JPH01199594A

JPH01199594A - タンパク質性組成物

Info

Publication number: JPH01199594A
Application number: JP63296389A
Authority: JP
Inventors: Hannah Farkas-Himsley; ハナ　ファーカス−ヒムスレイ; Geoffrey Wyatt Henson; ジェフリー　ワイアット　ヘンソン; Robert Charles Brooks; ロバート　チャールズ　ブルックス
Original assignee: Innovations Foundation of University of Toronto
Current assignee: Innovations Foundation of University of Toronto
Priority date: 1987-11-27
Filing date: 1988-11-25
Publication date: 1989-08-10
Also published as: FI885486A; NO885269D0; EP0318302A1; IL88480A0; DK661488D0; AU2591588A; MC1989A1; NO885269L; FI885486A0

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）この発明は、抗腫瘍効果および／または抗ウイルス効果
を示すタンパク質およびタンノぜり質性組成物に関する
。

（従来の技術）白血球細胞は、その他の成分も含めＴおよびＢ細胞（リ
ンパ球）から成る。Ｔ細胞に感染することが公知である
ウィルスの中で極めて医学的に重要なウィルスは、ＨＩ
Ｖ−Ｉというレトロウィルスであり、これらは、後天性
免役不全症候群またはＡＩＤＳの原因ウィルスとして最
近確認された。ＡＩＤＳに関与しているＨＩＶ−Ｉは、
血中Ｔ４細胞に感染し時としてこれらを破壊することが
ある。Ｔｓサプレッサー細胞は、こうした感染を受けな
い。

その他に医学的に重要なウィルス感染症として、エプス
タイン・バー（Ｅｐｓｔｅｉｎ　−Ｂａｒｒ　）ウィル
ス（ＥＢＶ　）で誘発される感染性単核白血球増加症や
種々のインフルエンザウィルス型によって誘発されるイ
ンフルエンザがあげられる。

ＡＩＤＳウィルスが現在、医学上の特に緊急課題である
ことはもちろんであるが、一般に人手可能で治療効果が
立証された治療薬は未だない。Ａ　ＩＤＳウィルスは患
者血中Ｔ細胞に感染し、長期にわたりそこで休止状態で
存在する。しかし、ある因子によってＡＩＤＳウィルス
の複製が刺激されると、このウィルスは急激に宿主Ｔ細
胞を破壊し、宿主Ｔ細胞は体内侵入者に対し免疫機能を
果たすことが出来なくなる。

研究者達は、現在バクテリオシンとして注目されている
バクテリア由来のタンパク質類な以前から同定し単離し
てきた。これらのタンパク質類は、グラム陽性およびグ
ラム陰性双方の種々のバクテリアで産生され、生産株の
名をとって命名されている。バクテリオシンは、正常時
には近縁関係にある生産株に特異的なバクテリア株と相
互作用し、それらを殺すことによって増殖を防止する。

バクテリオシンは、種々のタンパク質の発現および／ま
たは分泌を促進する縛発物質の存在下でバクテリア細胞
の増殖および分裂にともない生産され、このバクテリオ
シンタンパクも種々のタンパク質に属する。

（発明カモ解決しようとする課題）本発明の目的は、ウィルスに感染した哺乳類細胞を検出
する手段を提供することである。

本発明の次の目的は、悪性哺乳類細胞を検出する手段を
提供することである。

本発明のさらに次の目的は、さまざまなウィルス誘発感
染症と疾病の治療に用いることの出来る物質および組成
物を提供することである。

本発明のさらにもうひとつの目的は、悪性増殖の治療に
用いることができる物質および組成物を提供することで
ある。

（課題を解決するための手段）本発明は、バクテリオシン生産性誘発物質すなわち刺激
誘発物質の存在下でバクテリア細胞を培養しこの中から
タンパク質性組成物を抽出し少なくとも部分的に精製す
ることによって得ることのできるタンパク質またはタン
パク質性組成物が、哺乳類細胞において抗ウィルス活性
および／または抗腫瘍活性を示すという知見に基づいて
いる。

このタンパク質またはタンパク質性組成物はバクテリオ
シンを含有することができる。この方法で最初に調製し
た組成物はバクテリオシン類を含有しており抗ウィルス
および抗腫瘍活性を有する一方、さらに精製し実質的に
全てのバクテリオシン成分を除去することができる。結
果として生じたタンパク質または改変タンパク質性組成
物は、哺乳類細胞において少なくともひとつの上記活性
を実質的に示す。

ここでは、′悪性”という用語は、ステッドマｙ　（Ｓ
ｔｅｄｍａｎ　）医学辞典（２４版、ウィリアムスとラ
イＡ／−？　７　ス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ　＆、　Ｗｉｌ
ｋｉｎｓ　）、バルチモ７　（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ　）
、ロンドｙ　（Ｌｏｎｄｏｎ　）、１９８２　）に定義
しであるように、局部的浸潤性、破壊的増殖性および転
移性を有することを意味する。

したがって、本文では、１ウイルスに感染した哺乳類細
胞″という用語は、ウィルスに感染した腫瘍細胞すなわ
ち悪性細胞を除外して使用していること、つまり、本文
でいうウィルスに感染した哺乳類細胞は、自己制御性に
増殖するものであり、これは−見して悪性細胞の特徴で
はないということを理解していただきたい。

したがって、本発明によって、１種以上のタンパク質お
よびタンパク質性組成物を、ウィルスに感染した哺乳類
細胞および／または腫瘍化哺乳類細胞の治療に用いるた
め、提供する。

１だ、ウィルスに感染した非悪性哺乳類細胞および悪性
哺乳類細胞の増殖を検出する方法で、これらの細胞を不
発明のタンパク質またはタンパク質性組成物と相互作用
させウィルス感染細胞または悪性細胞を選択的にたたく
ことより成る方法が、この発明の範囲内で提供される。

（作　用）本発明のタンパク質性組成物の活性成分は、単一のタン
パク質または関連する１種以上のタンパク質である。こ
れらの組成物の活性成分は、ウィルス感染ｍ胞オたは悪
性細胞と選択的に相互作用することがわかった。さらに
、適当量のタンパク質または前記タンパク質組成物は、
ウィルス感染細胞または悪性細胞を状況に応じて選択的
に殺し、一方正常の健常細胞に対しては実質的に影Ｑケ
及ぼさない。

本発明で有用なタンパク質性組成物は、バクテリオシン
成分を含有する。

ひとつの調製方法による組成物は、バクテリオシンとと
もに形成される。このようなバクテリオシン調製物は、
多（の場合において、線維肉腫、急性リンパ芽球性白血
病（ＡＬＬ　）　、子宮頚癌、腺癌、扁平上皮癌、慢性
骨髄性白血病、プロリンパ性白血病、肥満細胞腫その他
多（の癌のようなさまざまな癌細胞を特異的に殺し、脣
たは、その増殖を特異的に阻害する物と同一である。本
発明の前記活性成分または活性成分類とともに産生でき
るバクテリオシン類の特別な例として、ビオシン類、ヒ
フジオシン類、マイコバクテリオシン類およびコリシン
類が挙げらハる。これらが残存し存在することは、有害
ではない。しかし、実質的に全くバクテリオシンを含有
しないタンパク質性組成物が、抗肝癌および／または抗
ウィルス活性を示す。

