FR2531435A1 - Procede de production de glycoproteines anti-tumeur - Google Patents

Abstract

PROCEDE DE PRODUCTION D'UNE GLYCOPROTEINE ANTI-TUMEUR AYANT UN POIDS MOLECULAIRE PLUS PETIT QUE LE POIDS MOLECULAIRE D'UNE GLYCOPROTEINE ANTI-TUMEUR DE DEPART, QUI CONSISTE A UTILISER COMME PRODUIT DE DEPART UNE GLYCOPROTEINE ANTI-TUMEUR OBTENUE A PARTIR D'UN EXTRAIT OU D'UN SURNAGEANT DE CULTURE DE CELLULES RETICULO-ENDOTHELIALES, LYMPHOBLASTES, CELLULES LEUCEMIQUES OU FIBROBLASTES D'ANIMAUX A SANG CHAUD, EFFECTUER UN TRAITEMENT DE DEGRADATION SUR LADITE GLYCOPROTEINE EN LA FAISANT REAGIR AVEC UN AGENT REDUCTEUR ET ENSUITE RECUPERER UNE GLYCOPROTEINEANTI-TUMEUR AYANT UN POIDS MOLECULAIRE REDUIT A PARTIR DU MELANGE REACTIONNEL.

Description

La présente invention concerne un procédé de production d'une

glycoprotéine anti-tumeur ayant un poids

moléculaire inférieur à celui d'une glycoprotéine anti-tu-

meur de départ, qui consiste à réduire le poids moléculai-

re d'une glycoprotéine anti-tumeur ayant un poids molécu-

laire élevé par traitement par un agent réducteur, et en-

suite à récupérer à partir du mélange réactionnel des gly-

coprotéines anti-tumeur ayant des poids moléculaires ré-

duits.

En dépit du fait que de nombreux agents théra-

peutiques ont été déjà présentés par un certain nombre de chercheurs de par le monde, le taux de guérison des tumeurs par ces agents thérapeutiques pour tumeurs reste encore très faible, et le développement d'agents thérapeutiques

améliorés fait l'objet d'actives recherches.

La présente invention vise un procédé de produc-

tion de glycoprotéines anti-tumeur.

Elle vise également un procédé de production de glycoprotéines antitumeur ayant des poids moléculaires plus petits à partir d'une glycoprotéine anti-tumeur ayant

un poids moléculaire élevé.

La présente invention vise également un procédé

d'obtention de C Bx avec un rendement élevé.

La présente invention vise également un procédé

d'obtention de C Bx 2 avec un rendement élevé.

La présente invention vise également un procédé

d'obtention de CBX 3 avec un rendement élevé.

La présente invention vise un procédé de pro-

duction d'une ou de plusieurs glycoprotéines anti-tumeur

ayant des poids moléculaires inférieurs à celui d'une gly-

coprotéine anti-tumeur de départ qui consiste à faire réa-

gir une glycoprotéine anti-tumeur ayant un poids molécu-

laire élevé avec un agent de réduction et ensuite obtenir

à partir du mélange réactionnel des glycoprotéines anti-

tumeur ayant un poids moléculaire réduit.

on Par le procédé de la présente invention, on peut obtenir avec un rendement élevé une glycoprotéine

anti-tumeur CB de poids moléculaire désiré.

La demanderesse, considérant que des cellules réticuloendothéliales jouant un rôle important dans le mécanisme biophylactique pouvaient produire une substance qui peut guérir des tumeurs, a depuis longtemps étudié le sujet de manière continue et intensive Récemment,

elle a découvert quatre sortes de glycoprotéines anti-

tumeur ayant des poids moléculaires différents à partir d'un extrait ou d'une fraction surnageante de culture de cellules réticulo-endothéliales, lymphoblastes, cellules leucémiques ou fibroblastes d'animaux à sang chaud, et les a désignées sous le nom de "destructeur de carcinome" ("Carcino-Breaker")X(poids moléculaire 12 000 17 000),

X 1 (poids moléculaire 70 000 90 000), X 2 (poids molédu-

laire 40 000 50 000), et X 3 (poids moléculaire 7 000 -

9 000) (voir la demande de brevet français n 83 03274); ces glycoprotéines sont désignées ci-après comme C Bx, C Bxi, CBX 2 et C Bx 3 respectivement et, dans le cas o

elles sont mentionnées inclusivement, comme CB).

Comme CBX C Bx 3 sont présentes en mélange dans

un extrait ou un surnageant de culture de cellules réticu-

lo-endothéliales de lymphoblastes de cellules leucémiques ou de fibroblastes d'animaux à sang chaud, il a été très

difficile d'obtenir efficacement et exclusivement un "des-

tructeur de carcinome" de poids moléculaire désiré, en

particulier ceux de plus faible poids moléculaire, c'est-

à-dire C Bx ou C Bx 3, en grande quantité.

La demanderesse a recherché de manière intensive un procédé efficace d'obtention et de purification de C Bx, C Bx 2 et/ou C Bx 3 et a été amenée à découvrir que par un traitement de dégradation d'une glycoprotéine anti-tumeur

(c'est-à-dire un "destructeur de carcinome" obtenu à par-

tir d'un extrait ou d'un surnageant de culture de cellules réticuloendothéliales, lymphoblastes, cellules leucémiques ou fibroblastes d'animaux à sang chaud avec un agent de

réduction, on peut obtenir à partir dudit mélange réaction-

nel liquide une glycoprotéine anti-tumeur ayant un poids moléculaire de 40 000 50 000, c'est-à-dire C Bx 2, une glycoprotéine anti-tumeur ayant un poids moléculaire de 12 000 17 000, c'est-à-dire CB et/ou une glycoprotéine anti-tumeur ayant un poids moléculaire de 7 000 9 000, c'est-à-dire C Bx 3 facilement et avec un rendement élevé,

-10 ayant ainsi réalisé la présente invention.

Les désignations de C Bx, C Bxl, C Bx 2 et C Bx 3

utilisées dans cette demande sont définies comme glyco-

*protéines anti-tumorales ou "Carcino Breaker" (CB) ("Des-

tructeur de carcinome") discutées dans le paragraphe pré-

cédent et ayant les propriétés suivantes C Bx: ( 1) Poids moléculaire; 12 000 17 000 ( 2) Réactions colorées; Manifeste une coloration indiquant

la présence de protéines dans la réaction de Lowry, mani-

feste une coloration indiquant la présence de liaisons

peptidiques et d'aminoacides dans la réaction avec la nin-

hydrine après hydrolyse par l'acide chlorhydrique, et ma-

nifeste une coloration, indiquant la présence de sucres dans

la réaction phénol-acide sulfurique, dans la réaction an-

throne-acide sulfurique, dans la réaction indole-acide sulfurique et dans la réaction tryptophane-acide sulfurique; ( 3) Aspect et solubilité, poudre blanche soluble dans l'eau, dans une solution aqueuse de chlorure de sodium et de tampon phosphate et peu soluble dans le benzène, l'hexane et le chloroforme; ( 4) Teneur en sucres: 27-33 %, dont la composition est 17-20 % d'hexoses, 5-7 % d'hexosamines et 5-6 % d'acides sialiques; ( 5) Point isoélectrique: 4,3 7,3 ( 6) Adsorbabilité: adsorbable sur agglutinine europeus Ulex (marque déposée) conjuguée avec du Sephadex (marque déposée) dans un tampon phosphate 0,01 M (p H 7,2); ( 7) Stabilité: stable dans une solution aqueuse de p H 2,0, p H 7,0 ou p H 11, 0 à 4 C pendant plus de 24 heures et dans une solution aqueuse de p H 7, 0 à 60 C pendant plus de 3 heures;

( 8) Cytotoxicité: abîme sélectivement les cellules tumo-

rales en n'endommageant pratiquement pas les cellules nor-

males; et ( 9) Différenciation: induit la différenciation de cellules

tumorales, c'est-à-dire fait redevenir normales les cellu-

les tumorales.

