INTERFERON ET PREPARATION LE CONTENANT.
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ron et de compositions en renfermant, ainsi que leur utilisation pour le traitement ou la prévention de certaines maladies.
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blié par Kodansha, Ltd; Tokyo, 1975), par D.A.J. Tyrrell �Interferone and its clinical potential", publié par William Heinemann Médical Books, Ltd, Londres, 1976), et dans "Protein, Nucleic acid
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Ltd, Tokyo, interferon est un terme utilisé pour définir une sub-
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rement par des cellules vivantes, lors de leur exposition à des inducteurs tels que virus, bactéries, protozoaires, rickettsies, acide nucléique, endotoxine ou polysaccharide, et qui se révèle active pour inhiber, de manière non spécifique, la multiplication de différents virus dans les cellules. Depuis sa découverte, l'interferon est considéré comme un agent thérapeutique et préventif prometteur pour le traitement des maladies virales.
Ces dernières années, on lui a reconnu une activité antitumorale à la fois sur les tumeurs virales et non virales..
Comme l'interferon est spécifique de l'espèce considérée, seul l' . interferon provenant de cellules humaines, vivantes, se révèle efficace pour la prévention et le traitement des maladies de l'homme*
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est obtenu par séparation à partir de sang frais, mais sa conservation et son alimentation, en grande quantité et à faible coût, sont très difficiles,
On a aussi essayé d'utiliser, pour la production d'interferon, des cellules vivantes, obtenues par ensemencement de cellules humaines
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tefois, les procédés in vitro ne sont pas utilisables sur une large
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une grande quantité de serum humain, et de donner une multiplication instable, une faible vitesse de multiplication et une faible concentration cellulaire.
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voir une production industrielle d'interferon suffisante, pour la prévention et le traitement des maladies chez l'homme.
La présente invention permet d'éviter ces inconvénients de l'art antérieur et d'obtenir une production industrielle facile- <EMI ID=9.1>
traitement de certaines maladies.
Le nouveau procédé selon l'invention consiste à transplanter des cellules humaines, classées, c'est-à-dire "établies", à des animaux à sang chaud, ou à ensemencer ces cellules dans une chambre de diffusion où elles se multiplient; tandis que l'animal les alimente au moyen de ses fluides du corps nutritifs et à exposer les cellules résultantes, in vitro ou in vivo, à l'action d'un
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bien plus efficace que celui de l'art antérieur pour la prévention ou le traitement de certaines maladies.
Comparé aux procédés classiques de l'art antérieur, utilisés pour la multiplication des cellules in vitro, le procédé selon l'invention présente l'avantage de ne pas exiger, ou d'exiger beaucoup moins de milieu nutritif complété avec du sérum humain coûteux il présente également l'avantage d'un maintien beaucoup plus facilede la multiplication des cellules établies et d'une activité
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cellules humaines établies peuvent se multiplier facilement dans les corps d'autres animaux à sang chaud, soit par transplantation directe des cellules dans ceux-là, ou bien par introduction d'une chambre de diffusion contenant ces cellules dans un animal ali-
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avec son fluide de corps nutritifs. De plus, comparé aux procédés classiques in vitro, le.procédé selon l'invention présente les caractéristiques supplémentaires d'une multiplication plus rapide et plus stable des cellules humaines établies, et de la possibilité d'obtenir une production plus forte de cellules et un rendement supérieur en lnterferon.,
On peut utiliser toutes les cellules humaines établies, susceptibles de se-multiplier facilement une fois transplantées dans le corps d'autres animaux à sang chaud. Par exemple, on peut utiliser conformément à l'invention des cellules humaines établies
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cellule HUF-2, et cellule WI-38, décrites dans *Protein,, Nucleic
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Shuppan Co. Ltd, Tokyo, et des cellules établies dérivées de cellules de tumeurs humaines telles que cellule Namalva décrite dans Journal of Clinical Microbiology, Vol. 1, pp. 116-117 (1975), cellule BALL-1, cellule TALL-1 et cellule NALL-1 décrites par Isao <EMI ID=15.1>
On peut se servir, conformément à l'invention, de tout ,animal à sang chaud, pourvu que les cellules humaines, établies,
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de la volaille comme poulet ou pigeon, et des mammifères comme chien, chat, singe, chèvre, bovin, cheval� lapin, cobaye, rat, hamster, souris normale et souris nue.
Comme les animaux sont susceptibles de présenter des immuno-réactions indésirables, lors de la transplantation chez eux des cellules humaines établies, il est de beaucoup préférable d'utiliser des animaux sous la forme la plus prématurée possible, savoir oeuf, embryon, foetus, animal jeune ou nouveau-né, pour exploiter l'immuno-paralysie. Préalablement à la transplantation des cellules, l'animal peut être prétraité par irradiation aux rayons X ou gamma à 200-600 rem, ou bien avec un antisérum ou un agent immuno-suppresseur qui diminue les immuno-réactions.
La souris "nue" est souhaitable comme animal à sang
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y transplanter sans prétraitement des cellules humaines établies, qui s'y multiplient rapidement. La multiplication des cellules humaines établies peut être de plus stabilisée par une première transplantation chez le hamster, suivie d'une transplantation dans la souris "nue", où est provoquée la formation d'interferon à activité accrue. Dans ce cas, les cellules multipliées sont à nouveau transplantables du corps d'un animal à sang chaud au corps d'un
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homme. Les cellules humaines établies peuvent être transplantées
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Au lieu de les faire se multiplier directement dans les corps des animaux, on peut ensemencer les cellules humaines établies, dans une chambre de diffusion, de forme et de dimension variables, munie d'une membrane filtrante dont les pores mesurent
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ultra-filtre ou fibre creuse, et placer cette chambre dans le corps d'un animal, par exemple dans le péritoine, afin de permettre l'alimentation des cellules au moyen des fluides nutritifs du corps de l'animal.
