SE451797B - Sett att framstella typ ii interferon - Google Patents

Description

15 20 25 30 35 451 797 2 peutiskt och profylaktiskt medel för humana sjukdomar.

Föreliggande uppfinnare har undersökt förfaranden, som lätt skulle kunna användas för kommersiell produktion av human-specifikt typ II-interferon, och har studerat möjligheterna för detta interferon som terapeutiskt och profylak- tiskt medel. Dessa undersökningar har resulterat i upptäckten, att man inte kan uppnå någon stor mängd typ Il-interferon med hög titer genom att överföra och föröka etablerade typ II-interferonproducerande humana celler i ett odlingsme- dium in vitro, men att man däremot lätt kan uppnå detta genom att transplantera cellerna till ett annat icke-humant varmblodigt djur, utfodra djuret för att tillåta humancellerna att utnyttja djurets näringskroppsvätska för sin förökning, därpå utsätta de förökade humana cellerna för inverkan av en effektiv mängd av en typ II~interferon-inducerare in vivo eller in vitro, efter uttagning av de förökade humana cellerna från djuret, under lämpliga betingelser för att ackumulera en betydande mängd human-specifikt typ II-interferon, och utvinna det ackumulera- de human-specifika typ lI-interferonet på i och för sig känt sätt. Det vid detta förfarande utvunna typ Il-interferonet har visat sig vara ett utmärkt terapeutiskt och profylaktiskt medel för typ lI-interferon-känsliga sjukdomar.

Jämfört med konventionella förfaranden, där de livskraftiga humana cellerna förökas in vitro har sättet enligt uppfinningen fördelen, att det inte kräver något eller kräver mycket mindre näringsmedium kompletterat med dyrbart serum, att upprätthållandet och regleringen av betingelserna under förökningen av de etablerade humana cellerna är lättare, och att man lätt kan erhålla typ II-interferon med hög titer. Vid sättet enligt uppfinningen kan etablerade humana celler således lätt förökas i andra icke-humana varmblodiga djur med användning av kroppsvätskan genom att transplantera cellerna däri, medan djuret utfodras på sedvanligt sätt. Vidare har sättet enligt uppfinningen, de ytterligare fördelarna, att förökningen av de humana cellerna är mer stabil, att förökningshastigheten är högre, och att utbytet avinducerat typ II-interferon per cell är mycket högre. g Man kan använda vilka etablerade humana celler som helst, så länge som de lätt förökas, när de transplanteras till andra icke-humana varmblodiga djurkroppar. Exempel på sådana cellinjer är HPB-ALL, MOLT-B, P 12/Ichikawa, HPB-MLT, P 8/Seki, JBL, HCL och P lii/Shibata, beskrivna i "Protein, Nucleic Acid and Enzyme", vol. 23, nr. 6, sid 697-711 (1978), Namalva-celler, beskrivnai "Journal of Clinical Microbiology", vol. 1, sid. 116-117 (1975), och BALL-I-celler, TALL-l-celler och NALL-l-celier, beskrivna av I. Miyoshi, "Nature", vol. 267, sid. 843-84!! (1977).

Speciellt föredras de humana lymfoblastoidcellinjerna. Etablerade huma- na celler, som kan användas vid sättet enligt uppfinningen, kan utväljas bland de l0 15 20 25 30 35 451 797 3 ovannämnda cellerna men är inte begränsade till dessa. I steg, som ligger före induceringen av interferon av typ II, kan de ovannämnda cellerna användas var för sig eller i kombination. När de etablerade humana celler, som används vid framställningen av typ II-interferon, är leukocyter, särskilt lymfocyter, kan användningen av en cellblandning, som innehåller B-lymfocyter (B-celler) och T- lymfocyter (T-celler) förutom de nämnda etablerade humana cellerna, ytterligare öka aktiviteten av det inducerade typ lI-interferonet. Till de etablerade humana cellerna kan om så önskas blandas humana leukocyter framställda ur färskt humant blod.

Vid sättet enligt uppfinningen kan man använda vilket som helst icke- humant varmblodigt djur, så länge som etablerade humana celler kan förökas däri. Exempel på sådana djur är fåglar såsom kycklingar och duvor, och däggdjur såsom hundar, kattor, apor, getter, grisar, nötkreatur, hästar, kaniner, marsvin, råttor, hamstrar, möss och nakna möss. Eftersom transplantationen av humana celler i de ovannämnda djurkropparna har en tendens att medföra oönskade immunreaktioner, bör djuren väljas i det mest omogna stadiet, nämligen ägg, foster, embryo eller nyfödda eller ganska unga djur, så att immunreaktionerna undertrycks i största möjliga utsträckning. Före transplantationen av cellerna kan djuret bestrålas med ca 200-600 rem röntgenstrålar eller gammastrâlar, eller man kan injicera antiserum eller ett immunsuppressivt medel för att undertrycka immunreaktionerna. Nakna möss, även vuxna nakna möss, är föredragna som varmblodiga djur, eftersom de är mindre benägna att förorsaka oönskade immunreaktioner, och eftersom etablerade humana celler kan transplanteras till dessa och snabbt förökas utan någon förbehandling. Transplantationen av förökade humana celler från en varmblodig djurkropp till en annan varmblodig djurkropp kan göra .förökningen av cellerna mycket mer stabil och mängden av typ Il-interferon, som induceras i cellerna, mycket större; t.ex. transplanteras etablerade humana celler i hamstrar och förökas däri, varefter de förökade humana cellerna uppsamlas och därefter transplanteras till nakna möss. I detta fall kan de förökade cellerna transplanteras ytterligare från ett varmblodigt djur till ett annat varmblodigt djur av samma art, av samma släkte, av samma klass eller av samma division. Etablerade humana celler kan också transplanteras till vilken del som helst av djurkroppen, så länge som de lätt förökas däri; t.ex. kan de transplanteras intraperitonealt, intravenöst, subkutant eller i allantoishålig- heten.

