JP2002507995A - ポテト塊茎からのプロテイナーゼインヒビタータンパク質の単離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 熱安定性プロテイナーゼインヒビタータンパク質を、ポテト塊茎のような植物組織から迅速かつ簡単に単離する方法が開示される。本方法は３つの工程を包含する。ポテト塊茎由来のタンパク質は、水性／アルコール抽出媒体において抽出されて、アルコール抽出物を生成する。アルコール抽出物は、第１の温度まで加熱され、次いで第２の温度まで冷却されて、細片を含む不溶性の沈澱物相と熱安定性プロテイナーゼインヒビタータンパク質を含む可溶性相とを生成する。熱安定性プロテイナーゼインヒビタータンパク質は、適切な透析媒体に対する透析によって可溶性相から沈澱される。沈澱されたタンパク質は、単一のインヒビタータンパク質、またはその混合物を含み得る。

Description

【発明の詳細な説明】 ポテト塊茎からのプロテイナーゼインヒビタータンパク質の単離方法 技術分野 本発明は一般的には、植物組織からのプロテイナーゼインヒビタータンパク質 の単離方法に関し、そしてより詳細には、ポテト塊茎からの熱安定性プロテイナ ーゼインヒビタータンパク質の単離に関する。 発明の背景 ポテトのようなナス科植物からの塊茎は、プロテイナーゼインヒビタータンパ ク質の広範なクラスの豊富な供給源である。これらのタンパク質の多くが、昆虫 および哺乳動物の両方において天然に存在する、トリプシンおよびキモトリプシ ンのような消化性プロテイナーゼの活性を阻害する。天然の消化プロセスを妨害 することによって、プロテイナーゼインヒビターは、草食動物による採集に対す る植物の天然の防御の一部を生成する。同じ理由によって、プロテイナーゼイン ヒビターは、アリ（fire ant）のような昆虫の制御についての害虫制御産業にお ける適用を有する。さらに、これらはヒト消化性プロテイナーゼをもまた阻害す るので、これらのインヒビターは肥満および糖尿病の制御についての製薬産業に おいて価値を有する。 ポテト塊茎は、プロテイナーゼインヒビターの研究および調製物の主要な供給 源である。ポテト塊茎に存在するいくつかのプロテイナーゼインヒビターは、熱 安定性の種である。これらの中に、トリプシンおよびキモトリプシンの両方を阻 害し、約20および20.5kDのサブユニット分子量（Mr）を有する、２つのクーニッ ツ型プロテイナーゼインヒビターがある（WalshおよびTwichell、Plant Physiol ．97:15-18，1991）。より小さいタンパク質はキモトリプシンの強力なインヒビ ターであり、そしてトリプシンの弱いインヒビターである。より大きいタンパク 質は、トリプシンの強力なインヒビターである。他の熱安定性プロテイナーゼイ ンヒビターは、約9.5kDのサブユニット分子量を有するもの（プロテイナーゼイ ンヒビターＩと名付けられている）を含み、これはキモトリプシンの強力なイン ヒビターであり（MelvilleおよびRyan、J．Biol．Chem．247:3445-3453，1972） 、さらに、約10.5kDのサブユニット分子量を有する別のもの（プロテイナーゼイ ンヒビターIIと名付けられている）を含み、これはキモトリプシンおよびトリプ シンの両方の強力なインヒビターである（Bryant，Green，およびRyan、Biochem istry 15:3418-3424，1976）。 これらの熱安定性プロテイナーゼインヒビターの以前の調製方法は、以下の工 程：ジチオン酸塩の存在下での抽出、熱処理、硫酸アンモニウム沈澱、およびク ロマトグラフィーを含む、多数の工程を組み込んでいた（WalshおよびTwichell 、Plant Physiol．97:15-18，1991;MelvilleおよびRyan、J．Biol．Chem．247:3 445-3453，1972;Bryant，GreenおよびRyan，Biochemistry 15:3418-3424，1976; RyanおよびKassell、Methods in Enz．