CB Xl ( 1) Poids moléculaire: 70 000 90 000; ( 2) Réactions colorées: manifeste une coloration indiquant

la présence de protéines dans la réaction de Lowry, mani-

feste une coloration indiquant la présence de liaisons peptidiques et d'amino-acides dans la réaction avec la ninhydrine après hydrolyse par l'acide chlorhydrique-et manifeste une coloration indiquant la présence de sucres dans la réaction phénol-acide sulfurique, dans la réaction anthrone-acide sulfurique, dans la réaction indole-acide sulfurique et dans la réaction tryptophane-acide sulfurique; ( 3) Aspect et solubilité: poudre blanche soluble dans l'eau, dans une solution aqueuse de chlorure de sodium aqueux et de tampon phosphate et difficilement soluble dans le benzène, l'hexane et le chloroforme; ( 4) Teneur en sucres: 35-45 %, dont la composition est 23-28 % d'hexoses, 8-11 % d'hexosamines et 4-6 % d'acides sialiques; ( 5) Point isoélectriqcrue: 4,3 6,2 ( 6) Adsorbabilité: adsorbable sur agglutinine europeus Ulex conjuguée à du Sephadex dans un tampon phosphate 0,01 M (p H 7,2); ( 7) Stabilité: stable dans une solution aqueuse de p H 2,0, p H 7,0, ou p H 11,0 à 4 C pendant plus de 24 heures et dans une solution aqueuse de p H 7,0 à 60 C pendant plus de 3 heures; et

( 8) Cytotoxicité: ab Lme sélectivement les cellules tumo-

rales en n'endommageant pratiquement pas les cellules nor-

maies. C Bx 2: X 2 ( 1) Poids moléculaire; 40 000 50 000; ( 2) Réactions colorées manifeste une coloration indiquant

la présence de protéines dans la réaction de Lowry, mani-

feste une coloration indiquant la présence de liaisons peptidiques et d'amino-acides dans la réaction avec la ninhydrine après hydrolyse par l'acide chlorhydrique et manifeste une coloration indiquant la présence de sucres dans la réaction phénol-acide sulfurique dans la réaction anthrone-acide sulfurique, dans la réaction indole-acide sulfurique et dans la réaction tryptophane-acide sulfurique; ( 3) Aspect et solubilité t poudre blanche soluble dans l'eau, dans une solution aqueuse de chlorure de sodium et

de tampon phosphate et difficilement soluble dans le ben-

zène, l'hexane et le chloroforme; ( 4) Teneur en sucres; 30 37 %, dont la composition est -23 % d'hexoses, 6-8 % d&hexosamines et 4-6 % d'acides sialiques; ( 5) Point isoélectrique: 4,2 7,3; ( 6) Adsorbabilité: adsorbable sur agglutinine europeus Ulex conjuguée à du Sephadex dans un tampon phosphate 0,01 M (p H 7,2); ( 7) Stabilité: stable dans une solution aqueuse de p H 2,0, p H 7,0 ou p H 11,0 à 4 C pendant plus de 24 heures et dans une solution aqueuse de p H 7,0 à 60 C pendant plus de 3 heures; et

( 8) Cytotoxicité: abîme sélectivement les cellules tumo-

rales en n'endommageant pratiquement pas les cellules nor-

males.

CBX 3 -

( 1) Poids moléculaire: 7 000 9 000; ( 2) Réactions colorées: manifeste une coloration indiquant

la présence de protéines dans la réaction de Lowry, mani-

feste une coloration indiquant la présente de liaisons peptidiques et d'amino-acides dans la réaction avec la ninhydrine après hydrolyse par l'acide chlorhydrique et manifeste une coloration indiquant la présence de sucres dans la réaction phénol-acide sulfurique, dans la réaction anthrone-acide sulfurique, dans la réaction indole-acide sulfurique et dans la réaction tryptophane-acide sulfurique; ( 3) Aspect et solubilité: poudre blanche soluble dans l'eau, dans une solution aqueuse de chlorure de sodium et

de tampon phosphate et difficilement soluble dans le ben-

zène, l'hexane et le chloroforme; ( 4) Teneur en sucres: 8 15 %, dont la composition est 6-10 % d'hexoses, 1-2 % d'hexosamines et 1-3 % d'acides sialiques; ( 5) Adsorbabilité: adsorbable sur carboxyméthylcellulose dans une chromatographie d'échange d'ions utilisant la carboxyméthylcellulose dans un tampon phosphate 0,05 M (p H 6,4); ( 6) Stabilité: stable dans une solution aqueuse de p H 2,0, p H 7,0 ou p H 11,0 à 4 C-pendant plus de 24 heures et dans une solution aqueuse de p H 7,0 à 60 C pendant plus de 3 heures;

( 7) Cytotoxicité: abîme sélectivement les cellules tumo-

rales et n'endommage pratiquement pas les cellules norma-

les; et ( 8) La séquence d'amino-acides de l'extrémité N-terminale

de la partie protéique est Alanine-Alanine-.

La présente invention s'effectue en général comme suit: une glycoprotéine anti-tumeur CB ayant un poids moléculaire plus élevé que le poids moléculaire désiré, qui a été séparée et purifiée à partir d'un extrait cellulaire ou d'un surnageant de culture, est dissoute à une concentration convenable, par exemple de 10 à 10 000

pg/ml, et soumise à un traitement-de dégradation en réa-

gissant avec une quantité appropriée d'un agent de réduc-

tion Le mélange réactionnel est dialysé, le dialysat est

dessalé, et les précipités formés sont éliminés par filtra-

tion Ensuite, ces précipités sont dissous dans une petite quantité de sérum physiologique ou une solution tamponnée et après dialyse, la solution est soumise à une filtration

sur gel utilisant du Sephadex G-50 pour obtenir une glyco-

protéine anti-tumeur ayant le poids moléculaire désiré.

Le terme "traitement de dégradation" tel qu'il est utilisé ici désigne un traitement pour convertir une

glycoprotéine ayant un poids moléculaire élevé en une gly-

coprotéine ayant un poids moléculaire plus petit en cassant chimiquement les liaisons intramoléculaires, comme les

ponts disulfure.

La substance de départ de la présente invention est de manière appropriée CBXî ou C Bx 2 l bien que CBX puisse

aussi être utilisée lorsque CBX 3 est un produit désiré.

Alors qu'il est préférable d'utiliser comme substance de départ une solution de CBX 1 et/ou C Bx 2 purifiées dans un tampon, sérum physiologique, eau distillée, etc, il est aussi possible d'utiliser un extrait cellulaire ou un

surnageant de culture contenant CB telle quelle.

CB peut être obtenue à partir d'un extrait ou

d'un surnageant de culture de cellules réticulo-endothé-

liales, lymphoblastes, cellules leucémiques ou fibroblastes

d'animaux à sang-chaud Les détails du procédé de produc-

tion et de l'effet anti-tumeur de CB sont décrits dans la

demande de brevet français 83 03274 La description de la-

dite demande est ci-incluse pour référence.

Comme exemples d'agent de réduction qui peuvent être utilisés dans la présente invention, on peut citer des thiols, comme le 2-mercaptoéthanol, le dithiothréitol, le

dithioérythritol, l'acide thioglycolique, l'acide monothio-

phosphorique, etc, des complexes hydrogène-métal comme le borohydrure de sodium, des phosphines tertiaires comme la tri-n-butylphosphine, la trisdiéthylaminoéthylphosphine, etc, des sulfites comme le sulfite de sodium, d e s c y a N ure S c omme le bromure de cyanogène, des ions métalliques comme l'ion argent, etc Ces composés sont

ceux employes en général pour la décomposition et l'élimi-

nation de contaminants du type protéique à poids molécu-

laires élevés, pour la dégradation d'une structure de di-

mension plus élevée d'une protéine et l'analyse de la

structure de base de ladite protéine, et ainsi de suite.