Sättet enligt uppfinningen medför den bekvämligheten, att det djur till vilket de etablerade humana cellerna transplanteras, kan utfodras på sedvanligt sätt, och att det inte krävs någon särskild behandling, inte ens efter transplantationen av cellerna. Den period, som är nödvändig för tillräcklig lO 15 20 25 30 35 A451 797 lf förökning av de transplanterade etablerade humana cellerna, är vanligtvis ca l- l0 veckor.

Antalet förökade humana celler är ca 107-1012 eller mer per djur.

Sättet enligt uppfinningen är med andra ord synnerligen fördelaktigt för framställning av typ Il-interferon, eftersom antalet celler, som transplanteras eller ympas i eller till djurkroppen, ökar ca 102-107 gånger eller mer genom förfarandet; detta är ca 10-106 gånger eller mer i förhållande till vad som uppnås vid ympning och förökning av samma celler i ett näringsodlingsmedium in vitro.

Vid induceringen av typ II-interferon kan man använda vilken metod som helst,,som inducerar typ ll-interferon i de förökade levande humana cellerna.

Cellerna kan utsättas för inverkan av en typ II-interferon-inducerare, där de förökas. Exempelvis kan de humana celler, som förökas i ascites i suspension, eller de tumörceller, som uppkommer subkutant, utsättas för inverkan av en typ lbinterferon-inducerare in vivo, där de förökas, och det inducerade typ Il- interferonet därefter renas och separeras från ascites-vätskan eller tumören. I motsats härtill kan de förökade humana cellerna efter isolering utsättas för inverkan av en typ Il-interferon-inducerare in vitro för inducering av typ II- interferon. Exempelvis kan de förökade humana cellerna som insamlas frân ascites, eller sådana som isoleras och dissocieras från de massiva tumörer, som uppkommer subkutant, suspenderas i ett näringsmedium, som hålls vid ca 20- 40°C, för att uppnå en cellkoncentration på ca 105-108 celler per ml, och därefter utsättas för en typ II-interferon-inducerare, varefter det inducerade typ II-interferonet renas och separeras.

Vid framställningen av typ II-interferon kan mängden av inducerat typ Il- interferon ökas ytterligare genom kända metoder såsom genom "priming", där man använder humant interferon med hög artspecificitet, och/eller super- induktionsmetoden, där man använder en metabolisk inhibitor. Vidare kan utbytet av det inducerade typ lI-interferonet per djur ökas ytterligare genom en eller flera av följande metoder: 1) En metod, där de förökade cellerna först utsätts för en typ av typ ll- interferon-inducerare för inducering av interferonet pâ det ställe där det bildas, och därpå, efter insamling från en viss del av djurkroppen eller från hela djurkroppen, utsätts för en typ II-interferon-inducerare. för inducering av interferonet in vitro; I 2) en metod, där de humana celler som redan använts flera gånger för framställning av typ ll-interferon, utsätts för inverkan av en typ lI-interferon- inducerare in vivo eller in vitro för inducering av interferon.

Som typ II-interferon-inducerare föredras vanligtvis mitogener, såsom fytohemagglutinin, konkanavalin A, kermesbärsmitogen, lipopolysackarider, 10 15 20 25 30 35 451 797 5 polysackarider, endotoxiner och bakterier. För sensibiliserade celler verkar antigen också som typ il-interferon-inducerara De ovannämnda typ lI-interferon- inducerarna används vanligtvis i en koncentration på ca 0,001 pg - 10 mg per ml.

Dessutom uppnår man vid användning av en eller flera typ I-interferon- inducerare, t.ex. virus, nukleinsyror och polynukleotider, i kombination med en typ iI-interferon-inducerare en ytterligare ökning av utbytet av det inducerade typ II-interferonet, och det är även på detta sätt möjligt att samtidigt inducera typ I-interferon och typ II-interferon.

