DK169479B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af humanspecifikt type II-interferon - Google Patents
Fremgangsmåde til fremstilling af humanspecifikt type II-interferon Download PDFInfo
- Publication number
- DK169479B1 DK169479B1 DK011880A DK11880A DK169479B1 DK 169479 B1 DK169479 B1 DK 169479B1 DK 011880 A DK011880 A DK 011880A DK 11880 A DK11880 A DK 11880A DK 169479 B1 DK169479 B1 DK 169479B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- cells
- interferon
- type
- human
- approx
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/57—IFN-gamma
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/811—Interferon
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
i DK 169479 B1
Den foreliggende opfindelse angår en særlig fremgangsmåde til fremstilling af humanspecifikt type Il-interferon, ved at type II-interferon-producerende etablerede humane celler transplanteres til legemet af et ikke-humant varmblodet dyr 5 eller cellerne podes i et dyrkningsmedium, som er anbragt i et diffusionskammer med indskudt filtermembran, hvilket diffusionskammer er udformet og anbragt i eller tilknyttet dyrelegemet på en sådan måde, at cellerne kan vokse i dyrets nærende legemsvæske i kammeret, og de transplanterede eller 10 podede celler formeres i det varmblodede dyrs legeme eller i diffusionskammeret under anvendelse af legemsvæsken^ hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at de formerede humane celler udsættes for indvirkning af en type II-interferoninducer over en periode på mere end 24 timer, hvorefter det 15 inducerede humanspecifikke type Il-interferon fraskilles og oprenses.
Som det er beskrevet af Shigeyasu Kobayashi, "Interferon", udgivet af Kodansha Co. Ltd., Tokyo, Japan (1975), D.A.J. Tyrrell, "Interferon and its Clinical Potential", udgivet af 20 William Heineman Medical Books Ltd. (London) (1976), og i "Protein, Nucleic Acid and Enzyme", bind 21, No. 4 (1976), er interferon den betegnelse, der angiver et proteinagtigt stof, som induceres intra- eller extra-cellulært ved at udsætte levende celler for indvirkning af en interferon-inducer, for 25 eksempel virus, bakterier, protozoer, rickettsia, nucleinsy-re, endotoxin og polysaccharid, og som har den virkning, at det ikke-specifikt inhiberer formeringen af forskellige vira i celler. På grund af sin funktion med hensyn til at inhibere virusformeringen er interferon længe blevet anset for at være 30 et lovende terapeutisk og profylaktisk middel for virale sygdomme. Det er for nylig blevet påvist, at interferon virker som antitumormiddel, ikke blot på virale tumorer, men også på ikke-virale tumorer, og der stilles derfor store forventninger til udnyttelsen af interferon som medicin.
35 Det er veldokumenteret, at begrebet interferon omfatter såvel type I- som type II-interferon. Interferon af type I eller DK 169479 B1 2 klassisk interferon har en molekylvægt på ca. 1 - 3 x 104 og induceres ved at udsætte levende celler for virale infektioner, og interferon af type II eller immuninterferon har en molekylvægt på ca. 4 - 7 x 104 og induceres i lymphocyter 5 efter stimulation med mitogener eller efter respons på antigener. Som det er beskrevet af L.B. Epstein, "Texas Reports on Biology and Medicine", bind 35, pp. 41-56 (1977), udgivet af University of Texas Medical Branch, Galveston, Texas, U.S.A., er interferon af type II mindre stabilt end interfe-10 ron af type I under strenge betingelser, nemlig ved en pH-værdi på under 2 og over 10 og/eller ved en temperatur på over 56°C. Da imidlertid type Il-interferon har en nær relation til immunoreaktioner, forventes type Il-interferon at have meget større terapeutisk og profylaktisk effektivitet på 15 interferon-følsomme sygdomme end type I-interferon.
På grund af den høje artsspecificitet kan de terapeutiske og profylaktiske virkninger på humane sygdomme ikke opnås med interferon, der er fremstillet ud fra andre kilder end levende humane celler. Hidtil er leukocyter blevet anvendt ved 20 fremstillingen af type Il-interferon. Det er meget vanskeligt at opnå en stor mængde type Il-interferon billigt ud fra leukocyter, da leukocyter skal fraskilles og fremstilles ud fra frisk blod og ikke kan tåle langvarig opbevaring. På grund af disse omstændigheder er der ikke blevet opnået kom-25 merciel produktion af type Il-interferon, der kan anvendes som terapeutisk og profylaktisk middel for humane sygdomme.
Nærværende opfindere har nu undersøgt en fremgangsmåde, der let vil kunne anvendes til kommerciel produktion af type Ilinterferon, og har studeret mulighederne for dette interferon 30 som terapeutisk og profylaktisk middel. Disse bestræbelser har resulteret i den opdagelse, at der ikke kunne opnås nogen stor mængde humanspecifikt type Il-interferon med høj titer ved at overføre og formere etablerede type II-interferonpro-ducerende humane celler i et dyrkningsmedium in vitro, men at 35 dette let kunne opnås ved at transplantere cellerne til andre varmblodede dyr eller ved at pode cellerne i et dyrkningsme- 3 DK 169479 B1 dium anbragt i et filtermembran-omgivet diffusionskammer, som er udformet og tilpasset i eller til dyrelegemet, således at cellerne kan vokse på dyrets legemsvæske som næringsmedium, formere de transplanterede eller podede celler under udnyt-5 telse af legemsvæskerne i det varmblodede dyr eller i diffusionskammeret og derpå udsætte de formerede celler for indvirkning af en type II-interferon-inducer i kombination med en type I-interferon-inducer in vivo eller in vitro til inducering af type II-interferon og fraskille og rense det 10 inducerede type II-interferon. Det ved denne fremgangsmåde vundne type Il-interferon er et fortrinligt terapeutisk og profylaktisk middel for type II-interferon-følsomme sygdomme.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen afviger fra konventionelle fremgangsmåder, hvor de levende celler formeres in vitro, og 15 den har den fordel, at den kræver ingen eller meget mindre næringsmedium suppleret med kostbart serum, at opretholdelsen og reguleringen af betingelserne under formeringen af de etablerede humane celler er lettere, og at der let kan opnås et type II-interferon med høj titer. Ved fremgangsmåden 20 ifølge opfindelsen kan etablerede humane celler let formeres i andre varmblodede dyr under anvendelse af legemsvæsken ved enten at transplantere cellerne deri eller til dyrelegemet at tilslutte et diffusionskammer, som er fyldt med et dyrkningsmedium med en suspension af cellerne, medens dyret fodres på 25 sædvanlig måde. Specielt har opfindelsen, sammenlignet med de konventionelle fremgangsmåder, hvor cellerne formeres in vitro, de yderligere fordele, at formeringen af cellerne er mere stabil, at formeringshastigheden er højere, og at udbyttet af induceret type Il-interferon pr. celle er meget høje-30 re.
Der kan anvendes hvilke som helst etablerede humane celler, når blot de formeres let, når de transplanteres til andre varmblodede dyrelegemer; der kan f.eks. anvendes HPB-ALL-celler, MOLT-3-celler, P 12/Ichikawa-celler, HPB-MLT-celler, 35 P 8/Seki-celler, JBL-celler, HCL-celler og P 10/Shibata-celler som beskrevet i "Protein, Nucleic Acid and Enzyme", bind DK 169479 B1 4 23, No. 6, pp. 697-711 (1978), Namalva-celler, som er beskrevet i "Journal of Clinical Microbiology", bind 1, pp. 116-117 (1975), og BALL-1-celler, TALL-1-celler og NALL-1-celler, der er beskrevet af I. Miyoshi, "Nature", bind 267, 5 pp. 843-844 (1977).
