CH658668A5

CH658668A5 - PROCESS FOR THE PRODUCTION OF HUMAN KALLIKREIN.

Info

Publication number: CH658668A5
Application number: CH376/83A
Authority: CH
Inventors: Sugimoto Kaname
Original assignee: Hayashibara Biochem Lab
Priority date: 1982-01-25
Filing date: 1983-01-24
Publication date: 1986-11-28
Also published as: GB2117384A; GB2117384B; FR2521164B1; KR840003287A; IT1167065B; JPS58126786A; JPH028709B2; FR2521164A1; IT8347608A0; KR900007647B1; GB8302019D0

Description

La présente invention concerne un procédé pour produire de la kallikréine humaine. The present invention relates to a process for producing human kallikrein.

La kallikréine (EC 3.4.21.8) est constituée de plusieurs enzymes de sources différentes et de spécificités différentes ayant la propriété commune de libérer des peptides vasomoteurs (kinines) à partir de leurs précurseurs inactifs (kininogènes) dans le plasma. Kallikrein (EC 3.4.21.8) consists of several enzymes from different sources and different specificities having the common property of releasing vasomotor peptides (kinins) from their inactive precursors (kininogens) in the plasma.

Les actions pharmacologiques de la kallikréine, c'est-à-dire les actions vasodépressive et hypotonique, la rendent utile comme agent thérapeutique dans les maladies des organes circulatoires, par exemple l'artériosclérose cérébrale ou cardiaque ou l'hypertension; donc les besoins en kallikréine s'accroissent rapidement. The pharmacological actions of kallikrein, that is to say the vasodepressive and hypotonic actions, make it useful as a therapeutic agent in diseases of the circulatory organs, for example cerebral or cardiac arteriosclerosis or hypertension; therefore the need for kallikrein is increasing rapidly.

Il est bien connu qu'on obtient la kallikréine à partir d'organes de mammifères, tels que le foie ou le pancréas, ou de liquides de l'organisme de mammifères, tels que le sang, la salive ou l'urine. It is well known that kallikrein is obtained from mammalian organs, such as the liver or pancreas, or from mammalian body fluids, such as blood, saliva or urine.

Comme décrit dans des demandes de brevets, par exemples les demandes de brevets japonais publiées non examinées Nos 102 495/77 et 167 228/80, on a généralement produit à ce jour la kallikréine avec des organes de porc mais en quantité insuffisante pour satisfaire la demande. As described in patent applications, for example published Japanese patent applications not examined Nos 102 495/77 and 167 228/80, kallikrein has generally been produced to date with pork organs but in an amount insufficient to satisfy the request.

Par suite de la réaction de type antigène-anticorps provoquée par la kallikréine lorsqu'on l'utilise en thérapeutique humaine, l'emploi de la kallikréine dérivant de cellules humaines vivantes est excellent et dépourvu de danger par suite de la moindre antigénicité. As a result of the antigen-antibody reaction caused by kallikrein when used in human therapy, the use of kallikrein derived from living human cells is excellent and harmless due to the lower antigenicity.

Donc, on recherche un procédé peu coûteux pour produire à l'échelle industrielle de la kallikréine humaine. Comme le montre la description qui suit, l'invention satisfait à ce besoin. So we are looking for an inexpensive process to produce human kallikrein on an industrial scale. As the following description shows, the invention satisfies this need.

L'invention a pour objets: The subject of the invention is:

— un procédé efficace pour multiplier des cellules humaines capables de produire de la kallikréine humaine; - an efficient method for multiplying human cells capable of producing human kallikrein;

— un procédé pour produire de la kallikréine humaine de titre élevé avec les cellules humaines ainsi obtenues; - a process for producing high titer human kallikrein with the human cells thus obtained;

— un procédé pour obtenir des cellules hybrides capables de produire de la kallikréine humaine, présentant un taux de multiplication cellulaire et un taux de production de la kallikréine humaine extrêmement élevés, et A method for obtaining hybrid cells capable of producing human kallikrein, exhibiting an extremely high rate of cell multiplication and a rate of production of human kallikrein, and

— un procédé pour accroître la production de kallikréine humaine par cellule. - a process for increasing the production of human kallikrein per cell.

De façon générale, on atteint ces objectifs ainsi que d'autres selon le procédé de l'invention qui comprend la multiplication de cellules humaines capables de produire de la kallikréine humaine, en transplantant lesdites cellules chez un animal à sang chaud autre que l'homme ou sinon en laissant lesdites cellules se multiplier dans une chambre de diffusion classique qui apporte auxdites cellules un liquide nutritif de l'organisme d'un animal à sang chaud autre que l'homme, et la production de la kallikréine humaine avec les cellules humaines multipliées par l'un ou l'autre des modes de multiplication in vivo ci-dessus. In general, these objectives and others are achieved according to the method of the invention which comprises the multiplication of human cells capable of producing human kallikrein, by transplanting said cells into a warm-blooded animal other than man or otherwise by allowing said cells to multiply in a conventional diffusion chamber which supplies said cells with a nutritive liquid from the organism of a warm-blooded animal other than man, and the production of human kallikrein with multiplied human cells by either of the above in vivo multiplication modes.

