RU2780675C1 - Способ подтверждения структуры рекомбинантного интерферона бета-1b - Google Patents
Способ подтверждения структуры рекомбинантного интерферона бета-1b Download PDFInfo
- Publication number
- RU2780675C1 RU2780675C1 RU2021127813A RU2021127813A RU2780675C1 RU 2780675 C1 RU2780675 C1 RU 2780675C1 RU 2021127813 A RU2021127813 A RU 2021127813A RU 2021127813 A RU2021127813 A RU 2021127813A RU 2780675 C1 RU2780675 C1 RU 2780675C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- interferon beta
- recombinant interferon
- solution
- standard sample
- substance
- Prior art date
Links
- 229940077452 Recombinant interferon beta-1b Drugs 0.000 title claims abstract description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 99
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 99
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims abstract description 49
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 36
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108010005714 Interferon beta-1b Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 229960003161 interferon beta-1b Drugs 0.000 claims abstract description 6
- 229960000789 Guanidine Hydrochloride Drugs 0.000 claims abstract description 4
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N Guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 3
- VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 1,4-dimercaptobutane-2,3-diol Chemical compound SCC(O)C(O)CS VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 9
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 claims description 9
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-Methionine Natural products CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 3
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 3
- 238000005187 foaming Methods 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 47
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 10
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 abstract description 10
- 238000002156 mixing Methods 0.000 abstract description 3
- 238000005020 pharmaceutical industry Methods 0.000 abstract 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 81
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 81
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 78
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 43
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 43
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 43
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 38
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 17
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 11
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 11
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 8
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 7
- 108010051815 EC 3.4.21.19 Proteins 0.000 description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 229940088598 Enzyme Drugs 0.000 description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 4
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 4
- 229940047124 Interferons Drugs 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 108090000467 Interferon beta Proteins 0.000 description 2
- 102000003996 Interferon beta Human genes 0.000 description 2
- 229960004461 Interferon beta-1a Drugs 0.000 description 2
- 108010005716 Interferon beta-1a Proteins 0.000 description 2
- 229960001388 Interferon-beta Drugs 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating Effects 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 2
- 102000035362 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005600 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 208000002672 Hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 102100008763 IFNA2 Human genes 0.000 description 1
- 229960003507 Interferon Alfa-2b Drugs 0.000 description 1
- 108010079944 Interferon-alpha2b Proteins 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 229940076185 Staphylococcus aureus Drugs 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral Effects 0.000 description 1
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 230000001264 neutralization Effects 0.000 description 1
- -1 octadecylsilyl Chemical group 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 238000001303 quality assessment method Methods 0.000 description 1
- 101710034647 rI Proteins 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу подтверждения первичной структуры рекомбинантного интерферона бета-1b пептидным картированием. Способ подтверждения первичной структуры рекомбинантного интерферона бета-1b пептидным картированием характеризуется тем, что берут отдельно интерферон бета-1b и его стандартный образец, не содержащие белковых стабилизаторов, и одновременно проводят их гидролиз путем последовательного приливания растворов фермента эндопротеиназы Glu-C и ацетатного буфера, перемешивания и помещения в термостат, далее приливают раствор гуанидина гидрохлорида, перемешивают и добавляют раствор дитиотреитола, перемешивают и помещают в термостат, охлаждают смесь, проводят обращенно-фазовое высокоэффективное жидкостное хроматографическое разделение при УФ-детектировании, получают и сравнивают пептидные карты первичной структуры рекомбинантного интерферона бета-1b и его стандартного образца. Вышеописанный способ используется для эффективного подтверждения подлинности первичной структуры рекомбинантного интерферона бета-1b. 5 з.п. ф-лы, 10 ил., 1 табл., 8 пр.
Description
Изобретение относится к области фармации, биотехнологии, биологии, химии, медицины, в частности, к подтверждению первичной структуры рекомбинантного интерферона бета-lb пептидным картированием в лабораторной экспертизе биологических лекарственных препаратов.
Уровень техники
Интерфероны - это цитокины, которые представлены семейством белков, обладающих антивирусной, иммуномодулирующей и противоопухолевой активностью, что позволяет их отнести к полифункциональным биорегуляторам широко спектра действия. Лекарственные препараты на основе рекомбинантного интерферона бета используются в клинической практике в качестве препаратов первой линии при терапии рассеянного склероза. Основным действующим веществом данных лекарственных препаратов является рекомбинантный интерферон бета-1а или бета-lb [1, 2]. Препараты интерферона альфа-2b и альфа-2а широко применяют для лечения гепатита В, гепатита С, а также при противоопухолевой терапии.
Интерфероны бета-1а и бета-lb имеют ряд существенных структурных различий в силу особенностей технологий производства. Характер данных различий, а именно, различие молекулярных масс, отсутствие в молекуле интерферона бета-lb гликанов и Mi, замена Ci6 на Si6, носит принципиальный характер для обязательного подтверждения подлинности структуры пептидным картированием для терапевтических белков, полученных с применением технологии рекомбинантной ДНК [3,4].
