FI57761C - Foerfarande foer framstaellning av antiinflammatoriskt vattenloesligt injicerbart tvaerbundet orgotein - Google Patents

Description

R25CT ΓβΊ ««^UUtOTUSjULKAISU ηΊΊΑΛ tBJ ^1) utlAggninqsskript 57761 ?Sas c w Patentti myönnetty 10 10 1930

Patent oeddelat (51) K*.lk?/1nta.3 C 07 G 7/04 SUOMI—FINLAND (21) 762567 (22) HekemtapiMI—AnaMcnlnfadac 07.09.76 (23) AHatpaM—ClMglwadai 07.09.76 (41) Tullut }ulkh*k»l — Bltvtt off«ntll| 10.03.77

Pftturttl. ]· rekisterihallitus (44) NthtiviMpMWfl,. ^ _

Patent· och registerstyrelean ' AmMom uth|d och utUkrtfun publieend 30.06.80 (32)(33)(31) Pyy*·»* etuelkeus—kglrd prtorttat 09.09.75 USA(US) 611658 (71) Diagnostic Data, Inc., 518 Logue Avenue, Mountain View, California " 9fc0U3, USA(US) (72) Wolfgang Huber, Atherton, California, Mark G. Saifer, Berkeley,

California, Levis p. Williams, Menlow Park, California, USA(US) (7^) Oy Kolster Ab (5M Menetelmä tulehduksenvastaisen, vesiliukoisen, injektoitavan, silloitetun orgoteiinin valmistamiseksi - Förfarande för framställning av antiinflammatoriekt, vattenlösligt, injieerbart, tvärbundet orgotein Tämän keksinnön kohteena on menetelmä tulehduksenvastaisen, vesiliukoisen, injektoitavan, silloitetuin orgoteiinin valmistamiseksi, jonka molekyylipaino on korkeintaan 200 000 ja jolla on pitkä vaikutusaika.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että orgoteiini tai orgoteiinin ja toisen veteen liukenevan, injektoitavan, vasta-ainetta synnyttämättömän proteiinin, kuten ihmisen seerumialbumiinin, seos saatetaan reagoimaan bifunktionaalisen silloitusaineen kuten dialdehydin tai bis-diatsobentsidiinin kanssa, joka muodostaa orgaanisen silloitusketjun kahden tai useamman orgoteiini-molekyylin välillä tai vastaavasti yhden tai useamman orgoteiinimolekyylin ja mainitun toisen proteiinin välillä.

Orgoteiini on vesiliukoinen proteiinijohdannainen oleellisesti puhtaassa, injektoitavassa muodossa, so. oleellisesti puhtaana muista proteiiniaineista, ks. amerikkalainen patentti 3 758 682. Amerikkalaisessa patentissa 3 637 6U1 on kuvattu orgoteiinia sekä sen käyttöä niveltulehdusten hoitooni amerikkalaisten 2 57761 patenttien 3 773 928 ja 3 773 929 mukaan orgoteiinivalmisteita voidaan käyttää tiettyjen virussairauksien ja vaikeiden tulehdusten hoitoon. Amerikkalaisessa patentissa 3 781 1U on kuvattu biologinen menetelmä proteiinin määrittämiseksi.

Orgoteiinilla on luonteenomainen fysikaalisten, kerniailisten, biologisten ja farmakodynaamisten ominaisuuksien yhdistelmä. Se on pallomainen, puskuri- ja vesiliukoinen proteiiniyhdiste, jolla on erittäin luja natiivi rakenne, vaikka se on lämpöherkkä\ se on kuitenkin melko stabiili puskuriliuoksessa, jonka pH on U—10, ja kestää 65°C kuumentamisen useita minuutteja. Kemiallisesti orgoteiinille on luonteenomaista, että se sisältää yleensä kaikkia proteiiniaminohappoja, pienen määrän hiilihydraattia, ei lainkaan lipidejä, 0,1-1,0 % metallia, eli 0-5 gramma-atomia (moolia kohti) yhtä tai useampaa kelatoitua kaksiarvoista metallia, jonka ionisäde on 0,60-1,00 Ä, mutta käytännöllisesti katsoen ei lainkaan kelatoimatonta kaksiarvoista metallia eikä myrkyllistä metallia. Orgoteiinilla on kyky katalysoida peroksidiradikaalien hajoamista disproportionoitumalla hapeksi ja vetyperoksidiksi McCord, J.M. ja Fridovich, I.J. Biol. Chem. 2UU, 6oi*9-6055 (1969).