Specielt foretrækkes de humane lymphoblastoidcellelinjer. Etablerede humane celler, der kan anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, kan udvælges blandt de ovennævnte celler, men er ikke begrænset dertil. I trin, som ligger før induk-10 tionen af interferon af type II, kan de ovennævnte celler anvendes hver for sig eller i kombination. Når de etablerede humane celler, der anvendes ved fremstillingen af type Ilinterferon, er leukocyter, især lymphocyter, kan anvendelsen af en celleblanding, indeholdende B-lymphocyter (B-celler) og 15 T-lymphocyter (T-celler) foruden de nævnte etablerede humane celler, yderligere forøge aktiviteten af det inducerede type II-interferon. Til de etablerede humane celler kan der om ønsket, blandes humane leukocyter fremstillet ud fra frisk humant blod.
20 Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan der anvendes et hvilket som helst ikke-humant varmblodet dyr, når blot etablerede humane celler kan formere sig deri: der kan f.eks. anvendes fugle såsom kyllinger og duer, og der kan anvendes pattedyr såsom hunde, katte, aber, geder, grise, okser, 25 heste, kaniner, marsvin, rotter, hamstere, mus og nøgne mus.
Da transplantationen af humane celler i de ovennævnte dyrele-gemer har tilbøjelighed til at medføre uønskede immunoreak-tioner, bør dyrene vælges i det mest umodne stadium, nemlig æg, fostre, embryo eller nyfødte eller ganske unge dyr, så at 30 immunoreaktionerne undertrykkes i videst mulig grad. Før transplantationen af cellerne kan dyret bestråles med ca.
200 - 600 REM røntgenstråler eller gammastråler, eller der kan injiceres antiserum eller et immunosuppressivt middel til undertrykkelse af immunoreaktionerne. Nøgne mus, selv voksne 35 nøgne mus, foretrækkes som de varmblodede dyr, da de er mindre tilbøjelige til at forårsage uønskede immunoreaktioner, DK 169479 B1 ‘ 5 og da etablerede humane celler kan transplanteres dertil og formeres hurtigt uden nogen forbehandling. Transplantationen af formerede humane celler fra ét varmblodet dyrelegeme til et andet varmblodet dyrelegeme kan gøre formeringen af cel-5 lerne meget mere stabil og mængden af type Il-interferon, som induceres i cellerne, meget større; f.eks. transplanteres etablerede humane celler i hamstere og formeres deri, hvorefter de formerede humane celler høstes og derefter transplanteres til nøgne mus. I dette tilfælde kan de formerede 10 celler transplanteres yderligere fra ét varmblodet dyr til et andet varmblodet dyr af samme art, af samme slægt, af samme klasse eller af samme inddeling. Etablerede humane celler kan også transplanteres til en hvilken som helst del af dyrelege-met, når de blot formeres let deri; f.eks. kan de transplan-15 teres intraperitonealt, intravenøst, subcutant eller i allan-toishulheden.
I stedet for at transplantere og formere etablerede humane celler til andre varmblodede dyr kan en hvilken som helst af de ovennævnte celletyper podes og formeres i et næringsmedium 20 hidrørende fra et andet varmblodet dyr i et diffusionskammer af konventionel type, der indlejres f.eks. intraperitonealt, og som er således udformet, at det lader cellerne udnytte dyrets legemsvæske. De kamre, der kan anvendes ved fremgangsmåde ifølge opfindelsen, kan være af forskellige former og 25 størrelser, og de bør være adskilt fra legemsvæsken ved filtermembraner, f.eks. membranfiltre, ultrafiltre eller hule fibre, til undgåelse af udslip af celler. Der foretrækkes især kamre med som adskillelse anbragte filtermembraner med porestørrelser på ca. 10'7 - 10"5 m. Om nødvendigt kan diffu-30 sionskammeret være således udformet og placeret, f.eks. på overfladen af dyrelegemet, at dyrets nærende legemsvæske kan cirkulere gennem kammeret, og udviklingen af de etablerede humane celler, som er podet i kammeret, kan iagttages gennem et gennemsigtigt sidevindue, der er udformet i kammervæggen.
35 Diffusionskammeret kan også være således udformet og anbragt, at det periodisk kan afbrydes fra dyrelegemet, og at cellerne formerer sig gennem hele dyrets liv, uden at dyret, for DK 169479 B1 6 yderligere at øge antallet af formerede celler pr. dyr, behøver slagtes på et tidspunkt, hvor dette ellers ikke var nødvendigt. Endvidere har fremgangsmåden ifølge opfindelsen, når den udnytter det ovennævnte diffusionskammer, den yderii-5 gere fordel, foruden at de formerede humane celler let kan høstes, da der ikke er nogen direkte kontakt mellem de humane celler og dyrecellerne, at det på grund af de ringere muligheder for at forårsage immunoreaktioner er muligt at anvende forskellige varmblodede dyr uden nogen immunoreaktions-redu-10 cerende forbehandling af dyrene.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen medfører den bekvemmelighed, at det dyr, til hvilket de etablerede humane celler transplanteres, kan fodres på sædvanlig måde, og at der ikke kræves nogen særlig behandling, selv ikke efter transplanta-15 tionen af cellerne. Den periode, der er nødvendig til tilstrækkelig formering af de transplanterede etablerede humane celler, er sædvanligvis ca. 1 - 10 uger.
Antallet af de formerede humane celler tælles og findes at være ca. 10 - 10 eller mere pr. dyr. Fremgangsmåden ifølge 20 opfindelsen er med andre ord særdeles fordelagtig til fremstilling af type II-interferon, da antallet af celler, der transplanteres eller podes i eller til dyrelegemet eller diffusionskammeret, stiger ca. 102 - 107 gange eller mere ved fremgangsmåden; dette er ca. 10 - 106 gange eller mere i 25 forhold til, hvad der opnås ved at pode og formere de samme celler i et næringsdyrkningsmedium in vitro.
Ved induktionen af type II-interferon kan der anvendes en hvilken som helst metode, der inducerer type II-interferon i de formerede levende humane celler. Cellerne kan udsættes for 30 indvirkning af en type II-interferon-inducer, hvor de formeres. F.eks. kan de humane celler, der formeres i ascites i suspension, eller de tumorceller, som fremkommer subcutant, udsættes for indvirkning af en type II-interferon-inducer in vivo, hvor de formeres, og det inducerede type II-interferon 35 renses derefter og adskilles fra ascites-væsken eller tumo- 7 DK 169479 B1 ren. I modsætning hertil kan de formerede humane celler efter isoleringen udsættes for indvirkning af en type Il-interferon- inducer in vitro til inducering af type II-interferon.
F.eks. kan de formerede humane celler, der er høstet fra 5 ascites, eller sådanne, som er isoleret og dissocieret fra de massive tumorer, som er fremkommet subcutant, suspenderes i et næringsmedium, der holdes ved ca. 20 - 40°C, til opnåelse af en cellekoncentration på ca. 105 - 108 celler pr. ml, og derefter udsættes for en type II-interferon-inducer. Derefter 10 renses og fraskilles det inducerede type II-interferon. Når humane celler formeres i et diffusionskammer, kan cellerne udsættes for en type II-interferon-inducer i kammeret in vivo, eller de kan udsættes for induceren in vitro, efter at de er isoleret fra kammeret.
