DE2637779A1 - Vernetztes orgotein - Google Patents

Vernetztes orgotein

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DE2637779A1
DE2637779A1 DE19762637779 DE2637779A DE2637779A1 DE 2637779 A1 DE2637779 A1 DE 2637779A1 DE 19762637779 DE19762637779 DE 19762637779 DE 2637779 A DE2637779 A DE 2637779A DE 2637779 A1 DE2637779 A1 DE 2637779A1
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Wolfgang Huber
Mark G Saifer
Lewis D Williams
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0089—Oxidoreductases (1.) acting on superoxide as acceptor (1.15)
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

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Description

Dr. Joachim Rasper
Patentanwalt
62 Wiesbaden
Blenhidttr Höhe 22 TtI. 5628 42
DIAGNOSTIC DATA, INC. .Mountain View, CaI., V.St.A.
Vernetztes Orgotein
Die vorliegende Erfindung betrifft Orgotein-Derivate.
Orgotein ist der offizielle Name, den das United States Adopted Name Council den Mitgliedern einer Familie von wasserlöslichen Protein-Artgenossen in weitgehend reiner, injizierbarer Form, d.h. weitgehend frei von anderen Proteinen, mit denen es ursprünglich vermischt oder kombiniert vorkommt, gegeben hat. Die US-PS 3,758,682 beschreibt pharmazeutische Präparate, die Orgotein enthalten. Unterschiedliche Verwendungsgebiete für Orgotein sind in den US-Patentschriften 3 637 441, 3 773 928, 3 773 929 und 3 781 414 beschrieben.
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Die Orgotein-Metallproteine sind Mitglieder einer Familie von Protein-Artgenoss en mit einer charakteristischen Kombination von physikalischen, chemischen, biologischen und pharmakodynamischen Eigenschaften. Jeder dieser Artgenossen ist physikalisch dadurch gekennzeichnet, daß er die isolierte, im wesentlichen reine Form eines globulären, in Pufferlösung und Wasser löslichen Proteins ist, das eine höchst kompakte native Konfiguration aufweist, die zwar wärmeempfindlich, jedoch gegen mehrminütiges Erhitzen auf 650C bei pH 4 - 10 widerstandfähig ist. In chemischer Hinsicht sind aie dadurch gekennzeichnet, daß sie alle bis auf 0 bis 2 der Proteinaminosäuren, einen geringen Gehalt an Kohlehydraten, keine Lipide, 0,1 bis 1,0 # Metallgehalt, der aus 1 bis 5 Grammatomen/Mol eines oder mehrerer chelatgebundener, divalenter Metalle mit einem Ionenradium von 0,60 bis 1,00 A besteht, und im wesentlichen keine chelatgebundenen monovalenten Metalle oder solche, die Zellgifte darstellen, im Molekül aufweisen.
1969 wurde entdeckt, daß die vom Rind stammenden Artgenossen des Orgotein-Proteins ein Enzym sind, weüdies die Fähigkeit hat, den Abbau von Superoxid-Radikalen in einer Disproportionierungsreaktion zu molekularem Sauerstoff und Wasserstoffperoxid zu katalysieren. Aufgrund dieser enzymatischen Wirksamkeit wurde dem Protein durch J.M. McCord und I. Fridovich der Käme Superoxiddismutase (SOD) verliehen (J.Biol. Chem. 244, 6049-6055, 19690-
99M
Untersuchungen mit Tc-markiertem Orgotein haben gezeigt, daß Orgotein nach intravenöser Verabreichung nur kurz im Blut verbleibt. So wurde z.B. 15 min. nach intravenöser Verabreichung des markierten Orgoteins praktisch die gesamte
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Radioaktivität-in den.Nieren-konzeniriert.gefunden. Eine :. ■■-... ähnliche, wenn auch weniger dramatische Anreicherung des Orgoteins in-den Nieren ,.tritt nach subkutaner. Injektion . auf.' In· klinischen Situationen, in denen eine Vielzahl von Orgotein-Injektionen angezeigt ist j wie ·ζ·.Β. bei rheumatoider. Arthritis und anderen chronischen* Ent zündungs ere ehe inungen, . ist es-wünschenswert, das Orgotein so lange wie möglich in den Körperflüssigkeiten zu halten.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, die Halbwertzeit von Orgotein-im Blut nach Injektion erheblich zu verlängern« Dieses. Ziel wird erfindungsgemäß dadurch erreicht, daß man Orgotein mit sich selbst oder mit Serum- oder Gewebeprotein vernetzt. Es wurde gefunden, daß Orgoteinj welches mit sich selbst oder mit Serum- oder Gewebeprotein vernetzt wurde, eine viel längere, z.B. eine 3 bis 10-fache Serumhalbwertzeit als Orgotein selbst aufweist, :
Die vorliegende Erfindung betrifft somit lösliches, injizierbares Orgotein, das mit.sich selbst oder mit injizierbarem Serum- oder Gewebeprotein vernetzt ist, die Erfindung betrifft weiterhin pharmazeutische Präparate für die patenterale Ver- · abreichung:, die im Gemisch mit einem pharazeutisch akzeptablen Träger ein derart vernetztes Orgotein enthalten, und sie betrifft zugleich Verfahren zur Gewinnung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen. .
