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Orgoteinist der offizielle Name, den das United States Adopted Name Council Mitgliedern einer Familie von artgleiche wasserlöslichen Proteinen in weitgehend reiner, injizierbarer Form, d. h. im wesentlichen frei von andern Proteinen, die mit ihnen in den Quellen vermischt oder verbunden sind, verliehen hat. In der US-PS Nr. 3, 758, 682 sind Orgotein enthaltende, pharmazeutische Präparate beschrieben. Diese Proteine be-
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mischen Eigenschaften, und kompakte globulare Konfiguration, sind in wässeriger : Pûfferlösung und Wasser löslich und hitzeempfindlich, aber gegen ein mehrminütiges Erhitzen bei 650C bei einem PH-Wert von 4 bis 10 stabil.
Jedes dieser Proteine enthält höchstens zwei der Proteinaminosäuren nicht, eine geringe Menge an Kohlehydraten, keine Lipide, 0, 1 bis 1, 0% Metalle, u. zw. 1 bis 5 g-At/Mol eines oder mehrere ehelat- gebundener, 2-wertiger Metalle mit einem Ionenradius von 0,06 bis 0, 1 nm und im wesentlichen keine 1-wertigen Metalle oder Zellgifte darstellende Metalle.
Das Aminosäureprofil der Orgotein-Argenossen ist, unabhängig von der Quelle, aus der sie isoliert wurden, bemerkenswert gleichbleibend. Tabelle 1 zeigt für ein Molekulargewicht von 32500 dieses Aminosäureprofil mehrerer Artgenossen des Orgoteins.
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Tabelle 1 Aminosäuren-ZusammensetzungverschiedenerOrgotein-Artgenossen (Reste pro Mol ; MG = 32500)
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<tb>
<tb> Aminosäuren <SEP> Leber, <SEP> Rote <SEP> Blutzellen
<tb> Rind <SEP> Rind <SEP> Schaf <SEP> Pferd <SEP> Schwein <SEP> Hund <SEP> Kaninchen <SEP> Ratte <SEP> Mocrschw. <SEP> Huhn <SEP> Mensch <SEP> Bereich
<tb> Alanin <SEP> 19 <SEP> 19 <SEP> 18 <SEP> 18 <SEP> 18 <SEP> 16 <SEP> 19 <SEP> 22 <SEP> 22 <SEP> 23 <SEP> 22 <SEP> 16- <SEP> 23 <SEP>
<tb> Arginin <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 10 <SEP> 6 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 6- <SEP> 10 <SEP>
<tb> Asparaginsäure <SEP> 37 <SEP> 36 <SEP> 35 <SEP> 35 <SEP> 31 <SEP> 29 <SEP> 34 <SEP> 30 <SEP> 34 <SEP> 36 <SEP> 37 <SEP> 29-37
<tb> Cystin-1/2 <SEP> 6 <SEP> 6 <SEP> 6 <SEP> 6 <SEP> 6 <SEP> 6 <SEP> 6 <SEP> 6 <SEP> 4 <SEP> 10 <SEP> 8 <SEP> 4- <SEP> 10 <SEP>
<tb> Glutaminsäure <SEP> 21 <SEP> 23
<SEP> 22 <SEP> 30 <SEP> 28 <SEP> 30 <SEP> 25 <SEP> 38 <SEP> 29 <SEP> 26 <SEP> 28 <SEP> 21- <SEP> 38 <SEP>
<tb> Glycin <SEP> 53 <SEP> 52 <SEP> 52 <SEP> 51 <SEP> 52 <SEP> 53 <SEP> 54 <SEP> 54 <SEP> 53 <SEP> 56 <SEP> 51 <SEP> 51- <SEP> 56
<tb> Histidin <SEP> 16 <SEP> 16 <SEP> 14 <SEP> 20 <SEP> 16 <SEP> 15 <SEP> 17 <SEP> 20 <SEP> 15 <SEP> 17 <SEP> 14 <SEP> 14-20
<tb> Isoleucin <SEP> 18 <SEP> 18 <SEP> 18 <SEP> 14 <SEP> 16 <SEP> 18 <SEP> 16 <SEP> 16 <SEP> 18 <SEP> 15 <SEP> 17 <SEP> 14- <SEP> 18
<tb> Leucin <SEP> 17 <SEP> 17 <SEP> 17 <SEP> 18 <SEP> 16 <SEP> 16 <SEP> 19 <SEP> 12 <SEP> 17 <SEP> 15 <SEP> 20 <SEP> 12- <SEP> 20
<tb> Lysin <SEP> 22 <SEP> 21 <SEP> 23 <SEP> 26 <SEP> 23 <SEP> 20 <SEP> 21 <SEP> 18 <SEP> 20 <SEP> 21 <SEP> 23 <SEP> 18- <SEP> 26
<tb> Methionin <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 6 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> 1-6
<tb> Phenylalanin <SEP> 8
<SEP> 8 <SEP> 7 <SEP> 9 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 6 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 8 <SEP> 6-9
<tb> Prolin <SEP> 12 <SEP> 13 <SEP> 15 <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> 13 <SEP> 10 <SEP> 12 <SEP> 13 <SEP> 12 <SEP> 10- <SEP> 15
