CN110337287A - 干扰素β变体的稳定制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及R27T的稳定药物制剂，该制剂包含人干扰素β变体(R27T)、乙酸盐缓冲液、精氨酸、海藻糖、泊洛沙姆188和甲硫氨酸。根据本发明的稳定的R27T药物制剂是通过在含甘露醇制剂的组合物中用海藻糖替代甘露醇而开发具有新组合物的制剂而获得的，该含甘露醇制剂是本发明人先前研究的。已经证实，该具有新组合物的制剂可以弥补由于混合和添加甘露醇和精氨酸HCl而导致蛋白聚集体增加的缺点，并且可以改善在长期储存期间的热力学/结构稳定性以及总的稳定性，因此预期该制剂可有利地用于预防、缓解和治疗多发性硬化症、癌症、自身免疫疾病、病毒感染性疾病、HIV感染性疾病、丙型肝炎、类风湿性关节炎等。

Description

干扰素β变体的稳定制剂
技术领域
本发明涉及R27T的稳定药物制剂，该制剂包含人干扰素β变体(R27T)、乙酸盐缓冲液、精氨酸、海藻糖、泊洛沙姆188和甲硫氨酸。
背景技术
干扰素(IFN)作为一种细胞因子表现出抗病毒活性，并具有抑制细胞增殖和调节先天免疫应答的功能。根据细胞来源(白细胞、成纤维细胞、T细胞)将IFN分类为IFN-α、IFN-β和IFN-γ。
其中，干扰素-β(IFN-β)是具有5个α-螺旋(α-螺旋)的球形蛋白，其大小为22kD，并且当去除糖链时大小为18kD。已经积极地进行了对IFN-β的临床应用研究，IFN-β作为减缓、减轻或治疗多发性硬化症状的药剂特别突出，并且进一步通过各种研究，已经报道了研究结果，即IFN-β对于治疗癌症，自身免疫疾病和病毒感染性疾病，与HIV、丙型肝炎、类风湿性关节炎等相关的疾病是有效的，其具有各种免疫活性，例如抗病毒活性，细胞生长抑制，淋巴细胞细胞毒性增加活性，免疫调节活性，诱导或抑制靶细胞分化的活性，巨噬细胞活化，增加细胞因子产生的活性，增加细胞毒性T细胞作用的活性和增加天然杀伤细胞的活性。
人IFN-β也是一种糖蛋白，并且由于与蛋白连接的糖链部分在蛋白的活性中起重要作用，因此在糖蛋白的情况下，蛋白的活性在添加糖链时可能增加。也就是说，已知蛋白糖基化可能影响许多生化特征，例如稳定性、溶解性、细胞内运输活性、药代动力学和抗原性。
因此，已经报道了一个示例，其中将糖链引入天然人IFN-β中作为糖蛋白以制备活性或功能增加或改善的人IFN-β变体(韩国专利No.10-0781666)。用于本发明的人IFN-β变体R27T是重组人IFN-β变体(下文称为rhINF-β)，其通过用苏氨酸(Thr)取代27位的精氨酸(Arg)，在INF-β1a的25位进行额外的糖基化而设计，并且与野生型INF-β1a(Rebif)相比，所述人IFN-β变体R27T具有增加稳定性、降低蛋白聚集倾向和增加半衰期的作用。也就是说，R27T是通过定点诱变针对额外的糖基化生产的rhINF-β的生物改进剂(biobetter)。
同时，蛋白药物开发的主要问题之一是通过赋予足够的化学、物理和生物稳定性来生产具有24个月或更长时间的长保质期产品。然而，由于蛋白降解途径中的各种固有的易感性，具有各种水平的蛋白结构的复杂性，例如蛋白的大分子和二级、三级和四级结构，所以实现高稳定性仍然是难题。
自1982年第一次批准和成功生产胰岛素作为第一种重组肽激素以来已经过去了30年或更长时间，随后，迄今已报道了许多成功的重组蛋白/肽药物案例。然而，在开发生物药物的过程中，特别是在生物药物的配制中，由于各种因素，例如蛋白聚集、物理化学不稳定性、低半衰期、低溶解度和药代动力学性质，因而仍然面临困难。