Из уровня техники известен один способ подтверждения структуры с помощью пептидного картирования интерферона бета-1а в сравнении со стандартным образцом, в соответствии с которым гидролиз белка проводят с помощью эндопротеиназы LysC в 0,05М трисгидрохлоридном буферном растворе pH 9,0 [4].
Из уровня техники известен другой способ подтверждения структуры с помощью пептидного картирования интерферона альфа-2а и альфа-2b в сравнении со стандартным образцом, в соответствии с которым гидролиз белка проводят с помощью трипсина в фосфатном буферном растворе pH 8,0 [5].
В вышеописанных способах раскрыты условия хроматографического разделения: параметры колонки, длина волны детектора, режим элюирования, скорость потока подвижной фазы, температура термостата хроматографической колонки, объем пробы.
К недостатку известных способов следует отнести условия гидролиза, а именно, в нейтральной и щелочной средах происходит быстрая денатурация интерферона бета-lb, которая препятствует дальнейшему проведению испытания из-за образующегося осадка интерферона бета-1b.
Авторами было обнаружено, что в настоящее время способ пептидного картирования для подтверждения подлинности первичной структуры интерферона бета-1b отсутствует.
Прототипом заявляемого изобретения выбран способ оценки подлинности интерферона альфа-2а и альфа-1b с помощью пептидного картирования [5].
Специалисту из области техники известно, что интерферон бета-1b является негликозилированным белком, стабильным в кислой среде.
Стабильность субстанции интерферона бета-lb в одном случае достигается с использованием ацетатного буферного раствора с pH 3,7-4,3, а в другом случае - внесением стабилизатора белковой природы, что позволяет поддерживать стабильность субстанции при значениях pH 7,1-7,8, более предпочтительных для формировании парентерального лекарственного средства. Однако наличие стабилизатора белковой природы является препятствующим фактором для подтверждения подлинности структуры целевого белка (интерферона бета-lb) методом пептидного картирования, поскольку данный стабилизатор также подвержен ферментативному гидролизу и получаемая таким образом пептидная карта содержит пики, не специфичные для целевого белка (интерферона бета-lb).
Существует явная потребность в разработке способа подтверждения первичной структуры рекомбинантного интерферона бета-lb пептидным картированием, где субстанция рекомбинантного интерферона бета-lb не содержит стабилизатора белковой природы.
Описание и сущность изобретения
Технической задачей является разработка специфического, эффективного способа подтверждения первичной структуры рекомбинантного интерферона бета-lb пептидным картированием, где субстанция рекомбинантного интерферона бета-lb не содержит стабилизаторов белкового происхождения, таких как белки (протеины) или пептиды или аминокислоты.
Техническим результатом изобретения является подтверждение подлинности первичной структуры рекомбинантного интерферона бета-lb пептидным картированием в сравнении со стандартным образцом рекомбинантного интерферона бета-1b.
Достижение технического результата обеспечивается благодаря:
- эффективной концентрации раствора рекомбинантного интерферона бета-1b обеспечивающей получение пептидной карты с пиками, интенсивность которых достаточна для их визуальной и инструментальной интерпретации;
- реагентам, представляющим собой фермент для гидролиза рекомбинантного интерферона бета-lb и ацетатный буферный раствор, взятых в эффективных количественных соотношениях;
- условиям гидролиза, включающего буферный раствор, pH буферного раствора, время гидролиза, температуру гидролиза;
- использованию раствора рекомбинантного интерферона бета-lb без содержания стабилизаторов белкового происхождения (белков или пептидов или аминокислот).
Осуществление заявленного способа
Для разработки заявленного способа использовали раствор рекомбинантного интерферона бета-lb без содержания стабилизаторов белкового происхождения, таких как белки (протеины) или пептиды или аминокислот.
Рекомбинантный интерферон бета-lb, полученный технологией рекомбинантного ДНК, является негликозилированным белком, стабильным в кислой среде, с молекулярной массой около 18,5 кДа (18500 Да), не содержащий N-концевой метионин и состоящий из 165 аминокислотных остатков в следующей последовательности:
SYNLLGFLQR SSNFQSQKLL WQLNGRLEYC LKDRMNFDIP
EEIKQLQQFQ KEDAALTIYE MLQNIFAIFR QDSSSTGWNE
TIVENLLANV YHQINHLKT V LEEKLEKEDF TRGKLMSSLH
LKRYYGRILH YLKAKEYSHC AWTIVRVEIL RNFYFINRLT
GYLRN
Основой для производства лекарственных препаратов интерферона бета-lb является субстанция, представляющая собой очищенный рекомбинантный интерферон бета-lb. В настоящее время в Российской Федерации зарегистрированы две субстанции интерферона бета-lb (далее - субстанция 1 и субстанция 2). В соответствии с международными и отечественными фармакопейными требованиями оценка качества субстанции интерферона бета-lb должна включать подтверждение подлинности структуры интерферона бета-1b.
Для подтверждения подлинности первичной структуры рекомбинантного интерферона бета-lb проводят пептидное картирование с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в сравнении с его стандартным образцом.