<tb> Serin <SEP> 17 <SEP> 17 <SEP> 14 <SEP> 14 <SEP> 13 <SEP> 20 <SEP> 18 <SEP> 18 <SEP> 18 <SEP> 15 <SEP> 19 <SEP> 13-20
<tb> Threonin <SEP> 26 <SEP> 25 <SEP> 20 <SEP> 16 <SEP> 27 <SEP> 20 <SEP> 21 <SEP> 17 <SEP> 17 <SEP> 18 <SEP> 18 <SEP> 16- <SEP> 27
<tb> Tryptophan'Nil <SEP> Nil <SEP> Nil <SEP> Nil <SEP> Nil <SEP> Nil <SEP> Nil <SEP> Nil <SEP> Nil <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 0- <SEP> 2
<tb> Tyrosin2 <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> Nil <SEP> 4 <SEP> 2 <SEP> Nil <SEP> 2 <SEP> Nil <SEP> 2 <SEP> Nil <SEP> 0- <SEP> 4
<tb> Valin <SEP> 33 <SEP> 32 <SEP> 31 <SEP> 29 <SEP> 29 <SEP> 34 <SEP> 31 <SEP> 35 <SEP> 32 <SEP> 30 <SEP> 30 <SEP> 29- <SEP> 35
<tb> Gesamtzahl <SEP> 317 <SEP>
315 <SEP> 306 <SEP> 304 <SEP> 307 <SEP> 311 <SEP> 315 <SEP> 315 <SEP> 309 <SEP> 317 <SEP> 318 <SEP> 304-318
<tb>
1ColormetrischoBestimmung2MittelwertausAminositureanalyseundspektrophotometrischerBestimmung
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Wie Tabelle 1 zeigt, besitzen Orgotein-Argenossen 18 bis 26 und gewöhnlich 20 bis 23 Lysinreste, von denen alle bis auf 1 bis 3 mit Trinitrobenzolsulfonsäure titrierbare e-Aminogruppen aufweisen. Aus Tabelle 1 ist ebenso ersichtlich, dass Orgotein-Argenossen 29 bis 37 Asparaginsäurereste und 21 bis 38 Glutaminsäurereste besitzen.
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3, 758, 682)unter weitgehender Beibehaltung seiner entzündungshemmenden Wirkung und eines wesentlichen Teils seiner Superoxyddismutasewirkung durch Alkylieren erhöht werden kann.
Dementsprechend bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zum Herstellen von injizierbaren Orgo- teinderivatenmit entzündungshemmender Wirkung und dieses Verfahren ist gemäss der Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass man Orgotein mit zumindest einem Alkylierungsmittel zum entsprechenden N-alkylierten bzw. 0-alkylierten Orgotein umsetzt und gewünschtenfalls das so hergestellte N-alkylierte und/oder O-alkylierte Orgotein mit Orgotein oder mit einem andern N-alkylierten und/oder 0-alkylierten Orgotein hybridisiert.
Im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens wird vorzugsweise Rinder-Orgotein eingesetzt, obzwar auch aus Organen oder dem Blut von Menschen, Schafen, Pferden, Schweinen, Hunden, Kaninchen, Meerschweinchen und Hühnern gewonnenes Orgotein oder ein Orgotein andern Ursprungs eingesetzt werden kann.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens wird das Orgotein mit
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reduktives Alkylierungsmittel, wie RCOR'+BH oder BH CN" (R, R'= H, CH3, C2H5, C6H5) eingesetzt.(Ein Verfahren zur reduktiven Alkylierung von Proteinen mit aromatischen Aldehyden und Natriumeyanöborhydrid ist in Friedman, M. et al, Int. J. Peptide Protein Res., Bd. 6,1974, S. 183-185 beschrieben. Die Alkylierung mit Acrylnitril ist in Means & Feeney,"Chemical Modifications of Proteins" Kap. 6, S. 114-117 ; Fletcher, J. C., Biochem. J., Bd. 98,1966, S. 34C ; Friedman, M. et al., J.Amer.Chem.Soc., Bd.87, 1965, S. 3672 ; Friedman, M. et al., J. Org.
Chem., Bd. 31,1966, S. 2888 beschrieben). Es ist jedöch auch möglich, im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens mit gleichem Vorteil als Alkylierungsmittel einen Ester oder ein Amid der Diazoessigsäure, beispielsweise eine Diazoverbindung der Formel N CH COX, in der X eine OCH-,OCH-,NH-oder eine NHCH CONH-Gruppe bedeutet, einzusetzen.