Les protéines traitées avec ces composés perdent souvent leur activité biologique, mais il est surprenant qu'un traitement de dégradation soit possible dans la présente

invention sans que soit perdue l'activité anti-tumeur.

Les conditions de mise en pratique de la pré-

sente invention comme la concentration de l'agent réduc-

teur, la température de traitement, le temps de traitement, le p H de traitement, etc, peuvent être choisies de manière appropriée selon le but recherché, par exemple si l'on

doit obtenir C Bx ou C Bx 3 seules ou toutes les deux simul-

tanément, etc L'agent réducteur peut être employé à une concentration de 10 l 09 M, de préférence par exemple

on emploie le 2-mercaptoéthanol 10-5 109 M, le dithio-

thréitol 102 10-5 M, le dithioérythritol 10-2 106 M, l'acide monothiophosphorique 10-1 10 6 M, le borohydrure

de sodium 102 10-5 M ou l'acide thioglycolique O 10 -

-6 M La température de traitement n'est pas particuliè-

3 È rement limitée du moment que la glycoprotéine ne subit pas

de dénaturation, et on peut employer une temperature com-

prise entre O et 37 C, de préférence la température ambian-

te peut être utilisée sans inconvénient On peut choisir le temps de traitement de manière appropriée pour-obtenir une CB ayant un poids moléculaire désiré, et ce-temps est

en général compris entre 10 minutes et 2 heures On choi-

sit de préférence un p H compris entre légèrement acide et

neutre, c'est-à-dire entre environ p H 5,5 et 7,5.

De plus, dans la mise en pratique du traitement de dégradation, un tensioactif, par exemple un tensio- actif ionique comme le dodécylsulfate de sodium (DSS), un tensio-actif non-ionique comme le Triton X (marque déposée)

etc, peut être de préférence présent dans le mélange réac-

tionnel pour augmenter le rendement La concentration opti-

male du tensio-actif varie selon le produit de départ dans le traitement de dégradation, de manière appropriée entre O,001 et 10 % Comme tensioactifs ioniques, on peut citer les anioniques, cationiques et amphotères Comme exemples de tensio-actifs anioniques appropriés, on peut citer le DSS, un sel de l'acide cholique, etc Comme exemples de tensio-actifs cationiques appropriés, on peut citer le bromure de dodécyltriméthylammonium, etc, et comme exemples

de tensio-actifs amphotères appropriés la désoxylysolé-

cithine, etc Comme exemples de tensio-actifs non-ioniques appropriés, on peut citer les Triton, des produits du type Tween, du type Span (tous trois marques déposées), etc.

Ils peuvent étre employés seuls ou en mélange.

La présente invention est décrite plus particu-

lièrement par les exemples suivants, qui ne sont pas limi-

tatifs.

Exemple 1.

a) Préparation des produits de départ.

On a préparé des CB de poids moléculaire plus

grand (c'est-à-dire C Bxi, C Bx 2 et C Bx) utilisés comme pro-

duits de départ dans les exemples 1 7.

Des lymphocytes humains ( 2 10 cellules) ont été mis en suspension dans 4 000 ml de milieu de Eagle contenant 10 % de sérum de veau, et, apres addition de phytohémagglutinine (Difco Co) à une concentration finale de 50 pg/ml, ont été cultivés à 37 C pendant 48 heures dans une atmosphère de 5 % de C 02 et 95 % d'air Ensuite, le surnageant du milieu de culture a été dialysé contre du tampon phosphate 0,01 M (p H 7,2), et une fraction dessalée avec du sulfate d'ammonium 40-80 % a été obtenue à partir du dialysat Cette fraction a été redialysée contre ledit tampon phosphate puis soumise à une filtration sur gel

utilisant du Sephadex G-100 (Pharmacia Co).

C Bxi, C Bx 2 et CBX bruts ont été obtenus dans des fractions avec des poids moléculaires de 70 000

90 000, 40 000 50 000 et 12 000 17 000 respectivement.

Le C Bxi brut a été adsorbé sur agglutinine europeus Ulex (marque déposée de Maruzen Oil Co) conjuguée à du Sephadex, et élué avec un tampon phosphate 0,01 M

contenant du fucose 0,5 M Après élimination du fucose par-

dialyse, C Bx 1 a été de nouveau adsorbé sur agglutinine europeus Ulex conjuguée à du Sephadex, puis on a effectué une élution par gradient en utilisant du tampon phosphate (p H 7,2), C Bxl purifié ayant ainsi été élué CBX 1 purifié

avec une activité spécifique de 50 000 unité/mg a été ob-

tenu en quantité totale de 5 200 unités en une opération.

Le CBX 2 brut a été purifié de la même manière, et on a obtenu C Bx 2 purifié avec une activité spécifique de 20 800 unité/mg en quantité totale de 5 200 unités en

une opération.

Le CB brut a également été purifié de la même x

manière et on a obtenu CBX purifié avec une activité spé-

cifique de 10 000 unité/mg en quantité totale de 10 000 unités en une opération C Bx purifié avec une activité spécifique de 7 500 unité/mg a également été obtenu en quantité totale de 150 unités à partir du même nombre de lymphocytes humains et en suivant le même mode opératoire,

sauf que le milieu de culture ne contenait pas la phyto-

hémagglutinine.

Tout au long de la description, l'activité est

exprimée en se basant sur la concentration qui inhibe 50 % de la prolifération de 105 cellules de cellules KB prises

comme une unité.

b) Traitement de dégradation.

On a dissous 200 000 unités de C Sx 1 (p m 70 000-

90 000) dans du sérum physiologique et on les a fait réagir

pendant une heure à température ambiante en présence de 2-

-7 mercaptoéthanol 5010 Mo Apres la réaction, le mélange

réactionnel a été dialysé et dessalé avec du sulfate d'am-

monium à 80 %, et le précipité a été éliminé par filtration.

Ce précipité a été dissous dans du sérum physiologique et

soumis à une filtration sur gel utilisant du Sephadex G-50.

Les fractions correspondant aux poids moléculaires 40 000 -

000, 12 000 17 000 et 7 000 9 000 ont été recueil-

lies et désignées respectivement sous les noms de Fraction

A, Fraction B et Fraction Co Les modes opératoires précé-

dents ont été répétés également en présence de DSS 0,05 %

et les mêmes fractions ont été obtenues.

Les propriétés physicochimiques de ces fractions

A, B et C ont été examinées et qes fractions ont été iden-

tifiées comme Bx CB 2 CBX et C Bx 3 respectivement Les résul-

tats sont résumés dans le Tableau 1 o O Tableau 1: Propriétés physidochimiques des Fractions A C Fraction A Fraction B Fraction C (ph 40 000 50 000) (pi 12 000 17 000) (/ 7 000 9 000) Identification CB CB CB

CX 2 CBX 3

Aspect et Poudre blanche soluble dans l'eau, dans une solution aqueuse de chlorur E solubilité

de sodium et de tampon phosphate et difficilement soluble dans le ben-

zène, l'hexane et le chloroforme.