XIX:883-889，1970;PearceおよびRyan、A nal．Biochem．130:223-225，1983）。残念ながら、これらの方法は厄介で、手 間がかかり、時間を浪費し、高価で、そして熱安定性プロテイナーゼインヒビタ ーを相対的に低収率でしか産生しない。主要な問題は、最初の抽出物が、乏しい 流動特性を有するペースト状のホモジネートを生成し、続く処理の工程、とりわ けろ過、硫酸アンモニウム沈澱、および再可溶化に困難さを生ずることである。 ペースト状の粘稠度は、ときには、続く工程の間に、とくに大規模抽出において 加圧ろ過の使用を必要とする（RyanおよびKassell、1970）。さらに、ペースト 状の粘稠度は、ペーストからの物質の完全な回収の困難さにより、収率を減少さ せる。以前のこれらの方法はまた、それらが遂行のために熟練した労働を必要と し、そしてしばしば完了までに数日を要するので不利である。 従って、当該分野において、ペースト状の抽出物の問題を克服し、硫酸アンモ ニウム沈澱の必要性を除去し、迅速で、安価で、行うのが単純で、そして実験室 スケールから大規模工業プロセスにいたるまで、任意のスケールで達成するのが 容易である、植物組織、特にポテト塊茎からのプロテイナーゼインヒビターを単 離する方法の必要性が存在する。本発明は、これらの必要性を満たし、そして他 の関連する利点を提供する。 発明の要旨 手短にいえば、本発明は、熱安定性プロテイナーゼインヒビタータンパク質を 、当該タンパク質を含む植物組織（特にポテト塊茎）から、迅速かつ単純に単離 する方法に関する。本方法は３つの工程を含む。第１に、ポテト塊茎からのタン パク質は、水性／アルコール抽出媒体（例えば、希ギ酸および20％エタノール） で可溶型で抽出される。抽出媒体中のエタノールの存在は、それがない場合での ペースト状ホモジネートを、操作するのが容易で、そして特にろ過が容易である 滑らかな流動性のアルコール抽出液に変換させる。第２に、アルコールは、第１ の温度まで加熱され、次いで第２の温度まで冷却される。アルコールの存在下の 加熱によって、アルコール抽出液中の所望でないタンパク質の大部分は変性し、 そして続く冷却により細片（debris）を構成する沈澱物相および熱安定性プロテ イナーゼインヒビタータンパク質を含む可溶性相の形成に導く。第３に、熱安定 プロテイナーゼインヒビタータンパク質は、適切な透析媒体（例えば、希ギ酸、 または水、次いで希ギ酸）に対する透析によって可溶性相から沈澱される。沈澱 されたタンパク質は、単一のインヒビタータンパク質（プロテイナーゼインヒビ ターII）であるか、またはプロテイナーゼインヒビターIIおよび２つのクーニッ ツプロテイナーゼインヒビター（１つはトリプシンに対して最も活性であり、他 方はキモトリプシンに対して最も活性である）の混合物であり得る。沈澱したプ ロテイナーゼインヒビタータンパク質は、もともと塊茎に存在する、他のタンパ ク質および他の構成成分の大部分を含まない。 沈澱したタンパク質が単一のインヒビターから構成されるか、またはインヒビ ターの混合物から構成されるかは、単一の改変によって決定される。この改変は 、変性工程のために選択される過熱温度に関する。単一のインヒビターは、70℃ まで加熱すること、50℃まで冷却すること、そして続いて0.22％ギ酸に対する透 析において得られ得る。インヒビター混合物は、50℃まで加熱すること、室温ま で冷却すること、次いで水に対する透析であって、ここで水透析に続いてさらに 0.88％までのギ酸が添加される透析によって得られ得る。 以前の方法に必要とされた数日と比較して、透析時間を除外した全体の方法は １時間より少ない時間で行われ得る。本方法は単純であり、熟練していない技術 者によって行われ得、そしていかなるスケールでの実行も受け入れられる。本方 法は、高価な硫酸アンモニウムおよびクロマトグラフィー工程の使用を避け、そ してエタノールさえ回収され得、これは本方法の処理コストをさらに下げる。