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Eventuellement, la multiplication des cellules humaines établies, peut être réalisée dans la chambre de diffusion avec circulation du fluide nutritif du corps de l'animal à sang chaud, à l'intérieur et l'extérieur du milieu nutritif de la chambre. Dans ce cas, si la chambre est située sur le corps de l'animal, on peut observer au travers de la paroi de la chambre où en est la multiplication, et le nombre de cellules par animal peut être encore accru, sans sacrifier sans nécessité l'animal, par l'enlèvement de la chambre, ensemencement des cellules dans une autre chambre contenant un milieu nutritif frais et mise en place de cette dernière sur le même animal.
Le procédé avec chambre de diffusion permet d'utiliser tout animal à sang chaud, sauf l'homme, pour la multiplication des cellules humaines établies, sans nécessité d'un prétraitement pour déprimer les immuno-réactions ; de plus dans ce cas, les cellules multipliées dans la chambre peuvent être récoltées facilement sans contamination par les cellules de l'animal, puisqu'il n'y a pas de contact direct entre elles, et il n'y a pas de danger de réactions indésirables.
Après la transplantation des cellules humaines, l'animal est alimenté selon le procédé habituel, sans traitement spécial.
La durée de la multiplication des cellules humaines établies est ordinairement de 1 à 20 semaines. Lorsque les cellules établies, transplantées, proviennent de leucocytes humains, normaux ou tumoraux, la vitesse de multiplication cellulaire est si rapide qu'elle peut s'achever habituellement en 1 à 5 semaines.
On trouve que le nombre des cellules humaines multipliées est de l'ordre de 10 7 à 10<1><2> ou plus, par. animal.
Autrement dit, les procédés selon l'invention sont très avantageux pour la production d'interferon, car le nombre de cellules transplantées ou ensemencées dans l'animal, est multiplié
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obtenu par les procédés antérieurs, in vitro, de multiplication des mêmes cellules en milieu nutritif.
. Les cellules humaines vivantes, multipliées" peuvent être amorcées par tout procédé connu pour produire l'interferon. La partie du corps de l'animal où les cellules se multiplient peut être exposé à l'action d'un agent de formation d'interferon. Par <EMI ID=23.1> <EMI ID=24.1>
l'agent de production d'interferon, des cellules humaines en cours de multiplication, en suspension dans la cavité péritonéale, ou des cellules humaines tumorales, formées sous la peau, suivie de .la collecte et de la purification de l'interferoH ainsi obtenu. La formation d'interferon peut également s'effectuer par récupération des cellules humaines multipliées à partir du corps de l'animal, suivie par leur exposition in vitro à l'action <EMI ID=25.1>
humaines, obtenues par collecte dans la cavité intrapéritonéale après multiplication, ou celles que l'on obtient pas dissociation de tumeurs massives, humaines, isolées, qui se forment sous la peau du corps de l'animal, sont mises en suspension dans un milieu
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sont exposées à l'action d' un agent de formation d'interferon, qui est ensuite recueilli et purifié.
Lorsque les cellules se multiplient dans des chambres
de diffusion, elles peuvent être exposées à l'action des agents de formation d'interferon dans ces chambres, ou après en avoir été extraites, Lors de la formation de l'interferon, la production de celui-ci peut être encore accrue par des procédés connus tels que l'amorçage utilisant de l'interferon, et le procédé de "superinduction" au moyen d'un inhibiteur métabolique.
La production d'interferon par animal peut être en outre augmentée par les procédés suivants (a) un procédé au cours duquel le nombre de cellules vivantes par animal peut être augmenté, sans sacrifice inutile de l'animal, par enlèvement de la chambre, suivi de l'ensemencement de ses cellules dans une autre chambre contenant un milieu nutritif frais, que l'on place ensuite sur le même animal ; (b) un procédé au cours duquel les cellules humaines, après multiplication dans le corps,dtun animal, sont expo-
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in vitro, les mêmes cellules étant utilisées une ou plusieurs fois. Conviennent par exemple comme agents de formation d'interferon : virus, bactérie, protozoaire, rickettsie, acide nucléique, endotoxine, et.polysaccharide.
L'interferon obtenu peut être facilement purifié par des procédés de purification connus, par exemple, par relargage, dialyse, filtration, centrifugation, concentration et lyophilisation. Eventuellement, la préparation ainsi obtenue d'interferon <EMI ID=29.1> peut 4tre à nouveau purifiée par des procédés connus tels qu'adsorption et désorption avec un échangeur d'ions, filtration sur gel, chromatographie d'affinité, fractionnement au point isoélectrique et électrophorèse.
L'activité de l'interferon est déterminée par la méthode
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humain, décrite dans "Protein, Nucleic Acid and Enzyme ', vol.20,
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Les exemples A suivants constituent une illustration
non limitative de la production d'interferon selon l'invention. EXEMPLE A-1
On transplante par voie sous-cutanée à des souris sans poils, "nues"
(atrichie), adultes, des cellules BALL-1 établies, de provenance humaine, et on les alimente de manière habituelle pendant 3 semaines. 109 environ de tumeur massive, par animal, formée sous la peau, sont isolés, coupés finement, mis en suspension dans une solution saline contenant de la trypsine, pour dissocier la tumeur en cellules, et les cellules sont recueillies par centrifugation. El-
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pH 7,2 et 37[deg.]C, contenant 5% en volume par volume de sérum humain, et remises en suspension pour donner une concentration de l'ordre
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unités/ml d'interferon partiellement purifié, spécifique de l'espèce humaine, et on fait incuber pendant 2 heures environ, puis on ajoute comme agent de production d'interferon du virus de Sendai titrant 300 hémoagglutinine/ml, et l'on fait incuber pendant 20 heures supplémentaires. La solution incubée est centrifugée à
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cellules. La partie surnageante est dialysée contre une solution tampon 0,1 M, de pH 2, contenant de l'acide chlorhydrique et du
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lution tampon-phosphate à 0,01 M, de pH 7,2; pendant 1.2 heures ; ensuite on filtre avec précaution à l'aide d'une membrane filtrante. Le filtrat .est concentré et lyophilisé en une poudre d'interferon
à activité élevée. L'activité en interferon est de l'ordre de
20 000 000 unités par souris "nue".