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Plus particulièrement, les objectifs de l'invention ont été atteints selon le procédé qui comprend (1) la transplantation de cellules humaines capables de produire de la kallikréine humaine chez un animal à sang chaud autre que l'homme; l'alimentation de l'animal pour permettre aux cellules humaines d'utiliser un liquide nutritif de l'organisme fourni par l'animal pour leur multiplication; l'extraction et la désagrégation de la tumeur obtenue formée chez l'animal pour obtenir les cellules humaines multipliées; la culture in vitro des cellules humaines dans un milieu nutritif en présence ou non d'un inducteur de kallikréine pendant une période suffisante pour accumuler une quantité notable de kallikréine humaine; et la récolte de la kallikréine humaine accumulée à partir de la culture ou sinon: (2) la mise en place d'une suspension de cellules humaines capables de produire de la kallikréine humaine dans une chambre de diffusion de type classique qui fournit auxdites cellules humaines un liquide nutritif de l'organisme d'un animal à sang chaud autre que l'homme; l'inclusion ou la mise en place de la chambre dans ou sur l'animal à sang chaud autre que l'homme; l'alimentation de l'animal pour permettre aux cellules humaines d'utiliser un liquide nutritif de l'organisme fourni pour leur multiplication; la récolte des cellules humaines multipliées dans la chambre; la culture des cellules humaines in vitro dans un milieu nutritif en présence ou non d'un inducteur de kallikréine pendant une période suffisante pour accumuler une quantité notable de kallikréine humaine; et la récolte de la kallikréine humaine accumulée dans la culture. More particularly, the objectives of the invention were achieved according to the method which comprises (1) the transplantation of human cells capable of producing human kallikrein in a warm-blooded animal other than man; feeding the animal to allow human cells to use a nutritive liquid from the body provided by the animal for their multiplication; extracting and disintegrating the obtained tumor formed in animals to obtain multiplied human cells; in vitro culture of human cells in a nutrient medium in the presence or absence of a kallikrein inducer for a period sufficient to accumulate a significant amount of human kallikrein; and harvesting the human kallikrein accumulated from the culture or otherwise: (2) placing a suspension of human cells capable of producing human kallikrein in a diffusion chamber of conventional type which supplies said human cells a nutrient fluid from the body of a warm-blooded animal other than man; inclusion or placement of the chamber in or on the warm-blooded animal other than man; feeding the animal to allow human cells to use a nutritive fluid from the body provided for their multiplication; harvesting multiplied human cells from the chamber; culturing human cells in vitro in a nutrient medium in the presence or absence of a kallikrein inducer for a period sufficient to accumulate a significant amount of human kallikrein; and the harvest of human kallikrein accumulated in the culture.

Les modes de réalisation préférés de l'invention vont maintenant être décrits de façon détaillée. The preferred embodiments of the invention will now be described in detail.

L'invention repose sur la découverte que la production de kallikréine humaine avec des cellules humaines, obtenues par multiplication in vivo de cellules humaines capables de produire de la kallikréine humaine en utilisant un animal à sang chaud autre que l'homme, est extrêmement supérieure à celle que l'on obtient avec les cellules multipliées in vitro. L'invention fournit un procédé pour produire de la kallikréine humaine qui consiste à multiplier des cellules humaines capables de produire de la kallikréine humaine par transplantation desdites cellules chez un animal à sang chaud autre que l'homme ou sinon à laisser lesdites cellules se multiplier dans une chambre de diffusion de type classique qui fournit auxdites cellules un liquide nutritif de l'organisme d'un animal à sang chaud autre que l'homme et à produire la kallikréine humaine désirée avec les cellules humaines ainsi obtenues. The invention is based on the discovery that the production of human kallikrein with human cells, obtained by in vivo multiplication of human cells capable of producing human kallikrein using a warm-blooded animal other than man, is extremely superior to that obtained with multiplied cells in vitro. The invention provides a method for producing human kallikrein which comprises multiplying human cells capable of producing human kallikrein by transplanting said cells into a warm-blooded animal other than man or otherwise letting said cells multiply in a diffusion chamber of conventional type which supplies said cells with a nutritive liquid from the organism of a warm-blooded animal other than man and produces the desired human kallikrein with the human cells thus obtained.

Contrairement aux procédés classiques utilisant une culture de tissu in vitro, le procédé réalisé in vivo ne nécessite pas ou bien moins de milieu nutritif contenant du sérum coûteux et rend bien plus facile l'entretien de la culture pendant la multiplication cellulaire et produit de plus une kallikréine humaine de titre bien supérieur. Unlike conventional methods using an in vitro tissue culture, the in vivo method requires no less or much less nutrient medium containing expensive serum and makes maintenance of the culture much easier during cell multiplication and moreover produces human kallikrein of much higher title.

Plus particulièrement, dans le procédé selon l'invention qui utilise comme hôte un animal à sang chaud autre que l'homme, on peut facilement multiplier certaines cellules humaines en utilisant un liquide nutritif de l'organisme fourni par l'animal en transplantant ces cellules chez l'animal ou sinon en les plaçant dans une chambre de diffusion de type classique conçue pour recevoir un liquide de l'organisme et en incluant ou plaçant la chambre dans ou sur l'animal et en alimentant l'animal de façon habituelle. More particularly, in the process according to the invention which uses a warm-blooded animal other than man as host, it is easy to multiply certain human cells by using a nutritive liquid of the organism supplied by the animal by transplanting these cells in the animal or otherwise by placing them in a diffusion chamber of the conventional type designed to receive a liquid from the organism and by including or placing the chamber in or on the animal and by feeding the animal in the usual way.

De plus, le procédé de l'invention se différencie des procédés classiques de multiplication cellulaire in vitro du fait qu'on peut obtenir des caractéristiques additionnelles, c'est-à-dire une multiplication cellulaire bien plus stabilisée et rapide, une production accrue des cellules et une production extrêmement plus élevée de kallikréine humaine par cellule. In addition, the method of the invention differs from conventional methods of cell multiplication in vitro by the fact that additional characteristics can be obtained, that is to say cell multiplication which is much more stabilized and rapid, increased production of cells and an extremely higher production of human kallikrein per cell.