特别地，蛋白聚集是几乎所有生物制药过程中容易发生的主要问题之一，原因在于治疗性蛋白在储存期间在溶液中在结构上/热力学上是不稳定的。由于治疗性蛋白在纯化、加工和储存过程中易受由各种因素引起的结构变化的影响，因此当蛋白暴露于高温、最大/最小pH、剪切应变和表面吸附时，上述问题可能会恶化。此外，由于基于蛋白的生物药物可能发生物理降解，例如由于解折叠、聚集和非天然聚集而形成不溶性颗粒，因此需要优化制备系统，例如稳定的pH范围、适当的缓冲系统、以及开发的辅料，以避免蛋白聚集或物理降解，并最大限度地提高稳定性。
因此，本发明人试图开发一种稳定的药物制剂，其具有人IFN-β变体的增强的储存和热力学/结构稳定性。
发明内容
技术问题
为了解决相关技术中的问题，根据开发能够增强作为人干扰素β变体的R27T的稳定性的药物制剂的深入研究，本发明人开发了具有新组合物的稳定的R27T制剂，这种制剂与现有制剂相比，其储存和热力学/结构稳定性得到改善并且R27T蛋白聚集体的形成减少，从而基于该发现完成了本发明。
因此，本发明的一个目的是提供一种具有新组合物的人干扰素β变体(R27T)的稳定药物制剂。
然而，本发明要实现的技术问题不限于上述问题，本领域技术人员从以下描述中可以清楚地理解未提及的其他问题。
【技术方案】
为达到本发明的目的，本发明提供一种人干扰素β变体(R27T)的稳定药物制剂，其包含：
(a)人干扰素β变体(R27T)，
(b)浓度为5mM至100mM的乙酸盐缓冲液，
(c)浓度为10mM至150mM的精氨酸，
(d)浓度为50mM至300mM的海藻糖，
(e)浓度为0.1mg/mL至10mg/mL的泊洛沙姆188，和
(f)浓度为0.5mM至5mM的甲硫氨酸。
作为本发明的一实施方案，所述人干扰素β变体(R27T)可以包含25位的氨基酸的天冬酰胺残基处的N-连接的糖链，其中用苏氨酸取代人干扰素β的27位的氨基酸的精氨酸。
作为本发明的另一实施方案，包含的所述乙酸盐缓冲液的浓度可以为10mM至30mM。
作为本发明的又一实施方案，所述乙酸盐缓冲液可以具有在3.6至4.4的范围内的pH。
作为本发明的又一实施方案，包含的所述精氨酸的浓度为50mM至100mM。
作为本发明的又一实施方案，包含的所述海藻糖的浓度可以为150mM至250mM。
作为本发明的又一实施方案，包含的所述泊洛沙姆188的浓度可以为0.1mg/mL至1mg/mL。
作为本发明的又一实施方案，包含的所述甲硫氨酸的浓度为0.5mM至2mM。
作为本发明的又一实施方案，所述稳定药物制剂可以具有在3.6至4.4的范围内的氢离子浓度指数(pH)。
作为本发明的又一实施方案，所述稳定药物制剂可以用于预防或治疗选自由多发性硬化症、癌症、自身免疫疾病、病毒感染性疾病、HIV感染性疾病、丙型肝炎和类风湿性关节炎组成的群组中的疾病。
作为本发明的又一实施方案，所述稳定药物制剂可以用于口服或肠胃外施用。
作为本发明的又一实施方案，所述稳定药物制剂可以是液体或冻干制剂。
此外，本发明提供了一种用于预防或治疗选自由多发性硬化症、癌症、自身免疫疾病、病毒感染性疾病、HIV感染性疾病、丙型肝炎和类风湿性关节炎组成的群组中的一种或多种疾病的药物组合物，该组合物包含药学有效量的稳定制剂。
另外，本发明提供了一种用于预防或治疗选自由多发性硬化症、癌症、自身免疫疾病、病毒感染性疾病、HIV感染性疾病、丙型肝炎和类风湿性关节炎组成的群组中的一种或多种疾病的方法，该方法包括：将药学有效量的所述稳定制剂施用给个体的步骤。
此外，本发明提供了所述稳定制剂用于预防或治疗选自由多发性硬化症、癌症、自身免疫疾病、病毒感染性疾病、HIV感染性疾病、丙型肝炎和类风湿性关节炎组成的群组中的一种或多种疾病的用途。
有益效果
根据本发明的R27T的稳定药物制剂是通过在含甘露醇制剂的组合物中用海藻糖替代甘露醇而开发具有新组合物的制剂而获得的，该含甘露醇制剂是本发明人先前研究的。已经证实，该制剂可以弥补由于混合和添加甘露醇和精氨酸HCl而导致蛋白聚集体增加的缺点，并且可以改善在长期储存期间的热力学/结构稳定性以及总的稳定性，因此预期该制剂可有利地用于预防、缓解和治疗多发性硬化症、癌症、自身免疫疾病、病毒感染性疾病、HIV感染性疾病、丙型肝炎、类风湿性关节炎等。