Rfactions colorées Lowry I Bleu (liaisons peptidiques) Ninhydrir 4)Bleu vîôlet (amino-acides)

Phenol-

acide sulfurique Brun gris (éucres) Anthrone 2) Bleu vert (sucres) acide sulfurique a-Naphthol 2) Violet (sucres) acide sulfurique Indole 2) Brun gris (sucres) acide sulfurique Tryptophane 2) Violet gris (sucres) acide sulfurique Holff 3) Incolore (pas de lipides) H r I" ___________________Tableau i (suite) Fraction A Fraction B Fraction C

(PM 40,000 50,000 > (PM'12 000 -17,000) <(/M 7 000 9 000)

Teneur en sucres 4)30 -37 % 27 -33 % 8 -15 % Hexose 20 23 % 17 20 % 6 10 % H Iexosamline 6 8 % 5 7 % 1-2 Acide sialique 4 6 % 5-6 i-3 % Adsobabe su aglutiineeuropeus Ulex thylcellulose dans une Adsorbabilité conjuguée à du Sephadex dans du tanpon chromxatographie d'échange

d'ions utilisant la carbo-

phosphate 0,01 M ( P 7 ? 2) xyméthylcellulose dans du tampon phosphate (p H 6,4) Point iso électriqut-5) 4 2 7 3 4 2 7 j 3 63 Stable dans une solution aqueuse de p H 2,0, p H 7,0 et p H l 11,0 à 4,c Stabilité 'pendant 24 heures ou plus et dans une solution aqueuse de p H 7,0 -à'

'C pendant 3 heures ou -plus.

çytotoxicité 6) Endommage sélectivement les cellules tumorales et n' endommage pratiquement

pas les cellules normales.

FI w rlu ui Lq P. (A VI 1) Selon la méthode de Sqikagaku Jikken Koza, Vol 1

(Tanpakushitsu Teiryohou).

2) Selon la méthode de Seikagaku Jikken Koza, Vol 4

(Toshitsu Teiryohou).

3) Selon la méthcde de Seikagaku Jikken Koza, Vol 3

(Shishitsu Teiryohou).

4) Spiro, H A "Methods in Enzymology", Vol 8, pp 3-26, 1966. ) "Isoelectrofocusing using Ampholine"(marque déposée)

(disponible chez LKB-Produkter AB, Suède).

6) 105 cellules ont été cultivées dans 1 ml de milieu de

Eagle contenant 10 % de-sérum de veau et chaque frac-

tion à 37 C pendant 48 heures dans une atmosphère 5 % de CO 2 95 % d'air, après quoi le nombre de cellules viables non colorées par le Bleu Trypan ont été comptées et la concentration de la fraction à laquelle 50 % des

cellules sont tuées a été prise comme mesure de la cyto-

toxicité. Le rendement en activité de chaque fraction de

l'exemple 1 est présenté dans le Tableau 2.

Tableau 2

Traitement de Activité (unité) dégradation C Bx 1 CBX CB CBX 3 Cxl 2 C x 3 Avant traitement 200 000 Traitement au 2 e Traitement au O 10 000 160 000 15 000 2-mercaptoéthanol Traitement au 2-nercaptoéthanol

+ O 5 000 150 000 25 000

traitement a UDSS

Exemple 2.

On a dissous 200 000 unités de C Bx 2 dans du sérum physiologique et on les a fait réagir pendant une

heure à température ambiante en présence de 2-mercapto-

éthanol 5 10-7 M Après la réaction, on a dialysé et des- salé avec du sulfate d'ammonium pour obtenir une fraction qui a été soumise à une filtration sur gel utilisant du

Sephadex G-50 o On a recueilli des fractions de poids mo-

léculaires de 12 000 17 000 (Fraction B) et 7 000 9 000 (Fraction C) Les modes opératoires précédents ont été également répétés en présence de DSS 0,05 %o Les fractions ont été déterminées comme étant C Bx et C Bx 3 de la manière décrite dans l'exemple 1 o Les rendements en CB et C Bx 3 et X 3 sont présentés dans le Tableau 3 o Tableau 3

Tableau 3

Exemple 3.

000 unités de CBX ont été traitées avec du

2-mercaptoéthanol 5 10-7 M et une fraction de poids molé-

culaire 7 000 9 000 (Fraction C) a été obtenue de la

même manière que dans l'exemple 1 o La fraction a été iden-

tifiée comme étant C Bx 3 comme dans l'exemple 1 Le rende-

ment en C Bx 3 obtenu est présenté dans le Tableau 4.

Traitement de I Activité (unité) Traite Uent de déorzdation désaation CBX 2 CBX C Bx 3

Avant traitement 200 000 -

Traitement au 2 ercaptoéthanol O 170 000 20 000 2-zercaptoethlanol Traitement au 2-.ercaptoéthanol

+ O 140 000 37 000

Trait-ement au DSS

*Tableau 4

Exemple 4.

Un mélange de 100 000 unités de C Bxi et 100 000 unités de CBX 2 a été traité avec du 2-mercaptoéthanol 5.10-7 M de la même manière que dans l'exemple 1 Les rendements en C Bx 2, CBX et C Bx 3 sont présentés dans le

Tableau 5.

Ta a 5 Tableau 5

Exemple 5.

Un mélange de 100 000 unités de CBX 1 et 100 000 unités de CBX a été traité avec du 2-mercaptoéthanol -7

5.107 M de la même manière que dans l'exemple 1 Les ren-

dements en CBX 2, CBX et C Bx 3 sont présentés dans le Tableau 6.

Traitement de Activité (unité) dégradation B

X X 3

Avant traitement 200 000 -

2 e Traitement au 110 000 58 000 2-mercaptoéthanol Traitement au 2. nercaptoéthanol

+ 90 000 73 000

Traitement au DSS Traitement de Activité (unité) dégradation x CB B C 3 CBX 1 CBX 2 ' C x C% 3

Avant traitement 100 000 100 000 -

Traitement au 0 20 000 150 000 20 000 2-mercaptoéthanol Traitement au 2mercaptoéthanol O 3 000 140 000 42 000 + Traitement au DSS

253 1 435

Tableau 6

Exemple 6.

Un mélange de 100 000 unités de CBX et 100 000 unités de C Bx 2 a été traité avec du 2-mercaptoéthanol 5.107 M de la même manière que dans l'exemple 1 Les rendements en CBX et C Bx 3 obtenus sont présentés dans le

Tableau 7.

Tableau 7

Exemple 7.

Un mélange de 100 000 unités de C Bxi, 100 000 unités de C Bx 2 et 100 000 unités de CBX a été traité avec du 2-mercaptoéthanol 5 10-7 M de la même manière que dans l'exemple 1 Les rendements en C Bx 2, CBX et C Bx 3 obtenus Activité (unité) Traitement de dégradation C Bx 1 C Bx 2 CB CB 3

Avant traitement 100 000 100 000 -

Traitement au O 19 000 130 000 40 000 2-mercaptoéthanol Traitement au 2mercaptoéthanol

+ O 7 000 120 000 57 000

Traitement au DSS Traitement de Activité (unité) dégradation C Bx 2 C X 3 Avant traitement 100 000 100 000 O Traitement au 2-mercaptoéthanol 120 000 65 000 Traitement au 2-mercaptoéthanol

+ O 90 000 77 000

Traitement au DSS sont présentés dans

le Tableau 8.

Tableau 8

Exemple 8.