ウィルスに感染している非悪性咄乳類細胞は、本文で述
べるタンパク質あるいはタンパク質組成物でこれらの細
胞を処理することによって、本発明の範囲内で検出でき
る。さらに詳細に言えば、ウィルスに感染した細胞は、
本文で述べるタンパク質またはタンパク質性組成物で上
記細胞を処理することによる細胞死によって検出できる
。

さらに、悪性哨乳顛細胞は、この発明にしたがって、本
願記載のタンパク質またはタンパク質性組成物で細胞を
処理することで検出できる。さらに、詳細に言えば、悪
性細胞は、本願記載のタンパク質またはタンパク質組成
物で細胞を処理することによる細胞死によって検出でき
る。

本発明の組成物で処理し、ウィルス感染の非悪性細胞お
よび悪性細胞を検出するために効率的に用いられる数多
くの方法が、当業者に公知である。

これらには、結合測定法（酵素連結結合、螢光結合およ
び放射性物質結合）およびトリチウム標識チミジン取り
込みとフロー・サイトメトリーナ含めて代謝による取り
込みアッセイが挙げられるが、これらに限定されるもの
ではない。

前記タンパク質性組成物は、バクテリオシン産生能を有
するバクテリア株を用いる公知の標準的技術で謔製する
ことができる。前記バクテリアを対数期まで発＃檜で増
殖させる。適切な化学薬品あるいは自然物質を用いるこ
とによって誘発を行うが、との誘発によって、誘発処理
前には抑制されていたほとんどの細胞が多くのタンパク
質を合成する。これらの細胞（９０−９９％の細胞）は
、また、適切な誘発条件下でバクテリオシンを合成する
。適切な誘発剤の一例として、約０．５μ、ｆ／−／−
１濃度のマイトマイシンＣがある。他の誘発剤も当分野
で公知でありかつ広く応用されており、紫外線や適当な
還元条件の適用も誘発剤として挙げられる。前記細胞を
さらにインキュベートする。培養によっては前記タンパ
ク質が培養増殖培地に分泌される。培養細胞がタンパク
質を放出しないので、細胞壁を破砕する必要がある場合
もある。これは、フレンチ（Ｆｒｅｎｃｈ　）プレス加
圧型細胞破壊装置を用いて圧力（例、２０，０００　ｐ
ｓｉ　（パラン。

ド／（インチ）２）下で破砕を行うことができる。

不純物の混ざったタンパク質性組成物を遠心分離により
細胞砕片より分離すると、上清液体中にこのタンパク質
性組成物が含有される。

上清を回収後、標準的な生化学的分離操作によって、こ
のタンパク質性組成物を精製する。例えば、最初に、種
々の濃度の硫酸アンモニウムのような塩を用いるのが好
適である。残った硫酸アンモニウムを、次に水への透析
で除去する。目的のタンパク質性組成物がバクチリオシ
／を含有している時には、このタンパク質性組成物を含
有する沈澱懸濁液を弱陽イオン性交換体であるセファデ
ックス（５ｅｐｈａｄｅｘ　）　ＤＥＡＦｉ　−Ａ　５
０のようなカラムでクロマトグラフィな行い、種々のタ
ンパク質を２８０　ｎｍにおける吸収をモニターするこ
とによって分離する。このようにして分離したタンパク
質から、このタンパク質性組成物のバクテリオシン成分
に感受性であることが公知のバクテリア細胞（すなわち
インジケーター株）をそれらの−定分量が殺す効果に基
づいて、活性分画を決定し選択する。次に、活性タンパ
ク質分画をプールする。タンパク質の電荷に基づき高速
液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）でさらに精製する。

２８０　ｎｍにおける吸収をモニターすることによって
得た種々のピークを分離し、再度インジケーター株に対
する活性を調べることができる。このタンパク質性組成
物の最終純度は、ドデシル硫酸す）　ＩＪウム・ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ　−ＰＡＧＥ　）で
決定することができる。目的の最終タンパク質またはタ
ンパク質性組成物が実質的にバクテリオシンを含有しな
いような時は、セファデックス（５ｅｐｈａｄｅｘ　）
　ＤＥＡＥ　−Ａ　５０の代わりにＡｃＡ　５４のよう
なサイズ排除クロマトグラフィーを用いることができる
。次いで、バクテリオシン活性で測定した活性分画を、
例えばＤＥＡＥ−）　ＩＪスアクリル（ＴＩ’（ＩＳＡ
ＣＲＹＬ　）　−Ｍイオン交換カラムでイオン交換クロ
マトグラフィを行う。こうすることによって、活性タン
パク質または活性タンパク質性物質をバクテリオシンか
ら分離する。この活性分画を、哺乳類悪性細胞に対する
活性、例えばトリチウム−チミジン取り込み測定によっ
て決定する。

ＨＰＬＣ−８ＢＣ（サイズ排除クロマトグラフィ）によ
って、さらにこの活性タンパク質またはタンパク質性物
質の精製を達成できる。再度、この活性分画を、哺乳類
悪性細胞に対する活性によって決定する。

このように、本発明で用いられるタンパク質性組成物の
選択、単離および精製は、当分野の技術の範囲内にある
。上述した通常のタンパク質製造およびスクリーニング
法によって、ウィルスに感染した哺乳類細胞および／ま
たは腫瘍化哺乳類細胞に活性のタンパク質またはタンパ
ク質性組成物が当業者にもたらされる。

結果として生じたタンパク質性組成物が、腫瘍化哺乳類
細胞に対し活性であることが示された。

このタンパク質組成物は、バクテリオシンについては微
量の残存量しか含有せず最小の抗菌活性を示す。これに
対して、分離されたバクテリオシン含有分画は、予期さ
れるとおりの強い抗菌活性を示すが、有意な抗腫瘍活性
を示さない。

本発明において有用なタンパク質性組成物は、未分離の
バクテリオシンを含有しており、毒性問題への安全を考
慮し比較的少量で用いるべきである。マウスで行った毒
性研究における動物−匹当たりの有効反復量（μｇ）は
、マウスにおいて１００％有効で毒性作用がなかった。

しかし、組成物の濃度上昇に伴い、毒性が顕著となった
。Ｃ３Ｈ／Ｊ糸マウマウス、マウ７ｌ匹当たり８０〜１
００μｇが致死量であった。ハイブリッド（１３ＤＸ２
ＦＩ／Ｊのような他糸マウスでは、（１３　Ｈ／Ｊマウ
スより耐性カ１０倍高く、マウス−匹当たり１０００μ
ｇで毒性が発現した。

哺乳類に対するタンパク質またはタンパク質性組成物の
適正投与量は、哺乳類患者の体重１　ｋｇ当たり約０．
１μｇから５００μＩの範囲にあり、体重１ｋｙ当たり
約５〜１００μＩの範囲にあることが好適である。この
用量を反復して投与することができる。標的細胞１個当
たり１０−５ｎｐから１　ＯｆｉＦのタンパク質性組成
物の割合になるように、この組成物を一定のリンパ球群
に添加することが好ましく、標的細胞光たり１０−’　
ｎ９−から１　ｎ５１’であることが最も好ましい。ウ
ィルス感染細胞を殺すための投与量は、腫瘍細胞の治療
に必要な量よりも有意に少ない。