Im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens werden vor allem die e-Aminogruppen der Lysinreste des Orgoteins alkyliert, wobei diese e-Aminogruppen monoalkyliert oder dialkyliert und unter Umständen zu
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meidbar, dass auch die freien Aminogruppen der Argininreste und die freien Carboxylgruppen der Asparagin- säure- und Glutaminsäurereste sowie weitere alkylierbare, im Molekül vorliegende Gruppen, insbesondere Hydroxylgruppen und der Stickstoff in Imidazolgruppen und Guanidinresten, Mercaptogruppen und Methylmercaptogruppen alkyliert werden. Während beispielsweise die Alkylierung bei einem pH-Wert von 10 mit Jodacetamid alleinig eine e-N-Alkylierung zu sein scheint, ist die Alkylierung mit Dimethylsulfat bei einem PH-Wert von 10 weniger selektiv und führt auch Methylgruppen anderswo im Molekül ein.
Die Alkylierung hat auch keinen Einfluss auf die dichte räumliche Konfiguration des Orgoteinmoleküls und führt zu einem sehr stabilen Orgoteinderivat, welches beispielsweise bei einstündigem Erhitzen auf 600C und selbst beim Angriff durch proteolytische Enzyme keine Veränderungen zeigt.
Der Ablauf der Alkylierung, soweit er die COOH-Alkylierung erfasst, und der Ablauf der N-Alkylierung, soweit sie eine ansonsten acylierbare-NH-Gruppe gegen eine Acylierung schützt, kann direkt durch einen Wechsel der elektrophoretischen Gesamtladung und im Auftauchen neuer Banden bei der Elektrophorese verfolgt werden.
Der im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens erzielte Alkylierungsgrad kann durch Vergleich der Wanderungsgeschwindigkeit eines nicht alkylierten Orgoteins mit der Wanderungsgeschwindigkeit eines alkylierten Orgoteins bei der Elektrophorese ermittelt werden.
Da das Orgoteinmolekül aus zwei identischen Peptidketten (Untereinheiten) aufgebaut ist, die unter mässigen Temperaturbedingungenund bei mässigen PH-Werten fest aber nicht kovalent miteinander verbunden sind, liegt die Hälfte der im Orgoteinmolekül enthaltenen 18 bis 26 Lysinreste und die Hälfte der im Orgoteinmolekül enthaltenen 50 bis 68 Glutamin- und Asparaginreste von welchen jedoch nur etwa 20 bis 27 eine freie
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gel etwa 6 bis 8, der freien Carboxygruppen der Glutamin- und Asparaginreste im sauren Milieu alkyliert werden können.
Sowohl beim Alkylieren von Aminogruppen als auch beim Alkylieren von Carboxygruppen des Orgoteins trittnuneineÄnderungderLadungdes Orgoteinmolekuls auf, die bei der Elektrophorese bei gegebener Feldstärke und bei gegebener Zusammensetzung der Lösung des Orgoteins eine andere Wanderungsgeschwindig-
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Das native, also nicht alkylierte Orgotein zeigt bei der Elektrophorese eine Hauptbande (Bande 1) und weniger ausgeprägte Banden (Banden + 2, + 3, usw.), die auf schneller in Richtung zur Anode wandernde Or-
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Verfahrens das Orgotein an-NH -Gruppen alkyliert wird und damit die freien-COOH-Gruppen des Orgoteinmoleküls einen immer stärkeren Beitrag zur Wanderungsgeschwindigkeit des Orgoteins bei der Elektrophorese liefern, treten statt der Bande 1 die mit nahezu gleichem Abstand voneinander getrennten und stärker zur Anode hin verschobenen Banden (+ 2, + 3, usw.) als Hauptbanden auf, je nachdem es sich bei den in die jeweilige Bande eingehenden Orgotéirimolekülen um solche handelt, in denen, in der angegebenen Reihenfolge, 1, 2, usw.
Aminogruppen alkyliert sind. Wenn umgekehrt im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens das Orgotein an-COOH-Gruppen alkyliert wird, liefern die Aminogruppen des Orgoteinmoleküls einen stär- kerenBeitragzurWanderungsgeschwindigkeitdes Orgoteins bei der Elektrophorese, so dass die Wanderungsgeschwindigkeit des Orgoteins in Richtung zur Anode verringert und dementsprechend die Hauptbanden - 1, - 2, usw. auftreten, je nachdem, ob in der angegebenen Reihenfolge 1, 2, usw.-COOH-Gruppen alkyliert worden sind.