Un mélange de 100 000 unités de CBXI, 100 000 -unités de CB X 2 et 100 000 unités de CB X est traité avec chacun des agents réducteurs indiqués dans le Tableau 9

par une méthode semblable à celle de l'exemple 1 La ré-

cupération de C Bx 2 C Bx et C Bx obtenus est montrée dans le Tableau 9 21 X X le Tableau Taleau Agent réducteurConcen- Uid Avant triterent tration CB xi CB j CB 1 j CBX 3 Avant traitement 1 200,00 O 10 O 1001000 l Acide thioglycolique 1 600200 2,0 rique 10-i' N 27,000 240,000 21,000 Acie ma Ll, hoshj 'k O 21,000 230,000 17,000 Tri-fi-ebu,dtylhshn 1 7 O 25, 000 230,000 32,000 Bthlposuxhin cyn 1 e O 6,M 0 21,000 240,000 28,000 Ionargent 1 o-6 N M O 23,000 240,00025,000

2531435- Traitement de Activité (unité) dégradation CB CB B,, CB xi X 2 %X 3

Avant traitement îoo 000 100 000 100 000 -

Traitement au 2300200 200 2-mercaptoéthanol O 2300 40 00 200 Traitement au 2 -mercaptoéthanol

+ O 8000 240000 33000

Traitqement au LSS

Exemple 9

1.101 cellules de cellules humaines BALL-1 (Miyoshi, Nature, Vol 267, pp 843-844, 1977) que l'on a fait proliférer sous la peau de souris nues ont été mises en suspension dans 20 litres de milieu de Eagle contenant % de sérum de veau et après addition de 1 108 ufp de virus de Sendai, cultivées à 37 C dans une atmosphère de % de C 02 et 95 % d'air pendant 48 heures Le surnageant

de culture obtenu à partir de là a été utilisé comme pro-

duit de départ Ce surnageant de culture contenait un mé-

lange de CB Xi, CBX 2 CBX et CBX 3 Le traitement-de dégra-

dation a été effectué sur ce surnageant de culture par addition de 2mercaptoéthanol 10-6 M et de DSS 0,1 % à

température ambiante pendant une heure Le mélange réac-

tionnel a été dialysé et dessalé avec du sulfate d'ammo-

nium pour obtenir une fraction qui a été soumise à une filtration sur gel utilisant du Sephadex G-50 pour obtenir C Bx 2, CBX et C Bx 3 Les résultats sont présentés dans le

Tableau 10.

Tableau 10

Exemple 10 o

Le procédé de l'exemple 9 a été répété excepté -7 que du 2mercaptoéthanol 5 107 M a été utilisé comme agent réducteur et chaque composé du Tableau 11 a été utilisé comme surfactant à une concentration donnée Les

résultats sont indiqués dans le Tableau 11.

Traitement de Activité (unité) dégradation CBX CBB xi C X 2 C Bx 3 Avant traitement 47 000 49 000 98 000 500 Après traitement O i 000 150 000 37 000

Tableau 11

Agent rêducteirSurfactant Activité (Unité) (Conceniration) (Concentration) c BxiC Bx 2C Bx C Bx 3 Avant traitement 48,000 51,00099,000400 Acide cholique

( 0.01 %) 0 2,000 154,000 36,000

Bro/rearade dod 8 g-i-

0 1,000 149,000 39,000

2-Mercapto Déoxyl solécithinj éthanol ( 0 01 %) O 3,000 160,000 31,000 ( 5 x 10-7 M) Tween 20

( 0.01 %) O 2,000 159,000 29,000

Span 60 ( 0.01 %) j O 1,000 158,000 31,000

Exemple 11.

5.109 cellules de lymphocytes périphériques de bovin ont été mises en suspension dans 1000 ml de milieu de Eagle contenant 10 % de sérum de veau et cultivées à

370 C dans une atmosphère de 5 % de CO 2 et 95 % d'air pen-

dant 48 heures Le surnageant de culture obtenu à partir de là a été utilisé comme produit de départ Ce surnageant

de culture contenait un mélange de C Bx 1, C Bx 2, CBX et C Bx 3.

Le traitement de dégradation a été effectué sur ce surna-

geant de culture par addition de dithiothrêitol 10-3 M à température ambiante pendant 2 heures, et suivi des modes

opératoires de l'exemple 9 pour obtenir C Bx 2, C Bx et C Bx 3.

Les résultats sont présentés dans le Tableau 12.

Tableau 12

A 6 tivité (unité) Traitement de A t é dégradation C Bxi C Bx 2 CBX C Bx 3 Avant traitement 113 000 12 000 23 000 200 Après traitement O 1 000 32 000 Il 000

Exemple 12.

1

3.1010 cellules de fibroblastes humains Flow 7000 (Flow Co) ont été mises en suspension dans 6 000 ml D de milieu de Eagle contenant 10 % de sérum de veau et après

addition de phytohémagglutinine pour obtenir une concentra-

tion finale de 50 pg/ml, cultivées -à 37 C dans une atmos-

phère de 5 % de C 02 et 95 % d'air pendant 48 heures Le surnageant de culture obtenu à partir de là a été utilisé comme produit de départ Ce surnageant de culture contenait

un mélange de C Bxi, C Bx 2, C Bx et C Bx 3 o Le traitement de dé-

gradation a été effectué sur ce surnageant de culture en

présence de borohydrure de sodium 0,1 M à température am-

biante pendant 2 heures, suivi des modes opératoires sem-

blables à ceux de l'exemple 9 pour obtenir CBX 2, CBX et CBX 3 Les résultats sont présentés dans le Tableau 13 o

Tableau 13

Exemple 13.

t O 2.1010 cellules de lymphocytes périphériques humains ont été mis en suspension dans-4 000 ml de milieu de Eagle contenant 10 % de sérum de veau et après addition

de phytohémagglutinine pour obtenir une concentration fi-

nale de 50 pg/ml, cultivées à 37 C dans une atmosphère de % de C 02 et 95 % d'air pendant 48 heures Le surnageant

de culture obtenu à partir de là a été utilisé comme pro-

duit de départ Il contenait un mélange de C Bxl, C Bx 2, CBX et CBX 3 Le traitement de dégradation a été effectué

sur ce surnageant de culture par addition de dithioérythri-

tol 5 10-4 M à température ambiante pendant une heure, suivi des modes opératoires semblables à ceux de l'exemple

9 pour obtenir C Bx 2, C Bx et CBX 3 Les résultats sont pré-

Activité (unité) Traitement de dégradation C Bxi CBX 2 CBX CBX 3

_-., ___.

Avant traitement 16 000 18 000 35 000 600 Après traitement O I 700 52 000 17 000

sentés dans le Tableau 14.

Tableau 14

Activité (unité) Traitement de Aégradation CB CBX 2 CBX CB X 3 Avant traitement 23 000 25 000 51 000 800 Apres traitement O 2 000 83 000 13 000

Exem Dle 14.

1.1010 cellules humaines Ball-1, que l'on avait fait proliférer en culture tissulaire, ont été mises en suspension dans 2 000 ml de milieu de Eagle contenant 10 % de sérum de veau et cultivées à 37 C dans une atmosphère

de 5 % de C 02 et 95 % d'air pendant 48 heures.

Le surnageant de culture obtenu à partir de là

a été utilisé comme produit de départ Il contenait un mé-

lange de CB Exi C Bx 2, CBX et C Bx 3 Le traitement de dégra-

dation a été effectué sur ce surnageant de culture en pré-

sence de 2-mercaptoéthanol 5 10 6 M à température ambiante soit pendant 2 heures soit pendant 5 minutes, suivi des modes opératoires semblables à ceux de l'exemple 9 pour obtenir CBX 2, C Bx et C Bx 3 Les résultats sont présentés

dans le Tableau 15.

Tableau 15

Traitement de dégradation Activité (unité) C Bx 3 Avant traitement 5 200 4 900 11 000 110 Après traitement ( 2 h)0 300 13 000 7 100 Après traitement ( 5 mn) 3 600 5 400 12 000 120 C Bxi C Bx 2 CBX

Lorsque le traitement de dégradation a été ef-

fectué pendant 5 minutes, C Bx 2 et C Bx ont pu être obtenus

avec des rendements élevés, tandis que 2 heures du traite-

ment de dégradation ont produit C Bx et CBX 3 avec des ren-

dements élevés. Exemple 15 Purification de C Bx 2, CB et C Bx 3 v

X X X 3 '

Les C Bx 2, C Bx et C Bx 3 bruts obtenus dans les exemples précédents peuvent être encore purifiés,-si on

le désire, d'une manière classique utilisée pour la puri-

fication des substances biologiques.