附图说明
图1说明了人干扰素β变体(R27T)的基因和蛋白序列。
图2是通过加入甘露醇制备的R27T制剂(加入赋形剂250mM甘露醇、50mM精氨酸HCl、0.5mg/mL泊洛沙姆188和1mM甲硫氨酸的制剂)和分别通过加入浓度为150mM、200mM和250mM的海藻糖、蔗糖或木糖醇代替甘露醇而制备的制剂总计10种制剂以0.1mg/mL的浓度并且在4℃下冷冻持续0天、1周、2周、3周和3个月后，经由通过尺寸排阻色谱法(SEC)测量残余单体的量来评价制剂的储存稳定性的结果。
图3是通过添加与如图2中的甘露醇相同的甘露醇制备的R27T制剂和通过加入浓度为200或250mM的海藻糖或木糖醇代替甘露醇而制备的制剂总共5种制剂在37℃的高温下储存0天、14天、21天和28天之后，通过进行SEC测量残留单体的量来评价制剂的储存稳定性的结果。
图4是用于根据是否将精氨酸HCl加入到具有包含甘露醇或海藻糖(其与图2和3中的相同)的组合物的制剂中来验证R27T的稳定性，并且是在每种制剂以低浓度(0.1mg/mL)或高浓度(0.64mg/mL)和37℃的高温储存1天、7天、14天和28天后通过SEC分析测量蛋白聚集度的结果。
具体实施方式
本发明涉及R27T的稳定药物制剂，该制剂包含人干扰素β变体(R27T)、乙酸盐缓冲液、精氨酸、海藻糖、泊洛沙姆188和甲硫氨酸。
在下文中，将详细描述本发明。
本发明人使用基本缓冲系统选择pH为3.8±0.2的20mM乙酸盐缓冲液，该系统通过先前研究针对R27T进行优化以开发人干扰素β变体R27T的稳定药物制剂，并通过实验(其中添加了用于增强R27T稳定性的各种赋形剂)证实，与现有制剂相比，通过加入甘露醇、精氨酸HCl、泊洛沙姆188和甲硫氨酸制备的制剂可以增强R27T的稳定性。然而，甘露醇和精氨酸HCl的混合组合物的缺点在于，当混合组合物在高浓度和高温下储存时，稳定性与现有制剂一样降低，并且为了克服该缺点，本发明人开发了一种稳定的R27T药物制剂，其具有能够通过筛选能够替代甘露醇的赋形剂来增强R27T稳定性的新组合物。
因此，本发明提供了一种人干扰素β变体(R27T)的稳定药物制剂，其包含人干扰素β变体(R27T)、浓度为5mM至100mM的乙酸盐缓冲液、浓度为10mM至150mM的精氨酸、浓度为50mM至300mM的海藻糖、浓度为0.1mg/mL至10mg/mL的泊洛沙姆188和浓度为0.5mM至5mM的甲硫氨酸。
在本发明的一实施方案中，为了找到与通过加入甘露醇制备的上述R27T制剂相比，能够提高R27T的储存稳定性的甘露醇替代物，通过使用海藻糖、蔗糖和木糖醇制备具有相同组成的R27T制剂之后，每种制剂的稳定性在每种制剂以低浓度储存后测定。结果证实，当使用海藻糖时，储存稳定性和可逆性显著增强，并且即使使用蔗糖和木糖醇，制剂的可逆性也相对增强(参见实施例2)。
在本发明的另一实施方案中，作为确定基于实施例2的结果通过替代甘露醇加入了作为赋形剂的海藻糖或木糖醇的R27T制剂的稳定性和抗病毒活性的结果，证实了通过在高温储存期间添加海藻糖制备的制剂具有最佳的抗热稳定性和与浓度增加相对应的最佳稳定性，并且表现出与使用甘露醇的制剂的热力学/结构稳定性和抗病毒活性类似的热力学/结构稳定性和抗病毒活性(参见实施例3)。
在本发明的另一实施方案中，作为经由通过在甘露醇或海藻糖与精氨酸混合的组合物中的蛋白聚集的变化分析制剂的稳定性的结果，证实与不存在精氨酸的情况相比，甘露醇在与精氨酸混合时增加蛋白聚集，而海藻糖在与精氨酸的混合组合物中相当减少蛋白聚集(参见实施例4)。
