 r-hIFNβ1a(닫힌 삼각형)와 비교하여 r-hIFNβ1a-Poloxamer 하이드로겔(1)(열린 마름모꼴)로부터 2시간후 방출된 r-hIFNβ1a의 항바이러스 활성을 나타낸다. 항바이러스 활성은 r-hIFNβ1a 농도의 함수로서 VSV 감염이후 세포(WISH 세포) 생존의 비율로서 표시된다(실시예 2).
도 3에서는 3.6 ㎍/㎏의 r-hIFNβ1a Poloxamer 하이드로겔(1)의 일회 주입(닫힌 사각형), 3.6 ㎍/㎏ r-hIFNβ1a 벌크의 일회 주입(대조 1: 열린 삼각형) 또는 각각 1.223 ㎍/㎏의 48시간 간격(t=0, 48h, 96h)으로 분리되는 주 3회 주입(대조 3: 열린 마름모꼴)의 피하 투여이후, 실험 전력이 없는 키노몰구스 원숭이(cynomolgus monkey)에서 r-hIFNβ1a의 혈액 농도의 변동vs. 시간을 나타낸다(실시예 3).
도 4에서는 3.6 ㎍/㎏의 r-hIFNβ1a GMS 리포겔의 일회 주입(대조 2: 도트) 또는 각각 1.223 ㎍/㎏의 48시간 간격(t=0, 48h, 96h)으로 분리되는 주 3회 주입(대조 3: 열린 마름모꼴)의 피하 투여이후, 실험 전력이 없는 키노몰구스 원숭이(cynomolgus monkey)에서 r-hIFNβ1a의 혈액 농도의 변동vs. 시간을 나타낸다(실시예 3).
도 5에서는 2.6% w/w of 트레할로스를 함유하는 Lutrol 하이드로겔 제제(2)(닫힌 사각형) 및 2.6% w/w HP베타CD를 함유하는 Lutrol 하이드로겔 제제(3)(닫힌 삼각형)와 비교하여 Lutrol 하이드로겔 제제(1)(도트)의 점성 프로필을 나타낸다.
도 6에서는 37℃에서 PBS(pH 7.4)에서 SE-HPLC/형광 탐지기에 의한 측정된 r-hIFNβ1a Poloxamer 하이드로겔(3)(Poloxamer 407-20% w/w; 아세테이트 완충제 50 mM/pH 3.8-77.34% w/w, r-hIFNβ1a -0.015% w/w, L-메티오닌-0.04% w/w, 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린-2.6% w/w)로부터 방출된 r-hIFNβ1a의 비율을 나타낸다.
다음의 약어는 각각 아래의 정의를 의미한다:
㎝(centimeter), cps(centipoise), Da(Dalton), g(gram), ㎍(microgram), min(minute), ㎎(milligram), ㎖(milliliter), ㎜(millimeter), mM(millimolar), mPas(milliPascal second), rpm(rotation per minute), nm(nanometer), CHO(Chinese Hamster Ovary), IFN(Interferon), IU(International Unit), i.v.(intra-venous), EMEM(Minimum Essential Medium Eagle with Earle’s salts), FBS(Fetal Bovine Serum), GMS(Glyceryl monostearate), MTT(N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid), MS(multiple sclerosis), MW(molecular weight), PBS(Phosphate Buffered Saline), PES(Polyethersulfone), PP(Polypropylene), PVDF(Polyvinylidene fluoride), r-IFN 베타(recombinant interferon beta), r-hIFNβ1a(recombinant interferon beta 1a produced in CHO cells), RIA(Radioimmuno-assay), s.c.(Subcutaneous), TIW(Three times a week), UI(International unit), VSV(Vesicular Stomatitis Virus).
Poloxamer의 합성은 Schmolka 1977, Journal of the American Oil Chemist's Society 54, 110-116에서 기술하고, 상업적으로 구입가능하다.
실시예 1: Poloxamer 407-r-hIFN-β1a 하이드로겔(1)
1. 전반적인 제조 절차:
얼음 중탕(ice bath)에 배치된 폴리프로필렌 베커(becker)(낮은 단백질 흡수)에서, 칭량된 양의 Lutrol®F127을 중합체의 완전 분해 때까지 자석 교 반(magnetic stirring)[500-800 rpm에서]하에 차가운(2-8℃) 아세테이트 완충제[50 mM, pH 3.8]에 서서히 첨가한다.
다른 용기에서, 안정화제(가령, Lutrol®F68과 L-메티오닌)를 함유하는 소량의 아세테이트 완충제를 농축된 r-IFN-베타 벌크 용액(bulk solution)(2 ㎎/㎖)에 첨가한다. 이렇게 제조된 완충제를 중합체 용액에 첨가하고 교반을 100-200 rpm으로 감소시켜 단백질의 기계적 스트레스(mechanical stress)를 최소화시킨다. 최종 산물은 2-8℃에서 폴리프로필렌 주사기에 충전시킨다.
상기 r-IFN-베타 벌크 용액은 한외-여과 원심분리(Sartorius VivaSpin 20 ㎖, 5000 Da의 MW 컷오프(cut off), 2500 rpm)에 의해 0.348 ㎎/㎖에서 2 ㎎/㎖로 농축된 아세테이트 완충액이다. 농축된 벌크 용액은 하기의 실시예 1 § 5에 기술된 바와 같이, 현재의 SEC-HPLC 검사 방법으로 순도(단량체 %)를 분석한다.
2. r-hIFN-베타
Rebif® 벌크 0.348 ㎎/㎖를 사용하고, 안정화제의 조합, 예를 들면, Lutrol®F68/L-메티오닌의 첨가로 상기 §1에 기술된 전반적인 절차에 따라 r-hIFN-베타 1a의 안정화된 용액을 제조하였다.