Um den Alkylierungsgrad durch Elektrophorese genau zu bestimmen, ist es erforderlich, ein Elektrophorogramm einer ein Orgotein unbekannten Alkylierungsgrades n enthaltenden Probe mit einem unter identischen Bedingungen erhaltenem Elektrophorogramm einer Orgotein und Orgoteine mit dem Alkylierungsgrad 1 bis mindestens n enthaltenden Probe zu vergleichen, da aus dem Abstand zweier benachbarter Banden, beispielsweise dem Abstand der Bande 2 von der Bande 1, nicht verlässlich genug auf die Nummer weiter entfernt liegender Banden geschlossen werden kann.
Im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens können mit milden Alkylierungsmitteln alle bis auf 2 bis 4 c-Aminogruppen der Lysinreste und unter stärker alkylierenden Bedingungen, beispielsweise mit überschüssigem Dimethylsulfat in einem 0,04 m Carbonatpuffer vom PH-Wert 10 alle bis auf etwa eine der zugänglichen, mitTNBStitrierbaren e-Aminogruppender Lysinreste alkyliert werden. Von den freien-COOH- Gruppen des Orgoteins sollen zweckmässig nur höchstens 10, vorzugsweise 6 bis 8,-COOH-Gruppen alkyliert werden, damit das alkylierte Orgotein bei der Elektrophorese weiterhin in Richtung zur Anode wandert.
Beim Herstellen von N-alkylierten Orgoteinen werden durch das Alkylierungsmittel vorzugsweise Cyclo-
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propyl- und ähnliche Cycloalkylalkylgruppen, Benzyl-, p-Xylyl-, Phenäthylgruppenundähnliche Aralkylgruppen, Alkylgruppenmitlbis8, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, insbesondere die Methyl- oder Äthylgruppe mit gegebenenfalls 1 oder mehreren, vorzugsweise einfachen Substituenten, beispielsweise Carboxyl-, Cyan-, Carbalkoxy- oder Amidgruppen, wie die Carboxymethyl-, Cyanomethyl-, Carbäthoxymethyl-, Carbo-
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Orgoteine können durch die allgemeine Formel
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veranschaulicht werden, in der n eine ganze Zahl von 1 bis etwa 26, vorzugsweise mindestens 10, insbesondere etwa 10 bis 18, bedeutet, die Summe von m und n gleich ist der Gesamtzahl der titrierbaren freien Aminogruppen im eingesetzten Orgotein,
"Perdesamino-Org"das von freien Aminogruppen befreite Gerüst
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OrgoteinesniederenAlkylrestesmitbis4KohlenstoffatomenfürR'',-CÊN,-CH2-CÊN,-CH2OHoder-CH (CH3)OH oder-Ph oder-COPh, bedeutet, worin Ph den Phenylrest bedeutet, der gegebenenfalls 1 bis 3 einfache Substituenten, wie die Methylgruppe, Chlor, Brom, die Nitrogruppe, eine Amidgruppe und die Methoxygruppe, die Carbomethoxy- oder Carbäthoxygruppe tragen kann, wie das beispielsweise bei der p-Tolyl-, sym.-Xylyl-, p-Amidophenyl-, m-Chlorphenyl- und p-Methoxyphenylgruppe der Fall ist.
Einige der im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens angewendeten Alkylierungsmittel alkylieren gleichzeitig mit den e-Aminogruppen der Lysinreste einige der freien Säuregruppen des Orgoteins, wobei al-
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- 6 - Nr. 353289 kylierte Orgoteine der allgemeinen Formel
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erhalten werden, in welcher
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<tb>
<tb> "Perdesamino-perdecarboxy-Org"das <SEP> von <SEP> freien <SEP> Aminogruppen <SEP> und <SEP> freien <SEP> Carboxygruppen <SEP> freie <SEP> Gerüst <SEP> des <SEP> Orgoteins <SEP> bedeutet,
<tb> RI, <SEP> m, <SEP> n <SEP> vorstehende <SEP> Bedeutung <SEP> besitzen,
<tb> y <SEP> die <SEP> Anzahl <SEP> der <SEP> alkylierten <SEP> Carboxylgruppen, <SEP> beispielsweise <SEP> 1 <SEP> bis <SEP> etwa <SEP> 8, <SEP> vorzugsweise <SEP> 2 <SEP> bis <SEP> 6,
<SEP> bedeutet <SEP> und
<tb> x <SEP> die <SEP> Anzahl <SEP> der <SEP> verbliebenen <SEP> freien <SEP> Carboxylgruppen <SEP> im <SEP> Orgoteinmolekül <SEP> ist.
<tb>
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Carboxymethyl-bzw. CarbamoylmethylgruppenIonenaustauschharzehromatographie, Elektrophorese und/oder Gelfiltration unter Verwendung eines als Molekularsieb wirkenden Polymeren gereinigt werden.
