PL99599B1 - Sposob otrzymywania tolerowanej srodzylnie gammaglobuliny - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania tolerowanej sródzylnie gammaglobuliny z surowego osadu gammaglobuliny, który uzyskano w znany sposób, np. przez frakcjonowanie krio-etanolowe, przez przeprowadzenie w stan nierozpuszczalny czesci gammaglobuliny przeciwdzialajacej dopelniaczowi, w którym surowy osad gammaglobuliny rozpuszcza sie ponownie w roztworze wodnym, który zawiera polimer rozpuszczal¬ ny w wodzie i ewentualnie substancje buforowa i nastepnie wytraca sie ponownie.Do substancji rozpuszczonych w osoczu krwi, nalezy miedzy innymi gammaglobulina, która stosuje sie do leczenia i zapobiegania zakazeniom. W celu wyodrebnienia gammaglobuliny z krwi musza zostac usuniete mozliwie wszystkie inne substancje, zawarte w osoczu, aby uzyskac mozliwie czysta gammaglobuline.W celu stracenia i wyodrebnienia gammaglobuliny z krwi stosuje sie w szczególnosci sposób znany pod nazwa metody „Cohn'a" (Cohn et al, J. Amer. Soc, tom 68, str. 459 - 475, tom 72, str. 465-474). W sposobie tym jako produkt wyjsciowy stosuje sie mieszane osocze z róznych próbek krwi. Jest to w zasadzie stracanie frakcjonowane w róznych warunkach. W pierwszym etapie oddziela sie najpierw w temperaturze minus 3°C i przy wartosci pH = 7,2 przy dodatku etanolu 8% jako pierwszy osad fibrynogen. Znajdujaca sie w górnej warstwie ciecz straca sie w drugim etapie za pomoca okolo 19% etanolu przy pH = 5,6. Osad zawiera glównie gammaglobuline.W celu oczyszczenia tego osadu, okreslonego jako frakcja Cohn'a, II-III, rozpuszcza sie go ponownie i najpierw wytraca powtórnie przy pH = 7,2 i za pomoca 8% etanolu. Pozostala górna warstwe straca sie nastepnie ponownie za pomoca 25% etanolu przy pH = 7,2. Powstajacy przy tym surowy osad sklada sie z co najmniej 90% gammaglobuliny. Osad pobiera sie w odpowiednim roztworze buforowym i po jalowym przesaczeniu jest on gotów do zastosowania dla czlowieka.Okazalo sie, ze w licznych przypadkach preparaty gammaglobuliny, które zostaly otrzymane w opisany lub inny sposób, maja dzialanie przeciwdzialajace dopelniaczowi, tak ze przy podawaniu srodzyInym powstaja komplikacje z powodu reakcji wlasciwych cialu.2 99 599 Próbowano dlatego zwiekszyc znosnosc sródzyIna gammaglobulin przez dalsze oczyszczanie surowego osadu. Znany jest z brytyjskiego opisu patentowego nr 1372953 (South African lnventions Development Corporation) sposób, w którym czesc gammaglobuliny, przeciwdzialajaca dopelniaczowi, przeprowadza sie w roztworze wodnym w stan nierozpuszczalny, dodajac rozpuszczalna w wodzie sól lub rozpuszczalny w wodzie liniowy, nitkowaty nie posiadajacy ladunku elektrycznego polimer, który z denaturowanymi, to znaczy czynnymi przeciwdzialajaco dopelniaczowi, skladnikami gammaglobuliny tworzy kompleks nierozpuszczalny, tak, ze mozna je wyodrebnic. Korzystnie wedlug wymienionego brytyjskiego opisu patentowego stosuje sie poliglikol etylenowy.Okazalo sie, ze znany sposób jest stosunkowo niewydajny, poniewaz poliglikol etylenowy jest ogólnie srodkiem stracajacym dla gammaglobulin, który zatem nie wytraca selektywnie skladników przeciwdzialajacych dopelniaczowi lecz wytraca równiez skladniki niedenaturowane. Ponadto udzial naturalnych czsteczek w otrzy¬ manym produkcie nie wynosi 100%. Zdolnosc do skladowania otrzymanej gammaglobuliny nie jest równiez optymalna.W przeciwienstwie do tego zadaniem wynalazku jest uzyskanie z surowego osadu gammaglobuliny zduza "wydajnoscia takiej gammaglobuliny, w której zawartosc naturalnych czasteczek gammaglobuliny praktycznie wynosi 100%, tak ze aktywnosc przeciwdzialajaca dopelniaczowi jest calkowicie stlumiona i globulina nadaje sie do zastosowania sródzylnego. Powinna byc równiez znacznie zwiekszona zdolnosc do skladowania nowego produktu.Zadanie to rozwiazano wedlug wynalazku w