3. 부형제:
3.1. Lutrol®F127( Poloxamer, Pluronic, Synperonic)
Lutrol®F127(폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 삼블록 공중 합체) BASF는 폴리-에틸렌-옥사이드와 폴리-프로필렌-옥사이드의 블록 공중합체이다. FDA 비활성 성분 가이드(i.v. 주입, 흡입, 안과 제조물, 경구 분말, 용액, 현탁액, 시럽, 국소 제조물)에 포함된다. UK에서 허가된 비-비경구(non-parenteral) 의약품에 포함된다(European Pharmacopoeia 4, p. 1777; USP 24 NF19 p 2492-2493).
Pluronic®F127에서, 폴리옥시에틸렌(친수성)의 비율은 73%이다((a)=(c)=67이고 (b)=98인 화학식(I)의 폴록사머).
Pluronic® F127의 전형적인 특성은 아래에 기재한다:
평균 분자량(average molecular weight): 12600 g/mol
융점(Melt. point): 56℃
물리적 형태 @ 20℃: 고체
점도 @ 77℃: 3100 cps
표면 장력 @ 25℃ 0.1% conc.: 41 dynes/㎝
Draves 습윤(3gm hook, 0.1% conc. @ 25℃: > 360s
거품 높이(foam height)(Ross Miles, 0.1%, 수성 @ 50℃: 40 ㎜
수용액에서 운점(cloud point), 1% conc.: >100℃
25℃, 물에서 HLB(친수성-친지성 균형, hydrophile-lipophile balance): 18-23
물에서 용해도 @ 25℃: >10%.
3.2. 빙초산(Glacial Acetic Acid), Sigma
3.3. Lutrol®F68(Poloxamer, Pluronic, Synperonic)
Lutrol®F68(폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체) BASF는 폴리-에틸렌-옥사이드와 폴리-프로필렌-옥사이드의 블록 공중합체이다. FDA 비활성 성분 가이드(i.v. 주입, 흡입, 안과 제조물, 경구 분말, 용액, 현탁액, 시럽, 국소 제조물)에 포함된다. UK에서 허가된 비-비경구(non-parenteral) 의약품에 포함된다(European Pharmacopoeia 4, p. 1777; USP 24 NF19 p 2492-2493).
Pluronic®F68에서, 폴리옥시에틸렌(친수성)의 비율은 80%이고, 폴리옥시프로필렌(소수성)의 분자량은 대략 1,967 Da이다((a)=(c)=79이고 (b)=28인 화학식(I)의 폴록사머).
Pluronic® F68의 전형적인 특성은 아래에 기재한다:
평균 분자량(average molecular weight): 8400
융점(Melt. point)/유동점(pour point): 52℃
물리적 형태 @ 20℃: 고체
점도(Brookfield) cps: 1000[25℃에서 액체, 60℃에서 반죽, 77℃에서 고체];
표면 장력(Surface tension), dynes/㎝ @ 25℃;
0.1% Conc.: 50.3
0.01% Conc.: 51.2
0.001% Conc.: 53.6
경계면 장력(Interfacial tension), dynes/㎝ @ 25℃ vs Nujol;
0.1% Conc.: 19.8
0.01% Conc.: 24.0
0.01% Conc.: 26.0
Draves 습윤, Seconds 25℃
1.0% Conc.: > 360
0.1% Conc.: > 360
거품 높이(foam height)
Ross Miles, 0.1%, mm @ 50℃: 35
Ross Miles, 0.1%, mm @ 26℃: 40
Dynamic, 0.1%, mm @ 400 ㎖/min: > 600
수용액에서 운점(cloud point), ℃
1% Conc.: >100
10% Conc.: >100
HLB(친수성-친지성 균형, hydrophile-lipophile balance): 29.
3.4. L-메티오닌, Sigma
L-메티오닌(L-Met)은 산화 및 결과적으로 IFN-베타 용액 안정성을 제한하는 0.03%의 수준으로 제제에 포함된다.
4. 하이드로겔(1) 조성물
120 ㎍/㎖의 r-hIFN-베타 1a를 함유하는 하이드로겔(1)은 아래의 조성을 보유하도록 제조되었다:
Lutrol®F127 25.0 % w/w
아세테이트 완충제[50 mM /pH 3.8] 74.7 % w/w
r-hIFN 베타 1a 0.012% w/w
L-메티오닌 0.03 % w/w
Lutrol®F-68 0.24 % w/w
하이드로겔(1)은 실시예 1,§1로부터 전반적인 절차에 따라 제조되었는데, 여기서 25 g의 Lutrol®F127 용액과 3 ㎎의 r-hIFN-베타 1a가 사용되었다.
5. 물리-화학적 특징
-점도
하이드로겔을 특성화하고 적절한 주입가능성 프로토콜(injectability protocol)을 뒷받침하기 위하여 역학 점성 연구(dynamic viscosity study)를 수행하였다; ViscoStar L Fungilab 회전형 점도계(rotational viscometer)를 이용하여 mPas(centipoise) 단위로 점도의 직접적인 결과를 획득하였다. 50 g 배치(batch)의 하이드로겔(1)을 제조하고 폴리프로필렌 바이알에 도입하며 점성 분석(viscosity analysis) 동안 얼음 중탕(T = 5 ± 2 ℃)에 유지시켰다. 보고된 점도 수치는 100-140 mPas이다(방추파(spindle) n°2, 100 rpm의 방추파 비율(spindle rate), 3분 평형 시간(equilibrating time)).
-단백질 방출
생리학적 피하 상태(physiological subcutaneous condition)를 모의하기 위하여, PBS에서 하이드로겔(1)로부터 IFN-베타 방출을 조사하였다. 1g의 제제(1)(프리필드 주사기를 이용하여 분배됨)를 이용하여, 37 ± 2℃에서 4 ㎖의 PBS(pH 7.4)로의 약물 방출 검사를 수행하였다(교반기 중탕 속도(shaker bath speed)=100 rpm). 샘플은 5분, 15분, 30분, 1시, 2시 시점에 수집하였다.
각 샘플은 형광 탐지기(Trp 형광)를 이용한 SE-HPLC로 분석하고 ELISA 방법(Toray Kit)으로 확증하였다. 이들 방법은 아래에 상술한다.