通过本发明实施方案的结果，证实了使用海藻糖作为赋形剂的本发明的新型的R27T稳定药物制剂与使用甘露醇的现有R27T制剂相比具有优异的稳定性，因此新型的R27T稳定药物制剂通过使用干扰素β，可以有效地用于治疗各种疾病。
如本文所使用的，术语“干扰素-β(IFN-β)”不仅指通过DNA重组技术从生物学流体中分离获得的或从真核或原核宿主细胞中获得的人源性成纤维细胞干扰素，还指其盐、功能衍生物、变体、类似物和活性部分。优选地，IFN-β意指干扰素β-1a。
如本文所使用的，用作甘露醇替代物的海藻糖是指非还原性二糖，其中两个D-葡萄糖分子通过1→1α键连接，并且在化学上，有α，α型，α，β型和β，β型这三种类型，并且可以天然获得的海藻糖是α，α型。海藻糖首先在黑麦麦角中发现，在细菌或酵母中大量存在，甚至在体液和昆虫卵中也观察到，并且已知其作为昆虫的能量来源或储存碳水化合物起重要作用。
如本文所使用的，术语“稳定的制剂”是这样的制剂，其中包含的蛋白的降解、变性、聚集和生物活性丧失的程度被控制到可接受的程度，并且不会随着时间的推移而增加到不可接受的水平。优选地，制剂将R27T活性维持至少约60％、优选至少约70％、更优选至少约80％，持续长达24个月。
如本文所使用，术语“缓冲剂”是指具有调节或维持制剂pH使得制剂的pH落入优选的pH范围内这样的效果的化合物的溶液。在本发明中，适用于调节pH的缓冲剂不受限制，但缓冲剂可包括磷酸、乙酸、柠檬酸和组氨酸，优选是浓度为5mM至100mM的乙酸盐缓冲剂，更优选可以以10mM至30mM的浓度被包含，甚至更优选以20mM的浓度被包含。
在本发明中，R27T的稳定药物制剂可以通过包括以下步骤来制备：使用包含浓度为5mM至100mM的乙酸盐缓冲液的溶液和赋形剂，对包含人干扰素变体R27T的溶液进行透析；并且过滤透析液。
在本发明中，作为赋形剂，可以加入浓度为10mM至150mM的精氨酸，浓度为50mM至300mM的海藻糖，浓度为0.1mg/mL至10mg/mL的泊洛沙姆188和浓度为0.5mM至5mM的甲硫氨酸，更优选可以加入浓度为50mM至100mM的精氨酸，浓度为150mM至250mM的海藻糖，浓度为0.1mg/mL至1mg/mL的泊洛沙姆188和浓度为0.5mM至2mM的甲硫氨酸。
当将本发明的R27T的稳定药物制剂制备成“液体制剂”时，优选的溶剂是水或注射用无菌水，并且可以是单剂量或多剂量的。优选本发明的用于多剂量的液体R27T制剂包括抑菌剂，例如苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸烷基(甲基、乙基、丙基、丁基等)酯、苯扎氯铵、苄索氯铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞。抑菌剂的使用含量可以在多剂量注射期间产生有效维持基本上无菌制剂(适于注射)的浓度，该注射期间为约12或24小时至约12天，优选约6至12天。优选抑菌剂的浓度为约0.1％至约2.0％(抑菌剂的质量/溶剂的质量)。
本发明的制剂可任选地进一步不仅包括稀释剂、赋形剂和载体，还包括生理学/药学上可接受的添加剂，例如，自由流化剂、乳化剂、稳定剂、防腐剂、着色剂、消泡剂和抗结块剂。
药学上可接受的载体没有特别限制，而是可包括生理盐水、聚乙二醇、乙醇、植物油、肉豆蔻酸异丙酯等。
此外，本发明提供了通过向个体施用药学有效量的无菌制剂来治疗诸如多发性硬化症、癌症、自身免疫疾病、病毒感染性疾病、HIV感染性疾病、丙型肝炎和类风湿性关节炎之类的疾病。
如本文所使用的，“个体”是指需要治疗疾病的受试者，更具体地，是指哺乳动物，例如人或非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马和牛。
关于“药学有效量”，对于本领域技术人员显而易见的是，其范围可以根据患者的体重、年龄、性别、健康状况、饮食、给药时间、给药方法和排泄率、疾病的严重程度等不同地进行调节。