Det inducerade typ Il-interferonet kan lätt renas och separeras genom konventionella renings- och separationsmetoder, t.ex. utsaltning, dialys, filtre- ring, centrifugering, koncentrering och frystorkning. Om man önskar ett i högre grad renat typ II-interferonpreparat, kan typ II-interferon med högsta renhet erhållas genom användning av konventionella metoder, t.ex. adsorption och desorption med hjälp av jonbytare, gelfiltrering, affinitetskromatografi, frak- tionering med hjälp av isoelektrisk punkt och elektrofores, i kombination med de ovannämnda metoderna.

Verkningarna av ytterst humanspecifika typ I- och typ II-interferoner bestäms genom den konventionella plaquereduktionsmetoden med humana am- nionceller såsom beskrivs i "Protein, Nucleic Acid and Enzyme", band 20, nr. 6, sid. 616-643 (1975), utgiven av Kyoritsu Shuppan Co., Ltd., Tokyo, Japan.

Hemagglutinationsenheten bestäms med metoden enligt SLE.. Salk, "Jour- nal of Immunology", band 49, sid. 87-98 (1944). a Nedanstående försök A beskriver framställning av typ iI-interferon genom sättet enligt uppfinningen.

FÖRSÖK A Interferon-produktivitet hos cellerna, när de förökas in vitro eller in vivo.

U Försök A-l. Förökning in vitro.

BALL-l-celler ympas i RPMI-i6li0 medium, som är kompletterat med 20% fetalt kalvserum vid pH-värdet 7,2, och odlas i suspension vid 37°C. De förökade cellerna tvättas med serumíritt RPMl-iéllfl medium vid pH-värdet 7,2 och suspenderas i ett färskt medium av samma sammansättning, så att man uppnår en ceilkoncentration på ca 1 x 106 celler per ml.

Försök A-2. Förökning in vivo.

Nyfödda hamstrar förínjiceras med antiserum framställt i kaniner på 10 15 20 25 451 797 6 känt sätt för undertryckning av deras immunreaktioner och transplanteras därefter med subkutana BALL-l-celler. Hamstrarna utfodras på sedvanligt sätt i 3 veckor. De massiva tumörer, som bildas subkutant, isoleras, skärs i små stycken och dissocieras i en fysiologisk saltlösning innehållande trypsin för utvinning av de förökade cellerna. De på så sätt utvunna cellerna tvättas med serumíritt RPMI-1640 medium vid pH-värdet 7,2 och suspenderas i ett färskt medium av samma sammansättning, så att man erhåller en cellkoncentration på ca 1 x 106 celler per ml.

Försök A-B. Framställning av interferon.

De suspensioner av BALL-l-celler, som framställts i försök A-l och A- 2, en cellkoncentration på ca 1 x 106 celler per ml, utsätts för fytohemagglutinin och/eller Sendai-virus för induktion av interferon. När fytohemagglutinin används ensamt, tillsätter man fytohemagglutinin i en mängd på ca 100 gper ml till suspensionerna, och man inkuberar vid 37°C i 3 dagar för induktion av interferon.

När Sendai-virus används ensamt, sätts Sendai-virus till suspensionerna i en mängd på ca 300 hemagglutinationsenheter per ml och man inkuberar vid 37°C i en dag för induktion av interferon. När fytohemagglutinin och Sendai-virus används tillsammans, sätter man till suspensionerna först fytohemagglutinin i en mängd på ca 100 ug per ml, och man inkuberar vid 37°C i två dagar, varefter man tillsätter Sendai-virus i en mängd på ca 300 hemagglutinationsenheter per ml, och inkuberar vid 37°C i ytterligare en dag för induktion av interferon.

De på så sätt utvunna interferonhaltiga suspensionerna centrifugeras.

De erhållna supernatanterna koncentreras med ett ultrafilter med en molekyl- viktsavskärning på 6000 och fraktioneras därpå efter molekylvikten med dextrangel. Aktiviteterna hos det utvunna typ I-interferonet, molekylvikt ca 25.000, och det utvunna typ Il-interferonet, molekylvikt ca 50.000, bestäms för bedömning av interferonaktiviteten per ml suspension efter inkubation. Resulta- ten framgår av Tabell I.

Tabell I Interferon-inducerare Förökning in vitro in vivo Fytohemagglutinin 20 ' 400 (20) . (400) Sendai-virus 1.700 6.700 (0) (0) Fytohemagglutinin + Sendai-virus 1.740 24.000 (so) 01.000) in» IO 15 20 25 30 35 451 797 _? De sammanlagda totala interferonaktiviteter som bestämts efter inkubering uttrycks som enheter per ml suspension, och aktiviteterna av typ II- interferon för varje preparat visas inom parentes.