배지에서 탐지된 IFN-베타의 양은 방출된 전체 단백질의 비율로서 표시하였다. 이들 2가지 방법으로 획득된 방출 프로필(release profile)은 이상 방출 패턴(biphasic release pattern)을 지시하는데, 빠른 개시 단계(onset phase)가 느린 약물 방출 속도(drug release rate)를 선행한다(도 1).
추출 절차와 SE-HPLC 분석:
하이드로겔 시스템에 통합된 IFN-베타의 추출 방법을 최적화하고 약물 회 수(drug recovery)를 측정하는 검사를 수행하였다.
추출 절차는 물과 아세톤으로 구성되는 물/유기 용매 혼합물에 기초하여, 아래와 같이 설정되었다:
- 500 ㎎의 하이드로겔 제제(1)는 원심분리 튜브에서 1.0 ㎖의 아세톤에 용해시키고 10℃ 이하의 온도에서 초음파 중탕(ultrasonic bath)에서 2분간 초음파처리하였다.
- 물은 최종 부피(final volume)로서 최대 3 ㎖까지 첨가하였다.
- 획득된 샘플은 원심분리하였다(10.000 rpm, +4℃에서 5분).
- 액체상(liquid phase)은 수집하고 분석하였다.
추출 절차이후, 샘플은 아래의 작업 조건(operative condition)에서 SE-HPLC로 분석하였다:
- HPLC 칼럼 TSK G2000 SWXL cod. 08540(7.8 ㎜ ID x 30 ㎝, 5 )
- 주입 부피(injection volume) 100 ㎕
- 칼럼 온도 실온
- 샘플 온도 실온
- 유속(flow rate): 0.5 ㎖/min.(등용매)
- 이동상(mobile phase) 70 % v/v 정제된 물(MILLIQ-Millipore)-30 % v/v 아세토니트릴-0,2 % v/v TFA
- 가동 시간(run time) 27 min
- 평형 시간(equilibration time) 3 min
- 형광 탐지기 파장(fluorescence detector wavelength): 여기(excitation) 280nm, 방출(emission) 348nm.
ELISA 검사:
ELISA 면역검사법(Toray kit)을 이용하여 IFN 하이드로겔(1)에 의해 방출된 IFN-베타의 농도를 사정하였다. 이 검사법은 일-단계 샌드위치 방법(one-step sandwich method)을 이용하고, r-hIFN-베타에 대한 다클론 항체로 코팅된 96-웰 마이크로플레이트에 기초한다. r-hIFN-베타에 특이적인 효소-결합된 단클론 항체를 웰에 첨가하고, 이후 표준(standard)과 샘플을 피펫으로 이들 웰로 옮겼다; 존재하는 임의의 r-hIFN-베타는 고정된 항체에 의해 결합된다. 임의의 결합되지 않은 항체-효소 시약을 제거하기 위한 세척이후, 기질 용액을 웰에 첨가하는데, 최초 단계에서 결합된 r-hIFN-베타의 양에 비례하여 색채가 전개된다. 색채 전개를 중단시키고, 색채의 강도를 측정한다.
상기 검사법은 샘플 배양이 +4℃에서 하룻밤동안 수행되는 점을 제외하고, 리플릿(leaflet)에 따라 수행하였다.
항체-코팅된 마이크로플레이트는 400 ㎕의 세척 용액(washing solution)으로 세척하고 종이 위에서 건조시켰다. 이후, 하이드로겔(1)의 약물 방출 실험으로부터 획득된 100 ㎕ 샘플 또는 r-hIFN-베타 참고(벌크) 농도-곡선(0-200 IU/㎖)으로 미 리 충전된 마이크로플레이트에 50 ㎕/웰의 효소-표지된 항체를 첨가하였다. 마이크로플레이트는 실온에서 120분간 배양하는 동안 완전하게 감쌌다. 배양의 종결 시점에서, 샘플은 제거하고, 마이크로플레이트는 3회 세척하고 종이 위에서 건조시켰다. 100 ㎕의 색채 전개 용액(colour developer solution)을 각 웰에 첨가하였다; 30분 배양후, 100 ㎕의 반응 중단물질(stopper reaction)을 첨가하고 450 nm와 650 nm의 이중 파장에서 흡광도를 조사하였다(도 1).
- 예비 안정성(preliminary stability)
IFN 하이드로겔(1) 안정성은 4℃에서 t= 0, 24시, 1주, 1개월, 2개월 시점에 모니터하였다. 수행된 분석은 시각적 검사에 의한 약물 적하(drug loading) 및 점성이었다(방추파(spindle) n°2, 100 rpm, T = 6 ± 2℃).
하이드로겔(1) 제제는 적어도 2개월동안 안정하였다.
실시예 2: Poloxamer 407-r-hIFN-베타 1a 하이드로겔(1)의 생물활성
하이드로겔(1)의 생물활성은 벌크 IFN-베타에서 관찰된 항바이러스 활성과 비교하여 하이드로겔(1) 제제로부터 방출된 r-hIFN-베타 1a의 항바이러스 활성을 통하여 측정한다.
가축에서 발굽과 입의 질환을 유발하는 바이러스인 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus, VSV)는 인터페론에 대한 감수성(sensitivity)으로 인하여 본 발명에 선택되었다.
이용된 항바이러스 검사법은 r-hIFN-베타 하이드로겔 샘플, 또는 r-hIFN-베타 1a 참고(벌크)의 연속 희석액(1:1.5 희석도)으로 미리 충전된 96-웰 마이크로역가 평판의 EMEM(4x104 세포/웰에서 5% FBS를 함유)(50 ㎕/웰)에 도말된 WISH 세포의 세포주에 대한 바이러스 세포변성 효과(cytopathic effect)의 IFN-베타 유도된 저해에 기초한다. 세포는 EMEM(2.5% FBS 함유)에 제조된 50 ㎕/웰의 수포성 구내염 바이러스(VSV)의 첨가에 앞서, 37℃와 5% CO2에서 18-22시간동안 배양하였다. 대조 세포 웰은 바이러스 현탁액 없이 배지 단독을 투입하고, 대조 바이러스는 VSV 현탁액 단독을 투입하였다. 감염된 세포는 37℃와 5% CO2에서 20-24시간동안 추가로 배양하고, 이후 5% MTT 용액으로 2시간동안 염색하였다. 실험의 종결 시점에서, 상층액은 따라버리고, 포르마잔 염(formazan salt)은 200 ㎕/웰의 에탄올 96% 첨가로 용해시켰다. 이들 평판은 분광광도계 평판-판독기(spectrophotometer plate-reader)에서 595 nm에서 판독하였다. 결과는 세포변성 효과 저해 비율 vs 대조 세포로 표시하였다.