Раствор рекомбинантного интерферона бета-lb, не содержащий стабилизаторов белкового происхождения, в виде белков или пептидов или аминокислот (далее - рекомбинантный интерферон бета-lb), берут в эффективном количестве с концентрацией рекомбинантного интерферона бета-lb не менее 0,6 мг/мл, поскольку данная концентрация интерферона бета-lb является эффективной для получения пиков, интенсивность которых приемлема для визуальной и инструментальной оценки. В случае, если раствор рекомбинантного интерферона бета-lb, не содержащий стабилизаторов белкового происхождения (белков или пептидов или аминокислот), имеет концентрацию интерферона бета-lb менее 0,6 мг/мл, то его концентрируют с помощью центрифугирования при 3800g с применением центрифужных фильтров с диаметром пор 10 кДа.
Выбор центрифужных фильтров с диаметром пор 10 кДа обусловлен тем, что молекулярная масса интерферона бета-lb составляет около 18,5 кДа.
Используемый фермент для ферментативного гидролиза представляет собой водный раствор эндопротеиназы Glu-C с концентрацией 1 мг/мл, где Эндопротеиназа Glu-C из Staphylococcus aureus V8, Sigma-Aldrich (кат № P2922).
Ацетатный буферный раствор с pH 4,50-4,57, представляет собой водную композицию, содержащую 5,7 мл 0,2М раствора уксусной кислоты и 4,3 мл 0,2М раствора натрия ацетата, где входящие компоненты смешивают между собой и при необходимости корректируют pH путем добавления 0,2М раствора уксусной кислоты или 0,2М раствора натрия ацетата.
Контрольная карта пептидного картирования применяется для определения отсутствия аутогидролиза фермента, используемого в гидролизе (см. пример 4, фиг. 10).
Для образования пептидных фрагментов рекомбинантного интерферона бета-lb проводят ферментативный гидролиз рекомбинантного интерферона бета-lb с применением раствора фермента Эндопротеиназа Glu-C с концентрацией 1 мг/мл и с заранее приготовленным ацетатным буферным раствором с pH от 4,50 до 4,57. При получении реакционной смеси для проведения ферментативного гидролиза берут эффективное количество (около 50 мкл) водного раствора рекомбинантного интерферона бета-lb без стабилизаторов белкового происхождения (белков или пептидов или аминокислот) с эффективной концентрацией не менее 0,6 мг/мл, помещают в пробирку или флакон, и далее последовательно прибавляют эффективное количество (около 3 мкл) водного раствора Эндопротеиназы Glu-C с концентрацией 1 мг/мл, а затем эффективное количество (около 20 мкл) ацетатного буферного раствора с pH от 4,50 до 4,57. Затем перемешивают и помещают в термостат при температуре 37° С и через 18 часов прибавляют 0,2 мл 6М раствора гуанидина гидрохлорида, перемешивают и прибавляют 0,007 мл 2М раствора дитиотрентола; далее полученную реакционную смесь помещают в термостат при температуре 100 °С на одну минуту, а потом выдерживают при комнатной температуре в течение около 10 минут и далее охлаждают смесь при температуре не более 8 °С в течение от 30 минут до 4-х часов (не более 4-х часов, но не менее 30 минут) не допуская образования льда и замораживания (от 0,1 °С до 8 °С).
Перемешивание и прибавление реакционных ингредиентов при проведении ферментативного гидролиза осуществляют с помощью автоматического дозатора или другого (их) предназначенного (ых) для этих манипуляций известных специалисту (ам) из данной области техники средств или устройств или способов.
Перемешивание реакционной смеси осуществляют около 30 секунд не допуская образования пены.
Специалисту из данной области техники известно, что в соответствии с требованиями Государственной Фармакопеи XIV к комнатной температуре относятся параметры не менее 15°С и не более 25 °С.
Одновременно в тех же условиях, что описаны выше, проводят ферментативный гидролиз стандартного образца рекомбинантного интерферона бета-lb, не содержащий стабилизаторов белкового происхождения (белков или пептидов или аминокислот), с эффективной концентрацией не менее 0,6 мг/мл, с молекулярной массой около 18,5 кДа, не содержащий N-концевой метионин и состоящий из 165 аминокислотных остатков и подтвержденной аминокислотной последовательностью:
SYNLLGFLQR SSNFQSQKLL W QLNGRLEY С LKDRMNFDIP
EEIKQLQQFQ KEDAALTIYE MLQNIFAIFR QDSSSTGWNE
TIVENLLANV YHQINHLKT V LEEKLEKEDF TRGKLMSSLH
LKRYYGRILH YLKAKEYSHC AWTIVRVEIL RNFYFINRLT
GYLRN (далее - стандартный образец рекомбинантного интерферона бета-lb).
Рекомбинантный интерферон бета-lb и его стандартный образец, используемые в ферментативном гидролизе для получения пептидных фрагментов не содержат стабилизаторов белкового происхождения (белков или пептидов или аминокислот).
Неожиданным образом, в ходе проведения исследования, определили, что хроматографические условия для интерферона альфа-2Ь могут быть применимы и для рекомбинантного интерферона бета-lb, так как в данных условиях можно получить разрешение пиков, приемлемое для визуальной и инструментальной оценки пептидной карты.