Det framgår av de i Tabell I visade resultaten, att medan det induceras en ringa mängd interferon i de celler som förökas in vitro, så induceras det en stor mängd interferon i de celler, som förökas in vivo. De celler som förökas både in vitro och in vivo ger typ I-interferon när de utsätts för Sendai-virus. De celler, som förökas in vivo, ger emellertid 4 gånger högre aktivitet än de celler, som förökas in vitro. Med hänsyn till interferonaktiviteterna hos de preparat, som inducerats med fytohemagglutinin och/eller Sendai-virus, observeras en anmärkningsvärd synergism med avseende på interferon-inducerarna vid fram- ställningen av typ I- och typ II-interferon, när man använder celler förökade in vivo. Speciellt har det typ II-interferon, som induceras vid användning av fytohemagglutinin och Sendai-virus i kombination, en ca 28 gånger högre aktivitet än det, som induceras vid användning av fytohemagglutinin enbart. Man observerar emellertid ingen synergism, när man använder de in vitro förökade cellerna.

Olika utföringsformer, som belyser framställningen av typ lI-interferon genom sättet enligt uppfinningen, framgår av det följande: Exempgl A.

Framställning av typ II-interferon.

Exempel A-I.

Till vuxna nakna möss transplanteras subkutant etablerade humana BALL- l-celler, och mössen utfodras pä sedvanligt sätt i 3 veckor. De massiva tumörer som uppkommer subkutant, ca 10 g per naken mimisoleras, skärs i små stycken och dissocieras i en fysiologisk saltlösning, som innehåller trypsin, för separation av de förökade humana cellerna. Cellerna tvättas med "Eagle's minimal essential medium" kompletterat med 5% (v/v) humant serum vid pH-värdet 7,2 och suspenderas i ett färskt medium med samma sammansättning, så att man uppnår en cellkoncentration påcaßxlOéceller per ml vid 37°C. Till denna suspension sätts ett partiellt renat humant interferon med hög artspecificitet i en mängd av ca 100 enheter per ml, och blandningen inkuberas i ca 2 timmar. Därpå sätts fytohemagglutinin till blandningen i en mängd på ca 200 pg per ml. Därefter inkuberas blandningen vid denna temperatur i ytterligare 3 dagar för induktion av typ II-interferon. Den inkuberade blandningen centrifugeras vid ca 1000 g och 4°C för eliminering av fällning såsom cellrester, och den erhållna supernatanten dialyseras mot en fysiologisk saltlösning, som är buffrad vid pH-värdet 7,2 med 0,0lM fosfatbuffert, i 24 timmar. Därefter filtreras det erhållna materialet 451 797 l0 l5 20 25 30 35 8 försiktigt med ett filtermembran, och det typ Il-interferonhaltiga filtratet koncentreras och frystorkas till ett pulver.

Pulvrets typ II-interferon-aktivitet är ca 1.500.000 enheter per naken mm.

Exempel A-2.

Till vuxna nakna möss transplanteras intraperitonealt etablerade humana BALL-l- och TALL-l-celler, och mössen utfodras på sedvanligt sätt i 5 veckor. i denakna mössen injiceras därefter intraperitonealt l mg fytohemagglutinin, och 24 timmar senare injiceras ca 3000 hemagglutinationsenheter Newcastle disease- virus, vars aktivitet är nästan förinaktiverad genom ultraviolett bestrâlning. De naknamössen avlivas, och deras ascites insamlas 24 timmar efter injektionen.

Ascites centrifugeras vid ca 1000 g och 4°C för eliminering av fällning såsom cellrester. Den erhållna supernatanten dialyseras mot en fysiologisk saltlösning, som är buffrad till pH-värdet 7,2 med en 0,0lM fosfatbuffert, i 15 timmar. Det erhållna materialet filtreras därefter och koncentreras försiktigt med filtermem- bran, så att man får ett koncentrat innehållande interferon.

Koncentratets sammanlagda interferonaktivitet är ca 800.000 enheter per l0 nakna möss, varav ca 300.000 enheter är typ lI-interferonaktivitet.

Exemæl A-B.

Nyfödda hamstrar förinjiceras med antiserum framställt ur kaniner enligt kända metoder för undertryckning av deras immunreaktioner, varefter de subkutant injiceras med etablerade humana JBL-celler. Hamstrarna utfodras på sedvanligt sätt i I: veckor. De massiva tumörer, som uppkommer subkutant, ca 30 g per hamster, isoleras och behandlas pâ liknande sätt som beskrivs i exempel A-l. De förökade cellerna tvättas med RPMl-IGÅLO-medium, som är kompletterat med 10% (v/v) fetalt kalvserum vid pH-värdet 7,4, och suspenderas i ett färskt medium med samma sammansättning, så att man uppnår en cellkoncentration på ca 2x 107 celler per ml vid 37°C. Till blandningen sätts ett partiellt renat humant typ Il-interferon med hög artspecificitet í en mängd av ca 200 enheter per ml, och man inkuberar vid 37°C i ca l timme. Till den inkuberade blandningen sätts därefter konkanavalin A i en mängd av ca 500 ng per ml, och man inkuberar i 3 dagar, varefter man tillsätter Sendai-virus i en mängd av ca 300 hemagglutinationsenheter per ml, och man inkuberar i l6 timmar för induktion av interferon. Blandningen renas och koncentreras försiktigt med filtermembran på liknande sätt som beskrivs i exempel A-2, varigenom man får en interferonhaltig lösning.