Filtrieren einer Lösung des Orgoteinderivats durch ein Mikroporenfilter der Porengrösse 0, 01 bis
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gibt, und bei bestimmten lokalen Schäden, wie Strahlungsschäden und Zystitis, bei welchen eine lokale Injektion, Infusion und/oder Einträufelung häufig wirksamer ist, bevorzugt ist. Die individuelle Dosis liegt gewöhnlich zwischen 0,5 bis 20 mg und die bevorzugte Dosis für den Menschen beträgt etwa 0,5 bis 8 mg, für das Pferd 5,0 bis 10,0 mg. Die exakte Dosis richtet sich nach Art und Schwere der Krankheit.
Die erfindungsgemäss hergestellten Orgoteinderivate sind ebenso wie Orgotein ein wirksames Mittel zur
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dungshemmende Produkte, beispielsweise wegen toxischer Nebeneffekte bei längerem Gebrauch, nur beschränkt verwendet werden können. Insbesondere heilen diese Orgoteinderivate Entzündungen und schwächen deren Folgen, beispielsweise im Harntrakt und in den Gelenken von verschiedenen Säugetieren. Sie mildern die Symptome, die bei rheumatoiden Erkrankungen, Osteoarthritis und posttraumatischer Arthritis sowie bei Bursitis, Tendonitis usw., auftreten.
Verfahren zur Gewinnung der als Ausgangsmaterial verwendeten Orgoteine und Angaben über die Ver- wendungsmöglichkeit der erfindungsgemäss hergestellten Orgoteinderivate einschliesslich Vorschlägen über die Verabreichung, Dosierungsform, Dosierungseinheit und Entzündungszustände und weitere Zustände, die für die Behandlung mit dem veresterten Orgotein empfänglich sind, finden sich in der US-PS Nr. 3,758, 682.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung, die Beispiele 1 bis 4 erläutern das N-Alkylieren von Orgotein, wogegen die Beispiele 5 bis 8 die Alkylierung des Orgoteins an-COOH-Gruppen erläutern.
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l : Eine Losung von 5mg Rinder-Orgotein in 4ml 0, 04 m Carbonatpuffer wird mit 20 methylsulfat behandelt, wobei der PH-Wert durch Zugabe von 0, 5 m NaOH bei 10,0 gehalten wird. Die Aufnahme der Base hat eine Halbwertszeit von etwa 37 min. Die Elektrophorese zeigt SOD-aktive Banden 1 bis - 5 (Mittelwert -3). Nach der Dialyse, dem Lyophilisieren und dem Wiederlösen in 1 ml Wasser besitzt das Protein noch seine SOD-Aktivität und einen Cu+-und Zn++-Gehalt, der sich gegenüber dem nicht behandelten Orgotein nicht verändert hat.
Die Acetylierung einer Lösung von 85 p. g/ml des modifizierten Proteins mit insgesamt 3 jul Essigsäureanhydrid in 0, 4 ml Boratpuffer vom PH-Wert 9 gibt einen mittleren elektrophoretischen Ladungswechsel von nur etwa -2, verglichen mit -20 für das native Orgotein in der gleichen Lösung.
Das mit Dimethylsulfat bei einem PH-Wert von 10 behandelte Orgotein ist deshalb umfassend N-methyliert, d. h. etwa 18 Methylgruppen/Molekül.
Beispiel 2 : Nach dem Verfahren gemäss Beispiel 1 werden die entsprechenden Orgotein-Artgenossen von Mensch, Schaf, Pferd, Schwein, Hund, Kaninchen, Meerschweinchen und Huhn als Ausgangsstoffe verwendet. In jedem Fall werden sämtliche mit Ausnahme einer Lysingruppe einer jeden Untereinheit des Orgotein-Moleküls alkyliert.
Beispiel 3 : Nach dem Verfahren gemäss Beispiel 1 wird Diäthylsulfat anstatt Dimethylsulfat verwendet. Die Eigenschaften des erhaltenen e-N-äthylierten Orgoteins sind im wesentlichen denen des E-N-methylierten Orgoteins gleich.
Bei spiel 4 : Die E-Aminogruppender Lysinreste des Rinder-Orgoteins werden mit 0, 2m Natriumjod- acetat bei Raumtemperatur unter den nachstehenden Bedingungen und mit den nachstehenden Ergebnissen carboxymethyliert.