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On transplante dans le péritoine de souris "nues" adultes des cel- <EMI ID=37.1>
animaux de la manière habituelle pendant 5 semaines. On injecte alors à ces souris, par voie intrapéritonéale, du virus de la maladie de New-Castle, ayant initialement un titre en hémoagglutinine de l'ordre de 3000, mais presque complètement préinactivé au moyen de radiation ultraviolette ; au bout de 24 heures on sacrifie les animaux et récolte le fluide ascitique. Ce fluide est centrifugé à
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notamment cellules. La partie surnageante est dialysée contre une solution tampon 0,1 M, de pH 2 contenant de l'acide chlorhydrique
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une solution tampon-phosphate à 0,01 M de pH 7,2 pendant 15 heures, ensuite on filtre avec précaution au moyen d'une membrane. Le filtrat est concentré pour donner une solution d'interferon d'activité élevée, de l'ordre de 700 000 unités/10 souries "nues". EXEMPLE A-3
On nourrit de manière habituelle pendant 4 semaines les hamsters nouveau-nés ayant reçu une injection intrapéritonéale de sérum
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et une transplantation sous-cutanée de cellules établies JBL de
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ple A-1, la tumeur massive de 30g environ qui s'est formée sous la peau de chaque animal. Les cellules obtenues sont lavées avec le
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de sérum de veau, et remises en suspension pour donner une concen-
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ajoute 200 unités/ml d'interfercn partiellement purifié, spécifique de l'espèce humaine, et on laisse incuber pendant 1 heure en-
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res supplémentaires, pour produire de l'interferon. La solution obtenue est ultérieurement purifiée et concentrée comme dans l'exemple A-2, et donne une solution d'interferon très active. L'activité de l'interferon est de ltordre de 15 000 000 unités par hamster.
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Des rats nouveau-nés reçoivent une transplantation par voie intraveineuse de cellules Namalva établies, de provenance humaine, et sont nourris de manière habituelle pendant 4 semaines. Sur chaque rat on isole alors et dissocie, /dans l'exemple A-1, une tumeur mas- <EMI ID=46.1>
sive sous-cutanée de 50g environ. Les cellules obtenues sont ensuite traitées comme dans l'exemple A-1, pour produire l'interferon. La solution d'interferon obtenu est purifiée et lyophilisée comme dans l'exemple A-1, pour donner une poudre très active d'interferon,
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EXEMPLE A-5
Des souris adultes sont soumises à une irradiation aux rayons X
de l'ordre de 400 rem, afin d'affaiblir leurs immuncréactions, puis
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ce humaine, et on les nourrit comme d'habitude pendant 3 semaines. On isole et dissocie alors, comme dans l'exemple A-1, chez chaque souris, une tumeur massive de 10g environ qui s'est formée sous la peau. Les cellules obtenues sont traitées comme dans l'exemple A-3 pour produire de l'interferon. La solution d'interferon résultante est purifiée et concentrée comme celle de l'exemple A-2 et devient très active. L'activité de cet interferon correspond à
8 000 000 unités par souris.
EXEMPLE A-6
Des cellules humaines établies OUMS-25 sont plantées sous la peau de hamsters, comme dans l'exemple A-3, et au bout de 3 semaines elles sont transplantées dans le péritoine de souris "nues" âgées de 10 jours. Ces souris sont alimentées de manière habituelle pendant 5 semaines, puis anesthésiées, et on recueille leur fluide ascitique. Ce fluide est centrifugé pour rassembler les cellules multipliées, qui sont lavées et laissées pour permettre la production d'interferon comme dans l'exemple A-1. La solution résultante d'interferon est purifiée et concentrée comme dans l'exemple A-2 pour donner une solution très active. L'activité de cet interferon correspond à 2 OOD OCO unités par souris.
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Des cellules établies JBL, de provenance humaine, sont mises en suspension dans une solution saline, dans des chambres de diffusion cylindriques en matière plastique de 10 ml, équipées d'une membrane
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sont incorporées dans le péritoine de rats adultes, lesquels sont alimentés de manière habituelle pendant 4 semaines, après quoi les chambres sont enlevées. On constate que les concentrations en cellules dans ces chambres sont voisines de 5 x 109 cellules/ml, ce qui correspond à 10<3> fois environ ce que l'on obtient in vitro- dans
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traitées comme dans l'exemple A-1 pour la production d'interferon. La solution d'interferon obtenue est purifiée, concentrée et lyophilisée, et elle donne une poudre d'activité élevée. L'activité de cet interferon correspond à peu près à 30 000 000 unités par rat.
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Dans les cavités allantoiques de blancs d'oeufs fertiles, incubés pendant 5 jours à 37[deg.]C, sont plantées des cellules NALL-1 de provenance humaine, et l'on fait incuber ces oeufs à 37[deg.]C pendant 1 semaine. Puis les oeufs sont ouverts et les cellules multipliées recueillies. Ces cellules sont traitées comme dans l'exemple A-1 en vue de la production d'interferon. La solution obtenue est purifiée et concentrée comme dans l'exemple A-2 ; elle est alors très active. L'activité de cet interferon correspond à environ 400 000 unités/10 blancs d'oeufs fertiles.
