MXPA06014078A - Formulaciones liquidas estabilizadas de interferon. - Google Patents

Abstract

Se describe una composicion farmaceutica liquida estabilizada, libre de HSA, que comprende un interferon, IFN, en donde dicha formulacion es una solucion que comprende un amortiguador, un aminoacido y un antioxidante; preferiblemente el interferon es IFN-beta recombinate humano.

Description

FORMULACIONES LIQUIDAS ESTABILIZADAS DE INTERFERON CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a composiciones farmacéuticas libres de HSA que contienen un interferón, más particularmente a formulaciones de interferón beta que comprenden un amortiguador, un aminoácido y un antioxidante.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los interferones son citocinas, esto es, proteínas solubles que transmiten mensajes entre las células y desempeñan una función esencial en el sistema inmune, ayudando a destruir los microorganismos que causan la infección y reparando cualquier daño resultante. Los interferones son secretados naturalmente por las células infectadas y fueron identificados por primera vez en 1957. Su nombre deriva del hecho de que "interfieren" con la duplicación y producción viral. Los interferones exhiben actividad tanto antiviral como antiproliferativa. Los interferones humanos naturales se agrupan en función de sus propiedades bioquímicas e inmunológicas en tres clases principales: interferón alfa (leucocito), ¡nterferón beta (fibroblasto) e interferón gamma (inmune). El interferón alfa actualmente está aprobado en los Estados Unidos y otros países para el tratamiento de la leucemia de células vellosas, verrugas venéreas, sarcoma de Kaposi (un cáncer que comúnmente afecta a los pacientes que padecen del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA)), y hepatitis no A no B crónica. Además, los interferones (IFN's) son glicoproteínas producidas en el cuerpo en respuesta a una infección viral. Inhiben la multiplicación de los virus en las células protegidas. Los IFN's, que consisten en una proteína de peso molecular bajo, son notablemente inespecíficos en su acción; esto es, el IFN inducido por un virus es eficaz contra una amplia gama de otros virus. Sin embargo, son específicos de especie, es decir, el IFN producido por una especie solo estimulará la actividad antiviral en las células de la misma especie o de una especie estrechamente relacionada. Los IFN's fueron el primer grupo de citocinas en ser aprovechadas por su actividad potencial antitumoral y antiviral. Los tres IFN's principales son referidos como IFN-a, IFN-ß e IFN-y. Estos tipos principales de IFN's se clasificaron inicialmente de acuerdo con sus células de origen (leucocito, fibroblasto o célula T). Sin embargo, se ha hecho evidente que una célula podría producir varios tipos. Por lo tanto, al IFN de leucocito ahora se le denomina IFN-a, el IFN de fibroblasto es el IFN-ß y el IFN de célula T es el IFN-?. También existe un cuarlo tipo de IFN, el IFN linfoblastoide, producido en la línea de células "Namalwa" (derivada del linfoma de Burkitt), que parece producir una mezcla de IFN tanto de leucocito como de fibroblasto.

La unidad de interferón o la unidad internacional de interferón (U, o Ul para la unidad internacional) se ha reportado como una medida de la actividad de IFN, definida como la cantidad necesaria para proteger al 50% de las células contra el daño viral. La prueba que se puede usar para medir la bioactividad es la prueba de inhibición del efecto citohepático descrita (Rubinstein y otros, 1981 ; Familletti, P. C. y otros, 1981 ). En esta prueba antiviral para el interferón, aproximadamente 1 unidad/rnl de interferón es la cantidad necesaria para producir un efecto citopático del 50%. Las unidades se determinan con respecto al estándar de referencia internacional de Hu-IFN-beta provisto por el National Institute of Health (Pestka, S. 1986) (EE. UU.). Cada clase de IFN contiene varios tipos distintos. El IFN-ß y el IFN-? son cada uno el producto de un solo gen. Las proteínas clasificadas como IFN-a son el grupo más diverso, conteniendo aproximadamente 15 tipos. Existe un racimo de genes de IFN-a en el cromosoma 9 que contiene por lo menos 23 miembros, de los cuales 15 son activos y transcritos. Los IFN-a maduros no son glicosilados. Los IFN-a e IFN-ß son todos de la misma longitud (165 o 166 aminoácidos) y tienen actividades biológicas similares. Los IFN-? son de 146 aminoácidos de longitud y se asemejan muy estrechamente a las clases a y ß. Solo los IFN-? pueden activar los macrófagos o inducir la maduración de las células T asesinas. Estos nuevos tipos de agentes terapéuticos algunas veces pueden ser llamados modificadores de la respuesta biológica (BRMs), porque tienen un efecto sobre la respuesta del organismo al tumor, afectando el reconocimiento mediante ¡nmunomodulación. El interferón de fibroblasto humano (IFN-ß) tiene actividad antiviral y también puede estimular a las células asesinas naturales contra las células neoplásicas. Es un polipéptido de aproximadamente 20,000 Da inducido por virus y ARN's de doble cadena. De la secuencia de nucleótidos del gen de interferón de fibroblasto, clonado por tecnología de recombinación de ADN (Derynk y otros, 1980), se dedujo la secuencia de aminoácidos completa de la proteína. Es de 166 aminoácidos de longitud. Shepard y otros (1981 ) describieron una mutación en la base 842 (Cys ->Tyr en la posición 141 ) que suprime su actividad antiviral, y una clona variante con una supresión de los nucleótidos 1119 -1121. Mark y otros (1984) insertaron una mutación artificial reemplazando la base 469 (T) con (A), ocasionando un cambio de aminoácido de Cys - Ser en la posición 17. Se informó que el IFN-ß resultante era tan activo como el IFN-ß "nativo" y era estable durante almacenamiento prolongado (a -70 °C). Rebif® (Serano -interferón ß recombinante humano), el último desarrollo en la terapia de interferón para la esclerosis múltiple (MS), es interferón beta-1a, producido de líneas de células de mamífero. Su nombre internacional no patentado (INN) recomendado es "interferón beta-1a". Como con todos los fármacos basados en proteína, un obstáculo mayor que se debe superar al usar IFN-ß como agente terapéutico, es la pérdida de utilidad farmacéutica que resulta de su inestabilidad en las formulaciones farmacéuticas. La inestabilidad física que pone en riesgo la actividad y eficacia del polipéptido en las formulaciones farmacéuticas incluye la desnaturalización y la formación de agregados solubles e insolubles, mientras que la inestabilidad química incluye hidrólisis, formación de imida, oxidación, racemización y desamidación. Se sabe que algunos de estos cambios producen pérdida o reducción de la actividad farmacéutica de la proteína de interés. En otros casos, los efectos precisos de estos cambios son desconocidos, pero aún así los productos de degradación resultantes son considerados farmacéuticamente inaceptables debido al potencial de efectos secundarios indeseables. La estabilización de los polipéptidos en las composiciones farmacéuticas sigue siendo un área en la cual la prueba y el error desempeñan una función principal (revisado por Wang (1999) Int. J. Pharm. 185:129-188; Wang y Hanson (1988), J. Parenteral Sci. Tech. 42:S3-S26). Los excipientes que se añaden a las formulaciones farmacéuticas de polipéptido para aumentar su estabilidad incluyen amortiguadores, azúcares, agentes tensioactivos, aminoácidos, polietilenglicoles y polímeros, pero los efectos estabilizadores de estos aditivos químicos varían dependiendo de la proteína. En US 2002/0172661 , se describen formulaciones de IFN beta que están caracterizadas por su fuerza iónica baja y un pH de aproximadamente 3.0-5.0.