有意な残存バクテリオシンを含有しない本発明のタンパ
ク質組成物は、マウス−匹当たり１０μｇ０治僚量で毒
性を発現しなかった。

実質的にバクテリオシンを含有しない組成物によって悪
性細胞を殺すための投与量と濃度は、インビボでもイン
ビトロでも、バクテリオシン未分離の上述のタンパク質
組成物の投与量および濃度と本質的に同様であった。

本発明のタンパク質類およびタンパク質組成物の投与方
法は、この組成物の剤形に影響する。この組成物はタン
パク質より成り胃内酵素によって消化されるため、また
、この組成物をリンパ球攻撃に用いるのが好適であるた
め、この組成物を注射投与用溶液として調製するのが好
ましい。したがって、好適な担体を生理食塩水水溶液媒
質中で緩衝化する。当分野で標準的な実施法にしたがっ
てこの溶液を調製する。この活性物質が活性状態のまま
標的部位に確実に到達するための適切な他の投与方法も
、同様に、用いることができ、かつ当分野の技術の範囲
内で決定することができる。

このような投与剤形の例として、徐放性すなわち放出を
持続性とした組成物があげられるが、しかしこれに限定
されるものではない。

本発明を、以下の特殊な実施例でさらに例示する。

（実施例）実施例１：タンパク質性組成物の調製フレイン・ハート・インフュージョン（ＢｒａｉｎＨｅ
ａｒｔ　Ｉｎｆｕｓｉｏｎ　）培地（ＢＨＩ　）　２０
０リツトル（デイフコ・ラボ（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｓ　
）、デトロイト（Ｄｅｔ−ｒｏｉｔ　）、ミシガｙ　（
Ｍｉｃｈｉｇａｎ　）　）に対し、−晩増殖させたバク
テリア生産株Ｅ、　ｃｏｌｉ　（大腸菌）Ｈ２Ｏ−１０
を一回接種した。バクテリア増殖が対数期に達するまで
、３７℃で培養物を増殖させた。

誘発剤すなわち０．５μｇ／、−（量のマイトマイシン
（Ｍｉｔｏ−ｍｙｃｉｎ　）　Ｃをこの培養に添加後、
増殖をさらに４−５時間継続させた。

結果として生じたブイヨンをシャープレス（Ｓｈａｒ−
ｐｌｅｓ　）遠心機で９０分回転し、上清ブイヨンと固
体および半固体物質のペレットを形成後、この上清ブイ
ヨンを捨てた。このペレットは、湿潤塊として５（１５
９−であった。ペレット内の細胞物質をフレンチ（Ｆｒ
ｅｎｃｈ　）プｌ／ス加圧型細胞破壊装置を用いて破砕
し、結果として生じた物質を最初の体積の１％容量のト
リス（Ｔｒｉｓ　）　（０，（１５Ｍ、　ｐＨ７，８）
に再懸濁した。結果として生じた＠濁液を遠沖し、ペレ
ット破片を捨てた。このようにして得た粗タンパク質性
組成物含有溶菌液を含む上清物質を、下記の実施例２に
述べる如（処理し精製した。

実施例２：タンパク質性組成物の精製実施例１で得た粗タンパク質性組成物含有上清（すなわ
ち、粗溶菌液、組成物］）を、種々の濃度の硫酸アンモ
ニウム沈澱によって、バクテリオシン活性成分以外のタ
ンパク質から分離した。このタンパク質性組成物のバク
テリオシン活性によって証明されたように、得られたタ
ンパク質性組成物中にもバクテリオシンが存在した。

３５−５０％濃度の硫酸アンモニウムで塩析したタンパ
ク質を保持し上清を捨てた。この沈１ＲＶｃ保持された
物質を再懸濁し水に対して透析後４６，０００ｙで遠沈
し、タンパク質性組成物２を得る。この結果として生じ
た上清を、以下の精製まで一２０℃に保存する。

この凍結上清を解かした後、セファデックス（５ｅｐｈ
ａｄｅｘ　）　−ＤＥＡＥＡ　−５０を用いてりｏマド
グラフィを行い、０．（１１．　Ｍ　）リス（Ｔｒｉｓ
　）　ｐＨ８，２中０．０　１．　ＯＭ　ＮａＣ１勾配
を溶出剤として用いかつ２８０　ｎｍにおける吸収をモ
ニターすることによって、凍結上清を分画し分取した。

目的分画をプールしタンパク質性組成物３（以後、■（
ＳＣ−１０）を得た。濁度検査を用い、インジケーター
株影二旦（大腸閉）Ｙｌｏに対するこの分画のバクテリ
オシン活性を詩べた。詳細に述べれば、プレイン・ハー
ト・インフュージョン培地中で３７℃で一晩増殖させた
インジケータ〜株を接鍵物として用い、ある特定の細胞
数の対数増殖を得た。これらのバクテリアを、上述の部
分ＷＩ製メタン・；り質性組成物の２倍希釈液と混合し
、インジケーター株の増殖阻害を分光光度法で記録した
。この濁度測定によって増殖反応曲線を作成し、培地中
の既知細胞数のインジケーター株に添加した既知濃度の
タンパク質組成物の角度から各程組成物１　ｍｌ当たり
の致死量を算出した。５０％のインジケーター株群を殺
すのに要する各種組成物１−当たりの致死量をＬＵ５０
とし、以下の表１に示した。また、表１を参照し検討し
た。

高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いてさら
にプールした分画の精製を行った。２８０ｎｍ　　’に
吸収ピークを示しタンパク質性組成物の性質を示す分画
を集めてプールし、タンパク質性組成物４を得た。この
一定分量について上述の向濁度検査を行った。

上述の方法の各段階で回収したバクテリオシン活性タン
パク質性物質の量およびこの緻のバクテリオシン活性を
以下の表１に記載した。

表　　１コリシンＨ８Ｃ，。の精製データタンパク質性含量　　バクテリオシン能（ａ）試験物質
　　　　　総量　出発量に　　ＬＵ５ｏ　　　比活性（
〜）　　対する％　（μη侃）１４粗訂飴液　　　　１５，６７４．　　１００　　０
．６７　４．３Ｘ１０−５２、　Ｆ’ＦＴ、　３５−５
０　　　１．２９８　　８．２８　　　０．５６　４．
３Ｘ１０−’（パーセントカット）３、ＰＰＴ、３５−５０％　　　１３９．８　　　０．
８９　　　０．１６　　１．ｌＸ１０−’セヂツクスＤ
ＥＡＪ÷二Ａ５０後Ｃ）ＩＳＣＩＯ“）４、ｊ＋ｐＬｃ−Ｄ肺が綬　　　　１５．９　　　０．
１０　　　０．６３　　４．０Ｘ１０−２のセファデッ
クスから（ａ）、濁度検査によってバクテリアに対して試験した
。

培養溶菌液由来の活性タンパク質量は、最初の溶菌液重
量のおよそ（１１０％にしか過ぎないことがわかるが、
これは、必要量のタンパク質組成物を生産するために大
量のバクテリアを培養することが好ましいことを示唆し
ている。ここで好適として用いられた精製法は、このタ
ンパク質性組成物の成分であるひとつのタンパク質のバ
クテリオシン活性を基準とした場合、９３０の精製係数
を得るに充分なものであり、この係数下では５０％イン
ジケーター株群の増殖阻害に要するこのタンパク質性組
成物は、０．６３μｆしか必要としない。実施例４　ｔ
　５．６でさらに研究するため単離されかつ以下でＨ２
Ｏ−１０と言われている分画は、表１の試験物質３であ
る。