C Bx 2 et C Bx ont été purifiés, par exemple, par la méthode décrite dans l'exemple loa) précédent pour la

préparation des produits de départ en utilisant de l'agglu-

tinine europeus Ulex conjuguée à du Sephadex On a obtenu

des préparations de CBX 2 et CBX purifiés ayant des activi-

tés spécifiques de 2 400 unité/mg et 2 500 unité/mg respec-

tivement. C Bx 3 a été purifié par exemple par adsorption sur concanavaline A conjuguée à du Sephalose suivie d'une élution par du tampon phosphate 0,01 M (p H 7,2) contenant

du a-méthyl-D-mannoside 0,5 Mo Après élimination du c-mé-

thyl-D-mannoside par dialyse, la solution a été appliquée sur de la carboxyméthylcellulose équilibrée avec du tampon

phosphate 0,05 M (p H 6,O), suivi d'une élution avec du tam-

pon phosphate 0,05 M (p H 7,8) o On a obtenu une préparation

de C Bx 3 purifié ayant une activité spécifique de 2 100 uni-

té/mg. Efficacité, toxicité, méthode d'utilisation et dosage des

CB de la présente invention.

Expérience 1 Sélectivité de l'effet cytotoxique -

Des échantillons de plusieurs 105 cellules de chacune des lignées de cellules tumorales comprenant des cellules KB (cancer du nasopharynx), des cellules MX-1 (cancer du sein, fournies par Dr Shigeru Tsukagoshi, Cancer Institute), des cellules Hep-2 (cancer de la gorge) et des cellules HEL (hépatome, Flow Co) et de lignées de cellules normales comprenant des cellules intestines 407,

des cellules cardiaques de Girardi, des cellules hépati-

ques de Chang, des cellules de Vero (rein de singe) et des cellules MDCK (rein de chien) (Flow Co), toutes ayant été cultivées au préalable pendant 24 heures respectivement, et 105 cellules de cellules P 388 et de cellules L 1210 (leucémie, fournies par Dr Shigeru Tsukagoshi, Cancer Institute), qui ont été utilisées immédiatement, ont été cultivés chacun dans 1 ml de milieu de Eagle contenant 10 % de sérum de veau et chaque produit à tester à 37 C pendant

48 heures dans une atmosphère de 5 % de C 02 et 95 % d'air.

Ensuite, le nombre de cellules viables n'ayant pas été colorées par le Bleu Trypan a été compté sous un microscope optique et la concentration du produit à tester à laquelle % des cellules ont été tuées a été calculée par rapport à un témoin pris comme 100 On a utilisé comme produit à tester C Bx 2, CBX et C Bx 3 obtenues dans l'exemple 15, les "-, B et y-lymphotoxines obtenues par une méthode connue (Granger G A et al, Cellular Immunology, Vol 38, pp.

388-402, 1978) et la Mitomycine C Une unité de la Lympho-

toxine est exprimée par un index classique basé sur la cytotoxicité sur les cellules L de souris (Eds, Bloom, B.R & Grade, P R "In vitro Methods in Cell-mediated

Immunity" Academic Press, 1979) Les résultats sont pré-

sentés dans le Tableau 16.

Tableau 16

Concentration pour 50 ',% d O inhibition de croissance Nom E& des I Biy BX F -lym y -lymnpho Mitomnyci'ne C cellules X CBX 3 iphot O Xin E hotoxin E toxine cellules (unité/ml) (unité/rni) (unité/ml) j(unité/ml) ( unité/rn)(unité/ml) KB Humaines 1 O 1,, 18 20 7 36 H Ep-2 Humaines 1 5 1 6 1 5 6 5 7 17 Cellu HEL Humaines 1 2 l 3 1 4 24 les tumo MX-1 Humaines 1/7 1 6 1 y 7 31 L 1210 souris 3,1 3 Y 3 310 -42 P 388 Scunes 30 31 34 - 36 Ifntes tines Humaines > 1 000 > 1 ooo > 1 000 77 91 si 33

Cardia-

Cmliiiquesde i Humîines >î 000 > 1 con > 1 000 21 les Girardi norma- liépa -00 1 O les tiques Humaines > 100 > O 100 10 9 9 20 de Chang Vero Singe Gi'620 630 51 MDCK Chien 50 50 50 43 Remarque) Il I signifie que llexpérîence n'a, pffs été effectuée,,u (A VI Comme il ressort des résultats précédents, CB

endommage sélectivement les cellules tumorales en n'endom-

mageant pratiquement pas les cellules normales A l'inver-

se, les a-, e et y-lymphotoxines et la Mitomycine C ont présenté une cytotoxicité non-sélective envers des cellu-

les normales et des cellules tumorales.

Expérience 2 Influence sur des souris auxquelles on a

transplanté le Sarcome 180 ou la Tumeur d'Ehrlich.

Des souris mâles (souche dd Y) pesant de 25 à

30 g ont reçu un transplant intrapéritonéal de 3 106 cel-

lules par animal du Sarcome 180 ou du liquide d'ascite de la tumeur d'Ehrlich, et on a observé le temps de survie compté en jours C Bx, CBX 2 et CBX 3 obtenus dans l'exemple

ont été administrés par voie intraveineuse à des grou-

pes de 5 souris, quotidiennement à partir du lendemain du jour de la transplantation jusqu'à la mort Les résultats, exprimés en pourcentages de la moyenne des jours de survie du groupe examiné par rapport à celle d'un groupe témoin,

sont présentés dans le Tableau 17.

Tableau 17

Moyenne Tumeur Produit à tester Posologie jours de ____ ___ ___ ____ ___ ___ ____ ___ I Journalière survie (%) 1 12 unit V/kg 112 CB x I 4 UnitîIkg 132 12 unite/kg 165 i Unite'kg 114 Sarcome C Bx 3 uni 1 klg 134 la 1uiit 14,kg 160 3 Unit*kg 102 > C Bx 3 3 unit/kg 133 Mitomycine C O ? mg/kg 141 Cyclophosphamide 20, mg/kg 170 i 2 unit*rig 1 U 50 CB x 4 unitv Icg 140 1.2 ung 186 Tuneur i ascitique 1 3unit/kg 136 d'Ehrlich CB X 2 * 3 unit/kg 164 1 e unitktkg 187 I unit&kg 140 C Bx 3 Unit/kg 155 la unitvkg 181 Mitomycine C JO 5 mg/kg j 165 _________Cyclophosphami de__J 20 mg/kg 205 Expérience 3 Influence sur les jours de survie de souris

portant un carcinome pulmonaire.

Des souris màles de souche BDF,,pesant de 20

à 25 g ont reçu-un transplant de 2 10 cellules du carci-

nome pulmonaire de Lewis par voie intramusculaire dans la

cuisse droite, et les jours de survie ont été observes.

C Bx, C Bx 2 et C Bx 3 obtenus dans l'exemple 15 ont été admi-

nistrés par voie intraveineuse à des groupes de 6 souris chaque jour à partir du lendemain du jour de transplanta-

tion jusqu'à la mort Les résultats exprimés en pourcenta-

ges de la moyenne des jours de survie du groupe examiné par rapport à celle d'un groupe témoin, sont présentés

dans le Tableau 18.