Las formulaciones de IFN-beta actuales emplean HSA como agente incrementador de solubilidad para IFN-beta. Sin embargo, el uso de HSA tiene algunas desventajas. La HSA es un producto de la sangre humana y por lo tanto debe ser recolectada de sujetos humanos. Aunque se toman medidas para reducir el riesgo, el uso de productos de la sangre humana tales como HSA acarrea la posibilidad de introducción de virus humanos tales como el VIH y el VHC. Consecuentemente, existe la necesidad de composiciones farmacéuticas de IFN-beta adicionales que comprendan estabilizadores fisiológicamente compatibles que mejoren la solubilidad de esta proteína y estabilicen la proteína contra la formación de agregados, aumentando así su utilidad farmacéutica.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención está dirigida a composiciones farmacéuticas estabilizadas que comprenden un interferón (IFN) y a métodos para su preparación. Estas composiciones se preparan en ausencia de albúmina sérica humana (HSA). Estas composiciones son referidas aquí como "libres de HSA". Las composiciones farmacéuticas de IFN libres de HSA comprenden un interferón (IFN), o una isoforma, muteína, proteína fusionada, derivado funcional, fracción activa o sal del mismo, en donde dicha composición es una solución que comprende un amortiguador, un aminoácido y un antioxidante. De acuerdo con una modalidad de la presente invención, las composiciones también comprenden un agente bacterioslático. Como se usa aquí, un "interferón" o "IFN" incluye cualquier molécula definida como tal en la literatura, que comprende por ejemplo cualquier tipo de IFN mencionado en la sección anterior "Antecedentes de la invención". En particular, en la definición anterior se incluyen IFN-a, IFN-ß e IFN-?. De acuerdo con la presente invención el IFN preferido es el IFN-ß. El IFN-ß adecuado de acuerdo con la presente invención está disponible comercialmente, por ejemplo, como Rebif® (Serano), Avonex® (Biogen) o Betaferon® (Schering). También, de acuerdo con la presente invención se prefiere usar interferones de origen humano. El término interferón como se usa aquí abarca una isoforma, muteína, proteína fusionada, derivado funcional, fracción activa o sal del mismo. El término "interferón beta" ("IFN-beta" o "IFN-ß"), como se usa aquí, incluye el interferón de fibroblasto, en particular de origen humano, obtenido por aislamiento de fluidos biológicos u obtenido por medio de técnicas de recombinación de ADN a partir de células procarióticas o eucarióticas, así como sus sales, derivados funcionales, variantes, análogos y fragmentos activos. La mención de IFN-beta se refiere preferiblemente al interferón beta-1a. Como se usa aquí, el término "muteínas" se refiere a análogos de IFN en los que uno o más de los residuos de aminoácido de un IFN natural son reemplazados por residuos de aminoácido diferentes, o son suprimidos, o uno o más residuos de aminoácido son añadidos a la secuencia natural de IFN, sin cambiar considerablemente la actividad de los productos resultantes en comparación con el IFN de tipo silvestre. Estas muteínas se preparan mediante síntesis conocidas y/o técnicas de mutagénesis dirigidas a un sitio, o cualquier otra técnica conocida adecuada para ello. Las muteínas preferidas incluyen por ejemplo las que describen Shepard y otros (1981 ) o Mark y otros (1984). Preferiblemente cualquier muteína tiene una secuencia de aminoácidos suficientemente duplicativa de la del IFN, por ejemplo para tener una actividad sustancialmente similar o aún mejor que un IFN. La función biológica del interferón es muy conocida para el experto en la materia, y están establecidos y disponibles estándares biológicos, por ejemplo del National Institute for Biological Standards and Control (http://immunology.org/links/NIBSC). Se han descrito bioensayos para la determinación de la actividad de IFN. Por ejemplo, se puede efectuar una prueba de IFN como la que describen Rubinstein y otros, 1981. De esta manera, por medio de experimentación rutinaria se puede determinar si alguna muteína dada tiene una actividad sustancialmente similar, o incluso mejor, que el IFN. Las muteínas de IFN que se pueden usar de acuerdo con la presente invención, o el ácido nucleico que codifica las mismas, incluyen un grupo finito de secuencias sustancialmente correspondientes como péptidos o polinucleótidos de sustitución que pueden ser obtenidos rutinariamente por el experto en la materia sin mayor experimentación, basándose en las enseñanzas y guías presentadas en la presente. Los cambios preferidos para las muteínas de acuerdo con la presente invención son los que se conocen como sustituciones "conservativas". Las sustituciones conservativas de aminoácidos de los polipéptidos o proteínas de la invención pueden incluir aminoácidos sinónimos dentro de un grupo, que tienen propiedades fisicoquímicas suficientemente similares para que la sustitución entre los miembros del grupo conserve la función biológica de la molécula. Es evidente que también se pueden hacer inserciones y supresiones de aminoácidos en las secuencias anteriormente definidas sin alterar su función, particularmente si las inserciones o supresiones incluyen solo unos pocos aminoácidos, por ejemplo menos de treinta, de preferencia menos de diez, y no remueven ni desplazan aminoácidos que son críticos para una conformación funcional, por ejemplo los residuos de cisteína. Las proteínas y muteínas producidas por tales supresiones y/o inserciones entran en la competencia de la presente invención. Preferiblemente, los grupos de aminoácidos sinónimos son los que se definen en el cuadro 1. Muy preferiblemente, los grupos de aminoácidos sinónimos son los que se definen en el cuadro 2; y muy preferiblemente los grupos de aminoácidos sinónimos son los que se definen en el cuadro 3.

CUADRO 1 Grupos preferidos de aminoácidos sinónimos Aminoácido Grupo sinónimo Ser Ser, Thr, Gly, Asn Arg Arg, Gln, Lys, Glu, His Leu lie, Phe, Tyr, Met, Val, Leu Pro Gly, Ala, Thr, Pro Thr Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr Ala Gly, Thr, Pro, Ala Val Met, Tyr, Phe, lie, Leu, Val Gly Ala, Thr, Pro, Ser, Gly He Met, Tyr, Phe, Val, Leu, lie Phe Trp, Met, Tyr, lie, Val, Leu, Phe Tyr Trp, Met, Phe, lie, Val, Leu, Tyr Cys Ser, Thr, Cys His Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His Gln Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln Asn Gln, Asp, Ser, Asn Lys Glu, Gln, His, Arg, Lys Asp Glu, Asn, Asp Glu Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu Met Phe, Me, Val, Leu, Met Trp Trp CUADRO 2 Grupos muy preferidos de aminoácidos sinónimos Aminoácido Grupo sinónimo Ser Ser Arg His, Lys, Arg Leu Leu, lie, Phe, Met Pro Ala, Pro Thr Thr Ala Pro, Ala Val Val, Met, lie Gly Gly lie lie, Met, Phe, Val, Leu Phe Met, Tyr, He, Leu, Phe Tyr Phe, Tyr Cys Cys, Ser His His, Gln, Arg Gln Glu, Gln, His Asn Asp, Asn Lys Lys, Arg Asp Asp, Asn Glu Glu, Gln Met Met, Phe, He, Val, Leu Trp Trp CUADRO 3 Grupos más preferidos de aminoácidos sinónimos Aminoácido Grupo sinónimo Ser Ser Arg Arg Leu Leu, He, Met Pro Pro Thr Thr Ala Ala Val Val Gly Gly He lie, Met, Leu Phe Phe Tyr Tyr Cys Cys, Ser His His Gln Gln Asn Asn Lys Lys Asp Asp Glu Glu Met Met, lie, Leu Trp Met Los ejemplos de producción de sustituciones de aminoácido en proteínas, que se pueden usar para obtener muteínas de IFN para usar en la presente invención, incluyen cualquiera de los pasos de los métodos conocidos, tales como los que se presentan en las patentes de EE. U.U. Nos. 4,959,314, 4,588,585 y 4,737,462, de Mark y otros; 5,166,943 de Koths y otros, 4,965,195 de Ñamen y otros; 4,879,111 de Chong y otros; y 5,017,691 de Lee y otros; y las proteínas sustituidas con lisina presentadas en la patente de E.E. U.U. No. 4,904,584 (Shaw y otros). Las muteínas específicas de IFN-beta han sido descritas, por ejemplo, por Mark y otros, 1984. El término "proteína fusionada" se refiere a un polipéptido que comprende un IFN o una muteína del mismo, fusionada con otra proteína, que por ejemplo tiene un tiempo de residencia prolongado en los fluidos corporales. Así, un IFN se puede fusionar con otra proteína, polipéptido o similar, por ejemplo con una inmunoglobulina o un fragmento de la misma. Los "derivados funcionales", como se usa aquí, cubren los derivados de IFN y sus muteínas y proteínas fusionadas, que se pueden preparar de los grupos funcionales que ocurren como cadenas laterales sobre los residuos o los grupos N- o C-terminales, por medios conocidos en la técnica, y se incluyen en la invención siempre que permanezcan farmacéuticamente aceptables, es decir, que no destruyan la actividad de la proteína que es sustancialmente similar a la actividad de IFN, y no confieran propiedades tóxicas a las composiciones que los contienen. Estos derivados, por ejemplo, pueden incluir cadenas laterales de polietilenglicol, que pueden enmascarar sitios antigénicos y prolongar la residencia del IFN en los fluidos corporales. Otros derivados incluyen esteres alifáticos de los grupos carboxilo, amidas de los grupos carboxilo por reacción con amoniaco o con aminas primarias o secundarias, derivados N-acilo de los grupos amino libres de los residuos de aminoácido formados con porciones acilo (por ejemplo los grupos alcanoilo o aroilo carbocíclico) o derivados O-acilo de los grupos hidroxilo libres (por ejemplo de los residuos de serilo o treonilo) formados con porciones de acilo. Como "fracciones activas" de IFN o muteínas y proteínas fusionadas, la presente invención cubre cualquier fragmento o precursor de la cadena de polipéptido de la molécula de proteína, solo o junto con moléculas o residuos asociados al mismo, por ejemplo residuos de azúcar o fosfato, o agregados de la molécula de proteína, o los residuos de azúcar por sí solos, siempre que dicha fracción no tenga una actividad significativamente reducida en comparación con el IFN correspondiente. El término "sales" significa aquí las sales de los grupos carboxilo y las sales de adición de ácido de los grupos amino de las proteínas anteriormente descritas o sus análogos. Las sales de un grupo carboxilo se pueden formar por medios conocidos e incluyen sales inorgánicas, por ejemplo sales de sodio, calcio, amonio, fierro o zinc, y similares, y sales con bases orgánicas tales como por ejemplo las formadas con aminas, tales como trietanolamina, argínina o lisina, piperidina, procaína y similares. Las sales de adición de ácido incluyen por ejemplo sales con ácidos minerales, tales como por ejemplo ácido clorhídrico o ácido sulfúrico, y sales con ácidos orgánicos, tales como por ejemplo ácido acético o ácido oxálico. Desde luego, cualquiera de estas sales debe retener la actividad biológica de las proteínas (IFN) relevantes para la presente invención, esto es, la capacidad de unirse al receptor correspondiente e iniciar la señalización del receptor. De acuerdo con la presente invención, se prefiere particularmente el uso de IFN-beta humano recombinante y los compuestos de la invención. Se ha descrito recientemente un tipo especial de variante de interferón. Los denominados "interferones de consenso" son variantes no naturales de IFN (US 6,013,253). De acuerdo con una modalidad preferida de la invención, los compuestos de la invención se usan en combinación con un interferón de consenso. Como se usa aquí, un interferón de consenso humano (IFN-con) significa un polipéptido no natural que incluye predominantemente aquellos residuos de aminoácido que son comunes a un subgrupo de IFN-alfa representativos de la mayoría de las secuencias de los subtipos de interferón natural de leucocito humano, y que incluyen en una o más de las posiciones en donde no hay aminoácido común para todos los subtipos, un aminoácido que ocurre predominantemente en esa posición, y en ningún caso incluye un residuo de aminoácido que no exista en esa posición en por lo menos un subtipo natural. El IFN-con abarca, sin limitación, las secuencias de aminoácidos designadas como IFN-con-1 , IFN-con2 e IFN-con3, que se describen en U.S. 4,695,623, 4,897,471 y 5,541 ,293. Las secuencias de ADN que codifican IFN-con pueden ser producidas como se describe en las patentes anteriormente mencionadas, o mediante otros métodos estándares. En una modalidad preferida adicional, la proteína fusionada comprende una Ig de fusión. La fusión puede ser dirigida, o mediante un péptido enlazador corto, que puede ser tan corto como de 1 a 3 residuos de aminoácido, de longitud o más grande, por ejemplo 13 residuos de aminoácido de longitud. Dicho enlazador puede ser un tripéptído de la secuencia E-F-M (Glu-Phe-Met), por ejemplo, o una secuencia enlazadora de 13 aminoácidos que comprende Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met, introducida entre la secuencia de IFN y la secuencia de inmunoglobulina. La proteína de fusión resultante puede tener propiedades mejoradas, tales como un tiempo de residencia prolongado en los fluidos corporales (vida media), mayor actividad específica, mayor grado de expresión, o se facilita la purificación de la proteína de fusión. En una modalidad preferida adicional, el IFN se fusiona con la región constante de una molécula de Ig. Preferiblemente se fusiona con regiones de cadena pesada, como los dominios CH2 y CH3 de la lgG1 humana, por ejemplo. Otras isoformas de moléculas de Ig también son adecuadas para la generación de proteínas de fusión de acuerdo con la presente invención, tales como las isoformas lgG2, lgG3 o lgG4, u otras clases de Ig, como IgM o IgA, por ejemplo. Las proteínas de fusión pueden ser monoméricas o multiméricas, heteromultiméricas u homomultiméricas. En una modalidad preferida adicional, el derivado funcional comprende por lo menos una porción unida a uno o más grupos funcionales, que ocurren como una o más cadenas laterales sobre los residuos de aminoácido. Preferiblemente, la porción es una porción de polietileno (PEG).