Les cellules humaines utilisables dans l'invention sont celles qui produisent une quantité notable de kallikréine humaine et que l'on peut multiplier chez un animal à sang chaud autre que l'homme après les y avoir transplantées. On peut utiliser de façon favorable dans l'invention des cellules humaines normales de pancréas, de glandes salivaires, de foie, de rein, de vessie et des fibroblastes pulmonaires; des cellules obtenues par transformation des cellules humaines normales par emploi d'un virus carcinogène ou de radiations; des cellules tumorales humaines de cancer du pancréas, de tumeur des glandes salivaires, de cancer du foie, de cancer du rein et de cancer de la vessie; et des lignées cellulaires établies des cellules 5 humaines ci-dessus. The human cells which can be used in the invention are those which produce a significant quantity of human kallikrein and which can be multiplied in a warm-blooded animal other than man after having been transplanted there. Normal human cells of the pancreas, salivary glands, liver, kidney, bladder and pulmonary fibroblasts can be favorably used in the invention; cells obtained by transformation of normal human cells using a carcinogenic virus or radiation; human tumor cells from pancreatic cancer, salivary gland tumor, liver cancer, kidney cancer and bladder cancer; and established cell lines from the above human cells.

Au lieu de l'emploi des cellules humaines décrites ci-dessus, l'emploi d'une lignée lymphoblastoïde humaine, qu'il est bien plus facile de soumettre à des repiquages et dans laquelle on peut introduire un ou plusieurs gènes humains codant pour la production de la io kallikréine par fusion cellulaire en utilisant du polyéthylèneglycol ou le virus Sendaï ou par des techniques de recombinaison génétique par emploi de nucléase, de ligase et d'ADN-polymérase, conduit à un accroissement extrême de la vitesse de multiplication cellulaire et/ou de la production de kallikréine humaine par cellule qui sont 15 environ deux à dix fois supérieures à ce qu'on obtient lorsqu'on emploie les cellules normales ou tumorales décrites ci-dessus. Instead of the use of the human cells described above, the use of a human lymphoblastoid line, which is much easier to undergo subcultures and into which one or more human genes coding for the production of io kallikrein by cell fusion using polyethylene glycol or the Sendai virus or by genetic recombination techniques using nuclease, ligase and DNA polymerase, leads to an extreme increase in the rate of cell multiplication and / or human kallikrein production per cell which are about two to ten times greater than that obtained when using the normal or tumor cells described above.

La transplantation d'une telle lignée lymphoblastoïde humaine à l'animal tend à former une ou plusieurs tumeurs massives qui sont très peu contaminées par les cellules de l'animal hôte. De plus, leur 20 désagrégation après l'extraction est très facile car la récolte des cellules humaines vivantes peut être facilement effectuée. Transplantation of such a human lymphoblastoid line to the animal tends to form one or more massive tumors which are very little contaminated by the cells of the host animal. In addition, their disintegration after extraction is very easy since the harvesting of living human cells can be easily carried out.

Des lignées lymphoblastoïdes humaines provenant de leucémies ou de lymphomes humains, telles que les lignées Namalwa, BALL-1, NALL-1, TALL-1 et JBL sont particulièrement appropriées à ces 25 objectifs. Human lymphoblastoid lines from leukemia or human lymphomas, such as the Namalwa, BALL-1, NALL-1, TALL-1 and JBL lines are particularly suitable for these purposes.

L'animal à sang chaud autre que l'homme que l'on peut utiliser dans l'invention peut être un de ceux chez qui les cellules humaines peuvent être multipliées: par exemple des oiseaux tels que le poulet et le pigeon; ou des mammifères tels que le chien, le chat, le singe, la 30 chèvre, le porc, le cheval, le lapin, la vache, le cobaye, le rat, le rat nu, le hamster, la souris ou la souris nue. The warm-blooded animal other than man which can be used in the invention can be one of those in which human cells can be multiplied: for example birds such as chicken and pigeon; or mammals such as dog, cat, monkey, goat, pig, horse, rabbit, cow, guinea pig, rat, naked rat, hamster, mouse or naked mouse.

Comme la transplantation de ces cellules humaines à l'animal déclenche une réaction immunitaire indésirable, l'emploi d'un animal à sang chaud autre que l'homme à l'âge le plus précoce possible, par 35 exemple à l'état d'oeuf, d'embryon, de fœtus, d'animal nouveau-né ou d'animal très jeune est souhaitable pour réduire autant que possible la réaction immunitaire. As the transplantation of these human cells to the animal triggers an undesirable immune reaction, the use of a warm-blooded animal other than man at the earliest possible age, for example in the state of egg, embryo, fetus, newborn animal or very young animal is desirable to minimize the immune response.

Avant la transplantation, on peut de plus traiter un tel animal par irradiation avec des rayons X ou des rayons y à raison d'environ 40 200 à 600 rems ou injecter un antisérum ou un immunosuppresseur pour réduire la réaction immunitaire au niveau le plus bas possible. Before transplantation, such an animal can also be treated by irradiation with x-rays or y-rays at a rate of approximately 40,200 to 600 rems or inject an antiserum or an immunosuppressant to reduce the immune reaction to the lowest possible level. .

L'emploi d'un animal de laboratoire présentant un déficit immunitaire, tel que la souris nue ou le rat nu, comme animal hôte, produit une réaction immunitaire moins indésirable même lorsque 45 l'animal est adulte et on peut facilement transplanter à l'animal l'un quelconque des types de cellules humaines décrites ci-dessus sans effectuer un tel prétraitement et les cellules s'y multiplient rapidement en risquant moins de provoquer la réaction immunitaire. The use of an immunodeficient laboratory animal, such as a naked mouse or naked rat, as a host animal produces a less undesirable immune response even when the animal is adult and can be easily transplanted animal any of the types of human cells described above without performing such pretreatment and the cells multiply therein with less risk of causing the immune reaction.