Пептидные фрагменты рекомбинантного интерферона бета-lb и пептидные фрагменты стандартного образца рекомбинантного интерферона бета-lb, являющиеся продуктом ферментативного гидролиза, подвергают хроматографическому разделению в режиме обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии в следующих условиях:
Хроматографическая колонка размером 100 х 4зб мм, заполненная октадецилсилил (С 18) силикагелем, диаметр частиц 5 мкм, размер пор 300А.
Подвижная фаза А: доводят 1 мл трифторуксусной кислоты до 1000 мл водой очищенной.
Подвижная фаза В : к 1 мл трифторуксусной кислоты прибавляют воду до 100 мл и доводят объем до 1000 мл ацетонитрилом.
Программа градиента:
| Интервал, мин | Подвижная фаза А, % об./об. | Подвижная фаза В, % об./об. |
| 0→8 | 100 | 0 |
| 8→68 | 100→40 | 0→60 |
| 68→72 | 40 | 60 |
| 72→75 | 40→100 | 60→0 |
| 75→80 | 100 | 0 |
Скорость потока 1 мл/мин
Температура колонки (30 ± 1)°С
Объем пробы 100 мкл
УФ-детектирование (ультрафиолетовое детектирование) проводят при длине волны 214 нм.
В результате высокоэффективного жидкостного хроматографического разделения пептидных фрагментов рекомбинантного интерферона бета-lb и пептидных фрагментов стандартного образца рекомбинантного интерферона бета-lb, получают пептидные карты, характеризующие первичную структуру рекомбинантного интерферона бета-1b.
Пептидная карта представляет собой хроматографический профиль распределения пептидных фрагментов индивидуальных для каждого белка (продуктов ферментативного гидролиза молекулы белка), поскольку характер гидролиза и, следовательно, состав пептидных фрагментов, зависит от исходной структуры и аминокислотной последовательности белка.
Хроматографический профиль распределения пептидов имеет вид пиков, каждый из которых соответствует исследуемому пептиду - фрагменту исходной молекулы белка, полученному в результате его (белка) специфического ферментативного гидролиза.
Профиль пептидной карты испытуемого образца должен совпадать с профилем пептидной карты стандартного образца.
Краткое описание чертежей и иных материалов (Приложения 1 -7)
Фиг.1. Типичная пептидная карта рекомбинантного интерферона бета-1b содержащего стабилизаторов белкового происхождения (белков, пептидов или аминокислот) (субстанции 1) при pH 4,50;
Фиг.2. Типичная пептидная карта рекомбинантного интерферона бета-lb не содержащего стабилизаторов белкового происхождения (белков, пептидов или аминокислот) (субстанции 2) при pH 4,50.
Фиг 3. Типичная пептидная карта стандартного образца рекомбинантного интерферона бета-lb не содержащего стабилизаторов белкового происхождения (белков, пептидов или аминокислот) при pH 4,50.
Фиг. 4. Типичная пептидная карта рекомбинантного интерферона бета-lb содержащего стабилизаторов белкового происхождения (белков, пептидов или аминокислот) (субстанции 1) при pH 4,54.
Фиг 5. Типичная пептидная карта рекомбинантного интерферона бета-1b содержащего стабилизаторов белкового происхождения (белков, пептидов или аминокислот) (субстанции 2) при pH 4,54.
Фиг 6. Типичная пептидная карта стандартного образца рекомбинантного интерферона бета-lb содержащего стабилизаторов белкового происхождения (белков, пептидов или аминокислот) при pH 4,54.
Фиг 7. Типичная пептидная карта рекомбинантного интерферона бета-1b содержащего стабилизаторов белкового происхождения (белков, пептидов или аминокислот) (субстанции 1) при pH 4,57
Фиг 8. Типичная пептидная карта рекомбинантного интерферона бета-1b содержащего стабилизаторов белкового происхождения (белков, пептидов или аминокислот) (субстанции 2) при pH 4,57
Фиг 9. Типичная пептидная карта стандартного образца рекомбинантного интерферона бета-lb содержащего стабилизаторов белкового происхождения (белков, пептидов или аминокислот) при pH 4,57.
Фиг. 10 Контрольная пептидная карта без рекомбинантного интерферона бета-1b при эффективном pH от 4,50 до 4,57
Возможность осуществления заявляемого изобретения раскрыта в следующих примерах.
Пример 1.
Способ подтверждения первичной структуры рекомбинантного интерферона бета- lb в субстанции 1 и в субстанции 2 не содержащих стабилизаторов белкового происхождения (белков или пептидов или аминокислот) в сравнении со стандартным образцом рекомбинантного интерферона бета-lb не содержащим стабилизаторов белкового происхождения (белков или пептидов или аминокислот) при pH 4,50.