Lösningens sammanlagda interferonaktivitet är ca l7.000.000 enheter per hamster, varav ca 6.000.000 är typ II-interferonaktivitet. *w .pe 10 15 20 25 30 35 451 797 Exemæl A-4.

Till nyfödda råttor transplanteras intravenöst etablerade humana Namalva-celler, varefter råttorna utfodras på sedvanligt sätt i 4 veckor. De massiva tumörer som uppkommer subkutant, ca 50 g per råtta, isoleras, skärs i små stycken och dissocieras på liknande sätt som beskrivs i exempel A-l. De förökade humana cellerna behandlas på liknande sätt som beskrivs i exempel A-l, bortsett från att man istället för fytohemagglutinin för induktion av typ II- interferon tillsätter Maruyama-vaccin i en mängd av ca lug per ml. Det inducerade typ II-interferonet renas, och den erhållna lösningen innehållande typ II-interferon frystorkas till ett pulver på liknande sätt som beskrivs i exempel A- 1.

Pulvrets typ II-interferonaktivitet är ca 8.000.000 enheter per råtta.

Exemæl A-5.

Först bestrålas vuxna möss med ca 400 rem röntgenstrålning för undertryckning av deras immunreaktioner, OCT! därefter ffflfl-Slïlênfefaf man subkutant i mössen etablerade humana TALL-l-celler, varefter mössen utfodras på sedvanligt sätt i 3 veckor. Efter isolering och finfördelning av de massiva tumörer som uppkommer subkutant, ca l0 g per mus, dissocieras tumörcellerna påliknande sätt som beskrivs i exempel A-l. Cellerna behandlas på liknande sätt som beskrivs i exempel A-3 för induktíon av interferon. Det inducerade interferonet renas och koncentreras på liknande sätt som beskrivs i Exempel A-Z, varigenom man får ett koncentrat som innehåller interferon.

Koncentratets sammanlagda interferonaktivitet är ca 9.000.000 enheter per mus, varav ca 3.000.000 enheter är typ li-interferonaktivitet.

Exemæl A-6. _ I hamstrar transplanteras först subkutant etablerade humana MOLT-B- celler på liknande sätt som beskrivs i exempel A-3, varefter hamstrarna utfodras på sedvanligt sätt i 3 veckor för förökning av cellerna. I l0 dagar gamla nakna möss transplanteras därefter intraperitonealt de förökade cellerna, och mössen utfodras på sedvanligt sätt i ytterligare 5 veckor. De nakna mössen anestetiseras för insamling av deras ascites. De erhållna ascites centrifugeras för utvinning av de förökade cellerna. Cellerna tvättas och behandlas på liknande sätt som beskrivs i A-l för induktion av typ II-interferon. Det 'inducerade typ Il- interferonet renas därefter och koncentreras på liknande sätt som beskrivs i exempel A-2 till ett koncentrat innehållande typ Il-interferon.

Koncentratets typ lI-interferonaktivitet är ca 500.000 enheter per naken mus. 10 15 20 25 30 35 451 797 '10 Exempel A-7.

'Etablerade humana NALL-l-celler transplanteras till allantoishålig- heten i embryonerade ägg, som är förinkuberade vid 37°C i 5 dagar, och äggen inkuberas vid denna temperatur i ytterligare 7 dagar. Äggen öppnas, och de förökade humana cellerna uppsamlas. Suspensionen av cellerna sätts till en lika stor volym TALL-l-celler, framställda som beskrivs i exempel A-5, och behandlas på liknande sätt som beskrivs i exempel A-l för induktion av typ II- interferon. Det inducerade typ lI-interferonet renas och koncentreras på liknande sätt som beskrivs i exempel Å-2, varigenom man får ett koncentrat innehållande typ Il-interferon.

Koncentratets typ lI-interferonaktivitet är ca 300.000 enheter per 10 embryonerade ägg.

Exempel A-8.

Ett pulver, som är framställt såsom beskrivs i exempel A-l, renas försiktigt ytterligare i ett pH-omrâde på 4-9 på konventionellt sätt såsom genom adsorption och desorption under användning av jonbytare, fraktionering efter molekyivikt genom gelfiltrering, koncentrering och omsorgsfull filtrering, på så sätt som beskrivs i Bodo's rapport, "Symposium on Preparation, Standardization and Clinical Use of Interferon. 11th International Immunobiological Symposium. 8 6: 9 June (1977) Zagreb, Yugoslavia". Man får ett högrenat interferonpreparat med en specifik aktivitet på 2 x 106 enheter per mg protein, och det sammanlagda utbytet är ca 40%.

Resultaten av försök B visar, att typ II-interferon, som fås genom sättet enligt de ovanstående exemplen, kan användas ensamt, i kombination med typ I- interferon eller i blandning med en eller flera andra substanser som effektivt terapeutiskt och/eller profylaktiskt medel som kan användas som injektion eller medicin för extern eller intern administrering för behandling av typ II-interferon- känsliga sjukdomar.