Tutkimukset ^^Tc-merkatulla orgoteiinilla todistavat, että orgoteiini pysyy vain lyhyen aikaa veressä suonensisäisen antamisen jälkeen. Esimerkiksi 15 minuutin kuluessa merkityn orgoteiinin suonensisäisestä antamisesta käytännöllisesti katsoen kaiken radioaktiivisuuden havaittiin keskittyneen munuaisiin. Samanlainen, vaikka vähemmän dramaattinen orgoteiinin kerääntyminen munuaisiin tapahtuu myös ihonalaisen injektoinnin jälkeen. Kliinisissä tilanteissa, joissa useat orgoteiiniruiskeet ovat toivottavia, esimerkiksi reumaattisessa niveltulehduksessa ja muissa kroonisissa tulehdustiloissa, on toivottavaa ylläpitää korkea orgoteiini-taso kehon nesteissä mahdollisimman pitkään.

Nyt on havaittu, että orgoteiinilla, joka on silloitettu itsensä tai seerumi- tai kudosproteiinin kanssa on paljon pitemmät, esim. 3-10-kertaiset seerumi -puoliintumisajat kuin orgoteiinilla itsellään.

On yllättävää havaita, ettei silloittaminen vaikuta haitallisesti orgoteiinin farmakodynaamiseen aktiivisuuteen, vaan silloitetulla orgoteiinilla on hyvä tulehduksia estävä vaikutus.

Sanonta "silloitettu" tarkoittaa tässä käytettynä, että orgoteiinimolekyyli on liittynyt vähintään yhteen muuhun orgoteiinimolekyyliin tai vähintään yhteen injektointikelpoiseen seerumi- tai kudosproteiinimolekyyliin yhden tai useamman silloitusryhmän välityksellä. Orgoteiini on mieluummin silloitettu keskimäärin 1-5 silloitusryhmällä, edullisimmin yhdellä.

Silloitusryhmän tarkka kemiallinen luonne ei ole kriittinen ja se voi olla ei-funktionaalinen, mutta tavallisesti se sisältää yhden tai useampia silloitus-aineessa olevia funktionaalisia ryhmiä, esim. karbonyyliryhmiä. Silloitusryhmä on 3 57761 mieluummin suoraketjuinen ja sen molekyylipaino on alle n. 200. Erityisen suositeltavia ovat siHoitusryhmät, jotka ovat hiilivetyjä lukuunottamatta silloitus-aineen kahta funktionaalista ryhmää niiden c<- ja 6J-asemissa, jotka reagoivat proteiinin kanssa silloittumisen aikaansaamiseksi.

Sopivia silloitusaineita on luetteloitu esim. Finn Wold'in artikkelissa teoksessa "Methods on Enzymology" Voi XI, sivut 617-61+0 (1967); ja G.E. Means, R.E. Feeney, "Chemical Modification of Proteins", sivut 39~^2 (1971); tällaisia silloitusaineita ovat: 1) di-isosyanaatit: 0=C=N-(CH2)n-N*C=0, jossa n = 1-8, esimerkiksi 0=c=Norto-, meta-, para-, N=C=0 ja

0=C=NJgy N=C=0, jossa n = 1-U

2) di-isotiosyanaatit: (yllä olevat vastaavat) + + NHp NH„

Il <= Il c 3) di-imidoesterit: R0C- (CH^COR , jossa R = Me, Et, n = 1-8 li) hi s (p-nitrofenyyli )dihappodi esterit: 0gN 0C-X-C-0— jossa X * (CHg)n, n = 1-6, X = — 5) dialdehydit: CH0-(CH2)n-CH0, jossa n = 1-6, erityisesti glutaarieldehjdi, ja 6) 1,5-difluori-2,1*-dinitrobentseeni , p.p'-difluori-mjm'-dinitrodifenyyli-sulfoni , dimetyyliadipimidaatti , fenoli-2 ,l+-disulfonyylikloridi ; formaldehydi , Woodvard’in reagenssi K ja bis-diatsobentsidiini.