タンパク濃度は、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ
）のクーマシー・ブリリアント・ブルー（Ｃｏｏｍａｓ
ｓｉｅＢｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｂｌｕｅ　）　０２５０色
累結合測定法（バイオ・ラド（Ｂｉｏ　−Ｒａｄ　）　
）によって決足した。全ての溶液に用いる水を蒸留しナ
フビュア（Ｎａｎｏｐｕｒｅ）装置（ミリボア（Ｍｉｌ
ｌｉｐｏｒｅ　）　）を通した。この水は、１８．３　
ｏｈｍｓ／ｃｍの伝導率を有していた。

２０　ｍＭ　）リス（Ｔｒｉｓ　）塩酸ｐＨ７，４中の
Ｅ、ｃｏｌｉ（大腸菌）　Ｈ２Ｏ１０粗細胞溶菌液の３
５−５０％硫酸アンモニウム分画（表１の分画２、実施
例２）の一部を解かし、直ぐに、９５％エタノール（）
７−　マ）　（Ｐｈａｒｍａｃｏ　）　）中１００ｍＭ
フェニルメタ７　スルホ、＝　ルア　ルオリド［ＰＭＳ
Ｆ　：］　（ジグＴ　（８ｉｇｍａ））で溶液中ＰＭＳ
　Ｆの最終濃度が１　ｒｎＭとなるように処理し、プロ
テアーゼ活性を阻害した。このＰＭ８Ｆ処理タ処理タン
パク−１，５Ｐ／３０〜３５−）を、４５０−のＡＣＡ
　５４　（ＩＢＦプロダクツ（Ｐｒｏｄｕｃｔｓ））を
詰め５０　ｍＭのトリｙ、　（ＴＲｌ５　）塩酸ｐＨ７
，４（ＬＫＢウルトログレード（ＵｌｔｒＯｇｒａｄｅ
））テ平衡トシタ９５Ｘ２．６ｃｒｆＬの低圧クロマト
グラフィ用カラム（ＬＫＢ　７７　ｋマシア（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ　）　）にかけた。

このタンパク質を平衡緩衝液で流速４０　ｄ／ｈｒ　（
ｌ５ＣＯｌ−リスポンプ（Ｔｒｉｓ　Ｐｕｍｐ　）　）
で一定組成下で溶出させた。溶出液を２８０ｎｍでモニ
ターシ（θ〜２　ＡＵＦＳ　）　（ｌ５ＣＯＵＡ　−５
吸収／螢光検出器（Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ　／　Ｆｌｕ
ｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｏｒ　）　）、５　
ｔｎｌずつ分画を集めた（　ｌ５ＣＯリドリーバ−■フ
ラク−７Ｅｌ　ン−’ｖ　Ｖフタ−（Ｒｅｔｒｉｅｖｅ
ｒ　ｒｉＦｒａｃｔｉｏｎＣｏｌｌｅｃｔｏｒ　）　）
　０ＡｃＡ　５４カラムから目的の細胞毒性タンパク質とと
もに溶出するバクテリオシンＨ８ＣＩ　Ｑの抗バクテリ
ア活性を測定することによって、活性分画を同定する。

１０００分の１希釈以上で五図肛（大腸菌）Ｙｌｏの増
殖阻害を示す分画な集め、スペクトラ／ボー／ｌ／　３
　（５ｐｅｃｔｒａ　／　Ｐｏｒ　３　）管（スペクト
ラム・メディカル・インダストリ（Ｓｐｅｃｔｒｕｒｎ
Ｍｅｄｉｃ４１　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ　）　）中で水
４１に対し２４時間透析した。この透析物質を凍結乾燥
し、ペレットを水中に再懸濁した。

この再懸濁タンパク質を、２０　ｍＭ　）リス（Ｔｒｉ
ｓ　）ｍｅ　ｐＨｓ、　ｏ　（ＬＫＢウルトログレード
（Ｕｌｔｒｏｇ−ｒ３ｄｅ　）　）で平衡としたＤＥＡ
Ｅ　−）リスアクリル（ＴＲｌ５ＡＣＲＹＩ、）−Ｍ　
（ＩＢＦブｏ　ｐ−り７　（Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）　）１
００−を充填した２　５　Ｘ　２．５　ａｍ低圧カラム
（アルテックス（Ａ、１ｔｅｘ　）　）にのせた。のせ
た直後１５分間流れを止め、タンパク質を充填剤に結合
させた。このカラムを平衡緩衝液で一定組成下に１時間
展開した後、平衡緩衝液中０−０．３５　Ｍの塩化ナト
リウム（アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ　）　９９＋％
）直線勾配で展翻した。流速は４０　ｔｎｔ／ｈｒ　（
ｌ５ＣＯトリスホンプ（Ｔｒｉｓ　Ｐｕｍｐ　）　）と
した。溶出を２８０ｎｍ　（０〜０．５　ＡＵＦＳ　）
で％　ニタ−Ｌ’（ｌ５ＣＯＵＡ−５吸収／螢光検出器
（Ａｂｓｏｒｂ２ｎｃｅ／ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＤ
ｅｔｅｃｔｏｒ　）　）　、分画を６ｄずつ分取した。

（■ＳＣＯリドリーバ■フラクション・コレクター（Ｒ
ｅｔｒ　１ｅｖｅｒＢ　Ｆｒａｃｔｉｏｎ　Ｃｏ１１ｅ
ｃｔｏｒ　）　）　。勾配の塩化ナトリウム濃度を、Ｙ
ＳＩ　３２型伝導率メーター（Ｙ８ＩＭｏｄｅｌ　３２
Ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ　Ｍｅｔｅｒ　）と２０　ｍＭ
　）リス（Ｔｒｉｓ　）塩酸ｐＨ−８，０中の０．０．
１，０．２゜０、３　、０．４　、０゜６，０．８Ｍ塩
化ナトリウム標準試料（ＬＫＢウルトロクレード（Ｕｌ
ｔｒｏｇｒａｄｅ　）　）で校正したベックマン・イン
ダストリアル・フローセル（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｄｕ
ｓｔｒｉａｌ　Ｆｌｏｗ　ｃｅｌｌ）でモニターした。

バクテリオシンＨ８Ｃ１０含有分画をバクテリア・スポ
ット検査で同定する。１０００分の１希釈以上で影匹旦
（大腸菌）ＹＩ　Ｏ増殖阻害を示す分画を集め、５０ｍ
Ｍ重炭酸アンモニウム（フィッシャー・サート（Ｆｉｓ
ｈｅｒ　Ｃｅｒｔ、　）　）　２　Ｌに透析後、−２０
℃で凍結乾燥後保存した。