La PEGilación se puede efectuar mediante los métodos conocidos, como los que se describen por ejemplo en WO 99/55377. La dosis administrada a un individuo, como una sola dosis o como una dosis múltiple, varía dependiendo de varios factores que incluyen las propiedades farmacocinéticas, la vía de administración, las condiciones y características del paciente (sexo, edad, peso corporal, salud, talla), grado de los síntomas, tratamientos concurrentes, frecuencia de tratamiento y el efecto deseado. De acuerdo con la invención, la dosis del IFN-beta en el tratamiento de MS recurrente depende del tipo de IFN-beta usado. De acuerdo con la presente invención, cuando el IFN es IFN-beta-1b recombinante producido en E. coli, comercialmente disponible bajo la marca Betaseron®, preferiblemente se puede administrar subcutáneamente cada tercer día a una dosis de aproximadamente 250 µg a 300 µg, u 8 UIM a 9.6 UIM por persona. De acuerdo con la presente invención, cuando el IFN es IFN-beta-1 a recombinante producido en células de ovario de hámster chino (células CHO), disponible comercialmente bajo la marca Avonex®, preferiblemente se puede administrar intramuscularmente una vez a la semana a una dosis de aproximadamente 30 µg a 33 µg, o 6 UIM a 6.6 UIM por persona. De acuerdo con la presente invención, cuando el IFN es IFN-beta-1a recombinante producido en células de ovario de hámster chino (células CHO), disponible comercialmente bajo la marca Rebit®, preferiblemente se puede administrar subcutáneamente tres veces a la semana (3/sem) a una dosis de 22 µg a 44 µg, o 6 UIM a 12 UIM por persona. La administración de agentes activos de acuerdo con la presente invención puede ser por la vía intravenosa, intramuscular o subcutánea. La vía de administración preferida para el IFN es la vía subcutánea. Una vía de administración preferida adicional es la administración intramuscular, que por ejemplo se puede aplicar una vez a la semana. El IFN también se puede administrar diariamente o cada tercer día, o menos frecuentemente. Preferiblemente, el IFN se administra una vez, dos veces o tres veces a la semana. El término "estabilidad" se refiere a la estabilidad física, química y conformacional de las formulaciones de interferón de la presente invención (que incluye el mantenimiento de la potencia biológica). La inestabilidad de una formulación de proteína puede ser causada por degradación química o agregación de las moléculas de proteína para formar polímeros de orden superior, desglicosilación, modificación de la glicosilación, oxidación o cualquier otra modificación estructural que reduce por lo menos una actividad biológica de un polipéptido de interferón incluido en la presente invención. Una solución o formulación "estable", es aquella en donde está aceptablemente controlado el grado de degradación, modificación, agregación, pérdida de actividad biológica y similares de las proteínas en la misma, y no aumenta inaceptablemente con el tiempo. De preferencia, la formulación retiene por lo menos aproximadamente 60% de la actividad de interferón declarada en el marbete, de preferencia por lo menos aproximadamente 70%, de preferencia por lo menos aproximadamente 80%, durante un periodo de 12 a 24 meses. Las composiciones de IFN estabilizadas libres de HSA de la invención tienen preferiblemente una vida de anaquel de por lo menos aproximadamente 6 meses, 12 meses, 18 meses; de preferencia por lo menos 20 meses, muy preferiblemente por lo menos aproximadamente 22 meses, de preferencia por lo menos aproximadamente 24 meses, cuando se almacena a 2-8°C. Se tienen disponibles métodos para monitorear la estabilidad de las composiciones farmacéuticas de IFN libres de HSA de la invención, que incluyen los métodos descritos en los ejemplos que se exponen en la presente. De esta manera, la formación de agregados de IFN durante el almacenamiento de una composición farmacéutica líquida de la invención, puede ser determinada fácilmente midiendo el cambio de IFN soluble en solución con el transcurso del tiempo. La cantidad de polipéptido soluble en solución puede ser cuantificada mediante varias pruebas analíticas adaptadas para detectar el IFN. Estas pruebas incluyen por ejemplo HPLC de fase inversa (RP-HPLC) y espectroscopia de absorción UV, como se describe en los ejemplos más abajo. La determinación de los agregados tanto solubles como insolubles durante el almacenamiento en formulaciones líquidas se puede hacer por ejemplo usando ultracentrifugación analítica, como se indica en los ejemplos más abajo, para distinguir entre aquella porción del polipéptido soluble que está presente como agregado soluble y aquella porción que está presente en forma molecular no agregada, biológicamente activa. Además, la ultracentrifugación a velocidad es capaz de detectar oligómeros tanto covalentes como no covalentes, tanto cuantitativa como cualitativamente. Similarmente, un método de exclusión de tamaño de HPLC nuevo (que se describe en los ejemplos), referido aquí como "SEC nueva", es capaz de detectar oligómeros tanto covalentes como no covalentes, cuantitativa y cualitativamente. La expresión "uso de multidosis" incluye el uso de un solo frasco, ampolleta o cartucho de una formulación de ¡nterferón para más de una inyección, por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6 o más inyecciones. Preferiblemente, las inyecciones se hacen durante un periodo de por lo menos aproximadamente 12 horas, 24 horas, 48 horas, etc., preferiblemente hasta un periodo de aproximadamente 12 días. Las inyecciones se pueden espaciar en tiempo, por ejemplo por un periodo de 6, 12, 24, 48 ó 72 horas. El término "aminoácido" se refiere a un aminoácido o una combinación de aminoácidos, en donde cualquier aminoácido dado está presente en su forma de base libre o en su forma de sal. Cuando se usa una combinación de aminoácidos, todos los aminoácidos pueden estar presentes en sus formas de base libre, todos pueden estar presentes en sus formas de sal, o algunos pueden estar presentes en sus formas de base libre mientras que otros están presentes en sus formas de sal. Los aminoácidos preferidos para usar en el presente método o formulación son aquellos que llevan una cadena lateral cargada, referida aquí como "aminoácidos de cadena lateral cargada", tales como arginina, glicina, ácido aspártico y ácido glutámico. Preferiblemente, el aminoácido es glicina. En el presente método o formulación de la invención se puede usar cualquier estereoisómero de un aminoácido particular (esto es, el isómero L, D, o DL), o combinaciones de estos estereoisómeros, siempre que el aminoácido particular esté presente en su forma de base libre o en su forma de sal. Preferiblemente se usa el estereoisómero L. También se pueden usar análogos de estos aminoácidos preferidos en la presente formulación de la invención. El término "análogo de aminoácido" se refiere a un derivado del aminoácido natural. Los análogos de arginina adecuados incluyen por ejemplo aminoguanidina y N-monoetil-L-arginina. Como con los aminoácidos preferidos, los análogos de aminoácido se usan en la presente formulación en su forma de base libre o en su forma de sal. Los aminoácidos también son referidos aquí como estabilizadores. Los aminoácidos usados en la presente formulación de la invención protegen el poiipéptido terapéuticamente activo contra varias tensiones, aumentando y/o manteniendo así la estabilidad de la formulación del interferón beta. Aquí, el término "tensión" incluye sin limitación calor, congelación, pH, luz, agitación, oxidación, deshidratación, superficies, corte, congelación/descongelación, presión, metales pesados, compuestos fenólicos, desnaturalizantes, etc. El término tensión abarca cualquier factor que modula (es decir, reduce, mantiene o aumenta) la estabilidad de la formulación que contiene el ¡nterferón beta. El incremento y/o mantenimiento de la estabilidad con la adición de un aminoácido ocurre de una manera dependiente de la concentración. Esto es, concentraciones crecientes de aminoácido producen un aumento y/o mantenimiento de la estabilidad de la formulación que contiene el interferón beta de la presente invención, cuando esa formulación que contiene el interferón beta normalmente exhibe formación de agregado u oligómero en ausencia del aminoácido. La determinación de la cantidad de un aminoácido particular por utilizar en la presente formulación de la invención, para disminuir la formación de oligómero o agregado y aumentar así la estabilidad de la proteína monomérica, puede ser realizada fácilmente sin mayor experimentación utilizando los métodos generalmente conocidos para el experto en la materia. El término "amortiguador" o "amortiguador fisiológicamente aceptable" se refiere a soluciones de compuestos que se sabe que son seguras para usar en formulaciones farmacéuticas o veterinarias, que tienen el efecto de mantener o controlar el pH de la formulación en una escala de pH deseada para la formulación. Los amortiguadores aceptables para controlar el pH de un pH moderadamente ácido a un pH moderadamente básico incluyen, sin limitación, compuestos tales como fosfato, acetato, citrato, arginína, TRIS e histidina. "TRIS" se refiere al 2-amino-2-hidroximetil-1 ,3-propanodiol, y a cualquier sal farmacológicamente aceptable del mismo. Los amortiguadores preferidos son los amortiguadores de acetato en solución salina o una sal aceptable.