On peut obtenir à la fois une stabilisation de la multiplication 50 cellulaire et une augmentation de la production de kallikréine humaine et une augmentation delà production de kallikréine humaine par transplantation répétée en utilisant une combinaison d'animaux à sang chaud autres que l'homme différents. Par exemple, on peut atteindre les deux objectifs en transplantant tout d'abord les 55 cellules humaines chez le hamster et en les y multipliant puis en retransplantant les cellules humaines multipliées chez la souris nue. Dans ce cas, la transplantation répétée peut être effectuée avec des animaux à sang chaud autres que l'homme appartenant à la même classe ou au même ordre ou appartenant à la même espèce ou au 60 même genre. Both stabilization of cell multiplication and an increase in human kallikrein production and an increase in human kallikrein production can be achieved by repeated transplantation using a combination of different warm-blooded animals. For example, we can achieve both objectives by first transplanting the 55 human cells in the hamster and by multiplying them then by transplanting the multiplied human cells in the naked mouse. In this case, repeated transplantation can be carried out with warm-blooded animals other than man belonging to the same class or the same order or belonging to the same species or the same genus.

Comme site de transplantation des cellules humaines chez l'animal, on peut choisir un site quelconque tant que les cellules s'y multiplient: on peut par exemple utiliser la cavité allantoïdienne ou effectuer la transplantation par voie intraveineuse, intrapéritonéale 65 ou sous-cutanée. As the site for transplantation of human cells in animals, any site can be chosen as long as the cells multiply there: one can for example use the allantoic cavity or carry out the transplantation by the intravenous, intraperitoneal 65 or subcutaneous route.

Au lieu de transplanter les cellules humaines chez l'animal, on peut multiplier facilement l'un quelconque des types de cellules humaines précédemment décrits en les plaçant dans une chambre de Instead of transplanting human cells into animals, any of the types of human cells described above can be easily propagated by placing them in a chamber.

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diffusion de type classique de formes et de tailles diverses munie par exemple d'une membrane filtrante, d'un ultrafiltre ou de fibres creuses ayant une taille nominale des pores d'environ 10~7 à 10-5 m, empêchant la contamination de la chambre par les cellules de l'animal mais alimentant les cellules humaines en liquide nutritif de l'organisme; en effectuant l'inclusion par exemple intrapéritonéale de la chambre chez l'animal et en laissant les cellules humaines s'y multiplier en utilisant le liquide nutritif de l'organisme fourni par l'animal. diffusion of conventional type of various shapes and sizes provided for example with a filter membrane, an ultrafilter or hollow fibers having a nominal pore size of about 10 ~ 7 to 10-5 m, preventing contamination of the room by the animal's cells but supplying the human cells with nutritive liquid of the organism; by carrying out the intraperitoneal inclusion, for example, of the chamber in the animal and letting human cells multiply therein using the nutritive liquid of the organism supplied by the animal.

De plus, la chambre de diffusion conçue à cet effet peut être placée sur l'animal pour que le liquide nutritif de l'organisme et la solution nutritive dans la chambre puissent circuler librement à travers la chambre. De la sorte, on peut observer la culture dans la chambre pendant la multiplication cellulaire à travers une ou plusieurs fenêtres latérales transparentes disposées sur une ou plusieurs parois de la chambre et/ou remplacer continuellement la chambre par une chambre neuve pour poursuivre la multiplication cellulaire pendant la durée de la vie de l'animal sans le sacrifier et augmenter considérablement la production de cellules par animal. In addition, the diffusion chamber designed for this purpose can be placed on the animal so that the nutritive liquid of the organism and the nutritive solution in the chamber can circulate freely through the chamber. In this way, the culture can be observed in the chamber during cell multiplication through one or more transparent side windows arranged on one or more walls of the chamber and / or continuously replace the chamber with a new chamber to continue cell multiplication during the life of the animal without sacrificing it and considerably increase the production of cells per animal.

Comme l'emploi d'une telle chambre de diffusion réduit la réaction immunitaire indésirable par suite de l'absence de contact direct entre les cellules humaines et les cellules de l'animal, on peut facilement utiliser comme hôte un animal à sang chaud autre que l'homme quelconque sans prétraitement et on peut en recueillir facilement les cellules humaines vivantes multipliées. Since the use of such a diffusion chamber reduces the undesirable immune reaction due to the absence of direct contact between human cells and animal cells, a warm-blooded animal other than any man without pretreatment and one can easily collect the multiplied living human cells.

On peut facilement alimenter l'animal de façon habituelle et aucun soin particulier n'est nécessaire, même après la transplantation. One can easily feed the animal in the usual way and no special care is necessary, even after the transplant.

La période requise pour obtenir la multiplication cellularie maximale est généralement de 1 à 20 semaines. Lorsque les cellules humaines sont des cellules tumorales ou lymphoblastoïdes, on peut généralement obtenir la multiplication cellulaire maximale en environ 1 à 5 semaines. Le nombre des cellules humaines ainsi obtenues peut être d'environ 107 à 1012 ou plus par animal. Selon l'invention, la production des cellules humaines transplantées est accrue d'environ 102 à 107 fois ou plus, ce qui est supérieur d'environ 10 à 10e fois ce qu'on obtient selon un procédé de multiplication in vitro utilisant un milieu nutritif. Donc, les cellules humaines multipliées peuvent être utilisées de façon favorable pour la production de kallikréine humaine. The period required to obtain maximum cellular multiplication is generally 1 to 20 weeks. When human cells are tumor or lymphoblastoid cells, maximum cell multiplication can usually be achieved in about 1 to 5 weeks. The number of human cells thus obtained can be about 107 to 1012 or more per animal. According to the invention, the production of transplanted human cells is increased by approximately 102 to 107 times or more, which is approximately 10 to 10 times greater than that obtained by an in vitro multiplication process using a nutritive medium. . Therefore, the multiplied human cells can be used favorably for the production of human kallikrein.