細胞１個当たりタンパク質１　ｎ９−とじた活性分画の
抗腫瘍活性を、ＲＰＭＩ　１６４０　（ギプコ（ＧＩＢ
ＣＯ））中で３７℃、５％Ｃ０２（マテソン（Ｍａｔｈ
ｅｓｏｎ　）　）ＦＩＯ％ＦＣ８（ギブ：Ｉ　（ＧＩＢ
ＣＯ）　）　（１ｎＶ′ｍ胞）とともに２４時間インキ
ュベーションしてＨＬ−６０ヒト骨髄細胞（ＡＴＣＣ）
との相互作用により測定した。３Ｈ−チミジンを次に添
加し、上述のインキュベーションを４時間継続した。７
５％を超える阻害を示した分画を集め、５　Ｑ　ｍＭ重
炭酸アンモニウム４Ｌに対し２４時間透析した（フィッ
シャー・サート（Ｆｉｓｃｈｅｒ　Ｃｅｒｔ、　）　）
。この試料を凍結乾燥し、０．２ｙ−塩化カリウム（ア
ルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ　）　９９　＋　％　）、
０．２Ｐ−塩基性リン酸カリウム（アルドリッチ（Ａｌ
ｄｒｉｃｈ　）　９９　＋％）、２．１６ｙ−二塩基性
リン酸ナトリウム（アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ　）
　９９＋％）、８Ｆ塩化ナトリウム（アルドリッチ（Ａ
ｌｄｒｉｃｈ　）　９９　＋％　）をリトル・ナノピュ
ア　（Ｌｉｔｒｅ　Ｎａｎｏｐｕｒｅ　）水に入れ、ｐ
Ｈを濃塩酸で調節した（フィッシャー（Ｆｉｓｃｈｅｒ
）ＡＣ８試薬）　ｐＨ６，９のリン酸緩衝生理食塩水（
ＰＢＳ　）中に入れた。

同様にして集めた活性分画につい℃、抗菌活性検査を行
い、分画中の残存バクテリオシンを定量した。５０％細
菌増殖阻害に必要な量が、ＤＥＡＥ−トリスアクリル（
ＴＲｌ８ＡＣ１３，ＹＬ　−Ｍ　）カラム処理前の物質
１−当たり０．１２μ２の濃度であるのに比し、この分
画１−では２１．４μｇの濃度であることがわかった。

この再懸濁タンパク質（２０〜４０　ｍｙ　）を、ＰＢ
Ｓで平衡とした６０Ｘ２．１５ｃｍのＴＳＫ　Ｇ　３０
０（１５ＷＨＰＬＣサイズ排除カラム（フエノメネック
ス（Ｐｈｅ−ｎｏｍｅｎｅｘ　）　）に注入した。（冷
蔵ウォーター・ウイスプ・オートインジェクター（Ｗａ
ｔｅｒ　Ｗｉｓｐ　Ａｕｔｏ−ｉｎｊｅｃｔｏｒ　）、
ＬＫＢ　２１５２　ＨＰＬＣコｙトローラ−１ＬＫＢ　
２１５０　ＨＰＬＣチタｙ　ホ７ブ２台、ＬＫＢ　２２
１０２チヤンネルレコーダー、ＬＫＢ　２１５１波長司
変検出器およびＬＫＢ　２２１１スブラーク・フラクシ
ョンコレクターで、このＨＰＬＣシステムは構成されて
いる））。本システムは、分子量でタンパク質を分離す
る。分子量約３，０００−１５０，０００の範囲のタン
パク質は、流速３．５ｉ／分で一定組成の平衡緩衝液で
溶出され、分画な７−ずつ分取する間、２８０ｎｍ　（
０−０，１６ＡＵＦＳ　）　テモニタ−ｊル。

活性分画を３Ｈ−チミジンアッセイ法で同定し集めた後
、５　Ｑ　ｍＭ重炭酸アンモニウム２７（フィッシャー
・サート（Ｆｉｓｈｅｒ　Ｃｅｒｔ、　）　）　ニ２４
時間透析し凍結乾燥した。

使用前、分子量既知の標準タンパク質（アルドリッジ（
Ａｌｄｒｉｄｇｅ　）　）を用いて、このカラムを検量
した。カラムから溶出したタンパク質性組成物は、標準
的検量実験によれば、分子量約７０，０００であった。

この組成物は、高い抗腫瘍活性を有していることがわか
った。さらに詳細にいえば、この組成物は、細胞１個当
たり０．３　ｎＰの■Ｃ３ｏ（腫瘍細胞増殖５０％阻害
濃度）を示した。この活性試験は、既述の如く、腫瘍性
ヒ）　１７７８球細胞によるトリチウム・チミジンの取
り込み測定により行った。

異なるＡＩＤＳ患者１４例から得たリンパ球をフ・　　
　　ＴＭイコルーハーク　　（Ｆｉｃｏｌ　ｌ−ＰａＣｔｕｅ　
ＴＩＭ）　（７フルマシア・ファイン・ケミカルズ（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　）、
ドーパ／ｌ／　（Ｄｏｒｖａｌ　）、ゲベツク（Ｑｕｅ
ｂｅｃ　）　）で分画後計数し、実験群と対１１ａ群に
分けた。コリシンＦＬＳＣＩ　Ｑを上述の如く抽出・精
製しｐＨ７，４０トリス緩衝液で希釈後実験群のリンパ
球群に対し、標的細胞１個当たりの■（ＳＣ−１０を１
０−５から１０−２ｎｆの割合となるように添加した。

対照群には、トリス緩衝希釈液のみを添加した。

この細胞群二群をマイクロウェル中に分注し、３Ｈ−チ
ミジン存在下５％Ｃｏ２湿４４空気中で一晩増殖させた
。その後、この細胞を集めた後洗浄し過剰５Ｈ−チミジ
ンを洗い未すシンチレーションカウンターに入れた。そ
して、細胞代謝と増殖を反鋏する放射性物質取り込みを
評価した。Ｈ２Ｏ−１０の効果を、ｌ−ｌ５Ｃ−１０処
理群における壊変数７分（ｄｐｍ　）の但：下％で評価
し、対照群と比較した。

これと平行し、健常者９例から得たリンパ球に１（ＳＣ
−１０を添加し、Ｈ２Ｏ−４０の希釈剤として用いたト
リス緩衝液しか添加していない対照健常リンパ球群と３
Ｈ−チミジン取り込み試験で比較した。

Ａ　Ｉ　Ｄ　、９ハイリスク群の患者３例より成る第三
のグループ（例えば、血友病患者）を検査した。但し、
これらの患者ではＡＩＤＳの存在が確認されていなかっ
た。これらの患者は、１年後および１年半後の検査で健
常であることが確認された。

この３例の各患者における３Ｈ−チミジン摂取を対照群
に対するバー七ントで表した。この対照群は、それぞれ
の場合において、Ｈ２Ｏ−１０処理を行わなかった各群
の患者または正常者である。

Ｈ２Ｏ−１０は、適用した濃度下において、ＡＩＤＳ患
者Ｓ患者上常者のＨＩＶ−１感染（ＡＩＤＳ　）　ＩＪ
ンパ球およびＡＩＤＳの疑いのある者と健常かつ正常者
のリンパ球に対し、下記の表の如（効果を示した。

表　　２ｓＨ−チミジン取り込み　　各［ＭＪ　ＶＣおけるＡＩ
ＤＳ患者１５検体（異なる患者１４例）阻害　　　　　　２０−８６５３１５検体中８検体（５
３％）（患者１４４例中７）ボーダーライン　　　９９−１（１５　　　　１０２　
　１５検体中２検体の阻害　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　（１３％）（患者１４例中２例）刺激　　　　　　）１１０　　　　　　２７０　　１５
検体中５検体（３３％）（患者１４４例中５）ＡＩＤＳの疑いのある者３検体（ＡＩＤＳの疑いのある異なる患者３例）阻害　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　３例中０刺激　
　　　）１１０　　　　　１４５　　　３例中１例正常
者１４検体（異なる正常者９例）阻害　　　　　　４３−６７５１１４検体中４検体（２
９％）（正常者９ｆ仲４＠）（９例中２例）刺激　　　　　）１１０　　　　　　１６６　　１４検
体中８検体（５７％）征常者９例中７例）＊ＡＩＤＳウィルスを保有しないと判明していたゝ正常
者“群にＩ（する者から得た試料中４検体が、上述のよ
うに、３Ｈ−チミジン取り込み試験でｌ−ｌ５Ｃ−１０
に感受性であったが、これはウィルス感染を示唆する。