Es ist höchst überraschend, daß das infolge der Vernetzungstark vergrößerte Molekulargewicht nicht" die pharakodynamische Wirksamkeit, insbesondere die entzündungshemmende Wirkung des Orgoteins nachteilig.beeinflußt. -■·-". .
DjBr hier verwendete .Ausdruck "vernetzt" bedeutet, daß ein Orgoteinmolekül mit mindestens einem anderen Orgoteinmolekül oder mindestens einem injizierbaren Serum- oder Gewebeprotein-
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molekül über ein oder mehrere Verknüpfungssteilen verbunden ist. Die genaue Zahl der Verknüpfungsstellen ist nicht kritisch, so lange die Wasserlöslichkeit erhalten bleibt. Vorzugsweise ist das erfindungsgemäße Orgotein über durchschnittlich 1 bis 5, insbesondere 1 Verknüpfungsstellen vernetzt.
Auch die genaue chemische Natur der Verknüpfungsstellen ist nicht kritisch; diese können nicht-funktionell sein, enthalten jedoch gewöhnlich ein oder mehrere Reste der funktioneilen Gruppen, die in dem Vernetzungsmittel anwesend sind, wie z.B. Carbonylgruppen. Vorzugsweise ist die Vernetzungsgruppe geradkettig und hat ein Molekulargewicht von weniger als 200. Besonders bevorzugt sind Vernetzungsgruppen, die Kohlenwasserstoffe sind, mit Ausnahme zweier Reste in oC- und ^-Stellung der beiden funktioneilen Gruppen des Vernetzungsmittels, die mit dem Protein unter Vernetzung reagiert haben.
Eine Vielzahl von Vernetzungsmitteln ist geeignet, um Orgotein mit sich selbst oder mit Serumalbumin zu vernetzen. Hinweise hierüber findet man bei Finn Wold in O.H.W.Hirs "Methode in Enzymology", Band XI, S.617-640 (1967) und G.E. Means, R.E. Feeney, "Chemical Modification of Proteins.", S.39-42 (1971).
Beispiele für geeignete Vernetzungsmittel sind:
Diisocyanate: O=C=N-(GH0) -W=C=O
2'n
O=C=N-
O=C=N-
N=C=O
(CH2)n
η = 1 bis 8
ortho, meta, para
-N=C=O η = 1-4
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Misothiocyanate: (Entsprechend dem Vorstehendon).
Diimidoester: NH0 NH0
ti l. . ti l «
■ R0C-(CH2)n COR R = Me, At n = 1 - 8
bis(p-Nitrophenyl)disäure-diester:
0 0
X = (CH2)n, η = 1-6, X = -/g)-
Dialdehyde: HOC-(CH2)n~COH, wobei η = 1 bis 6, insbesondere Glutaraldehyd.
Außerdem: 1 ,S-Difluoro^^-dinitrobenzol, p,p'-Difluorom,m'-dinitrodiphenylsulfon, Dimethyladipimidat, Phenol-2,4-disulfonylchlorid; Formaldehyd, Woodward's Reagenz K und Bisdiazobenzidin.