On peut réguler la reproduction des cellules humaines multipliées en les soumettant à une culture tissulaire in vitro de 1 à 4 jours avant le stade d'induction décrit ci-après. The reproduction of multiplied human cells can be regulated by subjecting them to an in vitro tissue culture from 1 to 4 days before the induction stage described below.

On peut employer dans l'invention un procédé quelconque induisant les cellules humaines multipliées à produire la kallikréine humaine. Par exemple, les cellules humaines multipliées obtenues par récolte à partir d'une suspension dans l'ascite ou d'une extraction et d'une désagrégation d'une ou plusieurs tumeurs massives, formées par exemple sous la peau, sont mises en suspension dans un milieu nutritif préchauffé à une température comprise dans la gamme d'environ 20 à 40: C pour obtenir une densité cellulaire d'environ 104 à 108 cellules par millilitre et incubées pour obtenir la kallikréine humaine. Dans ce cas, on peut exposer les cellules humaines à l'action d'un inducteur de la kallikréine pour accroître encore la production de kallikréine. L'inducteur de kallikréine utilisable dans l'invention peut être constitué d'un ou plusieurs de ceux qui induisent la production de kallikréine humaine dans les cellules humaines obtenues par multiplication de cellules humaines par emploi d'un animal à sang chaud autre que l'homme. Par exemple on peut utiliser comme inducteur de la kallikréine des amino-acides tels que la glycine ou la phénylalanine, des protéines telles que la caséine, des saccharides tels que le glucose, l'inositol, le ribose ou de désoxyri-bose ou une hormone telle que l'adrénaline. Any method of inducing multiplied human cells to produce human kallikrein can be employed in the invention. For example, the multiplied human cells obtained by harvesting from a suspension in ascites or from an extraction and disintegration of one or more massive tumors, formed for example under the skin, are suspended in a nutrient medium preheated to a temperature in the range of about 20 to 40: C to obtain a cell density of about 104 to 108 cells per milliliter and incubated to obtain human kallikrein. In this case, human cells can be exposed to the action of a kallikrein inducer to further increase the production of kallikrein. The kallikrein inducer usable in the invention may consist of one or more of those which induce the production of human kallikrein in human cells obtained by multiplication of human cells by use of a warm-blooded animal other than the man. For example, it is possible to use as an inducer of kallikrein amino acids such as glycine or phenylalanine, proteins such as casein, saccharides such as glucose, inositol, ribose or deoxyribose or a hormone such as adrenaline.

La stabilisation de la kallikréine humaine dans la culture et l'accroissement de la production de la kallikréine humaine peuvent être obtenus par addition à la culture d'un stabilisant de la kallikréine ou d'un stimulateur de la kallikréine tel que la trypsine (EC 3.4.21.4) ou d'un alcaloïde. Stabilization of human kallikrein in culture and increased production of human kallikrein can be achieved by adding a kallikrein stabilizer or a kallikrein stimulator such as trypsin to the culture (EC 3.4 .21.4) or an alkaloid.

La kallikréine humaine peut être facilement récoltée dans la culture selon des procédés de purification et de séparation qui utilisent des techniques classiques, par exemple la concentration, le relargage, la dialyse, la filtration, la centrifugation et/ou la lyophilisation. 5 Si une préparation de kallikréine humaine plus purifiée est souhaitable, on peut obtenir une préparation ayant la pureté maximale possible par emploi des techniques décrites ci-dessus en combinaison avec d'autres techniques classiques, par exemple l'absorption et la dé-sorption avec un échangeur d'ions, la filtration sur gel, l'électropho-îo rése, la Chromatographie d'affinité et/ou le fractionnement au point isoélectrique. Human kallikrein can be easily harvested from culture by purification and separation methods which use conventional techniques, for example concentration, salting out, dialysis, filtration, centrifugation and / or freeze drying. If a more purified human kallikrein preparation is desirable, a preparation having the maximum possible purity can be obtained by using the techniques described above in combination with other conventional techniques, for example absorption and desorption with an ion exchanger, gel filtration, electrophoresis, affinity chromatography and / or isoelectric point fractionation.

La présente kallikréine humaine est identique sur le plan immu-nologique à celle provenant de l'urine humaine et elle ne contient ni pyrogène ni virus de l'hépatite: on peut donc l'utiliser de façon 15 avantageuse isolément ou en combinaison avec un ou plusieurs agents tels qu'une hormone stéroïdienne, un anticoagulant ou un agent carcinostatique pour l'administration interne ou pour l'injection pour la prévention ou le traitement de maladies humaines. The present human kallikrein is immunologically identical to that from human urine and does not contain pyrogen or hepatitis virus: it can therefore be advantageously used alone or in combination with one or more several agents such as a steroid hormone, an anticoagulant or a carcinostatic agent for internal administration or for injection for the prevention or treatment of human diseases.

Dans toute la présente description, les titres de la kallikréine 20 humaine ont été déterminés selon la méthode de dosage biologique indiquée par Moriya et coll., Journal of Biochemistry, vol. 58, Throughout the present description, the titers of human kallikrein have been determined according to the biological assay method indicated by Moriya et al., Journal of Biochemistry, vol. 58,

page 201 (1965) avec une légère modification et ils sont exprimés en unités biologique (UK) déterminées par mesure de l'abaissement de pression sanguine chez un chien après administration de la kalli-25 kréine humaine. page 201 (1965) with a slight modification and they are expressed in biological units (UK) determined by measuring the reduction in blood pressure in a dog after administration of human kalli-25 krein.