ten sposób, ze surowy osad gammaglobuliny pobiera sie w roztworze wodnym, w którym zawarta jest skrobia hydroksyetylowa o ciezarze czasteczkowym 1000—900 000 w stezeniu 1—30% wagowych, przy czym z tego roztworu wytraca sie skladnik przeciwdzialajacy dopelniaczowi w znany sposób przez dodanie rozpuszczalnych w wodzie polimerów jako srodków stracajacych.Skrobia hydroksyetylowa dziala zatem nie jako srodek stracajacy, lecz sluzy do oddzielenia denaturowa¬ nych czasteczek od tych, które sa otrzymywane. Powoduje ona ochrone nieskupionych czasteczek gammaglobu¬ liny przed straceniem. Przez dodanie skrobi hydroksyetylowej znacznie polepszone jest nastepujace, znane stra¬ canie, pod wzgledem dokladnej selektywnosc;.Roztwór surowego osadu gammaglobuliny w buforowanym roztworze skrobi hydroksyetylowej zawiera zatem skladniki ulegajace i nie ulegajace stracaniu. Uwalnia sie go w nastepujacym frakcjonowanym procesie stracania, np. za pomoca poliglikolu etylenowego, od skladników wytracajacych sie to znaczy przeciwdzialaja¬ cych utleniaczowi. W tym celu korzystnie do roztworu skrobi hydroksyetylowej z surowym osadem dodaje sie w pierwszym etapie 10% poliglikolu etylenowego. Zostaja przy tym wytracone i nastepnie odwirowane skladniki, przeciwdzialajace utleniaczowi.Mieszanine odwirowuje sie. Pozostajaca górna warstwe zadaje sie przy pH = 7,0-7,2 20% poliglikolu etylenowego i ponownie odwirowuje. Otrzymany teraz osad zawiera praktycznie calkowicie czysta gammaglobu- line. Rozpuszcza sie go korzystnie w fizjologicznym roztworze soli kuchennej i doprowadza do stezenia okolo % bialka. Po jalowym przesaczeniu otrzymuje sie roztwór do stosowania terapeutycznego, w szczególnosci sródzylnego.Surowy osad gammaglobuliny pobiera sie korzystnie w buforowanym roztworze skrobi hydroksyetylowej, który ma wartosc pH =3,5,-8,0 lub optymalnie 6,5—6,9.Zawartosc skrobi' hydroksyetylowej wynosi korzystnie 8—10% wagowych przy czym optimum dzialania uzyskuje sie wtedy gdy zawartosc surowego osadu gammaglobuliny w roztworze wynosi 6% wagowych.Poszczególne etapy procesu wyjasnia nastepujacy przyklad.P r z y k l a d.Wytwarzanie surowego osadu gammaglobuliny. Jako material wyjsciowy stosuje sie zgroma¬ dzona plazme z krwi ludzkiej. W celu wywolania reakcji stracania zadaje sie ja 8% wagowych etanolu przy wyrtosci pH = 7,2 w temperaturze minus 3°C. Z plazmy wydziela sie tak zwana frakcje I wedlug Cohn'a.Ciecz w górnej warstwie zadaje sie nastepnie w temperaturze minus 5°C i przy wartosci pH = 5,8 19% etanolem.Wydziela sie tak zwana frakcja II-III, która sklada sie z gammaglobulin. Osad rozpuszcza sie ponownie i straca powtórnie przy pH = 5 i 8% etanolem. Pozostala górna warstwe straca sie nastepnie ponownie za pomoca 25% etanolu przy pH = 7,2. Powstajacy przy tym osad surowy = frakcji II, sklada sie z co najmniej 90% gammaglobu¬ liny.Obnizenie dzialania przeciwdzialajacego dopelniaczowi. W celu dalszego oczyszczenia surowego osadu gammaglobuliny rozpuszcza sie go ponownie w buforowanym roztworze wodnym o wartosci pH = 6,7 w steze¬ niu 6%. W tym roztworze wodnym rozpuszczonych jest dalej okolo 10% wagowych skrobi hydroksyetylowej.Skrobia hydroksyetylowa sama nie powoduje reakcji stracania, lecz umozliwia rozdzielenie pozadanych i niepoza¬ danych skladników gammaglobuliny.99 599 3 Wlasciwe stracanie przeprowadza sie w znany sposób, Do roztworu surowego osadu doprowadza sie 10% wagowych poliglikolu etylenowego. Wydzielaja sie przeciwdzialajace dopelniaczowi skladniki gammaglobuliny przez tworzenie nierozpuszczalnych kompleksów. Mieszanine odwirowuje sie. Pozostala górna warstwe, która zawiera czysta gammagJóbuline, zadaje sie jeszcze raz przy pH = 7,2 20% wagowych poliglikolu etylenowego.Oddziela sie osad czystej gammaglobuliny. Ten odwirowuje sie i ponownie pobiera w fizjologicznym roztworze soli kuchennej i doprowadza do stezenia 5,2% bialka i nastepnie saczy jalowo. Po tym otrzymuje sie produkt gotowy do zastosowania terapeutycznego. Preparat zawiera gammaglobuline o wysokiej czystosci, który nadaje sie do stosowania sródzylnego.