Jedes injizierbare Serum- oder Gewebeprotein, das nichtantigenisch ist, kann zur Gewinnung von mit Protein vernetzten Orgotein verwendet werden. Da Antigenizität zum Teil von der Tierart abhängt, von der das Protein gewonnen wurde (d.h. daß Protein von einer anderen Tierart als dem Empfänger in bestimmten Umfang antigenisch sein kann), und da der Mensch der bevorzugte Patient für die Orgote'in-Therapie ist, sind die bevorzugten Proteine solche vom Menschen. Jedoch sind auch Proteine von anderen Säugetieren, wie Pferd, Rind, Hund, Katze usw. zur Gewinnung von vernetzten Orgotein/ProteinProdukten geeignet, insbesondere dann, wenn diese Produkte für die Therapie dieser Tiere eingesetzt werden sollen. Obgleich also Protein von der gleichen Tierart wie der Patient
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als Ausgangsmaterial bevorzugt ist, ist es nicht entscheidend, daß Protein der gleichen Herkunft verwendet wird, da sich eine antigenische Reaktion im allgemeinen innerhalb tolerabler Grenzen hält.
Vevorzugte Klassen von injizierbaren Proteinen sind Globulin- und Albumin-Proteine. Unter diesen ist Serum-Albumin besonders bevorzugt. .
Ein Beispiel für menschliches Albumin, das als Ausgangsraaterial für vernetztes Orgotein/Albumin geeignet ist, sind stabile menschliche Blutplasma-Proteinfraktionen. Stabile Plasmaproteinfraktionen sind solche, die bei bis zu 60 C bis zu 10 Std. überleben und typischerweise überwiegend aus Albumin sowie geringen Mengen an alpha- und beta-Globulinen bestehen.
Eine bevorzugte Klasse solcher Ausgangsmaterialien ist eine nichthomogene Plasmaproteinfraktion, wie sie z.B. aus dem Überstehenden IV-1 durch Ausfällen mit Methanol (Cohn Methode 6-Verfahren) erhalten wird, und die zu einer 5^-igen Lösung (welche NaCl und einen Stabilisator, wie z.B. Acetyltryptophan und/oder Uatriumcaprylat enthält) wiederaufbereitet und danach 10 Std, auf 6O0C erhitzt worden ist, um Hepatitis-Virus zu zerstören. Diese stabile Plasmaproteinfraktion ist in der JA-PS 265 704 und der US-PS 2 958 628 beschrieben. Eine andere Klasse von geeigneten Ausgangsmaterialien sind lösungen von Plasmaproteinfraktionen, die für kürzere Zeiten, z.B. für etwa 2 bis 10 Std. auf etwa 60 C erhitzt worden sind.
Ein weiteres geeignetes Ausgangsmaterial· ist das iösliche Albumin, das durch Extraktion von menschlicher Placenta mit 1^-iger Kochsalzlösung und vorzugsweise anschließendes Er-
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hitzen in der oben beschriebenen Weise erhalten worden ist. Diese Ausgangsmaterialien· sind in der US-PS 3 876 775 beschrieben. . -: ·
Da die Wahrscheinlichkeit antigenischer Effekte mit zunehmendem Molekulargewicht wächst, haben die vernetzten Orgoteine vorzugsweise ein Molekulargewicht bis zu 500 000 und insbesondere bis zu 200 000, noch besser bis zu 100 000. Werden zwei Orgoteinmoleküle miteinander vernetzt, beträgt das Molekulargewicht des vernetzten Produkts ungefähr 65 000. Wenn drei Orgoteinmoleküle oder ein Orgotein- und ein Serumalbumin-Mo lekül miteinander vernetzt werden, liegt das Molekulargewicht des vernetzten Produkts bei etwa 98 000. Werden zwei Orgoteinmoleküle mit einem einzigen Serumalbuminmolekül vernetzt, ist das Molekulargewicht etwa 131 000. In jedem Falle hängt der genaue Wert von den Molekulargewichten des Albumins und von den Resten des Vernetzungsmittels ab, die die Verknüpfungsstelle bilden.