Tableau 18

Expérience 4 Influence sur les métastases pulmonaires d'un cancer. Des groupes de souris males souche BDF 1 pesant de 20 à 30 g, 6 animaux par groupe, ont reçu sous la peau

du dos un transplant d'un fragment de 2 mm 2 du cancer pul-

monaire de Lewis C Bx, C Bx 2 et C Bx 3 obtenus dans l'exemple Produit à tester Pslge oen Posologies Moen Produit à tes-ter jours de journalières sri survie (%)

42 I 08 I

1 ? 2 Uniitekg 103 CEB 4 unitkicg 114 12 unit-'kg 150 I uni"flg 107 C Bx 2 3 unit:'kg 123 1 o unit/kg 145 i Unit V Kg 116 C Bx 3 unit/kg 14 unit- /kg 158 Mitomycine C O 5 mg/kg 120 Cyclophosphamide 20 mg/kg 162 ont été administrés par voie intraveineuse une fois par jour pendant 12 jours à partir du 9 ème jour après la transplantation Le 2 lème jour après la transplantation, l'ensemble de la tumeur primitive a été isolé et pesé et le nombre de nodules métastasiques dans le poumon de l'ani- mal a été calculé selon la méthode de Wexler (J Natl. Cancer Institute, Vol 36, 641, 1966) Les résultats sont

présentés dans le Tableau 19.

Tableau 19

Produit 1tester Posologie Poids de la Nombre de nodules journalière tumeur (g) métastatiques dans le poumon Témoin 88 + 0,8 30 1 i 5, 6 C Bx 3 unit/kg 4 4 1 J 4 6,7 2 9 unit Y/kg3 ? 2 0,5 0,5 +O 3 CBX 2 3 uni, /Jkg 4, 5 1,S 6,9 2,l uni Wkg 2,3 O o,4 O 'o,7 i 0,4 CBX 3 3 unit'kg 4 >,1 k 1, 3 7 O 2 fi, 8 unit Ikg2,1: O 3 O 6 O; 3 ' Cyclophosphamide 20 uni ti/kg3 6 d: 07 04 Remarques Les résultats des tableaux sont exprimés en

tant que (moyenne) (erreur standard).

* Statistiquement différent du groupe témoin à un niveau

significatif de p 4 5 %.

*Statistiquement différent du groupe témoin à un niveau

significatif de p 1 %.

Comme le montrent clairement les résultats pré-

cédents, CBX, C Bx 2 et C Bx 3 ont supprimé avec succès le

cancer pulmonaire primitif et ses métastases pulmonaires.

Expérience 5 Test de toxicité (une seule administration).

On a administré par voie intraveineuse respec-

tivement 10 000 unité/kg de C Bx, 10 000 unité/kg de C Bx 2, ou 100 000 unité/kg de C Bx 3 à trois groupes de 10 animaux chacun de souris mâles de souche BDF 1 pesant de 20 à 25 g

et on a examiné les animaux pendant 7 jours Les 10 ani-

maux de chaque groupe respectif ont tous survécu sans ma-

nifester de modification de leur poids ni de leur état général, malgré l'administration respective de teneurs

de glycoprotéines aussi élevées.

Expérience 6 Test de toxicité (administration en continu

sur 30 jours).

On a administré C Bx, C Bx 2 ou C Bx 3 par voie intraveineuse à des souris mâles de souche BDF pesant de 20 à 25 g, 10 animaux par groupe, et ce pendant 30 jours, et le nombre d'animaux morts, les modifications de poids et de l'état général ont été observés Les animaux ont été pesés entre 9 et 10 heures du matin, et l'observation de l'état général a été faite les 10 oème, 20 ème et 30 ème jours selon la méthode de Arvien (Science, Vol 36, p 123, 1962) Il n'y a pas eu d'animaux morts pendant ces 30 jours lorsque 1 000 unité/kg/jour de CBX ou C Bx 2, ou 000 unité/kg/jour de C Bx 3 ont été administrées, et la courbe de gain de poids était approximativement la même que celle du groupe témoin De plus, l'état général des

animaux a été trouvé normal comme dans le groupe témoin.

Comme on peut le voir à partir des expériences

précédentes, C Bx, C Bx 2 et C Bx 3 arrêtent de manière sélec-

tive la croissance des cellules tumorales, et de plus non seulement suppriment de manière remarquable les métastases cancéreuses mais sont aussi extrêmement efficaces contre diverses tumeurs et sont malgré tout sans danger même à doses plus élevées que la dose à laquelle se manifestent les effets pharmaceutiques Par conséquent, C Bx, CBX 2 et CBX 3 sont très utiles pour la thérapie de diverses tumeurs

comme le cancer de l'estomac, le cancer du poumon, i'hépa-

tome, le cancer du colons, le cancer du sein, le cancer de l'utérus, la leucémie, etc De plus, des formes de poids moléculaires relativement faibles de CB (CBX, C Bx 21 C Bx 3) peuvent provenir de formes de poids moléculaires relative- ment plus élevés de CB (CBXI CBX 1 t C Bx 2) par traitement par un agent réducteur sans nuire à leur efficacité de

traitement des-tumeurs.

Claims (12)

REVENDICATIONS

1 Procédé de production d'une glycoprotéine anti-tumeur ayant un poids moléculaire inférieur au poids moléculaire d'une glycoprotéine antitumeur de départ, qui consiste à utiliser comme produit de départ une glycopro- téine anti-tumeur obtenue à partir d'un extrait ou d'un surnageant de culture de cellules réticulo-endothéliales,

lymphoblastes, cellules leucémiques ou fibroblastes d'ani-

maux à sang chaud, à effectuer un traitement de dégradation sur ladite glycoprotéine en la faisant réagir avec un agent

de réduction et ensuite à récupérer au moins une glycopro-

téine anti-tumeur ayant un poids moléculaire réduit à par-

tir du mélange réactionnel.

2 Procédé selon la revendication 1 dans lequel

la glycoprotéine anti-tumeur de départ est une glycoprotéi-

ne C Bxl ayant les propriétés suivantes: 1) Poids moléculaire:70 000 90 000; 2) Réactions colorées manifeste une coloration indiquant

la présence de protéines dans la réaction de Lowry, mani-

feste une coloration indiquant la présence de liaisons peptidiques et d'amino-acides dans la réaction avec la ninhydrine après hydrolyse avec l'acide chlorhydrique et manifeste une coloration indiquant la présence de sucres dans la réaction phénol-acide sulfurique, la réaction

anthrone-acide sulfurique, la réaction indole-acide sulfu-

rique et la réaction tryptophane-acide sulfurique; 3) Aspect et solubilité: poudre blanche soluble dans l'eau, une solution aqueuse de chlorure de sodium et de tampon phosphate et difficilement soluble dans le benzène, l'hexane et le chloroforme; 4) Teneur en sucres: 35 45 %, dont la composition est 23-28 % d'hexoses, 8-11 % d'hexosamines et 4-6 % d'acides sialiques; ) Point isoélectrique: 4,3 6,2; 6) Adsorbabilité: adsorbable sur agglutinine europeus Ulex (marque déposée) conjuguée à du Sephadex (marque déposée) dans du tampon phosphate 0,01 M (p H 7,2); 7) Stabilité: stable dans une solution aqueuse de p H 2,0, p H 7,0 ou p H 11, 0 à 4 C pendant plus de 24 heures et dans une solution aqueuse de p H 7, 0 à 60 C pendant plus de 3 heures; et