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<tb>
<tb>
Reaktionspuffer <SEP> Ladungsveränderung <SEP> bei <SEP> der
<tb> Elektrophorese
<tb> Mittelwert <SEP> : <SEP> Bereich
<tb> Orgotein <SEP> (1,4 <SEP> mg/ml) <SEP> + <SEP> JCH2CO-2Na+ <SEP> (0, <SEP> 2 <SEP> m) <SEP>
<tb> (a) <SEP> 0,3 <SEP> m <SEP> (pg <SEP> = <SEP> 3, <SEP> 8) <SEP> Acetatpuffer <SEP> (nur <SEP> Veränderungen <SEP> infolge <SEP> des
<tb> niedrigen <SEP> pH-Wertes)
<tb> (b) <SEP> 0,4 <SEP> m <SEP> (pH <SEP> = <SEP> 5, <SEP> 0) <SEP> Acetatpuffer <SEP> (keine <SEP> Veränderung <SEP> bis <SEP> 72 <SEP> h)
<tb> (c) <SEP> 0, <SEP> 23 <SEP> m <SEP> (prr <SEP> = <SEP> 9, <SEP> 2) <SEP> Carbonatpuffer <SEP> 0 <SEP> (15 <SEP> min), <SEP> 3 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 2 <SEP> (2 <SEP> 1/2 <SEP> h),
<tb> 5 <SEP> :
<SEP> 3 <SEP> (6 <SEP> 1/2 <SEP> h), <SEP> > 18 <SEP> (72 <SEP> h)
<tb>
Aus diesen elektrophoretischen Mustern scheint es, dass keine N-Alkylierung bei pH-Werten von 3,8 und 5,0 stattfindet und dass bei einem pH-Wert von 9,2 im Mittel etwa 3 -CH2COO--Gruppen in 2,5 h, etwa 5 derartige Gruppen in 6,5 und etwa 18 derartige Gruppen in 72 h an den #-Aminostickstoff-Atomen eingeführt wer- den.
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<tb>
<tb>
Orgotein <SEP> (2,8 <SEP> mg/ml) <SEP> + <SEP> JCH2CO-2Na+ <SEP> (0,43 <SEP> m)
<tb> (d) <SEP> pH <SEP> = <SEP> 6,0 <SEP> 0,4 <SEP> nach <SEP> 5 <SEP> Tagen <SEP> bei <SEP> Raumtemperatur
<tb> (e) <SEP> PH <SEP> = <SEP> 7,0 <SEP> 0,6 <SEP> (1 <SEP> Tag), <SEP> 1,0 <SEP> (2 <SEP> Tage), <SEP> 1,5 <SEP> (5 <SEP> Tage)
<tb> (f) <SEP> pH <SEP> = <SEP> 10 <SEP> 0 <SEP> (10 <SEP> min), <SEP> > <SEP> 3 <SEP> (2,5 <SEP> h), <SEP> > <SEP> 10 <SEP> (6,5 <SEP> h)
<tb>
Aus den elektrophoretischen Mustern eines derart behandelten Orgoteins scheint, dass bei einem pH-Wert von 6 weniger als die Hälfte der Orgotein-Moleküle alkyliert wird, bei einem pH-Wert von 7 in 2 Tagen die Orgotein-Moleküle im Mittel eine mit einer -CH2COO--Gruppe alkylierte e-Aminogruppe besitzen und in 5 Tagen im Mittel 2 derartige Gruppen je Molekül eingeführt werden.
Bei einem pH-Wert von 10 werden im Mittel mehr als 3 derartige Gruppen in 2,5 h und in 6,5 h im Mittel mehr als 10 derartige Gruppen je Mole- kül eingeführt.
Die Produkte sämtlicher vorstehender Alkylierungen, in denen -CH2COO--Gruppen eingeführt werden, sind ein Gemisch von e-aminoalkylierten Orgoteinen mit einer verschiedenen Zahl derartiger Gruppen, was durch das Auftauchen einer Vielzahl von Banden mit verschiedenen elektrophoretischen Wanderungsgeschwindigkeiten nachgewiesen wird.
Beispiel 5 : Eine Lösung (125 bt/ml) von 0, 5 mg Rinder-Orgotein und 0,5 Vol.-% Dimethylsulfat in 4 ml 0,05 m Acetatpuffer wird 100 min bei einem PH-Wert von 5 gehalten. Die elektrophoretische Analyse des Reaktionsproduktes zeigte SOD-aktive Banden von +2 bis-6 (Mittelwert-4). Das Produkt ist ein Orgotein mit im Mittel 4 -COOCR3-Gruppen.
Beispiel 6 : Eine Lösung von 0,5 mg Rinder-Orgotein und 10 t l Dimethylsulfat in 4 ml Wasser wird unter Zugabe von 0, 1 m-NaOH bei einem konstanten pH-Wert gehalten. Die Geschwindigkeit der Basenauf- nahme im prj-Bereieh von 7 bis 10 ist ziemlich unabhängig vom PH-Wert und der Zugabe von 0,25 m Natriumphosphatpuffer. Die Elektrophorese zeigt die Bildung von kathodisch stärkeren SOD-aktiven Banden bei einer Anfangsgeschwindigkeit von etwa -0, 5 Ladung/h. Nach 21 h überwiegend bei einem pH-Wert von 7 bis 8 wird die Lösung hinsichtlich der N-Methylierung und der Veresterung, wie nachstehend beschrieben, analysiert. Es kann keine N-Methylierung festgestellt werden.