2시간후 하이드로겔(1) 제제로부터 방출된 r-hIFN-베타 1a의 in vitro 생물활성은 2가지 상이한 실험 설정에서, 상기한 WISH-검사법을 이용하여 평가하였다. r-hIFN-베타 1a 농도는 37.7 ㎍/㎖이었다. 하이드로겔의 제조에 이용되는 r-hIFN-베타 1a 없는 Lutrol 하이드로겔(플라시보)의 임의의 가능한 간섭 역시 플라시보에서 r-hIFN-베타 1a 벌크를 스파이킹(spiking)함으로써 검증하였다.
양 배치(batch)로부터 2시간후 방출된 r-hIFN-베타 1a는 플라시보에 스파이 킹된 r-hIFN-베타 1a 벌크에 비하여, 생물활성을 유지하고 회복이 완전하다는 것을 입증하였다(도 2). 이런 이유로, 폴록사머 하이드로겔은 약물 방출이후 완전한 r-hIFN-베타 1a 생물활성을 유지할 수 있는 것으로 보인다.
실시예 3: Poloxamer 407-r-hIFN-베타 1a 하이드로겔(1)의 약동학적 프로필
본 발명의 IFN Poloxamer 하이드로겔의 서방(sustained release) 특성을 검사하기 위하여, 하이드로겔 약동학적 프로필을 완충제 제제 및 다른 겔 제제의 약동학적 프로필과 비교할 수 있다.
IFN-베타 하이드로겔 제제(1)의 약동학적 프로필은 실험 전력이 없는 키노몰구스 원숭이(각 군에서 2마리 수컷과 2마리 암컷)에서 조사하고 IFN-베타 리포겔 제제(lipogel formulation)의 약동학적 프로필과 비교하였다.
샘플은 19G 바늘이 달린 프리필드 주사기에 집어넣었다. 본 연구는 IFN-베타 하이드로겔(1)(120 ㎍/㎖)의 주 1회 s.c. 주입을 벌크 IFN-베타의 액체 완충된(pH 3.8) 제제(대조 1)의 주 1회 주입 또는 IFN-베타 리포겔(120 ㎍/㎖)(대조 2)의 주 1회 s.c. 주입을 비교하기 위하여 설계되었다(아래 표 IV).
다른 대조군이 이용되었는데, 여기서 이들 원숭이는 MS 치료를 위한 현재의 Rebif® 투약 섭생(dosing regimen)을 모의하는 주 3회(TIW) 방식(48시간 간격: t=0, 48h, 96h로 분리되는 주 3회 s.c. 주입)(대조 3)으로 투여되었다.
대조 1(그룹 2)에 대한 IFN 용액은 아세테이트 완충제 50 mM에 녹인 40 ㎍/㎖ IFN 용액으로 구성되었다.
대조 2(그룹 3)에 대한 IFN-베타 리포겔 조성은 아래와 같았다:
글리세린 모노스테아레이트(GMS), 22.37% w/w
( RYLO ™ MG20 PHARMA , Danisco Cultor )
PEG400 63.09% w/w
(Lutrol®E400, BASF)
아세트산 4.03% w/w
아세테이트 완충제[50 mM/pH 3.8] 9.94 % w/w
r-hIFN 베타 1a 0.01% w/w
L-메티오닌(Sigma) 0.03% w/w
하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린 0.03% w/w.
(Cavasol W7HP, Wacker)
대조 3(그룹 4)에 대한 IFN 용액은 아세테이트 완충제 50 mM에 녹인 16 ㎍/㎖ IFN 용액으로 구성되었다.
혈액 샘플링(blood sampling)은 투약-이전(pre-dose)을 포함하고, 그룹 1과 3의 경우에 주입이후 14일(336 h); 그룹 2의 경우에 주입이후 2일을 커버하도록 설계되었다. 그룹 4에 대한 샘플링은 첫 번째와 마지막 r-hIFN 베타 1a 주입이후 PK 프로파일링(PK profiling) 및 네오프테린(neopterin)의 완전 프로파일링(full profiling)이 가능하도록 설계되었다.
r-hIFN 베타 1a는 상기한 바와 같이, 효소 면역검사법, ELISA(Fujirebio)로 정량하였다. 네오프테린 수준은 RIA 검사법(ICN Biomedical)으로 정량하였다.
표 IV
그룹 제제 유형 용량(㎍/㎏) 주의
1 IFN-베타 하이드로겔 (1) 3.67 s.c. t=0에서 Poloxamer 하이드로겔 주입
2 IFN-베타 (대조 1) 3.67 s.c. t=0에서 벌크 용액 주입
3 IFN-베타 리포겔 (대조 2) 3.67 s.c. t=0에서 글리세릴 모노스테아레이트 리포겔 주입
4 벌크 IFN-베타 (대조 3) 3x1.223 s.c. t=0, 48h, 96h에서 벌크 용액 주입
β-IFN 방출:
이들 결과는 단일 s.c. 주입이후, Poloxamer 하이드로겔(1)(그룹 1)이 통제된 패턴으로 r-hIFN 베타를 방출하고 대략 1주일 또는 그 이상동안 혈장 수준을 5 UI/㎖ 이상으로 유지한다는 것을 입증하였다(도 3).