Plusieurs modes de réalisation de l'invention vont être décrits sans que la portée de l'invention soit limitée de quelconque façon. Several embodiments of the invention will be described without the scope of the invention being limited in any way.

Exemple 1 : Example 1:

30 On transplante par voie sous-cutanée à des souris nues adultes une lignée de cellules humaines de cancer du pancréas, COLO 357, et on les alimente de façon habituelle pendant 4 semaines. A naked pancreatic cancer cell line, COLO 357, is transplanted subcutaneously to adult mice and fed in the usual manner for 4 weeks.

Cette transplantation de cellules et l'alimentation ultérieure des animaux provoquent la formation sous-cutanée de tumeurs massives 35 pesant chacune environ 10 g que l'on extrait, fragmente et désagrège par mise en suspension dans une solution salée physiologique contenant de la trypsine. This cell transplantation and the subsequent feeding of the animals cause subcutaneous formation of massive tumors each weighing about 10 g which are extracted, fragmented and disintegrated by suspension in a physiological saline solution containing trypsin.

Ensuite on lave les cellules humaines avec du milieu 199 de Earle (pH 7,2) additionné de 10% v/v de sérum fœtal de veau et on met en 40 suspension dans du milieu frais ayant la même composition et contenant de plus environ 1 mg/ml de caséine, pour obtenir une densité cellulaire d'environ 1 x 10s cellules par millilitre puis on incube la culture pendant 10 jours à 37 C pour provoquer la production de kallikréine humaine. The human cells are then washed with Earle's medium 199 (pH 7.2) supplemented with 10% v / v of fetal calf serum and suspended in fresh medium having the same composition and additionally containing approximately 1 mg / ml of casein, to obtain a cell density of approximately 1 × 10 5 cells per milliliter, then the culture is incubated for 10 days at 37 ° C. to cause the production of human kallikrein.

45 Ensuite, on soumet la culture obtenue à un traitement par les ultrasons et on détermine le titre en kallikréine humaine du surnageant. Then, the culture obtained is subjected to an ultrasound treatment and the titer in human kallikrein of the supernatant is determined.

La production de kallikréine humaine est d'environ 600 UK par ml de culture. Human kallikrein production is around UK 600 per ml of culture.

se On réalise le témoin de la façon suivante: On cultive des cellules humaines de cancer du pancréas de la lignée COLO 357 in vitro dans du milieu 199 de Parker (pH 7,2) additionné de 10% v/v de sérum fœtal de veau et on soumet les cellules humaines multipliées à une induction semblable à celle ci-dessus. La production de kalli-55 kréine humaine n'est que de 20 UK par ml de culture. The control is carried out as follows: Human pancreatic cancer cells of the COLO 357 line are cultured in vitro in Parker medium 199 (pH 7.2) supplemented with 10% v / v of fetal calf serum and the multiplied human cells are subjected to an induction similar to that above. The production of human kalli-55 krein is only 20 UK per ml of culture.

Exemple 2: Example 2:

On met ensemble en suspension des cellules de la lignée humaine de cancer du pancréas COLO 357 et d'une lignée lymphoblastoïde se humaine Namalvva dans un récipient avec une solution salée de 140 mM en NaCl, 54 mM en KCl, 1 mM en NaH2P04 et 2 mM en CaCl2, pour obtenir des densités cellulaires respectives d'environ 103 cellules/ml. A la suspension cellulaire on ajoute, en refroidissant par la glace, une solution salée fraîche ayant la même composition et 65 contenant de plus du virus Sendaï préalablement inactivé par irradiation par les ultraviolets. Environ 5 minutes après l'addition, on transfère le mélange dans un incubateur à 37: C et on l'y agite pendant environ 30 minutes pour effectuer la fusion cellulaire et in Cells of the human pancreatic cancer line COLO 357 and of a human lymphoblastoid line Namalvva are suspended together in a container with a saline solution of 140 mM in NaCl, 54 mM in KCl, 1 mM in NaH2PO4 and 2 mM in CaCl2, to obtain respective cell densities of approximately 103 cells / ml. To the cell suspension is added, while cooling with ice, a fresh saline solution having the same composition and 65 additionally containing Sendai virus previously inactivated by ultraviolet irradiation. Approximately 5 minutes after the addition, the mixture is transferred to a 37: C incubator and stirred there for approximately 30 minutes to effect cell fusion and in

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troduire la capacité de production de la kallikréine humaine de la lignée humaine de cellules de cancer du pancréas dans la lignée humaine de cellules lymphoblastoïdes. translate the production capacity of human kallikrein from the human pancreatic cancer cell line into the human lymphoblastoid cell line.

On transplante par voie intrapéritonéale les cellules hybrides obtenues à des souris nues adultes que l'on alimente de façon habituelle pendant 5 semaines. The hybrid cells obtained are transplanted intraperitoneally to adult naked mice which are fed in the usual way for 5 weeks.

Après extraction des tumeurs massives obtenues pesant chacune environ 15 g, on soumet la suspension de cellules à une induction de la production de kallikréine humaine comme dans l'exemple 1, si ce n'est qu'on remplace la caséine par 0,1% p/v de phénylalanine et 0,1% p/v de glucose. After extraction of the massive tumors obtained, each weighing approximately 15 g, the cell suspension is subjected to an induction of human kallikrein production as in Example 1, except that the casein is replaced by 0.1% w / v phenylalanine and 0.1% w / v glucose.

La production de kallikréine humaine est d'environ 1500 UK par ml de culture. The production of human kallikrein is around 1500 UK per ml of culture.