Das Molverhältnis von Orgotein zu anderem in,]!zierbarem Serum- oder Gewebeprotein kann ermittelt werden, indem das ungefähre Molekulargewicht durch Gelchromatographie oder irgend ein anderes bekanntes Molekulargewichtsbestimmungsverfahren und indem der chelatgebundene Kupfer- und/oder Zinkgehalt bestimmt werden, da Orgotein unter den Proteinen eine Sonderstellung insoweit einnimmt, als es diese beiden •Metalle enthält.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Präparate enthalten ein vernetztes Orgotein gemäß dieser Erfindung und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Die Natur dieses Trägers wird natürlich von der Verabreihungsart bestimmt.
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Das pharmazeutische Präparat ist vorzugsweise ein steriles injizierbares Produkt, z.B. eine sterile wässrige Lösung. Diese Lösung kann in bekannter Weise unter Verwendung der genannten Träger zubereitet werden. Das sterile injizierbare Präparat kann auch eine sterile injizierbare Lösung oder Suspension in einem nicht-toxischen, parenteral akteptablen Verdünnungs- oder Lösungsmittel, wie z.B. 1,3-Butandiol sein.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen enthalten eine wirksame Einheitsdosismenge eines erfindungsgemäßen vernetzten Orgoteins, d.h. sie enthalten das vernetzte Orgotein in einer Konzentration, die ausreicht, um die gewünschte Wirkung hervorzurufen, wenn eine Einheitsdosis auf dem dem gewählten pharmazeutischen Träger angemessenen V/ege verabreicht wird. So können z.B. flüssige Präparate, und zwar sowohl oberflächlich anzuwendende als auch injizierbare, etwa 0,5 bis 20 mg vernetztes Orgotein pro 0,25 bis 10 ml, vorzugsweise pro 0,5 bis 5 ml enthalten, mit Ausnahme von intravenösen Infusionslösungen, die auch stärker verdünnt sein können und z.B. 0,5 bis 20 mg vernetztes Orgotein pro 50 bis 1000 ml, vorzugsweise pro 100 bis 500 ml Infusionslösung enthalten können. Tabletten, Kapseln und Suppositoren enthalten gewöhnlich 0,1 bis 25 mg, vorzugsweise 1 bis 10 mg vernetztes Orgotein pro Einheit.
Vernetztes Orgotein wird gewöhnlich durch Einträufelung oder durch Injektion, z.B. intramuskulär, subkutan, intravenös oder intradermal verabreicht. Die intramuskuläre Verabreichung wird bevorzugt, außer in Fällen von Schock, in denen zur Erzielung einer raschen Wirkung die intravenöse Verabreichung manchmal angezeigt sein kann, und bei bestimmten lokalisierten
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Schäden, wie Strahlungsschäden oder sonstiger Cystitis, bei denen eine lokale Injektion, Einträufelung und/oder Infusion häufig wirksamer ist. Die individuelle Dosis liegt gewöhnlich im Bereich von 0,5 "bis 10 mg; der bevorzugte Bereich ist beim Menschen etwa 0,5 bis 8 mg, beim Pferd etwa 5,0 bis 10,0 mg. Die genaue Dosis ist nicht kritisch und hängt von der Art und der Schwere der Krankheit ab.
Vernetztes Orgotein ist, wie Orgotein selbst, ein wirksames Mittel zur Behandlung von zahlreichen Entzündungserscheinungen einschließlich solcher, bei denen synthetische entzündungshemmende Mittel nur begrenzt verwendet werden können, z.B. wegen toxischer Nebenwirkungen bei längerem Gebrauch.
Vernetztes Orgotein ist insbesondere .brauchbar zur Heilung entzündlicher Zustände und zur Linderung ihrer Nachwirkungen, z.B. solcher in den Harnwegen und in den Gelenken verschiedener Säugetiere. Es kann verwendet werden zur Abschwächung der Symptome und der strukturellen Deformation bei posttraumatischer Arthritis und rheumatoiden Erkrankungen, wie Bursitis, Tendonitis und Osteoarthritis.