本发明制剂的优选剂量根据患者的病症和体重、疾病的程度、药物的形式、给药途径和持续时间不同而变化，但可以由本领域技术人员适当选择。然而，制剂优选按每日0.001至100mg/kg体重施用，更优选按每日0.01至30mg/kg体重施用。该剂量可以每天一次施用或可以分成几个剂量施用。
本发明的制剂可以通过各种途径施用给哺乳动物，如大鼠、小鼠、家畜和人。施用方法不受限制，本发明的制剂可以通过口服、直肠或静脉内、肌肉内、皮下、子宫内或脑室内注射施用。
在下文中，将提出用于帮助理解本发明的优选实施例。然而，提供以下实施例仅为了更容易理解本发明，并且本发明的内容不受以下实施例的限制。
实施例
实施例1.实验方法
1-1.尺寸排阻色谱法(SEC)
使用配备有TSK-GEL G3000SWXL SEC柱(TOSOH Bioscience，PA，美国)和二极管检测器(DAD)的Agilent高效液相色谱系统(Agilent HPLC1260，Santa Clara，CA，美国)分析R27T样品。为了分离水溶性R27T颗粒，流动相A(0.1％三氟乙酸(TFA)水溶液，100mM NaCl)和流动相B(0.1％TFA乙腈，100mM NaCl)以0.5mL/min的流速且以4：6的比例流动。分析作为样品中多聚体的峰的区域与水性聚集体的区域一起计算。在第一次测量和随后的测量之间R27T样品的总面积差异(色谱图结果中所有峰区域的面积之和)被定义为由于在测量期间形成不溶性聚集体导致。将各种类型的剩余比例(不溶性聚集体、单体和蛋白片段)计算为与初始时间相比的峰面积，并将储存时间段绘制为X轴。在这种情况下，用于计算剩余比例的等式如下。
剩余量(％)＝(at÷A0)×100
在该等式中，at表示每一时间蛋白峰的面积，A0表示每个蛋白峰的初始面积。误差棒是指三次测量的标准偏差(SD)。
1-2。差示扫描量热法(DSC)
为了进行R27T样品的热力学稳定性评估，使用VP-DSC微量热计(Microcal，Northampton，MA，美国)。实验以1℃/分钟的加热速率从15℃至120℃进行，并且总共重复三次。通过减去使用最终测量的缓冲液测量的基线并计算样品中存在的蛋白浓度来标准化DSC实验结果。
R27T测量结果通过线性基线调整设定用于结果的零调整的基线。在这种情况下，设定用于样品的零调整的基线的过程是复杂的，因为该过程受到通过加热引起的聚集和沉淀现象的干扰，并且本发明使得能获得最稳定的结果，而不管样品类型如何，或者使得用户能通过选择先前的基线选项在重复实验中进行确定。
最终的量热记录用Y轴上的过量比热(cal/℃mol)和X轴上的温度(℃)绘制。根据这些结果，计算蛋白转变温度(Tm)。
1-3.细胞病变效应(CPE)测定
为了评价每种R27T稳定制剂的抗病毒作用，将作为肺癌细胞系的A549细胞以3×105个细胞/mL等分到96孔板中，用100μl每种制剂处理含有细胞的100μl培养基，细胞在37℃培养22小时。在第2天取出上清液，并且细胞用浓度为1000TCID50/mL的100uL脑心肌炎病毒(EMCV)处理，并在37℃下培养22小时后，通过在第3天除去上清液并染色活细胞以测量570nm处的吸光度来计算与标准品相比较的滴度。
实施例2.根据赋形剂对R27T制剂进行的稳定性的比较和分析
2-1.R27T制剂的制备
本发明人通过先前的研究，通过向干扰素变体R27T添加20mM pH为3.8的乙酸盐缓冲液、甘露醇、精氨酸HCl、泊洛沙姆188和甲硫氨酸的赋形剂，制备了增强干扰素β变体R27T的稳定性的制剂。此外，本发明旨在通过发现能够取代用作现有干扰素稳定剂的甘露醇的赋形剂而开发了一种比加入甘露醇和精氨酸HCl的混合制剂更稳定的制剂。