これらの１偽陽性“者全例は、他のウィルスに感染して
いたことが５Ｈ−グーミジン取り込みによって後に確認
された。そのうち２例は２−５　Ａシンテターゼ試験に
よっても確認された。

この後者の試験については、１９８５年９月のジャーナ
ル・オプ・インフエクシャス・デイシーズ（Ｊｏｕｒ−
ｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅ
ｓ　）、リード（Ｒｅｅｄ）、Ｓ、　Ｅ、らに記載され
ており、ウィルス感染の早期診断技術として広く公知の
ものであり認められている。−・過性のウィルス感染に
関する後の研究では、この“偽防性′患者の１例が、３
Ｈ−チミジン阻害に反して刺激効果を示した。

ＡＩ　Ｄ　Ｓ患者に対して行った１５検査中５３％がチ
ミジン取り込み阻害を示し、１３％がボーダーラインの
阻害を示した。これに反し、正常者に対して行った１４
検査中５７％がチミジン摂取に効果的な刺激、１４％が
ボーダシインの阻害を示し、２９％（１４検体中４検体
）のみが組害を示した。

ＡＩＤＳの疑いのある者３例（１、）Ｉｓｃ−１０に対
す７：）感受性を全く示さなかった。この検査の時点で
、これらの唐者でＡＩＤＳウィルスを保有１“る者が生
くいないことが検査および観察から確認された。

表２に示した結果から、著明な効果を得ることができる
と要約できる。第一に、放射性物質取り込みを示した。

’に、ＩＤＳ　ＩＪンバ球の数が、）ＩＳＯ−１０の導
入によって有意に低下する。第二に、重要なこととして
、同濃度のＮ８Ｃ−１０に曝された正常リンパ球の増殖
が低下しない（７１％）。さらに興味あることとして、
Ｎ８Ｃ−１０に曝されたこれらの正常リンパ球の５７％
が、未処置群と比軟し、放射能計数率の増加を示したこ
とである。このことは、正常リンパ球の増殖を刺激した
ことを示唆し、この刺激は、Ｎ８Ｃ−１０で処理した実
質的な数の患者がＡＩＤＳ患者で見られる他の感染に対
し免疫力を増強する反応である。

ＡＩＤＳ　ｇ染リンパ球に対するＮ５Ｃ−１０作用の標
的を同定するために、モノクローナル抗体を用いた。Ａ
ＩＤＳ患者の免疫反応を妨害するサブセットヘルパーｐ
Ｈ発（Ｔ４）細胞のサブセットサプレッサー（Ｔｓ）細
胞に対する比、すなわち、Ｔ４／’Ｉ’ｓ比は、ＡＩＤ
Ｓ患者で低下する（エバット（Ｅｖａｔｔ）ら、ニュー
・イングランド・ジャーナル・オプ・メデイスン（Ｎｅ
ｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉ
ｃｉｎｅ）、３１３巻、４８３ページ、１９８５年を参
照）。免疫反応を賦活しかつそのために身体防御の必須
成分であるサブセットヘルパー誘発細胞（Ｔ４）は、Ｈ
■■−Ｉウィルスに感染しその機能が低下するか、ある
いはその機能を全く失う。したがって、Ｔ、細胞に対す
る特異的モノクローナル抗体（二ニー・イングランド・
ニュークリア　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃ−１
ｅａｒ　）　、ｊＪタログ番号ＮＥＮ−（１３８）およ
びＴｓ細胞に対する％異的モノクローナル抗体（ニュー
。

イングランド・ニュークリア（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ
　Ｎｕｃ−１ｅ３ｒ　）、カタログ番号ＮＥＩ　−（１
３９）　）＆用いて、ＡＩＤＳ患者由来のリンパ球をＮ
８Ｃ−１０で処理した後のＴ４およびＴＳＳリッツの有
無とその数を評価した。

１（ＳＣ−１０処理後もサブセットＴＳサプレッサーリ
ンパ球数は不変であり、一方、感染Ｔ４細胞の数は有意
に低下したことがわかった。

詳細に言えば、ハイブリドーマ技術（Ｈｙｂｒ　ｉ　ｄ
　ＯｍａＴｅｃｈｎｉｑｕｅ　）と言われている製法で
調製したＴ４とＴｓ細胞に対する特異的モノクローナル
抗体を用いて、上述の如く、試験を行った。この技術は
、当業者によって広く用いられている。

このようにして調製したＴ４あるいはＴｓに対するモノ
クローナル抗体を螢光化合物（例、フレオレセイン・イ
ソシアナート）で標識し、これ１工紫外線下における色
素螢光により検出できる。

次に、Ｔ４およびＴｓ細胞をそれぞれの螢光抗体と結合
させ、紫外線下で計数する。

検査した各ＡＩＤＳ患者は、Ｎ８Ｃ−１０存在下におい
て、Ｔ、リンパ球が１４−２１％の範囲で減少している
ことを示した。それらのＴｓリンパ球は、全く影響を受
けないかあるいは見かけだけ刺激を受けたかあるいは阻
害されたかのいずれかであった。

したがって、ここで述べた特定実施例によれば、タンパ
ク質性組成物ｆ（ＳＯ−１０は、ウィルス感染Ｔリンパ
球数を低下させる効果があることが示された。さらに詳
細に言えば、この組成物の有用性は、正常Ｔ細胞に有害
な作用を及ぼすことなくむしろ刺激を与えつつＴ４細胞
数を低下させることにあると定義される。

実施例５ＡＩＤＳ患者リンパ球およびのどの痛みを起こすインフ
ルエンザや感染性単核白血球増加症のような他のウィル
スに感染したリンパ球に対するＨ２Ｏ−１０の効果は、
ＩＲＣＳメディカル・サイエンス（Ｍｅｄｉｃａｌ　５
ｃｉｅｎｃｅ　）、１１巻、２３６−２３７ベージ、１
９８３年に記載された技術と同一の技術を用いて、フロ
ーサイトメトリーで決定できる。

この方法では、ある時点において、細胞期のある／ｉ定
相にある細胞のパーセントを評価するために、試料中に
おける各細胞のＤＮＡ含量を分析するのが一般的である
。ｌ−１ｓｃ−１０は、ＤＮＡ分解によるヌクレオチド
漏出によって感受性細胞に影響を及ぼすので、少量のＤ
ＮＡで処理した細胞の増加数をフロー・サイトメトリー
で検出できる。Ｈ２Ｏ−１０に感受性でかつそれで処理
した細胞は、ヒストグラム上に結果をプロットするとこ
れらの細胞のＤＮＡ分解によるＤＮＡ含量低下が示され
ることから、ゝ前Ｇ、′期内に集積することがよくわか
る。