Hinweise darauf, wie die als Ausgangsmaterial zu verwendenden Orgotein-Artgenossen isoliert, wie das vernetzte Orgotein angewendet werden können, einschließlich Verabreichungsformen, Dosisformen, Diätregeln und Entzündungs- oder anderen Zuständen, die mit vernetztem Orgotein behandelt werden können, finden sich in der US-PS 3 758 682.
Die Erfindung wird durch die nachstehenden, nicht einschränkenden Beispiele näher erläutert ι
Beispiel 1
Mit Glutaraldehyd vernetztes Rinderorgotein 0,34 mg Rinderorgotein (1,7 mg/ml) reagieren mit ο,2 mg Glutaraldehyd (0,1/0 in o,2 ml 0,0.1 M NaCl plus 0,01 M pH 7,5-Phosphatpufferlösung bei Raumtemperatur innerhalb von 15 min zu einem
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Gemisch, aus elektrophoretisch stärker anodischen (Banden 1-6) Superoxiddismutase (SOD)-Arteh. Das Produkt ist ein Gemisch aus unverändertem Orgotein und solchem Orgotein, das über Aminogruppen mit einem anderen Orgoteinmolekül oder zwei anderen Orgoteinmolekülen vernetzt ist und Molekularvolumina aufweist, die einem Molekulargewicht von etwa 30 000 (unverändertes Orgotein) bis etwa 100 000 entsprechen. Das Orgotein und die vernetzten Orgoteindimeren und -trimeren werden durch Gelchromatographie voneinander getrennt (Sephadex G-200 oder BioGel A 0,5).
Nach dem Verfahren von Beispiel 1 werden unter Verwendung der entsprechenden Orgotein-Artgenossen vom Menschen, Schaf, Pferd, Schwein, Hund, Kaninchen, Meerschweinchen oder Huhn als Ausgangsprotein vernetzte Produkte aus diesen Artgenossen erhalten, in denen 2 oder 3 Orgoteinmoleküle über verknüpfende Glutaraldehydreste miteinander verbunden sind. Diese dimeren und trimeren, vernetzten Produkte können durch Gelchromatographie unter Verwendung von Sephadex G-200 leicht voneinander getrennt werden.
Beispiel 2
Rinderorgotein, das mittels Glutaraldehyd mit Rinderserumalbumin vernetzt ist
Nach dem Verfahren von Beispiel 1 wird Rinderorgotein mit kristallinem Rinderserumalbumin (Miles Laboratories, Pentex Div.) vernetzt, indem ein Gemisch aus 1 mg Orgotein (1,7 mg/ml), 2 mg Rinderserumalbumin (BSA, 3,3 mg/ml) und 0,6 mg Glutaraldehyd (0,1 ft) in 0,6 ml einer 0,01 M NaCl/0,01 M pH 7,5-Phosphatpuffer-Lösung umgesetzt wird. Die Elektrophorese des Reaktionsgemisches läßt die gleichen stärker anodischen (SOD)-Aktivität-Banden wie in Beispiel 1 (Orgotein mit sich selbst vernetzt), plus einer SOD-Aktivität-Bande (mit dem Rinderserumalbumin vernetztes Orgotein) erkennen.
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Die Gelch.romatograph.ie (Bio-Gel A 0,5) zeigt, daß die SOD-aktiven Arten, die rait BSA elektrophoretisch gekoppelt sind, ein Molekularvolumen zwischen dem von BSA und dem von Katalase (Molgew. 100 000 - 200 000) haben und aus Orgotein bestehen, das mit einem Molekül BSA, bzw. aus Orgotein, das mit zwei Molekülen BSA vernetzt ist, und daß die Glutaraldehyd/ Orgotein-Banden, die stärker anodisch sind als Orgotein, ein Molekularvolumen haben, das um das Mehrfache größer ist als das von nativem Orgotein und den vernetzten Orgoteinen entspricht, die in Beispiel 1 erhalten wurden. Die verschiedenen vernetzten Arten werden durch Gelchromatographie wie vorstehend beschrieben getrennt.