本 方法は、１ポンド（約454ｇ）のポテトから300mgの実質的に純粋なプロテイナー ゼインヒビタータンパク質を産生し得、これは以前の方法を使用しての、100ポ ンドのポテトからの、より純粋でないタンパク質の150mg収量に対して、非常に 優れている。 本発明のこれらのおよび他の局面は、下記の詳細な説明および図面の参照にお いて明白である。 図面の簡単な説明 図１は、本発明に従って調製された、透析前の代表的な熱処理した水性／アル コール抽出物のHPLC分析である。 図２は、本発明に従って調製された、第１の、透析後の、プロテイナーゼイン ヒビタータンパク質混合物のHPLC分析である。 図３は、本発明に従って調製された、第１のプロテイナーゼインヒビタータン パク質混合物のゲル電気泳動分析を図示する。 図４は、本発明に従って調製された、第１のプロテイナーゼインヒビタータン パク質混合物のプロテイナーゼインヒビター活性を図示する。 図５は、本発明に従って調製された、第２のプロテイナーゼインヒビタータン パク質混合物のプロテイナーゼインヒビター活性を図示する。 図６は、本発明に従って調製された、第２のプロテイナーゼインヒビタータン パク質混合物のHPLC分析である。 図７は、本発明に従って調製された、第２のプロテイナーゼインヒビタータン パク質混合物のゲル電気泳動分析を図示する。 発明の詳細な説明 上記で述べたように、本発明は、熱安定性プロテイナーゼインヒビタータンパ ク質を含む植物組織からの、１つ以上の当該タンパク質の単離に関する。ポテト 塊茎は、特によく研究されている植物組織であり、いくつかのクラスの熱安定性 プロテイナーゼインヒビターを豊富に含むことが公知である。それゆえに、本発 明の１つの実施態様において、ポテト塊茎からの熱安定性プロテイナーゼインヒ ビタータンパク質の単離の方法が開示される。この方法が、インヒビターが熱安 定性であり、そしてアルコールおよび水を含む溶液中に可溶性である場合、他の 植物組織からの他のプロテイナーゼインヒビターの抽出に適用され得ることも、 当業者には明らかである。ポテト塊茎に加えて、代表的な組織は、サツマイモま たはキャッサバの塊茎、ポテト、トマト、および豆の葉および果実、すべての植 物種の種子、ならびにプロテイナーゼインヒビター遺伝子を発現する、遺伝子操 作された生物を含むが、これらに限定されない。 本発明の実施において、植物組織からプロテイナーゼインヒビタータンパク質 を調製する方法は、３つの工程を含む。 第１の工程において、タンパク質は、水性／アルコール抽出媒体中で組織から 抽出され、アルコール抽出物を得る。「抽出」は、植物組織の細胞構造を破壊し て、抽出媒体内に細胞内容物を放出させそして可溶化することをいう。抽出の最 初の工程は、当該分野で一般的に「ホモジナイゼーション」として知られており 、これは破壊的で機械的なプロセス（例えば、粉砕、研磨、混合、超音波処理、 または他の技術）であり得る。本発明において、抽出媒体は水性部分およびアル コール部分を有する溶液からなる。水性部分は、理想的には、優先的にプロテイ ナーゼインヒビターを可溶化するが、同時に組織から放出された所望でないタン パク質および他の高分子の沈澱を促進するものから選択されるべきである。酸性 溶液および高濃度の塩（0.3Mより高い）を含む溶液は、タンパク質および核酸の ような多くの高分子を沈澱させる傾向を有するが、しかるにいくつかのプロテイ ナーゼインヒビターは同じ溶液に可溶性である。それゆえに、本発明の１つの実 施態様では、希ギ酸および高濃度の塩からなる水性部分を使用する。アルコール もまた、高分子を沈澱させる傾向を有し、そして本発明は、いくつかのプロテイ ナーゼインヒビターがアルコールを含む溶液中に可溶性で残存することを開示す る。それゆえ抽出媒体はまた、アルコール部分を含む。アルコールは、植物組織 のホモジナイゼーションの間または後で、結果を実質的に変えることなく、抽出 媒体 の水性部分に添加され得る。