15 Ved fremstillingen af type Il-interferon kan mængden af induceret type Il-interferon forøges yderligere ved kendte metoder såsom ved "priming", hvor der anvendes humant interferon af høj artsspecificitet, og/eller superinduktionsmetoden, hvor der anvendes en metabolisk inhibitor. Endvidere kan 20 udbyttet af det inducerede type II-interferon pr. dyr forøges yderligere ved én eller flere af følgende metoder: 1) En metode, hvor de formerede celler først udsættes for en type II-interferon-inducer til inducering af interferonet på det sted, hvor de formeres, og derpå, efter høsten fra en vis 25 del af dyrelegemet eller fra hele dyrelegemet, udsættes for en type II-interferon-inducer til inducering af interferonet in vitro, 2) en metode, hvor de humane celler, som allerede er blevet anvendt flere gange til fremstilling af type II-interferon, 30 udsættes for indvirkning af en type II-interferon-inducer in vivo eller in vitro til inducering af interferon, og 3) en metode, ved hvilken et diffusionskammer, som er indlejret i eller tilknyttet til eller på dyrelegemet, periodisk DK 169479 B1 8 afbrydes til forøgelse af antallet af de formerede humane celler.
Som type II-interferon-inducer foretrækkes sædvanligvis mitogener såsom phytohemagglutinin, concanavalin A, "pork 5 weed mitogen", lipopolysaccharid, polysaccharid, endotoxin og bakterier. For sensibiliserede celler virker antigen også som type II-interferon-inducer. De ovennævnte type II-interferon-inducere anvendes sædvanligvis i en koncentration på ca.
0,001 μg - 10 mg pr. ml. Anvendelsen i fremgangsmåden ifølge 10 opfindelsen af én eller flere type I-interferon-inducere, f.eks. virus, nucleinsyre og polynucleotid, i kombination med en type II-interferon-inducer fører til en yderligere forøgelse af udbyttet af det inducerede type II-interferon i forhold til det udbytte, der opnås ved anvendelse af type II-15 interferon-induceren alene, og det er også på denne måde muligt samtidigt at inducere type I-interferon og type Ilinterferon.
Det inducerede type II-interferon kan let fraskilles og renses ved konventionelle rensnings- og adskillelsesmetoder, 20 f.eks. udsaltning, dialyse, filtrering, centrifugering, koncentrering og frysetørring. Hvis der ønskes et højere renset type II-interferonpræparat, kan type Il-interferon af højeste renhed opnås ved anvendelse af konventionelle metoder, f.eks. adsorption og desorption ved hjælp af ionbytter, 25 gelfiltrering, affinitetschromatografi, fraktionering ved hjælp af isoelektrisk punkt og elektroforese, i kombination med de ovennævnte metoder.
Virkningerne af humane type I- og type II-interferoner med høj artsspecificitet er bestemt ved den konventionelle pla-30 quereduktionsmetode med humane amnionceller som beskrevet i "Protein, Nucleic Acid and Enzyme", bind 20, No. 6, pp. 616-643 (1975), udgivet af Kyoritsu Shuppan Co., Ltd., Tokyo, Japan.
9 DK 169479 B1 Hæmagglutinationsenheden er bestemt efter metoden i henhold til J.E. Salk, "Journal of Immunology", bind 49, pp. 87-98 (1944) .
Nedenstående forsøg A beskriver fremstillingen af type II-in-5 terferon ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.
FORSØG A
Interferon-produktivitet af cellerne, når de formeres in vitro eller in vivo.
Forsøg A-l. Formering in vitro.
10 BALL-1-Celler podes i RPMI-1640 medium, der er suppleret med 20% føtalt kalveserum ved pH-værdi 7,2, og dyrkes i suspension ved 37°C. De formerede celler vaskes med serumfrit RPMI-1640 medium [G.E. Moore et al., Journal of the American Medical Association 199 (1967) 519] ved pH-værdi 7,2 og sus-15 penderes i et frisk medium af samme sammensætning til opnåelse af en cellekoncentration på ca. 1 x 106 celler pr. ml.
Forsøg A-2. Formering in vivo.
Nyfødte hamstere for-injiceres med antiserum fremstillet i kaniner på kendt måde til undertrykkelse af deres immunoreak-20 tioner og transplanteres derefter med subcutane BALL-l-cel-ler. Hamsterne fodres på sædvanlig måde i 3 uger. De massive tumorer, som fremkommer subcutant, isoleres, skæres i små stykker og dissocieres i en fysiologisk saltopløsning indeholdende trypsin til opnåelse af de formerede celler. De så-25 ledes vundne celler vaskes med serumfrit RPMI-1640 medium ved pH-værdi 7,2 og suspenderes i et frisk medium af samme sammensætning til opnåelse af en cellekoncentration på ca.
1 x 106 celler pr. ml.
DK 169479 B1 10
Forsøg A-3. Fremstilling af interferon.
De suspensioner af BALL-l-celler, som er fremstillet i forsøg A-l og A-2, en cellekoncentration på ca. 1 x 106 celler pr. ml, udsættes for phytohemagglutinin og/eller Sendai-virus til 5 induktion af interferon. Når phytohemagglutinin anvendes alene, sættes der til suspensionerne phytohemagglutinin i en mængde på ca. 100 μg pr. ml, og der inkuberes ved 37°C i 3 dage til induktion af interferon. Når Sendai-virus anvendes alene, sættes Sendai-virus til suspensionerne i en mængde på 10 ca. 300 hemagglutinationsenheder pr. ml, og der inkuberes ved 37°C i én dag til induktion af interferon. Når phytohemagglu-tinin og Sendai-virus anvendes sammen, sættes der til suspensionerne først phytohemagglutinin i en mængde på ca. 100 μg pr. ml, og der inkuberes ved 37°C i 2 dage, hvorpå der til-15 sættes Sendai-virus i en mængde på ca. 300 hemagglutinationsenheder pr. ml, og der inkuberes ved 37°C i yderligere én dag til induktion af interferon.
De således vundne interferonholdige suspensioner centrifugeres. De resulterende supernatanter koncentreres med et ultra-20 filter med en molekylvægtsafskæring på 6000 og fraktioneres derpå efter molekylvægten med dextrangel. Aktiviteterne af det vundne type I-interferon, molekylvægt ca. 25.000, og det vundne type Il-interferon, molekylvægt ca. 50.000, bestemmes til bedømmelse af interferonaktiviteten pr. ml suspension 25 efter inkubation. Resultaterne fremgår af tabel I.
11 DK 169479 B1
Tabel I
Interferon-inducer Formering in vitro in vivo 5 _
Phytohemagglutinin 20 400 (20) (400)
Sendai-virus 1.700 6.700 10 (0) (0)
Phytohemagglutinin 1.740 24.000 + Sendai-virus (30) (11.000) 15 De samlede totale interferonaktiviteter, der er bestemt efter inkubation, udtrykkes som enheder pr. ml suspension, og aktiviteterne af type II-interferon for hvert præparat er vist i parentes.
Det fremgår af de i tabel I viste resultater, at medens der 20 induceres en ringe mængde interferon i de celler, der formeres in vitro, induceres der en stor mængde interferon i de celler, der formeres in vivo. De celler, der formeres både in vitro og in vivo, giver type I-interferon, når de udsættes for Sendai-virus. De celler, der formeres in vivo, giver 25 imidlertid 4 gange højere aktivitet end de celler, der formeres in vitro. Med hensyn til interferonaktiviteterne af de præparater, der er induceret med phytohemagglutinin og/eller Sendai-virus, iagttages en bemærkelsesværdig synergisme med hensyn til interferon-inducerne ved fremstillingen af type I-30 og type II-interferon, når der anvendes celler formeret in vivo. Specielt har det type II-interferon, der induceres ved anvendelse af phytohemagglutinin og Sendai-virus i kombination, en ca. 28 gange højere aktivitet end det, der induceres under anvendelse af phytohemagglutinin alene. Der iagttages DK 169479 B1 12 imidlertid ingen synergisme, når der anvendes de in vitro formerede celler.
Forskellige udførelsesformer, der belyser fremstillingen af type Il-interferon ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, 5 fremgår af det følgende:
Eksempel A.
Fremstilling af type II-interferon.
Eksempel A-I.