EXEMPLE A-9
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exemple A-1, est à nouveau purifiée par les procédés décrits par G.Bodo (Symposium on Préparation, Standardisation and Clinical
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8 & 9 Juin 1977 Zagreb) c'est-à-dire, adsorption et désorption avec échangeur d'ion, fractionnement du poids moléculaire par filtration sur gel, concentration et filtration faite avec soin à l'aide d'une membrane. La solution, ainsi obtenue, a une activité
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à 40% environ.
L'interferon obtenu dans les exemples A-1 à A-9 peut être utilisé avantageusement, seul ou en mélange avec une ou plusieurs autres substances, en usage externe ou interne, pour la prévention et le traitement de maladies humaines sensibles à l'interferon. L'invention est illustrée avec référence aux expérimentations suivantes.
EXPERIMENTATION 1
Traitement de maladies à virus par l'interferon
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On ajoute à des couches monomoléculaires de cellules de poumon embryonnaire humain, formées par culture primaire dans des boites de
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d'interferon préparé par le procédé de l'exemple A-9 ; les mélanges
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nées de virus Varicella-zoster ou de Cytomegalovirus humain en quantité telle qu'il se forme environ 100 plaques dans le cas des cellules non additionnées d'intarferon. Ces mélanges sont mis à incuber, et on compte le nombre de plaques formées. L'effet inhi-
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miné au moyen de l'équation
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dans laquelle A est le nombre de plaques existant sans addition d' interferon et B le nombre de plaques existant dans le cas d'addi-
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TABLEAU
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Il ressort clairement des résultats de ce)tableau que l'interferon selon l'invention inhibe la multiplication de virus pathogènes. On ne constate pas d'anomalies dans les cellules humaines, cultivées
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1) Essai d'inhibition de la multiplication in vitro de cellules
tumorales.
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foetal de veau, est ajouté l'interferon préparé selon le procédé de l'exemple A-9, de façon à obtenir respectivement des concentrations de 30, 300 et 3 000 unités/ml. Les produits résultants sont
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bre de cellules par ml de milieu. On opère de même avec des témoins préparés comme plus haut à cela près que l'interferon a été préalablement inactivé par chauffage à 1000C pendant 30 minutes.
L'effet inhibiteur de l'interféron sur la multiplication des cel-
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% d'inhibition de la multiplication des cellules
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dans laquelle A est le nombre de cellules dans le témoin, et B le nombre de cellules dans l'essai traité à l'interferon. Les résultats sont donnés dans le tableau 2.
TABLEAU 2
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ment la multiplication des cellules de tumeurs BALL-1, TALL-1, NALL-1 et JBL, et qu'il est efficace à une concentration comprise entre 30 et 3000 unités par ml.
2) Essai d'inhibition de la multiplication de cellules de tumeur
in vivo.
L'essai est réalisé avec 8 souris "nues", âgées da 2 mois environ. Chaque souris reçoit par voie sous-cutanée, un transplant de 7,5x10 cellules TALL-1. A partir du troisième jour du transplant,
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feron préparé selon l'exemple A-3, à raison de 3 dosages par semaine, chacun de 10 000 unités. Pendant 48 jours après la transplantation, les souris sont alimentées, puis on les sacrifie, et l'on prélève et pèse les tumeurs formées, humides. Les 4 souris restantes, utilisées comme témoins, sont nourries et sacrifiées dans les mêmes conditions et leurs tumeurs sont pesées. Les résultats figurent dans le tableau 3.
TABLEAU 3
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3) Essai d'inhibition de la multiplication de cellules de tumeur
in vivo.
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L'essai est réalisé avec 8 souris "nues" de 2 mois environ.
On transplante chez chaque souris par voie sous-cutanée, 107 cellules JBL (tumorales). A partir de la troisième semaine de la transplantation, 4 souris reçoivent par voie intrapéritonéale, 8 dosages d'interferon préparé selon l'exemple A-2, à raison de 2 dosages par semaine de 1000 unités chacun. Après le transplant, les souris sont alimentées pendant 42 jours, puis sacrifiées et leurs tumeurs sont pesées humides. Les 4 souris restantes, utilisées comme témoins, et ne recevant pas d'interferon, sont alimentées et sacrifiées dans les mêmes conditions, et leurs tumeurs pesées. Les résultats sont reportés dans le tableau 4.
TABLEAU 4
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Il ressort clairement des résultats des tableaux 3 et 4, que l'interferon inhibe la formation de tumeur massive humaine chez la souris, et que même s'il y a formation de tumeur, son poids est bien moindre que celui de la tumeur des témoins. De/plus, les souris traitées à l'interferon sont physiquement plus actives que les témoins et ont plus d'appétit,
EXPERIMENTATION 3
Essai de toxicité aiguë
L'essai de toxicité aigUe est réalisé avec des souris de 20 jours, auxquelles on injecte, par voie intrapéritonéale, la solution d'interferon préparée selon l'exemple A-9. La toxicité est très faible;
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Il ressort des expérimentations décrites plus haut que les maladies sensibles à l'interferon, mentionnées dans la présente description, sont celles qui peuvent être traitées ou prévenues au moyen de l'interferon selon l'invention, c'est-à-dire des maladies virales, telles que kérato-conjonctivite épidémique, kératite herpétique, influenza, rubéole, hépatite sérique, et des maladies non virales comme leucémie et ostéosarcome.
On peut préparer les médicaments et agents thérapeutiques conte- <EMI ID=79.1>
nant de l'interferon, sous différentes formes selon les utilisations envisagées, c'est-à-dire sous forme de préparations liquides telles que pulvérisation, collyre, gouttes nasales, gargarisme et injection, de pâtes telles que onguent, et de préparations solides comme poudre, granules et comprimés.