Для образования пептидных фрагментов рекомбинантного интерферона бета-lb и его стандартного образца: берут по отдельности эффективное количество (около 50 мкл) рекомбинантного интерферона бета-lb с концентрацией 0,6 мг/мл без стабилизаторов белкового происхождения в виде белков, пептидов или аминокислот (субстанция 1), эффективное количество (около 50 мкл) рекомбинантного интерферона бета-lb с концентрацией 0,6 мг/мл без стабилизаторов белкового происхождения в виде белков, пептидов или аминокислот (субстанции 2), эффективное количество (около 50 мкл) стандартного образца рекомбинантного интерферона бета-lb без стабилизаторов белкового происхождения в виде белков, пептидов или аминокислот (стандартный образец), где субстанция 1 и субстанция 2 и стандартный образец, представляют собой водные растворы; затем к каждой субстанции и стандартному образцу прибавляют последовательно эффективное количество (около 3 мкл) водного раствора Эндопротеиназы Glu-C с концентрацией 1 мг/мл, а затем эффективное количество (около 20 мкл) ацетатного буферного раствора с pH 4,50, затем перемешивают и помещают в термостат при температуре 37 °С на 18 часов, а затем в каждую пробирку прибавляют по 0,2 мл 6М раствора гуанидина гидрохлорида, перемешивают и прибавляют в каждую пробирку по 0,007 мл 2М раствора дитиотрентола; далее полученную реакционную смесь перемешивают и помещают в термостат при температуре 100 °С на одну минуту и затем выдерживают при комнатной температуре около 10 минут и далее охлаждают в течение не более 4-х часов, но не менее 30 минут, при температуре не более 8°С, не допуская образования льда и замораживания.
Перемешивание и прибавление реакционных ингредиентов при проведении ферментативного гидролиза осуществляют с помощью автоматического дозатора или другого (их) предназначенного (ых) для этих манипуляций известных специалисту из данной области техники средств или устройств или способов.
Перемешивание реакционной смеси при проведении ферментативного гидролиза осуществляют около 30 секунд не допуская образования пены.
Специалисту из данной области техники известно, что в соответствии с требованиями Государственной Фармакопеи XIV к комнатной температуре относятся параметры не менее 15°С, но не более 25 °С.
Далее продукты ферментативного гидролиза (образовавшиеся пептидные фрагменты) подвергают хроматографическому разделению и дальнейшему сравнению полученных пептидных карт.
Типичная пептидная карта субстанции 1, субстанции 2 и стандартного образца, полученные в описанных выше условиях при pH 4,50, представлены на фиг.1, фиг.2, фиг.З. Времена удерживания пиков субстанции 1, субстанции 2 и стандартного образца представлены в таблице 1.
Данным примером подтверждено, что заявленный технический результат достигается в заявленном способе: раствор рекомбинантного интерферона бета-lb без стабилизаторов белковой природы (белков или пептидов или аминокислот) взятый в эффективной концентрации, подвергнутый ферментативному гидролизу при pH 4,50 и последующему хроматографическому разделению позволяет получить специфичную пептидную карту совпадающую при визуальной оценке с пептидной картой стандартного образца рекомбинантного интерферона бета-lb без стабилизаторов белковой природы (белков или пептидов или аминокислот) полученной в тех же условиях.
Пример 2.
Способ подтверждения первичной структуры рекомбинантного интерферона бета-lb в субстанции 1 и в субстанции 2 не содержащих стабилизаторов (белков или пептидов или аминокислот) в сравнении со стандартным образцом рекомбинантного интерферона бета-lb не содержащим стабилизаторов (белков или пептидов или аминокислот) при pH 4,54. Способ осуществляют как описано в примере 1 при охлаждении смеси 30 мин.
Типичная пептидная карта субстанции 1, субстанции 2 и стандартного образца, полученные в данных условиях, представлены на фиг.4, фиг.5, фиг.6. Времена удерживания пиков субстанции 1, субстанции 2 и стандартного образца представлены в таблице 1.
Данным примером подтверждено, что заявленный технический результат достигается в заявленном способе: раствор рекомбинантного интерферона бета-lb без стабилизаторов белковой природы (белков или пептидов или аминокислот) взятый в эффективной концентрации, подвергнутый ферментативному гидролизу при pH 4,54 и последующему хроматографическому разделению позволяет получить специфичную пептидную карту совпадающую при визуальной оценке с пептидной картой стандартного образца рекомбинантного интерферона бета-lb без стабилизаторов белковой природы (белков или пептидов или аминокислот) полученной в тех же условиях.
Пример 3.
Способ подтверждения первичной структуры рекомбинантного интерферона бета-lb в субстанции 1 и в субстанции 2 не содержащих стабилизаторов (белков или аминокислот) в сравнении со стандартным образцом рекомбинантного интерферона бета-lb не содержащим стабилизаторов (белков или пептидов или аминокислот) при pH 4,57. Способ осуществляют как описано в примере 1 при охлаждении смеси 4 часа.
Типичная пептидная карта субстанции 1, субстанции 2 и стандартного образца, полученные в данных условиях, представлены на фиг.7, фиг.8, фиг.9. Времена удерживания пиков субстанции 1, субстанции 2 и стандартного образца представлены в таблице 1.