(a) Die Acetylierung eines 0,5 Dil Anteils des veresterten Orgoteins mit 1 gel Essigsäureanhydrid und
3 gel 6 m NaOH bei 40C gibt eine Lösung, deren Elektrophoresemuster eine schnell bewegende anodi- sehe Bande ist, die der von acetyliertem nativen Orgotein ähnlich ist, wobei festgestellt wird, dass die freien Aminogruppen während der Veresterung unbeeinflusst bleiben.
(b) Ein 1 ml Anteil der veresterten Orgotein-Lösung wird auf einen pH-Wert von 10,5 eingestellt und in einem Exsikator über NaOH-Plätzehen aufbewahrt. Obwohl das kathodische Bandenmuster der Ban- den 1 bis-4 bei pH-Werten von 7 bis 9 stabil ist, verschwinden die kathodischen Banden bei einem
PH-Wert-von 10,5 allmählich innerhalb 4 Tagen, wobei das elektrophoretische Muster des nati- ven Orgoteins wieder erscheint. Die Proteinmethylester hydrolysieren üblicherweise leicht bei alka- lischen pH-Werten, wobei bestätigt wird, dass die kathodisch stärkeren Banden, die nach dem Ver- estern erscheinen, Orgotein-Ester sind.
Aus dem Vorstehenden ist offensichtlich, dass nach 2 h Dimethylsulfat bei einem pH-Wert von 7 bis 10 im Mittel eine-COOH-Gruppe je Molekül, nach 4 h etwa 2 je Molekül verestert und anschliessend die Zahl der veresterten-COOH-Gruppen auf einen Maximalwert von etwa 6 je Molekül dauernd ansteigt.
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Nach dem Verfahren gemäss den Beispielen 5 und 6, jedoch unter Verwendung der entsprechenden Orgoteinartgenossen von Mensch, Schaf, Pferd, Schwein, Hund, Kaninchen, Meerschweinchen und Huhn als Ausgangsprodukte werden jeweils im Mittel etwa 4 Carboxylgruppen des Orgoteinmoleküls verestert.
Nach dem Verfahren gemäss den Beispielen 5 und 6 werden unter Verwendung von Diäthylsulfat an Stelle von Dimethylsulfat Orgoteinäthylester erhalten, die noch 16 freie Carboxylgruppen enthalten. Die. Eigenschaften der erhaltenen veresterten Orgoteine sind im wesentlichen gleich denen des methylveresterten Orgoteins.
Dieveresterten Orgoteine können weiterhin gegebenenfalls durch Ionenaustauschchromatographie gereinigt werden, um die Produkte verschiedener Nettoladung und deshalb verschiedener Veresterungsgrade voneinander zu trennen. Beispielsweise trennt die Elution von 200 mg Orgotein über eine DEAE-Sephadexsäule der Abmessung 2,5 x40 cm mit 4 l eines linearen 0,01 m-bis 0, 2 m Trispuffergradienten vom pH-Wert 8,5 die Orgoteinbanden voneinander, wobei die elektrophoretisch stärker kathodischen Banden zuerst eluiert werden. Durch ein derartiges Verfahren kann das Gemisch von methylveresterten Orgoteinen, die nach dem Verfahren von Beispiel 5 hergestellt werden, in Fraktionen getrennt werden, die überwiegend 1, 2,3, 4,5 oder 6 Methylestergruppen je Orgoteinmolekül enthalten.
Eine derartige Fraktionierung eines teilweise modifizierten Orgoteins durch lonenaustausehchromatographie ist auf jedes modifizierte Orgotein anwendbar, dessen molekulare Ladung vom Modifizierungsgrad abhängt, beispielsweise methylverestertes Orgotein und carbäthoxymethylverestertes Orgotein.
Beispiel 7 : Diazoessigsäureäthylester wird durch Umsetzung von Glycinäthylester mit salpetriger Säure (vgl."Organic Synthesis Coll. Bd. IV, S. 424) hergestellt. Zur Extraktion des Diazoessigsäureester aus der wässerigen Lösung wird Chloroform an Stelle von Methylenchlorid verwendet.
2 ml einer etwa 1 m-Lösung von Diazoessigsäureäthylester in Chloroform wird in einem 25 ml-Kolben vorgelegt. Der grösste Teil des Chloroforms wird am Wasserstrahlvakuum abgedampft. Eine Lösung von 9 mg Rinder-Orgotein in 3 ml Wasser wird zugefügt und zur Dispersion der organischen Phase verrührt.