Un "agente de isotonicidad" es un compuesto que es tolerado fisiológicamente e imparte una tonicidad adecuada a una formulación para impedir el flujo neto de agua a través de las membranas celulares que están en contacto con la formulación. Compuestos tales corno glicerina se usan comúnmente para tales propósitos a concentraciones conocidas. Otros agentes de isotonicidad adecuados incluyen, sin limitación, manitol, aminoácidos o proteínas (por ejemplo glicina o albúmina), sales (por ejemplo cloruro de sodio), y azúcares (por ejemplo dextrosa, manitol, sacarosa y lactosa). El término "antioxidante" se refiere a un compuesto que impide que el oxígeno o los radicales libres de los derivados de oxígeno interaccionen con otras sustancias. Los antioxidantes están entre un número de excipientes añadidos comúnmente a los sistemas farmacéuticos para mejorar la estabilidad física y química. Los antioxidantes se agregan para minimizar o retardar los procesos oxidativos que ocurren con algunos fármacos o excipientes por exposición al oxígeno o en presencia de radicales libres. Frecuentemente estos procesos pueden ser catalizados por la luz, temperatura, concentración del ion hidrógeno, presencia de oligometales o peróxidos. Frecuentemente se usan como antioxidantes para los fármacos: sulfitos, bisulfitos, tiourea, metionina, sales del ácido etilendiaminatetraacético (EDTA), hidroxitolueno butilado (BHT), e hidroxianisol butilado (BHA). Se ha encontrado que el EDTA de sodio aumenta la actividad de los antioxidantes quelatando los iones metálicos, que de otra manera catalizarían la reacción de oxidación. El antioxidante preferido es la metionina. Los antioxidantes también se refieren aquí como estabilizadores. La metionina puede estar presente en su forma de base libre o en su forma de sal. En el presente método o formulación de la invención se puede usar cualquier estereoisómero de la metionina (es decir, el isómero L, D, o DL), siempre que la metionina esté presente en su forma de base libre o su forma de sal. Preferiblemente se usa el estereoisómero L. También se pueden usar en la presente formulación de la invención los análogos de la metionina. El término "análogo de metionina" se refiere a un derivado de la metionina natural. Los análogos de metionina también se pueden usar en la presente formulación en su forma de base libre o en su forma de sal. El incremento y/o mantenimiento de la estabilidad con la adición de antioxidantes (por ejemplo metionina) ocurre de manera dependiente de la concentración. Esto es, concentraciones crecientes de antioxidantes producen un aumento y/o mantenimiento de la estabilidad de la formulación que contiene el interferón beta de la presente invención, cuando esa formulación que contiene el interferón beta normalmente exhibe oxidación o formación de agregado/oligómero en ausencia del antioxidante. La determinación de la cantidad de antioxidante (por ejemplo la metionina) para usar en la presente formulación de la invención, para disminuir la oxidación o la formación de oligómeros/agregados, se puede hacer fácilmente sin mayor experimentación utilizando los métodos generalmente conocidos para el experto en la materia.

El término "bacteriostático" se refiere a un compuesto o composición añadida a una formulación para actuar como un agente antibacteriano. Los ejemplos de bacteriostáticos incluyen fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, alcohol bencílico, alquilparabeno (de metilo, etilo, propilo, butilo y similares), cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio, deshidroacetato de sodio y timerosal. Preferiblemente, el agente bacteriostático es el alcohol bencílico. El término "agente tensioactivo" se refiere a un compuesto soluble que reduce la tensión superficial de los líquidos, o reduce la tensión interfacial entre dos líquidos, o un líquido y un sólido, la tensión superficial siendo la fuerza que actúa sobre la superficie de un líquido, que tiende a minimizar el área de superficie. Algunas veces se han usado los agentes tensioactivos en las formulaciones farmacéuticas, incluyendo en el suministro de fármacos y polipéptidos de bajo peso molecular para modificar la absorción del fármaco o su suministro hacia los tejidos objetivo. Los agentes tensioactivos muy conocidos incluyen polisorbatos (derivados de polioxietileno; Tween) así como también Pluronic. De acuerdo con una modalidad preferida de la invención, se ha encontrado que formulando el interferón con un agente tensioactivo seleccionado de Pluronic® F77, Pluronic F87, Pluronic F88 y Pluronic® F68, particularmente Pluronic F68 (BASF, el Pluronic F68 también conocido como Poloxamer 188), se obtiene una formulación estable que minimiza la pérdida del principio activo ocasionada por adsorción sobre la superficie del dispositivo de suministro y/o frasco (por ejemplo jeringa, bomba, catéter, etc.). Se ha encontrado que formulando el interferón con un agente tensioactivo seleccionado de Pluronic® F77, Pluronic F87, Pluronic F88 y Pluronic® F68, de preferencia particularmente Pluronic F68 (BASF, el Pluronic F68 también conocido como Poloxamer 188), se obtiene una formulación estable que es más resistente a la oxidación y a la formación de agregados de proteína. Los agentes tensioactivos Pluronic son copolímeros de bloque de óxido de etileno (EO) y óxido de propileno (PO). El bloque de óxido de propileno (PO) está intercalado entre dos bloques de óxido de etileno (EO).