Til voksne nøgne mus transplanteres subcutant etablerede 10 humane BALL-1-celler, og musene fodres på sædvanlig måde i 3 uger. De massive tumorer, der fremkommer subcutant, ca. 10 g pr. nøgen mus, isoleres, skæres i små stykker og dissocieres i en fysiologisk saltopløsning indeholdende trypsin til fra-skillelse af de formerede humane celler. Cellerne vaskes med 15 Eagle's minimal essential medium suppleret med 5% v/v humant serum ved pH-værdi 7,2 [H. Eagle, Science 130 (1959) 432] og suspenderes i et frisk medium af samme sammensætning til opnåelse af en cellekoncentration på 5 x 106 celler pr. ml ved 37°C. Til denne suspension sættes et partielt renset 20 humant interferon med høj artsspecificitet i en mængde på ca. 100 enheder pr. ml, og blandingen inkuberes i ca. 2 timer. Derpå sættes phytohemagglutinin til blandingen i en mængde på ca. 200 pr. ml. Derpå inkuberes blandingen ved denne temperatur i yderligere 3 dage til induction af type II-inter-25 feron. Den inkuberede blanding centrifugeres ved ca. 1000 g og 4°C til fjernelse af bundfald såsom cellerester, og den resulterende supernatant dialyseres mod en fysiologisk saltopløsning, der er pufret ved pH-værdi 7,2 med 0,01M phos-phatpuffer, i 24 timer. Derpå filtreres det resulterende 30 materiale forsigtigt med en filtermembran, og det type II-interferonholdige filtrat koncentreres og frysetørres til et pulver.
13 DK 169479 B1
Pulverets type Il-interferon aktivitet er ca. 1.500.000 enheder pr. nøgen mus.
Eksempel A-2.
Til voksne nøgne mus transplanteres intraperitonealt etable-5 rede humane BALL-1- og TALL-1-celler, og musene fodres på sædvanlig måde i 5 uger. I de nøgne mus injiceres derefter intraperitonealt 1 mg phytohemagglutinin, og 24 timer senere injiceres ca. 3000 hemagglutinationsenheder Newcastle disease-virus, hvis aktivitet er næsten præ-inaktiveret ved 10 ultraviolet bestråling. De nøgne mus dræbes, og deres ascites høstes 24 timer efter injektionen. Ascites centrifugeres ved ca. 1000 g og 4°C til fjernelse af bundfald såsom cellerester. Den resulterende supernatant dialyseres mod en fysiologisk saltopløsning, der pufret til pH-værdi 7,2 med en 15 0,01M phosphatpuffer, i 15 timer. Det resulterende materiale filtreres derpå og koncentreres forsigtigt med filtermembraner til opnåelse af et koncentrat indeholdende interferon.
Koncentratets samlede interferonaktivitet er ca. 800.000 enheder pr. 10 nøgne mus, hvoraf ca. 300.000 enheder er type 20 II-interferonaktivitet.
Eksempel A-3.
Nyfødte hamstere præ-injiceres med antiserum fremstillet ud fra kaniner efter kendte metoder til undertrykkelse af deres immunoreaktioner, hvorefter de subcutant injiceres med etab-25 lerede humane JBL-celler. Hamsterne fodres på sædvanlig måde i 4 uger. De massive tumorer, der fremkommer subcutant, ca.
30 g pr. hamster, isoleres og behandles på lignende måde som beskrevet i eksempel A-l. De formerede celler vaskes med RPMI-1640-medium, der er suppleret med 10% v/v føtalt kalve-30 serum ved pH-værdi 7,4, og suspenderes i et frisk medium af samme sammensætning til opnåelse af en cellekoncentration på DK 169479 B1 14 ca. 2 x 107 celler pr. ml ved 37°C. Til blandingen sættes et partielt renset humant type Il-interferon med høj artsspecificitet i en mængde på ca. 200 enheder pr. ml, og der inkuberes ved 37°C i ca. 1 time. Til den inkuberede blanding 5 sættes derefter concanavalin A i en mængde på ca. 500 μg pr. ml, og der inkuberes i 3 dage, hvorpå der tilsættes Sendai-virus i en mængde på ca. 300 hemagglutinationsenheder pr. ml, og der inkuberes i 16 timer til induktion af interferon. Blandingen renses og koncentreres forsigtigt med filtermem-10 braner på lignende måde som beskrevet i eksempel A-2, hvorved der fås en interferonholdig opløsning.
Opløsningens samlede interferonaktivitet er ca. 17.000.000 enheder pr. hamster, hvoraf ca. 6.000.000 enheder er type II-interferonaktivitet.
15 Eksempel A-4.
Til nyfødte rotter transplanteres intravenøst etablerede humane Namalva-celler, hvorefter rotterne fodres på sædvanlig måde i 4 uger. De massive tumorer, der fremkommer subcutant, ca. 50 g pr. rotte, isoleres, skæres i små stykker og dis-20 socieres på lignende måde som beskrevet i eksempel A-l. De formerede humane celler behandles på lignende måde som beskrevet i eksempel A-l, bortset fra, at der i stedet for phytohemagglutinin til induktion af type Il-interferon tilsættes Maruyama-vaccine i en mængde på ca. l μg pr. ml. Det 25 inducerede type II-interferon renses, og den resulterende opløsning indeholdende type II-interferon frysetørres til et pulver på lignende måde som beskrevet i eksempel A-l.
Pulverets type II-interferonaktivitet er ca. 8.000.000 enheder pr. rotte.
Eksempel A-5.
15 DK 169479 B1 Først bestråles voksne mus med ca. 400 REM røntgenstråling til undertrykkelse af deres immunoreaktioner, og derefter transplanteres der subcutant i musene etablerede humane TALL-5 1-celler, hvorpå musene fodres på sædvanlig måde i 3 uger. Efter isolering og findeling af de massive tumorer, der fremkommer subcutant, ca. 10 g pr. mus, dissocieres tumorcellerne på lignende måde som beskrevet i eksempel A-l. Cellerne behandles på lignende måde som beskrevet i eksempel 10 A-3 til induktion af interferon. Det inducerede interferon renses og koncentreres på lignende måde som beskrevet i eksempel A-2, hvorved fås et koncentrat indeholdende interferon.
Koncentratets samlede interferonaktivitet er ca. 9.000.000 15 enheder pr. mus, hvoraf ca. 3.000.000 enheder er type II-interferonaktivitet.
Eksempel A-6.
I hamstere transplanteres først subcutant etablerede humane MOLT-3-celler på lignende måde som beskrevet i eksempel A-3, 20 hvorefter hamsterne fodres på sædvanlig måde i 3 uger til formering af cellerne. I 10 dage gamle nøgne mus transplanteres derefter intraperitonealt de formerede celler, og musene fodres på sædvanlig måde i yderligere 5 uger. De nøgne mus anæstetiseres til høst af deres ascites. De resulterende 25 ascites centrifugeres til høst af de formerede celler. Cellerne vaskes og behandles på lignende måde som beskrevet i A-1 til induktion af type II-interferon. Det inducerede type
Il-interferon renses derefter og koncentreres på lignende måde som beskrevet i eksempel A-2 til et koncentrat inde-30 holdende type Il-interferon.
Koncentratets type II-interferonaktivitet er ca. 500.000 enheder pr. nøgen mus.
Eksempel A-7.
16 DK 169479 B1
Under anvendelse af cylindriske diffusionskamre af formstof med membranfiltre med porestørrelsen 0,5 μ og kapacitet ca.
10 ml suspenderes etablerede humane JBL-celler i fysiologisk 5 saltopløsning. Kamrene indlejres intraperitonealt i voksne rotter. Rotterne fodres på sædvanlig måde i 4 uger, hvorefter kamrene fjernes. Koncentrationen af de formerede humane celler i kamrene er ca. 5 x 109 celler pr. ml, hvilket er ca.