FöRsöK ß Terapeutiska och profylaktiska verkningar av typ Il-interferon på interferon- känsliga sjukdomar.

Försök B-l. Terapi av virala sjukdomar med typ lI-interferon (inhiberande effekt på viral förökning in vitro). ' Till monoskikt av humana embryoniska lungceller, framställda genom primär odling i Petri-skålar, 6 cm i diameter, sätts 0,1, 1,0 eller 10,0 enheter av typ II-interferon, som är framställt som beskrivs i exempel A-9, och de erhållna blandningarna inkuberas i en 5% (v/v) COZ-inkubator vid 37°C i 20 timmar. Till cellerna sätts varicellazoster-virus eller humant cytomegalo-virus i mängder, f) 1» 10- l5 20 25 30 451 797 ll som ger 100 plaquer i frånvaro av typ II-interferon. Blandningarna inkuberas, och antalet resulterande plaquer räknas.

Den inhiberande effekten av typ II-interferon på virusförökningen bestäms med användning av följande ekvation: A-B Reduktion av antalet plaquer (96) = x 100 där A betecknar antalet plaquer som bildas i frånvaro av typ II-ínterferon, och B betecknar antalet plaquer, som bildas i närvaro av typ Il-interferon. Resultaten framgår av tabell II.

' ' Tabell Il Typ [Linfeffefon Varicella zoster-virus Humant cytomegalovirus 0 enheter 096 7 096 0,1 enheter 896 696 1,0 enheter ' 4996 5496 10,0 enheter 88% 8396 Som framgår av de i tabell Il visade resultaten, kan typ II-interferom som framställs enligt uppfinningen, effektivt inhibera förökningen av de virussjukdomsförorsakande virusen. Vid försöket medför tillsats av typ II- interferon ingen abnormitet i de humana cellerna.

Försök B-2. Terapi av icke-virala sjukdomar med typ II-interferon. l) Inhibering av tumörcellförökningen in vitro.

Typ II-interferon, framställt såsom beskrivs i exempel A-S, sätts till RPMI-l 640 medium, som är kompletterat med 1596 (v/v) fetalt kalvserum, så att man får en slutkoncentration på 5, 50 eller 500 enheter per ml. Till blandningarna transplanteras olika tumörceller, så att man uppnår en koncentration på 5 x 105 celler per ml. Blandningarna inkuberas sedan i en 596 (v/v) COz-ínkubator vid 37°C i 5 dagar, och antalet celler per ml medium räknas. Man utför kontrollförsök pâ liknande sätt som i de ovanstående försöken, bortsett från att man använder ett typ II-interferon, som är föl-inaktiverat genom uppvärmning vid 1oo°c 1 ao minuter.

Typ ll-interferoninhiberande effekt på tumörcellförökningen bestäms med följande ekvation: 451 7970 ' 12 Inhibering av tumörcellförökningen (96) (A-sxiojl-(ß-sxif) =--------3----x1oo (A-sxio) där A betecknar antalet celler i kontrollförsöket, och B betecknar antalet celler i 5 försöket med typ II-interferon. Resultaten framgår av nedanstående tabell III.

Tabell III Typ Il-interferpn Humana tumörceller koncentration enheter per m1). BALL-I TALL-l NALL-l JBL m s 1,17% +139s +19% +1s9s 50 +5596 +5996 +6l96 +5096 500 +8496 +8096 +8696 +8996 Som framgår av de i tabell III visade resultaten, inhiberar det typ II- interferon, som är framställt genom sättet enligt uppfinningen, effektivt 15 förökningen av tumörcellerna, såsom BALL-l-celler, TALL-l-celler, NALL-l- celler och JBL-celler, och-är effektivt i ett aktivt koncentrationsområde på 5 - 500 enheter per ml. _ 2) Inhibering av tumörcellförökningen in vivo.

Försöket utförs med 8 nakna möss, som är ca 2 månader gamla. TALL-l- 20 celler transplanteras subkutant i samtliga 8nakna mössi en mängd av 7,5 x 106 celler per naken mus. Från den andra dagen efter transplantationen ges 4 nakna möss 3 intraperitoneala injektioner på 1000 enheter av typ Il-interferon, framställt såsom beskrivs i exempel A-6, per vecka, 20 injektioner totalt. 48 dagar senare avlivas de nakna mÖSSen. och våtvikten av de uppkomna massiva tumörerna 25 bestäms. Man utför kontrollförsök med de övriga ll nakna mössenpâ liknande sätt som beskrivs i det ovanstående försöket, bortsett från att de inte får typ Il- ínterferon. Resultaten framgår av nedanstående tabell IV. 10 15 20 25 451 797 13 Tabell IV Försök nr". Kontroll Typ II-interferonbehandlade ' nakna möss 1 5,6 g 1,3 g 2 155 g 0,8 g 3 920 g g ll 6,3 g 0 g Genomsnittlig vikt 6,3 g 0,5 g 3) Inhibering av tumörcellförökningen in vivo.