Mitä tahansa injektoitavaa, ei-antigeenista seerumi- tai kudosproteiinia voidaan käyttää proteiinin kanssa silloitetun orgoteiinin tuottamiseen. Koska antigeenisyys on osittain riippuvainen eläinlajista, josta proteiini saadaan, ja proteiini, joka on saatu eri lajista kuin vastaanottava potilas, saattaa olla antigeeninen vaihtelevassa määrin, suositeltavat proteiinit ovat ihmisproteiineja. Kuitenkin muista nisäkäslajeista, kuten hevosesta, lehmästä, koirasta, kissasta jne. saadut proteiinit ovat käyttökelpoisia silloitettujen orgoteiini-proteiini- “ 57761 tuotteiden valmistuksessa, ja tietenkin erityisesti sopivia näillä saman lajin eläinten hoitoon. Vaikka proteiini, joka on saatu samasta eläinlajista, on suositeltava lähtöaineena, ei ole elintärkeää, että käytetään nimenomaan saman eläinlajin proteiinia, koska vasta-ainetta synnyttävä reaktio on tavallisesti siedettävissä rajoissa.

Suositeltavia injektoitavia proteiineja ovat liukoiset globuliini- ja albumiiniproteiinit, erikoisesti seerumialbumiini.

Esimerkki ihmisalbumiinista, joka on sopiva lähtöaineena keksinnön mukaisen menetelmän orgoteiini-albumiinisilloitusosaan, ovat stabiilit ihmisen veriplasman proteiinijakeet, joita ovat ne, jotka kestävät hajoamatta jopa 60°C:ssa jopa 10 tunnin ajan ja jotka koostuvat tyypillisesti etupäässä albumiinista ja pienistä määristä alfa- ja betaglobuliineja.

Sopiva lähtöaine on plasmaproteiinifraktio, joka saadaan nk. Cohnin menetelmällä nesteestä IV-1 seostamalla etanolilla (ks. esim. amerikkalainen patentti 2 958 628, palsta 3), joka proteiinifraktio on muodostettu uudelleen 3~% liuokseksi (joka sisältää NaCl:a ja stabilisaattoria, esim. asetyylitryptofaania ja/tai natriumkaprylaattia) ja kuumennettu sitten 60°C:een 10 tunniksi Hepatitis-viruksen tuhoamiseksi. Tätä stabiilia plasmaproteiinijaetta on kuvattu amerikkalaisessa patentissa 2 958 628. Toisen lähtöaineiden ryhmän muodostavat plasmaproteiinijakei-den liuokset, jotka on kuumennettu n. 60°C:een lyhyiksi ajoiksi esim. n. 2-10 tunniksi.

Toinen sopiva lähtöaine on liukoinen albumiini, joka on saatu uuttamalla ihmisistukkaa 1-% suolaliuoksella ja lämpökäsittelemällä yllä kuvatulla tavalla.

Näitä ja muita sopivia lähtöaineita on kuvattu amerikkalaisessa patentissa 3 876 775.

Koska vasta-aineita synnyttävien vaikutusten todennäköisyys kasvaa molekyyli-painon kasvaessa, silloitetun orgoteiinin molekyylipaino on korkeintaan 200 000.

Kun kaksi orgoteiinimolekyyliä silloitetaan yhteen, silloitetun tuotteen molekyyli-paino on suunnilleen 65 000, Kun kolme orgoteiinimolekyyliä tai yksi orgoteiini-ja yksi seerumialbumiinimolekyyli silloitetaan yhteen, silloitetun tuotteen molekyylipaino on n. 98 000. Kun kaksi orgoteiinimolekyyliä silloitetaan yhden seerumi-albumi inimolekyylin kanssa, molekyylipaino on n. 131 000.