1000 gange og derover højere end, hvad der opnås in vitro i 10 et næringsmedium under anvendelse af C02-inkubator. Til suspensionen af de resulterende celler sættes MOLT-3-celler, fremstillet som beskrevet i eksempel A-6, til en koncentration på ca. 20% v/v, og blandingen behandles på lignende måde som beskrevet i eksempel A-l til induktion af type II-inter-15 feron. Det inducerede type II-interferon renses og koncentreres til et koncentrat indeholdende type II-interferon, som derefter frysetørres til et pulver.
Pulverets type II-interferonaktivitet er ca. 4.000.000 enheder pr. rotte.
20 Eksempel A-8.
Etablerede humane NALL-l-celler transplanteres til allan-toishulheden i embryonerede æg, som er forinkuberet ved 37°C i 5 dage, og æggene inkuberes ved denne temperatur i yderligere 7 dage. Æggene åbnes, og de formerede humane celler 25 høstes. Suspensionen af cellerne sættes til et lige så stort rumfang TALL-1-celler, fremstillet som beskrevet i eksempel A-5, og behandles på lignende måde som beskrevet i eksempel A-l til induktion af type II-interferon. Det inducerede type II-interferon renses og koncentreres på lignende måde som 30 beskrevet i eksempel A-2, hvorved fås et koncentrat indeholdende type II-interferon.
17 DK 169479 B1
Koncentratets type II-interferonaktivitet er ca. 300.000 enheder pr. 10 embryonerede æg.
Eksempel A-9.
Et pulver, der er fremstillet som beskrevet i eksempel 5 A-l, renses yderligere forsigtigt i et pH-område på 4 - 9 på konventionel måde såsom ved adsorption og desorption under anvendelse ionbytter, fraktionering efter molekylvægt ved gelfiltrering, koncentrering og omhyggelig filtrering, således som det er beskrevet i Bodo's rapport, "Symposium on 10 Preparation, Standardization and Clinical Use of Interferon. 11th International Immunobiological Symposium. 8 & 9 June (1977), Zagreb, Yugoslavia". Der fås et højrenset interferonpræparat med en specifik aktivitet på 2 x 106 enheder pr. mg protein, og det samlede udbytte er ca. 40%.
15 Resultaterne af forsøg B viser, at type II-interferon, der fås ved fremgangsmåden ifølge de ovenstående eksempler, kan anvendes alene, i kombination med type I-interferon eller i blanding med ét eller flere andre stoffer som effektivt terapeutisk og/eller profylaktisk middel, der kan anvendes 20 som injektion eller medicin til extern eller intern administration til behandling af type II-interferon-følsomme sygdomme .
FORSØG B
Terapeutiske og profylaktiske virkninger af type II-inter-25 feron på interferon-følsomme sygdomme.
Forsøg B-l. Terapi af virale sygdomme med type Il-interferon (inhiberende effekt på viral formering in vitro).
18 DK 169479 B1
Til monolag af humane embryoniske lungeceller, fremstillet ved primær kultur i Petri-skåle, 6 cm i diameter, sættes 0,1, 1,0 eller 10,0 enheder af type Il-interferon, der er fremstillet som beskrevet i eksempel A-9, og de resulterende 5 blandinger inkuberes i en 5% v/v C02-inkubator ved 37°C i 20 timer. Til cellerne sættes variacellazoster-virus eller human cytomegalo-virus i mængder, som danner 100 plaquer i fravær af type II-interferon. Blandingerne inkuberes, og antallet af resulterende plaquer tælles.
10 Den inhiberende virkning af type II-interferon på virusformeringen bestemmes under anvendelse af følgende ligning.-
A - B
Reduktion af antallet af plaquer (%) = - x 100
A
15 hvor A betegner antallet af plaquer, der dannes i fravær af type Il-interferon, og B betegner antallet af plaquer, der dannes i nærværelse af type II-interferon. Resultaterne fremgår af tabel II.
Tabel II
20 Type II- Varicellazoster Human cytomegalo- inteferon virus virus 0 enheder 0% 0% 0,1 enheder 8% 6% 25 1,0 enheder 49% 54% 10,0 enheder 88% 83%
Som det fremgår af de i tabel II viste resultater, kan type
Il-interferon, der fremstilles i henhold til opfindelsen, 30 effektivt inhibere formeringen af de virussygdomsforårsagende vira. Ved forsøget medfører tilsætningen af type II-inter-feron ingen abnormalitet i de humane celler.
19 DK 169479 B1
Forsøg B-2. Terapi af ikke-virale sygdomme med type Il-interferon.
1) Inhibering af tumorcelleformeringen in vitro.
Type Il-interferon, fremstillet som beskrevet i eksempel A-9, 5 sættes til RPMI-1640 medium, der er suppleret med 15% v/v føtalt kalveserum, således at der fås en slutkoncentration på 5, 50 eller 500 enheder pr. ml. Til blandingerne transplanteres forskellige tumorceller til opnåelse af en koncentration på 5 x 105 celler pr. ml. Blandingerne inkuberes der-10 efter i en 5% v/v C02-inkubator ved 37°C i 5 dage, og antallet af cellerne pr. ml medium tælles. Der udføres kontrolforsøg på lignende måde som de ovenstående forsøg, bortset fra, at der anvendes et type II-interferon, som er for-inak-tiveret ved opvarmning ved 100°C i 30 minutter.
15 Type II-interferoninhiberende virkning på tumorcelleformerin-gen bestemmes ved følgende ligning:
Inhibering af tumorcelleformeringen (%) ( A - 5 x 105 ) - ( B - 5 x 105 ) = -x loo 20 ( A - 5 x 105 ) hvor A betegner antallet af celler i kontrolforsøget, og B betegner antallet af celler i forsøget med type Il-interferon. Resultaterne fremgår af nedenstående tabel III.
DK 169479 Bl 20
Tabel III
Type Il-interferon Human tumorcelle
koncentration BALL-1 TALL-1 NALL-1 JBL
(enheder pr. ml) 5 _ 5 +17% +13% +19% +18% 50 +55% +59% +61% +50% 500 +84% +80% +86% +89% 10 Som det fremgår af de i tabel III viste resultater, inhiberer det type II-interferon, som er fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, effektivt formeringen af tumorcellerne såsom BALL-l-celle, TALL-l-celle, NALL-l-celle og JBL-celle, og er effektivt i et aktivt koncentrationsområde på 5 - 500 15 enheder pr. ml.
2) Inhibering af tumorcelleformeringen in vivo.
Forsøget udføres med 8 nøgne mus, som er ca. 2 måneder gamle.
TALL-l-Celler transplanteres subcutant i alle 8 nøgne mus i en mængde på 7,5 x 106 celler pr. nøgen mus. Fra den anden 20 dag efter transplantationen gives 4 nøgne mus 3 intraperito-neale injektioner på 1000 enheder af type Il-interferon, fremstillet som beskrevet i eksempel A-6, pr. uge, 20 injektioner ialt. 48 dage senere slagtes de nøgne mus, og vådvægten af de fremkomne massive tumorer bestemmes. Der udføres 25 kontrolforsøg med de øvrige 4 nøgne mus på lignende måde som beskrevet i det ovenstående forsøg, bortset fra, at de ikke får type II-interferon. Resultaterne fremgår af nedenstående tabel IV.
Tabel IV
21 DK 169479 B1
Forsøg nr. Kontrol Type II-interferon behandlede nøgne mus 5 1 5,6 g 1,3 g 2 4,5 g 0,8 g 3 9,Og Og 4 6,3 g Og
Gennemsnitlig vægt 6,3 g 0,5 g 10 _ 3) Inhibering af tumorcelleformeringen in vivo.
Forsøget udføres med 8 nøgne mus, som er ca. 2 måneder gamle.