EO PO | EO Los agentes tensioactivos de Pluronic se sintetizan en un procedimiento de dos pasos: 1. Se crea un hidrófobo del peso molecular deseado mediante la adición controlada de óxido de propileno a los dos grupos hidroxilo de propilenglicol; y 2. Se añade óxido de etileno para intercalar el hidrófobo entre los grupos hidrofílicos. En el Pluronic® F77, el porcentaje de polioxietileno (hidrófilo) es de 70%, y el peso molecular del hidrófobo (polioxipropileno) es de aproximadamente 2,306 Da. En el Pluronic F87, el porcentaje de polioxietileno (hidrófilo) es de 70%, y el peso molecular del hidrófobo (polioxipropileno) es de aproximadamente 2,644 Da. En el Pluronic F88, el porcentaje de polioxietileno (hidrófilo) es de 80%, y el peso molecular del hidrófobo (polioxipropileno) es de aproximadamente 2,644 Da. En el Pluronic F68, el porcentaje de polioxietileno (hidrófilo) es de 80%, y el peso molecular del hidrófobo (polioxipropileno) es de aproximadamente 1 ,967 Da. A continuación se dan las propiedades típicas del Pluronic F77: Peso molecular promedio: 6600; Punto de fusión/vaciado: 48 °C; Forma física @ 20 °C: sólida; Viscosidad (cps, Brookfield): 480 [líquidos a 25 °C, pastas a 60 °C, y sólidos a 77 °Cj; Tensión superficial en dinas/cm @ 25 °C: Conc. 0.1 %: 47.0 Conc. 0.01 %: 49.3 Conc. 0.001 %: 52.8 Tensión interfacial en dinas/cm @ 25 °C contra Nujol: Conc.0.1%: 17.7 Conc.0.01%: 20.8 Conc.0.001%: 25.5 Mojado de Draves en segundos, a 25 °C: Conc.1.0%: >360 Conc. 0.1 % >360 Altura de la espuma: Ross Miles, 0.1%, mm @ 50 °C: 100 Ross Miles, 0.1 %, mm @ 26 °C: 47 Dinámica, 0.1 %, mm @ 400 ml/min: > 600 Punto de turbidez en solución acuosa, °C: Conc 1 %: >100 Conc. 10%: >100 HLB (balance hidrofílico-lipofílico): 25 A continuación se dan las propiedades típicas del Pluronic F87: Peso molecular promedio: 7700; Punto de fusión/vaciado: 49 °C; Forma física @ 20 °C: sólida; Viscosidad (cps, Brookfield): 700 [líquidos a 25 °C, pastas a 60 °C, y sólidos a 77 °C]; Tensión superficial en dinas/cm @ 25 °C: Conc. 0.1 %: 44.0 Conc. 0.01 %: 47.0 Conc. 0.001%: 50.2 Tensión interfacial en dinas/cm @ 25 °C contra Nujol: Conc. 0.1 %: 17.4 Conc. 0.01 %: 20.3 Conc. 0.01 %: 23.3 Mojado de Draves en segundos, a 25 °C: Conc. 1.0%: >360 Conc. 0.1 % >360 Altura de la espuma: Ross Miles, 0.1 %, mm @ 50 °C: 80 Ross Miles, 0.1 %, mm @ 26 °C: 37 Dinámica, 0.1 %, mm @ 400 ml/min: > 600 Punto de turbidez en solución acuosa, °C: Conc 1 %: >100 Conc. 10%: >100 HLB (balance hidrofílico-lipofílico): 24 A continuación se dan las propiedades típicas del Pluronic F88: Peso molecular promedio: 11400; Punto de fusión/vaciado: 54 °C; Forma física @ 20 °C: sólida; Viscosidad (cps, Brookfield): 2300 [líquidos a 25 °C, pastas a 60 °C, y sólidos a 77 °C]; Tensión superficial en dinas/cm @ 25 °C: Conc. 0.1 %: 48.5 Conc. 0.01 %: 52.6 Conc. 0.001 %: 55.7 Tensión interfacial en dinas/cm @ 25 °C contra Nujol: Conc. 0.1 %: 20.5 Conc. 0.01%: 23.3 Conc. 0.01 %: 27.0 Mojado de Draves en segundos, a 25 °C: Conc. 1.0%: >360 Conc. 0.1 % >360 Altura de la espuma: Ross Miles, 0.1 %, mm @ 50 °C: 80 Ross Miles, 0.1 %, mm @ 26 °C: 37 Dinámica, 0.1 %, mm @ 400 ml/min: > 600 Punto de turbidez en solución acuosa, °C: Conc 1 %: >100 Conc. 10%: >100 HLB (balance hidrofílico-lipofílico): 28 A continuación se dan las propiedades típicas del Pluronic F68: Peso molecular promedio: 8400; Punto de fusión/vaciado: 52 °C; Forma física @ 20 °C: sólida; Viscosidad (cps, Brookfield): 1000 [líquidos a 25 °C, pastas a 60 °C, y sólidos a 77 °C]; Tensión superficial en dinas/cm @ 25 °C: Conc. 0.1 %: 50.3 Conc. 0.01%: 51.2 Conc. 0.001 %: 53.6 Tensión interfacial en dinas/cm @ 25 °C contra Nujol: Conc. 0.1 %: 19.8 Conc. 0.01 %: 24.0 Conc. 0.01 %: 26.0 Mojado de Draves en segundos, a 25 °C: Conc. 1.0%: >360 Conc. 0.1 % >360 Altura de la espuma: Ross Miles, 0.1 %, mm @ 50 °C: 35 Ross Miles, 0.1 %, mm @ 26 °C: 40 Dinámica, 0.1 %, mm @ 400 ml/min: > 600 Punto de turbidez en solución acuosa, °C: Conc 1 %: >100 Conc. 10%: >100 HLB (balance hidrofílico-lipofílico): 29 También se pueden usar en las formulaciones de la invención otros polímeros que tienen propiedades similares a las indicadas anteriormente. El agente tensíoactivo preferido es el Pluronic F68 y los agentes tensioactivos que tienen propiedades similares. El Pluronic, particularmente el Pluronic F68, está presente preferiblemente a una concentración que es suficiente para mantener la estabilidad del interferón durante el periodo de almacenamiento deseado (por ejemplo de 12 a 24 meses), y también a una concentración que es suficiente para prevenir pérdidas de proteína debidas a la adsorción sobre las superficies, como las del frasco, ampolleta, cartucho o la jeringa. Preferiblemente, la concentración del Pluronic en las formulaciones líquidas, particularmente del Pluronic F68, es de aproximadamente 0.01 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de preferencia de aproximadamente 0.05 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, en particular de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 2 mg/ml, muy de preferencia de aproximadamente 0.5 mg/ml Preferiblemente, la concentración de IFN-beta-1 a en la formulación es de aproximadamente 10 µg/ml a aproximadamente 800 µg/ml, de preferencia de aproximadamente 20 µg/ml a aproximadamente 500 µg/ml, en particular de aproximadamente 30 µg/ml a aproximadamente 300 µg/ml, muy de preferencia de aproximadamente 22 µg/ml, 44 µg/ml, 88 µg/ml o 264 µg/ml Preferiblemente, las formulaciones de la presente invención tienen un pH de entre aproximadamente 3.5 y aproximadamente 5.5, de preferencia aproximadamente 4.7. Un amortiguador preferido es el acetato, siendo los contraiones preferidos los iones sodio o potasio Los amortiguadores salinos de acetato son muy conocidos. Las concentraciones del amortiguador en la solución general pueden variar entre aproximadamente 5 mM, 9 5 mM, 10 mM, 50 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, y 500 mM Preferiblemente, la concentración del amortiguador es de aproximadamente 10 mM En particular se prefiere un amortiguador 10 mM en iones acetato con un pH de 4.7 ± 0.2. En la composición de la invención, el antioxídante, por ejemplo metionina, está presente preferiblemente a una concentración de aproximadamente 0.01 mg/ml a aproximadamente 5.0 mg/ml, de preferencia de aproximadamente 0.05 mg/ml a aproximadamente 0.3 mg/ml, muy de preferencia de aproximadamente 0.12 mg/ml. En la composición de la invención, el aminoácido, por ejemplo lisina, está presente a una concentración de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml, de preferencia de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, muy de preferencia de aproximadamente 27.3 mg/ml. La invención incluye formulaciones líquidas. El disolvente preferido es agua para inyección. Las formulaciones líquidas pueden ser de monodosis y multidosis. Las formulaciones líquidas de interferón de la invención que están diseñadas para usar como multidosis, comprenden preferiblemente un agente bacteriostático, tal como fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, alcohol bencílico, alquilparabeno (de metilo, etilo, propilo, butilo y similares), cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio, deshidroacetato de sodio y timerosal. Se prefieren particularmente el fenol, alcohol bencílico y m-cresol, de preferencia el alcohol bencílico. El agente bacteriostático se usa en una cantidad que produce una concentración efectiva para mantener la formulación esencialmente libre de bacterias (adecuada para inyección) durante el periodo de inyección de la multidosis, que puede ser de aproximadamente 12 o 24 horas, a aproximadamente 12 días, de preferencia de aproximadamente 6 días a aproximadamente 12 días. El agente bacteriostático está presente preferiblemente a una concentración de aproximadamente 0.1 % (masa de bacteriostático /masa de disolvente) a aproximadamente 2.0%, de preferencia de aproximadamente 0.2% a aproximadamente 1.0%. En el caso del alcohol bencílico se prefieren particularmente las concentraciones de 0.2% o 0.3%). Sin embargo, el uso de un conservador, por ejemplo el alcohol bencílico, no está limitado a las formulaciones de multidosis, sino que también se pueden añadir a las formulaciones de una sola dosis. Una modalidad de la presente invención consiste en formulaciones de una sola dosis que contienen alcohol bencílico. En una modalidad adicional de las formulaciones de acuerdo con la presente invención, el interferón beta está por lo menos aproximadamente 96%, o por lo menos aproximadamente 98%, en su forma monomérica (con menos de 4%, de preferencia menos de 2%, de agregados), a temperatura ambiente o a 2-8°C, según el análisis de la velocidad de sedimentación que se describe más abajo. Una formulación preferida consiste en interferón-beta-1 a, alcohol bencílico, lisina, metionina, Pluronic F-68 y un amortiguador acuoso de acetato, preferiblemente para ajustar el pH de 3.7 a 4.7. Las cantidades del interferón en las formulaciones de la invención incluyen cantidades que después de la reconstitución producen concentraciones de aproximadamente 1.0 µg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, aunque son funcionales concentraciones más bajas y más altas, y dependen del vehículo de suministro deseado, por ejemplo, las formulaciones en solución diferirán de un parche transdérmico y de los métodos de administración pulmonar, transmucosal, osmótica o de microbomba. La concentración de interferón es de preferencia de aproximadamente 5.0 µg/ml a aproximadamente 2 mg/ml, de preferencia de aproximadamente 10 µg/ml a aproximadamente 1 mg/ml, muy de preferencia de aproximadamente 30 µg/ml a aproximadamente 100 µg/ml. Preferiblemente, las formulaciones de la invención retienen por lo menos aproximadamente 60% de la actividad del interferón en el momento del envasado, de preferencia por lo menos aproximadamente 70%, muy de preferencia por lo menos aproximadamente 80%, durante un periodo de 24 meses. En una modalidad preferida adicional, la invención provee un método de fabricación de una composición farmacéutica líquida como la que se describe arriba. En otra modalidad preferida, la invención provee un método para fabricar una composición farmacéutica envasada, que comprende colocar una solución que comprende el ingrediente activo y los excipientes anteriormente descritos. En otra modalidad preferida, la invención provee un artículo de fabricación para uso farmacéutico humano, que comprende un frasco que comprende las composiciones farmacéuticas anteriormente descritas, y material impreso que indica que dicha solución se puede mantener durante un periodo de aproximadamente 24 horas o mayor después del primer uso. Preferiblemente, el material impreso indica que la solución se puede mantener hasta aproximadamente 12 días. Después del primer uso de una formulación de multidosis, esta se puede guardar y usar durante al menos aproximadamente 24 horas, de preferencia durante por lo menos aproximadamente 4, 5 o 6 días, de preferencia hasta 12 días. Después del primer uso, preferiblemente la formulación se guarda a una temperatura menor que la temperatura ambiente (es decir, aproximadamente 25 °C o menos), de preferencia a una temperatura de aproximadamente 10 °C o menos, de preferencia a aproximadamente 2-8 °C, muy de preferencia a aproximadamente 4-6 °C. Las formulaciones de la presente invención se pueden preparar mediante un procedimiento que comprende agregar las cantidades calculadas de los excipientes a la solución amortiguadora y después se agrega el interferón. Después, la solución resultante se pone en frascos, ampolletas o cartuchos. El experto en la materia reconocerá variaciones de este procedimiento. Por ejemplo, el orden en que se agregan los componentes, si se usan aditivos adicionales, y la temperatura y el pH a los que se prepara la formulación, son todos factores que se pueden optimizar según la concentración y los medios de administración usados. En el caso de una formulación de multidosis, el agente bacteriostático se puede agregar a la solución que contiene el ingrediente activo (interferón), o alternativamente se puede mantener en un frasco o cartucho separado y subsiguientemente se mezcla con la solución que contiene el ingrediente activo en el momento del uso. Las formulaciones de la invención se pueden administrar usando los dispositivos reconocidos. Los ejemplos que comprenden estos sistemas de frascos individuales incluyen dispositivos autoinyectores o peninyectores para suministrar una solución tal como Rebiject®. Los productos actualmente reclamados incluyen material de envase. El material de envase provee, además de la información requerida por las agencias reguladoras, las condiciones bajo las cuales se puede usar el producto. Si es necesario, el material de envase de la presente invención provee instrucciones al paciente para preparar la solución final, y usar dicha solución final durante un periodo de 24 horas o más para el producto húmedo/seco de dos frascos. Para el producto en solución en un solo frasco, el marbete indica que dicha solución se puede usar durante un período de 24 horas o más. Los productos actualmente reclamados son útiles para uso farmacéutico humano. Las formulaciones conservadas estables pueden ser provistas a los pacientes como soluciones transparentes. La solución puede ser para un solo uso o se puede reutilizar múltiples veces, y puede ser suficiente para ciclos únicos o múltiples de tratamiento del paciente y por lo tanto provee un régimen de tratamiento más conveniente que el actualmente disponible. El interferón en las formulaciones o soluciones estables o conservadas que se describen en la presente, se pueden administrar a un paciente de acuerdo con la presente invención por medio de una variedad de métodos de suministro, que incluyen inyección s.c. o i.m; por vía transdérmica, pulmonar, transmucosal, implante, bomba osmótica, cartucho, microbomba, oral, u otros medios apreciados por el experto en la materia, como es bien conocido. El término "frasco" se refiere ampliamente a un recipiente adecuado para retener el interferón en forma sólida o líquida en un estado estéril contenido. Los ejemplos de un frasco como el que se usa aquí incluyen ampolletas, cartuchos, envases de burbujas u otros de estos recipientes, adecuados para suministrar el ¡nterferón al paciente por medio de una jeringa, bomba (incluyendo osmótica), catéter, parche transdérmico, atomizador pulmonar o transmucosal. Los frascos adecuados para envasar los productos para administración parenteral, pulmonar, transmucosal o transdérmica, son muy conocidos y reconocidos en la técnica. El término "tratamiento" dentro del contexto de esta invención se refiere a cualquier efecto benéfico sobre el avance de una enfermedad, incluyendo atenuación, reducción, disminución o decremento del desarrollo patológico después de la aparición de la enfermedad. Las composiciones farmacéuticas de la invención que comprenden IFN, o una isoforma, muteína, proteína fusionada, derivado funcional, fracción activa o sal del mismo, son útiles en la diagnosis, prevención y tratamiento (local o sistémico) de las indicaciones clínicas sensibles a la terapia con este polipéptido. Estas indicaciones clínicas incluyen, por ejemplo, trastornos o enfermedades del sistema nervioso central (SNC), cerebro, y/o médula espinal, que incluyen esclerosis múltiple; enfermedades autoinmunes que incluyen artritis reumatoide, sohasis, enfermedad de Crohn; y cáncer que incluye cáncer de mama, próstata, vejiga, riñon y colon. Todas las referencias aquí citadas, que incluyen artículos o resúmenes de revistas, solicitudes de patente de EE. UU. o internacionales, publicadas o no publicadas, patentes expedidas de EE. UU. o internacionales, o cualquier otra referencia, se incorporan aquí en su totalidad como referencia, incluyendo todos los datos, cuadros anexos y texto presentados en las referencias citadas. Además, el contenido completo de las referencias mencionadas en los documentos aquí citados también se incorpora en la presente como referencia. La referencia a los pasos de los métodos conocidos, los pasos de los métodos convencionales, los métodos conocidos o los métodos convencionales, de ninguna manera es una admisión de que algún aspecto, descripción o modalidad de la presente invención está revelada, enseñada o sugerida en la técnica relevante. Así, la descripción anterior de las modalidades específicas revelará completamente la naturaleza general de la invención que otros, aplicando el conocimiento de la técnica (incluyendo el contenido de las referencias aquí citadas), pueden modificar y/o adaptar fácilmente para varias aplicaciones tales como modalidades específicas, sin mayor experimentación, sin apartarse del concepto general de la presente invención. Por lo tanto, estas adaptaciones y modificaciones se consideran dentro de una gama de equivalentes de las modalidades descritas, basadas en la enseñanza y guía presentada en la presente. Se entiende que la fraseología o terminología de la presente tiene fines descriptivos y no limitativos, de modo que la terminología o fraseología de la presente especificación es para ser interpretada por el experto en la materia a la luz de las enseñanzas y guías presentadas, en combinación con su conocimiento de la materia.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Métodos analíticos Se usó HPLC de exclusión de tamaño (SE), también referida aquí como "SE-HPLC nueva" o "SEC nueva", y ultracentrifugación a velocidad (AUC), para medir la cantidad de agregados y oligómeros del interferón beta- 1 a humano recombinante (r-h-IFN-beta-1a o r-h-ßlFN-1a). Los métodos de SE-HPLC y AUC presentados más abajo son capaces de detectar oligómeros tanto covalentes como no covalentes, tanto cuantitativa como cualitativamente. a. SE-HPLC- Prueba de pureza La detección del contenido total de agregados se efectúa en una columna TSK G2000SWXL (TosoHaas) o BioSuite (Waters); la elución se hace en modo isocrático a 0.5 mL/min usando 50 mM de amortiguador de acetato de sodio, 50 mM de NaCI, pH 3.8; la longitud de onda se pone a 215 nm. El tiempo de corrida es de 30 minutos. Se analizan muestras a 88 mcg/mL como tales inyectando 100 µl. b. Análisis de la velocidad de sedimentación-AUC 1. Descripción del método Las muestras se cargan en celdas con piezas centrales de carbón-epon de 2 canales con 12 mm de longitud de trayectoria óptica. Las piezas centrales y las ventanas de zafiro se limpian con detergente y después se empapan con agua para tratar de tener las superficies más limpias posibles. El placebo correspondiente se carga en el canal de referencia (el instrumento funciona como un espectrofotómetro de doble haz). Las celdas cargadas se colocan entonces en un rotor analítico AN-50TÍ, cargado en una centrífuga analítica Beckman Óptima XL-I, y se llevan a 20 °C. Después, el rotor se pone a 3000 rpm y las muestras se exploran (a 280 nm, el pico de absorbancia) para confirmar la carga apropiada de la celda. El rotor se lleva entonces a la velocidad de corrida final de 50000 rpm. Se registran 50 exploraciones por cada muestra a esta velocidad de rotor. Los datos se analizan usando el método c(s) desarrollado por Peter Schuck en el N. I. H., que se ejecuta en su programa de análisis SEDFIT (versión 8.7; Schuck, P. (2000), "Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modelling", Biophys. J. 78, 1606-1619). En este enfoque, muchos datos en bruto son ajustados directamente para derivar la distribución de los coeficientes de sedimentación, mientras que se modela la influencia de la difusión sobre los datos para aumentar la resolución. El método trabaja asignando un coeficiente de difusión a cada valor de coeficiente de sedimentación, en función de la suposición de que todas las especies tienen la misma forma hidrodinámica general (con la forma definida por la relación del coeficiente friccional con respecto al de una esfera, f/f0). Los valores f/fo se varían entonces para encontrar el mejor ajuste general de los datos para cada muestra. Las distribuciones se calculan usando suavización de entropía máxima de 0.51. 2. Parámetros analíticos -Tipo de rotor rotor de 8 agujeros -Velocidad del rotor 50k rpm -Piezas centrales carbón-epon -Longitud del canal 12 mm -Temperatura durante la corrida de AUC 20 °C -Longitud de onda de detección 280 nm -Volumen de la muestra 432 mcl -Volumen de referencia 442 mcl 3. Equipo y software Ultracentrífuga analítica modelo XL-I (Beckman Coulter) Software SEDFIT versión 8.70b (Peter Schuck -National Institutes of Health) Software Origin versión 6.03 (Beckman Coulter) Software Proteome Lab XL-A/XL-I versión 5.0 (Beckman Coulter) c. Cuantificación de IFN-3-1 a por medio de RP-HPLC-QUANT- HPLC El método de fase inversa que se describe abajo permite la cuantificación del IFN-ß-1a en las muestras. La cuantificación de la proteína se efectúa en una columna C4 Wide-Pore Butyl 5 µm, 4.6x250mm (Baker); la longitud de onda se pone en 214 nm y la elución se efectúa a 1 mL/min usando la siguiente fase móvil y gradiente: A = agua /0.1 % de ácido trifluoroacético; B = acetonitrilo/ 0.1 % de ácido t fluoroacético; C = acetonitrilo Las muestras se analizaron inyectando 50 µL de la muestra como tal (muestras de 88 mcg/mL).