为此目的，如下表1所示，通过以下方式制备总共10种R27T制剂：使用与其它赋形剂的组成和浓度相同的组成和浓度以及在先前的研究中制备的包含甘露醇的制剂的组合物(1(F5))，添加各种浓度(150mM、200mM或250mM)的已知大量存在于细菌或酵母中的、以及甚至在体液和昆虫卵中观察到作为非还原性二糖(其中D-葡萄糖的两个分子通过1→1α键连接)的海藻糖而不是甘露醇，或者添加各种浓度(150mM、200mM或250mM)的被确定用于替代在先前的研究中的甘露醇的蔗糖或木糖醇，并且进行用于比较和分析所述制剂的稳定性的实验。
[表1]
2-2.SEC：单体量的分析
为了评价实施例2-1中制备的每种R27T制剂的储存稳定性，将10种制剂以0.1mg/mL的浓度和4℃分别冷藏0天、1周、2周、3周和3个月后，通过使用实施例1-1中的尺寸排阻色谱法测量残留单体的量。
结果，如图2所示，证实尽管初始浓度相同，但根据每种制剂(配方)显示单体的含量不同。当加入海藻糖代替甘露醇时，可逆性显著增加，因此证实储存稳定性显著增加。此外，海藻糖的使用浓度越高，可逆性越高，并且可以看出，特别是当以200mM和250mM的浓度添加海藻糖时，即使在冷却储存3个月后单体的量的变化也非常小。同时，证实即使在以150或200mM加入了蔗糖和木糖醇的制剂的情况下，制剂的可逆性也相对增加。
实施例3.根据海藻糖的添加验证R27T制剂的稳定性和抗病毒活性
3-1.SEC：单体量分析
基于实施例2的结果，主要对被证实与使用甘露醇的情况相比使用的增强R27T制剂的冷藏稳定性的海藻糖的制剂进行另外的稳定性分析。更具体地，通过加入浓度为250mM的甘露醇，或加入浓度为200mM或250mM的海藻糖或木糖醇来制备R27T制剂，制剂的详细组成示于下表2中。
[表2]
首先，为了评价5种R27T制剂的储存稳定性，每种制剂在0.64mg/mL的高浓度和37℃的高温下保存0天、14天、21天和28天后，通过实施例1-1中的方法测量单体的量。
结果，如图3所示，显示与其他制剂相比，制剂No.2，即以200mM加入海藻糖的案例具有最佳的抗热稳定性。此外，证实与其他制剂相比，根据浓度的增加，制剂也具有最高的稳定性。
3-2.DSC：热力学稳定性分析
除了实施例3-1中的储存稳定性分析之外，还通过对实施例1-2中的方法制备的5种R27T制剂进行DSC分析来评价R27T的热力学/结构稳定性。
结果，如下表3所示，可以看出，在加入甘露醇或海藻糖的制剂No.1至No.3中，Tm值显示出高于加入木糖醇的制剂No.4和No.5的Tm值，制剂No.1至No.3表现出相似的Tm值，因此，R27T的热力学或结构稳定性在这3种R27T制剂中是高的。
[表3]
3-3.CPE测定：抗病毒活性分析
除了实施例3-1和3-2中稳定性的分析之外，通过实施例1-3中的方法进行CPE测定，以比较相应的R27T制剂的抗病毒活性。
结果，如下表4所示，证实在加入了200mM海藻糖的制剂No.2的情况下，显示出与加入了甘露醇的制剂的抗病毒活性类似的抗病毒活性。
通过实施例的结果，证实当将通过添加200mM海藻糖制备的R27T制剂与通过添加250mM甘露醇制备的制剂进行比较时，储存稳定性、结构稳定性和抗病毒活性相似或增强，并且可以看出，上述浓度的海藻糖具有足以替代甘露醇的优点。
[表4]
实施例4.根据精氨酸HCl混合物的存在或不存在来比较和分析稳定性
在通过实施例2和3使用最终选择作为能够取代甘露醇的赋形剂的200mM的海藻糖的R27T制剂中，根据是否存在精氨酸HCl，分析制剂的储存稳定性是否存在差异。为此目的，如下表5所示，将仅使用乙酸盐缓冲液的制剂(对照-1)和加入250mM甘露醇而不加入精氨酸HCl的R27T制剂(对照-2)作为对照，并且将加入了50mM精氨酸HCl和250mM甘露醇的制剂(3)和加入了200mM海藻糖并且加入了或没有加入50mM精氨酸HCl的制剂(4和5)作为实验组。每种制剂在37℃的高温下以低浓度(0.1mg/mL)或高浓度(0.64mg/mL)储存1天、7天、14天和28天后，蛋白聚集程度通过实施例1-1的SEC分析测量。