Orgoteiinin ja muun injektoitavan seerumi- tai kudosproteiinin välinen molekyylisuhde voidaan määrittää määräämällä likimääräinen molekyylipaino geeli-kromatografisesti tai muulla tunnetulla menetelmällä, jolla määrätään proteiinien molekyylipainoja tai määräämällä sen kelatoitunut kupari- ja/tai sinkkipitoisuus, sillä orgoteiini on proteiineista ainoa, joka sisältää molempia näitä metalleja.

Silloitettu orgoteiini on tehokas parantamaan tulehdustiloja ja lievittämään niiden vaikutuksia, esimerkiksi niiden, jotka esiintyvät virtsatiehytalueella 57761 ja nivelissä eri nisäkkäillä. Se on käyttökelpoinen lievittämään tapaturman jälkeisen niveltulehduksen ja reumaattisen taudin, kuten limapussintulehduksen, jänne-tulehduksen ja luuniveltulehduksen oireita ja niihin liittyviä rakenteellisia epämuodostumia.

Farmakologisten kokeiden tulokset Määritettiin keksinnön mukaisesti valmistettujen silloitettujen orgoteiini-valmisteiden tulehdusta ehkäisevä vaikutus aiheuttamalla karrageenaanilla (0,02-0,2 ml, 1-2 %, keittosuolaliuos) turvotusta koe-eläimen (Webster-hiiri, paino 20-23 g, tai Sprague-Dawley-rotta, paino 172-205 g) takajalkaan tai selkään, ja määrittämällä tutkittavalla aineella käsiteltyjen eläinten ja vastaavasti vertai-^ lueläinten turvotuskohdan paino, kun noin 1 vuorokausi oli kulunut karrageenaanin antamisesta. Tutkittavaa ainetta annettiin kahdessa erässä, toinen ruiske 2-3 tuntia ennen karrageenaanin antamista, ja toinen 1-2 tuntia karrageenaanin antamisen jälkeen. Tulokset on esitetty seuraavissa taulukoissa.

Taulukko I

Turvonneen kohdan Annettu aine Inhibointi (%) paino (mg) 307 i 8,1* suolaliuosta 236 +36,7 8 mg/kg BSA-orgoteiinia 23,1 % 255 + 51 ,2 8 mg/kg Palosein-orgote- 16,9 % iinia 239 +30,6 8 mg/kg glutaarialdehydillä 22,2 %

Silloitettua BSA-orgoteiinia

Taulukko II

Turvonneen kohdan Annettu aine Inhibointi (%) paino (mg) 57,1 + 8,6 suolaliuosta 29,6 + 5,72 1,0 mg/ml Palosein- U8,16 % orgoteiinia 35.0 + 11,80 1,0 mg/ml DMS-orgoteiinia 38,70 % 28.0 + 5,58 1,0 mg/ml glutaarialdehydilla 50,96 % silloitettua orgoteiinia x) valmistaja Miles Laboratories, Pentex Div, 6 57761

Taulukko III

Annettu aine Inhibointi {%) 0,9 mg/kg bis-diatsobentsidiinillä silloitettua 53 polyorgoteiinia 1 mg/kg glutaarialdehydillä silloitettua 25 polyorgoteiinia 3 mg/kg " 32 10 mg/kg " 51

Esimerkki 1

Glutaarialdehydillä silloitettu naudan orgoteiini

Sekoitetaan 0,3^ mg naudan orgoteiinia (17 mg/ml) ja 0,2 mg glutaari-aldehydiä (0,1 $), sekä 0,2 ml 0,01-m NaClm ja 0,01-m pH 7,5 - fosfaattipuskurin seosta 15 minuuttia huoneen lämpötilassa ja erotetaan elektroforeettisesti, anodi-set nauhat 1-6, jotka sisältävät peroksidi-dismutaasia (S0D). Tuote on orgoteiinin ja silloitetun orgoteiinin seos. Silloitusryhmä on aminoryhmä ja seoksen molekyyli-tilavuus vastaa molekyylipainoa n. 30 000 (muuttumaton orgoteiini) - n. 100 000, eli seoksessa on orgoteiinin dimeerejä ja trimeerejä. Orgoteiini ja orgoteiinidi-meeri ja -trimeeri erotetaan geelikromatografieesti (Sephadex G-200, valmistaja Pharmacia Fine Chemicals, New Jersey, USA, tai Bio-Gel A 0,5, valmistaja Bio Red Laboratories, Kalifornia, USA).