本明細書中に開示される実施態様において、アルコ ールは、ホモジナイゼーションプロセスの間に、水性溶液に添加される。 エタノールは、本明細書に記載の好ましい実施態様において、約20％v/vで使 用される。しかし、他のアルコール（メタノール、プロパノール、またはフェノ ールを含むが、これらに限定されない）ならびに他の水混和性有機物で代替され 得る。代替アルコールは、種々の濃度において種々のアルコールを含む媒体を使 用して、植物組織を抽出することによって評価され得る。細片を遠心分離後、上 清中のタンパク質レベルおよび特異的なプロテイナーゼインヒビター活性の測定 は、最も高い比活性を産生するアルコールのタイプおよび濃度を決定する。 最初のホモジネートは、希ギ酸および塩の溶液中で調製され得る。例えば、ポ テト塊茎は、約0.2％ギ酸および0.3M NaClの最終濃度を有する媒体中でブレンダ ー中でホモジナイズし得る。エタノールを、ホモジナイゼーションプロセスの間 に添加する。この様式におけるエタノールの添加は、ポテト塊茎から調製される 抽出物にとって特に有用である。なぜなら、エタノールは、ホモジネートの粘稠 度を、濃厚なデンプン性のペーストから、滑らかな流動性のアルコール抽出物へ と変化させるからである。このことは、荒い細片の除去のような、アルコール抽 出物の続く操作を容易にする。本明細書中に記載される実施態様において、細片 は、チーズクロスを通して、アルコール抽出物を絞ることによって除去される。 細片の除去を達成するための他の方法は、遠心分離、珪藻土のような天然の物質 を通すろ過、合成フィルターを通すろ過、篩目を通しての押し出しおよび他の技 術を含むが、これらに限定されない。 第２の工程において、アルコール抽出物は第１の温度まで加熱され、次いで第 ２の温度まで冷却される。この操作は、抽出物中に存在する多くの所望でないタ ンパク質の変性および沈澱を引き起こし、そして不溶性の沈澱相および可溶性相 を生じる。変性は、タンパク質の二次構造および三次構造を破壊するプロセスで あり、タンパク質の折り畳みをほどくか、または別の様式でタンパク質のネイテ ィブな特性の喪失を引き起こす。変性は、タンパク質が後でそのネイティブな特 性を取り戻し得ない場合、不可逆的である。アルコールは、とりわけ、熱の存在 下において、多くのタンパク質の変性を促進する。冷却に際して、変性したタン パク質は凝集しやすく、不溶性の沈澱物を生成する。本発明の実施において、い くつかのプロテイナーゼインヒビターは、アルコールの存在下で加熱されず、そ して冷却された場合、不可逆的に変性され、そして可溶性のままであるが、大部 分の他のタンパク質は沈澱する。特に、本明細書に記載される実施態様は、ポテ ト塊茎由来のいくつかのプロテイナーゼインヒビターが、第１の温度まで加熱さ れ、そして第２の温度まで冷却された、20％エタノールを含むアルコール抽出物 の中で、活性かつ可溶性のままであることを示す。 一般的に、アルコール抽出物は、所望でないタンパク質を変性させるに十分熱 いが、プロテイナーゼインヒビターを不可逆的に変性させるほど熱くはない、第 １の温度まで加熱されるべきである。次いで、抽出物は、沈澱の凝集を促進する に十分低い第２の温度まで冷却させるべきである。冷却後、変性したタンパク質 および他の細片を含む不溶性の沈澱相が発生する。沈澱相は、遠心分離、ろ過、 または他の等価な方法によって残存する可溶性相から分離され得、清澄な可溶性 相を与える。可溶相は、プロテイナーゼインヒビタータンパク質を含む。 異なるプロテイナーゼインヒビターは、異なる変性および／または沈澱特性を 有するので、加熱工程の第１および第２の温度の選択は、得られるインヒビター のタイプの決定要因であり得る。ポテト塊茎のアルコール抽出物を使用する１つ の実施態様において、第１の温度は70℃であり、そして第２の温度は50℃である 。これは、プロテイナーゼインヒビターIIを含む調製物を産生する。ポテト塊茎 の同じアルコール抽出物を使用する別の実施態様において、第１の温度は50℃で あり、あそして第２の温度は室温である。