단백질 생체이용효율(protein bioavailability)은 대조로서 이용된 완충된 액체 제제(s.c. 단일과 TIW 주입 모두) 및 리포겔 제제보다 현저하게 높다(하기 표 V 참조).
Poloxamer 하이드로겔(1)에서 r-hIFN 베타 1a 방출은 도 3과 4에 도시된 바와 같이, GMS 기초된 리포겔(그룹 3)에서 획득된 r-hIFN 베타 1a 방출 프로필에 비하여 실제로 명백하게 통제된 패턴을 보인다. 리포겔(대조 2)로부터 r-hIFN 베타 1a 방출 프로필은 더욱 낮은 “파열(burst)” 및 낮고 연장된 항정 상태(steady state)로 특성화된다.
이들 결과는 대조 2로서 이용된 리포겔 제제가 r-hIFN 베타 1a의 서방에 적합하지 않다는 것을 입증한다.
표 V
PK 파라미터 IFN-베타 하이드로겔 (1) IFN-베타 리포겔 (대조 2) IFN-베타 (대조 1) IFN-베타 (대조 3) Day 1 IFN-베타 (대조 3) Day 5
T max (h) 8.0 ± 0.0 1.5 ± 0.5 1.3 ± 0.5 1.8 ± 0.5 1.4 ± 0.5
C max (IU/㎖) 231.3 ± 116.4 24.0 ± 12.1 96.3 ± 53.4 31.3 ± 0.9 26.1 ± 16.5
T ½ (h) 19.4 ± 2.4 45.1 ± 77.6 9.5 ± 3.8 6.1± 2.8 8.0 ± 3.5
혈청 네오프테린 수준 증가:
약력학적(PD) 결과는 겔로부터 방출된 r-hIFN 베타 1a의 생물활성을 확증하였다. 네오프테린 수준은 하이드로겔(1) 주입 vs. 대조(대조 1)에 대한 대략 24시간의 tmax 시프트(shift)로 증가하였다. r-hIFN 베타 1a의 반복 투약(TIW)은 더욱 낮지만 연장된 PD 프로필(대조 3)을 제공하였다. 리포겔 제제는 더욱 낮은 약력학적 프로필(대조 2)을 제공하였다.
대조 리포겔 제제의 제조:
폴리-프로필렌 베커(낮은 단백질 흡수)에서, 칭량된 양의 GMS와 PEG를 아세테이트 완충제[50 mM, pH 4-5]에서 혼합하고, 수분간 수조(40℃)에 유지시켜 용해되고 균질한 액체 매트릭스를 획득한다.
다른 용기에서, 안정화제와 부형제(즉, 사이클로덱스트린과 L-메티오닌)를 함유하는 소량의 아세테이트 완충제[50 mM, pH 4-5]를 농축된 r-IFN-베타 1a 벌크 용액(2 ㎎/㎖)에 첨가한다. 이렇게 제조된 완충제를 먼저, 대략 1.5분간 수조(40℃)에 집어넣고 지질 혼합물에 첨가하였다.
혼합물은 대략 5-10분간 수조에 방치하고, 이후 폴리프로필렌 막대로 가볍게 저으면서 실온으로 냉각시킨다.
이들 결과는 하이드로겔(1)이 r-hIFN 베타 1a 대조 액체 제제와 유사한 생물활성을 보유하고, 적어도 1주일간 r-hIFN 베타 1a의 혈장 수준 및 향상된 생체이용효율을 유지할 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 4: Poloxamer 407-r-hIFN-베타 1a 하이드로겔(1)의 멸균 여과
IFN-베타를 함유하는 단상(monophasic) 하이드로겔 용액은 멸균 여과(sterilizing filtration)로 처리될 수 있다. IFN-하이드로겔(1)은 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조하였다.
용액의 점도가 낮게 유지되는 온도, 예를 들면, 4℃에서, 47 ㎜ 막 직경과 0.2 ㎜ 컷오프(cut off)의 2가지 상이한 막(PVDF: 폴리비닐리덴 불화물(polyvinylidene fluoride) 및 PES: 폴리에테르설폰(polyethersulfone))(PALL Corporation)을 이용하였다.
점도는 유량계(rheometer)(ViscoStar L Fungilab): 50 ㎖ 하이드로겔(1)에서, 얼음 중탕(T = 5 ± 2 ℃), 방추파(spindle) n°2, 100 rpm에 유지된 폴리프로 필렌 바이알로의 여과전후에 측정한다. 여과 과정에 기인한 현저한 유동학적 변화는 관찰되지 않았다.
여과 전후에 IFN 적하된 하이드로겔(1)로부터 IFN 단량체 함량(monomer content)과 방출 동력학(release kinetics)은 SEC HPLC/형광 탐지기(PBS(pH 7.4), 37℃, 4 ㎖의 PBS에서 100 rpm/1g의 하이드로겔(1))로 분석하였다. 획득된 여과후 방출 프로필(release profiles after filtration)은 여과전 방출 프로필과 매우 유사하다. 이런 이유로, 여과 과정은 하이드로겔의 IFN 방출 특성을 변화시키지 않는다.
실시예 5: Poloxamer 407-r-hIFN-베타 1a 하이드로겔(2)
IFN-하이드로겔(2)는 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조되지만, 폴록사머 하이드로겔 용액의 형성에 앞서, 다시 말하면, Poloxamer 407의 첨가에 앞서 트레할로스(Sigma) 2.6% w/w가 완충액에 첨가된다.
하이드로겔(2) 조성물:
Poloxamer 407 25% w/w
아세테이트 완충제 50 mM/pH 3.8 72.04% w/w
r-hIFN베타 1a 0.012% w/w
L-메티오닌 0.03% w/w
Poloxamer 188 0.24% w/w
트레할로스 2.6% w/w.