[表5]
结果，如图4所示，证实在通过添加甘露醇制备的制剂的情况下，通过添加精氨酸HCl在低浓度和高浓度下蛋白聚集都增加(F2和F3之间的比较)，而在通过添加海藻糖制备的制剂的情况下，与添加精氨酸HCl的情况相比，蛋白聚集减少(F4和F5之间的比较)。
通过该结果，可以看出加入了海藻糖和精氨酸HCl的制剂比基于甘露醇的制剂具有更好的稳定性。
提供本发明的上述描述是为了说明的目的，并且本发明所属领域的技术人员将理解，在不改变本发明的技术精神或基本特征的情况下，可以容易地将本发明修改为其他特定形式。因此，应该理解，上述实施例在所有方面都仅是说明性的而非限制性的。
工业适用性
本发明提供的稳定的R27T药物制剂是通过用海藻糖取代在已由本发明人先前研究过的含有甘露醇的制剂的组合物中的甘露醇而具有新组合物的制剂。已经证实，该制剂可以弥补由于混合和添加甘露醇和精氨酸HCl而导致蛋白聚集体增加的缺点，并且可以改善热力学/结构稳定性以及在长期储存期间产生的稳定性，因此该制剂可以有利地用于预防、缓解和治疗多发性硬化症、癌症、自身免疫疾病、病毒感染性疾病、HIV感染性疾病、丙型肝炎和类风湿性关节炎等等。
序列表自由文本
<110> 瑗备恩有限公司
<120> 干扰素β变体的稳定制剂
<130> MPO19-039CN
<150> KR 10-2016-0129208
<151> 2016-10-06
<150> PCT/KR 2017/010826
<151> 2017-09-28
<160> 2
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 600
<212> DNA
<213> R27T IFN-β DNA型序列( Type R27T IFN-beta DNA sequence)
<400> 1
atgaccaaca agtgtctcct ccaaattgct ctcctgttgt gcttctccac tacagctctt 60
tccatgagct acaacttgct tggattccta caaagaagca gcaattttca gtgtcagaag 120
ctcctgtggc aattgaatgg gacgcttgaa tattgcctca aggacaggat gaactttgac 180
atccctgagg agattaagca gctgcagcag ttccagaagg aggacgccgc attgaccatc 240
tatgagatgc tccagaacat ctttgctatt ttcagacaag attcatctag cactggctgg 300
aatgagacta ttgttgagaa cctcctggct aatgtctatc atcagataaa ccatctgaag 360
acagtcctgg aagaaaaact ggagaaagaa gattttacca ggggaaaact catgagcagt 420
ctgcacctga aaagatatta tgggaggatt ctgcattacc tgaaggccaa ggagtacagt 480
cactgtgcct ggaccatagt cagagtggaa atcctaagga acttttactt cattaacaga 540
cttacaggtt acctccgaaa ctgaagatct cctagcctgt ccctctggga ctggacaatt 600
600
<210> 2
<211> 187
<212> PRT