Esimerkki 2

Naudan orgoteiini, joka on silloitettu naudan seerumialbumiiniin glutaarialdehydillä

Noudattaen esimerkin 1 menettelyä naudan orgoteiini silloitetaan kiteiseen naudan seerumialbumiiniin (Miles Laboratories, Pentex Div.) sekoittamalla 1 mg proteiinia (1,7 mg/ml), 2 mg naudan seerumi albumiinia (BSA, 3,3 mg/ml) ja 0,6 mg glutaarialdehydiä (0,1 %), sekä 0,6 ml 0,01-m NaCl:n ja 0,01-m pH 7,5 - fosfaatti-puskurin seosta. Reaktioseoksen elektroforeesi osoittaa anodisia (S0D)-aktiivisia nauhoja, kuten esimerkissä 1, nimittäin orgoteiini on silloitettuna itsensä kanssa, ja lisäksi SOD-aktiivinen nauha, joka kulkee BSA:n mukana, jolloin orgoteiini on silloitettuna naudan seerumialbumiiniin.

Geelikromatografia (Bio-Gel A 0,5) osoittaa, että SOD-sktiivisella aineella, joka kulkee BSA:n mukana, on molekyylitilavuus, joka on BSA:n ja katalaasin mole-kyylitilavuuksien välillä (molekyylipaino 100 000 - 200 000), eli se on orgoteiini silloitettuna yhden molekyylin kanssa BSA:a ja orgoteiini silloitettuna kahden molekyylin kanssa BSA:a, ja että glutaarialdehydi-orgoteiinijohdannaisilla, jotka ovat "anodisempia" kuin orgoteiini, on molekyylitilavuus, joka on useita kertoja suurempi kuin luonnon orgoteiinilla, eli ne vastaavat esimerkissä 1 saatuja 57761 silloitettuja orgoteiineja. Eri silloitetut orgoteiinit erotetaan geelikromatografi-sesti yllä kuvatulla tavalla.

Yli 0,5 %in glutaarialdehydipitoisuudet antavat heterogeenisempia tuotteita ja pienemmän kokonais-SOD-aktiivisuuden johtuen todennäköisesti suuremmasta poly-meroitumisasteesta.

Esimerkki 3

Bis-diatsohentsidiinillä silloitettu orgoteiini

Diatsoniumsuolat reagoivat tyrosiini-, histidiini- ja lysiinijäännösten kanssa, joten hifunktionaalista diatsoniumsuolaa voidaan käyttää silloittamaan sivuketjuryhmiä melko umpimähkäisesti.

" Bis-diatsohentsidiini valmistetaan diatsotoimalla hentsidiinihydrokloridia (33 mg) 0,15-m HClrssä (10 ml) 0°C:ssa natriumnitriitillä (25 mg) 15 minuutin _2 ajan. pH nostetaan arvoon 7-8 6-n NaOH:lla ja saadun 10 -liuoksen laimennuksia ^ lisätään nopeasti sekoittaen l*°C:ssa 2,5 mg taan naudan orgoteiinia, liuotettuna 1 mitään pH 7,5-fosfaattipuskuriin (0,025~m).

-U

pH-arvon ollessa 7,5 ja bxs-dxatsobentsidixnxpitoxsuuden ollessa 2 x 10 orgoteiinibentsidiiniliuos muuttui hitaasti punaruskeaksi. Kun tämä seos geeli- 3 . .

suodatetaan käyttäen 35 cm tn Bxo-Gel A 0,5~kolonnia, saadaan sarja protexxnxfrak-