Ces préparations sont suffisamment efficaces pour prévenir et traiter des maladies sensibles à l'action de l'interferon, si elles contiennent, en général, 1 à 10 000 000 unités d'interferon/g. Si nécessaire, ces préparations peuvent être mélangées avec une ou plusieurs autres substances, notamment agents thérapeutiques, véhicules, charges et stabilisants. Quelques formes de réalisation non limitative de préparations contenant de l'interferon sont décrites ciaprès.
EXEMPLE B-1
Préparation liquide
On réalise une préparation liquide à l'aide de sérum physiologique
et d'interferon obtenu par le procédé de l'exemple A-1, de façon � avoir une concentration en interfercn de 500 unités /ni. Cette préparation convient en pulvérisation, comme collyre, gouttes nasales et gargarisme, pour la prévention et le traitement de maladies virales, en particulier la kératoconjonctivite épidémique et l'influenza.
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Solution injectable
On prépare une solution injectable à partir de sérum physiologique
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avoir une concentration en interferoc de 100 000 unités/ml.
Cette solution injectable convient pour le traitement de toutes les maladies sensibles à l'action de l'interferon, telles que maladies virales ou tumorales.
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Solution injectable
Une solution injectable est préparée avec 500 ml d'une solution
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feron préparé suivant l'exemple A-5, et 10 mg de cyclophosphamide. Cette solution injectable convient en particulier pour le traitement de maladies tumorales.
EXEMPLE B-4
Solution injectable
On prépare une solution injectable avec 100 ml de solution aqueuse.
à 10% en poids/volume de maltose, 500 000 unités d'interferon préparé selon le procédé de l'exemple A-6 et 2 mg de mitomycine C. Cette solution injectable convient en particulier pour le traitement de maladies tumorales.
EXEMPLE B-5 - Onguent
Un onguent est préparé de manière habituelle par mélange de poudre d'interfexon obtenue selon l'exemple A-4, avec de la vaseline et de l'huile de paraffine, de façon à avoir une activité de 10 000 unités d'interferon/g. Cette préparation convient pour'le traitement de maladies virales de la peau.
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Comprimés
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midon et de maltose, de façon à avoir une activité de 1000 unités d'interferon/comprimé (100 mg). Ces comprimés conviennent pour prévenir et/traiter des maladies virales du système digestif.
EXEMPLE B-7
Préparation liquide
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10 ml de solution aqueuse à 10% en poids/volume de maltose, 200 000 unités d' interferon d e l'exemple A-8 et 5 mg de methotrexate. Cette préparation convient en particulier pour le traitement des maladies tumorales.
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1. Procédé de production d'interferon à partir de cellules humaines,
établies, caractérisé en ce que l'on transplante ces cellules, en vue de leur multiplication, dans le corps d'un animal à sang chaud, ou on les ensemence dans une chambre de diffusion placée dans l'animal, celui-ci les nourrissant avec son fluide corporel
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étant ensuite recueilli et purifié.
INTERFERON AND CONTAINER PREPARATION.
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ron and compositions containing them, as well as their use for the treatment or prevention of certain diseases.
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owned by Kodansha, Ltd; Tokyo, 1975), by D.A.J. Tyrrell � Interferone and its clinical potential ", published by William Heinemann Medical Books, Ltd, London, 1976), and in" Protein, Nucleic acid
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Ltd, Tokyo, interferon is a term used to define a sub-
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rely by living cells, when exposed to inducers such as viruses, bacteria, protozoa, rickettsiae, nucleic acid, endotoxin or polysaccharide, and which is found to be active in inhibiting, in a non-specific manner, the multiplication of different viruses in cells. Since its discovery, interferon has been regarded as a promising therapeutic and preventive agent for the treatment of viral diseases.
In recent years, it has been recognized to have antitumor activity on both viral and non-viral tumors.
As interferon is specific for the species under consideration, only the. interferon from living human cells has been shown to be effective in the prevention and treatment of human diseases *
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is obtained by separation from fresh blood, but its conservation and feeding, in large quantities and at low cost, are very difficult,
We have also tried to use, for the production of interferon, living cells, obtained by seeding human cells.
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However, in vitro methods cannot be used over a wide
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a large amount of human serum, and give unstable multiplication, low multiplication rate and low cell concentration.
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see sufficient industrial production of interferon, for the prevention and treatment of diseases in humans.
The present invention makes it possible to avoid these drawbacks of the prior art and to obtain easy industrial production - <EMI ID = 9.1>
treatment of certain diseases.
The new method according to the invention consists in transplanting human cells, classified, that is to say “established”, in warm-blooded animals, or in inoculating these cells in a diffusion chamber where they multiply; while the animal feeds them by means of its nutrient body fluids and to expose the resulting cells, in vitro or in vivo, to the action of a
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much more effective than that of the prior art for the prevention or treatment of certain diseases.
Compared to the conventional methods of the prior art, used for the multiplication of cells in vitro, the method according to the invention has the advantage of not requiring, or of requiring much less nutrient medium supplemented with expensive human serum. also has the advantage of much easier maintenance of the multiplication of established cells and
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established human cells can easily multiply in the bodies of other warm-blooded animals, either by direct transplantation of the cells into them, or by introducing a diffusion chamber containing these cells into a healthy animal.
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with its nutrient body fluid. In addition, compared to conventional in vitro methods, the method according to the invention exhibits the additional characteristics of a faster and more stable multiplication of established human cells, and the possibility of obtaining a higher production of cells and a higher interferon yield,
Any established human cells that can easily multiply when transplanted into the bodies of other warm-blooded animals can be used. For example, established human cells can be used according to the invention.