CUADRO 4 Tiempo de corrida = 65 mín La cuantificación de las muestras se efectúa contra una curva patrón en la escala de 0.0125 mg/mL - 0.2 mg/mL preparadas como un material estándar de referencia. d. Pureza por medio de HPLC de fase inversa (RP-HPLQ- DEG/OX El método de fase inversa que se describe más abajo permite la detección de formas oxidadas de IFN-ß-1 a, que se eluyen diferentemente de la molécula intacta. La cuantificación de las formas oxidadas se efectúa en una columna C4, Supelcosil LC-304 (Supelco) estabilizada térmicamente a 40°C; la longitud de onda se pone a 208 nm y se eluye a 1 mL/min usando la siguiente fase móvil y gradiente: A = agua 60% /acetonitrilo 40% /ácido heptafluorobutírico 0.14%; B = agua 20% / acetonitrilo 80%/ ácido heptafluorobutíríco 0.14%; C = agua 20% /acetonitrilo 80% /ácido trifluoroacético 0.1 %. Gradiente: CUADRO 5 Tiempo de corrida: 96 minutos (70 min+ 26 min equilibrio) Las muestras se analizan como tales inyectando 200 µL. (muestras de 88 mcg/mL). e. Bioensavo de inhibición del efecto citohepático-CPE Biopotencia (actividad antiviral) La actividad antiviral del IFN-ß-1 a se mide por medio del bioensayo de inhibición del efecto citohepático (CPE). La actividad biológica se mide por medio de una prueba antiviral basada en la protección inducida de IFN-ß (células WISH-tejido amniótico humano) contra el efecto citohepático de un virus (virus de la estomatitis vesicular). El principio del bioensayo del ¡nterferón se basa en el hecho de que varios virus, tales como el virus de la estomatitis vesicular (VEV), ocasionan muerte celular que puede ser visualizada por tinción vital. El efecto citohepático se puede usar entonces para cuantificar la protección de la célula por el interferón. La prueba se realiza por medición directa de la muerte celular, que es determinada por la cantidad de colorante de sal de tetrazolio MTT (dimetiltiotetrazolio) incorporado por las células vivas. El método utiliza una determinación espectrofotométrica automática del porcentaje de las células protegidas, y una prueba de línea paralela de tres puntos para la evaluación estadística del título.