<213> R27T IFN-β蛋白型序列 (Type R27T IFN-beta Protein sequence)
<400> 2
Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu Leu Cys Phe Ser
1 5 10 15
Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg
20 25 30
Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Thr
35 40 45
Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu
50 55 60
Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile
65 70 75 80
Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val
100 105 110
Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu
115 120 125
Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys
130 135 140
Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser
145 150 155 160
His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr
165 170 175
Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
180 185

Claims (12)

1.一种人干扰素β变体的稳定药物制剂，其包含：(a)人干扰素β变体，(b)浓度为5mM至100mM的乙酸盐缓冲液，(c)浓度为10mM至150mM的精氨酸，(d)浓度为50mM至300mM的海藻糖，(e)浓度为0.1mg/mL至10mg/mL的泊洛沙姆188，和(f)浓度为0.5mM至5mM的甲硫氨酸。
2.根据权利要求1所述的稳定药物制剂，其中所述人干扰素β变体包含属于25位的氨基酸的天冬酰胺残基处的N-连接的糖链，其中用苏氨酸取代属于人干扰素β的27位的氨基酸的精氨酸。
3.根据权利要求1所述的稳定药物制剂，其中包含的所述乙酸盐缓冲液的浓度为10mM至30mM。
4.根据权利要求1所述的稳定药物制剂，其中所述乙酸盐缓冲液具有在3.6至4.4的范围内的pH。
5.根据权利要求1所述的稳定药物制剂，其中包含的所述精氨酸的浓度为50mM至100mM。
6.根据权利要求1所述的稳定药物制剂，其中包含的所述海藻糖的浓度为150mM至250mM。
7.根据权利要求1所述的稳定药物制剂，其中包含的所述泊洛沙姆188的浓度为0.1mg/mL至1mg/mL。
8.根据权利要求1所述的稳定药物制剂，其中包含的所述甲硫氨酸的浓度为0.5mM至2mM。
9.根据权利要求1所述的稳定药物制剂，其中所述稳定药物制剂具有在3.6至4.4的范围内的氢离子浓度指数(pH)。
10.根据权利要求1所述的稳定药物制剂，其中所述稳定药物制剂用于预防或治疗选自由多发性硬化症、癌症、自身免疫疾病、病毒感染性疾病、HIV感染性疾病、丙型肝炎和类风湿性关节炎组成的群组中的疾病。
11.根据权利要求1所述的稳定药物制剂，其中所述稳定药物制剂用于口服或肠胃外施用。
12.根据权利要求1所述的稳定药物制剂，其中所述稳定药物制剂是液体或冻干制剂。
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