Glutaraldehyd-Konzentrationen oberhalb 0,5 i° ergeben homogenere Proteinarten und niedrigere SOD-Gesamtaktivität, was vermutlich durch stärkere Polymerisation und/oder intramolekulare Reaktionen bedingt ist.
Folgt man dem vorstehend beschriebenen Verfahren von Beispiel 2, ersetzt jedoch das BSA durch Serumalbumin vom Menschen, Schaf, Schwein, Hund, Kaninchen, Meerschweinchen oder Huhn, bzw. durch das weiter oben beschriebene hitzestabile menschliche Serumalbumin, dann erhält man den mit dem ,jeweiligen Serumalbumin vernetzten Rinderorgotein-Artgenossen. In ähnlicher Weise werden Orgotein-Artgenossen vom Menschen, Rind oder anderer Herkunft mit menschlichem Globulin, wie z.B. Gammaglobulin vernetzt.
Beispiel 3
Mittels Bisdiazobenzidin vernetztes Orgotein Diazoniumsalze reagieren mit Tyrosin-, Histidin- und LysinResten; deshalb kann ein bifunktionelles Diazoniumsalz ziemlich unterschiedslos zur Vernetzung von Seitenkettengruppen verwendet werden.
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Bisdiazobenzidin wird zubereitet durch. Diazotierung von 33 mg Benzidindihydrochlorid in 10 ml 0,15 M HCl bei O0C mit 25 mg Fatriumnitrit innerhalb 15 min. Der pH-Wert wird mit 6 Ή NaOH auf 7-8 angehoben, und Verdünnungen dieser 10 M starken Lösung werden unter starkem Rühren bei 4 C zu 2,5 mg/ml Orgotein in 0,025 M pH 7,5-Phosphatpuffer gegeben.
Bei pH 7f5 färbt sich, mit 2 χ 10 M Bisdiazobenzidin die Orgotein/Benzidin-Lösung rotbraun.
Die Gelfiltration des Reaktionsgemisches (pH 7,5; 2 χ 10 M Bisdiazobenzidin) durch eine 35 ml Bio-Gel A 0,5-Kolonne liefert eine Reihe von Proteinfraktionen vom Molgewicht 3 x 10 bis zu
5 einem Volumen vom Molgewicht > 5 x 10 . Der Hauptteil der gelben Farbe kommt mit dem Poren-Volumen durch. Die Elektro- ,. phoresis zeigt eine Zunahme in der elektrophoretischen Beweglichkeit und eine Abnahme der SOD-Aktivität mit zunehmendem Molekularvolumen. Das Protein in dem 3 x 10 -Molekulargewichtsbereich, hat eine Bandenstruktur (Banden 1-8) wie leicht modifiziertes natives Protein, aber die Arten mit höherem Molekularvolumen sind elektrophoretisch heterogen. Das vernetzte Produkt ist ein Gemisch von vernetzten Orgoteinen, die aus zwei bis zu etwa zehn Orgoteinmolekülen bestehen, welche durch verknüpfende ρ,ρ'-Aminobiphenylgruppen miteinander verbunden sind.
Bei hohen pH-Werten (9,2) und Bisdiazobenzidin-Konzentrationen über 2 χ 10 M fällt das Orgotein als brauner Niederschlag aus. Ähnlich fällt das meiste Protein bei pH 7,5 und 5,5 x 10 M Bisdiazobenzidin aus.
Das bedeutet, daß Bisdiazobenzidin selbst in geringem ( {'3) molarem Überschuß Orgotein leicht polymerisiert. Größere Überschüsse bewirken jedoch Ausfällung und Verlust an SOD-Aktivität.
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Nach dem Verfahren von Beispiel 3 werden bei Ersatz des Rinderorgoteins durch einen anderen Orgotein-Artgenossen, wie z.B. die in den Beispielen 1 und 2 genannten Artgenossen vom Menschen usw. cLie entsprechenden, über einen Bisdiazobenzidin-Rest vernetzten Artgenossen erhalten.
Beispiel 4
Mittels Dimethylsuberimidat* 2 HCl vernetztes Orgotein Rinderorgotein wird mit Dimethylsuberimidat unter ähnlichen Bedingungen polymerisiert, wie sie von Bartholeyns & Moore, Science 186, 444-445 (1974) an Ribonuclease angewendet wurden.