Данным примером подтверждено, что заявленный технический результат достигается в заявленном способе: раствор рекомбинантного интерферона бета-lb без стабилизаторов белковой природы (белков или пептидов или аминокислот) взятый в эффективной концентрации, подвергнутый ферментативному гидролизу при pH 4,57 и последующему хроматографическому разделению позволяет получить специфичную пептидную карту совпадающую при визуальной оценке с пептидной картой стандартного образца рекомбинантного интерферона бета-lb без стабилизаторов белковой природы (белков или пептидов или аминокислот) полученной в тех же условиях.
Пример 4.
Эффективность конечной концентрации Эндопротеиназы Glu-C подтверждается отсутствием аутогидролиза используемого фермента: высокоэффективное хроматографическое разделение продуктов ферментативного гидролиза холостой пробы, где вместо эффективного количества (около 50 мкл) рекомбинантного интерферона бета-lb брали 50 мкл ацетатного буферного раствора с эффективным pH 4,5-4,57. Далее проводили анализ в соответствии с описываемым способом в примере 1 или примере 2 или примере 3.
Таким образом, данный пример подтверждает отсутствие пептидных фрагментов, что демонстрирует контрольная пептидная карта (фиг. 10).
Пример 5
Взяли раствор рекомбинантного интерферона бета-lb не содержащий стабилизаторов белкового происхождения (белков, пептидов или аминокислот) с известной исходной концентрацией. Если концентрация интерферона бета-lb менее 0,6 мг/мл, то далее его концентрируют с помощью центрифугирования при 3800g с применением центрифужных фильтров с диаметром пор 10 кДа до концентрации интерферона бета-lb не менее 0,6 мг/мл. Конечную концентрацию интерферона бета-lb определяют исходя из значения исходной концентрации и пропорционального уменьшения объема взятого раствора.
Далее заявленный способ осуществляют, как описано в примере 1 или примере 2 или примере 3.
Пример 6.
С целью подтверждения специфичности и стабильности результатов (прецизионности) заявленного способа были проведены шесть независимых испытаний субстанции 1 рекомбинантного интерферона бета-lb не содержащей стабилизаторов белковой природы (белков, пептидов или аминокислот), субстанции 2 рекомбинантного интерферона бета-lb не содержащей стабилизаторов белковой природы (белков, пептидов или аминокислот) и стандартного образца рекомбинантного интерферона бета-lb не содержащего стабилизаторов белковой природы (белков, пептидов или аминокислот). В результате анализа пептидных карт были выбраны семь характеристических пиков, как наиболее интенсивных, хорошо разрешенных, симметричных пиков со стабильным временем удерживания (см. таб. 1)
Пример 7.
Специфичность заявленного способа оценивали путем визуального сравнительного анализа пептидных карт субстанции 1 рекомбинантного интерферона бета-lb не содержащей стабилизаторов белковой природы (белков, пептидов или аминокислот) и субстанции 2 рекомбинантного интерферона бета-lb не содержащей стабилизаторов белковой природы (белков, пептидов или аминокислот) с пептидными картами стандартного образца рекомбинантного интерферона бета-lb не содержащей стабилизаторов белковой природы (белков, пептидов или аминокислот). Было установлено, что общий профиль пептидных карт субстанции 1 рекомбинантного интерферона бета-lb не содержащей стабилизаторов белковой природы (белков, пептидов или аминокислот) и субстанции 2 рекомбинантного интерферона бета-lb не содержащей стабилизаторов (белковой природы (белков, пептидов или аминокислот) и времена удерживания семи характеристических пиков совпадают с общим профилем пептидных карт и временами удерживания семи характеристических пиков стандартного образца рекомбинантного интерферона бета-lb не содержащего стабилизаторов белковой природы (белков, пептидов или аминокислот) (фиг. 1-9).
Пример 8.
Прецизионность оценивали путем вычисления коэффициента вариации времени удерживания каждого из семи характеристических пиков (таблица 1).