Tumor-JBL-celler transplanteres subcutant i alle 8 nøgne mus i en mængde på 1 x 107 celler pr. nøgen mus. Fra anden uge 15 efter transplantationen gives 4 nøgne mus 2 intraperitoneale injektioner på 1000 enheder af type II-interferon, fremstillet som beskrevet i eksempel A-2, pr. uge, 8 injektioner i alt. 42 dage senere slagtes de nøgne mus, og vådvægten af de fremkomne massive tumorer bestemmes.
20 Der udføres kontrolforsøg med de øvrige 4 nøgne mus på lignende måde som beskrevet ovenfor, bortset fra, at de ikke får type II-interferon. Resultaterne fremgår af nedenstående tabel V.
Tabel V
DK 169479 B1 22
Forsøg nr. Kontrol Type II-interferon behandlede nøgne mus 5 1 4,7 g 0,5 g 2 6,2 g 0,5 g 3 15,3 g 0,5 g 4 16,9 g 0,8 g
Gennemsnitlig vægt 10,8 g 0,6 g 10 _
Som det fremgår af de i tabel IV og V anførte resultater, inhiberer type II-interferon-injektionen tumordannelsen og inhiberer også i ekstremt høj grad tumorudviklingen, selv når der er dannet tumor; vådvægten af de fremkomne massive tumo-15 rer hos de type II-interferon-behandlede nøgne mus er meget mindre end hos kontrolmusene. Desuden viser de type II-inter-feron-behandlede nøgne mus bedre appetit og er mere aktive end kontrolmusene.
FORSØG C
20 Akut toxicitet.
Den akutte toxicitetstest på det type II-interferonpræparat, der er fremstillet ved fremgangsmåden ifølge eksempel A-9, udføres med 20 dage gamle mus, og det påvises, at toxiciteten af det pågældende type II-interferonpræparat er ekstremt lav: 25 LD50-værdien er 20.000.000 enheder eller mere pr. kg ved intraperitoneal injektion.
Som det fremgår af de ovenstående forsøg, kan de type Ilinterferon- følsomme sygdomme, der er omtalt i nærværende beskrivelse, være sådanne sygdomme, som kan behandles og 30 forebygges med interferon fremstillet i henhold til den foreliggende opfindelse, f.eks. virale sygdomme såsom epide- 23 DK 169479 B1 misk keratoconjunctivitis, herpetisk keratitis, influenza, rubella og serumhepatitis samt ikke-virale sygdomme såsom leukæmi og osteosarcoma.
De terapeutiske og profylaktiske midler indeholdende type II-5 interferon, der kan anvendes i forbindelse med de nævnte type II-interferon-følsomme sygdomme, kan fremstilles i forskellige former og faser afhængigt af deres anvendelse, f.eks. flydende præparater til sprays, øjenskyllemidler, næsedråber, gurglemidler og injektionsmidler, pastapræparater såsom salve 10 og pastapræparater i pulver-, granule- og tabletform. Midlerne er tilstrækkelig effektive, når indholdet af type Ilinterferon er 1 - 10.000.000 enheder pr. g, og de kan om ønsket anvendes i kombination eller i blanding med ét eller flere andre stof-15 fer, f.eks. terapeutiske midler, bærestoffer, fyldstoffer og stabiliseringsmidler.
Da interferon ved intravenøs injektion let elimineres fra blodet i løbet af ca. 10 minutter og udskilles fra systemet, gør især instillationsadministration af interferon, f.eks.
20 ved inkorporering af interferon i instillationssukkersupple-mentopløsning, det muligt at forlænge administrationstiden til opnåelse af fuld og effektiv udnyttelse af det installerede interferon og yderligere forbedre interferonets terapeutiske og profylaktiske indvirkning på interferon-følsomme 2 5 sygdomme.
Forskellige udførelsesformer for type II-interferonholdige præparater af den her omhandlede art beskrives i det følgende : DK 169479 Bl 24
Eksempel B.
Præparater indeholdende type II-interferon.
Eksempel B-l. Flydende præparat.
Et flydende præparat fremstilles ved at opløse det type II-5 interferonholdige pulver, der fremstilles ved fremgangsmåden i henhold til eksempel A-l, i fysiologisk saltopløsning i en mængde på ca. 500 enheder pr. ml.
Præparatet kan anvendes som spray, øjenskyllemiddel, næsedråber og gurglemiddel ved behandling og forebyggelse af virale 10 sygdomme, især epidemisk keratoconjunctivitis og influenza.
Eksempel B-2. Injektionspræparat.
Et injektionspræparat fremstilles ved at blande det type Ilinterferon, der er fremstillet som beskrevet i eksempel Ά-9, i fysiologisk saltopløsning i en mængde på ca. 100.000 enhe-15 der pr. ml.
Injektionspræparatet er egnet til behandling og forebyggelse af alle type II-interferon-følsomme sygdomme, herunder virale sygdomme og tumorsygdomme.
Eksempel B-3. Sukkersupplement-injektionsopløsning.
20 En sukkersupplement-injektionsopløsning til intravenøs instillation fremstilles ved at blande 1.000.000 enheder af et interferonpræparat indeholdende type I- og type Il-interferoner, som begge er fremstillet som beskrevet i eksempel A-5, og 100 mg cyclophosphamid i 500 ml af en 10% w/v vandig 25 maltoseopløsning.
25 DK 169479 B1
Sukkersupplement-injektionsopløsningen er egnet som opløsning til kontinuerlig intravenøs infusion til behandling og fore-byggelse af tumorsygdomme.
Eksempel B-4. Injektionsopløsning.
5 En injektionsopløsning fremstilles ved at opløse 500.000 enheder af et interferonpræparat indeholdende type I- og type II-interferoner, der er fremstillet som beskrevet i eksempel A-2, og 2 mg mitomycin C i 100 ml af en 10% w/v vandig malto-seopløsning.
10 Injektionsopløsningen egner sig til behandling og forebyggelse af tumorsygdomme.
Eksempel B-5. Salve.
En salve fremstilles på konventionel måde ved at blande det pulver, der fremstilles som beskrevet i eksempel A-4, flyden-15 de paraffin og vaseline til et præparat med en type II-inter-feronaktivitet på 10.000 enheder pr. g.
Salven egner sig til behandling af virale hudsygdomme.
Eksempel B-6. Tablet.
Tabletter fremstilles på konventionel måde ved at tablettere 20 en blanding af det type II-interferonholdige pulver, der er fremstillet som beskrevet i A-7, stivelse og maltose til opnåelse af en type II-interferonaktivitet på ca. 1.000 enheder pr. tablet (ca. 100 mg).
Tabletterne egner sig til behandling og forebyggelse af 25 virale sygdomme, som forekommer i fordøjelsessystemet.
Claims (9)
1. Fremgangsmåde til fremstilling af humanspecifikt type Il interferon, ved at type II-interferon-producerende etablerede humane celler transplanteres til legemet af et ikke-humant varmblodet dyr eller cellerne podes i et dyrkningsmedium, som er anbragt i et diffusionskammer med indskudt filtermembran, 15 hvilket diffusionskammer er udformet og anbragt i eller tilknyttet dyrelegemet på en sådan måde, at cellerne kan vokse i dyrets nærende legemsvæske i kammeret, og de transplanterede eller podede celler formeres i det varmblodede dyrs legeme eller i diffusionskammeret under anvendelse af legemsvæsken, 20 kendetegnet ved, at de formerede humane celler udsættes for indvirkning af en type II-interferon-inducer over en periode på mere end 24 timer, hvorefter det inducerede humanspecifikke type Il-interferon fraskilles og oprenses.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 25 kendetegnet ved, at de type II-interferon-producerende etablerede humane celler er humane lymphoblastoid-cellelinjer.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at de type II-interferon-produ-30 cerende etablerede humane celler er HPB-ALL-celler, MOLT-3-celler, P 12/Ichikawa-celler, HPB-MLT-celler, P 8/Seki-cel- DK 169479 B1 ler, HCL-celler, P 10/Shibata-celler, Namalva-celler, BALL-1-celler, TALL-l-celler, NALL-l-celler og JBL-celler.