-점도
하이드로겔(2)를 특성화하고 이의 주입가능성을 특성화하기 위하여 역학 점성 연구(dynamic viscosity study)를 수행하였다. ViscoStar L Fungilab 회전형 점도계(rotational viscometer)를 이용하여 mPas(centipoise) 단위로 점도의 직접적인 결과를 획득하였다. 하이드로겔(2)는 폴리프로필렌 바이알에 도입하고, 온도를 변화시키고 점도계(viscometer) 디스플레이에서 수치를 지속으로 판독하면서 점도 측정(SPL4, 속도 범위 200-300 rpm)을 수행하였다.
이의 결과는 하이드로겔(1)과 비교하여 하이드로겔(2)의 상이한 유동학적 행태를 입증한다. 본 발명의 하이드로겔(2)에서 2.6% w/w로 트레할로스의 사용은 용액-겔 전이 온도(sol-gel transition temperature)에서 증가를 유도하는데(도 5), 이는 상기 매트릭스의 제조 상태와 취급을 개선한다.
실시예 6: Poloxamer 407-r-hIFN-베타 1a 하이드로겔(3)
IFN-하이드로겔(3)은 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조되지만, Poloxamer 407의 첨가에 앞서 자석 교반(500-700 rpm)하에 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린(Cavasol W7HP, Wacker) 2.6% w/w가 완충액에 첨가된다. 이후, 실시예 1에 기술된 바와 같이, 자석 교반하에 Poloxamer 407을 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린/완충액에 첨가한다.
하이드로겔(3) 조성물:
Poloxamer 407 20% w/w
아세테이트 완충제 50 mM/pH 3.8 77.34% w/w
r-hIFN베타 1a 0.015% w/w
L-메티오닌 0.04% w/w
Cavasol W7HP 2.6% w/w.
-점도
하이드로겔(3)을 특성화하고 이의 주입가능성을 특성화하기 위하여 역학 점성 연구(dynamic viscosity study)를 수행하였다. ViscoStar L Fungilab 회전형 점도계(rotational viscometer)를 이용하여 mPas(centipoise) 단위로 점도의 직접적인 결과를 획득하였다. 하이드로겔(3)은 폴리프로필렌 바이알에 도입하고, 온도를 변화시키고 점도계(viscometer) 디스플레이에서 수치를 지속으로 판독하면서 점도 측정(SPL4, 속도 범위 200-300 rpm)을 수행하였다.
도 5에 도시된 이의 결과는 하이드로겔(1)과 비교하여 하이드로겔(3)의 상이한 유동학적 행태를 입증한다: 하이드로겔(3)의 용액-겔 전이 온도는 대략 11℃에서 23℃로 상승한다.
놀랍게도, 하이드로겔(3)의 용액-겔 전이 온도의 시프트는 사용된 매트릭스-형성 Poloxamer 407(20% w/w)의 더욱 낮은 농도에도 불구하고, 트레할로스-함유 하 이드로겔(2)의 시프트에 비하여 훨씬 현저하게 증가하는데(도 5), 이는 상기 매트릭스의 제조 상태와 취급을 현저하게 개선한다.
-단백질 방출
생리학적 피하 상태(physiological subcutaneous condition)를 모의하기 위하여, 앞서 기술된 바와 같이 PBS에서 하이드로겔(3)로부터 IFN-베타 방출을 조사하였다. 1g의 하이드로겔(3)(프리필드 주사기를 이용하여 분배됨)을 사용하여, 37 ± 2℃에서 4 ㎖의 PBS(pH 7.4)로의 약물 방출 검사를 수행하였다(교반기 중탕 속도(shaker bath speed)=100 rpm). 샘플은 5분, 15분, 30분, 1시, 2시 시점에 수집하였다.
각 샘플은 형광 탐지기(Trp 형광)를 이용한 SE-HPLC로 분석하였다. 사이클로덱스트린-함유 하이드로겔(3)의 서방 특성(IFN-베타 방출 프로필)은 용액-겔 전이 온도에서 시프트에도 불구하고, 용액-겔 온도 전이 조절제가 없는 하이드로겔, 다시 말하면, 하이드로겔(1)의 서방 특성에 필적한다(도 6).
실시예 2에 기술된 바와 같은 항바이러스 검사로부터, 사이클로덱스트린-함유 하이드로겔(3)로부터 2시간후 방출된 r-hIFNβ1a는 플라시보에 스파이킹된 r-hIFNβ1a 벌크에 비하여, 생물활성을 유지하고 회복이 완전한 것으로 관찰되었다. 이런 이유로, 사이클로덱스트린-함유 하이드로겔(3)은 약물 방출이후 완전한 r-hIFNβ1a 생물활성을 유지할 수 있는 것으로 보인다.
실시예 7: Poloxamer 407-r-hIFN-베타 1a 하이드로겔(4)
IFN-하이드로겔(4)는 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조되지만, 폴록사머 하이드로겔 용액의 형성에 앞서, 다시 말하면, Poloxamer 407의 첨가에 앞서 글리세롤 30°B(Carlo Erba) 2.6% w/w가 완충액에 첨가된다.
하이드로겔(4) 조성물:
Poloxamer 407 25% w/w
아세테이트 완충제 50 mM/pH 3.8 72.04% w/w
r-hIFN베타 1a 0.012% w/w
L-메티오닌 0.03% w/w
Poloxamer 188 0.24% w/w
글리세롤 30°B 2.6% w/w.
실시예 8: Poloxamer 407-r-hIFN-베타 1a 하이드로겔(5)
IFN-하이드로겔(5)는 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조되지만, 폴록사머 하이드로겔 용액의 형성에 앞서, 다시 말하면, Poloxamer 407의 첨가에 앞서 PEG (Lutrol®E400, Basf) 2.6% w/w가 완충액에 첨가된다.
하이드로겔(5) 조성물:
Poloxamer 407 25% w/w
아세테이트 완충제 50 mM/pH 3.8 72.04% w/w
r-hIFN베타 1a 0.012% w/w
L-메티오닌 0.03% w/w
Poloxamer 188 0.24% w/w
PEG(Lutrol®E400) 2.6% w/w.
실시예 9: 시린징 검사(syringing test)
IFN 폴록사머 기초된 하이드로겔의 피하 주입가능성(subcutaneous injectability)을 검사하기 위하여, 상이한 유형의 바늘을 이용하여 시린징 검사를 수행할 수 있다.