| Таблица 1. Оценка прецизионности заявленного способа. | ||||||||
| Испытуемый образец | рН | Время удерживания, мин | ||||||
| пик 1 | пик 2 | пик 3 | пик 4 | пик 5 | пик 6 | пик 7 | ||
| Субстанция №1 |
4,50 | 27,23 | 30,35 | 42,76 | 45,14 | 49,11 | 52,88 | 55,56 |
| 27,05 | 30,17 | 42,51 | 44,88 | 48,84 | 52,60 | 55,26 | ||
| 4,54 | 27,06 | 30,22 | 42,62 | 44,99 | 48,93 | 52,73 | 55,40 | |
| 27,03 | 30,08 | 42,45 | 44,75 | 48,68 | 52,45 | 55,14 | ||
| 4,57 | 27,01 | 30,17 | 42,60 | 44,96 | 48,92 | 52,71 | 55,39 | |
| 27,05 | 30,11 | 42,58 | 44,87 | 48,80 | 52,59 | 55,30 | ||
| Субстанция №2 | 4,50 | 27,03 | 30,17 | 42,58 | 44,95 | 48,92 | 52,72 | 55,40 |
| 27,06 | 30,17 | 42,53 | 44,89 | 48,84 | 52,61 | 55,26 | ||
| 4,54 | 27,07 | 30,22 | 42,61 | 44,98 | 48,93 | 52,70 | 55,38 | |
| 26,93 | 30,03 | 42,41 | 44,74 | 48,69 | 52,47 | 55,13 | ||
| 4,57 | 26,99 | 30,07 | 42,49 | 44,79 | 48,77 | 52,57 | 55,24 | |
| 27,08 | 30,21 | 42,59 | 44,96 | 48,91 | 52,73 | 55,40 | ||
| Стандартный образец | 4,50 | 26,97 | 30,07 | 42,44 | 44,75 | 48,71 | 52,48 | 55,16 |
| 27,02 | 30,10 | 42,51 | 44,81 | 48,79 | 52,55 | 55,26 | ||
| 4,54 | 27,40 | 30,44 | 42,41 | 44,71 | 48,56 | 52,25 | 54,87 | |
| 27,11 | 30,24 | 42,63 | 44,99 | 48,94 | 52,72 | 55,40 | ||
| 4,57 | 27,06 | 30,20 | 42,61 | 44,97 | 48,92 | 52,70 | 55,39 | |
| 27,39 | 30,44 | 42,46 | 44,76 | 48,62 | 52,33 | 54,95 | ||
| Среднее арифметическое (n=18) | -- | 27,09 | 30,19 | 42,54 | 44,88 | 48,83 | 52,60 | 55,27 |
| Стандартное отклонение | -- | 0,13 | 0,12 | 0,09 | 0,12 | 0,14 | 0,16 | 0,17 |
| Коэффициент вариации, % | -- | 0,48 | 0,39 | 0,22 | 0,27 | 0,28 | 0,30 | 0,31 |
Из данных, представленных в таблице 1, следует, что прецизионность метода, оцениваемая по коэффициенту вариации, составило не более 0,5%.
Выше изложенное изобретение описано довольно подробно, с целью ясности понимания, и не должно рассматриваться, как ограничивающее объем притязаний.
Представленные примеры не ограничивают объем притязаний настоящего изобретения и служат только для цели иллюстрации и раскрытия заявленного способа.
Промышленная применимость
Все приведенные примеры, подтверждают эффективность и специфичность заявленного способа.
Таким образом, поставленная техническая задача, а именно, разработка эффективного и специфичного способа подтверждения первичной структуры рекомбинантного интерферона бета-lb без содержания стабилизаторов (белков или пептидов или аминокислот), достигнута, что подтверждается приведенными примерами.
Применение в фармации, биотехнологии, биологии, химии, медицине, заявленного способа является эффективным и специфичным.
Список литературы
1. EMA/CHMP/BMWP/652000/2010 «Guidline on similar biological medicinal products containing interferon beta».
2. Zettl U.K., Hecker М., Aktas O., et al. Interferon P-la and P-lb for patients with multiple sclerosis: updates to current knowledge. Expert Rev Clin Immunol. 2018; 14(2): 137-153.
3. Патент на изобретение № 2473696 (заявка № 2011129033 от 14.07.2011).
4. Европейская Фармакопея 01/2009:1639 «Interferon beta-la concentrated solution».
5. Европейская Фармакопея, Монография 07/2015:1110 «Interferon Alfa-2 Concentrated Solution»
6. О.Б. Устинникова, JI.А. Гайдерова, М.Л. Байкова, Т.Н. Лобанова, И.М. Щербаченко, Е.О.Голощапова, В.П. Бондарев. Обзор методических подходов к оценке качества лекарстенных средств на основе рекомбинантных интерферонов. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2017. Т.17. №3. с.152-155.
Claims (6)
1. Способ подтверждения первичной структуры рекомбинантного интерферона бета-1b пептидным картированием, характеризующийся тем, что берут отдельно интерферон бета-1b 50 мкл в концентрации 0,6 мг/мл и его стандартный образец, не содержащие белковых стабилизаторов, и одновременно проводят их гидролиз путем последовательного прибавления 3 мкл раствора фермента эндопротеиназы Glu-C с концентрацией 1 мг/мл, 20 мкл ацетатного буферного раствора рН 4,50-4,57, перемешивают и помещают в термостат при температуре 37°C на 18 часов, прибавляют 0,2 мл 6М раствора гуанидина гидрохлорида, перемешивают и добавляют 0,007 мл 2М раствора дитиотреитола, перемешивают и помещают в термостат при температуре 100°C на 1 мин, где перемешивание проводят без образования пены в течение 30 секунд, выдерживают при комнатной температуре в течение 10 минут, охлаждают смесь не более 4 часов, но не менее 30 минут при температуре не более 8°C, не допуская образования льда и замораживания, далее проводят обращенно-фазовое высокоэффективное жидкостное хроматографическое разделение при УФ-детектировании, где подвижная фаза А представляет собой 1 мл трифторуксусной кислоты, разведенной 1000 мл водой, и где подвижная фаза В представляет собой 1 мл трифторуксусной кислоты, разведенной водой до 100 мл и доведенной до объема 1000 мл ацетонитрилом, далее получают и сравнивают пептидные карты первичной структуры рекомбинантного интерферона бета-1b и его стандартного образца.