4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, kendetegnet ved, at der anvendes mere end én slags 5 etablerede humane celler.
5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det ikke-humane dyr er et pattedyr.
6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, 10 kendetegnet ved, at pattedyrene er hunde, katte, aber, grise, kvæg, heste, geder, kaniner, marsvin, rotter, hamstere, mus eller nøgne mus.
7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at diffusionskammeret har ind-15 skudte filtermembraner med porestørrelser på ca. 10'7 - 10"5m.
8. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7, kendetegnet ved, at suspensionen af formerede humane celler udsættes for indvirkning af en interferon- 20 inducer ved en interferon-inducerkoncentration på ca. 0,001 μg - 10 mg pr. ml.
9. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-8, kendetegnet ved, at de formerede humane celler udsættes for indvirkning af en interferon-inducer ved en tempe- 25 ratur på ca. 20 - 40°C.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP454479 | 1979-01-18 | ||
| JP454479A JPS5598118A (en) | 1979-01-18 | 1979-01-18 | Preparation of type-2 interferon and drug containing the same |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK11880A DK11880A (da) | 1980-07-19 |
| DK169479B1 true DK169479B1 (da) | 1994-11-07 |
Family
ID=11586983
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK011880A DK169479B1 (da) | 1979-01-18 | 1980-01-10 | Fremgangsmåde til fremstilling af humanspecifikt type II-interferon |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4285929A (da) |
| JP (1) | JPS5598118A (da) |
| AU (1) | AU536477B2 (da) |
| BE (1) | BE881217A (da) |
| CA (1) | CA1135622A (da) |
| CH (1) | CH650801A5 (da) |
| DE (1) | DE3001585C2 (da) |
| DK (1) | DK169479B1 (da) |
| ES (1) | ES487852A0 (da) |
| FI (1) | FI68519C (da) |
| FR (1) | FR2446637A1 (da) |
| GB (1) | GB2040292B (da) |
| IT (1) | IT1143056B (da) |
| NL (1) | NL8000291A (da) |
| NO (1) | NO156051C (da) |
| SE (2) | SE451797B (da) |
Families Citing this family (42)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS55154919A (en) * | 1979-05-24 | 1980-12-02 | Hayashibara Takeshi | Preparation of interferon |
| US4396601A (en) * | 1980-03-26 | 1983-08-02 | The Regents Of The University Of Calif. | Gene transfer in intact mammals |
| US4497796A (en) * | 1980-03-26 | 1985-02-05 | The Regents Of The University Of California | Gene transfer in intact mammals |
| JPS5826317B2 (ja) * | 1980-12-30 | 1983-06-02 | 株式会社 林原生物化学研究所 | ヒト甲状腺刺激ホルモンの製造方法 |
| US4621053A (en) * | 1980-07-30 | 1986-11-04 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Process for the production of human peptide hormones |
| JPS5825439B2 (ja) * | 1980-12-30 | 1983-05-27 | 株式会社林原生物化学研究所 | ヒト副甲状腺ホルモンの製造方法 |
| JPS6045849B2 (ja) * | 1980-08-25 | 1985-10-12 | 林原 健 | ヒトエリトロポエチンの製造方法 |
| JPS5743696A (en) * | 1980-08-27 | 1982-03-11 | Hayashibara Biochem Lab Inc | Preparation of human luteinizing hormone |
| JPS585671B2 (ja) * | 1980-08-27 | 1983-02-01 | 株式会社 林原生物化学研究所 | ヒト卵胞刺激ホルモンの製造方法 |
| JPS5852634B2 (ja) * | 1980-12-05 | 1983-11-24 | 株式会社林原生物化学研究所 | ウロキナ−ゼの製造法 |
| JPS609795B2 (ja) * | 1980-12-11 | 1985-03-13 | 株式会社林原生物化学研究所 | ヒト上皮細胞成長因子の製造方法 |
| JPS6030657B2 (ja) * | 1980-12-31 | 1985-07-17 | 株式会社林原生物化学研究所 | ヒト細胞増殖促進因子の製造方法 |
| JPS6030654B2 (ja) * | 1980-12-31 | 1985-07-17 | 株式会社林原生物化学研究所 | ヒトコロニ−刺激因子の製造方法 |
| FR2513124B1 (fr) * | 1981-07-21 | 1989-11-17 | Hayashibara Biochem Lab | Production et applications du facteur de lyse des cellules-cibles |
| US4507281A (en) * | 1981-10-13 | 1985-03-26 | Exovir, Inc. | Interferon-containing compositions |
| US5096705A (en) * | 1981-10-19 | 1992-03-17 | Genentech, Inc. | Human immune interferon |
| AU561343B2 (en) * | 1981-10-19 | 1987-05-07 | Genentech Inc. | Human immune interferon by recombinant dna |
| US5582824A (en) * | 1981-10-19 | 1996-12-10 | Genentech, Inc. | Recombinant DES-CYS-TYR-CYS human immune interferon |
| JPS58110548A (ja) * | 1981-12-24 | 1983-07-01 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 新規な生理活性ペプチド |
| JPS58126786A (ja) * | 1982-01-25 | 1983-07-28 | Hayashibara Biochem Lab Inc | ヒトカリクレインの製造方法 |
| US4624917A (en) * | 1982-02-17 | 1986-11-25 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Process for the production of human T-cell growth factor |
| FR2523155B1 (fr) * | 1982-03-11 | 1987-10-16 | Hayashibara Biochem Lab | Preparation de facteur de croissance des cellules t humaines |
| US6936694B1 (en) | 1982-05-06 | 2005-08-30 | Intermune, Inc. | Manufacture and expression of large structural genes |
| DE3381553D1 (de) * | 1982-10-25 | 1990-06-21 | Genentech Inc | Synergistische humaninterferonaktivitaet. |
| US4683199A (en) * | 1983-01-31 | 1987-07-28 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Interleukin-2 dependent cytotoxic T-cell clones |
| US4599306A (en) * | 1983-04-15 | 1986-07-08 | Amgen | Monoclonal antibodies which specifically bind to human immune interferon |
| US4723000A (en) * | 1983-07-05 | 1988-02-02 | Biospectrum, Inc. | Human interferon gamma and interleukin-2 |
| MX9203641A (es) * | 1983-12-16 | 1992-07-01 | Genentech Inc | Interferones gamma recombinantes que poseen estabilidad mejorada y metodos biotecnologicos para su obtencion. |
| US4855238A (en) * | 1983-12-16 | 1989-08-08 | Genentech, Inc. | Recombinant gamma interferons having enhanced stability and methods therefor |
| JPS60155137A (ja) * | 1984-01-23 | 1985-08-15 | Takeda Chem Ind Ltd | 高濃度ヒトγ型インタ−フエロン水溶液の製造法 |
| DE3521733A1 (de) * | 1985-06-18 | 1986-12-18 | Bioferon biochemische Substanzen GmbH & Co, 7958 Laupheim | Verwendung von interferon-gamma (ifn-gamma) enthaltenden praeparationen zur systemischen behandlung von tumoren und viruserkrankungen in niedriger dosierung |