특히, 시린징 검사는 Depot One(Imprint Pharmaceuticals)으로 불리는 새로운 주입 기술을 이용하여 수행된다.
선택된 Depot One 바늘은 아래와 같다:
- 18/23(18 게이지 바늘에 상당하는 내부 직경(internal diameter) 및 21 게이지 바늘의 최소 외부 직경(minimum external diameter))
- 21/26(21 게이지 바늘에 상당하는 내부 직경 및 26 게이지 바늘의 최소 외부 직경)
3 ㎖ 폴리프로필렌 주사기는 0.5 ㎖의 하이드로겔(1) 또는 하이드로겔(3)(4℃에 유지됨)로 적하하고, 대략 15분후 실온에서 폴리스티렌 바이알로 방출한다. 주사기를 비우는데 필요한 힘에 기초하여 “바늘 성능(needle performance)”을 평 가한다.
실온에서 시린징 검사는 하이드로겔(3)이 실온에서 매우 우수한 시린징 특성을 보유한다는 것을 입증한다.
실시예 10: Poloxamer 407-r-hIFN-β1a 하이드로겔(3)의 약동학적 프로필
Poloxamer 407-r-hIFN-베타 1a 하이드로겔(3)의 약동학적 특성은 기존의 r-hIFN-베타와 다른 연구 약물 처리의 전력이 없는 수컷 키노몰구스 원숭이(우리에서 갇혀 사육된 Macaca fascicularis)에서 평가할 수 있다.
동물:
체중 범위: 연구 시작 시점에 2-4 ㎏
연령 범위: 대략 5년
군당 동물 개체수: 4마리
이들 제제는 투여에 앞서 하룻밤(즉, 대략 16시간)동안 굶긴 이들 동물에 투여한다. 사료는 처리 4시간후 다시 공급한다. 물은 자유롭게 섭취할 수 있도록 한다.
r-hIFN-β1a-하이드로겔 제제(3)는 1g당 174 ㎍ r-hIFNβ1a의 강도(strength)로, 각각 21G 바늘이 달린 320 ㎎의 프리필드 주사기에서 제조한다. 겔 형성의 열-가역적 성질로 인하여, 프리필드 주사기는 4℃에 보관해야 하고, 투 여에 요구되는 시간동안만 실온에 유지시킨다.
1회 분량은 동물당 44 ㎍의 r-hIFNβ1a이고, 한쪽 다리의 피하조직(subcutis)에 주입된다. 프리필드 주사기에 담긴 200-250 ㎎의 r-hIFN베타 1a 하이드로겔 제제(3)를 그룹 1(동물 1 내지 4)의 각 원숭이(각 원숭이에 대하여 하나의 주사기)에 투여한다. 유리 프리필드 주사기는 투여전후에 칭량하여 투여된 용량의 정확한 수치를 구한다.
혈액은 아래 표에 상세하게 기술된 계획에 따라, 요측피 정맥(cephalic vein)으로부터 튜브로 수집한다:
샘플링 시간 혈액 샘플링 IFN 베타 분석 혈액 샘플링 네오프테린 분석 수집된 혈액의 전체량
조사-이전(day 1) - X 0.5 ㎖
투약-이전(0 h) X X 1.5 ㎖
30 min X - 1.0 ㎖
1 h X - 1.0 ㎖
2 h X - 1.0 ㎖
4 h X - 1.0 ㎖
6 h - X 0.5 ㎖
8 h X - 1.0 ㎖
24 h X X 1.5 ㎖
32 h X X 1,5 ㎖
48 h X X 1.5 ㎖
56 h X X 1.5 ㎖
72 h X X 1.5 ㎖
96 h X X 1.5 ㎖
104 h X X 1.5 ㎖
120 h X X 1.5 ㎖
168 h X X 1.5 ㎖
혈액 샘플은 실온에서 60분간 응고시킨다. 응괴는 4℃에서 15분간 2,500 g(3,350 rpm)에서 원심분리로 회전시킨다.
0.5 ㎖의 혈액이 수집되면, 2개의 혈청 분량을 제조하는데, 첫 번째 분량은 적어도 0.125 ㎖의 혈청을 함유하고, 두 번째 분량은 나머지 혈청을 함유한다.
1.0 ㎖의 혈액이 수집되면, 2개의 혈청 분량을 제조하는데, 첫 번째 분량은 적어도 0.250 ㎖의 혈청을 함유하고, 두 번째 분량은 나머지 혈청을 함유한다.
1.5 ㎖의 혈액이 수집되면, 3개의 혈청 분량을 제조하는데, 첫 번째와 두 번째 분량은 적어도 0.250 ㎖의 혈청을 함유하고, 세 번째 분량은 나머지 혈청을 함유한다.
r-hIFN-베타 1a 분석을 위한 혈청 샘플은 80℃에 보관한다.
네오프테린 분석을 위한 혈청 샘플은 20℃에 보관한다.
아래의 약동학적 파라미터는 각 투여이후 r-hIFNβ1a의 개별 혈청 농도(IU/㎖) vs. 시간(hour)으로부터 획득된다:
직접적인 약어
Cmax: 혈청에서 관찰된 최대 농도 수치
Tmax: Cmax 수치가 관찰되는 투여이후 시간
Tz: 정량가능 농도가 관찰된 마지막 샘플링 시간
Cz: 샘플링 시간 Tz에서 획득된 농도 수치.
WinNonlin®프로그램:
AUCz: 대수-선형 사다리꼴 규칙(log-linear trapezoidal rule)(Cmax까지 선형, Cmax이후 대수)으로 계산된, 샘플링 시간 Tz까지 혈청 농도 아래 영 역(area under the serum concentration) vs. 시간 곡선.
Tlin: 제거 반감기(elimination half-life)의 결정을 위하여 고려되는 첫 번째 지점.