Das Ausmaß der Polymerisation, beurteilt an der Gelchromatographie, reicht von Dimerisation bis zu höheren Stufen. Durch Erhöhung der Proteinkonzentration und der Pufferkonzentration wächst das durchschnittliche Ausmaß der Polymerisation.
Das Reaktionsprodukt ist somit ein Gemisch von vernetzten Orgoteinen, die aus zwei bis etwa sechs Orgoteinmolekülen bestehen, welche über verknüpfende -NH-(Ah2=)0-(CH2)g-C(fei2)-NH-Gruppen miteinander verbunden sind, und die durch GelChromatographie wie vorstehend beschrieben voneinander getrennt werden können.
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Claims (1)

  1. Pat entansprüche;
    1. Verfahren zur Herstellung eines wasserlöslichen, injizierbaren, vernetzten Orgoteins mit einem Molekulargewicht bis zu 500 000, bei welchem ein Orgoteinmolekül über mindestens eine organische Verknüpfungsgruppe vernetzt wird mit mindestens einem Molekül eines wasserlöslichen, injizierbaren nicht-antigenischen Proteins, dadurch gekennzeichnet, daß man Orgotein oder ein Gemisch aus Orgotein und einem anderen wasserlöslichen, injizierbaren, nichtantigenischen Protein unter an sich bekannten Proteinvernetzungsbedingungen mit einem difunktionalen Vernetzungsmittel umsetzt.
    2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Rinder-Orgotein verwendet.
    3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als das nicht-antigenische Protein ebenfalls Orgotein verwendet.
    4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man
    als nicht-antigenisches Protein ein Globulin oder Albumin verwende"*5·
    5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Serumalbumin verwendet.
    6. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß man Mens chen-S erumalbumin verwendet.
    7· Verfahren nach einem der Ansprüche 3 oder A, dadurch gekennzeichnet, daß man Orgotein mit Serumalbumin im Molverhältnis 1 zu 1-2 vernetzt.
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    8, Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5» dadurch gekennzeichnet, daß man ein Vernetzungsmittel verwendet, das geradkettig ist und ein Molekulargewicht unter etwa 200 hat.
    9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Vernetzungsmittel verwendet, bei welchem die beiden endständigen funktioneilen Gruppen über eine Kohlenwasserstoffgruppe miteinander verbunden sind.
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    i10> Wasserlösliches, injizierbares, vernetztes Orgotein mit einem Molekulargewicht bis zu 500 000, bei welchem Orgoteinmoleküle intermolekular über mindestens eine organische Verknüpf ungsgruppe vernetzt sind mit mindestens einem Molekül eines wass.erloslich.en, injizierbaren, nichtantigenischen Proteins.
    . Vernetztes Orgotein nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Orgotein vom Rind stammt.
    12. Vernetztes Orgotein nach Anspruch 8 oder 9, dadurch, gekennzeichnet, daß das nicht-antigenische Protein ebenfalls Orgotein ist.
    13. Vernetztes Orgotein nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das vernetzte Molekül aus 1 bis 3 vernetzten Orgotein-Molekülen besteht.
    14. Vernetztes Orgotein nach Anspruch 8 oder 9> dadurch gekennzeichnet, daß das nicht-antigenische Protein ein Globulin oder Albumin ist.
    . Vernetztes Globulin nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Albumin Serumalbumin ist.
    16,. Vernetztes Orgotein nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Serumalbumin menschliches Serumalbumin ist.
    17.. Vernetztes Orgotein nach Anspruch 12 oder 13» dadurch gekennzeichnet, daß ein Orgoteinmolekül mit 1 oder 2 Serumalbumin-Molekülen vernetzt ist.
    18,. Vernetztes Orgotein nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß ein Orgoteinmolekül vernetzt ist mit einem Mens chens erumalbumin-Molekül.
    19.. Pharmazeutisches Präparat, dadurch gekennzeichnet, daß es im Gemisch mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger eine entzündungshemmende Dosis eines vernetzten Orgotein gemäß Anspruch 1 enthält. 7fiQ811/infi1
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