これは、３つの異なるインヒビター（ プロテイナーゼインヒビターII、および２つのクーニッツプロテイナーゼインヒ ビター、１つはトリプシンに対して最も活性であり、そして他方はキモトリプシ ンに対して最も活性である）を含む混合物を産生する。 本方法は、加熱工程のための第１および第２の温度の選択が、植物組織の特定 の種について、特定のタイプのプロテイナーゼインヒビタータンパク質の最良の 収量を得るために必要なように改変されることを可能にする。例えば、１つの実 施態様内で、特定の植物組織由来のアルコール抽出物は、一連の異なる第１およ び第２の温度まで処理され得る。細片の遠心分離後、上清中のタンパク質レベル および特定のプロテイナーゼインヒビター活性の測定は、最高の比活性を産生す る熱処理を決定する。 アルコールは、アルコール抽出物を熱処理した後、可溶性相から回収され得る 。１つの実施態様において、エタノールは、アルコール抽出物が冷却された第２ の温度においてエバポレーションによって回収され得る。別の実施態様において 、アルコールは回収される必要はない。いずれの場合においても、アルコールの 存在または不在は、本方法の続く工程に効果を与えない。 本方法の第３の工程において、プロテイナーゼインヒビターは、インヒビター の沈澱を促進する媒体（好ましくは、プロトン性の酸、例えば有機酸を使用する 酸性透析溶液、最も好ましくはギ酸）に対する透析を介する沈澱によって可溶性 相から回収される。透析は、タンパク質の回収のための沈澱を促進するだけでは なく、また、先の工程から持ち越されたより小さいタンパク質および他の分子を 除去する。透析媒体の選択は、部分的には、単離されるプロテイナーゼインヒビ ターによって決定される。１つの実施態様において、約0.22％の希ギ酸がポテト 塊茎由来のプロテイナーゼインヒビターIIを回収するために使用される。別の実 施態様において、水道水が、ポテト塊茎由来の３つのプロテイナーゼインヒビタ ーの混合物を回収するために好適である。水道水が透析媒体として使用される場 合、タンパク質は、続くギ酸の約0.88％までの添加によって沈澱され得る。いず れの場合においても、透析は、12,000〜14,000ダルトンのカットオフ分子量を有 する膜を横切る。可溶性抽出物中に存在する塩残留アルコールおよび他の低分子 は除去される一方で、プロテイナーゼインヒビターを含む白い沈澱物が生成する 。実験室スケールの実施態様において、20〜24時間の透析は、完全な沈澱生成に 十分である。しかし、より良好な、またはより迅速なプロテイナーゼインヒビタ ーの回収を生じ得る透析の他の方法、溶質交換、または沈澱形成で代替され得る 。 沈澱したタンパク質は、ろ過、遠心分離、または他の方法によって回収され得 る。沈澱したタンパク質は、種々の程度の純度のプロテイナーゼインヒビタータ ンパク質の混合物を含む。１つ以上のプロテイナーゼインヒビタータンパク質は 、沈澱物中の全タンパク質の90％を超える部分を構成し得る。このような沈澱物 は、プロテイナーゼインヒビタータンパク質の実質的に純粋な混合物とみなされ 得る。 沈澱物は、意図する使用またはプロテイナーゼインヒビターの続く処方に適切な 溶媒において溶解され得る。本明細書に提供される実施態様において、沈澱物は 0.1M炭酸水素アンモニウム中で溶解され、これは可溶化および続く凍結乾燥（プ ロテイナーゼインヒビターの安定な貯蔵の公知の方法）に適切である。 本明細書に記載される一般的な方法論は、インヒビターが、アルコールおよび 熱の存在下での不可逆的な変性に耐性である場合、種々の植物組織からの種々の 熱安定性プロテイナーゼインヒビタータンパク質の調製に適切である。この方法 は、使用される特定の組織、存在するプロテイナーゼインヒビター、ならびに当 該方法のために使用される特定のアルコール、温度、および透析媒体に依存する 、種々の程度の純度を有するプロテイナーゼインヒビタータンパク質の混合物を 産生する。