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HUF-2 cell, and WI-38 cell, described in * Protein ,, Nucleic
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Shuppan Co. Ltd., Tokyo, and established cells derived from human tumor cells such as Namalva cell described in Journal of Clinical Microbiology, Vol. 1, pp. 116-117 (1975), BALL-1 cell, TALL-1 cell and NALL-1 cell described by Isao <EMI ID = 15.1>
Any warm-blooded animal can be used according to the invention, provided that the human cells, established,
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poultry such as chicken or pigeon, and mammals such as dogs, cats, monkeys, goats, cattle, horses � rabbit, guinea pig, rat, hamster, normal mouse and naked mouse.
Since animals are susceptible to unwanted immune reactions, when transplanting established human cells into them, it is much preferable to use animals in the most premature form possible, i.e. egg, embryo, fetus, animal. young or newborn, to exploit immuno-palsy. Prior to the transplantation of the cells, the animal can be pretreated by irradiation with X or gamma rays at 200-600 rem, or else with an antiserum or an immunosuppressive agent which decreases the immuno-reactions.
The "naked" mouse is desirable as a blood animal
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transplant there without pretreatment established human cells, which multiply rapidly. The multiplication of established human cells can be further stabilized by a first transplantation into the hamster, followed by transplantation into the "naked" mouse, where the formation of increased activity interferon is induced. In this case, the multiplied cells are again transplantable from the body of a warm-blooded animal to the body of a
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man. Established human cells can be transplanted
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Instead of making them multiply directly in the bodies of animals, we can inoculate established human cells in a diffusion chamber, of variable shape and size, provided with a filter membrane whose pores measure
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ultra-filter or hollow fiber, and place this chamber in the body of an animal, for example in the peritoneum, in order to allow the nourishment of the cells by means of the nutritive fluids of the body of the animal.
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Optionally, the multiplication of established human cells can be carried out in the diffusion chamber with circulation of the nutrient fluid from the body of the warm-blooded animal, inside and outside the nutrient medium of the chamber. In this case, if the chamber is located on the body of the animal, one can observe through the wall of the chamber where the multiplication is, and the number of cells per animal can be further increased, without sacrificing unnecessarily. the animal, by removing the chamber, seeding the cells into another chamber containing fresh nutrient medium and placing the latter on the same animal.
The method with a diffusion chamber makes it possible to use any warm-blooded animal, except man, for the multiplication of established human cells, without the need for pretreatment to suppress the immune reactions; moreover in this case, the cells multiplied in the chamber can be harvested easily without contamination by the cells of the animal, since there is no direct contact between them, and there is no danger of adverse reactions.
After transplantation of human cells, the animal is fed according to the usual method, without special treatment.
The duration of multiplication of established human cells is usually 1 to 20 weeks. When the established, transplanted cells are from human, normal or tumor leukocytes, the rate of cell multiplication is so rapid that it can usually be completed within 1 to 5 weeks.
The number of human cells multiplied is found to be on the order of 10 7 to 10 <1> <2> or more, by. animal.
In other words, the methods according to the invention are very advantageous for the production of interferon, since the number of cells transplanted or seeded in the animal is multiplied.
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obtained by the prior methods, in vitro, of multiplication of the same cells in a nutrient medium.
. Living, multiplied human cells "can be initiated by any method known to produce interferon. The part of the animal's body where the cells multiply may be exposed to the action of an interferon-forming agent. By <EMI ID = 23.1> <EMI ID = 24.1>
the agent for producing interferon, human cells in the course of multiplication, suspended in the peritoneal cavity, or human tumor cells, formed under the skin, followed by the collection and purification of the interferoH thus obtained . The formation of interferon can also occur by recovery of the human cells multiplied from the body of the animal, followed by their exposure in vitro to the action <EMI ID = 25.1>
human, obtained by collection in the intraperitoneal cavity after multiplication, or those obtained by dissociation of massive, human, isolated tumors which form under the skin of the animal's body, are suspended in a medium
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are exposed to the action of an interferon forming agent, which is then collected and purified.
When cells multiply in chambers
diffusion, they can be exposed to the action of interferon-forming agents in these chambers, or after having been extracted therefrom. During the formation of the interferon, the production of the latter can be further increased by known methods such as initiation using interferon, and the method of "superinduction" using a metabolic inhibitor.
Interferon production per animal can be further increased by the following methods (a) a method in which the number of living cells per animal can be increased, without unnecessary sacrifice of the animal, by removing the chamber, followed by seeding its cells in another chamber containing fresh nutrient medium, which is then placed on the same animal; (b) a process in which human cells, after multiplication in the body, of an animal, are exposed
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in vitro, the same cells being used one or more times. Suitable as interferon-forming agents, for example: virus, bacteria, protozoan, rickettsia, nucleic acid, endotoxin, and polysaccharide.
The obtained interferon can be easily purified by known purification methods, for example, by salting out, dialysis, filtration, centrifugation, concentration and lyophilization. Optionally, the thus obtained preparation of interferon <EMI ID = 29.1> can be further purified by known methods such as adsorption and desorption with an ion exchanger, gel filtration, affinity chromatography, isoelectric point fractionation. and electrophoresis.
The activity of interferon is determined by the method
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human, described in "Protein, Nucleic Acid and Enzyme ', vol.20,
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The following examples A are illustrative
without limitation of the production of interferon according to the invention. EXAMPLE A-1
Transplanted subcutaneously to hairless, "naked" mice
(atrichia), adults, established BALL-1 cells of human origin and fed in the usual manner for 3 weeks. About 109 of massive tumor per animal formed under the skin are isolated, cut finely, suspended in saline solution containing trypsin, to dissociate the tumor into cells, and the cells are collected by centrifugation. El-
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pH 7.2 and 37 [deg.] C, containing 5% by volume by volume of human serum, and resuspended to give a concentration of the order
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units / ml of partially purified interferon, specific for human species, and incubated for about 2 hours, then added as an agent for producing Sendai virus interferon assaying 300 hemoagglutinin / ml, and made incubate for an additional 20 hours. The incubated solution is centrifuged at
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cells. The supernatant part is dialyzed against a 0.1 M buffer solution, pH 2, containing hydrochloric acid and
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0.01 M phosphate buffer solution, pH 7.2; for 1.2 hours; then filtered carefully using a filter membrane. The filtrate is concentrated and lyophilized to an interferon powder.
at high activity. Interferon activity is of the order of
20,000,000 units per "naked" mouse.