さらに詳細に言えば、以前に感染性単核白血球増加症（
エプスｐ　イｙ　−、バー　（Ｅｐｓｔｅｉｎ　−Ｂａ
ｒｒ　）ウィルスによる）として診断された患者から得
たＩＪ　ンハー４ヲ−ｙ　イー１−／ｌ／　・バー　り
（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ）（ファルマシア・ファイ
ン・ケミカルズ（ＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅ　Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌｓ　）　、モントリオール（Ｍｏｎｔｒｅａ
ｌ））によって単離し、ヨウ化プロビジウムによって染
色した。ｌ−ｌ５Ｃ−１０を実施例１のように抽出し精
製し、ＪｊＩＬ離したリンパ球試料に添加した。次いで
、細胞の螢光を、フロー・サイトメーター（ＩＦ’ｃＭ
　）中で増殖期において測定した。Ｉ（ＳＣ−１０を添
加しなかった検査リンパ球を用いた標準試料にお番する
Ｇ。／Ｇ、期細胞に対する被験リンノぐ球のＧ。／Ｇ、
期細胞を検量した。検査した総細胞数を、多くの打ち出
されたデータから得た。ピーク下の細胞数を積分し゛ゝ
前Ｇ、ｔｔ期およびＧ。／Ｇ、期にある細胞に対スル総
細胞のパーセントを算出した。最終結果をま、対照群す
なわちＨ２Ｏ−１０に曝されなかったウィルス感染細胞
数に起こった変化（％）に対し加減を行った後の値とし
て示した。

表３に結果を示す。

表　　３１　１　＋３３−１４−３１−２．０　’＋２　＋２４
　＋１７−２４　＋０．２　　＋２　　　　３　　　＋
１７　　　＋１１　　　−１８　　　　＋１．０　　　
　＋４　　　＋２１　　　＋３０　　　−２２　　　−
１−１．３　　　　＋３５　＋１５　＋１４−１３−２
．６　＋４、　　　６　　−２．４　　　＋１３　　−
５．１　　　＋７．６　　　　＋５　　　　　７　　　
　＋０．５　　　＋４．．６　　　　−０．８　　　　
＋Ｏ１３−６８−４，３＋７．５　　　、＋２．０　　
　　＋２．２　　　　＋７　９　＋１．３−１．１−０
．３−１．２　−７例に対し、９回検査を行った。７例
中５例は”前（）、１期にある細胞の集積を示し、これ
は細胞がＨ２Ｏ−１０に感受性であることを示す（欄３
を参照）。検査を受けた７例中４例は、ヒストグラム上
で（）。／Ｇ、期細胞の減少を示した（橢５を参照）。

７８％の検体で患者試料はＨ２Ｏ−１０に感受性を示し
たと要約される。

実施例６実施例４の第−節で正常と分類されかつ臨床症状からイ
ンフルエンザに罹患していたと思われる患者４例は、Ｈ
２Ｏ−１０に対Ｉ−１−過性の陽性反応な：呈すること
がわかった。これらの患者は、さらに２−５Ａシンテタ
ーゼの存在も検査で陽性であり、このシンテターゼの存
在は、ウィルス感染−ド（Ｒｅａｄ　）ら、９月号、１
９８５年）。インフルエンザ症状の回復に充分な時間が
経過した後、これらの患者について再度１（８Ｃ−１０
感受性ケ検査し、陰性であることがわかった。これらの
結果から、少なくともい（つかのウィルス感染はトＩＳ
Ｃ−１０で影響を受けるという仮定的結論が導き出され
る。

実施例３で調製した実質的にバクテリオシンを含有しな
いタンパク質性組成物のマウス腫瘍細胞に及ぼす効果を
調べた。２Ｏ−２５Ｐのマウス（Ｃ３Ｈ／Ｊ）１５四に
対しそれぞれ１０’個の転移性細胞を静注した。５匹の
実験群マウスに対し、さらに、本発明のバクテリオシン
ν「含有タンパク質性組成物］、０μ２を腹腔内に投与
した。もう−群の実験群マウス５匹に対し、１０μｇ０
Ｈ８Ｃ−１ｋｇを注射した。対照群のマウス５匹は緩衝
液のみを投与した。細胞を３週間増殖させた時点でマウ
スを珈殺“した。１５匹のマウス全てから肺を摘出し、
細胞増殖巣を計数した。各細胞増殖巣は、勅、瘍細胞１
個の増殖を示す。対照群と処置群の細胞増殖巣数の差（
パーセント）は、Ｈ２Ｏ−１０あるいはバクテリオシン
な実質的に含有しないタンパク質性組成物による腫瘍細
胞の阻害パーセントである。

対照群に比し、両笑触群で細胞増殖巣の減少が９０％ケ
超えていた。

贋和細胞系統Ｆｉｇ−６０の腫瘍細胞なＲＰＭＩ　−１
６４０（デイ７：ｚ　（Ｄｉｆｃｏ　）　）培地上で、
１０％牛脂児血清（デイフコ（Ｄｉｒｃｏ　）　）　７
添加し５％ＣＯ２，３７℃で増殖させた。この細胞を次
に洗浄し新鮮培地に′！Ｉｉ、濁し計数後、実験群と対
照群に分けた。各群すなわち細胞群は、約４　Ｘ　１０
’個の細胞より成っていた。上記の実施例３で記載した
如く調製したタンパク質性組成物をトリス緩衝液ｐＨ７
，４に希釈後実験細胞群に添加し、細胞１個当たり２　
、１．５　、０．５　、０．２５ｎＰクンバク賀の割岩
とした。対照細胞群には、トリス緩衝液だけを加えた。

１５胞群をマイクロウェルに分注し８　Ｘ　１０’閂細
胞とした後、３７℃、５％湿１１１Ｃｏ２空気中で、’
Ｈ−チミジン存在下で一晩増殖させた。その後、この細
Ｍを集め（ハーベスト）、過剰の３Ｆｉ−チミジンを洗
い流し、細胞代謝と増殖を反映する放射性物質取り込み
を評ｆｔ１ｌｉ−ｊるため、シンチレーション・カウン
ターで計数した。改変タンパク負性組成物の効果を、対
照群に対する治療群の１分間当たりの壊変政の減少（パ
ーセント）で評価した。

対照群のＤＰＭと実験群のＤＰＭ間の差（パーセント）
は、改変タンパク質性組成物の殺腫瘍細胞効果を示す。

実質的にバクテリオシン非含有の改変タンパク質性組成
物は、細胞１個当たり０．３　ｎｆＰ未満で、５０％の
細胞群を殺すのに充分であることがわかった。

（発明の効果）本文で報告し述べた結果から、試験に用いた組成物は、
抗腫瘍性でかつおそら（また抗ウイルス性であり、ＨＩ
Ｖ−Ｉのようなウィルスを攻撃することのできる１種以
上のタンパク質を含有することが示唆される。この活性
成分あるいは活性成分類を構成するタンパク質またはタ
ンパク質類ｔ１バクテリオシン形成に通常用いられる誘
発剤の効果によりバクテリア細胞によるタンパク質の発
現と分泌を誘発することによって、産生できる。上記の
結果から、抗ウイルス性および抗腫瘍性双方の活性タン
パク質またはタンパク質類は、バクテリオシンタンパク
質がこのようなバクテリア細胞培養方法によって産生さ
れる時、例えばＨ２Ｏ−１ｋｇのような組成物中に、こ
のバクテリオシンタンパク質とともに存在することが示
された。抗腫瘍活性は、バクテリオシン類を実質的に除
去したタンパク質性組成物中に存在することが示された
。