Försöket utförs med 8 nakna möss, som är ca 2 månader gamla. Tumör- JBL-celler transplanteras subkutant i samtliga 8 nakna möss i en mängd av l x 107 celler per naken mus. Från den andra veckan efter transplantationen ges 4 nakna möss 2 intraperitoneala injektioner på 1000 enheter av typ II-interferon, framställt såsom beskrivs i exempel A-2, per vecka, 8 injektioner totalt. 42 dagar senare avlivas de nakna mössen, och våtvikten av de uppkomna massiva tumörerna bestäms. i i Man utför kontrollförsök med de övriga 4 nakna mössen på liknande sätt som beskrivs ovan, bortsett från att de inte får typ II-interferon. Resultaten framgår av nedanstående tabell V.

Tabell V Försök nr. Kontroll Typ Il-interferon-behandlade nakna möss l 4,7 g 0,5 g 2 6,2 g 0,5 s 3 15,3 g 0,5 g Genomsnittlig vikt 10,8 g 0:5 8 10 15 20 25 30 35 451 797 - 14 Som framgår av de i tabell IV och V angivna resultaten inhiberar typ Il- interferon-injektionen tumörbildningen och inhiberar även i extremt hög grad tumörutvecklingen, även när det bildats tumör; vâtvikten av de uppkomna massiva tumörerna hos de typ II-interferon-behandlade nakna mössenär mycket mindre hos kontrollmössen. Dessutom visar de typ ll-interferon-behandlade nakna mössen bättre aptit och är mer aktiva än kontrollmössen.

FÖRSÖK C Akut toxicitet.

Akut toxicitetstest på det typ II-interferonpreparat, som framställts genom sättet enligt exempel A-8, utförs med 20 dagar gamla möss och visar, att toxiciteten hos det ifrågavarande typ lI-interferonpreparatet är ytterst låg: LDjo-värdet är 20.000.000 enheter eller mer per kg vid intraperitoneal injektion.

Som framgår av det ovanstående försöket kan de typ Il-interferon- känsliga sjukdomar, som är omnämnda i föreliggande beskrivning, vara sådana sjukdomar, som kan behandlas och förebyggas med interferon framställt enligt föreliggande uppfinning, t.ex. virala sjukdomar såsom epidemisk keratokonjunkti- vit, herpetisk keratit, influensa, rubeola och serumhepatit samt icke-virala sjukdomar såsom leukemi och osteosarkom.

De terapeutiska och profylaktiska medlen innehållande typ ll-interferon, som kan användas i förening med de angivna typ II-interferon-känsliga sjuk- domarna, kan framställas i olika former och faser beroende pâ deras användning, t.ex. flytande preparat för sprayer, ögonsköljmedel, näsdroppar, gurgelmedel och injektionsmedel, fasta preparat såsom salvor och pastapreparat i pulver-, granul- och tablettform. Medlen är tillräckligt effektiva, när innehållet av typ Il- interferon är l - l0.000.000 enheter per g, och de kan om så. önskas användas i kombination eller i-blandning med en eller flera andra substanser, t.ex. terapeutiska medel, bärarsubstanser; fyllmedel och stabiliseringsmedel.

Eftersom interferon vid intravenös injektion lätt elimineras från blodet inom loppet av ca 10 minuter och utsöndras från systemet, gör i synnerhet instillationsadministrering av interferon, t.ex. genom införlivande av interferon i installationssockerkomplementlösning, det möjligt att förlängaadministrations- tiden för att uppnå fullt och effektivt utnyttjande av det instillerade interferonet och ytterligare förbättra interferonets terapeutiska och profylaktiska inverkan på interferon-känsliga sjukdomar.

Olika utföringsformer för typ II-interferonhaltiga preparat av det här behandlade slaget beskrivs i det följande: l0 15 20 25 30 35 451 797' -15 Exempgl B. ~ Preparat innehållande typ Il-interferon.

Exempel B-l. Flytande preparat.

Ett flytande preparat framställs genom upplösning av ett typ ll- interferonhaltigt pulver, som framställts genom sättet enligt exempel A-l, i fysiologisk saltlösning i en mängd på ca 500 enheter per ml.

Preparatet kan användas som spray, ögonsköljmedel, näsdroppar och gurgelmedel vid behandling och förebyggande av virala sjukdomar, särskilt epidemisk keratokonjunktivit och influensa.

ExemElAB-Z. Injektionspreparat. i Ett injektionspreparat framställs genom att man blandar ett typ Il- interferon, framställts såsom beskrivs i exempel A-8, i fysiologisk saltlösning i en mängd på ca 100.000 enheter per ml.

Injektionspreparatet är lämpat för behandling och förebyggande av alla typ II-interferon-känsliga sjukdomar, häribland virala sjukdomar och tumörsjuk- domar. ' Exempel B-3. Sockerkomplement-injektionslösning.