Die Lösung wird bei 40C aufbewahrt und jeweils nach einigen Tagen aufgerührt. Währenddessen bleibt das Reaktionsgemisch heterogen. Die Elektrophorese zeigt die allmähliche Bildung von stärker kathodischen SOD-aktiven Proteinbanden -1 bis -6. Die mittlere Ladungsveränderung beträgt 1, 2 nach 5 Tagen und 3 nach 12 Tagen. Das Produkt ist ein Gemisch von Carbäthoxymethyl-Orgoteinestern, wobei sie nach 5 Tagen entweder eine oder zwei derartige Estergruppen je Molekül und nach 12 Tagen 1 bis 6 derartige Estergruppen besitzen.
Die wässerige Phase wird anschliessend filtriert und durch chromatographisches Fraktionieren unter Verwendung einer 10 ml fassenden Sephadex G-25-Säule entsalzt. Die Proteinfraktionen werden gefriergetrocknet und erneut in 2 ml Wasser gelöst. Der pH-Wert wird von 3,7 auf 5,6 mit 2 11 m-NaOH angehoben.
Die Elektrophorese zeigt keine Abweichung von dem Zustand vor dem Entsalzen und Gefriertrocknen. Eine Rückreaktion dieser Lösung innerhalb eines Monats unter den gleichen, vorstehend beschriebenen Bedingungen ergibt einen Proteinflecken auf der Elektrophorese mit geringerer SOD-Aktivität und kein Produkt, das stärker kathodisch als die Bande-6 ist.
Beispiel 8 : Nach dem Verfahren gemäss den Beispielen 5 und 6 wird Rinderorgotein unter den in der nachstehenden Tabelle angegebenen Bedingungen alkyliert.
EMI8.1
<tb>
<tb> pH <SEP> Puffer <SEP> Orgotein <SEP> Dimethyl-Hydrolyse-SOD-aktive <SEP> Banden
<tb> sulfat <SEP> Halbwert- <SEP> auf <SEP> der <SEP> ElektroVol.-% <SEP> zeit <SEP> phorese
<tb> (a) <SEP> 5,0 <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> m <SEP> 125 <SEP> J. <SEP> ! <SEP> g/ml <SEP> 0,25 <SEP> 54 <SEP> min <SEP> +1 <SEP> bis <SEP> -4 <SEP>
<tb> . <SEP> (Mittelwert-2)
<tb> (b) <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> Acetat <SEP> 125 <SEP> J. <SEP> ! <SEP> g/ml <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 54 <SEP> min <SEP> -1 <SEP> bis <SEP> -6 <SEP>
<tb> (Mittelwert-4)
<tb> (c) <SEP> 7,0 <SEP> 0, <SEP> 016 <SEP> m <SEP> 80 <SEP> J.
<SEP> ! <SEP> g/ml <SEP> 0,65 <SEP> 1h-2 <SEP> bis-6 <SEP>
<tb> (d) <SEP> 7, <SEP> 0 <SEP> Phosphat <SEP> 80 <SEP> jug/ml <SEP> 1, <SEP> 3 <SEP> 1h <SEP> Schwache <SEP> Spur <SEP> SOD
<tb> von <SEP> +4 <SEP> bis-6 <SEP> mit
<tb> Max. <SEP> bei-6
<tb> (e) <SEP> 11,2- <SEP> 0, <SEP> 05m <SEP> 125 <SEP> J. <SEP> ! <SEP> g/ml <SEP> 0,5 <SEP> 1/2 <SEP> h <SEP> +2 <SEP> bis-3
<tb> 9, <SEP> 3 <SEP> Carbonat <SEP> bei <SEP> PH <SEP> 10 <SEP>
<tb>
+ Halbwertszeit der NaOH-Aufnahme, die zur Aufrechterhaltung eines konstanten
PH-Wertes benötigt wird.
<Desc/Clms Page number 9>
Das Produkt von Beispiel (a) hatim Mittel 2 veresterte-COOH-Gruppen je Molekül, während Beispiel (b) im Mittel4 derartige Gruppen besitzt. Die Anwesenheit einer Vielzahl von kathodischen Banden beweist, dass die veresterten Produkte aus einer Vielzahl von veresterten Orgoteinen bestehen, die 1 bis etwa 6 Estergruppen je Molekül enthalten.
PATENTANSPRÜCHE : 1. Verfahren zum Herstellen von injizierbaren Orgoteinderivaten mit entzündungshemmender Wirkung, dadurch gekennzeichnet, dass man Orgotein mit zumindest einem Alkylierungsmittel zum entspre- chenden N-alkylierten bzw. 0-alkylierten Orgotein umsetzt und gewünschtenfalls das so hergestellte N-alkylierte und/oder 0-alkylierte Orgotein mit Orgotein oder mit einem andern N-alkylierten und/oder O-alkylierten Orgotein hybridisiert.
2. Verfahrennach Anspruchl, dadurch gekennzeichnet, dass man als Orgotein Rinder-Orgotein einsetzt.