Le témoin, pour lequel on cultive les cellules humaines hybrides in vitro pour leur multiplication puis traitées comme dans l'exemple 1 pour produire de la kallikréine humaine, ne fournit qu'environ 100 UK de kallikréine humaine/ml de culture. The control, for which the hybrid human cells are cultivated in vitro for their multiplication and then treated as in Example 1 to produce human kallikrein, provides only about 100 UK of human kallikrein / ml of culture.

Exemple 3: Example 3:

On met en suspension des cellules humaines de tumeur rénale que l'on a obtenues par extraction de tissu de tumeur rénale d'un patient, fragmentation et désagrégation, et des cellules de la lignée lymphoblastoïde humaine BALL-1 dans un récipient avec une solution salée 140 mM en NaCl, 54 mM en KCl, 1 mM en NaH2P04 et 2 mM en CaCl2, pour obtenir des densités cellulaires respectives d'environ 103 cellules par millilitre. On ajoute à la suspension cellulaire, en refroidissant par de la glace, une solution salée fraîche ayant la même composition et contenant de plus du virus Sendaï préalablement inactivé par irradiation par les ultraviolets. On transfère ensuite le mélange dans un incubateur à 37°C environ 5 minutes après l'addition, et on l'y agite pendant environ 30 minutes pour effectuer la fusion cellulaire et introduire la capacité de production de la kallikréine humaine des cellules humaines de tumeur rénale dans les cellules de la lignée lymphoblastoïde. Human kidney tumor cells obtained by extracting kidney tumor tissue from a patient, fragmentation and disintegration, and cells of the human lymphoblastoid line BALL-1 are suspended in a container with saline solution. 140 mM in NaCl, 54 mM in KCl, 1 mM in NaH2PO4 and 2 mM in CaCl2, to obtain respective cell densities of approximately 103 cells per milliliter. A fresh salt solution having the same composition and additionally containing Sendai virus previously inactivated by ultraviolet irradiation is added to the cell suspension, while cooling with ice. The mixture is then transferred to an incubator at 37 ° C about 5 minutes after addition, and stirred there for about 30 minutes to effect cell fusion and introduce the human kallikrein production capacity of human tumor cells kidney in cells of the lymphoblastoid line.

Après injection d'un antisérum préparé de façon habituelle chez le lapin à des hamsters nouveau-nés pour réduire leur réaction immunitaire, on transplante les cellules hybrides par voie sous-cutanée à ces animaux que l'on alimente de façon habituelle pendant 3 semaines. After injecting an antiserum prepared in the usual way in rabbits into newborn hamsters to reduce their immune reaction, the hybrid cells are transplanted subcutaneously to these animals which are fed in the usual way for 3 weeks.

On traite comme dans l'exemple 1, pour induire la production de kallikréine humaine, la suspension cellulaire obtenue à partir des tumeurs massives formées sous la peau et pesant chacune environ 10 g. The procedure is as in Example 1, to induce the production of human kallikrein, the cell suspension obtained from massive tumors formed under the skin and each weighing approximately 10 g.

La production de kallikréine humaine est d'environ 2100 UK/ml de culture. Human kallikrein production is approximately 2100 UK / ml of culture.

Le témoin, pour lequel on cultive les cellules BALL-1 hybridées in vitro comme dans l'exemple 1 pour les multiplier, puis qu'on traite comme dans l'exemple 1 pour produire la kallikréine humaine, ne fournit qu'environ 200 UK de kallikréine humaine/ml de culture. The control, for which the BALL-1 hybridized cells are cultivated in vitro as in Example 1 to multiply them, then treated as in Example 1 to produce human kallikrein, provides only approximately 200 UK of human kallikrein / ml of culture.

Exemple 4: Example 4:

On transplante par voie intraveineuse à des rats nouveau-nés des cellules d'une lignée lymphoblastoïde humaine Namalwa hybridées dans lesquelles on a introduit la capacité de production de la kallikréine humaine comme dans l'exemple 2 et on alimente les animaux de façon habituelle pendant 4 semaines. The cells of a hybridized Namalwa human lymphoblastoid line are intravenously transplanted into newborn rats into which the production capacity of human kallikrein has been introduced as in Example 2 and the animals are fed in the usual way for 4 weeks.

Après extraction des tumeurs massives obtenues, pesant chacune 5 environ 40 g, on traite la suspension cellulaire comme dans l'exemple 2 pour induire la production de kallikréine humaine. After extraction of the massive tumors obtained, each weighing approximately 40 g, the cell suspension is treated as in Example 2 to induce the production of human kallikrein.

La production de kallikréine humaine est d'environ 1400 UK/ml de culture. Human kallikrein production is around 1400 UK / ml of culture.

io Exemple 5: io Example 5:

Après avoir irradié des souris adultes avec des rayons X à une dose d'environ 400 rems pour réduire leurs réactions immunitaires, on transplante par voie sous-cutanée aux animaux des cellules de la lignée humaine cancéreuse COLO 357 et on les alimente de façon 15 habituelle pendant 4 semaines. After irradiating adult mice with X-rays at a dose of about 400 rems to reduce their immune reactions, cells of the human cancer line COLO 357 are transplanted to the animals and fed as usual. for 4 weeks.

On extrait les tumeurs massives obtenues formées sous la peau pesant chacune environ 15 g et on les traite comme dans l'exemple 1 pour induire la production de kallikréine humaine. The massive tumors obtained formed under the skin, each weighing approximately 15 g, are extracted and treated as in Example 1 to induce the production of human kallikrein.

La production de kallikréine humaine est d'environ 900 UK/ml 20 de culture. Human kallikrein production is approximately 900 UK / ml of culture.