| DE3436637A1 (de) * | 1984-10-05 | 1986-04-10 | Bioferon biochemische Substanzen GmbH & Co, 7958 Laupheim | Verwendung von interferon-gamma (ifn-gamma) enthaltenden praeparationen zur behandlung von schmerzen |
| DE3436638C2 (de) * | 1984-10-05 | 1992-10-08 | Bioferon biochemische Substanzen GmbH & Co, 7958 Laupheim | Verwendung von Interferon-gamma (IFN-gamma) enthaltenden Präparationen zur Behandlung rheumatischer Erkrankungen |
| IL76591A0 (en) * | 1984-10-05 | 1986-02-28 | Bioferon Biochem Substanz | Pharmaceutical compositions containing ifn-ypsilon and processes for the preparation thereof |
| US5019385A (en) * | 1984-11-09 | 1991-05-28 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Novel lymphopine LK 2 and pharmaceutic compositions containing same |
| JPS61137828A (ja) * | 1984-12-07 | 1986-06-25 | Shionogi & Co Ltd | γ−インタ−フエロン製剤組成物 |
| CA1340698C (en) * | 1986-07-25 | 1999-08-10 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kaguku Kenkyujo | Preparation and uses of interferon-gamma |
| DE3731255A1 (de) * | 1987-09-17 | 1989-04-06 | Boehringer Ingelheim Int | Stabilisierung von therapeutisch wirksamen proteinen in pharmazeutischen zubereitungen |
| US5849282A (en) * | 1990-05-09 | 1998-12-15 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Method of treating colon, renal, and lung carcinomas with γ-interferon and Ser71 !-interleukin-1β |
| WO1992017209A1 (en) * | 1991-04-08 | 1992-10-15 | Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited | Porous solid preparation containing physiologically active protein substance |
| US6514728B1 (en) * | 1998-11-09 | 2003-02-04 | Nippon Biocaptal Limited | Process for preparation of cytokines using Sendai virus expression system |
| BR112014026360A2 (pt) | 2012-04-23 | 2017-06-27 | Gen Electric | aerofólio de turbina e pá de turbina |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BR6914761D0 (pt) * | 1969-01-17 | 1973-03-08 | Merck & Co Inc | Processos quimicos |
| JPS5134442B2 (da) * | 1972-05-04 | 1976-09-27 | ||
| GB2016015B (en) * | 1978-01-22 | 1982-05-06 | Hayashibara Co | Method of preparing interferon and preparations containing interferon |
| JPS5654158A (en) * | 1979-10-09 | 1981-05-14 | Hitachi Ltd | Control system for call waiting |
-
1979
- 1979-01-18 JP JP454479A patent/JPS5598118A/ja active Granted
-
1980
- 1980-01-07 US US06/109,861 patent/US4285929A/en not_active Expired - Lifetime
- 1980-01-10 DK DK011880A patent/DK169479B1/da active
- 1980-01-11 SE SE8000243A patent/SE451797B/sv unknown
- 1980-01-11 AU AU54561/80A patent/AU536477B2/en not_active Ceased
- 1980-01-16 CH CH341/80A patent/CH650801A5/fr not_active IP Right Cessation
- 1980-01-17 NL NL8000291A patent/NL8000291A/nl not_active Application Discontinuation
- 1980-01-17 DE DE3001585A patent/DE3001585C2/de not_active Expired
- 1980-01-17 BE BE0/199020A patent/BE881217A/fr not_active IP Right Cessation
- 1980-01-17 FI FI800147A patent/FI68519C/fi not_active IP Right Cessation
- 1980-01-17 NO NO800105A patent/NO156051C/no unknown
- 1980-01-17 IT IT47632/80A patent/IT1143056B/it active
- 1980-01-17 CA CA000343891A patent/CA1135622A/en not_active Expired
- 1980-01-17 GB GB8001662A patent/GB2040292B/en not_active Expired
- 1980-01-18 ES ES487852A patent/ES487852A0/es active Granted
- 1980-01-18 FR FR8001063A patent/FR2446637A1/fr active Granted
-
1987
- 1987-05-06 SE SE8701856A patent/SE456741B/sv unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2446637B1 (da) | 1983-07-18 |
| ES8103162A1 (es) | 1981-02-16 |
| SE456741B (sv) | 1988-10-31 |
| ES487852A0 (es) | 1981-02-16 |
| IT8047632A0 (it) | 1980-01-17 |
| IT1143056B (it) | 1986-10-22 |
| DE3001585A1 (de) | 1980-07-31 |
| US4285929A (en) | 1981-08-25 |
| CA1135622A (en) | 1982-11-16 |
| SE8701856D0 (sv) | 1987-05-06 |
| FR2446637A1 (fr) | 1980-08-14 |
| AU5456180A (en) | 1980-07-24 |
| FI800147A (fi) | 1980-07-19 |
| JPS631296B2 (da) | 1988-01-12 |
| SE8000243L (sv) | 1980-07-19 |
| AU536477B2 (en) | 1984-05-10 |
| CH650801A5 (fr) | 1985-08-15 |
| NO156051B (no) | 1987-04-06 |
| SE451797B (sv) | 1987-11-02 |
| FI68519B (fi) | 1985-06-28 |
| GB2040292A (en) | 1980-08-28 |
| NO800105L (no) | 1980-07-21 |
| FI68519C (fi) | 1985-10-10 |
| GB2040292B (en) | 1983-04-13 |
| BE881217A (fr) | 1980-07-17 |
| NO156051C (no) | 1987-07-15 |
| JPS5598118A (en) | 1980-07-25 |
| DE3001585C2 (de) | 1985-05-15 |
| SE8701856L (sv) | 1987-05-06 |
| NL8000291A (nl) | 1980-07-22 |
| DK11880A (da) | 1980-07-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK169479B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af humanspecifikt type II-interferon | |
| NL192086C (nl) | Werkwijze ter bereiding van interferonen en werkwijze ter bereiding van een geneesmiddel dat interferonen bevat. | |
| KR930000188B1 (ko) | 신규 림포카인(lymphokine), 이 림포카인에 특이적인 모노클로날 항체 및 이들의 제조방법 | |
| JPS6227048B2 (da) | ||
| Mazuski et al. | Direct effects of endotoxin on hepatocytes: Synthesis of a specific secretory protein | |
| KR930004596B1 (ko) | 신규 림포킨(lymphokine) 및 이에 대해 특이성을 갖는 모노클로날(monoclonal) 항체의 제조 방법 | |
| NO173144B (no) | Fremgangsmaate til fremstilling av interferongamma | |
| KR820001174B1 (ko) | 사람 특이성 인터페론의 제조법 | |
| JPH0764744B2 (ja) | 標的細胞障害性因子とヒトインタ−フェロンとを有効成分として含有する悪性腫瘍治療剤 | |
| JPS6245208B2 (da) | ||
| KR950008569B1 (ko) | 신규 림포카인(lymphokine) 및 그 제조방법과 사용방법 | |
| KR970002165B1 (ko) | γ-인터페론의 제조방법과 그 용도 | |
| JPS61263929A (ja) | 抗タイプ２インターフェロン感受性疾患剤 | |
| KR830001817B1 (ko) | 타이프ⅱ 인터페론의 제조방법 | |
| JP2850293B2 (ja) | γ−インターフェロン感受性疾患剤 | |
| JP2532025B2 (ja) | 新リンホカインｉｉｉを有効成分とする抗腫瘍作用を有するリンホカインの活性増強剤 | |
| JPS5815921A (ja) | 抗リンホトキシン感受性疾患剤 | |
| JPS61115026A (ja) | 新リンホカイン２の製造方法 | |
| JPH0811759B2 (ja) | 新リンホカイン▲ｉｉ▼とその製法および用途 | |
| JPS5889195A (ja) | 標的細胞障害性因子の製造方法 | |
| JPS60126228A (ja) | 新リンホカイン１とその製造方法および用途 | |
| JPH0526468B2 (da) | ||
| JPS61115099A (ja) | モノクロ−ナル抗体とその製法 | |
| JPS62223196A (ja) | 精製されたヒト ツモア・ネクロシス・フアクタ− | |
| JPH0574575B2 (da) |