En sockerkomplement-injektionslösning för intravenös instillatíon fram- ställs genom att man blandar 1.000.000 enheter av ett interferonpreparat innehållande typ l- och typ lI-interferoner, som båda framställts såsom beskrivsi exempel A-S, och 100 mg cyklofosfamidi 500 ml av en l096-ig (w/v) vattenhaltig maltoslösning.

Sockerkomplement-injektionslösningen är lämpad som lösning för konti- nuerlig intravenös infusion för behandling och förebyggande av tumörsjukdomar.

Exempel 13-4. injektionslösning.

En injektionslösning framställs genom upplösning av 500.000 enheter av ett interferonpreparat innehållande typ l- och typ ll-interferoner, som fram- ställts såsom beskrivs i exempel A-2, och 2 mg mitomycin C i 100 ml av en 1096- ig (w/v) vattenhaltig maltoslösning.

Injektionslösningen är lämplig för behandling och förebyggande av tumörsjukdomar.

Exempel 5-5. Salva.

En salva framställs på konventionellt sätt genom 'att man blandar ett pulver, som framställts såsom beskrivs i exempel A4, flytande paraffin och vaselin till ett preparat med en typ II-interferonaktivitet på 10.000 enheter per g.

Salvan är lämplig för behandling av virala hudsjukdomar.

Exempel B-G. Flytande beredning.

En flytande beredning för oral administrering framställs genom upplös- 451 797 ' .le . ning av 5 mg metotrexat och ett koncentrat med en typ lI-interferonaktivitet på 200.000 enheter, som framställts genom metoden i exempel A-7, i 10 ml av en l0%-ig (w/v) vattenhaltig maltoslösning.

Beredningen är lämplig för behandling och förebyggande av-tumörsjuk- domar.

»N-

Claims (9)

JO 15 20 25 30 4 5 1 7 9 7 l7 PATENTKRAV

1. l. 'Sätt att framställa human-specifikt typ II-interferon, ' k ä n n e-t e c k n a t av att man transplanterar etablerade humana celler med förmåga att producera human-specifikt typ Il-interferon till ett icke-humant varmblodigt djur, utfodrar djuret för att tillåta humancellerna att utnyttja djurets näringskroppsvätska för sin förökning, utsätter de för-ökade humana cellerna för en effektiv mängd av en typ ll-interferon-inducerare in vivo eller in vitro, efter uttagning av de förökade humana cellerna från djuret, under lämpliga betingelser för att ackumulera en betydande mängd human-specifikt typ ll- ínterferon, och utvinner det ackumulerade human-specifika typ Il-interferonet på i och för sig känt sätt. *

2. Sätt enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a t av att nämnda etablerade humana celler med förmåga att producera human-specifikt typ II-lnterferon är etablerade humana lymfo- blastoidceller.

3. Sätt enligt patentkravet l eller 2, av att nämnda etablerade humana celler med förmåga att producera human-specifikt typ II-interferon är HPB-ALL-celler, MOLT-S-celler, P l2/Ichikawa-celler, HPB-MLT-celler, P 8/Seki-celler, HCL-celler, P l0/Shi- bata-celler, Namalva-celler, BALL-l-celler, TALL-l-celler eller JBL-celler. kännetecknat

4. Sätt enligt något av patentkraven 1-3, k ä n n e t e c k n a t av att det icke-humana varmblodiga djuret utfodras i l- l0 veckor.

5. Sätt enlígtnågot av patentkraven 1-14, k ä n n e t e c k n a t av att de förökade humana cellerna utsätts för en typ ll- interferon-inducerare i en koncentration i området 0,001 pg till l0 mg per ml cellsuspension och vid en temperatur i omrâdet 20-40°C.

6. Sätt enligt något av patentkraven 1-5, k ä n n e t e c k n a t av att nämnda inducerings- och utvinningssteg innefattar att man odlar de förökade humana cellerna på ett in vitro-kulturmedium som innehåller en effektiv mängd av en typ II-interferon-inducerare under lämpliga betingelser för att ackumulera en betydande mängd human-specifikt typ ll- interferon, och utvinner det ackumulerade human-specifikatyp lI-interferonet från kulturen på i och för sig känt sätt. 451 797 18

7. Sätt enligt något av patentkraven 1-6, k ä n n e t e c k n a t av att man använder en eller flera typ I-interíeron- inducerare i kombination med en typ Il-interferon-inducerare i induceringssteget.

8. Sätt enligt något av patentkraven l-7, k ä n n e t e c k n a t av att det icke-humana varmblodiga djuret är ett däggdjur eller ett fjäderfä.

9. Sätt enligt något av patentkraven 1-8, k ä n n e t e c k n a t av att det icke-humana varmblodiga djuret är kyckling, duva, hund, katt, apa, get, gris, ko, häst, kanin, marsvin, råtta, hamster, mus 10 eller naken mus. : - v41