Procedimiento: La prueba se hace en placas de microtítulo. a. Se añaden 50 µl de medio de cultivo celular (MEM /5% de FBS) a cada pocilio. b. Se añaden 100 µl de la muestra de IFN-ß-1 a o de solución estándar (60-100 Ul de hlFN-ß/ml) a los pocilios y se hacen tres diluciones graduales de 1 :1.5 de fila a fila en las placas. c. Se añaden a cada pocilio 50 µl de suspensión de las células WISH (0.78-0.82 x106 células/ml), y las placas se incuban a 37 °C durante 18- 20 horas en una incubadora húmeda con 5% de CO2. d. Se añade a cada pocilio una suspensión de VSV excepto a los pocilios de control de células, llenados con MEM/ 2% de FBS. e. Las placas se incuban 24 horas en una incubadora húmeda con 5% de CO2 a 37 °C. f. Después de haber verificado por medio de un microscopio invertido que: (1 ) se alcanza por lo menos 80% de daño celular en la fila de control de VSV y (2) los valores medios del porcentaje de protección en presencia del estándar de IFN-ß están dentro del 84% del estándar sin diluir, el 45% de la dilución 1 :1.5 y el 27% de la dilución 1 :3, los cultivos se tiñen con el colorante específico MTT. g. Se determina la intensidad de la coloración mediante la lectura espectrofotométrica automática a 592 nm. h. Para cuantificar la actividad de IFN-ß-1 a, se analizan entonces las lecturas de la DO por medio de un programa de computadora (Colombo Software).