所定の組織について最適化された場合、プロテイナーゼインヒビター の実質的に純粋な組成物が高収量で、下記のポテト塊茎プロテイナーゼインヒビ ターについて実施例によって示されるように、得られ得る。この目的のために、 以下の実施例は、例示の目的のために提供され、限定のためではない。 実施例 実施例１ ポテトプロテイナーゼインヒビターIIの調製 Russet Burbankポテトの１ポンド（1b）を、100ml 0.88％ギ酸および1.5 NaCl の存在下で2分間、ブレンダー中でホモジナイズした。ブレンディングの間、125 mlの95％エタノールをゆっくりとホモジネートに添加して、最終エタノール濃度 を約20％にした。これは、ホモジネートをペーストから、ろ過を容易にする液体 混合物に変化させた。荒い不溶性の細片を、８層のチーズクロスを通して液体を 絞ることによって除去した。液体のろ液を回収して、アルコール抽出物とした。 アルコール抽出物を、エバポレーターフラスコに移し、そしてフラスコを、攪 拌しながら、沸騰水バス中に沈めることにより、温度が70℃に到達するまで加熱 した。その時点で、フラスコを、バス温度が50℃のフラッシュエバポレーターに 取りつけた。エバポレーターを使用して、エタノールを回収した。しかし、本方 法を継続するために、エタノールを回収する必要はなかった。生じる液体を、40 00×ｇで遠心分離し、生成した過剰のデンプンおよび沈澱した不溶性相を除去し 、可溶性相を示す清澄な上清を回収した。 可溶性相は、12,000〜14,000分子量カットオフ透析バンドに置いて、10リット ルの0.22％ギ酸に対して少なくとも12時間、ギ酸溶液を数回交換して透析した。 この時点までに白色の沈澱がバッグ中で生成した。沈澱物は、純粋なプロテイナ ーゼインヒビターIIであり、これは4000×ｇの遠心分離で回収した。沈澱物は、 0.1M炭酸水素アンモニウム中で溶解し、凍結乾燥した。収量は、ポテト１ポンド （1b.）あたり約57mgインヒビターであった。より良好な収量は、新しく収穫し たポテト、またはより高いレベルのプロテイナーゼインヒビターIIを有するポテ ト品種で開始することにより達成され得る。 図１および図２は、この手順から回収した物質のHPLC分析を示す。両方の図は 、セミ分取C18カラム（Vydac，カタログ番号#218TP510，5，10×250mm）から溶 出した物質の280nmでの分光学的な吸光度を示し、このカラムは、20％溶媒Ａ（0 .1％トリフルオロ酢酸）から50％溶媒Ｂ（0.1％トリフルオロ酢酸／アセトニト リル）の直線勾配を使用して、45分間にわたって、2ml/minで展開した。図１は 、透析前の、工程２におけるアルコール抽出物の熱変性後に回収した清澄な可溶 性相中に存在する可溶性物質を示す。図２は、工程３における透析後に生成した 沈澱物中に存在する物質を示す。沈澱物は、分析のために溶媒Ａに溶解した。 図３は、図２のHPLC分析からのピーク＃１中の物質のゲル電気泳動分析を示す 。レーン１は、エタノールを添加する前の、最初のポテトホモジネートの試料で ある。レーン２、３および４は、それぞれ、ピーク＃１の前部、中間部、後部の 試料である。ピーク１を、さらに免疫学的分析に供して、この物質をポテトプロ テイナーゼインヒビターIIとして同定した。 図４は、図２からのピーク＃１のプロテイナーゼインヒビターII活性を示す。 この物質は、トリプシン（T）およびキモトリプシン（C）の両方の強力なインヒ ビターであることが示された。トリプシン阻害について、4.0μgの物質が2μgの トリプシンを阻害した。キモトリプシン阻害について、1.4μgの物質が1.5μgの キモトリプシンを阻害した。この二重の阻害活性は、プロテイナーゼインヒビタ ーIIに特徴的である。実施例２ ポテトからのポテトプロテイナーゼインヒビターの混合物の調製 アルコール抽出物を、上記の実施例１のように調製した。アルコール抽出物を 、攪拌しながら、フラスコを沸騰水バス中に沈めることにより、温度が50℃に到 達するまで加熱した。 