Exemple 6: Example 6:

On met en suspension des cellules de la lignée lymphoblastoïde 25 humaine BALL-1 hybridées, dans lesquelles on a introduit la capacité de produire la kallikréine humaine de la même façon que dans l'exemple 3, dans une chambre de diffusion cylindrique en matière plastique ayant un volume intérieur d'environ 10 ml munie d'une membrane filtrante ayant une taille nominale des pores d'environ 30 0,5 |im avec une solution salée physiologique et on place la chambre dans le péritoine d'un rat adulte. Ensuite on alimente l'animal de façon habituelle pendant 4 semaines et on retire la chambre. Cells of the hybridized human BALL-1 lymphoblastoid line are suspended, into which the capacity to produce human kallikrein has been introduced in the same way as in Example 3, in a cylindrical plastic diffusion chamber having an internal volume of about 10 ml provided with a filter membrane having a nominal pore size of about 0.5 µm with physiological saline and the chamber is placed in the peritoneum of an adult rat. Then we feed the animal in the usual way for 4 weeks and remove the chamber.

La densité des cellules humaines dans la chambre est d'environ 2 x 10® cellules/ml ce qui est supérieur d'environ 103 fois ce qu'on 35 obtient selon une méthode de culture tissulaire in vitro avec un incubateur à C02. The density of human cells in the chamber is approximately 2 x 10® cells / ml which is approximately 103 times higher than that obtained by an in vitro tissue culture method with a CO 2 incubator.

On traite ensuite les cellules humaines comme dans l'exemple 2 pour induire la production de kallikréine humaine. The human cells are then treated as in Example 2 to induce the production of human kallikrein.

La production de kallikréine humaine est d'environ 1800 UK/ml 40 de culture. Human kallikrein production is around 1800 UK / ml 40 of culture.

Exemple 7: Example 7:

On transplante dans les cavités allantoïdiennes d'œufs embryon-nés que l'on a préincubés pendant 5 jours à 37° C des cellules de la 45 lignée lymphoblastoïde humaine BALL-1 hybridées dans lesquelles on a introduit la capacité de produire la kallikréine humaine comme dans l'exemple 3 et on incube les œufs à cette température pendant environ 1 semaine. Hybridized BALL-1 cells of the human lymphoblastoid line BALL-1 were transplanted into the allantoic cavities of embryo-born eggs which had been preincubated for 5 days at 37 ° C., in which the capacity to produce human kallikrein was introduced. in Example 3 and the eggs are incubated at this temperature for about 1 week.

On recueille les cellules humaines dans les œufs et on les traite 50 comme dans l'exemple 2 pour induire la production de kallikréine humaine. Human cells are collected from the eggs and treated as in Example 2 to induce production of human kallikrein.

La production de kallikréine humaine est d'environ 1200 UK/ml de culture. The production of human kallikrein is approximately 1200 UK / ml of culture.

R R

Claims

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(1) transplant human cells capable of producing human kallikrein into a warm-blooded animal other than man;

feeding the animal to allow human cells to use a nutritive liquid from the animal's body for their multiplication;

extracting and disaggregating the obtained tumor formed in animals to obtain multiplied human cells;

cultivating human cells in a nutritive medium in vitro in the presence or not of a kallikrein inducer for a period sufficient to accumulate a significant quantity of human kallikrein, and collecting the human kallikrein accumulated from the culture, or otherwise,

let the human cells use a nutritive liquid from the animal's organism for their multiplication, and let the multiplied human cells release human kallikrein, or else,

1. Process for producing human kallikrein, characterized in that it comprises the stages which consist in:

(2) placing a suspension of human cells capable of producing human kallikrein in a conventional type diffusion chamber to supply said human cells with a nutritive liquid from the organism of a warm-blooded animal other than man;

include or place the chamber in or on a warm-blooded animal other than man;

feed the animal to allow human cells to use the body fluid for their multiplication;

collect the multiplied human cells from the chamber; culturing human cells in a nutritive medium in vitro in the presence or absence of a kallikrein inducer for a period sufficient to accumulate a significant amount of human kallikrein, and collecting the human kallikrein accumulated from the culture.

2. Method according to claim 1, characterized in that it comprises the stages consisting in:

(2) placing human cells capable of producing human kallikrein in a device supplying them with a nutritive liquid from the organism of a warm-blooded animal other than man;

include or place the device in or on the animal;

let human cells use the body's nutrient fluid for their multiplication, and let multiplied human cells release human kallikrein.

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3. Method according to claim 1, characterized in that said human cells capable of producing human kallikrein are normal human cells chosen from the group consisting of human pancreatic cells, human salivary gland cells, human liver cells , human kidney cells, human bladder cells and pulmonary fibroblasts.

4. Method according to claim 1, characterized in that said human cells are human tumor cells chosen from the group consisting of human pancreatic cancer cells, human salivary gland cancer cells, human liver cancer cells , human kidney cancer cells, human bladder cancer cells and those obtained by transformation of human cells described in claim 3.

5. Method according to claim 1, characterized in that said human cells are hybrid human cells into which the capacity to produce human kallikrein has been introduced.

6. Method according to claim 1, characterized in that said human cells are cells of a human lymphoblastoid line hybridized with any of the human cells described in claims 3 and 4 to introduce the production capacity of human kallikrein seconds into the first.

7. Method according to claim 6, characterized in that said human lymphoblastoid line is part of the group consisting of the lines Namalvva, BALL-1, NALL-1, TALL-1 and JBL.

8. Method according to claim 1, characterized in that said warm-blooded animal other than man is a mammal or a bird.

9. Method according to claim 1, characterized in that said kallikrein inducer is one or more elements from the group consisting of amino acids, proteins, sugars and hormones.