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Adult "naked" mice are transplanted into the peritoneum of cells <EMI ID = 37.1>
animals in the usual way for 5 weeks. These mice are then injected intraperitoneally with New Castle's disease virus, initially having a hemoagglutinin titre of the order of 3000, but almost completely preinactivated by means of ultraviolet radiation; after 24 hours the animals are sacrificed and the ascites fluid is harvested. This fluid is centrifuged at
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especially cells. The supernatant part is dialyzed against a 0.1 M buffer solution of pH 2 containing hydrochloric acid.
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a 0.01 M phosphate buffer solution of pH 7.2 for 15 hours, then filtered carefully through a membrane. The filtrate is concentrated to give a solution of high activity interferon, of the order of 700,000 units / 10 "naked" mice. EXAMPLE A-3
Newborn hamsters injected intraperitoneally with serum are fed in the usual manner for 4 weeks.
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and subcutaneous transplantation of established JBL cells from
<EMI ID = 41.1>
ple A-1, the massive tumor of about 30g which formed under the skin of each animal. The cells obtained are washed with the
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of calf serum, and resuspended to give a concen-
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add 200 units / ml of partially purified interfercn, specific for the human species, and incubate for 1 hour in-
<EMI ID = 44.1>
additional res, to produce interferon. The solution obtained is subsequently purified and concentrated as in Example A-2, and gives a very active interferon solution. Interferon activity is of the order of 15,000,000 units per hamster.
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Newborn rats are transplanted intravenously with established Namalva cells of human origin and are routinely fed for 4 weeks. On each rat is then isolated and dissociated, / in example A-1, a massive tumor <EMI ID = 46.1>
sive subcutaneously of approximately 50g. The cells obtained are then treated as in Example A-1, to produce the interferon. The interferon solution obtained is purified and lyophilized as in Example A-1, to give a very active powder of interferon,
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EXAMPLE A-5
Adult mice are subjected to X-ray irradiation
of the order of 400 rem, in order to weaken their immune reactions, then
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this human, and we feed them as usual for 3 weeks. Is isolated and then dissociated, as in Example A-1, in each mouse, a massive tumor of approximately 10 g which has formed under the skin. The cells obtained are treated as in Example A-3 to produce interferon. The resulting interferon solution is purified and concentrated like that of Example A-2 and becomes very active. The activity of this interferon corresponds to
8,000,000 units per mouse.
EXAMPLE A-6
Established human OUMS-25 cells are planted under the skin of hamsters, as in Example A-3, and after 3 weeks are transplanted into the peritoneum of 10 day old "naked" mice. These mice are fed in the usual way for 5 weeks, then anesthetized, and their ascites fluid is collected. This fluid is centrifuged to collect the multiplied cells, which are washed and left to allow the production of interferon as in Example A-1. The resulting interferon solution is purified and concentrated as in Example A-2 to give a very active solution. The activity of this interferon corresponds to 2 OOD OCO units per mouse.
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Established JBL cells of human origin are suspended in saline solution in 10 ml cylindrical plastic diffusion chambers fitted with a membrane.
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are incorporated into the peritoneum of adult rats, which are fed in the usual way for 4 weeks, after which the chambers are removed. It is found that the cell concentrations in these chambers are close to 5 x 109 cells / ml, which corresponds to approximately 10 <3> times what is obtained in vitro- in
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processed as in Example A-1 for the production of interferon. The obtained interferon solution is purified, concentrated and lyophilized, and it gives a powder of high activity. The activity of this interferon corresponds to approximately 30,000,000 units per rat.
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In the allantoic cavities of fertile egg whites, incubated for 5 days at 37 [deg.] C, are planted NALL-1 cells of human origin, and these eggs are incubated at 37 [deg.] C for 1 week. Then the eggs are opened and the multiplied cells collected. These cells are treated as in Example A-1 for the production of interferon. The solution obtained is purified and concentrated as in Example A-2; she is then very active. The activity of this interferon corresponds to approximately 400,000 units / 10 fertile egg whites.
EXAMPLE A-9
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example A-1, is again purified by the methods described by G. Bodo (Symposium on Preparation, Standardization and Clinical
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8 & 9 June 1977 Zagreb) i.e. adsorption and desorption with ion exchanger, fractionation of molecular weight by gel filtration, concentration and careful filtration using a membrane. The solution thus obtained has an activity
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at about 40%.
The interferon obtained in Examples A-1 to A-9 can be used advantageously, alone or in admixture with one or more other substances, in external or internal use, for the prevention and the treatment of human diseases sensitive to interferon. . The invention is illustrated with reference to the following experiments.
EXPERIMENT 1
Treatment of virus diseases with interferon
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To monomolecular layers of human embryonic lung cells, formed by primary culture in dishes of
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interferon prepared by the method of Example A-9; mixtures
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born from Varicella-zoster virus or human Cytomegalovirus in an amount such that approximately 100 plaques are formed in the case of cells not supplemented with intarferon. These mixtures are incubated, and the number of plaques formed is counted. The inhi- effect
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mined by means of the equation
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in which A is the number of plaques existing without addition of interferon and B the number of plaques existing in the case of addi-
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BOARD
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It is clear from the results of this) table that the interferon according to the invention inhibits the multiplication of pathogenic viruses. There are no abnormalities in human cells, cultured
<EMI ID = 66.1>
1) In vitro cell multiplication inhibition test
tumor.