その時点で、フラスコを冷たい流水のウォーターバスに沈め、温度を室温まで下 げた。生じる液体を、4000×ｇで遠心分離し、過剰のデンプンおよび沈澱した不 溶性相を除去し、可溶性相を示す清澄な上清を回収した。 可溶性相を、12,000〜14,000分子量カットオフ透析バンドに置いて、流れる水 道水に対して、24時間透析した。このあと、バッグ中の溶液を0.88％ギ酸に調整 したか、または代替的に透析溶液を0.88％ギ酸に調整し、そして透析をさらなる 4時間継続した。この時点までに白色の沈澱がバッグ中で生成した。沈澱物は、 以下の図５または図６に示されるように、プロテイナーゼインヒビターIIおよび ２つのクーニッツファミリープロテイナーゼインヒビターを含んだ。沈澱物を回 収し、溶解し、そして実施例１のように凍結乾燥した。収量は、ポテト１ポンド （1b.）あたり約300mgインヒビターであった。やはり、より良好な収量は、新し く収穫したポテト、またはより高いレベルのプロテイナーゼインヒビターIIを有 するポテト品種で開始することにより達成され得る。 図５は、回収された沈澱混合物のプロテイナーゼインヒビター活性を示す。こ の物質は、トリプシン（T）およびキモトリプシン（C）の両方の強力なインヒビ ターであることが見出された。トリプシン阻害について、3.2μgの物質が2.0μg のトリプシンを阻害した。キモトリプシン阻害について、2.2μgの物質が1.5μg のキモトリプシンを阻害した。 図６は、この手順から回収された、最終的に沈澱した物質のHPLC分析を示す。 条件は図２に記載されたものと同じである。３つの同定されたピークを、図７に 示されたようにゲル電気泳動分析に供した。レーン１、２、および３は、それぞ れ図６のピーク＃１、＃２、および＃３からの物質である。前記のように、免疫 学的分析は、ピーク＃１中の物質がプロテイナーゼインヒビターIIであると同定 した。ピーク２および３からの物質を、アミノ酸配列決定分析に供した。この分 析により、ピーク２の物質は、強力なキモトリプシン阻害活性および弱いトリプ シン阻害活性を有する、クーニッツファミリーインヒビターであると同定された 。ピーク３は、強力なトリプシン阻害活性を有する、クーニッツファミリーイン ヒビターであると同定された。 上記により、本発明の特定の実施態様は、本明細書中で例示の目的のために記 載されたが、本発明の精神および範囲から離れることなく、種々の改変がなされ 得ることが理解される。従って、本発明は添付の請求の範囲によって以外では限 定されない。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．熱安定性プロテイナーゼインヒビタータンパク質を含む植物組織から、該プ ロテイナーゼインヒビタータンパク質を得るための方法であって、以下の工程： 水性／アルコール溶媒中で該植物組織由来のプロテイナーゼインヒビタータン パク質を抽出して、可溶化されたプロテイナーゼインヒビタータンパク質を含む アルコール抽出物を生成する工程； 該アルコール抽出物を第１の温度まで加熱し、続いて第２の温度まで冷却して 、不溶性の沈澱物相および可溶性相を生成する工程；および 酸性透析溶液に対する透析により、該可溶性相から該プロテイナーゼインヒビ タータンパク質を沈澱させる工程、 を包含する、方法。 ２．前記植物組織がポテト塊茎である、請求項１に記載の方法。 ３．前記プロテイナーゼインヒビタータンパク質がポテトプロテイナーゼインヒ ビターIIである、請求項１に記載の方法。 ４．前記プロテイナーゼインヒビタータンパク質が、ポテトプロテイナーゼイン ヒビターII、優勢なキモトリプシン阻害活性を有するクーニッツファミリーキモ トリプシン／トリプシンインヒビター、および優勢なトリプシン阻害活性を有す るクーニッツファミリートリプシン／キモトリプシンインヒビターの混合物であ る、請求項１に記載の方法。 ５．前記水性／アルコール溶媒が最終濃度で約0.2％ギ酸、約0.3Ｍ NaCl、およ び約20％エタノールを含み；前記第１の温度が約70℃以上であり；前記第２の温 度が約50℃以下であり；そして前記水性透析溶液が約0.22％ギ酸を含む、請求項 １に記載の方法。 ６．前記水性／アルコール溶媒が約0.2％ギ酸、約0.3Ｍ NaCl、および約20％エ タノールを含み；前記第１の温度が約50℃であり；前記第２の温度が約27℃以下 であり；そして前記水性透析溶液が最初は水からなり；そして水に対する透析の 期間の後で、前記可溶性相または該水性透析溶液の少なくとも一方が約0.88％ギ 酸を含むように調整される、請求項１に記載の方法。 ７．熱安定性プロテイナーゼインヒビタータンパク質を含むポテト塊茎から、該 プロテイナーゼインヒビタータンパク質を得るための方法であって、以下の工程 ： 約0.2％ギ酸および約0.3Ｍ NaClを含む媒体中で該ポテト塊茎をホモジナイズ することによって該ポテト塊茎を抽出し、粗抽出物を生成する工程； 約１容量のエタノールを４容量の該粗抽出物に添加して、アルコール抽出物を 生成する工程； 該アルコール抽出物を濾過して、濾過された抽出物を生成する工程； 該濾過された抽出物を50℃以上の第１の温度まで加熱し、続いて50℃以下の第 ２の温度まで冷却して、不溶性の沈澱物相および可溶性相を含む熱処理抽出物を 生成する工程； 該熱処理抽出物を多孔性フィルターを通して濾過すること、または該熱処理抽 出物を約4,000×ｇで約５分間遠心分離することのうちの少なくとも一方によっ て、該可溶性相から該不溶性の沈澱物相を分離して、清澄化された可溶性相を生 成する工程； 約12,000ダルトンの分子量カットオフを有する透析膜を使用して、水道水また は約0.2％ギ酸のいずれかを含む透析媒体に対する透析によって、該清澄化され た可溶性相から不純物を除去して、透析された抽出物を生成する工程； 該透析媒体中に約0.22％ギ酸を含むこと、または約0.88％までギ酸を添加する ことの少なくとも一方によって、該透析された抽出物からプロテイナーゼインヒ ビタータンパク質を沈澱させて、沈澱混合物を生成する工程； 該沈澱混合物を多孔性フィルターを通して濾過すること、または該沈澱混合物 を約4,000×ｇで約５分間遠心分離することの少なくとも一方によって、沈澱し たプロテイナーゼインヒビタータンパク質を回収して、プロテイナーゼインヒビ タータンパク質の混合物を得る工程、 を包含する、方法。 ８．請求項１から７のいずれか１項に記載の方法に従って得られる、熱安定性プ ロテイナーゼインヒビタータンパク質。 ９．熱安定性プロテイナーゼインヒビタータンパク質を含む組織から、該プロテ イナーゼインヒビタータンパク質を得るための方法であって、酸性透析溶液に対 する透析または透析された可溶性相抽出物への酸の添加によって、該組織から調 製された可溶性相抽出物から該プロテイナーゼインヒビタータンパク質を沈澱さ せる工程を含む、方法。 １０．透析に先立って、前記可溶性抽出物が第１の温度まで加熱され、そして第 ２の温度まで冷却されて、不溶性の沈澱物相および前記プロテイナーゼインヒビ ターを含む可溶性相抽出物を生成する、請求項９に記載の方法。 １１．前記可溶性相抽出物中にアルコールが存在し、透析または酸の添加に先だ って水性／アルコール溶媒を生成する、請求項９に記載の方法。 １２．前記酸がギ酸であるか、または前記酸性透析溶液がギ酸を含む、請求項９ に記載の方法。 １３．前記酸性透析溶液が、約0.22％のギ酸を含む、請求項１２に記載の方法。 １４．透析が、酸の非存在下で前記可溶性相抽出物に対して行われ、続いてギ酸 が添加されて約0.88％ギ酸を含む溶液を得る、請求項１２に記載の方法。 １５．前記組織が植物組織である、請求項９から１４のいずれか１項に記載の方 法。 １６．前記植物組織がポテト塊茎である、請求項１５に記載の方法。 １７．前記組織が、プロテイナーゼインヒビター遺伝子を発現する、遺伝子操作 された生物由来である、請求項９から１４に記載の方法。 １８．請求項９から１６のいずれか１項に記載の方法に従って得られる、プロテ イナーゼインヒビタータンパク質。