... U

txoxtai molekyylxpaxno vaxhtelee 3 x 10 ista axna geelxn huokostilavuuden määräämään maksimimolekyylipainoon, >5 x 10^. Suurin osa keltaisesta väristä tulee läpi maksimin kohdalla. Elektroforeesi osoittaa elektroforeettisen liikkuvuuden kasvua ja SOD-aktiivisuuden laskua molekyylitilavuuden kasvaessa. Molekyylipainoalueella 3 x 10 olevan proteiinin nauhat (nauhat 1-8) ovat samantapaiset kuin hieman modifioidun luonnon proteiinin nauhat, mutta suuremman molekyylitilavuuden omaavat aineet ovat elektroforeettisesti heterogeenisia. Silloitettu tuote on silloittu-neiden orgoteiinien seos, jotka koostuvat 2 - n. 10:stä orgoteiinimolekyylistä, jolloin ρ,ρ'-aminobifenyyliryhmät muodostavat siltoja.

pH-arvon ollessa korkea (9,2) ja his-diatsobentsidiinipitoisuuden ollessa -1* ylx 2 x 10 -m orgotexxnx saostuu ruskehtavana sakkana. pH-arvon ollessa 7,5 J& -5 " bxs-dxatsobentsxdxxnxpxtoxsuuden 5,5 x 10 -m suurxn osa protexxnxsta saostuu.

Näin ollen bis-diatsobentsidiini polymeroi helposti orgoteiinin, jopa sen molaarisen ylimäärän ollessa pieni (<3). Suuret bis-diatsobentsidiiniylimäärät aiheuttavat kuitenkin saostumista ja SOD-aktiivisuuden menetystä.

Esimerkki ^

Orgoteiini, joka on silloitettu dimetyylisuberimidaattihydrokloridilla Naudan orgoteiini polymeroidaan dimetyylisuberimidaateilla käyttäen samanlaisia olosuhteita kuin Bartholeyns Sf Moore, Science, 186, 1+h5 (197^) käytti vät ri bonukleamiille.

8 57761

Saadun polymeroitumisen määrä vaihtelee aina dimeroitumisesta eteenpäin (geelikromatografinen analyysi). Proteiini- ja puskuripitoisuuden kasvaessa poly-meroitumisaste nousee.

Reaktiotuote on näin ollen silloittuneiden orgoteiinien seos; silloitetut orgoteiinit koostuvat 2 - noin 6 orgoteiinimolekyylistä, joita sillat + + -NH-(NH2=)C-(CH2)g-C(=NH2)-NH- yhdistävät, ja ne voidaan erottaa geelikromatogra-fisesti yllä kuvatulla tavalla.

Naudan orgoteiini (5,5 mg) liuotetaan 9,5 ml:aan pH-arvoltaan 10 olevaa 0,1-m fosfaattipuskuria, lisätään 0,5 mg dimetyylisuberimidaattidihydrokloridia ja sekoitetaan 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa; pH pidetään arvossa 9,8-10,0 . 3 0,1-m NaOH:lla. Reaktioseos kaadetaan 35 cm :n Βίο-Gel A 0,5-kolonniin, joka on täytetty 0,1-m NH^OActlla, jonka pH on 8, reaktion päättämiseksi ja proteiinin fraktioimiseksi koon mukaan. Suurin osa proteiiniaineesta eluoituu yhä luonnon orgoteiinin mukana, vaikka elektroforeesi osoittaa SOD-aktiivisten aineiden nauhoja (-U...+3). Loppuosa proteiiniaineesta (n. 1/1» koko proteiinimäärästä) eluoituu korkeampien molekyylipainojen kohdissa; suurin osa tästä on orgoteiinin di-meeriä. Suurimolekyylinen proteiini erottuu epäselvästi elektroforeettisesti nauhojen 1-3 kohdalla.

Esimerkki 5

Orgoteiini, joka on silloitettu dimetyylisuberimidaattidihydrokloridilla Samalla tavoin kuin esimerkissä h 20 mg:n naudan orgoteiinia annetaan reagoida 0,5 mg:n kanssa dimetyyli suberimi daattidihydroklori di a 0,5 ml:ssa 0,5-m Na2HP0^:a, joka on säädetty pH-arvoon 10 0,1-m Na0H:lla. Tunnin kuluttua huoneenlämpötilassa reaktio päätetään lisäämällä 50 ^il 6-n NH^OAc:a. Geelikromatografia osoittaa, että läsnä on vain vähän polymeroitumatonta orgoteiinia; muodostuneet orgoteiinipolymeerit ovat etupäässä trimeerejä ja tetrameerejä.