EJEMPLO 2 Estabilización de las formulaciones de interferón be a-1a libres de HSA Se hizo el siguiente experimento para verificar el efecto protector ejercido por una formulación que comprende un aminoácido (esto es, lisina) y un antioxidante (esto es, metionina), en el almacenamiento de una formulación de r-h-IFN-ß-1 a, a varias temperaturas (2-8 °C, 25 °C y 40 °C). Se usaron los siguientes métodos y pruebas analíticas durante el desarrollo (véase el ejemplo 1 ): - Actividad biológica (bioensayo in vitro) - Prueba (método RP-HPLC) - Productos de oxidación (método Deg-ox) - Dímeros/agregados (SEC-HPLC nueva y AUC, ambos métodos son capaces de detectar oligómeros covalentes y no covalentes) - Método cuantitativo de RP-HPLC (HPLC Quant) - pH (método potenciométrico) Los resultados se indican en los cuadros 6 a 8. 1. Procedimiento a. La formulación se fabricó usando una masa almacenada/despachada a 2-8 °C. La concentración del r-h-IFN-beta-1 a en la masa fue de aproximadamente 0.5 mg/mL. b. La formulación, que comprende lisina (como se indica en el punto 2), se fabricó diluyendo la sustancia activa en un vehículo, alcanzando así la composición final (concentración de r-h-IFN-beta-1a de 88 mcg/mL). c. La solución compuesta se filtró asépticamente a través de una membrana de nylon de 0.2 mieras y se recogió en un recipiente estéril; entonces se llenaron unas jeringas con 0.5 mL usando una máquina llenadora. d. La muestra se guardó entonces en cabinas termostáticas a 2-8 °C, 25 °C y 40 °C, y se analizaron de acuerdo con un plan de estabilidad usando varios métodos/pruebas, hasta aproximadamente 2 meses de almacenamiento (1-3 semanas para las muestras guardadas a 40 °C). 2. Composición de la formulación: a. 0.088 mg/mL de r-h-interferón-beta-1a b. 27.3 mg/mL de monoclorhidrato de L-lisina (código 1.05701 , Merck) c. 0.12 mg/mL de L-metionina (1.05707, Merck) d. 0.5 mg/mL de Pluronic F-68 (Lutrol F68 DAC, USP/NF, BASF), 5163315 e. 10 mM de acetato de sodio, pH 4.7 3. Resultados: CUADRO 6 Almacenamiento a 2-8 °C CUADRO 7 Almacenamiento a 25 °C CUADRO 8 Almacenamiento a 40 °C 4. Conclusiones: Los estudios de almacenamiento muestran que una formulación o composición que comprende lisina, metionina y Pluronic F-68, permanece muy estable hasta 8 semanas a 2-8 °C y también a 25 °C. Permanece estable hasta 3 semanas a 40 °C en cuanto al porcentaje de monómero (el porcentaje de monómero es siempre mayor de 98%). Dos métodos diferentes confirmaron estos resultados (AUC y SE-HPLC nueva). De esta manera, la formulación de la presente invención comprende preferiblemente una combinación de un aminoácido y un antioxidante. Preferiblemente también se agrega a la composición un agente tensioactivo. Preferiblemente, el aminoácido es lisina y el antioxidante es metionina. Preferiblemente, el agente tensioactivo se selecciona de Tween (por ejemplo Tween 20), Pluronic® F77, Pluronic F87, Pluronic F88 y Pluronic F68. De preferencia, el agente tensioactivo es Pluronic F68. Preferiblemente, la formulación se ajusta a una escala de pH de 3.5 a 5.5. De preferencia, la formulación se ajusta a pH 4.7.

Preferiblemente, la lisina está presente a una concentración de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml. De preferencia, la lisina está presente a una concentración de aproximadamente 27.3 mg/ml. Preferiblemente, el agente tensioactivo está presente a una concentración de aproximadamente 0.01 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml. De preferencia, el agente tensioactivo está presente a una concentración de aproximadamente 0.5 mg/ml. Preferiblemente, el antioxidante está presente a una concentración de aproximadamente 0.01 mg/ml a aproximadamente 5.0 mg/ml. De preferencia, el antioxidante está presente a una concentración de aproximadamente 0.12 mg/ml. Preferiblemente, el interferón está presente a una concentración de aproximadamente 10 µg/ml a aproximadamente 800 µg/ml. De preferencia, el interferón está presente a una concentración de aproximadamente 88 µg/ml.

Referencias 1. Derynk R. y otros, Nature 1980; 285, 542-547. 2. Familletti, P. C, Rubinstein, S., y Pestka, S. 1981 "A Convenient and Rapid Cytopathic Effect Inhibition Assay for Interferon" en Methods in Enzymology, Vol. 78 (S. Pestka, ed.), Academic Press, Nueva York, 387-394; 3. Mark D.F. y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 81 (18) 5662-5666 (1984). 4. Pestka, S. (1986) "Interferon Standards and General Abbreviations" en Methods in Enzymology (S. Pestka, ed.), Academic Press, Nueva York 1 19, 14-23. 5. Rubinstein, S., Familletti, P. C. y Pestka, S. "Convenient Assay for Interferons" J. Virol 1981 ; 37, 755-758. 6. Shepard H. M. y otros, Nature 1981 ; 294, 563-565.

Claims (31)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una composición farmacéutica líquida estabilizada libre de

HSA, que comprende un interferón (IFN), en donde dicha formulación es una solución que comprende un amortiguador, un aminoácido y un antioxidante. 2.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha formulación también comprende un agente tensioactivo.

3.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada además porque dicho interferón es el IFN-beta.

4.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque dicho IFN-beta es IFN-beta recombinante humano. 5.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque dicho amortiguador está presente en una cantidad suficiente para mantener el pH de dicha composición dentro de una escala de más o menos 0.5 unidades de un pH especificado, en donde el pH especificado es de aproximadamente 3.5 a aproximadamente 5.

5.

6.- La composición de conformidad con la reivindicación precedente, caracterizada además porque dicho pH es de 4.7±0.2.

7.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque dicho amortiguador está presente en una concentración de aproximadamente 5 mM a 500 mM.

8.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque dicho amortiguador está presente en una concentración de aproximadamente 10 mM.

9.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque el amortiguador es un amortiguador de acetato.

10.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque dicho aminoácido se selecciona del grupo aminoácidos de cadena lateral cargada.

11.- La composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque dicho aminoácido se selecciona de arginina, lisina, ácido aspártico y ácido glutámico.

12.- La composición de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizada además porque dicho aminoácido es lisina.

13.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque dicha lisina está presente en una concentración de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml.

14.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque dicha lisina está presente en una concentración de aproximadamente 27.3 mg/ml.

15.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque dicho agente tensioactivo se selecciona de Tween, Pluronic® F77, Pluronic F-87, Pluronic F-88 y Pluronic F-68.

16.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque dicho agente tensioactivo es Pluronic F68.

17.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque dicho agente tensioactivo está presente en una concentración de aproximadamente 0.01 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml.

18.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque dicho agente tensioactivo está presente en una concentración de aproximadamente 0.5 mg/ml.

19.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque dicho antioxidante es metionina.

20.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque dicho antioxidante está presente en una concentración de aproximadamente 0.01 mg/ml a aproximadamente 5.0 mg/ml.

21.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque dicho antioxidante está presente en una concentración de aproximadamente 0.12 mg/ml.

22.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque dicho interferón está presente en una concentración de aproximadamente 10 µg/ml a aproximadamente 800 µg/ml.

23.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque dicho interferón es interferón beta-1a recombinante humano y está presente en una concentración de aproximadamente 22 µg/ml, 44 µg/ml o 88 µg/ml.

24.- La composición de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada además porque dicho interferón está presente en una concentración de aproximadamente 88 µg/ml.

25.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque comprende un agente bacteriostático seleccionado de fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, alcohol bencílico, alquilparabeno (de metilo, etilo, propilo, butilo y similares), cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio, deshidroacetato de sodio y timerosal.

26.- La composición de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada además porque el agente bacteriostático es alcohol bencílico.

27.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque consiste en interferón beta-1a, alcohol bencílico, lisina, metionina, Pluronic F-68 y un amortiguador acuoso de acetato.

28.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque el interferón está por lo menos aproximadamente 96%, o aproximadamente 98% como un monómero.

29.- Un recipiente sellado herméticamente en condiciones estériles y apropiado para almacenamiento antes de usar, que comprende la formulación farmacéutica líquida que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28.

30.- El recipiente de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque es una jeringa preparada, un frasco o un autoinyector.

31.- El uso de una composición de IFN como la que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la esclerosis múltiple.