<EMI ID = 67.1>
fetal calf, is added the interferon prepared according to the process of Example A-9, so as to obtain concentrations of 30, 300 and 3000 units / ml, respectively. The resulting products are
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ber of cells per ml of medium. The same is done with controls prepared as above except that the interferon has been previously inactivated by heating at 1000C for 30 minutes.
The inhibitory effect of interferon on cell multiplication
<EMI ID = 70.1>
% inhibition of cell multiplication
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where A is the number of cells in the control, and B is the number of cells in the interferon-treated assay. The results are given in Table 2.
TABLE 2
<EMI ID = 72.1>
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The multiplication of tumor cells BALL-1, TALL-1, NALL-1 and JBL, and that it is effective at a concentration between 30 and 3000 units per ml.
2) Tumor Cell Multiplication Inhibition Test
in vivo.
The test is carried out with 8 "naked" mice, approximately 2 months old. Each mouse receives a transplant of 7.5x10 TALL-1 cells subcutaneously. From the third day of the transplant,
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feron prepared according to Example A-3, at a rate of 3 dosages per week, each of 10,000 units. For 48 days after transplantation, the mice are fed, then they are sacrificed, and the formed, wet tumors are removed and weighed. The 4 remaining mice, used as controls, are fed and sacrificed under the same conditions and their tumors are weighed. The results are shown in Table 3.
TABLE 3
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3) Tumor Cell Multiplication Inhibition Test
in vivo.
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The test is carried out with 8 "naked" mice of approximately 2 months.
107 JBL (tumor) cells are transplanted subcutaneously in each mouse. From the third week of transplantation, 4 mice receive, intraperitoneally, 8 dosages of interferon prepared according to Example A-2, at a rate of 2 dosages per week of 1000 units each. After the transplant, the mice are fed for 42 days, then sacrificed and their tumors are weighed wet. The 4 remaining mice, used as controls, and not receiving interferon, are fed and sacrificed under the same conditions, and their tumors weighed. The results are reported in Table 4.
TABLE 4
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It is clear from the results of Tables 3 and 4, that interferon inhibits the formation of massive human tumor in mice, and that even if there is tumor formation, its weight is much less than that of the tumor of the controls. . In addition, the mice treated with interferon are physically more active than the controls and have more appetite,
EXPERIMENT 3
Acute toxicity test
The acute toxicity test is carried out with 20-day-old mice, into which the interferon solution prepared according to Example A-9 is injected intraperitoneally. The toxicity is very low;
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It emerges from the experiments described above that the diseases sensitive to interferon, mentioned in the present description, are those which can be treated or prevented by means of the interferon according to the invention, that is to say diseases viral diseases, such as epidemic keratoconjunctivitis, herpetic keratitis, influenza, rubella, serum hepatitis, and non-viral diseases such as leukemia and osteosarcoma.
Drugs and therapeutic agents can be prepared containing <EMI ID = 79.1>
nant of interferon, in different forms according to the envisaged uses, that is to say in the form of liquid preparations such as spray, eye drops, nasal drops, gargle and injection, of pastes such as ointment, and of solid preparations such as powder, granules and tablets.
These preparations are sufficiently effective in preventing and treating diseases sensitive to the action of interferon, if they generally contain 1 to 10,000,000 units of interferon / g. If necessary, these preparations can be mixed with one or more other substances, in particular therapeutic agents, vehicles, fillers and stabilizers. Some non-limiting embodiments of interferon-containing preparations are described below.
EXAMPLE B-1
Liquid preparation
A liquid preparation is made using physiological serum
and interferon obtained by the method of Example A-1, so as � have an interfercn concentration of 500 units / ni. This preparation is suitable as a spray, as an eye drops, nasal drops and gargle, for the prevention and treatment of viral diseases, in particular epidemic keratoconjunctivitis and influenza.
<EMI ID = 80.1>
Solution for injection
An injectable solution is prepared from physiological saline
<EMI ID = 81.1>
have an interferoc concentration of 100,000 units / ml.
This injectable solution is suitable for the treatment of all diseases sensitive to the action of interferon, such as viral or tumor diseases.
<EMI ID = 82.1>
Solution for injection
A solution for injection is prepared with 500 ml of a solution
<EMI ID = 83.1>
feron prepared according to Example A-5, and 10 mg of cyclophosphamide. This injectable solution is suitable in particular for the treatment of tumor diseases.
EXAMPLE B-4
Solution for injection
An injectable solution is prepared with 100 ml of aqueous solution.
at 10% by weight / volume of maltose, 500,000 units of interferon prepared according to the process of Example A-6 and 2 mg of mitomycin C. This injectable solution is suitable in particular for the treatment of tumor diseases.
EXAMPLE B-5 - Ointment
An ointment is prepared in the usual way by mixing interfexon powder obtained according to Example A-4, with petroleum jelly and paraffin oil, so as to have an activity of 10,000 interferon units / g . This preparation is suitable for the treatment of viral diseases of the skin.
<EMI ID = 84.1>
Tablets
<EMI ID = 85.1>
midon and maltose, so as to have an activity of 1000 interferon units / tablet (100 mg). These tablets are suitable for preventing and / treating viral diseases of the digestive system.
EXAMPLE B-7
Liquid preparation
<EMI ID = 86.1>
10 ml of 10% w / v aqueous maltose solution, 200,000 units of interferon from Example A-8 and 5 mg of methotrexate. This preparation is suitable in particular for the treatment of tumor diseases.
<EMI ID = 87.1>
1. A method of producing interferon from human cells,
established, characterized in that these cells are transplanted, with a view to their multiplication, in the body of a warm-blooded animal, or they are seeded in a diffusion chamber placed in the animal, the latter feeding them with his body fluid
<EMI ID = 88.1>
<EMI ID = 89.1>
being then collected and purified.