λz: 최종 농도 수치의 자연 대수(natural logarithm) vs. 시간(Tlin에서부터 Tz까지)을 적합시킴으로써 획득된 선형 회귀 곡선(linear regression curve)의 기울기로 계산된 제거율 상수(elimination rate constant).
t½: 아래의 방정식으로 계산된 제거 반감기:
t½ = (ln 2)/ λz
AUC: 아래의 방정식으로 계산된, 혈청 농도 아래 영역 vs. 시간 곡선:
AUC = AUCz + Cz/λz
%AUCext: 아래의 방정식으로 계산된, 외삽된(즉, 외삽(extrapolation)으로 획득된) AUC 비율:
%AUCext = (AUC - AUCz )/ AUC . 100
본 실험은 시판되는 IFNβ 제제(가령, Rebif®: 44 ㎍ r-hIFNβ1a(12 MIU)의 강도로, 0.5 ㎖ 주입 부피(injection volume)의 21G 바늘이 달린 프리필드 주사기에 포장되고 인간 혈청 알부민(HSA), 만니톨, 나트륨 아세테이트를 부형제로 함유하는 용액 제제)를 참고로 하여 병렬 동물 그룹 2로 수행할 수 있다. 이런 경우에, 하나의 Rebif® 프리필드 주사기의 전체 내용물(0.5 ㎖)은 그룹 2(동물 5 내지 8)의 각 원숭이(각 동물당 하나의 주사기)에 투여된다.
분석물: 인터페론 베타(r-hIFNβ1a):
Tmax Cmax AUClast Tlast Clast AUC (0-72)
[h] [IU/㎖] [hr*IU/㎖] [h] [IU/㎖] [hr*IU/㎖]
평균 12 1930 54300 96 9.64 53900
SD 8.0 992 16000 16 5.10 15800
CV% 67 51.3 29.4 17 52.9 29.3
이들 결과는 r-hIFNβ1a 하이드로겔 제제(3)가 높은 생체이용효율을 보유한다는 것을 입증한다.
SEQUENCE LISTING <110> ARES TRADING S.A. <120> HYDROGEL INTERFERON FORMULATIONS <130> WO/840 <160> 2 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 3 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Synthetic construct <400> 1 Glu Phe Met 1 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> unknown <220> <223> synthetic construct <400> 2 Glu Phe Gly Ala Gly Leu Val Leu Gly Gly Gln Phe Met 1 5 10

Claims (20)

  1. 인터페론(IFN)을 함유하는 제약학적 조성물에 있어서, 상기 조성물은Poloxamer 하이드로겔인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 인터페론은 IFN-베타인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  3. 제 1항 또는 2항에 있어서, 인터페론은 재조합 IFN-베타인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  4. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 인터페론은 재조합 IFN-베타 1a인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  5. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 완충제와 항산화제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  6. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 완충제와 계면활성제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  7. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 용액-겔 온도 전이 조절제(sol-gel temperature transition modifier)를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  8. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 트레할로스와 사이클로덱스트린에서 선택되는 용액-겔 온도 전이 조절제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  9. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, Poloxamer는 Poloxamer 407인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  10. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 20 내지 25% w/w의 Poloxamer 407을 함유하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  11. 제 1항에 있어서, 재조합 IFN-베타 1a를 함유하고 완충제와 L-메티오닌을 추가로 함유하는 Poloxamer 407 하이드로겔인 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  12. 제 11항에 있어서, Poloxamer 188을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  13. 제 12항에 있어서, 트레할로스를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  14. 제 11항에 있어서, 하이드록시프로필 베타 사이클로덱스트린을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  15. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 아래에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물:
    Poloxamer 407 - 25% w/w
    아세테이트 완충제 50 mM/pH 3.8 - 74.7% w/w
    r-hIFN베타 1a - 0.012% w/w
    L-메티오닌 - 0.03% w/w
    Poloxamer 188 - 0.24% w/w;
    Poloxamer 407 - 25% w/w
    아세테이트 완충제 50 mM/pH 3.8 - 72.04% w/w
    r-hIFN베타 1a - 0.012% w/w
    L-메티오닌 - 0.03% w/w
    Poloxamer 188 - 0.24% w/w
    글리세롤 30°B- 2.6% w/w;
    Poloxamer 407 - 25% w/w
    아세테이트 완충제 50 mM/pH 3.8 - 72.04% w/w
    r-hIFN베타 1a - 0.012% w/w
    L-메티오닌 - 0.03% w/w
    Poloxamer 188 - 0.24% w/w
    PEG(Lutrol®E400) - 2.6% w/w;
    Poloxamer 407 - 25% w/w
    아세테이트 완충제 50 mM/pH 3.8 - 72.04% w/w
    r-h-IFN베타 1a - 0.012% w/w
    L-메티오닌 - 0.03% w/w
    Poloxamer 188 - 0.24% w/w
    트레할로스 - 2.6% w/w;
    Poloxamer 407 - 20% w/w
    아세테이트 완충제 50 mM/pH 3.8 - 77.34% w/w
    r-h-IFN베타 1a - 0.015% w/w
    L-메티오닌 - 0.04% w/w
    하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린 - 2.6% w/w.
  16. 제 1항 내지 15항중 어느 한 항에 따른 IFN 하이드로겔 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 균질성 중합체 용액이 형성되는 온도에서, 계산된 양의 Poloxamer를 완충액에 첨가하고, 이후 인터페론을 첨가하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 완충액은 용액-겔 온도 전이 조절제(solution-to-gel temperature transition modifier)를 함유하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  18. 제 16항에 있어서, 완충액은 트레할로스와 사이클로덱스트린에서 선택되는 용액-겔 온도 전이 조절제를 함유하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  19. 제 16항 내지 18항에 있어서, 인터페론은 L-메티오닌, Poloxamer 188, 이들의 조합에서 선택되는 안정화제를 함유하는 용액으로부터 첨가되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  20. 다발성 경화증의 치료를 위한 제약학적 제제의 제조에서 제 1항 내지 15항중 어느 한 항에 따른 IFN 하이드로겔 조성물의 용도.
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