8) Cytotoxicité: endommage sélectivement les cellules tu-

morales et n'endommage pratiquement pas les cellules nor-

males. La glycoprotéine anti-tumeur obtenue par le

traitement de dégradation est au moins une des glycopro-

téines anti-tumeur C Bx 2, CBX et C Bx 3 ayant les propriétés suivantes: C Bx 2 1) Poids moléculaire: 40 000 50 000; 2) Réactions colorées: manifeste une coloration indiquant

la présence de protéines dans la réaction de Lowry, mani-

feste une coloration indiquant la présence de liaisons peptidiques et d'amino-acides dans la réaction avec la ninhydrine après hydrolyse avec l'acide chlorhydrique, et manifeste une coloration indiquant la présence de sucres dans la réaction phénol-acide sulfurique, la réaction

anthrone-acide sulfurique, la réaction indole-acide sulfu-

rique et la réaction tryptophane-acide sulfurique; 3) Aspect et solubilité: poudre blanche soluble dans l'eau, une solution aqueuse de chlorure de sodium et de tampon phosphate, difficilement soluble dans le benzène, l'hexane et le chloroforme; 4) Teneur en sucres: 30 37 %, dont la composition est 20-23 % d'hexoses, 6-8 % d'hexosamines et 4-6 % d'acides sialiques; ) Point isoélectrique: 4,2 7,3; 6) Adsorbabilité: adsorbable sur agglutinine europeus Ulex conjuguée à du Sephadex dans du tampon phosphate 0,01 M (p H 7,2); 7) Stabilité: stable dans une solution aqueuse de p H 2,0, p H 7,0 ou p H 11,0 à 4 C pendant plus de 24 heures et dans une solution aqueuse de p H 7,0 à 60 C pendant plus de 3 heures; et 8) Cytotoxicité: endommage sélectivement les cellules tu- morales en n'endommageant pratiquement pas les cellules normales. CBX: 1) Poids moléculaire: 12 000 17 000; 2) Réactions colorées: manifeste une coloration indiquant

la présence de protéines dans la réaction de Lowry, mani-

feste une coloration indiquant la présence de liaisons peptidiques et d'amino-acides dans la réaction avec la ninhydrine après hydrolyse avec l'acide chlorhydrique, et manifeste une coloration indiquant la présence de sucres dans la réaction phénol-acide sulfurique, la réaction

anthrone-acide sulfurique, la réaction indole-acide sulfu-

rique et la réaction tryptophane-acide sulfurique; 3) Aspect et solubilité: poudre blanche soluble dans l'eau, une solution aqueuse de chlorure de sodium et de tampon phosphate et difficilement soluble dans le benzène, l'hexane et le chloroforme; 4) Teneur en sucres: 27 33 %, dont la composition est

17-20 % d'hexoses, 5-7 % d'hexosamines et 5-6 % d'acides-

sialiques; ) Point isoélectrique: 4,3 7,3; 6) Adsorbabilité: adsorbable sur agglutinine europeus Ulex conjuguée à du Sephadex dans du tampon phosphate 0,01 M (p H 7,2); 7) Stabilité: stable dans une solution aqueuse de p H 2,0, p H 7,0 ou p H 11,0 à 4 C pendant plus de 24 heures et dans une solution aqueuse de p H 7,0 à 60 C pendant plus de 3 heures;

8) Cytotoxicité: endommage sélectivement les cellules tu-

morales et n'endommage pratiquement pas les cellules nor-

males; et

9) Différenciation: induit la différenciation des cellu-

les tumorales, c'est-à-dire ramène'à la normale les cellu-

les tumorales.

CB 3:

1) Poids moléculaire 7 000 9 000 2) Réactions colorées manifeste une coloration indiquant

la présence de protéines dans la réaction de Lowry, mani-

feste une coloration indiquant la présence de liaisons peptidiques et d'amino-acides dans la réaction avec la ninhydrine après hydrolyse avec l'acide chlorhydrique, et manifeste une coloration indiquant la présence de sucres dans la réaction phénol-acide sulfurique, la réaction

anthrone-acide sulfurique, la réaction indole-acide sulfu-

rique et la réaction tryptophane-acide sulfurique; 3) Aspect et solubilité poudre blanche soluble dans l'eau, une solution aqueuse de chlorure de sodium, aqueux et de tampon phosphate et difficilement soluble dans le benzène, l'hexane et le chloroforme 4) Teneur en sucres: 8 15 %, dont la composition est 6-10 % d'hexoses, 1-2 % d 'hexosamines et 1-3 % d'acides sialiques ) Adsorbabilité: adsorbable sur carboxyméthylcellulose dans une chromatographie d'échange d'ions utilisant la carboxyméthylcellulose dans du tampon phosphate 0,05 M (p H 6,4); 6) Stabilité: stable dans une solution aqueuse de p H 2,0, p H 7,0 ou p H 11,0 à 4 C pendant plus de 24 heures et dans une solution aqueuse de p H 7,0 à 60 C pendant plus de 3 heures;

7) Cytotoxicité: endommage sélectivement les cellules tu-

morales et n'endommage pratiquement pas les cellules nor-

males; et 8) La séquence d'amino-acides de l'extrémité N-terminale

de la partie protéique est Alanine-Alanine-.

3 Procédé selon la revendication 2 dans lequel la glycoprotéine antitumeur de départ C Bxi est obtenue à

partir d'un surnageant de culture de cellules réticulo-

endothéliales, lymphoblastes, cellules leucémiques ou fi-

broblastes d'animaux à sang chaud par dessalage du surna- geant, et fractionnement du précipité ainsi obtenu par filtration sur gel pour obtenir une fraction ayant un poids moléculaire de 70 000 90 000 et ensuite adsorption et élution de la fraction sur agglutinine europeus Ulex

conjuguée à du Sephadex.

4 Procédé selon la revendication 1 dans lequel la glycoprotéine antitumeur de départ est C Bx 2, et la

glycoprotéine anti-tumeur obtenue par le traitement de dé-

gradation est au moins un membre du groupe constitué de

C Bx et C Bx 3.

Procédé selon la revendication 4 dans lequel la glycoprotéine anti-tumeur de départ C Bx 2 est obtenue à

partir d'un surnageant de culture de cellules réticulo-

endothéliales, lymphoblastes, cellules leucémiques ou fi-

broblastes d'animaux à sang chaud par dessalage du surna-

geant et fractionnement du précipité ainsi obtenu par fil-

tration sur gel pour obtenir une fraction ayant un poids moléculaire de 40 000 50 000, et ensuite adsorption et

élution de la fraction sur agglutinine europeus Ulex con-

juguée-à du Sephadex.

6 Procédé selon la revendication 1 dans lequel

la glycoprotéine anti-tumeur de départ est CBX et la glyco-

protéine anti-tumeur obtenue par le traitement de dégrada-

tion est C Bx 3.

7 Procédé selon la revendication 6 dans lequel la glycoprotéine antitumeur de départ C Bx est obtenue à

partir du surnageant de culture de cellules réticulo-endo-

théliales, lymphoblastes, cellules leucémiques ou fibro-

blastes d'animaux à sang chaud par dessalage du surnageant et fractionnement du précipité ainsi formé par filtration

sur gel pour obtenir une fraction ayant un poids molécu-

laire de 12 000 17 000 et ensuite adsorption et élution de la fraction sur agglutinine europeus Ulex conjuguée à

du Sephadex.

8 Procédé selon l'une quelconque des revendi- cations 1 à 7 dans lequel l'agent réducteur est au moins choisi dans le groupe constitué par un thiol, un complexe métal-hydrogène, une phosphine tertiaire, un sulfite, un

cyanure et un ion métallique.

9 Procédé selon la revendication 8 dans lequel le thiol est le 2mercaptoéthanol, le dithiothréitol, le

dithioérythritol, l'acide thioglycolique ou l'acide mono-

thiophosphorique.

Procédé selon l'une des revendications 1 ou

8 dans lequel le traitement de dégradation est effectué en présence d'un tensio-actif o

11 Procédé selon la revendication 10 dans le-

quel le tensio-actif est le dodécylsulfate de sodium, le cholate de sodium, le bromure de dodécyltriméthylammonium, la désoxylysolécithine, le Triton X, le Tween 20 ou le

Span 60 (marques déposées).

12 Procédé selon l'une des revendications 8 ou

dans lequel le traitement de dégradation est effectué à une température comprise entre O et 37 C à un p H compris

entre légèrement acide et neutre.

13 Procédé selon la revendication 12 dans le-

quel la température est comprise entre 15 et 25 C.