2. Способ по п. 1, дополнительно характеризующийся тем, что молекулярная масса рекомбинантного интерферона бета-1b составляет 18,5 кДа.
3. Способ по п. 2, дополнительно характеризующийся тем, что рекомбинантный интерферон бета-1b не содержит N-концевой метионин.
4. Способ по п. 2 или 3, дополнительно характеризующийся тем, что рекомбинантный интерферон бета-1b состоит из 165 аминокислотных остатков.
5. Способ по п. 1, дополнительно характеризующийся тем, что ацетатный буферный раствор представляет собой композицию, состоящую из 0,2М раствора уксусной кислоты и 4,3 мл 0,2М раствора натрия ацетата.
6. Способ по п. 1, дополнительно характеризующийся тем, что УФ-детектирование проводят при длине волны 214 нм.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2780675C1 true RU2780675C1 (ru) | 2022-09-28 |
Family
ID=
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Европейская Фармакопея, Монография 07/2015:1110 "Interferon Alfa-2 Concentrated Solution" https://file.wuxuwang.com/yaopinbz/EP9/EP9.0_02__830.pdf. ГОЛОЩАПОВА Е.О. и др. Рекомбинантные интерфероны бета-1а и бета-1b: особенности структуры белка и проблемные вопросы подтверждения ее подлинности. Химико-фармацевтический журнал. Том 52, N 8, 2018, стр. 61-64, https://doi.org/10.30906/0023-1134-2018-52-8-61-64. УСТИННИКОВА О.Б. и др. Обзор методических подходов к оценке качества лекарственных средств на основе рекомбинантных интерферонов. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2017. Т.17. N 3. с.152-155. УСТИННИКОВА О.Б. и др. Разработка порядка аттестации стандартного образца метиониновой формы интерферона альфа-2b для подтверждения подлинности методом пептидного картирования. Медицинская иммунология 2018, Т. 20, N 4, стр. 543-550. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2020203183B2 (en) | C1-inh compositions and methods for the prevention and treatment of disorders associated with c1 esterase inhibitor deficiency | |
| Morgenstern et al. | Effect of PEG molecular weight and PEGylation degree on the physical stability of PEGylated lysozyme | |
| EA011586B1 (ru) | Новый карбамилированный еро и способ его получения | |
| Yamniuk et al. | Application of a kosmotrope-based solubility assay to multiple protein therapeutic classes indicates broad use as a high-throughput screen for protein therapeutic aggregation propensity | |
| KR20090089881A (ko) | 액체 항-광견병 항체 조성물 | |
| Naicker et al. | A UHPLC–MS/MS method for the simultaneous determination of piperacillin and tazobactam in plasma (total and unbound), urine and renal replacement therapy effluent | |
| JP2021508711A (ja) | Ａｐｌ型ペプチドを含む医薬組成物 | |
| RU2780675C1 (ru) | Способ подтверждения структуры рекомбинантного интерферона бета-1b | |
| CN104546702B (zh) | 重组人脑利钠肽注射剂及其制备方法 | |
| DE4221836A1 (de) | Das biochemisch aufgereinigte Mistel-Lektin (ML-1) als therapeutisch anwendbarer Immunmodulator | |
| Jeong et al. | Proteomic analysis of differently expressed proteins in a mouse model for allergic asthma | |
| Eng et al. | Formulation development and primary degradation pathways for recombinant human nerve growth factor | |
| CN113613675A (zh) | TACI-Fc融合蛋白药物制剂 | |
| CN109498565B (zh) | 一种稳定的抗pd-1抗体制剂及其用途 | |
| MXPA02000190A (es) | Preparacion de una composicion terapeutica. | |
| Vorob’ev et al. | Physicochemical properties, toxicity, and specific activity of a follitropin alpha biosimilar | |
| Braun et al. | Interaction of the vitamin D‐binding protein (groupspecific component) and its ligand 25‐hydroxyvitamin D3: Binding differences of the various genetic types disclosed by isoelectric focusing | |
| Mirzaei et al. | Enhancement of the stability of human growth hormone by using tris (hydroxymethyl) aminomethane: molecular docking and experimental analysis | |
| CN103536898B (zh) | 胸腺五肽药物组合物 | |
| CN107058269B (zh) | 药用激肽原酶及其制备方法和应用 | |
| JP2548822B2 (ja) | マカラスムギ由来の糖タンパク質、その製造法及びそれを含有する免疫調節剤 | |
| Dibiase et al. | The design of analytical methods for use in topical epidermal growth factor product development | |
| JP2002516087A (ja) | 幾つかの重篤な疾患の治療のための医薬組成物を調製するための修飾されたリゾチームｃの使用 | |
| Salamat-Miller et al. | Development of protein-specific analytical methodologies to evaluate compatibility of recombinant human (rh) IGF-1/rhIGFBP-3 with intravenous medications co-administered to neonates | |
| Biswas et al. | Development and Validation of a Stability-Indicating Method for Bone Morphogenetic Protein-2 |