本発明の抗ウィルス活性あるいは抗腫瘍活性のタンパク
質あるいはタンパク質類の製法に関し、バクテリオシン
誘発条件下で適当なバクテリア細胞を培養すること、こ
のようにして産生されたタンパク質性組成物を単離し、
この中からバクテリオシンを分離すること、結果として
生じたタンパク質性組成物から個々のタンパク質を回収
しインビトロおよび／またはインビボにおける方法によ
って、その中の抗腫瘍タンパク質類および／または抗ウ
イルスタンパク質類な同定するため検査することによっ
て調製する好適な製法をこれまで記載してきたが、他の
調製法も開発できることが予測できる。個々のタンパク
質を単離し精製する常法および活性の検査常法が決まれ
ば、問題のタンパク質を、その明らかとなった特性に適
する他の公知の方法で合成することができる。

したがって、これらのアミノ酸配列を研究し、例えば固
体活性化ゲルを担体として用いる固相メリフイールド（
Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　）技術を使用することによって
、アミノ酸あるいは適当な配列のペプチド短鎖を順次結
合し、このタンパク質類の常法による段階的合成が実施
できる。別法としては、問題のタンパク質あるいはタン
パク質類のアミノ酸配列知見から、遺伝子工学技術を開
発し実施することもできる。当分野の範囲内で公知の技
術だけを用いて、発現体（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅ
ｈｉｃｌｅ　）例えば発現すべきタンパク質に適合する
発現系に対し、組み換えプラスミドを用いて適切な配列
のＤＮＡを挿入することができる。このようにして製造
された活性タンパク質あるいはタンパク質類の同一性を
、詳細に記載しかつここで実施例を示した方法によって
得たものと比較し、本質的に＋＝　−物質が産生された
ことを確認できる。

このように、本発明のタンパク質またはタンパク質性組
成物は、記載したバクテリア細胞醗酵によって誘発され
るバクテリオシンとともに得ることができる一方、他の
独立した方法によって産生ずることができる。これらの
方法は、製造方法の如何にかかわらず、本発明の顕著で
かつ新規の組成物を産生ずる。

代理人　　三　宅　正　夫（他１名）手続補正書（鮭） −ｖＡ′犬年７月ノ１日

Claims

【特許請求の範囲】

（１）抗ウィルス活性および抗腫瘍活性の少なくともひ
とつを有するタンパク質性組成物であって、少なくとも
ひとつのタンパク質より成り、かつ誘発剤の存在下でバ
クテリア細胞を培養すること、培地からタンパク質性混
合物を抽出すること、その中から結果として生じる得ら
れた活性タンパク質性組成物を回収することを包含する
工程によつて得ることのできるタンパク質性組成物。
（２）前記組成物が、実質的にバクテリオシンを含有し
ない請求項（１）に記載の組成物。
（３）分子量およそ７０，０００ダルトンのタンパク質
の溶出位置に対応する位置で、サイズ排除クロマトグラ
フィカラムで溶出できることを特徴とする請求項（２）
に記載の前記組成物。
（４）前記誘発剤がバクテリオシン合成誘発剤である上
述の工程によつて得ることのできる請求項（２）に記載
の組成物。
（５）合成されたバクテリオシンが、ビオシン類、ピブ
リオシン類、マイコバクテリオシン類およびコリシン類
から選ばれたものである前記工程によつて得ることので
きる請求項（４）に記載の組成物。
（６）前記誘発剤がマイトマイシンＣである前記工程に
よつて得ることができる請求項（５）に記載の組成物。
（７）前記バクテリア細胞が￥Ｅ．￥￥ｃｏｌｉ￥（大
腸菌）細胞である前記工程によつて得ることのできる請
求項（１）に記載の組成物。
（８）ビオシン類、ビブリオシン類、マイコバクテリオ
シン類およびコリシン類から選択されたひとつのバクテ
リオシンを包含する請求項（１）に記載の組成物。
（９）ウィルスに感染した哺乳類細胞または悪性哺乳類
細胞を、請求項（１）に記載の増殖阻害性タンパク質性
組成物および／または増殖阻害量のタンパク質性組成物
で処理することより成る上記細胞の増殖阻害方法。
（１０）請求項（２）に記載の増殖阻害性タンパク質性
組成物および／または増殖阻害量のタンパク質性組成物
によつて悪性哺乳類細胞を処理することより成る上記細
胞の増殖阻害方法。
（１１）前記ウィルスに感染した哺乳類細胞が、ＨＩＶ
−Ｉウィルス、感染性単核白血球増加症ウィルスおよび
インフルエンザウイルスから選択されたひとつのウィル
スに感染した白血球である請求項（９）に記載の方法。
（１２）前記ウィルスに感染した哺乳類細胞が、ＨＩＶ
−Ｉウィルスに感染したＴ細胞である請求項（１１）に
記載の方法。
（１３）生存哺乳類に対し、体重１ｋｇ当たり０．１μ
ｇから５００μｇのおよその範囲の上記タンパク質性組
成物の用量を投与する請求項（９）に記載の方法。
（１４）前記タンパク質性組成物が、体重１ｋｇ当たり
５μｇから１００μｇのおよその範囲で投与される請求
項（１３）に記載の方法。
（１５）生存哺乳類に対し、体重１ｋｇ当たり０．１μ
ｇから５００μｇのおよその範囲の前記タンパク質性組
成物の用量を投与する請求項（１０）に記載の方法。
（１６）前記タンパク質性組成物を、体重１ｋｇ当たり
、５μｇから１００μｇのおよその範囲内で投与する請
求項（１５）に記載の方法。
（１７）前記細胞が哺乳類体部から得た生物試料中に存
在しかつ細胞１個当たり１０＾−＾５ｎｇから１０ｎｇ
のおよその範囲の量の前記タンパク質性組成物で処理さ
れる請求項（９）に記載の方法。
（１８）前記細胞が哺乳類体部から得た生物試料中に存
在しかつ細胞１個当たり１０＾−＾５ｎｇから１０ｎｇ
のおよその範囲の量の前記タンパク質性組成物で処理さ
れる請求項（１０）に記載の方法。
（１９）薬剤学的に許容できる希釈剤と混合した請求項
（１）記載のタンパク質性組成物を有する、悪性哺乳類
細胞および／またはウィルス感染哺乳類細胞の増殖阻害
および殺細胞用の薬剤組成物。
（２０）請求項（２）に記載の前記タンパク質性組成物
の効果量を悪性哺乳類細胞に投与することより成る前記
細胞の増殖阻害および殺細胞用の薬剤組成物。
（２１）ＡＩＤＳ感染、感染性単核白血球増加症および
インフルエンザウイルス感染から選択されたウィルス感
染の白血球を有する患者に対し、請求項（１）に記載の
タンパク質性組成物の効果量を投与することより成る上
記患者の治療方法。
（２２）請求項（１）に記載されたタンパク質性組成物
をウィルス感染非悪性哺乳類細胞と相互作用させること
によつて上記細胞を検出する方法。
（２３）請求項（２）に記載されたタンパク質性組成物
を悪性哺乳類細胞と相互作用させることによつて上記細
胞を検出する方法。