* Na zalaczonych rysunkach przedstawiono wzór strukturalny skrobi hydroksyetylowej oraz wykresy odpornosci-elektroforezy (IEP) róznych gammaglobulin lub normalnych surowic, które zostaly wytworzone wedlug znanych metod lub nowym sposobem wedlug wynalazku. Górna czesc wykresu wskazuje przy tym kazdorazowo wykresy IEP normalnych surowic krwi, podczas gdy dolne czesci wskazuja wykresy nastepujacych substancji: a/ wzorcowej gammaglobuliny b/proteolitycznie modyfikowanej gammaglobuliny, c/gammaglobuliny modyfikowanej betapropiolaktonem, d/ gammaglobuliny, wytworzonej sposobem wedlug wynalazku.W przypadku prób wedlug wykresów a/ do c/ chodzi kazdorazowo o zmodyfikowany preparat, znajdujacy sie w handlu. Preparat, otrzymany wedlug brytyjskiego opisu patentowego nr 1372 953, nie jest dostepny w handlu. Te próby oprócz linii gammaglobuliny (podluzna linia w ksztalcie sierpa w prawym zakresie wykresu) wykazuja jeszcze dalsze skladniki bialkowe krwi ludzkiej. Linie gammaglobuliny w próbach a/ i b/ wskutek modyfikacji chemicznej przedstawione sa nieostro. Próba c/ wykazuje zmienione polozenie w porównaniu z linia gammaglobuliny surowicy porównawczej.Natomiast okazuje sie wyraznie, ze próba d/ sklada sie praktycznie wylacznie z czystej gammaglobuliny, poniewaz linia widma o ksztalcie sierpa zawarta jest wyraznie w normalnej surowicy.Z wykresów mozna odczytac, ze gammaglobulina otrzymana sposobem wedlug wynalazku jest praktycznie w 100% czysta i odpowiada calkowicie gammaglobulinie pierwotnej surowicy krwi. To ostatnie oznacza, ze czasteczki nie sa zmodyfikowane albo chemicznie zmienione. Z tych wlasciwosci wynikaja równiez dalsze korzystne wlasciwosci gammaglobuliny, wytworzonej sposobem wedlug wynalazku, mianowicie jej absolutnie pewna znosnosc sródzylna i silnie zmniejszone przeciwdzialanie dopelniaczowi wobec wlasciwych cialu substancji obronnych w dzialaniu in vitro.Dalsza zalete stanowi szczególnie duza trwalosc podczas skladowania gammaglobulin, wytworzonych sposobem wedlug wynalazku. PL

Claims (5)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób otrzymywania tolerowanej sródzylnie gammaglobuliny z surowego osadu gammaglobuliny, otrzymanego przez frakcjonowanie krio-etanolowe, przez przeprowadzenie wstan nierozpuszczalny czesci gammaglobuliny przeciwdzialajacej dopelniaczowi, w którym surowy osad gammaglobuliny rozpuszcza sie ponownie w roztworze wodnym, który zawiera polimer rozpuszczalny w wodzie i ewentualnie substancje buforowa, i nastepnie ponownie wytraca, znamienny tym, ze surowy osad gammaglobuliny pobiera sie w roztworze wodnym, w którym zawarta jest skrobia hydroksyetylowa o ciezarze czasteczkowym 1000— 900000 w stezeniu 1—30% wagowych i nastepnie wytraca sie z roztworu skladnik przeciwdzialajacy dopelnia¬ czowi przez dodanie polimeru, rozpuszczalnego w wodzie.
2. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze surowy osad gammaglobuliny rozpuszcza sie w buforowanym wodnym roztworze skrobi hydroksyetylowej o wartosci pH = 3,5—8,0.
3. 3. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze surowy osad gammaglobuliny rozpuszcza sie w wodnym roztworze skrobi hydroksyetylowej o wartosci pH = 6,5—6,9.
4. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze surowy osad gammaglobuliny rozpuszcza sie w roztworze wodnym, który zawiera 8—10% wagowych skrobi hydroksyetylowej.
5. 5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze rozpuszcza sie 6% wagowych surowego osadu gammaglobuliny w roztworze zawierajacym 10% wagowych skrobi hydroksetylowej.99 599 Fi9 *"°H0H2C ° "& OCH2CH2OH OCH2CH2OH V**t Prac. Poligraf. UP PRL naklad 120 + 18 Cena 45 zl PL